CN103917555A - 人tnf特异性的牛科动物多克隆抗体 - Google Patents

Abstract

本公开提供一种包含特异性结合到人肿瘤坏死因子(hTNF)的多克隆抗体的组合物，其中所述多克隆抗体衍生自已通过hTNF或其免疫原性部分免疫的牛科动物的血清、奶或初乳。进一步提供用于抗hTNF多克隆抗体的抗原特异性分析的方法。

Description

人TNF特异性的牛科动物多克隆抗体

政府支持

本发明完全地或部分地得到NIH资助号1R43DE019735-01、1R43DK083810-01A1和2R44DK083810-02以及得到HHS合同HHSO100201100027C的支持。政府享有本发明的某些权利。

发明背景

抗体是一类重要的药物。已证实靶抗原特异性的抗体是治疗癌症和自身免疫疾病高度有效的治疗剂，并且其用途对深受折磨的患者具有巨大的益处。抗体通常为具体靶标高度特异性的，并因此往往具有比小分子治疗剂所见的更低的脱靶毒性。

WO2009/046168、WO2009/020748和US20070184049A1描述了衍生自免疫化哺乳动物的奶的多克隆抗体的用途，以用作局部递送到消化道以靶向于调节一种或多种疾病发病的抗原的治疗剂。初乳和奶（尤其是来源于牛科动物）是用于经口递送给人类患者的多克隆抗体极其安全的来源。人们已经深入探索了牛科动物免疫球蛋白，因为普通牛奶含有大约1.5g/L的IgG。然而，奶和初乳含有其他组分，这些组分自身具有治疗性用途，但是可能在使用衍生自奶源的多克隆抗体治疗某些疾病的情况下不理想。除了通过使供体动物免疫而诱导的特异性抗体外，奶和初乳包含具有其他特异性的抗体和许多其他生物活性的非免疫球蛋白因子，包括但不限于肽和小分子（综述见于Korhnonen{Korhonen和Pihlanto,2007,Curr Pharm Des,13,829-43}和Liang{Liang等人,2011,Int J Environ Res Public Health,8,3764-76}）。

奶和初乳中的具体非免疫球蛋白组分（其中许多单独地或组合地具有生物活性）包括乳铁蛋白、乳过氧化物酶、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、转铁蛋白、溶菌酶、EGF、FGF、IGF-1、IGF-2、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、PDGF、VEGF、NGF、CTGF、胰岛素、蛋白酶、PRP、谷氨酰胺、聚胺、核苷酸、催乳激素、生长激素抑制素、催产素、促黄体激素释放激素、TSH、甲状腺素、降钙素、雌激素、孕酮、IL-1b、TNF、IL-6、IL-10、IL-8、G-CSF、IFN-γ、GM-CSF、C3、C4、乳腺衍生生长因子II、人乳生长因子III、生长激素及生长激素释放因子、酪蛋白、酪蛋白源肽、维生素B1、B2、B6、B12、E、A、C、叶酸、泛酸、β-胡萝卜素、糖原、视黄酸、钙、铬、铁、镁、磷、钾、钠、锌、异亮氨酸、亮氨酸、组氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、色氨酸、精氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、丙氨酸、酪氨酸、脯氨酸、天冬氨酸、丝氨酸、β-2微球蛋白、血凝乳酶(Haemopexin)、亲血色球蛋白(haptoglobulin)、乳清酸、过氧化物酶和黄嘌呤氧化酶。

初乳广泛用作营养补充剂，并已作为治疗剂进行了研究。{Khan等人,2002,Aliment Pharmacol Ther,16,1917-22}。还已表明，它在结肠炎动物模型中有效{Bodammer等人,2011,J Nutr,141,1056-61}。

许多研究人员已通过浓缩上列非免疫球蛋白组分中的一种或多种然后去除诸如免疫球蛋白和酪蛋白的其他组分而利用了初乳和奶的此类非免疫球蛋白组分的治疗性用途。此类浓缩的生长因子的潜在治疗性用途包括治疗消化疾病以及治疗消化道炎症。初乳已被视为多种肠道疾病的有益治疗措施。衍生自奶或初乳的生长因子已被考虑了其在化疗引起的粘膜炎中的用途。奶衍生生长因子和其他生物活性组分的富集方法是本领域已知的。本领域公开了用于口服以治疗疾病尤其是因病原体感染所致的胃肠疾病的牛科动物源性抗体的组合物。然而，本领域未设想与存在于奶或初乳中的非免疫球蛋白组分分离的此类抗体的用途，尤其是在经口递送时。实际上，此前据信，初乳的此类非免疫球蛋白组分使口服用抗体稳定化。

之前未认识到，在药用抗体产品中存在多种活性非免疫球蛋白因子可能存在问题。因存在非免疫球蛋白生物活性物质而引起的其中一些问题在此列出。其一，这些非免疫球蛋白因子中的一些的水平受到奶牛健康、农场管理实践和采奶所处的泌乳期的影响。例如，在来自55头奶牛的初乳的一项调查中{Kehoe等人,2007,J Dairy Sci,90,4108-16}，乳铁蛋白的平均水平为0.8mg/ml，但各头奶牛的范围为0.1mg/ml–2.2mg/ml。这为产品带来了波动来源，从而使得难以实现许可生物制品所需的制造一致性。

这些非免疫球蛋白因子的表达的波动尤其具有挑战性，因为已不可能清楚地鉴定负责初乳生物活性的单一组分或组分混合物。在一个方面，这使得非常难以实现产品均一性。在另一方面，使得难以设定产品的技术规范。

其二，这些非免疫球蛋白因子中的一些可作用于治疗剂中的特异性抗体所靶向的相同通路或疾病过程。这将使得难以评价因施用特异性抗体而产生的治疗有益效果。

其三，这些非免疫球蛋白因子中的一些可能与安全性问题存在关联，尤其是在给予患有胃肠疾病的患者时。这在抗体产品旨在长期施用时尤其如此。例如，长期暴露于生长因子可增加恶性肿瘤的风险。

因此，存在这样一种需要：开发组合物和方法以允许制造一致的抗体产品，这种产品不含潜在地在治疗上造成混淆的活性，包括存在非免疫球蛋白因子杂质。

抗体通常为具体靶标高度特异性的，并因此往往具有比小分子治疗剂所见的更低的脱靶毒性。本文称为“TNF”的肿瘤坏死因子α特异性的单克隆抗体包括称为的治疗性单克隆抗体，它们在治疗炎性肠病中有效。然而，它们的使用与升高的恶性肿瘤风险和升高的严重感染风险存在关联(Bongartz等人,2006,JAMA,295,2275-85)，这可能是由于全身性免疫抑制所致。因此，存在这样一种需要：生成能够将抗体导向其中临床有益效果将最大的位置而使抗体在其他部位的活性降至最低的方法和抗TNF抗体的药物组合物。

抗TNF抗体治疗剂的用途通常还受到所施用的抗体的免疫原性的限制。针对治疗剂诱导抗体与活性的损失以及与不良输注反应的可能性存在关联。在抗体衍生自非人类物种时，最清楚地观察到免疫原性。然而，人类抗人抗体反应(HAHA)的存在也有描述，并且是重大临床问题的原因(Ritter等人,2001,Cancer Res,61,6851-9;Tracey等人,2008,Pharmacol Ther,117,244-79)。在炎性肠病的治疗中，用全身性施用的抗TNF抗体治疗的患者常常因中和抗体的诱导而变得对抗体疗法无反应(Tracey等人,2008,Pharmacol Ther,117,244-79)。因此，存在这样一种需要：生成能够使免疫原性最小化同时维持疗效的方法和抗体治疗剂的药物组合物；以及这样一种需要：生成可用于治疗已变得对现有抗TNF抗体治疗剂无反应的患者的方法和药物组合物。

使用多克隆抗体与使用单克隆抗体相比具有潜在的临床优势，原因是在多克隆抗体中存在针对抗原靶的多种反应性。可生成一种多克隆抗体，它具有针对诸如人肿瘤坏死因子(hTNF)的抗原靶上的全部或多个表位的反应性。由于含有许多表位特异性的组合物的多克隆性质，当使用多克隆抗体时可在靶抗原上实现的功能性抗体密度明显高于单克隆抗体。这导致更有效的靶抗原封闭或清除。此外，由于组合物的多克隆性质，靶抗原上的若干表位可被同时封闭，从而导致更有效的生物活性封闭。由于生物活性TNF作为展示出各个表位的多个拷贝的三聚体存在(Santora等人,2001,Anal Biochem.299:119-29)，因此多克隆抗体在通过多个重复表位使三聚TNF分子交联而形成免疫复合物时更有效。此类免疫复合物将会有利于通过网状内皮系统更有效地清除生物活性TNF。

与单克隆抗体形成相比，多克隆抗体制备物包含混合的特异性，因此，将以非常低的浓度递送具有特定特异性的任何单一和各个交叉反应抗体，从而大大降低因交叉反应性所致的有害副作用的可能性。多克隆抗体制备物任何不想要的交叉反应性可通过对抗体组合物的进一步纯化而除去。如果单克隆抗体导致不想要的交叉反应性，则它是所存在的单一抗体固有的，当然无法在不破坏制备物活性的情况下除去。

在削弱的交叉反应可能性方面，多克隆抗体诱导中和抗个体基因型免疫反应的可能性也将比单克隆抗体低得多，原因是所施用的多克隆抗体制备物的各个单一表位特异性个体基因型以非常低的量或浓度存在，可能低于生成抗个体基因型反应的阈值。

虽然多克隆抗体结合到靶抗原上的多个表位，但是特定的多克隆抗体不会识别所有可能的表位。某些表位是免疫原性的，而其他表位是非免疫原性的。某些免疫原性表位将比其他免疫原性表位具有更大程度的免疫显性。特定免疫原性表位的相对免疫显性受到该表位与生成多克隆抗体的宿主动物中天然存在的同源表位之间的同源程度的影响。相对免疫显性还受该表位暴露于宿主免疫反应的影响，并可通过在免疫前有意地或通过与特定佐剂的相互作用使抗原解折叠或以其他方式变性而操纵。相对免疫显性还受所用的特定免疫方案的影响，因为免疫原的剂量和加强免疫的次数及时间均可能通过称为亲和力成熟的过程选择特定的抗体特异性而改变特定表位的相对识别。

多克隆抗体的特异性对其功能具有重要意义。多克隆抗体中一些单独的抗体分子可在不干扰生物活性的位点结合到靶抗原。其他单独的抗体分子可在干扰某些生物活性但不干扰其他生物活性的位点结合到靶抗原。这对具有复杂作用机理的抗原尤其如此。TNF例如是一种三聚分子，它在可溶性形式和膜结合形式中均具有活性，并结合到至少两类单独的受体。因此，重要的是在功能上限定多克隆抗体的特异性。

治疗性抗TNF抗体的体内作用机理还不是很清楚，尤其是对于已在体外确定的许多可能机理的相对贡献和涉及到的具体TNF表位而言。可溶形式的TNF的可能抑制机理包括封闭其与多种多样的细胞类型上的任一类或两类TNF受体TNFR1和TNFR2的结合，以及免疫复合物清除机理。TNF的膜结合形式可充当TNFR2的配体或充当“受体”以引发反向信号转导机理，因此抗TNF抗体可通过封闭与TNFR2的相互作用或通过激活反向信号转导机理而作用于膜结合TNF。因此，为了确保多克隆抗体批次之间的重现性，尤其是那些用作临床治疗剂的抗体，重要的是开展确定多克隆抗体具体特异性的测定。

确定多克隆抗体特异性的一种方式是评价多克隆抗体结合到同源抗原和/或在功能上抑制同源抗原（诸如来自不同物种的相同抗原）的能力。抗体的物种特异性提供多克隆抗体所识别的表位的特定平衡的指纹，并因此是确定和鉴定特定多克隆抗体的关键要素。结合可使用诸如ELISA或RIA的免疫测定法或使用诸如平衡透析或采用BIAcore仪器的表面等离子体共振的直接结合测定法加以评价。TNF中和功能可在可溶性TNF或膜结合TNF的测定法中加以评价，诸如通过标准体外L929测定法。

确定多克隆抗体特异性的另一方式是评价hTNF的重组变体（与TNF相关的分子，诸如其他细胞因子（如淋巴毒素））的结合和抑制，以及与hTNF的肽片段的结合。

确定多克隆抗体特异性的另一种方式是通过表位作图。多克隆抗体的表位作图提供靶抗原与多克隆抗体相互作用和结合的那些部分的相关信息。

存在对用在临床环境中时具有比现有技术药剂更少的潜在副作用的新型抗TNF药剂的需要。

发明概要

在一个实施方案中，本发明提供一种包含特异性结合到衍生自已通过人hTNF或其抗原部分免疫的牛科动物的血清、奶或初乳的hTNF的多克隆抗体的组合物。此类多克隆抗体在本文也称为“抗hTNF多克隆抗体”或“牛科动物源性抗hTNF多克隆抗体”。如本文所用的术语“特异性结合hTNF”或“hTNF特异性的”意指本发明的多克隆抗体能够结合到hTNF。

与各种物种的TNF的交叉反应性程度有效地确定多克隆抗体主要在hTNF中所结合的表位，因为一些表位是高度保守的，而其他表位则在物种之间不同。通过来自不同物种的TNF的交叉反应性确定的表位谱可能无法通过各TNF物种的序列同源性加以预测，也无法通过用于免疫的佐剂加以预测；因此，抗人TNF多克隆抗体的TNF物种特异性谱不能预料，并限定本发明的独特组合物。根据本发明，本发明的抗hTNF多克隆抗体的抗原特异性分析是独特的，并且此前尚未针对现有技术的抗hTNF多克隆或单克隆抗体进行描述。

由于在从啮齿类动物到灵长类动物的物种中TNF一级结构的高度同源性(>75%)，预计在由牛科动物多克隆抗体识别的人TNF上的一些抗原表位将与来自其他物种的TNF分子共有。然而，多克隆抗体与各TNF物种的交叉反应性程度代表了本发明的抗hTNF多克隆抗体的独特抗原特异性。此外，对于TNF结合抗体以及对于TNF中和抗体而言，在各TNF物种之中的交叉反应性模式均是本发明的抗hTNF多克隆抗体的抗原特异性的独特指纹。

在一个优选的实施方案中，本发明的多克隆抗体结合并中和人TNF。在一个实施方案中，多克隆抗体还结合和/或中和选自食蟹猴TNF和恒河猴TNF的非人灵长类动物的TNF。在一个实施方案中，除了结合hTNF外，多克隆抗体还结合犬科动物TNF。在一个实施方案中，多克隆抗体结合犬科动物TNF的程度大于食蟹猴TNF，而中和食蟹猴TNF的程度大于犬科动物TNF。在一个实施方案中，多克隆抗体同抗体与hTNF的交叉反应性比与鼠TNF的交叉反应性低约2%，优选低约1%。在一个实施方案中，多克隆抗体在中和鼠科动物TNF方面具有可忽略不计的活性。

在一个实施方案中，多克隆抗体结合在大约选自以下氨基酸位置内的hTNF上的至少一个表位：SEQ ID NO:1的第1-15位氨基酸、SEQ ID NO:1的第21-35位氨基酸、SEQ ID NO:1的第61-65位氨基酸、SEQ ID NO:1的第91-95位氨基酸、SEQ ID NO:1的第131-140位氨基酸及其任何组合。在一个实施方案中，本发明的多克隆抗体结合到hTNF的至少一个表位，其中hTNF表位包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6。

在一个实施方案中，本发明的抗hTNF多克隆抗体诱导表达跨膜TNF的外周血单核细胞(PBMC)中的细胞凋亡。

在一个实施方案中，hTNF特异性的多克隆抗体的效价在通过ELISA测试时为至少1mg/ml（其中将效价定义为产生半最大反应的抗体浓度并且其中浓度由BCA测定法中的蛋白浓度限定）。在一个实施方案中，多克隆抗体在细胞毒性测定中抑制hTNF，并且优选地，在测定中的hTNF抑制效价当作为EC₅₀计算时为约0.1mg/ml，更优选0.03mg/ml或更高（其中将EC₅₀定义为生成hTNF的半最大抑制的抗体浓度并且其中浓度由BCA测定法中的蛋白浓度限定）。

在一个实施方案中，本发明的多克隆抗体具有上述特色实施方案中的任何两个或更多个的组合。

本发明还提供药物组合物以及将本发明的抗hTNF多克隆抗体药物组合物用于治疗疾病的方法，其中TNF在该疾病的发病中存在牵连。在一个优选的实施方案中，将本发明的药物组合物局部递送到消化道中的患病区域，诸如经口或经直肠递送到消化道。

在一个优选的实施方案中，包含本发明的抗hTNF多克隆抗体组合物的药物组合物可用于治疗炎性疾病，包括消化道的炎性疾病，诸如炎性肠病，包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。

在一个实施方案中，包含本发明的抗hTNF多克隆抗体组合物的药物组合物可用于治疗口腔或胃肠粘膜炎，包括由放疗或化疗导致的粘膜炎。

在一个实施方案中，包含本发明的抗hTNF多克隆组合物的药物组合物可用于治疗因暴露于辐射而导致的消化道炎症和损害，包括治疗性暴露于辐射和非治疗性暴露于辐射，包括胃肠急性放射综合征(GI-ARS)。

在一个实施方案中，本发明包括向非人动物施用本发明的多克隆抗体，以收集临床前或临床数据。非人动物可以是健康的（例如，毒理学研究），或可以患有待通过本发明的hTNF多克隆抗体治疗的障碍，诸如目标疾病的非人动物模型。在一个实施方案中，所测试的非人哺乳动物是粘膜炎或炎性肠病动物模型，诸如在Bowen等人,J.Support.Oncol(2011)9:161-168；Mizoguchi和Mizoguchi,(2008)J.ofGastroenteraol(2008)43:1-17和Watkins等人(1997)Gut40:628-633中所述的那些动物模型。在一个实施方案中，所测试的非人哺乳动物是胃肠急性放射综合征(GI-ARS)动物模型，诸如在Williams等人,Radiation Research Society(2010)173:557-578中所述的动物模型之一。在一个实施方案中，非人动物是表达与本发明的hTNF多克隆抗体具有交叉反应性的TNF的同源物，诸如狗、猴、小型猪或豚鼠。

本发明还提供制备包含特异性集合到hTNF的多克隆抗体的组合物的方法，包括以下步骤：用hTNF或其抗原部分和佐剂接种牛科动物，优选地其中佐剂为Quil A、Montanide ISA201VG、或以及在牛科动物已对hTNF产生免疫反应后从动物中回收血清、奶或初乳。

在一个实施方案中，本发明的组合物去除了非免疫球蛋白因子。在一个实施方案中，生物来源为奶或初乳。在一个优选的实施方案中，生物来源为来自通过靶抗原或其免疫原性部分免疫的动物的奶或初乳。在一个实施方案中，组合物去除了乳铁蛋白。在一个实施方案中，组合物去除了低分子量生长因子。在一个实施方案中，组合物去除了非免疫球蛋白因子，并进一步去除了非靶抗原特异性的免疫球蛋白。

本发明的多克隆抗hTNF抗体在用于hTNF中和的标准细胞毒性生物测定法中进行测试时与现有技术的单克隆抗hTNF抗体一样强效，但预计在临床环境中使用时具有更少的副作用。本发明的抗hTNF多克隆抗体的表征以及制备和使用这些抗体并任选地对它们进行纯化的工艺在本文予以描述。

附图简述

通过以下对附图中所示的本发明的优选实施方案的更具体描述，本发明的前述及其他目标、特征和优点将显而易见，在附图中相同的参考符号在所有不同的视图中表示相同的部分。附图未必按比例绘制，而是将重点放在示出本发明的原理上。

图1是折线图，显示了抗人TNF ELISA数据。将ELISA板用rhTNF包被，然后将3倍稀释序列的牛科动物抗TNF血清(Serum-470)样品加入板中。进行了比色分析，并测定了450nm处的光密度。显示的是通过四种不同的佐剂生成的人TNF的抗血清中存在的抗体的曲线。

图2是折线图，显示了抗牛科动物Ig ELISA数据。将ELISA板用抗牛科动物IgG包被。将Serum-470的混合样进行系列稀释，然后加到板中并洗涤。使用过氧化物酶偶联的抗牛科动物IgG抗体检测了结合。显示的是通过四种不同的佐剂生成的人TNF的抗血清中存在的抗体的结合曲线。

图3是柱状图，显示了得自不同动物物种的TNF的Serum-470（Quil A佐剂）的相对ELISA滴度。

图4是柱状图，显示了得自不同动物物种的TNF的Serum-470（Quil A佐剂）的相对ELISA滴度和L929IC50。

图5是折线图，显示了抗牛科动物Ig ELISA数据。

图6是折线图，显示了得自不同动物物种的TNF的L929IC50。

图7是折线图，显示了通过竞争ELISA测得的TNF的亲和纯化人AVX-470(AVX-470A)的亲和力。

图8是折线图，显示了通过ELISA测得的亲和纯化人AVX-470(AVX-470A)的效价。

图9是折线图，显示了在标准体外L929测定法中通过中和而评价的亲和纯化AVX-470(AVX-470A)的效价。

图10显示了FACS分析的读出，表明了对用AVX-470或英夫利西单抗处理的人类细胞的细胞凋亡的诱导。

发明详述

如本文所用的术语“免疫球蛋白(Ig)是指特异性结合并识别抗原的包含来自免疫球蛋白基因或其片段的骨架区的多肽。免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因以及许多免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，它们继而分别限定免疫球蛋白类IgG、IgM、IgA、IgD（不存在于牛科动物中）和IgE。通常，免疫球蛋白的抗原结合区在结合到靶受体的特异性和亲和力方面最为关键。示例性免疫球蛋白结构单元包括四聚体，并且在本文也称为“抗体”并包括多克隆抗体。各四聚体由两对相同的多肽链组成，每一对具有一条“轻”链（约25kD）和一条“重”链（约50-70kD）。各条链的N端限定主要负责抗原识别的约100至110个或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(V_L)和可变重链(V_H)分别是指这些轻链和重链。

免疫球蛋白例如作为完整的抗体或作为多种得到充分表征的由各种肽酶的降解而产生的抗体片段（例如Fab、F(ab’)₂、Fab’、Fc）而存在。免疫球蛋白还例如作为可存在于生物来源诸如奶或初乳中的片段而存在，这些片段是天然降解或与奶或初乳的加工相关的降解的结果。如本文所用，术语免疫球蛋白包括与免疫球蛋白相关的多肽，诸如分泌成分以及与IgA和IgM相关的J链组分。因此，如本文所用，术语免疫球蛋白(Ig)组合物是指完整抗体（包括多克隆抗体）或其片段或衍生自所有免疫球蛋白同种型的与之相关的蛋白组分的组合物。

如本文所用的术语“多克隆抗体”是指包含不同的抗体分子的组合物，这些抗体分子能够结合到相同或不同抗原上的多种不同的特异性抗原决定簇（在本文也称为“表位”）或与之反应。多克隆抗体的抗原特异性的变动位于构成多克隆抗体的各个抗体分子的可变区中以及位于构成多克隆抗体的抗体分子的特定混合物中。优选地，包含本发明的多克隆抗体的组合物通过用如下规定的靶抗原或其部分对动物进行免疫而制备，并衍生自从免疫的动物得到的血、奶或初乳。

包含衍生自免疫动物的血清（血）、奶或初乳的多克隆抗体的组合物除了靶抗原特异性抗体外通常还含有非免疫原特异性的抗体。根据一个优选的实施方案，本发明的抗hTNF多克隆抗体组合物包含至少0.3%或更多的特异性中和hTNF的抗体。

其他非免疫球蛋白因子也可存在于衍生自动物血、奶或初乳的本发明的多克隆抗体组合物中。靶抗原（例如hTNF）特异性的多克隆抗体可进一步从多克隆抗体制备物中纯化，或者可不进一步纯化而使用多克隆抗体制备物。然而，在一个优选的实施方案中，本发明的多克隆抗体已基本上去除了非免疫球蛋白因子，如本文所述。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体的制备物。单克隆抗体组合物对于靶抗原的特定表位显示出单一结合特异性和亲和力。单克隆抗体的混合物因此不被视为多克隆抗体。然而，如果单克隆抗体的混合物提供本发明的多克隆抗体相同的独特特性，则此类单克隆抗体被视为本发明的多克隆抗体的等同物。

“表位”是分子被抗体结合的部分。表位也称为决定簇或抗原决定簇。结合到相同抗原上的不同表位的多克隆抗体可对它们结合的抗原的活性具有不同的作用，具体取决于表位的位置。结合到抗原活性侧中的表位的抗体可完全封闭抗原的功能，而结合在不同表位的另一多克隆抗体单独地可对抗原的活性无影响或具有很少的影响。然而，此类抗体仍可激活补体或其他效应子功能并因而导致抗原的消除，并可导致结合到相同抗原上不同表位的多克隆抗体的协同作用。

抗原或免疫原的“免疫原性部分”或“免疫原性片段”是抗原免疫原能够在通过该抗原或免疫原免疫的宿主动物中诱导免疫反应并优选地导致动物生成针对靶抗原的多克隆抗体的任何部分。在一个优选的实施方案中，免疫原是hTNF或其免疫原性片段。

出于本发明的目的，“消化道”由嘴、咽、食道、胃、小肠（十二指肠、空肠、回肠）、大肠（盲肠、结肠、直肠）和肛门组成。出于本发明的目的，“口腔”应理解为包括嘴、咽和食道。出于本发明的目的，“胃肠道”或“GI道”应被理解为包括胃、小肠（十二指肠、空肠、回肠）、大肠（盲肠、结肠、直肠）和肛门。

人肿瘤坏死因子(hTNF)是在许多疾病的发病中存在牵连的细胞因子，包括炎性疾病，诸如炎性肠病，包括克罗恩病和溃疡性结肠炎。还已证实，TNF的抑制可治疗粘膜炎（包括由化疗或放疗导致的粘膜炎）和因暴露于治疗源（诸如用于治疗癌症和其他疾病的放疗）和非治疗源（包括GI急性放射综合征(GI-ARS)）产生的辐射而导致的损伤(WO2009/046168)。

在人类和动物物种中，TNF在从其细胞表面结合前体（跨膜TNF(tmTNF)，26kDa单体的同三聚体）酶促裂解后作为成熟的/可溶的TNF(sTNF)（17-kDa单体的同三聚体）而释放。重组人类TNF和得自各种动物物种的重组TNF是由cDNA转染的细菌细胞表达的并经纯化成同质的sTNF的基因衍生同源物。TNF的生物功能通过TNF三聚体结合到多种多样的细胞类型的表面上的两种不同TNF受体TNFR1和TNFR2中的任一者而引发。将会预见，针对受体结合氨基酸上或附近的TNF上的表位的抗体能够封闭TNF与其受体的结合并中和其生物活性。此外，一些抗TNF抗体可结合到不干扰受体结合并且不中和TNF活性的TNF上的表位。人类TNF单体为157个氨基酸长并在本文通过SEQ ID NO:1的第1-157位氨基酸表示，但也可通过前体形式的第76-233位氨基酸表示，并且未糖基化。

如本文所用的术语“非免疫球蛋白因子”包括非免疫球蛋白和肽、非免疫球蛋白大分子和小分子。非靶抗原特异性的存在于生物来源诸如初乳、奶或血清中的抗体在本文称为“非特异性抗体”。术语“靶抗原”是指组合物的多克隆抗体旨在发生结合的抗体。

如本领域所理解的是，靶抗原是存在于患者中的抗原，该患者将最终通过为靶抗原特异性的本发明的多克隆抗体组合物进行治疗。因此，根据本发明的多克隆抗体将在施用给患者时结合靶抗原。例如，对于TNF特异性的多克隆抗体而言，当患者为人类患者时，靶抗原优选地为人类TNF（本文也称为“hTNF”）。

在一个优选的实施方案中，组合物包含从牛科动物（优选免疫化奶牛）的奶或初乳中分离的hTNF特异性的多克隆抗体。在一个实施方案中，多克隆抗体为牛科动物IgG抗体。在一个实施方案中，多克隆抗体为存在于奶或初乳中的混合Ig同种型（包括IgA、IgM和IgG）的牛科动物抗体。

牛科动物初乳（早期奶）是本发明的多克隆抗体组合物的优选来源。在奶牛中，抗体不跨过胎盘，并因此所有被动免疫均通过初乳转移到新生牛。因此，奶牛在分娩后立即分泌大量的抗体到初乳中，并且初乳中约50%的蛋白是免疫球蛋白。在出生后的前4小时中，50mg/ml的免疫球蛋白浓度通常存在于初乳中(Butler和Kehrli,2005,Mucosal Immunology,1763-1793)，在24小时后降到25-30mg/ml(Ontsouka等人,2003,J Dairy Sci,86,2005-11)。如本文所用，术语“初乳”是指在分娩后的前3至4天内由奶牛产生的乳状分泌物。在一些情况下，将规定初乳从分娩后的特定时间框架内分离（例如，分娩后首次挤奶初乳、第一天初乳或前3至4天的初乳）。

产生本发明的特异性靶向抗原的多克隆抗体的一般方法是本领域技术人员已知的（参见例如Coligan,Current Protocols inImmunology(1991)；Harlow&Lane,Antibodies,A Laboratory Manual(1988)；Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice(第2版1986)和Kohler&Milstein,Nature256:495-497(1975)）。此类技术包括通过使合适的动物免疫而制备多克隆抗体（参见例如Huse等人,Science246:1275-1281(1989);Ward等人,Nature341:544-546(1989)）。本发明提供获得本发明的多克隆抗体的优化方法，并且此类方法在本文予以描述。

多种包含hTNF或其抗原或免疫原性片段或部分的免疫原可用于产生与hTNF特异性反应的抗体。例如，hTNF的抗原或免疫原性片段或蛋白部分可使用已知的程序从合适的来源诸如组织培养物中分离。在一个优选的实施方案中，免疫原为重组人类TNF(rhTNF)。重组hTNF可在真核或原核细胞中表达，并如本领域所已知而纯化。可选地，衍生自rhTNF的合成肽可用作免疫原。合成肽可在免疫前偶联到载体蛋白。纯或不纯形式的天然存在的hTNF也可以使用。然后将产品注射进能够产生抗体的动物，优选牛科动物。动物也可用已通过hTNF转染的细胞免疫，或可通过编码hTNF的DNA免疫。

在一个优选的实施方案中，用于接种动物的免疫原还包含佐剂以增强动物中的抗体反应。选择合适的佐剂非常重要，因为佐剂具有影响以下方面的能力：细胞介导的免疫的滴度、同种型、亲合力和性质的能力，以及如本文的“实施例”中所证实，本发明的抗hTNF多克隆抗体的抗原物种特异性谱。佐剂包括但不限于油包水乳液，诸如完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IFA)和可得自Seppic,Paris,France的Montanide ISA201VG（不完全seppic佐剂、水包油包水双重乳液）；Montanide ISA-25；水包油乳液，诸如可得自MVP Laboratories,OmahaNebraska的和铝盐佐剂；基于免疫调节剂GMDP（一种得自保加利亚乳酸杆菌细胞壁的糖肽）的Gerbu佐剂(GERBU Biochemicals GmbH,Gaiberg,Germany)；和皂苷，诸如Quil A。

在一个优选的实施方案中，本发明提供用于制备包含特异性结合到hTNF的多克隆抗体的组合物的方法，所述方法包括以下步骤：用hTNF和佐剂接种牛科动物，优选地其中佐剂为Quil A、Montanide ISA201VG、或以及在牛科动物已对hTNF产生免疫反应后从动物回收血清、奶和/或初乳。在另一个优选的实施方案中，佐剂为Montanide ISA-25。

在一个实施方案中，动物接受三次间隔2-3周的通过hTNF抗原和佐剂组合进行的免疫。在一个实施方案中，动物接受四次间隔2-3周的通过hTNF抗原和佐剂组合进行的免疫。

在一个实施方案中，本发明提供一种多克隆抗体的组合物，该抗体结合和/或中和得自适于进行安全性毒理学研究的物种的TNF。在药品的开发中，必须在开始人类临床试验前在动物中测试新型原料药或药品。在一些药品的开发中，诸如用于治疗GI急性放射综合征的那些，不可能在人类临床试验中评价疗效，而药物的上市批准基于动物模型中的疗效研究。优选的是，原料药或药品在动物物种中显示出相关的反应性。食蟹猴和恒河猴是两种优选的物种。狗和猪是其他优选的物种。

如本文所用，“中和TNF活性”的本发明的多克隆抗体是指其结合到TNF导致TNF的生物活性受到抑制的抗体。这种TNF生物活性抑制可通过测量TNF生物活性的一个或多个指标而评估，诸如TNF诱导的细胞毒性（体外或体内）。这些TNF生物活性指标可通过本领域已知的并在实施例中描述的若干标准体外或体内测定法中的一种或多种加以评估。

优选地，抗体中和TNF活性的能力通过如实施例中所述的对TNF诱导的L929细胞的细胞毒性的抑制来评估。在一个优选的实施方案中，本发明的多克隆抗体在标准体外L929测定法中以4.0pM或更低的Ki中和人类TNF细胞毒性。

抑制常数K_i是抑制剂效价的度量。配体的抗体抑制的K_i可使用Cheng-Prusoff方程的改型由不同配体浓度下的抗体的IC₅₀值计算，该方程最初开发用于测量酶抑制剂的动力学参数(Cheng和Prusoff,(1973)Biochem Pharmacol22:3099–108)。

Cheng-Prusoff方程：K_i=IC₅₀/[1+(A/EC₅₀)]；

其中：

IC₅₀=将TNF活性降低50%所需的血清稀释度

A=用于测定法中的TNF的浓度（通常为EC₉₀）

EC₅₀=将L929细胞的生长抑制50%所需的TNF的浓度。

在一个优选的实施方案中，本发明的多克隆抗体在标准体外L929测定法中以至少约0.03mg/ml的EC50中和人类TNF细胞毒性。

在一个实施方案中，本发明提供还结合并中和得自至少一种选自食蟹猴或恒河猴的非人灵长类动物的TNF的多克隆抗体。例如，本发明的多克隆抗体以hTNF的EC50的2倍内的EC50结合食蟹猴TNF和恒河猴TNF（参见实施例27）。

在一个实施方案中，本发明提供还结合犬科动物TNF的多克隆抗体。在一个实施方案中，多克隆抗体中和食蟹猴TNF的程度大于中和犬科动物TNF。在一个实施方案中，多克隆抗体结合犬科动物TNF的程度大于食蟹猴TNF。

在一个实施方案中，该方法提供与鼠科动物TNF的交叉反应性低于约2%并优选低于约1%的多克隆抗体。鉴于人类TNF与鼠科动物TNF之间的高度氨基酸同一性将会产生这样以下期望：针对人类TNF产生的一群多克隆抗体也会包括在宿主物种（牛科动物）TNF不共有的人类和鼠科动物TNF形式上的保守表位对应的特异性多克隆抗体，因此这种与鼠科动物TNF的低交叉反应性是令人惊讶的。多克隆抗体这种令人惊讶的特性部分地限定本发明的独特特异性和组合物。

本发明人还发现：多克隆抗体的抗原物种特异性谱可在制备多克隆抗体的过程中诸如通过选择与靶抗原一起用于接种牛科动物的佐剂、免疫原的剂量、免疫原的类型（例如片段或完整蛋白）和/或免疫计划而加以调节。这可用于进一步限定有助于本发明的独特抗原特异性和组合物的因素。

在一个实施方案中，本发明的多克隆抗体中和TNF活性的能力通过抗体诱导免疫效应细胞（诸如在表达跨膜TNF的细胞中的活化淋巴细胞）中的细胞凋亡的能力加以评估(Van den Brande等人(2003)Gastroenterology124:1774-1785)。这可通过相关细胞（诸如如实施例31中所述表达跨膜TNF的人类PBMC）中的细胞凋亡测定法进行评估。

本发明的多克隆抗体优选地不特异性结合到其他细胞因子，诸如淋巴毒素(LTα/TNFβ)、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IFNγ和TGFβ。

在一个实施方案中，hTNF特异性的多克隆抗体的滴度在通过ELISA测试时为至少100。在一个实施方案中，hTNF特异性的多克隆抗体的滴度在通过ELISA测试时为至少300。在一个实施方案中，hTNF特异性的多克隆抗体的EC50在通过ELISA测试时为至少1mg/ml。在一个实施方案中，hTNF特异性的多克隆抗体的EC50在通过ELISA测试时为至少0.3mg/ml。

除了通过供体动物免疫而诱导的靶抗原特异性的多克隆抗体外，奶和初乳还含有具有其他特异性的抗体（这里称为“非特异性免疫球蛋白”）和许多其他蛋白、肽和小分子（这里称为“非免疫球蛋白因子”）。这些非免疫球蛋白因子具有多种生物活性并通常被认为是良性的或有益的。

在本发明的一个方面，非免疫球蛋白因子在制造工艺期间从本发明的多克隆抗体组合物中去除。该去除可通过杂质或免疫球蛋白吸收到亲和柱上而完成。可选地，该去除可使用尺寸排阻色谱或相似的技术进行。可选地，该去除可使用超滤/渗滤或相似的技术进行。可选地，该去除可通过杂质或免疫球蛋白吸收到离子交换柱上而进行。可以使用根据本发明用于纯化和分离免疫球蛋白的上述方法的组合。

在本发明的一个方面，在进程内检验期间以及作为包含针对特定靶抗原的多克隆抗体的组合物的放行检验的一部分，对具体的非免疫球蛋白因子的水平进行监控。在一个实施方案中，所有非免疫球蛋白因子的水平降低到初乳中的平均水平的至少五分之一。在一个实施方案中，所有非免疫球蛋白因子的水平降低到初乳中的平均水平的至少十分之一。在一个实施方案中，本发明的多克隆组合物基本上不含非免疫球蛋白因子。

在一个优选的实施方案中，从本发明的多克隆抗体组合物中去除的非免疫球蛋白因子为乳铁蛋白。在一个优选的实施方案中，从本发明的多克隆抗体组合物中去除的非免疫球蛋白因子为一种或多种特定的生长因子。在一个实施方案中，一种或多种特定的生长因子去除到其在初乳中的天然水平的至少五分之一并优选至少十分之一，并且优选地本发明的组合物基本上不含生长因子。

生长因子包括但不限于胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、表皮生长因子(EGF)、神经生长因子(NGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、生长激素和胰岛素。

表1提供显示了天然存在于奶和初乳中的多种非免疫球蛋白因子的一般水平的数据(Ontsouka等人,J.Dairy Sci.86:2005-2011)。

表1

因子	初乳（第2天）	奶
			IGF-1(ug/ml)	103±21	4±1
胰岛素(ug/ml)	4.55±1.04	0.37±0.02
			催乳激素(ug/ml)	120±16	15.4±1.0
TNF-α(ug/ml)	5.0±0.6	1.8±0.2
			γ-谷氨酰转移酶(ukat/L)	137±9	24±8

表2提供显示了天然存在于奶和初乳中的多种非免疫球蛋白因子的一般水平的另外数据(Su,C.K.,和B.H.Chiang(2003)J Dairy Sci.,86:1639-1645)。

表2

因子	初乳	奶
			乳铁蛋白(mg/ml)	1.0	可忽略
BSA(mg/ml)	1.0	0.4
			β-乳球蛋白(mg/ml)	6.0	3.2

α-乳白蛋白

1.1

1.1

表3提供显示了存在于奶和初乳中的多种非免疫球蛋白因子的正常水平的数据(Playford等人,2000,Am.J.Clin.Nutr.72:5-14)。

表3

因子	初乳	奶
			TGF-β(ug/ml)	20-40	1-2
IGF-1(ug/ml)	0.5	0.01

可从根据本发明的衍生自奶或初乳的本发明的多克隆抗体组合物中去除的非免疫球蛋白因子（包括生长因子）包括但不限于表4中所列的那些。

表4

检索表：(-)=负调控、TGF=转化生长因子、MCP=巨噬细胞化学趋化蛋白、MIP=巨噬细胞炎症蛋白、GRO=生长相关癌基因、IL=白介素、VEGF=血管内皮生长因子、PLGF=胎盘生长因子、FGF=成纤维细胞生长因子、HGF=肝细胞生长因子、Cyr61=Cysteine-Rich(富半胱氨酸肝素结合蛋白)61、GM-CSF=粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子、IP=干扰素-γ-诱导蛋白-10、PDGF=血小板衍生生长因子、CTGF=结缔组织生长因子、IGF=胰岛素样生长因子、NGF=神经生长因子、EGF=表皮生长因子、HB-EGF=肝素结合表皮生长因子、NDF=Neu分化因子、BMP=骨形态发生蛋白、Ig=免疫球蛋白、PRP=富脯氨酸多肽、C=补体、IF=干扰素-γ。

已去除了非免疫球蛋白因子的本发明的多克隆抗体组合物在本文有时称为“去除非Ig因子的多克隆抗体组合物”。本发明的此类去除非Ig因子的多克隆抗体组合物适用于治疗疾病，其中该疾病的发病受多克隆抗体所针对的靶抗原的调节。这种治疗还包括在疾病的治疗中减轻与衍生自生物来源的多克隆抗体组合物的使用相关的潜在副作用，而不论治疗是针对急性疾病还是慢性疾病。

本发明的去除非Ig因子的多克隆抗体组合物可进一步接受处理以富含靶抗原特异性的多克隆抗体，其中非特异性免疫球蛋白已从多克隆抗体组合物中选择性去除或移除。多种用于富集针对具体靶抗原的抗体的多克隆抗体的技术是本领域技术人员已知的。在一个实施方案中，存在于本发明组合物中的至少60%、优选至少70%、优选至少80%、优选至少90%并优选至少95%的免疫球蛋白是靶抗原特异性的多克隆抗体。在一个实施方案中，多克隆抗体组合物富含结合到靶抗原的抗体，使得组合物基本上不含非特异性免疫球蛋白。经过富集以结合到靶抗原的去除非Ig因子的多克隆抗体组合物在本文有时称为“富集的去除了非Ig因子的多克隆抗体组合物”。在一个实施方案中，本发明包括多克隆组合物，其中去除了非特异性抗原并任选地去除了非免疫球蛋白因子。

在一个优选的实施方案中，本发明提供一种包含衍生自牛科动物初乳的分离的和纯化的免疫球蛋白的组合物，该牛科动物已通过靶抗原的全部或一部分免疫，其中该组合物包含能够在如本领域已知的标准测定法中结合靶抗原和/或中和靶抗原和/或改变靶抗原功能的多克隆抗体。此类测定法包括但不限于ELISA、放射性免疫测定法、免疫扩散、流式细胞术、Western印迹、凝集、免疫电泳、表面等离子体共振以及基于靶抗原功能中和或调控的测定法，诸如在基于L929细胞的测定法中TNF的中和。在一个实施方案中，如通过还原性SDSPAGE/光密度法测量，组合物含至少90%的免疫球蛋白。在一个优选的实施方案中，如通过还原性SDS-PAGE/光密度法测量，组合物含至少95%、优选至少97%、优选至少98%并优选至少99%的免疫球蛋白。

在一个实施方案中，乳铁蛋白(LF)、α-乳白蛋白(a-Lac)、β-乳球蛋白(b-Lac)、乳过氧化物酶(LPO)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)中的至少一者去除到其在初乳中的正常水平的至少十分之一。

在一个优选的实施方案中，乳铁蛋白按以下水平存在于衍生自牛科动物初乳的免疫球蛋白组合物中：每克存在于组合物中的总蛋白不超过约10mg，其中组合物的总蛋白含量通过二辛可宁酸(BCA)测定法(Smith,P.K.,等人,Measurement of protein using bicinchoninic acid.Anal.Biochem.150,76-85,(1985))测量，而乳铁蛋白的水平通过ELISA测量。更优选地，乳铁蛋白的水平为约3mg/g总蛋白或更低、更优选约1mg/g总蛋白或更低并且最优选低于1mg/g总蛋白，诸如0.3mg/g或更低。

在一个优选的实施方案中，α-乳白蛋白(a-Lac)按以下水平存在于衍生自牛科动物初乳的Ig组合物中：每克存在于组合物中的总蛋白不超过约75mg并优选不超过约20mg，其中组合物的总蛋白含量通过二辛可宁酸(BCA)测定法测量，而a-Lac的水平通过ELISA测量。更优选地，a-Lac的水平为约3mg/g(w/w)总蛋白或更低、更优选约1mg/g总蛋白或更低并且最优选低于1mg/g总蛋白。

在一个优选的实施方案中，β-乳球蛋白(b-Lac)按以下水平存在于Ig组合物中：每克存在于组合物中的总蛋白不超过约20mg并优选不超过约10mg，其中组合物的总蛋白含量通过二辛可宁酸(BCA)测定法测量，而b-Lac的水平通过ELISA测量。更优选地，b-Lac的水平为约5mg/g总蛋白或更低、并且更优选约3mg/g总蛋白或更低、更优选约1mg/g总蛋白或更低并且最优选低于1mg/g总蛋白。

在一个实施方案中，乳过氧化物酶(LPO)按以下水平存在于Ig组合物中：每克存在于组合物中的总蛋白不超过约10mg，其中组合物的总蛋白含量通过二辛可宁酸(BCA)测定法测量，而LPO的水平通过ELISA测量。更优选地，LPO的水平为约2mg/g(w/w)总蛋白或更低、更优选约1mg/g总蛋白或更低、更优选约0.2mg/g总蛋白或更低并且最优选低于0.2mg/g总蛋白。

在一个实施方案中，胰岛素样生长因子-1(IFG-1)按以下水平存在于衍生自牛科动物初乳的Ig组合物中：每克存在于组合物中的总蛋白不超过约10mg，其中组合物的总蛋白含量通过二辛可宁酸(BCA)测定法测量，而IGF-1的水平通过ELISA测量。更优选地，IFG-1的水平为约1mg/g总蛋白或更低、更优选约0.1mg/g总蛋白或更低并且最优选低于0.1mg/g总蛋白。

在一个实施方案中，本发明提供用于制备包含衍生自牛科动物初乳的分离并纯化的免疫球蛋白的组合物，该牛科动物已通过靶抗原的全部或一部分免疫，其中组合物通过还原性SDS-PAGE/光密度法测定时含至少90%的免疫球蛋白并且基本上去除了包括但不限于乳铁蛋白(LF)、α-乳白蛋白(a-Lac)、β-乳球蛋白(b-Lac)、乳过氧化物酶(LPO)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的非免疫球蛋白因子，并且其中组合物在标准抗体结合测定法中结合靶抗原，其中组合物的制备包括以下步骤：提供衍生自牛科动物初乳的乳清，该牛科动物已用通过本领域已知的程序处理而去除脂肪和酪蛋白的靶抗原免疫；将经处理的乳清的pH调节到6.6至7.0的pH；通过与阳离子交换柱串联的阴离子交换柱过滤乳清，其中乳清按顺序通过串联的两根柱子，而不添加改变盐浓度或pH的材料；在按顺序通过串联的两根柱子后收集流通液(flow through)，而不在收集前添加改变盐浓度或pH的材料；以及通过超滤浓缩流通液。该工艺还可以包括使用例如偶联到靶抗原（诸如hTNF）的亲和基质对通过超滤而浓缩的流通材料进行亲和纯化。该工艺还可以包括使用标准技术对浓缩的流通产物进行冻干或喷雾干燥。该工艺还可以包括通过标准手段（包括“实施例”中所述的测定法）在喷雾干燥或冻干前对浓缩的流通产物进行检测，以确定杂质是否在理想的水平。

在一个实施方案中，存在于乳清中的抗hTNF多克隆抗体的比活性在通过超滤步骤浓缩流通液后提高约2倍。在一个实施方案中，与超滤后的浓缩流通液的hTNF中和活性相比，在亲和纯化材料的标准体外L929测定法中测得的hTNF细胞毒性的中和活性提高至少10倍、优选至少100倍并优选约300倍或更高，其中中和活性按每毫克蛋白的活性表示。

在一个实施方案中，阴离子交换柱是强阴离子交换柱而阳离子交换柱是强阳离子交换柱。适用于本发明的强阳离子交换柱包括但不限于Capto S(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)、ToyoPearlGigaCap S-650M(Tosoh Bioscience,Tokyo,Japan)、S Sepharose XL(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)、MacroPrep High S(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)、TSK Gel BioAssist S(TosohBioscience,Tokyo,Japan)、POROS XS(Life Technologies/AppliedBiosystems,Carlsbad,CA)。适用于本发明的强阴离子交换柱包括但不限于Capto-Q(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)、ToyoPearlGigaCap Q-650M(Tosoh Bioscience,Tokyo,Japan)、Q Sepharose XL(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)、Macro-Prep High Q(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)、TSK gel BioAssist Q(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA)、TSK gel QAE-25SW(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)、POROS HQ(Life Technologies/Applied Biosystems,Carlsbad,CA)。

弱阳离子和阴离子交换柱也将适用于本发明。适用于本发明的弱阳离子交换柱包括但不限于Macro-Prep CM(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)、CM Ceramic Hyper D(Pall Corporation,Port Washington,NY)、CM Sepharose FF(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)。适用于本发明的弱阴离子交换柱包括但不限于TSK-gel DEAE5PW(Tosoh Bioscience,Tokyo,Japan)、TSK-gel DEAE5NPR(TosohBioScience,Tokyo,Japan)、Capto-DEAE(GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ)、DEAE Ceramic Hyper-D(Pall Corporation,PortWashington,NY)、Mustang S(Pall Corporation,Port Washington,NY)、POROS D(Life Technologies/Applied Biosystems,Carlsbad,CA)。

在一个实施方案中，进入柱子的乳清溶液的导电率为约4+/-1毫西门子/厘米。在一个实施方案中，两根柱子的流通液的导电率为约4+/-1毫西门子/厘米。在一个实施方案中，进入柱子的乳清溶液的pH与两根柱子的流通液的pH相同。

该方法尤其可用于制备大量纯化并分离的如上所述基本上去除了非Ig因子的本发明的Ig组合物。使用离子交换层析法从包含多克隆抗体的Ig组合物中去除非免疫球蛋白因子由于多克隆组合物中各种抗体克隆的pI范围在过去一直颇具挑战。之前的方法需要使用具有不同条件和洗脱步骤的多根柱子，以从pI高于或低于多克隆抗体物质的那些pI的非免疫球蛋白因子中分离免疫球蛋白。使用串联的顺序流通阴离子和阳离子交换柱能够大规模纯化多克隆抗体，同时从最终组合物中基本上去除非Ig因子。该方法可在无需多根柱子、单独洗脱和多种工艺条件（诸如pH、盐和温度）变化的情况下实现Ig组合物的纯化和分离。如本文所用，大规模纯化意指至少30L的原料（初乳）。

在一个优选的实施方案中，本发明提供药物制剂，它包含任选的、如本文详细描述的药学上可接受的赋形剂，和基本上由分离并纯化的免疫球蛋白组成的组合物，该免疫球蛋白衍生自已用靶抗原的全部或一部分免疫的牛科动物的初乳，其中组合物在通过还原性SDS-PAGE/光密度法测定时含至少90%的免疫球蛋白，并且每克存在于组合物中的总蛋白对应含有低于约10mg的乳铁蛋白，并且其中组合物的总蛋白含量通过二辛可宁酸(BCA)测定法测量而乳铁蛋白的水平通过ELISA测量，其中该组合物在测定法中结合或调节靶抗原。本发明的药物组合物可去除了如上所述的其他非免疫球蛋白因子，包括但不限于α-乳白蛋白(a-Lac)、β-乳球蛋白(b-Lac)、乳过氧化物酶(LPO)和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)，达到如本文所述的水平。

任选地去除了非Ig因子的包含衍生自牛科动物的hTNF特异性多克隆抗体的本发明的组合物具有若干治疗性和诊断性应用以及在竞争性结合测定法中的用途。

在一个实施方案中，本发明的包含多克隆抗hTNF抗体的组合物可用作治疗多种疾病的药物组合物，其中TNF的产生促成疾病的发病。

在一个实施方案中，该疾病为炎性疾病，诸如炎性肠病或消化道的其他炎性疾病。在一个实施方案中，将本发明的包含多克隆抗hTNF抗体的组合物配制成用于治疗消化道疾病的药物组合物，诸如炎性肠病（包括克罗恩病和溃疡性结肠炎）、粘膜炎以及因暴露于治疗性或非治疗性辐射而导致的消化道损伤。

在一个实施方案中，本发明的包含多克隆抗hTNF抗体的组合物适用于治疗口腔或肠粘膜炎。粘膜炎可例如因放疗、化疗或其任意组合所致。在一个实施方案中，粘膜炎可因暴露于放疗背景之外的高剂量辐射（包括全身照射）所致。在一个实施方案中，本发明的去除非Ig因子的抗TNF多克隆抗体组合物适用于治疗复发性口疮性口炎。在另一个实施方案中，本发明的去除非Ig因子的抗TNF多克隆抗体组合物适用于治疗嗜酸细胞性食管炎、嗜酸细胞性胃炎以及在胃肠道的一部分中涉及高嗜酸性细胞活动的其他病症。本发明的组合物可例如局部施用到口腔以治疗口腔粘膜炎和口疮性口炎，或经口或经直肠施用到消化道例如以治疗肠粘膜炎。

对于消化道的一些疾病，已有治疗措施。例如，小分子和生物疗法均已可用于治疗克罗恩病和溃疡性结肠炎（炎性肠病的两种形式）。目前使用的大多数抗体疗法为设计成全身递送的单克隆抗体，并通过注射施用给患者。已证实，注射的抗体可用于治疗炎性肠病，并且还可用于治疗消化道的其他疾病。然而，全身性施用抗体可影响全身的生理过程，而不仅仅是在消化道内，而这对于一些疾病可能是不利的。

例如，用于治疗炎性肠病的抗TNF抗体与严重的副作用存在关联。例如与临床有益效果相关的抗TNF抗体的血清水平是高于0.5ug/ml的浓度(Nestorov,2005,J Rheumatol Suppl,74,13-8;Tracey等人,2008,Pharmacol Ther,117,244-79)。虽然与不良事件相关的抗TNF抗体的血清水平尚未准确知道，但是认为大于临床有益效果所需的水平(Nestorov,2005,J Rheumatol Suppl,74,13-8)。因此，与现有肠胃外给药的TNF拮抗剂相比，本发明的治疗性组合物和方法与降低的全身性免疫抑制、降低的全身性分布、降低的免疫原性、降低的快速耐受性（无论是因中和抗体的诱导还是因另一种机理所致）和降低的直接副作用（例如输注反应）相关。

当诸如通过经口或经直肠递送而局部递送给消化道时，本发明的牛科动物源性多克隆抗hTNF组合物使治疗性抗体在消化道之外的活性最小化并且还使针对治疗性抗体的中和免疫反应的诱导最小化。抗体可跨过消化道的粘膜屏障，进入粘膜下空间与它们的靶标相互作用，但基本上不进入全身循环。

在一个方面，本发明提供使用本发明的多克隆抗体组合物治疗患者的方法。如本文所用的术语“患者”是指动物。优选地，动物为哺乳动物。更优选地，哺乳动物为人。“患者”还指代例如狗、猫、马、奶牛、猪、豚鼠、鱼、鸟等。

术语“治疗”涵盖障碍、疾病、病痛或其他病症（在本文统称为“病症”）的至少一种症状或其他方面的缓解、治愈或预防，或病症严重性的减轻等等。本发明的组合物不需要实现彻底根治或根除疾病的每一症状或表现就能构成可行的治疗剂。如相关领域所认识到，用作治疗剂的药物可减轻给定病态的严重性，但不需要消除疾病的每一表现就能视为有用的治疗剂。相似地，预防性施用的治疗不需要在预防病症的发生中完全有效就能构成可行的预防剂。只需要减轻疾病的影响（例如，通过降低其症状的数量或严重性，或通过增强另一种治疗的效果，或通过产生另一种有益效果）或降低疾病将会在受试者中发生或恶化的可能性就已足够。在一个实施方案中，若表明施用了治疗有效量的组合物的患者相对于反映特定障碍严重性的指标的基线值发生了持续的改善，则该组合物构成了该障碍的治疗措施。

本发明的药物组合物包含治疗有效量的以下组合物，该组合物包含与一种或多种药学上可接受的载体或赋形剂一起配制的本发明的牛科动物源性抗hTNF多克隆抗体。所谓本发明的抗体的“治疗有效量”是指以适用于任何医疗的合理效/险比赋予所治疗的受试者治疗效果的组合物的量。治疗效果如该术语在本文中所使用的足以“治疗”患者。

对于口腔障碍，本发明的牛科动物源性多克隆抗hTNF组合物可以漱口水、漱口液、膏剂、凝胶剂或其他合适的制剂递送。本发明的抗体可使用设计成增加活性抗体与粘膜表面之间的接触的制剂递送，诸如口腔贴片、口腔胶带、粘膜粘附膜、舌下片剂、锭剂、糯米纸囊剂(wafer)、咀嚼片、速溶片剂、泡腾片或口腔或舌下固体。对于消化道障碍，抗体可以胶囊剂、片剂、液体制剂或设计成将药物引入消化道的相似剂型通过口腔摄入而递送。可选地，抗体可通过栓剂或灌肠剂施用以递送到下消化道。此类制剂是本领域技术人员熟知的。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体或赋形剂”意指无毒、惰性的固体、半固体或液体填充剂、稀释剂、包封材料或任何类型的制剂辅助材料。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例为糖，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，诸如可可油和栓剂蜡；油，诸如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，诸如丙二醇；酯，诸如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，诸如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；不含热原的水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒相容润滑剂，诸如月桂基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂、释放剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可根据配方师的判断而存在于组合物中。

经口施用的液体剂型包括药学上可接受的乳剂、微乳剂、溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性化合物外，液体剂型还可以含有本领域常用的惰性稀释剂，比如水或其他溶剂、增溶剂和乳化剂，诸如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苄醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺、油（尤其是棉籽油、落花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油）、甘油、四氢糠醇、聚乙二醇类和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯，以及它们的混合物。除了惰性稀释剂外，口腔组合物还可以包含佐剂，诸如润湿剂、乳化剂和助悬剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂。

供直肠施用的组合物优选地为栓剂，其可以通过将本发明的化合物与合适的非刺激性赋形剂或载体混合而制备，这些载体或赋形剂在环境温度下为固体，但在体温下为液体，并因此在直肠或阴道腔体中熔化并释放出活性化合物，诸如可可油、聚乙二醇或栓剂蜡。在一个实施方案中，供直肠施用的组合物为灌肠剂的形式。

经口施用的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在此类固体剂型中，将活性化合物与以下物质混合：至少一种惰性的、药学上可接受的赋形剂或载体，诸如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或：a)填充剂或增量剂，诸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和硅酸；b)粘合剂，比如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；c)保润剂，诸如甘油；d)崩解剂，诸如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、藻酸、某些硅酸盐和碳酸钠；e)溶解阻滞剂，诸如石蜡；f)吸收加速剂，诸如季铵化合物；g)润湿剂，比如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；h)吸收剂，诸如高岭土和膨润土；和i)润滑剂，诸如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠，以及它们的混合物。就胶囊剂、片剂和丸剂而言，剂型还可以包含缓冲剂。相似类型的固体组合物也可以在使用诸如乳糖以及高分子量聚乙二醇等作为赋形剂的软硬填充明胶胶囊中用作填充物。

在一些条件下可能期望针对经口或经直肠递送的本发明组合物的胃降解提供额外的保护度。如果需要这样，则存在许多肠溶衣选项。在一个实施方案中，肠溶衣利用胃后的pH变化来溶解薄膜衣并释放出活性成分。已开发了包衣料和制剂将蛋白治疗剂递送到小肠，并且这些方法可经过改进用于递送本发明的抗体。例如，已开发了包肠溶衣的胰岛素剂型用于经口递送{Toorisaka等人,2005,J Control Release,107,91-6}。

此外，片剂、糖衣丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂固体剂型可通过药物制剂领域熟知的其他包衣料和壳体制备。它们可任选地含有遮盖剂，并且还可以具有它们以延迟方式仅或优先地在肠道的某一部分中释放出活性成分的组成。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物物质和蜡。

有效剂量将根据施用途径以及与其他药剂共同使用的可能性而变化。然而，应当理解，本发明的化合物和组合物的总每日用量将由主治医师在经过深思熟虑的医疗判断范围内决定。任何特定患者的具体治疗有效剂量水平将取决于多种因素，包括所治疗的障碍和障碍的严重性；所采用的具体化合物的活性；所采用的具体组合物；患者的年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食；所采用的具体化合物的施用时间、施用途径和排泄率；化合物相对于进食的递送时间；治疗的持续时间；与所采用的化合物联合或同时使用的药物；以及医疗领域熟知的类似因素。

本发明的特定实施方案涉及按以下剂量向受试者施用包含本发明的抗体的药物组合物：约1mg/天至约1g/天，更优选约10mg/天至约500mg/天，并且最优选约20mg/天至约100mg/天。在一个实施方案中，按以下抗体剂量向受试者施用多克隆抗体制备物：约100mg至约50g/天，更优选约500mg/天至约10g/天，并且最优选约1g/天至约5g/天，其中该多克隆抗体制备物尚未富集靶抗原特异性的抗体。

治疗方案包括一天一次、一天两次或一天三次或更多次施用本发明的抗体组合物以治疗本文所公开的医学障碍。在一个实施方案中，将本发明的抗体组合物一天施用四次、一天施用6次或一天施用8次以治疗本文所公开的医学障碍。在一个实施方案中，将本发明的抗体组合物一周施用一次、一周施用两次、或一周施用三次或更多次以治疗本文所公开的医学障碍。

本发明的方法和组合物包括与可用于治疗患者罹患的病症的一种或多种另外的治疗剂联合使用本发明的抗体。此类另外的药剂的实例包括蛋白类药物和非蛋白类药物。本发明的抗体可与之联合的用于例如炎性肠病的此类另外的治疗剂的非限制性实例包括以下这些：口服类固醇、IFN-β、布地奈德；表皮生长因子；皮质类固醇；环孢菌素、柳氮磺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝唑；脂氧合酶抑制剂；美沙拉明(mesalamine)；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓素抑制剂；IL-1受体拮抗剂；抗IL-1β单克隆抗体；抗IL-6单克隆抗体；生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶基-咪唑化合物；CDP-571/BAY-10-3356（人源化抗TNF抗体；Celltech/Bayer)；75kdTNFR-IgG（75kD TNF受体-IgG融合蛋白；Immunex；参见例如Arthritis&Rheumatism(1994)Vol.37,S295;J.Invest.Med.(1996)Vol.44,235A）；55kdTNFR-IgG（55kD TNF受体-IgG融合蛋白；Hoffmann-LaRoche）；白介素-10(SCH52000;Schering Plough)；IL-4；IL-10和/或IL-4激动剂（例如激动剂抗体）；白介素-11；葡糖苷酸或葡聚糖偶联的泼尼松龙、地塞米松或布地奈德前药；ICAM-1反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸（ISIS2302；Isis Pharmaceuticals,Inc.）；可溶性补体受体1（TP10；T Cell Sciences,Inc.）；缓释美沙拉秦；甲氨蝶呤；血小板活化因子(PAF)拮抗剂；环丙沙星；和利诺卡因。

许多适用于治疗TNF调控的疾病（例如IBD）的潜在共治疗剂可商购获得或者目前正处于临床开发中，并包括以下这些：5-ASA(通用名)；MMX美沙拉秦(Cosmo)；MMX布地奈德(Cosmo)；MMX LMW肝素(Cosmo)；ER美沙拉秦(Salix)；硫唑嘌呤(通用名)；6-巯嘌呤；英夫利西单抗(Centocor,J&J)；阿达木单抗(Abbott)；赛妥珠单抗pegol(UCB)；Atrosab(BalioPharma)；那他珠单抗(Elan)；戈利木单抗(Centocor J&J)；德沙拉秦(Palau)；HMPL-004(Hutchinson MediPharma)；Ozoralizumab(Ablynx)；TNF-a Kinoid(Neovacs)；阿吡莫德(Synta)；优特克单抗(Centocor J&J)；Briakinumab(Abbott)；SCH-900222(Schering Plough)；FM202及FM303()；MP-196；巴利昔单抗(Cerimon)；达利珠单抗(Roche)；芳妥珠单抗(PDL)；C326(Avidia)；Sirukumab(Centocor J&J)；Olokizumab(UCB)；Sarilumab(Centocor J&J)；BMS-945429(Alder)；托珠单抗(Chugai)；安芦珠单抗(Wyeth)；QAX567(Novartis)；GSK1070806(GSK)；PF-05230900(Pfizer)；Vidofludimus(4SC)；Tofactinib(Pfizer)；AG014(Actogenix)；IL-27ActoBiotic(Actogenix)；维西珠单抗(PDL)；利妥昔单抗(Genentech)；阿巴西普(BMS)；非格司亭(Amgen)；沙格司亭(Immunex,Amgen)；Vidolizumab(Millennium)；Etrolizumab(Genentech)；AJM-300(Ajinimoto)；ASP-2002(Mitsubishi)；Alicaforsen(Isis)；PF-547659(Pfizer)；CCX282(GSK1605786)；CCX507(ChemoCentryx)；CNDO-201(Coronado)；Remestemcel-L(Osiris)；PDA-001(Celgene)；OvaSave(TxCell)；Secukinumab；MDX-1100(Medarex)；替托司特(Otsuka)；LT-02(Lipid Therapeutics)；VT-301(ViThera)。

当将多种治疗剂共同施用时，剂量可相应地进行调整，如相关领域所认识的。“共施用”和“联合疗法”不限于同时施用，而是包括其中将本发明的抗体在涉及向患者施用至少一种其他治疗剂的治疗过程中施用至少一次的治疗方案。

提供以下实施例是为了示出本发明的具体实施方案或特征，而不旨在限制其范围。

实施例

实施例1.牛科动物初乳抗TNF多克隆抗体组合物和工艺

在经审计的、合格的动物工厂产生免疫初乳。怀孕的荷斯坦奶牛来自受FDA巴氏奶条例(PMO)监管的美国商业A级奶奶牛场。PMO规定了圈养要求、建筑和设备标准、可接受的清洁和杀虫剂材料的使用、挤奶程序、卫生要求等。

将动物在开始免疫前隔离至少两周，并在必要时擦干。将合格的牛与其他动物单独圈养和保持，并每日进行观察。对饲料源进行控制，以防止引入未经批准的动物源蛋白。由州对来源奶牛群进行检测或证实不存在普鲁氏菌病和TB。奶牛接受（死的或灭活的）以下方面的常规免疫，或对以下方面进行筛查：

将合格的奶牛采用已经过USDA批准用于奶牛的商业兽医佐剂通过三(3)剂rhTNF进行免疫。将最终的制备疫苗根据已建立的SOP在兽医的直接监督下施用，间隔为两至三周。在每次注射时和产犊时采集血清样品。

对免疫的奶牛单独地挤奶。动物在产犊时必须处于明显良好的健康状况，无临床型乳房炎的迹象。使用标准乳品清洁实践和按FDA巴氏奶条例批准使用的材料，对奶牛的乳房进行挤奶准备。在分娩后，每天采集两次初乳，持续三(3)天。采集每一次挤初乳时的样品用于分析，将两样品和大量的初乳立即在-20C冷冻。所有初乳原材料来料在使用前均检测合格。

将初乳解冻，通过在1200至3600磅/小时的流速和24至43.5℃的温度下进行连续流离心而减少脂肪组分。将脱脂奶用1.5倍体积的反渗透(RO)水稀释，测量并记录pH，然后用酸调节到4.6±0.1。将酸化的脱脂初乳在21至35℃下保持静止25-45分钟。通过滗析离心而除去酸化步骤沉淀下来的酪蛋白。单独收集澄清的上清液和酪蛋白淤渣，测量并记录，然后丢弃酪蛋白部分。

将得自澄清上清液的免疫球蛋白通过封闭系统中的蛋白G层析法分离。将蛋白G树脂（例如Sepharose4Fast Flow gel、PharmaciaBiotech AB、Uppsala、Sweden）填充到柱子中，通过制造商建议的结合缓冲液平衡。为了确保维持正确的离子强度和pH以实现最佳的结合，将澄清的上清液针对结合缓冲液透析，然后以20mg/ml的总蛋白与床体积比施加到床体积。流速为0.8ml/min。将柱子用10倍床体积的结合缓冲液洗涤。将结合的牛IgG用10倍床体积的0.1M甘氨酸-HCl缓冲液(pH2.7)洗脱。为了中和洗脱的馏分，在洗脱前将100μl/ml的1M Tris-HCl(pH9.0)加入收集管。在280nm处监测纯化谱，收集目标馏分，汇集，然后在4℃下针对PBS透析。将收集的产物洗出液通过超滤而浓缩。

实施例2.牛科动物初乳抗TNF抗体：在小鼠炎性肠病模型中对纯化的抗体与免疫初乳乳清进行比较。

免疫初乳在Southwest Biolabs（位于Las Cruces,New Mexico的在USDA注册的研究机构）产生。在怀孕的最后三个月采购了六头荷斯坦奶牛，运输到研究机构，在免疫前适应一周。动物接受了具有两种佐剂之一的抗原的3次皮下注射，间隔为2-3周，最后一次注射在计算的分娩日期前三周给予。从所有动物采集前8次挤奶的初乳（产犊后的前四天）。一只动物在乳房完全发育前过早产犊，从而导致了初乳中免疫球蛋白的水平较低，将这只动物的初乳丢弃。

由分娩后1-4天采集的初乳制备了混合样，并使用标准方法制备了乳清(Su和Chiang,2003)。将乳清用蒸馏水按1:3稀释，用冰醋酸酸化到pH4.6以使酪蛋白沉淀，然后离心。除去上清液，将pH调节到7.4以生成免疫乳清。

使用亲硫吸附剂对免疫球蛋白馏分进行纯化。亲硫吸附剂（T凝胶）购自Pierce(Thermo Scientific)。将层析柱充填上50ml树脂，然后用150ml结合缓冲液（0.5M硫酸钠、20mM磷酸钠，pH8.0）平衡。将免疫乳清在水浴中解冻，然后将固体硫酸钠加入以将最终浓度带到0.5M。将溶液在3700rpm下离心15分钟以除去颗粒物，用结合缓冲液按1:1稀释，然后在室温下上样到T凝胶柱。将柱子用5倍柱体积(150ml)的结合缓冲液洗涤。将免疫球蛋白用低盐（50mM磷酸钠，pH8.0）洗脱，洗脱出并汇集含蛋白的柱馏分。将洗脱出来的材料在Amicon搅拌式超滤装置上浓缩，该装置带有截留分子量为100,000的YM过滤器，然后除菌过滤。

平行地纯化了对照免疫球蛋白。对含有抗TNF活性的免疫球蛋白（在本文可互换地称为“鼠科动物AVX-470”或“AVX-470m”）和对照初乳免疫球蛋白测定了它们结合并中和鼠科动物TNF的能力。免疫球蛋白在特异性ELISA中结合到TNF，而对照免疫球蛋白未观察到结合。

通过采用鼠科动物L929细胞的基于细胞的标准TNF测定法，测定了牛抗体中和TNF诱导的细胞毒性的能力。将不同浓度的抗体在96孔微孔板中在37℃下用鼠科动物TNF预孵育了2小时。将抗体-抗原混合物与1ug/ml的放线菌素D一起加到L929细胞的汇合培养物中，在37℃下孵育24小时。使用WST测定法评估了细胞活力。抗TNF抗体在此基于细胞的测定法中中和了TNF，而对照抗体没有效果。

在鼠科动物TNBS诱导的结肠炎模型中，对与得自用鼠科动物TNF免疫的奶牛的乳清（AVX-470m-乳清）和对照乳清一起的纯化AVX-470m和对照免疫球蛋白进行了评价。研究在Biomodels,LLC进行。平均起始体重为21.0g的雄性C57Bl/6小鼠得自Charles RiverLaboratories(Wilmington,MA)。使小鼠在开始研究前适应5天。在第0天，通过直肠内施用50%乙醇媒介物中的4mg TNBS而诱导了结肠炎。

在第0天，在异氟烷麻醉下通过直肠内施用50%乙醇中的100μLTNBS(4mg)而诱导了结肠炎。八只另外的动物用作未处理的对照，并经直肠内给予100μL的50%乙醇。通过管饲法(p.o.)在第-1天至第3天以每剂0.1mL向动物给予供试品或媒介物，每天两次(b.i.d.)。在第5天，使用视频内窥镜检查评估了所有动物中的结肠炎严重性。内窥镜检查使用小动物内窥镜(Karl Storz Endoskope,Germany)以设盲方式进行。为了评价结肠炎严重性，将动物用异氟烷麻醉，然后接受降结肠的视频内窥镜检查。以0（正常）至4（严重溃疡）范围内的量表在视觉上对结肠炎评分。通过描述性术语，对该量表定义如下：

内窥镜检查结肠炎评分量表

评分：说明

0：正常

1：血管供应减少

2：血管供应减少且质脆

3：质脆且糜烂

4：溃疡且出血

使用学生t检验(SigmaPlot11.2,Systat Software,Inc.)确定了试验组与媒介物对照之间的统计学差异。内窥镜检查评分在下表5中示出。

表5

	平均值	标准偏差	与TNBS媒介物对照的差异
				EtOH对照	0.25	0.46	p<0.001
TNBS-媒介物	2.17	0.58	NA
				5mg AVX-470m	1.50	0.76	p=0.038
1.5mg AVX-470m	1.75	0.71	NS
				0.5mg AVX-470m	1.75	1.28	NS
1.5mg对照Ig	2.50	0.76	NS
				AVX-470m-乳清	1.63	0.52	p=0.046
对照乳清	2.00	0.53	NS

结肠炎评分在用TNBS处理的组中与用乙醇处理的对照组相比明显升高。接受5mg AVX-470m或AVX-470m-乳清口服治疗的组均在第5天均显示出明显降低的结肠炎严重性评分。未观察到结肠炎严重性的其他显著差异。

令人惊讶的是，这些数据表明通过AVX-470m-乳清以及通过纯化的AVX-470m均观察到了活性；当将免疫球蛋白从其他乳清组分中纯化出来时未见活性的降低。

实施例3.免疫初乳的产生

在经审计的、合格的动物工厂产生免疫初乳。怀孕的荷斯坦奶牛来自受US FDA A级巴氏奶条例(PMO)监管的商业奶牛场。对动物进行隔离并擦干。由州对来源奶牛群进行检测或证实不存在普鲁氏菌病和TB。奶牛接受了（死的或灭活的）以下方面的常规免疫，或对以下方面进行筛查：

将合格的奶牛采用Quil A佐剂通过三(3)剂rhTNF免疫，间隔为两至三周，最后一次注射在计算的分娩日期前三周给予。从所有动物采集前8次挤奶的初乳（产犊后的前四天）。采集每一次挤初乳时的样品用于分析，将两样品和大量的初乳立即在-20C冷冻。通过ELISA确定特异性结合到重组人TNF以及在L929细胞测定法中确定中和重组人TNF而判断，所有奶牛均产生了特异性抗体。

实施例4.通过硫酸铵沉淀法从牛科动物初乳中纯化免疫球蛋白

将得自用重组鼠科动物TNF免疫的奶牛的初乳样品解冻，合并得到750mL的初乳混合样。为了除去脂肪，将初乳在室温下以2954xg离心20分钟。除去脂肪后，将初乳在水中稀释（1份初乳；2份水），使用乙酸将pH调至4.6，然后搅拌20分钟。将悬浮液在室温下以3488xg离心30分钟，从乳清中除去酪蛋白沉淀。用10N NaOH将乳清的pH调至pH7.4。将50%的饱和硫酸铵溶液（313g/L的硫酸铵）缓慢加入乳清，在4℃下搅拌1.5小时。将悬浮液在4℃下以3488xg离心30分钟。缓慢倾析出上清液。将免疫球蛋白沉淀重悬在磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH7.2)中以溶解沉淀。将样品在4℃下针对更换8次的2L PBS(pH7.2)透析36小时。通过在4℃下在管顶部添加聚乙烯吡咯烷酮粉末(PVP-40,SIGMA-Aldrich,St Louis,MO)而浓缩牛免疫球蛋白。将浓缩的免疫球蛋白溶液从透析管中移除。

实施例5.在HiTrap Capto S柱上从初乳中除去杂质

将冷冻的初乳(1.89L)在45℃下在水浴中解冻。在乙酸酸化步骤以沉淀酪蛋白后，将初乳制备物保持在4℃过夜。将酸化的材料升至43℃，然后在2,730RCF下离心。将上清液保留，用氢氧化铝中和至pH6.4。将中和后的制备物通过添加等体积的反渗透水而稀释，得到2.8L除去脂肪的、酪蛋白含量降低的初乳或初乳乳清。对乳清制备物的等分试样进行测试，以评价各层析柱的有效性。

在该实施例中，将乳清的等分试样(30mL)施加到阴离子交换柱（5mL HiTrap Capto Q填充柱，购自GE Healthcare Bio-Sciences,Piscataway,NJ）或阳离子交换柱（5mL HiTrap Capto S，也购自GEHealthcare Bio-Sciences）上。将各柱用1M NaCl稀释，将流通液和洗出液通过SDS-PAGE在还原性条件下进行分析。将标记泳道上样Dual Color Molecular Weight Marker(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)。将凝胶用考马斯蓝R-250染色以显示蛋白。50kDa和25kDa的两根条带分别指示免疫球蛋白的重链和轻链。得自凝胶的数据表明在乳清的制备过程中，如通过该方法所判断，不存在免疫球蛋白明显的收率损失。免疫球蛋白在Capto-Q和Capto-S柱的流通液中均观察到。在用于该初乳乳清制备的条件下，Capto-Q基质未明显结合乳清制备物中的任何高丰度蛋白，但是它对除去低丰度蛋白杂质可具有重要的作用，如在进一步的实施例中所见。相比之下，注意到Capto-S从初乳乳清中结合并因此浓缩具有约75kDa的低分子量的蛋白。

实施例6.通过巯乙基吡啶(MEP)层析法去除非免疫球蛋白因子而制备多克隆抗体组合物

对可用于纯化免疫球蛋白的MEP基质(Pall Corporation,PortWashington,NY)从乳清中纯化多克隆抗体制备物的能力进行了测试。在该实施例中，将得自Capto-S流通液的25mg样品调节到0.15MNaCl的最终浓度，然后通过0.22μm过滤器(Millipax,MilliporeCorporation,Billerica,MA)过滤。然后将样品以2mL/min的流速施加到1mL MEP基质柱。对280nm处的吸光度进行监测，对柱子进行洗涤，直到吸光度单位达到基线水平。将结合到柱子的蛋白用柠檬酸梯度洗脱，以降低pH。免疫球蛋白馏分在约pH5.0洗脱出来。凝胶的制备如下：泳道1为BioRad Precision Dual Color标记，泳道2为Capto-S流通液（MEP柱上样），泳道3-12为馏分36-43，包括得自洗脱峰的馏分。使用ImageJ软件(NIH,http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html)定量的光密度法扫描表明：重链和轻链占总蛋白的约95%。

这些数据表明MEP可能是除去杂质的有效树脂。然而，后面的实施例将证明MEP不是优选的方法。

实施例7.通过分析型尺寸排阻色谱法研究通过MEP纯化的乳清蛋白抗体制备物的组成

尺寸排阻色谱法是一种可用于评估纯化的蛋白制备物的组成的技术。蛋白复合物或具有较高天然分子量的蛋白洗脱出来的时间早于具有较低天然分子量的蛋白。使得自乳清蛋白（0.5mL总体积中0.5mg）层析的汇集的MEP洗出液在KTAEXPLORER^TMFPLC系统上的高分离度TRICORNS200柱（Superdex20010/300GL，得自GEHealthcare Bio Sciences,Piscataway,NJ）上经受分析型尺寸排阻色谱分析。将柱子在也为洗脱缓冲液的磷酸盐缓冲盐水(0.15M NaCl)中预平衡。在280nm处监测吸光度。使用Unicorn软件包测量了峰下面积。在这些条件下，预计免疫球蛋白将维持天然构象。数据表明，洗脱体积为13.5mL的主峰经计算为表示球蛋白的约149kDa的保留时间，非常接近于免疫球蛋白的理论分子量150kDa。该实施例中的数据与SDS-PAGE分析一致，并表明MEP基质结合并纯化了多克隆抗体组合物。

实施例8.使用15L初乳和2L MEP柱研究向更大规模的工艺的放大

在该实施例中，对参数进行了研究以便放大MEP柱工艺。以中试规模制备了脱脂乳清：首先，通过连续流离心，然后用10%乳酸酸化至pH4.6而制备了脱脂初乳(15L)。过夜保持后，通过离心除去酪蛋白，保留上清液，用0.5M NaOH中和至pH6.4。然后将乳清通过中试规模的过滤器组（深层过滤器（CUNO Zeta Plus滤芯）然后是0.2μm过滤器）过滤，然后上样到充填进INdEX柱的用20mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液(pH6.8)预平衡的2L MEP树脂柱。将柱子用大约10L相同的缓冲液充分洗涤，然后用20mM柠檬酸盐-磷酸盐(pH2.8)洗脱。将洗脱的样品用1M Tris中和。然后将洗出液相对于5倍体积的反渗透水渗滤以交换缓冲液，然后使用中试规模的切向流过滤设备(Pall Corporation,Port Washington,NY)通过超滤而浓缩。未观察到粘度存在问题。

得自还原性SDS PAGE分析的结果在很大程度上再次重复了在实验室规模所见的结果。除了免疫球蛋白重链和轻链外，还注意到了存在两种主要的杂质。

实施例9.喷雾干燥实施例

将得自牛免疫球蛋白MEP层析分离的洗出液通过超滤/渗滤浓缩到约80mg/ml的蛋白，以形成用于实验室规模的喷雾干燥实验的进料流。所有喷雾干燥开发工作均由Pharma Spray Drying,Inc.BedfordHills,NY使用Buchi B-290台式实验室喷雾干燥机进行。

这些初步实验的目的是确定将以最少的粘附和产物滞留在旋风分离器内形成可收集粉末的喷雾干燥条件。在喷雾干燥前未向浓缩的初乳免疫球蛋白添加赋形剂。各测试的参数在表6中显示。

表6-Buchi B-290试验工作

将这些试验粉末各自手工充填到明胶胶囊（00号，Capsugel,Cambridge,MA）中以得到原型口服剂型。

实施例10.MEP纯化和Capto-S纯化工艺的比较。

在评价使用MEP树脂得到的结果中，担心在洗出液中存在杂质，以及担心结合容量。此外，在制备药理学组合物的工艺中，可放大性、快速生产能力以及避免体积的变化都是重要的因素。使得活性药学成分不结合到柱树脂而非期望的污染物则发生结合的工艺可代表一种优选的工艺。因此，再次研究了流通法。

在该实施例中，如文献所述（Gregory,A.G.，美国专利5,707,678）进行了前期步骤：将脱脂初乳用2倍反渗透水稀释、酸化、中和，然后在连续流离心中处理。在过夜保持步骤后，将硅藻土（USP/NF级，Sigma Aldrich）添加到4/g L，然后将材料搅拌10min，用10%氢氧化钠中和，通过Cuno Zeta Plus BioCap深层过滤器(602A05A,3MCorporation,St.Paul,MN)和0.2μm过滤器(MilliPAK MPGL02GH2,Millipore Corporation,Billerica,MA)过滤。

将乳清施加到MEP柱或Capto-S柱上。在层析后，将得自各比较方的相应馏分（保留的馏分，对于MEP用pH梯度洗脱；Capto-S的流通液，调节到100mM NaCl）随后用Pall Pharmaceutical系列设备(Pall Corporation,Port Washington,NY)和TMP-Flux50kD标称分子量截留(NMWCO)膜超滤得到50g/L的估计浓度。将跨膜压力(TMP)调节到维持接近15psi的水平。将材料相对于三至五倍体积的反渗透水渗滤，然后进行第二超滤步骤，以将蛋白浓度带至100g/L。使用BCA^TM测定试剂盒通过二辛可宁酸法如供应商(Thermo FisherScientific,Rockford,IL)所述进行了蛋白浓度的测定。将样品在使用NUPAGE MOPS SDS运行缓冲液的还原性4-12%Bis-Tris NOVEX凝胶(NUPAGE,Invitrogen)上运行。标记泳道为Novex Sharp预染的蛋白标准品(Invitrogen,Carlsbad,CA)。将凝胶用EZ Blue染色试剂（Sigma目录号G1041）染色。将凝胶在台式扫描仪(HP ScanJet Model G3010)上扫描，通过ImageJ软件(NIH)分析成像数据。

凝胶分析表明，MEP工艺和Capto-S-TFF工艺产生了不同的谱，例如MEP工艺具有作为可能污染物的占优势的乳铁蛋白，而Capto-S工艺具有作为可能污染物的乳球蛋白。通过与SDS-PAGE上运行的标准品进行比较、考虑到等电点以及得自质谱分析的结果鉴定了污染物。随后，可应用合适的优化和精制步骤以实现多克隆抗体组合物的不同的优选实施方案。

实施例11.多克隆组合物中的IgM和IgA的定量

将市售ELISA试剂盒（目录号E11-101和目录号E11-121，BethylLaboratories,Montgomery,TX）用于分别测定不同制备物中的IgM和IgA的水平。将抗牛IgM或IgA抗体预包被在所提供的96孔条形板上。对板进行洗涤，封闭，再将样品的系列稀释样加入，洗涤，然后通过辣根过氧化物酶偶联的、亲和纯化的山羊抗牛IgM或山羊抗牛IgA以及作为底物的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)检测了结合。将通过MEP层析而纯化的材料与得自Capto-S层析的流通材料进行了比较。表7中的数据表示为基于使用BCA测定法测定的蛋白浓度的每克产物对应的同种型毫克数。

表7

样品	IgA(mg/g)	IgM(mg/g)
			脱脂初乳	24	51
MEP	108	14
			Capto-S	136	72

IgA水平在两种纯化的制备物中均升高，从而反映了免疫球蛋白因杂质（尤其是酪蛋白）的除去而得以富集。IgM在Capto-S制备物中略微富集，但在MEP制备物中被大量除去。这进一步证实了Capto-S方法优于MEP。在Capto-S制备物中，13%的蛋白为IgA，而7%的为IgM，从而反映了基于这些同种型在初乳中的典型水平，所有IgA得以保留而IgM损失了大约50%。

实施例12.选择性沉淀以除去乳铁蛋白

选择性沉淀是一种可以浓缩所关注的蛋白或除去污染性蛋白的技术。在该实验中，据发现，通过二碱式磷酸盐对酸化、脱脂、脱酪蛋白的初乳进行中和选择性沉淀出乳铁蛋白。将脱脂初乳解冻，加热到42℃，然后用1.5倍体积的水稀释。将溶液用5%的乳酸酸化到4.6的最终pH。通过粗过滤、接着通过连续流离心而除去酪蛋白，然后将酸化后的材料保持在2-8℃过夜。在早上，将4g/L硅藻土加入，然后通过CUNO Zeta Plus囊式过滤器对材料过滤。然后对不同的中和条件进行比较：不同的温度、中和率以及使用NaOH或磷酸氢二钠。在所有情况下，均观察到了一定的浊度，通过离心除去沉淀的材料，然后通过还原性SDS PAGE进行分析。

在该实验中，据发现，当将磷酸氢二钠用于中和得自酪蛋白后的初乳的乳清制备物中的pH时，与氢氧化钠相比，乳铁蛋白相同相对迁移率的75kDa蛋白（与市售标准品相比）在沉淀馏分中得以富集。推定的乳铁蛋白的相对富集伴有白色的沉淀，可能是磷酸钙。

基于此结果，使用磷酸氢二钠作为中和剂以及使用连续流离心法除去沉淀材料而进行了中试规模的运行。然而，经证实磷酸钙沉淀极难从加工设备中清除。因此，虽然该方法在实验室规模上是可用的，但是它不是中试或生产规模的优选方法。

实施例13.顺序流通策略的优点–实验室规模研究

这里所述的实验显示使用可靠放大到中试和生产规模的树脂进行的实验室规模的层析，然后使用还原性SDS PAGE进行蛋白谱分析。以中试规模制备了初乳乳清，然后将样品上样到如下所示的5ml柱，再通过SDS PAGE分析。

与实施例10中的数据一起，该实验表明采用Capto-S和Capto-Q的顺序流通层析工艺可得到与MEP柱层析相比改进的工艺。具体地讲，通过与流通Capto-S串联的流通Capto-Q的新策略得到的结果看起来尤其具有前景。

实施例14.放大到30L初乳和3L柱的串联Capto-S和Capto-Q层析

通过Westphalia设备(SA-1-02-175,GEA Mechanical EquipmentUS,Inc.,Northvale,NJ)中的连续流离心、在42℃添加乳酸（DL-乳酸，85%溶液，Fisher Scientific,Waltham,MA）进行酸沉淀，然后进行粗过滤而从30L初乳中除去脂肪。在粗过滤后，将材料保持在2-8℃过夜，然后通过添加氨基丁三醇(Trizma Base,Sigma Aldrich,St LouisMO)而中和。将中和后的乳清通过连续流沉淀而澄清。接下来，在絮凝步骤中，将硅藻土过滤剂(Sigma Aldrich,St Louis,MO)在第一囊式过滤器（Gregory,A.G.，美国专利5,707,678）前添加到4g/mL，搅拌10min。澄清过滤器组由20μm Alpha纤维聚丙烯(Meissner FiltrationProducts,Camarillo,CA)/0.45μm聚丙烯过滤器CLMFO.45-222(Meissner Filtration Products,Camarillo,CA)/0.2μm过滤器(PallCorporation,Port Washington,NY)组成。

将Capto-S树脂（3L床体积）和Capto-Q树脂（3L床体积）装填到两根串联的INdEX140/500柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.,Piscataway,NJ)中。在上样前，将柱子依次用12L反渗透水、12L0.5M NaCl、12L反渗透水、12L1M NaCl、12L反渗透水，然后用60L1M Tris-HCl pH6.8洗涤。将乳清(30L)以0.5L/min的流速泵到柱子上，将柱子用2.5倍柱体积的平衡缓冲液洗涤。使用在线流动池(PendoTECH,Princeton,NJ)监测了280nm处的吸光度。当A280达到基线水平时，停止流通液的收集。层析后，将产物使用PallPharmaceutical系列设备(Pall Corporation,Port Washington,NY)通过超滤（50kDa NMWCO过滤器）浓缩，然后相对于5倍体积的反渗透水渗滤。产物通过超滤浓缩到了>75mg/mL。最终加热处理在60℃进行10小时。

进行了SDS PAGE分析以收集得自串联的Capto-S和Capto-Q上的该30L中试规模柱层析的结果。通过用1M的NaCl对柱子进行剥脱而评估了结合到Capto-S和Capto-Q柱的蛋白。凝胶的制备如下：泳道1，蛋白分子量标记；泳道2-4，用作对免疫球蛋白含量进行定量的对照的渐增量的IgG轻链标准品（电泳，纯度>99%，来自人骨髓瘤浆细胞，得自Sigma Aldrich,St Louis,MO）；泳道5，串联层析前的上样；泳道6，得自Capto-S/3L Capto-Q串联柱的流通液；泳道7，串联柱的洗出液(1M NaCl)。将凝胶用考马斯亮蓝染色，然后使用MFC-9120CN扫描仪(Brother)进行电子成像。将ImageJ1.45s软件(National Institutes of Health,Bethesda,MD,imagej.nih.hov/ij/docs)用于形成光密度图。通过对半峰高之间的基线扣减面积进行积分而测量了峰面积。

泳道5和6的光密度曲线的比较表明非Ig蛋白的减少以及Ig蛋白重链和轻链的浓缩。在泳道6所示的组合物中，81%的产物以免疫球蛋白重链和轻链存在。高分子量条带是聚集的Ig重链（参见实施例14），而存在于70-80kDa部分中的大部分材料也与产物相关（IgM和分泌成分-参见实施例14）。因此，95%的产物是免疫球蛋白。

泳道7的曲线表明大量的非Ig蛋白优选地结合到树脂。与泳道5和6的曲线以及其他数据合在一起，可以得出结论，串联流通层析是一种用于从初乳中制备多克隆抗体组合物的强有力的方法。在下面的实施例中进一步研究了流通液和洗出液中的蛋白的种类。将容易地认识到，该工艺或其变型形式将提供适于口服的适当收率的多克隆抗体组合物。

实施例15.放大到80L初乳的串联Capto-S和Capto-Q层析（预言性）

已示例性地示出了以30L规模制备抗体组合物的方法，本领域的技术人员将认识到，该程序可无需大量实验而放大到80L。将如下文所述由80L初乳制备抗体组合物。

通过Westphalia设备(SA-1-02-175,GEA Mechanical EquipmentUS,Inc.,Northvale,NJ)中的连续流离心，从初乳(80L)中除去脂肪。将所得的脱脂初乳用2倍体积的反渗透水稀释，在42℃下将乳酸加入达到4.6的最终pH（DL-乳酸，85%的溶液，Fisher Scientific,Waltham,MA）以沉淀酪蛋白，其中通过宽直叶桨或等同的混合设备进行混合。在粗过滤或等同步骤（诸如压酪机）以除去酪蛋白后，将材料保持在2-8℃过夜，然后通过添加氨基丁三醇(Trizma Base,Sigma Aldrich,St.Louis MO)进行中和。将硅藻土过滤剂(Sigma Aldrich,St Louis,MO)在第一囊式过滤器前加入达到4g/mL，搅拌10min。澄清过滤器组由20μm Alpha纤维聚丙烯(Meissner Filtration Products,Camarillo,CA)/0.45μm聚丙烯过滤器CLMFO.45-222(Meissner Filtration Products,Camarillo,CA)/0.2μm过滤器(Pall Corporation,Port Washington,NY)组成。将认识到，得自这些或其他制造商的其他过滤器组也将等同地制备供层析用的样品。

在该实施例中，通过将样品划分成三个等分试样，然后使每一部分接受串联层析而实现放大，其中在样品之间对柱装置进行洗涤。将Capto-S树脂（3L床体积）和Capto-Q树脂（3L床体积）装填到两根串联的INdEX140/500柱(GE Healthcare Bio-Sciences Corp.,Piscataway,NJ)中。在每个样品上样前，将串联柱装置用12L反渗透水、12L0.5M NaCl、12L反渗透水、12L1M NaCl、12L反渗透水，然后用1M Tris-HCl pH6.8洗涤（直到pH稳定在6.8）。在洗涤步骤后，将柱子用18L10mM Tris-HCl(pH6.8)平衡。测量乳清的pH和电导率，将乳清以0.5L/min的流速泵到柱子上，然后用2.5倍柱体积的平衡缓冲液对柱装置进行洗涤。使用在线流动池(PendoTECH,Princeton,NJ)对280nm处的吸光度和pH进行监测。当A280达到基线水平时，停止流通液的收集。在层析后，测量pH和电导率，据发现pH在上样材料的pH的0.2个pH单位内，并且据发现电导率在上样材料的1毫西门子/厘米内。将产物使用Pall Pharmaceutical系列设备(Pall Corporation,Port Washington,NY)通过超滤（50kDa NMWCO过滤器）浓缩，然后相对于5倍体积的反渗透水渗滤。产物通过超滤浓缩到>75mg/mL。最终加热处理在60℃进行10小时。

实施例16.通过质谱分析法研究多克隆抗体制备物中蛋白的种类

将52kg初乳乳清上样到如实施例14所述的两根串联的3LCapto-S和Capto-Q柱。通过还原性SDS-PAGE对流通液和剥脱馏分进行分析，将相关条带从凝胶上剪下。使样品经受质谱分析。分析在University of Massachusetts的LTQ-Orbitrap设备(FisherThermoScientific,Waltham,MA)上进行。将所得的肽序列用于搜索NCBI nr数据库。表8汇总了各条带最普遍的序列。

表8

对流通材料的分析确认了还原性SDS PAGE上的主条带（条带4和5）表示IgG重链和轻链。条带4之上的拖尾（条带3）也为IgG重链，并且可能表示不同的糖型。在牛免疫球蛋白的所有分析中所见的高分子量条带（条带1）是IgG重链的聚集体。在标记为条带2的样品中观察到了条带的三元组。该三元组主要由分泌成分(79kDa)、IgM(76kDa)和转铁蛋白(73kDa)组成。分泌成分和IgM均为组合物的所需组分，而转铁蛋白则为杂质。剩余的低分子量条带包含杂质α-乳白蛋白和角蛋白。这些杂质将在下游超滤/渗滤精制过程中除去。

对从柱子上剥脱的材料的分析确认了工艺除去了乳铁蛋白、牛血清白蛋白、β-乳球蛋白和α-乳白蛋白以及一些免疫球蛋白和一些微量杂质。

该分析表明了可混杂在药理学活性多克隆抗体制备物的产生中的外来蛋白可使用该策略加以除去，并且进一步的精制步骤可用于产生适于患者人群（包括胃肠系统受损的那些人群）的组合物。

实施例17.使用不同方法纯化的组合物的直接比较

对使用四种不同的方法纯化的初乳组合物进行了直接比较：硫酯T凝胶层析法（实施例2）、硫酸铵沉淀法（实施例4）、MEP层析法（实施例8）和Capto-S/Capto-Q串联层析法（实施例14）。通过还原性SDS PAGE以及通过ELISA对各制备物的样品进行了分析，以对乳铁蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白的水平进行定量。还通过ELISA对样品进行了测定，以对乳过氧化物酶和IGF-1的水平进行定量。

这些不同的组合物的还原性SDS PAGE分析准备如下：泳道1：分子量标记；泳道2：脱脂混合初乳；泳道3：脱脂、去酪蛋白乳清；泳道4：仅Capto-S的流通液；泳道5：仅Capto-Q的流通液；泳道6：Capto-S/Capto-Q的流通液；泳道7：MEP层析；泳道8：硫酸铵纯化的抗体制备物；泳道9：T凝胶纯化的抗体制备物；泳道10：鼠科动物TNF特异性的亲和纯化抗体。进行了凝胶的光密度分析。这些数据确认了在以上实施例中展示的结果并表明通过此方法所判断在研究中的四种方法产生了大致相当的杂质水平（注意，T凝胶和硫酸铵产物以实验室规模纯化，而MEP和Capto-S/Capto-Q产物以中试规模纯化）。

当进行测定以对具体杂质的水平定量时，观察到了更明显的差异。

将样品在BCA测定法中进行了分析以对总蛋白定量，以及通过ELISA进行了分析以对具体杂质的水平定量。将市售ELISA试剂盒（目录号E10-126,Bethyl Laboratories,Montgomery,TX）用于对乳铁蛋白定量。根据制造商的建议，将ELISA板包被上按1:100稀释的所提供的山羊抗牛乳铁蛋白包被抗体试剂。对板进行洗涤，封闭，再将样品的系列稀释样加入，洗涤，然后通过辣根过氧化物酶偶联的、亲和纯化的山羊抗牛乳铁蛋白和作为底物的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)检测了结合。将市售ELISA试剂盒（目录号E10-125和目录号E10-128，Bethyl Laboratories,Montgomery,TX）用于分别对β-乳球蛋白和α-乳白蛋白定量。根据制造商的建议，将ELISA板包被上按1:100稀释的所提供的山羊抗牛β-乳球蛋白或α-乳白蛋白包被抗体试剂。对板进行洗涤，封闭，再将样品的系列稀释样加入，洗涤，然后分别通过辣根过氧化物酶偶联的、亲和纯化的山羊抗牛β-乳球蛋白或α-乳白蛋白以及作为底物的3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)检测了结合。将市售ELISA试剂盒（目录号KT-20283和目录号KT-18278,KamiyaBiomedical Co.,Seattle,WA）用于分别对不同制备物中的牛乳过氧化物酶(LPO)和胰岛素样生长因子I(IGF-I)的水平进行测定。将抗牛LPO或IGF-I抗体预包被在所提供的96孔条形板上。将样品的系列稀释样品和校准标准品加入，然后进行孵育，再添加检测试剂A。在另外孵育后，对孔进行洗涤，将检测试剂B加入，再进行孵育。最后，对孔进行洗涤，用3,3′,5,5′-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液进行孵育，然后用终止液孵育，再在450nm处读取。表9和10对结果进行汇总。

表9

样品	乳铁蛋白mg/g	α-乳白蛋白mg/g	β-乳球蛋白mg/g
				脱脂初乳	10	88	197
乳清	11	146	70
				Capto-S/Capto-Q	0.3	75	0.5
MEP	30	4.0	7.6
				硫酸铵	2.4	>20	25
T凝胶	0.5	ND	ND

表10

样品	IGF-1mg/g	乳过氧化物酶mg/g
			乳清	>5.1	64
Capto-S/Capto-Q8Feb	0.09	0.18
			Capto-S/Capto-Q10Feb	0.05	0.21
MEP	41	21
			T凝胶	0.12	1.8

实施例18.通过Capto-S/Capto-Q层析，然后通过超滤而纯化的组合物的还原性SDS PAGE分析

从实施例14中所述的初乳乳清纯化了免疫球蛋白。使流通串联Capto-S和Capto-Q柱的材料经受30,000分子量截留膜上的超滤，将渗余液通过还原性SDS-PAGE和凝胶光密度分析法进行了分析。

该实施例中的数据与实施例17中的数据的比较证实了增加超滤步骤干净地除去了留在Capto-S/Capto-Q流通液中的α-乳白蛋白。在实施例17中分析的材料在光密度分析中具有1%的α-乳白蛋白峰面积，其对应于通过ELISA测定的75mg/g的α-乳白蛋白浓度（参见实施例17）。在超滤后，在SDS-PAGE分析中不可检测的α-乳白蛋白，从而表明α-乳白蛋白的水平<15mg/g。

基于光密度法，该组合物为97%的免疫球蛋白：55%的Ig重链（IgG和IgA）、33%的Ig轻链（κ和λ）、3%的分泌IgM重链和3%的转铁蛋白杂质。

Capto-Q是一种强阴离子交换树脂，而Capto-S是一种强阳离子交换树脂。通常，将基于蛋白的pI对pH进行优化以结合一种树脂或另一种树脂。然而，多克隆抗体具有宽pI范围，从而使这种方法复杂化。使用这些柱子使得可以实现最高的纯化及分离免疫球蛋白收率的新方法是选择处于多克隆免疫球蛋白的预测pI范围中间的pH，诸如如表11所示的6.6至7.0范围内的pH。

表11

本文所述的实验确定了优选的是使用流通法而不是结合和洗脱，因为流通法提供更快的通量、更少的昂贵缓冲液用量并产生纯度更高的制剂。如果条件不正确，则一些免疫球蛋白将结合到树脂，从而导致收率降低。本文所述的方法对条件进行了优化，以最高的免疫球蛋白组合物纯度实现了最高的收率。

实施例19.通过免疫球蛋白的纯化提高效价。A)制备了在本文也称为“AVX-470”的根据本发明的多克隆抗hTNF抗体，并使用与实施例3和14中所述的那些方法相似的方法进行了纯化。通过离心将初乳脱脂，然后通过ELISA测定了抗TNF抗体的存在性。通过BCA测定了蛋白浓度，将脱脂初乳的活性表示为AU/mg蛋白。在两个单独运行中，据发现脱脂初乳具有338AU/mg和277AU/mg。通过酪蛋白的酸沉淀、过滤、串联阴离子和阳离子交换层析、渗滤和超滤以及热处理对脱脂初乳进一步纯化。通过ELISA对最终样品再次测定了抗TNF活性，以及通过BCA再次测定了蛋白浓度。据发现，最终的原料药批次具有634和526AU/mg蛋白。因此，在整个纯化步骤中，各批次的效价提高1.9倍，与免疫球蛋白的富集一致。

B)AVX-470的亲和纯化

通过将重组人TNF偶合到Affigel-10制备了亲和基质。简而言之，将3mg作为由PBS（磷酸盐缓冲盐水，pH7.2）制备的冻干粉的人TNF（Cell Sciences，目录号CRT100C，批号3105816）复原，然后与0.5mL Affigel-10(BioRad)结合以进行偶合，再进行洗涤、封闭并根据制造商的说明储存。将上文(A)中制得的AVX-470在PBS中稀释，然后通过柱子。将基质用20倍柱体积的PBS洗涤，用2.5倍体积的50mM柠檬酸/100mM氯化钠(pH2.0)洗脱，收集到装有足量1MTrizma碱溶液的容器中以提供有效的立即中和。将样品通过280nm处的吸光度分析，然后基于1.4mg/mL-A_280nm的粗略换算因数进行初步评价。hTNF诱导的细胞毒性的标准体外L929测定法显示出命名为“AVX-470A”的亲和纯化材料的TNF中和活性的311倍纯化。数据表明0.3%的AVX-470A是TNF特异性的。该亲和纯化抗体的效价与英夫利西单抗的效价非常相似（EC50=51ng/ml，相比之下，英夫利西单抗为76ng/ml），如表12所示。

表12

抗体	TNF ELISA中的EC50(ug/ml)
		AVX-470	15.9
英夫利西单抗	0.076
		AVX-470A	0.051

实施例20.通过重组人TNF对奶牛免疫

选择年龄为3至5个月的十二头雌性奶牛犊进行免疫研究。在三周检疫期后，将每头牛犊用与四种可能的佐剂之一结合的0.05mg重组人TNF(rhTNF)免疫四次：Quil A(0.5mg/mL)、Montanide ISA201VG（50%溶液）、（20%溶液）或BCL（20%溶液）。

rhTNF由Cell Sciences作为冻干粉而提供，并且在使用前最多2天配制成1mg/mL牛血清白蛋白中的0.05mg/mL溶液。Quil A佐剂由Accurate Chemical&Scientific Corp.作为冻干粉而提供，并在使用当天配制成1mg/ml的溶液。Montanide ISA201VG由Seppic,Inc.作为可直接使用的液体而提供。和佐剂由MVP Technologies,Inc.作为可直接使用的液体而提供。

每个佐剂组存在三头牛犊。每次免疫为2cc的体积，所有的均在颈部或肩部区域经皮下施用。将第一次免疫的日期指定为研究第0天；后续免疫在第21、35和56天施用。在每次免疫后对动物观察72小时，报告任何异常或不平常的发现。在第0天（免疫前出血）、21天、35天和56天采集了五十毫升血清样品，在第70天（最终免疫后两周）采集了最终大体积(300-500mL)样品进行免疫学分析。

通过从颈静脉采集全血获得了血清样品。将最终大体积出血采集到250mL无菌采集袋中。

将通过对牛犊免疫产生的血清源材料命名为Serum-470。

实施例21.通过ELISA测定与人TNF的结合

为了确定Serum-470是否能够结合到人TNF，通过ELISA对血清样品进行了测定。使用第四个出血样品，由通过给定的佐剂免疫的各组动物形成了混合样。将重组人TNF(Cell Sciences)稀释进0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)然后以1ug/ml的浓度以0.1mL/孔包被到96孔板上。在室温下孵育1小时后，将板用0.01M Tris缓冲盐水(TTBS)中的0.05%Tween洗涤五次。将血清样品在TTBS中进行稀释，然后将0.1mL以1:10–1:590,490的3倍稀释序列加入平行孔中。在室温下一小时后，将板用TTBS洗涤五次，然后将0.1mL辣根过氧化物酶偶联的山羊抗牛IgG(h+l)(Bethyl Labs,Montgomery TX)以1:100,000的稀释度加入各孔。

在室温下一小时后，将板用TTBS洗涤五次，在添加了在暗处孵育三十分钟的50μl/孔的3,3’,5,5’四甲基联苯胺(TMB)底物(Invitrogen,Carlsbad,CA)，然后添加0.05mL/孔的1%H₂SO₄终止液后进行了比色分析。

在450nm处测定了光密度。将通过无血清的孔测定的背景吸光度从实验OD450值中减去。

图1显示了抗TNF ELISA数据。所有四组免疫动物均具有结合到人TNF的抗体，然而抗TNF抗体的滴度在各组之间不同，其中Quil A是最有效的佐剂。在出血前血清样品中检测到了即使有也没有多少的抗体。

为了确定滴度的差异是否是因不同组中总免疫球蛋白浓度的变化所致，通过ELISA对血清样品的总免疫球蛋白浓度进行了测定。将微孔板如上用抗牛IgG(h+l)抗体(Bethyl Laboratories)以5ug/ml进行包被。将Serum-470的混合样进行系列稀释，然后加到板中并洗涤。使用辣根过氧化物酶偶联的绵羊抗牛IgG抗体检测了结合。

图2显示了抗Ig ELISA数据。所有四组和出血前样品均具有相当的免疫球蛋白浓度。因此，在图1中所见的各组之间抗TNF滴度的差异表示人TNF特异性的免疫球蛋白百分比的差异。

实施例22.通过Serum-470中和人TNF

使用鼠科动物L929成纤维细胞系（American Type CultureCollection,Rockville,MD；目录号CCL-1）通过标准TNF细胞毒性生物测定法(Mathews N.,等人1987,Lymphokines and Interferons)对Serum-470样品（第4次出血的混合样品）中和人TNF的能力进行了测定。将L929细胞通过连续传代维持在由含有10%胎牛血清(Invitrogen,Carlsbad,CA)的伊格尔最低必需培养基(EMEM)组成的培养基中。在测定前一天，通过0.25%胰蛋白酶-EDTA(Invitrogen)进行简短的胰蛋白酶化将L929细胞从组织培养瓶中收获。将细胞在培养基中进行洗涤，然后以0.1mL的等分试样将6×10⁴个细胞/孔分配到96孔板中，然后在37℃的CO₂培养箱中孵育过夜。在96孔板的平行孔中制备了Serum-470样品在含有2ug/ml放线菌素-D(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)的培养基中的3倍系列稀释样（0.06mL/孔）。

将重组人TNF（rhTNF；Cell Sciences In.,Canton,MA；目录号CRT-100C）（0.06μL/孔，在含有2ug/ml放线菌素-D的培养基中为4ng/ml）加到各孔中，然后将混合物在37℃预孵育1小时。将Serum-470/rhTNF混合物（0.01mL/孔）加到L929细胞的汇合培养物中，在37℃孵育20小时。每个孔的最终体积为0.2mL，含有1ng/mlrhTNF、1ug/ml放线菌素-D和以1:30开始的Serum-470样品的八个3倍稀释样。

对照孔包含培养基与细胞或rhTNF与细胞。通过向各孔添加0.02mL Promega Substrate:CellTiter96Aqueous One Solution Reagent(Promega,Madison,WI)，将板在37℃ CO₂培养箱中孵育6小时，然后在ELISA酶标仪中读取各孔490nm的OD而评估了L929细胞的活力。将TNF中和的效价计算为在存在固定量(1ng/ml)TNF的情况下Serum-470样品系列稀释样的IC₅₀值。将数据表示为导致TNF活性的半最大抑制的稀释度的倒数。

如表13所示，所有四种佐剂均诱导了能够中和人TNF的抗体，而在出血前样品中未见活性。在佐剂之间观察到了定量差异，其中Quil A和Montanide ISA 291 VG在诱导强中和抗体反应中是最有效的。

表13

样品	IC50
		Quil A	8300
Montanide ISA291VG	8300
		Emulsigen-D	2200
Emulsigen-BCl	1300
		出血前	无活性

实施例23.Serum-470(Quil A)的物种特异性

使用TNF ELISA测定了Serum-470的TNF物种特异性。测试了得自9个物种的重组TNF(rTNF)（人、犬科动物、食蟹猴、恒河猴、豚鼠、猪科动物、鼠科动物、大鼠、牛科动物）。TNF样品购自CellSciences（人、鼠科动物）、R&D Systems（犬科动物、恒河猴、豚鼠、猪科动物、大鼠、牛科动物）或Sino Biological,Inc.（食蟹猴）。将微量滴定板包被上得自不同物种的rTNF，然后如实施例2中所述进行测定。血清样品是得自用rhTNF和Quil A佐剂免疫的牛犊的混合样。使用非线性回归分析测定了ELISA滴度。

图3显示了得自不同动物物种的TNF的Serum-470(Quil A)相对滴度。

实施例24.佐剂对抗原特异性的作用

为了确定用于免疫的佐剂是否可能影响诱导的抗体的特异性，通过ELISA对得自各组牛犊的混合样结合人或犬科动物TNF的能力进行了测定。测定如实施例21和23进行。

表14显示了通过ELISA测定的与人和犬科动物TNF的相对结合。所有四个血清混合样在对人TNF进行测定时均比对犬科动物TNF进行测定时具有更高的滴度。然而，相对滴度在佐剂之间存在差异。得自用Quil A、Montanide ISA201VG或Emulsigen BCL免疫的动物的血清均具有2.2–2.5的相对滴度。然而，得自用Emulsigen D免疫的动物的血清显示出更大程度的物种特异性，其中对人TNF的偏好是对犬科动物TNF的5.5倍。

这些数据表明选择免疫条件（包括佐剂）将影响抗体的特异性谱。

实施例25.Serum-470的物种特异性：ELISA结合数据与L929中和数据的比较。

如实施例24所述通过ELISA对Serum-470(Quil A)的物种特异性谱进行了测定，并且图4所示的数据与实施例24中所述的那些数据相同。以与实施例22所示的数据相似的方式，但将得自不同物种的TNF用于测定法中，使用L929中和测定法对Serum-470的物种特异性进行了测定。以大约ED90（L929读数降低90%所处的浓度）测定了各TNF物种。Kis使用公式Ki=IC50/[1+(A/ED50)]进行计算，其中IC50=产生50%的反应抑制的AVX-470的稀释度；A=用于测定法中的TNF的浓度；以及ED50=抑制L929细胞所需的得自特定物种的TNF的半最大浓度。

另外为了计算各TNF的基于浓度的IC₅₀，假设对于Serum-470(Quil A)而言1%的总免疫球蛋白浓度（8mg/mL；图12）为TNF特异性的（即，0.08mg/mL未稀释血清）。然后将TNF特异性抗体的未稀释浓度(0.08mg/mL)除以稀释度IC₅₀，再代入Cheng-Prusoff公式，从而得到表示为mg/mL以及表示为pM的K_i（表15）。人TNF3.47pM的K_i与AstraZeneca(Newham等人,2011)所报道的绵羊抗人TNF抗体片段AZD9773所报道的4pM的K_i相当。

表15和图4所示的数据证实了血清源AVX-470多克隆抗体的物种特异性谱。

表15

^*IC50值使用8mg/mL的总血清Ig定量(110811)并假定1%为TNF特异性的而得出：(8mg/mL)(0.01)/(在L929测定法中得出50%的细胞死亡抑制的血清稀释度)

^**假定所有抗体均为150000Da

可基于倒数K_i比较而将各TNF物种的K_i值与人TNF的K_i进行比较（因为K_i越小表明抑制效力越高）。该分析得出Serum-470对得自不同物种的TNF相对于对人TNF的交叉反应程度的定量测定。与人TNF相比，Serum-470显示出对恒河猴TNF(73%)和食蟹猴TNF(48%)的最大中和交叉反应性。

涉及得自ELISA（倍数降低）和L929K_i（倍数增加）的相对倍数差异的汇总在表16中给出。

表16.ELISA滴度和L929K _i 汇总（相对倍数活性）

TNF	ELISA滴度倍数降低	Ki倍数增加
			人	(-)	(-)
恒河猴	4.3	1.4
			食蟹猴	2.9	2.1
猫科动物	10.5	8.9
			犬科动物	2.4	21.9
兔	ND	>45.7
			鼠科动物	112.1	>51.7
豚鼠	20.4	>57.6
			大鼠	361.3	>284.3
牛科动物	465.3	>557.2
			猪科动物	25.0	>557.2

使用Serum-470进行的效价测定表明最高的AVX-470结合和中和交叉反应程度在本研究中所评价的10个物种之中将是非人灵长类：恒河猴和食蟹猴。

如图4中突出显示，数据还表明结合和中和数据不相关并且测量这两种数据不是关键性的。

实施例26-初乳源AVX-470抗体显示出与Serum470相同的物种 特异性

a)在抗TNF ELISA（结合）中测量了在实施例3和14中由初乳制备的AVX-470的物种特异性的差异。

得自不同物种的TNF购自商业供应商。人和鼠科动物的TNF购自Cell Sciences，恒河猴、犬科动物和牛科动物的TNF购自R&DSystems，食蟹猴TNF购自Sino Biological,Inc.。将ELISA板(GreinerBio-One)以0.1mL碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)(SIGMA#C3041)中1μg/mL的浓度包被上得自不同物种的TNF，洗涤，然后用Tris缓冲盐水中0.05%的TWEEN(TBS-TWEEN)封闭。将AVX-470的系列稀释样加入，然后在室温下孵育1小时。将板用辣根过氧化物酶(HRP)偶联的绵羊抗牛科动物抗体(Bethyl Laboratories)和3,3’,5,5’-四甲基联苯胺底物(Invitrogen)显色，并通过添加1%的H₂SO₄而终止。在不存在血清而孵育的各TNF物种的背景值从各含血清孔中减去。数据在图6中示出。根据该数据，初乳源AVX-470抗体的物种特异性与衍生自血清的AVX-470抗体的物种特异性相似，从而表明衍生自已根据实施例3所述的方法免疫的牛科动物的初乳或血清的抗体是相同的。

b)在L929测定法（中和）中测得的AVX-470的物种特异性。

使用鼠科动物成纤维细胞系测定了根据实施例3和14制备的AVX-470抗体中和TNF的能力。首先计算了各物种的TNF杀死90%L929细胞(EC₉₀)的有效TNF浓度，以便在S形剂量反应曲线线性部分的顶部开始抗TNF抗体中和实验。得自不同物种的TNF购自商业供应商。人和鼠科动物TNF购自Cell Sciences，恒河猴、犬科动物和牛科动物的TNF购自R&D Systems，以及食蟹猴TNF购自SinoBiological,Inc.。将L929细胞在96孔板中以3.5×10⁴个细胞/孔培养过夜，然后用1μg/mL放线菌素D中的TNF系列稀释样孵育20小时。用CellTiter96Aqueous One Solution(Promega,Madison,WI)培养4小时后评估了细胞活力。使用490nm处的0.72OD计算了各物种的TNF的EC₉₀，因为这与由大多数物种的TNF导致的约90%的细胞死亡相关联。为了评估AVX-470导致的中和，将L929细胞如上所述进行接种。将AVX-470的系列稀释样用重组TNF（以EC₉₀）在37℃下预孵育1小时，然后与放线菌素D一起加到L929细胞中。根据TNF滴定分析，使用Promega底物评估了细胞活力。EC₅₀是导致50%的TNF介导的L929细胞杀灭抑制的AVX-470浓度，并在表17中示出。

表17

TNF来源	EC50(mg/ml)
		人	0.028
恒河猴	0.032
		食蟹猴	0.048
犬科动物	0.25
		鼠科动物	>2.0
大鼠	>2.0
		牛科动物	>2.0

如上面的实施例26(a)中所示，血清源serum-470的TNF中和谱与初乳源AVX-470的相同。数据还证实了物种交叉反应性的细微特异性。

实施例27.表位作图

a)概述获取通过与实施例3和14中所述的那些方法相似的方法制备的AVX-470的样品，它包含衍生自根据实施例3的免疫方案用rhTNF免疫的牛的初乳的抗hTNF多克隆抗体。基于Timmerman等人(2007)J.Mol Recognit.,20:283-99中所述的CLIPS技术，设计了总共2625种不同的肽，以重构人TNF的可能构象和不连续表位，其中用于表位作图的TNF的序列具有SEQ ID NO:1的第1-157位氨基酸的氨基酸序列：

VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVV

PSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSP

CQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQV

YFGIIAL(SEQ ID NO：1)

应该指出的是，SEQ ID NO:1不含hTNF的胞质和跨膜区。应当理解，氨基酸数在hTNF的全长序列中可以不同。

使用ELISA对样品AVX-470的抗体与各合成肽的结合进行了测试。使用不同的样品浓度和多种封闭条件变化对hTNF肽上的样品AVX-470进行ELISA分析鉴定了TNF的五个不同的结合区（表位）：

表位投射到hTNF的相关晶体结构上标明SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3和SEQ ID NO:5的表位是暴露于表面的。SEQ ID NO:6的表位未暴露于表面，但是在三聚体状态中主要与另一TNF单体接触。SEQ ID NO:4的表位主要埋藏在TNF单体内。

b)方法-肽的合成和筛选程序

为了重构目标分子的不连续表位，合成了结构化肽的文库。这使用在Timmerman等人,(2007)J.Mol Recognit.20:283-99中所述的支架上的化学连接肽(Chemically Linked Peptides on Scaffolds,CLIPS)技术进行。CLIPS技术允许将肽结构化成单环、双环、三环、片状折叠、螺旋状折叠以及它们的组合。将CLIPS模板偶合到半胱氨酸残基。将肽中多个半胱氨酸的侧链偶合到一个或两个CLIPS模板。例如，将0.5mM的T2CLIPS模板1,3-二(溴甲基)苯溶液溶于碳酸氢铵(20mM,pH7.9)/乙腈(1:1(v/v)。将溶液加到肽阵列上。CLIPS模板将结合到存在于肽阵列（如Sloostra等人,(1996)Molecular Diversity1:87-96中所述的具有3ul孔的455孔板）的固相结合肽中的两个半胱氨酸的侧链。将肽阵列在溶液中轻轻摇晃30至60分钟同时保持被溶液完全覆盖。最后，将肽阵列用过量的H₂O彻底洗涤，在70℃下在PBS(pH7.2)中含有1%SDS/0.1%β-巯基乙醇的破坏缓冲液中超声处理30分钟，然后在H₂O中再超声处理45分钟。以相似的方式但现在具有三个半胱氨酸制备了T3CLIPS运载肽。

在ELISA中测试了抗体与各合成肽的结合。将肽阵列用5%的封闭溶液（该封闭溶液由4%卵清蛋白、5%马样品、1%Tween80组成）在室温下预孵育30分钟。将肽阵列用一抗溶液（在PBS/1%Tween80中浓度为1至100ug/ml，4℃过夜）孵育。洗涤后，将肽阵列用兔抗绵羊抗体孵育（1/1000，25℃下一小时），洗涤后，用猪抗兔抗体过氧化物酶偶联物孵育（1/1000，25℃下一小时）。洗涤后，将过氧化物酶底物2,2′-连氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸酯)(ABTS)和2微升/毫升的3%H₂O₂加入。一小时后，测量显色情况。通过电荷耦合器件(CCD)照相机和图像处理系统对显色定量。

c)结果

1.全局结果和信噪比

使用四种不同的AVX-470浓度对所有肽的结合活性进行了分析。在25ug/ml浓度中，应用了四种不同的封闭条件。这7种筛选一起对于鉴定靶蛋白上的结合区以及区分较强和较弱的结合区是最佳的。

2.表位的鉴定

该分析所生成的所有数据集作为“分段”图或作为热图在线性图中示出。在所采用的样品的最低实验浓度下，观察到了目标蛋白(VRSSSRTPSDKPVAH)(SEQ ID NO:1)N端区域中肽的优势结合：在图最左侧约1000处的5根较高的条。该发现在所有实验肽组中一致。当通过控制样品的含量或实验封闭条件而改变结合条件时，可以观察到，可鉴定出多个独立的结合区。热图可视化显示出结合到

VRSSSRTPSDKPVAH    (SEQ ID NO:2)

QAEGQLQWLNRRANA  (SEQ ID NO:3)

QVLFK            (SEQ ID NO:4)

VNLLS            (SEQ ID NO:5)

在高样品浓度和低封闭强度下，也观察到了残基(RLSAEINRPD)(SEQ ID NO:6)的一些信号。

讨论：

VRSSSRTPSDKPVAH(SEQ ID NO:2)是优势表位并涉及多克隆抗体结合，但不一定中和活性。本发明的多克隆抗体对该表位的结合导致中和的潜力较低，原因是犬科动物和猫科动物TNF的第3-15位残基的序列几乎与人TNF相同（犬科动物：VKSSSRTPSDKPVAH(SEQ ID NO:7)；猫科动物：LRSSSRTPSDKPVAH(SEQ ID NO:8)），并且本发明的多克隆抗体对犬科动物和猫科动物TNF的中和低于20%，如图4所示。然而，Dong等人最近证实了序列80-91(SSRTPSDKPVAH(SEQ ID NO:9))特异性的抗体可在动物模型中抑制胶原诱导型关节炎，并且已将其指定为新的中和表位(Dong等人PLoS ONE(2010)5:e8920)。

QAEGQLQWLNRRANA(SEQ ID NO:3)暴露于表面并与依那西普的结合位点之一（SEQ ID NO:1的第29-36位氨基酸）部分重叠，依那西普是一种重组人可溶性TNF受体拮抗剂，它是通过将人TNFR2的胞外域连接到人IgG1的FC部分而生成的二聚融合蛋白（由Amgen,Thousand Oaks,CA作为销售）。该表位可能在本发明的多克隆抗体对hTNF的结合及中和方面相关。

QVLFK(SEQ ID NO:4)埋藏在单体中，并且不可能与结合或中和相关。

VNLLS(SEQ ID NO:5)暴露于表面并与等同于SEQ ID NO:1的第83-91位氨基酸的依那西普结合位点之一部分重叠。然而，该区域是高度保守的（存在于犬科动物、猫科动物、猪、小鼠和兔中的相同序列），并且不可能在本发明的多克隆抗体对hTNF的中和中相关。

RLSAEINRPD(SEQ ID NO:6)似乎为弱结合子。该表位在与hTNF三聚体中的另一单体接触的hTNF单体上暴露于表面。与英夫利西单抗（在美国由Janssen Biotech Inc.作为销售的嵌合单克隆抗hTNF抗体）的表位存在部分重叠。该表位存在多个令人惊讶的方面。首先，该表位是在人TNF与牛科动物TNF之间高度保守的区域。因此，预计它在作为本发明多克隆抗体的来源动物的牛科动物中无免疫原性。然而，根据实施例30，它可能在结合及中和中发挥着作用，该实施例表明多克隆抗体AVX-470在中和测定法中在中和hTNF方面与英夫利西单抗一样强效。

通过用人TNF和合适的佐剂对动物进行免疫而诱导的多克隆抗血清已有人使用小鼠(Corti等人,Molecular Immunology(1992)29:471-479)、兔(Corti,1992)和山羊(Yonei等人,J.Biol.Chem.(1995)270:19509-19515)进行了描述。Corti(1992)证明了衍生自小鼠血清的抗hTNF抗体识别如SEQ ID NO:1所示的hTNF的表位1-23、95-116、117-136和137-157。Corti(1992)还证明了衍生自兔的抗hTNF抗体识别如SEQ ID NO:1所示的表位1-23、56-75、95-116、137-157。在这些中，表位1-23最具免疫原性。Yonei(1995)证明了衍生自山羊的抗hTNF抗体识别如SEQ ID NO:1所示的hTNF的表位7-11、17-23、30-39、42-49、106-112、135-142。

当与该实施例中所公开的AVX-470牛科动物源性抗体进行比较时，显然的是，在此处所述的条件下用hTNF免疫奶牛导致了独特的免疫优势区(immunodominant footprint)。虽然将不同的技术用于这些研究的每一者中以确定免疫原性表位，但是显然的是，在AVX-470中所见的模式与在其他报告中所见的不同。要注意的是，对AVX-470的61-65和91-95的抗体反应未在任何其他物种中报道。此外，在小鼠血清中报道的免疫显性位点(104-112)也在兔血清(95-116)和山羊血清(106-112)中检测到，但未在AVX-470中见到。

实施例28.通过竞争ELISA测量的AVX-470对TNF的亲和力。

将96孔平底NUNC MaxiSorp ELISA板用35ng/ml的重组人TNF(Cell Sciences)在碳酸盐包被缓冲液中包被过夜。将板用PBS-T（含0.05%Tween-20的PBS）洗涤，并用PBS-T中的1%牛科动物血清白蛋白封闭。将AVX-470A（如实施例19(b)中所述的亲和纯化AVX-470）和英夫利西单抗（用作阳性对照的人源化抗TNF单克隆抗体）在室温下以不同的TNF浓度孵育1小时。AVX-470A和英夫利西单抗的浓度分别为35ng/ml和2ng/ml；选择这些浓度是因为它们在直接结合ELISA中在抗体剂量反应曲线的线性部分。将TNF-抗体混合物转移到TNF包被的板，在室温下孵育2小时。对板进行洗涤，然后对于AVX-470样品使用HRP标记的绵羊抗牛科动物抗体(Bethyl Labs)进行检测，或对于英夫利西单抗样品使用HRP标记的小鼠抗人抗体(Abcam)进行检测。将板用TMB底物显示，并用1%H₂SO₄终止。

如图7所示，AVX-470A和英夫利西单抗均具有2×10^-10M的亲和力测得值。然而，两种药剂的滴定曲线形状大不相同。结合TNF上单个表位的单克隆抗体英夫利西单抗显示出非常尖锐的抑制曲线，曲线上只有一个点(1e-10M)落在无结合与饱和结合之间。相比之下，结合TNF上多个表位的多克隆抗体AVX-470显示出缓得多的抑制曲线，曲线上有4个点（1e-11至1e-8）落在无结合与饱和结合之间。

实施例29.通过在ELISA中的结合而评价的亲和纯化AVX-470A的效价。

使用实施例26(a)中的方案，在TNF特异性ELISA中对实施例3、14和19(b)中制备的亲和纯化AVX-470进行了测定。将人源化抗TNF单克隆抗体英夫利西单抗用作对比物。如图8所示，如通过ELISA测得的TNF结合所定义，AVX-470A的效价是英夫利西单抗的效价的十分之一。

实施例30.通过在L929测定法中的中和而评价的亲和纯化AVX-470A的效价。

使用实施例26(b)中的方案，在L929测定法中对实施例3、14和19(b)中制备的亲和纯化AVX-470进行了测定，以测量TNF中和。将人源化抗TNF单克隆抗体英夫利西单抗用作对比物。如图9所示，如通过TNF中和所定义，AVX-470A的效价是英夫利西单抗的效价的1.5倍。

实施例29和30一起表明，在通过ELISA测量的TNF结合与在L929测定法中测量的TNF中和之间不存在关联。虽然不旨在通过暗示机理而限制本发明的范围，但是可能的是，AVX-470的效力由于多克隆抗体结合到TNF上多个表位的协同效应而比基于单独的结合数据所预期的效力更强。

实施例31.细胞凋亡的诱导

使用如Nesbitt,A.(2007)Inflamm.Bowel Dis.13,1323；Atreya,R.(2011)Gastroenter.141,2026和Kaymakcalan,Z.(2006)Poster atFOCIS Annual Scientific Meeting中所述的方案的改进形式进行了细胞凋亡的诱导。简而言之，得自健康供体的人全血购自Research BloodComponents(Boston,MA)。将全血采集在BD Vacutainer CPT-肝素管中，管中含有FICOLL Hypaque密度流体和聚酯凝胶阻隔物，以通过密度离心分离外周血单核细胞(PBMC)。将PBMC在37℃、5%CO₂和95%湿度下培养。将IMDM培养基补充10%胎牛血清、GlutaMAX(Gibco)、青霉素和链霉素。将细胞以1×10⁶个细胞/ml接种到板上，然后用5ng/ml PMA和1μM离子霉素刺激48小时。收获细胞，在完全培养基中洗涤三次，然后单独地、与10mg/ml AVX-470或与100μg/ml英夫利西单抗一起以1×10⁶个细胞/ml再次接种到板上。二十四小时后，将细胞通过用膜联蛋白V和碘化丙啶染色而评估细胞凋亡，并在FACSCanto II(BD Biosciences)上接受荧光激活细胞分选(FACS)分析。

如图10所示，表达高水平的碘化丙啶和膜联蛋白V的细胞（右上象限）是晚期凋亡细胞，而表达高水平膜联蛋白V但表达低水平碘化丙啶（右下象限）的细胞是早期凋亡细胞。数据在表18中汇总。

表18

组	晚期凋亡细胞	总凋亡细胞
			未处理	27.16%	34.65%
英夫利西单抗	42.08%	53.87%
			AVX-470	43.34%	52.11%

因此，AVX-470识别跨膜TNF，并诱导表达跨膜TNF的细胞的细胞凋亡。通过抗体结合跨膜TNF产生的细胞凋亡中涉及到的一种机理是抗体通过膜结合TNF而诱导反向信号转导和/或中和跨膜TNF的生物活性，使得抗细胞凋亡信号转导得以减弱，从而增加细胞凋亡(Van den Brande等人(2003)Gastroenterology124:1774-1785)。

实施例32.对AVX-470结合人IL-6的能力的评估

以夹心ELISA形式评价了AVX-470与rhTNF和rhIL-6的结合，其中细胞因子（TNF或IL-6）使用特异性ELISA试剂盒通过结合于板上的标准抗体进行捕获。人TNF-αDuoSet试剂盒和人白介素-6Quantikine试剂盒购自R&D Systems。IL-6试剂盒伴随有预包被且预封闭的捕获抗IL-6抗体。对于TNF试剂盒，将板包被上4ug/ml的捕获抗TNF抗体，然后在室温下孵育过夜，用PBS中的1%BSA（牛科动物血清白蛋白）封闭1小时，然后进行洗涤。将人TNF(1000–18.75pg/ml)或IL-6(300–3.12pg/ml)标准品的两倍稀释样加入，在室温下孵育2小时，然后对板进行再次洗涤。将得自试剂盒的检测抗体(250ng/ml)、AVX-470(1.5mg/ml)、对照牛科动物Ig(1.5mg/ml)或英夫利西单抗(12.5ng/ml)加入，在室温下孵育2小时，然后洗涤。使用HRP标记的抗牛科动物Ig对AVX-470的结合进行了检测；使用HRP标记的抗人Ig对英夫利西单抗的结合进行了检测；使用HRP标记的链霉亲和素对随试剂盒提供的生物素酰化标准品的结合进行了检测。将所有板用TMB底物显色。将数据表示为450nm处的吸光度，其中从各值中减去在不存在细胞因子的情况下所见的背景值。数据在表19中汇总。

表19

数据表明AVX-470结合到重组人TNF，但未结合到重组人IL-6。对照牛科动物免疫球蛋白未结合到任一细胞因子。英夫利西单抗结合到TNF但未结合到IL-6。

实施例33.AVX-470牛科动物抗TNF抗体的安全性测试

为了在体内评价AVX-470的安全性，在Calvert Laboratories,Inc.(Scott Township,PA)进行了在大鼠和食蟹猴中进行的GLP毒理学研究。将纯化的抗体原料药通过管饲法向雄性和雌性SD大鼠每天施用两次，持续28天，剂量为250、1000和4000mg/kg/天（每组每种性别10只动物）。在任何组中均无计划外的死亡。在对照盐水组和AVX-470低、中、高剂量组中的任何动物中均未注意到异常的临床观察结果。在任何剂量水平下均未注意到与供试品相关的对体重的影响。AVX-470在所测试的任何剂量下均无明显的临床病理学影响。在任何剂量组中均无明显的临床化学或血液学参数的变化。对对照/盐水和AVX-470高剂量组中在第29天实施安乐死的雄性和雌性SD大鼠的淋巴和胃肠器官进行了显微镜检查。在该研究的条件下，在SD大鼠中在最高的测试剂量水平（4000mg/kg/天）下，不存在对淋巴和胃肠器官的与AVX-470相关的显微毒性作用。

将AVX-470通过管饲法向雄性和雌性食蟹猴（每组每种性别3只）每天施用两次，持续28天，剂量为125、500和2000mg/kg/天。在任何组中均无计划外的死亡。在对照盐水组和AVX-470低、中、高剂量组中的任何动物中均未注意到明显的临床观察结果。在任何剂量水平下均未注意到与供试品相关的对体重的影响。AVX-470在所测试的任何剂量下均无明显的临床病理学影响。在任何剂量组中均无明显的临床化学或血液学参数的变化。对在第29天实施安乐死的雄性和雌性食蟹猴的淋巴和胃肠器官进行了显微镜检查。在该研究的条件下，在食蟹猴中在最高的测试剂量水平（2000mg/kg/天）下，不存在对淋巴和胃肠器官的与AVX-470相关的显微毒性作用。

本文提及的专利和科学文献确立了本领域技术人员可以获得的知识。本文引述的所有美国专利和已公开或未公开的美国专利申请以引用方式并入。本文引述的所有已公开的外国专利和专利申请据此以引用方式并入。本文引述的所有其他公开的参考文献、文件、手稿和科学文献据此以引用方式并入。

虽然已参考本发明的优选实施方案对本发明进行了具体展示和描述，但是本领域的技术人员将理解的是，在不脱离所附权利要求书涵盖的本发明的范围的情况下，可在本发明中作出形式和细节的多种更改。还应当理解，本文所述的实施方案不互相排斥，并且各个实施方案中的特征可根据本发明全部地或部分地加以组合。

Claims (24)

1.一种包含特异性结合到人肿瘤坏死因子α(hTNF)的多克隆抗体的组合物，其中所述多克隆抗体衍生自已通过hTNF或其免疫原性部分免疫的牛科动物的血清、奶或初乳，其中所述多克隆抗体包括以下特征中的一个或多个：

a)中和人TNF以及选自恒河猴TNF和食蟹猴TNF的至少一种非人灵长类TNF的活性；

b)结合到hTNF上的至少一个表位，其中至少一个表位包含选自SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6的氨基酸序列的全部或一部分的氨基酸序列；以及

c)在表达跨膜TNF的外周血单核细胞中在体外诱导细胞凋亡。

2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多克隆抗体还结合并中和犬科动物TNF。

3.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多克隆抗体与鼠科动物TNF的交叉反应性为与hTNF的交叉反应性的约2%或更低。

4.根据权利要求1所述的组合物，其中所述多克隆抗体结合犬科动物TNF的程度比食蟹猴TNF大，而中和食蟹猴TNF的程度比犬科动物TNF大。

5.根据权利要求1所述的组合物，其以0.03mg/ml或更低的EC50在标准体外L929测定法中中和人TNF细胞毒性。

6.根据权利要求1所述的组合物，其中将所述牛科动物通过重组hTNF或其免疫原性片段免疫。

7.根据权利要求1所述的组合物，其中将所述牛科动物通过与选自Quil A、Montanide ISA201VG、Montanide ISA-25、Emulsigen-D和Emulsigen-BCL的佐剂相结合的hTNF或其免疫原性片段免疫。

8.一种包含权利要求1所述的组合物和药学上可接受的载体或赋形剂的药物组合物。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，还包含至少一种另外的治疗剂。

10.一种治疗患者的炎性肠病(IBD)的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求8所述的药物组合物。

11.一种治疗患者的口腔或肠粘膜炎的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求8所述的组合物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述口腔或肠粘膜炎因化疗或放疗而引起。

13.根据权利要求11所述的方法，其中所述口腔或肠粘膜炎因非治疗性暴露于辐射所致。

14.一种治疗患者的胃肠急性放射综合征(GI-ARS)的方法，包括向所述患者施用治疗有效量的权利要求8所述的组合物。

15.根据权利要求10、11或14所述的方法，其中所述组合物经口或经直肠施用。

16.一种治疗GI-ARS的非人动物模型中的GI-ARS的方法，包括向GI-ARS的所述非人动物模型施用权利要求8所述的组合物的步骤。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述非人动物模型选自非人灵长类、狗和猪。

18.根据权利要求17所述的方法，其中所述非人灵长类选自食蟹猴和恒河猴。

19.根据权利要求1所述的组合物，对于所述组合物中存在的每克总蛋白，所述组合物包含低于约1mg的乳铁蛋白。

20.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的制备包括以下步骤：

(a)通过阴离子交换柱或阳离子交换柱过滤衍生自牛科动物初乳的乳清；

(b)收集步骤(a)中的流通液；以及

(c)通过超滤浓缩步骤(b)的流通液。

21.根据权利要求1所述的组合物，其中所述组合物的制备包括以下步骤：

(a)将衍生自牛科动物初乳的乳清的pH调节到6.6至7.0的pH；

(b)通过与阳离子交换柱串联的阴离子交换柱过滤乳清，其中所述乳清按顺序流通串联的两根柱子，而不添加改变盐浓度或pH的材料；

(c)在流通步骤(b)的两根柱子后收集流通液，而不在收集前添加改变盐浓度或pH的材料；以及

(d)通过超滤浓缩步骤(b)的流通液。

22.根据权利要求21所述的组合物，其中存在于乳清中的所述多克隆抗体的比活性在步骤(d)的浓缩流通液中提高约2倍。

23.根据权利要求21所述的组合物，其中所述组合物的制备还包括步骤(e)：使用偶联到hTNF的亲和基质对步骤(d)的浓缩物进行亲和纯化。

24.根据权利要求23所述的组合物，其中在步骤(e)的亲和纯化材料的标准体外L929测定法中测得的hTNF细胞毒性的中和活性与步骤(d)的浓缩流通液的中和活性相比提高至少100倍。