ES2817802T3 - Métodos para purificar una proteína objetivo de una o más impurezas en una muestra - Google Patents

Abstract

Un metodo para purificar una proteina objetivo que contiene una region Fc de una o mas impurezas en una muestra, el metodo comprende las etapas de: a) poner en contacto la muestra con un medio de cromatografia de afinidad; b) eluir la proteina objetivo que contiene una region Fc del medio de afinidad mediante el uso de un tampon que tiene un pH que varia de 2,0 a 4,0 y una conductividad que varia de 5 a 50 mS; c) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografia de intercambio cationico; d) poner en contacto el medio de cromatografia de intercambio cationico con un tampon que tiene un pH menor que 4,0 durante un periodo de tiempo adecuado para la inactivacion viral, en donde la conductividad del tampon es de 5 a 50 mS; e) eluir la proteina objetivo que contiene una region Fc del medio de cromatografia de intercambio cationico mediante el uso de un tampon que tiene un pH que varia de 5,0 a 9,0; f) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografia de intercambio anionico; y g) recuperar la proteina objetivo que contiene una region Fc, en donde el metodo es un proceso continuo y las condiciones eliminan la necesidad de un deposito colector entre las etapasb) y c) y las etapas e) y f), o una etapa de intercambio de tampon entre las etapas b) y c) y las etapas e) y f), o un deposito colector y una etapa de intercambio de tampon entre las etapas b) y c) y las etapas e) y f).

Description

d e s c r ip c ió n

Métodos para purificar una proteína objetivo de una o más impurezas en una muestra

Solicitudes relacionadas

La presente solicitud reivindica el beneficio de prioridad de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos núm.

61/273,709, fecha de presentación 7 de agosto de 2009.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos de purificación de proteínas. En particular, la presente invención se refiere a métodos para purificar una proteína objetivo (proteínas que contienen una región Fc tales como, por ejemplo, anticuerpos y fragmentos de estos y moléculas similares a anticuerpos tales como, por ejemplo, inmunoadhesinas) de una composición que comprende la proteína objetivo y una o más impurezas.

Antecedentes

La purificación eficiente y económica a gran escala de proteínas, por ejemplo, proteínas terapéuticas que incluyen anticuerpos, es una consideración cada vez más importante para las industrias biotecnológica y farmacéutica. En general, los procesos para la purificación de proteínas son muy elaborados y costosos e incluyen muchas etapas diferentes. Por ejemplo, típicamente, las proteínas se producen mediante el uso de métodos de cultivo celular, por ejemplo, mediante el uso ya sea de líneas celulares de mamífero o bacterianas modificadas genéticamente para producir la proteína de interés mediante la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. En general, la separación de la proteína deseada de los componentes del medio que se alimentan a las células y de los subproductos de las propias células, así como también cualquier otra impureza que pueda existir plantea un desafío formidable. Tal separación es especialmente importante cuando las proteínas terapéuticas se destinan al uso en seres humanos y deben ser aprobadas por la Administración de Alimentos y Fármacos (FDA).

En general, los procesos de purificación que se usan actualmente, incluyen al menos las siguientes etapas: lisis celular para recuperar una proteína intracelular o la recuperación de una proteína del medio en caso de una proteína secretada; eliminación de restos celulares mediante el uso de centrifugación diferencial o filtración para obtener una muestra clarificada que contiene la proteína de interés; uso de una variedad de medios de cromatografía en un proceso de múltiples etapas para separar una proteína de interés de las diversas impurezas en la muestra.

Los métodos de cromatografía usados comúnmente incluyen uno o más medios de cromatografía de afinidad, medios de cromatografía de intercambio iónico, interacción hidrófoba, interacción hidrófila, exclusión por tamaño y modo mixto (es decir, combinación de varios métodos de cromatografía). Por ejemplo, para la purificación de anticuerpos monoclonales, se han descrito varios procesos, la mayoría de los cuales incluyen una etapa inicial de captura de afinidad con proteína A seguido de una o más etapas de pulido por intercambio iónico. Además, pueden usarse otras tecnologías de cromatografía, tales como: cromatografía de interacciones hidrófobas (HIC) con unión y elución; cromatografía de interacciones hidrófobas de flujo continuo (FTHIC); técnicas de cromatografía en modo mixto, por ejemplo, intercambio catiónico y aniónico débil con unión y elución (Abx), interacción hidrófoba y de intercambio iónico con unión y elución e interacción de modo mixto hidrófoba y de intercambio iónico de flujo continuo (FTMM), ambos de los cuales pueden utilizar resinas tales como Capto Adhere, Capto MMC, HEA Hypercel, p P A Hypercel. Además, la cromatografía de inducción de carga hidrófoba (HCl) junto con otras y combinaciones de varias técnicas puede usarse para pulir. En general, es importante que las etapas de pulido contengan una etapa de intercambio aniónico para proporcionar una etapa adicional de eliminación del virus ortogonal. El documento WO 2009/017491 A1 se refiere a métodos para purificar anticuerpos mediante el uso de hidroxiapatita cerámica. El documento WO 2008/025748 A1 se refiere a un proceso para la purificación de proteínas que contienen Fc. El documento WO 2008/025747 A1 se refiere a un proceso para la purificación de proteínas de fusión a Fc.

Aunque se han descrito métodos de purificación de proteínas que implican una combinación de diversas etapas de cromatografía, como se analizó anteriormente, estos métodos requieren el uso de un depósito colector y/o una etapa de intercambio de tampón entre cada etapa de cromatografía. Típicamente, la proteína objetivo se eluye en un depósito colector donde las condiciones del tampón/solución se ajustan de manera que sean adecuadas para la siguiente etapa de cromatografía (denominada intercambio de tampón). Las condiciones del tampón en el depósito colector, por ejemplo, pH, sal, etc., se ajustan típicamente según sea necesario, antes de cargarlo en el siguiente medio de cromatografía o una membrana de filtración.

Resumen de la invención

La presente invención está definida por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reivindicaciones se proporciona solo a título informativo.

La presente invención proporciona, al menos en parte, métodos mejorados para purificar o separar una proteína de interés de una o más impurezas, donde los métodos eliminan la necesidad de un depósito colector y/o una etapa de intercambio de tampón entre diversas etapas de cromatografía.

En diversas modalidades, la presente invención proporciona la purificación de proteínas que contienen una región Fc (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y proteínas similares) con una plantilla robusta, sin embargo, evita el depósito colector o etapas de intercambio de tampón intermedias. En consecuencia, el proceso de purificación puede denominarse un "proceso conectado". El proceso abarca el uso de condiciones apropiadas y medios de cromatografía para lograr un proceso continuo y sin depósito colector.

En algunas modalidades de acuerdo con la invención, se proporciona un método para purificar una proteína objetivo que contiene una región Fc de una o más impurezas en una muestra, donde el método comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra con un medio de cromatografía de afinidad; (b) eluir la proteína objetivo que contiene una región Fc del medio de afinidad; (c) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografía de intercambio catiónico; (d) eluir la proteína objetivo que contiene una región Fc del medio de cromatografía de intercambio catiónico; (e) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografía de intercambio aniónico; y (f) recuperar la proteína objetivo que contiene una región Fc, donde el método elimina la necesidad de un depósito colector entre las etapas (b) y (c) y las etapas (d) y (e).

En otras modalidades de acuerdo con la invención, se proporciona un método para purificar una proteína objetivo que contiene una región Fc de una o más impurezas en una muestra, donde el método comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra con un medio de cromatografía de afinidad; (b) eluir la proteína objetivo que contiene una región Fc del medio de afinidad; (c) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografía de intercambio catiónico; (d) eluir la proteína objetivo que contiene una región Fc del medio de cromatografía de intercambio catiónico; (e) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografía de intercambio aniónico; y (f) recuperar la proteína objetivo que contiene una región Fc, donde el método elimina la necesidad de una etapa de intercambio de tampón entre las etapas (b) y (c) y las etapas (d) y (e).

Aún en otras modalidades de acuerdo con la invención, se proporciona un método para purificar una proteína objetivo que contiene una región Fc de una o más impurezas en una muestra, donde el método comprende las etapas de: (a) poner en contacto la muestra con un medio de cromatografía de afinidad; (b) eluir la proteína objetivo que contiene una región Fc del medio de afinidad; (c) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografía de intercambio catiónico; (d) eluir la proteína objetivo que contiene una región Fc del medio de cromatografía de intercambio catiónico; (e) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografía de intercambio aniónico; y (f) recuperar la proteína objetivo que contiene una región Fc, donde el método elimina la necesidad de un depósito colector y una etapa de intercambio de tampón entre las etapas (b) y (c) y las etapas (d) y (e).

En algunas modalidades de acuerdo con los métodos de la invención reivindicada, los métodos comprenden además una etapa de preelución entre las etapas (a) y (b). En diversas modalidades, la etapa de preelución comprende poner en contacto el medio de cromatografía de afinidad de la etapa (a) con un tampón de cromatografía de intercambio catiónico.

En diversas modalidades, los métodos reivindicados son útiles para purificar una proteína objetivo que contiene una región Fc de una o más impurezas. Tales proteínas objetivo que contienen una región Fc incluyen, pero no se limitan a, un anticuerpo, una molécula de inmunoadhesión y una proteína de fusión a Fc, y fragmentos de esta que contienen una Fc. En una modalidad particular, una proteína objetivo que contiene una región Fc es un anticuerpo monoclonal.

En diversas modalidades, la proteína objetivo que contiene una región Fc se eluye del medio de afinidad mediante el uso de un tampón que tiene un pH que varía de 2,0 a 4,0.

En algunas modalidades, la etapa (d) comprende el uso de un tampón que tiene un pH que varía de 5,0 a 9,0. Aún en otras modalidades, la etapa (d) comprende el uso de un tampón que tiene un pH que varía de 6,0 a 8,0.

En algunas modalidades, la etapa de medios de cromatografía de afinidad en los métodos de la invención comprende el uso de Proteína A o una variante funcional de esta.

En algunas modalidades, los métodos de acuerdo con la invención incluyen además una etapa de inactivación del virus entre las etapas (c) y (d). En algunas modalidades, la etapa de inactivación del virus comprende poner en contacto el medio de cromatografía de intercambio catiónico con un tampón que tiene un pH menor que 4,0 durante un período de tiempo adecuado para la inactivación viral. El período de tiempo generalmente varía de 15 a 60 minutos.

También se describen en la presente descripción kits para purificar una proteína objetivo que contiene una región Fc de una o más impurezas en una muestra. En algunas modalidades, tal kit comprende uno o más de: una columna de cromatografía de afinidad, una columna de cromatografía de intercambio catiónico, una columna de cromatografía de intercambio aniónico y uno o más tampones de elución junto con instrucciones para el uso del kit.

En algunas modalidades, la una o más columnas de cromatografía incluidas en el kit son desechables.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 representa cromatogramas para cargar muestras en diversas condiciones de pH en una columna de intercambio catiónico.

La Figura 2 muestra los resultados de un experimento de SDS-PAGE en el que las muestras se analizaron en condiciones no reductoras, como se describe en detalle en el Ejemplo 3. Las bandas dominantes en todos los carriles representan la IgG. La IgG intacta puede verse a ~ 175 kDa. Las bandas adicionales a 150 kDa, 100 kDa, 75 kDa, 40 kDa y 20 kDa surgen de la IgG parcialmente reducida, la IgG sin ensamblar o de fragmentos de IgG.

La Figura 3 muestra un esquema para un Akta modificado (es decir, la estación de trabajo o sistema de cromatografía) que muestra la conexión de columnas para un proceso en línea de tres etapas.

La Figura 4 representa un cromatograma para la carga directa del medio de afinidad con Proteína A en una columna de intercambio catiónico.

La Figura 5 representa un cromatograma para 2 ciclos de carga de las etapas de captura por afinidad con Proteína A en una sola columna de intercambio catiónico en línea.

La Figura 6 representa un cromatograma para 4 ciclos de carga de las etapas de captura por afinidad con Proteína A en una sola columna de intercambio catiónico en línea.

La Figura 7 representa los resultados de un experimento de SDS-PAGE, como se describe en detalle en los Ejemplos 4-7. Las bandas dominantes en todos los carriles representan la IgG. Las muestras se analizaron en condiciones reductoras y no reductoras. La IgG intacta puede verse a ~ 175 kDa. Las bandas adicionales a 150 kDa, 100 kDa, 75 kDa, 40 kDa y 20 kDa surgen de la IgG parcialmente reducida, la IgG sin ensamblar o de fragmentos de IgG.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona, al menos en parte, métodos nuevos y mejorados para purificar una proteína objetivo de una muestra que contiene la proteína objetivo y una o más impurezas, donde los métodos eliminan específicamente la necesidad de un depósito colector y/o una etapa de intercambio de tampón, uno o ambos de los cuales se realizan típicamente entre diversas etapas de cromatografía que forman parte de un proceso convencional de purificación de proteínas.

Los métodos descritos en la presente descripción son inventivos y más eficientes que los descritos en la técnica, ya que reducen las restricciones del proceso y proporcionan una plantilla para un proceso desechable o parcialmente desechable, donde el manejo de líquidos puede ser un desafío. El proceso podría aplicarse a cualquier polipéptido de unión a Proteína A (por ejemplo, que contiene una región Fc), tal como anticuerpos monoclonales y fragmentos que contienen una región Fc, moléculas de inmunoadhesión y proteínas de fusión Fc. En algunas modalidades, las condiciones del proceso dependen del valor de pI de la molécula objetivo que se purifica, lo que puede determinar fácilmente un experto en la técnica. Los tampones descritos en la presente descripción funcionan mejor para proteínas que contienen una región Fc, tales como anticuerpos monoclonales que tienen una pI mayor que 8,0. Sin embargo, el proceso puede optimizarse fácilmente para proteínas que tienen una pI menor que 8,0, basado en las enseñanzas de la técnica y las descritas en la presente descripción.

I. Definiciones

Para que la presente descripción pueda entenderse más fácilmente, primero se definen ciertos términos. Se establecen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada.

Los términos "inmunoglobulina", "Ig" o "anticuerpo" (usados de manera intercambiable en la presente descripción) se refieren a una proteína que tiene una estructura básica de cuatro cadenas polipeptídicas que consta de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, y dichas cadenas se estabilizan, por ejemplo, mediante enlaces disulfuro intercatenarios, que tienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno. El término "inmunoglobulina de cadena sencilla" o "anticuerpo de cadena sencilla" (usado indistintamente en la presente descripción) se refiere a una proteína que tiene una estructura de dos cadenas polipeptídicas que consiste en una cadena pesada y una cadena ligera, estabilizándose dichas cadenas, por ejemplo, mediante enlaces peptídicos intercatenarios, que tienen la capacidad de unirse específicamente al antígeno. El término "dominio" se refiere a una región globular de un polipéptido de cadena pesada o ligera que comprende bucles peptídicos (por ejemplo, que comprenden de 3 a 4 bucles peptídicos) estabilizados, por ejemplo, mediante una lámina p-plegada y/o un enlace disulfuro intracatenario. Los dominios se denominan en la presente descripción adicionalmente como "constantes" o "variables", basándose en la falta relativa de variación de secuencias dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio "constante", o en la variación significativa dentro de los dominios de varios miembros de la clase en el caso de un dominio "variable". Los "dominios" de los anticuerpos o polipéptidos a menudo se denominan indistintamente en la técnica como "regiones" de los anticuerpos o polipéptidos. Los dominios "constantes" de las cadenas ligeras de los anticuerpos se denominan indistintamente "regiones constantes de la cadena ligera", "dominios constantes de la cadena ligera", regiones "CL" o dominios "CL". Los dominios "constantes" de las cadenas pesadas de los anticuerpos se denominan indistintamente "regiones constantes de la cadena pesada", "dominios constantes de la cadena pesada", regiones "CH" o dominios "CH". Los dominios "variables" de las cadenas ligeras de los anticuerpos se denominan indistintamente "regiones variables de la cadena ligera", "dominios variables de la cadena ligera", regiones "VL" o dominios "VL". Los dominios "variables" de las cadenas pesadas de los anticuerpos se denominan indistintamente "regiones variables de la cadena pesada", "dominios variables de la cadena pesada", regiones "VH" o dominios "VH".

Las inmunoglobulinas o los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y pueden existir en forma monomérica o polimérica, por ejemplo, los anticuerpos IgM que existen en forma pentamérica y/o los anticuerpos IgA que existen en forma monomérica, dimérica o multimérica. Las inmunoglobulinas o los anticuerpos además pueden incluir anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos) y fragmentos de anticuerpos siempre que retengan o se modifiquen para comprender un dominio de unión específico del ligando. El término "fragmento" se refiere a una parte o porción de un anticuerpo o cadena de anticuerpo que comprende menos residuos de aminoácidos que un anticuerpo o cadena de anticuerpo intacto o completo. Los fragmentos pueden obtenerse a través del tratamiento químico o enzimático de un anticuerpo intacto o completo o una cadena de anticuerpo. Los fragmentos, además, pueden obtenerse por medios recombinantes. Cuando se producen de forma recombinante, los fragmentos pueden expresarse solos o como parte de una proteína más grande llamada proteína de fusión. Los fragmentos ilustrativos incluyen los fragmentos Fab, Fab', F(ab')² , Fc y/o Fv. Las proteínas de fusión ilustrativas incluyen las proteínas de fusión Fc.

Generalmente, una inmunoglobulina o anticuerpo se dirige contra un "antígeno" de interés. Preferentemente, el antígeno es un polipéptido biológicamente importante, y la administración del anticuerpo a un mamífero que padece una enfermedad o trastorno puede dar como resultado un beneficio terapéutico en ese mamífero. Sin embargo, se contemplan además anticuerpos dirigidos contra antígenos no polipeptídicos (tales como antígenos de glucolípidos asociados a tumores; ver la patente de Estados Unidos núm. 5,091,178). Cuando el antígeno es un polipéptido, puede ser una molécula transmembrana (por ejemplo, un receptor) o un ligando tal como un factor de crecimiento.

El término "anticuerpo monoclonal", como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que constituyen la población son idénticos excepto por posibles mutaciones naturales que pueden estar presentes en cantidades menores. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con las preparaciones de anticuerpos convencionales (policlonales), que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante del antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse que requiera la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de acuerdo con la presente invención pueden prepararse mediante el método de hibridoma descrito por primera vez por Kohler y otros, Nature 256:495 (1975), o pueden elaborarse mediante métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente de Esatdos Unidos núm. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse además de bibliotecas de anticuerpos de fagos mediante el uso de las técnicas descritas en Clackson y otros, Nature 352:624-628 (1991) y Marks y otros, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).

Los anticuerpos monoclonales pueden incluir además anticuerpos "quiméricos" (inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase particular de anticuerpos, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de Estados Unidos núm. 4,816,567 y Morrison y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

El término "región hipervariable", cuando se usa en la presente descripción, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una "región determinante de la complementariedad" o "CDR" (es decir, residuos 24-34 (L1), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Kabat y otros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5ta Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda Md. (1991)) y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (es decir, residuos 26-32 (L1), 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena pesada; Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Los residuos "estructurales" o "FR" son aquellos residuos de dominio variable distintos de los residuos de la región hipervariable como se define en la presente descripción.

Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en los que los residuos de la región hipervariable del receptor se sustituyen por residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) como el ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región estructural (FR) Fv de la inmunoglobulina humana se sustituyen por los residuos no humanos correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se realizan para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente la totalidad de al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en el que todos o sustancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a los de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fc), típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles, ver Jones y otros, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature 332:323-329 (1988); y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).

Los términos "polinucleótido" y "molécula de ácido nucleico", usados indistintamente en la presente descripción, se refieren a formas poliméricas de nucleótidos de cualquier longitud, ya sean ribonucleótidos o desoxirribonucleótidos. Estos términos incluyen un ADN monocatenario, bicatenario o tricatenario, ADN genómico, ADNc, ARN, híbrido de ADN-ARN, o un polímero que comprende las bases de purina y pirimidina, u otras bases de nucleótidos naturales, modificadas químicamente o bioquímicamente, no naturales o derivatizadas. La cadena principal del polinucleótido puede comprender azúcares y grupos fosfato (como puede encontrarse típicamente en ARN o ADN), o grupos azúcar o fosfato modificados o sustituidos. Además, puede obtenerse un polinucleótido bicatenario a partir del producto polinucleotídico monocatenario de la síntesis química ya sea sintetizando la cadena complementaria e hibridando las cadenas en condiciones apropiadas, o sintetizando la cadena complementaria de novo mediante el uso de un ADN polimerasa con un cebador apropiado. Una molécula de ácido nucleico puede tomar muchas formas diferentes, por ejemplo, un gen o fragmento de gen, uno o más exones, uno o más intrones, ARNm, ADNc, polinucleótidos recombinantes, polinucleótidos ramificados, plásmidos, vectores, ADN aislado de cualquier secuencia, ARN aislado de cualquier secuencia, sondas de ácido nucleico y cebadores. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y análogos de nucleótidos, uracilo, otros azúcares y grupos de enlace tales como fluororibosa y tioato, y ramificaciones de nucleótidos. Como se usa en la presente descripción, "ADN" o "secuencia de nucleótidos" incluye no solo las bases A, T, C y G, sino que también incluye cualquiera de sus análogos o formas modificadas de estas bases, tales como nucleótidos metilados, modificaciones internucleotídicas tales como enlaces no cargados y tioatos, uso de análogos de azúcares y estructuras de cadena principal modificadas y/o alternativas, tales como las poliamidas. En una modalidad particular, una molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una variante de SpA.

Como se usa en la presente descripción, el término "inmunoadhesina" designa moléculas similares a anticuerpos que combinan el "dominio de unión" de una proteína de "adhesión" heteróloga (por ejemplo, un receptor, ligando o enzima) con las funciones efectoras de un dominio constante de inmunoglobulina. Estructuralmente, las inmunoadhesinas comprenden una fusión de la secuencia de aminoácidos de adhesina con la especificidad de unión deseada que es diferente del sitio de reconocimiento y unión de antígeno (sitio de combinación de antígeno) de un anticuerpo (es decir, es "heterólogo") y una secuencia de dominio constante de inmunoglobulina. La secuencia de dominio constante de inmunoglobulina en la inmunoadhesina se deriva preferentemente de las cadenas pesadas y1, y2, o y4 ya que las inmunoadhesinas que comprenden estas regiones pueden purificarse mediante cromatografía con Proteína A (Lindmark y otros, J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)).

Una "quimera de anticuerpo-inmunoadhesina" comprende una molécula que combina al menos un dominio de un anticuerpo (por ejemplo, una región Fc) con al menos una molécula de inmunoadhesina. Las quimeras de anticuerpoinmunoadhesina ilustrativas son las quimeras biespecíficas de CD4-IgG descritas en Berg y otros, PNAS (USA) 88:4723-4727 (1991) y Chamow y otros, J. Immunol. 153:4268 (1994).

El término "región Fc" y "proteína que contiene una región Fc" significa que la proteína contiene regiones o dominios constantes de cadena pesada y/o ligera (regiones CH y CL como se definió previamente) de una inmunoglobulina. Las proteínas que contienen una "región Fc" pueden poseer las funciones efectoras de un dominio constante de inmunoglobulina. Una "región Fc" tales como las regiones CH²/CH³ , puede unirse selectivamente a ligandos de afinidad tales como la Proteína A o variantes funcionales de esta. En algunas modalidades, una proteína que contiene una región Fc se une específicamente a la Proteína A o un derivado, variante o fragmento funcional de esta. En otras modalidades, una proteína que contiene una región Fc se une específicamente a la Proteína G o la Proteína L, o derivados, variantes o fragmentos funcionales de esta.

El término "dominio de unión a ligando" como se usa en la presente descripción se refiere a cualquier receptor de superficie celular nativo o cualquier región o derivado de este que retiene al menos una unión de ligando cualitativa de un receptor nativo correspondiente. En algunas modalidades de acuerdo con la invención reivindicada, un dominio de unión a ligando se fusiona a una región Fc. En una modalidad específica, el receptor para el ligando se deriva de un polipéptido de superficie celular que tiene un dominio extracelular que es homólogo a un miembro de la súper familia de genes de inmunoglobulina. En general, cualquier receptor puede usarse en los métodos de la invención, siempre que incluya o esté fusionado a una región Fc, como se define en la presente descripción. Otros receptores, que no son miembros de la súper familia de genes de inmunoglobulina pero que, sin embargo, están específicamente cubiertos por esta definición, son receptores para citocinas, y en particular receptores con actividad tirosina quinasa (receptor tirosina quinasas), miembros de las superfamilias del receptor de hematopoyetina y del factor de crecimiento nervioso y moléculas de adhesión celular, por ejemplo, (E-, L- y P- selectinas).

El término "dominio de unión al receptor" se usa para designar cualquier ligando nativo para un receptor, incluidas las moléculas de adhesión celular, o cualquier región o derivado de tal ligando nativo que retiene al menos una capacidad de unión al receptor cualitativa de un ligando nativo correspondiente. Esta definición, entre otras, incluye específicamente secuencias de unión de ligandos para los receptores mencionados anteriormente. En algunas modalidades, un dominio de unión al receptor contiene o está fusionado a una región Fc, como se describe en la presente descripción.

El término "composición", "solución" o "muestra" a purificar en la presente descripción comprende la proteína objetivo (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc) y una o más impurezas. La composición o muestra puede estar "parcialmente purificada" (es decir, debe haberse sometido a una o más etapas de purificación, tal como mediante cromatografía de no afinidad descrita en la presente descripción) o puede obtenerse directamente de una célula huésped u organismo que produce el polipéptido (por ejemplo, la composición puede comprender fluido de cultivo celular cosechado).

Como se usa en la presente descripción, el término "polipéptido" generalmente se refiere a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos. Los términos "proteína de interés" y "proteína objetivo", como se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a una proteína o polipéptido, que incluye, pero no se limita a, una proteína que contiene una región Fc tal como un anticuerpo que se purifica mediante un método de la invención, a partir de una mezcla de proteínas y, opcionalmente, otros materiales tales como restos celulares y similares.

Como se discutió anteriormente, en algunas modalidades, una proteína objetivo es una proteína que contiene una región Fc, por ejemplo, una inmunoglobulina. En algunas modalidades, una proteína que contiene una región Fc es una proteína recombinante que incluye la región Fc de una inmunoglobulina fusionada a otro polipéptido o un fragmento de este. Los polipéptidos ilustrativos incluyen, por ejemplo, renina; una hormona del crecimiento, que incluye la hormona del crecimiento humano y la hormona del crecimiento bovina; factor liberador de hormona del crecimiento, hormona paratiroidea; hormona estimulante del tiroides; lipoproteínas; a-1-antitripsina; cadena a de insulina; cadena p de insulina; proinsulina; hormona estimulante del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; factores de coagulación tales como el factor VIIIC, factor IX, factor tisular y factor von Willebrand; factores anticoagulantes como la proteína C; factor natriurético auricular; tensioactivo pulmonar; un activador de plasminógeno, tal como uroquinasa u orina humana o activador de plasminógeno de tipo tisular (t-PA); bombesina; trombina; factor de crecimiento hematopoyético, factor de necrosis tumoral -a y -P; encefalinasa; RANTES (expresado y secretado por células T normales, y regulado por activación); proteína inflamatoria de macrófagos humanos (MIP-1-a); una albúmina sérica tal como albúmina sérica humana; sustancia inhibidora Mulleriana; cadena a de relaxina; cadena p de relaxina; prorrelaxina; péptido asociado a gonadotropina de ratón; una proteína microbiana, como la p-lactamasa; Dnasa; IgE; un antígeno asociado a linfocitos T citotóxicos (CTLA), por ejemplo, CTLA-4; inhibina activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; Proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico como el factor neurotrófico derivado de hueso (BDNF), neurotrofina-3, -4, -5 o -6 (NT-3, NT-4, NT-5 o NT-6), o un factor de crecimiento nervioso tal como -p.; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF); factor de crecimiento de fibroblastos tales como aFGF y PFGF; factor de crecimiento epidérmico (EGF); factor de crecimiento transformante (TGF) tales como TGF-alfa y TGF-p, que incluye TGF-pi, TGF-P2, TGF-P3, TGF-p4, o TGF-P5; factor de crecimiento similar a insulina I y II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-I (IGF-I cerebral), proteínas de unión al factor de crecimiento similar a insulina (IGFBP); proteínas CD tales como CD3, CD4, CD8, CD19, CD20, CD34 y CD40; eritropoyetina; factores osteoinductores; inmunotoxinas; una proteína morfogenética ósea (BMP); un interferón tal como interferón-a, -p, y --y; factores estimulantes de colonias (CSF), por ejemplo, M-CSF, GM-CSF y G-CSF; interleucinas (IL), por ejemplo, IL-1 a IL-10; superóxido dismutasa; receptores de células T; proteínas de la membrana superficial; factor de aceleración de la descomposición; antígeno viral tal como, por ejemplo, una porción de la envoltura del SIDA; proteínas de transporte; receptores de alojamiento; adresinas; proteínas reguladoras, integrinas tales como CD11a, C D llb , CD11c, CD18, una ICa M, VLA-4 y VCAM; un antígeno asociado a tumor tal como el receptor HER2, HER3 o HER4; y fragmentos y/o variantes de cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente. Además, una proteína o polipéptido de la invención es un anticuerpo, fragmento o variante de este, que se une específicamente a cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente.

El término "variante ácida" es una variante de una proteína objetivo que es más ácida (por ejemplo, según lo determinado por cromatografía de intercambio catiónico) que la proteína objetivo. Un ejemplo de una variante ácida es una variante desamidada.

El término "contaminante", "impureza" o "resto celular", como se usa indistintamente en la presente descripción, se refiere a cualquier molécula extraña u objetable, que incluye una macromolécula biológica tal como un ADN, un ARN, una o más proteínas de células huésped, endotoxinas, lípidos y uno o más aditivos que pueden estar presentes en una muestra que contiene la proteína objetivo que contiene la Fc que se separa de una o más de las moléculas extrañas u objetables mediante el uso de un proceso de la presente invención. Además, tal contaminante puede incluir cualquier reactivo que se use en una etapa que pueda ocurrir antes del proceso de purificación.

Los términos "proteína de células de ovario de hámster chino" y "CHOP" se usan indistintamente para referirse a una mezcla de proteínas de células huésped ("HCP") derivadas de un cultivo de células de ovario de hámster chino ("CHO"). La HCP o CHOP generalmente está presente como una impureza en un medio de cultivo celular o lisado (por ejemplo, un fluido de cultivo celular cosechado ("HCCF")) que comprende una proteína de interés tal como un anticuerpo o inmunoadhesina expresado en una célula CHO). La cantidad de CHOP presente en una mezcla que comprende una proteína de interés proporciona una medida del grado de pureza de la proteína de interés. La HCP o CHOP incluye, pero no se limita a, una proteína de interés expresada por la célula huésped, tal como una célula huésped CHO. Típicamente, la cantidad de CHOP en una mezcla de proteínas se expresa en partes por millón en relación con la cantidad de proteína de interés en la mezcla. Se entiende que cuando la célula huésped es otro tipo de célula, por ejemplo, una célula de mamífero diferente de CHO, una E. coli, una levadura, una célula de insecto o una célula vegetal, h Cp se refiere a las proteínas, distintas de la proteína objetivo, encontradas en un lisado de la célula huésped.

El término "partes por millón" o "ppm" se usan indistintamente en la presente descripción para referirse a una medida de pureza de una proteína objetivo purificada mediante un método de la invención. Las unidades ppm se refieren a la cantidad de HCP o CHOP en nanogramos/mililitro por proteína de interés en miligramos/mililitro (es decir, ppm de CHOP = (ng/ml de CHOP)/(mg/ml de proteína de interés), donde las proteínas están en solución). Cuando las proteínas se secan (tal como mediante liofilización), ppm se refiere a (ng de CHOP)/(mg de proteína de interés)).

Los términos "purificar", "separar" o "aislar", como se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren al aumento del grado de pureza de un polipéptido o proteína de interés o una proteína objetivo de una composición o muestra que comprende el polipéptido y uno o más impurezas. Típicamente, el grado de pureza de la proteína objetivo se aumenta al eliminar (total o parcialmente) al menos una impureza de la composición. Una "etapa de purificación" puede ser parte de un proceso de purificación global que da como resultado una composición o muestra "homogénea", que se usa en la presente descripción para referirse a una composición o muestra que comprende menos de 100 ppm de HCP en una composición que comprende la proteína de interés, alternativamente menos de 90 ppm, menos de 80 ppm, menos de 70 ppm, menos de 60 ppm, menos de 50 ppm, menos de 40 ppm, menos de 30 ppm, menos de 20 ppm, menos de 10 ppm, menos de 5 ppm o menos de 3 ppm de HCP.

Los términos "proceso de flujo continuo", "modo de flujo continuo" y "cromatografía de flujo continuo", como se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a una técnica de separación de productos en la que al menos un producto (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc) contenido en una muestra junto con uno o más contaminantes está destinado a fluir a través de una resina o medio cromatográfico, mientras que al menos un contaminante o impureza potencial se une a la resina o medio cromatográfico. El "modo de flujo continuo" es generalmente una operación isocrática (es decir, un proceso de cromatografía durante el cual no se cambia la composición de la fase móvil).

En algunas modalidades de acuerdo con los métodos reivindicados y como se describe en los Ejemplos expuestos en la presente descripción, los métodos emplean una etapa de cromatografía de intercambio aniónico que se realiza en un modo de flujo continuo.

Los términos "modo de unión y elución" y "proceso de unión y elución", como se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a una técnica de separación de productos en la cual al menos un producto contenido en una muestra (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc) se une a una resina o medio cromatográfico y posteriormente se eluye.

Como se usa en la presente descripción, los términos "depósito colector", "depósito de agrupación" y "depósito intermedio", como se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a cualquier recipiente, depósito o bolsa, que puede usarse para recolectar la salida de una etapa del proceso (por ejemplo, un eluato de una columna). En la mayoría de los procesos convencionales, uno o más recipientes intermedios se usan para ajustar las condiciones/propiedades de la salida de una etapa del proceso para que sea adecuado para la siguiente etapa del proceso. Por ejemplo, puede ser necesario ajustar el pH y/o la conductividad de un eluato de una columna o etapa de cromatografía (por ejemplo, que contiene proteínas objetivo e impurezas) antes de cargar el conjunto en la siguiente columna o etapa de cromatografía. En diversas modalidades de acuerdo con los métodos de la presente invención, se evita la necesidad de un depósito colector. En consecuencia, en diversas modalidades de los métodos reivindicados, los métodos proporcionan una forma mejorada de purificar una proteína objetivo de una o más impurezas sin la necesidad de un depósito colector, que se usa típicamente en procesos de purificación convencionales.

Como se usa en la presente descripción, el término "proceso conectado" se refiere a un proceso de purificación para una proteína que contiene una región Fc, lo que evita la necesidad de un depósito colector y/o una etapa de intercambio de tampón. En consecuencia, los procesos conectados de acuerdo con la invención reivindicada son superiores a los procesos de purificación convencionales usados actualmente en la técnica, ya que proporcionan ahorros significativos tanto de tiempo como de recursos.

Como se usa en la presente descripción, el término "etapa de intercambio de tampón" se refiere a un ajuste de condición de solución en línea, que es típicamente una alternativa en muchos procesos convencionales, al uso de un depósito colector, como se describió anteriormente. En una etapa típica de intercambio de tampón, pueden mezclarse o valorarse dos soluciones durante la transferencia mediante el uso de la mezcla de solución en una tubería o recipiente de mezcla, dispositivo o aparato de filtración. Por ejemplo, puede requerirse que una solución se diluya para reducir la conductividad al mezclar la solución con otra solución de menor conductividad. El intercambio de tampones puede lograrse con la ayuda de dispositivos de filtración, tales como diafiltración, ultrafiltración y similares. En algunas modalidades de acuerdo con la invención reivindicada, los métodos proporcionan un proceso mejorado para purificar proteínas, que elimina la necesidad de una etapa de intercambio de tampón.

En algunas otras modalidades, los métodos de acuerdo con la invención reivindicada evitan la necesidad tanto de un depósito colector como de una etapa de intercambio de tampón.

El término "cromatografía" se refiere a cualquier tipo de técnica que separa un analito de interés (porejemplo, una proteína que contiene una región Fc tal como una inmunoglobulina) de otras moléculas presentes en una mezcla. Por lo general, el analito de interés se separa de otras moléculas como resultado de las diferencias en las velocidades a las que las moléculas individuales de la mezcla migran a través de un medio estacionario bajo la influencia de una fase móvil, o en procesos de unión y elución.

Los términos "resina de cromatografía" o "medios de cromatografía" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a cualquier tipo de fase sólida que separa un analito de interés (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc tal como una inmunoglobulina) de otras moléculas presentes en una mezcla. Por lo general, el analito de interés se separa de otras moléculas como resultado de las diferencias en las velocidades a las que las moléculas individuales de la mezcla migran a través de una fase sólida estacionaria bajo la influencia de una fase móvil, o en procesos de unión y elución. Los ejemplos no limitantes incluyen resinas de intercambio catiónico, resinas de afinidad, resinas de intercambio aniónico, membranas de intercambio aniónico, resinas de interacción hidrófoba y monolitos de intercambio iónico.

El término "separación por afinidad" o "purificación por afinidad", como se usa en la presente descripción, se refiere a cualquier técnica de purificación o ensayo que implica poner en contacto una muestra que contiene un analito objetivo (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc tal como una inmunoglobulina) con un medio de afinidad (por ejemplo, un soporte sólido que lleva en él un ligando afinidad conocido para unir el analito tal como, por ejemplo, proteína a o una variante de esta) que se conoce que se une el analito objetivo.

Los términos "cromatografía de afinidad" y "cromatografía de afinidad de proteínas", como se usan indistintamente en la presente descripción, se refieren a una técnica de separación de proteínas en la que una proteína objetivo (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc de interés o anticuerpo) se une específicamente a un ligando que es específico para la proteína objetivo. Tal ligando se denomina generalmente ligando bioespecífico. En algunas modalidades, el ligando bioespecífico (por ejemplo, la Proteína A o una variante funcional de la misma) se une covalentemente a un material cromatográfico en fase sólida y es accesible a la proteína objetivo en solución cuando la solución se pone en contacto con el material cromatográfico en fase sólida. La proteína objetivo generalmente retiene su afinidad de unión específica por el ligando bioespecífico durante las etapas cromatográficas, mientras que otros solutos y/o proteínas en la mezcla no se unen de manera apreciable o específica al ligando. La unión de la proteína objetivo al ligando inmovilizado permite que las proteínas contaminantes o las impurezas proteicas pasen a través del medio cromatográfico mientras que la proteína objetivo permanece unida específicamente al ligando inmovilizado en el material en fase sólida. La proteína objetivo específicamente unida se elimina después en forma activa del ligando inmovilizado en condiciones adecuadas (por ejemplo, pH bajo, pH alto, sal alta, ligando competidor, etc.), y se pasa a través de la columna cromatográfica con el tampón de elución, libre de proteínas contaminantes o impurezas proteicas que anteriormente se les permitió pasar a través de la columna. Cualquier componente puede usarse como un ligando para purificar su proteína de unión específica respectiva, por ejemplo, anticuerpo. Sin embargo, en varios métodos de acuerdo con la presente invención, la proteína A se usa como un ligando para una proteína objetivo que contiene una región Fc. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente las condiciones para la elución del ligando bioespecífico (por ejemplo, la Proteína A) de la proteína objetivo (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc). En algunas modalidades, la Proteína G o la Proteína L o una variante funcional de esta puede usarse como un ligando bioespecífico. En algunas modalidades, se usa un ligando bioespecífico tal como la proteína A en un intervalo de pH de 5-9 para unirse a una proteína que contiene una región Fc, lavar o reequilibrar el conjugado de ligando bioespecífico / proteína objetivo, seguido de la elución con un tampón que tiene pH aproximadamente o inferior a 4 que contiene al menos una sal.

Los términos "intercambio iónico" y "cromatografía de intercambio iónico" se refieren al proceso cromatográfico en el cual un soluto o analito de interés (por ejemplo, una proteína objetivo que contiene una región Fc) en una mezcla interactúa con un compuesto cargado unido (tal como mediante unión covalente) a un material de intercambio iónico en fase sólida, de manera que el soluto o analito de interés interactúa de manera no específica con el compuesto cargado más o menos que las impurezas o contaminantes del soluto en la mezcla. Los solutos contaminantes en la mezcla eluyen a partir de una columna del material de intercambio iónico más rápido o más lento que el soluto de interés o están unidos o excluidos de la resina con respecto al soluto de interés. La "cromatografía de intercambio iónico" incluye específicamente el intercambio catiónico, el intercambio aniónico y la cromatografía de intercambio iónico en modo mixto. Por ejemplo, la cromatografía de intercambio catiónico puede unir la molécula objetivo (por ejemplo, una proteína objetivo que contiene una región Fc) seguida de elución (cromatografía de intercambio catiónico de unión y elución o "CIEX") o puede unir predominantemente las impurezas mientras que la molécula objetivo "fluye continuamente" a través de la columna (cromatografía de flujo continuo de intercambio catiónico FT-CIEX). La cromatografía de intercambio aniónico puede unir la molécula objetivo (por ejemplo, una proteína objetivo que contiene una región Fc) seguida de elución o puede unir predominantemente las impurezas mientras la molécula objetivo "fluye continuamente" a través de la columna. En algunas modalidades y como se demuestra en los Ejemplos expuestos en la presente descripción, la etapa de cromatografía de intercambio aniónico se realiza en un modo de flujo continuo.

La frase "material de intercambio iónico" se refiere a una fase sólida que está cargada negativamente (es decir, una resina de intercambio catiónico) o cargada positivamente (es decir, una resina de intercambio aniónico). La carga puede proporcionarse al unir uno o más ligandos cargados a la fase sólida, por ejemplo, mediante enlace covalente. Alternativamente, o además, la carga puede ser una propiedad inherente de la fase sólida (por ejemplo, como es el caso de la sílice, que tiene una carga general negativa).

Una "resina de intercambio catiónico" se refiere a una fase sólida que está cargada negativamente y que, por lo tanto, tiene cationes libres para el intercambio con cationes en una solución acuosa que pasa a través de la fase sólida. Un ligando cargado negativamente unido a la fase sólida para formar la resina de intercambio catiónico puede ser, por ejemplo, un carboxilato o sulfonato. Las resinas de intercambio catiónico disponibles comercialmente incluyen carboximetilcelulosa, sulfopropilo (SP) inmovilizado en agarosa (por ejemplo, SP-SEPHAROSE FAST FLOW™ o Sp -SEPHAROSE HIGH Pe Rf Or m A n Ce ™, de Pharmacia) y sulfonilo inmovilizado en agarosa (por ejemplo, S-SEPHAROSE FAST FLOW™ de GE Pharmacia).

Una "resina de intercambio iónico de modo mixto" se refiere a una fase sólida que se modifica covalentemente con restos catiónicos, aniónicos e hidrófobos. Una resina de intercambio iónico de modo mixto disponible comercialmente es BAKERBOND ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, N.J.) que contiene grupos de intercambio catiónico débiles, una baja concentración de grupos de intercambio aniónico y ligandos hidrófobos unidos a una matriz de soporte en fase sólida de gel de sílice.

El término "resina de intercambio aniónico" se usa en la presente descripción para referirse a una fase sólida que está cargada positivamente, por ejemplo, que tiene uno o más ligandos cargados positivamente, tales como grupos amino cuaternarios, unidos a la misma. Las resinas de intercambio aniónico disponibles comercialmente incluyen celulosa DEAE, QAE SEPHADEX™ y FAST Q SEPHAROSE™ (Pharmacia).

Los términos "Proteína A" y "ProA" se usan indistintamente en la presente descripción y abarcan la Proteína A recuperada de una fuente nativa de esta, la Proteína A producida sintéticamente (por ejemplo, mediante síntesis de péptidos o mediante técnicas recombinantes), y variantes de esta que retienen la capacidad de unirse a proteínas que tienen una región CH²/CH³ , tal como una región Fc. La proteína A puede adquirirse comercialmente de Repligen, Pharmacia y Fermatech. La proteína A generalmente se inmoviliza en un material de soporte en fase sólida. El término "ProA" también se refiere a una resina o columna de cromatografía de afinidad que contiene una matriz cromatográfica de soporte sólido a la que está unida covalentemente la Proteína A.

Un derivado, fragmento o variante funcional de la Proteína A usada en los métodos de acuerdo con la presente invención puede caracterizarse por una constante de unión de al menos K=10-8 M, y preferentemente K=10-9 M, para la región Fc de IgG2a de ratón o IgG1 humana. Una interacción que cumple con dicho valor para la constante de unión se denomina "unión de alta afinidad" en el presente contexto. Preferentemente, tal derivado funcional o variante de la Proteína A comprende al menos parte de un dominio funcional de unión a IgG de la Proteína A de tipo silvestre, seleccionada de los dominios naturales E, D, A, B, C o mutantes modificados por ingeniería genética de esta que han retenido la funcionalidad de unión a IgG.

Además, los derivados de Proteína A o las variantes modificadas genéticamente para permitir una unión de un solo punto pueden usarse, además, en la etapa de cromatografía de afinidad en los métodos reivindicados. La unión de un solo punto generalmente significa que el resto de proteína se une a través de un enlace covalente único a un material de soporte cromatográfico de la cromatografía de afinidad con Proteína A. Tal unión a un solo punto puede producirse, además, mediante el uso de residuos adecuadamente reactivos que se colocan en una posición expuesta de aminoácidos, concretamente en un bucle, cerca del extremo N o C o en cualquier otro lugar en la circunferencia externa del pliegue proteico. Los grupos reactivos adecuados son, por ejemplo, funciones sulfhidrilo o amino.

Una "proteína A contaminante" de acuerdo con la presente invención es cualquier tipo de descendiente funcional de unión a IgG de una proteína A o un derivado funcional de esta como se definió anteriormente que se obtiene al eluir el anticuerpo unido de una columna de cromatografía de afinidad con Proteína A. Tal especie de proteína A contaminante puede resultar, por ejemplo, de la hidrólisis de enlaces peptídicos que es muy probable que ocurra por medio de la acción enzimática, en particular en la fabricación industrial. La cromatografía con proteína A se aplica como una etapa inicial en el procesamiento posterior cuando la solución de producto fresco, purificada crudamente, todavía alberga una actividad proteasa considerable. Es probable que las células moribundas en el caldo de cultivo celular o las células interrumpidas en las etapas iniciales de centrifugación o filtración hayan liberado proteasas; para fines regulatorios, la suplementación del caldo de cultivo celular con inhibidores de proteasa antes o en el curso del procesamiento posterior generalmente no se logra, en contraste con la práctica de investigación bioquímica. Ejemplos son el cloruro de fenil-metil-sulfonilo (PMSF) o el ácido e-caproico. Tales agentes químicos no son deseables como aditivos en la producción de productos biofarmacéuticos. Además, es posible que los derivados o fragmentos funcionales recombinantes de la Proteína A sean menos resistentes a la proteasa que la Proteína A de tipo silvestre, dependiendo de la estructura terciaria del plegamiento proteico. Los segmentos de aminoácidos que unen dominios de unión de IgG individuales pueden quedar expuestos una vez que se reduce el número total de dominios de unión. Los contactos entre dominios pueden contribuir a la estabilidad del plegamiento de dominios. También puede ser que la unión del anticuerpo por la Proteína A o dichos derivados funcionales de esta influya o facilite la susceptibilidad a la acción de la proteasa, debido a los cambios conformacionales inducidos por la unión del anticuerpo. Nuevamente, la Proteína A de tipo silvestre o de longitud completa o fragmentos funcionales y diseñados de esta podrían comportarse de manera diferente.

Al "unir" una molécula a una resina de cromatografía se entiende exponer la molécula a la resina de cromatografía en condiciones apropiadas (pH/conductividad) de manera que la molécula se inmovilice reversiblemente en o sobre la resina de cromatografía en virtud de interacciones ligando-proteína. Los ejemplos no limitantes incluyen interacciones iónicas entre la molécula y un grupo cargado o grupos cargados del material de intercambio iónico y una interacción bioespecífica entre la Proteína A y una inmunoglobulina.

El término "unión específica" como se usa en la presente descripción, tal como para describir interacciones entre una proteína objetivo (por ejemplo, una proteína que contiene una región Fc) y un ligando unido a un soporte sólido (por ejemplo, Proteína A unida a una matriz o resina en fase sólida), se refiere a la unión generalmente reversible de una proteína de interés a un ligando a través de los efectos combinados de la complementariedad espacial de las estructuras de proteína y ligando en un sitio de unión acoplado con fuerzas electrostáticas, enlaces de hidrógeno, fuerzas hidrófobas y/o fuerzas de van der Waals en el sitio de unión. Generalmente, cuanto mayor sea la complementariedad espacial y más fuertes sean las otras fuerzas en el sitio de unión, mayor será la especificidad de unión de una proteína para su ligando respectivo. Los ejemplos no limitantes de unión específica incluyen unión de anticuerpo-antígeno, unión de enzimasustrato, unión de enzima-cofactor, quelación de iones metálicos, unión de ADN-proteína de unión de ADN, interacciones de proteína-proteína reguladora, y similares. Idealmente, en la cromatografía de afinidad se produce una unión específica con una afinidad de aproximadamente 10-4 a 10-8 M en solución libre.

El término "unión no específica" como se usa en la presente descripción, tal como para describir las interacciones entre una molécula de interés (por ejemplo, una proteína objetivo se ha descrito en la presente descripción) y un ligando u otro compuesto unido a un soporte sólido (por ejemplo, Proteína A unida a una matriz o resina de fase sólida), se refiere a la unión de una proteína de interés al ligando o compuesto en un soporte sólido a través de fuerzas electrostáticas, enlaces de hidrógeno, fuerzas hidrófobas y/o fuerzas de van der Waals en un sitio de interacción, pero que carece de complementariedad estructural que potencia los efectos de las fuerzas no estructurales. Los ejemplos de interacciones no específicas incluyen, pero no se limitan a, fuerzas electrostáticas, hidrofóbicas y de Van der Waals, así como enlaces de hidrógeno.

Una "sal" es un compuesto formado por la interacción de un ácido y una base. Las diversas sales que pueden usarse en los tampones descritos en la presente descripción incluyen, pero sin limitarse a, acetato (por ejemplo, acetato de sodio), citrato (por ejemplo, citrato de sodio), cloruro (por ejemplo, cloruro de sodio), sulfato (por ejemplo, sulfato de sodio) o una sal de potasio.

Como se usa en la presente descripción, el término "disolvente" se refiere a una sustancia líquida capaz de disolver o dispersar una o más sustancias para proporcionar una disolución. Los disolventes incluyen disolventes acuosos y orgánicos, donde los disolventes orgánicos útiles incluyen un disolvente apolar, etanol, metanol, isopropanol, acetonitrilo, hexilenglicol, propilenglicol y 2,2-tiodiglicol.

El término "detergente" se refiere a tensioactivos iónicos y no iónicos tales como polisorbatos (por ejemplo, polisorbatos 20 u 80); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188); Tritón; dodecil sulfato de sodio (SDS); laurel sulfato de sodio; octilglicósido de sodio; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sulfobetaína; lauril-, miristil-, linoleil- o estearil-sarcosina; linoleil-, miristil- o cetil-betaína; lauroamidopropil-, cocamidopropil-, linoleamidopropil-, miristamidopropil-, palmidopropil- o isoestearamidopropil-betaína (por ejemplo, lauroamidopropilo); miristamidopropil-, palmidopropil- o isostearamidopropildimetil-amina; metil cocoil sodio- o metil oleil-taurato de disodio; y la serie MONAQuAt ™ (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), Detergentes útiles es un polisorbato, tal como polisorbato 20 (TWEEN 20®.) o polisorbato 80 (TWEEN 80®.).

El término "polímero", como se usa en la presente descripción, se refiere a una molécula formada mediante enlaces covalentes de dos o más monómeros, donde los monómeros no son residuos de aminoácidos. Los ejemplos de polímeros incluyen polietilenglicol, polipropilglicol y copolímeros (porejemplo, Pluronics, PF68 etc). Un polímero útil es polietilenglicol (PEG), por ejemplo, PEG 400 y PEG 8000.

Por "fase sólida" o "sustratos porosos" o "matrices base" se entiende una matriz no acuosa a la que pueden adherirse uno o más ligandos cargados. La fase sólida puede ser una columna de purificación, una fase discontinua de partículas discretas, una membrana, monolito o filtro, etc. Los ejemplos de materiales para formar la fase sólida incluyen polisacáridos (tales como agarosa y celulosa); y otras matrices mecánicamente estables tales como sílice (por ejemplo, vidrio de poro controlado), poli(estirenivinil)benceno, poliacrilamida, partículas cerámicas y derivados de cualquiera de los anteriores.

Un "tampón" es una solución que resiste los cambios en el pH por la acción de sus componentes conjugados ácido-base. Varios tampones que pueden emplearse dependiendo, por ejemplo, del pH deseado del tampón se describen en Buffers. A Guide for the Preparation and Use of Buffers in Biological Systems, Gueffroy, D., ed. Calbiochem Corporation (1975). En algunas etapas de los métodos de la invención reivindicada, un tampón tiene un pH en el intervalo de 2,0 a 4,0, o de 2,8 a 3,8. En otras etapas de la invención reivindicada, un tampón tiene un pH en el intervalo de 5,0 a 9,0. En otras etapas de la invención reivindicada, un tampón tiene un pH en el intervalo de 4,0 a 6,5. En otras etapas de los métodos de la invención reivindicada, un tampón tiene un pH inferior a 4,0. Los ejemplos no limitantes de tampones que controlarán el pH en este intervalo incluyen tampones MES, MOPS, MOPSO, Tris, HEPES, fosfato, acetato, citrato, succinato y de amonio, así como combinaciones de estos.

El término "tampón de intercambio catiónico" se refiere a tampones de equilibrio con un pH y una conductividad tales que la molécula objetivo (por ejemplo, inmunoglobulina) se unirá al material de intercambio catiónico.

Un "tampón de carga" es un tampón que se usa para cargar la muestra o composición que comprende la molécula objetivo de interés (por ejemplo, una proteína objetivo que contiene una región Fc) y una o más impurezas en una columna de cromatografía (por ejemplo, una columna de afinidad o una columna de intercambio iónico). El tampón de carga tiene una conductividad y/o pH tal que la molécula de interés (y generalmente una o más impurezas) está unida a la resina de cromatografía o tal que la proteína de interés fluye a través de la columna mientras las impurezas se unen a la resina.

Se usa un "tampón intermedio" para eluir una o más impurezas de la resina de cromatografía, antes de eluir la molécula de polipéptido de interés. La conductividad y/o el pH del tampón intermedio es/son tales que una o más impurezas se eluyen de la resina de intercambio iónico, pero no cantidades significativas del polipéptido de interés.

La expresión "tampón de lavado" o "tampón de equilibrio" se usan indistintamente en la presente descripción, se refiere a un tampón usado para lavar o reequilibrar la resina de cromatografía antes de eluir la molécula de polipéptido de interés. En algunos casos, el tampón de lavado y el tampón de carga pueden ser iguales.

Se usa un "tampón de elución" para eluir la proteína objetivo de la fase sólida. La conductividad y/o el pH del tampón de elución es/son generalmente tales que la proteína objetivo se eluye de la resina de cromatografía.

Puede usarse un "tampón de regeneración" para regenerar la resina de cromatografía de manera que pueda reutilizarse. El tampón de regeneración tiene una conductividad y/o pH según sea necesario para eliminar sustancialmente todas las impurezas y la proteína objetivo de la resina de cromatografía.

El término "conductividad" se refiere a la capacidad de una solución acuosa para conducir una corriente eléctrica entre dos electrodos. En solución, la corriente fluye por transporte de iones. Por lo tanto, con una cantidad creciente de iones presentes en la solución acuosa, la solución tendrá una conductividad más alta. La unidad de medida de la conductividad es miliSiemens por centímetro (mS/cm o mS), y puede medirse mediante el uso de un medidor de conductividad vendido, por ejemplo, por Orion. La conductividad de una solución puede alterarse cambiando la concentración de iones en ella. Por ejemplo, la concentración de un agente tamponador y/o la concentración de una sal (por ejemplo, NaCl o KCl) en la solución puede alterarse para lograr la conductividad deseada. Preferentemente, la concentración de sal de los diversos tampones se modifica para lograr la conductividad deseada como en los Ejemplos más adelante.

El término "pI" o "punto isoeléctrico" de un polipéptido se refiere al pH al cual la carga positiva del polipéptido equilibra su carga negativa. El pI puede calcularse a partir de la carga neta de los residuos de aminoácidos o residuos de ácido siálico de los carbohidratos unidos del polipéptido, o puede determinarse mediante focalización isoeléctrica.

Por "lavado" de un medio de cromatografía se entiende que se pasa un tampón apropiado a través o sobre los medios.

"Eluir" una molécula (por ejemplo, un polipéptido de interés o una impureza) de la resina de cromatografía se entiende eliminar la molécula de la misma alterando las condiciones de la solución de manera que el tampón compita con la molécula de interés por los sitios de ligando en la resina de cromatografía. Un ejemplo no limitante es eluir una molécula de una resina de intercambio iónico alterando la fuerza iónica del tampón que rodea el material de intercambio iónico de manera que el tampón compita con la molécula por los sitios cargados en el material de intercambio iónico.

Como se usa en la presente descripción, "filtrado" se refiere a esa porción de una muestra que pasa a través de la membrana de filtración.

Como se usa en la presente descripción, "fracción retenida" se refiere a esa porción de una muestra que es retenida sustancialmente por la membrana de filtración.

La expresión "inactivación de virus", "eliminación de virus" o "reducción de virus", como se usa indistintamente en la presente descripción, se refiere a cualquier proceso que puede hacer que un virus sea incapaz de infectar una célula o inhibir la función del virus a través de un medio físico-químico. Los métodos típicos de inactivación de virus incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con pH bajo (por ejemplo, por debajo de pH 4,5, por debajo de 4,0 o por debajo de 3,8), tratamiento térmico, tratamiento con surfactantes y radiación (por ejemplo, exposición a la luz ultravioleta). En algunas modalidades, los métodos de inactivación de virus están dirigidos contra los retrovirus. En una modalidad particular, se usan condiciones de pH bajo para la inactivación del virus ya que tales condiciones típicamente interrumpen la envoltura lipídica del virus, inactivando así el virus.

El término "condición de pH bajo", como se usa en la presente descripción, se refiere a una propiedad de una solución acuosa o un tampón, donde el pH de la solución o tampón está por debajo de las condiciones normales de funcionamiento, que típicamente se usan para la carga de medios de intercambio catiónico (CIEX) de una muestra que contiene una proteína que contiene una región Fc (por ejemplo, anticuerpos monoclonales o MAb). Por ejemplo, las condiciones de carga de CIEX típicas están por encima de pH 4,5 y generalmente pH 5 a 6. En los métodos de acuerdo con la presente invención, puede usarse una condición de pH bajo, por ejemplo, un pH por debajo de 4,5.

La expresión "etapa de preelución" se refiere a la penúltima etapa de cromatografía antes de la elución, donde la molécula objetivo permanece unida a la columna, pero la mezcla del tampón durante la carga en la siguiente columna no afecta negativamente el rendimiento objetivo o la pureza objetivo. Los ejemplos no limitantes incluyen equilibrar una columna de Proteína A cargada con una proteína que contiene Fc en un tampón adecuado para la carga de la columna de intercambio catiónico tal como acetato de sodio pH 5,4 o citrato de sodio pH 5,0, después la elución de la columna con acetato de sodio pH 3 sobre una columna de intercambio catiónico.

"Filtración de flujo tangencial" o "TFF" o "filtración de flujo cruzado" se refiere a un proceso de filtración en el que la mezcla de muestra circula a través de la parte superior de la membrana, mientras que la presión aplicada provoca que ciertos solutos y moléculas pequeñas pasen a través de la membrana. Típicamente, la solución fluye paralela a la membrana del filtro. Un diferencial de presión a través de la membrana provoca que fluyan fluidos y solutos filtrables a través del filtro. Esto puede llevarse a cabo como un proceso de flujo continuo, ya que la solución se pasa repetidamente sobre la membrana mientras que el fluido que pasa a través del filtro se extrae continuamente en un circuito separado.

"Filtración de flujo tangencial de alto rendimiento" o "HPTFF" se refiere a TFF realizado a un flujo entre 5 % y 100 % de la presión transmembrana en la curva de flujo frente a presión transmembrana (ver, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos núm. 5,256,694; patente de los Estados Unidos núm. 4,490,937 y la patente de los Estados Unidos núm.

6,054,051).

"Distribución del tamaño de poro" se refiere, básicamente, al número de poros que tienen un radio real, R, cerca de algún radio teórico, r, expresado como la función de densidad de probabilidad (ver, Zeman, L. J. y Zydney, A. L., más arriba, páginas 299-301). A medida que aumenta la desviación estándar de los radios de poro reales, aumenta la distribución del tamaño de poro. La distribución estrecha del tamaño de poro resulta de una reducción en la desviación estándar de los poros a partir del valor teórico. Esto se logra, por ejemplo, cuando los tamaños de algunos de los poros más grandes se reducen mediante la adición de compuesto cargado en los poros más grandes de una membrana cargada. El principio de intrusión de poro líquido-líquido es útil para medir la distribución del tamaño de poro (ver R. van Reis y A. L. Zydney, más arriba, página 2201). De acuerdo con este principio, dos líquidos altamente inmiscibles, tales como las soluciones de una sal de sulfato y un poli(etilenglicol) se ponen en contacto mediante la mezcla para alcanzar el reparto de equilibrio. La membrana que se va a probar se ceba con uno de los líquidos para que se llenen todos los poros. Después de drenar los canales de alimentación, el segundo fluido se introduce en el sistema. A continuación, el primer fluido es desplazado fuera de los poros por el segundo fluido, y la tasa de flujo se mide en función de la presión transmembrana. Los datos resultantes proporcionan información sobre la distribución del tamaño de poro y pueden correlacionarse con el límite de peso molecular nominal (ver R. van Reis y A. L. Zydney, más arriba, página 2201).

Los ejemplos de "grupos funcionales" incluyen, pero no se limitan a, grupos de intercambio iónico, grupos de bioafinidad o bioespecíficos, grupos hidrófobos, grupos de interacción tiofílica, quelatos o grupos quelantes, grupos que tienen las llamadas interacciones pi-pi con compuestos objetivo, grupos de formación de enlaces de hidrógeno, y grupos hidrófilos.

Los ejemplos de "ligandos" incluyen, pero no se limitan a, grupos de intercambio iónico, grupos de interacciones hidrófobas, grupos de interacciones hidrófilas, grupos de interacciones tiofílicas, grupos de afinidad metálica, grupos de afinidad, grupos de bioafinidad y grupos de modo mixto (combinaciones de los mencionados anteriormente). Algunos ligandos preferidos que pueden usarse en la presente descripción incluyen, pero no se limitan a, grupos de intercambio catiónico fuertes, tales como sulfopropilo, ácido sulfónico; grupos de intercambio aniónico fuertes, tales como cloruro de trimetilamonio; grupos de intercambio catiónico débiles, tales como ácido carboxílico; grupos de intercambio aniónico débiles, tales como N,N dietilamino o DEAE; grupos de interacciones hidrófobas, tales como fenilo, butilo, propilo, hexilo; y grupos de afinidad, tales como la proteína A, la proteína G y la proteína L.

II. Etapa de cromatografía de afinidad

En diversas modalidades de acuerdo con la invención reivindicada, los métodos de la invención abarcan el uso de una resina de afinidad basada en Proteína A para su uso en la etapa de cromatografía de afinidad. La proteína A puede ser la Proteína A nativa (de Staph. Aureus), Proteína A recombinante o variante funcional de esta. Los ejemplos de resinas de Proteína A que pueden usarse en los procesos reivindicados incluyen: ProSep-vA HC, ProSep Ultra Plus, MabSelect, MabSelect SuRe y otras resinas de afinidad comercialmente disponibles. Se podrían utilizar otros ligandos/resinas de afinidad en los métodos descritos en la presente descripción, tales como, por ejemplo, la Proteína G y otras proteínas de unión a Fc (por ejemplo, anticuerpos de camélidos de cadena sencilla).

En los métodos reivindicados, siguiendo la etapa de captura de afinidad, la proteína objetivo se eluye preferentemente mediante el uso de un pH de 2,0 a 4,0, y preferentemente un pH de 2,8 a 3,8. El volumen del grupo de elución debe ser un volumen lo suficientemente grande como para eliminar la proteína objetivo de la columna de afinidad y cargar con éxito en la columna de intercambio de cationes en línea posterior en el proceso. Estos volúmenes variarán dependiendo del tamaño relativo de las columnas de afinidad y de intercambio catiónico. Por ejemplo, si las columnas de afinidad y de intercambio catiónico son del mismo tamaño, entonces el grupo de elución se eluiría preferentemente en 1 a 5 volúmenes de columna (CV), con la máxima preferencia 1,5 a 4 CV. Los ejemplos de tampones de elución de afinidad son ácido acético, ácido cítrico, fosfato y glicina. Estos tampones de elución de afinidad pueden modificarse con sales o aditivos adicionales para controlar la conductividad o mejorar la recuperación del producto. Por ejemplo, los componentes adicionales pueden contener aditivos para reducir la formación de agregados. Los ejemplos de aditivos incluyen, pero no se limitan a, arginina, hexilenglicol y polietilenglicol.

En algunas modalidades, una etapa de captura por afinidad proporciona una buena capacidad de carga, recuperación del producto y eliminación de impurezas para la(s) etapa(s) posterior (es) de intercambio iónico.

III. Etapas de cromatografía de intercambio iónico

En el caso de los métodos descritos en la presente descripción, el grupo de elución de la etapa de afinidad se carga directamente en la columna de intercambio catiónico, eliminando así el uso de un depósito colector/etapa de intercambio de tampón. La columna de intercambio catiónico puede equilibrarse con un tampón que varía de pH 3,0 a 7,0, con conductividades que varían de 2 a 20 mS; y con la máxima preferencia pH de 4,5 a 6 que tiene conductividades de 2 a 16 mS. La columna puede cargarse con proteína a 5 - 120 gramos de proteína objetivo por litro de resina (g/L) en un solo ciclo de elución de la columna de afinidad o 5 - 120 g/L a través de múltiples ciclos de elución de la columna de afinidad. En algunas modalidades, la carga total en la columna de intercambio catiónico es 20 - 80 g/L o 40 - 60 g/L.

La columna de intercambio catiónico puede cargarse con 1 o más ciclos desde la etapa de captura por afinidad reequilibrando la columna de intercambio catiónico a un pH mayor que el pH de elución por afinidad después de la carga.

Para validar la eliminación de virus en el proceso general, la columna CIEX puede intercambiarse en un tampón con un pH menor que 4,0 (por ejemplo, < 3,8) para inactivación viral durante 10-60 minutos o 15 - 45 minutos después de la carga del producto. Alternativamente, la fracción de flujo continuo de la columna podría validarse para la eliminación del virus al pH de carga, lo que da como resultado una eliminación acumulativa del virus tanto para la fracción de flujo continuo del virus como para la inactivación viral por pH reducido.

Se ha observado que la exposición de ciertas proteínas objetivo a condiciones de pH bajo durante o después de la carga o unión de proteínas a una columna puede influir en la recuperación general de las proteínas objetivo. La invención reivindicada proporciona métodos mejorados de purificación que evitan la pérdida de recuperación al aumentar la conductividad de ciertas etapas del proceso. Por ejemplo, la recuperación de la proteína objetivo de la etapa de intercambio catiónico (CIEX) puede verse influenciada por las etapas con tampón de pH bajo durante el proceso de purificación tal como, por ejemplo, la etapa de elución de la proteína A y las etapas de inactivación del virus, que frecuentemente se llevan a cabo a pH bajo. En ciertas modalidades de acuerdo con los métodos reivindicados, se proporciona un proceso de purificación mejorado, que emplea un aumento en la conductividad de un tampón de pH bajo, mejorando así la recuperación general de la proteína objetivo. Alternativamente, el pH de un tampón de pH bajo puede aumentar ligeramente (por ejemplo, mediante el uso de un pH 4,5 frente a un pH 3,5).

La conductividad de un tampón de pH bajo puede aumentarse, por ejemplo, mediante la adición de sal al tampón de elución de Proteína A o al tampón de inactivación de virus. La sal que puede usarse dependerá del pH del tampón y puede ser fácilmente identificada por un experto en la técnica. En algunas modalidades, la cantidad de sal añadida varía de 25 mM a 500 mM y de 100 mM a 250 mM.

La elución de la columna de intercambio catiónico puede lograrse mediante el uso de cualquiera de las etapas descritas en la presente descripción, así como también aquellas que son conocidas en la técnica o aquellas que pueden ser fácilmente determinadas por un experto en la técnica. Por ejemplo, en algunas modalidades, la elución de la columna de intercambio catiónico puede lograrse mediante el uso de una o más etapas de pH, donde el eluato se carga directamente en un medio de intercambio aniónico en un modo de flujo continuo. El cambio de pH de elución también puede incluir cambios en el tipo de tampón, la concentración de tampón y la concentración de sal. El intervalo preferido de pH de elución para la etapa de intercambio catiónico descrita en la presente descripción es de aproximadamente 6,0 a 9,0, o de aproximadamente 7,0 a 8,0.

La elución de la columna de intercambio catiónico también puede lograrse mediante el uso de solo un aumento en la conductividad del tampón. El intervalo preferido de conductividades de elución depende del pH y del punto isoeléctrico (pI) de las moléculas objetivo. En general, la elución es eficaz con cambios de conductividad que varían de 4 mS a 50 mS, o de 8 mS a 30 mS. La elución de la columna de intercambio catiónico debe optimizarse para tener en cuenta el rendimiento de la etapa de flujo continuo de intercambio aniónico posterior a través de la etapa. Por ejemplo, en algunos casos puede lograrse una elución eficaz de la etapa de intercambio catiónico, por ejemplo, mediante el uso de un pH más alto con baja conductividad, como, por ejemplo, un tampón de 6 mS a pH 7,0, o mediante el uso de un pH más bajo con mayor conductividad, tal como, por ejemplo, un tampón de 15 mS a pH 5,5. En estos casos, el rendimiento de la etapa de flujo continuo de intercambio aniónico debe explorarse con ambas condiciones y el rendimiento posterior de la etapa de intercambio catiónico determina el método de elución preferido para el intercambio catiónico.

En algunas modalidades, un método de acuerdo con la presente invención incluye una etapa de filtración de virus entre y después de cualquiera de las etapas del método, según sea apropiado. En algunas modalidades, la etapa de filtración de virus emplea un prefiltro, que puede ser de cualquier formato, incluyendo, pero no se limita a, una membrana, filtro de profundidad, columna de cromatografía o combinaciones de estos. El proceso puede incluir clarificación adicional o filtración profunda antes de la captura por afinidad mediante el uso de una membrana, filtro de profundidad, columna de cromatografía o combinaciones de estos. Pueden añadirse etapas de pulido adicionales después del intercambio aniónico, incluidos, pero no se limitan a, HPTFF, FT-HIC, HIC y otros.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos.

Ejemplos

Ejemplo 1: Comparación de las capacidades de unión de las resinas para la carga con pH bajo

Se compararon tres medios de intercambio catiónico para la capacidad dinámica en las condiciones enumeradas en la Tabla 1 (condiciones de elución típicas para la cromatografía de afinidad con Proteína A) mediante el uso del siguiente método.

Se usaron medios de intercambio catiónico ilustrativos que tenían las siguientes características: resina de polimetacrilato mono-dispersa porosa con un tamaño medio de partícula de 60 llm, tamaño de poro entre 60-80 nm, una densidad de ligando "S" entre 170-270|_imol/mL de resina y que tiene propiedades de flujo de presión de manera que una altura de lecho de 20 cm puede alcanzar >400 cm/hr a 2 bar y la capacidad de IgG es > 50 g/L a 3 minutos de tiempo de residencia, comercialmente ProRes-S™ de Millipore Corporation, Fractogel-S® de EMD Merck y SP-Sepharose Fast Flow® de GE Healthcare se empacaron en columnas Omnifit (0,66 cm de diámetro, 7 cm de altura del lecho) (Bio Chem Valve, Inc., Boontown, NJ) y se sometieron a pruebas para determinar la capacidad de unión dinámica de la gammaglobulina humana policlonal (IgG). Las columnas se equilibraron con el pH y la conductividad en la Tabla 1, la conductividad se ajustó con cloruro de sodio según fue necesario. La proteína (5 g/L) se cargó en la columna con la proteína en el mismo tampón que el tampón de equilibrio. La capacidad a un avance del 5 % a una tasa de flujo de carga consistente con un tiempo de residencia de 3 minutos se usó para caracterizar la capacidad de unión dinámica.

Tabla 1. Resumen de las capacidades de unión para CIEX a pH bajo.

Ejemplo 2: Demostración de las etapas de intercambio iónico mediante el uso de una alimentación modelo en condiciones de carga directa

En un experimento representativo, se usó una alimentación de proteína modelo para la demostración de la recuperación y purificación de proteína después de la carga directa de una columna de intercambio catiónico seguida de una etapa de intercambio aniónico.

Se diseñó un grupo de elución de Proteína A modelo mediante el uso de la siguiente mezcla: tampón de acetato de sodio 50 mM pH 3,5, 2,5 g/L de IgG policlonal, n-Proteína A 50-100 ppm y 10 % en peso de HCCF de una línea celular CHO no expresante. Una columna Omnifit de 7 cm x 0,66 cm empaquetada con ProRes-S™ se equilibró con tampón de acetato 50 mM a pH 3,5 (5 volúmenes de columna, CV). La mezcla del grupo de elución de proteína A modelo (~ 20 mL) se cargó en la columna ProRes-S™ a 0,33 CV/min. Después de cargar la mezcla de proteínas, la resina se equilibró con 3CV de tampón de citrato 100 mM a pH 5. Después del equilibrio a pH 5, la columna se eluyó posteriormente con una serie de etapas de pH comenzando con Tris 50 mM, pH 8,0 con NaCl 0,3 M para 2CV, seguido de Tris 50 mM, pH 8,0 con NaCl 0,4 M para 2CV y Tris 50 mM, pH 8,0 con NaCl 0,5 M para 2CV. Los volúmenes de elución se cargaron directamente en una columna de resina de intercambio aniónico ilustrativa (porejemplo, medios base ProRes-S™ modificados con química de intercambio aniónico, como se describe en la publicación de patente de Estados Unidos núm. 20090050566), preequilibrada con Tris 50 mM, pH 8,0 con NaCl 0,3 M y establecida en línea y aguas abajo de la columna de intercambio catiónico descrita anteriormente. La fracción de flujo continuo se recogió en fracciones de 2CV correspondientes a las etapas de elución de intercambio catiónico. Las fracciones de flujo continuo se agruparon de manera apropiada para formar un "grupo posterior a la cromatografía" y se analizaron las impurezas principales, cuyos resultados se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2. Purificación por intercambio iónico (pulido) del grupo de elución de Proteína A modelo

Ejemplo 3: Un proceso en modo discontinuo para purificar una proteína que contiene una región Fc

En un experimento representativo, se diseñó un proceso en modo discontinuo para purificar un anticuerpo monoclonal, que es una proteína que contiene una región Fc ilustrativa, donde el proceso usa una resina de Proteína A, una resina de intercambio catiónico con carga a diferentes condiciones de pH y un intercambio aniónico. El proceso se describe a continuación. Este experimento demostró condiciones que permitirían la carga directa de las etapas de intercambio iónico después de la captura por afinidad sin la necesidad de un depósito colector o una etapa de intercambio de tampón. Una línea de expresión de IgG de células de ovario de hámster chino (CHO) se incubó en un biorreactor agitado durante aproximadamente 10 días. Las células se eliminaron mediante el uso de un filtro de profundidad primario (Millipore DOHC) seguido de una clarificación secundaria con un segundo filtro de profundidad (Millipore XOHC). La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso del siguiente procedimiento:

La etapa de afinidad empleó el medio de Proteína A ProSep® Ultra Plus (Millipore Corporation) y las Dimensiones de columna fueron las siguientes: Altura = 7 cm; I.D. = 1 cm y Volumen de columna = 5,5 mL.

Tabla 3.1. Procedimiento para la etapa de captura por afinidad

La etapa de cromatografía de intercambio catiónico empleó los medios ProRes-S™ (Millipore Corporation) y las Dimensiones de columna fueron las siguientes: Altura = 22 cm; I.D. = 0,66 cm y Volumen de columna = 7,53 mL.

Tabla 3.2 Procedimiento general para la etapa de CIEX

continuación

La etapa de cromatografía de intercambio aniónico empleó la membrana ChromaSorb® (MiNipore Corporation), en el dispositivo ChromaSorb de 0,08 mL.

Tabla 3.3 Procedimiento general para la etapa de FT-AIEX

Las columnas se corrieron de forma independiente y los grupos de cada etapa se ajustaron para imitar una posible condición de transferencia directa entre columnas. ProSep Ultra Plus se empaquetó en una columna como se describió anteriormente y se cargó de acuerdo con las etapas de la Tabla 3.1.

El grupo de elución se generó en un intervalo de valores de pH (pH 3,42, pH 3,44, pH 3,46 y pH 3,5) recolectados y el pH se ajustó para crear grupos con un intervalo de condiciones de pH para la carga de CIEX. Los grupos con ajuste de pH a pH 3,41 (denominado muestra 1 en la presente descripción), pH 3,75 (denominado muestra 2 en la presente descripción), pH 4 (denominado muestra 3 en la presente descripción), pH 4,3 (denominado muestra 4 en la presente descripción) y pH 5,0 (denominado muestra 5 en la presente descripción) después se cargaron individualmente en una columna de intercambio catiónico (por ejemplo, ProRes-S™) mediante el uso del protocolo descrito en la Tabla 3.2 (ver la Figura 1 para cromatogramas representativos). Los grupos de elución de la etapa de intercambio catiónico se recolectaron y el pH se ajustó a pH 8,0 antes de la cargar en la etapa de intercambio aniónico (adsorbente de membrana de flujo continuo ChromaSorb). Las agrupaciones finales se recolectaron después de la etapa de FT-AIEX y se analizaron para determinar su pureza y rendimiento. Los resultados se muestran en la Tabla 3.4 y la Tabla 3.5 a continuación. Los rendimientos de ChromaSorb fueron de alrededor del 100 % y como se esperaba no se vieron afectados por la carga de pH de ProRes-S™. La pureza de los grupos intermedios y finales se muestra en la Tabla 3.6 a continuación. El análisis de los geles de SDS PAGE para los grupos correspondientes se muestra en la Figura 2. La alimentación se diluyó 2 veces y las muestras restantes se diluyeron 20 veces con tampón Laemmli.

Tabla 3.4 Rendimientos de la etapa de captura por afinidad

Tabla 3.5 Rendimientos de la etapa de CIEX

Tabla 3.6 Pureza del grupo intermedio y final del proceso descrito en el Ejemplo 3.

Ejemplo 4: Proceso de purificación mediante el uso de resina de proteína A, resina de intercambio catiónico y una resina de intercambio aniónico sin la necesidad de un depósito colector y una etapa de intercambio de tampón

En otro experimento representativo, se diseñó un proceso mejorado para la purificación de una proteína que contiene una región Fc, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, cuyo proceso emplea una resina de proteína A, una resina de intercambio catiónico y una resina de intercambio aniónico, sin la necesidad de un depósito colector y una etapa de intercambio de tampón.

Específicamente, se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción del Ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso del procedimiento descrito en la Tabla 4, mediante el uso de las columnas enumeradas más adelante.

La etapa de afinidad empleó la resina de Proteína A, ProSep Ultra Plus (Millipore Corporation), y la columna tenía las siguientes dimensiones: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL

La etapa de cromatografía de intercambio catiónico empleó los medios ProRes-S (Millipore Corporation) y tenía las Dimensiones de columna de la siguiente manera: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL La resina de intercambio aniónico usada fue Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare) y las Dimensiones de columna fueron las siguientes: Altura = 7 cm I.D. = 0,66 cm y el Volumen de la columna = 2,4 mL

Tabla 4. Procedimiento para el proceso de purificación de 3 etapas sin depósitos colectores o etapas de intercambio de tampón

continuación

El procedimiento descrito en la Tabla 4 se ejecutó en un sistema explorador Akta (GE Healthcare) con la configuración de conexiones mostrada en la Figura 3. Las columnas se ejecutaron individualmente o se acoplaron (conectaron) como en la secuencia descrita en la Tabla 4. De esta manera, sorprendentemente, el producto IgG podría purificarse sin usar depósitos colectores o intercambio de tampón. Sin desear limitarse a la teoría, se contempla que la columna de cromatografía se convierta en el "depósito colector" que almacena el producto mientras el tampón se cambia a un tampón que funciona como un tampón de elución para la columna cargada y un tampón de carga para la siguiente columna aguas abajo. Los cromatogramas se muestran en la Figura 4. La pureza y el rendimiento se caracterizan en la Tabla 6.

Ejemplo 5: Proceso de purificación mediante el uso de resina de Proteína A, resina de intercambio catiónico y una membrana de intercambio aniónico para purificar un anticuerpo monoclonal sin la necesidad de un depósito colector o una etapa de intercambio de tampón

Se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción en el Ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso del procedimiento descrito en la Tabla 4, mediante el uso de las columnas enumeradas más adelante.

La resina de Proteína A usada fue ProSep Ultra Plus (Millipore Corporation) que tenía las dimensiones de columna de la siguiente manera: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL

El medio de cromatografía de intercambio catiónico usado fue el ProRes-S y tenía las dimensiones de columna de la siguiente manera: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL.

La membrana de intercambio aniónico usada fue ChromaSorb (Millipore Corporation) en el dispositivo ChromaSorb de 0,08 mL

Las columnas anteriores se ejecutaron como se describe para el Ejemplo 4, excepto por la etapa de AIEX que usó un adsorbente de membrana en lugar de una columna de resina. El procedimiento descrito en la Tabla 4 se ejecutó en un sistema Akta Explorer con la configuración de conexiones mostrada en la Figura 3. Las columnas se ejecutaron individualmente o acopladas (en línea) en la secuencia descrita en la Tabla 4. En consecuencia, sorprendentemente, el producto IgG podría purificarse sin usar depósitos colectores o una etapa de intercambio de tampón. La pureza y el rendimiento se caracterizan en la Tabla 6.

Ejemplo 6: Proceso de purificación mediante el uso de múltiples ciclos de una resina de Proteína A, un ciclo único de una resina de intercambio catiónico y una membrana de intercambio aniónico para purificar un anticuerpo monoclonal

Se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción en el Ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso del procedimiento descrito en la Tabla 5, mediante el uso de las columnas enumeradas más adelante.

La resina de Proteína A usada fue ProSep Ultra Plus (Millipore Corporation) con las siguientes dimensiones de columna: altura = 12 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 4,1 mL

La cromatografía de intercambio catiónico se realizó mediante el uso de ProRes-S y con las siguientes dimensiones de columna: altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL.

La membrana de intercambio aniónico mediante el uso de ChromaSorb (Millipore Corporation) se usó con un dispositivo ChromaSorb de 0,08 mL.

Tabla 5. Procedimiento para el proceso de purificación de 3 etapas sin depósitos colectores o una etapa de intercambio de tampón

continuación

Las columnas anteriores se ejecutaron como se describe para el Ejemplo 5, excepto que la etapa de captura de Proteína A se completó un ciclo 2 veces en la columna de intercambio catiónico (Repetir las etapas 4-11). La columna CIEX se eluyó sobre un adsorbente de membrana en lugar de una columna de resina. El procedimiento descrito en la Tabla 6 se ejecutó en un sistema Akta Explorer con la configuración de conexiones mostrada en la Figura 3.

Las columnas se ejecutaron individualmente o acopladas (en línea) en la secuencia descrita en la Tabla 5. De esta manera, el producto IgG podría purificarse sin usar depósitos colectores o intercambio de tampón, proporcionando así un proceso más eficiente y mejorado. La Figura 5 muestra los cromatogramas para cargar 2 ciclos de elución de afinidad por proteína A en la etapa de intercambio catiónico. La pureza y el rendimiento se caracterizan en la Tabla 6.

Ejemplo 7: Proceso de purificación mediante el uso de múltiples ciclos de una resina de Proteína A, un ciclo único de una resina de intercambio catiónico y una membrana de intercambio aniónico para purificar un anticuerpo monoclonal

Se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción en el Ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso del procedimiento descrito en la Tabla 5, mediante el uso de las columnas enumeradas más adelante.

La resina de proteína A usada fue la ProSep Ultra Plus (Millipore Corporation) y tenía las siguientes dimensiones de columna: Altura = 5 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 2 mL.

La etapa de cromatografía de intercambio catiónico usó los medios ProRes-S (Millipore Corporation) y las Dimensiones de la columna de la siguiente manera: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL.

La membrana de intercambio aniónico usada fue ChromaSorb (Millipore Corporation) en el dispositivo ChromaSorb 0,08 mL.

Las columnas descritas anteriormente se ejecutaron como se describe para el Ejemplo 6, excepto que la etapa de captura de Proteína A se sometió a un ciclo de un total de 4x en la columna de intercambio catiónico (las Etapas 4-11 se ejecutaron 4 veces sucesivas antes de la elución del catión). El procedimiento descrito en la Tabla 6 se ejecutó en un sistema Akta Explorer con la configuración de conexiones mostrada en la Figura 3.Las columnas se ejecutaron individualmente o acopladas (en línea) en la secuencia descrita en la Tabla 6.

En consecuencia, sorprendentemente, el producto IgG podría purificarse sin usar depósitos colectores o una etapa de intercambio de tampón. La Figura 6 muestra los cromatogramas para cargar 4 ciclos de elución de afinidad de proteína A en la etapa de intercambio catiónico. La pureza y el rendimiento se caracterizan en la Tabla 6.

Tabla 6 Pureza final del grupo para el proceso descrito en Ios Ejemplos 4-7

Ejemplo 8: Proceso de purificación mediante el uso de un ciclo único de una resina de Proteína A, un ciclo único de una resina de intercambio catiónico y una resina de intercambio aniónico para purificar un anticuerpo monoclonal

Se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción en el Ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso del procedimiento descrito en la Tabla 7, mediante el uso de las columnas enumeradas más adelante.

La resina de Proteína A usada fue la ProSep Ultra Plus (Millipore Corporation) y tenía las siguientes Dimensiones de columna: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL

La etapa de cromatografía de intercambio de cationes empleó los medios ProRes-S (Millipore Corporation) y las siguientes Dimensiones de columna: altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7.5mL.

La resina de intercambio aniónico usada fue la Q Sepharose Fast Flow (GE Healthcare), que tenía las siguientes Dimensiones de columna: Altura = 5 cm; I.D. = 1,1 cm; y Volumen de columna = 4,8 mL.

Tabla 7. Procedimiento para el proceso de purificación de 3 etapas sin depósitos colectores o una etapa de intercambio de tampón

continuación

Las columnas anteriores se ejecutaron mediante el uso del procedimiento descrito en la Tabla 7 en un sistema Akta Explorer con la configuración de conexiones mostrada en la Figura 3. Las columnas se ejecutaron individualmente o acopladas (en línea) en la secuencia descrita en la Tabla 7. En consecuencia, el producto IgG se purificó sin usar depósitos colectores o intercambio de tampón.

La pureza y el rendimiento se caracterizan en la Tabla 9.

Ejemplo 9: Proceso mediante el uso de un ciclo único de una resina de Proteína A, un ciclo único de una resina de intercambio catiónico y una membrana de intercambio aniónico para purificar un anticuerpo monoclonal.

Se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción en el ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso del procedimiento descrito en la Tabla 7, mediante el uso de las columnas enumeradas más adelante.

La resina de proteína A usada fue ProSep Ultra Plus (Millipore Corporation) que tiene las siguientes Dimensiones de columna: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL.

La etapa de cromatografía de intercambio catiónico usó los medios ProRes-S (Millipore Corporation) y las siguientes Dimensiones de columna: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL.

Se usó la siguiente membrana de intercambio aniónico: ChromaSorb (Millipore Corporation) en un dispositivo ChromaSorb de 0,08 mL.

Se ejecutaron las columnas anteriores, como se describió anteriormente para el Ejemplo 8. El procedimiento descrito en la Tabla 7 se ejecutó en un sistema Akta Explorer con la configuración de conexiones mostrada en la Figura 3. Las columnas se ejecutaron individualmente o acopladas (en línea) en la secuencia descrita en la Tabla 7.

En consecuencia, el producto IgG se purificó sin usar depósitos colectores o una etapa de intercambio de tampón. La pureza y el rendimiento se caracterizan en la Tabla 9.

Ejemplo 10: Proceso de purificación mediante el uso de múltiples ciclos de una resina de proteína A, un ciclo único de una resina de intercambio catiónico y una resina en modo mixto para purificar un anticuerpo monoclonal

Se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción en el Ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso del procedimiento descrito en la Tabla 8, mediante el uso de las columnas enumeradas más adelante.

El medio de proteína A usado fue la resina ProSep Ultra Plus (Millipore Corporation) que tenía las siguientes Dimensiones de columna: Altura = 5 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 2 mL.

El medio de cromatografía de intercambio catiónico usado fue el ProRes-S (Millipore Corporation), que tenía las siguientes Dimensiones de columna: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL.

El medio de cromatografía de intercambio aniónico fue una resina en modo mixto mediante el uso de Capto Adhere (GE Healthcare) que tenía las siguientes Dimensiones de columna: Altura = 5 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 2 mL

Las columnas descritas anteriormente se ejecutaron como se describió para el Ejemplo 6, excepto que la etapa de captura de Proteína A se sometió a un ciclo de un total de 4x en la columna de intercambio catiónico (las Etapas 4-11 se ejecutaron 4 veces sucesivas antes de la elución del catión). El procedimiento descrito en la Tabla 8 se ejecutó en un sistema Akta Explorer con la configuración de conexiones mostrada en la Figura 3. Las columnas se ejecutaron individualmente o se acoplaron (en línea) en la secuencia descrita en la Tabla 8. De esta manera, sorprendentemente, el producto IgG podría purificarse sin usar depósitos colectores o una etapa de intercambio de tampón. La pureza y el rendimiento se caracterizan en la Tabla 9.

Tabla 8 Procedimiento para el proceso de purificación de 3 etapas sin depósitos colectores o una etapa de intercambio de tampón

continuación

Ejemplo 11. Proceso de purificación mediante el uso de un ciclo único de una resina de Proteína A, un ciclo único de una resina de intercambio catiónico que incluye un medio de intercambio aniónico para purificar un anticuerpo monoclonal

Se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción en el ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso del procedimiento descrito en la Tabla 7, mediante el uso de las columnas enumeradas más adelante.

El medio de Proteína A utilizado fue el MabSelect® SuRe (GE Healthcare) que tenía las Dimensiones de columna: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL.

La cromatografía de intercambio de cationes usada fue la ProRes-S (Millipore Corporation) que tenía las Dimensiones de columna: altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL.

La membrana de intercambio aniónico usada fue la ChromaSorb (Millipore Corporation) con un dispositivo ChromaSorb de 0,08 mL.

Las columnas anteriores se ejecutaron como en el ejemplo 8. El procedimiento descrito en la Tabla 7 se ejecutó en un sistema Akta Explorer con la configuración de conexiones mostrada en la Figura 3. Las columnas se ejecutaron individualmente o acopladas (en línea) en la secuencia descrita en la Tabla 7. De esta manera, el producto IgG podría purificarse sin usar depósitos colectores o intercambio de tampón. La pureza y el rendimiento se caracterizan en la Tabla 9.

Tabla 9 Pureza del grupo final para el proceso descrito en Ios Ejemplos 8-11.

Ejemplo 12: Proceso de purificación mediante el uso de un ciclo único de una resina de Proteína A, un ciclo único de una resina de intercambio catiónico sin mantener el pH bajo y una membrana de intercambio aniónico para purificar un anticuerpo monoclonal.

Se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción en el ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso del procedimiento descrito en la Tabla 7, mediante el uso de las columnas enumeradas más adelante.

La resina de Proteína A usada fue ProSepUltra Plus (Millipore Corporation) con las siguientes Dimensiones de columna: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL.

La etapa de Cromatografía de intercambio catiónico usó ProRes-S (Millipore Corporation) que tiene las siguientes Dimensiones de columna: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL

La etapa de cromatografía de intercambio aniónico empleó ChromaSorb (Millipore Corporation) con un dispositivo ChomaSort de 0,08 mL.

Las columnas anteriores se ejecutaron como se describe para el Ejemplo 8. El procedimiento descrito en la Tabla 7 se ejecutó en un sistema Akta Explorer con la configuración de conexiones mostrada en la Figura 3. Las columnas se ejecutaron individualmente o acopladas (en línea) en la secuencia descrita en la Tabla 7. De esta manera, sorprendentemente, el producto IgG podría purificarse sin usar depósitos colectores o intercambio de tampón. La pureza y el rendimiento se caracterizan en la Tabla 11.

Ejemplo 13. Proceso de purificación mediante el uso de un ciclo único de una resina de Proteína A, un ciclo único de una resina de intercambio catiónico que incluye mantener el pH bajo durante 30 minutos y una membrana de intercambio aniónico para purificar un anticuerpo monoclonal

Se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción en el Ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso del procedimiento descrito en la Tabla 10, mediante el uso de las columnas enumeradas más adelante.

La etapa de afinidad utilizó la resina de proteína A, ProSep Ultra Plus (Millipore Corporation) que tiene las Dimensiones de columna: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL.

La etapa de cromatografía de intercambio catiónico usó los medios ProRes-S (Millipore Corporation) que tenían las Dimensiones de columna: Altura = 21 cm; I.D. = 0,66 cm; y Volumen de columna = 7,5 mL.

La etapa de cromatografía de intercambio aniónico usó la membrana ChromaSorb con el dispositivo ChromaSorb de 0,08 mL (Millipore Corporation).

Tabla 10. Procedimiento para el proceso de purificación en 3 etapas sin depósitos colectores o una etapa de intercambio de tampón

Las columnas anteriores se ejecutaron mediante el uso del procedimiento de la Tabla 10. El procedimiento descrito en la Tabla 10 se ejecutó en un sistema Akta Explorer con la configuración de conexiones mostrada en la Figura 3. En consecuencia, sorprendentemente, el producto IgG podría purificarse sin usar depósitos colectores o etapas de intercambio de tampón. La pureza y el rendimiento se caracterizan en la Tabla 11.

Ejemplo 14. Demostración del proceso de la invención mediante el uso de un ciclo único de una resina de Proteína A, un ciclo único de una resina de intercambio catiónico que incluye mantener el pH bajo durante 1 hora y una membrana de intercambio aniónico para purificar un anticuerpo monoclonal

Las columnas descritas en el Ejemplo 13 se ejecutaron mediante el uso del procedimiento en la Tabla 10, con la excepción de que el tiempo de exposición de la etapa de mantener el pH bajo se incrementó a 1 hora en comparación con 30 minutos en el Ejemplo 13. El procedimiento descrito en la Tabla 10 se ejecutó en un sistema Akta Explorer con la configuración de conexiones mostrada en la Figura 3. De esta manera, el producto IgG podría purificarse sin usar depósitos colectores o una etapa de intercambio de tampón. La pureza y el rendimiento se caracterizan en la Tabla 11.

Tabla 11. Recuperación y pureza del producto para el proceso de la invención manteniendo el pH bajo

Ejemplo 15. Proceso de purificación mediante el uso de un ciclo único de una resina de Proteína A, recolectada como un grupo y después añadida con un virus, seguido de un ciclo único de una resina de intercambio catiónico que incluye mantener el pH bajo para inactivar el virus en la columna de intercambio catiónico

Se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción en el Ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso de una columna ProSep Ultra Plus similar al procedimiento descrito en la Tabla 3.1 con la excepción de que el tampón de equilibrio es Tris 25 mM, NaCl 25 mM, EDTA 0,05 M, pH 7,0 y el tampón de elución es ácido acético 100 mM, NaCl 150 mM, pH 3,5. La elución de la columna de Proteína A se valoró a pH 4,0 para aproximar la carga directa del grupo de elución de la Proteína A en la columna de intercambio catiónico. Se añadió al grupo un pico viral de 6,5 Log X-MuLV (pico de 5 %, virus de la leucemia murina). El grupo se ejecutó después a través de una columna de intercambio catiónico ProRes-S en las condiciones descritas en la Tabla 12. Las fracciones relevantes se analizaron para determinar X-MuLV a través de un ensayo de infectividad y qPCR mediante el uso de métodos y protocolos estándar bien conocidos en la técnica. El lavado de mantenimiento de pH bajo y la regeneración de la columna mostraron una reducción logarítmica de > 3,5 en la infectividad del virus y no se detectó ningún virus activo. El grupo de elución del producto mostró una reducción logarítmica de > 4,3 en la infectividad del virus y no se detectó ningún virus activo. Por lo tanto, la inactivación del virus con un mantenimiento de pH bajo en la columna CIEX es una forma efectiva de reducir la actividad del virus por debajo de los niveles detectables. Para reivindicar niveles más altos de eliminación, la estrategia y el ensayo de adición de virus necesitarían refinarse para mejorar la resolución.

Tabla 12. Etapas de cromatografía y condiciones de tamponamiento para el experimento de adición de virus

continuación

Ejemplo 16. Optimización de la recuperación del producto de intercambio catiónico a través de la optimización de mantenimiento de pH bajo de intercambio de cationes y/o condiciones de elución de Proteína A

Se preparó una alimentación clarificada que contenía IgG de acuerdo con la descripción en el Ejemplo 3. La IgG1 se purificó del fluido de cultivo celular clarificado cosechado (HCCF) mediante el uso de una columna ProSep Ultra Plus de acuerdo con el procedimiento descrito en la Tabla 3.1, con la excepción de que el tampón de equilibrio es Tris 25 mM, NaCl 25 mM, e DtA 0,05 M, pH 7,0. El grupo de elución de Proteína A se ajustó a pH 5 y una concentración final de 1,2 g/L. Se midieron nueve muestras individuales de 0,5 mL de resina de intercambio catiónico ProRes-S mediante el uso de una columna desechable (Evergreen Scientific, Los Ángeles CA) equilibrada con 5 CV de tampón de acetato de sodio 50 mM a pH 5 (tampón de EQ CIEX) y se añadieron a tubos de centrífuga plásticos individuales de 50 mL. Las muestras de resina ProRes-S se cargaron a 40 g/L mediante la adición de 25 mL del grupo de Proteína A descrita anteriormente. Las mezclas de proteína/resina se rotaron durante 4 horas. Las muestras de resina ProRes-S se filtraron después en columnas de cromatografía desechables y se lavaron con 5CV de tampón de EQ CIEX. Las muestras de resina se devolvieron posteriormente a tubos de centrífuga de 50 mL y se añadieron una serie de volúmenes de 15 mL de tampones de lavado de pH bajo (como se muestra en la Tabla 13) para imitar la etapa de mantenimiento de pH bajo o la condición de carga de elución de Proteína A para la carga directa del CIEX de la columna de Proteína A. Los tampones de pH bajo de 15 mL de volumen tenían un pH de 3,5 y contenían varias conductividades debido a la adición de cloruro de sodio descrita en la Tabla 13. Las muestras se rotaron durante 1,5 horas y después se transfirieron a una columna de cromatografía desechable. A continuación, se lavaron las muestras con tampón de EQ CIEX y se eluyeron con 5 mL de un tampón de elución de CIEX típico; cloruro de sodio 200 mM en acetato de sodio 50 mM pH 5,4. La recuperación del producto se determinó por la absorbancia a 280 nm mediante el uso de un coeficiente de extinción de 1,38. Las recuperaciones del producto basadas en la carga del grupo de Proteína A se informan en la Tabla 13. Sorprendentemente, la recuperación del producto después de la exposición a tampones de pH bajo es sensible a la conductividad del tampón de pH bajo. La recuperación del producto se mejora enormemente con la adición de sal en los tampones de pH bajo que se presentarían en las etapas de mantenimiento de pH bajo y elución de Proteína A.

Tabla 13. Recuperación de producto para diversas conductividades de tampón de mantenimiento de pH bajo o elución de Proteína A

Ejemplo 17. Optimización de la recuperación de IgG policlonal de intercambio catiónico a través de la optimización de la conductividad del tampón de elución de Proteína A (tampón de carga de CIEX) y CIEX

Se construyó un modelo del grupo de elución de Proteína A mediante el uso de la siguiente mezcla mediante el uso de acetato de sodio 50 mM y 2,5 g/L de IgG policlonal (PAb, SeraCare Life Sciences, Inc., Oceanside, CA) a tres valores de pH diferentes; pH 3,5, pH 4 y pH 4,5. Se equilibraron tres muestras individuales de 4,5 mL de resina ProRes-S en una columna de cromatografía desechable con acetato de sodio 50 mM a pH 3,5, pH 4 y pH 4,5, respectivamente. Las muestras de resina se añadieron después a su respectiva alimentación modelo que contenía PAb de pH equivalente a una carga de 40 g/L. Se permitió que se produjera la unión a proteínas durante la noche mientras las muestras se rotaban a 20 rpm. Las muestras de resina se lavaron después con 10 CV de un tampón de equilibrio de pH equivalente (acetato 50 mM, pH 3,5, pH 4 y pH 4,5, respectivamente).

Las muestras se usaron después para formar una suspensión de perlas al 10 % v/v en un tampón de equilibrio de pH equivalente. La resina se suspendió y se dispensaron 10 pL de resina (100 pL de suspensión) en placas de filtro de 96 pocillos (membrana de PVDF hidrófila de 1 um, Millipore Corp.). El exceso de tampón de pH bajo de la suspensión se eliminó mediante el uso de un sistema de filtración de placa de múltiples paredes (Millipore Corporation), aislando así los 10 pL de resina ProRes-S cargada con PAb. Se añadió un intervalo de condiciones de tampón de elución (30 condiciones individuales, 200 uL por cada pocillo) a los pocillos por triplicado para cada pH de carga de PAb. Las placas se agitaron durante 1 hora y se midió la absorbancia a 280. La absorbancia se correlacionó con la recuperación de IgG y se informa en la Tabla 14. Sorprendentemente, la recuperación del producto en un amplio intervalo de condiciones de elución es sensible al pH bajo el cual se realizó la carga.

Aunque este experimento es una carga estática de la resina, la tendencia sigue siendo una consideración importante para la optimización de un proceso conectado. El pH del tampón de elución de Proteína A determina el intervalo de condiciones de pH que experimentará la molécula objetivo, tal como la IgG, durante la carga de la resina de intercambio catiónico durante el procesamiento conectado. La Tabla 14 sugiere mantener el valor de pH de carga de CIEX en el valor más alto posible donde se produce la elución de la proteína de la columna de afinidad, tal como la Proteína A, que debería proporcionar la mayor recuperación del producto.

Tabla 14. Recuperación del producto para diversas conductividades del tampón de elución de Proteína A

continuación

Ejemplo 18. Caracterización de la pureza del grupo de productos

En los ejemplos expuestos en la presente descripción, el nivel de agregado de IgG se midió mediante el uso de cromatografía de exclusión por tamaño / HPLC. Se hizo funcionar una columna Zorbax GF450 (catálogo de Agilent 884973-902, S/N USMX006417) a una tasa de flujo de 1 mL/min mediante el uso de un tampón de fosfato de sodio 0,2 M, pH 7. La muestra se inyectó y los tiempos de retención se compararon con los estándares conocidos.

El nivel de IgG en disolución se midió alternativamente mediante el uso de una columna analítica de proteína A. Una columna Poros A/Proteína A 20 (Applied Biosystems) se equilibró con PBS, se eluyó con Glisina 0,1 M (pH 2,0) y se limpió con guanidina HCl 6 M. Se creó una curva patrón de IgG mediante el uso de una serie de volúmenes de inyección variables de IgG policlonal (Seracare). Se inyectaron las muestras y se determinaron las concentraciones de IgG a partir de la curva patrón.

El grupo de elución se midió por absorbancia UV a 280 nm para determinar la concentración y el rendimiento de IgG. El grupo de elución también se analizó para determinar la concentración de CHOP mediante el uso de un kit comercial de ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) (Todos los datos de HCP con CHO HCP ELISA Kit F015, excepto la Tabla 11, HCP 3G ELISA, F550; Cygnus Technologies Inc., Southport, N.C.). Las concentraciones de ADN se determinaron mediante el uso de un ensayo Picogreen estándar y ADN de esperma de arenque como un estándar. Las concentraciones de Proteína A se determinaron mediante el uso de un kit ELISA (conceptos OEM) mediante el uso de nproteína A como un estándar. La SDS-PAGE se realizó diluyendo las muestras 2x con tampón Laemmli 2x y después el análisis en condiciones no reductoras y reductoras según sea apropiado. Los geles se cargaron con 10 pL de muestra por carril y se tiñeron con azul Gelcode (Thermo fisher 24592).

La memoria descriptiva se comprende más a fondo a la luz de las enseñanzas de las referencias citadas en la memoria descriptiva. Las modalidades dentro de la memoria descriptiva proporcionan una ilustración de las modalidades de esta invención. En la medida en que el material al que se hace referencia contradiga o sea inconsistente con la presente memoria descriptiva, la presente memoria descriptiva sustituirá a tal material. La cita de cualquiera de las referencias en la presente descripción no es una admisión de que tales referencias sean la técnica anterior a la presente invención.

A menos que se indique lo contrario, todos los números que expresan cantidades de ingredientes, cultivos celulares, condiciones de tratamiento, etc., utilizados en la memoria descriptiva, incluidas las reivindicaciones, deben entenderse como modificados en todos los casos por el término "aproximadamente". Por consiguiente, a menos que se indique lo contrario, los parámetros numéricos son aproximaciones y pueden variar dependiendo de las propiedades deseadas que se pretenden obtener mediante la presente invención. A menos que se indique de otra manera, el término "al menos" que precede a una serie de elementos debe entenderse que se refiere a cada elemento de la serie. Los expertos en la técnica reconocerán, o podrán determinar utilizando simplemente la experimentación rutinaria, muchos equivalentes a las modalidades específicas de la invención descritas en la presente descripción. Se pretende que tales equivalentes estén abarcados por las siguientes reivindicaciones.

A pesar de que los intervalos numéricos y los parámetros que establecen el amplio alcance de la invención son aproximaciones, los valores numéricos establecidos en los ejemplos específicos se indican con la mayor precisión posible. Además, debe entenderse que todos los intervalos pensados en la presente descripción abarcan todos los subintervalos incluidos en los mismos. Por ejemplo, un intervalo de "1 a 10" incluye todos y cada uno de los subintervalos entre (e incluyendo) el valor mínimo de 1 y el valor máximo de 10, es decir, todos y cada uno de los subintervalos tienen un valor mínimo igual o mayor que 1 y un valor máximo igual o inferior a 10, por ejemplo, 5,5 hasta 10.

Claims (10)

r e iv in d ic a c io n e s

1. Un método para purificar una proteína objetivo que contiene una región Fc de una o más impurezas en una muestra, el método comprende las etapas de:

a) poner en contacto la muestra con un medio de cromatografía de afinidad;

b) eluir la proteína objetivo que contiene una región Fc del medio de afinidad mediante el uso de un tampón que tiene un pH que varía de 2,0 a 4,0 y una conductividad que varía de 5 a 50 mS;

c) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografía de intercambio catiónico;

d) poner en contacto el medio de cromatografía de intercambio catiónico con un tampón que tiene un pH menor que 4,0 durante un período de tiempo adecuado para la inactivación viral, en donde la conductividad del tampón es de 5 a 50 mS;

e) eluir la proteína objetivo que contiene una región Fc del medio de cromatografía de intercambio catiónico mediante el uso de un tampón que tiene un pH que varía de 5,0 a 9,0;

f) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografía de intercambio aniónico; y

g) recuperar la proteína objetivo que contiene una región Fc,

en donde el método es un proceso continuo y las condiciones eliminan la necesidad de un depósito colector entre las etapasb) y c) y las etapas e) y f), o una etapa de intercambio de tampón entre las etapas b) y c) y las etapas e) y f), o un depósito colector y una etapa de intercambio de tampón entre las etapas b) y c) y las etapas e) y f).

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método comprende además una etapa de preelución entre las etapas a) y b), en donde la proteína objetivo permanece unida a un medio de afinidad, y el tampón que se mezcla durante la carga en el medio de cromatografía de intercambio catiónico no afecta de manera adversa el rendimiento objetivo o la pureza objetivo.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína objetivo que contiene una región Fc se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo, una molécula de inmunoadhesión y una proteína de fusión a Fc, y fragmentos de esta que contienen una Fc; en cuyo caso opcionalmente en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la etapa de preelución comprende poner en contacto el medio de afinidad con un tampón de cromatografía de intercambio catiónico.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el período de tiempo adecuado para la inactivación del virus varía de 15 a 60 minutos.

6. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la etapa e) comprende el uso de un tampón que tiene un pH que varía de 6,0 a 8,0.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la etapa b) comprende el uso de un tampón que comprende una conductividad que varía de 12 a 25 mS.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el medio de cromatografía de afinidad comprende proteína A o una variante funcional de esta.

9. Un proceso conectado para purificar una proteína objetivo que contiene una región Fc de una o más impurezas en una muestra, el método comprende las etapas de:

a) poner en contacto la muestra con un medio de cromatografía de afinidad;

b) eluir la proteína objetivo que contiene una región Fc del medio de afinidad mediante el uso de un tampón que tiene un pH que varía de 2,0 a 4,0 y una conductividad que varía de 5 a 50 mS;

c) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografía de intercambio catiónico;

d) poner en contacto el medio de cromatografía de intercambio catiónico con un tampón que tiene un pH menor que 4,0 durante un período de tiempo adecuado para la inactivación viral, en donde la conductividad del tampón es de 5 a 50 mS;

e) eluir la proteína objetivo que contiene una región Fc del medio de cromatografía de intercambio catiónico mediante el uso de un tampón que tiene un pH que varía de 5,0 a 9,0;

f) poner en contacto el eluato con un medio de cromatografía de intercambio aniónico; y

g) recuperar la proteína objetivo que contiene una región Fc.

10. El proceso conectado de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el proceso elimina la necesidad de un depósito colector y/o una etapa de intercambio de tampón entre las etapas b) y c) y entre las etapas e) y f).