KR20220066309A

KR20220066309A - 펩티드 및 이를 포함하는 세포 융합제 및 암 치료용 의학 조성물

Info

Publication number: KR20220066309A
Application number: KR1020227012189A
Authority: KR
Inventors: 미치코 코가
Original assignee: 미치코 코가
Priority date: 2019-09-20
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2022-05-24
Also published as: JP7329056B2; JPWO2021054448A1; CN114423778A; JP2023133582A; EP4032589A4; US20230034205A1; WO2021054448A1; CA3158336A1; EP4032589A1; CN114423778B; AU2020349967A1

Abstract

본 발명의 목적은 효율적인 세포융합 방법을 제공하는 것이다. 또한, 세포융합에 의해 암세포를 사멸시키는 방법을 제공하는 것이다.
　상기 과제는, 본 발명의 (1) 서열번호 1~8로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (2) 서열번호 1~8로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, １~４의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 세포융합활성에 의해 해결할 수 있다.

Description

펩티드 및 이를 포함하는 세포 융합제 및 암 치료용 의학 조성물

본 발명은 펩티드(peptide) 및 그것을 포함하는 세포 융합제 및 암 치료용 의학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면, 세포를 효율적으로 융합시킬 수 있다.

세포융합은, 센다이 바이러스(センダイウイルス)에 세포를 융합시키는 작용이 있는 것으로부터 발견된 현상이다 (비특허문헌 1 및 2). 현재는, 품종 개량 또는 모노클로날(モノクロ-ナル) 항체의 생산 등에, 세포융합이 이용되고 있다. 또한, 바이러스를 이용하는 것 이외에, 프로토플라스트-PEG(プロトプラスト-PEG)법 또는 전기 자극에 의해서도 세포융합이 일어나는 것이 알려져 있다.

[비특허문헌 1] Cell fusion, 1970, Harvard University Press, Mass. [비특허문헌 2] Cell Fusion and some subcellular Properties of heterokaryons and hybrids, Journal of Cell Biology, VOLUME 67, 1975, pages 257-280

본 발명자들은, 효율적으로 세포융합시킬 방법이 없을까 생각했다. 또한, 세포융합에 의해, 암세포를 사멸시킬 수 있는 것은 없을까도 생각했다.

따라서, 본 발명의 목적은, 효율적인 세포융합의 방법을 제공하는 것이다. 또한, 세포융합에 의해, 암세포를 사멸시킬 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자는, 효율적인 세포융합 방법에 있어서, 예의 연구한 결과, 놀랍게도, 특정의 아미노산배열을 가지는 신규의 펩티드에 의해, 세포를 효율적으로 융합시킬 수 있음을 발견했다.

본 발명은, 이러한 지견에 기초한 것이다.

따라서, 본 발명은.

[1] (1) 서열(配列) 번호 1~8로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는 (2) 서열번호 1~8로 표시된 아미노산 서열에 있어서, 1~4개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 또한 세포융합 활성을 갖는 폴리펩티드,

[2] 상기 서열번호 1~8로 표시된 아미노산 서열이, Ｎ 말단에 메틸(メチル)기를 가지는, [1]에 기재된 폴리펩티드,

[3] [1] 또는 [2]에 기재된 펩티드를 코드(コ-ド)하는 폴리뉴클레오티드(ポリヌクレオチド),

[4] [3]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터,

[5] [4]에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체,

[6] [1] 또는 [2]에 기재된 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합성 단편,

[7] 유효성분으로서, [1] 또는 [2]에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 세포 융합제,

[8] 유효성분으로서, [1] 또는 [2]에 기재된 폴리펩티드를 포함하는, 의약 조성물,

[9] 암 치료용인, [8]에 기재된 의약 조성물,

[10] [1] 또는 [2]에 기재된 폴리펩티드의 유효량을, 치료가 필요한 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 암의 치료방법.

[11] 암의 치료용인, [1] 또는 [2]에 기재된 폴리펩티드, 및

[12] [1] 또는 [2]에 기재된 폴리펩티드의, 암 치료용 의학 조성물의 제조에의 사용, 에 관한 것이다.

본 발명의 폴리펩티드에 의하면, 세포를 효율적으로 융합시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩티드는, 암 치료용 의학 조성물의, 유효 성분으로서 사용할 수 있다.

도 1a (도 1-1)는 RFL세포 및 LCC세포에 펩티드 1을 작용시키는 경우의, RFL세포의 약확대(弱擴大)(A 및 B) 현미경 사진이다.
도 1b (도 1-2)는 RFL세포 및 LCC세포에 펩티드1을 작용시킨 경우의, RFL세포의 강확대(C) 현미경 사진, 및 LCC세포(D)의 현미경 사진이다.
도 2는 RFL세포에 펩티드 2를 작용시킨 경우의 RFL세포의 약확대(A) 및 강확대(强擴大)(B) 현미경 사진이다.
도３은 RFL세포에 펩티드 3을 작용시킨 경우의, RFL세포의 약확대 현미경 사진이다.
도 4는 RFL세포에 펩티드 4를 작용시킨 경우의, RFL세포의 약확대 현미경 사진이다.
도 5는 RFL세포에 펩티드 5를 작용시킨 경우의, RFL세포의 약확대 현미경 사진이다.
도 6a (도 6-1)는 RFL세포 및 RM-4세포에 펩티드 6을 작용시킨 경우의, RFL세포의 약확대(A) 및 강확대(B) 현미경 사진이다.
도 6b (도 6-2)는 RFL세포 및 RM-4세포에 펩티드 6을 작용시킨 경우의 RM-4세포의 약확대(C 및 D) 현미경 사진이다.
도 7은 RFL세포에 펩티드 7을 작용시킨 경우의, RFL세포의 약확대(A) 및 강확대(B) 현미경 사진이다.
도 8a (도 8-1)는 RFL세포 및 LCC세포에 펩티드 8을 작용시킨 경우의, RFL세포의 약확대(A및 B) 현미경 사진이다.
도 8b (도 8-2)는 RFL세포 및 LCC세포에 펩티드 8을 작용시킨 경우의, RFL세포의 강확대(C) 현미경 사진, 및 LCC세포(D)의 현미경 사진이다.
도 ９는 RFL세포에 펩티드 9를 작용시킨 경우의, RFL세포의 약확대 현미경 사진이다.
도 10은 RFL세포에 펩티드10을 작용시킨 경우의, RFL세포의 약확대 현미경 사진이다.
도 11은 RM-4세포에 펩티드 1을 작용시켜, 아포토시스(アポト-シス, 세포 자살)의 유도를 Caspase-3/7의 활성화(A) 및 AnnexinV의 활성화 (B)에 의해 측정한 그래프이다.
도 12는 RM-4세포에 펩티드 1을 작용시켜, 18시간 후의 Caspase-3/7의 활성화(녹색 형광) 및 AnnexinV의 활성화 (적색 형광)를 확인한 형광 현미경 사진이다.
도 13은 RM-4세포에 펩티드 1을 작용시켜, 78 시간후의 Caspase-3/7의 활성화(녹색 형광) 및 AnnexinV의 활성화(적색 형광)을 확인한 형광 현미경 사진이다.
도 14는 마우스에 암 세포를 이식하고, 펩티드 6을 투여하여 28 일간의 종양 체적의 변화를 나타낸 그래프이다.
도 15는 마우스에 암 세포를 이식하고, 펩티드 6을 투여하여 28 일간의 체중 변화를 나타낸 그래프이다.
도 16은 마우스에 암 세포를 이식하고, 펩티드 6을 투여한 군과 대조군의 28일 후의 종양 중량을 나타낸 그래프이다.
도 17은 펩티드 6을 투여한 마우스의 적출된 종양 덩어리의 40배의 사진(A) 및 400배 사진(B), 및 대조군의 마우스의 적출된 종양 덩어리의 40배 사진(C) 및 400 배 사진(D)이다.

[1] 폴리펩티드

본 발명의 폴리펩티드는 (1) 서열번호 1~8로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 1~8로 표시된 아미노산 서열은, 이하의 것과 같다.

Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala（서열번호 1）

Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Leu-Ala（서열번호 2）

Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Ile-Ala（서열번호 3）

Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Leu-Ala（서열번호 4）

Pro-Ile-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala（서열번호 5）

Pro-Ile-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Leu-Ala（서열번호 6）

Pro-Ile-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Ile-Ala（서열번호 7）

Pro-Ile-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Leu-Ala（서열번호 8）

또한, 본 발명의 폴리펩티드는 (2) 서열번호 1~8로 표시된 아미노산 서열에 있어서, 1~4의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 세포융합활성을 가진다.

상기 (1) 서열번호 1~8로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는, (1) 서열번호 1~8로 표시된 아미노산 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드를 포함한다. 또한, (2) 서열번호 1~8로 표시된 아미노산 서열에 있어서, 1~4의 아미노산이 결실, 치환, 삽입 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 세포융합 활성을 가지는 폴리펩티드(이하, 「기능적 등가 개변체」 라고 칭할 수 있음)는, (2) 서열번호 1~8로 표시된 아미노산 서열에 있어서, 1~4의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지며, 그리고 세포융합 활성을 가지는 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명의 폴리펩티드는, 서열번호 1~8로 표시된 아미노산 서열 등의 상기 10개의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩티드에 의해서, 세포융합 활성을 나타낼 수 있고, 10개의 아미노산 서열 중에, 세포융합 활성을 보이는 특정의 구조를 가지고 있다. 따라서, 10개의 아미노산 서열 중의 세포융합 활성을 보이는 특정의 구조가 망가지지 않는 한에 있어서, 다른 아미노산, 폴리펩티드, 또는 단백질이 본 발명의 폴리펩티드에 결합해도, 본 발명의 폴리펩티드는 세포융합화 활성을 보일 수 있다.

《기능적 등가 개변체》

기능적 등가 개변체는, 서열번호 1~8로 표시된 아미노산 서열에서 1 또는 복수의 위치에서, 1~4개, 바람직하게는 1~3개, 더욱 바람직하게는 1~2개, 가장 바람직하게는 1개의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 그리고 세포융합 활성을 가지는 폴리펩티드인 한에 있어서, 특별히 한정되는 것은 아니다.

예를 들면, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에 대하여, 서열번호 2 또는 서열번호5의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는, 1개의 아미노산이 치환된 기능적 등가 개변체이며, 서열번호 3 또는 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는, 2개의 아미노산이 치환된 기능적 등가 개변체이며, 서열번호 4 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는, 3개의 아미노산이 치환된 기능적 등가 개변체이며, 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는, 4개의 아미노산이 치환된 기능적 등가 개변체이다.

기능적 등가 개변체에 있어서, 「1~4의 아미노산의 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가」는, 본 발명의 폴리펩티드의 기능을 유지하는 보존적 치환이다. 「보존적 치환」으로는 한정되지 않지만, 예를 들어, 아미노산 잔기를 다른 화학적으로 유사한 아미노산 잔기로 치환함으로써 실시할 수 있다. 예를 들어, 어떤 소수성 잔기를 다른 소수성 잔기로 치환하는 경우, 어떤 극성 잔기를 동일한 전하를 갖는 다른 극성 잔기로 치환하는 경우 등을 들 수 있다. 이러한 치환을 행하는 것을 가능하게 하는 유사한 아미노산은 아미노산마다 당업계에 공지되어 있다. 비극성(소수성)아미노산으로서는, 예를 들면, 알라닌(アラニン), 발린(バリン), 이소류신(イソロイシン), 류신, 프롤린(プロリン), 트립토판(トリプトファン), 페닐알라닌(フェニルアラニン), 메티오닌(メチオニン) 등을 들 수 있다. 극성(중성)아미노산으로서는, 예를 들면, 글리신, 세린, 트레오닌, 티로신(チロシン), 글루타민, 아스파라긴, 시스테인 등을 들 수 있다. 양전하를 갖는 (염기성) 아미노산으로서는, 아르기닌(アルギニン), 히스티딘(ヒスチジン), 리신(リジン)등을 들 수 있다. 또한, 부전하를 갖는 (산성) 아미노산으로서는, 아스파라긴산(アスパラギン酸), 글루타민산(グルタミン酸) 등을 들 수 있다. 한정되는 것은 아니지만, 이러한 보존적 치환에 의해, 세포융합 활성을 갖는 기능적 등가 개변체를 얻을 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는, 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 Ｎ말단의 프롤린(プロリン)이 메틸화되어 있다. 즉, Ｎ말단의 프롤린은, 바람직하게는 메틸화 프롤린이다. 한정되는 것은 아니나, Ｎ말단의 프롤린이 메틸화되어 있는 것에 의해서, 더욱 우수한 세포융합 활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 폴리펩티드는, 본 기술분야에서 공지의 방법에 의해 제조할 수 있다. 예를 들면, 후술의 발현벡터를 포함하는 형질 전환체를 배양하여 얻을 수 있으나, 화학 합성법에 의해 제조하는 것이 바람직하다.

《세포융합 활성》

본 발명의 폴리펩티드는, 세포융합 활성을 가진다. 본 발명의 폴리펩티드에 의한 세포융합은, 일부의 세포가 융합하여, 복수의 핵을 가지는 융합세포를 형성한다.

또한, 융합한 세포는, 세포융합 이후에 아포토시스(アポト-シス)가 유도되어 세포가 사멸한다.

《폴리뉴클레오티드》

본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 본 발명의 폴리펩티드를 코드(コ-ド)하는 폴리뉴클레오티드인 한, 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 명세서에서 용어 「폴리뉴클레오티드」에는 DNA 및 RNA 둘 다가 포함된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면 화학 합성법 등에 의해 제조할 수 있다.

《발현벡터》

본 발명의 발현벡터(ベクタ-)는, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터이다. 즉, 본 발명의 벡터는, 본 발명에 의해 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 한, 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들면, 사용하는 숙주 세포에 대응하여 적절히 선택한 공지의 발현벡터에, 본 발명에 의한 상기 폴리뉴클레오티드를 삽입함에 의해 얻을 수 있는 벡터를 들 수 있다. 본 발명의 벡터는, 자기 복제 벡터, 즉, 염색체 외의 독립체로서 존재하며, 그것의 복제가 염색체의 복제에 의존하지 않는, 예를 들어, 플라스미드를 기본으로 구축할 수 있다. 또한, 본 발현벡터는, 숙주세포에 도입되었을 때, 그 숙주세포의 게놈 중에 혼입되어 그것이 혼입된 염색체와 함께 복제되는 것이어도 좋다. 본 발명에 의한 벡터 구축의 수순 및 방법은, 유전자 공학의 분야에서 관용되어 있는 것을 사용할 수 있다.

《형질전환체》

본 발명에 의하면, 상기 발현벡터에 의해 형질전환된 세포가 제공된다. 이 숙주 벡터계는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 대장균, 방선균, 효모, 사상균, 진핵생물의 세포 등을 이용한 계, 및 이들을 이용한 다른 단백질과의 융합 단백질 발현계 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 발현벡터에 의해 세포의 형질전환도, 이 분야에서 관용되고 있는 방법에 따라서 실시할 수 있다.

또한, 이 형질전환체를 적절한 배지에서 배양하고, 배양물로부터 상기 본 발명에 따른 폴리 펩티드를 단리(單離)함으로써 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 다른 측면에 따르면, 상기 본 발명에 따른 신규 폴리펩티드의 제조 방법이 제공된다. 형질전환체의 배양 및 그 조건은, 사용되는 세포에서 그것과 본질적으로 동등해도 좋다. 또한, 형질전환체를 배양한 후, 목적하는 단백질을 회수하는 방법은, 이 분야에서 관용되고 있는 것을 이용할 수 있다.

《항체》

본 발명의 단백질에 대응하는 항체（예를 들면, 폴리클로날(ポリクロ-ナル)항체 또는 모노클로날 항체）는, 각종 동물에 본 발명의 단백질, 또는 그것의 단편을 직접 투여하여 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 단백질을 코드하는 폴리뉴클레오티드를 삽입한 플라스미드(プラスミド)를 이용하여, ＤＮＡ백신법(ワクチン法) (Raz, E.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 9519-9523, 1994；또는 Donnelly, J. J.ら, J. Infect. Dis., 173, 314-320, 1996）에 의해서도 얻을 수 있다.

폴리클로날항체는, 예를 들면, 본 발명의 단백질 또는 그의 단편을 적당한 보조제(アジュバント)（예를 들면, 프로인트(フロイント) 완전 보조제 등）에 유탁한 유탁액을, 복강, 피하 또는 정맥 등에 면역하여 감작한 동물 (예: 토끼, 마우스, 염소 또는 닭 등)의 혈청 또는 알로부터 제조할 수 있다. 이와 같이 제조된 혈청 또는 알로부터, 통상적인 단백질 단리 정제법에 의해 폴리클로날 항체를 분리 정제할 수 있다. 이와 같은 분리 정제 방법으로서는, 예를 들면 원심분리, 투석, 황산암모늄에 의한 염석(鹽析), 또는 DEAE-셀룰로오스, 하이드록시아파타이트(ハイドロキシアパタイト), 혹은 단백질 A 아가로스 등에 의한 크로마토그래피법을 들 수 있다.

모노클로날항체는, 예를 들면, 켈러(ケ-ラ-)와 밀스타인(ミルスタイン)의 세포융합법（Kohler, G.및 Milstein, C., Nature, 256, 495-497, 1975）에 의해, 당업자가 용이하게 제조하는 것이 가능하다.

즉, 본 발명의 단백질 또는 그의 단편을 적당한 보조제(アジュバント)（예를 들면, 프로인트 완전 보조제 등）에 유탁한 유탁액을, 수주간 마다 마우스의 복강, 피하 또는 정맥에 수회 반복 접종하여 면역한다. 최종 면역 후, 비장 세포를 꺼내고 골수종(ミエロ-マ)세포와 융합시켜 하이브리도마(ハイブリド-マ)를 제조한다.

하이브리도마를 얻기 위한 골수종세포로서는, 예를 들면, 히포크산틴(ヒポキサンチン)-구아닌(グアニン)-포스포리보실트랜스퍼라아제(ホスホリボシルトランスフェラ-ゼ) 결손 또는 티미딘 키나아제(チミジンキナ-ゼ)결손과 같은 마커(マ-カ-)를 가지는 골수종세포（예를 들면, 마우스 골수종세포 주 P3X63Ag8.U1）를 이용할 수 있다. 또한, 융합제로서는, 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(ポリエチレングリコ-ル)을 이용할 수 있다. 또한, 하이브리도마 제작에 있어서의 배지로서, 예를 들면, 이글(イ-グル氏) 최소 필수 배지, 달베코(ダルベッコ氏) 변법 최소 필수 배지, 또는 RPMI-1640 등의 통상 자주 사용되고 있는 배지에, 10~30 %의 소태아 혈청을 적절히 더하여 사용할 수 있다. 융합주(融合株)는, HAT 선택법에 의해 선택할 수 있다. 하이브리도마의 스크리닝은 배양 상청을 이용하고, ELISA법 또는 면역조직 염색법 등 주지의 방법에 의해 실시하여, 목적하는 항체를 분비하고 있는 하이브리도마의 클론을 선택할 수 있다. 또한, 한계 희석법에 의해 서브크로닝(サブクロ-ニング)을 반복하여, 하이브리도마의 단크로닝성(單クロ-ン性)을 보증할 수 있다. 이와 같이 획득된 하이브리도마는, 배지 중에서 2~4일간, 혹은, 프리스탄(プリスタン)으로 전처리한 BALB/c계 마우스의 복강 내에서 10~20 일간 배양함으로써, 정제 가능한 양의 항체를 생산할 수 있다.

이와 같이 제조된 모노클로날항체는, 배양 상청 또는 복수(腹水)로부터 통상적인 폴리펩티드 단리 정제법에 의해 분리 정제할 수 있다. 그와 같은 분리 정제 방법으로서는, 예를 들면, 원심분리, 투석, 황산암모늄에 의한 염석(

析), 또는 DEAE-셀룰로오스, 하이드록시아파타이트(アパタイト), 또는 단백질 A 아가로스 등에 의한 크로마토그래피법을 들 수 있다.

　또한, 모노클로날항체 또는 그의 일부분을 포함하는 항체 단편은, 상기 모노클로날항체를 코드하는 유전자의 전부 또는 일부를 발현벡터에 통합하여, 적절한 숙주 세포 (예를 들면, 대장균, 효모 또는 동물 세포)에 도입시켜 생산할 수 있다.

이상과 같이 분리 정제된 항체（폴리클로날항체 및 모노클로날항체를 포함）에 있어서, 일반적 방법에 의해, 폴리펩티드 분해효소 (예를 들면, 펩신(ペプシン) 또는 파파인(パパイン) 등)에 의해 소화를 하고, 계속해서, 통상의 폴리펩티드 단리 정제법에 의해 분리 정제함으로써, 활성인 항체의 일부를 포함하는 항원 결합성 단편, 예를 들면, F(ab)₂, Fab, Fab, 또는 Fv를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명의 단백질에 반응하는 항체를, 크락슨(クラクソン) 등의 방법 또는 제베데(ゼベデ) 등의 방법 (Clackson, T. 등, Nature, 352, 624-628, 1991; 또는 Zebedee, S. 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 3175-3179, 1992)에 의해, 일쇄 (single chain) Fv 또는 ab로서 얻는 것이 가능하다. 또한, 마우스 항체 유전자를 인간 항체 유전자로 치환한 트랜스제닉 마우스(トランスジェニックマウス) (Lonberg, N. et al., Nature, 368, 856-859, 1994)에 면역시킴으로써 인간 항체를 얻는 것도 가능하다.

[2] 세포 융합제

본 발명의 세포 융합제는, 유효성분으로서, 본 발명의 상기 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 세포 융합제는, 1종의 폴리펩티드를 단독으로 포함하여도 좋으나, 2종 이상의 폴리펩티드를 조합하여 포함해도 좋다.

세포 융합제에 있어서 상기 폴리펩티드의 함유랑은, 특별히 한정되는 것은 아니나, 예를 들면 0.1 ~ 100 중량%이며, 바람직하게는 10 ~ 100 중량%이고, 더욱 바람직하게는 30 ~ 90 중량%이다. 본 발명의 세포 융합제는, 폴리펩티드 이외의 성분으로서, 담체(예를 들어, 물 또는 완충액), 부형제, 희석제, 보존제, 안정화제, 방부제, 또는 산화 방지제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 세포 융합제는, 식물의 품종 개량 또는 모노클로날항체의 생산 등에 이용할 수 있다. 본 발명의 세포 융합제에 의하면, 효율적으로 세포를 융합시킬 수 있다.

　본 발명의 세포 융합제에 의해서, 융합된 세포로서는, 특별히 한정되는 것은 아니며, 미생물의 세포, 식물세포, 또는 동물세포를 들 수 있다. 동물세포로서는, 마우스, 래트, 토끼, 모르모트, 염소, 양, 말, 소 등의 척추동물(예를 들어, 포유동물)의 유핵세포(예를 들어 혈액세포, 림프계세포, 내장을 구성하는 세포), 포유동물 유래의 암세포 등을 들 수 있다.

세포융합의 온도는, 세포 융합이 일어나는 한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면 0 ~ 40 ℃이며, 바람직하게는 10 ~ 38 ℃이다. 처리 시간은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 1분 내지 2시간이다.

[3] 의약 조성물

본 발명의 의약 조성물은, 유효성분으로서, 본 발명의 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 의약 조성물이 예방 또는 치료할 수 있는 질환은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어 암 세포를 융합시키고, 암 세포를 사멸시켜서, 암을 치료할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 펩티드는, 세포융합에 의해, 세포에 아포토시스(アポト-シス)를 유도할 수 있다. 융합한 세포는, Caspase-3/7 또는 AnnexinV가 활성하고, 아포토시스가 유도된다. 융합세포에 아포토시스가 유도됨에 의해, 암세포를 사멸시킬 수 있다.

본 발명의 의약 조성물이 치료할 수 있는 암으로서는, 설암, 치육암, 악성 림프종, 악성 흑색종, 상악암, 비암, 비강암, 후두암, 인두암, 신경교종, 수막종, 신경교종, 신경아세포종, 갑상유두선암, 갑상선 여포암, 갑상선 수양암, 원발성 폐암, 편평 상피암, 선암, 폐포 상피암, 대세포성 미분화암, 소세포성 미분화암, 카르티노이드(カルチノイド), 고환 종양, 전립선암, 유방암, 유방 페이젯(ペ-ジェット)병, 유방육종, 골종양, 갑상선암, 위암, 간암, 급성 골수성 백혈병, 급성 전수성 백혈병, 급성 골수성 단핵구 백혈병, 급성 단구성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 미분화성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 림프성 백혈병, 성인형 T세포 백혈병, 악성 림프종, 다발성 골수종, 원발성 마크로글로불린(マクログロブリン)혈증, 소아성 백혈병, 식도암, 위암, 위·대장 평활근육종, 위·장 악성 림프종, 췌·담낭암, 십이지장암, 대장암, 원발성 간암, 간아종, 자궁상피내암, 자궁경부 편평상피암, 자궁선암, 자궁선 편평 상피암, 자궁체부 선류암, 자궁육종, 자궁암 육종, 자궁 파괴성 기태, 자궁 악성 융모 상피종, 자궁 악성 흑색종, 난소암, 중배엽성 혼합종양, 신암, 신우 이행 상피암, 요관 이행 상피암, 방광 유두암, 방광 이행 상피암, 요도 편평 상피암, 요도 선암, 윌름스(ウィルムス) 종양, 횡문근육종, 섬유육종, 골육종, 연골육종, 활액막 육종, 점액 육종, 지방육종, 유잉(ユ-イング)육종, 피부편평상피암, 피부기저세포암, 피부보엔(ボ-エン)병, 피부페이젯(ペ-ジェット)병, 피부악성흑색종, 악성중피암, 전이성 선암, 전이성 편평상피암, 전이성 육종 및 중피종을 들 수 있다.

본 발명의 의약 조성물의 투여제형으로서는, 특별히 한정은 없고, 예를 들어, 산제, 세립제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼제, 시럽제, 엑기스제, 또는 환제 등의 경구제, 또는 주사제, 외용액제, 연고제, 좌제, 국소 투여 크림, 또는 점안제 등의 비경구제를 들 수 있다.

경구제는, 예를 들면, 젤라틴, 알긴산나트륨, 전분, 옥수수 전분, 백당, 유당, 포도당(ブドウ糖), 만니트(マンニット), 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트린, 폴리비닐피롤리덴, 결정 셀룰로오스, 대두 레시틴, 자당(ショ糖), 지방산 에스테르, 탈크(タルク), 스테아르산 마그네슘, 폴리에틸렌글리콜, 규산 마그네슘, 무수 규산, 또는 합성 규산 알루미늄 등의 부형제, 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤활제, 유동성 촉진제, 희석제, 보존제, 착색제, 향료, 교미제(矯味劑), 안정화제, 보습제, 방부제, 또는 산화 방지제 등을 사용하여, 통상의 방법에 따라 제조할 수 있다.

비경구제로서는, 예를 들어 주사제를 들 수 있다. 주사제의 조제에 있어서는, 유효 성분 외에, 예를 들면 생리 식염수 혹은 링거액 등의 수용성 용제, 식물유 또는 지방산 에스테르 등의 비수용성 용제, 포도당 혹은 염화나트륨 등의 등장화제(等張化劑), 용해 보조제, 안정 화제, 방부제, 현탁 화제, 유화제 등을 임의로 사용할 수 있다.

의약 조성물을 이용하는 경우의 투여량은, 예를 들면, 사용하는 유효 성분의 종류, 질병의 종류, 환자의 연령, 성별, 체중, 생상의 정도, 또는 투여 방법에 따라 적절히 결정할 수 있고, 경구적으로 또는 비경구적으로 투여하는 것이 가능하다. 예를 들면, 본 발명의 의약 조성물을 경구 섭취하는 경우의 섭취량은, 예를 들면 성인의 경우, 폴리펩티드로서 1일당 0.01 ~ 100 mg/kg이 바람직하다. 또한, 상기의 투여법은 일례이며, 다른 투여법이어도 좋다. 인간에게 의학 조성물을 투여하는 방법, 투여량, 투여 기간, 투여 간격 등은 관리되는 임상 시험에 의해 결정되는 것이 바람직하다.

또한, 투여 형태도 의약품에 한정되지 않고, 다양한 형태, 예를 들면 기능성 식품이나 건강 식품 (음료도 포함), 또는 사료로서 음식물의 형태로 주는 것도 가능하다.

폴리펩티드를 함유하는 의약 조성물의 제조 방법은, 폴리펩티드를 유효 성분으로서 포함하는 것 이외에는, 공지의 의약품의 제조 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 의약 조성물은, 그 밖의 성분을 함유할 수 있다. 상기 그 밖의 성분으로서는, 예를 들면, 식용 유지, 물, 글리세린 지방산 에스테르, 설탕 지방산 에스테르, 소르비탄 지방산 에스테르, 프로필렌 글리콜 지방산 에스테르, 글리세린 유기산 지방산 에스테르, 폴리글리세린 지방산 에스테르, 스테아로일 젖산 칼슘, 스테아로일 젖산 나트륨, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르 등의 유화제, 로커스트 빈 검(ロ-カストビ-ンガム), 카라기난(カラギ-ナン), 알긴산, 펙틴, 크산탄 검(キサンタンガム), 크리스탈 셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 한천, 글루코만난, 젤라틴, 전분, 또는 화공 전분 등의 증점 안정제, 식염, 또는 염화칼륨 등의 염미제, 아세트산, 젖산, 또는 글루콘산 등의 산미료, 당류 또는 당알코올 류, 스테비아, 또는 아스파탐 등의 감미료, 베타 카로틴, 카라멜, 또는 붉은 누룩 색소 등의 착색료, 토코페롤, 또는 차 추출물 등의 산화 방지제, 착향료, pH 조정제, 식품 보존료, 또는 휴지(日持ち)향상제 등의 식품 소재나 식품 첨가물을 들 수 있다. 또한, 각종 비타민, 코엔자임 Q, 식물 스테롤, 유지보구(乳脂坊球)피막 등의 기능 소재를 함유시키는 것도 가능하다. 이들 그 밖의 성분의 함유량은, 본 발명의 의약 조성물 중, 합계로 바람직하게는 8 질량％ 이하, 보다 바람직하게는 40 질량％ 이하, 더욱 바람직하게는 20 질량％ 이하로 한다.

본 발명의 의학 조성물은, 인간에 대해 투여될 수 있지만, 투여 대상은 인간 이외의 동물일 수 있고, 개, 고양이, 토끼, 햄스터, 모르모트, 및 다람쥐 등의 애완동물; 소 및 돼지 등의 가축; 마우스, 래트 등의 실험 동물; 및 동물원 등에서 사육되고 있는 동물 등을 들 수 있다.

《암의 치료 방법》

본 발명의 암의 치료 방법은, 상기 폴리펩티드의 유효량을, 치료가 필요한 대상에게 투여하는 공정을 포함한다. 즉, 본 발명의 폴리펩티드는 암의 치료 방법에 사용할 수 있다. 상기 의학 조성물의 유효량을 인간 또는 동물에 투여함으로써 암을 치료할 수 있다.

《암의 치료용인 폴리펩티드》

본 발명의 폴리펩티드는, 암의 치료용이다.

상기 폴리펩티드는, 암의 치료 방법에 사용할 수 있다. 즉, 본 명세서는 암의 치료용인 폴리펩티드를 개시한다.

《폴리펩티드의 의약 조성물의 제조에의 사용》

상기 폴리펩티드는, 의약 조성물의 제조에 사용할 수 있다. 즉, 본 명세서는, 폴리펩티드의 의약 조성물의 제조에의 사용을 개시한다. 상기 의약 조성물은 한정되는 것은 아니나, 암 치료용 의학 조성물이다.

《작용》

본 발명의 폴리펩티드가, 세포융합 활성을 가지는 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았지만 다음과 같이 추정된다. 그러나, 본 발명은 이하의 추정에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 폴리펩티드는, 서열번호 1 ~ 8의 아미노산 서열에 공통으로 존재하는 구조에 의해 세포융합 활성을 나타내는 것으로 생각된다. 한정되는 것은 아니나, 첫 번째 프롤린은 비교적 중요하다고 여겨진다. 한편, 2번째 및 9번째의 류신 또는 이소류신은 서로 치환되어도 세포융합 활성을 나타내기 때문에, 2번째 및 9번째의 아미노산은 치환 가능하고, 다른 아미노산(예를 들면 발린)으로의 치환에 의해서도 세포융합 활성을 나타낼 가능성이 높다고 생각된다. 또한, 5번째 및 6번째의 트레오닌과 글루타민도 상호 치환되어도 세포융합 활성을 나타내기 때문에, 5번째 및 6번째의 아미노산은 치환 가능하고, 4번째의 세린 및 7번째의 트레오닌을 포함하여, 성질이 유사한 다른 아미노산으로의 치환에 의해서도 세포융합 활성을 나타낼 가능성이 높다고 생각된다. 또한, 8번째 및 10번째 알라닌도 유사한 성질의 아미노산, 예를 들어 글리신으로 치환되어도 세포 융합 활성을 나타낼 수 있다고 생각된다. 또한, N 말단의 프롤린의 메틸화는 각 펩티드의 세포 융합능 및 암세포의 아포토시스의 유도에 필수적인 것은 아니다. 따라서, N-말단 프롤린에 하나 이상의 아미노산이 부가된 펩티드도 세포융합 및 아포토시스 유도능을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명의 폴리펩티드가 항암 작용을 갖는 메카니즘은 완전히 해명되어 있는 것은 아니지만, 이하와 같이 추정된다. 그러나, 본 발명은 이하의 추정에 의해 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 폴리펩티드는, 암세포를 융합시킬 수 있고, 세포에 아포토시스를 유도하고, 그것에 의해 암세포를 사멸시킬 수 있는 것으로 추정된다. 또한, 상기 세포융합은 암의 종류에 관계없이 유도된다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드는 많은 종류의 암에 유효하리라고 생각된다.

[실시예]

이하, 실시예에 의해서 본 발명을 구체적으로 설명하나, 이들은 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

《실시예 1》

본 합성예에서는, 하기의 서열번호 1~8로 표시되는 아미노산 서열의 N 말단의 프롤린이 메틸화된 펩티드, 서열번호１로 표시된 아미노산 서열의 펩티드（프롤린이 메틸화되지 않음）, 및 서열번호 9로 표시된 아미노산 서열의 N 말단의 프롤린이 메틸화된 펩티드를 합성했다. 펩티드 합성은, 글라이너/패스맥스(グライナ-/ファスマックス)사에 위탁했다. 또한, 서열번호 9로 표시되는 아미노산 서열은, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열의 C 말측에 트레오닌 및 알라닌이 부가된 아미노산 서열이다.

CH₃-Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala (이하, 펩티드 1로 불린다；서열번호 １)

CH₃-Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Leu-Ala（이하, 펩티드 ２로 불린다；서열번호 ２）

CH₃-Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Ile-Ala（이하, 펩티드 ３로 불린다；서열번호 ３）

CH₃-Pro-Leu-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Leu-Ala（이하, 펩티드 ４로 불린다；서열번호 ４）

CH₃-Pro-Ile-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala（이하, 펩티드 ５로 불린다；서열번호 ５）

CH₃-Pro-Ile-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Leu-Ala（이하, 펩티드 ６로 불린다；서열번호 ６）

CH₃-Pro-Ile-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Ile-Ala（이하, 펩티드 ７로 불린다；서열번호 ７）

CH₃-Pro-Ile-Val-Ser-Gln-Thr-Thr-Ala-Leu-Ala（이하, 펩티드 ８로 불린다；서열번호 ８）

CH₃-Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala-Thr-Ala（이하, 펩티드 ９로 불린다；서열번호 ９）

Pro-Leu-Val-Ser-Thr-Gln-Thr-Ala-Ile-Ala（이하, 펩티드 10으로 불린다；서열번호 １）

아미노산의 합성은, standard 9-fluorenylmethoxycarbonyl(Fmoc) method에 따라서 수행했다. 구체적으로는 Fmoc 아미노산을 HBTU/HOBT 용액 （HBTU: 2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethyluroniu Hexafluorophosphate；HOBT:1-Hydroxybenzotriazole）으로 활성화하고, DIEA（N,N'- Diisopropylethylamine）를 첨가하여 아미노산을 축합시켰다.

합성된 아미노산의 레진으로부터의 절단은 다음과 같이 실시하였었다. TFA（trifluoroacetic acid）용액（4.125 mL TFA, 0.25 mL H₂O, 0.375 g phenol, 0.125 mL ethanedithiol and 0.25 mL thioanisole)）을 만들고, 레진에 추가하여, 상온에서 2 시간 동안 반응시켜 차가운 에테르로 침전시켜 crude 펩타이드를 얻었다.

생성된 조정제(粗精製) 펩티드를 RP-HPLC를 사용하여 정제하고 동결 건조시켰다. 정제의 순도는 하기 조건의 HPLC 및 MS에서 검토하였다.

HPLC 조건

　A Buffer：0.1％ TFA/H₂O, B Buffer：0.1％ TFA/Acetonitrile

　Column：SunFire C18 Column, 5 μm, 4.6 x 150 mm

　Flow rate：1 mL/min

　Wavelength：220 nm

MALDI-TOF-MS

《실시예 2》

　본 실시예에서는, RFL세포(래트 폐태아 유래 세포) 또는 LLC세포(루이스 폐암 유래 세포)에, 실시예 1에서 얻어진 펩티드1을 작용시켜, 펩티드의 세포 융합 활성을 검토하였다.

　RFL세포 또는 LLC세포（2 x 10⁶개）를 ５％ＦＢＳ（Biosera, Cat No. 015BS493）를 첨가했던 RPMI-1640（Wako, 189-02025）배지 6 mL에 현탁하고, 24 well　plate (Iwaki, 2820-024）의 각 well에 8 x 10⁴개／0.25 mL 분주하여, 배양했다. 배지를 제거하고, 새롭게 배지(20 μＬ) 및 펩티드 １（1 μｇ/mL）을 분주하고, 게다가 24~36 시간 배양했다. 배양 종료 후, 메탄올（Wako）에서 고정하고, 김자(ギムザ) 염색액(무토 (武藤) 화학 15003)으로 핵 염색을 행하여 현미경으로 검사하였다.

도 １에 RFL세포의 약확대（A 및 B）및 강확대 (C) 현미경 사진, 및 LCC세포(D）의 현미경 사진을 나타낸다. RFL세포 및 LCC세포의 어디에서도, 세포가 융합하여, 복수의 핵을 가지는 융합세포가 발견되었다.

《실시예 3》

본 실시예에서는, 펩티드2의 세포융합 활성을 검토했다. 펩티드 1 대신에 펩티드 2를 사용한 점, 및 RFL세포만을 사용한 점을 제외하고는, 실시예 2의 조작을 반복했다.

도 2에 RFL세포의 약확대(A) 및 강확대(B) 현미경 사진을 보여준다. RFL세포에서, 세포가 융합하고, 복수의 핵을 가지는 융합세포가 보였다.

《실시예 4》

본 실시예에서는, 펩티드 3의 세포융합 활성을 검토했다. 펩티드 2 대신 펩티드 3을 사용한 점을 제외하고는, 실시예 3의 조작을 반복했다.

도 3에 RFL세포의 약확대의 현미경 사진을 보여준다. RFL세포에서, 세포가 융합하여, 복수의 핵을 가지는 융합세포가 보였다.

《실시예 5》

본 실시예에서는, 펩티드 4의 세포융합 활성을 검토했다. 펩티드 2 대신에 펩티드 4를 사용한 점을 제외하고는, 실시예 3의 조작을 반복했다.

도 4에 RFL세포의 약확대의 현미경 사진을 보여준다. RFL세포에서, 세포가 융합하여, 복수의 핵을 가지는 융합세포가 보였다.

《실시예 6》

본 실시예에서는, 펩티드 5의 세포융합 활성을 검토했다. 펩티드 2 대신에 펩티드 5를 이용한 점을 제외하고는, 실시예 3의 조작을 반복했다.

도 5에 RFL세포의 약확대의 현미경 사진을 보여준다. RFL세포에 있어서, 세포가 융합하여, 복수의 핵을 가지는 융합세포가 보였다.

《실시예 ７》

본 실시예에서는, 펩티드 ６의 세포융합 활성을 검토했다. 펩티드 １ 대신에 펩티드 ６을 이용한 점, 및 LCC세포 대신에 RM-4세포를 이용한 점을 제외하고는, 실시예 ２의 조작을 반복했다. 또한, RM-4세포는, RFL세포에 모로니 마우스(モロニ-マウス) 백혈병 바이러스를 감염시켜 선택된 암세포이다.

도 ６에 RFL세포의 약확대(A) 및 강확대(B) 현미경 사진 및 RM-4세포의 약확대(C 및 D)를 보여준다. RFL세포 및 RM-4세포에 있어서, 세포가 융합하여, 복수의 핵을 가지는 융합세포가 보였다.

《실시예８》

본 실시예에서는, 펩티드 7의 세포융합 활성을 검토했다. 펩티드 2 대신에 펩티드 7을 사용한 점을 제외하고는, 실시예 3의 조작을 반복했다.

도 7에 RFL세포의 약확대(A) 및 강확대(B)의 현미경 사진을 보여준다. RFL세포에 있어서, 세포가 융합하여, 복수의 핵을 가지는 융합세포가 보였다.

《실시예 ９》

본 실시예에서는, 펩티드８의 세포융합 활성을 검토했다. 펩티드 2 대신에 펩티드 8을 사용한 점을 제외하고는, 실시예 2의 조작을 반복했다.

도 8에 RFL세포의 약확대(A 및 B) 및 강확대(Ｃ) 현미경 사진, 및 LCC세포(D)의 현미경 사진을 보여준다. RFL세포 및 LCC세포에 있어서, 세포가 융합하여, 복수의 핵을 가지는 융합세포가 보였다.

《실시예 10》

본 실시예에서는, 펩티드 9의 세포융합 활성을 검토했다. 펩티드 2 대신에 펩티드 9를 사용한 점을 제외하고는, 실시예 3의 조작을 반복했다. 도 9에 RFL세포의 약확대 현미경 사진을 보여준다. RFL세포에 있어서, 세포가 융합하여, 복수의 핵을 가지는 융합세포가 보였다.

펩티드 9는, 펩티드 1의 C 말측에 트레오닌 및 알라닌이 부가된 펩티드이지만, 세포융합 활성을 갖고 있어서, 그 세포융합 활성은 펩티드 1 보다 우수하다.

《실시예 11》

본 실시예에서는, 펩티드 10의 세포융합 활성을 검토했다. 펩티드 2 대신에 펩티드 9를 사용한 점을 제외하고는, 실시예 3의 조작을 반복했다. 도 10에 RFL세포의 약확대의 현미경 사진을 보여준다. RFL세포에 있어서, 세포가 융합하여, 복수의 핵을 가지는 융합세포가 보였다.

즉, 펩티드 1의 N 말단(末)의 프롤린이, N메틸화프롤린이 아니고, 통상의 프롤린의 펩타이드도, 세포융합 활성을 가지고 있었지만, 펩티드 1의 세포융합 활성 쪽이 더 강한 것 같았다.

《실시예 12》

본 실시예에서는, RM-4세포를 이용하여, 펩티드 1의 아포토시스 능력을 검토했다. 아포토시스의 지표인 Caspase-3/7 및 AnnexinV의 활성을, IncuCyte S3 생세포화 분석 시스템(에센바이오사이언스(エッセンバイオサイエンス)사)을 사용하여 측정하였다.

Caspase-3/7의 활성은, 세포막을 통과할 수 있는 불활성 비형광(DEVD) 기질을 이용하여 측정된다. 활성화 Caspase-3/7이 기질을 절단함으로써, DNA 결합 녹색 형광 라벨이 방출되고, 녹색 형광의 강도로 인해, Caspase-3/7의 활성이 측정된다.

AnnexinV의 활성은, 광안정성의 CF 색소를 사용하여 측정한다. CF 색소는 포스파티딜 세린 (ホスファチジルセリン, PS)에 결합하면 적색 형광 신호를 발하고, 적색 형광 신호에 의해 AnnexinV의 활성이 측정된다.

RM-4세포를 96웰 플레이트에 파종하고, 펩티드 1을 0.06 μｇ/mL 첨가했다. Caspase-3/7 Green Reagent (Unit size: 20ｕl, ５ｍＭ/vial)을 Ham's F-12K로 500배 희석하여 첨가하고, Annexin V Red Reagent(Unit size: 100 testers/ vial)을 Ham's F-12K로 100배 희석하여 첨가했다. IncuCyte S3 생세포화 해석 시스템을 이용하고, 대물렌즈 배율 10배, 시야수 4에서, 1시간마다 3일간 연속 스캔하여 측정하였다. 대조군(コントロ-ル)으로서, 펩티드 1을 처리하지 않은 RM-4 세포를 사용하였다.

도 11(A)에 Caspase-3/7의 활성을, 도 11(B)는 AnnexinV의 활성을 나타낸다. Caspase-3/7 및 AnnexinV는 모두에서, 10시간에서 20시간 사이에 급격히 상승하고, 그 후에도 서서히 활성이 상승했다. 한편, 펩티드 1을 처리하지 않는 RM-4세포에서는, Caspase-3/7 및 AnnexinV의 활성은 상승하지 않았다.

도 12 및 도 13에 각각 18시간 후 및 78시간 후의 형광현미경 사진을 나타낸다. 펩티드 １의 처리에 의해서, RM-4세포에 아포토시스가 유도되는 것을 알 수 있다.

《실시예 13》

본 실시예에서는, A549세포(인간 폐포 상피 선암 세포)에 대하여 펩티드 ６의 항암 작용을 in vivo로 검토했다.

6마리씩 그룹화한 CAnN.Cg-Foxn1^nu/CrlCrlj 누드 마우스에, PBS에 4 x 10⁶ cells/mL의 농도로 현탁한 A549 세포를, 0.1 mL 우측 복부측 부분의 피하에 이식하였다. 종양 이식 후 14일, 17일, 21일, 24일, 28일, 31일, 35일 및 38일 후에, 펩티드6을 25 mg/kg의 투용량으로, 꼬리 정맥으로부터 정맥내 투여하였다 (펩티드 6군). 대조군은 PBS만을 투여하였다.

3일 또는 4일마다, 종양 체적 및 체중을 측정하고, 종양 이식 38일 후(펩티드 투여 개시로부터 28일)에 부검하여, 종양을 적출하였다. 종양 체적은, 단경 및 장경을 캘리퍼스(ノギス)로 측정하고, 「추정 종양 체적= (단경)²x (장경) ÷ 2」의 식으로부터 계산하였다. 또한, 대조군의 1마리의 마우스는 종양이 과도하게 커졌기 때문에, 종양 이식 후 35일에, 실험을 중지하고, 5마리의 마우스로 평가하였다.

도 14 및 도 15에 나타난 바와 같이, 펩티드 ６의 투여에 의해, 종양 체적이 감소하고 항암 효과가 있음이 확인되었다. 또한, 펩티드 6의 투여는 마우스의 체중에 영향이 없었고, 부작용 등은 보이지 않았다.

적출된 종양의 HE 염색 사진을 도 17에 나타낸다. 도 17A (x 40) 및 B (x 400)는 펩티드 6이 투여된 A549 세포의 종양 덩어리의 사진이고, 도 17C (x 40) 및 D (x 400)는 대조군이다. 대조군은 종양 조직 덩어리에 세포가 충전되어 있지만, 펩티드 6을 투여한 마우스에서는 종양 내부가 괴사를 일으키고 있어, 펩티드 6이 항종양 효과를 나타냈다고 생각된다.

<산업상 이용가능성>

본 발명의 폴리펩티드는 식물세포 및 동물세포의 세포융합에 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 의약 조성물은 암의 치료에 사용할 수 있다.

<110> KOGA, Michiko <120> PEPTIDE, AND CELL FUSION AGENT AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR CANCER THERAPY CONTAINING SAID PEPTIDE <130> 21278-JP <150> JP 2019-171919 <151> 2019-09-20 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Fusion peptide <400> 1 Pro Leu Val Ser Thr Gln Thr Ala Ile Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Fusion peptide <400> 2 Pro Leu Val Ser Thr Gln Thr Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 3 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Fusion peptide <400> 3 Pro Leu Val Ser Gln Thr Thr Ala Ile Ala 1 5 10 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Fusion peptide <400> 4 Pro Leu Val Ser Gln Thr Thr Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Fusion peptide <400> 5 Pro Ile Val Ser Thr Gln Thr Ala Ile Ala 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Fusion peptide <400> 6 Pro Ile Val Ser Thr Gln Thr Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 7 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Fusion peptide <400> 7 Pro Ile Val Ser Gln Thr Thr Ala Ile Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 10 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Fusion peptide <400> 8 Pro Ile Val Ser Gln Thr Thr Ala Leu Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Unknown <220> <223> Fusion peptide <400> 9 Pro Leu Val Ser Thr Gln Thr Ala Ile Ala Thr Ala 1 5 10

Claims

(１）서열번호 1~8로 표시되는 아미노산 서열로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드, 또는
(２）서열번호 1~8 로 표시되는 아미노산 서열에 있어서, １~４의 아미노산이 결실, 치환, 삽입, 및/또는 부가된 아미노산 서열을 포함하고, 세포융합활성을 가지는 폴리펩티드.
청구항 1에 있어서, 상기 서열번호 1~8로 표시되는 아미노산 서열이, Ｎ 말단에 메틸기를 가지는 것인, 폴리펩티드.
청구항 1 또는 2에 기재된 펩티드를 코드하는 폴리뉴클레오티드.
청구항 ３에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
청구항 4에 기재된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환체.
청구항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드에 결합하는 항체 또는 그의 항원결합성 단편.
유효성분으로서, 청구항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 세포 융합제.
유효성분으로서, 청구항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드를 포함하는 의약 조성물.
암 치료용인, 청구항 8에 기재된 의약 조성물.
청구항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드의 유효량을, 치료가 필요한 대상에게 투여하는 공정을 포함하는, 암의 치료방법.
암의 치료용인, 청구항 1 또는 2에 기재된 폴리펩티드.
청구항１ 또는 ２에 기재된 폴리펩티드의, 암 치료용 의학 조성물의 제조에의 사용.