WO2017093589A1 - Anticuerpos monoclonales frente a bambi y uso para tratamiento de enfermedades inflamatorias - Google Patents

Anticuerpos monoclonales frente a bambi y uso para tratamiento de enfermedades inflamatorias Download PDF

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WO2017093589A1
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bambi
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antiserum
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Ramón MERINO PÉREZ
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Definitions

  • the present invention relates to antibodies against the BAMBI protein (BMP and Activin Membrane Bound lnhibitc- ⁇ and its use for the treatment and prevention of inflammatory diseases.) Therefore, the present invention can be framed within the scope of Medicine.
  • RA rheumatoid arthritis
  • psoriasis inflammatory bowel disease
  • spondyloarthritis or systemic lupus erythematosus
  • RA is the most common autoimmune rheumatic disease.
  • CD4 + T lymphocytes are especially implicated, a name that encompasses multiple effector subpopulations (TH 1, TH2, TH 17, TFH) or regulatory (Treg, Tr1) lymphocytes, basically defined by the pattern of secreting cytokines ( Zhu J et al. 2010 Annu Rev Immunol 28: 445; Zygmunt B et al. 201 1 Adv Immunol 109: 159).
  • Tregs cells In contrast, the decrease in the number and / or suppressive activity of Tregs cells is critical in IPEX syndrome, observed in patients with mutations in the foxp3 gene (Bennett CL et al. 2001 Nat Genet 27:20) or in mice “scurfy" deficient in this gene (Khattri R et al. 2003 Nat. Immunol 4: 337).
  • cytokine-specific monoclonal antibodies or soluble receptors of these factors (globally referred to as biological drugs) have begun to be used. These compounds have their great specificity as an advantage and the results obtained with them have been very positive.
  • biological drugs are not exempt from serious side effects and there is also frequent resistance to them, which forces the suspension of treatments. Therefore, the development of highly specific therapies using monoclonal antibodies against new biological targets is essential.
  • the present invention demonstrates the use of monoclonal antibodies against BAMBI for the treatment and prevention of autoimmune diseases, these exemplified with recognized models of arthritis, psoriasis and colitis.
  • the present invention relates to a monoclonal antibody that specifically recognizes an amino acid sequence comprising a peptide with at least 80% identity with SEQ ID NO: 1, preferably 80, 81, 82, 83, 84 , 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%, where the size of said amino acid sequence is between 15 and 30 amino acids ( 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 or 25 amino acids), preferably 25 amino acids.
  • antibody refers to immunoglobulin molecules and immunologically active portions (or fragments) of immunoglobulin molecules.
  • antibody comprises monoclonal antibodies and polyclonal antibodies, in the present invention the antibody is monoclonal, and refers to an intact antibody or immunologically active fragments thereof, and includes human, humanized and non-human, recombinant, chimeric antibodies. and synthetic.
  • antibody refers to the immunoglobulin that the animal or a hybrid cell has specifically synthesized against the sequence described in the first aspect of the present invention.
  • immunologically active portions or fragments of immunoglobulins include F (ab) and F (ab ') 2 fragments, which can be generated by treating the antibody with an enzyme, for example pepsin.
  • “Monoclonal antibodies” are homogeneous populations of identical antibodies, produced by a hybridoma, that is, a hybrid cell resulting from the fusion of a clone of B lymphocytes descended from a single and single stem cell and a tumor plasma cell, which are directed against a single site or antigenic determinant.
  • the process for obtaining the monoclonal antibodies of the invention can be carried out according to conventional methods, known in the state of the art.
  • said antibodies can be purified by conventional means, such as affinity chromatography, A-Sepharose protein, hydroxyapatite chromatography, gel electrophoresis or dialysis.
  • immunoglobulin M immunoglobulin M
  • IgD immunoglobulin D
  • IgG immunoglobulin G
  • IgA immunoglobulin A
  • IgE immunoglobulin E
  • the monoclonal antibodies included in the present invention are: clone B101-37 (lgG1) and clone B 143-14 (IgM).
  • a preferred embodiment of the first aspect of the invention specifically recognizes the sequence SEQ ID NO: 1: Murine BAMBI peptide (109-133): LH DVLSPSKSEASGQGN RYQH DSSR or SEQ ID NO: 2: Human BAMBI peptide (109-133): LHDVLSPPRGEASGQGNRYQHDGSR.
  • a more preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the antibody wherein said antibody is expressed from the cell line (hybridoma) deposited with an international authority.
  • the antibody may comprise a detectable label.
  • An even more preferred embodiment of the first aspect of the invention relates to the antibody wherein said antibody is conjugated to a fluorochrome, an enzyme, a gold particle, a nanoparticle, a peptide or other protein of interest, for example a protein or ligand peptide of a receiver.
  • detectable label refers to a molecular label that allows the detection, location and / or identification of the molecule to which it is attached, by methods and equipment suitable for detection, either by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or chemical media.
  • detectable labels for compound mapping include, but are not limited to radioactive isotopes, enzyme substrates, co-factors, ligands, chemiluminescent agents, fluorophores, enzymes (for example peroxidase), receptors and combinations thereof.
  • the antibody is labeled with biotin, avidin, streptoavidin, alkaline phosphatase or horseradish peroxidase (HRP).
  • the monoclonal antibody can be altered biochemically, by genetic manipulation or it can be synthetic, it can also lack portions.
  • the antibody comprises a heavy chain comprising the sequence SEQ ID NO: 3 and / or a light chain comprising the sequence SEQ ID NO: 4.
  • the antibody comprises a heavy chain comprising the sequence SEQ ID NO: 5 and / or a light chain comprising the sequence SEQ ID NO: 6.
  • the antibody is the antibody designated in the present invention as clone B101-37 (IgG1, ⁇ anti-BAMBI) and / or clone B143-14 (IgM, ⁇ anti-BAMBI).
  • the present invention also relates to a gene construct that is capable of generating the antibody of the first aspect of the present invention.
  • identity refers to the proportion of identical amino acids between two peptides or proteins that are compared. Sequence comparison methods are known in the state of the art, and include, but are not limited to, the BLASTP or BLASTN, ClustalW and FASTA program. We can consider that peptides or proteins with percentages of identity of at least 80% will maintain the same properties as the sequence SEQ ID NO: 1.
  • Specific recognition means “specific binding” to the binding (reaction, interaction or specific binding) between the antibody of the invention and the sequence described in the first aspect of the invention.
  • a second aspect of the present invention relates to an antiserum comprising the antibody of the first aspect of the invention.
  • the term "antiserum” refers to a serum obtained after immunization of an animal with an immunogen.
  • the antiserum comprises antibodies specific to said immunogen generated after the immune response produced in the animal.
  • the immunogen is the peptide with at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 (preferably 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89 , 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 or 100%), preferably SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2, and the antiserum comprises specific monoclonal antibodies generated against said sequence .
  • a third aspect of the present invention relates to a cell that expresses the antibody of the first aspect of the invention (hybridoma).
  • a fourth aspect of the present invention relates to the use of the antibody of the first aspect of the invention or of the antiserum of the second aspect of the invention for the inhibition of BMP and Activin Membrane Bound Inhibitor ⁇ BAMB ⁇ ).
  • a fifth aspect of the present invention relates to the use of the antibody of the first aspect of the invention or of the antiserum of the second aspect of the invention for the preparation of a medicament.
  • the present invention also relates to the antibody of the first aspect of the invention, or of the antiserum of the second aspect of the invention, for use as a medicament.
  • a sixth aspect of the present invention relates to the use of the antibody of the first aspect of the invention or of the antiserum of the second aspect of the invention for the preparation of a medicament for the treatment or prevention of autoimmune diseases.
  • the present invention also relates to the antibody of the first aspect of the invention, or of the antiserum of the second aspect of the invention, for use as a medicament for the treatment or prevention of autoimmune diseases.
  • Autoimmune disease is understood in the present invention as a disease in which the cells of the immune system trigger a chronic inflammatory response in one or several tissues of the individual causing deterioration or even destruction.
  • autoimmune disease and “chronic inflammatory disease” are used interchangeably.
  • the autoimmune disease is preferably autoimmune arthritis, inflammatory bowel disease, psoriasis, spondyloarthritis or systemic lupus erythematosus.
  • the autoimmune arthritis is newly started arthritis or rheumatoid arthritis.
  • autoimmune diseases are selected from the list consisting of: arthritis Autoimmune, spondyloarthritis, psoriasis, systemic lupus erythematosus and inflammatory bowel disease.
  • the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • the term "autoimmune arthritis” encompasses both the terms “Rheumatoid Arthritis” and “Undifferentiated Arthritis” whether it is of recent onset or if it is well established.
  • ARC Recent Arthritis
  • onset arthritis disease consisting of inflammation of at least one joint, less than one year of evolution that meets the criteria established by the American College of Rheumatology (American College of Rheumatology or ACR) and EULAR of "Rheumatoid Arthritis or RA” (Aletaha, Neogi et al. Ann Rheum Dis 2010; 69: 1580-1588) or, that without fulfilling these criteria, does not meet other criteria autoimmune, degenerative or metabolic diseases that may explain the symptoms.
  • This last case has been called “undifferentiated arthritis” (Al) which, in many cases, left to its free evolution, ends up leading to an RA.
  • ARC refers to a chronic and progressive autoimmune systemic disease, which causes chronic inflammation mainly of the joints, and that given its progressive nature, produces the destruction of them, with their consequent deformation and loss of functional capacity.
  • this disease can cause extra-articular alterations in various organs.
  • Spondyloarthritis in the present invention is understood as those autoimmune diseases with axial and / or peripheral involvement that meet the classification criteria of the Assessment of SpondyloArthritis International Society (ASAS) (Rudwaleit et al. Ann Rheum Dis 2011; 70: 25-31).
  • Systemic lupus erythematosus is understood in the present invention as a systemic autoimmune disease defined by the criteria of the American College of Rheumatology (Tan et al. Arthritis Rheum-1982; 25: 1271-1277).
  • the term "inflammatory bowel disease” or “EN” in the present invention refers to chronic inflammation of the intestine in an individual, where said inflammation is due to the individual's own immune system. The two most frequent forms correspond to ulcerative colitis and Crohn's disease. So in a preferred embodiment the autoimmune disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • psoriasis is understood to be that skin disease which is characterized by a malfunction of the immune system, which causes excess production of skin cells. This disease leads to the formation of reddish bulges covered with scaling. In addition, excess cell production also causes the infiltration of white blood cells into the skin. The lesions are generally located in regions with greater friction, such as, but not limited to, elbows, knees or English.
  • a seventh aspect of the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the monoclonal antibody of the first aspect of the invention or of the antiserum of the second aspect of the invention.
  • pharmaceutical composition herein refers to any substance used for diagnosis, prevention, relief, treatment or cure of a disease in humans or animals.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be used both alone and in combination with other pharmaceutical compositions.
  • the pharmaceutical composition further comprises a pharmaceutically acceptable carrier or excipient.
  • excipient refers to a substance that aids in the absorption of the pharmaceutical composition, which comprises the antibody of the invention, stabilizes it or aids in its preparation in the sense of giving it a consistency, shape, taste or any other characteristic. specific functional.
  • the excipients could have the function of keeping the ingredients together such as starches, sugars or cellulose, sweetening function, coloring function, protective function such as for example isolating it from air and / or moisture, filling function of a pill, capsule or any other form of presentation such as phosphate Dibasic calcium, a disintegrating function to facilitate the dissolution of the components and their absorption, without excluding other types of excipients not mentioned in this paragraph.
  • a “pharmaceutically acceptable vehicle” refers to those substances, or combination of substances, known in the pharmaceutical sector, used in the preparation of pharmaceutical forms of administration and includes, but are not limited to, solids, liquids, solvents or surfactants.
  • the carrier can be an inert substance or of analogous action to any of the compounds of the present invention and whose function is to facilitate the incorporation of the drug as well as other compounds, allow a better dosage and administration or give consistency and form to the composition Pharmaceutical When the presentation form is liquid, the vehicle is the diluent.
  • pharmaceutically acceptable refers to the compound referred to being allowed and evaluated so as not to cause damage to the organisms to which it is administered.
  • An eighth aspect of the present invention relates to the in vitro use of the antibody of the first aspect of the invention or of the antiserum of the second aspect of the invention for the screening of drugs, preferably drugs directed to the treatment and / or prevention of autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases are selected from the list consisting of: autoimmune arthritis, spondyloarthritis, psoriasis, systemic lupus erythematosus and inflammatory bowel disease. More preferably the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • in vitro refers to the method of the invention being performed outside the subject's body. That is, it is performed on a biological sample of a subject.
  • biological sample in the present invention refers to any sample that allows drug screening, and includes, but is not limited to, biological fluids or tissues of an individual, obtained by any method known to a person skilled in the art that serves for that end.
  • the biological sample could be, for example, but without limitation, a sample of fluid, such as blood, plasma, serum or tissue.
  • the biological sample in the present invention can be fresh, frozen, fixed or fixed and embedded in paraffin.
  • subject and individual are used interchangeably.
  • the term “subject” or “individual” refers to all animals classified as mammals and includes but is not limited to farm and domestic animals, primates and humans, for example humans, non-primates. humans, cows, horses, pigs, sheep, goats, dogs, cats or rodents.
  • the subject is a human being male or female of any age or race.
  • a ninth aspect of the present invention relates to a method of obtaining a monoclonal antibody that recognizes an amino acid sequence comprising a peptide with at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 1 comprising:
  • step (b) obtaining a hybridoma from step a) that generates specific monoclonal antibodies against an amino acid sequence comprising a sequence with at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the method further comprises a step (c) of isolation of the monoclonal antibody from the hybridoma generated in step (b).
  • amino acid sequence is the sequence SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the non-human animal is a mammal that is selected from the list consisting of pig, chimpanzee, mouse, rat, rabbit and guinea pig.
  • kit of the invention or “device of the invention” comprising the antibody, the antiserum, the cell, as described in the invention, and / or any combination thereof.
  • the kit and / or device of the invention may further comprise, without any limitation, probes, buffers, enzymes, agents to prevent contamination, etc.
  • the kit can include all the supports and containers necessary for commissioning and optimization.
  • the kit may also contain other proteins, including antibodies or antigens, that serve as positive and negative controls.
  • this kit further comprises the instructions for carrying out the detection of the BAMBI protein, preferably by an immunohistochemical assay, more preferably by ELISA, Western blot or immunofluorescence.
  • the antibody of the invention in the kit is labeled or immobilized.
  • label refers to the antibody being conjugated to a tag.
  • a high number of labels that can be conjugated to an antibody are known in the state of the art.
  • Examples of labels that can be used to label an antibody are, but are not limited to, radioisotopes (for example, 32P, 35S or 3H), fluorescent or luminescent markers [eg, fluorescein (FITC), rhodamine, texas red, phycoerythrin (PE ), allophycocyanin, 6-carboxyfluorescein (6-FAM), 2 ', 7'-dimethoxy-4', 5'-dichloro-6-carboxyfluorescein (JOE), 6-carboxy-X-rhodamine (ROX), 6-carboxy - 2 ', 4', 7 ', 4,7-hexachlorofluorescein (HEX), 5-carboxyfluorescein (5-FAM) or ⁇ , ⁇ , ⁇ ',
  • the term "immobilized”, as used in the present description, refers to the fact that the antibody of the invention can be attached to a support without losing its activity.
  • the support can be the surface of a matrix, (for example, a nylon matrix), a microtiter plate (for example, 96 wells) or support of similar plastic, or beads (spheres, for example, agarose spheres or small superparamagnetic microspheres composed of biodegradable matrices).
  • a matrix for example, a nylon matrix
  • a microtiter plate for example, 96 wells
  • beads spheres, for example, agarose spheres or small superparamagnetic microspheres composed of biodegradable matrices.
  • the kit is used for Detection of the peptide of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2.
  • the present invention relates to the in vitro use of the kit and / or device of the invention the treatment and / or prevention of autoimmune diseases.
  • autoimmune diseases are selected from the list consisting of: autoimmune arthritis, spondyloarthritis, psoriasis, systemic lupus erythematosus and inflammatory bowel disease, more specifically the inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • Another object of the invention is a method of treatment and / or prevention of autoimmune diseases comprising the administration to a subject in need of a therapeutically effective amount of the antibody of the invention, of the antiserum of the invention, or of the composition of the invention.
  • treatment refers to an intervention performed with the intention of preventing the development or altering the pathology of a disorder. Therefore, “treatment” refers to both therapeutic treatment and prophylactic or preventive measures.
  • a "subject in need of treatment” includes those cases that already have the disorder as well as those in which the disorder is to be prevented.
  • a therapeutic agent can directly alter the magnitude of the response of a component of the immune response, or make the disease more susceptible to treatment by other therapeutic agents, for example, antibiotics, antifungals, agents anti-inflammatories, chemotherapeutic agents, etc.
  • Administration can be carried out "in combination with" one or more therapeutic agents including simultaneous (concurrent) and consecutive administration in any order.
  • terapéuticaally effective amount refers to the amount of antibody, antiserum or composition of the invention, which is required to achieve an appreciable improvement in the condition, for example, a pathology. , of the disease or objective condition of the treatment.
  • autoimmune diseases are selected from the list consisting of: autoimmune arthritis, spondyloarthritis, psoriasis, systemic lupus erythematosus and inflammatory bowel disease, more specifically Inflammatory bowel disease is ulcerative colitis or Crohn's disease.
  • FIG. 1 Characterization of the murine anti-BAMBI (109-133) mAbs B101-37 and B143-14.
  • FIG. 2 Induction of BAMBI expression in murine and human CD4 + T cells after activation.
  • FIG. 3 Effect of inhibition of BAMBI in vitro differentiation of Treg cell and TH to 17.
  • CD4 + T cells CD25- CD44- CD62L + na 'IVE B6 mice and normal CD4 + T Bambi murine and human lymphocytes KO were stimulated for 5 days with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies under Treg (upper panels) or TH17 (lower panels) polarizing conditions in the presence of AcM B143-14 (anti-BAMBI IgM) or a polyclonal mouse IgM (Sigma ).
  • FIG. 4 The AcM B101-37 inhibits the development of arthritis in the CIA model.
  • FIG. 5 Effect of treatment with B101-37 on the development of psoriatic arthritis induced by morning injection.
  • mice received a weekly injection of 10 mg of morning (white arrows) and were treated with the AcM B101-37 (2 mg / mouse / week) from the time of the first morning injection (preventive B101-37) or from the appearance of the first signs of disease (therapeutic B101-37) until the end of the experiment (black arrows).
  • mice treated with 2 mg / mouse / week of an irrelevant murine lgG1 (lgG1-C) were used.
  • the evolution of the clinical severity of arthritis (upper panel) and the thickness of the ears (lower panel) is shown as a marker of severity of cutaneous psoriasis.
  • Statistical differences are represented as: * p ⁇ 0.05, ** p ⁇ 0.01, *** pO.001.
  • FIG: 7 Effect of treatment with B101-37 on the development of imiquimod-induced psoriasis.
  • 12.5 mg of imiquimod (Aldara) was applied for 6 days to the right ears of B10RIII mice deficient or not in BAMBI.
  • the different experimental groups were treated from the moment of the first application of imiquimod with a single dose of 2 mg of B101-37 or of an irrelevant murine lgG1 (lgG1-C).
  • FIG. 8 Effect of treatment with B101-37 on the development of DSS colitis.
  • the severity of the colitis was assessed by quantifying the ICD (A) or by analyzing the shortening of the colon (B).
  • BAMBI-KO were immunized with the BAMBI peptide (109-133) murine keyhole conjugate limpet hemocyanin (KLH) and emulsified in Freund's complete adjuvant (CFA). Mice were immunized two more times (one month apart between each immunization) with the same peptide emulsified in incomplete Freund's adjuvant (IFA).
  • the murine BAMBI (109-133) peptide is located in the extracellular region of BAMBI and differs with its human counterpart in 4 amino acids (positions 8, 9, 10 and 23 of SEQ ID NO: 1).
  • mice The presence of circulating murine anti-BAMBI antibodies (109-133) in the immunized mice was evaluated 15 days after each immunization by ELISA. Mice with higher titers of these antibodies were used to obtain murine anti-BAMBI monoclonal antibodies (AcM). For this, spleen cell suspensions were fused with the non-secreting myeloma line SP2 / 0-Ag14 as described previously (Yokoyama WM. Et al. Curr Protoc Immunol. 2013, Unit 2.5). The Hybridomas producing human anti-BAMBI AcM were selected by enzyme immunoassay (ELISA).
  • clone B101-37 (lgG1, ⁇ anti-BAMBI) and clone B143-14 (IgM, ⁇ anti-BAMBI).
  • the specificity of the MFAs was subsequently evaluated by Western Blot in cell membrane lysates of hearts from normal B6 and B6 BAMBI-KO mice and from human myocardial samples obtained from surgical biopsies.
  • RNA ribonucleic acid
  • CDR complementarity determining regions
  • the following amplimers were used to define the CDR of the heavy chain of B101-37: 5 'degenerate amplifier of the FR1 region of the heavy chain: 5'-CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC-3 (SEQ ID NO: 7) '; 3 'amplifier of the lgG1 constant region: 5'-GGA AGA TCT ATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC-3' (SEQ ID NO: 8).
  • the degenerate amplifier of the FR1 region of the heavy chain mentioned above and the 3 'amplifier of the constant region of IgM were used: 5'-GGA AGA TCT GAC ATT TGG GAA GGA CTG ACT CTC-3 '(SEQ ID NO: 9).
  • the following amplifiers were used to define the CDR of the light chains of B101-37 and B143-14: degenerate amplifier of the FR1 region of the ⁇ light chain: 5'-GG GAG CTC GAT ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3 '(SEQ ID NO: 10); 3 'amplifier of the light chain constant region ⁇ : 5'-GGT GCA TGC GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3' (SEQ ID NO: 11).
  • the PCR products were subsequently sequenced (STABVida, Caparica, Portugal) and the sequences analyzed by the IgBLAST program. Study of the expression of BAMBI in murine and human CD4 T lymphocytes.
  • the expression of BAMBI was studied by flow cytometry in CD4 + T lymphocytes of normal B6 mice after stimulation using biotinylated B101-37 in AcM.
  • the CD4 + T lymphocytes isolated from the spleen of normal B6 mice were stimulated in vitro for 48 hours with anti-CD3 (1 ⁇ g / well) and anti-CD28 (0.5 ⁇ g / well) antibodies bound to the plate in the presence or absence of 2 ng / ml of recombinant murine TGFfi and / or 1 ng / ml of recombinant murine IL-2 (PeproTech, London).
  • lymphocytes were purified from 50 ml of buffy-coats from healthy donors of the Blood and Tissue Bank of Cantabria (Marqués de Valdecilla University Hospital, Santander). The mononucleated cells obtained after Ficoll gradient were subjected to a positive selection after mapping with CDM specific mAb conjugated to my magnetic particles (MACS) using a magnetic separator (AutoMACS, Miltenyi Biotec). The CD4 + T lymphocytes were subsequently stimulated in vitro for 48 hours with anti-CD3 (1 ⁇ g / well) and anti-CD28 (0.5 ⁇ g / well) antibodies bound to the culture plate. Lysates of the cell membranes of activated lymphocytes were obtained as described above. In vitro differentiation cultures of murine and human CD4 + T lymphocytes to Treg and TH17 cells.
  • 5x10 5 CD4 + naf ' ve cells were stimulated for 5 days with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies bound to the culture plate plastic, under Treg polarizing conditions (2 ng / ml of murine TGF) or TH 17 (1 ng / ml of murine TGF and 10 ng / ml of murine IL-6) in the presence of 20 ⁇ g / ml B143-14 or 20 ⁇ g / ml of murine IgM (Sigma, St Louis, Missouri) as an isotypic control.
  • Treg polarizing conditions (2 ng / ml of murine TGF) or TH 17 (1 ng / ml of murine TGF and 10 ng / ml of murine IL-6)
  • 20 ⁇ g / ml B143-14 or 20 ⁇ g / ml of murine IgM Sigma, St Louis, Missouri
  • TCD4 + FoxP3 + (Treg) and CD4 + IL-17 + (TH17) lymphocytes at the end of the culture were analyzed by flow cytometry, as described above (Iglesias M. et al. Arthritis Rheum 2013, 65: 343).
  • mice B10RIII MHC H-2r deficient or not BAMBI were immunized before the 12th week of age intradermally at the base of the tail with 150 ug of collagen type II bovine (MD Biosciences, Zurich) emulsified (vol. 1/1) in CFA containing a concentration of Mycobacterium tuberculosis of 4 mg / ml (MD Biosciences), as described previously (Iglesias M. et al. Arthritis Rheum 2013, 65: 343).
  • collagen type II bovine MD Biosciences, Zurich
  • mice normalized immunized B10RIII mice were treated intraperitoneally (ip) during the first 4 weeks after immunization with 2 or 0.3 mg / week of B101-37 or with 2 mg / week of a lgG1 anti-TNP used as an isotypic control (lgG1-C).
  • the evolution of arthritis was monitored weekly from 3 to (date of onset of arthritis) at 8 a week after immunization.
  • the severity of arthritis was assessed in each of the four extremities by the method described by Wooley and cois (Wooley PH. Et al. J Immunol 1985, 135: 2443).
  • the final DAI value was calculated by adding the values of the different parameters and dividing it by 3.
  • mice that received a single morning injection were treated from the time of morning administration (disease induction) with 2 mg / week of B101-37 or with 2 mg / week of a lgG1 anti-TNP used as lgG1-C.
  • non-transgenic B10RIII mice with the chronic form of the disease were treated with 2 mg / week of B101-37 (divided into 3 equal doses every 2 days) from the time of the first morning injection (preventive treatment) or since the first clinical signs of the process were observed (3 days after the first morning injection; therapeutic treatment) until the end of the experiment.
  • non-transgenic B1 ORI II mice treated with an anti-TNP lgG1 from the onset of The first signs of the disease Psoriasis lesions were assessed at the level of the auricular pavilions, quantifying their thickness with the help of a digital caliper.
  • the animals were sacrificed 24 hrs after the last application of imiquimod and skin samples were collected for histological study.
  • the thickness of the epidermis and dermis in histological samples from the ears treated with imiquimod was quantified in each animal using the ImageJ program, in relation to the respective thicknesses of the histological samples from the untreated contralateral ears.
  • Example 1 Molecular characterization of the anti-BAMBI AcM.
  • the specificity of the B101-37 and B143-14 anti-BAMBI mAbs was initially determined by ELISA (during the hybridoma screening process) and subsequently by Western Blot. Both mAbs recognize a band of approximately 27-29 kDa and another of approximately 54 kDa, compatible with BAMBI monomers and dimers resistant to sodium dodecyl sulfate (SDS) and reducing conditions, such and as previously described (Xavier S et al. 2010 PLoS One 5: e12995), in the lysates of B6 mice but not in those of B6 BAMBI-KO mice ( Figure 1A).
  • Example 2 Expression of BAMBI in CD4 + T cells.
  • CD4 + T lymphocytes play a fundamental role in the development of inflammatory and autoimmune pathologies. For this reason, the regulation of BAMBI expression in this lymphocyte population in mice was studied by flow cytometry and later in humans by Western blotting, using in both cases the AcM B101-37.
  • CD4 + T naf sees murine lymphocytes not BAMBI expression was detected but was induced 48 hours after in vitro stimulation with anti-CD3 and anti-CD28 antibody ( Figure 2A). This expression was increased after the addition of ⁇ , but not IL-2, to activated CD4 + T cells ( Figure 2A).
  • Example 3 The inhibition of BAMBI with the murine B143-14 anti-BAMBI mAb (109-133) alters in vitro differentiation of mouse and human CD4 + T lymphocytes to the Treg and TH17 subtypes.
  • naive CD4 + T lymphocytes from normal B6 and BAMBI-KO mice were activated in vitro under Treg or TH17 cell polarization conditions, in the presence of the B143-14 AcM or a murine IgM used as an isotypic control.
  • the inhibition of BAMBI after the addition to the culture of B143-14, but not of the control IgM increased and reduced the Treg and TH 17 differentiation in vitro, respectively, of CD4 + T lymphocytes from normal B6 mice ( Figure 3A).
  • Example 4 Therapeutic effect of AcM B101 -37 on the development of CIA, morning-induced psoriatic arthritis, imiquimod-induced psoriasis and DSS colitis.
  • the preceding results indicate that: 1) we have AcMs capable of recognizing BAMBI in the mouse and in humans, 2) BAMBI expression is induced in CD4 + T cells after activation in both the mouse and humans; and 3) in both species the inhibition of BAMBI in vitro with a murine anti-BAMBI AcM (109-133) alters the functional differentiation of CD4 + T cells in the same direction as described in B6 mice.
  • BAMBI-KO increase of Treg cells and decrease of TH17.

Abstract

La presente invención se refiere a anticuerpos monoclonales específicos frente a un péptido de la proteína BAMBI, así como a sus usos y métodos que los comprenden. Preferiblemente los anticuerpos se utilizan para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Description

ANTICUERPOS MONOCLONALES FRENTE A BAMBI Y USO PARA
TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES INFLAMATORIAS DESCRIPCIÓN
La presente invención se refiere a anticuerpos frente a la proteína BAMBI (BMP and Activin Membrane Bound lnhibitc-ή y a su uso para el tratamiento y prevención de enfermedades inflamatorias. Por lo tanto, la presente invención se puede encuadrar en el ámbito de la Medicina.
ESTADO DE LA TÉCNICA
Bajo la denominación de enfermedad "autoinmune o inflamatoria crónica" se engloban actualmente más de 100 entidades nosológicas que globalmente afectan a un 10% de la población mundial (Shoenfeld Y et al. 2008 J Autoimmun 31 :325). Las enfermedades autoinmunes son el resultado de la acción de múltiples agentes ambientales sobre un fondo genético y/o epigenético particular. La acumulación en un mismo individuo de todos estos factores altera la regulación de la respuesta inmune, provocando respuestas aberrantes frente a agentes externos o la reacción del sistema frente a lo propio. La consecuencia es el desarrollo de enfermedades autoinflamatorias y/o autoinmunes.
Entre las enfermedades autoinmunes se engloban tanto la artritis reumatoide (AR), la psoriasis, la enfermedad inflamatoria intestinal, la espondiloartritis o el lupus eritematoso sistémico, comparten una serie de mecanismos etiopatogénicos y también comparten su respuesta a tratamientos inmunomoduladores o inmunosupresores similares o iguales. La AR es la enfermedad reumática autoinmune más común.
En las enfermedades de base autoinmune están especialmente implicados los linfocitos T CD4+, denominación que engloba múltiples subpoblaciones efectoras (linfocitos TH 1 , TH2, TH 17, TFH) o reguladoras (Treg, Tr1), definidas básicamente por el patrón de citocinas que secretan (Zhu J et al. 2010 Annu Rev Immunol 28:445; Zygmunt B et al. 201 1 Adv Immunol 109: 159). Alteraciones en el control de los mecanismos que regulan la diferenciación y activación de las diferentes subpoblaciones funcionales de linfocitos T CD4+ se han implicado en el desarrollo de patologías de base inmunitaria. En este sentido, algunas enfermedades autoinmunes severas se han asociado al incremento incontrolado en la diferenciación y/o funcionalidad de los linfocitos TH17 (Róhn TA et al. 2006 Eur J Immunol 36:2857; Kebir H et al. 2007 Nat Med 13: 1173; esclerosis múltiple o artritis reumatoide entre otras) o TFH (Tangye SG et al. 2013 Nat Rev Immunol 13:412; lupus eritematoso sistémico). Por el contrario, la disminución en el número y/o actividad supresora de las células Tregs es crítica en el síndrome IPEX, observado en pacientes con mutaciones en el gen foxp3 (Bennett CL et al. 2001 Nat Genet 27:20) o en ratones "scurfy" deficientes en este gen (Khattri R et al. 2003 Nat. Immunol 4:337).
Para el tratamiento de las enfermedades autoinmunes se han utilizado fármacos inmunosupresores poco específicos y que por lo tanto presentan múltiples efectos adversos. Más recientemente se han comenzado a utilizar anticuerpos monoclonales específicos de citocinas o receptores solubles de dichos factores (denominados globalmente como fármacos biológicos). Estos compuestos presentan como ventaja su gran especificidad y los resultados obtenidos con ellos han sido muy positivos. Sin embargo, la utilización de los fármacos biológicos no está exenta de efectos secundarios graves y además es frecuente la aparición de resistencias a los mismos, que obligan a la suspensión de los tratamientos. Por todo ello, es fundamental el desarrollo de terapias altamente específicas utilizando anticuerpos monoclonales contra nuevas dianas biológicas.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En la presente invención se demuestra el uso de anticuerpos monoclonales frente a BAMBI para el tratamiento y prevención de enfermedades autoinmunes, ejemplificadas éstas con modelos reconocidos de artritis, psoriasis y colitis.
En un primer aspecto la presente invención se refiere a un anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente una secuencia de aminoácidos que comprende un péptido con al menos un 80% de identidad con SEQ ID NO: 1 , preferiblemente un 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%, donde el tamaño de dicha secuencia de aminoácidos es de entre 15 y 30 aminoácidos (15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24 o 25 aminoácidos), preferiblemente de 25 aminoácidos. El término "anticuerpo", tal como aquí se utiliza en la presente invención, se refiere a moléculas de inmunoglobulinas y porciones (o fragmentos) inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas. Es decir, moléculas que se unen específicamente (inmunorreaccionan) con un antígeno, tal como, por ejemplo, un péptido o una proteína (un inmunógeno o epítopo). El término "anticuerpo" comprende anticuerpos monoclonales y anticuerpos policlonales, en la presente invención el anticuerpo es monoclonal, y se refiere a un anticuerpo intacto o a fragmentos inmunológicamente activos de él, e incluye anticuerpos humanos, humanizados y de origen no humano, recombinantes, quiméricos y sintéticos. En el contexto de esta invención el término anticuerpo se refiere a la inmunoglobulina que el animal o una célula híbrida ha sintetizado de forma específica frente a la secuencia descrita en el primer aspecto de la presente invención.
Ejemplos de porciones o fragmentos de inmunoglobulinas inmunológicamente activas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2, los cuales pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima, por ejemplo pepsina.
Los "anticuerpos monoclonales" son poblaciones homogéneas de anticuerpos idénticos, producidos por un hibridoma, es decir, una célula híbrida producto de la fusión de un clon de linfocitos B descendiente de una sola y única célula madre y una célula plasmática tumoral, que están dirigidos contra un único sitio o determinante antigénico. El procedimiento de obtención de los anticuerpos monoclonales de la invención puede realizarse según métodos convencionales, conocidos en el estado de la técnica. Opcionalmente, dichos anticuerpos pueden purificarse por medios convencionales, tales como cromatografía de afinidad, proteína A-Sepharosa, cromatografía con hidroxiapatito, electroforesis en gel o diálisis.
Tal y como es conocido por el experto en la materia, hay cinco isotipos o clases principales de inmunoglobulinas: inmunoglobulina M (IgM), inmunoglobulina D (IgD), inmunoglobulina G (IgG) (que a su vez presenta los siguientes subtipos en el ratón: lgG1 , lgG2a, lgG2b e lgG3), inmunoglobulina A (IgA) e inmunoglobulina E (IgE). Los anticuerpos monoclonales incluidos en la presente invención son: clon B101-37 (lgG1) y clon B 143- 14 (IgM). Una realización preferida del primer aspecto de la invención el anticuerpo reconoce específicamente la secuencia SEQ ID NO: 1 : Péptido BAMBI(109-133) murino: LH DVLSPSKSEASGQGN RYQH DSSR o SEQ ID NO: 2: Péptido BAMBI(109-133) humano: LHDVLSPPRGEASGQGNRYQHDGSR.
Una realización más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al anticuerpo donde dicho anticuerpo está expresado a partir de la línea celular (hibridoma) depositada en una autoridad internacional. En una realización particular el anticuerpo puede comprender una etiqueta detectable. Una realización aún más preferida del primer aspecto de la invención se refiere al anticuerpo donde dicho anticuerpo está conjugado con un fluorocromo, una enzima, una partícula de oro, una nanopartícula, un péptido u otra proteína de interés, por ejemplo una proteína o péptido ligando de un receptor.
El término "etiqueta detectable" o "mareaje" en la presente invención hace referencia a una etiqueta molecular que permite la detección, localización y/o identificación de la molécula a la que está unido, mediante procedimientos y equipamiento adecuados para la detección, bien mediante medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, inmunoquímicos o químicos. Ejemplos de etiquetas detectables para el mareaje de compuestos incluyen, aunque no se limitan a isótopos radiactivos, sustratos enzimáticos, co-factores, ligandos, agentes quimioluminiscentes, fluoróforos, enzimas (por ejemplo peroxidasa), receptores y combinaciones de éstos. En una realización particular el anticuerpo está marcado con biotina, avidina, estreptoavidina, fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano (HRP). Métodos para el mareaje y guía para la elección de mareajes adecuados para diferentes propósitos son conocidos por el experto en la materia.
El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente, por manipulación genética o puede ser sintético, puede también carecer de porciones.
En una realización más preferida del primer aspecto de la invención el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 y/o una cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4. En otra realización más preferida del primer aspecto de la invención el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y/o una cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6. En una realización preferida el anticuerpo es el anticuerpo denominado en la presente invención como clon B101-37 (lgG1 , κ anti-BAMBI) y/o el clon B143-14 (IgM, κ anti- BAMBI).
En una realización particular la presente invención también se refiere a una construcción génica que es capaz de generar el anticuerpo del primer aspecto de la presente invención.
El término "identidad", tal y como se utiliza en esta memoria, hace referencia a la proporción de aminoácidos idénticos entre dos péptidos o proteínas que se comparan. Los métodos de comparación de secuencias son conocidos en el estado de la técnica, e incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el programa BLASTP o BLASTN, ClustalW y FASTA. Podemos considerar, que péptidos o proteínas con porcentajes de identidad de, al menos, un 80% mantendrán las mismas propiedades que la secuencia SEQ ID NO: 1.
Se entiende por "reconocimiento específico" "unión específica" a la unión (reacción, interacción o unión específica) entre el anticuerpo de la invención y la secuencia descrita en el primer aspecto de la invención. Un segundo aspecto de la presente invención se refiere a un antisuero que comprende el anticuerpo del primer aspecto de la invención.
El término "antisuero" se refiere a un suero obtenido tras la inmunización de un animal con un inmunógeno. El antisuero comprende anticuerpos específicos de dicho inmunógeno generados tras la respuesta inmune producida en el animal. En el contexto de la presente invención el inmunógeno es el péptido con al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1 (preferiblemente un 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 o 100%), preferiblemente SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2, y el antisuero comprende anticuerpos monoclonales específicos generados frente a dicha secuencia. Un tercer aspecto de la presente invención se refiere a una célula que expresa el anticuerpo del primer aspecto de la invención (hibridoma). Un cuarto aspecto de la presente invención se refiere al uso del anticuerpo del primer aspecto de la invención o del antisuero del segundo aspecto de la invención para la inhibición de BMP and Activin Membrane Bound Inhibitor {BAMB\).
Un quinto aspecto de la presente invención se refiere al uso del anticuerpo del primer aspecto de la invención o del antisuero del segundo aspecto de la invención para la elaboración de un medicamento. Alternativamente, la presente invención se refiere también al anticuerpo del primer aspecto de la invención, o del antisuero del segundo aspecto de la invención, para su uso como medicamento. Un sexto aspecto de la presente invención se refiere al uso del anticuerpo del primer aspecto de la invención o del antisuero del segundo aspecto de la invención para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunes. Alternativamente, la presente invención se refiere también al anticuerpo del primer aspecto de la invención, o del antisuero del segundo aspecto de la invención, para su uso como medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunes.
Se entiende por "enfermedad autoinmune" en la presente invención aquella enfermedad en la que las células del sistema inmune desencadenan una respuesta inflamatoria crónica en uno o varios tejidos del individuo provocando su deterioro o incluso destrucción. En la presente invención los términos "enfermedad autoinmune" y "enfermedad inflamatoria crónica" se utilizan indistintamente.
La enfermedad autoinmune es preferiblemente artritis autoinmune, enfermedad inflamatoria intestinal, psoriasis, espondiloartritis o lupus eritematoso sistémico. En una realización aún más preferida la artritis autoinmune es artritis de reciente comienzo o artritis reumatoide.
Por este motivo, en una realización más preferida del sexto aspecto de la invención las enfermedades autoinmunes se seleccionan de la lista que consiste en: artritis autoinmune, espondiloartritis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y enfermedad inflamatoria intestinal. Preferiblemente la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn. En la presente invención el término "artritis autoinmune" engloba tanto los términos "Artritis Reumatoide" como "Artritis Indiferenciada" tanto si es de reciente comienzo como si está bien establecida.
Se entiende por "Artritis de Reciente Comienzo" (ARC) (o artritis de inicio) en la presente invención, aquella enfermedad consistente en inflamación de al menos una articulación, de menos de un año de evolución que cumple los criterios preestablecidos por el Colegio Americano de Reumatología (American College of Rheumatology o ACR) y EULAR de "Artritis reumatoide o AR" (Aletaha, Neogi et al. Ann Rheum Dis 2010;69:1580-1588) o, que sin cumplir dichos criterios, no cumple criterios de otras enfermedades autoinmunes, degenerativas o metabólicas que puedan explicar los síntomas. Este último caso, viene siendo denominado "Artritis Indiferenciada" (Al) que, en muchos de los casos, dejados a su libre evolución, acaban desembocando en una AR. En esta invención los términos ARC, AR o Al hacen referencia a una enfermedad sistémica autoinmune crónica y progresiva, la cual provoca la inflamación crónica fundamentalmente de las articulaciones, y que dada su naturaleza progresiva, produce la destrucción de las mismas, con su consecuente deformación y pérdida de capacidad funcional. Además, esta enfermedad puede provocar alteraciones extraarticulares en diversos órganos. Se entiende por "espondiloartritis" en la presente invención como aquellas enfermedades autoinmunes con afectación axial y/o periférica que cumplen los criterios de clasificación de la Assessment of SpondyloArthritis International Society (ASAS o Sociedad Internacional de Evaluación de Espodiloartritis) (Rudwaleit et al. Ann Rheum Dis 2011 ;70:25-31).
Se entiende por "lupus eritematoso sistémico" en la presente invención aquella enfermedad autoinmune sistémica definida por los criterios del Colegio Americano de Reumatología (Tan et al. Arthritis Rheum- 1982;25:1271-1277). El término "enfermedad inflamatoria intestinal" o "EN" en la presente invención se refiere a la inflamación crónica del intestino en un individuo, donde dicha inflamación es debida al sistema inmune del propio individuo. Las dos formas más frecuentes corresponden a la colitis ulcerosa y la enfermedad de Crohn. Por lo que en una realización preferida la enfermedad autoinmune es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
En la presente invención se entiende por "psoriasis" aquella enfermedad cutánea la cual está caracterizada por un mal funcionamiento del sistema inmune, lo que provoca un exceso de producción de células cutáneas. Esta enfermedad da lugar a la formación de abultamientos rojizos cubiertos de descamaciones. Además, el exceso de producción de células también produce la infiltración de glóbulos blancos en la piel. Las lesiones de forma general se localizan en regiones con un mayor rozamiento, como por ejemplo, aunque sin limitarse, los codos, las rodillas o ingles.
Un séptimo aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal del primer aspecto de la invención o del antisuero del segundo aspecto de la invención. El término "composición farmacéutica" en esta memoria hace referencia a cualquier sustancia usada para diagnóstico, prevención, alivio, tratamiento o curación de una enfermedad en el ser humano o en los animales. La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse tanto sola como en combinación con otras composiciones farmacéuticas. En una realización preferida, la composición farmacéutica además comprende un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable.
El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de la composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo de la invención, la estabiliza o ayuda en su preparación en el sentido de darle una consistencia, forma, sabor o cualquier otra característica funcional específica. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.
Un "vehículo farmacéuticamente aceptable" (o "farmacológicamente aceptable") se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensioactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de la presente invención y cuya función es facilitar la incorporación del fármaco así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. El término "farmacológicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.
La composición farmacéutica de esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida. Un octavo aspecto de la presente invención se refiere a uso in vitro del anticuerpo del primer aspecto de la invención o del antisuero del segundo aspecto de la invención para el cribado de fármacos, preferiblemente fármacos dirigidos al tratamiento y/o prevención de enfermedades autoinmunes. Preferiblemente las enfermedades autoinmunes se seleccionan de la lista que consiste en: artritis autoinmune, espondiloartritis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y enfermedad inflamatoria intestinal. Más preferiblemente la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
El término "in vitro" se refiere a que el método de la invención se realiza fuera del cuerpo del sujeto. Es decir, se realiza en una muestra biológica de un sujeto.
El término "muestra biológica" en la presente invención se refiere a cualquier muestra que permita el cribado de fármacos, e incluye, pero sin limitarnos, fluidos biológicos o tejidos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin. La muestra biológica podría ser, por ejemplo, pero sin limitarse, una muestra de fluido, como sangre, plasma, suero o tejido. La muestra biológica en la presente invención puede ser fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina. En la presente invención los términos "sujeto" e "individuo" se usan indistintamente. Como se usa en el presente documento, el término "sujeto" o "individuo" se refiere a todos los animales clasificados como mamíferos e incluye pero no se limita a animales de granja y domésticos, primates y humanos, por ejemplo seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano hombre o mujer de cualquier edad o raza.
Un noveno aspecto de la presente invención se refiere a un método de obtención de un anticuerpo monoclonal que reconoce una secuencia de aminoácidos que comprende un péptido con al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1 que comprende:
a. obtener el suero previamente extraído de un animal no-humano inmunizado con una proteína recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un péptido con al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1 ,
b. obtener un hibridoma a partir de la etapa a) que genere anticuerpos monoclonales específicos frente a una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia con al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida del noveno aspecto de la invención el método comprende además una etapa (c) de aislamiento del anticuerpo monoclonal a partir del hibridoma generado en la etapa (b).
En otra realización más preferida del noveno aspecto de la invención en la etapa (a) la secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
En una realización aún más preferida del sexto aspecto de la invención el animal no- humano es un mamífero que se selecciona de la lista que consiste en cerdo, chimpancé, ratón, rata, conejo y cobaya. Un décimo aspecto de la presente invención se refiere a un kit y/o dispositivo, de ahora en adelante "kit de la invención" o "dispositivo de la invención", que comprende el anticuerpo, el antisuero, la célula, según se describen en la invención, y/o cualquier combinación de los mismos.
El kit y/o dispositivo de la invención puede comprender además, sin ningún tipo de limitación, sondas, tampones, enzimas, agentes para prevenir la contaminación, etc. Por otro lado el kit puede incluir todos los soportes y recipientes necesarios para su puesta en marcha y optimización. El kit puede contener además otras proteínas, incluyendo anticuerpos o antígenos, que sirvan como controles positivos y negativos. Preferiblemente, este kit comprende además las instrucciones para llevar a cabo la detección de la proteína BAMBI, preferiblemente mediante un ensayo inmunohistoquímico, más preferiblemente mediante ELISA, Western blot o inmunofluorescencia.
Opcionalmente, el anticuerpo de la invención en el kit está marcado o inmovilizado.
El término "marcado", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a que el anticuerpo está conjugado con una etiqueta. Son conocidos en el estado de la técnica un elevado número de etiquetas que pueden ser conjugadas a un anticuerpo. Ejemplos de etiquetas que pueden ser empleadas para marcar un anticuerpo son, pero sin limitarnos, radioisótopos (por ejemplo, 32P, 35S o 3H), marcadores fluorescentes o luminiscentes [por ejemplo, fluoresceina (FITC), rodamina, texas red, ficoeritrina (PE), aloficocianina, 6-carboxifluoresceina (6-FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'- dicloro-6-carboxifluoresceina (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi- 2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceina (HEX), 5-carboxifluoresceina (5-FAM) o Ν,Ν,Ν',Ν'- tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA)]; anticuerpos, fragmentos de anticuerpos [por ejemplo, fragmentos F(ab)2)], etiquetas de afinidad [por ejemplo, biotina, avidina, agarosa, proteína morfogenética del hueso (BMP), haptenos], enzimas o substratos de enzimas [por ejemplo, fosfatasa alcalina (AP) y peroxidasa de rábano picante (HRP)].
El término "inmovilizado", tal y como se utiliza en la presente descripción, se refiere a que el anticuerpo de la invención puede ser unido a un soporte sin perder su actividad. Preferiblemente, el soporte puede ser la superficie de una matriz, (por ejemplo, una matriz de nylon), una placa de microvaloración (por ejemplo, de 96 pocilios) o soporte de plástico similar, o bien cuentas (esferas, por ejemplo, esferas de agarosa o microesferas pequeñas superparamagnéticas compuestas de matrices biodegradables). Otro aspecto de la invención se refiere al uso in vitro del kit de la invención para la detección de un péptido con al menos un 80% de identidad con la SEQ ID NO: 1. En una realización más preferida, el kit se usa para la detección del péptido de SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2. En otro aspecto, la presente invención se refiere al uso in vitro del kit y/o dispositivo de la invención el tratamiento y/o prevención de enfermedades autoinmunes. En una realización más particular de este aspecto, las enfermedades autoinmunes se seleccionan de la lista que consiste en: artritis autoinmune, espondiloartritis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y enfermedad inflamatoria intestinal, más específicamente la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
Otro objeto de la invención lo constituye un método de tratamiento y/o prevención de enfermedades autoinmunes que comprende la administración a un sujeto que lo necesite de una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo de la invención, del antisuero de la invención, o de la composición de la invención.
A efectos de la presente invención el término "tratamiento" se refiere a una intervención realizada con la intención de prevenir el desarrollo o alterar la patología de un trastorno. Por consiguiente, "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Un "sujeto en necesidad de tratamiento" incluye aquellos casos que ya tienen el trastorno así como aquellos en los que el trastorno se va a prevenir. En el tratamiento de una enfermedad de tipo inmunológico, un agente terapéutico puede alterar directamente la magnitud de la respuesta de un componente de la respuesta inmune, o hacer la enfermedad más susceptible al tratamiento por otros agentes terapéuticos, por ejemplo, antibióticos, antifúngicos, agentes antiinflamatorios, agentes quimioterapéuticos, etc. La administración puede llevarse a cabo "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. A efectos de la presente invención el término "cantidad terapéuticamente efectiva" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere la cantidad de anticuerpo, antisuero o composición de la invención, que se requiere para lograr una mejora apreciable en el estado, por ejemplo, una patología, de la enfermedad o condición objetivo del tratamiento.
En una realización preferida del método de tratamiento y/o prevención de la invención, este se caracteriza por que las enfermedades autoinmunes se seleccionan de la lista que consiste en: artritis autoinmune, espondiloartritis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y enfermedad inflamatoria intestinal, más específicamente la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 : Caracterización de los AcMs anti-BAMBI(109-133) murino B101-37 y B143-14. A) Especificidad de los AcMs anti-BAMBI B101-37 y B143-14 evaluada por Western Blot en lisados de membranas celulares de corazón de ratones B6 normales y B6.BAMBI-KO. B) Reconocimiento de BAMBI humano por el AcM B101-37 evaluado por Western Blot en lisados de membranas celulares de corazón humano. C) Secuencia de las CDR de las cadenas pesadas y ligeras de los AcMs B101-37 y B143- 14. Se indica el reordenamiento VDJ y VJ de las cadenas pesadas y ligeras, respectivamente, de ambos AcMs.
FIG. 2: Inducción de la expresión de BAMBI en linfocitos T CD4+ murinos y humanos tras su activación. A) Análisis comparativo por citometría de flujo de la expresión de BAMBI en linfocitos T CD4+ de ratones B6 normales y B6.BAMBI-KO antes y 48 horas tras su activación in vitro con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en presencia o ausencia de ΤΘΡβ o IL-2 (paneles superiores). En los paneles inferiores se compara la tinción con B101-37 de los linfocitos T CD4+ activados de ratones B6.BAMBI-KO con la de un lgG1 control isotípico en linfocitos T CD4+ activados de ratones normales. B) Inducción de BAMBI en linfocitos T humanos estimulados in vitro durante 48 horas con AcMs anti-CD3 y anti-CD28. La expresión de BAMBI se analizó por Western Blot en lisados de membrana plasmática. Como control de carga se comparó la expresión de N-Ras en los mismos lisados.
FIG. 3: Efecto de la inhibición de BAMBI en la diferenciación in vitro de los linfocitos T CD4+ murinos y humanos a célula Treg y TH 17. A) Células T CD4+CD25- CD62L+CD44- na'íve de ratones B6 normales y BAMBI-KO fueron estimuladas durante 5 días con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 en condiciones polarizantes Treg (paneles superiores) o TH17 (paneles inferiores) en presencia del AcM B143-14 (IgM anti-BAMBI) o una IgM de ratón policlonal (Sigma). B) Linfocitos T CD4+ naí've humanos, purificados por separación magnética, fueron activados in vitro durante 10 días con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 conjugados a bolas en condiciones de diferenciación THO o Treg y en presencia del AcM B143-14 (IgM anti-BAMBI) o una IgM de ratón policlonal. Se muestra los porcentajes de células CD4+FoxP3+ analizados mediante citometría de flujo en las condiciones de diferenciación THO (barras blancas) y Treg (barras negras). C) Linfocitos T CD4+ memoria humanos, purificados por separación magnética, fueron activados in vitro durante 10 días con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 conjugados a bolas en condiciones de diferenciación THO o TH17. Se muestra el efecto de la inhibición de BAMBI con el AcM B143-14 en la diferenciación a células TH 17 productoras o no de IFN□ analizados mediante citometría de flujo. Las diferencias estadísticas se representan como: **p<0,01.
FIG. 4: El AcM B101-37 inhibe el desarrollo de artritis en el modelo de CIA. A y B) Para la inducción de CIA los ratones B10RIII normales fueron inmunizados con colágeno de tipo II bovino emulsionado en CFA. Los diferentes grupos experimentales recibieron tratamientos con 2 mg/ratón/semana, 0,3 mg/ratón/semana de B101-37 o con 2 mg/ratón/semana de una lgG1 murina irrelevante (lgG1-C) durante las primeras 4 semanas tras la inmunización. Se muestra el grado de severidad clínica de cada ratón (A) y de distintas lesiones radiológicas (media±SD) asociadas a destrucción articular a la 8a semana tras la inmunización (B). Como controles de los experimentos anteriores se comparó el desarrollo de CIA entre ratones B10RIII normales y BAMBI- KO. Se muestra la evolución de la severidad clínica de la artritis en estos animales expresada como media±SD. (C) y de distintas lesiones radiológicas (media±SD) asociadas a destrucción articular a la 8a semana tras la inmunización (D). Las diferencias estadísticas se representan como: *p<0,05, **p<0,01. FIG. 5: Efecto del tratamiento con B101-37 en el desarrollo de artritis psoriásica inducida por inyección de mañano. A) Ratones B10RIII normales o BAMBI-KO tratados o no desde el inicio del experimento con el AcM B101-37 (2 mg/ratón/semana) recibieron una inyección i.p. de 10 mg de Mañano obtenido de la levadura Saccharomyces cerevisiae. Se representa la evolución en la severidad de la artritis y en el porcentaje de incremento en el grosor de las orejas (media ± SD) en los diferentes grupos experimentales. B) Fotografías representativas del aspecto macroscópico del pabellón auricular de los grupos experimentales descritos en (A). Las diferencias estadísticas se representan como: *p<0,05, **p<0,01 , *** p<0,001. FIG. 6: Efecto terapéutico del tratamiento con B101-37 en el desarrollo de artritis psoriásica crónica. Ratones B10RIII normales recibieron una inyección semanal de 10 mg de mañano (flechas blancas) y fueron tratados con el AcM B101-37 (2 mg/ratón/semana) desde el momento de la primera inyección de mañano (B101-37 preventivo) o desde la aparición de los primeros signos de enfermedad (B101-37 terapéutico) hasta el final del experimento (flechas negras). Como controles se utilizaron ratones tratados con 2 mg/ratón/semana de una lgG1 murina irrelevante (lgG1-C). Se muestra la evolución de la severidad clínica de la artritis (panel superior) y del grosor de las orejas (panel inferior) como marcador de severidad de la psoriasis cutánea. Las diferencias estadísticas se representan como: *p<0.05, **p<0.01 , *** pO.001.
FIG: 7: Efecto del tratamiento con B101-37 en el desarrollo de psoriasis inducida por imiquimod. Se aplicó 12.5 mg de imiquimod (Aldara ) durante 6 días en las orejas derechas de los ratones B10RIII deficientes o no en BAMBI. Los distintos grupos experimentales fueron tratados desde el momento de la primera aplicación de imiquimod con una única dosis de 2 mg de B101-37 o de una lgG1 murina irrelevante (lgG1-C). A) Evolución de la severidad clínica de las lesiones cutáneas valorando la aparición y severidad de eritema, descamación de la piel y grosor de la oreja tratada en comparación con el de la contralateral no tratada. B) Severidad histológica de las lesiones cutáneas. Las fotografías superiores muestran ejemplos representativos (x10) de cortes histológicos de las orejas teñidos con hematoxilina-eosina. Los paneles inferiores muestran los valores del grosor de la epidermis (panel izquierdo) y de la dermis (panel derecho) en los distintos animales de cada grupo experimental. Las diferencias estadísticas se representan como: *p<0.05, *** p<0.001.
FIG. 8: Efecto del tratamiento con B101-37 en el desarrollo de colitis DSS. Ratones B6 normales o BAMBI-KO tratados o no desde el inicio del experimento con el AcM B101- 37 (2 mg/ratón/semana) recibieron DSS disuelto al 3% en el agua del biberón durante 5 días. La severidad de la colitis fue evaluada mediante cuantificación del DAI (A) o analizando el acortamiento del colon (B). C) Mortalidad en los diferentes grupos experimentales. Las diferencias estadísticas se representan como: *p<0,05, **p<0,01.
EJEMPLOS A continuación se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
MATERIAL Y METODOS. Obtención y caracterización de los anticuerpos monoclonales anti-BAMBI murinos.
Ratones B6. BAMBI-KO fueron inmunizados con el péptido BAMBI(109-133) murino conjugado a keyhole limpet hemocyanin (KLH) y emulsionado en adyuvante completo de Freund (CFA). Los ratones fueron inmunizados en dos ocasiones más (con un mes de diferencia entre cada inmunización) con el mismo péptido emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (IFA). El péptido BAMBI(109-133) murino se localiza en la región extracelular de BAMBI y difiere con su homólogo humano en 4 aminoácidos (posiciones 8, 9, 10 y 23 de la SEQ ID NO: 1). La presencia de anticuerpos circulantes anti-BAMBI(109-133) murino en los ratones inmunizados fue evaluada 15 días tras cada inmunización mediante ELISA. Los ratones con títulos más altos de estos anticuerpos fueron utilizados para la obtención de los anticuerpos monoclonales (AcM) anti-BAMBI murino. Para ello, suspensiones celulares de bazo se fusionaron con la línea de mieloma no secretor SP2/0-Ag14 tal y como se ha descrito anteriormente (Yokoyama WM. et al. Curr Protoc Immunol. 2013, Unit 2.5). Los hibridomas productores de AcM anti-BAMBI humano fueron seleccionados por inmunoensayo enzimático (ELISA). En la presente invención se han caracterizado dos de los AcM obtenidos; el clon B101-37 (lgG1 , κ anti-BAMBI) y el clon B143-14 (IgM, κ anti-BAMBI). La especificidad de los AcM fue evaluada posteriormente mediante Western Blot en lisados de membranas celulares de corazones procedentes de ratones B6 normales y B6.BAMBI-KO y de muestras de miocardio humano obtenidas de biopsias quirúrgicas.
El ácido ribonucleico (ARN) de los AcM B101-37 y B143-14 fue aislado mediante el kit comercial RNeasy Mini Kit (Qiagen). Para definir las secuencias codificantes para las regiones determinantes de complementariedad (CDR) en la cadena pesada y ligera de ambos AcMs se realizaron RT-PCRs a partir de los RNAs purificados, tal y como se ha descrito previamente (Wang Z. et al. J Immunol Methods. 2000, 233: 167). Para definir el CDR de la cadena pesada de B101-37 se utilizaron los siguientes amplímeros: amplímero 5' degenerado de la región FR1 de la cadena pesada: 5'-CTT CCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TC-3 (SEQ ID NO: 7)'; amplímero 3' de la región constante de lgG1 : 5'-GGA AGA TCT ATA GAC AGA TGG GGG TGT CGT TTT GGC- 3' (SEQ ID NO: 8). Para definir el CDR de la cadena pesada de B143-14 se utilizaron el amplímero degenerado de la región FR1 de la cadena pesada mencionado anteriormente y el amplímero 3' de la región constante de IgM: 5'-GGA AGA TCT GAC ATT TGG GAA GGA CTG ACT CTC-3' (SEQ ID NO: 9). Para definir el CDR de la cadenas ligeras de B101-37 y B143-14 se utilizaron los siguientes amplímeros: amplímero degenerado de la región FR1 de la cadena ligera κ: 5'-GG GAG CTC GAT ATT GTG MTS ACM CAR WCT MCA-3' (SEQ ID NO: 10); amplímero 3' de la región constante de la cadena ligera κ: 5'-GGT GCA TGC GGA TAC AGT TGG TGC AGC ATC-3' (SEQ ID NO: 11). Los productos de PCR fueron posteriormente secuenciados (STABVida, Caparica, Portugal) y las secuencias analizadas mediante el programa IgBLAST. Estudio de la expresión de BAMBI en linfocitos T CD4 murinos y humanos.
Se estudió mediante citometría de flujo la expresión of BAMBI en linfocitos T CD4+ de ratones B6 normales tras su estimulación utilizando en AcM B101-37 biotinilado. Los linfocitos T CD4+ aislados del bazo de ratones B6 normales fueron estimulados in vitro durante 48 horas con anticuerpos anti-CD3 (1 μg/pocillo) y anti-CD28 (0,5 μg/pocillo) unidos a la placa en presencia o ausencia de 2 ng/ml of TGFfi murino recombinante y/o 1 ng/ml of IL-2 murino recombinante (PeproTech, Londres). Como controles negativos se utilizaron células de bazo de ratones B6.BAMBI-KO estimuladas de igual forma y coloreadas con B101-37 biotinilado y de ratones B6 normales coloreadas con un control isotípico lgG1 biotinilado. Las células coloreadas fueron analizadas en un citómetro FACSCanto II equipado con el software FACSDiva (BD Biosciences).
La expresión de BAMBI en células T CD4+ humanas tras su estimulación in vitro se analizó mediante Western Blot. Dichos linfocitos fueron purificados a partir de 50 mi de buffy-coats procedentes de donantes sanos del Banco de Sangre y Tejidos de Cantabria (Hospital Universitario Marqués de Valdecilla, Santander). Las células mononucleadas obtenidas tras gradiente de Ficoll se sometieron a una selección positiva tras mareaje con AcM específico de CD4 conjugado a mi ero partículas magnéticas (MACS) utilizando un separador magnético (AutoMACS, Miltenyi Biotec). Los linfocitos T CD4+ fueron posteriormente estimulados in vitro durante 48 horas con anticuerpos anti-CD3 (1 μg/pocillo) y anti-CD28 (0,5 μg/pocillo) unidos a la placa de cultivo. Los lisados de las membranas celulares de los linfocitos activados se obtuvieron tal y como se ha descrito anteriormente. Cultivos de diferenciación in vitro de linfocitos T CD4+ murinos y humanos a células Treg y TH17.
La capacidad inhibitoria de los AcM anti-BAMBI dirigidos contra el péptido BAMBI(109- 133) se exploró in vitro en cultivos de linfocitos T CD4+ murinos y humanos diferenciados a células Treg y TH 17. En estos experimentos se utilizó el AcM B143-14. En los experimentos con linfocitos murinos, se purificaron células CD4+ naf've (CD4+CD25-CD62L+CD44-) de los bazos de ratones B6 normales mediante cell sorting (FACSAria, BD Biosciences). 5x105 células CD4+ naf've se estimularon durante 5 días con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 unidos al plástico de la placa de cultivo, en condiciones polarizantes Treg (2 ng/ml de TGF murino) o TH 17 (1 ng/ml de TGF murino y 10 ng/ml de IL-6 murino) en presencia de 20 μg/ml B143-14 o 20 μg/ml de IgM murina (Sigma, St Louis, Missouri) como control isotípico. Los porcentajes de linfocitos TCD4+FoxP3+ (Treg) y CD4+IL-17+ (TH17) al final del cultivo se analizaron mediante citometría de flujo, tal y como hemos descrito anteriormente (Iglesias M. et al. Arthritis Rheum 2013, 65:343). Linfocitos T CD4+ humanos naive (en la diferenciación Treg) o memoria CD45RO+ (en las diferenciación TH17), purificados por separación magnética, fueron activados in vitro durante 10 días con anticuerpos (Acs) anti-CD3 y anti-CD28 conjugados a bolas en condiciones de diferenciación Treg (5 ng/ml de ΤΘΡβ) o TH 17 (20 ng/ml de I L- β, 30 ng/ml de IL-6, 30 ng/ml de IL-23, 3 ng/ml de ΤΘΡβΙ , 1 μg/ml de anti-IFNY y 2,5 μg/ml de anti-IL-4), en presencia de 20 μg/ml de B143-14 o 20 μg/ml de IgM murina. Los porcentajes de linfocitos TCD4+FoxP3+ (Treg) y CD4+IL-17+ (TH17) al final del cultivo se analizaron mediante citometría de flujo.
Modelo experimental de artritis tras inmunización con colágeno de tipo II bovino emulsionado en CFA (CIA).
Grupos de 10 ratones B10RIII (MHC H-2r) deficientes o no en BAMBI fueron inmunizados antes de la 12a semana de edad por vía intradérmica en la base de la cola con 150 μg de colágeno de tipo II bovino (MD Biosciences, Zurich) emulsionado (vol. 1/1) en CFA conteniendo una concentración de Mycobacterium tuberculosis de 4 mg/ml (MD Biosciences), tal y como hemos descrito anteriormente (Iglesias M. et al. Arthritis Rheum 2013, 65:343). Para estudiar el efecto de la inhibición BAMBI en el desarrollo de CIA los ratones B10RIII normales inmunizados fueron tratados intraperitonealmente (i.p.) durante las primeras 4 semanas tras la inmunización con 2 o 0,3 mg/semana de B101-37 o con 2 mg/semana de una lgG1 anti-TNP usada como control isotípico (lgG1-C). La evolución de la artritis fue monitorizada semanalmente desde la 3a (fecha de comienzo de la artritis) a la 8a semana después de la inmunización. La severidad de la artritis se evaluó en cada una de las cuatro extremidades mediante el método descrito por Wooley y cois (Wooley PH. et al. J Immunol 1985, 135:2443). Así mismo, a las 8 semanas de la inmunización se evaluaron las lesiones articulares en las patas delanteras y traseras mediante radiología, tal y como hemos descrito anteriormente (Iglesias M. et al. Arthritis Rheum 2013, 65:343). Modelo experimental de colitis por sulfato de dextrano (colitis-DSS). Para la inducción de colitis, el DSS (MPbio.com) se disolvió en agua al 3%. Esta disolución (con cambios diarios del agua) se suministró en el biberón a los ratones de los diferentes grupos experimentales durante un periodo de tiempo variable [hasta que los ratones del grupo control alcancen un índice de actividad de la enfermedad (DAI) de entre 1 ,5-2 (aproximadamente 4-5 días)]. Diariamente se midió el agua consumida por cada grupo experimental y se valoró el DAI calculando el score clínico de los siguientes parámetros: A) pérdida de peso: 0= no hay pérdida de peso, 1 = pérdida del 1-5 % de peso, 2=: pérdida del 5-10 % de peso, 3= pérdida del 10-20 % de peso y 4= pérdida de más del 20% de peso; B) consistencia de las heces (se otorga el mismo valor a todos los animales que estén en la misma caja): 0= heces de consistencia normal, 2= heces blandas y 4= diarrea; C) sangrado rectal (se otorga el mismo valor a todos los animales que estén en la misma caja): 0= no hay sangrado, 2= sangrado leve y 4= sangrado intenso. El valor de DAI final se calculó sumando los valores de los diferentes parámetros y dividiéndolo por 3.
Inducción de artritis psoriásica con mañano.
Para la inducción de un cuadro agudo de artritis psoriásica grupos de ratones B10RIII deficientes o no en BAMBI recibieron una inyección i.p. de 10 mg de mañano obtenido de la levadura S. cerevisiae (Sigma-Aldrich) disuelto in 200 μΙ de PBS (Khmaladze I. et al. Proc Nati Acad Sci USA 2014, 1 1 1 Έ3669). Adicionalmente, se indujo una forma crónica del proceso en ratones B10RIII no transgénicos mediante la inyección repetida de la misma dosis de mañano una vez por semana. Para estudiar el efecto del tratamiento con B101-37 en la prevención de artritis psoriásica los ratones que recibieron una única inyección de mañano fueron tratados desde el momento de la administración del mañano (inducción de la enfermedad) con 2 mg/semana de B101- 37 o con 2 mg/semana de una lgG1 anti-TNP usada como lgG1-C. Para valorar el efecto terapéutico del tratamiento con B101-37 los ratones B10RIII no transgénicos con la forma crónica de la enfermedad fueron tratados con 2 mg/semana de B101-37 (repartidos en 3 dosis iguales cada 2 días) desde el momento de la primera inyección con mañano (tratamiento preventivo) o desde que se observaron los primeros signos clínicos del proceso (3 días tras la primera inyección de mañano; tratamiento terapéutico) hasta el final del experimento. De nuevo, como controles se analizaron ratones B1 ORI II no transgénicos tratados con una lgG1 anti-TNP desde la aparición de los primeros signos de la enfermedad. Las lesiones de psoriasis se valoraron a nivel de los pabellones auriculares cuantificando el grosor de los mismos con ayuda de un calibrador digital. La severidad de la artritis se evaluó en cada una de las cuatro patas, en una escala de 0-10 (rango total de 0-40) de la siguiente forma: inflamación severa de carpo/tarso= 5 puntos sumándose 1 punto adicional por cada dedo inflamado. Si la inflamación es leve= 3 puntos por carpo/tarso + 0,5 puntos por cada dedo inflamado.
Modelo experimental de psoriasis cutánea inducida por imiquimod. Para la inducción de psoriasis cutánea se aplicó tópicamente 12.5 mg de imiquimod (Aldara ) durante 6 días en las orejas derechas de los ratones B10RIII deficientes o no en BAMBI. Los distintos grupos experimentales fueron tratados en el momento de la primera aplicación de imiquimod con una única dosis de 2 mg de B101-37 o de una lgG1 irrelevante. Se evaluó diariamente el eritema, la descamación y el aumento de grosor de la oreja. El eritema y la descamación se valoraron utilizando un score clínico de 0 a 4 de la siguiente forma: ninguna= 0, leve= 1 , moderada= 2, severa= 3, muy severa= 4. El aumento de grosor en la oreja tratada se calculó con la ayuda de un calibrador digital en comparación con el grosor de la oreja izquierda no tratada de la siguiente forma: ningún incremento= 0, incremento del 0.1-10%= 1 , incremento del 10.1-20%= 2, incremento del 20.1-30%= 3, incremento del 30.1-40%= 4, incremento del 40.1-50%= 5. Los animales fueron sacrificados 24 hrs después de la última aplicación de imiquimod y se recogieron muestras de piel para estudio histológico. El grosor de la epidermis y de la dermis en las muestras histológicas procedentes de las orejas tratadas con imiquimod se cuantificó en cada animal utilizando el programa ImageJ, en relación con los respectivos grosores de las muestras histológicas procedentes de las orejas contralaterales no tratadas.
Ejemplo 1 : Caracterización molecular de los AcM anti-BAMBI. La especificidad de los AcM anti-BAMBI B101-37 y B143-14 se determinó inicialmente mediante ELISA (durante el proceso de cribado de los hibridomas) y posteriormente mediante Western Blot. Ambos AcM reconocen una banda de aproximadamente 27-29 kDa y otra de aproximadamente 54 kDa, compatibles con monómeros de BAMBI y dímeros resistentes a dodecil sulfato sódico (SDS) y condiciones reductoras, tal y como ha sido descrito previamente (Xavier S et al. 2010 PLoS One 5:e12995), en los lisados de los ratones B6 pero no en los de los ratones B6.BAMBI-KO (Figure 1A).
Aunque el péptido BAMBI(109-133) murino utilizado para el desarrollo de los AcM anti- BAMBI difiere de su homólogo humano en 4 aminoácidos, estudios de Western Blot en lisados de membrana plasmática de miocardio indican que B101-37 también reconoce a BAMBI humano (Figura 1 B).
Posteriormente, caracterizamos las CDRs de las cadenas pesadas y ligeras de ambos AcM anti-BAMBI mediante secuenciación del ácido desoxirribonucleico (DNA) (SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO; 6). La comparación de las secuencias de DNA con la base de datos IgBLAST indica que las CDR de las cadenas pesada y ligera del AcM B101-37 son el resultado del reordenamiento de los segmentos V9-3/D1-3/J1 y V15-103/J5, respectivamente, mientas que las CDR de las cadenas pesada y ligera del AcM B143-14 son el resultado del reordenamiento de los segmentos V1-55/D4-1/J2 y V5-43/J1 , respectivamente.
Ejemplo 2: Expresión de BAMBI en los linfocitos T CD4+. Los linfocitos T CD4+ desempeñan un papel fundamental en el desarrollo de patologías inflamatorias y autoinmunes. Por este motivo se estudió la regulación de la expresión de BAMBI en esta población linfocitaria en ratones mediante citometría de flujo y posteriormente en humanos mediante Western Blot, utilizando en ambos casos el AcM B101-37. En linfocitos T CD4+ naf've murinos no se detectó la expresión de BAMBI pero se indujo 48 horas tras su estimulación in vitro con anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28 (Figura 2A). Esta expresión se incrementó tras la adición de ΤΘΡβ, pero no de IL-2, a las células T CD4+ activadas (Figura 2A). Como controles de especificidad del AcM B101-37, no se detectó mareaje en citometría de flujo tanto en los linfocitos T CD4+ activados de los ratones BAMBI-KO coloreados B101-37 como en los de los ratones B6 normales coloreados con un control isotípico lgG1 , respectivamente (Figura 2A, paneles inferiores).
Al igual que en el ratón, la expresión de BAMBI fue muy baja en los linfocitos CD4+ na'íve humanos, induciéndose tras su estimulación con anticuerpos anti-CD3 y anti- CD28 (Figura 2B). Ejemplo 3: La inhibición de BAMBI con el AcM anti-BAMBI(109-133) murino B143-14 altera la diferenciación in vitro de los linfocitos T CD4+ de ratón y humanos a los subtipos Treg y TH17.
En estudios previos demostramos que la ausencia de BAMBI en los linfocitos T CD4+ de los ratones BAMBI-KO potenciaba e inhibía su diferenciación in vitro a las poblaciones Treg y TH17, respectivamente (Postigo J et al. Tesis doctoral defendida el 19 de abril de 2013, Universidad de Cantabria). Para valorar el efecto inhibitorio de los AcM anti-BAMBI dirigidos contra el epítopo BAMBI(109-133) murino, analizamos la capacidad de B143-14 para alterar la diferenciación funcional de los linfocitos T CD4+ de ratones normales en el mismo sentido que lo observado en los ratones BAMBI-KO. Para ello, linfocitos T CD4+ naíve de ratones B6 normales y BAMBI-KO fueron activados in vitro en condiciones de polarización a célula Treg o TH17, en presencia del AcM B143-14 o de una IgM murina usada como control isotípico. Al igual que lo observado con los linfocitos de los ratones BAMBI-KO, la inhibición de BAMBI tras la adición al cultivo de B143-14, pero no de la IgM control, incrementó y redujo la diferenciación Treg y TH 17 in vitro, respectivamente, de linfocitos T CD4+ de ratones B6 normales (Figura 3A).
Finalmente, observamos que en presencia del AcM B143-14, pero no de la IgM control, la diferenciación in vitro de linfocitos T CD4+ naíve (a Treg) o de memoria (a Th17) humanos, activados en condiciones polarizantes hacia Treg (Figura 3B) o TH17 (Figura 3C) se altera en el mismo sentido que en el ratón: incremento de Treg y disminución de TH17.
Ejemplo 4: Efecto terapéutico del AcM B101 -37 en el desarrollo de CIA, artritis psoriásica inducida por mañano, psoriasis inducida por imiquimod y colitis-DSS. Los resultados precedentes indican que: 1) disponemos de AcMs capaces de reconocer a BAMBI en el ratón y en humanos, 2) la expresión de BAMBI se induce en los linfocitos T CD4+ tras su activación tanto en el ratón como en humanos; y 3) en ambas especies la inhibición de BAMBI in vitro con un AcM anti-BAMBI(109-133) murino altera la diferenciación funcional los linfocitos T CD4+ en el mismo sentido que lo descrito en los ratones B6. BAMBI-KO (incremento de células Treg y disminución de TH17). Estos hallazgos plantean la posibilidad de que la inhibición de BAMBI in vivo tenga un efecto terapéutico en patologías inflamatorias/autoinmunes.
En la presente invención hemos caracterizado el potencial terapéutico de B101-37 en el desarrollo de CIA (el modelo experimental de artritis reumatoide más empleado por la comunidad científica), artritis psoriásica inducida por mañano, psoriasis inducida por imiquimod (el modelo experimental de psoriasis cutánea más empleado por la comunidad científica) y colitis-DSS. Tanto desde el punto de vista clínico como radiológico, el tratamiento de los ratones B10RIII normales con 2 mg/semana de B101-37 durante las primeras 4 semanas tras la inmunización con colágeno de tipo II bovino inhibió el desarrollo de CIA en estos animales, a diferencia de lo observado en los ratones tratados con 0,3 mg/semana de B101-37 o con 2 mg/semana de lgG1-C (Figuras 4A y 4B). La inhibición de la CIA tras el tratamiento con la dosis alta de B101-37 fue similar a la observada en los ratones B10RIII.BAMBI-KO inmunizados (Figuras 4C y 4D).
Al igual que en el modelo de CIA, el tratamiento con 2 mg/semana de B101-37 desde el momento de la administración de mañano a los ratones B1 ORI II normales redujo de forma muy significativa la severidad de las lesiones articulares y cutáneas en este modelo experimental de artritis psoriásica aguda inducido tras una inyección única de mañano, de forma similar a lo observado en los B10RIII.BAMBI-KO (Figura 5).
Los resultados anteriores demuestran un efecto preventivo del tratamiento con B101- 37 sobre el desarrollo de las lesiones cutáneas y articulares agudas inducidas tras la administración de una única inyección de mañano. Posteriormente, se analizó el potencial terapéutico de B101-37 en la variedad crónica de este modelo experimental. En la Figura 6 se muestra que la inyección semanal de mañano a los ratones B10RIII provoca la aparición lesiones articulares y cutáneas que se mantienen en el tiempo. El tratamiento preventivo con 2 mg/semana de B101-37 (iniciado desde el momento de la primera inyección de mañano y mantenido hasta el final del experimento) redujo de forma significativa la severidad de dichas lesiones a lo largo el estudio (Figura 6). Así mismo, se observó una disminución significativa, y similar a la observada con el tratamiento preventivo, de las manifestaciones cutáneas y articulares tras el inicio del tratamiento con B101-37 una vez que los primeros signos de la enfermedad ya eran evidentes (tres días después de la primera inyección de mañano (Figura 6).
El potencial terapéutico de B101-37 en psoriasis se confirmó en el modelo experimental de psoriasis cutánea más utilizado en la comunidad científica, la psoriasis inducida por imiquimod. La aplicación tópica de imiquimod durante 6 días consecutivos a ratones B10RIII no transgénicos induce lesiones cutáneas con características histológicas de psoriasis (Figura 7). A diferencia del modelo anterior, la administración de imiquimod no provoca el desarrollo de artritis. El tratamiento de los ratones B10RIII no transgénicos con B101-37, desde el momento de la primera aplicación de imiquimod y con la misma dosis usada en los modelos precedentes, redujo de forma significativa la severidad de la enfermedad desde el punto de vista clínico (Figura 7A) e histológico (Figura 7B), tal y como se observó en ratones B10RIII- BAMBI.KO.
Por último, valoramos el efecto terapéutico de B101-37 en el modelo experimental de colitis-DSS. Al igual que en los ratones B6.BAMBI-KO, los ratones B6 normales tratados con 2 mg/semana de B101-37 desde el momento de la administración de DSS desarrollaron una colitis significativamente menos severa que los controles no tratados (Figura 8A). Sin embargo, el efecto protector del tratamiento con B101-37 en los ratones B6 no fue tan importante como el observado en los animales BAMBI-KO, sobre todo en lo que respecta al grado de acortamiento del colon (Figura 8A, panel derecho). Cabe destacar que tanto en los animales B6 tratados con B101-37 como en los ratones BAMBI-KO se previno completamente la mortalidad asociada a la inducción de colitis-DSS (Figura 8B).
Por lo tanto, en la presente invención se demuestra el uso de anticuerpos frente a BAMBI para el tratamiento y prevención de enfermedades autoinmunes.

Claims

REIVINDICACIONES
1. Anticuerpo monoclonal que reconoce específicamente una secuencia de aminoácidos que comprende un péptido con al menos un 80% de identidad con SEQ ID NO: 1 , donde el tamaño de dicha secuencia de aminoácidos es de entre 15 y 30 aminoácidos.
2. Anticuerpo según la reivindicación 1 donde dicho anticuerpo reconoce específicamente la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
3. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID NO: 3 y/o una cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID NO: 4.
4. Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 donde el anticuerpo comprende una cadena pesada que comprende la secuencia SEQ ID NO: 5 y/o una cadena ligera que comprende la secuencia SEQ ID NO: 6.
5. Antisuero que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
6. Célula que expresa el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
7. Uso in vitro del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o del antisuero según la reivindicación 5 para la inhibición de BMP and Activin Membrane Bound Inhibitor (BAMBI).
8. Uso del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o del antisuero según la reivindicación 5 para la elaboración de un medicamento.
9. Uso del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o del antisuero según la reivindicación 5 para la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades autoinmunes.
10. Uso según la reivindicación 9 donde las enfermedades autoinmunes se seleccionan de la lista que consiste en: artritis autoinmune, espondiloartritis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y enfermedad inflamatoria intestinal.
1 1. Uso según la reivindicación 10 donde la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
12. Composición farmacéutica que comprende el anticuerpo monoclonal según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o el antisuero según la reivindicación 5.
13. Uso in vitro del anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o del antisuero según la reivindicación 5 para el cribado de fármacos.
14. Método de obtención de un anticuerpo monoclonal que reconoce una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia con al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1 que comprende:
a. obtener el suero previamente extraído de un animal no-humano inmunizado con una proteína recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende un péptido con al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1 ,
b. obtener un hibridoma a partir del suero de la etapa a) que genere anticuerpos monoclonales específicos frente a una secuencia de aminoácidos que comprende una secuencia con al menos un 80% de identidad con la secuencia SEQ ID NO: 1.
15. Método según la reivindicación 14, que comprende además una etapa (c) de aislamiento del anticuerpo monoclonal a partir del hibridoma generado en la etapa (b).
16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15 donde en la etapa (a) la secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, donde el animal no- humano es un mamífero que se selecciona de la lista que consiste en cerdo, chimpancé, ratón, rata, conejo y cobaya.
18. Kit y/o dispositivo que comprende el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el antisuero según la reivindicación 5 y/o cualquier combinación de los mismos.
19. Uso in vitro del kit y/o dispositivo según la reivindicación 18 para la detección de un péptido con al menos un 80% de identidad con SEQ ID NO: 1.
20. Uso in vitro del kit según la reivindicación 19 para la detección de la secuencia SEQ ID NO: 1 o SEQ ID NO: 2.
21. Uso in vitro del kit y/o dispositivo según la reivindicación 18 para el tratamiento y/o prevención de enfermedades autoinmunes.
22. Uso in vitro del kit y/o dispositivo según la reivindicación 21 donde las enfermedades autoinmunes se seleccionan de la lista que consiste en: artritis autoinmune, espondiloartritis, psoriasis, lupus eritematoso sistémico y enfermedad inflamatoria intestinal.
23. Uso in vitro del kit y/o dispositivo según la reivindicación 22 donde la enfermedad inflamatoria intestinal es colitis ulcerosa o enfermedad de Crohn.
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