CN110267987A

CN110267987A - 治疗炎性病症的治疗剂

Info

Publication number: CN110267987A
Application number: CN201880008314.2A
Authority: CN
Inventors: 约翰·兰登; 露丝·伊丽莎白·科克森
Original assignee: Micropharmaceuticals Co Ltd
Current assignee: Micropharmaceuticals Co Ltd; Micropharm Ltd
Priority date: 2017-01-27
Filing date: 2018-01-29
Publication date: 2019-09-20
Also published as: WO2018138524A1; US20210347876A1; JP6997785B2; JP2020506882A; JP2022046576A; US20190338021A1; GB201701404D0; CA3046446A1; US11098114B2; AU2018213127A1; EP3574011A1

Abstract

本发明涉及用于口服给药的抗体组合物，其包含与人肿瘤坏死因子α(TNFα)结合的完整血源性多克隆抗体，以及在胃肠转运过程中保护抗体的手段，以及其制备方法，试剂盒，和治疗用途。

Description

治疗炎性病症的治疗剂

本发明涉及适用于治疗炎性病症的抗体治疗剂。

肿瘤坏死因子α(TNFα)是介导全身性炎症的主要细胞因子，并且涉及许多疾病和病症，包括败血症性休克，以及胃肠病症，例如炎症性肠病。

慢性炎症性肠病(IBD)的两种主要形式为溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。UC和CD影响了欧洲和北美的500多万人，其发病率在全球范围内不断增加。两者都为肠免疫稳态失调的结果，其特征在于肠壁中可溶性和膜结合的TNFα水平显着升高。由于此类疾病的慢性特性，长期治疗是必需的。考虑到这一点，目前的抗体治疗剂依赖于针对TNFα的单克隆抗体的全身给药。此类单克隆抗体通常为嵌合的或人源化的，以避免在患者体内诱导体液免疫应答。由于触发此反应的风险，已经避免使用动物来源的多克隆抗体。目前广泛使用的三种单克隆抗体是嵌合鼠英夫利昔单抗和完全人源化的阿达木单抗和依那西普。英夫利昔单抗静脉输注，而另外两个静脉输注。

全身使用抗体与输液反应有关，并且这种治疗对于门诊患者来说是不方便的，因为静脉输注通常需要在医院短暂停留。另外，全身给予的McAb(分子量～150000Da)从血液传递到组织液，然后穿过胃肠道层到达上皮发炎内层的效率也是值得怀疑的。此外，由于TNFα是一种细胞因子，在系统性保护患者免受感染方面起着重要的促炎作用，因此长期全身给予抗TNFα抗体可增加严重副作用的发生率，包括肺结核复发、机会性感染、脱髓鞘性疾病和淋巴瘤的长期风险。

本发明解决了至少一个上述问题。

本发明人惊奇地发现，当适合配制用于口服给药时，结合TNFα的完整血源性抗体构成炎性病症如IBD的改进治疗剂。

源自血液并配制在本发明组合物中的多克隆TNFα抗体，当口服给予时令人惊讶地表现出改善的功效和比常规制备的抗体(例如乳源性抗体)改善的特异性滴度。

特别地，在绵羊或马宿主(优选绵羊宿主)中制备并配制在本发明组合物中的多克隆TNFα抗体，当口服给予时令人惊讶地表现出比常规制备的抗体改善的功效和改善的特异性滴度。

另外或或者，与全身给予的常规抗体(例如单克隆抗体)相比，当向受试者口服给药时，本发明的多克隆抗体不会引起或大大减少副作用(例如体液免疫应答副作用)。因此，与全身给予的抗体组合物不同，本发明的组合物适合于延长的治疗用途。

作为进一步的优点，该多克隆抗体的制备比常规单克隆抗体便宜得多。因此，本发明提供了可扩展和/或成本有效的治疗剂。

在一个方面，本发明提供用于口服给药的抗体组合物，其包含结合人肿瘤坏死因子α(TNFα)的完整血源性多克隆抗体，以及在胃肠转运过程中保护抗体的手段(means)。

有利地，抗TNFα的血源性多克隆抗体可从同一宿主的血液中多次获得，而无需杀死该宿主。这与使用牛初乳等来源的传统方法不同，牛初乳只能在有限的时间内产生抗体(例如一次)。

血源性抗体可从非人哺乳动物获得。

如本文所用，术语“可获得”还包括术语“获得”。在一个实施方案中，术语“可获得”是指获得。

优选地，抗体是绵羊或马多克隆抗体。

更优选地，抗体是绵羊多克隆抗体(例如可从绵羊获得)。

因此，在一个方面，提供用于口服给药的抗体组合物，其包含与人肿瘤坏死因子α(TNFα)结合的完整绵羊多克隆抗体，以及用于在胃肠转运过程中保护抗体的手段。

本发明的抗体结合并中和人肿瘤坏死因子α(TNFα)。抗体以比非人TNFα或替代抗原更高的结合亲和力结合人TNFα。在一个实施方案中，本发明的抗体以至少10-4M或至少10-5M的亲和力(通过解离常数Kd测量)结合人TNFα。在一个实施方案中，本发明的抗体可以至少10-6M或至少10-7M的亲和力(Kd)结合人TNFα。合适地，本发明的抗体可以至少10-8M或至少10-9M的亲和力(Kd)结合人TNFα。

或者或另外，可通过缔合常数(Ka)测量抗体结合亲和力。在一个实施方案中，本发明的抗体以至少106M的亲和力(通过缔合常数Ka测量)结合人TNFα。合适地，本发明的抗体以至少107M(例如至少108M)的亲和力(通过结合常数Ka测量)结合人TNFα。

可使用实施例3中所述的测定法测试抗体结合。可使用实施例4中所述的测定法测试中和作用。更详细地，可测定抗体组合物以测试TNFα对L929小鼠纤维肉瘤细胞系的细胞毒性作用的中和作用。

令人惊讶的是，与其他非血来源(例如禽蛋[例如来自蛋黄]或牛源，如牛奶)相比较，可从用人TNFα(或其纯化的部分)免疫的非人哺乳动物(优选绵羊和/或马非人哺乳动物)获得的血源性抗体含有更高浓度的人TNFα特异性抗体，在一些情况下，该血液(例如血清或血浆)或其纯化部分中的特异性抗体的浓度高100倍。

在一个实施方案中，可获自用人TNFα(或其纯化部分)免疫的宿主(例如非人哺乳动物)的血液样品中包含的总抗体的至少5％(合适为至少10％)与人TNFα结合。在另一个实施方案中，可获自用人TNFα(或其纯化部分)免疫的宿主(例如非人哺乳动物)的血液样品中包含的总抗体的至少15％或20％(合适为至少25％或至少30％)与人TNFα结合。

在一个实施方案中，可获自用人TNFα(或其纯化部分)免疫的绵羊的抗血清中包含的总抗体的至少5％(合适为至少10％)与人TNFα结合。在另一个实施方案中，可获自用人TNFα(或其纯化部分)免疫的绵羊的抗血清中包含的总抗体的至少15％或20％(合适为至少25％或至少30％)与人TNFα结合。

在一个实施方案中，可获自用人TNFα(或其纯化部分)免疫的马的血浆中包含的总抗体的至少5％(合适为至少10％)与人TNFα结合。在另一个实施方案中，可获自用人TNFα(或其纯化部分)免疫的马的血浆中包含的总抗体的至少15％或20％(合适为至少25％或至少30％)与人TNFα结合。

在一个实施方案中，抗体组合物包含浓度为5-100g/L或10-75g/L的完整多克隆抗体。在一个实施方案中，抗体组合物包含浓度为20-75g/L或35-60g/L的完整多克隆抗体。合适地，抗体组合物可包含至少约20或50g/L的完整多克隆抗体。所提及的浓度可为总完整多克隆抗体的浓度，合适为总完整多克隆IgG(即包括结合以及不结合TNFα的抗体)。在一个实施方案中，前述实施方案涉及与TNFα结合的完整多克隆抗体。优选所提到的抗体是绵羊多克隆抗体。

“抗体”是包含至少一个或两个重(H)链可变区(本文中缩写为VHC)和至少一个或两个轻(L)链可变区(本文缩写为VLC)的蛋白质。VHC和VLC区可进一步细分为高变区，称为“互补决定区”(“CDR”)，散布有更保守的区，称为“框架区”(FR)。框架区和CDR的范围已被精确定义(参见，Kabat,E.A.,et al.Sequences of Proteins of Immunological Interest,Fifth Edition,U.S.Department of Health and Human Services,NIH PublicationNo.91-3242,1991,和Chothia,C.et al,J.MoI.Biol.196:901-917,1987,其通过引用并入本文)。优选地，VHC和VLC各由三个CDR和四个FR组成，按照以下顺序从氨基末端到羧基末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。

抗体的VHC或VLC链可进一步包括重链或轻链恒定区的全部或部分。在一个实施方案中，抗体是两个重免疫球蛋白链和两个轻免疫球蛋白链的四聚体，其中重免疫球蛋白链和轻免疫球蛋白链通过例如二硫键相互连接。重链恒定区包括三个结构域，CH1、CH2和CH3。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区通常介导抗体与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM类型的完整免疫球蛋白(及其亚型)，其中免疫球蛋白的轻链可为κ或λ的类型。优选地，本发明的抗体是完整IgG。

术语“完整抗体”在本文中用于将本发明的抗体与抗体片段(例如抗体Fab、F(ab)2或Fc)区分开。因此，“完整抗体”包含(或由以下组成)全长抗体中存在的每个抗体区/结构域(例如可从绵羊获得)。“完整抗体”的单体包含(或由以下组成)两条重链和两条轻链。重链各包含(或由以下组成)VH结构域、CH1结构域、CH2结构域、和CH3结构域。轻链各包含(或由以下组成)CL结构域和VL结构域。

因此，本发明的抗体组合物不包含或基本上不包含抗体片段(例如，Fab、F(ab)2或Fc片段)。在发明上下文中使用的术语“基本上不”是指本发明组合物中包含的抗体总浓度的5％，4％，3％，2％，1％，0.5％，0.1％或0.01％以下是抗体片段。相反，在一个实施方案中，组合物中包含的抗体总浓度的至少95％，96％，97％，98％，99％，99.5％，99.9％，99.99％或100％(合适为100％)是完整抗体。在一个实施方案中，可从污染的抗体片段中纯化和/或分离多克隆抗体。

有利地，与抗体片段相比，本发明的完整抗体显示出改善的TNFα结合和/或中和作用，表现出改善的TNFα结合能力(实施例3)和/或中和能力(实施例4)。此外，与需要额外处理和/或纯化步骤的抗体片段相比，本发明的完整抗体的生产成本要低得多。

在一个方面，本发明提供制备与人肿瘤坏死因子α(TNFα)结合的完整血源性多克隆抗体的方法，该方法包括从已经给予包含人TNFα或其片段的免疫原的非人哺乳动物获得血液样品。血液样品包含与人TNFα结合的完整多克隆抗体。本发明还涉及可通过该方法获得的抗体。

血液样品可进一步处理，例如，以获得血清或血浆。因此，抗体可从血清或血浆获得。在非人哺乳动物是绵羊的实施方案中，抗体可从血清获得。在非人哺乳动物是马的实施方案中，抗体可从血浆获得。

如本文所用，术语“血源性”是指抗体是从用于产生该抗体的宿主(例如非人哺乳动物)的血液中获得的。通常，血源性抗体可通过皮下、肌肉内、腹膜内和/或静脉内给予该宿主(例如非人哺乳动物)人TNFα或其片段而获得。

在一个实施方案中，血液样品(例如血清)包含至少1,2,3,4,5,6,7或8g/L与人TNFα结合的抗体，优选为至少3g/L或至少5g/L与人TNFα结合的抗体。

在一个实施方案中，血液样品(例如血清)包含约1-约12g/L与人TNFα结合的抗体，例如约3-约9g/L与人TNFα结合的抗体。

该方法可进一步包括将血源性多克隆抗体与在胃肠转运过程中保护该抗体的手段混合。

在一个实施方案中，血液样品包含与人TNFα结合的抗体，亲合力为至少1×109L/mol，优选为至少1×1010L/mol。

优选地，非人哺乳动物是绵羊非人哺乳动物。

绵羊抗体是在绵羊中产生的抗体。使用绵羊作为与人TNFα结合的血源性抗体的生产宿主有许多优点。本发明人发现，与绵羊血(例如血清)中存在的人TNFα结合的抗体的浓度随时间保持基本恒定，从获得最大浓度的特异性抗体开始通常需要大约6个月浓度才会减半。因此，避免/尽可能减少了频繁使用人TNFα进行再免疫的需要。另外，基本上恒定浓度的特异性抗体可每年获得高产量的血源性抗体。相反，本发明人发现，当使用牛奶(例如牛乳)、鸡蛋、或初乳时，每年的抗体产量要低得多。此外，可在免疫方案的几乎任何时间点(一旦达到最大抗体浓度)获得高浓度的特异性抗体。这与血液中具有波动浓度的特异性抗体的其他非人哺乳动物形成对比，因此需要：测量抗体浓度，并确保仅在特异性抗体浓度高时才获得血液样品。因此，使用绵羊作为生产宿主去除了该额外步骤和/或消除了制备用方法中的不可预测性。

此外，本发明人已经表明绵羊之间的特异性血源性抗体浓度是一致的。

另外，在发达国家，绵羊数量丰富，与其他非人哺乳动物相比，其易于使用。

因此，在一个实施方案中，非人哺乳动物是具有基本恒定血液浓度的多克隆抗体的非人哺乳动物(例如绵羊)，该多克隆抗体在该非人哺乳动物被给予包含人TNFα或其片段的免疫原后与人TNFα结合。

如本文所用，术语“基本上恒定”是指与人TNFα结合的多克隆抗体的血液浓度在达到该抗体的最大血液浓度后6个月内和/或6个月后(优选为6个月内和6个月后)降低该抗体的最大血液浓度(100％)的75％或以下(优选为降低70％，65％或60％或以下，更优选为降低55％或以下(例如50％或以下))。

或者或另外，如本文所用，术语“基本上恒定”可意指在达到与人TNFα结合的多克隆抗体的最大血液浓度(100％)后6个月内和/或6个月后(优选为6个月内和6个月后)，该多克隆抗体的血液浓度为最大值的至少20％，优选为至少25％，30％，35％或40％，或更优选为至少45％(例如约50％)。

在一个实施方案中，与人TNFα结合的多克隆抗体的最大血液浓度发生在免疫后至少10周，例如免疫后至少11周。优选为与人TNFα结合的多克隆抗体的最大血液浓度发生在免疫后约12周。

因此，本发明包括产生用于本发明组合物中的绵羊抗体的方法，该方法通常包括：

将包含人TNFα或其片段的免疫原给予羊；

ii.允许有足够的时间在羊中产生抗体；和

iii.由羊获得抗体。

如本文所用，术语“羊(sheep)”与术语“绵羊(ovine)”同义。如本文所用，羊包括属于绵羊属内的任何物种(例如，盘羊、东方盘羊、赤羊、赤羊(指名亚种)、大角羊、白大角羊、雪山盘羊)。

如本文所用,术语“绵羊抗体”是与在羊中产生的抗体具有至少85％、90％、95％、或99％氨基酸序列同一性的抗体。如本文所用，优选为“绵羊抗体”是与在羊中产生的抗体具有100％氨基酸序列同一性的抗体。

在一个实施方案中，本发明的组合物仅包含绵羊抗体，因此不包括来自非绵羊源的抗体。

抗体通常可从羊血清中获得。因此，本文所述的产生绵羊抗体的方法产生羊抗血清，其包含能结合和/或中和人TNFα的抗体。在一个实施方案中，分离和/或纯化抗体，例如从羊抗血清中分离和/或纯化。

优选地，非人哺乳动物是马非人哺乳动物。

马抗体是在马中产生的抗体。有利地，通过使用马作为生产宿主，可每年获得高产量的与人TNFα结合的血源性抗体。此外，已发现马血细胞在收集样品后迅速沉降，因此在获得血浆时不需要耗时的离心步骤。

在非人哺乳动物是马非人哺乳动物的实施方案中，制备方法可包括从血液样品中获得血浆，并将该样品的血细胞返回到该马非人哺乳动物。合适地，血液样品采集后24小时、12小时、6小时、1小时或30分钟内可返回血细胞。

因此，本发明包括产生用于本发明组合物中的马抗体的方法，该方法通常包括：

将包含人TNFα或其片段的免疫原给予马；

ii.允许有足够的时间在马中产生抗体；和

iii.由马获得抗体。

如本文所用，术语“马(horse)”与术语“马(equine)”同义。如本文所用，马包含属于马属的任何物种。优选地，马是野马中的一种或多种，例如家马。

如本文所用，术语“马抗体”是与在马中产生的抗体具有至少85％、90％、95％、或99％氨基酸序列同一性的抗体。优选地，如本文所用，“马抗体”是与在马中产生的抗体具有100％氨基酸序列同一性的抗体。

在一个实施方案中，本发明的组合物仅包含马抗体，因此不包括来自非马源的抗体。

抗体通常可从马血浆中获得。因此，本文所述的产生马抗体的方法产生马血浆，其包含能结合和/或中和人TNFα的抗体。在一个实施方案中，分离和/或纯化抗体，例如从马血浆中分离和/或纯化。

用于产生本发明抗体的免疫原是人TNFα，其任选地经纯化。如本文所用，术语“人TNFα”包括全长人TNFα、其变体或其片段。优选地，术语“人TNFα”是指全长人TNFα。合适地，人TNFα可为重组人TNFα。

免疫原可为包含SEQ ID No.1(或由SEQ ID No.1组成)的人TNFα。在一个实施方案中，免疫原是SEQ ID No.1的片段。在一个实施方案中，免疫原是与SEQ ID No.1具有至少70％(合适为至少80％)序列同一性的人TNFα变体(或其片段)。合适地，免疫原是与SEQ IDNo.1具有至少90％(合适为至少95％)序列同一性的人TNFα变体(或其片段)。

免疫原可为包含SEQ ID No.2(或由SEQ ID No.2组成)的人TNFα。在一个实施方案中，免疫原是SEQ ID No.2的片段。在一个实施方案中，免疫原是与SEQ ID No.2具有至少70％(合适为至少80％)序列同一性的人TNFα变体(或其片段)。合适地，免疫原是与SEQ IDNo.2具有至少90％(合适为至少95％)序列同一性的人TNFα变体(或其片段)。

在一个实施方案中，免疫原包含(或由以下组成)SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、或SEQ ID No.13或与其具有至少70％序列同一性(例如与其至少80％序列同一性)的序列。在一个实施方案中，免疫原包含(或由以下组成)与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ IDNo.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ IDNo.12、或SEQ ID No.13具有至少90％(例如至少95％)序列同一性的序列。在一个实施方案中，免疫原是一种或多种该序列的片段或变体。

在一个实施方案中，“变体”可为肽或肽片段的模拟物，该模拟物复制肽或肽片段的至少一个表位。在另一个实施方案中，“变体”可为与本文所述序列相比具有至少一个氨基酸突变或修饰的肽或肽片段。在一个实施方案中，变体是SEQ ID No.13。

本文提及的“片段”可为SEQ ID No.1的片段，其具有1-156的任意数的氨基酸。或者或另外，本文提及的“片段”可为SEQ ID No.2的片段，其具有1-232的任何数的氨基酸。该片段优选包括人TNFα的至少一个表位。该“片段”还可具有与其来源的人TNFα相同的抗原交叉反应性和/或基本相同的体内生物活性。例如，能结合片段的抗体也能结合其来源的人TNFα。或者，该片段可具有诱导T淋巴细胞“回忆应答”的相同能力，该T-淋巴细胞先前已经暴露于人TNFα的抗原成分。

在一个实施方案中，片段包含(或由以下组成)SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.12或与其具有至少70％序列同一性(例如与其具有至少80％序列同一性)的序列。在一个实施方案中，片段包含(或由以下组成)与SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、或SEQ ID No.12具有至少90％(例如至少95％)序列同一性的序列。

在一个实施方案中，免疫原或其片段包含(或由以下组成)人TNFα(例如，SEQ IDNo.1或SEQ ID No.2)的N-末端或N-末端片段。在一个实施方案中，N-末端或N-末端片段包含(或由以下组成)SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或与其具有至少70％序列同一性(例如与其具有至少80％序列同一性)的序列。在一个实施方案中，N-末端或N-末端片段包含(或由以下组成)与SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ IDNo.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7具有至少90％(例如至少95％)序列同一性的序列。

在一些实施方案中，本发明的多克隆抗体显示出对鼠TNFα的交叉反应性和/或中和作用。

有利地，与人TNFα结合的N-末端片段的抗体可具有改善的中和特性。

不希望受理论束缚，据信人TNFα包含多个表位(或由多个表位组成)。例如，人TNFα单体可包含至少2或3个表位。据信人TNFα也采用三聚体结构。因此，人TNFα三聚体可包含其他表位。不希望受理论束缚，据信组合物的至少5-15种抗体(例如10-15种抗体)可与人TNFα三聚体结合。合适地，组合物中约12种抗体可结合人TNFα三聚体。

发明的抗体组合物包含多克隆抗体，因此优选地，该抗体组合物包含一群抗体，其中该群能与人TNFα的多个表位(优选所有表位)结合。

在一个实施方案中，本发明的抗体组合物包含与人TNFα的第一表位结合的第一抗体和与人TNFα的第二表位结合的第二抗体。优选地，本发明的抗体组合物包含与人TNFα的第三表位结合的第三抗体。合适地，本发明的抗体组合物可包含其他抗体，其各自与人TNFα的不同其他表位结合。

本发明的抗体组合物合适地包含与SEQ ID No.1和/或SEQ ID No.2结合的抗体。合适地，本发明的抗体组合物可包含与SEQ ID No.13结合的抗体。

在一个实施方案中，抗体组合物包含与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12或SEQ ID No.13、或与其具有至少70％序列同一性(例如与其具有至少80％序列同一性)的序列中的一个或多个(例如多个)结合的抗体。在一个实施方案中，抗体组合物包含与一个或多个(例如多个)与SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8、SEQID No.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12或SEQ ID No.13具有至少90％(例如至少95％)序列同一性的序列结合的抗体。

在一个实施方案中，抗体组合物包含与人TNFα(SEQ ID No.1或SEQ ID No.2)的N-末端结合的抗体。在一个实施方案中，该抗体与SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7或与其具有至少70％序列同一性(例如与其具有至少80％序列同一性)的序列中的一个或多个(例如多个)结合。在一个实施方案中，该抗体与一个或多个(例如多个)与SEQ ID No.3、SEQ ID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6或SEQ ID No.7具有至少90％(例如至少95％)序列同一性的序列结合。

多个序列是指至少2个(例如至少3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)该序列。合适地，术语多个序列是指所有列举的序列。

可用佐剂配制抗原。合适的佐剂可包括明矾(磷酸铝或氢氧化铝)、皂苷(及其纯化组分QuilA)、弗氏完全和不完全佐剂、RIBBI佐剂、和用于研究和兽医应用的其他佐剂。

本发明涉及多种免疫方案。在一个实施方案中，非人哺乳动物(例如绵羊或马)在第0天给予免疫原，随后每隔一段时间给予免疫原。所需的间隔范围和剂量范围可由本领域技术人员基于免疫原的确切性质、给药途径、和制剂的性质等来确定。此类剂量水平的变化可使用标准的经验优化程序进行调节。类似地，本发明并不旨在限于任何特定的抗体收集方案。收集时间通常可在第56天之后。特异性抗体(即结合免疫原的抗体)的水平可表示每升血、血清或血浆至少2g(例如每升血、血清或血浆至少3g)。

随后可纯化从非人哺乳动物(例如绵羊或马)获得的抗体，从而提供本文所述的“纯化组分”。在一个实施方案中，可通过沉淀、色谱、过滤、或其组合纯化抗体。选择的纯化方法可为使IgG能够保留在溶液中、共分离抑制剂(例如α1-抗胰蛋白酶)，共分离白蛋白、或其组合的方法。

沉淀可为硫酸钠沉淀，或辛酸沉淀。合适地，沉淀是硫酸钠沉淀。有利地，硫酸钠沉淀可共分离α1-抗胰蛋白酶。

本发明的完整多克隆抗体适合用缓冲液配制。缓冲液可包括生理盐，例如柠檬酸钠和/或柠檬酸。生理盐在缓冲液中的浓度可为100-200mM或125-175mM。适当地，生理盐在缓冲液中的浓度可为约150mM(优选为153mM)。

配制本发明的抗体组合物用于口服给药。已发现本发明的口服给予抗体组合物具有以下一个或多个意想不到的优点：

·与静脉给药，特别是皮下或肌内给药的抗体制剂相比，有效浓度的抗体在口服给药时更快地到达胃肠道的所需区域；

·大部分多克隆抗体到达其靶标，因此，可显著更低浓度(例如小于10％)给药，例如，与全身给药相比，其中大多数抗体保留在体内血液和细胞外液空间中，

·口服多克隆抗体被认为局限于胃肠道的腔和壁，没有进入体循环。这有三个主要优点：i.口服给药不会引起全身免疫反应，因此可以无限期地继续给予本发明的组合物而不引起体液免疫反应；ii.出于同样的原因，没有急性或迟发性超敏反应的风险；和iii.本发明的多克隆抗体不会中和全身定位的TNFα，从而避免感染如结核病和其他并发症(包括恶性肿瘤)的风险；

口服产品受监管审查的程度要低得多。实际上，例如，作为营养补充饮料的马、绵羊或牛血浆在口服给药时提供了关于其安全性的进一步证明。此外，一些基于口服抗体的产品被视为食物；

口服给药抗体比系统给予的抗体需要更少的纯化和安全性测试；

制备不需要使用洁净室设施；

·由于以下原因，治疗费用显著降低：本发明的多克隆抗体的制备成本相对较低；口服给药时所需抗体浓度较低；避免因日间病例入院；并且不需要全身(例如静脉注射(IV))给药所需的护士/保健专业人员的时间；和/或

·口服制剂提供改善的患者便利性，可在受试者自己的家中和在他/她方便的时间给药。此外，大多数受试者，尤其是儿科组，发现口感舒适的口服产品比全身给药更容易接受。

适于口服给药的组合物可为溶液、悬浮液或干粉(其在使用前溶解或悬浮于合适载体中)形式。

在制备药物制剂时，可将抗体溶解于载体中，并且例如通过使用无菌技术通过无菌过滤器过滤来灭菌，然后填充到合适的无菌小瓶或安瓿中并密封。有利地，缓冲剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂或杀菌剂或悬浮剂和/或局部麻醉剂等添加剂可溶解于载体中。

干粉(其在使用前溶解或悬浮于合适载体中)可通过在无菌区域中使用无菌技术将预先灭菌的成分填充到无菌容器中来制备。或者，可在无菌区域中使用无菌技术将成分溶解于合适容器中。将容器无菌密封。

在一个特别优选的实施方案中，将口服给药组合物配制成液体。

口服给药的问题是确保足够浓度的功能性抗体通过胃肠道转运至其靶标(例如小肠或结肠)。可能抑制最佳量功能性抗体到达肠道的因素包括存在于消化分泌物中的蛋白水解酶，其降解抗体分子。因此，本发明的抗体组合物包含在胃肠转运过程中保护抗体的手段。此手段抵抗和/或减少转运过程中抗体组合物遇到的不良效应。不良效应可能是由于例如胃肠酶(例如胃酶如胃蛋白酶)和化学环境(例如胃酸)。

如本文所用，术语“在胃肠转运过程中保护抗体的手段”并不意图包括抗体多肽本身的保护性/稳定性氨基酸修饰(例如点突变、取代、添加、或缺失)或抗体的保护性/稳定性翻译后修饰(例如糖基化)。然而，作为例外，在一个实施方案中，该手段可包括与本发明的抗体共价连接的PEG化部分，而在另一个实施方案中，也不包括PEG化和PEG化部分。事实上，通过氨基酸修饰和翻译后修饰来保护/稳定抗体的方法是不利的，因为其使制备过程复杂化并增加生产成本。为避免疑义，除了如本文所述在胃肠转运过程中存在保护抗体的手段之外，上述内容不排除抗体多肽的保护性/稳定性氨基酸修饰或抗体的保护性/稳定性翻译后修饰的存在。

优选地，用于保护抗体的手段不包含凝集素。更优选地，用于保护抗体的手段不与本发明的抗体复合。

以下是对该手段的各种实施方案的非限制性描述。该实施方案的每一个可单独使用或彼此组合使用。本领域技术人员已知的其他手段也包括在本发明中，并且也可单独使用或与任何以下实施方案组合使用。

在特别优选的实施方案中，用于保护本文所述抗体的手段包含至少一种蛋白酶抑制剂。有利地，本发明人已经发现，包含结合人肿瘤坏死因子α(TNFα)和蛋白酶抑制剂的血源性多克隆抗体的组合物在治疗炎性病症时具有意料不到的协同效应(即，超过了观察到的单独使用抗体和蛋白酶抑制剂治疗受试者的预期加和效应)。

不希望受理论束缚，据信在患有炎性病症的受试者中胃肠道的上皮表面失去其正常的保护性粘液层。本发明人已经发现，这种损失导致该上皮表面被蛋白水解酶攻击，导致稳态破坏和/或持续/恶化的病理。令人惊讶的是，本发明的抗体组合物既可保护胃肠道免受该蛋白水解酶的影响，也可通过TNFα结合减少炎症和治疗其他症状。

虽然(如下所述)任何蛋白酶抑制剂可用于本发明，但在一个实施方案中，蛋白酶抑制剂是大豆来源的蛋白酶抑制剂。

选自Bowman-Birk蛋白抑制剂家族的蛋白酶抑制剂是特别优选的。Bowman-Birk抑制剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂，其通过暴露的表面环与蛋白酶相互作用并抑制蛋白酶，该表面环通常是二硫键连接的短β-折叠区域。合适的Bowman-Birk抑制剂可从多种来源获得，包括豆类(例如大豆、利马豆、绿豆、蚕豆、小豆)、小麦(例如Triticum aestivum)、大麦(例如Hordeum vulgare)、大米(例如Oryza sativa)，坚果(例如花生)、薏苡根、小米、大结豆、Lonchocarpus carpassa，窄叶野豌豆和苜蓿。合适地，Bowman-Birk抑制剂可从一种或多种该类来源的种子中获得。

在一个实施方案中，用于在胃肠转运过程中保护组合物抗体的手段包括特异性结合并抑制或灭活胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白水解活性的多肽。这些手段可为胰蛋白酶-1和/或胰蛋白酶-2的抑制剂。或者或另外，该手段可为胰凝乳蛋白酶B的抑制剂。

在一个实施方案中，抑制剂是大分子抑制剂(例如分子量为至少5kDa的大分子抑制剂)，例如多肽类抑制剂。举例来说，该抑制剂可含有多肽环，当其被胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶切割时，使得抑制剂与蛋白酶非常强烈地结合，从而抑制胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的进一步作用。

在一个实施方案中，用于在胃肠转运过程中保护抗体的手段包括可从蛋(例如禽(鸡)蛋)获得的手段。更具体地，用于在胃肠转运过程中保护抗体的手段可为蛋清。适当地，蛋清可为粉末蛋清。因此，在一个实施方案中，本发明包括将完整多克隆抗体与蛋(合适为蛋清，优选粉末蛋清)混合。

可从蛋(例如蛋清)获得的手段可为胰蛋白酶抑制剂、胰凝乳蛋白酶抑制剂或其组合。因此，该手段可包括蛋来源的(例如蛋清来源的)胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶抑制剂。

在一个实施方案中，存在于蛋(例如蛋清)中的手段为卵类粘蛋白、卵巢抑制素、卵细胞球蛋白、或其组合中的一种或多种。卵类粘蛋白(Mw28500±3500)是禽蛋清的糖蛋白蛋白酶抑制剂。当针对牛胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶进行测试时，该抑制剂具有活性。卵巢抑制素和卵细胞球蛋白是在原始禽蛋清中发现的蛋白酶抑制剂。

可从蛋中获得的手段可任何合适的浓度使用。当手段是干蛋(例如粉末蛋清)时，干蛋在组合物中的浓度可为至少25g/L或至少35g/L。在一个实施方案中，干蛋在组合物中的浓度可为至少45g/L或至少55g/L。在一些实施方案中，干蛋在组合物中的浓度可为40-80g/L(合适为50-70g/L)。

在一个实施方案中，用于在胃肠转运过程中保护抗体的手段包括α-1-抗胰蛋白酶。

在另一个实施方案中，该手段是大豆胰蛋白酶抑制剂。

在一个实施方案中，为方便起见，可以初乳(例如牛初乳)的形式提供抑制剂混合物。或者(或另外)，可使用其活性组分。初乳易于与抗体组合以提供用于口服给药的合适制剂。

在一个实施方案中，胰蛋白酶抑制剂是在外分泌胰腺中天然合成的小蛋白(例如Mw为5-25kDa)，其可防止胰蛋白酶原转化为胰蛋白酶，从而保护自身免受胰蛋白酶消化。胰腺胰蛋白酶抑制剂竞争性地结合胰蛋白酶的活性位点并以非常低的浓度使其失活。适用于本发明的胰蛋白酶抑制剂的实例包括天然产生的和重组产生的分子，例如：

天然胰蛋白酶抑制剂由腺泡细胞产生，并提供防止意外胰蛋白酶原激活和随之而来的无限制蛋白水解的安全性。举例来说，细胞内碱性胰蛋白酶抑制剂(BPTI)在1936年由Kunitz和Northrop首先结晶出来。碱性胰蛋白酶抑制剂(BPTI)在pH值为3-10之间与牛胰蛋白酶以及人胰蛋白酶形成非常稳定的1:1复合物。胰凝乳蛋白酶也被BPTI抑制。首先由Kunitz(1945)结晶的大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)是大豆中发现的几种胰蛋白酶抑制剂之一。最著名的制剂是Kunitz的制剂(Mw为21500±800；等电点为4.5)。Kunitz大豆抑制剂由通过两个二硫键交联的单一多肽链组成，并抑制胰蛋白酶(在相同摩尔的情况下)和在较小程度上抑制胰凝乳蛋白酶。利马豆胰蛋白酶抑制剂(LBI)通过形成等摩尔复合物而作用于胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶。胰蛋白酶易感结合位点是Lys-Ser肽键，而胰凝乳蛋白酶作用位点是Leu-Ser键(Krahn和Stevens 1970)。利马豆胰蛋白酶抑制剂(Mw为8000-10000)可色谱分离成多达六种变体。其都具有相似但不相同的氨基酸组成，含有6个或7个二硫键，并缺少蛋氨酸和色氨酸。

作为进一步的实例，Bowman Birk蛋白酶抑制剂是由大豆和一系列豆科植物产生的一组胰凝乳蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂。其是7-10kda的富含二硫化物的小蛋白，对人体无毒，且耐受性良好。对于极端pH值极其稳定的胰凝乳蛋白酶抑制剂存在于龟蛋清中。此类小肽抑制剂(约13kDa)与胰凝乳蛋白酶形成稳定的复合物(Guha等(1984)J.Bioscience 6：155-163)。

在一个实施方案中，胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶抑制剂组分可为结合(例如特异性结合)胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶并灭活胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的酶活性的抗体(包括其片段)。此类抗体抑制剂可作为上述非抗体抑制剂的替代或补充。因此，可使用抗体抑制剂和非抗体抑制剂的抑制剂组合。举例来说，非抗体抑制剂(例如蛋清来源的抑制剂)可与抗体抑制剂组合使用，其中抗体抑制胰凝乳蛋白酶(和/或胰蛋白酶)。类似地，非抗体胰凝乳蛋白酶抑制剂可与抗体抑制剂组合使用，其中抗体抑制胰蛋白酶(和/或胰凝乳蛋白酶)。此类抗体可常规制备。

在一个实施方案中，胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶抑制剂在组合物中的浓度可为至少25g/L或至少35g/L。在一个实施方案中，胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶抑制剂在组合物中的浓度可为至少45g/L或至少55g/L。在一些实施方案中，胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶抑制剂在组合物中的浓度可为40-80g/L(合适为50-70g/L)。

或者或另外(优选另外)，用于在胃肠转运过程中保护抗体的手段包括抗酸剂。在使用中，该抗酸剂组分有助于保护抗体组分免受受试者体内存在的高酸性胃环境的影响。

抗酸剂是任何物质，通常是碱或碱性盐，其抵抗胃酸。换句话说，抗酸剂是胃酸中和剂，其在有限的时间内提高胃pH，理想地高于pH5.0。抗酸剂进行中和反应，即其缓冲胃酸，升高pH以降低胃中的酸度。

用于本发明的合适抗酸剂的实例包括：氢氧化铝(例如，Amphojel,AlternaGEL)；氢氧化镁(例如，Phillips’Milk of Magnesia)；氢氧化铝与氢氧化镁(例如，Maalox,Mylanta,Diovol)；碳酸铝凝胶(例如，Basaljel)；碳酸钙(例如，Alcalak,TUMS,Quick-Eze,Rennie,Titralac,Rolaids)；碳酸氢钠(例如，小苏打、黄金养胃泡腾片)；碳酸镁；三硅酸镁；水滑石(例如，Mg6Al2(CO3)(OH)16·4(H2O)；铝碳酸镁)；碱式水杨酸铋(例如，Pepto-Bismol)；藻酸盐(例如，海藻酸钠、海藻酸)；水化铝酸镁与二甲基硅油(例如，Pepsil)；任何上述物质与二甲基硅油组合，例如Asilone，其具有三种活性成分，氢氧化铝和氧化镁中和酸，除去疼痛原因，和二甲基硅油。

在一个实施方案中，抗酸剂是氢氧化镁和/或氢氧化铝。氢氧化铝可以干燥氢氧化铝凝胶形式加入组合物中。优选地，本发明组合物包含氢氧化镁和氢氧化铝。

抗酸剂可以任何合适的浓度使用。在一个实施方案中，抗酸剂的浓度可为至少5g/L或至少10g/L(例如，每种使用的抗酸剂)。在另一个实施方案中，抗酸剂的浓度可为至少15g/L或至少20g/L(例如，每种使用的抗酸剂)。在一些实施方案中，可使用5-40g/L(合适为10-30g/L)的抗酸剂(例如，每种使用的抗酸剂)。

在一个优选的实施方案中，本发明的组合物包含5-40g/L(合适为10-30g/L)的氯化镁和/或5-40g/L(合适为10-30g/L)的氢氧化铝。

在一个实施方案中，抗体组合物包含抗酸剂分子和：特异性结合并抑制或灭活胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白水解活性的多肽；和/或结合胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶并灭活该胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白酶活性的抗体。

本发明的组合物可包含一种或多种抗微生物剂。在一个实施方案中，抗微生物剂是对羟基苯甲酸甲酯(E218)和/或对羟基苯甲酸丙酯(E216)。合适地，本发明的组合物包含对羟基苯甲酸甲酯(E218)和对羟基苯甲酸丙酯(E216)的组合。

抗微生物剂(例如，每种抗微生物剂)在组合物中的浓度可为至少0.2g/L或至少0.4g/L。在一个实施方案中，抗微生物剂在组合物中的浓度可为至少0.6g/L或至少1.0g/L。合适地，抗微生物剂的浓度可为至少1.5g/L或至少2.0g/L。在一些实施方案中，抗微生物剂的浓度为0.2-1.0g/L。在其他实施方案中，抗微生物剂的浓度为1.0-3.0g/L(例如，1.5-2.5g/L)。

本发明的组合物可包含悬浮稳定剂，例如甘氨酸。悬浮稳定剂(例如，200mM甘氨酸)的浓度可为至少5g/L，或至少10g/L。在其他实施方案中，悬浮稳定剂(例如200mM甘氨酸)的浓度为10-20g/L。

或者或另外，本发明的组合物可包含消泡剂，例如二甲基硅油。该消泡剂的浓度可为至少5g/L，或至少10g/L。在一个实施方案中，消泡剂的浓度为5-25g/L(合适为10-20g/L)。

除上述之外，本发明的组合物可包含甜味剂和/或调味剂，例如香草精、糖(例如葡萄糖、蔗糖等)、糖醇、蜂蜜、水果、糖浆(例如枫糖浆、大米糖浆、桦树糖浆、松子糖浆、山核桃糖浆、杨树糖浆、棕榈糖浆、甜菜糖浆、高粱糖浆、玉米糖浆、甘蔗糖浆、金色糖浆、大麦麦芽糖浆、糖蜜(糖浆)、糙米糖浆、龙舌兰糖浆、雪莲果糖浆)、乙酰磺胺酸钾(也称为Sunett)、阿力甜(也称为aclame)、阿斯巴甜(也称为Equal或Nutrasweet)、茴脑、甜蜜素、甘草甜素、罗汉果、纽甜、紫苏糖、糖精(也称为低脂糖)、甜菊糖、三氯蔗糖(也称为SucraPlus和Splenda)、或菊粉。在一个实施方案中，甜味剂包括糖精钠和甘露醇。在一个实施方案中，调味剂包括薄荷油。

甜味剂和/或调味剂在本发明组合物中的浓度可为0.1-40g/L，例如0.1-30g/L。

本发明组合物可包含悬浮剂，例如黄原胶。该悬浮剂的浓度可为至少1g/L或2g/L。合适地，该悬浮剂的浓度可为1-10g/L，例如3-5g/L。

在一个实施方案中，本发明的组合物可根据下表配制：

任选地，组合物可进一步包含：

在一个优选的实施方案中，本发明的组合物可按照下表配制：

在优选的实施方案中，本发明的组合物可任选地进一步包含：

另外(或者)，就上述制剂组分而言，组合物还可包括用于保护抗体免受胃的酸性环境影响的物理和/或化学手段，使得活性抗体最终被给药至肠道作用位点(例如结肠)。

举例来说，抗体可被包封(例如，丸粒、颗粒基质、微珠、微球、纳米颗粒、或脂质体)和/或可被化学保护(例如通过PEG化)。

适用于本发明的常规封装技术包括：

回肠末端和结肠(升结肠除外)的pH高于胃肠(GI)道的任何其他区域。因此，优选在高pH水平下崩解的剂型对于该区域的位点特异性给药是最佳的。设计pH依赖性多颗粒结肠特异性给药系统的最简单方法之一是肠溶包衣颗粒。传统上，肠溶包衣用于预防上胃肠道中的药物释放。肠溶包衣聚合物可作为粘合剂和颗粒的包衣材料。将柠檬酸引入包衣和/或片剂基质中有助于延迟体外释放和体内吸收，因为由于酸的存在，芯系统的崩解时间延长。用于口服给药的最常用的pH依赖性涂层聚合物是甲基丙烯酸共聚物，Eudragit L100和Eudragit S100，其分别在pH 6.0和7.0下溶解。此两种聚合物以各种比例的组合使得可在6.0-7.0的pH范围内控制药物释放。包含此类聚合物的胶囊可进一步用聚甲基丙烯酸酯溶液包衣。

类似地，可加入赋形剂，例如作为包衣材料的醋酸羟丙基甲基纤维素琥珀酸酯水溶液，和作为pH调节剂的柠檬酸。硬脂酸棕榈酸甘油酯可作为缓释材料以配制控释基质。

包衣制剂(例如Eudragit S100)可进一步用一层壳聚糖盐酸盐覆盖。在水合时，胶囊壳溶解，并且壳聚糖层形成凝胶(内pH为4.5)，其在Eudragit膜周围产生酸性环境，使其在升结肠中不溶解。在升结肠中，壳聚糖盐酸盐凝胶被结肠微菌群降解，从而将Eudragit膜暴露于结肠环境。但由于升结肠呈弱酸性，pH值小于7.0，因此薄膜包衣仍保持完整。然而，当到达pH大于7的降结肠时，Eudragit薄膜包衣溶解，并且药物以受控方式从基质中释放。可基于例如内包衣(Eudragit RL/RS的组合)和外包衣(Eudragit FS 30D)使用多层包衣。Eudragit FS 30D是丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯和甲基丙烯酸的离子共聚物，对pH敏感，且在pH值高于6.5时溶解。

也可使用微生物控制给药系统，其依赖于结肠微生物菌群的独特酶促能力。这种类型的给药系统能够更特异性靶向，而与沿胃肠道的pH变化无关。可使用许多天然多糖，例如硫酸软骨素、果胶、葡聚糖、瓜尔胶等。包含水凝胶珠(壳聚糖和三聚磷酸盐(TPP))的多颗粒系统是一种选择--TPP充当带正电荷的壳聚糖的抗衡离子以形成凝胶珠。凝胶珠含有牛血清白蛋白(BSA)，其是一种易于在胃肠道上部降解的蛋白，并且壳聚糖与TPP的交联导致壳聚糖的溶解度降低，从而导致蛋白(抗体)较少在上部胃肠转运过程中释放。直链淀粉是特别好的成膜聚合物(通过凝胶化)，也可与Eudragit RS/RL 30D水分散体混合。类似地，可使用酰胺化低甲氧基果胶，其与二价阳离子(例如钙或锌)形成刚性凝胶，以产生用于结肠给药的果胶酸钙凝胶珠。果胶可与钙盐结合-果胶酸钙(果胶的不溶性盐)不会被胃酶或肠酶降解，但能够被结肠果胶分解酶降解。作为交联可溶性多糖以形成不溶性盐的替代方案，多糖类系统可用pH敏感性聚合物包衣。举例来说，可制备壳聚糖微孔，并分别用丙烯酸聚合物包被，例如Eudragit L100和Eudragit S100。Eudragit P-4135 F表示合适的pH敏感聚合物的另一个实例，其可用于制备用于结肠给药的微粒。

可使用多颗粒系统，其在结肠环境中将pH敏感给药和生物降解结合起来。举例来说，可使用喷雾干燥等技术，然后通过油包油溶剂蒸发等技术应用微囊化在Eudragit聚合物中的壳聚糖微芯来制备壳聚糖微芯的内部包埋基质。在外部Eudragit包衣在适当的pH下溶解后，暴露的壳聚糖微芯膨胀并在碱性pH下形成凝胶屏障，并且在结肠区域中，壳多糖经历降解从而增强释放。类似的结肠给药多颗粒系统可基于用Eudragit L100或S100包衣的壳聚糖微球。合适的制备技术包括乳液溶剂蒸发。壳多糖可与戊二醛交联。

聚丙烯酸酯表示用于本发明的合适给药载体的另一个实例。举例来说，可使用与双官能偶氮化合物交联的苯乙烯和甲基丙烯酸羟乙酯的三元共聚物。该系统依赖于结肠微生物群对偶氮键的裂解，导致聚合物降解。类似地，pH响应性聚(甲基丙烯酸-g-乙二醇)水凝胶可用作口服给药载体。一旦进入小肠的碱性和中性环境，凝胶迅速膨胀并解离。

在另一个实施方案中，微胶囊制剂可用于经口结肠特异性给药。更详细地，可使用丙烯酸乙酯/甲基丙烯酸甲酯/甲基丙烯酸2-羟乙酯(聚(EA/MME/HEMA)的水胶体三元共聚物，例如通过乳液聚合技术合成的。此类聚合物具有延迟释放特性，其特征在于延迟时间长和包埋部分的随后快速释放。

在另一个实施方案中，口服给药的纳米颗粒可作为合适的给药载体。举例来说，可将负载的纳米颗粒包埋到pH敏感微球中，其用于将引入的纳米颗粒给药到期望的结肠作用位点。纳米颗粒具有大的比表面，表明与生物表面的高交互势。因此，可通过将纳米颗粒与不同分子结合来诱导生物粘附。举例来说，纳米颗粒可由小麦谷蛋白的麦醇溶蛋白蛋白分离物制备，然后与凝集素(提供特异性生物粘附的非免疫源糖蛋白)缀合。因此，提供纳米颗粒，其具有与肠的非特异性相互作用的高容量，且凝集素的结合为结肠粘膜提供了更高的特异性。

在一个实施方案中，可使用基于白蛋白-壳聚糖混合基质微球填充的包衣胶囊制剂的给药载体。在这方面，将本发明的抗体制剂填充到硬明胶胶囊中并肠溶包衣。

在一个实施方案中，白蛋白微球可作为口服给药系统。

在一个实施方案中，可使用含角鲨烷油的多重乳液。

在一个实施方案中，聚(丙交酯-共-乙交酯)微球可作为口服给药载体。

在一个实施方案中，可使用在单层基质膜中包含pH响应性肠溶聚合物(EudragitS)和可生物降解多糖(抗性淀粉)的混合物的结肠给药包衣。此类给药载体的实例可商购获得，例如来自Encap Drug Delivery(Livingston，UK)-特定实施方案包括PHLORALTM和ENCODETM。

另外(或者)，就上述给药载体实施方案而言，可通过用聚乙二醇(PEG)PEG化来保护本发明的抗体免受酸侵蚀。各种分子量(500-40000Da)的PEG可例如以每抗体分子2-20个PEG分子的比例与IgG偶联。参见Greenwald,R.B et al(2003)“Effective drug deliveryby PEGylated drug conjugates”,Advanced Drug Delivery Reviews 55,pp.217-250。该出版物通过引用整体并入本文。

在一个实施方案中，可用聚(乙二醇)(PEG)化学修饰给药胶囊，例如脂质体、微胶囊或纳米胶囊(例如壳聚糖纳米胶囊)。典型的PEG化程度为0.1-5％，例如0.5-2％，例如0.5％或1％。PEG的存在，无论是单独的还是接枝到壳聚糖上，都改善了给药胶囊在胃肠液中的稳定性。

在一个实施方案中，本发明的抗体可用由氰尿酰氯、琥珀酰亚胺琥珀酸酯和甲苯磺酰氯活化的单甲氧基聚乙烯二醇处理。

PEG化给药载体如脂质体、微胶囊或纳米胶囊具有在疾病部位积累并促进靶细胞转染的内在能力。与许多病毒载体不同，PEG化脂质体通常被认为是非免疫原性的。

在一个实施方案中，使用支链PEG化试剂作为支链PEG保护基团比直链PEG分子更有效。

在一个方面，本发明提供用于治疗炎性病症的本发明的抗体组合物，其中该抗体组合物口服给予受试者。还提供抗体组合物在制备用于治疗炎性病症的药物中的相关用途，以及治疗炎性病症的方法，包括口服给予受试者本发明的抗体组合物。

如本文所用，术语“病症”还包括“疾病”。在一个实施方案中，病症为疾病。

如本文所用，术语“受试者”是指哺乳动物，例如人或其他动物。优选地，“受试者”是指人受试者。

在胃肠转运过程中保护抗体的手段可与本发明的抗体顺序(例如作为单独组分)或同时口服给予。当顺序给予时，优选在本发明的抗体之前给予保护手段。在优选的实施方案中，保护手段与本发明的抗体同时给予。

本发明的抗体组合物可用于治疗选自以下的炎性病症：败血症性休克、胃肠病症(例如肠病症)、炎性肠病、移植物抗宿主病症、和/或由以下引起/加剧的炎性病症：肠道感染、非甾体抗炎药、精神压力、酒精、肠手术、局部缺血和再灌注、食物过敏、或其组合。

在优选的实施方案中，炎性病症是选自溃疡性结肠炎、克罗恩病或其组合的炎性肠病。

在特别优选的实施方案中，炎性病症是溃疡性结肠炎，且抗体是绵羊或马多克隆抗体(更优选绵羊多克隆抗体)。

炎性肠病通常与诸如频繁腹泻的症状相关。由于治疗剂在肠中的保留减少，因此需要高浓度的抗体来治疗炎性肠病。因此，单克隆抗体疗法是不可行的(例如由于与单克隆抗体的产生相关的高成本)。有利地，本发明的多克隆抗体组合物提供了治疗炎性肠病的问题的解决方案。该多克隆抗体组合物制备相对便宜，因此提供了可行的治疗剂。

需要合适的治疗剂以具有对人TNFα的高特异性。有利地，与非血源性(和/或例如非绵羊或非马)抗体和/或单克隆抗体相比，血源性多克隆抗体(例如绵羊或马)(由于制备方法)表现出对人TNFα的高特异性。此外，根据定义，包含单克隆抗体的组合物仅结合单个表位，而包含多克隆抗体的组合物将与几个结合，从而增加中和人TNFα的功效。

如本文所用，术语“治疗”或“治疗”包括预防性治疗(例如预防疾病的发作)以及矫正治疗(已经患有疾病的受试者的治疗)。如本文所用，“治疗”或“治疗”优选是指矫正治疗。

如本文所用，术语“治疗”或“治疗”是指病症和/或其症状。

因此，本发明的组合物可以治疗有效量或预防有效量给予受试者。

“治疗有效量”是指当单独或组合给予受试者以治疗炎性病症(或其症状)时，足以对该病症或其症状实现治疗的抗体的任何量。

“预防有效量”是指当单独或组合给予受试者时，抑制或延迟炎性病症(或其症状)的发作或复发的抗体的任何量。在一些实施方案中，预防有效量完全防止炎性病症的发作或复发。“抑制”发作是指减少炎性病症发作(或其症状)的可能性，或完全预防发作。

合适的剂量范围是产生所需治疗效果的剂量范围(例如，其中抗体/组合物以治疗或预防有效量给药)。典型的剂量方案可包括每周一次、两次、三次、四次、五次、六次或七次给予本发明的组合物。在一个实施方案中，剂量方案包括每天给予本发明的组合物，例如每天给予一次或两次。

在一个实施方案中，在治疗的前四周，将本发明的组合物每天两次给予受试者。在一些实施方案中，后续治疗是通过每日一次给予组合物。

合适的剂量可为2g或更少(例如1g或更少)的多克隆抗体。在一个实施方案中，剂量为0.5g或更少，或0.25g或更少的多克隆抗体。

在一个实施方案中，完整多克隆抗体以每天2g或更少的剂量给予。在另一个实施方案中，剂量为每天1g或更少，例如每天0.5g或0.25g或更少。

合适地，上述剂量是指包含在本发明组合物中的完整多克隆抗体的总量，合适为总完整多克隆IgG(即包括结合TNFα的抗体和不结合TNFα的抗体)。完整多克隆抗体可直接从血液样品(例如抗血清)或其纯化的部分获得。优选地，从血液样品(例如绵羊血液样品)(例如抗血清)中纯化完整多克隆抗体。例如，样品可能已经过沉淀(例如硫酸钠沉淀)和过滤。合适地，组合物中包含的总完整多克隆抗体的至少5％(例如至少10％)结合TNFα。更优选为组合物中包含的总完整多克隆抗体的至少15％或至少20％(例如至少25％或至少30％)结合TNFα。

令人惊讶的是，在如此低剂量的完整血源性多克隆抗体中观察到治疗/预防效果，表明与非血来源(如牛奶)相比，产生了高浓度特异性抗体(即结合TNFα的抗体)。此外令人惊讶的是，在如此低剂量的总完整绵羊或马(优选绵羊)多克隆抗体中观察到治疗/预防效果，表明使用绵羊或马(优选绵羊)宿主产生了高浓度特异性抗体(即结合TNFα的抗体)。

在一个实施方案中，典型的日剂量为每kg体重5-20mg(例如8-15mg或约10mg)的完整多克隆抗体。单位剂量可从小于100mg变化，但通常在每剂250-500mg的范围内。该剂量可每天给予(例如每天1x，2x，3x或4x)。

在一些实施方案中，本发明的抗体组合物可与一种或多种其他治疗剂组合给予受试者。该一种或多种其他治疗剂可与本发明的抗体组合物顺序或同时给予。

在一个实施方案中，抗体组合物与治疗炎性病症(例如本文提及的炎性病症)的治疗剂组合给予。合适地，抗体组合物可与治疗炎症性肠道病症(例如炎症性肠病)的治疗剂组合施用。

在一个实施方案中，治疗剂可为氨基水杨酸盐(5-ASA)、皮质类固醇、免疫调节剂、抗生素或生物治疗剂(例如治疗性抗体)。

合适的治疗剂的实例可包括：泼尼松、泼尼松龙磷酸钠、布地奈德、美沙拉嗪、柳氮磺胺吡啶、促肾上腺皮质激素、硫唑嘌呤、英夫利昔单抗、氢化可的松、甲基强的松龙、甲基强的松龙琥珀酸钠、巯嘌呤、地塞米松、地塞米松磷酸钠、醋酸倍他米松、倍他米松磷酸钠、环孢菌素、色甘酸钠、麦考酚酸酯、氢化可的松琥珀酸钠、醋酸氢化可的松、曲安奈德、可的松、甲基强的松龙乙酸酯、或其组合、或其药学上可接受的盐。

在一个实施方案中，抗体组合物可与一种或多种益生菌一起给与。如本文所用，术语“益生菌”是指任何活的微生物(例如，包括细菌或酵母)，当例如以足够量摄入或局部施用时，其有益地影响宿主生物体，即通过向宿主生物体提供一种或多种可证明的健康益处。益生菌可改善一个或多个粘膜表面的微生物平衡。例如，粘膜表面可为胃肠道(例如肠)。

本发明还提供包含本发明抗体组合物的试剂盒，以及使用该试剂盒的说明书。说明书可用于在医学中使用抗体组合物，适合于抗体组合物在治疗炎性病症中的用途。在一个实施方案中，说明书描述了向受试者口服给予抗体组合物。或者或另外，说明书可能描述适当的剂量方案，例如本文所述的任何剂量方案。

在一个实施方案中，试剂盒包含含有本发明抗体的第一容器、包含在胃肠道转运过程中保护该抗体的手段的第二容器、和说明书。优选地，说明书描述了用于配制抗体的方法和获得本发明组合物的手段。

在一个实施方案中，试剂盒包含一种或多种本文所述的其他治疗剂。

另一方面，本发明涉及包含本发明抗体组合物的食品。食品可为任何食品，其中抗体组合物中包含的抗体保持功能，或者其中大部分抗体保留结合并中和人TNFα的能力。如本文使用，术语“大部分”是指起始抗体的至少90％，例如至少95％或98％保留结合并中和人TNFα的能力。

食品可为乳制品。在一个实施方案中，乳制品选自酸奶、干酪或牛奶。

食品可包含益生菌，和任选的一种或多种益生元。如本文所用，术语“益生元”是指通过选择性刺激一种或多种有益细菌的生长和/或活性而有益地影响宿主的非消化性食物成分。

序列比较

对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，可将测试序列与其进行比较。当使用序列比较算法时，将测试和参考序列输入计算机，如果需要，指定后续坐标，并指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法基于指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。

用于比较的序列的最佳比对可例如通过以下进行：Smith和Waterman的局部同源性比对算法[Adv.Appl.Math.2:484(1981)],Needleman和Wunsch的算法[J.Mol.Biol.48:443(1970)]，Pearson和Lipman的搜索相似性方法[Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA 85:2444(1988)],通过计算机实现此类算法(GAP,BESTFIT,FASTA,and TFASTA-Sequence AnalysisSoftware Package of the Genetics Computer Group,University of WisconsinBiotechnology Center,1710 University Avenue,Madison,Wis.53705),或通过目视检查[see Current Protocols in Molecular Biology,F.M.Ausbel et al,eds,CurrentProtocols,a joint venture between Greene Publishing Associates,In.And JohnWiley&Sons,Inc.(1995Supplement)Ausbubel]。

适用于确定百分比序列相似性的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法[参见Altschul(1990)J.Mol.Biol.215:pp.403-410；and“http://www.ncbi.nlm.nih.gov/”ofthe National Center for Biotechnology Information]。

在一个同源性比较中，同一性在序列的区域上存在，其长度为至少10或20或30或40或50个氨基酸残基。在另一个同源性比较中，同一性在序列的区域上存在，其长度为至少60或70或80或90或100个氨基酸残基。

可使用多种序列比对方法中的任何一种来确定百分比同一性，包括但不限于全局方法、局部方法和混合方法，例如分段法。确定百分比同一性的方案是本领域技术人员范围内的常规方法。全局方法从分子的开端到末端比对序列，并通过将各个残基对的评分相加并通过实施空位罚分来确定最佳比对。非限制性方法包括例如CLUSTAL W,参见例如,JulieD.Thompson等人,CLUSTAL W:Improving the Sensitivity of Progressive MultipleSequence Alignment Through Sequence Weighting,Position-Specif；和迭代细化，参见例如Osamu Gotoh,Significant Improvement in Accuracy of MultipleProtein.Sequence Alignments by Iterative Refinement as Assessed by Referenceto Structural Alignments,264(4)J.MoI.Biol.823-838(1996)。局部方法通过鉴定所有输入序列共有的一个或多个保守基序来比对序列。非限制性方法包括例如Match-box,参见例如，Eric Depiereux and Ernest Feytmans,Match-Box:A Fundamentally NewAlgorithm for the Simultaneous Alignment of Several Protein Sequences,8(5)CABIOS 501-509(1992)；吉布斯采样，参见例如C.E.Lawrence等人,Detecting SubtleSequence Signals:A Gibbs Sampling Strategy for Multiple Alignment,262(5131)Science 208-214(1993)；Align-M，参见例如Ivo Van WaI Ie等人,Align-M-A NewAlgorithm for Multiple Alignment of Highly Divergent Sequences,20(9)Bioinformatics:1428-1435(2004)。

因此，百分比序列同一性通过常规方法确定。参见例如Altschul等人，Bull.Math.Bio.48:603-16,1986 and Henikoff and Henikoff,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:10915-19,1992。简而言之，使用空位开放罚分为10，空位延伸罚分为1，Henikoff和Henikoff的“blosum 62”评分矩阵(同上)来比对两个氨基酸序列以优化比对评分，如下所示(氨基酸用标准单字母代码表示)。

然后将百分比同一性计算为：

相同匹配的总数

__________________________________________x100

[较长序列的长度加上引入较长序列的空位数

以比对两个序列]

基本上同源的多肽的特征在于具有一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。这些变化优选为具有微小性质，即保守氨基酸取代(见下文)和不会显著影响多肽折叠或活性的其他取代；通常为1-约30个氨基酸的小缺失；和较小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端的甲硫氨酸残基，最多约20-25个残基的较小接头肽，或亲和标签。

保守氨基酸取代可包括：碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸、组氨酸)，酸性氨基酸(谷氨酸、天冬氨酸)，极性氨基酸(谷氨酰胺、天冬酰胺)，疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸)，芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸)，小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸)。

除20种标准氨基酸外，非标准氨基酸(如4-羟基脯氨酸、6-N-甲基赖氨酸、2-氨基异丁酸、异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可替代本发明多肽的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、和非天然氨基酸可取代多肽氨基酸残基。本发明的多肽还可包含非天然存在的氨基酸残基。

非天然存在的氨基酸包括但不限于反式-3-甲基脯氨酸、2,4-亚甲基-脯氨酸、顺式-4-羟基脯氨酸、反式-4-羟基-脯氨酸、N-甲基甘氨酸、异-苏氨酸、甲基-苏氨酸、羟基-乙基半胱氨酸、羟乙基-半胱氨酸、硝基-谷氨酰胺、高谷氨酰胺、哌啶酸、叔-亮氨酸、正缬氨酸、2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯基-丙氨酸、4-氮杂苯基-丙氨酸、和4-氟苯丙氨酸。本领域已知几种将非天然存在的氨基酸残基引入蛋白质中的方法。例如，可使用体外系统，其中使用化学氨基酰化的抑制性tRNA抑制无义突变。合成氨基酸和氨酰化tRNA的方法是本领域已知的。含有无义突变的质粒的转录和翻译在包含大肠杆菌S30提取物和市售酶和其他试剂的无细胞系统中进行。蛋白质通过色谱法纯化。参见例如，Robertson et al.,J.Am.Chem.Soc.113:2722,1991；Ellman et al.,Methods Enzymol.202:301,1991；Chunget al.,Science 259:806-9,1993；and Chung et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:10145-9,1993)。在第二种方法中，通过显微注射突变mRNA和化学氨基酰化的抑制性tRNA在非洲爪蟾卵母细胞上进行翻译(Turcatti et al.,J.Biol.Chem.271:19991-8,1996)。在第三种方法中，在无待取代的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)存在下并在期望的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸、3-氮杂苯丙氨酸、4-氮杂苯丙氨酸、或4-氟苯丙氨酸)的存在下培养大肠杆菌细胞。将非天然存在的氨基酸引入多肽中代替其天然对应物。参见Koide等人，Biochem.33:7470-6,1994。天然存在的氨基酸残基可通过体外化学修饰转化为非天然存在的物种。化学修饰可与定点诱变相结合，以进一步扩大取代范围(Wynn andRichards,Protein Sci.2:395-403,1993)。

有限数量的非保守氨基酸、不由遗传密码编码的氨基酸、非天然存在的氨基酸、和非天然氨基酸可取代本发明多肽的氨基酸残基。

可根据本领域已知的方法鉴定本发明多肽中的必需氨基酸，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变(Cunningham和Wells，Science 244：1081-5,1989)。生物相互作用的位点也可通过结构的物理分析来确定，如通过核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记等技术，结合假定接触位点氨基酸的突变进行确定。参见例如de Vos et al.,Science 255:306-12,1992；Smith et al.,J.Mol.Biol.224:899-904,1992；Wlodaver et al.,FEBS Lett.309:59-64,1992。必需氨基酸的同一性也可通过分析与本发明多肽的相关组分(例如易位或蛋白酶组分)的同源性来推断。

可使用已知的诱变和筛选方法制备和测试多个氨基酸取代，例如，Reidhaar-Olson和Sauer(Science 241:53-7,1988)或Bowie和Sauer(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2152-6,1989)所公开的那些。简而言之，这些作者公开了同时随机化多肽中两个或多个位置，选择功能性多肽，然后对诱变的多肽进行测序以确定在每个位置的允许取代谱的方法。可使用的其他方法包括噬菌体展示(例如，Lowman et al.,Biochem.30:10832-7,1991；Ladner et al.,U.S.Patent No.5,223,409；Huse,WIPO Publication WO 92/06204)和区域定向诱变(Derbyshire et al.,Gene 46:145,1986；Ner et al.,DNA 7:127,1988)。

除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。Singleton,等人,DICTIONARY OF MICROBIOLOGYAND MOLECULAR BIOLOGY,20ED.,John Wiley和Sons,New York(1994),和Hale&Marham,THEHARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY,Harper Perennial,NY(1991)为本领域技术人员提供本公开中使用的许多术语的通用字典。

本公开不受本文公开的示例性方法和材料的限制，并且与本文描述的那些类似或等同的任何方法和材料可用于实践或测试本公开的实施方案。数字范围包括定义范围的数字。除非另有说明，否则任何核酸序列以5'-3'方向从左至右书写；氨基酸序列分别以氨基至羧基取向从左至右书写。本文提供的标题不是对本公开的各个方面或实施方案的限制。本文使用氨基酸的名称，三个字母的缩写或单个字母的缩写来指代氨基酸。如本文所用，术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽、和肽。如本文所用，术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些情况下，术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求中，可使用氨基酸残基的常规单字母和三字母代码。符合IUPACIUB生物化学命名联合委员会(JCBN)定义的氨基酸的3字母代码。还应理解，由于遗传密码的简并性，多肽可由多于一个核苷酸序列编码。

术语的其他定义可出现在整个说明书中。应理解，本公开不限于所描述的特定实施方案，并且因此可以变化。还应理解，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制，因为本公开的范围仅由所附权利要求限定。

在提供一系列值的情况下，应理解，除非上下文另有明确规定，否则还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值，即下限单位的十分之一。在所述范围内的任何所述值或中间值之间的每个较小范围，和在该所述范围内的任何其他所述值或中间值都包含在本公开中。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或不包括在该范围内，并且在较小范围内包括上限和下限的一个，两个都不包括或两个都包括的每个范围也包括在本公开中，但受所述范围内任何特别排除的上下限的约束。在所述范围包括上下限的一个或两个的情况下，不包括那些包括的上下限的一个或两个的范围也包括在本公开中。必须注意的是，如本文和所附权利要求中所使用的，单数形式“一”，“一个”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一种抗体”包括多种此候选剂，并且提及“该抗体”包括提及一种或多种抗体及其本领域技术人员已知的等同物，等等。本文讨论的出版物仅仅是为了其在本申请的提交日之前的公开而提供的。本文中的任何内容均不应被解释为承认这些出版物构成所附权利要求的现有技术。

现在将参考以下附图和实施例仅通过举例描述本发明。

附图

现在将参考附图仅通过举例描述本发明的实施方案，其中：

图1示出用辛酸(▲)或硫酸钠(■)纯化的完整抗TNFα对牛胰蛋白酶的抑制。TNFα抗血清(●)用作对照。

图2示出用于检测抗血清(●)中抗TNFαIgG和通过辛酸沉淀(▲)纯化的IgG的直接ELISA的结果。

图3示出使用L929细胞测试抗TNFα片段(■)，完整抗TNFα(▲)和TNFα抗血清(●)的中和活性的免疫细胞毒性测定(ICTA)的结果。起始浓度：抗TNFα片段-50mg/ml；完整抗TNFα-210mg/ml；TNFα抗血清蛋白浓度-86mg/ml。

图4示出ELISA比较由绵羊血完整PcAb(抗人TNFαIgG)和单克隆抗体英夫利昔单抗与鼠TNFα结合的结果。抗人TNFαIgG(●)，英夫利昔单抗(■)，和阴性对照(PCB)(▲)。

实施例

实施例1

人TNFα绵羊抗血清的制备

成熟的人TNFα(hTNFa)(UniProtKB登录号：P01375)获自R&D Systems，Boehringer。氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

用于美利奴羊的初次免疫的免疫原包含弗氏完全佐剂和每只绵羊100μg的hTNFa。将蛋白质:佐剂混合物皮下并均匀注射到6个选择其靠近腋窝、腹股沟和前骶管引流淋巴腺的注射部位。每只绵羊以28天的间隔用100μg的hTNFa和弗氏不完全佐剂再次免疫，并根据严格的州和国家动物福利道德准则，14天后在Turretfield研究中心(澳大利亚南澳大利亚州Rosedale)的加工厂每隔大约4周采集血样。这些动物没有最终流血。每公斤体重总共10mL血可从颈外静脉收集,而不损害动物。

随后将绵羊抗血清在-20℃储存。

实施例2

人TNFα多克隆绵羊抗体(完整抗TNFα)的纯化

使用两种不同的纯化绵羊PcAb的方法，以确定哪种方法将在更大程度上共同分离人胰蛋白酶，α1-抗胰蛋白酶的有效抑制剂。使用辛酸沉淀(其使白蛋白沉淀并将IgG保持在溶液中)或硫酸钠沉淀(其使IgG沉淀)。将纯化的IgG过滤并在-20℃储存，备用于加入所提出的口服给药制剂中或用于进一步表征。

用比色法测定了抗血清和用辛酸或硫酸钠纯化的两个IgG组分中蛋白酶抑制剂的存在对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的抑制。该测定基于Kakade ML等人，Determination oftrypsin inhibitor activity of soy products:a collaborative analysis of animproved procedure.Cereal Chem 51:376-381,1974(其通过引用并入本文)的方法，并测量通过胰蛋白酶将Na-苯甲酰基-DL-精氨酸-对-硝基苯胺溶液(L-BAPNA)(无色)裂解为对硝基苯胺(黄色底物)。

将抑制剂样品的两倍稀释液在含有20mM CaCl2(100μl终体积)的50mM Tris-缓冲液(pH 8.2)中通过96孔板(Grenier UV-Star)稀释。在每个孔中添加100μl胰蛋白酶(0.2mg/ml稀释于1mM HCL)或胰凝乳蛋白酶(1mg/ml于WFI)溶液，然后对于胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶分别添加100μl的L-BAPNA或NSLPN(2mM于DMSO)。通过添加50μl终止溶液(30％v/v的乙酸)，5分钟后中止反应，进行胰蛋白酶测定，且60分钟后中止反应，进行胰凝乳蛋白酶测定，并使用Omega PolarStar在410nm处用分光光度法测量吸光度。通过在底物溶液之前添加终止溶液来制备空白样品。然后将平均吸光度值相对于稀释度作图，得到剂量响应曲线。代表性的曲线示于图1中，其表明硫酸钠纯化保留a1-抗胰蛋白酶抑制剂比辛酸沉淀法好得多。

这两种方法也可用于评估蛋白酶抑制剂在模拟胃液和肠液中培养后在口服制剂中的存活率。

实施例3

用于表征抗体结合的酶联免疫吸附测定

产生的特异性抗体与重组人TNFα(rhTNFa)表面上的多个表位结合，但不与重组啮齿动物TNFα结合。结合的亲合力非常高。

开发了直接ELISA测定法，用于检测来自该抗血清(完整抗TNFa)的绵羊抗血清和IgG的纯化组分(通过辛酸沉淀纯化)中的抗TNFαIgG。Immulon 4HBx微量滴定板用1μg/mLhTNFa包被。用含有0.1％吐温20(PBST)的磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤滴定板3次，并在37℃下用封闭缓冲液(2.5％胎牛血清稀释于PBS)封闭1小时。滴定板用抗血清在37℃下洗涤培养1小时，初始稀释度为1:1000，随后进行1:2系列稀释；用PBST洗涤；并与驴抗羊IgG辣根过氧化物酶缀合物在37℃下培养1小时。进一步洗涤后，加入3,3'，5,5'-四甲基联苯胺(TMB)液体底物溶液，约10分钟后加入1.0M HCL终止反应，然后在450nm读取光密度。

所开发的测定显示非常低的背景，其使用免疫前的绵羊血清进行测试(图2)。

实施例4

用于表征抗体中和作用的免疫细胞毒性测定

使用L929小鼠纤维肉瘤细胞系(可从Sigma-Aldrich商购，The Old Brickyard，New Road，Gillingham，Dorset，SP8 4XT，UK)测试TNFα的细胞毒性作用以及抗体对TNFα的中和能力。因此开发了一种测定法，用于测试抗血清中绵羊PcAb以及来自抗血清(完整抗TNFα)的纯化IgG及其片段(抗TNFα片段)对rhTNFα的细胞毒性作用的中和作用，

通过对实施例1的绵羊抗血清的一部分储备物进行木瓜蛋白酶消化来制备抗TNFα片段。Fab以10g/L的浓度存在，并且约10％的总Fab对TNFα具有特异性。亲和色谱步骤不包括在其制备中。在过量Fab的存在下，约12个Fab分子与每个TNFα三聚体连接。

作为攻击(challenging)量，我们使用从细胞毒性测定确定的IC90 hTNFa浓度为13ng/ml(数据未显示)。简言之，将含有两倍于DMEM中所需的攻击剂量的L929细胞与等体积的各种稀释度的hTNFα抗血清或抗TNFα片段或完整抗TNFα共培养24小时。作为阳性对照(最大杀灭)，使用2.5μg/ml hTNFa。基于用中性红细胞染色，通过比色测定评定抗体毒素中和滴度。

基于用中性红细胞染色，通过比色测定评定抗体毒素中和滴度(代表性曲线如图3所示)。

特异性抗体浓度计算如下：

特异性Ab浓度[g/L]＝[CCD(μg/L)–LC50(μg/L)]x[MWAb/(MW Ag x BS)]x EC50 x10-6

CCD(μg/L)–攻击量＝13μg/L(LC90由对L929细胞的TNFα细胞毒性测定)

LC50(μg/L)＝0.3μg/L(由对L929细胞的TNFα细胞毒性测定)

BS–结合位点＝2对于整个IgG

MW Ab＝160 000Da

MW Ag(TNFα)＝51 000Da

考虑到上述因素，抗血清中的特异性PcAb浓度计算为2.9g/L。

实施例5

完整抗TNFα的制剂

基于Kakade ML等人，Determination of trypsin inhibitor activity of soyproducts:a collaborative analysis of an improved procedure.Cereal Chem 51:376-381,1974的方法，使用比色测定法针对胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶评定蛋白酶抑制剂的选择以保护本发明的PcAb(完整抗TNFα)免于消化以及抑制剂在胃液和肠液中的存活率。胰蛋白酶测定如上所述。胰凝乳蛋白酶测定使用无色NSLPN底物，产生黄色。

加入表1中的两种抗酸剂、氢氧化镁和氢氧化铝凝胶，以中和低胃pH，从而防止胃中的胃蛋白酶降解完整抗TNFα的活性成分-绵羊抗TNFαIgG和蛋清胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂。其他成分是抗微生物剂对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯，据信其保持低生物负载。当悬浮液在使用前混合时，加入消泡剂二甲基硅油以防止蛋白质变性。糖精钠和甘露醇形式的甜味剂降低了两种抗酸剂的苦味。调味剂薄荷油用于改善味道。加入悬浮剂黄原胶以使所有上述组分保持悬浮状态。

通过实验确定，向制剂中添加200mM甘氨酸显著改善了悬浮液的稳定性。

表1.完整抗TNFα口服制剂的组合物。

实施例6

口服给药组合物的理化特征

通过仔细进行目视检查，确保悬浮液的外观及其纯度。通过将50ml制剂倒入100ml量筒中测定悬浮液的沉降体积，并监测沉降体积并以不同的时间间隔记录。

获得重复的结果，并且根据以下等式计算沉降体积：

F＝Vu/Vo

其中F是沉积体积，Vu-沉积物的最终高度，Vo-总悬浮液的初始高度。

在沉降实验开始后48小时内，未观察到沉降(Vu＝0)。因此，药物悬浮液在48小时内保持非常稳定而没有任何分离。此外，48小时后，将具有悬浮液的量筒倒置，在量筒的底部没有观察到任何层。这表明在悬浮液中没有形成层。换句话说，在实验的48小时期间，在制备的悬浮液中没有观察到絮凝。

实施例7

案例研究

一名27岁的白人男性在紧急入院时被诊断为患有急性、严重的溃疡性结肠炎，这可通过结肠镜检查和活组织检查得到证实。立即给予受试者静脉注射氢化可的松，但在接下来的六天内没有反应。担心他可能需要全结肠切除术，因此，他口服给予本发明的制剂(例如按照实施例5)。在前两周，他每天两次接受50ml，然后每天50ml再接受12周。

根据他对英国肠道疾病调查问卷(UK-IBDQ)的答案和各种临床参数，病人恢复得很快很好。此外，C-反应蛋白等测量参数恢复到正常值，并且他没有经历严重的副作用。在研究结束时，通过第二次结肠镜检查和活组织检查评估，粘膜愈合明显。

实施例8

口服给药组合物的协同作用

提供以下制剂：

制剂A：完整抗TNFα；

制剂B：蛋清干蛋白酶抑制剂；

制剂C：Bowman-Birk抑制剂(大豆)；

制剂D：完整抗TNFα+蛋清干蛋白酶抑制剂；和

制剂E：完整抗TNFα+Bowman-Birk抑制剂(大豆)。

25名患有溃疡性结肠炎的患者和25名患有克罗恩病的患者同意参与研究以测试制剂A-E的功效。将患者分成5组，并给予制剂A-E中的一种(即5名患有溃疡性结肠炎的患者给予制剂A和5名患有克罗恩病的患者给予制剂A，5名患有溃疡性结肠炎的患者给予制剂B和5名患有克罗恩病的患者给予疾病制剂B，等)。剂量方案是20ml(相当于1g完整抗TNFα)，每天两次，持续4周，之后每天一次。

医生确定，与给予制剂A-C的患者相比，给予制剂D和E的两个疾病组中的患者显示出更大的改善和减轻的症状。结肠镜检查显示治疗后肠道表面层的改善。施用制剂D和E的患者的改善远远大于施用制剂A-C的患者的改善，并且远远大于制剂A+B和制剂A+C的预期组合改善(通过结肠镜检查确定)。因此，PcAb和蛋白酶抑制剂的组合(例如，EWD蛋白酶抑制剂和/或Bowman-Birk抑制剂)产生了意想不到的协同效应。

比较例9

来自羊血清(绵羊)和鸡蛋的特异性抗体滴度的比较分析

进行了一项研究，以评估从鸡蛋中获得的特异性IgY的浓度和亲合力，与绵羊抗血清的特异性抗体浓度进行比较。

用人白细胞介素-6(hIL-6，促炎细胞因子如TNFα)免疫一组10只鸡和5只绵羊，并比较所得特异性PcAb的滴度和亲合力。平均亲合力常数对于鸡IgY为1.3×1010L/mol，对于绵羊抗体为3.1×1010L/mol。然而，在羊中获得的特异性PcAb水平(平均滴度≥1:200000)是在蛋黄中发现的滴度(≤1:20000)的十倍以上。当用多种其他免疫原免疫羊和母鸡时，特异性PcAb浓度的这十倍或以上的差异也是明显的。

上述实验显示了来源于血液，特别是来源于绵羊来源的抗体的优点。

实施例10

来源于羊血清(绵羊)和牛奶(牛)的特异性抗体滴度的比较分析

进行了一项研究，以评估来自适当免疫奶牛的初乳和牛奶作为PcAb来源的潜力。

用人TNFα免疫奶牛，首先在初乳中然后在牛奶的系列样品中测定所得特异性PcAb的滴度。在初乳中获得的最大滴度为1:275000(与绵羊抗血清中的1:800000比较)，并且在第一次挤奶后，水平迅速下降至约1:27500。

因此，与源于牛奶/初乳来源相比，血来源显示产生更高浓度的结合人TNFα的抗体。

实施例11

口服抗体制剂的稳定性

在储存约12个月后，测试实施例5的口服制剂的抗体结合和中和活性。结果表明，蛋白酶抑制剂活性没有恶化，制剂的物理稳定性没有变化，这保持了抗体的结合和中和活性。

实施例12

口服抗体制剂的抗微生物剂的功效

实施例5的口服制剂中的抗微生物剂-对羟基苯甲酸甲酯(E218)(浓度2g/L)和对羟基苯甲酸丙酯(E216)(0.6g/L)-根据欧洲药典标准对金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、白色念珠菌和巴西放线菌等生物体进行体外抗菌试验，显示完全无菌。

实施例13

血源性多克隆抗体与单克隆抗体的比较

使用结合人TNFα的血源性(绵羊)多克隆抗体和结合人TNFα的单克隆抗体英夫利昔单抗(Schering-Plough Ltd)进行比较抗原结合试验。

图4显示单克隆抗体英夫利昔单抗不与鼠TNFα结合，而来源于绵羊的多克隆抗体与人TNFα结合。

本发明的血源性多克隆抗体显示结合并中和鼠TNFα，尽管其浓度比中和人TNFα所需的浓度高约100倍。英夫利昔单抗未观察到鼠TNFα的中和作用，表明与本发明的抗体相比中和能力总体降低。

序列

SEQ ID No.1

VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

SEQ ID No.2

MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

SEQ ID No.3

MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCP

SEQ ID No.4

VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCP

SEQ ID No.5

VRSSSRTP

SEQ ID No.6

HVVANPQAEGQLQWLNRR

SEQ ID No.7

NGVELR

SEQ ID No.8

VPSEG

SEQ ID No.9

CPSTHVL

SEQ ID No.10

ISRIAVSYQTK

SEQ ID No.11

PCQRETPEGAEAK

SEQ ID No.12

DRLSAEINRPDYLDFA

SEQ ID No.13(变体人TNFαP84L)

MSTESMIRDVELAEEALPKKTGGPQGSRRCLFLSLFSFLIVAGATTLFCLLHFGVIGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTLSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

上述说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文中。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员来说是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施例描述了本发明，但是应该理解，要求保护的本发明不应该不适当地限于这些特定的实施例。实际上，对于生物化学和生物技术或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改旨在落入所附权利要求的范围内。

序列表

<110> 微药有限公司（MICROPHARM LIMITED）

<120> 治疗炎性病症的治疗剂

<130> P47564WO

<150> GB1701404.4

<151> 2017-01-27

<160> 13

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 157

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

1 5 10 15

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg

20 25 30

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

35 40 45

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

85 90 95

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 105 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

115 120 125

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

130 135 140

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

145 150 155

<210> 2

<211> 233

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala

1 5 10 15

Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe

20 25 30

Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe

35 40 45

Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro

50 55 60

Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser

65 70 75 80

Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu

100 105 110

Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser

115 120 125

Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly

130 135 140

Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

145 150 155 160

Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro

165 170 175

Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu

180 185 190

Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu

195 200 205

Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly

210 215 220

Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

225 230

<210> 3

<211> 146

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala

1 5 10 15

Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe

20 25 30

Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe

35 40 45

Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro

50 55 60

Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser

65 70 75 80

Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu

100 105 110

Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser

115 120 125

Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly

130 135 140

Cys Pro

145

<210> 4

<211> 70

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 4

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

1 5 10 15

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg

20 25 30

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

35 40 45

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Gly Cys Pro

65 70

<210> 5

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 5

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro

1 5

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 6

His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn

1 5 10 15

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<211> 6

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 7

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<210> 8

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<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 8

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1 5

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 9

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1 5

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys

1 5 10

<210> 11

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 11

Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

1 5 10

<210> 12

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala

1 5 10 15

<210> 13

<211> 233

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala

1 5 10 15

Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe

20 25 30

Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe

35 40 45

Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro

50 55 60

Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser

65 70 75 80

Ser Arg Thr Leu Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

85 90 95

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu

100 105 110

Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser

115 120 125

Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly

130 135 140

Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

145 150 155 160

Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro

165 170 175

Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu

180 185 190

Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu

195 200 205

Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly

210 215 220

Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

225 230

Claims

1.一种用于口服给药的抗体组合物，其包含与人肿瘤坏死因子α(TNFα)结合的完整血源性多克隆抗体，以及在胃肠转运过程中保护抗体的手段。

2.根据权利要求1所述的抗体组合物，其中所述血源性多克隆抗体是绵羊血源多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的抗体组合物，其中所述血源性多克隆抗体是马血源多克隆抗体。

4.根据前述权利要求中任一项的抗体组合物，其中用于保护抗体的手段包括至少一种蛋白酶抑制剂。

5.根据权利要求4所述的抗体组合物，其中所述蛋白酶抑制剂是选自Bowman-Birk蛋白抑制剂家族中的一种或多种。

6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体组合物，配制成液体。

7.根据前述权利要求中任一项所述的抗体组合物，其中用于保护抗体的手段包括可从蛋清获得的手段。

8.根据前述权利要求中任一项所述的抗体组合物，其中用于保护抗体的手段包括蛋清，优选粉末蛋清。

9.根据前述权利要求中任一项所述的抗体组合物，其中用于保护抗体的手段包括一种或多种抗酸剂。

10.根据前述权利要求中任一项所述的抗体组合物，其中用于保护抗体的手段包括以下一种或多种：

a.多肽，其特异性结合并抑制或灭活胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白水解活性；和/或

b.与胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶结合并抑制或灭活所述胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白酶活性的抗体；和/或

c.抗酸剂。

11.根据前述权利要求中任一项所述的抗体组合物，其中所述组合物包含抗酸剂和：

b.与胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶结合并抑制或灭活所述胰蛋白酶和/或胰凝乳蛋白酶的蛋白酶活性的抗体。

12.根据前述权利要求中任一项所述的抗体组合物，其中所述手段包括卵类粘蛋白、卵巢抑制素、卵细胞球蛋白、或其组合中的一种或多种。

13.根据前述权利要求中任一项所述的抗体组合物，其中组合物中存在的总抗体的至少5％与TNFα结合。

14.根据前述权利要求中任一项所述的抗体组合物，其中组合物中存在的总抗体的至少10％与TNFα结合。

15.制备与人肿瘤坏死因子α(TNFα)结合的完整血源性多克隆抗体的方法，所述方法包括从已经给予包含人TNFα或其片段的免疫原的非人哺乳动物获得血液样品。

16.根据权利要求15所述的方法，其中所述非人哺乳动物是绵羊非人哺乳动物。

17.根据权利要求15或16所述的方法，还包括从血液样品中获得血清。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述非人哺乳动物是马非人哺乳动物。

19.根据权利要求15或18所述的方法，还包括从所述血液样品中获得血浆。

20.根据权利要求15-19中任一项所述的方法，还包括使用硫酸钠沉淀或辛酸沉淀来纯化抗体。

21.通过权利要求15-20中任一项所述的方法获得的抗体。

22.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体组合物，用于治疗炎性病症，其中所述抗体组合物口服给予受试者。

23.根据权利要求1-14中任一项所述的抗体组合物在制备用于治疗炎性病症的药物中的用途，其中所述抗体组合物口服给予受试者。

24.治疗炎性疾病的方法，包括口服给予权利要求1-14中任一项所述的抗体组合物。

25.根据权利要求22-24中任一项所述的用途抗体组合物、用途或方法，其中所述抗体和保护抗体的手段同时给予。

26.根据权利要求22-24中任一项所述的用途抗体组合物、用途或方法，其中所述抗体和保护抗体的手段分别给予。

27.根据权利要求22-26中任一项所述的用途抗体组合物、用途或方法，其中所述炎性病症是败血症性休克。

28.根据权利要求22-27中任一项所述的用途抗体组合物、用途或方法，其中所述炎性病症是胃肠病症，优选肠道病症。

29.根据权利要求22-28中任一项所述的用途抗体组合物、用途或方法，其中所述炎性病症是炎性肠病、肠道感染、移植物抗宿主病症、由以下引起的病症：非甾体抗炎药、精神压力、酒精、肠手术、局部缺血和再灌注、食物过敏、或其组合。

30.根据权利要求22-29中任一项所述的用途抗体组合物、用途或方法，其中所述炎性病症是选自溃疡性结肠炎、克罗恩病或其组合的炎性肠病。

31.根据权利要求22-30中任一项所述的用途抗体组合物、用途或方法，其中所述抗体组合物以每天2g或更少的剂量给予受试者。

32.根据权利要求22-31中任一项所述的用途抗体组合物、用途或方法，其中所述抗体组合物以每天1g或更少的剂量给予受试者。

33.试剂盒，其包含根据权利要求1-14中任一项所述的抗体组合物，以及使用该试剂盒的说明书。

34.食品，其包含权利要求1-14中任一项所述的抗体组合物。

35.根据权利要求34所述的食品，其中所述食品是乳制品，优选为选自酸奶、奶酪或牛奶的乳制品。

36.根据权利要求34或35所述的食品，还包含益生菌和任选的益生元。