JP5791602B2 - 試料中の1つ以上の不純物から標的タンパク質を精製するための方法 - Google Patents
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Description
本出願は、その全ての内容が全体として本明細書に組み込まれる、出願日2009年8月7日の米国仮特許出願第61/273,709号の優先権の利益を主張する。
本発明は、タンパク質の精製の方法に、少なくとも部分的に関する。特に、本発明は、標的タンパク質(例えば抗体およびこれらの断片、ならびに例えばイムノアドヘシンなどの抗体様の分子などの、例えばFc領域含有タンパク質)および1つ以上の不純物を含む組成物から、標的タンパク質を精製するための方法に、少なくとも部分的に関する。
本発明は、1つ以上の不純物から、対象のタンパク質を精製または分離する改良された方法を、少なくとも部分的に提供し、これらの方法は、様々なクロマトグラフィーのステップの間の集積タンクおよび/またはバッファー交換のステップの必要性を排除する。
本発明は、標的タンパク質および1つ以上の不純物を含む試料から、標的タンパク質を精製するための新規で改良された方法を、少なくとも部分的に提供し、これらの方法は、集積タンクおよび/またはバッファー交換のステップの必要性を特に排除し、集積タンクおよび/またはバッファー交換のステップの1つまたは両方とも、従来のタンパク質精製方法の一部を形成する様々なクロマトグラフィーのステップの間において典型的に実施される。
本開示がより容易に理解されるために、特定の用語が最初に定義される。追加の定義は、詳細な記載の全体を通じて明記される。
請求された発明による様々な実施形態において、本発明の方法は、アフィニティークロマトグラフィーのステップにおける使用のためのプロテインAベースのアフィニティー樹脂の使用を網羅する。プロテインAは、天然のプロテインA(スタフィロコッカス・アウレウス(Staph.Aureus)由来)、組換えプロテインAまたはこの機能的変異体であり得る。請求された方法において使用されてよいプロテインA樹脂の例としては、ProSep−vA HC、ProSep Ultra Plus、MabSelect、MabSelect SuReおよびその他の市販のアフィニティー樹脂が挙げられる。その他のアフィニティーリガンド/樹脂、例えば、プロテインGおよびその他のFc結合タンパク質(例えば1本鎖ラクダ科動物抗体)などは、本明細書において記載された方法において使用され得る。
本明細書において記載された方法の場合、アフィニティーのステップの溶出プールは、カチオン交換カラム上へ直接ロードされ、それによって収集タンク/バッファー交換のステップの使用を排除する。カチオン交換カラムは、2−20mSの範囲の伝導率を有するpH3.0から7.0の範囲のバッファー、最も好ましくは伝導率2−16mSを有してpH4.5から6の範囲のバッファーによって平衡化され得る。カラムは、アフィニティーカラムからの1溶出サイクルにおいて樹脂1リットルに付き標的タンパク質5−120グラム(g/L)またはアフィニティーカラムの複数の溶出サイクルによる5−120g/Lまで、タンパク質でロードされ得る。いくつかの実施形態において、カチオン交換カラム上の総ロードは、20−80g/Lまたは40−60g/Lである。
低pHロードのための樹脂の結合能力の比較
3つのカチオン交換媒体は、以下の方法を使用して、表1に掲載された条件(プロテインAアフィニティークロマトグラフィーのための典型的な溶出条件)下で、動的能力について比較された。
直接ロード条件下のモデル供給物を使用するイオン交換のステップの実証
代表する実験において、モデルタンパク質供給物が、カチオン交換カラムの直接ロード、その次にアニオン交換のステップが続く、タンパク質の回収および精製の実証のために使用された。
Fc領域含有タンパク質を精製するためのバッチ方式の方法
代表する実験において、代表的なFc領域含有タンパク質であるモノクローナル抗体を精製するためのバッチ方式の方法が設計され、この方法は、プロテインA樹脂、様々なpH条件でのロードによるカチオン交換樹脂およびアニオン交換を使用する。方法は、以下の通り説明される。この実験は、収集タンクまたはバッファー交換のステップの必要性なしに、アフィニティー捕獲に続くイオン交換のステップの直接ロードを可能にさせ得る条件を実証した。
収集タンクおよびバッファー交換のステップの必要性がない、プロテインA樹脂、カチオン交換樹脂およびアニオン交換樹脂を使用する精製方法
別の代表する実験において、改良された方法は、Fc領域含有タンパク質、例えばモノクローナル抗体の精製のために設計され、その方法は、収集タンクおよびバッファー交換のステップの必要性なしに、プロテインA樹脂、カチオン交換樹脂およびアニオン交換樹脂を使用する。
収集タンクまたはバッファー交換のステップの必要性なしに、モノクローナル抗体を精製するために、プロテインA樹脂、カチオン交換樹脂およびアニオン交換膜を使用する精製方法
清澄化されたIgG含有供給物は、実施例3における記載に従って調製された。IgG1は、下に掲載されたカラムを使用して、表4において記載された手順を使用して、収集され清澄化された細胞培養液(HCCF)から精製された。
モノクローナル抗体を精製するために、プロテインA樹脂を複数サイクル、カチオン交換樹脂を単一サイクルおよびアニオン交換膜を使用する精製方法
清澄化されたIgG含有供給物は、実施例3における記載に従って調製された。IgG1は、下に掲載されたカラムを使用して、表5において記載された手順を使用して、収集され清澄化された細胞培養液(HCCF)から精製された。
モノクローナル抗体を精製するために、プロテインA樹脂を複数サイクル、カチオン交換樹脂を単一サイクルおよびアニオン交換膜を使用する精製方法
清澄化されたIgG含有供給物は、実施例3における記載に従って調製された。IgG1は、下に掲載されたカラムを使用して、表5において記載された手順を使用して、収集され清澄化された細胞培養液(HCCF)から精製された。
モノクローナル抗体を精製するために、プロテインA樹脂を単一サイクル、カチオン交換樹脂を単一サイクルおよびアニオン交換樹脂を使用する精製方法
清澄化されたIgG含有供給物は、実施例3における記載に従って調製された。IgG1は、下に掲載されたカラムを使用して、表7において記載された手順を使用して、収集され清澄化された細胞培養液(HCCF)から精製された。
モノクローナル抗体を精製するために、プロテインA樹脂を単一サイクル、カチオン交換樹脂を単一サイクルおよびアニオン交換膜を使用する方法
清澄化されたIgG含有供給物は、実施例3における記載に従って調製された。IgG1は、下に掲載されたカラムを使用して、表7において記載された手順を使用して、収集され清澄化された細胞培養液(HCCF)から精製された。
モノクローナル抗体を精製するために、プロテインA樹脂を複数サイクル、カチオン交換樹脂を単一サイクルおよび混合型樹脂を使用する精製方法
清澄化されたIgG含有供給物は、実施例3における記載に従って調製された。IgG1は、下に掲載されたカラムを使用して、表8において記載された手順を使用して、収集され清澄化された細胞培養液(HCCF)から精製された。
モノクローナル抗体を精製するために、アニオン交換媒体を含む、プロテインA樹脂を単一サイクル、カチオン交換樹脂を単一サイクル使用する精製方法
清澄化されたIgG含有供給物は、実施例3における記載に従って調製された。IgG1は、下に掲載されたカラムを使用して、表7において記載された手順を使用して、収集され清澄化された細胞培養液(HCCF)から精製された。
モノクローナル抗体を精製するために、プロテインA樹脂を単一サイクル、低pHを保持しないカチオン交換樹脂を単一サイクルおよびアニオン交換膜を使用する精製方法
清澄化されたIgG含有供給物は、実施例3における記載に従って調製された。IgG1は、下に掲載されたカラムを使用して、表7において記載された手順を使用して、収集され清澄化された細胞培養液(HCCF)から精製された。
モノクローナル抗体を精製するために、プロテインA樹脂を単一サイクル、低pHでの保持30分含むカチオン交換樹脂を単一サイクルおよびアニオン交換膜を使用する精製方法
清澄化されたIgG含有供給物は、実施例3における記載に従って調製された。IgG1は、下に掲載されたカラムを使用して、表10において記載された手順を使用して、収集され清澄化された細胞培養液(HCCF)から精製された。
モノクローナル抗体を精製するために、プロテインA樹脂を単一サイクル、1時間の低pH保持を含むカチオン交換樹脂を単一サイクルおよびアニオン交換膜を使用する発明の方法の実証
実施例13において記載されたカラムは、低pH保持のステップの暴露時間が、実施例13における30分に対して、1時間まで増加されたことを除いて、表10における手順を使用して実施された。表10において記載された手順は、図3において示された配管構造を有するAkta explorerシステム上で実施された。このようにして、IgG生成物は、収集タンクまたはバッファー交換のステップを使用することなく精製され得る。純度および収率は、表11において明示される。
プロテインA樹脂を単一サイクル使用し、プールとして収集され、次にウイルスでスパイク、続いて、カチオン交換カラム上でウイルスを不活化させるための低pH保持を含むカチオン交換樹脂を単一サイクル使用する精製方法
清澄化されたIgG含有供給物は、実施例3における記載に従って調製された。IgG1は、平衡化バッファーが25mMトリス、25mM NaCl、0.05M EDTA、pH7.0であることおよび溶出バッファーが100mM酢酸、150mM NaCl、pH3.5であることを除いて、表3.1において記載された手順と同様のProSep Ultra Plusカラムを使用して、収集され清澄化された細胞培養液(HCCF)から精製された。プロテインAカラム溶出物を、カチオン交換カラム上へのプロテインAからの溶出プールの直接ロードに近づけるために、pH4.0まで滴定した。6.5LogのX−MuLV(5%スパイク、マウス白血病ウイルス)のウイルススパイクを、プールに加えた。次に、プールを、表12において記載された条件下で、ProRes−Sカチオン交換カラム通じて流した。関連する画分を、当技術分野においてよく知られた標準的な方法および手順を使用して、感染力アッセイおよびqPCRにより、X−MulVについてアッセイした。低pH保持洗浄およびカラム再生は、ウイルス感染力において≧3.5logの低下を示し、活性ウイルスは検出されなかった。生成物溶出プールは、ウイルス感染力において≧4.3logの低下を示し、活性ウイルスは検出されなかった。したがって、CIEXカラム上での低pH保持によるウイルスの不活化は、検出レベルより低くウイルス活性を低下させる有効な方法である。より高いレベルの除去を請求するために、ウイルススパイク方策およびアッセイは、精密化されて、分解能を改良する必要があり得る。
カチオン交換低pH保持および/またはプロテインA溶出条件の最適化による、カチオン交換生成物の回収の最適化
清澄化されたIgG含有供給物は、実施例3における記載に従って調製された。IgG1は、平衡化バッファーが25mMトリス、25mM NaCl、0.05M EDTA、pH7.0であることを除いて、表3.1において記載された手順に従って、ProSep Ultra Plusカラムを使用して、収集され清澄化された細胞培養液(HCCF)から精製された。プロテインA溶出プールを、pH5および最終濃度1.2g/Lまでに調節した。ProRes−Sカチオン交換樹脂の0.5mL試料9個を、使い捨てのカラム(Evergreen Scientific、Los Angels、CA)を使用して測定し、pH5の50mM酢酸ナトリウムバッファー(CIEX EQバッファー)5CVで平衡化し、50mLプラスチック遠心分離管にそれぞれ加えた。ProSep−S樹脂試料を、以前に記載されたプロテインAプール25mLの添加によって、40g/Lまでロードした。タンパク質/樹脂混合物を、4時間循環した。次に、ProSep−S樹脂試料を、使い捨てのクロマトグラフィーカラム中へ濾過し、CIEX EQバッファー5CVによって洗浄した。続いて、樹脂試料を、50mL遠心分離管に戻し、低pH洗浄バッファーを15mL体積ずつ相次いで(表13に示される通り)加えて、低pH保持のステップまたはプロテインAカラムからのCIEXの直接ロードのためのプロテインA溶出ロード条件に似せた。15mL体積の低pHバッファーは、pH3.5であり、表13において記載された塩化ナトリウムの添加に起因して、様々な伝導率を有した。試料を、1.5時間、循環させ、次に、使い捨てのクロマトグラフィーカラムへ移動させた。次に、試料を、CIEX EQバッファーによって洗浄し、典型的なCIEX溶出バッファー(50mM酢酸ナトリウム中に200mM塩化ナトリウム、pH5.4)5mLによって溶出した。生成物の回収は、消光率1.38を使用して、280nmでの吸光度によって決定された。プロテインAプールロードに基づく生成物の回収は、表13に報告される。驚くべきことに低pHバッファーへの暴露後の生成物の回収が、低pHバッファーの伝導率に敏感である。生成物の回収は、低pH保持およびプロテインA溶出のステップにおいて存在し得る低pHバッファーにおける塩の添加によって大きく改良される。
プロテインA溶出バッファーの伝導率(CIEXローディングバッファー)およびCIEXの最適化による、カチオン交換ポリクローナルIgG回収の最適化
モデルプロテインA溶出プールは、pH3.5、pH4およびpH4.5の3つの異なるpH値で、50mM酢酸ナトリウムおよびポリクローナルIgG(PAb、ScraCare Life Science,Inc.、Oceanside、CA)2.5g/Lを使用する以下の混合物を使用して作製された。ProRes−S樹脂の3つの個々の4.5mL試料を、それぞれpH3.5、pH4およびpH4.5で、50mM酢酸ナトリウムによって、使い捨てのクロマトグラフィーカラム中で平衡化した。次に、樹脂試料を、ロード量40g/Lまで、それぞれのpH等価のPAb含有モデル供給物に加えた。試料を20rpmで循環させている間、タンパク質結合は、一晩中発生させられた。次に、樹脂試料を、pH等価の平衡化バッファー(50mM酢酸塩、それぞれpH3.5、pH4およびpH4.5)10CVによって洗浄した。
生成物プールの純度の特性評価
本明細書において明記された実施例において、IgG会合体のレベルは、サイズ排除クロマトグラフィー/HPLCを使用して測定された。Zorbax GF450(Agilent cat884973−902、S/N USMX006417)カラムは、0.2Mリン酸ナトリウム、pH7のバッファーを使用して、1mL/分の流速で実施された。試料は注入され、保持時間は、既知の標準と比較された。
Claims (16)
- 試料中の1つ以上の不純物からFc領域含有標的タンパク質を精製する方法であって、
(a)試料をアフィニティークロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、
(b)アフィニティー媒体から、Fc領域含有標的タンパク質を溶出するステップ、
(c)溶出物をカチオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、
(d)カチオン交換クロマトグラフィー媒体を、ウイルスの不活化に適切な時間4.0より低いpHを有するバッファーに接触させるステップ、ここでバッファーの伝導率は5から50mSであり、
(e)カチオン交換クロマトグラフィー媒体から、Fc領域含有標的タンパク質を溶出するステップ、
(f)溶出物をアニオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、および
(g)Fc領域含有標的タンパク質を回収するステップ
を含み、ステップ(b)と(c)およびステップ(e)と(f)との間の集積タンクの必要性を排除する、方法。 - 試料中の1つ以上の不純物からFc領域含有標的タンパク質を精製する方法であって、
(a)試料をアフィニティークロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、
(b)アフィニティー媒体から、Fc領域含有標的タンパク質を溶出するステップ、
(c)溶出物をカチオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、
(d)カチオン交換クロマトグラフィー媒体を、ウイルスの不活化に適切な時間4.0より低いpHを有するバッファーに接触させるステップ、ここでバッファーの伝導率は5から50mSであり、
(e)カチオン交換クロマトグラフィー媒体から、Fc領域含有標的タンパク質を溶出するステップ、
(f)溶出物をアニオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、および
(g)Fc領域含有標的タンパク質を回収するステップ
を含み、ステップ(b)と(c)およびステップ(e)と(f)との間のバッファー交換のステップの必要性を排除する、方法。 - 試料中の1つ以上の不純物からFc領域含有標的タンパク質を精製する方法であって、
(a)試料をアフィニティークロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、
(b)アフィニティー媒体から、Fc領域含有標的タンパク質を溶出するステップ、
(c)溶出物をカチオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、
(d)カチオン交換クロマトグラフィー媒体を、ウイルスの不活化に適切な時間4.0より低いpHを有するバッファーに接触させるステップ、ここでバッファーの伝導率は5から50mSであり、
(e)カチオン交換クロマトグラフィー媒体から、Fc領域含有標的タンパク質を溶出するステップ、
(f)溶出物をアニオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、および
(g)Fc領域含有標的タンパク質を回収するステップ
を含む、ステップ(b)と(c)ならびにステップ(e)と(f)との間の集積タンクおよびバッファー交換のステップの必要性を排除する、方法。 - ステップ(a)と(b)との間の前溶出のステップをさらに含む、請求項3の方法。
- Fc領域含有標的タンパク質が、抗体、免疫接着分子およびFc融合タンパク質、ならびにこれらのFc含有断片からなる群から選択される、請求項3の方法。
- 抗体が、モノクローナル抗体である、請求項5の方法。
- ステップ(b)が、2.0から4.0の範囲のpHを有するバッファーの使用を含む、請求項3の方法。
- 前溶出のステップが、アフィニティー媒体をカチオン交換クロマトグラフィーバッファーに接触させることを含む、請求項4の方法。
- ウイルスの不活化に適切な時間が15分から60分に及ぶ範囲である、請求項1の方法。
- ステップ(e)が、5.0から9.0の範囲であるpHを有するバッファーの使用を含む、請求項3の方法。
- ステップ(e)が、6.0から8.0の範囲であるpHを有するバッファーの使用を含む、請求項3の方法。
- ステップ(b)が、5から50mSの範囲の伝導率を含むバッファーの使用を含む、請求項3の方法。
- ステップ(b)が、12から25mSの範囲の伝導率を含むバッファーの使用を含む、請求項3の方法。
- アフィニティークロマトグラフィー媒体が、プロテインAまたはこの機能的変異体を含む、請求項3の方法。
- 試料中の1つ以上の不純物からFc領域含有標的タンパク質を精製するための連結された方法であって、
(a)試料をアフィニティークロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、
(b)アフィニティー媒体から、Fc領域含有標的タンパク質を溶出するステップ、
(c)溶出物をカチオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、
(d)カチオン交換クロマトグラフィー媒体を、ウイルスの不活化に適切な時間4.0より低いpHを有するバッファーに接触させるステップ、ここでバッファーの伝導率は5から50mSであり、
(e)カチオン交換クロマトグラフィー媒体から、Fc領域含有標的タンパク質を溶出するステップ、
(f)溶出物をアニオン交換クロマトグラフィー媒体に接触させるステップ、および
(g)Fc領域含有標的タンパク質を回収するステップ
を含む、連結された方法。 - ステップ(b)と(c)ならびにステップ(e)と(f)との間の集積タンクおよび/またはバッファー交換のステップの必要性を排除する、請求項15の連結された方法。
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