WO2003100428A2 - Verfahren zu diagnostizierung eines tumors bei einem patienten durch bestimmung von pibf - Google Patents

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WO2003100428A2
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Eszter Nagy
Beata Polgar
Tamas Palkovics
Margit Lachmann
Christoph Klade
Tamas Henics
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Intercell Ag
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant protein with a progesterone-induced immunomodulating protein (PIBF) activity, a nucleic acid molecule which codes for a recombinant protein with a PIBF activity, a nucleic acid vector which has this nucleic acid sequence, a cell comprising this vector and a method for diagnosing a tumor in a patient.
  • PIBF progesterone-induced immunomodulating protein
  • progesterone - a steroid hormone with a broad immunosuppressive spectrum of effects - is an absolute necessity.
  • Peripheral lymphocytes of healthy pregnant women express nuclear receptors as sensors for this hormone (Szekeres-Bartho et al., J. Reprod. Immuno 1.16, 239 (1989); Szekeres-Bartho et al., Cell. Immuno 1. 125, 273 (1990 )), and produce a mediator protein called progesterone-induced blocking factor (PIBF) (Szekeres-Bartho et al., Am. J. Reprod. Immuno1. Microbiol. 9, 15 (1985)).
  • PIBF progesterone-induced blocking factor
  • the sequence of the human liver PIBF cDNA showed no substantial homology with that of any of the known proteins (HSPIBF, Acc. No. Y09631).
  • the encoded precursor protein is very hydrophilic and has a molecular weight of 89 kDa.
  • Naturally occurring PIBF as originally discovered, is a 34-36 kDa immunomodulating protein with a sequence length of 757 amino acids.
  • the concentration of PIBF in urine samples from healthy subjects was found to be about 1-10 ng / ml, whereas the concentration of PIBF in pregnant women from the 2nd trimester was in the range of about 70-150 ng / ml. These high amounts quickly return to normal after an abortion or labor.
  • PIBF which mediates the effects of progesterone, has a very strong immunomodulating function both in vitro and in vivo.
  • PIBF proved to be essential for pregnancy in the mouse model, since it was obtained from the culture supernatants of mouse lymphocytes isolated PIBF protects fetuses from absorption induced by antiprogesterone.
  • neutralizing antibodies against the mouse PIBF cause the resorption of embryos and consequently an abortus.
  • the important role of PIBF in human reproduction has also been confirmed by measuring the small amounts in the body fluids of pathological pregnancies. PIBF plays an important role in maintaining pregnancy, most likely by inhibiting natural killer lymphocytes.
  • NK cells peripheral blood lymphocytes containing NK (natural killer) cells. It has been found that there are at least two mechanisms of action of PIBF on NK cells: one is a direct inhibition of NK cell activity. NK cells kill their target cells by exocytosis of perforin and serine esterase-containing granules in the contact area between effector and target cells. Decidual lymphocytes - of which 60% carry NK surface markers - have a high perforin content, but they exert only a low level of cytotoxic activity.
  • activated NK cells find their targets and bind in the presence of PIBF, they do not release perforin from the storage granules and, as a result, the target cells do not lyse. It appears that PIBF paralyzes the NK cells and controls the cytotoxic mechanism by inhibiting degranulation and thereby the release of the killer substances.
  • TNF ⁇ tumor necrosis factor ⁇
  • Tm dominance helps reduce cell-mediated responses and improve B- Cells
  • T H ⁇ dominance leads to reduced humoral reactions and favors the cell immunological mechanisms.
  • Secreted PIBF facilitates the production of T H2 cytokines, such as IL-3, IL-4 and IL-10, whereas it suppresses T H ⁇ cytokines, such as IL-12 and IFN- ⁇ , both in vitro and in vivo.
  • T H ⁇ shift in vivo which is also a characteristic of failed pregnancies.
  • Cancer Malignant tumors, ie cancers, are the second leading cause of death in all developed countries after heart disease and occur in one in three people. One in four people dies of cancer. Cancer is primarily characterized by an increase in the number of abnormal or neoplastic cells that originate from normal tissue that grows to form a tumor mass, by the invasion of neighboring tissues by these neoplastic tumor cells, and by the generation of malignant cells that over the blood or lymphatic system reach regional lymph nodes and distant places. The latter progression to malignancy is called metastasis. Cancer can result from the breakdown of communication between neoplastic cells and their environment, including their normal neighboring lines. Both growth-stimulating and growth-inhibiting signals are routinely exchanged between cells within a tissue. Normally, cells do not divide in the absence of stimulating signals, and similarly they stop dividing when there are inhibitory signals. In the cancerous or neoplastic state, a cell acquires the ability to ignore these signals and to multiply under conditions in which normal cells would not grow.
  • Tumor cells have to acquire a number of different faulty features in order to multiply. This requirement is evidenced by the fact that the genomes of certain well-studied tumors have several different, independently modified genes, including activated oncogenes and inactivated tumor suppressor genes. Each of these genetic changes appears to be responsible for conferring some of these traits, which overall represent the complete neoplastic phenotype.
  • Tumor cells carry antigens that can be recognized as foreign to the body, and one of the main functions of the immune system is to eliminate such cells before they can form large tumors. This immune monitoring is clearly ineffective in patients with progressively malignant diseases.
  • a number of protective measures have been identified that suppress self-reactivity and that may represent a major barrier in the immune system's ability to wipe out tumor cells.
  • the tumors have an immunologically privileged state and grow without or with limited control by the immune system.
  • An object of the present invention is a new method for diagnosing a tumor in a patient which is easy and safe to carry out, which method does not require high-tech equipment, does not cause any particular inconvenience to the patient, which can be carried out quickly and gives results which allow a distinction between a patient with a tumor and a healthy patient.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for performing the method for diagnosing a tumor in a patient.
  • Yet another object of the present invention is to provide an effective anti-tumor medicine.
  • the method according to the present invention for diagnosing a tumor in a patient with which the above object is achieved comprises taking a sample from the patient, measuring the concentration of the PIBF (progesterone-induced blocking factor) or a derivative thereof or one of them Fragments of it in the sample and that Determine whether the concentration of the PIBF in the sample is above or below a predetermined threshold, the concentration above the threshold identifying a patient with a tumor.
  • PIBF progesterone-induced blocking factor
  • PIBF PIBF plays a role in the development or maintenance of immunological tolerance to malignantly transformed cells and is therefore a useful marker for tumor cells.
  • the method according to the present invention takes advantage of the fact that the concentration of PIBF in a sample taken from the patient to be tested is higher than the concentration of PIBF in a sample taken from a healthy person ,
  • the sample taken by the patient can be any type of sample that is liquid or not and can come from virtually any part of the body.
  • concentration of PIBF can be measured according to any method known in the art that enables the concentration of PIBF in a sample to be quantified. This can include chemical, microbiological, physical techniques, staining, etc. on liquids, tissue samples, etc. Possible methods include in vivo imaging using a computer tomograph (CT) and magnetic resonance image (Magnetic Resonance Image, MRI) after labeling with radionuclear or paramagnetic (e.g. gadolinium) labels.
  • CT computer tomograph
  • MRI magnetic resonance image
  • the PIBF may undergo metabolic or other changes in the patient's body, the PIBF may have modifications depending on which sample was taken from the patient. For example, the PIBF may have been cleaved so that only a fragment of the PIBF in the existing sample is available. The PIBF may also have been modified so that a derivative of the PIBF is present in this sample or a fragment of this derivative. It was also shown that alternatively processed PIBF mRNAs are present in tumor cells in a different concentration compared to normal cells, which is why proteins or fragments which are translated from these different forms of mRNA molecules or fragments thereof, also from the expression "fragments "are included.
  • a PIBF derivative or a fragment of the PIBF or the PIBF derivative or PIBF-related substances can also be used as an indication of the concentration of the PIBF in the patient , and therefore the particular concentration can be used for the method for diagnosing a tumor in a patient according to the present invention.
  • PIBF or fragments thereof refers - without being restricted thereto - to sequences according to SEQ ID No. 1, 3, 4, 6, 8, 10, 14, 15, 17, 19, 20 , 23, 25, 27, 29, 31, 32, 34 and 36 or fragments or derivatives thereof. Therefore, examples of PIBF or fragments thereof that can be detected or quantified according to the present invention are these sequences mentioned above. Since it was shown that exons 17 and 18 are included in almost all identified mRNA forms, PIBF fragments which have exons 17 and 18 (cf. the figures) are preferred for the detection or quantification of PIBF in a sample used.
  • the fragment of the PIBF or the PIBF derivative can comprise, for example, less than 715 amino acids, preferably less than 500 amino acids, more preferably less than 200 amino acids, and most preferably less than 50 amino acids.
  • derivative includes, for example, all natural or non-naturally occurring modifications, for example cleavage, Glycosylations, methylations, acetylations, amidations, phosphorylations, sulfations, deletions, substitutions, etc.
  • threshold value also refers to a concentration value which will generally be the mean sample concentration of PIBF in healthy sample donors. It is possible to take a known general mean PIBF concentration in healthy people according to the literature or to determine the sample concentration of PIBF in healthy donors in the practice of the present invention.
  • the threshold can also be determined for healthy (normal) samples that were previously taken (in the healthy state) by the same person. Examples of such threshold values can be, for example, between 1 and 10 ng / ml, preferably between 1 and 5 ng / ml, the concentration depending on the detection method and the type of tumor.
  • the threshold value can be zero if alternatively processed PIBF-mRNA products are only present in tumor cells and not in healthy cells. Therefore, the threshold value also depends on the PIBF molecule and must be determined individually for each specific PIBF molecule.
  • the threshold it is important that the healthy person does not take the sample from a pregnant woman, since the PIBF concentration in samples from pregnant women is higher than the PIBF concentration in samples from non-pregnant women.
  • the PIBF concentration measured in the patient's sample which is above the predetermined threshold, identifies individuals suspected of having a tumor.
  • a "tumor” as used herein means any neoplastic cell growth and proliferation, whether malignant or benign, and all pre-cancerous and cancerous cells and tissues.
  • the term “patient” includes patients with a tumor, but also patients for whom there is a possibility that they have a tumor, as well as healthy people who are undergoing a routine routine check-up.
  • the term “patient” can also include any animal, in particular mouse, rat, guinea pig, monkey, the animal preferably being a laboratory animal used for analyzes, for example for the detection of specific tumors, for testing anti-tumor substances or carcinogenic substances is.
  • the animal can be a genetically modified animal which has a predisposition to the formation of tumors.
  • pregnancy also leads to increased PIBF levels, sexually active women must be tested using conventional pregnancy tests (e.g. due to hCG) before they are considered to be patients with a tumor. It also means that if the patient is a pregnant woman who is past the first trimester, it is very difficult to use this test to detect tumor growth.
  • pregnancy-related malignancies are related to the uncontrolled growth of pregnancy-related tissues (such as trophoblast cells in Mola hydatidosa)
  • extremely high levels of PIBF > 150-200 ng / ml
  • the tumor to be diagnosed with the method according to the present invention is an epithelial carcinoma. Since the vast majority of human tumors (based on worldwide mortality data) are epithelial carcinomas (lung, breast, colon, etc.), the method according to the present invention is particularly advantageous for the diagnosis of this type of tumor.
  • the epithelial carcinoma is preferably a colon carcinoma or a breast carcinoma, a lymphoma, a larynx carcinoma, a tumor of the urinary tract, in particular a bladder carcinoma, a lung tumor, a leukemia, a plasmacytoma, a myeloma, in particular myeloma multiplex, a myeloproliferative neck or a head and neck disease -Tumor.
  • the PIBF concentration in samples taken from patients with the above-mentioned tumors is particularly high compared to PIBF concentrations in samples from healthy ones Patients.
  • a concentration above the threshold value identifies individuals suspected of having a tumor.
  • a concentration below the threshold does not necessarily rule out the presence of a tumor in certain cases.
  • the sample is a body fluid, preferably urine or serum.
  • the body fluid can be taken in any laboratory or even in the patient's home and is particularly advantageous for routine diagnosis, diagnosis in a patient who is very weak and for regular checks on the progression of the tumor in a patient.
  • the PIBF concentration can be determined, for example, using a dry chemistry method, e.g. with a strip that changes color depending on the PIBF concentration in a sample in which it is immersed.
  • the sample is a tissue sample.
  • a method according to the present invention in which a tissue sample from the patient is used, enables the tumor to be localized directly, especially when taking different tissue samples and be compared with each other. It is also possible to follow the progression of the tumor directly.
  • the method according to the present invention can also be used at least as an additional method for deciding whether tissue and which parts of a patient's body need to be surgically removed.
  • the threshold is the concentration of the PIBF in a sample of a healthy person.
  • Threshold particularly precise when it is the mean concentration of the PIBF of a plurality of samples from healthy people.
  • the threshold value is preferably determined by measuring the concentration of the PIBF in a sample of at least one healthy person in parallel with the determination of the concentration of the PIBF in a sample of the patient. Since the measured concentration depends on the method of measuring the PIBF concentration, the diagnosis is more specific and accurate if the method of measuring the PIBF concentration in the patient's sample and in the sample of the healthy person are identical.
  • the sample of the patient and the sample of the healthy person are preferably measured in parallel, e.g. at the same time to avoid any disturbing parameters, e.g. Eliminate temperature, buffers, etc. that have an impact on the result.
  • the sample of the healthy person is preferably measured in parallel as a "negative sample".
  • the concentration of the PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof in a sample which has a specific concentration of PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof is advantageously measured in parallel with the determination of the PIBF concentration in the sample of the patient ,
  • the parallel measurement of the positive control enables the results to be checked and any divergence in the process to be determined.
  • the PIBF concentration in the sample is preferably measured immunologically, in particular by means of a competitive test, a sandwich test, by immunostaining ("immunostaining") or combinations of these methods. Any immunological method known to those skilled in the art can be used. Immunological methods or very sensitive methods for the detection of molecules are therefore particularly advantageous for measuring the PIBF concentration in the sample.
  • immunological methods it is necessary to have at least one anti-PIBF antibody that specifically binds to PIBF, derivatives thereof or fragments thereof.
  • the Antibody can be monoclonal or polyclonal and can also be recombinant. Humanized monoclonal or phage encoded monoclonal single chain antibodies can also be used.
  • Examples of recombinant anti-human PIBF monoclonal antibodies that can be used as described above are at Hybridorn Cell Bank at the Medical Faculty of the University of Pecs, Department of Immunology and Biotechnology, Hungary, under accession numbers 11 through 14 / 2001, cell line codes HYB 255-258.
  • Single chain antibodies are structurally defined to include the binding portion of a first polypeptide from the variable region of an antibody in conjunction with the binding portion of a second polypeptide from the variable region of an antibody, the two polypeptides being linked by a peptide linker that connects the first and second polypeptides into a single polypeptide chain.
  • the single polypeptide chain thus comprises a pair of variable regions linked by a polypeptide linker.
  • the regions can combine to form a functional antigen binding site, as in the case where the regions comprise a variable region pair with a light chain and a heavy chain with corresponding pairwise complementary determining regions (CDRs).
  • humanized antibody as used herein means antibody molecules in which amino acids in the known antigen binding reagents have been replaced for greater similarity to a human antibody, while maintaining the original binding ability.
  • the antibodies can be generated using methods well known in the art. Such antibodies include, but are not limited to, polyclonal, monoclonal, recombinant, chimeric, single chain antibodies, Fab fragments, and fragments generated from a Fab expression library. neutralizing Antibodies (ie those that inhibit dimer formation) are particularly preferred for therapeutic use.
  • PIBF protein or any fragment or oligopeptide thereof that has immunogenic properties, or one PIBF-DNA (fragment) can be immunized.
  • various adjuvants can be used to increase the immunological response.
  • adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant, mineral gels such as aluminum hydroxide, and surface-active substances such as lysolecithin, Pluronic polyols, polyanions, aluminum, polycations (e.g.
  • polyArg polyArg
  • peptides amino acids
  • oil emulsions keyhole limpets -Hemocyanin (keyhole limpet hemocyanin)
  • dinitrophenol dinitrophenol.
  • BCG Bacilli Calmette-Guerin
  • Corynebacterium parvum are particularly preferred.
  • the peptides, fragments or oligopeptides used to induce antibodies to PIBF have an amino acid sequence consisting of at least five amino acids and, more preferably, at least 10 amino acids. It is also preferred that they are identical to part of the amino acid sequence of the natural protein. Short stretches of PIBF amino acids can be fused to those of another protein, such as the keyhole limpet hemocyanin, and antibodies raised against the chimeric molecule.
  • Monoclonal antibodies to PIBF can be made using any technique that involves the generation of antibody molecules by continuous cell lines in culture. These include, but are not limited to, the hybridoma technique, the human B cell hybridoma technique and the EBV hybridoma technique.
  • chimeric antibodies can splicing mouse antibody Genes to human antibody genes can be used to obtain a molecule with appropriate antigen specificity and biological activity.
  • techniques described for the generation of single chain antibodies can be adapted using prior art methods to generate PIBF specific single chain antibodies.
  • Antibodies with related specificity, but with a different idiotypic composition can be generated by chain shuffling from randomized combinatorial immunoglobulin libraries.
  • Antibodies can also be raised by inducing in vivo production in the lymphocyte population or by screening recombinant immunoglobulin libraries or groups of highly specific binding reagents.
  • Antibody fragments containing specific binding sites for PIBF can also be made.
  • these fragments include, but are not limited to, the F (ab ') 2 fragments that can be generated by pepsin digestion of the antibody molecule and the Fab fragments that can be obtained by reducing the disulfide bridges of the F (ab ') 2 fragments can be generated.
  • Fab expression libraries can be constructed to allow quick and easy identification of monoclonal Fab fragments with the desired specificity.
  • Various immunoassays can be used for screening to identify antibodies with the desired specificity.
  • Numerous protocols for competitive binding or immunoradiometric assays using either polyclonal or monoclonal antibodies with established specificities are well known in the art.
  • Such immunoassays typically involve measuring the complex formation between PIBF and its specific antibody.
  • a monoclonal-based two-site immunoassay using monoclonal antibodies reactive to two independent PIBF epitopes is preferred, but a competitive binding assay can also be used.
  • the concentration of the PIBF in the sample is measured by a competitive test.
  • a solid phase is covered with preferably recombinant human PIBF (or its variants) with a specific concentration.
  • Labeled anti-PIBF antibodies are added together with the examples to be measured.
  • the absolute concentration of the PIBF can be determined on the basis of these readings. This is a particularly precise method, especially if the sample is a body fluid, and can be carried out, for example, by means of ELISA.
  • the concentration of the PIBF in a sample is measured by means of a sandwich test.
  • This test requires two anti-PIBF antibodies, each of which binds to a different epitope of the PIBF molecule.
  • the first anti-PIBF antibody is preferably immobilized on a solid support, after which the sample to be measured is added so that the PIBF present in the sample binds to the first anti-PIBF antibody.
  • a second anti-PIBF antibody which is preferably labeled, is added so that it binds to the bound PIBF.
  • the amount of bound second anti-PIBF antibody is measured and used as an indication of the absolute concentration of the PIBF in the sample.
  • This method is also preferably used if the sample to be measured is a body fluid of the patient and can be carried out by means of ELISA.
  • the concentration of the PIBF in a sample is measured by means of immunostaining.
  • This method is preferably used when the sample to be measured is a tissue sample from the patient.
  • the anti-PIBF antibody is added directly to the patient's tissue sample, where it binds to the PIBF present in the tissue sample.
  • the bound antibody is quantified there by directly indicating the concentration of the PIBF in the tissue sample.
  • the PIBF concentration is measured indirectly by measuring the concentration of PIBF mRNA in the sample.
  • Polynucleotides including oligonucleotide sequences, antisense RNA and DNA molecules and PNAs can be used for this.
  • the polynucleotides can be used to detect and quantify gene expression in samples in which the expression of PIBF is associated with a tumor.
  • a kit can be provided which comprises a reagent having the above (labeled) polynucleotides to perform a PIBF mRNA measurement in the particular sample.
  • concentration of alternatively processed mRNA can also provide information as to whether the cells are tumor cells or not.
  • hybridization with nucleotide probes can be used to identify PIBF mRNA sequences.
  • Nucleotide sequences that are complementary to the PIBF mRNA can be labeled using standard methods and added to a patient's fluid or tissue sample under conditions suitable for the formation of hybridization complexes. After an appropriate incubation period, the sample is washed and the signal is quantified and compared to the threshold.
  • the specificity of the probe determines whether it is made from a highly specific region or from a less specific region, and the stringency of the hybridization (maximum, high, medium or low) determine whether the probe only contains naturally occurring sequences which code for PIBF, alleles, or related sequences are identified.
  • Probes used for the hybridization of PIBF-mRNA (related) sequences should preferably have at least 50%, preferably 70%, even more preferably 90%, homology with the PIBF-coding sequence or fragments thereof.
  • the hybridization probes of the present invention can be DNA or RNA and from the nucleotide sequence of SEQ ID. No.3 (PIBF cDNA). Examples of such PIBF mRNA molecules to be detected and / or quantified are, for example, those which are detected by DNA or RNA which are derived from the nucleotide sequence of SEQ ID No. 5, 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35 and 37.
  • exons 17 and 18 are included in almost all identified mRNA forms, it is preferred to use DNA or RNA that comes from a sequence coding for exons 17 and 18 (cf. the figures) for detection or Quantification of PIBF mRNA used in a sample.
  • Hybridization probes can be labeled using a wide variety of marker groups, for example radionucleotides, such as 32P or 35S, or enzymatic labels, such as alkaline phosphatase, which is coupled to the probe via avidin / biotin coupling systems, etc.
  • marker groups for example radionucleotides, such as 32P or 35S, or enzymatic labels, such as alkaline phosphatase, which is coupled to the probe via avidin / biotin coupling systems, etc.
  • polynucleotide sequences coding for PIBF can also be used in Northern blot analysis, dot blot or other membrane-based techniques; with dip stick, pin, ELISA or (micro) chip tests using liquids or tissues from patient biopsies to detect PIBF mRNAs. Such methods are well known in the art.
  • PIBF mRNA can be detected and measured using RT-PCR:
  • a first step the mRNA is transcribed into cDNA by reverse transcriptase, after which the cDNA is detected and quantified using PCR.
  • the oligomers for the PCR can be synthesized chemically, generated enzymatically, or produced from a recombinant source. Oligomers preferably consist of two nucleotide sequences, one with sense and another with antisense orientation, which are used under optimized conditions to identify the specific sequence. The same two oligomers, "nested" sets of oligomers, or even a degenerate pool of oligomers can be used under less stringent conditions for the detection and / or quantification of closely related sequences.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for determining the positive or negative progression of a tumor in a patient, comprising diagnosing a tumor in a patient according to one of the above-mentioned methods according to the present invention, and determining whether the measured concentration of the PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof in the sample above or below at least a previously measured concentration of the PIBF or a derivative thereof or fragment thereof in at least one sample previously taken from the same patient, a concentration above the previously measured concentration being a positive progression identified. Since the concentration of the PIBF in a sample is directly proportional to the progression of the tumor, for example size, development, etc., the method according to the present invention enables a direct analysis of the course of the disease.
  • an anti-PIBF antibody or a fragment thereof in a method according to the present invention described above.
  • the anti-PIBF antibody can be monoclonal, polyclonal, further recombinant, humanized, or a single chain antibody encoded by phages. If only a fragment of the antibody is used, this fragment comprises the epitope of the anti-PIBF antibody, which recognizes the PIBF.
  • the monoclonal antibody can be produced as mentioned above, and the examples given above also apply here.
  • Another aspect of the present invention relates to Use of PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof in one of the above mentioned methods according to the present invention.
  • the fragment can be a fragment of the PIBF or a fragment of the PIBF derivative.
  • the same definitions and preferred embodiments or examples apply as mentioned above.
  • the PIBF is recombinant, which means that the derivative or fragment can also be recombinant.
  • Another aspect of the present invention relates to a set which has a first reagent which has at least one anti-PIBF antibody or a fragment thereof and a second reagent which has PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof in a specific concentration, includes.
  • the anti-PIBF antibody and the PIBF are present in a form that enables their storage, e.g. in dry, lyophilized, frozen or dissolved form.
  • the set can contain any other buffers, enzymes, salts etc. which are necessary for carrying out the above-mentioned method.
  • the set preferably comprises a solid phase to which the at least one anti-PIBF antibody or the fragment thereof or the PIBF or the derivative thereof or the fragment thereof is bound.
  • the solid phase can be any solid phase known to those skilled in the art, e.g. any insoluble material that can constitute a substrate on which the proteins or peptides can be immobilized, for example in the form of a dry strip. Such substrates can include nylon, amino acids, glass, cellulose and the like. counting.
  • the set can preferably be used for a competitive or a sandwich test, the further reagent, which has either the antibody or the PIBF, depending on which is immobilized on the solid phase, and the sample is added to the solid phase.
  • the PIBF present in the set mentioned above is recombinant, which of course means that the derivative thereof or the fragment thereof are also recombinant.
  • a preferred set comprises a further reagent with a second anti-PIBF antibody or a fragment thereof which binds to an epitope of the PIBF which is different from the epitope recognized by the first anti-PIBF antibody or its fragment. This set is particularly advantageous for carrying out a sandwich test.
  • the above-mentioned set according to the present invention is preferably used to diagnose a tumor in a patient or to determine the progression of a tumor in a patient.
  • the procedures are the same as described above, with the reagent comprising the PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof in the determined concentration either as a positive control as described above or for carrying out a competitive test as described above. (where it is used in competition with the PIBF present in the patient's sample) or for both.
  • Another aspect of the present invention relates to the use of an anti-PIBF antibody or a fragment thereof for the production of an anti-tumor drug.
  • the anti-PIBF antibody or fragment thereof specifically blocks or neutralizes PIBF, thereby specifically eliminating PIBF activity in tumors and thus making the tumors susceptible to NK (and potentially CD8 + and other T cell-mediated lysis) be made.
  • mono- and bi-specific antibodies can specifically recognize PIBF on the surface of tumor cells and can be used to deliver toxic substances to the tumorous compartment of the patient's body.
  • the main strategy of the anti-tumor drug is to use the knowledge that tumor cells produce higher PIBF concentrations. With this information, which forms the basis of the present invention, various strategies for combating a tumor in a patient can be developed.
  • the antibody is a monoclonal, humanized or single chain antibody.
  • the above-mentioned deposited antibodies can also be used for this aspect of the present invention.
  • the antibody preferably has a molecule attached to it.
  • the anti-PIBF antibody is used as the targeting or delivery mechanism to target a molecule, e.g. a pharmaceutical agent to deliver to cells or tissues that express PIBF.
  • the antibody that is administered to the patient binds to the tumor expressing PIBF, thereby bringing the molecule that is toxic to the tumor into direct contact with the tumor.
  • a toxic molecule can be used that penetrates the tumor cells and interferes with essential metabolic steps, for example, whereby it kills the cells.
  • the toxic molecule can also induce cell lysis or act as a receptor for other toxic substances or enzymes that kill the tumorous cells.
  • the most important thing, regardless of the way in which the toxic molecule acts, is that the anti-PIBF antibody directs the molecule specifically to the tumorous cells and does not interfere with healthy cells.
  • the molecule can preferably be a toxic substance or a prodrug, in particular a radionuclide, a toxin or a chemotherapeutic drug.
  • a radionuclide e.g. a radionuclide
  • a toxin e.g. a toxin
  • a chemotherapeutic drug e.g. a radionuclide
  • Another aspect of the present invention relates to the use of the PIBF or a derivative thereof or fragment thereof for the manufacture of an anti-tumor drug. According to the present invention, there are two strategies for these anti-tumor drugs:
  • a PIBF derivative or a fragment thereof is used as an inhibitory protein or peptide which interferes with the PIBF effect by binding putative receptors for PIBF which are present on cells, for example NK cells, and thereby blocking them or inactivated, or downstream signaling components inhibits receptor binding.
  • the medicament is a vaccine.
  • the PIBF derivative or fragment thereof has the immunogenic peptide of PIBF and can be used for vaccination either to induce antigen-specific cytotoxic anti-tumor T cell responses and / or to produce neutralizing antibodies by the immune system of the To stimulate cancer patients themselves, which would free the NK cells from suppression by PIBF.
  • the vaccine preferably has an adjuvant.
  • an adjuvant can be, for example, but not exclusively, Freund's mineral gels such as aluminum hydroxide and surface-active substances such as lysolecithin, Pluronic polyols, polyanions, polycations (e.g. polyArg), peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanin and dinitrophenol ,
  • adjuvants preferred for use in humans include BCG (Bacilli Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum.
  • the PIBF or the derivative thereof or the fragment thereof is preferably recombinant or a chemically synthesized molecule.
  • An advantageous aspect of the present invention relates to the use of a polynucleotide which codes for PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof, or a PIBF antisense molecule for the production of an anti-tumor medicament.
  • the expression “polynucleotide coding for PIBF” or “nucleotide sequences complementary to the PIBF mRNA” refers to a sequence which originates from a sequence which is preferably selected from the group consisting of SEQ ID No. 3, 5 , 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37 or fragments or derivatives thereof.
  • Genes coding for PIBF can be switched off by transforming a cell or tissue with expression vectors, the large amounts of a polynucleotide or a derivative thereof or a fragment thereof coding for PIBF.
  • Such constructs can be used to introduce untranslatable sense or antisense sequences into a cell. Even if there is no integration into the DNA, such vectors can continue to transcribe RNA molecules until they are switched off by endogenous nucleases.
  • Temporary expression can take a month or more for a non-replicating vector, and even longer if suitable replication elements are part of the vector system.
  • Modifications of gene expression can be made by designing antisense molecules, DNA, RNA or PNA, to the control regions of the gene coding for PIBF, i.e. of promoters, enhancers and introns. Oligonucleotides derived from the transcription initiation site, e.g. between positions -10 and +10 from the start point are preferred. Similarly, inhibition can be achieved using the "triple helix" base pairing methodology. Triple helix pairing is useful because it inhibits the ability of the double helix to open sufficiently for polymerase, transcription factor, or regulatory molecule binding.
  • the antisense molecules can also be designed to block translation of the mRNA by preventing the transcript from binding to ribosomes.
  • antisense refers to nucleotide sequences that are complementary to a specific DNA or RNA sequence. Antisense molecules can be made by any method, including synthesis by ligating the gene (s) of interest in reverse orientation to a virus promoter that enables the synthesis of a complementary strand. Once inserted into a cell, this transcribed strand combines with the natural sequences produced by the cell to form duplexes. These duplexes then block either further transcription or translation.
  • antisense molecules can be used to the polynucleotide encoding PIBF in situations where it would be desirable to transcribe the mRNA To block.
  • cells can be transformed with sequences that are complementary to polynucleotides coding for PIBF.
  • antisense molecules can be used to modulate PIBF activity or to regulate gene function. Such a technique is well known in the art, and sense or antisense oligomers or larger fragments can be designed from various locations along the coding or control regions of sequences encoding PIBF.
  • Expression ectors derived from retroviruses, adenovirus, herpes or vaccinia viruses or from various bacterial plasmids can be used to deliver nucleotide sequences to the targeted tumorous organ, tissue, or the cell population. Methods that are well known to those skilled in the art can be used to construct recombinant vectors that express antisense molecules that are complementary to the polynucleotides of the gene encoding the PIBF.
  • Ribozymes enzymatic RNA molecules
  • the mechanism of the ribozyme action includes the sequence-specific hybridization of the ribozyme molecule to a complementary target RNA, followed by endonucleolytic cleavage. Examples that can be used include manufactured hammerhead motif ribozyme molecules that can specifically and efficiently catalyze the endonucleolytic cleavage of sequences encoding PIBF.
  • RNA sequences of between 15 and 20 ribonucleotides can be evaluated for secondary structural features that could render the oligonucleotide inoperable.
  • the suitability of the candidate goals can also be tested by testing the accessibility to a hybridization complementary oligonucleotides can be evaluated using ribonuclease protection assays.
  • Antisense molecules and ribozymes of the invention can be made by any method known in the art for the synthesis of nucleic acid molecules. These include techniques for the chemical synthesis of oligonucleotides, such as chemical solid-phase phosphoramidite synthesis. Alternatively, RNA molecules can be generated by in vitro and in vivo transcription of DNA sequences coding for PIBF. Such DNA sequences can be incorporated in a variety of vectors with suitable RNA polymerase promoters, such as T7 or SP6. Alternatively, these cDNA constructs, which synthesize antisense RNA constitutively or inducibly, can be introduced into cell lines, cells or tissues.
  • RNA molecules can be modified to increase intracellular stability and half-life. Possible modifications include, but are not limited to, the addition of flanking sequences at the 5 'and / or 3' end of the molecule or the use of phosphorothioate or 2 '-O-methyl instead of phosphodiesterase bonds within of the molecular scaffold. This concept is inherent in the production of PNAs and can be expanded in all of these molecules by the inclusion of non-traditional bases such as inosine, queosine and wybutosine as well as acetyl, methyl, thio and similarly modified forms of adenine, cytidine, guanine, Thymine and uridine, which are not easily recognized by endogenous endonucleases.
  • vectors can be inserted into stem cells that have been removed from the patient and have been clonally propagated for the purpose of autologous re-transplantation in the same patient (allogeneic stem cell transplantation). Insertion by transfection and by liposome injections can be accomplished using methods well known in the art.
  • Any of the anti-tumor drugs described above can be used on any suitable subject, including, for example, mammals such as dogs, cats, cows, horses, rabbits, monkeys and, most preferably, humans.
  • Another aspect of the present invention is a method of treating a patient with a tumor, the method comprising administering to the patient an effective amount of an anti-PIBF antibody or a fragment thereof.
  • Another aspect of the present invention relates to a method of treating a tumor in a patient, which method comprises administering an effective amount of PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof.
  • Another preferred aspect of the present invention relates to a method for treating a tumor in a patient, the method comprising the administration of an effective amount of a polynucleotide which codes for PIBF or for a derivative thereof or a fragment thereof or for PIBF antisense molecule, includes.
  • Another aspect of the present invention relates to a pharmaceutical preparation for the treatment of a tumor in a patient, the preparation comprising an anti-PIBF Antibody or a fragment thereof, PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof, and polynucleotide-encoded PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof or a PIBF antisense molecule.
  • an anti-PIBF Antibody or a fragment thereof PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof
  • polynucleotide-encoded PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof or a PIBF antisense molecule polynucleotide-encoded PIBF or a derivative thereof or a fragment thereof or a PIBF antisense molecule.
  • the pharmaceutical composition can be administered alone or in combination with at least one other agent, such as a stabilizing compound, which can be administered in any sterile, biocompatible pharmaceutical carrier, including but not limited to saline, buffered saline, dextrose and water.
  • a stabilizing compound which can be administered in any sterile, biocompatible pharmaceutical carrier, including but not limited to saline, buffered saline, dextrose and water.
  • the pharmaceutical preparations can be administered to a patient alone or in combination with other agents, drugs or hormones.
  • the pharmaceutical preparations used in the method of treating a tumor in a patient can be administered in a number of ways, including, but not limited to, oral, intravenous, intramuscular, intraarterial, intramedullary, intrathecal, intraventricular, transdermal, subcutaneous, intraperitoneal, intranasal, enteral , topical, sublingual or rectal.
  • these pharmaceutical compositions can have suitable pharmaceutically acceptable carriers, including excipients and excipients, which facilitate the processing of the active compounds into preparations which can be used pharmaceutically.
  • suitable pharmaceutically acceptable carriers including excipients and excipients, which facilitate the processing of the active compounds into preparations which can be used pharmaceutically.
  • the carriers enable the pharmaceutical preparations to be formulated as tablets, pills, dragées, capsules, liquids, gels, syrups, slurries, suspensions and the like. Like ..
  • the present invention also relates to a recombinant protein with a PIBF activity according to SEQ. ID.Nr.1 and derivatives thereof.
  • This PIBF protein according to the present invention has the full PIBF activity, comparable to natural PIBF (comprising the sequence according to SEQ. ID. R.2), but does not have the exact amino acids 595 to 614 and amino acid No. 333 according to the natural PIBF sequence (SEQ. ID.Nr.2).
  • the protein sequence of the recombinant PIBF protein according to the present invention (SEQ. ID. No. 1) comprises 757 amino acid residues.
  • the present invention therefore sees new recombinant PIBF proteins with the SEQ. ID.Nr.1 or derivatives or homologues thereof. Therefore, the recombinant protein having a PIBF activity according to the present invention comprises
  • a PIBF activity of at least 50% of the natural human PIBF molecule is at least 50% of the natural human PIBF molecule.
  • PIBF activity can be defined and quantified as NK or CTL inhibition.
  • NK inhibition is assumed when, in the presence of PIBF, the otherwise efficient effector cells (tested in the absence of PIBF) are paralyzed, ie either recognition and binding (conjugation) or killing of the target cells as a result of the PIBF concentration is reduced.
  • the activity can be expressed as percent inhibition / ⁇ g PIBF or similar substances compared to no PIBF. This applies in a similar way to CTL inhibitory activity (Szekeres-Bartho et al., Cell. Immunol. 177 (1997), 194-199, Szekeres-Bartho et al., Am. J. Reprod. Immunol.
  • the PIBF activity can be shown as Th2 enhancement by quantifying T 2 (IL-3, IL-4, IL-6, IL-10) - to Thl (IL-12, IFN- ⁇ ) lymphokines either Protein or RNA level is measured, and subsequent determination of the ratio of the Th2 signals to the Thl signals is determined, defined and quantified.
  • Th2 and a simultaneous decrease in Thl cytokines indicate Th2 enhancement. It can be expressed as an increase in the percentage of Th2-cytokine-positive or a decrease in the percentage of Th1-cytokine-positive peripheral blood mononuclear cells (PMBCs) / ⁇ g PIBF become.
  • cytokine mRNAs can be determined using standard RT-PCR-based quantification tests, Szekeres-Bartho et al. , AJRI 35 (1996), 348-351, Szekeres-Bartho et al. , Am.J.Reprod. Immunol. 23, 26, (1990), Szekeres-Bartho et al., Am.J. Ob. Gyn. 163, 1320 (1990) can be measured.
  • the recombinant protein has an amino acid sequence as indicated by amino acid residues 300 to 350 in SEQ. ID No. l specified on.
  • Amino acid No. 333 in natural human PIBF protein (SEQ. ID.Nr.2) is Cys instead of Arg in the recombinant PIBF protein according to the present invention (SEQ. ID.Nr .1). Therefore, the recombinant protein according to the present invention preferably has an Arg as amino acid No. 333 according to SEQ. ID.l and a considerable PIBF activity (> 50%). However, it may have additional amino acid residues at either or both ends, which are identical to the amino acid residues in SEQ. ID.Nr.1 identical, homologous to or different from these, as long as the recombinant protein has a PIBF activity of at least 50% of the natural human PIBF molecule.
  • the recombinant protein has an amino acid sequence as indicated by amino acid residues 580 to 630 in SEQ. ID.Nr.1 indicated, and considerable PIBF activity (> 50%).
  • This recombinant protein therefore has the sequence of the PIBF according to the invention between amino acid residues 580 to 630 in SEQ. ID.l on. It can furthermore have further amino acid residues either at one or at both ends, which correspond to the amino acid residues in SEQ. ID.NO.1 are identical, homologous to, or different from, as long as the recombinant protein has a PIBF activity of at least 50% of a natural human PIBF molecule.
  • a protein having a PIBF activity comprising
  • amino acid sequence according to SEQ. ID.Nr. 4 or
  • This protein was found to be an 89 kDa protein with PIBF activity that was isolated from a mouse.
  • This amino acid sequence is particularly advantageous with regard to the aspects of the detection, diagnosis and analysis of tumors, anti-tumor substances, carcinogenic substances in mice, but also in other laboratory animals. Furthermore, tests on animals, e.g. Mice, guinea pigs, hamsters, rats, with a predisposition to a tumor.
  • Another aspect relates to animals, especially mice, in which this protein is inhibited or its activity is blocked. This can e.g. by providing analogs of the binding partners of this protein.
  • a preferred aspect of the present invention relates to a protein which has an amino acid sequence with an identity of at least 85%, preferably at least 90%, even more preferably at least 95%, as determined by means of the FAST / A algorithm, with a sequence selected from the group consisting of the SEQ. ID. r. 6, 8, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 23, 25, 27, 29, 31, 32, 34 and 36, this protein being an alternatively processed PIBF protein. It was shown that alternatively processed mRNA molecules are present in different tissues and therefore also express alternatively processed proteins. Surprisingly, these alternatively processed proteins are located in another in tumor tissues Concentration before, compared to the healthy tissues. This can be used advantageously for the detection and analysis of tumors in a sample, in particular the SEQ. ID.Nr.
  • PIBF 6 and 8 are preferred because these are two smaller forms of PIBF found in primary human tumors, the SEQ. ID.Nr. 6 in gastric adenocarcinoma and the SEQ. ID.Nr. 8 in endo etrium adenocarcinoma. Counterparts from the normal tissue of the same patient did not express any detectable amounts of these PIBF mRNA splice variants. However, it was also shown that exons 17 and 18 are included in almost all identified forms. Peptides that have these exons are therefore particularly advantageous.
  • the term "alternatively spliced PIBF proteins” refers to proteins derived from proteins with PIBF activity.
  • the present invention provides a nucleic acid molecule which codes for the recombinant protein described above with a PIBF activity according to the present invention. It is of course further possible that the nucleic acid molecule has an additional sequence that codes for at least a second protein that is different from the PIBF protein, thereby providing a nucleic acid sequence that codes for a fusion protein that has at least in part a peptide with PIBF activity.
  • mouse nucleic acid molecule e.g. SEQ. ID No. 5 or a fragment thereof
  • this is preferably used to generate "knock-out" mice, i.e. from mice in which the expression of the PIBF gene or a fragment thereof is blocked or inhibited. This is done, for example, by providing an antisense mouse PIBF nucleic acid molecule or a fragment thereof, which strategy is described above.
  • Another aspect of the present invention therefore relates to "knock-out" mice which have an inhibited or reduced expression of the active PIBF protein.
  • nucleic acid molecule which encodes an alternatively processed PIBF protein comprising a nucleic acid sequence with an identity of at least 80%, preferably at least 90%, even more preferably, at least 95%, with a sequence selected from the group consisting of SEQ. ID. No. 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35 and 37 or
  • nucleic acid sequences that alternatively correspond to spliced mRNA molecules that are found in various tissues, in particular the SEQ. ID.Nr.7 and the SEQ. ID.Nr.9 refer to alternatively spliced mRNA molecules that were only found in tumor tissues, whereas normal tissues did not have these mRNA sequences. Therefore, these are particularly advantageous for the detection or analysis of tumors and of healthy cells and tissues.
  • the present invention relates to a nucleic acid vector which has a nucleic acid sequence according to the invention.
  • mRNA is produced which provides an RNA strand for the translation of a recombinant protein with PIBF activity according to the present invention or a protein according to the invention.
  • the regulatory element can be any suitable element known to those skilled in the art, particularly a specific promoter selected according to the specific host into which the vector is to be introduced to achieve maximum recombinant protein production.
  • the regulating element can furthermore have enhancers which increase the transcription.
  • the nucleic acid vector preferably has a selection marker.
  • the selection marker can be any suitable marker known to those skilled in the art to select cells or host organisms in which the vector is has been introduced. Such a selection marker can be, for example, any gene which codes for a protein which mediates resistance to antibiotics, or a gene which codes for a protein which is necessary for cell metabolism, the cells or host organisms into which the vector mentioned above is to be introduced, deficient in this protein.
  • the selection marker can also be any gene that changes the phenotype of the cell or host organism that has taken up the above-mentioned vector, for example the color.
  • the present invention relates to a cell which has the above-mentioned vector according to the present application.
  • the vector can be integrated into the genome of the cell or can also be present as exogenous DNA in the cytoplasm, as long as the transcription of the complementary nucleic acid molecule is provided.
  • the term "cell” encompasses any prokaryotic or eukaryotic cell. These cells are preferably used for the production of recombinant proteins with PIBF activity according to the present invention. These recombinant proteins produced can be isolated and purified and further used according to methods well known in the art, e.g. for the preparation of pharmaceutical preparations which have recombinant proteins with PIBF activity according to the present invention.
  • FIG. 3 shows a Northern blot for the detection of PIBF mRNA in different tissues.
  • Fig. 4 shows the immunohistochemical analysis of a human Primary tumor.
  • 5A-5D show the influence of anti-PIBF treatment on NK cell target killing of tumor cells.
  • Figures 6A-6C show the effect of the recombinant PIBF on IL-10 and IL-12 expression of non-pregnancy lymphocytes.
  • Figure 7 shows PIBF levels in urine samples from patients with non-adenocarcinoma and non-solid tumors.
  • Figure 9 shows the normalization of PIBF levels after surgery or chemotherapy.
  • Figure 10 shows the various PIBF mRNAs that were overexpressed in human primary tumors.
  • Figure 11 shows PIBF binding to human PBMC.
  • Figure 12 shows alternatively spliced PIBF mRNA.
  • Figure 13 shows the immunohistochemical analysis of human primary and secondary (metastases) melanomas.
  • 15 to 16 show PIBF levels in urine samples from patients with hematological tumors.
  • Figure 17 shows the amounts of PIBF in urine samples from patients with head and neck tumors before and after therapy.
  • Figure 18 shows the amounts of PIBF in urine samples from patients with urinary tract tumors before and after therapy.
  • Fig. 1 shows the alignment of recombinant (human) and Mouse (natural) PIBF, where A is the recombinant sequence, B is the IC mouse sequence (cloned from a mouse testicle library), C is the EST mouse, composed of dEST libraries based on the human sequences and D is the bovine sequence.
  • X represents the signal sequence according to the PSG prediction method, y the signal sequence according to the GvH prediction, z the ER membrane retention signal, w the leucine zipper pattern DNA binding motif, v the peroxisomal targeting signal and u the nuclear localization signal.
  • the PIBF gene is located on chromosome 13. A number of introns are present in the PIBF gene (see FIG. 2), with intron 2 having multiple copies of the Alu repeat element which serves as a site for alternative splicing , A shows a gap between genomic contigs.
  • FIG. 3 shows a Northern blot for the detection of PIBF mRNA in various normal tissues: stomach (A), thyroid (B), spinal cord (C), lymph nodes (D), trachea (E), adrenal gland (F), bone marrow ( G), spleen (H), thymus (I), prostate (J), testis (K), uterus (L), small intestine (M), colon (N), PBL (0), heart (P), brain ( Q, placenta (R), lung (S), liver (T), skeletal muscle (U), kidney (V), pancreas (W)
  • the arrows in Fig. 4 indicate 3 different mRNA forms.
  • Example 1 ESTs entries that match the human PIBF sequence
  • EST entries in human cDNA libraries were searched which match the human PIBF sequence.
  • 43 entries with PIBF sequences were found from 2.2 million dESTs, which were stored in 3776 human cDNA libraries. These 43 entries belong to 27 different libraries. 7 of the 27 (25%) libraries come from normal tissues (from non-pregnant adults without a tumor). It is important that testes, which is an immune-privileged tissue, often indicate the presence of PIBF mRNA. 13 of the 27 libraries contain mRNAs that were expressed in tumorous tissues (-50%). The rest comes from fetal or pregnant tissues. This shows that PIBF preferably during development, Pregnancy and malignancy is expressed. However, the number of matching ESTs can correlate with the mRNA abundance, but depends very much on the quality of the library. For this reason, they cannot be viewed directly as a measure of the amount of expression (see Table I).
  • Example 2 Determination of the PIBF concentration in urine samples from cancer patients
  • a competitive ELISA-based test was created to measure PIBF in the urine of cancer patients.
  • ELISA plates were coated with recombinant human PIBF at a concentration of 2 ⁇ g / ml.
  • Polyclonal anti-PIBF IgG labeled with biotin was added along with the samples whose PIBF content was to be determined. The higher the PIBF concentration in the sample, the lower the corresponding ELISA value.
  • the absolute PIBF concentration can be determined on the basis of these ELISA readings.
  • Urine samples from cancer patients were taken and used fresh or frozen shortly after sampling and stored at -20 ° C until analysis. It has previously been determined that serum PIBF levels in healthy pregnant women are significantly higher than those in non-pregnant women or in pathological pregnancies.
  • urine samples from healthy pregnant women and from normal healthy, non-pregnant individuals served as positive or negative controls. The results are summarized in Table II. Normal (healthy, non-pregnant) individuals have low urinary PIBF concentrations (5 ng / ml). The urine of pregnant women was characterized by an average PIBF concentration of 110 ng / ml. It is important that high levels of PIBF quickly return to normal after abortion or labor.
  • PIBF concentration is related to tumor mass and the detection of PIBF in urine can be used to monitor disease progression and relapse.
  • the increase in urinary PIBF concentration as a result of the presence of a PIBF-producing tumor is even greater, since not all tumor types are PIBF-positive (-70-80% of the tumors tested so far).
  • the most prevalent type of tumor among patients was lung cancer with 23 cases. Most of the lung cancer patients had a high concentration of PIBF. The lack of high PIBF in the urine could be correlated with the clinical disease status, namely the PIBF concentrations after removal of the primary tumor and in the remission stage were significantly lower or even normal.
  • PIBF human breast epithelial carcinoma
  • the normal tissue is shown in the left column in FIG. 4, labeled "A”, and tumor tissue is shown in the right column, labeled "B”.
  • the first row (labeled “1") is lung cancer (small cells)
  • the second row (labeled “2") is bladder cancer (transitional cell)
  • row “3” shows gastric cancer (adenocarcinoma).
  • PIBF production is a general phenomenon of the malignant or undifferentiated state, and consequently PIBF can serve as a tumor marker.
  • PIBF generated by tumor cells - secreted or expressed on the cell surface - will systemically or locally inhibit killer cell activity. It has long been known that there are cell lines that are good targets in NK tests, while others are not.
  • the MCF-7 human tumor cell line belongs to the bad target category. It is therefore a possibility that the low killing activity against these cells is the result of PIBF production that inhibits NK activity because the MCF-7 cell line has been shown to produce PIBF.
  • FIG. 5 shows that the anti-PIBF treatment increases the targeted killing of tumor cells by NK cells: the minus and the plus mean the treatment with or without anti-P BF-IgG, the numbers are the percent of the NK - Activity for Figures 5A and 5B and the percent inhibition of NK activity for Figures 5C and 5D.
  • the source of the NK cells were freshly isolated PBMCs from healthy individuals.
  • this test enables the study of the efficacy of exogenous PIBF to reduce PIBF target cell killing and, more importantly, to assess the strength of neutralizing anti-PIBF antibodies to stimulate lysis of PIBF + tumor cells.
  • Neutralizing rabbit anti-human and also anti-mouse antisera are produced, these polyclonal antibodies being able to inactivate natural PIBF in vitro (human leukocyte cultures in the NK test) or in vivo (pregnant mice, as an animal model) ,
  • K562 cells as targets
  • PBMCs as source for NK cells
  • the generation of the prototype T H 2 lymphokine, IL-10 was measured by detecting and counting the number of IL-10 positive lymphocytes (using immunohistochemistry on cytospins) after 24 h treatment.
  • the percent IL-10 positive lymphocytes increased depending on the rPIBF concentration from 0.35 +/- 0.15 to 3.5 +/- 1.5%.
  • the opposite effect was seen on IL-12 (T H ⁇ -lymphokine) -producing lymphocytes by the same treatment.
  • the number of IL-12 positive lymphocytes decreased depending on the PIBF concentration, which resulted in an approximately 8-fold decrease in the highest amount of PIBF.
  • the neutralization of the effect of natural PIBFs on cytokine production has also been successful.
  • Treatment of lymphocytes from pregnancy (producing PIBF) with anti-PIBF-IgGs for 3 hours resulted in a significant reduction in the number of IL-10-positive and a significant increase in the number of IL-12-positive cells (FIGS. 6B and C) , These results demonstrate that the recombinant PIBF form is active in inducing T H 2 cytokine expression.
  • neutralizing antibodies can remove active PIBF generated by cells in vivo and thus can potentiate Tm cytokines.
  • Example 6 Diagnostic test The diagnostic value of the urinary PIBF amounts in the case of malignancies is further exemplified by the use of urine samples from patients with non-adenocarcinoma tumors and non-solid tumors (FIG. 7); the dots represent results with individual sera. The average numbers are shown. N means the number of patients.
  • lymphomas lymphomas
  • Fig. 7A normal urinary PIBF concentration
  • Fig. 7C head and neck tumors
  • Fig. 7B malignancies of the urinary tract
  • the polyclonal antibodies are replaced in a similar antigen capture sandwich test with a pair of monoclonal antibodies (ab) generated in mice using the 48 kDa rPIBF N-terminal as the antigen.
  • ab monoclonal antibodies
  • the increased PIBF levels in urine samples from tumor patients are detected with the monoclonal antibody pairs similar to the polyclonal antibodies (FIG.
  • C control
  • A all hematological tumors
  • L lymphoma
  • Leu leukemia
  • P plasmacytoma
  • N not defined
  • No. number of patients
  • POLY polyclonal ab
  • MONO monoclonal ab.
  • mouse PIBF In addition to the full-length human PIBF, full-length mouse PIBF mRNA and the protein sequence were identified (SEQ. ID. No. 4, 5). The mouse PIBF is also organized into 18 exons and has an amino acid homology of 89%.
  • PIBF amino acid sequences encoded by these exons are essential for PIBF function.
  • several mRNA forms with different sequences lead to this same C-terminal PIBF polypeptide with a predicted molecular weight of 10 kDa.
  • the truncated forms of PIBF which were identified by means of RT-PCR analyzes of RNA samples, were obtained from various human (SEQ. ID. No. 6, No. 10-20) and mouse tissues and cell lines (SEQ. ID. No. 8, 9, 23-37) isolated.
  • the different PIBF forms are expressed differentiated and have different functional attributes.
  • RNA was either with PIBF-specific exon 1 / exon 18 (Fig. 10A) and exon 2 / exon 18 primer pairs (Fig. 10B) or with ribosome protein S9-specific primers (for one load Control) of the same samples amplified.
  • Rapidly growing cells eg in tumors and embryos, cells of immune-privileged tissue (testes, placenta) contain more PIBF mRNA of the entire length.
  • testes, placenta immune-privileged tissue
  • the function of the PIBF also depends on the structure of the mature protein form.
  • One of the most interesting forms is encoded by exons 2-3-4-5-17-18 mRNA commonly found in human and mouse tissues such as human and mouse placenta, human lymphocytes, mouse embryos and in human gastric tumor. It encodes a 298 and 297 amino acid polypeptide with a predicted molecular weight of 35 kDa. (SEQ. ID. No. 6, 7 for humans, SEQ. ID. No. 8,9 for mice). The two proteins are 86% homologous.
  • the FACS analysis shows that the human 35 kDa form binds specifically to human immune cells (FIG. 11): FACS staining of human PBMCs with 35 kDa-PIBF and ⁇ -PIBF antibodies (anti-rabbit FITC). The cells are in the monocyte cell region
  • Figure 12A shows full length mouse 89 kDA PIBF (SEQ ID NO: 4)
  • Figure 12B shows exons (1-5) - (17-18), which are found in gastric tumor, human terminal placenta, male and female lymphocytes, female pregnancy lymphocytes (SEQ ID No. 6)
  • Fig. 12C shows exons (1-5) - (17-18) found in mouse placenta and embryo (SEQ.ID No. 8 )
  • Fig. 12D shows exons 1- (13-18) (SEQ. ID No. 11)
  • Fig. 12E shows exons 1- (15-18), which are found in MCF-7 cells and pregnancy. Find lymphocytes (SEQ.ID No. 12), Fig.
  • FIG. 12F shows part of intron 14 and exons 15-18 found in the leukocyte cDNA library (SEQ. ID No. 13)
  • Fig. 12G shows that Exons 1+ (9-10) + (12-15) + (17-18) found in MCF-7 cells and gestational lymphocytes (SEQ. ID No. 14)
  • Fig. 12H shows exons 1 + (3-7) + (9-10) +12+ (17-18) found in MCF-7 cells - human breast tumor cell line (SEQ. ID No. 17)
  • Fig. 121 shows Exon (1-7) + (9-15) + (17-18), which one i n MCF-7- Cells Find - Human Breast Tumor Cell Line (SEQ. ID No. 19)
  • Figure 12J shows exon (1-7) + (9-10) +12+
  • Fig. 12K shows exon (1-2) - (17-18), which found in mouse embryo and placenta (SEQ. ID No. 23), FIG. 12L shows exon (1-4) - (16-18) found in mouse placenta (SEQ. ID No. 25), Fig. 12M shows exons (1-2) - (15-18) found in mouse testes (SEQ. ID No. 27), Fig. 12N shows exons 1-11 18 found in the mouse embryo ( SEQ. ID No. 29), Fig. 120 shows exons (1-11) -18 found in the mouse embryo (SEQ. ID No. 31), Fig.
  • Example 8 Detection of PIBF in human primary tumor tissues
  • the two-plate polyclonal antibody assay set forth in Example 6 was simplified by using a peptide-specific polyclonal or monoclonal antibody in a one-plate ELISA.
  • the polyclonal antibody was raised by rabbits (New Zealand White) three times at 3 week intervals with a 55 AS long peptide (MKQILVKMHSKHSENSLLLTKTEPKHVTENQKSKTLNVPKEHEDNIFTPKPTL), corresponding to exon 17 from PIBF, which was consistently present in all previously detected spliced variants (cf. Example 7).
  • New monoclonal antibodies were raised against this peptide by immunizing BalbC mice according to standard protocols to generate mAbs. The specificity was tested by ELISA using the immunization peptide and recombinant PIBFs.
  • Standard preparation logarithmic dilution of synthetic peptide dilutions coded with exon 17 (2000 ng / ml, 1000 ng / ml, 100 ng / ml, 10 ng / ml, 1 ng / ml, 0.1 ng / ml) in 0.5 M phosphate buffer, pH 7.4-7.6, were mixed with an equal volume of a biotin-labeled synthetic peptide (1 ⁇ g / ml in 0.5 M PBS).
  • Sample preparation biological samples were diluted 1: 2.5 and 1: 5 in 0.5 M phosphate buffer, pH 7.4-7.6 and with an equal volume of a synthetic peptide labeled with biotin (1st ⁇ g / ml in 0.5 M PBS) mixed.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten, welches das Messen der Konzentration von Progesteron-induziertem immunmodulierendem Protein (PIBF) oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon in der dem Patienten entnommenen Probe umfasst, und die Verwendung eines anti-PIBF-Antikörpers, eines PIBFs oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon bzw. eines für PIBF codierenden Polynuklebtids als Anti-Tumor-Medikament.

Description

PIBF
Die vorliegende Erfindung betrifft ein rekombinantes Protein mit einer Progesteron-induzierten immunmodulierenden Protein- (PIBF) - Aktivität, ein Nukleinsäure-Molekül, das für ein rekombinantes Protein mit einer PIBF-Aktivität codiert, einen Nukleinsäure- Vektor, der diese Nukleinsäuresequenz aufweist, eine Zelle, die diesen Vektor umfasst, und ein Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten.
Zur Aufrechterhaltung einer normalen Schwangerschaft ist die Produktion von Progesteron - einem Steroidhor on mit einem breiten immunsuppressiven irkungsSpektrum - eine absolute Notwendigkeit. Periphere Lymphozyten gesunder schwangerer Frauen exprimieren nukleare Rezeptoren als Sensoren für dieses Hormon (Szekeres-Bartho et al . , J. Reprod. Immuno1. 16, 239 (1989); Szekeres-Bartho et al . , Cell. Immuno1. 125, 273 (1990)), und produzieren ein Vermittler-Protein mit der Bezeichnung Progesteron-induzierter Blockierungsfaktor (PIBF) (Szekeres- Bartho et al., Am. J. Reprod. Immuno1. Microbiol. 9, 15 (1985)). Die Sequenz der PIBF-cDNA aus der menschlichen Leber zeigte keine wesentliche Homologie mit der von irgend einem der bekannten Proteine (HSPIBF, Acc. No. Y09631) . Das codierte Vorläuferprotein ist sehr hydrophil und hat ein Molekulargewicht von 89 kDa. Natürlich vorkommender PIBF ist, so wie ursprünglich entdeckt, ein 34-36 kDa immunmodulierendes Protein mit einer Sequenzlänge von 757 Aminosäuren.
Es wurde festgestellt, dass die Konzentration des PIBF in Harnproben gesunder Personen etwa 1-10 ng/ml beträgt, wogegen die Konzentration des PIBF bei schwangeren Frauen ab dem 2. Trimester in einem Bereich von etwa 70-150 ng/ml liegt. Diese hohen Mengen kehren nach einem Abortus oder nach Wehen rasch wieder auf das normale Niveau zurück.
Es zeigte sich, dass PIBF, welcher die Auswirkungen von Progesteron vermittelt, eine sehr starke immunmodulierende Funktion sowohl in vitro als auch in vivo aufweist. Tatsächlich erwies sich PIBF als für die Schwangerschaft im Mäusemodell essentiell, da aus den Kulturüberständen von Mauslymphozyten isolierter PIBF Föten vor der durch Antiprogesteron induzierten Resorption schützt. Außerdem bewirken neutralisierende Antikörper gegen den Maus-PIBF die Resorption von Embryonen und folglich einen Abortus . Die wichtige Rolle des PIBF bei der menschlichen Fortpflanzung wurde auch durch Messen der geringen Mengen in den Körperflüssigkeiten pathologischer Schwangerschaften bestätigt, PIBF spielt eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Schwangerschaft, höchst wahrscheinlich dadurch, dass er natürliche Killer-Lymphozyten hemmt. Bedeutsamerweise kann durch experimentelle Manipulation der Menge des PIBF in vi tro die Killer-Aktivität der peripheren Blutlymphozyten, die NK (natürliche Killer) -Zellen enthalten, moduliert werden. Es wurde festgestellt, dass es mindestens zwei Wirkmechanismen des PIBF auf NK-Zellen gibt: eine ist eine direkte Hemmung der NK-Zellaktivität . NK-Zellen töten ihre Ziel- Zellen durch Exocytose von Perforin und Serin-Esterase enthaltenden Granula in der Kontaktfläche zwischen Effektor- und Ziel-Zellen. Deziduale Lymphozyten - von welchen 60 % NK- Oberflächenmarker tragen - besitzen einen hohen Perforingehalt, sie üben jedoch nur eine geringe cytotoxische Aktivität aus. Obwohl aktivierte NK-Zellen ihre Ziele finden und in Anwesenheit von PIBF binden, setzen sie jedoch kein Perforin aus den Lagergranula frei, und infolgedessen kommt es zu keiner Lyse der Ziel-Zellen. Es scheint, dass PIBF die NK-Zellen lähmt und den cytotoxischen Mechanismus durch Hemmung der Degranulation und dadurch der Freisetzung der Killersubstanzen unter Kontrolle hält.
Es gibt einen weiteren indirekten Mechanismus, mittels welchem PIBF seine Anti-NK-Wirkung ausübt, nämlich durch eine veränderte Cytokin-Expression. In Anwesenheit von PIBF kommt es zu einer beträchtlichen Abnahme der TNFα- (Tumor-Nekrose-Faktor α) - Produktion durch NK-Zellen, die auch bei der Niederregulierung der NK-Aktivität eine Rolle spielen könnte. Die Menge an sezerniertem TNFα steht im umgekehrten Verhältnis zur PIBF- Produktion, und zwar sowohl in vi tro als auch in vivo .
Der zweite Hauptwirkungsmechanismus von PIBF ist die Induktion der TH2-Cytokin-Dominanz . Die Tm-Dominanz trägt zur Verringerung der zellvermittelten Reaktionen und zur Verbesserung der B- Zellen bei, wogegen die THι-Dominanz zu verringerten humoralen Reaktionen führt und die zeilimmunologischen Mechanismen begünstigt. Sezernierter PIBF erleichtert die Produktion von TH2- Cytokinen, wie IL-3, IL-4 und IL-10, wogegen er THι-Cytokine, wie IL-12 und IFN-γ supprimiert, und zwar sowohl in vi tro als auch in vivo . Die Neutralisierung des PIBF durch spezifische Antikörper führt in vivo zu einer THι-Verschiebung, die auch ein Charakteristikum von fehlgeschlagenen Schwangerschaften ist. Die Auswirkung des PIBF auf humorale Immunreaktionen ist nicht nur eine einfache Verbesserung, sondern auch die Induktion der Erzeugung asymmetrischer Antikörper. Dies ist eine Population von Antikörpern (ab) , die auf Grund des Vorhandenseins eines Mannose-reichen Oligosaccharid-Restes an einem der Fab-Arme des Moleküls eine asymmetrische Struktur hat, und die keine oder nur geringe Effektorfunktionen hat; diese ab könnten jedoch als blockierende Antikörper wirken. Das Verhältnis von asymmetrischem IgG war in Überständen von Hybrido -Zellen, die in Gegenwart von PIBF gezüchtet worden waren, wesentlich höher als in jenen, die in Abwesenheit von PIBF gezüchtet worden waren. Weitere Untersuchungen zeigten ein positives Verhältnis zwischen asymmetrischem Antikörpergehalt der Seren und der PIBF- Expression auf Lymphozyten. Weiters verringerte die Blockierung der Progesteron-Rezeptoren durch RU 486 oder die Neutralisierung endogener PIBF-Aktivität durch spezifische anti-PIBF-Antikörper, die Produktion asymmetrischer Antikörper bei trächtigen Mäusen ganz wesentlich.
Maligne Tumoren, d.h. Krebsarten, sind in allen entwickelten Ländern nach Herzerk ankungen die zweite Haupttodesursache und treten bei einer von drei Personen auf. Eine von je vier Personen stirbt an Krebs. Krebs ist vor allem durch eine Zunahme der Anzahl der abnormalen oder neoplastischen Zellen gekennzeichnet, die von einem normalen Gewebe stammen, welches sich zur Bildung einer Tumormasse vermehrt, durch die Invasion benachbarter Gewebe durch diese neoplastischen Tumorzellen, und durch die Erzeugung maligner Zellen, welche über das Blut oder das Lymphsystem zu regionalen Lymphknoten und zu entfernten Stellen gelangen. Letzteres Fortschreiten zur Malignität wird als Metastase bezeichnet. Krebs kann aus dem Zusammenbrechen der Kommunikation zwischen neoplastischen Zellen und ihrer Umgebung, einschließlich ihrer normalen Nachbarzeilen, entstehen. Sowohl wachstumsstimulierende als auch als wachstumshemmende Signale werden routinemäßig zwischen Zellen innerhalb eines Gewebes ausgetauscht. Normalerweise teilen sich Zellen bei Fehlen stimulierender Signale nicht, und in gleicher Weise hören sie bei Vorliegen von Hemmsignalen auf, sich zu teilen. Im Krebs- oder neoplastischen Zustand erwirbt eine Zelle die Fähigkeit, sich über diese Signale hinwegzusetzen und sich unter Bedingungen, unter welchen normale Zellen nicht wachsen würden, zu vermehren.
Tumorzellen müssen eine Reihe verschiedener fehlerhafter Merkmale erwerben, um sich zu vermehren. Diese Anforderung wird durch die Tatsache belegt, dass die Genome bestimmter gut untersuchter Tumoren mehrere verschiedene, unabhängig voneinander veränderte Gene aufweisen, einschließlich aktivierter Onkogene und inaktivierter Tumor-Suppressor-Gene. Jede dieser genetischen Veränderungen scheint dafür verantwortlich zu sein, einige dieser Merkmale, die insgesamt den kompletten neoplastischen Phänotyp repräsentieren, zu verleihen.
Tumorzellen tragen Antigene, die als für den Körper fremd erkannt werden können, und es ist eine der Hauptfunktionen des Immunsystems, solche Zellen zu eliminieren, bevor sie große Tumoren bilden können. Diese Immunüberwachung ist bei Patienten mit fortschreitend malignen Erkrankungen deutlich wirkungslos . Eine Reihe von Schutzmaßnahmen wurde identifiziert, die eine Eigenreaktivität supprimiert, und die eine Hauptbarriere in der Fähigkeit des Immunsystems, Tumorzellen auszulöschen, darstellen kann. Es gibt eine Reihe von Mechanismen, die von Tumorzellen ausgeübt werden, wie 1. die Nichtexpression klassischer und die Expression nicht-klassischer, selbstidentifizierender Klasse I- MHC-Moleküle (wie HLA-G) , welche die TötungsWirkung der (Tumor)Antigen-spezifischen Klasse I-MHC-eingeschränkten CTLs unterminiert; 2. eine Tendenz zu TH2-Reaktionen, wobei die THι- Helferfunktion und folglich wirksame cytotoxische Antitumorreaktionen supprimiert werden; und 3. die Produktion immunsuppressiver Faktoren, die lokale und systemische Immunreaktionen niederregulleren (beispielsweise verringert die Sekretion von TGF-ß die T-Zellen-Proliferation und die Cytotoxizität die Expression von fas-Ligand, die eine Apoptose von CTLs induziert.). Als Resultat dieser kumulativen Wirkungen haben die Tumoren einen immunologisch privilegierten Zustand und wachsen ohne oder mit einer eingeschränkten Kontrolle durch das Immunsystem.
Es ist ziemlich genau erwiesen, dass viele pathologische Zustände, wie Infektionen, Krebs, Autoimmunerkrankungen, usw. durch die ungünstige Expression bestimmter Moleküle gekennzeichnet sind. Diese Moleküle dienen somit als "Marker" für einen bestimmten pathologischen oder abnormalen Zustand. Abgesehen von ihrer Verwendung als diagnostische "Ziele", d.h. Materialien, die zur Diagnose dieser abnormalen Zustände identifizierbar sind, dienen die Moleküle als Reagentien, die verwendet werden können, um diagnostische und/oder therapeutische Mittel zu erzeugen.
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten, das leicht und sicher durchführbar ist, welches Verfahren keine High-Tech- Geräte erfordert, dem Patienten keine besonderen Unannehmlichkeiten verursacht, das rasch durchführbar ist und Ergebnisse bringt, die eine Unterscheidung zwischen einem Patienten mit einem Tumor und einem gesunden Patienten erlauben.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Sets zur Durchführung des Verfahrens zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer wirksamen Antitumormedizin.
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten, mit welchem das obige Ziel erreicht wird, umfasst das Entnehmen einer Probe vom Patienten, das Messen der Konzentration des PIBF (Progesteron-induzierten Blockierungs-Faktors) oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon in der Probe und das Bestimmen, ob die Konzentration des PIBF in der Probe über oder unter einem vorbestimmten Schwellenwert liegt, wobei die Konzentration über dem Schwellenwert einen Patienten mit einem Tumor identifiziert.
Während der Charakterisierung von PIBF als wichtiges immunmodulierendes Molekül für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft zeigte es sich überraschenderweise, dass Tumorzellen PIBF oder PIBF-verwandte Substanzen exprimieren, wogegen bei angrenzenden normalen Geweben keine oder nur eine geringe PIBF-Reaktivität feststellbar ist. Dies deutet darauf hin, dass PIBF bei der Entwicklung oder Aufrechterhaltung der immunologischen Toleranz gegenüber bösartig transformierten Zellen eine Rolle spielt und daher einen nützlichen Marker für Tumorzellen bildet.
Daher macht sich das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die Tatsache zu Nutze, dass die Konzentration von PIBF in einer Probe, die vom zu testenden Patienten genommen worden ist, höher ist als die Konzentration von PIBF in einer Probe, die von einer gesunden Person genommen wurde.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die vom Patienten genommene Probe jede Art von Probe, die flüssig oder auch nicht ist, sein und kann von praktisch jedem Teil des Körpers stammen. Die Konzentration des PIBF kann gemäß jedem auf diesem Gebiet bekannten Verfahren, das die Quantifizierung der Konzentration von PIBF in einer Probe ermöglicht, gemessen werden. Diese kann chemische, mikrobiologische, physikalische Techniken, Färbung etc. auf Flüssigkeiten, Gewebsproben usw. umfassen. Zu den möglichen Methoden zählen in vivo-Bildgebung mittels Computer- Tomograph (CT) und Magnetresonanz-Bild (Magnetic Resonance Image, MRI) nach Markierung mit Radionuklein- bzw. paramagnetischen (z.B. Gadolinium-)Markierungen.
Da der PIBF Stoffwechsel- oder anderen Veränderungen im Körper des Patienten unterworfen sein kann, kann der PIBF Modifikationen aufweisen, je nach dem, welche Probe vom Patienten genommen wurde. Der PIBF kann beispielsweise gespalten worden sein, so dass nur ein Fragment des PIBF in der vorhandenden Probe vorliegt. Der PIBF kann weiters so modifiziert worden sein, dass ein Derivat des PIBF in dieser Probe vorliegt oder auch ein Fragment dieses Derivats. Es zeigte sich auch, dass alternativ prozessierte PIBF-mRNAs in Tumorzellen in einer im Vergleich zu normalen Zellen unterschiedlichen Konzentration vorhanden sind, weshalb Proteine oder Fragmente, die aus diesen unterschiedlichen Formen von mRNA-Molekülen oder Fragmenten davon translatiert sind, ebenfalls vom Ausdruck "Fragmente" mit umfasst sind. Daher kann auch ein PIBF-Derivat oder ein Fragment des PIBF oder des PIBF- Derivats oder PIBF-verwandte Substanzen (wie beispielsweise ein gespaltenes Produkt von 34 kDa oder ein alternativ gespleißtes 14 kDa-Produkt) als Indikation der Konzentration des PIBF im Patienten verwendet werden, und daher kann die jeweilige Konzentration für das Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "PIBF oder Fragmente davon" - ohne darauf eingeschränkt zu sein - auf Sequenzen gemäß SEQ ID Nr: 1, 3, 4, 6, 8, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 23, 25, 27, 29, 31, 32, 34 und 36 oder Fragmente oder Derivate davon. Daher sind Beispiele für PIBF oder Fragmente davon, die gemäß der vorliegenden Erfindung detektiert oder quantifiziert werden können, diese oben erwähnten Sequenzen. Da es sich zeigte, dass die Exons 17 und 18 in beinahe allen identifizierten mRNA-Formen inkludiert sind, werden PIBF- Fragmente, die die Exons 17 und 18 aufweisen (vgl. die Figuren) vorzugsweise für die Detektion oder Quantifizierung von PIBF in einer Probe verwendet.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann das Fragment des PIBF oder des PIBF-Derivats beispielsweise weniger als 715 Aminosäuren, vorzugsweise weniger als 500 Aminosäuren, noch mehr bevorzugt weniger als 200 Aminosäuren, und am meisten bevorzugt weniger als 50 Aminosäuren, umfassen.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Ausdruck "Derivat" beispielsweise alle natürlichen oder selbst nicht natürlich auftretenden Modifikationen, z.B. Spaltung, Glykosylierungen, Methylierungen, Acetylierungen, Amidierungen, Phosphorylierungen, Sulfatierungen, Deletionen, Substitutionen, etc ..
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich auch "Schwellenwert" auf einen Konzentrationswert, der im Allgemeinen die mittlere Probenkonzentration von PIBF bei gesunden Probenspendern sein wird. Es ist möglich, eine bekannte allgemeine mittlere PIBF-Konzentration bei gesunden Menschen gemäß der Literatur zu nehmen oder auch die Probenkonzentration von PIBF bei gesunden Spendern bei der Durchführung der vorliegenden Erfindung zu bestimmen. Der Schwellenwert kann auch bei gesunden (normalen) Proben bestimmt werden, die früher (im gesunden Zustand) von derselben Person entnommen wurden. Beispiele für solche Schwellenwerte können beispielsweise zwischen 1 und 10 ng/ml, vorzugsweise zwischen 1 und 5 ng/ml, sein, wobei die Konzentration vom Detektionsverfahren sowie vom Typ des Tumors abhängt. Weiters kann der Schwellenwert Null sein, wenn alternativ prozessierte PIBF-mRNA-Produkte nur in Tumorzellen und nicht in gesunden Zellen vorhanden sind. Daher hängt der Schwellenwert auch vom PIBF-Molekül ab und muss für jedes spezifische PIBF-Molekül einzeln bestimmt werden.
Bei der Bestimmung des Schwellenwertes ist es jedoch wichtig, dass die Probe von der gesunden Person nicht von einer schwangeren Frau genommen wird, da die PIBF-Konzentration bei Proben von schwangeren Frauen höher ist als die PIBF- Konzentration in Proben nicht-schwangerer Frauen.
Die PIBF-Konzentration, die in der vom Patienten entnommenen Probe gemessen wird, welche über dem vorbestimmten Schwellenwert liegt, identifiziert Individuen mit einem Verdacht auf einen Tumor. Ein "Tumor", wie hierin verwendet, bezeichnet jedes neoplastische Zellwachstum und jede Vermehrung, sei sie bösartig oder gutartig, und alle vor-kanzerösen und kanzerösen Zellen und Gewebe .
Unter den Ausdruck "Patient" fallen im Rahmen der vorliegenden Erfindung Patienten mit einem Tumor, jedoch auch Patienten, bei welchen die Möglichkeit besteht, dass sie einen Tumor haben, sowie gesunde Menschen, die sich einer allgemeinen Routineuntersuchung unterziehen. Natürlich kann der Ausdruck "Patient" auch jedes Tier, insbesondere Maus, Ratte, Meerschweinchen, Affe, umfassen, wobei das Tier vorzugsweise ein für Analysen, z.B. zum Nachweis spezifischer Tumoren, zum Testen von Anti-Tumor-Substanzen oder karzinogenen Substanzen, verwendetes Labortier ist. Weiters kann das Tier ein genetisch modifiziertes Tier sein, welches eine Prädisposition für die Bildung von Tumoren aufweist.
Da die Schwangerschaft auch zu erhöhten PIBF-Mengen führt, müssen sexuell aktive Frauen mittels herkömmlicher Schwangerschaftstests (z.B. auf Grund von hCG) getestet werden, bevor sie als Patienten mit einem Tumor angesehen werden. Es bedeutet auch, dass es sehr schwierig ist, diesen Test zur Detektion von Tumorwachstum zu benützen, wenn der Patient eine schwangere Frau ist, die über das erste Trimester hinaus ist. Da jedoch ein beträchtlicher Teil der mit einer Schwangerschaft in Beziehung stehenden Malignitäten mit dem unkontrollierten Wachstum von Schwangerschafts-bezogenen Geweben zu tun hat (wie Trophoblastenzellen bei Mola hydatidosa) , könnten extrem hohe PIBF-Mengen (> 150-200 ng/ml) ein Tumorwachstum mit oder ohne Vorhandensein eines lebensfähigen Babys anzeigen.
Vorzugsweise ist der Tumor, der mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung diagnostiziert werden soll, ein Epithel- Karzinom. Da die überwiegende Mehrzahl der Human-Tumoren (bezogen auf die weltweiten Sterblichkeitsdaten) Epithelkarzinome sind (Lunge, Brust, Colon, usw.), ist das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung für die Diagnose dieser Art von Tumor besonders vorteilhaft.
Das Epithelkarzinom ist vorzugsweise ein Kolonkarzinom oder ein Brustkarzinom, ein Lymphom, ein Kehlkopfkarzinom, ein Tumor des Harntrakts, insbesondere ein Blasenkarzinom, ein Lungentumor, eine Leukämie, ein Plasmozytom, ein Myelom, insbesondere Myeloma multiplex, ein myeloproliferative Erkrankung oder ein Kopf- und Hals-Tumor. Die PIBF-Konzentration bei Proben, die von Patienten mit den oben erwähnten Tumoren entnommen wurden, ist besonders hoch im Vergleich zu PIBF-Konzentrationen in Proben von gesunden Patienten. Daher identifiziert, wenn das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Diagnostizierung eines der oben erwähnten Tumoren verwendet wird, eine Konzentration, die über dem Schwellenwert liegt, Individuen mit einem Verdacht auf einen Tumor. Eine Konzentration, die unter dem Schwellenwert liegt, schließt jedoch nicht unbedingt das Vorhandensein eines Tumors in bestimmten Fällen aus .
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Probe eine Körperflüssigkeit, vorzugsweise Harn bzw. Serum. Dies ermöglicht eine sehr einfache Art der Probennahme vom Patienten, ohne jeglichen chirurgischen Schritt und ohne die Notwendigkeit spezifischer High-Tech-Instrumente. Die Körperflüssigkeit kann in jedem Labor oder selbst im Heim des Patienten entnommen werden und ist besonders vorteilhaft für eine Routinediagnose, eine Diagnose bei einem Patienten, der sehr schwach ist, und für regelmäßige Überprüfungen des Fortschreitens des Tumors bei einem Patienten. Die PIBF- Konzentration kann beispielsweise mittels einer Trockenchemie- Methode, z.B. mit einem Streifen, der seine Farbe je nach der PIBF-Konzentration in einer Probe, in die er eingetaucht wird, ändert, gemessen werden.
Alternativ ist die Probe eine Gewebsprobe. Obwohl die Entnahme dieser Art von Probe aus dem Patienten nicht so einfach ist wie das Entnehmen einer Körperflüssigkeit, ermöglicht ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, bei welchem eine Gewebsprobe vom Patienten verwendet wird, die direkte Lokalisierung des Tumors, insbesondere, wenn verschiedene Gewebsproben entnommen und miteinander verglichen werden. Weiters ist es möglich, die Progression des Tumors direkt zu verfolgen. Außerdem kann das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung durch Detektion der Gewebe mit einem Tumor weiters zumindest als ein zusätzliches Verfahren zur Entscheidung, ob Gewebe und welche Teile eines Körpers des Patienten chirurgisch entfernt werden müssen, verwendet werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Schwellenwert die Konzentration des PIBF in einer Probe einer gesunden Person. Natürlich ist der Schwellenwert besonders präzise, wenn er die mittlere Konzentration des PIBF einer Mehrzahl von Proben von gesunden Personen ist.
Vorzugsweise wird der Schwellenwert durch Messen der Konzentration des PIBF in einer Probe mindestens einer gesunden Person parallel zur Bestimmung der Konzentration des PIBF in einer Probe des Patienten bestimmt. Da die gemessene Konzentration vom Verfahren der Messung der PIBF-Konzentration abhängt, ist die Diagnose spezifischer und exakter, wenn das Verfahren zur Messung der PIBF-Konzentration in der Probe des Patienten und in der Probe der gesunden Person identisch ist . Um die Sensitivität des Verfahrens weiters zu erhöhen, werden die Probe des Patienten und die Probe der gesunden Person vorzugsweise parallel gemessen, z.B. zur selben Zeit, um jegliche störende Parameter, z.B. Temperatur, Puffer, etc., die einen Einfluss auf das Ergebnis haben, zu eliminieren. Die Probe der gesunden Person wird vorzugsweise parallel als "Negativprobe" gemessen.
Vorteilhaft wird als positive Kontrolle die Konzentration des PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon in einer Probe, die eine bestimmte Konzentration von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon aufweist, parallel zur Bestimmung der PIBF-Konzentration in der Probe des Patienten gemessen. Die Parallel-Messung der positiven Kontrolle ermöglicht es, die Ergebnisse zu kontrollieren und jegliche Divergenz im Verfahren festzustellen.
Vorzugsweise wird die PIBF-Konzentration in der Probe immunologisch gemessen, insbesondere durch einen kompetitiven Test, einen Sandwich-Test, durch Immunfärbung ( "immunostaining" ) oder Kombinationen dieser Methoden. Jedes immunologische Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, kann angewendet werden. Immunologische Verfahren oder sehr sensitive Verfahren zur Detektion von Molekülen sind daher zur Messung der PIBF- Konzentration in der Probe besonders vorteilhaft. Um das immunologische Verfahren durchzuführen, ist es notwendig, mindestens einen anti-PIBF-Antikörper zu haben, der spezifisch an PIBF, Derivate davon oder Fragmente davon, bindet. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und kann weiters rekombinant sein. Weiters können humanisierte monoklonale oder durch Phagen codierte monoklonale Einzelketten-Antikörper verwendet werden.
Beispiele für rekombinante, monoklonale anti-Human-PIBF- Antikörper, die wie oben beschrieben verwendet werden können, sind an der Hybridorn-Zellbank an der medizinischen Fakultät der Universität von Pecs, Abteilung für Immunologie und Biotechnologie, Ungarn, unter den Hinterlegungsnummern 11 bis 14/2001, Zelllinien-Codes HYB 255-258, hinterlegt.
"Einzelketten-Antikörper" sind strukturell so definiert, dass sie den Bindungsteil eines ersten Polypeptids aus der variablen Region eines Antikörpers in Verbindung mit dem Bindungsteil eines zweiten Polypeptids aus der variablen Region eines Antikörpers umfassen, wobei die beiden Polypeptide durch einen Peptid-Linker verbunden sind, der das erste und das zweite Polypeptid zu einer einzigen Polypeptidkette verbindet . Die einzige Polypeptidkette umfasst somit ein Paar variabler Regionen, die durch einen Polypeptid-Linker verbunden sind. Die Regionen können sich zur Bildung einer funktionalen Antigen- Bindungsstelle verbinden, wie in jenem Fall, in welchem die Regionen ein variables Regionen-Paar mit einer leichten Kette und einer schweren Kette mit entsprechend paarweisen komplementären Bestimmungsregionen (complementary determining regions, CDRs) umfassen.
Der Ausdruck "humanisierter Antikörper" , wie hierin verwendet, bedeutet Antikörper-Moleküle, in welchen Aminosäuren in den bekannten Antigenbindungsreagenzien zwecks größerer Ähnlichkeit mit einem humanen Antikörper ersetzt wurden, wobei jedoch die ursprüngliche Bindungsfähigkeit erhalten bleibt.
Die Antikörper können unter Verwendung von Verfahren, die auf diesem Gebiet wohlbekannt sind, erzeugt werden. Zu solchen Antikörpern zählen, ohne auf diese eingeschränkt zu sein, polyklonale, monoklonale, rekombinante, Chimäre, Einzelketten- (single chain) -Antikörper, Fab-Fragmente und Fragmente, die von einer Fab-Expressionsbibliothek erzeugt wurden. Neutralisierende Antikörper (d.h. jene, die die Dimer-Bildung hemmen) sind zur therapeutischen Verwendung besonders bevorzugt.
Für die Herstellung von Antikörpern können verschiedene Wirte, einschließlich Ziegen, Kaninchen, Ratten, Mäuse, Hühner (Yab) , Menschen und andere, durch Injektion mit natürlichem oder rekombinantem PIBF-Protein oder jedem Fragment oder Oligopeptid desselben, das immunogene Eigenschaften aufweist, oder einer PIBF-DNA (Fragment) immunisiert werden. Je nach der Wirts- Spezies können verschiedene Adjuvantien zur Steigerung der immunologischen Reaktion verwendet werden. Zu solchen Adjuvantien zählen, ohne auf diese eingeschränkt zu sein, Freund' sches Adjuvans, Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, und grenzflächenaktive Substanzen, wie Lysolezithin, Pluronic- Polyole, Polyanione, Aluminium, Polykationen (z.B. polyArg) , Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Haemocyanin (keyhole limpet hemocyanin) und Dinitrophenol. Unter den bei Menschen verwendeten Adjuvantien sind BCG (Bacilli Calmette- Guerin) und Corynebacterium parvum besonders bevorzugt.
Es ist bevorzugt, dass die Peptide, Fragmente oder Oligopeptide, die zur Induktion von Antikörpern gegen PIBF verwendet werden, eine Aminosäuresequenz aufweisen, die aus mindestens fünf Aminosäuren und, mehr bevorzugt, mindestens 10 Aminosäuren besteht. Es ist auch bevorzugt, dass sie identisch mit einem Teil der Aminosäuresequenz des natürlichen Proteins sind. Kurze Abschnitte von PIBF-Aminosäuren können mit jenen eines anderen Proteins, wie dem Schlüsselloch-Napfschnecken-Haemocyanin fusioniert werden, und Antikörper gegen das Chimäre Molekül werden erzeugt.
Monoklonale Antikörper gegen PIBF können unter Verwendung jeder Technik, die eine Erzeugung von Antikörper-Molekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur vorsieht, hergestellt werden. Zu diesen zählen die Hybridom-Technik, die Human-B- Zellen-Hybridom-Technik und die EBV-Hybridom-Technik, ohne edoch auf diese eingeschränkt zu sein.
Außerdem können Techniken, die für die Herstellung "chimärer Antikörper" entwickelt wurden, das Spleißen von Maus-Antikörper- Genen zu humanen Antikörper-Genen zum Erhalt eines Moleküls mit entsprechender Antigen-Spezifität und biologischer Aktivität verwendet werden. Alternativ können Techniken, die für die Erzeugung von Einzelketten-Antikörpern beschrieben wurden, adaptiert werden, wobei Verfahren des Standes der Technik verwendet werden, um PIBF-spezifische Einzelketten-Antikörper zu erzeugen. Antikörper mit verwandter Spezifität, jedoch mit einer unterschiedlichen idiotypischen Zusammensetzung, können durch das Mischen von Ketten ("chain shuffling" ) aus randomisierten kombinatorischen Immunglobulin-Bibliotheken erzeugt werden.
Antikörper können auch durch Induktion einer in vivo-Produktion in der Lymphozyten-Population oder durch Screenen rekombinanter Immunglobulin-Bibliotheken oder von Gruppen hoch-spezifischer Bindungs-Reagenzien erzeugt werden.
Antikörper-Fragmente, die spezifische Bindungsstellen für PIBF enthalten, können ebenfalls hergestellt werden. Beispielsweise zählen zu diesen Fragmenten, ohne auf diese eingeschränkt zu sein, die F (ab' ) 2-Fragmente, die durch Pepsin-Verdau des Antikörper-Moleküls erzeugt werden können, und die Fab- Fragmente, die durch Reduktion der Disulfid-Brücken der F(ab')2- Fragmente erzeugt werden können. Alternativ können Fab- Expressions-Bibliotheken konstruiert werden, um eine rasche und einfache Identifizierung monoklonaler Fab-Fragmente mit der gewünschten Spezifität zu ermöglichen.
Verschiedene Immunoassays können zum Screenen verwendet werden, um Antikörper mit der gewünschten Spezifität zu identifizieren. Zahlreiche Protokolle für kompetitive Bindungs- oder immunradiometrische Tests unter Verwendung entweder polyklonaler oder monoklonaler Antikörper mit etablierten Spezifitäten sind auf dem Gebiet wohlbekannt. Zu solchen Immunoassays gehört typischerweise die Messung der Komplex-Bildung zwischen PIBF und seinem spezifischen Antikörper. Ein Zwei-Stellen-Immunoassay auf monoklonaler Basis unter Verwendung monoklonaler Antikörper, die gegenüber zwei voneinander unabhängigen PIBF-Epitopen reaktiv sind, ist bevorzugt, doch kann ein kompetitiver Bindungs-Test ebenso verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform wird die Konzentration des PIBF in der Probe durch einen kompetitiven Test gemessen. Gemäß diesem Verfahren wird eine feste Phase mit vorzugsweise rekombinantem Human-PIBF (oder seinen Varianten) mit einer spezifischen Konzentration bedeckt. Markierte anti-PIBF- Antikörper werden zusammen mit den zu messenden Beispielen zugegeben. Je höher die PIBF-Konzentration in der Probe ist, desto niedriger ist der entsprechene detektierte Wert. Auf Grund dieser Ablesungen kann die absolute Konzentration des PIBF bestimmt werden. Dies ist ein besonders präzises Verfahren, insbesondere, wenn die Probe eine Körperflüssigkeit ist, und kann beispielsweise mittels ELISA durchgeführt werden.
Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Konzentration des PIBF in einer Probe mittels eines Sandwich-Tests gemessen. Für diesen Test muss man zwei anti- PIBF-Antikörper haben, die jeder an ein anderes Epitop des PIBF- Moleküls binden. Der erste anti-PIBF-Antikörper ist vorzugsweise an einem festen Träger immobilisiert, wonach die zu messende Probe zugegeben wird, so dass der in der Probe vorhandene PIBF an den ersten anti-PIBF-Antikörper bindet. Ein zweiter anti- PIBF-Antikörper, der vorzugsweise markiert ist, wird zugegeben, so dass er an den gebundenen PIBF bindet. Die Menge des gebundenen zweiten anti-PIBF-Antikörpers wird gemessen und als Angabe für die absolute Konzentration des PIBF in der Probe verwendet. Auch dieses Verfahren wird vorzugsweise verwendet, wenn die zu messende Probe eine Körperflüssigkeit des Patienten ist, und kann mittels ELISA durchgeführt werden.
Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Konzentration des PIBF in einer Probe mittels Immunfärbung gemessen. Dieses Verfahren wird vorzugsweise dann verwendet, wenn die zu messende Probe eine Gewebsprobe des Patienten ist. Gemäß diesem Verfahren wird der anti-PIBF- Antikörper direkt zur Gewebsprobe des Patienten zugegeben, wo er an den in der Gewebsprobe vorhandenen PIBF bindet . Der gebundene Antikörper wird dort durch direkte Anzeige der Konzentration des PIBF in der Gewebsprobe quantifiziert. Dieses Verfahren ermöglicht die Lokalisierung von PIBF in einer Probe. Vorzugsweise wird die PIBF-Konzentration indirekt gemessen, durch Messung der Konzentration von PIBF-mRNA in der Probe. Dazu können Polynukleotide, einschließlich Oligonukleotid-Sequenzen, antisense-RNA- und -DNA-Moleküle und PNAs verwendet werden. Die Polynukleotide können zur Detektion und Quantifizierung der Gen- Expression in Proben verwendet werden, in welchen die Expression von PIBF mit einem Tumor in Verbindung gebracht wird. Demgemäß kann ein Set bereitgestellt werden, welches ein Reagens umfasst, das die oben erwähnten (markierten) Polynukleotide aufweist, um eine PIBF-mRNA-Messung in der bestimmten Probe durchzuführen. Hier ist es wiederum weiters bevorzugt, die Konzentration alternativ prozessierter mRNA zu messen. Auch die Anwesenheit oder Abwesenheit eines spezifischen mRNA-Moleküls kann eine Information dahingehend liefern, ob die Zellen Tumorzellen sind oder nicht .
Gemäß einem Aspekt kann die Hybridisierung mit Nukleotid-Sonden zur Identifizierung von PIBF-mRNA-Sequenzen verwendet werden. Nukleotid-Sequenzen, die zur PIBF-mRNA komplementär sind, können mittels Standardmethoden markiert werden und unter Bedingungen, die für die Bildung von Hybridisierungskomplexen geeignet sind, zu einer Flüssigkeits- oder Gewebsprobe eines Patienten zugegeben werden. Nach einer geeigneten Inkubationsdauer wird die Probe gewaschen, und das Signal wird quantifiziert und mit dem Schwellenwert verglichen.
Die Spezifität der Sonde, ob sie aus einer hochspezifischen Region oder aus einer weniger spezifischen Region hergestellt ist und die Stringenz der Hybridisierung (maximal, hoch, mittel oder niedrig) bestimmen, ob die Sonde nur natürlich vorkommende Sequenzen, die für PIBF codieren, Allele, oder verwandte Sequenzen identifiziert.
Sonden, die für die Hybridisierung von PIBF-mRNA (verwandten) Sequenzen verwendet werden, sollten vorzugsweise eine mindestens 50%, vorzugsweise 70%, noch mehr bevorzugt 90%, Homologie mit der PIBF-codierenden Sequenz oder Fragmenten davon aufweisen. Die Hybridisierungssonden der vorliegenden Erfindung können DNA oder RNA sein und von der Nukleotid-Sequenz der SEQ ID. Nr.3 (PIBF-cDNA) stammen. Beispiele für solche zu detektierende und/oder zu quantifizierende PIBF-mRNA-Moleküle sind z.B. jene, die von DNA oder RNA detektiert werden, welche von der Nukleotid-Sequenz der SEQ ID Nr. 5, 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35 und 37 stammt. Da es sich zeigte, dass die Exons 17 und 18 in beinahe allen identifizierten mRNA-Formen inkludiert sind, werden vorzugsweise die DNA oder RNA, die von einer für die Exons 17 und 18 codierenden Sequenz stammen (vgl. die Figuren) für die Detektion oder Quantifikation von PIBF-mRNA in einer Probe verwendet .
Hybridisierungssonden können mittels verschiedenster Marker- Gruppen markiert werden, beispielsweise Radionukleotide, wie 32P oder 35S, oder enzymatischen Markierungen, wie alkalische Phosphatase, die über Avidin/Biotin-Kopplungssysteme mit der Sonde gekoppelt ist, u.dgl..
Die für PIBF codierenden Polynukleotid-Sequenzen können weiters bei der Northern Blot-Analyse, Dot-Blot oder anderen Techniken auf Membran-Basis verwendet werden; bei Dip-Stick-, Pin, ELISA oder (Mikro) -Chip-Tests unter Verwendung von Flüssigkeiten oder Geweben aus Patienten-Biopsien zur Detektion von PIBF-mRNAs . Solche Methoden sind auf dem Gebiet wohl bekannt.
Zusätzlich kann PIBF-mRNA mittels RT-PCR detektiert und gemessen werden: In einem ersten Schritt wird die mRNA durch Revers- Transcriptase in cDNA transkribiert, wonach die cDNA detektiert und mittels PCR quantifiziert wird. Die Oligomeren für die PCR können chemisch synthetisiert, enzymatisch erzeugt, oder aus einer rekombinanten Quelle produziert sein. Oligomere bestehen vorzugsweise aus zwei Nukleotid-Sequenzen, einer mit sense- und einer anderen mit antisense-Orientierung, die unter optimierten Bedingungen zur Identifizierung der spezifischen Sequenz verwendet werden. Dieselben beiden Oligomeren, "nested" Sets von Oligomeren oder selbst ein degenerierter Pool von Oligomeren können unter weniger stringenten Bedingungen zur Detektion und/oder Quantifizierung nah verwandter Sequenzen verwendet werden. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der positiven oder negativen Progression eines Tumors in einem Patienten, umfassend das Diagnostizieren eines Tumors bei einem Patienten gemäß einer der oben erwähnten Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, und das Bestimmen, ob die gemessene Konzentration des PIBF oder eines Derivats davon oder Fragments davon in der Probe über oder unter mindestens einer zuvor gemessenen Konzentration des PIBF oder eines Derivats davon oder Fragments davon in mindestens einer zuvor vom selben Patienten entnommenen Probe ist, wobei eine Konzentration über der zuvor gemessenen Konzentration eine positive Progression identifiziert. Da die Konzentration des PIBF in einer Probe direkt proportional zur Progression des Tumors, z.B. Größe, Entwicklung etc. ist,' ermöglicht das Verfahren gemäß der vorliegen-den Erfindung eine direkte Analyse des Krankheitsverlaufs. Für eine vollständige Charakterisierung der Progression des Tumors ist es natürlich vorteilhaft, über einen Zeitraum viele Proben zu nehmen, insbesondere vor und nach einer spezifischen Behandlung, z.B. mit einer Substanz oder durch vollständiges oder teilweises Entfernen des Tumorgewebes, in welchem Fall die Wirksamkeit der spezifischen Behandlung analysiert werden kann. Der hierin verwendete Ausdruck "positive Progression" bedeutet, dass sich der Tumor weiterentwickelt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines anti-PIBF-Antikörpers oder eines Fragments desselben bei einem oben beschriebenen Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Wie voranstehend erwähnt, kann der anti- PIBF-Antikörper monoklonal, polyklonal, er kann weiters rekombinant, humanisiert oder ein durch Phagen codierter Einzelketten-Antikörper sein. Wenn nur ein Fragment des Antikörpers verwendet wird, umfasst dieses Fragment das Epitop des anti-PIBF-Antikörpers, welches den PIBF erkennt.
Es ist bevorzugt, einen monoklonalen Antikörper zu verwenden, um ein höchst spezifisches und präzises Ergebnis zu erreichen. Der monoklonale Antikörper kann, wie oben erwähnt, hergestellt werden, und die oben angeführten Beispiele gelten auch hier.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon bei einem der oben erwähnten Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung. Wie bereits voranstehend erwähnt, kann das Fragment ein Fragment des PIBF oder ein Fragment des PIBF- Derivats sein. Hier gelten dieselben Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen oder Beispiele, wie oben erwähnt.
Vorzugsweise ist der PIBF rekombinant, was bedeutet, dass auch das Derivat oder das Fragment rekombinant sein kann.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set, welches ein erstes Reagens, das mindestens einen anti-PIBF- Antikörper oder ein Fragment davon aufweist, und ein zweites Reagens, das PIBF oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon in einer bestimmten Konzentration aufweist, umfasst. Natürlich sind der anti-PIBF-Antikörper und der PIBF in einer Form vorhanden, die deren Lagerung ermöglicht, z.B. in trockener, lyophilisierter, gefrorener oder gelöster Form. Weiters kann das Set jedwede weitere Puffer, Enzyme, Salze etc. enthalten, die für die Durchführung des oben erwähnten Verfahrens notwendig sind.
Vorzugsweise umfasst das Set eine feste Phase, an welche der mindestens eine anti-PIBF-Antikörper oder das Fragment davon oder der PIBF oder das Derivat davon oder das Fragment davon gebunden ist. Die feste Phase kann jede dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannte feste Phase sein, z.B. jedes unlösliche Material, das ein Substrat darstellen kann, auf welchem man die Proteine oder Peptide immobilisieren kann, beispielsweise in Form eines trockenen Streifens. Zu solchen Substraten können Nylon, Aminosäuren, Glas, Cellulose u.dgl. zählen. Das Set kann vorzugsweise für einen kompetitiven oder für einen Sandwich-Test verwendet werden, wobei das weitere Reagens, das entweder den Antikörper oder den PIBF aufweist, je nachdem, welcher an der festen Phase immobilisiert ist, und die Probe zur festen Phase zugegeben werden.
Vorzugsweise ist der im oben erwähnten Set vorhandene PIBF rekombinant, was natürlich bedeutet, dass auch das Derivat davon bzw. -das Fragment davon rekombinant sind. Ein bevorzugtes Set umfasst ein weiteres Reagens mit einem zweiten anti-PIBF-Antikörper oder einem Fragment davon, welches an ein Epitop des PIBF bindet, das von dem vom ersten anti-PIBF- Antikörper oder dessen Fragment erkannte Epitop verschieden ist. Dieses Set ist besonders vorteilhaft, um einen Sandwich-Test durchzuführen.
Das oben erwähnte Set gemäß der vorliegenden Erfindung dient vorzugsweise zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten bzw. zur Feststellung der Progression eines Tumors bei einem Patienten. Die Verfahren sind dieselben, wie oben beschrieben, wobei das Reagens, das den PIBF oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon in der bestimmten Konzentration aufweist, entweder als positive Kontrolle, wie oben beschrieben, oder zur Durchführung eines kompetitiven Tests, wie oben beschrieben, (wobei es in Konkurrenz zum in der Probe des Patienten vorhandenen PIBF verwendet wird, ) oder für beides verwendet wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines anti-PIBF-Antikörpers oder eines Fragments davon zur Herstellung eines anti-Tumor-Medikaments . Der anti- PIBF-Antikörper oder das Fragment davon bewirkt eine spezifische Blockierung oder Neutralisierung von PIBF, wodurch die PIBF- Aktivität in Tumoren spezifisch eliminiert wird und die Tumoren somit für NK (und potentiell für CD8+ und andere T-Zellen- vermittelte Lyse) empfänglich gemacht werden. Weiters können mono- und bi-spezifische Antikörper PIBF an der Oberfläche von Tumorzellen spezifisch erkennen und können verwendet werden, um toxische Substanzen an das tumoröse Kompartiment des Körpers des Patienten abzugeben. Die Hauptstrategie des anti-Tumor- Medikaments ist die Verwendung des Wissens, dass Tumorzellen höhere PIBF-Konzentrationen erzeugen. Mit dieser Information, die die Grundlage der vorliegenden Erfindung bildet, können verschiedene Strategien zur Bekämpfung eines Tumors bei einem Patienten entwickelt werden.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Antikörper ein monoklonaler, humanisierter, bzw. Einzelketten-Antikörper. Die oben erwähnten hinterlegten Antikörper können auch für diesen Aspekt der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Vorzugsweise hat der Antikörper ein an ihm haftendes Molekül . In diesem Fall wird der anti-PIBF-Antikörper als Ziel- oder Abgabe- Mechanismus verwendet, um ein Molekül, z.B. ein pharmazeutisches Mittel, zu Zellen oder Geweben zu bringen, die PIBF exprimieren. Der Antikörper, der dem Patienten verabreicht wird, bindet an den PIBF exprimierenden Tumor und bringt dadurch das Molekül, das für den Tumor toxisch ist, in direkten Kontakt mit dem Tumor. Es gibt verschiedene Verfahren und Moleküle, die verwendet werden, die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind. Beispielsweise kann ein toxisches Molekül verwendet werden, das in die Tumorzellen eindringt und beispielsweise in essentielle Stoffwechselschritte eingreift, wodurch es die Zellen tötet. Das toxische Molekül kann auch eine Zell-Lyse induzieren oder als Rezeptor für andere toxische Substanzen oder Enzyme dienen, die die tumorösen Zellen töten. Das Wichtigste ist jedoch, unabhängig von der Art, in welcher das toxische Molekül wirkt, dass das Molekül durch den anti-PIBF-Antikörper spezifisch zu den tumorösen Zellen geleitet wird und in gesunde Zellen nicht eingreift.
Das Molekül kann vorzugsweise eine toxische Substanz bzw. ein Prodrug sein, insbesondere ein Radionuklid, ein Toxin bzw. ein chemotherapeutisches Medikament. Durch Abgabe der Substanz an das tumoröse Ziel wird ein wirksames Anti-Tumor-Medikament erhalten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des PIBF oder eines Derivats davon oder Fragments davon für die Herstellung eines Anti-Tumor-Medikaments . Gemäß der vorliegenden Erfindung gibt es zwei Strategien für diese Anti-Tumor-Medikamente:
- Ein PIBF-Derivat oder ein Fragment desselben wird als Hemm- Protein oder -Peptid verwendet, welches in die PIBF-Wirkung eingreift, indem es putative Rezeptoren für PIBF, die an Zellen, z.B. NK-Zellen, vorhanden sind, bindet und dadurch blockiert oder inaktiviert, oder Signal-gebende Komponenten stromabwärts der Rezeptor-Bindung inhibiert .
- Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Medikament ein Vakzin. Das PIBF-Derivat oder Fragment davon weist das immunogene Peptid von PIBF auf und kann zur Impfung verwendet werden, entweder um Antigen-spezifische cytotoxische Anti-Tumor-T-Zellen-Reaktionen zu induzieren und/oder um die Produktion neutralisierender Antikörper durch das Immunsystem des Krebspatienten selbst zu stimulieren, was die NK-Zellen von der Suppression durch PIBF befreien würde.
Vorzugsweise weist das Vakzin ein Adjuvans auf. Ein solches Adjuvans können beispielsweise, doch nicht ausschließlich, Freund' sehe Mineral-Gele, wie Aluminiumhydroxid und grenzflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Pluronic- Polyole, Polyanione, Polykatione (z.B. polyArg) , Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Napfschnecken-Haemocyanin und Dinitrophenol sein. Zu den bei Menschen vorzugsweise verwendeten Adjuvantien gehören BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum.
Vorzugsweise ist der PIBF oder das Derivat davon oder das Fragment davon rekombinant bzw. ein chemisch synthetisiertes Molekül .
Ein vorteilhafter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Polynukleotids, das für PIBF oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon codiert, oder eines PIBF- antisense-Moleküls zur Herstellung eines Anti-Tumor-Medikaments . Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck "für PIBF codierendes Polynukleotid" oder "zur PIBF-mRNA komplementäre Nukleotidsequenzen" auf eine Sequenz, die von einer Sequenz stammt, welche vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nr. 3, 5, 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35, 37 oder Fragmenten oder Derivaten davon.
Gene, die für PIBF codieren, können durch Transformation einer Zelle oder eines Gewebes mit Expressionsvektoren, die große Mengen eines Polynukleotids oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon, das für PIBF codiert, ausgeschaltet werden. Solche Konstrukte können verwendet werden, um untranslatierbare sense- oder antisense-Sequenzen in eine Zelle einzuführen. Selbst wenn keine Integration in die DNA vorliegt, können solche Vektoren weiterhin RNA-Moleküle transkribieren, bis sie durch endogene Nukleasen abgeschaltet werden. Eine vorübergehende Expression kann bei einem nicht-replizierenden Vektor einen Monat oder länger dauern und noch länger, wenn geeignete Replikationselemente Teil des Vektor-Systems sind.
Modifikationen der Gen-Expression sind durch Entwerfen von antisense-Molekülen, DNA, RNA oder PNA, zu den Steuerregionen des für PIBF codierenden Gens, d.h. der Promotoren, Enhancer und Introne, erhältlich. Oligonukleotide, die aus der Transkriptionsinitiierungsstelle stammen, z.B. zwischen den Positionen -10 und +10 ab der Start-Stelle, sind bevorzugt. In ähnlicher Weise kann eine Hemmung unter Verwendung der "Dreifach-Helix"-Basenpaarungs-Methodik erreicht werden. Dreifach-Helix-Paarung ist nützlich, weil es die Hemmung der Fähigkeit der Doppelhelix, sich für die Bindung von Polymerasen, Transkriptionsfaktoren oder regulierenden Molekülen genügend zu öffnen, bewirkt. Die antisense-Moleküle können auch so gestaltet werden, dass sie die Translation der mRNA blockieren, indem sie das Transkript hindern, an Ribosome zu binden.
Der Ausdruck "antisense", wie hierin verwendet, bezieht sich auf Nukleotid-Sequenzen, die zu einer spezifischen DNA- oder RNA- Sequenz komplementär sind. Antisense-Moleküle können mit jedem Verfahren hergestellt werden, einschließlich einer Synthese durch Ligieren des (der) Gens (Gene) , an welchem (welchen) ein Interesse besteht, in umgekehrter Orientierung zu einem Virus- Promotor, der die Synthese eines komplementären Stranges ermöglicht. Sobald er in eine Zelle eingeführt ist, vereinigt sich dieser transkribierte Strang mit den natürlichen, von der Zelle produzierten Sequenzen, um Duplexe zu bilden. Diese Duplexe blockieren dann entweder die weitere Transkription oder die Translation.
Gemäß einem Aspekt können antisense-Moleküle zu dem für PIBF codierenden Polynukleotid in Situationen verwendet werden, in welchen es wünschenswert wäre, die Transkription der mRNA zu blockieren. Insbesondere können Zellen mit Sequenzen transformiert werden, die zu für PIBF codierenden Polynukleoti en komplementär sind. So können antisense-Moleküle verwendet werden, um die PIBF-Aktivität zu modulieren, oder um eine Regulierung der Gen-Funktion zu erreichen. Eine derartige Technik ist auf dem Gebiet wohlbekannt, und sense- oder antisense-Oligomere oder größere Fragmente können von verschiedenen Orten entlang der Codier- oder Steuerregionen von Sequenzen, die für PIBF codieren, entworfen werden.
Expressions ektoren, die von Retroviren, Adenovirus, Herpes- oder Vaccinia-Viren oder von verschiedenen Bakterien-Plasmiden stammen, können zur Abgabe von Nukleotid-Sequenzen an das angepeilte tumoröse Organ, Gewebe, oder die Zellpopulation verwendet werden. Verfahren, die dem Fachmann auf diesem Gebiet gut bekannt sind, können zur Konstruktion rekombinanter Vektoren verwendet werden, die antisense-Moleküle exprimieren, welche zu den Polynukleotiden des für den PIBF codierenden Gens komp1ementär sind.
Ribozyme, enzymatische RNA-Moleküle, können ebenfalls zur Katalyse der spezifischen Spaltung von RNA verwendet werden. Zum Mechanismus der Ribozym-Wirkung gehört die Sequenz-spezifische Hybridisierung des Ribozym-Moleküls an eine komplementäre Ziel- RNA, gefolgt von endonukleolytischer Spaltung. Beispiele, die verwendet werden können, umfassen hergestellte Hammerkopf-Motiv- Ribozym-Moleküle die die endonukleolytische Spaltung von Sequenzen, die für PIBF codieren, spezifisch und effizient katalysieren können.
Spezifische Ribozym-Spaltungssteilen innerhalb jedes potentiellen RNA-Zieles werden anfangs durch Scannen des Ziel- Moleküls auf Ribozym-Spaltungsstellen, die die folgenden Sequenzen inkludieren, identifiziert: GUA, GUU und GUC. Sobald sie identifiziert sind, können kurze RNA-Sequenzen von zwischen 15 und 20 Ribonukleotiden, entsprechend der Region des Ziel- Gens, das die Spaltstelle enthält, im Hinblick auf sekundäre Strukturmerkmale, die das Oligonukleotid inoperabel machen könnten, bewertet werden. Die Eignung der Anwärter-Ziele kann auch durch Testen der Zugänglichkeit zu einer Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden unter Verwendung von Ribonuklease-Schutz-Tests evaluiert werden.
Antisense-Moleküle und -Ribozyme der Erfindung können mit jedem Verfahren, das auf dem Gebiet für die Synthese von Nukleinsäuremolekülen bekannt ist, hergestellt werden. Zu diesen zählen Techniken zur chemischen Synthetisierung von Oligonukleotiden, wie die chemische Festphasen-Phosphoramidit- Synthese. Alternativ können RNA-Moleküle durch in vi tro- und in vivo-Transkription von DNA-Sequenzen, die für PIBF codieren, erzeugt werden. Solche DNA-Sequenzen können in vielerlei Vektoren mit geeigneten RNA-Polymerase-Promotoren, wie T7 oder SP6, inkorporiert werden. Alternativ können diese cDNA- Konstrukte, die antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisieren, in Zelllinien, Zellen oder Gewebe eingebracht werden.
RNA-Moleküle können modifiziert werden, um die intrazelluläre Stabilität und die Halbwertszeit zu erhöhen. Zu den möglichen Modifikationen zählen, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein, die Addition von flankierenden Sequenzen am 5 ' - und/oder 3 ' -Ende des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorthioat oder 2 ' -O- Methyl anstelle von Phosphodiesterase-Bindungen innerhalb des Molekül-Gerüstes . Dieses Konzept wohnt der Produktion von PNAs inne und kann in allen diesen Molekülen erweitert werden durch den Einschluss nicht-traditioneller Basen, wie Inosin, Queosin und Wybutosin sowie Acetyl-, Methyl-, Thio- und ähnlich modifizierter Formen von Adenin, Cytidin, Guanin, Thymin und Uridin, die von endogenen Endonukleasen nicht so leicht erkannt werden.
Viele Methoden zur Einführung von Vektoren in Zellen oder Gewebe sind verfügbar und gleichermaßen zur Verwendung in vivo, in vi tro und ex vivo geeignet. Für die ex vivo-Therapie können Vektoren in Stammzellen eingefügt werden, die dem Patienten entnommen wurden und klonal vermehrt wurden zwecks autologer ReTransplantation in denselben Patienten (allogene Stammzellen- Transplantation) . Ein Einbringen durch Transfektion und durch Liposom-Injektionen kann unter Verwendung von Verfahren, die auf diesem Gebiet wohl bekannt sind, erreicht werden. Jedes der oben beschriebenen Anti-Tumor-Medikamente kann an jedem geeigneten Subjekt, einschließlich beispielsweise Säugern, wie Hunden, Katzen, Kühen, Pferden, Kaninchen, Affen und, am meisten bevorzugt, Menschen, angewendet werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung eines Patienten mit einem Tumor, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines anti- PIBF-Antikörpers oder eines Fragments davon an den Patienten umfasst.
In zwei Veröffentlichungen (Szekeres-Bartho et al . , Am.J.Reprod. Immuno. 24, 105, 1990; Szekeres-Bartho et al . , Cell .Immunol .177, 194, 1997) wurde nachgewiesen, dass die Zugabe von neutralisierendem anti-PIBF-Antikörper bei Mäusen ein erfolgreiches Schwangerschaftergebnis stört. Außerdem verhinderte PIBF, isoliert aus Kulturüberständen von mit Progesteron behandelten Maus-Lymphozyten bei Injektion in vivo die abortive Wirkung von Anti-Progesteron-Medikamenten. Diese Daten lassen darauf schließen, dass diese Reagenzien auf ähnliche Weise bei Patienten mit Krebs oder mit Autoimmunerkrankungen wirken könnten.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung eines Tumors bei einem Patienten, wobei dieses Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon umfasst.
Ein anderer bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung eines Tumors bei einem Patienten, wobei das Verfahren die Verabreichung einer wirksamen Menge eines Polynukleotids , das für PIBF oder für ein Derivat davon oder ein Fragment davon oder für PIBF-antisense-Molekül codiert, umfasst.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Präparation zur Behandlung eines Tumors bei einem Patienten, wobei die Präparation einen anti-PIBF- Antikörper oder ein Fragment davon, PIBF oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon, und von Polynukleotid codierten PIBF oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon bzw. ein PIBF- antisense-Molekül umfasst. Natürlich gelten auch hier wiederum dieselben Definitionen und bevorzugten Ausführungsformen wie oben erwähnt .
Die pharmazeutische Zusammensetzung kann alleine oder in Kombination mit mindestens einem anderen Mittel, wie einer stabilisierenden Verbindung, verabreicht werden, welche in jedem sterilen, biokompatiblen pharmazeutischen Träger verabreicht werden kann, einschließlich - doch nicht ausschließlich - Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose und Wasser. Die pharmazeutischen Präparationen können alleine oder in Kombination mit anderen Mitteln, Arzneistoffen oder Hormonen einem Patienten verabreicht werden. Die für das Verfahren zur Behandlung eines Tumors bei einem Patienten verwendeten pharmazeutischen Präparationen können auf zahlreichen Wegen verabreicht werden, einschließlich - jedoch nicht ausschließlich - oral, intravenös, intramuskulär, intraarteriell, intramedullar, intrathekal, intraventrikulär, transdermal, subkutan, intraperitoneal, intranasal, enteral, topisch, sublingual oder rektal .
Zusätzlich zu den aktiven Ingredienzien können diese pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch akzeptable Träger, einschließlich Exzipienten und Hilfsstoffe, aufweisen, die die Verarbeitung der aktiven Verbindungen zu Präparationen, die pharmazeutisch verwendet werden können, erleichtern. Die Träger ermöglichen die Formulierung der pharmazeutischen Präparationen als Tabletten, Pillen, Dragees, Kapseln, Flüssigkeiten, Gele, Sirups, Aufschlämmungen, Suspensionen u. dgl ..
Gemäß einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein rekombinantes Protein mit einer PIBF-Aktivität gemäß SEQ. ID.Nr.l und Derivate davon. Dieses PIBF-Protein gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt die volle PIBF-Aktivität, vergleichbar natürlichem PIBF (umfassend die Sequenz gemäß SEQ. ID. r.2) , weist jedoch nicht die exakten Aminosäuren 595 bis 614 sowie die Aminosäure Nr. 333 gemäß der natürlichen PIBF- Sequenz (SEQ. ID.Nr.2) auf. Die Proteinsequenz des rekombinanten PIBF-Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung (SEQ. ID.Nr.l) umfasst 757 Aminosäurereste. Die vorliegende Erfindung sieht daher neue rekombinante PIBF-Proteine mit der SEQ. ID.Nr.l oder Derivate oder Homologe davon vor. Daher umfasst das rekombinante Protein mit einer PIBF-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung
- die Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID.Nr.l, oder
- eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäure-Identität von mindestens 98% mit der Sequenz gemäß SEQ. ID.Nr.l, wie mittels FAST/A-Algorithmus bestimmt, oder
- eine Aminosequenz mit einer Aminosäure-Identität von mindestens 95% mit der Sequenz von Aminosäurerest 580 bis 630 von SEQ. ID.Nr.l, wie mittels FAST/A-Algorithmus bestimmt, und
- eine PIBF-Aktivität von mindestens 50% des natürlichen humanen PIBF-Moleküls .
Die PIBF-Aktivität kann als NK- oder CTL-Hemmung definiert und quantifiziert werden. Eine NK-Hemmung wird angenommen, wenn in Gegenwart von PIBF die ansonsten effizienten Effektor-Zellen (in Abwesenheit von PIBF getestet) paralysiert sind, d.h. entweder die Erkennung und Bindung (Konjugation) oder die Tötung der Ziel-Zellen als Folge der PIBF-Konzentration verringert ist. Die Aktivität kann als Prozent Inhibierung/μg PIBF oder ähnlicher Substanzen im Vergleich zu keinem PIBF ausgedrückt werden. Dies gilt in ähnlicher Weise für CTL-Hemmaktivität (Szekeres-Bartho et al., Cell. Immunol.177 (1997), 194-199, Szekeres-Bartho et al . , Am.J.Reprod. Immunol. 24, 105, (1990)). Weiters kann die PIBF-Aktivität als Th2-Verstärkung, die durch Quantifizierung von T 2(IL-3, IL-4, IL-6, IL-10)- zu Thl(IL-12, IFN-γ) - Lymphokinen entweder auf Protein- oder auf RNA-Ebene gemessen wird, und nachfolgende Feststellung des Verhältnisses der Th2- Signale zu den Thl-Signalen bestimmt wird, definiert und quantifiziert werden. Eine Zunahme der Th2- und eine gleichzeitige Abnahme der Thl-Cytokine zeigen eine Th2- Verstärkung an. Sie kann als Steigerung der Prozentsatzes von Th2-Cytokin-positiven oder eine Abnahme im Prozentsatz von Thl- Cytokin-positiven peripheren mononuklearen Blutzellen (peripheral blood ononuclear cells, PMBCs)/μg PIBF ausgedrückt werden. Man kann auch die absoluten Mengen dieser Cytokine (gemäß Standardmethoden aus der Literatur) , die in den Kulturüberstand oder in Körperflüssigkeiten sezerniert werden, als eine Funktion der PIBF-Konzentration zu messen. Die Cytokin- mRNAs können mittels Standard-Quantifizierungstests auf RT-PCR- Basis, Szekeres-Bartho et al . , AJRI 35 (1996), 348-351, Szekeres-Bartho et al . , Am.J.Reprod. Immunol. 23, 26, (1990), Szekeres-Bartho et al., Am.J.Ob.Gyn. 163, 1320 (1990) gemessen werden.
Trotz der wesentlichen Unterschiede in der Aminosäuresequenz des PIBF-Proteins gemäß der vorliegenden Erfindung im Vergleich zur natürlichen humanen PIBF-Sequenz ist es möglich, ein rekombinantes Protein mit einer Sequenz, wie oben definiert (SEQ. ID. r.1) zu erzeugen, welches rekombinante Protein besonders große funktioneile Ähnlichkeiten mit dem natürlichen Protein aufweist.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das rekombinante Protein eine Aminosäuresequenz, wie durch die Aminosäurereste 300 bis 350 in SEQ. ID.Nr.l angegeben, auf. Die Aminosäure Nr. 333 im natürlichen Human- PIBF-Protein (SEQ. ID.Nr.2) ist Cys anstelle von Arg im rekombinanten PIBF-Protein gemäß der vorliegenden Erfindung (SEQ. ID.Nr .1) . Daher weist das rekombinante Protein gemäß der vorliegenden Erfindung vorzugsweise ein Arg als Aminosäure Nr. 333 gemäß SEQ. ID.Nr.l und eine beträchtliche PIBF-Aktivität (>50%) auf. Es kann jedoch entweder an einem oder an beiden Enden weitere Aminosäurereste aufweisen, die mit den Aminosäureresten in SEQ. ID.Nr.l identisch, homolog zu diesen oder von diesen verschieden sind, solange das rekombinante Protein eine PIBF-Aktivität von mindestens 50% des natürlichen Human-PIBF-Moleküls hat.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist das rekombinante Protein eine Aminosäuresequenz, wie durch die Aminosäurereste 580 bis 630 in SEQ. ID.Nr.l angegeben, und eine beträchtliche PIBF-Aktivität (>50%) auf. Dieses rekombinante Protein weist daher die Sequenz des erfindungsgemäßen PIBF zwischen den Aminosäureresten 580 bis 630 in SEQ. ID.Nr.l auf. Es kann weiters entweder an einem oder an beiden Enden weitere Aminosäurereste aufweisen, die mit den Aminosäureresten in SEQ. ID.NO.1 identisch, homolog zu diesen oder von diesen verschieden sind, solange das rekombinante Protein eine PIBF-Aktivität von mindestens 50% eines natürlichen Human-PIBF-Moleküls hat.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Protein mit einer PIBF-Aktivität vorgesehen, umfassend
• die Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID.Nr. 4 oder
• eine Aminosäure mit einer Aminosäure-Identität von mindestens 85%, vorzugsweise mindestens 90%, noch mehr bevorzugt, mindestens 95%, am meisten bevorzugt, 99%, mit der Sequenz gemäß SEQ. ID. r.4, wie mittels FAST/A-Algorithmus bestimmt.
Dieses Protein erwies sich als ein 89 kDa-Protein mit einer PIBF-Aktivität, das von einer Maus isoliert worden war. Diese Aminosäuresequenz ist besonders vorteilhaft in Bezug auf die Aspekte der Detektion, Diagnose und Analyse von Tumoren, AntiTumor-Substanzen, karzinogenen Substanzen bei Mäusen, aber auch bei anderen Labor-Tieren. Weiters können mit Hilfe dieses erfindungsgemäßen Proteins Tests an Tieren, z.B. Mäusen, Meerschweinchen, Hamstern, Ratten, mit einer Veranlagung für einen Tumor durchgeführt werden. Ein weiterer Aspekt betrifft Tiere, insbesondere Mäuse, bei welchen dieses Protein inhibiert ist oder seine Aktivität blockiert ist. Dies kann z.B. durch das Vorsehen von Analoga der Bindungspartner dieses Proteins durchgeführt werden.
Ein bevorzugter Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Protein, welches eine Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 85%, vorzugsweise mindestens 90%, noch mehr bevorzugt, mindestens 95%, wie mittels FAST/A-Algorithmus bestimmt, mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus den SEQ. ID. r. 6, 8, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 23, 25, 27, 29, 31, 32, 34 und 36 aufweist, wobei dieses Protein ein alternativ prozessiertes PIBF-Protein ist. Es zeigte sich, dass alternativ prozessierte mRNA-Moleküle in verschiedenen Geweben vorhanden sind und daher auch alternativ prozessierte Proteine exprimieren. Überraschenderweise liegen diese alternativ prozessierten Proteine in Tumorgeweben in einer anderen Konzentration vor, im Vergleich zu den gesunden Geweben. Dies kann vorteilhaft zur Detektion und Analyse von Tumoren in einer Probe verwendet werden, wobei insbesondere die SEQ. ID.Nr. 6 und 8 bevorzugt sind, da diese zwei kleinere PIBF-Formen sind, die man in humanen Primär-Tumoren findet, die SEQ. ID.Nr. 6 im Adenokarzino des Magens und die SEQ. ID.Nr. 8 im Endo etrium- Adenokarzinom. Gegenstücke vom normalen Gewebe derselben Patienten exprimierten keine nachweisbaren Mengen dieser PIBF- mRNA-Spleiß-Varianten. Es zeigte sich jedoch auch, dass die Exons 17 und 18 in beinahe allen identifizierten Formen inkludiert sind. Daher sind Peptide, die diese Exons aufweisen, besonders vorteilhaft. Der Ausdruck "alternativ gespleißte PIBF- Proteine" bezieht sich auf Proteine, die von Proteinen mit PIBF- Aktivität abgeleitet sind.
Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Nukleinsäure-Molekül vor, das für das oben beschriebene rekombinante Protein mit einer PIBF-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung codiert. Es ist natürlich weiters möglich, dass das Nukleinsäure-Molekül eine zusätzliche Sequenz aufweist, die für mindestens ein zweites Protein, das ein anderes als das PIBF-Protein ist, codiert, wodurch eine Nukleinsäure-Sequenz vorgesehen wird, die für ein Fusionsprotein codiert, das mindestens in einem Teil ein Peptid mit PIBF- Aktivität aufweist.
In Bezug auf das Maus-Nukleinsäure-Molekül, z.B. SEQ. ID.Nr.5 oder ein Fragment davon, wird dies vorzugsweise zur Erzeugung von "knock-out" -Mäusen verwendet, d.h. von Mäusen, bei welchen die Expression des PIBF-Gens oder eines Fragments davon blockiert oder inhibert ist. Dies wird beispielsweise durchgeführt, indem ein antisense-Maus-PIBF-Nukleinsäure-Molekül oder ein Fragment davon vorgesehen wird, welche Strategie voranstehend beschrieben ist. Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft daher "knock-out" -Mäuse, die eine inhibierte oder reduzierte Expression des aktiven PIBF- Proteins aufweisen.
Vorzugsweise wird ein Nukleinsäure-Molekül vorgesehen, das für ein alternativ prozessiertes PIBF-Protein codiert, umfassend eine Nukleinsäuresequenz mit einer Identität von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, noch mehr bevorzugt, mindestens 95%, mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID. Nr. 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35 und 37 oder
• eine Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer der obigen Sequenzen hybridisiert, oder
• eine Sequenz, die infolge des genetischen Codes einer der obigen Sequenzen degeneriert ist.
Dies sind Nukleinsäuresequenzen, die alternativ gespleißten mRNA-Molekülen entsprechen, welche man in verschiedenen Geweben findet, wobei insbesondere die SEQ. ID.Nr.7 und die SEQ. ID.Nr.9 sich auf alternativ gespleißte mRNA-Moleküle beziehen, die man nur in Tumorgeweben fand, während normale Gewebe diese mRNA- Sequenzen nicht aufwiesen. Daher sind diese bei der Detektion oder Analyse von Tumoren sowie von gesunden Zellen und Geweben besonders vorteilhaft.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung einen Nukleinsäure-Vektor, der eine erfindungsgemäße Nukleinsäure-Sequenz aufweist.
Wenn der oben erwähnte Vektor gemäß der vorliegenden Erfindung in einen geeigneten Wirt eingeführt wird, wird mRNA produziert, die einen RNA-Strang für die Translation eines rekombinanten Proteins mit PIBF-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung oder ein erfindungsgemäßes Protein vorsieht.
Das Regulierungselement kann jedes geeignete Element sein, das dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, insbesondere ein spezifischer Promotor, der gemäß dem spezifischen Wirt, in welchen der Vektor eingeführt werden soll, ausgewählt wird, um eine maximale Produktion an rekombinantem Protein zu erreichen. Das Regulierungselement kann weiters Enhancer aufweisen, die die Transkription verstärken.
Vorzugsweise weist der Nukleinsäure-Vektor einen Selektionsmarker auf. Der Selektionsmarker kann jeder geeignete Marker sein, der dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt ist, um Zellen oder Wirtsorganismen zu selektieren, in welche der Vektor eingeführt worden ist. Ein solcher Selektionsmarker kann beispielsweise jedes Gen sein, das für ein eine Antibiotika- Resistenz vermittelndes Protein codiert, oder ein Gen, das für ein für den Zellstoffwechsel notwendiges Protein codiert, wobei die Zellen oder Wirtsorganismen, in die der oben erwähnte Vektor eingeführt werden soll, einen Mangel an diesem Protein aufweisen. Der Selektionsmarker kann weiters jedes Gen sein, das den Phänotyp der Zelle oder des Wirtsorganismus, die (der) den oben erwähnten Vektor aufgenommen hat, verändert, z.B. die Farbe.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Zelle, welche den oben erwähnten Vektor gemäß der vorliegenden Anmeldung aufweist. Der Vektor kann in das Genom der Zelle integriert sein oder auch als exogene DNA im Cytoplasma vorhanden sein, solange die Transkription des komplementären Nukleinsäure-Moleküls vorgesehen ist. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Ausdruck "Zelle" jede prokaryontische oder eukaryontische Zelle. Diese Zellen werden vorzugsweise zur Herstellung rekombinanter Proteine mit PIBF- Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet. Diese hergestellten rekombinanten Proteine können gemäß auf diesem Gebiet gut bekannter Verfahren isoliert und gereinigt und weiter verwendet werden, z.B. zur Herstellung pharmazeutischer Präparationen, die rekombinante Proteine mit PIBF-Aktivität gemäß der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele und Figuren genauer beschrieben, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
Fig. 1 zeigt die Ausrichtung rekombinanter und (natürlicher) Maus-PIBF-Aminosäuresequenzen,
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung der Exons und Introns in der PIBF-Gen-Region auf Chromosom 13 ,
Fig. 3 zeigt einen Northern Blot zur Detektion von PIBF-mRNA in verschiedenen Geweben.
Fig. 4 zeigt die immunhistochemische Analyse eines humanen Primär-Tumors .
Fig. 5A - 5D zeigen den Einfluss der anti-PIBF-Behandlung auf NK-Zell-Ziel-Tötung von Tumorzellen.
Fig. 6A - 6 C zeigen die Wirkung des rekombinanten PIBF auf IL- 10- und IL-12-Expression von Nicht-Schwangerschafts-Lymphozyten.
Fig. 7 zeigt PIBF-Mengen in Harnproben von Patienten mit nicht- Adenokarzinom-Tumoren und nicht-festen Tumoren.
Fig. 8 zeigt die Detektion erhöhter PIBF-Mengen mit Hilfe monoklonaler und polyklonaler Antikörper.
Fig. 9 zeigt die Normalisierung von PIBF-Mengen nach Operation oder Chemotherapie.
Fig. 10 zeigt die verschiedenen PIBF-mRNAs, die in humanen Primär-Tumoren überexprimiert wurden.
Fig. 11 zeigt die PIBF-Bindung an Human-PBMC.
Fig. 12 zeigt alterantiv gespleißte PIBF-mRNA.
Fig. 13 zeigt die immunohistochemische Analyse von humanen Primär- und Sekundär- (Metastasen) -Melanomen.
Fig. 14 zeigt die Detektion erhöhter PIBF-Mengen mit Hilfe von Peptid-spezifischen polyklonalen/monoklonalen Antikörpern.
Fig. 15 bis 16 zeigen PIBF-Mengen in Harnproben von Patienten mit hämatologischen Tumoren.
Fig. 17 zeigt die PIBF-Mengen in Harnproben von Patienten mit Kopf- und Hals-Tumoren vor und nach Therapie.
Fig. 18 zeigt die PIBF-Mengen in Harnproben von Patienten mit Harntrakt-Tumoren vor und nach Therapie.
Fig. 1 zeigt die Ausrichtung von rekombinantem (humanem) und Maus- (natürlichem) PIBF, wobei A die rekombinante Sequenz ist, B die IC-Maus-Sequenz (aus einer Maus-Hodenbibliothek kloniert) ist, C die EST-Maus, zusammengesetzt aus dEST-Bibliotheken auf Basis der Human-Sequenzen, ist und D die bovine Sequenz ist. X repräsentiert die Signal-Sequenz gemäß der PSG- Voraussagemethode, y die Signal-Sequenz gemäß der GvH- Voraussage, z das ER-Membran-Retentionssignal, w das Leucin- Zipp-Muster -DNA-Bindungsmotiv, v das peroxisomale Targeting- Signal und u das nukleare Lokalisations-Signal .
Das PIBF-Gen befindet sich auf Chromosom 13. Eine Anzahl von Introns sind im PIBF-Gen vorhanden (vgl. Fig. 2), wobei in Intron 2 mehrfache Kopien des Alu-repeat-Elements vorhanden sind, das als Stelle für alternatives Spleißen dient. A zeigt eine Lücke zwischen genomischen "contigs".
Fig. 3 zeigt einen Northern Blot zur Detektion von PIBF-mRNA in verschiedenen normalen Geweben: Magen (A) , Schilddrüse (B) , Rückenmark (C) , Lymphknoten (D) , Luftröhre (E) , Nebenniere (F) , Knochenmark (G) , Milz (H) , Thymus (I), Prostata (J) , Hoden (K) , Uterus (L) , Dünndarm (M) , Kolon (N) , PBL (0) , Herz (P) , Gehirn (Q, Plazenta (R) , Lunge (S) , Leber (T) , Skelettmuskel (U) , Niere (V) , Pankreas (W) . Die Pfeile in Fig. 4 zeigen 3 verschiedene mRNA-Formen an.
Beispiel 1: ESTs-Eintragungen, die zur humanen PIBF-Sequenz passen
EST-Eintragungen in Human-cDNA-Bibliotheken wurden gesucht, die zur humanen PIBF-Sequenz passen. 43 Eintragungen mit PIBF- Sequenzen wurden aus 2,2 Millionen dESTs, die in 3776 Human- cDNA-Bibliotheken abgelegt waren, gefunden. Diese 43 Eintragungen gehören zu 27 verschiedenen Bibliotheken. 7 der 27 (25%) Bibliotheken stammen von normalen Geweben (von nichtschwangeren Erwachsenen, ohne Tumor) . Wichtig ist, dass Hoden, welcher ein immun-privilegiertes Gewebe ist, häufig die Anwesenheit von PIBF-mRNA anzeigt. 13 der 27 Bibliotheken enthalten mRNAs, die in tumorösen Geweben exprimiert wurden (-50%) . Der Rest stammt von fötalem oder Schwangeren-Geweben. Dies zeigt, dass PIBF vorzugsweise während der Entwicklung, Schwangerschaft und Malignität exprimiert wird. Die Anzahl der passenden ESTs kann jedoch mit dem mRNA-Überfluss in Wechselbeziehung stehen, hängt jedoch sehr von der Qualität der Bibliothek ab. Aus diesem Grund kann man sie nicht direkt als Maß für die Expressionsmenge ansehen (vgl. Tabelle I).
TABELLE I
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Beispiel 2 : Bestimmung der PIBF-Konzentration in Harnproben von Krebspatienten
Ein kompetitiver Test auf ELISA-Basis wurde zur Messung von PIBF im Harn von Krebspatienten erstellt. ELISA-Platten wurden mit rekombinantem Human-PIBF mit einer Konzentration von 2 μg/ml beschichtet. Mit Biotin markiertes polyklonales anti-PIBF-IgG wurde zusammen mit den Proben, deren PIBF-Gehalt bestimmt werden sollte, zugegeben. Je höher die PIBF-Konzentration in der Probe, desto niedriger ist der entsprechende ELISA-Wert. Auf Grund dieser ELISA-Ablesungen kann die absolute PIBF-Konzentration bestimmt werden.
Harnproben von Krebspatienten wurden genommen und frisch verwendet oder kurz nach der Probennahme gefroren und bei -20°C bis zur Analyse gelagert. Es wurde zuvor bestimmt, dass die PIBF-Mengen im Serum bei gesunden schwangeren Frauen bedeutend höher sind als die Mengen bei nicht-schwangeren Frauen oder bei pathologischen Schwangerschaften. Um den Test an Harn-PIBF von Krebspatienten auszuwerten, dienten Harnproben von gesunden schwangeren Frauen und von normal gesunden, nicht-schwangeren Individuen als positive bzw. negative Kontrollen. Die Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefasst. Normale (gesunde, nichtschwangere) Individuen haben niedrige Harn-PIBF-Konzentrationen (5 ng/ml) . Der Harn schwangerer Frauen war durch eine durchschnittliche PIBF-Konzentration von 110 ng/ml gekennzeichnet. Es ist wichtig, dass hohe PIBF-Mengen nach einem Abortus oder Wehen rasch auf das normale Maß zurückkehrten. Eine Analyse der Harnproben von 65 Tumor-Patienten zeigte deutlich, dass Patienten mit einem Tumor eine wesentlich höhere Menge an PIBF in ihrem Harn aufwiesen als gesunde, nicht-schwangere Individuen, und zwar im Bereich von 5 bis 180 ng/ml. Patienten mit fortgeschrittenem Krebs (großer Primär-Tumor und/oder Metastasen) schienen höhere Werte zu haben, wofür als Beispiel die Daten von Harnproben von Patienten mit Lungentumor mit einer durchschnittlichen Konzentration von 28 gegenüber 43 ng/ml mit bzw. ohne Metastasen dienen.
Diese Daten zeigen, dass die PIBF-Konzentration in Beziehung zur Tumormasse steht, und der Nachweis von PIBF im Harn kann zur Überwachung der Krankheitsprogression und von Rückfällen verwendet werden. Der Anstieg der Harn-PIBF-Konzentration als Folge der Anwesenheit eines PIBF-produzierenden Tumors ist noch stärker, da nicht alle Tumor-Typen PIBF-positiv sind (-70-80% der bisher getesteten Tumoren) .
Der am meisten vorherrschende Tumor-Typ unter den Patienten war Lungenkrebs mit 23 Fällen. Die meisten der Lungenkrebs-Patienten wiesen eine hohe PIBF-Konzentration auf. Das Fehlen von hohem PIBF im Harn konnte mit dem klinischen Krankheitsstatus in Korrelation gesetzt werden, es waren nämlich die PIBF- Konzentrationen nach Entfernen des Primär-Tumors und im Remissionsstadium wesentlich niedriger oder sogar normal .
TABELLE II
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Beispiel 3 : Detektion von PIBF in Tumorgeweben
Nach dem Nachweis der PIBF-Expression mittels der MCF-7 (humanes Mamma-Epithelkarzinom) -Zelllinie wurde eine Reihe von humanen Primär-Tumoren auf die Expression von PIBF untersucht. Es zeigte sich, dass PIBF im Kulturüberstand von MCF-7-Zellen auftritt, was nahe legt, dass dieses Protein auf ähnliche Weise exprimiert und sezerniert wird, was man bei Kulturen von Lymphozyten von Schwangeren oder aktivierten Lymphozyten feststellte. Gemäß einer proteomischen Analyse erkennen anti-PIBF-Antikörper Proteine mit zwei verschiedenen Größen im Zelllysat durch 2D- Western-Analyse. Ein 34-kDa-Spot entspricht vermutlich der sezernierten Form. Ein weiteres großes, 60-62 kDa-Doublett wird nachgewiesen, welches die Zell-assoziierte Haupt-PIBF-Form sein könnte.
Eine Vielfalt von mit Formalin fixierten humanen Primär-Tumoren wurde ex vivo immunhistologisch untersucht unter Verwendung von polyklonalem Kaninchen-Antiserum, das durch Immunisierung mit humanem, natürlichem PIBF (34-kDa) oder rekombinantem PIBF (89- kDa) erzeugt worden war. Die Ergebnisse zeigen, dass viele der getesteten Tumor-Typen PIBF oder PIBF-verwandte Substanzen, z.B. PIBF-Moleküle verschiedener Länge, PIBF-Moleküle aus unterschiedlich gespleißter mRNA, trunkierte Moleküle, Fusionsproteine usw. exprimieren (Tabelle III) . 15 der 27 Tumoren (55%) zeigten eine stark positive Färbung. Das Fehlen einer spezifischen Immunfärbung der Normalgewebe-Gegenstücke beweist, dass transformierte Tumor-Zellen PIBF differentiell exprimieren (vgl. Fig. 4) . In der in Fig. 4 linken, mit "A" bezeichneten Spalte ist das Normalgewebe gezeigt, in der rechten, mit "B" bezeichneten Spalte sind Tumorgewebe gezeigt. In der ersten (mit "1" bezeichneten) Reihe ist Lungenkrebs (kleine Zellen), in der zweiten (mit "2") bezeichneten Reihe ist Harnblasenkarzinom (Übergangszelle) , und in Reihe "3" ist Magenkrebs (Adenokarzinom) gezeigt. Diese Daten belegen auch, dass die PIBF-Positivität ein Ergebnis der Expression durch die Tumorzellen selbst ist, und nicht der Bindung von PIBF aus dem extrazellulären Fluid (von infiltrierenden Lymphozyten sezerniert) . TABELLE III
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Auf Grund der oben erwähnten Ergebnisse ist die PIBF-Produktion ein ganz allgemeines Phänomen des malignen oder undifferenzierten Zustands, und folglich kann PIBF als Tumor- Marker dienen.
Beispiel 4 : Modulation der NK-Aktivität durch die Anwesenheit von PIBF
Wenn man alle Daten hinsichtlich der potentiellen Bedeutung von PIBF bei der Suppression von anti-Tumor-Reaktionen zusammennimmt, ist es plausibel, dass durch Tumorzellen erzeugter PIBF - sezerniert oder an der Zelloberfläche exprimiert - die Killerzellen-Aktivität systemisch oder lokal inhibieren wird. Es ist seit langem bekannt, das es Zelllinien gibt, die bei NK-Tests gute Ziele sind, wogegen andere dies nicht sind. Die Human-Tumor-Zelllinie MCF-7 gehört zur Kategorie der schlechten Ziele. Es ist daher eine Möglichkeit, dass die niedrige Tötungsaktivität gegen diese Zellen das Ergebnis einer PIBF-Produktion ist, die die NK-Aktivität inhibiert, da die MCF- 7-Zelllinie erwiesenermaßen PIBF produziert. Um diese Möglichkeit zu testen, wurden PIBF-exprimierende MCF-7-Zellen als Ziele in einem 4-stündigen Einzelzellen-Cytotoxizitäts-Test gemäß Grimm und Bonavida "Frequency determination of killer cells by a single-cell cytotoxic assay" ; Methods Enzymol . 93, 270 (1983) verwendet. In Fig. 5 ist gezeigt, dass die anti-PIBF- Behandlung die gezielte Tötung von Tumorzellen durch NK-Zellen verstärkt: Das Minus und das Plus bedeuten die Behandlung mit oder ohne anti-P BF-IgG, die Zahlen sind die Prozent der NK- Aktvität für Fig. 5A und 5B und die Prozent der Hemmung der NK- Aktivität für Fig. 5C und 5D. Die Quelle der NK-Zellen waren frisch isolierte PBMCs von gesunden Individuen. Tatsächlich steigerte die Behandlung dieser Tumor-Zellen mit anti-PIBF-IgGs ihre Empfindlichkeit gegenüber einer durch NK vermittelten Lyse drastisch, etwa 8-10fach (Fig. 5A) . Die grundlegende Tötungsaktivität gegen MCF-7-Zellen ist sehr niedrig (1-2%) , wogegen hohe Werte (50-80%) messbar sind, wenn K562-Zellen als Zielzellen in Paralleltests verwendet werden. Dieselbe anti- PIBF-Behandlung, die zur Steigerung der Zielaktivität von Tumorzellen wirksam zu sein scheint, hatte jedoch keine Wirkung auf eine Nicht-Tumor-Zelllinie (McCoy, Human-Embryo- Fibroblasten) (Fig. 5B) . Durch Charakterisierung repräsentativer Mitglieder (gute im Vergleich zu schlechten Zielen) beider Gruppen kann man eine Wechselbeziehung zwischen der Expression von PIBF- und NK-Zellaktivität aufstellen. Außerdem ermöglicht dieser Test die Untersuchung der Wirksamkeit von exogenem PIBF zur Verringerung der PIBF-Zielzellen-Tötung, und, was noch wichtiger ist, zur Beurteilung der Stärke neutralisierender anti-PIBF-Antikörper zur Stimulierung der Lyse von PIBF+ Tumorzellen. Neutralisierende Kaninchen-anti-Human- und auch -anti-Maus-Antiseren werden hergestellt, wobei diese polyklonalen Antikörper natürlichen PIBF in vi tro (Human- Leukozyten-Kulturen im NK-Test) oder in vivo (trächtige Mäuse, als Tiermodell) inaktivieren können. Durch Zugeben von rekombinantem PIBF zu K562-Zellen (als Ziele) und PBMCs (als Quelle für NK-Zellen) war es möglich, die grundlegende Tötungsaktivität um 60-70% zu verringern (Fig. 5C) . Antikörper, die gegen den rekombinanten PIBF erzeugt wurden, schalteten diese Inhibierung der Tötungsaktivität beinahe vollständig aus (Fig. 5D) .
Beispiel 5 ; Modulierung des Cytokin-Gleichgewichts
Einer der Hauptmechanismen der die Schwangerschaft fördernden Wirkung von PIBF ist die Induktion der TH2-Cytokine. Es gibt nun Beweise dafür, dass die rekombinante Form von PIBF auch wirksam ist, die Cytokin-Expression durch periphere Blutlymphozyten in vi tro zu modulieren. Um die Funktionalität des rekombinanten Human-PIBF, der in E. coli exprimiert und mittels GST-Markierung gereinigt worden war, zu testen, wurde rPIBF zu von Nicht- Schwangeren stammenden peripheren Lymphozyten, die mittels Ficoll-Pague-Gradient isoliert und mit einer 106/ml-Zelldichte gezüchtet worden waren, zugegeben. Die Erzeugung des Prototyps TH2-Lymphokin, IL-10, wurde durch Detektion und Zählen der Anzahl IL-10-positiver Lymphozyten (mittels Immunhistochemie auf Cytospins) nach 24 h Behandlung gemessen. Die Prozent IL-10- positiver Lymphozyten nahm in Abhängigkeit von der rPIBF- Konzentration von 0,35 +/- 0,15 auf 3,5 +/- 1,5% zu. Bei der höchsten rPIBF-Konzentration (10 μg/ml) waren lOx mehr IL-10- positive Lymphozyten vorhanden als in Kontroll-Kulturen (Fig. 6A) . Die entgegengesetzte Wirkung war auf IL-12 (THι-Lymphokin) - produzierenden Lymphozyten durch dieselbe Behandlung zu sehen. Die Anzahl IL-12-positiver Lymphozyten nahm in Abhängigkeit der PIBF-Konzentration ab, was zu einer etwa 8-fachen Verringerung bei der höchsten Menge an PIBF führte. Die Neutralisierung der Wirkung natürlichen PIBFs auf die Cytokin-Produktion war ebenso erfolgreich. Die 3-stündige Behandlung der Lymphozyten einer Schwangerschaft (PIBF produzierend) mit anti-PIBF-IgGs führte zu einer signifikanten Verringerung der Anzahl IL-10-positiver und einer signifikanten Zunahme der Anzahl IL-12-positiver Zellen (Fig. 6B und C) . Diese Ergebnisse beweisen, dass die rekombinante PIBF-Form aktiv zur Induktion von TH2-Cytokin- Expression ist. Von noch größerer Wichtigkeit ist, dass neutralisierende Antikörper aktiven PIBF, der durch Zellen in vivo erzeugt ist, entfernen und folglich Tm-Cytokine verstärken können.
Beispiel 6: Diagnose-Test Der diagnostische Wert der Harn-PIBF-Mengen bei Malignitäten wird weiter beispielhaft durch die Verwendung von Harnproben von Patienten mit nicht-Adenokarzinom-Tumoren und nicht-festen Tumoren (Fig. 7) gezeigt; die Punkte repräsentieren Ergebnisse mit einzelnen Seren. Die Durchschnittszahlen sind gezeigt. N bedeutet die Anzahl von Patienten.
Beispiele:
Verschiedene hämatologische Malignitäten, insbesondere Lymphome (LY, N:36) und auch Leukämien (Leu, N=18) , Plasmozytome (PL, N=ll) und myeloproliferative Erkrankungen (MOP, N=7) sind durch eine über der normalen Harn-PIBF-Konzentration (Kontrolle C, N=86) liegende Konzentration (Fig. 7A) ; (A = alle Tumoren) gekennzeichnet. Andere Beispiele sind Kopf- und Hals-Tumoren (Fig. 7C) und die Malignitäten des Harntrakts (Fig. 7B) + = mit Metastasen, N = 15; - = ohne Metastasen, N = 14. Es ist auch offensichtlich, dass die Masse des Tumorgewebes - das heißt, Erkrankung mit oder ohne Metastasen, Entfernen des Tumors - die PIBF-Konzentration stark beeinflusst (Fig. 7B, C) .
Die polyklonalen Antikörper werden in einem ähnlichen Antigen- Einfang-Sandwich-Test mit einem Paar monoklonaler Antikörper (ab) ersetzt, die in Mäusen unter Verwendung des N-terminalen 48 kDa-rPIBF als Antigen erzeugt wurden. Etwa zwanzig verschiedene Hybridom-Klone wurden getestet, danach wurden vier stabil und gut produzierende Klone für den ELISA-Test und auch für andere Diagnose-Methoden (Immunohistochemie) ausgewählt. Diese Hybridom-Klone sind bei der Hybridorn-Zellbank an der medizinischen Fakultät der Universität von Pecs hinterlegt. (Die Hinterlegungsnummern sind 11-14/2001, Zelllinien-Codes: HYB255- 258) . Die erhöhten PIBF-Mengen in Harnproben von Tumorpatienten werden mit den monoklonalen Antikörper-Paaren ähnlich den polyklonalen Antikörpern detektiert (Fig. 8) , wobei C = Kontrolle, A = alle hämatologischen Tumoren, L = Lymphom, Leu = Leukämie, P = Plasmazytom, N = nicht definiert; Nr. = Anzahl der Patienten; POLY = polyklonaler ab, MONO = monoklonaler ab.
Die umfangreicheren Daten verstärken nicht nur die diagnostischen Möglichkeiten, sondern insbesondere auch die Tumor-Überwachungsmöglichkeit des Harn- und Serum-PIBF-ELISA. Mit dem Test ist ein therapeutischer Erfolg und Fehlschlag nachweis- und vorhersagbar, wie sich durch eine Normalisierung der PIBF-Mengen nach einer Operation oder Chemotherapie und einen signifikanten Anstieg bei Patienten, die einen Rückfall erleiden, zeigt (Fig. 9A: hämatologischer Tumor, B: Harntrakt- Tumor) , sowohl bei den polyklonalen als auch bei den monoklonalen anti-PIBF-Antikörpern, wobei C = Kontrolle, B = vor Behandlung REL = Rückfall, REM = Remission.
Beispiel 7 : Verschiedene Formen von PIBF
Zusätzlich zum Human-PIBF der gesamten Länge wurde Maus-PIBF- mRNA der gesamten Länge und die Proteinsequenz identifiziert (SEQ. ID.Nr.4, 5) . Der Maus-PIBF ist auch in 18 Exons organisiert und weist eine Aminosäuren-Homologie von 89% auf.
Beim Versuch, die PIBF-mRNA-Mengen in normalen und Tumor-Geweben mit RT-PCR zu vergleichen, entdeckte man eine Anzahl alternativ gespleißter PIBF-mRNA-Formen. Die Struktur der alternativ gespleißten mRNAs und die korrespondierenden Protein-Produkte sind in Tabelle IV zusammengefasst . Alle in einer Spezies identifizierten Formen können in anderen Spezies vorkommen und ähnliche Funktionen haben. Dies ist durch die homologen 35 kDa- PIBF-Protein-Formen beispielhaft angeführt. Mit Ausnahme einer Form von mRNA, die eine alternative Exon 14 ' -DNA enthält, die in der vorherrschenden pre-mRNA eine Intron-Sequenz ist, wurden sie alle durch ein perfektes Exon-"Skipping" erzeugt, wobei mehrere Exons im Vergleich zur gesamten Länge ausgelassen wurden. Die Exon-17- und -18-Sequenzen sind in beinahe allen identifizierten Formen inkludiert. Das lässt darauf schließen, dass die von diesen Exons codierten Aminosäuresequenzen für die PIBF-Funktion wesentlich sind. Außerdem führen mehrere mRNA-Formen mit verschiedenen Sequenzen zu diesem selben C-terminalen PIBF- Polypeptid mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 10 kDa. Die trunkierten Formen des PIBF, die mittels RT-PCR-Analysen von RNA-Proben identifiziert wurden, wurden aus verschiedenen humanen (SEQ. ID.Nr. 6, Nr. 10-20) und Maus-Geweben und Zelllinien (SEQ. ID.Nr. 8, 9, 23-37) isoliert. Die verschiedenen PIBF-Formen werden differenziert exprimiert und weisen unterschiedliche funktionelle Attribute auf.
Beispiele:
Die mRNA der gesamten Länge (Exons 1-18) codiert für ein 89 kDa- Kernprotein. Die Bioinformatik sagt eine Kern-
Kompartimentalisierung auf Grund der beiden Kern-Lokalisierungs- Signale in den Exons 7 und 13 voraus, und eine Nukleinsäure- Bindungsdomäne in den Exons 14-16. Gemäß Zell-Fraktionierung und Western Blot mit monoklonalen anti-PIBF-Antikörpern ist das 89 kDa-Protein tatsächlich ausschließlich an den Kern-Fraktionen lokalisiert. Formen mit geringerem Molekulargewicht sind in den zytosolischen und sezernierten Fraktionen verschiedener Human- und Maus-Primär-Tumoren, Embryo und Zelllinien vorhanden.
Auf der Basis der Northern- (Fig. 3) und RT-PCR-Analyse (Fig. 10) kann man die mRNA der gesamten Länge beinahe in allen Geweben finden, jedoch in unterschiedlichen Mengen. Eine semiquantitative RT-PCR wurde an zusammenpassenden Tumor- /Normalgewebe-Paaren durchgeführt. Dieselbe Menge an RNA wurde entweder mit PIBF-spezifischen Exon 1/Exon 18- (Fig. 10A) und Exon 2/Exon 18-Primer-Paaren (Fig. 10B) oder mit für Ribosomen- Protein S9-spezifischen Primern (für eine Beladungs-Kontrolle) derselben Proben amplifiziert . Die Proben sind: 1 = Plazenta- cDNA, 2 = Magentumor, 3 = Magen, normal, 4 = Uterus-tumor, 5 = Uterus, normal, 6 = Neg. Kontr.: ohne Matrize. Rasch wachsende Zellen, z.B. bei Tumoren und Embryo, Zellen immun-privilegierter Gewebe (Hoden, Plazenta) enthalten mehr PIBF-mRNA der gesamten Länge. Die RT-PCR-Analyse von humanen Primär-Tumoren und die nachfolgende Klonierung und DNA-Sequenzierung von PIBF-cDNA zeigen, dass die alternativ prozessierten PIBF-mRNA-Formen anders exprimiert werden. Dies ist durch zwei kleinere PIBF- Formen beispielhaft gezeigt, die man in humanen Primär-Tumoren findet. Die Expression der Exons (1-5) - (17-18) -Form im Magen- Adenokarzinom und die der Exons 1- (13-18) -Form im Endometrium- Adenokarzinom ist auf Tumorgewebe eingeschränkt, da die Gegenstücke aus normalem Gewebe derselben Patienten keine nachweisbaren Mengen dieser PIBF-mRNA-Spleiß-Varianten exprimieren. Wichtig ist, dass man diese beiden und andere alternativ prozessierte PIBF-mRNAs auch in immunprivilegierten Geweben (Plazenta, Embryo, Hoden) und in Immunzellen findet.
Die Funktion des PIBF hängt auch von der Struktur der reifen Protein-Form ab. Eine der interessantesten Formen wird von Exons 2-3-4-5-17-18-mRNA codiert, die man häufig in Human- und Maus- Geweben findet, wie Human- und Maus-Plazenta, Human-Lymphozyten, Maus-Embryo und im Human-Magentumor . Sie codiert für ein 298 und 297 Aminosäuren langes Polypeptid mit einem vorausgesagten Molekulargewicht von 35 kDa. (SEQ. ID.Nr .6, 7 für den Menschen, SEQ. ID.Nr. 8,9 für die Maus) . Die beiden Proteine sind zu 86% homolog. Die FACS-Analyse zeigt, dass die humane 35 kDa-Form spezifisch an humane Immunzellen bindet (Fig. 11) : FACS-Färbung von humanen PBMCs mit 35 kDa-PIBF und α-PIBF-Antikörpern (antiKaninchen-FITC) . Die Zellen sind in der Monozyten-Zellregion
(Fig. ILA) und im Lymphozyten- "Gate" (Fig. 11B) gezeigt. M ist die Anzahl der Zellen im "Gate" mit erhöhter Flurescenz, in Prozent (%) ausgedrückt, die Zahlen bedeuten: 1 = PBMC + anti- Exon 17 PIBF, 2 = PMBC + PIBF-35kDa (1 μg) + anti-Exon 17, 3 = PBMC + PIBF-35kDa (5 μg) + anti-Exon 17, 4 = PBMC + PIBF-35kDa
(15 μg) + anti-Exon 17. Die Bindung an humane Lymphozyten und Monozyten deutet auf einen PIBF-Rezeptor an diesen Immunzellen hin. Eine trunkierte Version von rPIBF mit Exon 1-9 (48 kDa) mit dem N-terminalen Teil dieser funktionellen PIBF-Form und ohne den C-terminalen Teil (Exon 17-18) ist hinsichtlich einer Bindung an Immunzellen nicht funktionell (Daten nicht gezeigt) .
Table IV.
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Die Fig. 12A bis 12Q zeigen die alternativ prozessierten PIBF- Proteine, wobei die Exons schematisch dargestellt sind:
Fig. 12A zeigt Maus-89-kDA PIBF der gesamten Länge (SEQ ID Nr. 4), Fig. 12B zeigt die Exons (1-5) - (17-18) , die man bei Magentumor, humaner terminaler Plazenta, männlichen und weiblichen Lymphozyten, weiblichen Schwangerschafts-Lymphozyten (SEQ ID Nr. 6) findet, Fig. 12C zeigt die Exons (1-5) - (17-18) , die man in Maus-Plazenta und -Embryo (SEQ.ID Nr. 8) findet, Fig. 12D zeigt die Exons 1- (13-18) (SEQ. ID Nr. 11), Fig. 12E zeigt die Exons 1- (15-18), die man in MCF-7-Zellen und Schwangerschafts-Lymphozyten findet (SEQ.ID No. 12), Fig. 12F zeigt einen Teil von Intron 14 und Exons 15-18, die man in der Leukozyten-cDNA-Bibliothek findet (SEQ. ID Nr. 13), Fig. 12G zeigt die Exons 1+ (9-10) + (12-15) + (17-18) , die man in MCF-7- Zellen und Schwangerschafts-Lymphozyten findet (SEQ. ID Nr. 14), Fig. 12H zeigt die Exons 1+ (3-7) + (9-10) +12+ (17-18) , die man in MCF-7-Zellen findet - humane Mamma-Tumor-Zelllinie (SEQ. ID Nr. 17), Fig. 121 zeigt Exon (1-7) + (9-15) + (17-18) , die man in MCF-7- Zellen findet - humane Mamma-Tumor-Zelllinie (SEQ. ID Nr. 19) , Fig. 12J zeigt Exon (1-7) + (9-10) +12+
(17-18) , die man in MCF-7-Zellen findet - humane Mamma-Tumor- Zelllinie (SEQ. ID Nr. 22), Fig. 12K zeigt Exon (1-2) - (17-18) , die man in Maus-Embryo und -Plazenta findet (SEQ. ID Nr. 23), Fig. 12L zeigt Exon (1-4) - (16-18) , die man in Maus-Plazenta findet (SEQ. ID Nr. 25), Fig. 12M zeigt Exons (1-2) - (15-18) , die man in Maus-Hoden findet (SEQ. ID Nr. 27), Fig. 12N zeigt die Exons 1-11 18 die man im Maus-Embryo (SEQ. ID Nr. 29) findet, Fig. 120 zeigt die Exons (1-11) -18, die man im Maus-Embryo (SEQ. ID Nr. 31) findet, Fig. 12P zeigt die Exons 1- (8-14) - (17-18) , die man im Maus-Embryo (SEQ. ID Nr. 34) findet, und Fig. 12Q zeigt die Exons (1-1) - (15-18) , die man in Maus-Hoden (SEQ. ID Nr. 36) findet.
Beispiel 8 : Detektion von PIBF in humanen Pri är-Tumor-Geweben
Methode: Im unhistochemie (vgl. Beispiel 3, außer dass monoklonale Antikörper verwendet wurden, nicht polyklonale Kaninchen-Seren) .
Neben den früher vorgesehenen Beispielen: 8 verschiedene Human- Melanome wurden mit monoklonalen anti-PIBF-Antikörpern getestet. Die Antikörper wurden unter Verwendung des N-terminalen 48 kDa- Fragments von PIBF erzeugt (siehe oben) . Fig. 13 zeigt zwei repräsentative immunhistochemische Analysen der 8 verschiedenen getesteten Melanome.
Beispiel 9 : Diagnose-Test
Methode: ELISA mit monoklonalem anti-PIBF-Antikörper (vgl. Beispiel 6)
Der Zwei-Platten-Test mit polyklonalen Antikörpern, der in Beispiel 6 dargelegt ist, wurde vereinfacht, indem ein Peptid- spezifischer polyklonaler oder monoklonaler Antikörper in einem Ein-Platten-ELISA-Test verwendet wurde. Der polyklonale Antikörper wurde erzeugt, indem Kaninchen (New Zealand White) dreimal in Intervallen von 3 Wochen mit einem 55 AS langen Peptid (MKQILVKMHSKHSENSLLLTKTEPKHVTENQKSKTLNVPKEHEDNIFTPKPTL) , entsprechend Exon 17 von PIBF, das beständig in allen bisher nachgewiesenen gespleißten Varianten vorhanden war (vgl . Beispiel 7), immunisiert wurden. Neue monoklonale Antikörper wurden gegen dieses Peptid erzeugt, indem BalbC-Mäuse gemäß Standard-Protokollen immunisiert wurden, um mAbs zu erzeugen. Die Spezifität wurde mittels ELISA getestet, wobei das Immunisierungs-Peptid und rekombinante PIBFs verwendet wurden.
Protokoll für KOMPETITIVEN PIBF-ELISA: 1-PLATTEN-SYSTEM
1.Mikrotiter-Platten mit 96 Vertiefungen wurden über Nacht bei 4°C mit 100 μl/Vertiefung eines anti-Exonl7-polyklonalen oder monoklonalen IgG beschichtet (4 μg/ l in 50 mM Carbonat- Puffer, pH 9,6) .
2.Die Platten wurden dreimal mit 200 μl PBS-Tween (pH: 7,2-7,4) gewaschen, und nicht-spezifische Bindungsstellen wurden mit PBS-Tween +0,5% Gelatine + 0,1% BSA 1 h lang bei 37°C blockiert.
3.Die Platten wurden dreimal mit 200 μl PBS-Tween gewaschen.
4. Standard-Präparation: logarithmische Verdünnung von mit Exon 17 codierten synthetischen Peptid-Verdünnungen (2000 ng/ml, 1000 ng/ml, 100 ng/ml, 10 ng/ml, 1 ng/ml, 0,1 ng/ml) in 0,5 M Phosphat-Puffer, pH 7,4-7,6, wurden mit einem gleichen Volumen eines mit Biotin markierten synthetischen Peptids (1 μg/ml in 0,5 M PBS) gemischt.
5.Proben-Herstellung: biologische Proben wurden 1:2,5 und 1:5 in 0,5 M Phosphat-Puffer, pH 7,4-7,6, verdünnt und mit einem gleichen Volumen eines mit Biotin markierten synthetischen Peptids (1 μg/ml in 0,5 M PBS) gemischt.
100 μl Aliquots der verdünnten Standard- und Harnproben wurden in die Vertiefungen von ELISA-Platten gegeben und 1 h lang bei 37°C inkubiert.
6. Nach dem Waschen wurden die Platten mit HRPO-konjubiertem Streptavidin, das 1:1000 in 0,1% BSA + PBS-Tween verdünnt worden war, 30 min lang bei 37°C inkubiert. Die gebundenen Enzym-Konjugate wurden mit OPD nachgewiesen. Die Absorption wurde bei 492 nm innerhalb von 30 min bestimmt. Die Konzentrationen des Harn-PIBF wurden aus der Standard-Kurve berechnet, und reichten von 0,005 ng/ml bis 1000 ng/ml. Die Fig. 14-18 zeigen die Detektion der PIBF-Mengen bei spezifischen Tumor-Patienten.
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Claims

Patentansprüche :
1. Verfahren zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten, welches Verfahren das Entnehmen einer Probe vom Patienten, das Messen der Konzentration von PIBF (Progesteron- induzierter Blockierungs-Faktor) oder eines Derivats davon oder Fragments davon in der Probe und die Bestimmung, ob die PIBF-Konzentration in der Probe über oder unter einem vorbestimmten Schwellenwert liegt, umfasst, wobei die Konzentration über dem Schwellenwert einen Patienten mit einem Tumor identifiziert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Tumor ein Epithel-Karzinom, ein Kolonkarzinom oder ein Brustkarzinom, ein Lymphom, ein Kehlkopfkarzinom, ein Harntrakt-Tumor, insbesondere ein Blasenkarzinom, ein Lungentumor, eine Leukämie, ein Plasmazytom, ein Myelom, insbesondere Myeloma multiplex, eine myeloproliferative Erkrankung, oder ein Kopf- und Halstumor ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Körperflüssigkeit, insbesondere Harn oder Serum ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe eine Gewebsprobe ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, dass der Schwellenwert die Konzentration des PIBF in einer Probe einer gesunden Person ist.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Schwellenwert durch Messen der PIBF- Konzentration in mindestens einer gesunden Person parallel zur Bestimmung der PIBF-Konzentration in einer Probe des Patienten bestimmt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass als positive Kontrolle die Konzentration von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon in der Probe, die eine festgelegte Konzentration von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon aufweist, gemessen wird, parallel zur Bestimmung der Konzentration des PIBF in der Probe des Patienten.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 , dadurch gekennzeichnet, dass die PIBF-Konzentration in der Probe immunologisch, insbesondere durch einen kompetitiven Test, durch einen Sandwich-Test, durch Immunfärbung oder durch Kombinationen dieser Methoden gemessen wird.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch
„ gekennzeichnet, dass die PIBF-Konzentration in der Probe indirekt, durch Messung der Konzentration der PIBF-mRNA in der Probe, gemessen wird.
10. Verfahren zur Bestimmung der positiven oder negativen Progression eines Tumors bei einem Patienten, welches die Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9 und die Feststellung, ob die gemessene Konzentration des PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon in der Probe über oder unter mindestens einer zuvor gemessenen Konzentration von PIBF oder einem Derivat davon oder einem Fragment davon in mindestens einer zuvor vom selben Patienten genommenen Probe liegt, wobei eine über der zuvor gemessenen Konzentration liegende Konzentration eine positive Progression identifiziert .
11. Verwendung eines anti-PIBF-Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen Antikörpers oder eines Fragments davon bei einem Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10.
12. Verwendung von PIBF oder einem Derivat davon oder einem Fragment davon bei einem Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass der PIBF ein rekombinanter PIBF ist.
14. Set, umfassend ein erstes Reagens, das mindestens einen anti-PIBF-Antikörper oder ein Fragment desselben aufweist, und ein zweites Reagens, das PIBF oder ein Derivat davon oder ein Fragment davon mit einer bestimmten Konzentration aufweist.
15. Set nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass es eine feste Phase aufweist, an die der mindestens eine anti-PIBF- Antikörper oder das Fragment davon oder das PIBF oder das Derivat davon oder das Fragment davon gebunden ist.
16. Set nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, dass der PIBF rekombinant ist.
17. Set nach einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein weiteres Reagens umfasst, welches einen zweiten anti-PIBF-Antikörper oder ein Fragment davon aufweist, der (das) an ein Epitop des PIBF bindet, welches von dem vom ersten anti-PIBF-Antikörper oder seinem Fragment erkannten Epitop verschieden ist.
18. Set nach einem der Ansprüche 14 bis 17 zur Diagnostizierung eines Tumors bei einem Patienten bzw. zur Feststellung der Progression eines Tumors bei einem Patienten.
19. Verwendung eines anti-PIBF-Antikörpers, vorzugsweise eines monoklonalen anti-PIBF-Antikörpers, insbesondere eines humanisierten anti-PIBF-Antikörpers oder eines Fragments davon zur Herstellung eines anti-Tumor-Medikaments .
20. Verwendung nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein Einzelketten-Antikörper ist.
21. Verwendung nach Anspruch 19 oder 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein an ihm haftendes Molekül aufweist.
22. Verwendung nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass das Molekül eine toxische Substanz ist, insbesondere ein Radionuklid, ein chemotherapeutischer Arzneistoff oder ein Toxin, bzw. ein Prodrug.
23. Verwendung von PIBF oder eines Derivats davon oder eines Fragments davon zur Herstellung eines Anti-Tumor-Medikaments.
24. Verwendung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Medikament ein Vakzin ist.
25. Verwendung nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das Vakzin weiters ein Adjuvans aufweist.
26. Verwendung nach Anspruch 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass der PIBF oder das Derivat davon oder das Fragment davon rekombinant ist.
27. Verwendung nach Anspruch 23 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der PIBF oder das Derivat davon oder das Fragment davon ein chemisch synthetisiertes Molekül ist.
28. Verwendung eines Polynukleotids, das für PIBF oder ein Derivat davon oder Fragment davon oder für ein PIBF-antisense- Molekül codiert, zur Herstellung eines Anti-Tumor-Medikaments.
29. Rekombinantes Protein mit einer Progesteron-induzierten, immunmodulierenden Protein (PIBF-) -Aktivität, welches die Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID.Nr.l oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäure-Identität von mindestens 98% mit der Sequenz gemäß SEQ. ID.Nr.l, wie mittels FAST/A-Algorithmus bestimmt, oder eine Aminosäuresequenz mit einer Aminosäure-Identität von mindestens 95% mit der Sequenz von Aminosäurerest 580 bis 630 von SEQ. ID.Nr.l, wie mittels FAST/A-Algorithmus bestimmt, und eine PIBF-Aktivität von mindestens 50% des natürlichen Human- PIBF-Moleküls aufweist.
30. Rekombinantes Protein nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz, wie durch die Aminosäurereste 300 bis 350 in SEQ. ID.Nr.l angegeben, aufweist .
31. Rekombinantes Protein nach Anspruch 29 oder 30, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz, wie durch die Aminosäurereste 580 bis 630 in SEQ. ID.Nr.l angegeben, aufweist .
32. Protein mit PIBF-Aktivität, umfassend
• die Aminosäuresequenz gemäß SEQ. ID. r.4 oder
• eine Aminosäure mit einer Aminosäure-Identität von mindestens 85%, vorzugsweise mindestens 90%, noch mehr bevorzugt, mindestens 95%, am meisten bevorzugt 99%, mit der Sequenz gemäß SEQ. ID.Nr.4, wie mittels FAST/A-Algorithmus bestimmt.
33. Protein, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Aminosäuresequenz mit einer Identität von mindestens 85%, vorzugsweise mindestens 90%, noch mehr bevorzugt, mindestens 95%, wie mittels FAST/A-Algorithmus bestimmt, mit einer Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ. ID.Nr. 6, 8, 10, 14, 15, 17, 19, 20, 23, 25, 27, 29, 31, 32, 34 und 36 aufweist, wobei das Protein ein alternativ prozessiertes PIBF- Protein ist.
34. Nukleinsäure-Molekül, das für ein rekombinantes Protein mit einer PIBF-Aktivität nach einem der Ansprüche 29 bis 32 codiert.
35. Nukleinsäure-Molekül, welches für ein alternativ prozessiertes PIBF-Protein codiert, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleinsäuresequenz mit einer Identität von mindestens 80%, vorzugsweise mindestens 90%, noch mehr bevorzugt, mindestens 95% mit
• einer Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
SEQ. ID.Nr. 7, 9, 11, 12, 13, 16, 18, 21, 22, 24, 26, 28, 30, 33, 35 und 37, oder
• einer Sequenz, die unter stringenten Bedingungen mit einer der obigen Sequenzen hybridisiert, oder
• einer Sequenz, die infolge des genetischen Codes zu einer der obigen Sequenzen degeneriert ist, aufweist.
36. Nukleinsäure-Vektor, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 34 oder 35 und ein geeignetes Regulierungselement .
37. Nukleinsäure-Vektor nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, dass er weiters einen Selektions-Marker aufweist.
38. Zelle, umfassend einen Vektor nach einem der Ansprüche 34 bis 36.
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