TWI395948B - 新穎之生理物質ｎｅｓｆａｔｉｎ及其相關物質、以及此等之用途 - Google Patents

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TWI395948B
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Hiroshi Eguchi
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Description

新穎之生理物質NESFATIN及其相關物質、以及此等之用途
本發明係關於一種關於攝食調節及/或體重調節之因子之新穎取得方法。再者，本發明係關於一種藉由該方法所得到之攝食調節及/或體重調節之聚胜肽、編碼該聚胜肽之核酸分子、以及關於使用其等之攝食抑制及/或體重增加抑制之疾病之治療、預防、診斷之方法。再者，本發明係關於一種食慾亢進及/或體重增加亢進相關之疾病治療、預防、診斷之方法，且該方法係使用能抑制該聚胜肽或基因之作用之物質。進而，本發明係關於一種藉由抑制該聚胜肽、該基因、或其等之活性之物質所得之攝食調節及/或體重調節之相關疾病之模型動物，以及一種利用其等之該聚胜肽之作用或表現之調節化合物之篩選方法。再者，本發明係關於一種藉由該篩選方法所選擇之化合物、以及利用該化合物之疾病之診斷方法、治療藥劑。
所謂肥胖，係體重，尤其是白色脂肪組織過剩之狀態，一般而言，可藉由身體質量指數(BMI，Body Mass Index)≧25Kg/m2 來加以分類，或者亦可以體脂肪率計，成人男性在25%以上，成人女性在30%以上加以分類。在以高脂肪食物為中心之飲食習慣及運動不足的現代社會中，被分類為肥胖之人之比率有增加之傾向。在2000年厚生勞動省之國民營養調查之結果中，男性在這10年及20年之比較上被分類為肥胖之人有確實地增加，且在40歲至69歲中則有約30%之人被歸類為肥胖。此外，即使在女性由60歲至69歲中亦有約30%之人被歸類為肥胖。
傳統上，肥胖有被認為是美容上問題之傾向，惟現今則更認為伴隨著(或可伴隨著)肥胖之健康障礙為臨床上一大問題點，而成為肥胖預防或治療之醫學上根據。在此種狀況下，日本肥胖學會將肥胖症定義為「合併有起因於肥胖甚至相關之健康障礙；或在臨床上其合併係可預測之情形下，醫學上必須減重之病態」而提倡應以疾病視之。在此所謂之健康障礙，除二型糖尿病或耐糖能力異常外，並包含高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、變形性關節症等整形外科性疾病、月經異常等(松澤祐次日本臨床株式會社日本臨床社發行2003年7月28日61卷增刊號6「肥胖症」第5－8頁)。再者，起因於肥胖之疾病例如有惡性腫瘤，特別是關於乳癌、子宮癌、結腸癌、腎臟癌、食道癌、胰臟癌、肝臟癌、膽囊癌之發病上，肥胖已被報告係危險因子(松澤祐次日本臨床株式會社日本臨床社發行2003年7月28日61卷增刊號6「肥胖症」第5－8頁；Abu－Abid等Journal of medicine(USA)2002年1月1日33卷1－4號第73－86頁；以及Nair等Hepatology(USA)2002年7月1日36卷1號第150－155頁)。進而，近年以來，更有提出會升高一種被稱為代謝症候群之動脈硬化性疾病(心肌梗塞、腦栓塞等)危險性之複合型危險症候群，在日本之腦血管障礙、心血管障礙因為占全部死亡率之30%而受到矚目。因此，日本肥胖學會、日本動脈硬化學會、日本糖尿病學會、日本高血壓學會、日本循環器學會、日本腎臟學會、日本血栓止血學會、日本內科學會即共同地整合了此診斷基準，而於2005年4月8日之日本內科學會記者會上公開發表了此一基準。據此，即以「內臟肥胖」(內臟脂肪堆積)為危險之中心，如在腰圍上男性85cm以上，女性90cm以上，且在血清脂質異常(三酸甘油脂值在150 mg/dL以上，HDL膽固醇值未達40 mg/Dl之任一者或二者)、血壓高值(收縮期血壓在130 mmHg以上，擴張期血壓在85 mmHg之任一者或二者)、高血糖(空腹時血糖值在110 mg/dL以上)之中具有二者以上危險時，即診斷為代謝症候群(日本內科學會雜誌代謝症候群診斷基準檢討委員會2005年4月號94卷第794－809頁)。在使用此基準之情形下，有報告發現在接受住院健檢的290名成年男子中，相對於被診斷為肥胖症之人之61名(21%)，被診斷為代謝症候群之人則為27名(9%)，且指出肥胖症未含卻被診斷為代謝症候群之人還有9名(3%)(醫學之腳步高橋和男、齋藤康2005年213卷6號第549－554頁)。
基於肥胖被認為是基本上所攝取之能量(卡路里)之量持續地超過所消耗之能量(卡路里)之量的緣故，為降低對於肥胖或肥胖症之人之體重特別是體脂肪率起見，一般係推薦飲食療法及運動療法。然而，這些療法在繼續時也會造成食慾增加、生活習慣變化上之適應、運動負荷上之壓力等，如要繼續就須克服很多的困難。進而，在飲食療法中，如使攝取卡路里降低時，就會發生由腸道之營養吸收率增加以及身體之能量代謝降低等現象，亦即所謂的「回縮」現象，而飲食療法亦常見到中途放棄之情形。肥胖症在內科之治療上存在有中樞性食慾抑制藥、熱代謝促進藥、消化吸收阻礙藥、脂肪合成阻礙藥等，惟在目前之日本，保險上可使用之藥劑僅有被分類為中樞性食慾抑制藥之「麥金道爾」而已。並且，「麥金道爾」係類似覺醒劑之化合物，還有興奮、焦躁、心血管系統之負荷、排尿困難等其他副作用，甚至因限定使用三個月以內也不能說是容易使用之藥劑(諾佛帝法瑪公司「『薩諾類克斯』錠0.5mg」附件)。
相較於肥胖，過度的體重降低(所謂「消瘦」)或飲食減少(所謂「食慾不振」)，會因生體防禦(免疫系統)反應之降低而造成容易感染、造血系統障礙、無月經或月經不順、不孕症、精神性障礙、末梢神經麻痺、低血壓、骨質疏鬆症等之原因。一般言之，在BMI<18.5 Kg/m2 之情形；或在體脂肪率，男性10%以下而女性15%之情形，係被分類為「消瘦」。在2000年之厚生勞動省之國民營養調查，女性中BMI<18.5 Kg/m2 之人之比例，20歲至39歲在這10年及20年間有確實地增加，在20歲至29歲之人有約24%被分類為「消瘦」。此種情形有可能是在年輕女性中很注意外型，而有意識地控制其飲食量之故。然而，在此年齡層常發生之中樞性攝食異常症中之神經性食慾不振症(厭食症)等，有時會有食慾本身極低，營養狀態惡化，而全身衰弱至死之情形發生。再者，包含傳統上稱為胃下垂、胃鬆弛、神經性胃炎等概念之食慾降低，稱為功能性腸胃症(Functional dyspepsia)之疾病，有指出此疾病會顯示出食後早期之飽脹感，食慾降低等症狀(Talley等(Gut)(England)1999年45卷Suppl 2：第1137－1142頁)。進而，造成食慾不振之原因，例如有癌症、發炎性疾病、腦下垂體、甲狀腺、副腎上腺等功能之降低，以及手術後、過度壓力等，以此種狀態持續長時間而食慾不振時，會引起身體之衰弱。
在此種狀況下，近年來開始普遍進行攝食調節之生體內因子之研究，甚至於與瘦體素、脂締素、「固列凝」(Ghrelin)等因子在攝食調節上之關連性，亦加以研究。惟現今究為何種因子在攝食調節及/或體重調節扮演主要之角色，則尚未有結論出現，並且，上述因子亦尚未達到實際治療上可使用之程度。其中，特別是瘦體素，因係有關攝食調節及體重調節之相關因子而受到矚目，其亦有使用重組瘦體素之臨床應用上之嘗試經驗，惟僅在肥胖病患之中之極少部分可見到效果(松田守弘、下村伊一郎 日本臨床 株式會社日本臨床社2003年7月28日發行61卷增刊號6「肥胖症」第325－328)。再者，在肥胖病患中有許多人存在有對於瘦體素之抗性，從而有認為：為顯示出藥效就必須投予大量之瘦體素，或投予之效果也會因病患個人間之差異而有不同(Heymsfield等，Journal of American Medical Association(USA)1999年282卷第1568－1575頁)。進而，近年來發現瘦體素之作用在攝食調節及體重調節上並無專一性而具有很多之生理作用，投予瘦體素除擔心會有透過血壓之上升作用、血小板凝集作用、氧化壓力之增大作用等而對於心血管系統之副作用外，亦有顯示其參與腎臟或肝臟上之纖維化，甚至與癌症產生有關，顯示出其作為治療藥劑時之問題點(Concidine等，Seminars in Vascular Medicine(USA)2005年5卷1號第15－24頁，以及小川佳宏、菅波孝祥，Adiposcience，富士醫學出版，2005年2卷2號第118－12頁)。
從而，識者咸望能鑑定出在攝食調節及/或體重調節上扮演中心角色之因子，並將其應用於肥胖及肥胖症之治療上。然而，參與攝食調節及/或體重調節之因子之報告極少，舉例而言，在糖尿病之治療藥劑上被廣泛使用之PPAR γ增敏劑(agonist)，並未被報告有直接參與攝食調節及/或體重調節者。
另一方面，NEFA(Nuclear EF－hand acidic)，亦被稱為NucleobindinII(NUCB2)，其NEFA基因之編碼聚胜肽，係具有鈣結合區域(EF區域)及DNA結合區域者(Barnikol－Watanabe等，Biological chemistry Hoppe－Seyler(Germany)1994年，375卷8號，第497－512頁)。NEFA被認為與Nucleobindin之相同性高，而係具有鈣反應性之EF－hand超級家族(super family)之DNA結合因子之一員(Karabinos等，Molecular biology and evolution(USA)1996年13卷7卷，第990－998頁)。有就實際上NEFA上之鈣結合能或與細胞之增殖控制因子之Necdin之結合性等加以調查(Kroll等，Biochemical and biophysical research communications(USA)，1999年260卷1號，第1－8頁；以及Taniguichi等，The Journal of biological chemistry(USA)2000年275卷41號，第31674－37681頁)，惟並無詳細的生理學作用方面之報告。再者，NEFA亦有被嘗試調查關於眼科疾病之Usher’s Syndrome或胃癌之發病基因之可能性(DeAngelis等，Biochimica et biophysica acta，Netherlands，1998年，407卷1號，第84－91頁；以及Line等，British journal of cancer，England，2002年，86卷11號，第1824－1830頁)。進而，NEFA聚胜肽亦顯示在其胺基末端上具有訊息序列而分泌至細胞外之可能性(醫學之腳步高橋和男、齋藤康2005年213卷6號第549－554頁)，惟關於分泌至細胞外之生理上、藥理上之作用，則完全沒有報告。再者，關於與NEFA之攝食調節及/或體重調節之關係，亦無任何報告。
 〔發明之揭示〕
本發明所欲解決之課題，係提供一種在攝食調節及/或體重調節上關連因子之新穎取得方法，以及以該方法得到之基因、該基因所編碼之聚胜肽，或者將藉由該基因之編碼聚胜肽資訊所得到之新穎聚胜肽，作為攝食障礙及/或體重調節相關之疾病之治療、控制、診斷方法。再者，將阻礙該基因或聚胜肽之作用之物質，提供作為攝食調節及/或體重調節上相關疾病之治療、控制、診斷方法。進而，提供一種藉由該基因或聚胜肽、或阻礙其等活性之物質所得到之攝食調節及/或體重調節上相關疾病之模型動物。再者，提供一種利用這些之該聚胜肽之作用或表現之調節化合物之篩選方法、以該篩選方法所篩選之化合物、以及利用該化合物之疾病之診斷方法、治療藥劑。
本發明者們，在就攝食調節及/或體重調節相關因子之新穎取得方法進行開發而重複各種檢討後，結果發現藉由使用具有PPAR γ增敏劑(agonist)活性之噻唑烷二酮(Thiazolidinediones)類，可以取得攝食調節及/或體重減少相關基因及聚胜肽。再者，發現以該方法所得到之因子，係具有到目前為止所未經報告之功能之NEFA，並將該聚胜肽性之因子命名為NESFATIN。在就NESFATIN進行檢討後，發現在傳統的報告中非功能區域之部分序列，係具有對於攝食抑制及/或體重減少之活性，進而更揭示了新穎的聚胜肽NESFATIN－1、NESFATIN－1M30、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、及NESFATIN－1M10M。再者，發現與NEFA/NESFATIN在胺基酸序列及基因上之鹼基序列之相同性高，在屬於同一家族之NucleobindinI(NUCB 1)中，顯示具有與相當於NUCB 1之NESFATIN－1M30部位之NUCB1－M30同樣之活性。
進而，更發現NESFATIN、NESFATIN－1、或NESFATIN－1M30結合抗體，具有攝食亢進及體重增加之活性，確認了NESFATIN、NESFATIN－1、或NESFATIN－1M30之活性抑制，具有攝食亢進及體重增加上之效果。
亦即，本發明係提供以下所述者。
(1)一種攝食調節及/或體重調節之關連因子之取得方法，其特徵係包含使具有PPAR γ增敏劑活性之噻唑烷二酮類之化合物作用於哺乳類細胞之步驟，以及將藉由該化合物所表現誘導之基因進行鑑定之步驟。
(2)如1之方法，其中該噻唑烷二酮類之化合物係胰島素增敏劑(troglitazone)。
(3)如(1)或(2)之方法，其中哺乳類細胞係肺非小細胞癌細胞株、脂肪細胞或腦神經衍生細胞。
(4)如(1)、(2)或(3)之方法，其中攝食調節及/或體重調節係攝食抑制及/或體重增加抑制。
(5)一種聚胜肽，其特徵係含有序列編號65~73或107~115中任一者所示之胺基酸序列。
(6)一種聚胜肽，其特徵係含有序列編號39~41或101~103中任一者所示之胺基酸序列。
(7)一種聚胜肽，其特徵係含有序列編號13~15所示之胺基酸序列。
(8)一種聚胜肽，其特徵係含有具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之序列編號3、6或9所示之胺基酸序列。
(9)一種具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽，其特徵係由與序列編號13~15、39~41、65~73、101~103或107~115之任一者所示胺基酸序列之任一者，具有至少60%以上之相同性之胺基酸序列；或者由在序列編號13~15、39~41、65~73、101~103或107~115之任一者所示胺基酸序列之任一者中，其一部之胺基酸為缺失、插入或取代之胺基酸序列所成者。
(10)一種聚胜肽，其特徵為其係具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽，且由與序列編號3、6或9所示胺基酸序列之任一者，具有至少60%以上之相同性之胺基酸序列；或者由在序列編號3、6或9所示胺基酸序列之任一者中，其一部之胺基酸為缺失、插入或取代之胺基酸序列所成者；且其在相當於序列編號3、6或9之胺基酸編號82~162之胺基酸序列中，係含有至少一個生體內所含之切斷酶之認識部位者。
(11)如(5)~(10)中任一者之聚胜肽，其特徵為在N末端或C末端上附加有至少一個以上之胺基酸。
(12)如(5)~(10)中任一者之聚胜肽，其特徵為至少一者之胺基酸殘基係以化合物或胜肽修飾者。
(13)如(5)~(12)中任一者之聚胜肽，其特徵為該體重增加抑制活性係體脂肪增加抑制活性。
(14)一種核酸分子，其特徵係編碼如(5)~(13)中任一者之聚胜肽。
(15)一種核酸分子，其特徵係含有序列編號74~82或116~124之任一者所示之鹼基序列者。
(16)一種核酸分子，其特徵係含有序列編號44~46或104~106之任一者所示之鹼基序列者。
(17)一種核酸分子，其特徵係含有序列編號18~20所示之鹼基序列者。
(18)一種核酸分子，其特徵係含有序列編號10、11或12所示之鹼基序列，且編碼具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽者。
(19)一種核酸分子，其特徵係與序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、116~124所示鹼基序列或其部分序列在嚴苛條件下進行雜合，且編碼具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽者。
(20)如(14)~(19)中任一者之核酸分子，其中該體重增加抑制活性係體脂肪增加抑制活性。
(21)一種載體，其特徵係含有如(14)~(20)中任一者之核酸分子者。
(22)如(21)之載體，其中核酸分子係於控制該核酸分子之表現之調節性核酸分子之控制下作功能性結合者。
(23)一種轉形體，其特徵係含有如(14)~(20)中任一者之核酸分子者。
(24)如(23)之轉形體，其中係表現該核酸分子之轉錄產物。
(25)如(23)或(24)之轉形體，其中係表現該核酸分子所編碼之聚胜肽。
(26)如(23)、(24)、或(25)之轉形體，其中轉形體係微生物。
(27)如(26)之轉形體，其中微生物係大腸桿菌。
(28)如(25)之轉形體，其中轉形體係哺乳類細胞。
(29)如(25)之轉形體，其中轉形體係植物細胞。
(30)一種用於攝食抑制及/或體重增加抑制之醫藥組成物，其特徵係含有如(5)~(13)中任一者之聚胜肽或含有該聚胜肽之胺基酸序列之一部之胜肽、如(21)或(22)之載體、或如(23)~(29)中任一者之轉形體，以作為有效成分。
(31)如(30)之醫藥組成物，其中該體重增加抑制係體脂肪增加抑制。
(32)如(30)或(31)之醫藥組成物，其中其係用於選自肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病患、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、整形外科性疾病、月經異常及惡性腫瘤之疾病病患。
(33)如(30)或(31)之醫藥組成物，其中惡性腫瘤係乳癌、子宮癌、結腸癌、腎臟癌、食道癌、胰臟癌、肝臟癌或膽囊癌之任一者。
(34)如(30)~(33)中任一者之醫藥組成物，其特徵係含有藥學上可容許之添加劑。
(35)一種抗體，其特徵係與如(5)~(13)中任一者之聚胜肽進行結合。
(36)如(35)之抗體，其中其係與序列編號24、32所示之胺基酸序列構成之胜肽進行結合。
(37)一種物質，其特徵係抑制如(5)~(13)中任一者之聚胜肽之活性或產生。
(38)如(37)之物質，其中係藉由與該聚胜肽進行結合，而抑制該聚胜肽之活性。
(39)如(37)之物質，其中抑制該聚胜肽之活性之物質，係(35)或(36)之抗體。
(40)一種物質，其特徵係抑制編碼如(5)~(13)之聚胜肽之基因之表現。
(41)如(40)之基因表現抑制物質，其中該基因之表現抑制物質係反意義寡核苷酸分子。
(42)如(41)之基因表現抑制物質，其中反意義寡核苷酸分子係含有序列編號31所示之鹼基序列。
(43)如(40)之基因表現抑制物質，其中基因之表現抑制物質係RNAi分子。
(44)一種載體，其特徵係含有(41)或(42)之反意義寡核苷酸分子、或與(43)之RNAi分子之核酸序列互補之鹼基序列所成之核酸分子，而用以製造該反意義寡核苷酸分子或該RNAi分子者。
(45)一種用於食慾亢進及/或體重增加亢進之醫藥組成物，其特徵係含有如(37)~(43)中任一者之物質或(44)之載體。
(46)如(45)之醫藥組成物，其中係含有藥學上可容許之添加劑。
(47)一種基因轉殖非人類生物，其特徵係含有(14)~(20)中任一者之核酸分子，或(21)~(22)之任一者之載體。
(48)如(47)之基因轉殖非人類生物，其中如(14)~(20)中任一者之核酸分子係被表現者。
(49)如(47)或(48)之基因轉殖非人類生物，其中如(23)至(28)中轉形體之任一者係被導入者。
(50)如(47)、(48)或(49)之基因轉殖非人類生物，其中該基因轉殖非人類生物係顯示攝食抑制狀態或體重增加抑制狀態之基因轉殖非人類動物。
(51)如(47)、(48)或(49)之基因轉殖非人類生物，其中該基因轉殖非人類生物係基因轉殖植物。
(52)一種基因轉殖非人類動物，其特徵係導入有如(35)或(36)之抗體、或如(37)~(39)中任一者之抑制物質、如(40)~(43)之基因表現抑制物質、或如(44)之載體，且顯示有食慾亢進或體重增加亢進者。
(53)一種基因剔除(knockout)非人類動物，其特徵係使含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124中任一者所示鹼基序列之基因全區域或其一部有缺陷者。
(54)如(53)之基因剔除非人類動物，其中係顯示有食慾亢進或體重增加者。
(55)如(52)、(53)或(54)之非人類動物，其中其可作為選自肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病患、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、整形外科性疾病、月經異常及惡性腫瘤之疾病之模型動物而使用。
(56)如(5)~(13)中任一者之胜肽之製造方法，其中係以無細胞蛋白質合成法或化學合成法進行者。
(57)一種如(5)~(13)中任一者之胜肽之製造方法，其特徵係使用如(23)~(29)中任一者之轉形體、(47)~(51)中任一者之基因轉殖非人類生物、或(52)~(55)中任一者之非人類動物。。
(58)如(56)或(57)之製造方法，其中係包含該胜肽與(35)或(36)之抗體之分離所進行之純化步驟。
(59)如(56)或(57)之製造方法，其中係包含將該胜肽作為GST融合蛋白質而使其表現，並使用谷胱甘太結合載體而純化之步驟。
(60)如(56)或(57)之製造方法，其中係包含將該胜肽作為His Tag融合蛋白質而使其表現，並使用金屬鉗合載體而純化之步驟。
(61)如(56)或(57)之製造方法，其中係包含將該胜肽作為FLAG Tag融合蛋白質而使其表現，並使用抗FLAG Tag抗體之結合載體而純化之步驟。
(62)一種用於預測或診斷攝食亢進或體重增加之狀態之檢定方法，其特徵係包含一種檢測步驟，以檢測哺乳類動物之生體樣品中，含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之核酸分子；或者含有序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115之任一者所示胺基酸序列之聚胜肽之含量者。
(63)如(62)之檢定方法，其中係包含將哺乳類動物之生體樣品中之該核酸分子或該聚胜肽之含量，與正常個體之生體樣品進行比較之步驟。
(64)如(62)或(63)之檢定方法，其中係包含將哺乳類動物之生體樣品中之該核酸分子或該聚胜肽之含量之降低狀態，判斷為攝食亢進或體重增加之狀態之步驟。
(65)如(62)~(64)中任一者之檢定方法，其中係包含將哺乳類動物之生體樣品中之該核酸分子或該聚胜肽之含量之降低狀態，判斷為選自肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病患、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、整形外科性疾病、月經異常及惡性腫瘤之疾病發病或有發病之虞之步驟。
(66)如(62)或(63)之檢定方法，其中係包含將哺乳類動物之生體樣品中之該核酸分子或該聚胜肽之含量之增加狀態，判斷為攝食抑制或體重增加抑制之狀態之步驟。
(67)如(62)~(66)中任一者之檢定方法，其中係將該聚胜肽之含量之檢測，使用(35)或(36)之抗體而進行者。
(68)如(62)~(66)中任一者之檢定方法，其中該核酸分子含量之檢測，係使用用以檢測含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之核酸分子之PCR引子、探針、或DNA晶片中之至少一者所進行。
(69)一種用於如(62)~(68)中任一者之檢定方法之檢定套組，其特徵係包含用以檢測含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之核酸分子之PCR引子、探針、或DNA晶片；或者認識含有序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115之任一者所示胺基酸序列之聚胜肽之抗體、標準胜肽、或結合競合反應用胜肽修飾體中之至少一者。
(70)一種具有攝食抑制及/或體重增加抑制之效果之治療劑或預防劑之篩選方法，其特徵係包含使受測物質接觸於哺乳類細胞之步驟；以及檢測該細胞中，含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之基因表現量之增加，或者檢測該細胞內所含或細胞外所分泌之含有序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115所示胺基酸序列之聚胜肽量之增加之步驟者。
(71)如(70)之篩選方法，其中哺乳類細胞係導入有控制含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之基因表現之調節性核酸分子，以及報導子基因之核酸分子；並將含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之基因之表現誘導藉由報導子基因之表現誘導加以檢測者。
(72)一種具有攝食抑制及/或體重增加抑制之效果之治療劑或預防劑之篩選方法，其特徵係包含將受測物質投予至哺乳動物之步驟；以及檢測該受測動物之生體樣品中，含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之基因表現之亢進，或者檢測含有序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115之任一者所示胺基酸序列之聚胜肽之產生亢進之步驟者。
(73)一種具有攝食抑制及/或體重增加抑制之效果之治療劑或預防劑之篩選方法，其特徵係包含將受測物質投予至如(47)~(50)中任一者之基因轉殖非人類生物、或如(52)~(55)中任一者之非人類動物之步驟；以及檢測該基因轉殖非人類生物或非人類動物中之攝食抑制及/或體重增加抑制之步驟者。
(74)如(70)~(73)中任一者之篩選方法，其中該具有攝食抑制及/或體重增加抑制之效果之治療劑或預防劑，係針對選自肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病患、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、整形外科性疾病、月經異常及惡性腫瘤之疾病之治療劑或預防劑。
(75)一種具有攝食抑制及/或體重增加抑制之效果之治療劑或預防劑，其特徵係藉由如(70)~(74)中任一者之方法所得者。
(76)如(75)之治療劑或預防劑，其中該具有攝食抑制及/或體重增加抑制之效果之治療劑或預防劑，係針對選自肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病患、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、整形外科性疾病、月經異常及惡性腫瘤之疾病之治療劑或預防劑。
(77)一種具有攝食亢進及/或體重增加亢進之效果之治療劑或預防劑之篩選方法，其特徵係包含使受測物質接觸於哺乳類細胞之步驟；以及檢測該細胞中，含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之基因表現量之減少，或者檢測該細胞內所含或細胞外所分泌之序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115之任一者所示胺基酸序列之聚胜肽量之減少之步驟者。
(78)如(77)之篩選方法，其中哺乳類細胞係導入有控制含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之基因表現之調節性核酸分子，以及報導子基因之核酸分子；並將含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之基因之表現抑制，藉由報導子基因之表現抑制加以檢測者。
(79)一種具有攝食亢進及/或體重增加亢進之效果之治療劑或預防劑之篩選方法，其特徵係包含將受測物質投予至哺乳動物之步驟；以及檢測該受測動物之生體樣品中，含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之基因表現之抑制，或者檢測含有序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115之任一者所示胺基酸序列之聚胜肽之產生抑制之步驟者。
(80)一種具有攝食亢進及/或體重增加亢進之效果之治療劑或預防劑之篩選方法，其特徵係包含將受測物質投予至如(47)~(50)中任一者之基因轉殖非人類生物、或(52)~(55)中任一者之非人類動物上之步驟；以及檢測該基因轉殖非人類生物或該非人類動物中之攝食之亢進或體重增加之亢進之步驟者。
(81)一種具有攝食亢進及/或體重增加亢進之效果之治療劑或預防劑，其特徵係藉由如(77)~(80)中任一者之方法所得者。
本發明係藉由使用PPAR γ增敏劑，而取得攝食及體重調節之相關因子。再者，藉由使用NESFATIN、NESFATIN－1、NESFATIN－1M30、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、NESFATIN－1M10M、NUCB1－M30、NUCB1－M16、NUCB1－M14、NUCB1－M10M，而能預防或治療肥胖或肥胖症、神經性過食症等代謝、攝食障礙相關疾病、二型糖尿病、耐糖能異常、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟疾病、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、變形性關節症等整形外科性疾病、月經異常、惡性腫瘤等肥胖症相關疾病。進而，藉由使用抗體等抑制NESFATIN、NESFATIN－1、或NESFATIN－1M30活性之物質，可以預防或治療手術後及/或癌症病患之食慾不振或厭食症等營養、攝食障礙之相關疾病。
 〔實施發明之最佳型態〕 <攝食調節及/或體重調節之相關因子之取得方法>
本發明係有關一種攝食調節及/或體重調節之相關因子之取得方法，其特徵係包含將具有PPARγ增敏劑活性之噻唑烷二酮類化合物作用於哺乳類細胞之步驟，以及將以該化合物所表現誘導之基因加以鑑定之步驟。
本發明中，所謂「攝食調節」，係指一定期間內之動物之攝食或人之飲食(以下，合稱為攝食等)量之調節、或於一定期間內以攝食等所攝取之卡路里總量之調節。再者，在攝食調節上，亦包含關於食慾或飽脹感之調節等攝食等動機方面之情事之調節。
在此所謂「攝食抑制」，係指與未經攝食調節之時點相比較，以攝食等之量或攝食等所攝取之卡路里之總量減少之狀態、或未經攝食調節之狀況下進行比較，以攝食等之量或攝食等所攝取之卡路里總量，其增大之傾向被抑制之狀態而言。再者，在攝食抑制中亦包含食慾之減退、飽脹感之亢進等狀態。
另一方面，在此所謂之「攝食亢進」，係指與未經攝食調節之時點相比較，以攝食等之量或攝食等所攝取之卡路里之總量增加之狀態、或未經攝食調節之狀況下進行比較，以攝食等之量或攝食等所攝取之卡路里總量，其降低之傾向被抑制之狀態而言。再者，在攝食亢進中亦包含食慾之增加、飽脹感之抑制等狀態。
所謂「體重調節」，係指在人類或動物中，體重絕對值、體格指數(使用體重及體長之指標)或體脂肪率之調節之意。在此，所謂「體重增加抑制」，係指與未經體重調節之時點相比較，體重絕對值、體格指數或體脂肪率為降低或維持之狀態；或與未經體重調節之狀況下，進行比較，其體重絕對值、體格指數或體脂肪率之增加傾向受到抑制之意。
此外，本發明書中所謂「體脂肪增加抑制」，係指與未經體重調節之時點相比較，體脂肪率降低或維持之狀態；或與未經體重調節之狀況下相比較，體脂肪率增加之傾向受抑制之狀況而言。此外，所謂「體重增加亢進」，係指與未經體重調節之時點相比較，體重絕對值、體格指數或體脂肪率為增加或維持之狀態；或與未經體重調節之狀況下，進行比較，其體重絕對值、體格指數或體脂肪率之增加傾向受到抑制之意。在本發明中亦稱為「體重減少抑制」。在人類之情形，體格指數之代表者，係使用身高BMI(Body Mass Index)，其計算則以體重(kg)÷身高(m)÷身高(m)，而單位則表示為Kg/m2 。因此，體重增加抑制或體重增加亢進之效果，可以此種BMI作為指標而表示。此外，體脂肪率，係以體脂肪占體重之重量比例來表示，其測定例如有體密度法、體水分法、體內鉀量測定法、阻抗法、雙重能量－X射線吸收法、中性子賦活法、近紅外分光法、皮下脂肪厚度法、畫面法等(日本臨床61卷增刊號6第357－400頁2003年日本臨床社刊)。
在本發明中，所謂「具有PPAR γ增敏劑活性之噻唑烷二酮類之化合物」，舉例而言，係指胰島素增敏劑(troglitazone)troglitazone、pioglitazone、rosiglitazone、以及rivoglitazone等，其中又以troglitazone為臨床上最初使用之物質。
本發明中，用以取得攝食調節及/或體重調節之相關因子之哺乳類細胞，例如有肺非小細胞癌細胞株、脂肪細胞、及腦神經衍生細胞等，惟只要係能表現PPAR γ之細胞即可，並不限於此等之範圍。
使前述化合物作用於哺乳類細胞之方法，舉例而言，有以下所述者，亦即將該細胞於該化合物之刺激下進行培養之方法(Satoh等，Oncogene，England，2002年，21卷，第2171－2180頁)。
以該化合物所表現誘導之基因，其鑑定，例如可將專一地誘導表現之基因，藉由使用削減法或DNA陣列解析等方法來進行(Satoh等，Oncogene，England，2002年，21卷，第2171－2180頁)。此外，為了由利用所得到之PPAR γ活性化而專一地衍生之基因中，選擇出分泌於細胞外之因子之編碼物質，可將該基因之鹼基序列進行解析，再由是否編碼有分泌訊息胜肽而加以選擇。進而，由此等基因中選擇參與攝食調節及/或體重調節之基因之方法，例如有含有人類或動物之視床下部之腦之樣品、以及使用以該基因進行編碼之聚胜肽之結合抗體之組織萃取物，進行免疫學檢測(例示於實施例3中)或組織化學方法(例示於實施例4及9中)或利用RT－PCR(原位雜合法：例示於實施例8中)法等來確認其視床下部之表現之方法等。
此外，所得到之參與攝食調節及/或體重調節之基因，可依據該鹼基序列之解析而鑑定出所編碼之聚胜肽之胺基酸序列。所得到之聚胜肽之胺基酸序列或含有其部分胺基酸序列之胜肽或聚胜肽，可使用基因工程或合成化學之方法而加以製作。
將如此所得到之聚胜肽，或在生體內可表現之形式所導入之該胜肽，其所編碼之核酸分子，局部地或全身地導入受測動物中，再調查該動物之攝食量及/或體重之變化，由所得到之聚胜肽或該聚胜肽之編碼基因中，可選出與攝食調節及/或體重調節之相關聚胜肽或基因。此外，其他方法，例如有將對於所得到之聚胜肽之結合抗體，或者可抑制編碼該聚胜肽之基因表現之反意義寡核苷酸分子或RNAi分子等，局部地或全身地導入試驗動物，而藉由調查該動物之攝食量及/或體重之變化，由所得到之聚胜肽或該聚胜肽之編碼基因中，選擇出攝食調節及/或體重調節之相關聚胜肽或基因。
<具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽>
本發明係有關具有以前述方法所得到之攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽。此種聚胜肽，例如有至今功能仍尚未被鑑定之NESFATIN基因所編碼之聚胜肽，該聚胜肽具有前述功能係由本發明所最先發現者。在本發明中，NESFATIN基因係被發現會在被稱為控制食慾之腦視床下部處表現(如實施例4、8、9、24及26中所例示者)，並發現NESFATIN聚胜肽藉由投予至動物之腦內，可引起動物之攝餌量及體重之降低(如實施例6及25中所例示者)。進而，藉由阻礙NESFATIN聚胜肽之功能之抑制或NESFATIN基因之表現，而在動物中可引起攝食亢進及體重增加(如實施例7及實施例15所例示者)。
再者，NESFATIN聚胜肽之例子，例如有含有序列編號3、6及9所示之胺基酸序列者。含有人類之訊息胜肽之前驅體NESFATIN聚胜肽，係標識於序列編號2中。前驅體NESFATIN聚胜肽在分泌於細胞外時，因為訊息胜肽被切斷之故，實質上顯示活性之人類成熟型NESFATIN聚胜肽就成為序列編號3所示之形式。再者，在本發明中，NESFATIN聚胜肽亦可單純稱為NESFATIN。
進而，在本發明中關於具有前述攝食抑制及/或體重增加抑制活性之NESFATIN聚胜肽之研究，繼續努力進行研究之結果，發現了具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之新穎構造之聚胜肽，並完成了本發明。該新穎構造之聚胜肽之發現，推測應係於NESFATIN聚胜肽被分泌至細胞外時，因蛋白質分解酶而被分解，從而就NESFATIN聚胜肽所衍生之各種胜肽進行檢討。其結果，發現了具有由序列編號5所示之NESFATIN聚胜肽之胺基酸編號第25至第106之相當序列之82個胺基酸所成之聚胜肽，其具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性，並可使體脂肪率降低(如實施例12、實施例13及實施例34所例示者)；進而，藉由阻礙NESFATIN－1聚胜肽功能之抑制，而可在動物中引起攝食亢進。據此，將該聚胜肽命名為NESFATIN－1(序列編號14)。NESFATIN聚胜肽係在其構造內具有鈣結合性及DNA結合性之區域等，惟NESFATIN－1聚胜肽係不含這些已知區域構造之序列，從而獲得該NESFATIN－1聚胜肽者即係基於傳統習知之技藝完全不可能預期者。此外，在生體內之胜肽荷爾蒙，已知有許多以前驅體荷爾蒙之形式被表現，其後再以蛋白質分解酶等加以切斷之形式而獲得之例子，且在該作用上有許多報告指出與原荷爾蒙轉化酶(Prohormone Convertase 或 Proprotein Convertase：PC)有關。在序列編號2之人類全長NESFATIN聚胜肽、序列編號5之老鼠前驅體NESFATIN聚胜肽、及序列編號8之大鼠前驅體NESFATIN聚胜肽中，可能存在著以原荷爾蒙轉化酶之次型式之PC1/3(EC 3.4.21.93，悉達(Seidah)等，DNA and Cell Biology，USA，9卷，1990年，第415－424頁)或PC2(EC 3.4.21.94，悉達(Seidah)等，DNA and Cell Biology，USA，9卷，1990年，第415－424頁)切斷之可能共通部位(參照實施例10)，顯示其可能各由序列編號13至15所示之NESFATIN－1胜肽被切下。
此外，在以原荷爾蒙轉化酶切斷之部位上，將加入突變之NESFATIN(Mut)投予至大鼠腦室中時，可得到沒有攝食抑制效果之意外結果(實施例14)。據此，NESFATIN－1聚胜肽除可能係在生體內參與攝食調節及/或體重調節之功能分子外，同時，發現了NESFATIN聚胜肽為能運作起見，以原荷爾蒙轉化酶等包含於生體內之蛋白質酶加以處理之過程亦相當重要。
據上，NESFATIN/NEFA作為胰島素元之類的荷爾蒙前驅體功能係完全未知者，在本發明中就NESFATIN/NEFA之表現部位、或PC1/3及PC2可表現之細胞中之NESFATIN/NEFA表現加以解析，並就其活性及構造努力進行檢討之結果，係最初被發現者。此外，基於原荷爾蒙轉化酶之認識部位之Arg－Arg或Lys－Arg之序列即使存在，在PC1/3及PC2無法被處理之分泌蛋白質亦存在之情事，由NESFATIN/NEFA切下NESFATIN－1而顯示攝食抑制及/或體重增加抑制活性者，顯非習於此技藝者所亦於推知者。
據上，本發明係關於序列編號l3~15所示之NESFATIN－1聚胜肽。該NESFATIN－1聚胜肽，如前所述，係具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性者。老鼠之NESFATIN－1聚胜肽之胺基酸序列係顯示於序列編號14中。具有此種序列之NESFATIN－1聚胜肽，可將序列編號14之NESFATIN－1聚胜肽以原荷爾蒙轉化酶加以切斷，並用逆向色層分析法等方法純化；或以對於後述之NESFATIN－1聚胜肽之抗體發生結合或游離之步驟而獲得。
進而，關於NESFATIN－1聚胜肽之構造及攝食抑制及/或體重增加抑制活性繼續努力進行檢討之結果，發現了具有由序列編號14所示之NESFATIN聚胜肽之胺基酸編號第24至第53之相當序列之30個胺基酸所成之新穎聚胜肽，其具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性(如實施例20所例示者)，茲將該聚胜肽命名為NESFATIN－1M30(序列編號41)。NESFATIN－1M30聚胜肽之表現，係即使NESFATIN聚胜肽或NESFATIN－1聚胜肽被生理地或人工地切斷或分解，如含有相當於NESFATIN－1M30之部位存在時，該聚胜肽即顯示保有攝食抑制及/或體重增加抑制活性者。
進而，在由30個胺基酸長度所構成之NESFATIN－1M30之構造中，就具有攝食抑制活性之部位活性加以檢討。其結果，由其部分胜肽之16個胺基酸長度所構成之NESFATIN－1M16、14個胺基酸長度所構成之NESFATIN－1M14、10個胺基酸長度所構成之NESFATIN－1M10M，顯示其保有攝食抑制及/或體重增加抑制活性者(實施例22)。
將由此種序列編號13、序列編號14、或序列編號15所示之82個胺基酸所構成之NESFATIN－1之序列，就其對於已知之具有攝食調節作用之因子之胺基酸序列之相同性進行解析，其結果發現並無具有強烈相同性之序列，此顯示基於傳統習知之技藝完全無法預測此等NESFATIN－1M30、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、NESFATIN－1M10M，係具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性者。此外，即使在未顯示活性之人類衍生之NESFATIN及NESFATIN－1，其相當於此等 NESFATIN－1M30、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、NESFATIN－1M10M之聚胜肽中，亦明確地係具有活性者。
亦即，本發明係關於序列編號39~41所示之NESFATIN－1M30聚胜肽、序列編號65、68或71所示之NESFATIN－1M16聚胜肽、序列編號66、69或72所示之NESFATIN－1M14聚胜肽、或序列編號68、70或73所示之NESFATIN－1M10M聚胜肽。該NESFATIN－1M30聚胜肽、NESFATIN－1M16聚胜肽、NESFATIN－1M14聚胜肽、及NESFATIN－1M10M聚胜肽，如前所述，係具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性者。此外，人類之NESFATIN－1M30聚胜肽之胺基酸序列係標識於序列編號39中。進而，其中，除了具有序列編號3、序列編號6、序列編號9、序列編號13、序列編號14、或序列編號15所示之胜肽外，具有序列編號39、序列編號40、或序列編號41所示胺基酸序列之聚胜肽中，亦包含具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽亦包含於NESFATIN－1M30聚胜肽中。此種聚胜肽之例子，如NESFATIN聚胜肽或NESFATIN－1聚胜肽被生理地或人工地切斷或分解之聚胜肽中，所含有相當於NESFATIN－1M30之序列者。
在與NEFA/NESFATIN之胺基酸序列及基因具有高度之鹼基序列相同性，且屬於同一科之NucleobindinI(NUCB1)中，就相當於NUCB1之NESFATIN－1M30之部位之NUCB1－M30是否具有相同活性進行檢討。其結果，確認NUCB1－M30亦具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性(實施例23)。此外，將人類、大鼠、老鼠之NESFATIN加以比較時，顯示其各自相當於NESFATIN及NUCB1之NESFATIN－1之部位，尤其是相當於NESFATIN－1M30之部位中，胺基酸序列具有高度之保存性。據上，與NESFATIN－1M16聚胜肽、NESFATIN－1M14聚胜肽、及NESFATIN－1M10M聚胜肽同樣地，由NUCB1之16個胺基酸長度構成之NUCB1－M16、14個胺基酸長度構成之NUCB1－M14、10個胺基酸長度構成之NUCB1－M10M，亦可推測其係保有攝食抑制及/或體重增加抑制活性者。
亦即，本發明係關於序列編號101~103所示NUCB1－M30聚胜肽、序列編號107、110或113所示NUCB1－M16聚胜肽、序列編號108、111或114所示NUCB1－M14聚胜肽、或序列編號109、112或115所示NUCB1－M10M聚胜肽者。該NUCB1－M30聚胜肽、NUCB1－M16聚胜肽、NUCB1－M14聚胜肽、及NUCB1－M10M聚胜肽，如前所述，係保有攝食抑制及/或體重增加抑制活性者。
再者，本發明係關於由與序列編號13~15、39~41、65~73、101~103或107~115所示胺基酸序列之任一者，至少具有60%以上相同性之胺基酸序列所成之具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性者。與序列編號13~15、39~41、65~73、101~103或107~115所示胺基酸序列具有之相同性，係以70%以上為較佳，並以80%以上為最佳。其代表性例子，有人類以外之動物種之NESFATIN－1M30聚胜肽者。舉例而言，由與人類之NESFATIN－1M30聚胜肽之胺基酸序列(序列編號39)，具有60%以上相同性之胺基酸序列所成，且具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽，其例如有老鼠之NESFATIN－1M30聚胜肽(序列編號41)、以及大鼠之NESFATIN－1M30聚胜肽(序列編號40)等，惟並不限於此範圍。
再者，由與序列編號13~15、39~41、65~73、101~103或107~115所示胺基酸序列之任一者，至少具有60%以上相同性之胺基酸序列所成之聚胜肽中，具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽，其選擇可將該聚胜肽或聚胜肽之編碼核酸分子，局部地或全面地導入受測動物中，再藉由選擇可抑制該動物之攝食量及/或體重之聚胜肽而進行。此外，其他方法尚有將可抑制對於前述聚胜肽之抗體、或該聚胜肽之編碼基因之表現之反意義寡核苷酸分子或RNAi分子等，局部地或全面地導入受測動物中，再藉由選擇可抑制該動物之攝食量及/或體重之聚胜肽而進行。以下，茲將此種聚胜肽稱為NESFATIN－1M30修飾體、NESFATIN－1M16修飾體、NESFATIN－1M14修飾體、及NESFATIN－1M10M修飾體、NUCB1－M30修飾體、NUCB1－M16修飾體、NUCB1－M14修飾體、及NUCB1－M10M修飾體等。
進而，本發明係關於在序列編號13~15、39~41、65~73、101~103或107~115所示胺基酸序列之任一者中，其一部胺基酸有缺失、插入、或取代之胺基酸序列所成，且具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽者。此種聚胜肽，例如可在序列編號13~15、39~41、65~73、101~103或107~115之胺基酸序列中，將一個以上之胺基酸殘基，以與該胺基酸為化學上性狀或構造上類似之胺基酸進行取代而獲得。此種化學上性狀或構造上類似之胺基酸，其取代，亦即高度保存性之胺基酸之取代具體態樣，對於習於此技藝者係廣為熟知者。舉例而言，甘胺酸(Gly)係與脯胺酸(Pro)、丙胺酸(Ala)及纈胺酸(Val)；白板酸(Leu)係與異白板酸(Ile)；麩胺酸(Glu)係與麩醯胺酸(Gln)；天冬胺酸(Asp)係與天冬醯胺酸(Asn)；半胱胺酸(Cys)係與蘇胺酸(Thr)；蘇胺酸係與絲胺酸(Ser)及丙胺酸；離胺酸(Lys)係與精胺酸(Arg)，在化學上性狀或構造上為類似者。進而，其他方法，有將胺基酸之取代容易度加以列表之胺基酸矩陣，例如可參照PAM(Wilbur)，Molecular biology and evolution，USA，1985年，2卷，第434－447頁及BLOSUM((Henikoff)等，Proceedings of the National Academy of Sciences ofthe United States of America，USA，1992年，89卷，第10915－10919頁)等，參考其等級之高低以進行胺基酸之取代，此為習於此技藝者皆可易於實施者。
再者，在序列編號13~15、39~41、65~73、101~103或107~115所示胺基酸序列之任一者中，其一部胺基酸有缺失、插入、或取代之胺基酸序列所成之聚胜肽中，具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽，其選擇可與前述NESFATIN修飾體之選擇同樣地進行。此外，以下，茲將此種聚胜肽亦稱為NESFATIN－1M30修飾體等。
再者，本發明係關於由與序列編號3、6或9所示胺基酸序列之任一者，至少具有60%以上相同性之胺基酸序列；或者在序列編號3、6或9所示胺基酸序列之任一者中，其一部胺基酸有缺失、插入、或取代之胺基酸序列所成，且具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽者。茲將該聚胜肽，與前述之修飾體相同地，在以下稱為NESFATIN修飾體。該NESFATIN修飾體，係與前述之NESFATIN－1M30修飾體等相同地，與序列編號3、6或9所示胺基酸序列具有之相同性，係以70%以上為較佳，並以80%以上為最佳。
再者，如前所述，為使NESFATIN聚胜肽能發生功能起見，本發明已確知以在原荷爾蒙轉化酶等生體內所含之蛋白質酶加以處理之過程係十分重要。因此，該NESFATIN修飾體，係以可在生體內產生NESFATIN－1、NESFATIN－1M30、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、NESFATIN－1M10M、NUCB1－M30、NUCB1－M16、NUCB1－M14、或NUCB1－M10M(含有序列編號13~15、39~41、65~73、101~103或107~115所示胺基酸序列之聚胜肽)、或其等之聚胜肽為較佳。此種NESFATIN修飾體，必須在其胺基酸序列中，具有生體內所含之蛋白質酶等切斷酶之認識部位。此種切斷酶，例如有原荷爾蒙轉化酶(PC)等，此種原荷爾蒙轉化酶，例如有furin、PC1(亦有被稱為PC3者)、PC2、PACE4、PC4、PC6(亦有被稱為PC5者)、LPC(亦有被稱為PC7或PC8者)等(The FASEB Journal，1216，vol.17，July 2003)。再者，只要是可在末梢或腦室內使NESFATIN－1等產生者即可，其蛋白質酶之種類並無特別之限制。
此外，基於同樣之理由，該切斷酶之認識部位之位置並無特別之限制，其只要是NESFATIN修飾體即可，而基於老鼠衍生NESFATIN－1、NESFATIN－2、NESFATIN－3、及NESFATIN－2/3之實驗結果(實施例10)，係以在可使之產生NESFATIN－1之原荷爾蒙轉化酶之認識部位，亦即序列編號3、6或9之胺基酸編號82、83；以及，老鼠衍生之NESFATIN所含之另一處原荷爾蒙轉化酶之認識部位，亦即序列編號3、6或9之胺基酸編號163、164之間；換言之，即為相當於序列編號3、6或9之胺基酸編號82~162之胺基酸序列中，設定至少包含一個在生體內所含之切斷酶之認識部位者，其基於不會對於可產生之聚胜肽活性造成影響之觀點而較佳。
再者，該修飾體，關於其是否具有可在生體內被切斷之活性，是否具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之確認，係與前述之NESFATIN－1M30修飾體等之選擇相同，可將該聚胜肽、或該聚胜肽之編碼核酸分子，局部地或全身地導入受測動物中，並藉由選擇可抑制該動物之攝食量及/或體重之聚胜肽而進行。其他方法尚有將可抑制對於前述聚胜肽之抗體、或該聚胜肽之編碼基因之表現之反意義寡核苷酸分子或RNAi分子等，局部地或全面地導入受測動物中，再藉由選擇可抑制該動物之攝食量及/或體重之聚胜肽而進行。
本發明之NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、NESFATIN－1M30、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、NESFATIN－1M10M、NUCB1－M30、NUCB1－M16、NUCB1－M14、或NUCB1－M10M，亦包含在N末端或C末端上附加有至少一個以上之胺基酸者。此種NESFATIN聚胜肽等中，舉例而言，係包含在序列編號3、序列編號6或序列編號9之胺基酸序列之N末端上，附加有甲硫胺酸殘基、乙醯基或焦麩胺酸等，以及在N末端或C末端上附加有適當之Tag序列(典型者為組胺酸Tag或FLAGTag)者。具有此種構成之NESFATIN聚胜肽等，其具有使用金屬鉗合劑載體或抗體而容易進行純化之優點。此外，如將NESFATIN在生體內以原荷爾蒙轉化酶加以處理時，可產生在NESFATIN－1之C末端上附加有原荷爾蒙轉化酶之認識部位者，而此種聚胜肽亦包含於本發明之聚胜肽中。
再者，本發明之NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、NESFATIN－1M30、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、NESFATIN－1M10M、NUCB1－M30、NUCB1－M16、NUCB1－M14、或NUCB1－M10M，其係包含至少一個胺基酸殘基被以化合物或胜肽加以修飾者。在此種NESFATIN聚胜肽等中，舉例而言，係包含可在序列編號3、序列編號6或序列編號9所示序列等上，將NESFATIN聚胜肽等以外之胜肽或螢光物質等，使用習知方法(Hermanson等，Bioconjugate techniques，USA，1996年發行，Academic Press)使之進行酶性或化學性的會合所得到之聚胜肽；舉例而言，有青色多管水母衍生之螢光蛋白質或分泌型鹼性磷酸酯酶之胺基酸序列者(所謂的融合蛋白質)。舉例而言，與青色多管水母衍生之螢光蛋白質之融合蛋白質，可藉由測定其螢光強度；而與分泌型鹼性磷酸酯酶之融合蛋白質，則可藉由測定使該酶與其基質發生反應所生之發色、發光或螢光強度，而容易地可檢測出其等之融合蛋白質之存在。此種NESFATIN聚胜肽等，藉由實施例6所記載之方法等測試活性，而可以鑑定出對於攝食調節及/或體重調節之作用。
本發明係關於一種用於具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之醫藥組成物，其特徵係包含NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、NESFATIN－1M30、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、NESFATIN－1M10M、NUCB1－M30、NUCB1－M16、NUCB1－M14、或NUCB1－M10M或者其等之修飾體(以下合稱「NESFATIN聚胜肽等」)之任一者，或含有該NESFATIN聚胜肽等之胺基酸序列一部之胜肽作為有效成分者。所謂含有該NESFATIN聚胜肽等之胺基酸序列一部之胜肽，係指在保持攝食抑制及/或體重增加抑制活性之限度內，使該聚胜肽之一部胺基酸序列發生缺失者之意。
<在攝食或體重增加發生亢進情事時所引起疾病之治療或預防用之醫藥組成物>
本發明係關於一種含有前述NESFATIN聚胜肽等之任一者，或含有該NESFATIN聚胜肽等之胺基酸序列一部之胜肽作為有效成分，且在攝食或體重增加發生亢進情事時所引起疾病之治療或預防用之醫藥組成物。
本發明之NESFATIN聚胜肽等之藥理學上效果，可依NESFATIN聚胜肽投予至大鼠第3腦室內(實施例6及25)、NESFATIN－1聚胜肽投予至大鼠第3腦室內(實施例12、13、27及34)、NESFATIN－1聚胜肽投予至老鼠腹腔內或皮下(實施例18及19)、NESFATIN－1M30聚胜肽投予至老鼠腹腔內(實施例20)等所例示之結果加以證明。再者，藉由將具有瘦體素抵抗性之模型動物Zucker fa/fa大鼠中之NESFATIN－1聚胜肽投予至第3腦室內(實施例17)，可例示出在病態模型動物之藥理學上效果，並且對於在人類之肥胖上所引起之瘦體素抵抗性之病態，其亦例示有其藥理學上效果。進而，藉由在Agouti黃老鼠之投予實驗(實施例18)，顯示其可能透過與已知之參與攝食調節之因子之質素激素(melanocortin)系相異之機構，而在藥理學上進行攝食控制之可能性。由這些例示之事實，證明NESFATIN聚胜肽等係可作為在攝食或體重增加發生亢進情事時所引起疾病之治療或預防用之醫藥組成物者。所謂「攝食或體重增加發生亢進情事時所引起疾病」，例如有肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病患、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、整形外科性疾病、月經異常及惡性腫瘤等。肥胖，係包含起因於肥胖所合併之相關健康障礙，或者在臨床上該合併可預測時，醫學上必須減重之病態之肥胖症。在整形外科之疾病中，包含因體重過重所致之變形性關節症、腰椎症(變形性脊椎症)、腰痛症(閃腰)等。此外，惡性腫瘤中，包含乳癌、子宮癌、結腸癌、腎臟癌、食道癌、胰臟癌、肝臟癌及膽囊癌。
再者，本發明之醫藥組成物，亦可包含藥學上可容許之任一種添加劑。使用藥學上可容許之任一種添加劑之製劑，可以「REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20t h EDITION，University of the Sciences in Philadelphia著，Williams & Wilkins公司，2000年12月15日發行」所記載之方法實施。此種醫藥組成物之一種型態，係藉由在無菌之水性液體或油性液體中進行溶解、懸浮、或乳化，而供作調製之液劑。此種溶劑，例如有水性液體之注射用蒸餾水、生理食鹽水等，此外尚可添加滲透壓調節劑(例如D－葡萄糖、D－山梨糖醇、D－甘露糖醇、氯化鈉等)，或者併用適當之溶解輔助劑(例如醇類(如乙醇)、聚醇類(如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性界面活性劑(如聚蘇佩特80、聚氧基伸乙基硬化箆麻子油50)等)。再者，即使在油性液體作為溶劑使用時，該油性液體之例子有芝麻油、大豆油等，亦可併用溶解輔助劑例如苄基苯甲酸、苄基醇等。在此種液劑中，亦有適當地使用緩衝劑(如磷酸鹽類緩衝劑、醋酸鹽類緩衝劑)、無痛化劑(如毒芹氯化苄叉、鹽酸普魯卡因等)、安定劑(例如人類血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(如抗壞血酸、異抗壞血酸及其等之鹽等)、著色劑(如葉綠素銅、β－胡蘿蔔素、紅色2號、藍色1號等)、防腐劑(如對羥基苯甲酸酯、苯酚、氯化苯釷等)、增黏劑(如羥基丙基纖維素、羧基甲基纖維素及其等之鹽類)、安定化劑(例如人類血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇等)、矯臭劑(如薄荷醇、柑橘香料等)等添加劑。此外，其他之醫藥組成物(用以與上述幾個「醫藥品組成物」之表現可統一起見)之型態，例如有散劑、錠劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、座劑、片劑等固態劑。在以經口用製劑之型式投予之固態劑上，添加劑例如有賦形劑(如結晶性纖維素、乳糖、澱粉等)、滑潤劑(如硬脂酸鎂、滑石等)、結合劑(羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙二醇(macrogol)等)、崩壞劑(如澱粉、羧基甲基纖維素鈣等)等。此外，如有必要，可使用防腐劑(苄基醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等)、抗氧化劑、著色劑、甜味劑等之添加劑。進而，其他型態例如有黏膜用醫藥組成物，在此製劑中亦可基於對黏膜賦予吸著性、滯留性等之主要目的，而添加而含有以下之添加劑：黏著劑、黏著增強劑、黏稠劑、黏稠化劑等(如黏蛋白、洋菜、明膠、果膠、卡拉膠、褐藻酸鈉、洛卡斯膠、三仙膠、西黃蓍膠、阿拉伯膠、甲殼素、普魯藍多糖、蠟質澱粉、硫糖鋁、纖維素及其衍生物(例如羥基丙基甲基纖維素、聚丙三醇脂肪酸酯、丙烯酸(甲基)丙烯酸烷基共聚物或其鹽、聚丙三醇脂肪酸酯等))。然而，供給用於生體上之醫藥組成物之型態及溶劑或添加劑並不限於此範圍，只要是習於此技藝者皆可適當地加以選擇。
前述醫藥組成物，基於症狀改善之目的，可以經口或非經口而進行投予。在經口投予時，可選擇顆粒劑、散劑、錠劑、膠囊劑、液劑、糖漿劑、乳劑或懸浮劑、酏劑等劑型。在非經口投予時，例如可作為經鼻劑，而選擇液劑、懸浮劑、固態製劑等。再者，其他之非經口投予型態，可作為注射劑，注射劑可選擇皮下注射劑、靜脈注射劑、點滴注射劑、肌肉注射劑、腦室內注射劑或腹腔內注射劑等。再者，在其他之非經口投予上使用之製劑，例如有座劑、舌下劑、經皮劑、經鼻劑以外之經黏膜投予劑等。進而，亦可以動脈導管或血管內栓塞劑所含有或塗佈之態樣，而在血管內進行局部投予。
前述醫藥組成物之投予量，係依病患之年齡、性別、體重、症狀、治療效果、投予方法、處理時間、或該醫藥組成物中所含之活性成分之種類等而有不同，一般係每個成人，可以每次在0.1 mg至500 mg之範圍，較佳係在0.5 mg至200 mg之範圍內進行投予。然而，投予量因為會因各種條件而變動，且亦有可能其投予量會超過上述之範圍。
再者，NESFATIN聚胜肽等之編碼基因，其可以基因治療之態樣來使用。所謂該基因治療，舉例而言，可藉由將該基因導入生體而達成其治療效果。習知之方法，例如將會帶來治療效果之蛋白質之編碼基因導入生體中，使其表現，即可以治療疾病(金田著，日本藥理雜誌，2001年發行117卷，第299~306頁)。
再者，進而，藉由將NESFATIN聚胜肽等之編碼基因之任一者導入，並藉由將可表現該聚胜肽之形式之轉形體進行投予，較佳係在欲導入之種間使用可移植之宿主之轉形體並進行投予，即可以藉由以該轉形體產生之NESFATIN聚胜肽等進行治療。
<具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽之編碼核酸分子>
進而，本發明係關於前述NESFATIN聚胜肽等之任一者之編碼核酸分子。前述NESFATIN聚胜肽之編碼核酸分子，例如有人類之前驅體NESFATIN聚胜肽之編碼基因之鹼基序列所成之核酸分子(序列編號1)、老鼠之前驅體NESFATIN聚胜肽之編碼基因之鹼基序列所成之核酸分子(序列編號4)、大鼠之前驅體NESFATIN聚胜肽之編碼基因之鹼基序列所成之核酸分子(序列編號7)、扣除訊息胜肽部分之成熟型人類NESFATIN聚胜肽之編碼基因之鹼基序列所成之核酸分子(序列編號10)、老鼠之成熟型NESFATIN聚胜肽之編碼基因之鹼基序列所成之核酸分子(序列編號11)、或大鼠之成熟型NESFATIN聚胜肽之編碼基因之鹼基序列所成之核酸分子(序列編號12)等。
前述NESFATIN－1聚胜肽之編碼核酸分子，例如有人類之NESFATIN－1聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號18)、老鼠之NESFATIN－1聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號19)、以及大鼠之NESFATIN－1聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號20)等。
前述NESFATIN－1M30聚胜肽之編碼核酸分子，例如有人類之NESFATIN－1M30聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號44)、老鼠之NESFATIN－1M30聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號46)、以及大鼠之NESFATIN－1M30聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號45)等。
前述NESFATIN－1M16聚胜肽之編碼核酸分子，例如有人類之NESFATIN－1M16聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號74)、老鼠之NESFATIN－1M16聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號80)、以及大鼠之NESFATIN－1M16聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號77)等。
前述NESFATIN－1M14聚胜肽之編碼核酸分子，例如有人類之NESFATIN－1M14聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號75)、老鼠之NESFATIN－1M14聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號81)、以及大鼠之NESFATIN－1M14聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號78)等。
前述NESFATIN－1M10M聚胜肽之編碼核酸分子，例如有人類之NESFATIN－1M10M聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號76)、老鼠之NESFATIN－1M10M聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號82)、以及大鼠之NESFATIN－1M10M聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號79)等。
前述NUCB1－M30聚胜肽之編碼核酸分子，例如有人類之NUCB1－M30聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號104)、老鼠之NUCB1－M30聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號106)、以及大鼠之NUCB1－M30聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號105)等。
前述NUCB1－M16聚胜肽之編碼核酸分子，例如有人類之NUCB1－M16聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號116)、老鼠之NUCB1－M16聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號122)、以及大鼠之NUCB1－M16聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號119)等。
前述NUCB1－M14聚胜肽之編碼核酸分子，例如有人類之NUCB1－M14聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號117)、老鼠之NUCB1－M14聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號123)、以及大鼠之NUCB1－M14聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號120)等。
前述NUCB1－M10M聚胜肽之編碼核酸分子，例如有人類之NUCB1－M10M聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號118)、老鼠之NUCB1－M10M聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號124)、以及大鼠之NUCB1－M10M聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號121)等。
再者，在本發明之NESFATIN聚胜肽等中，如前所述，亦包含在N末端或C末端上至少附加有1個以上之胺基酸者；以及至少1個胺基酸殘基被以化合物或胜肽加以修飾者。此種NESFATIN聚胜肽等之編碼核酸分子，舉例而言，如以NESFATIN聚胜肽為例時，在序列編號3、序列編號6、或序列編號9之序列之N末端上再附加有任意聚胜肽所成聚胜肽之編碼核酸分子，其可以藉由在序列編號10、序列編號11、或序列編號12之5’末端上具有ATG之鹼基序列，並在其後將連接有所欲附加胺基酸序列之編碼密碼之鹼基序列附加於其上而製作得到。再者，本發明之核酸分子，其亦包含該在NESFATIN聚胜肽等之胺基酸序列之N末端及/或C末端上，附加有原荷爾蒙轉化酶等之蛋白質酶認識(切斷)序列所成聚胜肽之編碼核酸分子，惟並不限於此等範圍。
其他，舉例而言，尚包含在序列編號3、序列編號6、或序列編號9所示之胺基酸序列所成聚胜肽之編碼基因序列之5’或3’末端上，將青色多管水母衍生之螢光蛋白質或分泌型鹼性磷酸酯酶之編碼基因序列，以各自之蛋白質之胺基酸序列被轉譯之形式加以結合之鹼基序列所成核酸分子等。
在前述NESFATIN等修飾體之編碼核酸分子中，係包含由與序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103或107~115所示胺基酸序列之任一者，至少具有60%以上相同性之胺基酸序列所成之具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽之編碼核酸分子，該相同性係以70%以上為較佳，並以80%以上為最佳。其代表性例子，如以NESFATIN－1M30聚胜肽為例時，例如有人類以外之動物種之NESFATIN－1M30聚胜肽等。舉例而言，有由具有與人類之NESFATIN－1M30聚胜肽之胺基酸序列(序列編號39)為60%以上相同性之胺基酸序列所成，且具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽之編碼核酸分子，如老鼠之NESFATIN－1M30聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號46)、大鼠之NESFATIN－1M30聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號45)、人類之NUCB1－M30聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號104)、老鼠之NUCB1－M30聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號106)、以及大鼠之NUCB1－M30聚胜肽之編碼核酸分子(序列編號105)等，惟並不限於此等核酸分子之範圍。
再者，前述NESFATIN等修飾體之編碼核酸分子中，亦包含在序列編號6、9、13~15、39~41、65~73、101~103或107~115所示胺基酸序列之任一者中，其一部胺基酸有缺失、插入、或取代之胺基酸序列所成，且具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽之編碼核酸分子。
進而，本發明亦關於一種可與序列編號4、7、11、12、18、19、20、44~46、74~82、104~106、或116~124所示鹼基序列或該鹼基序列之部分序列在嚴苛條件下進行雜合，且編碼具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽之核酸分子。此種核酸分子，可藉由使用序列編號4、7、10、11、12、18、19、20、44~46、74~82、104~106、或116~124所示鹼基序列或該鹼基序列之部分序列之雜合法而得到。具體而言，可將任意生物種衍生之cDNA或基因組DNA斷片等插入於質體載體或噬菌體載體，再導入大腸菌等宿主而製得其基因庫。進而將其於含有適當之選擇藥劑之洋菜培養基上進行培養。其後，將所生之重組大腸菌選殖株或噬菌體選殖株複印至硝基纖維素模等再取下，並以含有鹼或界面活性劑之狀態將菌體或噬菌體溶解，將其中所含之DNA固定於膜上，相對於該膜將序列編號4、7、11、12、18、19、20、44~46、74~82、104~106、或116~124所示鹼基序列或該鹼基序列之部分序列所成DNA，以3 2 P等加以標識，並與溶解有單股化之探針之適當雜合溶液在適當溫度下進行反應。反應後，將該膜以x2 SSC等洗淨並除去多餘之探針後，在高度嚴苛條件(例如x0.1 SSC，65℃)或中度嚴苛條件(例如x0.5 SSC，65℃)下加以洗淨，再將該膜在黑暗中與X射線接觸並感光。在數小時至數日之時間，將在低溫致冷器等中進行感光之X射線薄膜加以顯影，檢測其感光點，再將複製至該膜上之培養皿對應位置上之大腸菌或噬菌體採取並加以培養後，對於載體中所插入基因之序列進行解析，即可取得與NESFATIN基因、NESFATIN－1基因或NESFATIN－1M30基因具有高度相同性之基因。再者，使用該基因序列，進而以cDNA或基因組資料庫之雜合反應，取得選殖株或引子延伸法等來鑑定周邊序列，即可解析出編碼蛋白質之基因構造，並取得與NESFATIN、NESFATIN－1、NESFATIN－1M30、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、NESFATIN－1M10M、NUCB1－M30、NUCB1－M16、NUCB1－M14、及NUCB1－M10M具有相同性之分子之核酸分子。進而，與序列編號4、7、10、11、12、18、19、20、44~46、74~82、104~106、或116~124所示鹼基序列或該鹼基序列之部分序列，可在嚴苛條件下進行雜合之核酸分子中，該具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽之編碼核酸分子，其選擇可藉由將該核酸分子所編碼之聚胜肽、或該核酸分子，局部地或全身地導入受測動物中，再選擇可抑制該動物之攝食量及/或體重之核酸分子而進行。此外，其他方法，有將對於該核酸分子所編碼之聚胜肽之結合抗體，或者可抑制編碼該核酸分子之基因表現之反意義寡核苷酸分子或RNAi分子等，局部地或全身地導入試驗動物，再藉由選擇可抑制該動物之攝食量及/或體重之核酸分子而進行。
<載體>
再者，本發明係有關含有前述NESFATIN聚胜肽等任一者之編碼核酸分子之載體。使用含有此種前述NESFATIN聚胜肽等之編碼核酸分子之載體，並藉由製作一在微生物等宿主細胞上導入有NESFATIN聚胜肽等基因等之基因重組體，即能安定地保存或複製該基因。在具有可在宿主細胞內複製之功能之載體中所重組之NESFATIN聚胜肽等之編碼基因，可藉由將重組細胞在適當之培養基中進行培養，並藉由細胞之增殖或細胞內導入基因之複製數之增幅，即可大量地調製出該基因之核酸分子。
再者，該核酸分子，亦可在控制該核酸分子之表現之調節性核酸分子之控制下，進行功能性之結合。可控制該核酸分子之表現之調節性核酸分子，例如有啟動子序列或加強子序列等，或用以將重組基因在宿主細胞內表現之調節序列之編碼核酸分子等，只要係習於此技藝者皆可適當地加以選擇。NESFATIN聚胜肽等之編碼核酸分子，可藉由在此種調節序列之編碼核酸分子之控制下進行重組，而在任意之宿主細胞(例如微生物、哺乳類細胞、昆蟲細胞等)中，使NESFATIN聚胜肽等大量地產生。
再者，可在本發明所使用之載體，通常例如有在欲表現之基因上游使其保有啟動子，在下游使其保有聚腺嘌呤基化部位及轉錄終止序列等之表現載體。在脊椎動物此種表現載體，例如有保有SV40之初期啟動子之pSV2dhfr(Mol.Cell.Biol.,854,1981)、pcDNA3.1(＋)(Invitrogen公司)及pCAGGS(Gene,108,193－200,1991)等，惟並不限於此等範圍，只要是習於此技藝者皆可適當地加以選擇。再者，此種載體，亦可基於攝食抑制或體重增加抑制之治療目的而導入哺乳類細胞中。
如將大腸菌作為宿主而使用時，例如可使用pBR322及其改良載體等，惟並不限於此等範圍，亦可使用習知之各種菌株及載體。啟動子，例如有大腸菌乳糖(lac)、大腸菌trp等啟動子，惟並不限於此等範圍。此外，該啟動子，不論何者均已特性化，而為習於此技藝者所習知，可為合成者或由已知之質體所重組者。
其具體例子，有在實施例5中，將NESFATIN聚胜肽之編碼核酸分子重組至載體中，製作大腸菌之基因重組體，而製得保持有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之NESFATIN聚胜肽。再者，有在實施例16中，將序列編號13至15之胺基酸序列作為與谷胱甘太－S－轉化酶(GST，Glutathione－S－Transferase)等之融合蛋白質而使其表現，並使用在谷胱甘太固定化載體上之吸附、脫離反應而純化之後，藉由將GST部分切斷並純化而將NESFATIN－1胜肽以基因重組法而製得。進而，有在實施例16中，將NESFATIN－1聚胜肽之編碼核酸分子重組至載體中，製作大腸菌之基因重組體，即可調製出保持有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之NESFATIN－1聚胜肽。
再者，本發明之載體，為了攝食抑制及/或體重增加抑制之目的，可藉由使用基因治療之方法導入哺乳類細胞，而達成其治療效果。藉由將帶有治療效果之蛋白質、亦即NESFATIN聚胜肽之編碼基因導入哺乳類動物中並使其表現者，而得治療疾病之方法係此業界所公知者(金田著，日本藥理雜誌，2001年發行，117卷，第299~306頁)。
<轉形體>
本發明係有關含有前述NESFATIN聚胜肽等任一者之編碼核酸分子之轉形體。此種轉形體，可藉由將該聚胜肽之編碼基因導入宿主細胞轉形而製得。轉形方法，例如有生物學上方法、物理性方法、化學性方法等。生物學上方法，例如有使用病毒載體之方法、利用專一性受體之方法、細胞融合法(HVJ(仙台病毒))、聚乙二醇(PEG)、電細胞融合法、微小核融合法(染色體移入)等。物理性方法，例如有顯微注射法、電穿孔法、基因槍法(gene gun)等。化學性方法，例如有磷酸鈣沉澱法、脂質體法、DEAE葡聚糖法、原生質體法、紅血球形骸細胞法、紅血球膜形骸細胞法、微膠囊法等。只要是習於此技藝者皆可適當地加以選擇。此外，所得到之轉形體可依據一般方法而加以培養，而生產出NESFATIN聚胜肽等。在培養上所使用之培養基，可根據所採用之宿主細胞而適當地選用各種慣用之物質，而在其培養及宿主細胞之生長上最適合條件下來實施。
可在真核細胞中使標的蛋白質表現之方法，在各該領域中習如有許多系統。舉例而言，在酵母菌體中表現之系統，例如有特開昭57－159489號公報之「酵母菌中之蛋白質之表現」；在植物細胞中表現之系統，例如有特許2517813號公報之「用於在生體細胞中導入生物學上物質之改良方法及裝置」或特開2003－274953號之「在植物細胞之基因導入方法及基因導入用之植物細胞處理裝置」；在昆蟲細胞中表現之系統，例如有特開昭60－37988號公報之「重組桿狀病毒表現載體之製法」；在哺乳類動物細胞中表現之系統，例如有特開平2－171198號公報之「真核性表現之改良」，惟在此範圍外毋寧仍有許多系統存在者。
在轉形上所使用之宿主細胞，亦可使用真核性宿主細胞及原核性宿主細胞之任一者。真核性宿主細胞，係包含脊椎動物、酵母菌、植物細胞、及昆蟲細胞等。植物細胞，例如有由雙子葉或單子葉植物之組織片或組織分離之細胞，或者由組織所形成之傷癒組織之衍生細胞等。脊椎動物細胞，例如有CHO細胞、293T細胞及COS7細胞等。原核性宿主細胞，例如有大腸菌、枯草菌及放線菌等，例如在大腸菌即常使用Echerichia coli K12株等。再者，如使用脊椎動物作為宿主細胞時，所得到之轉形體，基於用在攝食抑制或體重增加抑制之治療上，其細胞治療之目的，可以導入於哺乳類動物中。該轉形體，係以就編碼所導入之NESFATIN聚胜肽等之基因，確認其是否有表現來確認者為較佳。再者，在該轉形體之投予上，該轉形體係以分散於各種緩衝劑、生理食鹽水等中再投予者為較佳(特開2003－342201號公報)。
<抗體>
本發明係有關與前述NESFATIN聚胜肽等任一者結合之抗體。此種抗體，可使用習於此技藝者習知之手法而製得。本發明之抗體，可為多株抗體、或單株抗體(Milstein等，Nature，England，1983年10月6日發行，305卷5934號，第537~540頁)。舉例而言，對於NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、NESFATIN－1M30聚胜肽、NESFATIN－1M16、NESFATIN－lM14、NESFATIN－1M10M、NUCB1－M30、NUCB1－M16、NUCB1－M14、或NUCB1－M10M之多株抗體，其可以由對於抗原產生免疫反應之哺乳動物血清等進行回收。進而，其他的例子則可由具有NESFATIN聚胜肽等部分序列所成之序列之胜肽，使哺乳類動物產生免疫反應後再由其血清等中進行回收。更具體之例子，係如實施例3所示者，可藉由與相當於序列編號8之胺基酸編號141至152之序列之胜肽(序列編號24)，結合於「攜帶蛋白質」，再將其作為抗原並使動物發生免疫，而得到與NESFATIN聚胜肽等結合之抗體。再者，此抗體在被投予至動物時，在該動物上顯示係具有攝食亢進及體重增加之效果(實施例7)。再者，其他具體例子，尚有藉由將相當於序列編號8之胺基酸編號48至62之序列之胜肽(序列編號32)，結合於「攜帶蛋白質」，再將其作為抗原並使動物發生免疫，而得到與NESFATIN聚胜肽等結合之抗體(實施例10)。此序列編號32之聚胜肽因係由人類、老鼠、大鼠之NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽以及NESFATIN－1M30聚胜肽中，共通之胺基酸序列所成之故，所得到之抗體即可與這些聚胜肽全部進行結合。再者，此抗體如被投予至動物中時，該動物上會顯示攝食亢進及體重增加之效果(實施例14)。此外，尚可由揭示之NESFATIN聚胜肽等序列而製作作為適當抗原之胜肽，再製作抗體。
對於前述NESFATIN聚胜肽等之單株抗體，可由對於抗原產生免疫反應之哺乳動物取出免疫細胞，並與骨髓腫細胞等進行細胞融合而得到融合瘤，對之進行篩選後再由其培養物加以回收。
此種抗體，可適當地加以標識，而使用於前述NESFATIN聚胜肽等之檢測上。再者，亦可不將該抗體加以標識，而對專一地結合於該抗體之物質(例如蛋白質A或蛋白質G)而進行間接的檢測。具體之檢測方法，例如有ELISA法。
用以得到本發明之抗體之抗原，例如可將前述NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、NESFATIN－1M30、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、NESFATIN－1M10M、NUCB1－M30、NUCB1－M16、NUCB1－M14、及NUCB1－M10M或其等之修飾體之編碼核酸分子、或其一部，重組至表現載體中，再將其導入適當之宿主細胞，製作轉形體，培養該轉形體後使重組蛋白質表現，另由培養體或培養上清液中將所表現之重組蛋白質進行純化而得到。或者，亦可將以該基因所編碼之胺基酸序列、或以全長cDNA所編碼之胺基酸序列之部分序列所成之寡胜肽，進行化學性合成，並作為免疫原而使用。免疫動物，可使用老鼠、大鼠、兔子、山羊、馬、倉鼠等，只要是習於此技藝者皆可適當地加以選擇。
<可抑制具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽之活性或表現之物質>
在本發明之檢討中，係發現製作對於NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、及NESFATIN－1M30聚胜肽之結合抗體，投予至動物之腦中，而使得該動物之攝食量產生亢進者(實施例7及實施例14)。再者，藉由將可抑制NESFATIN基因之表現之反意義RNA(寡核苷酸)投予至動物之腦內，可見到該動物之攝食量之亢進及體重之增加(實施例15)。此現象顯示NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、或NESFATIN－1M30聚胜肽，在腦內具有實際上攝食調節及/或體重調節之功能。進而，NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、或NESFATIN－1M30聚胜肽在末梢(血中)或腦內之濃度上升，會有攝食抑制及/或體重增加抑制之現象，顯示可抑制該聚胜肽之活性或表現之物質之作用，係攝食亢進及/或體重增加亢進，從而證明NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、及/或NESFATIN－1M30聚胜肽，係在生體內扮演攝食調節及/或體重調節之中心角色之因子。在此同時，對於NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、及/或NESFATIN－1M30聚胜肽，可阻礙其等活性或阻礙其等表現之物質本身，亦可用於攝食降低或體重降低所導致之疾病或症狀，例如厭食症、功能性胃腸症(Functional dyspepsia)、或癌症、發炎性疾病、腦下垂體、甲狀腺、副腎上腺等功能降低、手術後或過度之壓力等所導致之攝食抑制及/或體重增加抑制狀態上之治療、診斷、治療藥劑等之篩選等。
亦即，本發明係關於可抑制NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、NESFATIN－1M30聚胜肽、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、NESFATIN－1M10M、NUCB1－M30、NUCB1－M16、NUCB1－M14、及NUCB1－M10M之活性或生產之物質。進而，更佳者，該物質係關於攝食亢進及/或體重增加亢進活性之物質。可抑制NESFATIN聚胜肽等之活性之物質，係包含以可結合於NESFATIN聚胜肽等者為其特徵，但未必以與該等聚胜肽結合者為必要。前者之例子，有對於NESFATIN聚胜肽等之抗體；後者之例子，有對於NESFATIN聚胜肽等之負面優勢(dominant negative)聚胜肽等。在此，所謂負面優勢，係指相對於野生型具有在量上及質上之優越性，而能阻礙野生型之功能之突變株。負面優勢，可藉由野生型之胺基酸之一部缺失或改變而製得。
再者，本發明係有關抑制NESFATIN聚胜肽、NESFATIN－1聚胜肽、NESFATIN－1M30聚胜肽、NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、NESFATIN－1M10M、NUCB1－M30、NUCB1－M16、NUCB1－M14、及NUCB1－M10M之編碼基因表現之物質。此種物質，舉例而言，例如有反意義寡核苷酸、RNAi分子等。在此所謂NESFATIN聚胜肽之編碼基因，係指含有將NESFATIN聚胜肽等之編碼核酸分子中之鹼基序列之全體或一部，作為連續性或非連續性單位之核酸分子者。再者，所謂基因之表現，係指由該基因所編碼NESFATIN聚胜肽等之編碼核酸分子被轉錄之過程，使該被轉錄之核酸分子安定化之過程，以該被轉錄之核酸分子藉由轉譯而生產NESFATIN聚胜肽等之過程。因此，所謂基因表現之抑制，係指抑制由NESFATIN聚胜肽等之編碼基因之轉錄、安定化、以及轉譯之任一者之過程。
前述反意義寡核苷酸，舉例而言，可使用NESFATIN聚胜肽之編碼基因序列，而加以設計。此種反意義寡核苷酸，例如有具有序列編號31之構造之「默霍魯諾」型反意義寡核苷酸。該反意義寡核苷酸，舉例而言，如實施例15所示，係投予至動物中，而能顯示該動物之攝食亢進或體重增加之亢進作用者。反意義寡核苷酸，為避免在細胞內被分解起見，已知有許多修飾或結合樣式，如為習於此技藝者，即可選擇適當之反意義寡核苷酸之構造(Curreck等，Europian Journal of Biochemistry，UK，2003年，270卷，第1628－486頁)。其構造，例如有天然型(D－寡)、硫代磷酸酯型(S－寡)、甲基磷酸鹽型(M－寡)、磷醯胺型(A－寡)、2’－O－甲基型D－寡、嗎啉化合物(Mo－寡)、聚醯胺核酸等。再者，一般係使用長度為10鹼基至70鹼基、較佳為使用15鹼基至30鹼基者。
RNA干擾現象(RNA interference，簡稱RNAi)，係藉由使21~23殘基之雙股RNA將含有相同序列之標的RNA加以分解，並將其表現強力地抑制之意。因此，包含具有與NESFATIN聚胜肽等之編碼基因之mRNA同一鹼基序列之雙股結構之RNA，可利用於NESFATIN聚胜肽等之基因之表現抑制上。為得到RNAi之效果，較佳係使用具有至少20個以上連續之鹼基序列之雙股結構之RNA。雙股結構，可為以相異之股所構成者，亦可以藉由1個RNA之莖－環結構而賦予一雙股者。此外，亦可以藉由在各股之3，側上使其具有2個鹼基之懸突，而增強基因之表現抑制作用。有關用於RNAi之設計上之序列及長度或結構，如為習於此技藝者，可嘗試各種改變，而找出最適當之具有最強基因表現抑制作用之RNAi者(Milhavet等，Pharmacological Review，USA，2003年，55卷，第629－648頁)。
再者，前述反意義寡核苷酸分子及RNAi分子，可藉由將由與該分子之核酸序列互補之鹼基序列所成之核酸分子重組至載體中，再將其導入宿主細胞中進行轉形，並培養轉形體而製得。所使用之宿主細胞及轉形之方法，如前述<轉形體>所記載者，只要係習於此技藝者皆可適當地加以選擇。此外，其他方法，反意義寡核苷酸分子及RNAi分子尚可藉由化學合成法來製得。
<用於食慾亢進或體重增加亢進之醫藥品>
再者，本發明係有關一種食慾亢進或體重增加亢進之醫藥品，其特徵係含有阻礙NESFATIN聚胜肽等活性或產生之物質、或者將抑制NESFATIN聚胜肽等之編碼基因之表現之物質，而作為有效成分者。該醫藥組成物，可使用在攝食或體重增加被抑制所致之疾病或症狀上。在攝食或體重增加被抑制所致之疾病或症狀，例如有厭食症、功能性胃腸症(Functional dyspepsia)、或癌症、發炎性疾病、腦下垂體、甲狀腺、副腎上腺等之功能降低，以及手術後或過度之壓力所致之攝食抑制及/或體重增加抑制狀態等。
再者，本發明之醫藥組成物，亦可含有藥學上可容許之任一種添加劑。使用藥學上可容許之添加劑之製劑，其實施上可依循「REMINGTON：THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20t h EDITION，University of the Sciences in Philadelphia著，Williams & Wilkins公司，2000年12月15日發行」所記載之方法。此種醫藥組成物之一種型態，例如可藉由溶解、懸浮、或乳化於無菌之水性液或油性液中而製作成液劑。此種溶劑，水性液例如有注射用蒸餾水、生理食鹽水等，此外尚可添加滲透壓調節劑(例如D－葡萄糖、D－山梨糖醇、D－甘露糖醇、氯化鈉等)，或者併用適當之溶解輔助劑(例如醇類(如乙醇)、聚醇類(如丙二醇、聚乙二醇)、非離子性界面活性劑(如聚蘇佩特80、聚氧基伸乙基硬化萞麻子油50)等)。再者，即使在油性液體作為溶劑使用時，該油性液體之例子有芝麻油、大豆油等，亦可併用溶解輔助劑例如苄基苯甲酸、苄基醇等。在此種液劑中，亦有適當地使用緩衝劑(如磷酸鹽類緩衝劑、醋酸鹽類緩衝劑)、無痛化劑(如毒芹氯化苄叉、鹽酸普魯卡因等)、安定劑(例如人類血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存劑(如抗壞血酸、異抗壞血酸及其等之鹽等)、著色劑(如葉綠素銅、β－胡蘿蔔素、紅色2號、藍色1號等)、防腐劑(如對羥基苯甲酸酯、苯酚、氯化苯釷等)、增黏劑(如羥基丙基纖維素、羧基甲基纖維素及其等之鹽類)、安定化劑(例如人類血清白蛋白、甘露糖醇、山梨糖醇等)、矯臭劑(如薄荷醇、柑橘香料等)等添加劑。此外，其他之醫藥組成物(用以與上述幾個「醫藥品組成物」之表現可統一起見)之型態，例如有散劑、錠劑、顆粒劑、膠囊劑、丸劑、座劑、片劑等固態劑。在以經口用製劑之型式投予之固態劑上，添加劑例如有賦形劑(如結晶性纖維素、乳糖、澱粉等)、滑潤劑(如硬脂酸鎂、滑石等)、結合劑(羥基丙基纖維素、羥基丙基甲基纖維素、聚乙二醇(macrogol)等)、崩壞劑(如澱粉、羧基甲基纖維素鈣等)等。此外，如有必要，可使用防腐劑(苄基醇、氯丁醇、對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯等)、抗氧化劑、著色劑、甜味劑等之添加劑。
進而，其他型態例如有黏膜用醫藥組成物，在此製劑中亦可基於對黏膜賦予吸著性、滯留性等之主要目的，而添加而含有以下之添加劑：黏著劑、黏著增強劑、黏稠劑、黏稠化劑等(如黏蛋白、洋菜、明膠、果膠、卡拉膠、褐藻酸鈉、洛卡斯膠、三仙膠、西黃蓍膠、阿拉伯膠、甲殼素、普魯藍多糖、蠟質澱粉、硫糖鋁、纖維素及其衍生物(例如羥基丙基甲基纖維素、聚丙三醇脂肪酸酯、丙烯酸(甲基)丙烯酸烷基共聚物或其鹽、聚丙三醇脂肪酸酯等))。然而，供給用於生體上之醫藥組成物之型態及溶劑或添加劑並不限於此範圍，只要是習於此技藝者皆可適當地加以選擇。
前述醫藥組成物，基於症狀改善之目的，可以經口或非經口而進行投予。在經口投予時，可選擇顆粒劑、散劑、錠劑、膠囊劑、液劑、糖漿劑、乳劑或懸浮劑、酏劑等劑型。在非經口投予時，例如可作為經鼻劑，而選擇液劑、懸浮劑、固態製劑等。再者，其他之非經口投予型態，可作為注射劑，注射劑可選擇皮下注射劑、靜脈注射劑、點滴注射劑、肌肉注射劑、腦室內注射劑或腹腔內注射劑等。再者，在其他之非經口投予上使用之製劑，例如有座劑、舌下劑、經皮劑、經鼻劑以外之經黏膜投予劑等。進而，亦可以動脈導管或血管內栓塞劑所含有或塗佈之態樣，而在血管內進行局部投予。
前述醫藥組成物之投予量，係依病患之年齡、性別、體重、症狀、治療效果、投予方法、處理時間、或該醫藥組成物中所含之活性成分之種類等而有不同，一般係每個成人，可以每次在0.1 mg至500 mg之範圍，較佳係在0.5 mg至20 mg之範圍內進行投予。然而，投予量因為會因各種條件而變動，且亦有可能其投予量會超過上述之範圍。
再者，進而，前述反意義寡核苷酸分子及RNAi分子等，可將重組至適當之啟動子序列之下游，而作為可帶來反意義寡核苷酸或RNAi效果之RNA表現載體並進行投予。如將此表現載體以可到達對象病患之腦內之形式而導入，並藉由這些基因之反意義寡核苷酸或RNAi效果，使抑制此等基因之表現之聚核苷酸表現，即能對於因該基因之表現水準降低所致之攝食抑制及/或體重增加抑制之狀態，而達成其治療效果。
<基因轉殖動物、肥胖、肥胖症及疾病模型動物>
本發明係關於前述NESFATIN聚胜肽等之編碼基因、或包含了含有其等之載體之基因轉殖非人類動物。詳細言之，該基因係關於全身性，較佳為在視床下部之表現強度可上升，且顯示攝食抑制狀態或體重增加抑制狀態之基因轉殖非人類動物。將前述聚胜肽之編碼基因表現程度以人為地增強之基因轉殖非人類動物，可作為顯示攝食抑制及/或體重增加抑制之模型動物而加以利用。
本發明係關於一種食慾亢進或體重增加亢進之基因轉殖非人類動物，其特徵為其被導入一種物質，該物質可抑制具有前述攝食抑制及/或體重調節抑制活性之聚胜肽活性或表現者(例如抗體、反意義寡核苷酸分子、RNAi分子等物質)。導入編碼此種物質之基因所產生之基因轉殖非人類動物，其可作為顯示攝食及體重增加有亢進情形之模型動物而加以利用。再者，該基因轉殖非人類動物，其亦可作為肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病患、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、整形性關節症等整形外科上疾病、月經異常或惡性腫瘤等疾病之模型動物。
以特定之基因為對象，得到基因轉殖動物之方法係已廣為習知者。亦即，可藉由將基因及卵混合並以磷酸鈣處理之方法；在位相差顯微鏡下，以為微小的吸管將基因直接導入前核期卵之核中之方法(微注射法，美國專利第4873191號)；以及使用胚間性細胞(ES細胞)之方法等，而得到基因轉殖動物。此外，尚有研究者開發出將基因插入逆轉錄病毒載體中，並使卵感染之方法；或者，透過精子將基因導入卵之精子載體法等。所謂精子載體法，係指將外來基因附著於精子或以電穿孔等方法取至精子細胞內後，使卵子受精，而能導入外來基因之基因重組法(Lavitranoet M等，Cell(1989)57，717－723)。
再者，在表現載體上使用之啟動子，如使用可藉由適當藥劑等物質而調整其轉錄之啟動子時，投予該物質即可基因轉殖動物中，外來性NESFATIN聚胜肽等之編碼基因或該聚胜肽，對於其活性或表現之抑制物質，調整該物質之表現水準。
進而，本發明係關於一種NESFATIN聚胜肽等之編碼基因之全區域或其一部有缺陷之基因剔除(knock out)非人類動物，且將該基因以其他基因加以取代之基因置入(knock in)動物，亦包含於本發明中。舉例而言，NESFATIN聚胜肽等之基因之基因剔除動物，其可作為攝食亢進及/或體重增加亢進之動物而使用。
進而，本發明係關於被投予前述NESFATIN聚胜肽等之非人類動物所成之攝食及/或體重增加被抑制之動物；或者，被投予可抑制該聚胜肽之活性或表現之物質之非人類動物所成之攝食及體重增加有亢進情形之模型動物。攝食及體重增加有亢進情形之非人類動物，亦可作為肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病患、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、整形性關節症等整形外科上疾病、月經異常或惡性腫瘤等疾病之模型動物而使用。
可作為本發明之模型動物而使用之動物種類，亦可利用人類以外之所有脊椎動物而加以製作。具體言之，可在老鼠、大鼠、兔子、迷你豬、山羊、綿羊、猴子、狗、貓、或牛等脊椎動物中，導入基因或投予物質而製作其模型動物。
<具有攝食抑制及/或體重增加抑制活性之聚胜肽之製造方法>
本發明係有關使用前述基因轉殖非人類動物及基因轉殖植物之該聚胜肽之製造方法，其特徵係含有可表現前述NESFATIN聚胜肽等之編碼基因之前述轉形體、或該聚胜肽之編碼基因、或含有其等之載體。
在本發明之前述聚胜肽之製造方法中，可以為了適於在轉形體或基因轉殖非人類動物上之表現、轉錄、轉譯等，而對於前述DNA序列、質體及病毒作許多之修飾或變更。舉例而言，利用遺傳密碼之同義性，透過蛋白質之密碼區域整體，即可進行核苷酸之取代。此種序列，可由NESFATIN聚胜肽等之胺基酸序列、或該聚胜肽之編碼基因之鹼基序列而推得，並依以下之傳統合成法加以組合。此種合成法，在實質上可依據Itakura等人之方法(Itakura et al,Science 198,1056,1977)及Crea等人之方法(Crea et al,Proc,Natl.Acad.Sci.USA 75,5765,1978)而進行。因此，在本發明之聚胜肽之製造方法中所使用之前述NESFATIN聚胜肽等編碼基因，並無特別限定於利用所例示之鹼基序列、質體及病毒者。
使用轉形體之前述聚胜肽之製造方法，可藉由培養該轉形體而達成。在培養中所使用之培氧基，可配合所採用之宿主細胞而適當地選擇各種常用之物質，其培養亦可適於宿主細胞之生長發育之條件下實施。
再者，前述聚胜肽，可在轉形體之細胞內、細胞外或細胞膜上進行生產。此外，使用其他NESFATIN聚胜肽等之編碼基因之聚胜肽製造方法，例如有藉由無細胞系之蛋白質進行合成之方法，其代表者則有試管內(in vitro)轉譯反應系統。在此試管內(in vitro)轉譯反應系統中，可以附加在NESFATIN聚胜肽等之編碼基因之5’上游可控制轉錄調節之序列，較佳則為附加SP6啟動子、T3啟動子、T7啟動子等，藉由在細胞內或試管中轉錄該基因，而製作NESFATIN聚胜肽之編碼RNA分子，再使用由小麥胚芽、大腸菌、網狀紅血球等製作之試管內轉錄反應用之細胞萃取物而進行。其一個例子，可依據澤崎等，蛋白質．核酸．酶，2003年，48卷，第549－554頁所記載之方法。以此種轉形體或無細胞系蛋白合成所生產之聚胜肽，可依據期望利用其物理學上性質、化學上性質等，進行各種分離操作[日本生化學會編，「生化學資料書II」第1版第1刷，株式會社東京化學同人，1980年6月23日發行，第1175~1259頁；Arakawa等，Biochemistry，USA，1986年12月16日發行25卷25號，第8274~8277頁；Langley等，Europian Journal of Biochemistry，Germany，1987年3月2日發行163卷2號，第313~321頁等參照]，即能分離、純化。該方法，具體而言，例如有以一般的再構成處理、蛋白質沉澱劑進行處理(鹽析法)、離心分離、滲透壓衝擊法、超音波破碎法、限外過濾法、凝膠過濾法、吸附色層分析法、離子交換色層分析法、親和性色層分析法、高速液體色層分析法(HPLC)等各種液體色層分析法、透析法、以及此等之組合等。為利用與前述聚胜肽之親和性以進行純化，例如可使用與前述聚胜肽會結合之抗體，並藉由與該聚胜肽與該抗體之脫離而進行。
再者，在本發明之前述聚胜肽之製造方法中，亦可以使在該聚胜肽上融合有親和性端點(affinity tag)之蛋白質於轉形體或基因轉殖非人類動物產生，藉由分離、純化該親和性端點融合蛋白質而進行。該親和性端點融合蛋白質如可表現時，就可以利用該端點而進行親和性純化。該親和性端點，例如有谷胱甘太－S－轉化酶(GST)、組胺酸端點(His tag，Sisk等，Journal of Virology，USA，1994年2月發行，68卷2號，第766~775頁)、及FLAG端點(Hopp等，Biotechnology，1988年發行，6卷，第1204頁~1210頁)。
在前述聚胜肽上融合有GST之GST融合蛋白質，可藉由使用谷胱甘太固定化載體，並使用GST與該谷胱甘太結合載體之吸附、脫離反應進行純化，其後，再藉由由GST融合蛋白質將GST部分切斷進行純化，即可製造前述聚胜肽。
組胺酸端點融合蛋白質，可藉由使用金屬離子鉗合載體，並使用組胺酸端點與該金屬離子鉗合載體之吸附、脫離反應進行純化，其後，再藉由由組胺酸端點融合蛋白質將組胺酸端點部分切斷進行純化，即可製造前述聚胜肽。
FLAG端點融合蛋白質，可藉由使用抗FLAG端點之結合載體，並使用FLAG端點與該金屬離子鉗合載體之吸附、脫離反應進行純化，其後，再藉由由FLAG端點融合蛋白質將FLAG端點部分切斷進行純化，即可製造前述聚胜肽。
NESFATIN－1聚胜肽，可將以前述之方法取得之NESFATIN聚胜肽，以蛋白質轉化酶等蛋白質分解酵素加以處理，將其分解物以逆相色層分析法進行分劃，再以質量分析等確認NESFATIN－1聚胜肽所含有之劃分，再回收即可製得。NESFATIN－1修飾體，亦可相同地加以製作。
如此所製得之本發明之NESFATIN聚胜肽等，亦可於轉譯後修飾其N末端，本發明中亦包含此種經修飾之聚胜肽分子。舉例而言，N末端被改變為焦麩醯胺酸之聚胜肽，其可藉由將前述之本發明之NESFATIN聚胜肽等，使其N末端成為麩醯胺酸殘基再使其表現，然後將所得到之聚胜肽以5~10%醋酸溶液等酸性條件加以處理即可製得(Park等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，USA，1991年3月發行，第22046~2050頁)。再者，N末端被乙醯化之胜肽，可將本發明之NESFATIN聚胜肽等，使成為在N末端具有α胺基之任意胺基酸殘基再使其表現，然後以Sulfo－NHS－Acetate或無水醋酸加以處理即可製得。將此種聚胜肽在轉譯後修飾N末端之方法，在該技術領域上已經廣被知悉。此外，其他之NESFATIN聚胜肽等，亦可以螢光物質等化合物加以處理而修飾(Hermanson等，Bioconjugate techniques，USA，Academic Press，1996年發行)。
亦可使用基因轉殖非人類動物來進行前述NESFATIN聚胜肽等之製造。其方法，例如有由包含前述NESFATIN聚胜肽等之編碼基因或含有其等之載體之基因轉殖非人類動物進行採取，即由器官、組織、血液、乳汁等或將其等進行細切、磨碎、分劃之加工物等，分離掉固態成分之液體成分；或使用水性溶劑或有機溶劑所萃取之液體成分，即可將包含有標的之胜肽之劃分進行回收。標的之聚胜肽，可由該劃分，而藉由利用上述物理學性質、化學上性質等各種分離操作加以分離、純化。
再者，使用基因轉殖植物亦可實施前述NESFATIN聚胜肽等之製造方法。該方法，舉例而言，可藉由參照特開2003－116385號「含有日本腦炎疫苗之編碼基因之基因轉殖植物」之公報等而實施。此外，基因轉殖植物之製作方法，可參照特開2002－17186號公報等之「基因轉殖植物」而進行製作。此種基因轉殖植物之葉、莖、根、果實、果皮、芽、種子及花瓣等組織或由其等之組織衍生之傷癒組織等，或視情形由該組織被細切、剝皮、磨碎、壓縮之加工物等，標的之聚胜肽便可藉由使用水性溶劑或有機溶劑之萃取液回收，或者藉由壓榨所採取之榨取汁液回收，或者在油中進行回收。進而，可將該聚胜肽，藉由利用上述物理學性質、化學上性質等各種分離操作加以分離、純化。
本發明之前述聚胜肽，亦可以化學合成之方式合成而取得。此時，可藉由利用固相合成法或液相合成法等一般使用之胜肽合成法。在胜肽合成上之縮合法或胺基酸殘基之保護、及合成後之保護基之脫離方面，可利用習知之方法(泉谷等，胜肽合成之基礎與實驗，丸善株式會社，1975年發行；矢島等－日本生化學會編，生化學實驗講座1，蛋白質之化學IV，東京化學同人株式會社，1977年發行)。再者，可將聚胜肽之胜肽序列全體一次地加以合成，或者，亦可使用將該蛋白質之部分胜肽各自地合成，再將其部分胜肽加以縮合之方法(日本生化學會編，新生化學實驗講座，蛋白質IV，合成及表現，東京化學同人株式會社，1991年發行)。
在胜肽合成上所使用之胺基酸之α胺，一般係以tBoc基或Fmoc基加以保護，惟在最後所得到之聚胜肽，可以此等保護基繼續保護，或作成脫保護之型式。再者，如有需要，亦可將該胜肽之脫保護胺基酸末端以酵素性或化學性地，藉由焦程醯胺酸、乙醯基、甲醯基或螢光物質等作成修飾之型式(Hermanson等，Bioconjugate techniques，USA，1996年發行，Academic Press)。具體例子，有在前述本發明之聚胜肽之N末端上以具有麩胺酸之型式加以合成，將該胜肽以5至10%醋酸溶液等稀酸處理使發生環化，而改變成焦麩醯胺酸(Park等，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，USA，1991年3月發行，第22046~2050頁)。
再者，如有必要，亦可以在合成後之聚胜肽之C末端上附加醯胺基或螢光物質等型式，而製作成合成胜肽。舉例而言，為了得到以固相合成法在C末端導入醯胺基之合成胜肽起見，在由固相載體(樹脂)進行切斷反應時，可使用該C末端被醯胺化形式之市售樹脂以進行。再者，在C末端進行螢光物質等之修飾之方法，可以習知之方法進行(Hermanson等，Bioconjugate techniques，USA，1996年發行，Academic Press)。
<用以預測或診斷攝食調節及/或體重調節之狀態之檢測方法>
本發明係有關哺乳類動物之攝食調節及/或體重調節方面，其相關疾病之判定、疾病嚴重程度、病態進行之監控、預測、預後或前述醫藥品組成物之投與判斷等之診斷之方法。亦即，本發明係關於一種用以預測或診斷攝食調節及/或體重調節之狀態之檢測方法，其特徵係使用受測哺乳類動物所衍生之樣品，將該樣品中所含之NESFATIN之編碼核酸分子(序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、116~124之任一者所示鹼基序列之核酸分子)、或NESFATIN聚胜肽等(含有序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115之任一者所示胺基酸序列之聚胜肽)之含量，與正常個體所衍生之樣品加以比較而進行。再者，所謂正常個體，係指正常或未經處理之個體之意。
詳細言之，本發明關於一種用以預測或診斷攝食調節及/或體重調節之狀態之檢測方法，其特徵係包含將受測哺乳類動物之生體所衍生之樣品中，含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、116~124之任一者所示鹼基序列之核酸分子含量，與正常個體之生體樣品進行比較，並檢測該基因之表現之降低狀態或亢進狀態之步驟者。
可使用之生體樣品，例如有血液、尿、腦脊髓液、唾液、以活組織檢測法所採取之腦組織等，其中特別以血液為最佳。可作為樣品使用之血液，例如有全血、或由全血所得到之血漿或血清。這些生體樣品之採取方法係習知者。此外，這些生體樣品之溶解產物等調製物亦可作為樣品而使用。或者，如由調製物將mRNA加以萃取時，其可作為用以測定前述核酸分子之對應mRNA之樣品。為萃取生體樣品之溶解產物或mRNA時，使用市售之套組將十分便利。或者，在血液、腦脊髓液等液狀之生體樣品中，可根據需要以緩衝液等加以稀釋，作為蛋白質或基因之測定上之樣品。
哺乳類動物之生體樣品中，含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、116~124之任一者所示鹼基序列之核酸分子含量，可將含有該核酸分子之鹼基序列之核苷酸、或與其互補鏈互補之鹼基序列所成之至少18個鹼基長度之寡核苷酸，作為PCR引子、探針使用而加以測定。此時，如為習於此技藝者，可使用各種電腦程式，而設計出適合用途之引子及探針。此種多核苷酸或寡核苷酸，可配合分析實驗形式而結合適當之標識，或預先固定於適當之支持體上。此種PC引子及探針，可以重組地、合成性地加以製造，或者以習於此技藝者所可利用之任意方法加以製造。舉例而言，在本發明中可使用之PCR引子，例如有序列編號22(前置引子)及序列編號23(反置引子)等，惟並不限於此範圍。再者，本發明中所可使用之探針，舉例而言，可使用前述引子，將序列編號21之DNA序列作為模板，而藉由將增幅之斷片進行標識化所製得者(實施例2參照)，惟並不限於此範圍。
含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之核酸分子，其表現程度之測定值，可依據習知之方法加以補正。藉由補正，即可以在受測之生體樣品及正常個體之生體樣品間，就該含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之核酸分子，比較其表現程度。測定值之補正，可在生體樣品之各細胞間，就表現程度大且無變動之基因(例如管家基因)，基於其表現程度之測定值而進行。表現程度大且無變動之基因，其例子如β－肌動蛋白、GAPDH等。
如使用mRNA而就序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之核酸分子，測定其表現程度時，可以適當地配合其診斷方法之格式加以實施。舉例而言，如使用由生體組織所萃取之mRNA時，可選擇RT－PCR法、北方墨漬法等；如使用組織標本時，可選擇原位雜合反應法等。例如在實施例8中，藉由絕食而使之食慾亢進之大鼠中，NESFATIN基因表現被抑制，而藉由攝食則在食慾被抑制之狀態下其NESFATIN基因表現即亢進者，已揭示於原位雜合反應法所示之實例中。
含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之基因，其表現量可與由正常個體所衍生之生體樣品加以比較，如檢測出該基因表現有降低狀態時，即可預測或診斷其有攝食亢進或體重增加之狀態，進而，可預測或診斷選自肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病患、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、整形外科性疾病、月經異常及惡性腫瘤之疾病病患。另一方面，該基因之表現如被檢測出有亢進狀態時，受測之哺乳類動物即可預測或診斷係處在攝食抑制狀態或體重增加抑制之狀態，進而，有厭食症、功能性胃腸症(Functional dyspepsia)、或癌症、發炎性疾病、腦下垂體、甲狀腺、副腎上腺等功能降低、手術後或過度之壓力等所導致之攝食抑制及/或體重增加抑制狀態。
進而，本發明關於一種預測或診斷攝食調節及/或體重調節之狀態之方法，其特徵係包含將哺乳類動物之生體樣品中，NESFATIN聚胜肽等(含有序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115之任一者所示胺基酸序列之聚胜肽)之含量，與正常個體之生體樣品加以比較而進行，並檢測該基因含量之降低狀態或上升狀態之步驟者。該方法，可藉由測定NESFATIN聚胜肽等而進行。
可使用之生體樣品，例如有血液、尿、腦脊髓液、唾液、以活組織檢測法所採取之腦組織等，其中特別以血液為最佳。可作為樣品使用之血液，例如有全血、或由全血所得到之血漿或血清。這些生體樣品之採取方法係習知者。此外，這些生體樣品之溶解產物等調製物亦可作為樣品而使用。在製作生體樣品之溶解產物上，如使用市售之套組將十分便利。或者，在血液、腦脊髓液等液狀之生體樣品中，可根據需要以緩衝液等加以稀釋，作為蛋白質之測定上之樣品。
NESFATIN聚胜肽等之測定，可使用該聚胜肽之免疫學上測定法，在該免疫學上之測定中，可使用與NESFATIN聚胜肽等結合之抗體。此種抗體例如有前述之抗體，具體而言，可將實施例3及實施例10所取得之NESFATIN聚胜肽衍生之胜肽，進行免疫反應而取得抗體；或者，將NESFATIN－1聚胜肽或NESFATIN－1M30聚胜肽衍生之胜肽，進行免疫反應而取得抗體。此外，並不限於這些抗體，只要是對於NESFATIN聚胜肽等之多株抗體或單株抗體者，並無限定皆可使用。
再者，在本發明之方法所使用之抗體，可配合分析實驗形式而結合適當之標識。或者，該抗體亦可配合分析實驗形式而預先固定於適當之支持體上。
免疫學上之測定法，可以適當地配合其診斷方法之格式加以實施。舉例而言，如使用血液樣品或生體組織之溶解產物等時，可選擇ELISA法、RIA法、西方墨漬法等，再者，如使用組織標本時，可選擇免疫組織化學性方法等。更具體之例子，有實施例所示之西方墨漬法、實施例4及11所示之免疫組織化學性方法等，惟亦可使用其他抗體並構築適當之NESFATIN聚胜肽等之測定系統。舉例而言，在實施例3中係西方墨漬法之例子，實施例4及9中係免疫組織化學性方法之例子，實施例21則係ELISA(競合EIA)之例子。
受測樣品之NESFATIN聚胜肽等含量，如與正常個體之生體樣品加以比較，並檢測出該聚胜肽之含量為降低狀態時，即可預測其係攝食亢進或體重增加亢進之狀態，進而，並可預測或診斷有選自肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病患、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、整形外科性疾病、月經異常及惡性腫瘤之疾病病患。另一方面，如檢測出該聚胜肽之含量為上升狀態時，即可預測或診斷其係攝食抑制或體重增加抑制之狀態，進而，並可預測或診斷有厭食症、功能性胃腸症(Functional dyspepsia)、或癌症、發炎性疾病、腦下垂體、甲狀腺、副腎上腺等功能降低、手術後或過度之壓力等所導致之攝食抑制及/或體重增加抑制病態。
<用以預測或診斷攝食調節及/或體重調節之狀態之檢測方法用之套組>
本發明亦關於用以預測或診斷前述之攝食調節及/或體重調節之狀態之檢測方法用之套組。此種套組，例如有用以檢測NESFATIN等之編碼基因(含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之基因)表現量之套組；或用以檢測NESFATIN聚胜肽等(含有序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115之任一者所示胺基酸序列之聚胜肽)之含量之套組等。
NESFATIN等之編碼基因表現量之套組中，係至少含有一種用以檢測該基因之PCR引子、探針或DNA晶片。
所謂包含於本發明之套組之PCR引子，係指與NESFATIN等之編碼基因之鹼基序列、或其互補鏈互補之鹼基序列所成之至少18個鹼基長度之寡核苷酸，只要係習於此技藝者，皆可基於本說明書所載之NESFATIN等之編碼基因之鹼基序列，而適當地加以調製。舉例而言，本發明之套組中所含之PCR引子，例如有序列編號22(前置引子)及序列編號23(反置引子)等，惟並不限於此範圍。再者，本發明之套組中所含之探針，例如可使用前述引子，以序列編號21之DNA序列作為模板，將增幅之斷片加以標識化而製得者，惟並不限於此範圍。所謂包含於本發明之套組之DNA晶片，可將前述探針固定於玻璃等基盤上而製作。
此外，本發明之套組中，其附加性要件上，亦可含有用以稀釋試劑或生體樣品之緩衝液、陽性對照組、陰性對照組、用以測定標識之基質、反應容器、記載分析手冊之指示書等。這些要件亦可根據需要而事先地加以混合。再者，如有需要，可在各要件上添加保存劑或防腐劑。
NESFATIN聚胜肽之含量測定套組中，應含有認識該聚胜肽之抗體、標準胜肽或結合競合反應用胜肽修飾體之至少之一者。
本發明之套組中所含之抗體，只要係與前述之方法上所使用之抗體相同，可認識NESFATIN聚胜肽等之抗體即可，並無特別之限制。
所謂本發明之套組中所含之標準胜肽，係指與NESFATIN聚胜肽等在量上具有依存性之結合力，而能作為標準檢量曲線之作成上用途者。此種標準聚胜肽，例如有NESFATIN聚胜肽等，該聚胜肽所認識之聚胜肽。
所謂本發明之套組中所含之結合競合反應用胜肽修飾體，係指以前述抗體所可認識之胜肽，並與作為測定對象之生體樣品中之NESFATIN聚胜肽等及該抗體之結合，具有拮抗作用之胜肽。再者，該結合競合反應用胜肽修飾體，一般可適當地加以標識而使用。
含有此等之本發明之套組，舉例而言，可藉由(1)在前述結合競合反應用胜肽修飾體之存在下，由標準胜肽與前述抗體而作成標準檢量曲線；(2)在生體樣品中，在前述結合競合反應用胜肽修飾體之存在下，添加前述抗體；(3)以標準檢量曲線測定結合競合反應用胜肽修飾體與抗體之結合量者，而測定在生體樣品中所含之NESFATIN聚胜肽等之含量。
再者，亦可使用可認識彼此不會阻礙其結合之二種類NESFATIN聚胜肽等之抗體，並測定該聚胜肽之含量。此時，一般係將第一抗體固定於固相上，第二抗體則適當地加以標識而使用。
含有此等之本發明之套組，舉例而言，可藉由(1)在固定化之第一抗體上添加標準胜肽並反應後，進而藉由添加經標識之第二抗體，而作成標準檢量曲線；(2)在同樣地固定化之第一抗體中，添加生體樣品並反應後，再添加經標識之第二抗體；(3)以標準檢量曲線測定以生體樣品進行反應之第二抗體結合量者，而測定在生體樣品中所含之NESFATIN聚胜肽等之含量。
此外，本發明之套組中，其附加性要件上，亦可含有用以稀釋試劑或生體樣品之緩衝液、陽性對照組、陰性對照組、用以測定標識之基質、反應容器、記載分析手冊之指示書等。這些要件亦可根據需要而事先地加以混合。再者，如有需要，可在各要件上添加保存劑或防腐劑。
<具治療潛力之化合物之篩選方法>
本發明係關於一種具有攝食調節及/或體重調節之效果，且具有關於攝食調節及/或體重調節之疾病或症狀之治療或預防潛力之化合物篩選方法。
亦即，本發明係關於一種具有攝食抑制及/或體重增加抑制效果之治療劑或預防劑之篩選方法，其特徵係包含使受測物質接觸於哺乳類細胞之步驟；以及檢測該細胞中，NESFATIN等之編碼基因(含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之基因)表現之誘導，或者檢測該細胞內所含或細胞外所分泌之NESFATIN聚胜肽等(含有序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115之任一者所示胺基酸序列之聚胜肽)量之增加之步驟者。在肥胖、糖尿病、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟疾病、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、整形外科性疾病、月經異常、惡性腫瘤中，顯示攝食之抑制或體重增加之抑制有其必要。藉由前述之篩選方法，即可製得對於該疾病之治療劑或預防劑。
本發明係關於一種具有攝食亢進及/或體重增加亢進效果之治療劑或預防劑之篩選方法，其特徵係包含使受測物質接觸於哺乳類細胞之步驟；以及檢測該細胞中，NESFATIN等之編碼基因之表現抑制，或者檢測該細胞內所含或細胞外所分泌之NESFATIN聚胜肽等量之減少之步驟者。在厭食症、功能性胃腸症(Functional dyspepsia)、或癌症、發炎性疾病、腦下垂體、甲狀腺、副腎上腺等功能降低、手術後或過度之壓力等所導致之攝食抑制及/或體重增加抑制狀態中，顯示攝食之亢進或體重增加之亢進有其必要。藉由前述之篩選方法，即可製得對於該疾病之治療劑或預防劑。
所謂可將該聚胜肽或其之編碼基因之表現程度，使之上升或降低之化合物，係指相對於基因之轉錄、安定化或轉譯、或蛋白質之分泌、活性表現或安定化之任一者之步驟，可發揮促進地或抑制地作用之化合物。所謂可使本發明中之基因表現程度降低之化合物，係指相對於這些步驟之任一者為具有阻礙作用之化合物。
本發明之攝食調節及/或體重調節之相關疾病或症狀之具治療潛力之化合物之篩選方法，其可以生體中或亦可以試管中而進行。此種篩選，例如在生體中，可依以下之步驟來實施。
(1)在受測動物中，投予具治療潛力之化合物之步驟。
(2)測定前述受測動物之生體樣品中，NESFATIN聚胜肽等、或該聚胜肽之編碼基因之表現強度之步驟。
(3)與未投予具治療潛力之化合物之對照組相比較，從可使NESFATIN聚胜肽等、或該聚胜肽之編碼基因之表現強度提昇之化合物或降低之化合物，加以選擇之步驟。
可使NESFATIN聚胜肽等產生亢進，或可使該聚胜肽之編碼基因之表現強度上升之化合物，即成為攝食及/或體重增加抑制之治療藥劑之候補物質。具有該活性之物質，例如有PPARγ增敏劑等，惟並不限定於此範圍。另一方面，可使NESFATIN聚胜肽等產生抑制，或可使該聚胜肽之編碼基因之表現強度降低之化合物，即成為攝食及/或體重增加亢進之治療藥劑之候補物質。具有此種活性之物質，例如有與NESFATIN聚胜肽等結合之抗體、對於該聚胜肽之編碼基因之反意義寡核苷酸、PPAR γ增敏劑等，惟並不限於限於此範圍。
在本發明之篩選方法中所使用之受測動物，例如可使用正常動物，惟亦可使用適當之攝食調節及/或體重調節相關疾病之病態模型動物等。此種病態模型動物之例子，有Agouti－黃老鼠(C57BL/6J－Ay/a)肥胖模型老鼠或Zucker fa/fa肥胖大鼠等，再者，亦可使用本發明之基因轉殖動物、或被投予可抑制NESFATIN聚胜肽等或該聚胜肽之編碼基因之活性或表現之物質之模型動物等。
有關測定NESFATIN聚胜肽等、或該聚胜肽之編碼基因之表現強度，可依據免疫學上測定法或進行mRNA等測定而實施。在免疫學上測定法中，可藉由適當配合其測定目的或生體樣品之格式而實施。舉例而言，如生體樣品係使用血液樣品或生體組織之溶解產物等時，可選擇ELISA法、RIA法、西方墨漬法等，再者，如使用組織標本時，可選擇免疫組織化學性方法等。如測定mRNA時，可藉由適當配合其測定目的或生體樣品之格式而實施。如使用由生體組織所萃取之mRNA時，可選擇RT－PCR法、北方墨漬法等。如使用組織標本時，則可選擇原位雜合反應法等。
試管中(in vitro)進行篩選之例子，可依據下述步驟來實施。
(1)在哺乳動物衍生之細胞或組織中，使具治療潛力之化合物與其接觸之步驟。
(2)測定前述細胞或組織之樣品中，NESFATIN聚胜肽等、或該聚胜肽之編碼基因之表現強度之步驟。
(3)與未使其接觸具治療潛力之化合物之對照組相比較，從可使NESFATIN聚胜肽等、或該聚胜肽之編碼基因之表現強度提昇之化合物或降低之化合物，加以選擇之步驟。
此時，可使NESFATIN聚胜肽等產生亢進，或可使該聚胜肽之編碼基因之表現強度上升之化合物，即成為攝食及/或體重增加抑制之治療藥劑之候補物質。具有此種活性之物質，例如有PPAR γ增敏劑等，惟並不限定於此範圍。再者，可使NESFATIN聚胜肽等產生抑制，或可使該聚胜肽之編碼基因之表現強度降低之化合物，即成為攝食及/或體重增加亢進之治療藥劑之候補物質。具有此種活性之物質，例如有與NESFATIN聚胜肽等結合之抗體、對於該聚胜肽之編碼基因之反意義寡核苷酸、PPAR γ增敏劑等，惟並不限於限於此範圍。
在本發明之篩選方法中所使用之受測細胞，如為動物衍生之細胞時，例如有由適當動物分離之細胞，或所樹立之細胞株等。其例子有肺非小細胞癌細胞株、脂肪細胞、腦或神經衍生細胞、或細胞株等。再者，由動物衍生之組織可使用由適當動物所取出之器官或組織者，惟其例子可以使用含有視床下部之形式之腦組織切片等而實施。
關於測定NESFATIN聚胜肽等、或該聚胜肽之編碼基因之表現強度，可藉由免疫學測定法或mRNA等測定而進行。在免疫學上測定法中，可藉由適當配合其測定目的或生體樣品之格式而實施。舉例而言，樣品如係由動物衍生之細胞時，可使用流式細胞技術法或細胞免疫染色等。如係使用由樣品而來之溶解產物等調製物時，其免疫學上測定法可選擇ELISA法、RIA法、西方墨漬法等。如測定mRNA時，可藉由適當配合其測定目的或生體樣品之格式而實施，舉例而言，如就動物衍生之細胞或組織樣品欲仍舊保持其型態時，可選擇原位雜合反應法等。如使用由該樣品所萃取之mRNA時，可選擇RT－PCR法、北方墨漬法等。
再者，本發明中揭示PPAR γ增敏劑可使NESFATIN聚胜肽等及其編碼基因之表現上升。因此，在上述步驟之「在哺乳動物衍生之細胞或組織中，使具治療潛力之化合物與其接觸之步驟」中，可藉由將噻唑烷二酮等PPAR γ增敏劑，與具治療潛力之化合物同時地互相接觸，或者在該時點之前後與樣品接觸，就可以篩選出可抑制表現有上升之NESFATIN聚胜肽等、或其等之編碼基因之表現之化合物，亦可篩選出該聚胜肽或其編碼基因之表現不經由PPAR γ增敏劑之機制而可使表現上升之化合物。
再者，亦可以藉由測定NESFATIN聚胜肽等在作用於細胞時所產生之細胞反應而篩選出化合物。此種篩選之例子如有包含下述步驟者。
(1)在哺乳動物衍生之細胞或組織中，使具治療潛力之化合物與其接觸之步驟。
(2)在前述細胞或組織之樣品中，與NESFATIN聚胜肽等接觸之步驟。
(3)與未使其接觸具治療潛力之化合物之對照組相比較，測定其細胞反應性之有無或強度之步驟。
此時，可使NESFATIN聚胜肽等導致之細胞反應強度上升之化合物，即成為可抑制攝食及/或體重增加之治療藥劑之候補物質。再者，可使NESFATIN聚胜肽等導致之細胞反應強度降低之化合物，則成為可亢進攝食及/或體重增加之治療藥劑之候補物質。具有如後者之活性之物質，例如有可與NESFATIN聚胜肽等結合之抗體，惟並不限於此範圍。
受測細胞，如為動物衍生之細胞者，例如有由適當動物分離之細胞，或所樹立之細胞株等。其例子有肺非小細胞癌細胞株、脂肪細胞、及腦或神經衍生細胞、或細胞株等。再者，由動物衍生之組織可使用由適當動物所取出之器官或組織者，惟其例子可以使用含有視床下部之形式之腦組織切片等而實施。
所謂前述細胞中之反應，係指NESFATIN聚胜肽等作用於細胞所引起之物理性、化學性變化，例如細胞之型態、膜電位、細胞之增殖、細胞內鈣濃度、遊走反應、細胞內二次信使分子(cAMP、cGMP等)濃度等之變化等。
進而，本發明之篩選方法中，係可取得在NESFATIN基因之基因組上，控制該基因表現之轉錄調節區域，並利用一利用轉錄調節區域之核酸分子之報導子分析系統。所謂報導子分析系統，係指以在轉錄調節區域之下游所配置之報導子基因之表現量作為指標，而篩選可作用於該轉錄調節區域之之轉錄調節因子之篩選分析系統。
此種篩選之例子，例如有含有以下之(1)~(3)之步驟者。
(1)將在NESFATIN聚胜肽之編碼基因之轉錄調節區域及該轉錄調節區域之控制下，含有報導子基因之載體導入於細胞中，再將該細胞與具治療潛力之化合物接觸之步驟。
(2)測定前述報導子基因之活性之步驟。
(3)與未使其接觸具治療潛力之化合物之對照組相比較，選擇可使前述報導子基因之表現程度降低之化合物或上升之化合物。
此時，使報導子基因之表現強度上升之化合物，即成為可抑制攝食及/或體重增加之治療藥劑之候補物質。具有該活性之物質，例如有PPAR γ增敏劑等，惟並不限定於此範圍。再者，可使報導子基因之表現強度降低之化合物，即成為可亢進攝食及/或體重增加之治療藥劑之候補物質。具有此種活性之物質，例如有與NESFATIN聚胜肽等結合之抗體、對於該聚胜肽之編碼基因之反意義寡核苷酸、PPAR γ增敏劑等，惟並不限於限於此範圍。
轉錄調節區域，例如有啟動子、促進子、在一般啟動子區域可見到之CAAT盒、或TATA盒等。報導子基因，可利用CAT(chloramphenicol acetyltransferase)基因、蟲螢光酵素(luciferase)基因、成長激素基因等。
可導入報導子基因載體之細胞，例如有由動物分離或樹立之細胞株、或酵母等之非動物細胞等。
導入於報導子基因載體之宿主之方法，例如有生物學上方法、物理學上方法、化學上方法等。生物學上方法，例如有使用病毒載體之方法、利用專一性受體之方法、細胞融合法(HVJ(仙台病毒))、聚乙二醇(PEG)、電細胞融合法、微小核融合法(染色體移入)等。物理性方法，例如有顯微注射法、電穿孔法、基因槍法(gene gun)等。化學性方法，例如有磷酸鈣沉澱法、脂質體法、DEAE葡聚糖法、原生質體法、紅血球形骸細胞法、紅血球膜形骸細胞法、微膠囊法等。
前述之本發明之各種篩選方法中，聚核苷酸、抗體、細胞株、或模型動物，可預先作成套組。在此種套組中，其附加性要件，亦可含有標識檢測上使用之基質化合物、用於細胞培養之培氧基或容器、陽性或陰性之標準樣品、或記載有套組使用方法之指示書等。這些要件亦可根據需要而事先地加以混合，如有需要，可在各要件上添加保存劑或防腐劑。
以下，茲以實施例詳細地說明本發明，惟本發明並不限於這些實施例。再者，在以下之實施例中，各操作除非有明示者，否則即依「Molecular Cloning」(Sambrook，J.,Fritsch,E.F.及Maniatis,T.著，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989年刊印)所記載之方法，或者，如使用市售之試劑或套組時則依市售品之指示書進行。在使用動物之實驗中，除非特別明示，否則動物(雄大鼠)係在上午6點至下午6點間之12小時進行照明，並以下午6點至隔日上午6點間之12小時保持黑暗之週期下，作為照明條件，並以22℃之條件進行飼育，該實驗則在得到群馬大學動物實驗設施之許可後進行。
實施例 實施例1 以PPARγ增敏劑刺激所衍生之基因之選殖
為了自可藉由PPARγ調節表現之基因中，鑑定出可作用於攝食及/或體重調節之基因起見，在以PPARγ增敏劑刺激SQ－5細胞(主要是人類肺癌細胞所衍生者)時，選殖該可被專一性地誘導之基因，進而由其中選定可能作為分泌性因子而發生作用之基因。
關於藉由PPARγ而使肺非小細胞癌可被專一性地誘導表現之基因取得方法，係記載於該文獻(佐藤等，Oncogene，England，2002年，21卷，第2171~2180頁)之方法。茲將該方法簡單地記載如下，將SQ－5(理研生物資源中心RBC0110)以PPARγ增敏劑之一者之噻唑烷二酮(三共株式會社)10－ 4 M在48小時刺激下所培養者，以及未以噻唑烷二酮刺激之SQ－5細胞，分別調製成聚(A)＋RNA(mRNA)並以逆轉錄反應調製成雙股DNA。使用所得到之雙股DNA並以噻唑烷二酮刺激細胞，並由該細胞調製cDNA(實驗方)後，再使用以未經刺激之細胞所表現之細胞cDNA(驅動方)將共同表現之基因扣除，而實施基因刪減(subtraction)法。基因刪減法，係使用將實驗方及驅動方之cDNA以限制酵素RsaI切斷之片段，再藉由CLONTECH公司PCR－based cloning套組，依據所添附之操作手冊而進行。在刪減之反應中所殘留之cDNA，使用TAE緩衝液(40mM Tris－Acetate，1mM EDTA)在1%瓊脂凝膠中進行電泳，其後回收其cDNA相當於0.5~2.0 kb長度之物質，使用pGEM( R ) －T Easy Vector System I(普羅美佳公司Cat.No.A1360)，根據所添附之操作手冊，與pGEM( R ) －T Easy載體進行結合反應。將經結合反應之載體導入大腸菌DH5 α株中，在由含有50μg/ml安比西林之LB培養基所製作之洋菜培養基上，使其形成菌落，並採取所得到之菌落後，得到含有可藉噻唑烷二酮刺激而專一性其表現被誘導之基因之cDNA的選殖株。
各選殖株之鑑定，係以對於所選殖之cDNA的鹼基序列進行解析。將所得到之各選殖株之大腸菌以含有50μg/ml安比西林之LB培養基10 ml培養一夜，由該菌體使用QIAGEN公司QIAprep( R ) Spin Miniprep套組並依據添附之操作手冊調製質體。
就所得到之各選殖株之質體，使用T7引子(普羅美佳公司Cat.No.Q5021)及應用生物系統公司之BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction套組(Cat.No.4303149)，依據添附之操作手冊，製作鹼基序列解析用反應物，並使用ABI377型DNA定序儀(Perkin－Elmer公司)，進行鹼基序列之解析。
將各該選殖株cDNA之鹼基序列作為查詢(Query)標的，並與EMBL及Genbank之核酸序列資料庫上之序列進行BLAST法，而就全長之cDNA序列為已知者而取得其序列。
藉由上述步驟，可得到全長之cDNA序列者，為選擇分泌性因子起見，以Signal P軟體加以解析，而解析該具有訊息胜肽之蛋白質編碼cDNA。
<結果>
使用由以噻唑烷二酮刺激之SQ－5細胞所取得之cDNA，並藉未經噻唑烷二酮刺激之SQ－5細胞之cDNA進行刪減反應，所得到之選殖株為596株。在其等之內，與EMBL及Genbank之核酸序列中之登錄序列，被認係具有顯著相同性者為213株。進而藉由訊息胜肽之解析，顯示在9個選殖株中具有訊息胜肽序列。該9個選殖株中之1個，係功能尚未經鑑定之人類NEFA基因(序列編號1)。
實施例2 在以PPAR γ增敏劑刺激所得之培養細胞株中之NEFA基因之表現誘導
為確認以噻唑烷二酮所得之NEFA基因之誘導，使用會表現PPAR γ之細胞株HTB185及SQ5、以及脂肪細胞株3T3－L1，並就以北方墨漬法所得之NEFA基因進行表現解析。
將SQ－5(理研生物資源中心RBC0110)，在含有10%牛胎兒血清(Invitrogen－GIBCO公司)之RPMI1640培養基(Invitrogen－BRL公司Cat.No.11875－085)中，進行隔代培養。以人類腦髓芽細胞腫株HTB185細胞(D283 Med：ATCC HTB185)、以及以胰島素．dexamethasone．IBMX進行分化誘導之老鼠胎兒纖維芽細胞株(前驅脂肪細胞株)3T3－L1細胞(ATCC CL－173)，則在含有10%牛胎兒血清之DMEM培養基(Invitrogen－GIBCO公司Cat.No.11995－040)中，進行隔代培養。各自將懸浮在10ml培養液中之各細胞106 細胞，旋繞纏附至直徑10cm之薄織物上，細胞附著於基質之後，僅添加DMSO(控制組)或另外再添加噻唑烷二酮(三共株式會社)至培養基中，至其濃度成為10－ 4 M、10－ 4 . 5 M、或10－ 5 M，並以24小時或48小時、37℃，在5% CO2 之條件下進行培養。就各實驗群各以5張薄織物處理之細胞，在所定之時間後由基質剝離並收集，而使用ISOGEN(日本基因公司Cat.No.317－02503)依據其操作手冊所記載之方法將全部RNA進行萃取、回收。
用於檢測NEFA基因之探針之製作，可使用序列編號21所記載之565 bp長度之DNA斷片，再藉由使用SP6聚合酶之試管內(in vitro)轉錄進行標識化而製作。首先，將藉由老鼠腦cDNA基因庫(Invitrogen公司Cat.No.10655－25)所萃取之質體作為模板，再將以下所記載之引子使用0.2μM之濃度，以變性94℃ 1.5分鐘、煉合58℃ 1分鐘、增幅72℃ 2分鐘之反應循環，進行35循環，而製作增幅DNA(使用寶生技公司Takara Ex TaqT M 聚合酶Cat.No.RR001A 2.5U)。
NEFA探針製作PCR用引子：前置引子：5－CCAGTGGAAAATGCAAGGAT－3(序列編號22)反置引子：5－TCTTTGCTTCCGGGATGATTA－3(序列編號23)
所製得之增幅DNA產物，DNA，使用TAE緩衝液在2%瓊脂凝膠中進行電泳，確認其產物之純度後，使用pGEM( R ) －T Easy Vector System I(普羅美佳公司Cat.No.A1360)，根據所添附之操作手冊，在pGEM( R ) －TEasy載體中進行次選殖，將其導入大腸菌DH5 α株中，在由含有50μg/ml安比西林之LB培養基所製作之洋菜培養基上，使其形成菌落。各自採取所得到之菌落數個後，將該大腸菌以含有50μg/ml安比西林之LB培養基10 ml培養一夜，由該菌體使用QIAGEN公司QIAprep( R ) Spin Miniprep套組並依據添附之操作手冊調製質體。使用T7引子(普羅美佳公司Cat.No.Q5021)或SP6引子(普羅美佳公司Cat.No.Q5011)及應用生物系統公司之BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction套組(Cat.No.4303149)，依據添附之操作手冊，製作鹼基序列解析用反應物，並使用ABI377型DNA定序儀(Perkin－Elmer公司)，進行鹼基序列之解析。其結果，將具有與預測之序列一致之序列，且由NEFA衍生之增幅基因之5’側係朝向載體之T7啟動子側之選殖株，而得到製作探針用之質體以作為選殖株。將該選殖株以含有50μg/ml安比西林之LB培養基10 ml培養一夜，由該菌體使用QIAGEN公司質體迷你套組並依據添附之操作手冊調製質體。所調製之質體以限制酵素Nco I切斷，並以苯酚萃取、苯酚/CIAA萃取進行純化，在酒精沉澱後於不含RNA分解酵素之TE緩衝液(10 mM Tris－HCl、1 mM EDTA、pH 8.0)中，以1μg/ml使其溶解者，作為探針製作用之模板質體DNA。標識化RNA探針係由模板質體DNA 1μg，使用普羅美佳(Promega)公司Riboprobe( R ) System－SP6，並使用2.5μM之[α－3 2 P]UTP(Amersham Bioscience公司Cat.No.PB10203、3000 ci/mM、10 mci/ml)及20U之RNA合成酵素(含在套組中)，依據套組所添附之操作手冊而製作。
北方墨漬用之電泳，可將由各細胞所得到之全部RNA，使用以含有0.66M之脫離子化甲醛之MOPS緩衝液(20 mM 3－(N－嗎啉代)－丙磺酸，5 mM醋酸鈉，0.5 mM EDTA)所製作之1.2%瓊脂凝膠，再以含有甲醛之MOPS 緩衝液進行100V/2小時電泳。由電泳後之凝膠，使用10倍濃度之SSC(150 mM NaCl，15 mM醋酸鈉)，再將RNA轉移至耐綸膜(Perkin－Elmer公司，Gene Screen Plus( R ) 雜合轉移膜)上。該經轉移之耐綸膜，則使用Stratagene公司之Stratalinker利用UV進行RNA之固定化。其後，耐綸膜利用前雜合反應液(0.25 M NaCl、20 mM Tris－HCl pH 7.5、2.5 mM EDTA、1% SDS、0.5%牛血清白蛋白、0.5%聚乙烯吡咯烷酮、0.5% Ficoll、50%脫離子化甲醯胺)，在43℃下進行3小時之雜合反應，進而，利用含有1,000,000 cpm/ml之標識RNA探針之雜合反應液(0.25 M NaCl、20 mM Tris－HCl pH 7.5、2.5 mM EDTA、1% SDS、0.5%牛血清白蛋白、0.5%聚乙烯吡咯烷酮、0.5% Ficoll、50%脫離子化甲醯胺、10%硫酸葡聚糖)，在43℃下進行一夜之雜合反應，雜合反應後之耐綸膜，以2倍濃度之SSC洗滌後，再於含有60℃之0.1%SDS之0.2倍濃度之SSC中，以每次30分鐘進行嚴格洗淨二次。洗淨後之耐綸膜，在增感屏(Cronex公司，Lightning plus)存在下，以X射線(柯達公司，XAR film)曝光一夜，再檢測經雜合之標記化RNA探針。
<結果>
以噻唑烷二酮(TGZ)在細胞株進行NEFA基因誘導，並以北方墨漬法進行解析之結果，係示於圖1中。圖1至4係使用表現PPAR γ之人類腦髓芽細胞腫株HTB185細胞之檢測結果。色帶1及3係未以TGZ刺激HTB185細胞之狀態下所培養之細胞RNA(各為24小時、48小時培養)，色帶2及4係各以噻唑烷二酮10－ 4 M刺激HTB185細胞達24小時及48小時之細胞RNA，其NEFA基因表現之檢測結果。其結果，未以TGZ刺激之細胞中僅有極微量之NEFA基因表現被確認(色帶1及3)，相較於此，在以TGZ刺激達48小時之細胞中，則確認有顯著之誘導情形(色帶4)。此外，色帶5及6，係使用可表現PPAR γ之SQ－5之結果。色帶5係未以TGZ刺激狀態下所培養之SQ－5細胞之RNA(24小時培養)，色帶6則係以TGZ 10－ 4 M刺激達24小時之細胞RNA，其NEFA基因表現之檢測結果。其結果，未以TGZ刺激之細胞中有低程度之表現被確認(色帶5)，相較於此，在以TGZ刺激達24小時之細胞中，則確認有顯著之誘導情形(色帶6)。進而，在圖1之色帶7至10，係可表現PPAR γ之老鼠胎兒纖維芽細胞株(前驅脂肪細胞株)3T3－L1細胞之檢測結果。色帶7係未以TGZ刺激狀態下所培養之3T3－L1細胞之RNA(48小時培養)，色帶8~10則係將3T3－L1細胞以TGZ各10－ 5 M、10－ 4 . 5 M、10－ 4 M刺激達48小時之細胞RNA，其NEFA基因表現之檢測結果。其結果，未以TGZ刺激之細胞中確認有相當之表現量(色帶7)，該表現在以10－ 5 M~10－ 4 M之TGZ刺激下，亦可得到相同之結果，而確認NEFA基因在脂肪細胞中係不論有無PPAR γ之刺激能夠恆常地表現者。
實施例3 對於NEFA之抗體之製作及在大鼠腦中之表現之檢測
有論者主張在脂肪細胞中表現之分泌蛋白質，即使在腦中亦會表現並可能具有攝食調節作用，即所謂腦－脂肪細胞系(The Brain－Adipose Axis)者(森昌朋：肥胖研究，2004年10卷，第117－119頁，Shimizu H and Mori M：Nutritional Nuerosci 8：7－20，2005)。據此，茲製作對於可在脂肪細胞及腦腫瘤細胞中表現之NEFA之抗體，並檢討其在NEFA之視床下部之表現處所。
為製作對於NEFA之抗體，抗原係使用在大鼠前驅體NEFA聚胜肽之胺基酸序列(序列編號8)第141個之His至第152個之Ser為止之序列上，其C末端附加有Cys之合成胜肽(序列編號24：由株式會社ATP所合成)者(以下，將該胜肽稱為NAP胜肽)。NAP胜肽：N－HisLeuAsnHisGlnAsnProAspThrPheGluSerCys－C(序列編號24)
該合成胜肽係使用PIERCE公司Imject(R)Maleimide Activated Mariculture Keyhole Limpet Hemocyanin添附之操作手冊，使聚胜肽共價結合於KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)上。所得到之共價結合物係以相對於1隻兔子，使用0.2 mg於1次之免疫中。免疫係將共價結合物溶液0.25 ml(共價混合物濃度1 mg/ml)與等量之佛氏完全佐劑H－37 Ra(和光純藥－Difco公司Cat.No.528－00031)進行混合，在業經除毛之紐西蘭白系兔子(購自今井實驗動物試驗場)之背部，在8個位置以每50μl進行皮內注射。同樣之免疫進而以每二週再進行4次之方式，在最後之免疫一週後採取一部份之血液，使用該業經免疫之共價結合物，以ELISA法確認該血清中之抗體價，並於隔日將動物犧牲而採取其全血。由所得到之血液製作血清，再由該血清使用DEAESepharoseFF(Amersham Bioscience公司，Cat.No.17－0709－10)以習知方法純化兔子IgG。經純化之兔子IgG，使用1 mg之NAP胜肽而利用以SulfoLink套組(PIERCE公司Cat.No.44895)製作之胜肽固定管柱，依據該套組所添附之操作手冊進行親和性純化。
使用所得到之對於NAP胜肽之抗體(抗NAP多株抗體)，就大鼠腦中之NEFA聚胜肽之表現，以西方墨漬法進行解析。
由大鼠腦中得到之蛋白質萃取液，係由8週大之Wistar系大鼠(日本查爾斯．李弗)之腦視床下部(1.7 g)，在5 ml之萃取緩衝液(50 mM Tris－HCl pH 8.0、150 mM NaCl、5 mM EDTA、1% Nonidet P－40)中均質調製而成。在大鼠腦中之溶解產物上，與含有等量之SDS－聚丙烯醯胺電泳(SDS－PAGE)用之5%之β－乙基硫醇之Laemmli樣品緩衝液(BIO－RAD公司Cat.No.161－0737)，進行等量混合，在100℃下加溫5分鐘後，於常溫下以微離心機離心15000 rpm、10分鐘後，回收上清液。將該上清液20μl以聚丙烯醯胺凝膠(BIO－RAD公司Ready凝膠10－20%，Cat.No.161－J390V)，使用Tris－glycine/SDS緩衝液(25 mM Tris、192 mM glycine、0.1% SDS、pH 8.3)在100V下電泳1小時，以複印至硝基纖維膜上。將該膜以3%明膠/TBS在室溫下阻隔(Blocking)1小時，再以TBS－0.05%Tween洗淨3次，TBS洗淨1次。其後，在含有抗NAP多株抗體1μg/ml之1%明膠/TBS溶液中，以室溫使其整夜反應。隔日，再以TBS－0.05%Tween洗淨3次，TBS洗淨1次，再將在1%明膠/TBS溶液中稀釋約1μg/ml濃度之抗兔子IgG山羊多株抗體過氧化酵素共價結合物(Cappel公司，Cat.No.674371)在室溫下反應1小時。然後以TBS－0.05%Tween洗淨3次，TBS洗淨2次，並以HRP呈色套組(BIO－RAD公司，Cat.No.170－64631)，在室溫下5分鐘使其呈色並檢測其色帶。
<結果>
NEFA聚胜肽之構造模式圖與抗體之製作上使用之胜肽序列之NEFA上之位置係示於圖2之A中；將NAP胜肽進行免疫反應而製作多株抗體，並以大鼠腦之蛋白質萃取液進行之西方墨漬圖結果係示於圖2之B中。在以對於NAP胜肽製作之多株抗體，使用大鼠腦之蛋白質萃取液進行之西方墨漬圖時，在約47.5 kd之分子量處確認有單一之色帶(圖2B)。據此，顯示對於NAP之抗體係認識全長之NEFA，且在大鼠之腦內有NEFA表現。
實施例4 在大鼠之腦視床下部之NESFATIN表現部位之檢測
為對於與攝食調節有相關，且在大鼠之腦視床下部之NESFATIN表現部位進行檢測起見，使用大鼠之腦切片進行免疫組織化學性之解析。在8週大之Wistar系大鼠(由日本SLC購得)腹腔內注射40 mg/kg之戊基巴比妥酸鈉使其麻醉，切開胸腔由心臟注入50 ml生理食鹽水(0.85% NaCl)，再以配利斯特幫浦將含有4%多聚甲醛之400 ml PBS(20mM磷酸緩衝液、150mM NaCl、pH7.2)注入並使其循環，而將腦灌流固定。其後，將腦摘下，切下含有視床下部之部分，以含有4%多聚甲醛之PBS在4℃下固定一夜。經固定之腦樣品，再於4℃下以含有10%蔗糖之PBS浸漬4小時、含有15%蔗糖之PBS浸漬4小時、含有20%蔗糖之PBS浸漬一夜。其後，腦樣品浸漬於OCT化合物中，以乾冰－丙酮冷凍並製作包埋之嵌段。由所製作之嵌段使用組織切片機，在－20℃下製作6μm厚度之切片，置於塗佈有矽烷之玻片(MATSUNAMI製之MAS塗佈玻片)上風乾。置於玻片上之組織切片以3%過氧化氫水處理5分鐘，再以PBS在5分鐘內洗淨2次。進而，將組織切片以10%山羊正常血清(株式會社日冷Cat.No.426042)在室溫下處理10分鐘進行阻隔，另將對於在含有0.5%BSA之PBS中稀釋之1μg/ml之NAP胜肽之多株抗體(實施例3)，於室溫下對其反應1小時(Ab群)。將玻片以PBS洗淨後，以Histofine Simple Stain大鼠MAX－PO(株式會社日冷Cat.No.414181)反應，以PBS在5分內洗淨3次後，使用Simple Stain DAB溶液(株式會社日冷Cat.No.415172)使其呈色。將呈色後之玻片進行水洗後，以蘇木精染色液(武藤化學藥品Cat.No.3000)，以水洗、酒精脫色、二甲苯使其透明後，使用非水溶性封閉劑(株式會社日冷Cat.No.415141)，放置蓋玻片再將其封閉。使用封閉後之玻片之腦切片，在顯微鏡下進行觀察。
<結果>
圖3係表示在大鼠腦之視床下部及第三腦室(3V)區域之組織切片中，以抗NAP胜肽抗體進行之組織免疫化學染色之顯微鏡呈像(200倍)。圖中，在視床下部之Arc：弓狀核、PVN：室傍核、LH：外側野、SON：視床上核上可見到專一性染色，在這些部位上可見到有NEFA表現。據上結果，顯示NEFA聚胜肽在大鼠之視床下部，特別是弓狀核、室傍核、視床上核、及外側野係有表現者。
再者，由此成績確認以NEFA基因所編碼之NEFA聚胜肽，在與視床下部之攝食調節有關之部位上係有表現者，因此將該聚胜肽命名為NESFATIN。
實施例5 重組NESFATIN之製作
為確認與攝食調節有關之在視床下部神經核上表現之NESFATIN之性狀，以大腸菌製作重組NESFATIN。以在老鼠成熟型NESFATIN聚胜肽(序列編號6)之N末端上結合有GST(谷胱甘太－S－轉化酶)之融合蛋白質(重組老鼠GST－NEFA：序列編號25)使其表現，再將該融合蛋白質使用以蛋白質酵素處理而純化重組成熟型老鼠NESFATIN(序列編號26)之方法。此外，NESFATIN與老鼠NESFATIN之胺基酸相同性程度上，係96.5%而為非常高者。
重組老鼠GST－NEFA表現用之基因之製作，首先，係將藉由老鼠腦cDNA基因庫(Invitrogen公司Cat.No.10655－25)所萃取之質體作為模板，再將以下所記載之引子(各使用0.25μM之濃度)，以變性94℃下變性反應1.5分鐘、變性94℃下0.5分鐘、煉合60℃ 0.5分鐘、伸長72℃ 2分鐘之反應循環，進行5循環後；再以變性94℃下0.5分鐘、煉合及增幅72℃下2分鐘之反應循環，進行30循環後，製作增幅DNA(使用Stratagene公司PfuTurbo( R ) 合酶，Cat.No.600250)。
重組成熟型老鼠NEFAcDNA製作PCR用引子：前置引子：5－TTGGATCCGTTCCTATCGATGTGGACAAGAC－3(序列編號27)反置引子：5－TTGCGGCCGCTTATGTGTGTGGCTCAAACTTCAG－3(序列編號28)
所製得之PCR產物，使用QIAGEN公司MinElute PCR純化套組進行純化，並以限制酵素BamHI及NotI切斷，以2%瓊脂凝膠－TAE電泳將1.3 kb左右之色帶切下回收DNA斷片(QIAGEN公司MinElute凝膠萃取套組Cat.No.28604)。將該1.3 kb之DNA斷片，與業經以限制酵素BamHI及NotI切斷之pGEM－11Zf(＋)載體(普羅美佳公司P2411)，進行結合反應，將大腸菌DH5α株(寶生技公司Cat.No.9057)轉形，在含有50μg/ml安比西林之LB培養基所製作之洋菜培養基上，使其形成菌落。
採取所得到之菌落數個後，就由各該選殖株所調製之質體，使用pUC/M13前置引子(普羅美佳公司Cat.No.Q5391)、pUC/M13反置引子(普羅美佳公司Cat.No.Q5401)、衍生自老鼠NEFA基因內之序列之二種類引子mSQ1(5－CCTGAACCACCAGAATCC－3：序列編號29)及mSQ2(5－AGACTGATGGATTGGACC－3：序列編號30)，及應用生物及應用生物系統公司之BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction套組(Cat.No.4303149)，並使用ABI377型DNA定序儀(Perkin－Elmer公司)，進行鹼基序列之解析。其結果，將鹼基序列解析上具有與序列編號11一致之鹼基序列選殖株，以含有50μg/ml安比西林之LB培養基10 ml培養一夜，由該菌體使用QIAGEN公司QIAprep( R ) Spin Miniprep套組並依據添附之操作手冊調製質體。
將該質體以限制酵素BamHI及NotI切斷，以2%瓊脂凝膠－TAE電泳將1.2 kb左右之色帶切下回收DNA斷片。所回收之DNA斷片，與業經以限制酵素BamHI及NotI切斷之pGEM－4T－載體(Amersham Bioscience公司Cat.No.27－4580－01)，進行結合反應，將大腸菌BL21株(Amersham Bioscience公司Cat.No.27－1542－01)上使用基因Pulser Xcell電穿孔系統(BIO－RAD公司Cat.No.165－2660J1)轉形，在含有50μg/ml安比西林之LB培養基所製作之洋菜培養基上，使其形成菌落。以轉形所得到之重組大腸菌，藉由使用pGEX5’定序引子及pGEX3’定序引子(Amersham Bioscience公司Cat.No.27－1410－01及27－1411－01)之PCR，來確認是否有插入子，進而藉由使用實施例2中之NEFA探針製作PCR用引子之套組，來確認NEFA基因之插入情形。使用已確認成熟型NEFAcDNA已經重組至pGEX－4T－載體中之選殖株，而進行重組老鼠GST－NEFA蛋白質之表現。以含有100μg/ml安比西林之LB培養基10 ml在37℃下震盪培養一夜，其中5ml加入含有100μg/ml安比西林之LB培養基500 ml中，並在37℃下震盪培養至600 nm波長之吸光度為0.6為止(將一部之菌進行採樣：Preinduced bacteria)。在該培養基中添加IPTG(Isopropyl－β－D－thiogalatopyranoside：Gibco BRL公司)至最終濃度為1 mM，進而以37進行3小時之震盪培養。培養後，含有菌體之培養基以5,000 g在4℃下離心15分鐘，回收菌體，懸浮於25 ml之PBS中。懸浮液以－80℃冷凍1小時後，在37℃下使其儘速解凍，並於冰上以超音波處理30秒×5次使菌體破碎。其後，再以10,000 g在4℃下離心30分鐘回收其上清液(對沉澱劃分加以採樣：Post－sonicated pellet)。
上清液使用AKTA－FPLC液體色層分析系統(Amersham Bioscience公司)供於以PBS平衡化之5 ml級距之GSTrapFF管柱(Amersham Bioscience公司Cat.No.17－5131－01)中，其後再以50 ml之PBS將管柱洗淨(流速：1 ml/分鐘)。其後，溶離之緩衝液(10 mM還原型谷胱甘太，0.4 M Tris－HCl pH 8.0，0.2M NaCl)以1 ml/分鐘之流速流動，並以各1 ml之部份進行回收，而以280 nm之吸光度回收含有蛋白質之劃分(280 nm之吸光度為最高之部分：Purified GST－NEFA)。將前培養細菌劃分、後－超音波震盪小片劃分、純化GST－NEFA劃分之一部，溶解於含有5%之β－巰基乙醇之Laemmli樣品緩衝液(BIO－RAD公司Cat.No.161－0737)中，於100℃下處理5分鐘後以微離心機15,000 rpm離心5分鐘所得之上清液，藉由聚丙烯醯胺凝膠(BIO－RAD公司Ready凝膠10－20%，Cat.No.161－J390V)，使用Tris－glycine/SDS緩衝液在100V下電泳1小時，並以庫馬西亮藍染色液(BIO－RAD公司Bio－Safe CBB G－250 Cat.No.161－0786)進行染色。經純化之GST－NEFA劃分，其幾乎皆係以使用業經PBS平衡過之HITrap Desalting管柱(Amersham Bioscience公司Cat.No.17－1408－01)之液體色層分析，除去樣品中之還原型谷胱甘太，再供於業經PBS平衡過之5 ml級距之GSTrapFF管柱中。將管柱以1 ml/分之流速使用25 ml之PBS洗淨後，再使用15 ml之蛋白質酵素反應緩衝液(50 mM Tris pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 Mm DTT)通過管柱後，將20 U/ml濃度之凝血酵素(Amersham Bioscience公司Cat.No.27－0846－01)之4.6 ml蛋白質酵素反應緩衝液供於管柱中，在該全體量均進入管柱後停止液體色層分析之幫浦，於室溫(22℃)下進行一夜之蛋白質酵素反應。隔日，將管柱以1 ml/分之流速使用15 ml之PBS流動並回收劃分，所得到之劃分以HiTrap Benzamidine FF管柱(Amersham Bioscience公司Cat.No.17－5143－02)使其通過，再得到除去凝血酵素之劃分(Prepurified sample)。為由該劃分將重組成熟型老鼠NEFA聚胜肽純化起見，以陰離子交換樹脂進行色層分析之分劃。將前純化之樣品(Prepurified sample)(20 ml)以緩衝液A(20 mM bis－Tris pH 6.5、0.1 mM NaCl、0.1% CHAPS)稀釋成5倍，再供於以緩衝液A平衡過之HiTrap Q HP管柱(Amersham Bioscience公司Cat.No.17－1153－01)中，其後以1 ml/分之流速使用緩衝液A加以洗淨(以每1 ml之部分進行回收：washed sample)。將洗淨之管柱使用緩衝液A及緩衝液B(20 mM bis－Tris pH 6.5、1 mM NaCl、0.1% CHAPS)，在緩衝液B成為0~50%/60分鐘之直線濃度梯度之情形下，以0.5 ml/分之流速進行溶離。此時，每0.5 ml取出1個部分，並回收在280 nm波長之吸光度下含有蛋白質之劃分(Purified sample)。將該純化之步驟所得到之樣品(Prepurified sample，Washed sample，Purified sample)，取出一部份，與含有5%之β－巰基乙醇之Laemmli樣品緩衝液等量混合，並於100℃下加溫5分鐘後，以與實施例3同樣之方法進行西方墨漬法。將該劃分對於PBS進行透析，而製得經純化之成熟型老鼠NEFA聚胜肽。
<結果>
圖4之A中係表示以重組大腸菌使GST－NEFA融合蛋白質表現，並以GSTrapFF管柱純化GST－NEFA融合蛋白質之步驟中，所得樣品之SDS－PAGE染色圖。圖4之B則係表示由GST－NEFA融合蛋白質以凝血酵素將成熟NEFA聚胜肽切下，並以HiTrap Q HP管柱進行純化之過程中，所得樣品中之抗NAP多株抗體進行西方墨漬法之結果示意圖。如圖4所示，第3色帶中，以IPTG誘導表現後再使菌體破碎所得之後－超音波震動處理小片(Post－sonicated pellet)中，相較於第2色帶之前誘導細菌樣品而言，分子量65 kd產物被確認有顯著之增大情形。再者，在以GSTrapFF管柱純化之劃分(Purified sample)中，因確認有65 kd之主產物之故，顯示在重組大腸菌中該重組老鼠GST－NEFA融合蛋白質有表現之情形。又根據圖4之B，純化前之樣品(Prepurified sample)，其除可檢測到以分子量47.5 kd之凝血酵素所切斷之成熟型老鼠NEFA聚胜肽及分子量約65 kd之重組老鼠GST－NEFA融合蛋白質之色帶外，尚可確認有數條之色帶。另一方面，在純化樣品中可確認僅有分子量47.5 kd之主要色帶及65 kd之微弱色帶，顯示其可得到幾乎純粹之重組成熟型老鼠NEFA聚胜肽。
實施例6 以NESFATIN進行腦室內投予對於攝食行動之作用上檢討
為了檢驗對於所得到重組NESFATIN動物之攝食行動之作用起見，在未麻醉下對於大鼠之大三腦室進行腦內投予之實驗。
大鼠係使用Wistar系大鼠(由日本SLC購得)，以上午6點至下午6點間之12小時進行照明，並以下午6點至隔日上午6點間之12小時保持黑暗之週期下，作為照明條件，並以22℃下投予粉末飼料(日本克雷爾公司CE－2)之條件進行飼育，在實驗中亦以同樣之條件繼續進行飼育。實驗係由雄性8~9週大之Wistar系大鼠中，選擇體重為200~250 g間之個體使用。投予係將生理食鹽水(控制組)、或實施例5所製作之重組NESFATIN以相對於生理食鹽水5μl而溶解1 pmol、4 pmol、20 pmol者，對於每個個體各投予5μl(各群N＝5)。大鼠中係以在腹腔中，以相當於體重1 kg投予40 mg之戊巴比妥鈉進行麻醉，將頭部去毛後將腦定位固定裝置(David Kopf公司，Mode 1962)加以固定，切開頭皮，將23G針(引導插管)在達到第三腦室之情形(前囪後方2.5 mm，表面9.5 mm)下留置固定。在該引導插管固定1週後，供於各實驗中。在手術回復後，攝食活動亢進進入暗期之前，在無麻醉下將29G之注入用插管插入該引導插管中，以1秒鐘1μl之速度將生理食鹽水或溶解於生理食鹽水之成熟型老鼠NESFATIN溶液投予5μl，在投予後2~3分鐘左右直接將插管固定後，拔除注入用插管，再放回個別之籠中。測量在其後之1小時、3小時、6小時後，該飼料之重量變化並記錄其攝食量，以作為攝食行動之指標。再者，統計上有意義之差係使用分散分析(analysis of variance)。
<結果>
在第三腦室中各投予重組NESFATIN為0、1、4、20 pmol時，其投予後0~1小時內之攝食量，係如圖5之A所示；1~3小時內之攝食量，係如圖5之B所示；3~6小時內之攝食量，則如圖5之C所示者。在0~1、1~3、3~6小時之任一者中，與僅投予生理食鹽水之大鼠相較，在投予重組NESFATIN之群組中，確認其係有投予量依存性地攝食量降低之情形。特別在投予20 pmol之重組NESFATIN群中，不論是在0~1小時/1~3小時/3~6小時(各P<0.01)之任一者中，其等之攝食量與對照群組相較，均確認有統計上有意義之攝食抑制作用。由此等之成績，顯示NESFATIN在腦內具有抑制攝食行動之作用。
實施例7 藉由抗NESFATIN抗體之腦室內投予而對於攝食行動之作用之檢討
為進而檢測NESFATIN之攝食調節作用起見，檢討該對於NESFATIN之抗體投予於第三腦室內時對攝食行動之影響。
抗體係使用實施例4所製作之抗NAP胜肽抗體(NAP IgG)，將生理食鹽水稀釋過之抗體5μl投予至大鼠中(投予量5μg)。控制組係將未經免疫之兔子所純化之IgG(控制組IgG)，以相同濃度進行同量投予。大鼠係使用Wistar系大鼠(由日本SLC購得)，與實施例6相同地進行飼育，實驗係由雄性8~9週大之Wistar系大鼠中，選擇體重為200~250 g間之個體使用。投予時期，係於攝食行動較少亦即進入照明期前進行，投予之方法可與實施例6所記載之方法同樣地進行。測定其在腦室內投予後~3小時~6小時~9小時之間，其粉末飼料之攝食量。再者，在統計上有意義之差之檢測上，係使用分散分析(analysis of variance)者。
<結果>
將控制組IgG或抗NESFATIN抗體(NAP IgG)投予至腦室內之大鼠中，其0~3小時之間之攝食量係表示於圖6之A中，3~6小時之間之攝食量係表示於圖6之B中，6~12小時之間之攝食量係表示於圖6之C中。將抗NESFATIN抗體投予至腦室內之個體，其在照明期之0~3小時(圖6之A)、以及3~6小時(圖6之B)之攝食量，顯示相較於被投予控制組IgG之個體，其係具有統計上有意義之促進效果(各P<0.001)。其在抗NESFATIN抗體投予群之攝食量增大，0~3小時(圖6之A)係控制組IgG投予群之約9倍，3~6小時係約10倍左右。然而，6~9小時之間因為變成黑暗期，控制組IgG投予群之攝食行動開始之故，並無見到統計上有意義之差。如此地，因為藉由抗NESFATIN抗體之投予可見到大鼠攝食量之亢進情形，顯示抗NESFATIN抗體可抑制內在性之NESFATIN作用，且NESFATIN係有參與攝食行動者。
實施例8 在大鼠視床下部之NEFA基因之表現及絕食對於其影響之檢討
內因性NESFATIN之基因表現會因為絕食而受到何種影響，係以原位(in situ)雜合法進行檢討。
腦組織中之原位(in situ)雜合用之探針，係使用實施例2所製作之製作NEFA探針用之質體。使用以限制酵素Nco I切斷並純化之該質體1μg，再使用洋地黃毒(DIG，digoxigenin)RNA標識套組(羅氏診斷公司Cat.No.1175025)，藉由SP6－RNA轉錄酵素之反應，製作DIG標識化cRNA探針。SP6－RNA轉錄酵素之反應，係以40℃反應2小時，再對於反應後之20μl反應液添加2μl之0.2 M EDTA(pH 7.0)使反應停止，再於其上加入2.5μl之3 M LiCl及75μl之－20℃冰冷乙醇加以混合後，於－20℃下靜置一夜。隔日，將反應物以設定於4℃之微離心機，15,000 rpm下離心20分鐘，除去上清液，在沉澱中加入50μl之70%乙醇並再次離心，而除去上清液再使沉澱乾燥。使沉澱溶於DEPC處理水(日本基因公司Cat.No.314－90205)中，以瓊脂凝膠電泳將RNA量進行定量，再以DEPC處理水將其稀釋成0.1 mg/ml之RNA濃度。為縮短所得到之cRNA長度(≒450鹼基)起見，對於該0.1 mg/ml濃度之RNA溶液10μl，再加入10μl之DEPC處理水及40μl之碳酸鹽緩衝液(60 mM碳酸鈉、40 mM碳酸氫鈉、pH 10.2)並進行混合，再於60℃下使其反應30分鐘。對於反應物，再加入60μl之中和溶液(3M醋酸鈉、1%醋酸、pH 6.0)，再加入360μl之於－20℃下冰冷乙醇並進行混合後，在－70℃下冷卻30分鐘並以設定在4℃之微離心機，15,000 rpm下離心20分鐘，除去上清液，而得到沉澱。沉澱在加入100μl之70%乙醇(－20℃)，再次離心並除去上清液，使沉澱乾燥。所乾燥之沉澱溶解於100μl之DEPC處理水中，以瓊脂凝膠電泳測定其濃度。所得到之探針濃度為約50μg/ml。如此所得到之DIG標識NEFAcRNA探針，則用於原位雜合反應中。
將約8週大之雄性Wistar系大鼠(由日本SLC購得)(體重為200~250 g)分別飼養可自由攝食粉末飼料之個體(Normal)、48小時不給予飼料僅給予飲水而飼育之個體(Starvation)、36小時不給予飼料後再使其可自由攝食飼料12小時之個體(Re－feeding)，以與實施例5記載之方法及同樣地含有4%多聚甲醛之PBS加以灌流固定，再將腦取出。將所取出之腦切下其含有視床下部之部分，再以含有4%多聚甲醛之PBS在4℃下固定一夜。經固定之腦樣品，再以與實施例4之方法同樣地使用組織切片機，製作10μm厚度之切片，置於塗佈有矽烷之玻片上。將載有腦組織切片之載玻片放入恆溫器中以50℃處理2分鐘後，使切片在室溫下乾燥30分鐘。其後，切片再以含有4%多聚甲醛之PBS室溫下處理7分鐘加以固定，又以PBS處理3分鐘、及2倍濃度之SSC處理5分鐘，而洗淨2次。
在載玻片之腦組織切片上，再加入原位雜合反應液(4倍濃度SSC、10%硫酸葡聚糖、1倍濃度Denhardt’s液、2 mM EDTA、50%脫離子化甲醯胺、500μg/ml鱒魚精子DNA)，使其覆蓋，在37℃下進行1小時之前雜合反應。在前雜合反應終了後，丟棄該覆蓋之液體，再加入含有200 ng/ml濃度之DIG標識化NEFAcRNA探針之原位雜合反應液，使其覆蓋，並於濕潤箱中在37℃下進行16小時之雜合反應。載有雜合後腦組織切片之載玻片，於37℃下以2倍濃度之SSC洗淨5分鐘後，再於37℃下以含有60%甲醯胺之0.2倍濃度SSC洗淨5分鐘，其各進行3次洗淨，進而，在室溫下以2倍濃度SSC洗淨5分鐘，進行2次。
洗淨後之腦組織中之經雜合，使用DIG核酸檢測套組(羅氏診斷公司Cat.No.11175041)加以檢測，其方法之概要係如下所示。將載有腦組織之載玻片以含有150 mM NaCl之100 mM Tris－HCl(pH 7.5)緩衝液在室溫下洗淨5分鐘，再使用以套組中所含之阻隔劑使之飽和之同緩衝液(阻隔緩衝液)，在室溫下進行30分鐘之阻隔反應。將套組中所含之抗DIG抗體鹼性磷酸酵素共價結合物於阻隔緩衝液中稀釋成1/200之濃度後，置於載玻片上，室溫下使其反應2小時。反應後之載玻片以含有150 mM NaCl之100 mM Tris－HCl(pH 7.5)緩衝液，在5分鐘內洗淨2次後，再以檢測緩衝液(100 mM Tris－HCl、pH 7.5、100 mM NaCl、50 mM MgCl2 )洗淨10分鐘。其後，加入含有0.18 mg/ml之BCIP及0.34 mg/ml之NBT之檢測緩衝液，於室溫下使其反應16小時進行呈色反應。將該載玻片以含有1 mM EDTA之10 mM Tris－HCl(pH 8.0)洗淨5分鐘，使呈色反應停止。
進而，該載玻片以蒸餾水洗淨5分鐘，並以1%亞甲基綠進行5分鐘染色後，以蒸餾水洗淨，進行醇類脫水、二甲苯透明化，使用非水溶性封閉劑(株式會社日冷Cat.No.415141)蓋上蓋玻片並使其封閉。其後，以光學顯微鏡進行觀察。
<結果>
與圖7之A所示對照組相比較，圖7之B係表示進行48小時絕食之情形下，室傍核(PVN)之NESFATIN之mRNA表現有顯著地減少，圖7之C則係以絕食後之再攝食，而使NESFATIN之mRNA基因表現回復。根據這些結果，判斷內因性之NESFATIN係與攝食調節有關者。
實施例9 飢餓狀態之大鼠腦內之NESFATIN表現之檢討
關於絕食狀態下內因性之NESFATIN變動，係以免疫組織染色法進行檢討。
將約8週大之雄性Wistar系大鼠(由日本SLC購得)(體重為220~250 g)使用可自由攝食粉末飼料之對照群、及24小時絕食之絕食群，製作這些大鼠之腦組織切片，並以抗NESFATIN抗體進行免疫組織化學上之解析。關於組織切片上之製作及免疫組織染色上之方法，皆與實施例4之方法同樣地進行。此外，為調查與攝食相關之腦之區域中，神經細胞之活性化狀態，使用對於c－Fos之抗體，進行絕食群之腦組織中免疫組織化學上之解析。該方法則使用稀釋成500倍之c－Fos(K－25)抗體(Santa Cruz Biotechnology公司sc－253)，來取代抗NESFATIN抗體，並與上述同樣地進行。
<結果>
對照群之視床下部中，抗NESFATIN抗體(NAP Ab)之免疫組織染色圖之顯微鏡呈像(200倍)係示於圖8之A中；絕食群之視床下部中，抗NESFATIN抗體之免疫組織染色圖之顯微鏡呈像(與A同倍率)係示於圖8之B中；絕食群之視床下部中，抗c－Fos抗體之免疫組織染色圖之呈像(與A同倍率)係示於圖8之C中。再者，圖之上半段係室傍核之呈像，下半段則表示弓狀核之呈像。與對照群相較，在絕食群之視床下部中，室傍核(圖8之B上半段)弓狀核(圖8之B下半段)之染色性有顯明地減少，顯示因絕食而使NESFATIN表現有降低之情形。此外，在食慾亢進之狀態下，確認有c－Fos蛋白質之表現。據此，在因絕食而食慾亢進之狀態中，被認為具有食慾抑制效果之NESFATIN表現有降低情形，考慮其應係有食慾之調節情形發生。
實施例10 NESFATIN－1、NESFATIN－2、NESFATIN－3、及NESFATIN－2/3胜肽之製作及對於NESFATIN－1胜肽之抗體、對於NESFATIN－3及NESFATIN－2/3之抗體之製作
在實施例3~9中，顯示NESFATIN在腦視床下部有表現以及對於攝食與體重調節之作用。此外，該NESFATIN在其前驅體中，因具有訊息胜肽之故，顯示亦有分泌至細胞外之可能性。已知有某種活性蛋白質在後轉譯步驟中，被以原荷爾蒙轉化酶(PC)加以切斷。因此，對於原荷爾蒙轉化酶之切斷部位序列之Arg－Arg或Lys－Arg之序列，亦進行解析其是否存在於老鼠、大鼠、及人類之NEFA序列上。其結果，確認在老鼠、大鼠、及人類之序列上共通者，由N末端之第107個及108個胺基酸序列之位置及第199個及200個位置上，存在有Lys－Arg序列，而在第188個及189個胺基酸序列之位置上，存在有Arg－Arg序列(圖9A)。因此，在NESFATIN之序列中，相當於第25至106個胺基酸之82個殘基之胜肽被命名為NESFATIN－1(序列編號15)，相當於第109至187個胺基酸之79個殘基之胜肽被命名為NESFATIN－2(序列編號16)，相當於第190至420個胺基酸之231個殘基之胜肽被命名為NESFATIN－3(序列編號17)。此時，已知區域構造之DNA結合區域(胺基酸編號171~223)係以分段為NESFATIN－2及NESFATIN－3之形式，nectin結合區域(胺基酸編號213~420)、鈣結合區域(胺基酸編號254~265及306~317)及Asp/Glu－豐富區域(胺基酸編號306~317)係包含於NESFATIN－3之序列內，惟NESFATIN－1序列中則不包含已知之區域構造(圖9B)。因此，將由NESFATIN－2及NESFATIN－3之序列所成之胜肽部分命名為NESFATIN－2/3(序列編號47)。大鼠之NESFATIN－1胜肽(序列編號15)及NESFATIN－2胜肽(序列編號16)，其合成係委託矢內研究所(股)，以固相合成進行合成並以逆相液體色層分析進行純化。NESFATIN－3(序列編號17)係使用由大鼠腦所調製之cDNA，並利用序列編號48及序列編號49之引子，取得增幅之DNA(序列編號50)，使用該DNA並依Post Genome Institute Co.LTD(Shimizu Y et al：Nature Biotech 19：751－755,2001)藉由無細胞蛋白質合成法加以製作。
所使用之PCR引子：前置引子：5’－ATGGAATATTTAAAAACGCTGAGTGAG－3’(序列編號48)反置引子：5’－TTATGTGTGTGGCTCAAACTTCA－3’(序列編號49)
以此方法所製作之NESFATIN－3係成為在N末端上有Met結合之序列(序列編號51)之形式。
同樣地NESFATIN－2/3(序列編號47)，則使用序列編號52及序列編號53之引子，取得由大鼠衍生之cDNA所增幅之DNA(序列編號54)，依據無細胞蛋白質合成法而製作。
所使用之PCR引子：前置引子：5’－ATGCAAGAAGTAGGAAGACTGAGAA－3’(序列編號52)反置引子：5’－TTATGTGTGTGGCTCAAACTTCA－3’(序列編號53)
以此方法所製作之NESFATIN－2/3係成為在N末端上有Met結合之序列(序列編號55)之形式。
再者，為製作與實施例3所製作之抗NAP胜肽抗體係其他區域之抗體起見，製作了在NAP1胜肽之胺基酸編號24至38之相當序列(相當於序列編號5之老鼠前驅體NEFA聚胜肽之胺基酸編號48至62者)之C末端上附加有Cys之序列(NAP－1Ab：序列編號32)、NAP－3之胺基酸編號1至9之相當序列(相當於序列編號5之老鼠前驅體NEFA聚胜肽之胺基酸編號190至198者)、以及在NAP－3胜肽之胺基酸編號136至149之相當序列(序列編號5之老鼠前驅體NEFA聚胜肽之序列中之胺基酸編號325至338者)之C末端上附加有Cys之序列(各為NAP－C1 Ab序列編號33及NAP－C2 Ab：序列編號34)。NAP－1 Ab：N－ProAspThrGlyLeuTyrTyrAspGluTyrLeuLysGlnValIleCys－C(序列編號32)NAP－C1 Ab：N－GluTyrLeuLysThrLeuSerGluGluCys－C(序列編號33)NAP－C2 Ab：N－LysGluPheLeuGluProAspSerTrpGluThrLeuAspGlnCys－C(序列編號34)
NAP－1 Ab、NAP－C1 Ab、NAP－C2 Ab之各胜肽之製作，係依賴株式會社ATP，以固相合成法進行合成，再以逆相液體色層分析法進行純化。所得到之NAP－1 Ab、NAP－C1 Ab、NAP－C2 Ab之各胜肽，以與實施例3之方法同樣地製作該與KLH之共價結合物，藉由對於兔子之免疫反應而製作含有對於各胜肽之抗體之血清。由各血清使用DEAE管柱依據習用方法純化兔子IgG，而各自作為NAP－1 IgG(Nesfatin－1 IgG)、NAP－C1 IgG(Nesfatin－C1 IgG)、NAP－C2 IgG(Nesfatin－C2 IgG)。
將上述製作之NESFATIN－1胜肽及NESFATIN－3胜肽，各以SDS－聚丙烯醯胺凝膠(12%)電泳法使其進行電泳，其後，再將各胜肽以與實施例3同樣之方法，各自使用Nesfatin－1 IgG及Nesfatin－C2 IgG進行西方墨漬法。
<結果>
以固相合成法進行合成，並以逆相色層分析法純化之NESFATIN－1胜肽、NESFATIN－2胜肽、NESFATIN－3胜肽、NESFATIN－2/3胜肽，以分析用C18逆相色層分析法在幾乎單一峰部之純度下進行純化，分取其峰部，再以MAS光譜解析法(NESFATIN－1及NESFATIN－2)或SDS－聚丙烯醯胺凝膠(12%)電泳法(NESFATIN－3及NESFATIN－2/3)進行解析時，顯示該約略被預測為NESFATIN－1、NESFATIN－2、NESFATIN－3、及NESFATIN－2/3之各胜肽分子量之胜肽，係已被合成者。此外，在將NAP－1 Ab、NAP－C1 Ab、NAP－C2 Ab之各胜肽與KLH之共價結合物，進行免疫反應所得之兔子中，可確認對於各自之3種胜肽之抗體價均有上升之情形，而得到對於各胜肽之之抗體(IgG)。
再者，將NESFATIN－1胜肽進行電泳並以Nesfatin－1 IgG進行西方墨漬法之結果，確認在9.7 kd處有色帶，再將NESFATIN－3胜肽進行電泳並以Nesfatin－C2 IgG進行西方墨漬法之結果，確認在27.9 kd處有色帶(圖9C)。基於此結果，顯示Nesfatin－1 IgG及Nesfatin－C2 IgG之各抗體，各自對於NESFATIN－1胜肽，及NESFATIN－3(NESFATIN－2/3)有結合情形發生。
實施例11 以NAP－1IgG及以抗PC抗體進行之免疫組織化學解析
為證明NESFATIN－1由NESFATIN被處理起見，首先，將實施例10所製作之NAP－1IgG(Nesfatin－1 IgG)，以及將對於抗原荷爾蒙轉化酶抗體(抗PC)之抗體，在大鼠視床下部進行二重免疫組織染色，以進行NESFATIN及PC之位置之解析。
腦組織切片之製作係根據以下方法進行。在8週大之Wistar系大鼠(由日本查爾斯．李弗購得)腹腔內注射40 mg/kg之戊基巴比妥酸鈉使其麻醉，切開胸腔由心臟注入50 ml生理食鹽水(0.85% NaCl)，再以配利斯特幫浦將含有4%多聚甲醛之400 ml PBS(20 mM磷酸緩衝液、150 mM NaCl、pH 7.2)注入並使其循環，而將腦灌流固定。其後，將腦摘下，切下含有視床下部之部分，以含有4%多聚甲醛之PBS在4℃下固定一夜。經固定之腦樣品，再於4℃下以含有10%蔗糖之PBS浸漬4小時、含有15%蔗糖之PBS浸漬4小時、含有20%蔗糖之PBS浸漬一夜。其後，腦樣品浸漬於OCT化合物中，以乾冰－丙酮冷凍並製作包埋之嵌段。由所製作之嵌段使用組織切片機，在－20℃下製作6μm厚度之切片，置於塗佈有矽烷之玻片(MATSUNAMI製之MAS塗佈玻片)上風乾。置於玻片上之組織切片以3%過氧化氫水處理5分鐘，再以PBS在5分鐘內洗淨2次。
將載有腦組織切片之載玻片，以10%山羊正常血清(株式會社日冷Cat.No.426042)在室溫下處理10分鐘進行阻隔，另將含有0.5%BSA之PBS稀釋成1/500之NAP－1IgG(Nesfatin－1 IgG：實施例10)在室溫下使其反應1小時。使抗體進行反應之載玻片，以PBS在5分內洗淨3次後，使用Histofine Simple Stain大鼠MAX－PO(株式會社日冷Cat.No.414181)反應，以PBS洗淨後，再使用4－氯－1－萘酚(ICN公司Cat.No.980611：經4－氯－1－萘酚穩定之呈色原)使其呈色。將呈色後之載玻片以PBS在5分內洗淨3次後，將載玻片浸漬於0.1 M甘胺酸緩衝液(pH 2.2)中1.5小時(每30分鐘換一次該緩衝液)，然後再以PBS在5分內洗淨3次。進而，將載玻片以10%山羊正常血清(株式會社日冷Cat.No.426042)在室溫下處理10分鐘進行阻隔。將此時點之前所處理之載玻片分成二群，一半作為可認識原荷爾蒙轉化酶之次形式之PC1及PC3之抗體(PC－1/3：Chemicon公司Cat.No.AB1260)，另一半則作為可認識原荷爾蒙轉化酶之次形式之PC2之抗體(PC－2：Chemicon公司Cat.No.AB1262)，而作成含有0.5% BSA之PBS所稀釋之抗體液，並於室溫下反應1小時。其後，載玻片以PBS在5分內洗淨3次後，將含有0.5%BSA之PBS稀釋成1/200之山羊抗兔子IgG－Alexa594共價結合物(Molecular Probes公司Cat.No.A11008)在室溫下，使各載玻片反應30分鐘。其後，載玻片以PBS在5分內洗淨3次後，使其微微風乾後再以甘油及蓋玻片封閉，並將蓋玻片之周圍以透明指甲油封住而製作標本。將標本以共焦點雷射顯微鏡(Bio－Rad公司MRC－1024 confocal laser scanning equipment＋尼康公司Eclipse E800 upright microscope)，並將4－氯－1－萘酚之染色作為位相差像，再將Alexa594之螢光使用Krypton－氬氣雷射(波長：568 nm)下之激態光，而使用605±3o nm之Band Pass濾波器作成螢光像加以觀察。
<結果>
圖10之A之圈1及圈2，係表示大鼠視床下部組織中之免疫組織化學圖上，其Nesfatin－1 IgG之染色圖；而圖10之B之圈1係表示PC－1/3之螢光圖，圖10之B之圈2則係表示PC－2之螢光圖。圖10之A之圈1及圖10之B之圈2，及圖10之A之圈2及圖10之B之圈2，均在同樣之視野中產生了呈色像及螢光像。如圖10之A之圈1及圈2所表示者，以Nesfatin－1 IgG所染色之細胞被確認為係大鼠視床下部細胞。在這些之大多數細胞中，抗PC－1/3抗體及抗PC－2抗體之染色圖，係與Nesfatin－1 IgG陽性細胞為一致者。據此，在NESFATIN有表現之細胞中，原荷爾蒙轉化酶之PC－1/3及PC－2會共同表現，此顯示NESFATIN有可能因為原荷爾蒙轉化酶而被處理。
實施例12對於NESFATIN－1、NESFATIN－2、NESFATIN－3、及NESFATIN－2/3腦內投予所致攝食量調節之作用上之檢討
檢測在NESFATIN之何部位上具有攝食抑制活性部位。在腦內投予上所使用之投予樣品，係僅有生理食鹽水(Vehicle群)，或各將實施例10所製作之NESFATIN－1、NESFATIN－2、NESFATIN－3、或NESFATIN－2/3溶解於生理食鹽水中，並以每個個體為25 pmol之投予量，在黑暗期來臨前投予至第3腦室中。大鼠係使用Wistar系大鼠(由日本SLC購得)，與實施例6相同地進行飼育，實驗係由雄性8~9週大之Wistar系大鼠中，選擇體重為200~250 g間之個體使用(N＝5)。在大鼠之腦室內投予實驗，其實驗技術及攝食量之測定上，係以與實施例6之方法相同地進行。再者，攝食量之測定，則係由投予後之1小時(0~1小時)及投予1小時後之2小時(1~3小時)之間，其飼料之減少量作為攝食量而計算。
再者，在與上述相同之條件下，將僅有NESFATIN－1作為樣品，而以每個個體為1、5或25 pmol之投予量，在黑暗期前進行投予至第三腦室內之實驗。在該實驗中，測定在投予後1小時(0~1小時)之攝食量。
<結果>
如圖11之A所示，與對照群(Cont)相較，即使將NESFATIN－2、NESFATIN－3、及NESFATIN－2/3投予至腦室內，在攝食量上亦無統計上有意義變動被確認(0~1小時：圖11之A之a－1；1~3小時：圖11之A之a－2)。另一方面，以25 pmol NESFATIN－1進行腦室內投予被確認有明顯的攝食抑制效果。再如圖11之B所示者，將NESFATIN－1以每個大鼠個體在腦內以1、5或25 pmol之投予量進行投予時，確認相對於僅投予生理食鹽水者(0)，在NESFATIN－1投予量增加之同時，有攝食量降低之現象，特別在投予5 pmol或25 pmol時，確認有統計上有意義之攝食減少情形。由此等之結果，確定NESFATIN之攝食抑制活性係在於NESFATIN－1。
實施例13將NESFATIN－1在腦室內連續地進行投予之攝食量及體重之變化
進而，檢討將NESFATIN－1連續地投予至腦室內時之攝食及體重上變化之影響。NESFATIN－1之投予，係藉由滲透壓幫浦連續10日在腦室內進行投予。動物係使用約8週大之Wistar系雄性大鼠(由日本SLC購得)，選擇體重為200~250 g間之個體使用。大鼠中係以在腹腔中，以相當於體重1 kg投予40 mg之戊巴比妥鈉進行麻醉，將頭部去毛後將腦定位固定裝置(David Kopf公司，Mode 1962)加以固定，切開頭皮，將23G針(引導插管)在達到第三腦室之情形(前囪後方2.5 mm，表面9.5 mm)下留置固定。在該引導插管固定1週後，供於各實驗中。滲透壓幫浦係使用Alzet公司2002型，並將先以0.22μm之Millex GV過濾器(Millipore公司)滅菌之生理食鹽水中，溶解之NESFATIN－1(NESFATIN－1投予群)；或者僅將滅菌之生理食鹽水(對照群)，在使用前注入滲透壓幫浦中，而在使用前日起浸在生理食鹽水中進行滲調(priming)。將注入有各樣品之滲透壓幫浦連接在接有注入用插管之管子上，首先通過包埋之引導插管，然後該注入用插管之前端再進入大鼠之第三腦室中而固定。在此種狀態之使用，係以每24小時12 μ l之速度將樣品注入第三腦室中，而在NESFATIN－1投予群中則為每1日投予5 pmol之NESFATIN－1至腦室中。包埋有滲透壓幫浦之大鼠係以麻醉確認，裝入個別之籠中，並在其可以自由地攝取粉末飼料及飲用水之條件下進行飼育。攝食量之測定，係由將插管及滲透壓幫浦埋入之次日起，每日上午9點測量其所殘存之飼料重量，藉由求出與前日之飼料重量之差，而計算出一日(24小時)之攝餌量。然後，由投予開始6日後，在測定攝餌量時同時測定其體重，並就其體重之變化加以紀錄。
<結果>
圖12之A所示者，在NESFATIN－1投予群中，從投予開始後1日起，就可見到攝食量減少之情形，而較測定期間中之對照群而言，攝食量係保持在降低之情形。再如圖12之B所示者，體重增加之速度在NESFATIN－1投予群中，相較測定期間中之對照群而言，有統計上有意義之減少。
實施例14 藉由抗NESFATIN－1抗體或抗NESFATIN－3抗體之腦內投予及突變型NESFATIN之腦內投予所作之攝食調節上之檢討
在實施例12及13中，藉由NESFATIN－1胜肽之腦內投予可見到攝食量降低之效果。進而，為確認此事實起見，將可認識NESFATIN－1之NAP－1 IgG(Nesfatin－1 IgG)、或可認識NESFATIN－3之NAP－C1 IgG(Nesfatin－C1 IgG)或NAP－C2 IgG(Nesfatin－C2 IgG)，投予至大鼠之腦室內，並檢討對於攝食量之影響。再者，為調查NESFATIN藉由原荷爾蒙轉化酶被切斷而產生NESFATIN－1與攝食調節間之關係，將序列編號26之序列內，相當於胺基酸編號第84及第85個之Lys、Arg之序列，取代為Ala、Ala之序列之突變體(KR－AA突變株：Mut)，再檢討其投予至大鼠腦內之效果。
在腦室內投予所使用之投予樣品，係將在生理食鹽水中未經免疫之兔子純化IgG(控制群)、或在實施例11中所製作之NAP－1 IgG(Nesfatin－1 IgG)、NAP－C1 IgG(Nesfatin－C1 IgG)或NAP－C2 IgG(Nesfatin－C2 IgG)，各自地溶解於生理食鹽水中，並以相當於1個個體在第三腦室內投予5μl(5μg)。大鼠係使用Wistar系大鼠(由日本SLC購得)，與實施例6相同地進行飼育，實驗係由雄性8~9週大之Wistar系大鼠中，選擇體重為200~250 g間之個體使用。在大鼠之腦室內投予實驗，其實驗技術及攝食量之測定上，係以與實施例7之方法相同地進行。再者，攝食量之測定，則係由投予後之3小時(0~3小時)及投予3小時後之3小時(3~6小時)之間，其飼料之減少量作為攝食量而計算。
KR－AA突變株之製作，係將實施例5所取得之成熟型老鼠NESFATIN基因，使其表現並實施。實施例5所取得之成熟型老鼠NESFATIN基因，係使用由pGEM－11Zf(＋)所選殖之質體，以PCR法而製作出2種斷片。第1個DNA斷片係使用該質體5 ng，並以mNucB2－F360[Sac2Thr]引子及mNucB2[KR－AA]R583引子之組件，進行PCR而製作。
mNucB2－F360[Sac2Thr]：5'－GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTGTTCCTATCGATGTGGACAAGACCAA－3'(序列編號56)mNucB2[KR－AA]R583：5'－CTTCTTGAGCAGCCAGCTCATCCAGTCTCGTCCTCA－3'(序列編號57)
反應條件，係於變性90℃下進行變性反應1分鐘，再以變性98℃10秒、煉合6o℃30秒、伸長68℃1分鐘之反應循環，進行20循環，而製作增幅DNA(使用Stratagene公司PfuTurbo( R ) 聚合酶Cat.No.600250)。
再者，與第2個的第1個DNA斷片相同地，使用該質體5 ng DNA斷片，並以mNucB2[KR－AA]F612引子及mNucB2－R1527[NotI]引子之組件，進行PCR而製作。mNucB2[KR－AA]F612：5'－GAGCTGGCTGCTCAAGAAGTAGGAAGACTGCGGATGCT－3'(序列編號58)mNucB2－R1527[NotI]：5'－GGTTGCGGCCGCACTTTATGTGTGTGGCTCAAACTTCAG－3'(序列編號59)
PCR條件係與第1個DNA片段之增幅相同者。
為製作2種類之DNA斷片起見，將上述2種類之PCR反應後之樣品，以每50μl各加5μl之方式加入反應液中，並以各0.25μM之His－Thr－For[SpeI]引子及前述之mNucB2－R1527[NotI]引子，及1倍濃度之Pfu緩衝液、2.5單位之PfuTurbo DNA聚合酶(以上為Stratagene公司)及0.2 mM之dNTPs(Promega公司：C1141)之反應液，於變性90℃下進行變性反應1分鐘，再以變性98℃ 10秒、煉合60℃ 30秒、伸長68℃ 1分鐘之反應循環，進行20循環，而製作增幅DNA。
His－Thr－For[SpeI]：5'－GGTTACTAGTGGTTCTGGTCATCACCATCACCATCACTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGT－3'(序列編號60)
所得到之PCR產物，以1%瓊脂凝膠電泳將增幅之色帶回收，使用QIAEX－II(QIAGEN)套組進行回收。所回收之增幅DNA使用限制酵素SpeI及NotI加以消化，再與相同地以SpeI及NotI加以消化pET41a(＋)載體(Novagen公司)，進行結合反應(Quick DNA Ligation Kit(New England BioLab公司))，並進行選殖。該經選殖之DNA，與實施例5相同地進行DNA鹼基序列之解析，取得所導入之突變部分與其他鹼基序列無相異之選殖株，而能得到KR－AA突變株表現用之載體。關於表現、純化，係以與實施例5相同之方法來實施。所得到之KR－AA突變株之胺基酸序列係表示於序列編號61中。再者，Wt(正常NESFATIN)則係使用實施例5所製作者。將所得到之KR－AA突變株(Mut)及正常NESFATIN(Wt)之各聚胜肽各5 pmol，以與實施例6相同之方法投予至大鼠之第三腦室中。在投予1小時後、3小時後、6小時後及12小時後，藉由測定飼料之重量變化，算出其攝取量，並作為攝取行動之指標。
<結果>
在第三腦室中投予之控制群IgG、NAP－1 IgG(Nesfatin－1 IgG)、NAP－C1 IgG(Nesfatin－C1 IgG)或NAP－C2 IgG(Nesfatin－C2 IgG)之各群中，將投予後0~3小時間之攝食量示於圖13A之a－1，投予後3~6小時間之攝食量示於圖13A之a－2，投予後6~9小時間之攝食量示於圖13A之a－3。在0~3小時(圖13A之a－1)、3~6小時(圖13A之a－2)中，與控制群IgG投予之大鼠相比較，該在投予NAP－1 IgG(Nesfatin－1 IgG)之個體中，確認有統計上有意義之攝食量增加(0~3小時係P<0.001，3~6小時係P<0.05)之情形，惟在投予NAP－C1 IgG(Nesfatin－C1 IgG)或NAP－C2 IgG(Nesfatin－C2 IgG)之群中，則無法見到有對於Vehicle群之統計上有意義之攝食量差異。再於6~9小時間之結果上，控制群IgG群、NAP－1 IgG(Nesfatin－1 IgG)群、NAP－C1 IgG(Nesfatin－C1 IgG)群或NAP－C2 IgG(Nesfatin－C2 IgG)群之各群中，無法見到有統計上有意義之攝食量差異。根據此結果，顯示藉由對於NESFATIN－1之抗體，內在性之NESFATIN－1之功能被阻礙將可以使其攝食量增大。據此，除了實施例13檢測所檢測者，即NESFATIN－1胜肽在腦室內投予可具有攝食抑制作用以外，該具有阻礙NESFATIN－1功能之物質並具有攝食量增大之效果。
再者，將相當於重組老鼠NESFATIN(Wt)及胺基酸編號第84及第85個之Lys、Arg之序列，取代為Ala、Ala之序列之突變體(Mut)，以5 pmol投予至大鼠腦室內時所調查之攝食量上之影響，其結果係示於圖13B中。在圖13B中，b－1係表示投予後0~1小時之攝食量，b－2係表示投予後1~3小時之攝食量，b－3係表示投予後3~6小時之攝食量者。如b－1~b－3所示者，相對於在投予Wt(正常NESFATIN)5 pmol之大鼠中，各時段皆可確認有統計上有意義之攝食抑制活動，而在以原荷爾蒙轉化酶切斷之部位上有插入突變之NESFATIN(Mut)中，則無攝食上之抑制效果。據此，顯示為使NESFATIN能正常發揮其功能起見，NESFATIN－1以原荷爾蒙轉化酶等加以處理之過程係極為重要者。
實施例15 檢討對於NEFA基因之反意義RNA連續地投予至腦室內所造成攝食及體重上之影響
為將NESFATIN(NEFA)基因之表現與攝食及體重調節之關係，更進一步地詳細調查起見，將可抑制NESFATIN基因之表現之反意義RNA連續地投予至第三腦室內，並調查其造成之影響。
對於NESFATIN基因之反意義RNA，係使用夾有轉譯起始部位(translational start site)之序列之下述序列之RNA者。
NESFATIN反意義RNA 5－ATGGTCCTCCACCTCATCTTCAGAG－3(序列編號31)
NESFATIN反意義RNA之投予，係藉由滲透壓幫浦連續12日在腦室內進行投予。動物係使用約8週大之Wistar系雄性大鼠(由日本SLC購得)，選擇體重為200~250 g間之個體使用。大鼠中係以在腹腔中，以相當於體重1 kg投予40 mg之戊巴比妥鈉進行麻醉，將頭部去毛後將腦定位固定裝置(David Kopf公司，Mode 1962)加以固定，切開頭皮，將23G針(引導插管)在達到第三腦室之情形(前囪後方2.5 mm，表面9.5 mm)下留置固定。在該引導插管固定1週後，供於各實驗中。滲透壓幫浦係使用Alzet公司2002型，在使用前日起浸在生理食鹽水中進行滲調(priming)，並將先以0.22μm之Millex GV過濾器滅菌之NESFATIN錯義RNA溶解於生理食鹽水中之溶液(Antisense投予群)、或者同樣地滅菌之錯義RNA(ATCGTGCTCCACGTCATCTACACAG)溶解於生理食鹽水中之溶液(對照群)，在使用前注入滲透壓幫浦中。將注入有各樣品之滲透壓幫浦連接在接有注入用插管之管子上，首先通過包埋之引導插管，然後該注入用插管之前端再進入大鼠之第三腦室中而固定。在此種狀態之使用，係以每24小時12μl之速度將樣品注入第三腦室中，而反意義RNA及錯義RNA則各以每1日40μg之投予量注入。包埋有滲透壓幫浦之大鼠係以麻醉確認，裝入個別之籠中，並在其可以自由地攝取粉末飼料及飲用水之條件下進行飼育。攝食量之測定，係由將插管及滲透壓幫浦埋入之次日起，每日上午9點測量其所殘存之飼料重量，藉由求出與前日之飼料重量之差，而計算出一日(24小時)之攝餌量。然後，由投予開始6日後，在測定攝餌量時同時測定其體重，並就其體重之變化加以紀錄。
在投予開始後第12日將各群之個體犧牲，取出腦之視床下部並使用所萃取之樣品，以Nesfatin－1 Ab之西方墨漬法確認NESFATIN之表現。西方墨漬法，係以實施例3及12相同之方法進行。以西方墨漬法之呈色使其染色之色帶，則依密度法(Densitometry)測定色帶之濃度。
<結果>
對照群及投予NESFATIN反意義RNA之反意義投予群，其24小時之攝食量變化係示於圖14之A中，體重之變化則示於圖14之B中。攝食量(圖14之A)，係與對照群相比較，在反意義投予群中，由開始後第1日可確認有攝食量之增大情形，其攝食量在測定期間中(至投予後開始12日為止)則常有超越對照群之情形。此外，在體重之變化(圖14之B)中，投予開始後6日內，其體重係不論在對照群及反意義投予群皆無差別產生，惟自第7日起，在反意義投予群中，相較於對照群則可見到統計上有意義之體重增加(P<0.05)，且該差距在第9日至11日為止之測定期間則更加地擴大。使用在第12日被犧牲之大鼠視床下部，進行NESFATIN－1之西方墨漬法之解析，將其與對照組(依據密度法之色帶強度為14.3±1.2AU)相比較，發現反意義投予群(依據密度法之色帶強度為8.5±0.7AU)中有統計上有意義之NESFATIN－1表現減少之情形。根據此結果，NESFATIN反意義RNA投予至腦室內，可抑制NESFATIN－1之表現，攝食量及體重增加上亦確認有亢進之效果。
實施例16 以重組體進行之重組NESFATIN－1之製造
為將NESFATIN－1大量地加以調整起見，茲就使用重組體進行之重組NESFATIN－1之製造方法進行檢討。
取得老鼠NESFATIN－1之編碼基因，在其末端上結合GST(谷胱甘太－S－轉化酶)與組胺酸Tag之基因，在轉譯後之蛋白質中以組胺酸Tag之胺基酸序列及老鼠NESFATIN－1之胺基酸序列間，有凝血酵素切斷部位(－Leu－Val－Pro－Arg－Gly－Ser－)夾雜之形式下，構築該表現載體。老鼠NESFATIN－1之基因取得，係使用老鼠腦cDNA(Clontech公司)進行二次之PCR(Nested PCR)。第一次之PCR，係將以下之前置引子(mNucB2－F337：序列編號35)及反置引子(mNucB2－R712：序列編號36)，各以100 pM之濃度，並以Pyrobest DNA聚合酵素(寶生技(股)R005A)，使用添附之反應緩衝液及dNTP，依據添附之操作手冊進行反應。PCR反應係於90℃下進行反應1分鐘後，再以98℃ 10秒、68℃ 1分鐘之反應循環，進行30循環，然後再以68℃反應2分鐘之溫度條件進行。
前置引子(mNucB2－F337)：5’－GCACGCTGAC CGCTC TGGAAG－3’(序列編號35)反置引子(mNucB2－R712)：5’－CAAATGTGTT AGGAT TCTGGTGGTTCA－3’(序列編號36)
所得到之PCR產物係使用0.5μl，而第二次之PCR，以下之前置引子(mNucB2－N3[SacI－Thr])及反置引子(mNucB2－R389[NotI])係使用100 pM，與第一次之PCR相同地，使用Pyrobest DNA聚合酵素進行PCR反應。PCR反應係於90℃下進行反應1分鐘後，再以98℃ 10秒、60℃ 30秒、68℃ 1分鐘之溫度循環，進行20循環，然後再以68℃反應2分鐘之溫度條件進行。
前置引子(mNucB2－N3[SacI－Thr])：5’－GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTCCTATCGATGTGGACAAGACCAA－3’(序列編號37)反置引子(mNucB2－R589[NotI])：5’－GGTTGCGGCCGCTTACCTCTTCAGCTCATCCAGTCTCG－3’(序列編號38)
第2次之PCR所使用之PCR反應樣品，係以苯酚/氯仿萃取純化後，以限制酵素SacII及NotI切斷，進行瓊脂凝膠電泳，切下相當於約300 bp之帶(band)，以QIAEC－II套組(QIAGEN公司)純化，經純化之約300 bp之PCR產物，再與以限制酵素SacII及NotI切斷之pET41a(＋)質體載體(Novagen公司)，進行結合反應(Quick DNA Ligase Kit(New England BioLab公司))。將進行結合反應之載體導入大腸菌J409株中，就所得到之轉形體8個以小規模進行質體萃取，將使用所得到之質體並重組有NESFATIN－1基因之序列，藉由應用生物系統公司之BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction套組及ABI377型DNA定序儀(Perkin－Elmer公司)，進行鹼基序列之解析。其結果，得到一重組有具有NESFATIN－1序列之基因之表現載體，並命名為pET41a(＋)GST－His－LVPRGS－mNAP1。
將所得到之pET41a(＋)GST－His－LVPRGS－ mNAP1導入大腸菌BL21(DE3)Codon Plus RIPL中，使其表現，並進行GST．組胺酸Tag．凝血酵素切斷序列．NESFATIN－1之融合蛋白質(GST－His－LVPRGS－mNAP1)之表現。將pET41a(＋)GST－His－LVPRGS－mNAP1導入大腸菌BL21(DE3)Codon Plus RIPL中，將其於含有康納黴素之LB培養基中選擇而得到選殖株，而在10 ml之含有康納黴素之LB培養基中以37℃進行培養。培養則在該培養液在600 nm波長之吸光度達到0.8時點停止。將該培養液30 ml移至100 ml之含有康納黴素之LB培養基中，進而以37℃進行培養，於該培養液在600 nm波長之吸光度達到0.8時，加入1 ml之100 mM IPTG，而誘導蛋白質之表現。在添加IPTG後，再以37℃震盪培養3小時。將該培養液以8000 rpm離心分離20分鐘(4℃)，再回收大腸菌之菌體。
由所得到之大腸菌菌體萃取GST－His－LVPRGS－mNAP1融合蛋白質，使用鎳鉗合管柱(Ni－NTA agarose)進行純化。將菌體懸浮於20 ml之含有1倍濃度Complete－EDTA free(羅氏診斷公司)及0.5倍濃度之BugBuster(默克公司Novagen Cat.No.70584)之超音波震盪緩衝液(50 mM KH2 PO4 、50 mM NaCl、2 mM DTT、pH 7.5)中，於冰水中再進行10分鐘之超音波處理使其破碎。超音波處理後之樣品以15,000 rpm離心分離20分鐘，回收其上清液。將所得到之上清液10 ml，供於事先以Lysis緩衝液(50 mM NaH2 PO4 、300 mM NaCl、10 mM咪唑、pH 8.0)平衡過之1 ml之Ni－NTA瓊脂管柱中，進而以10 ml之洗滌緩衝液(50 mM NaH2 PO4 、300 mM NaCl、20 mM咪唑、pH 8.0)洗淨二次。將洗淨後之管柱以2.5 ml之洗滌緩衝液(50 mM NaH2 PO4 、300 mM NaCl、250 mM咪唑、pH 8.0)進行二次溶離，然後回收含有所溶離之GST－His－LVPRGS－mNAP1融合蛋白質之劃分。由剩下之菌體之萃取上清液亦進行同樣之處理，再回收含有GST－His－LVPRGS－mNAP1融合蛋白質之劃分。
由GST－His－LVPRGS－mNAP1融合蛋白質除去GST及組胺酸Tag之部分，進而純化，同時為除去具有發炎性物質作用之大腸菌衍生之脂多酶(lipopolysaccaride，LPS)起見，使GST－His－LVPRGS－mNAP1融合蛋白質在結合於GST樹脂之狀態下進行凝血酵素處理，以及逆向色層分析之純化。接著，此階段以後之處理之緩衝液，接使用業經確認為LPS者。將含有在Ni－NTA瓊脂管柱純化所得之GST－His－LVPRGS－mNAP1融合蛋白質之劃分7.2 ml，以1倍濃度之GST Bind/Wash緩衝液(默克Novagen Cat.No.70571)(相當於7.2 ml)洗淨，最後再添加於以3 ml GST Bind/Wash緩衝液懸浮之GST樹脂中(默克Novagen Cat.No.70541)(相當於7.2ml)，在20℃下攪拌少於1小時。以離心分離將樹脂回收後，將樹脂以36ml之GST Bind/Wash緩衝液洗淨，於洗淨後之樹脂上添加3.6 ml之溶解有20單位/ml凝血酵素之PBS加以懸浮，再於20℃之弱攪拌狀態下使其反應20小時。反應後之樹脂以各1.8 ml分注於孔徑為0.22μm之附有濾網(Millipore)之杯中，以3,000 rpm離心2分鐘，再回收經過濾之凝血酵素處理過之樣品。相對於所得到之凝血酵素處理過之樣品450μl，加入50μl之醋酸，而作為C18逆相色層分析法之樣品。逆相色層分析法係於0.1%三氟醋酸存在下以乙腈梯度之溶離法，該梯度係設定為10%乙腈：10分鐘/10至20%乙腈梯度：60分鐘/30至40%乙腈梯度：40分鐘/40至60%乙腈梯度：5分鐘。由管柱所溶離之蛋白質，係以測定波長280 nm之吸光度進行監控。再就以乙腈之梯度所溶離之劃分，以SDS－PAGE及西方墨漬法調查時，確認NESFATIN－1係於乙腈濃度為36.2%處被溶離出來。因此，回收該劃分，冷凍乾燥後，再度溶解於注射用蒸餾水中後加以使用，然後以吸光度測量蛋白質之濃度，以及ES法(生化學工業)來測定LPS之含量。
<結果>
由100 ml之培養液以Ni－NTA瓊脂純化之粗純化GST－His－LVPRGS－mNAP1係約7 mg，而以凝血酵素處理及C18逆相色層分析法高度純化之NESFATIN－1，其回收量則為約472.5μg。此外，經高度純化之NESFATIN－1所含有之LPS量，相對於1μg之NESFATIN－1，係約4 pg者。進而，將高度純化之NESFATIN－1，以與實施例13相同之方法投予至大鼠之腦室內時，確認具有對大鼠之攝食抑制及體重增加抑制效果。據此，藉由使用重組體進行表現及純化，顯示可以製造出具有活性之NESFATIN－1。
實施例17 藉由NESFATIN－1腦內投予所進行之Zucker fa/fa大鼠之第3腦室內投予對於攝食量調節之作用之檢討
如傳統技藝所記載者，在肥胖及/或肥胖症病患中，有很多對於瘦體素具有抵抗性之例子，從而亦成為病態或治療上之問題。因此，使用具有瘦體素抵抗性之病態模型動物之Zucker fa/fa大鼠(Michael等，Nature Genetics，1996年13卷，第18－19頁)，來檢討NESFATIN－1在攝食量調節上之效果。
大鼠係使用8週大之雄Zucker fa/fa(Zucker)系大鼠以及對照動物之Zucker ＋/＋(Lean)系大鼠，由日本日本查爾斯．李弗購得，以購入後上午6點至下午6點間之12小時進行照明，並以下午6點至隔日上午6點間之12小時保持黑暗之週期下，給予粉末飼料(日本克雷爾公司，CE－2)，在22℃下進行飼育，並且實驗期間亦以同樣之條件進行飼育。購入之大鼠在1週以上之預備飼育後，由9至10週大之個體中選擇體重200~250 g間之個體在實驗上使用。
投予上使用之樣品，係將實施例16所製作之重組大鼠NESFATIN－1以每5μl PBS含有5 pmol之形式加以溶解而使用，控制組之樣品則僅使用生理食鹽水(Saline)。所調製之樣品，將Zucker大鼠及Lean大鼠以5隻為一群(Zucker/NESFATIN－1群、Lean/NESFATIN－1群、Zucker/Saline群、Lean/Saline群)，而在各大鼠之第三腦室內各投予5μl。投予時期，係於攝食行動在進入亢進食期前進行，而投予之技術則以與實施例6之方法相同地進行。
在腦室內投予後，於各大鼠之0~1小時、1~3小時、及3~6小時之間，測定粉末飼料之減少重量而來測定其攝食量。此外，在統計上有意義之差之檢定，則係以分散分析(analysis of variance)來進行。
<結果>
圖15之A，係表示對於Lean大鼠投予NESFATIN－1之群(Lean/NESFATIN－1群)及投予生理食鹽水之群(Lean/Saline群)，其攝食量之測定結果；圖15之B，係表示對於Zucker大鼠投予NESFATIN－1之群(Zucker/NESFATIN－1群)及投予生理食鹽水之群(Zucker/Saline群)，其攝食量之測定結果。在控制組動物之Lean大鼠之結果(圖15之A)中，其投予後0~1小時及1~3小時之攝食量，與Saline群相比較時，在NESFATIN－1投予群均確認有降低之情形(P<0.001)。此外，3~6小時間則無攝食量上之差。即使在對瘦體素具抵抗性之模型動物之Zucker中，其與Lean同樣地，在投予後0~1小時及1~3小時之攝食量，與Saline群相比較時，在NESFATIN－1投予群均確認有統計上有意義之攝食量降低之情形(P<0.001)。再者，3~6小時間亦確認有統計上有意義之攝食量降低之情形(P<0.05)(圖15之B)。據此，顯示NESFATIN－1之攝食抑制作用係不藉由瘦體素之作用而發生其功能，即使在有瘦體素抵抗性之狀態下亦有其效果。
實施例18 藉由NESFATIN－1在老鼠腹腔內投予所進行之對於攝食量調節之作用之檢討
藉由在大鼠腦室內投予之實驗，顯示NESFATIN及NESFATIN－1係參與攝食量之調節者，惟為檢討在其他之動物種類之效果，而進行在老鼠之投予實驗。再者，考慮到實際上作為醫藥品之實用性，而認為末梢投予亦能具有效果將十分重要，而選擇以腹腔作為投予路徑而進行投予。進而，在藉由Agouti蛋白質之過剩表現，而能使MC3R/MC4R之攝食抑制功能被阻礙之肥胖模型動物，亦即在Agouti－黃(C57BL/6J－Ay /a)老鼠上亦進行投予試驗。
實驗動物係採用7週大之雄性ICR系老鼠，由日本SLC(股)購入，以購入後上午6點至下午6點間之12小時進行照明，並以下午6點至隔日上午6點間之12小時保持黑暗之週期下，給予粉末飼料(日本克雷爾公司，CE－2)，在22℃下進行飼育，並且實驗期間亦以同樣之條件進行飼育。購入之大鼠在1週以上之預備飼育後，由8至9週大之個體中選擇體重35~40 g間之個體在實驗上使用。
投予上使用之樣品，係將實施例16所製作之重組老鼠NESFATIN－1以每200μl生理食鹽水中各含有2 nmol、10 nmol、或50 nmol之量之形式加以溶解而使用，控制組之樣品則僅使用生理食鹽水(Saline)。樣品係以附有25G之注射針之圖倍爾格林注射筒，對於各老鼠(每群5隻)之腹腔中各進行200μl之單次投予，投予時間則於進入黑暗期之前(下午6點)進行。
另在肥胖模型動物之實驗中，對照群係使用C57BL/6J系之老鼠，而肥胖模型動物則使用Agouti－黃老鼠，這些動物皆自日本查爾斯．李弗(Jackson Lab.)購得。飼育條件，所使用老鼠之週齡等係與ICR老鼠同樣，惟對照群老鼠係選擇體重25~28 g之個體，Agouti－黃老鼠則係選擇體重31~38 g之個體。投予上所使用之樣品，係將重組老鼠NESFATIN－1以每200μl生理食鹽水中含有10 nmol之量之形式加以溶解而使用，控制組之樣品則僅使用生理食鹽水(Saline)(每群16隻)。其他之條件則與上述相同地進行。
投予後之各隻老鼠放回各自之籠內，測定投予後0~3小時之間粉末飼料之減少重量而來測定其攝食量。此外，在統計上有意義之差之檢定，則係以分散分析(analysis of variance)來進行。
<結果>
在ICR老鼠之腹腔內投予NESFATIN－1或生理食鹽水時，其投予後0~3小時之攝食量之測定結果係如圖16之A所示。在圖16之A之結果中，係將NESFATIN－1以每隻老鼠2 nmol、10 nmol、及50 nmol投予至老鼠中，而其與控制組(Saline群)相比較，確認有攝食量降低之情形，特別是在10 nmol(p<0.05)及50 nmol(p<0.005)中，確認有統計上有意義之攝食量降低之情形。據此，顯示NESFATIN－1不僅在大鼠，即使在老鼠亦顯示有攝食抑制之情形，在很多種類上與攝食之調節作用有關，並且不僅在腦內，即使在由腹腔等未梢所進行之投予亦能對於攝食抑制作用發揮其效果。並且，NESFATIN－1即使在投予至腹腔內時，亦顯示在投予後早期具有攝食抑制之效果。
再者，在肥胖模型老鼠之實驗中，將生理食鹽水(Cont)或NESFATIN－1(10 pmol)投予至對照群之老鼠(C57BL/6J)中，其攝食量之測定結果係如圖16之B所示；而在肥胖模型老鼠之實驗中，將生理食鹽水(Cont)或NESFATIN－1(10 pmol)投予至Agouti－黃老鼠中，其攝食量之測定結果則係如圖16之C所示者。其結果，係不論在對照群之老鼠或Agouti－黃老鼠中，腹腔內有投予NESFATIN－1之老鼠相較於控制組，其攝食量均有統計上有意義之降低情形。因為Agouti－黃老鼠藉由Agouti蛋白質之過剩表現，而MC3R/MC4R配位子之黑素皮質素(melanocortin)所導致之攝食抑制無法作用之肥胖模型，其顯示即使在老鼠之投予實驗中，在實施例17之Zucker(fa/fa)大鼠之結果上有顯示瘦體素抵抗性之模型具有藥理活性；同樣地，其應係藉由與已知之Agouti/黑素皮質素系之攝食抑制為彼此獨立之機制來進行攝食之調節者。
實施例19 NESFATIN－1在老鼠之腹腔內投予以及皮下投予時對於攝食量調節之作用之檢討
在實施例18中，揭示了NESFATIN－1即使在老鼠腹腔內投予時，亦有攝食抑制作用上之效果，惟在此另以NESFATIN－1在皮下投予之效果，作為其他末梢投予之例子。
投予上使用之樣品，係將實施例16所製作之重組老鼠NESFATIN－1以每200μl生理食鹽水中含有10 nmol之量之形式加以溶解而使用，控制組之樣品則僅使用生理食鹽水(Saline)。樣品係以附有25G之注射針之圖倍爾格林注射筒，對於各老鼠之腹腔或背部皮下中各進行200μl之單次投予，投予時間則於進入黑暗期之前(下午6點)進行。其餘條件，悉與實施例18相同地進行。
<結果>
在老鼠之腹腔內(ip)或皮下(sc)投予NESFATIN－1(10 nmol)或生理食鹽水(0)時，其0~3小時之攝食量之測定結果係如圖17之A所示；0~14小時之攝食量則係如圖17之B所示。在圖17之A中，相對於生理食鹽水投予群(0)，將10 nmol NESFATIN－1投予至腹腔內(ip)及皮下(sc)之群中，可見到攝食量有降低之傾向，特別在腹腔內投予群確認有統計上有意義(P<0.05)之降低情形。在圖17之B中同樣地，相對於生理食鹽水投予群(0)，將10 nmol NESFATIN－1投予至腹腔內(ip)及皮下(sc)之群中，可見到攝食量有降低之傾向，惟在腹腔內(ip)投予群則無統計上有意義(P<0.005)之攝食量降低情形，確認在皮下(sc)投予群中相對於生理食鹽水投予群有統計上有意義之降低情形。在圖17之A及B之結果中，在腹腔內投予NESFATIN－1者，有在早期即有攝食抑制效果之傾向；而在皮下投予者，則有略為遲延之傾向。基此，在末梢投予中，顯示不僅在腹腔內投予，即使在皮下投予上，NESFATIN－1均具有攝食抑制效果。此外，對於在腦發生作用之藥劑而言，其末梢投予是否能得到效果在實用上將相當重要，關於此點，NESFATIN－1基於實施例18及19之結果即具有作為醫藥品使用之有用性者。
實施例20 NESFATIN－1之部分胜肽(NESFATIN－IN23、NESFATIN－1M30、NESFATIN－1C29)在老鼠腹腔內投予所產生之攝食調節上作用之檢討
在實施例10及12中，係由NESFATIN中之原荷爾蒙轉化酶之切斷部位，而達成了NESFATIN－1之發明。然而，在NESFATIN－1之功能解析上，特定出該聚胜肽之功能部位係十分重要者，並且，在醫藥品之應用上，該胺基酸係以長度較短者基於製造、投予量、抗原性等之觀點而較有利。因此，進而由該82個胺基酸長度所成之NESFATIN－1構造中，深入地檢討其具有攝食抑制活性之部位，從而製作了NESFATIN－1之部分胜肽，並將其投予至老鼠之腹腔內進行測定攝食量之實驗。
在衍生自老鼠NESFATIN序列，老鼠NESFATIN－1之胺基酸序列(序列編號14)中，將胺基酸末端開始之胺基酸編號進行命名，亦即各將1至23之序列命名為NESFATIN－IN23，24至53命名為NESFATIN－1M30，54至82則命名為NESFATIN－1C29。
NESFATIN－1N23：ValProIleAspValAspLysThrLysValHisAsnThrGluProValGluAsnAlaArgIleGluPro(序列編號42)NESFATIN－1M30：ProAspThrGlyLeuTyrTyrAspGluTyrLeuLysGlnValIleGluValLeuGluThrAspProHisPheArgGluLysLeuGlnLys(序列編號41)NESFATIN－1C29：AlaAspIleGluGluIleArgSerGlyArgLeuSerGlnGluLeuAspLeuValSerHisLysValArgThrArgLeuAspGluLeu(序列編號43)
NESFATIN－IN23、NESFATIN－1M30、NESFATIN－1C29之各聚胜肽，係向BIOLOGICA(股)公司購得，以HPLC法在95%以上之純度下作成之合成胜肽加以使用。各聚胜肽，係各以每200μl生理食鹽水中含有50 nmol之量之形式加以溶解而使用，控制組之樣品則僅使用生理食鹽水(Vehicle群)作為樣品而使用。樣品係以附有25G之注射針之圖倍爾格林注射筒，對於各老鼠(每群5隻)之腹腔中各進行200μl之單次投予，投予時間則於進入黑暗期之前(下午6點)進行。老鼠係使用雄性ICR系大鼠(由日本SLC購得)，其飼育及實驗條件悉與實施例18相同地進行飼育。
在投予後將各老鼠分別地置入籠內，測定0~3小時之間粉末飼料之減少重量而來測定其攝食量。此外，在統計上有意義之差之檢定，則係以分散分析(analysis of variance)來進行。
再者，並以人類、大鼠及老鼠之NESFATIN－1之胺基酸序列之排列比對(alignment)來進行比較。使用人類NESFATIN－1(序列編號13)、老鼠NESFATIN－1(序列編號14)及大鼠NESFATIN－1(序列編號15)之胺基酸序列，而依據CLUSTAL－W法(Higgins等人，Nucleic Acids Research，1994年22卷，第4673－4680頁)進行比對。
<結果>
在老鼠腹腔內投予生理食鹽水(Vehicle群)、NESFATIN－1N23(－N23)、NESFATIN－1M30(－M30)、NESFATIN－1C29(－C29)之各群，其投予後0~3小時之攝食量之測定結果，係示於圖18A中。與投予生理食鹽水之控制組群(Vehicle群)相較，投予NESFATIN－1M30之群(N－1b)中，則確認有統計上有意義(P<0.02)之攝食量降低之情形。然而，在投予NESFATIN－1N23(N－1a)之群及投予NESFATIN－1C29(N－1c)之群中，則確認無確認有統計上有意義之攝食量降低或亢進之情形。據此，顯示NESFATIN－1M30對於NESFATIN－1(以及NESFATIN)之攝食抑制活性，係最為重要之功能上部位。此外，由於NESFATIN－1M30藉由腹腔內投予亦可見到攝食抑制活性之故，顯示該聚胜肽亦在醫藥品上有實用化之可能。
再者，人類、老鼠及大鼠之NESFATIN－1之胺基酸序列之排列比對之結果，與NESFATIN－1N23、NESFATIN－1M30、及NESFATIN－1C29之部位係示於圖18B中。顯示NESFATIN－1M30之部位在各種之間，其胺基酸序列有被高度地保存者。
實施例21 EIA系之構築及視床下部組織中NESFATIN－1胜肽之檢測
在實施例11中，基於大鼠視床下部細胞中，對於NESFATIN－1之抗體(Nesfatin－1 IgG)以及對於原荷爾蒙轉化酶(PC1/3及PC2)之抗體之結果，顯示NESFATIN及原荷爾蒙轉化酶有可能在同一細胞中表現，而產生NESFATIN－1。為就其進而加以檢討起見，構築可檢測NESFATIN或NESFATIN－1之競合EIA系，進而將由大鼠視床下部組織中萃取之樣品，以HPLC進行分劃之圖型及以合成所製作之NESFATIN－1之圖型，加以比較。
競合性EIA系，係將實施例10所製作之Nesfatin－1 IgG及經生物素標識之NESFATIN－1胜肽，來進行製作。將溶解有10μg/ml Nesfatin－1 IgG之PBS各以50μl/井分注至96井之ELISA盤(住友貝克萊：MS－8596F)中，將盤密封並於4℃下靜置一夜，以使抗體固定化。抗體已被固定化之盤以PBS將各井洗淨後，將含有10%牛血清白蛋白(BSA)之PBS以250 μ l/井各自地進行分注，並於室溫下放置2小時。其後，將盤之各井以PBS洗淨3次後，製作成抗體固定化盤。
為製作經標識化之NESFATIN－1起見，製作一在NESFATIN－1之C末端附加有半胱胺酸殘基之形式之NESFATIN－1(NESFATIN－1 Cys：序列編號62)。製作之方法係與實施例16相同，惟為取得NESFATIN－1 Cys之編碼核酸之PCR，則以下述引子組件進行。
前置引子：5’－GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTCCTATCGATGTGGACAAGACCAA－3’(序列編號63)反置引子：5’－GGTTGCGGCCGCTTAACACCTCTTCAGCTCATCCAGTCTCG－3’(序列編號64)
將與實施例16所記載之方法同樣地進行表現、純化之NESFATIN－1 Cys，溶解於含有50 mM之2－巰基乙醇胺、1 mM之EDTA之0.1 M磷酸緩衝液(pH 6.0)中，在37℃下處理90分鐘後，加入0.1%三氟醋酸(TFA)，供於Sep－PakC18管柱(Waters公司)，將管柱以0.1%TFA、10%乙腈水溶液10 ml洗淨後，再以3 ml之0.1%TFA、60%乙腈水溶液溶離。溶離物於冷凍乾燥後，溶解於0.1 M磷酸緩衝液(pH 7.0)中使成5 mg/ml，再於其中加入以1/40容積之二甲基甲醯胺(DMF)溶解之20 mg/ml之生物素(Long Arm)Maleimide(VECTOR Lab.)，室溫下使其反應3小時。以生物素(Long Arm)Maleimide使之反應之NESFATIN－1 Cys，加入TFA使成0.1%，並供於裝置有逆相C18管柱(納可來蒂斯克公司：COSMOSIL(登錄商標)5C18－AR－300 20.0 mml.D.×150 mm)之HPLC中，以210 nm下波長之吸光度進行監控，再以0.1%TFA水溶液，進而以含有0.1%TFA之20%乙腈水溶液加以洗淨，直至無法確認出溶離物之吸光度為止，其後，加入20~60%乙腈梯度之水溶液，再取出在210 nm之吸光度具有最大峰部之劃分。所得到之劃分於冷凍乾燥後溶解於PBS中，再將其作為標識化之NESFATIN－1而使用。
將標識化之NESFATIN－1溶解於含有2%BSA之PBS中使成1μg/ml者。標準曲線之作成係將實施例16所製作之重組NESFATIN－1，以含有2%BSA之PBS稀釋使成6000 ng/ml之濃度者，再將其以含有2%BSA之PBS稀釋成二倍公比後加以使用。(標準樣品：6000、3000、1500、750.0、375.0、187.5、93.8 ng/ml)。所製作之標識化之NESFATIN－1及標準樣品，以各50μl加入微測試管中並加以混合，再以各50μl分注於抗體固定化盤之井中。然後，將作為生體樣品之例子之取自大鼠之髓液，直接或另以含有2%BSA之PBS稀釋成二倍之樣品，以50μl再加上標識化之NESFATIN－1溶液50μl，於沒有微測試管下進行混合，將各50μl分注於抗體固定化盤之井中(檢體)。分注後之抗體固定化盤於室溫下靜置1小時後，捨棄井中之反應樣品，並以含有0.2%之Tween－20之PBS洗淨三次。其後，以含有2%之BSA及0.2%之Tween－20之PBS稀釋成1/1,000之Avidin－Peroxidase(Sigma公司A7419－2ML)分注於各井中50μl，再靜置於室溫下30分鐘。反應後，除去各井之溶液，以含有0.2%之Tween－20之PBS洗淨四次後，再以TBS(50mM Tris－HCl，0.15M NaCl，pH 8.0)洗淨二次。在洗淨後之抗體固定化盤之各井中，加入50μl之Peroxidase基質之TMB(PIERCE公司：1－Step(登錄商標)TurboTMB)，於室溫下使其反應30分鐘。其後，於各井中加入50μl之0.5N硫酸使反應停止，並以吸光盤讀取器測定450 nm波長之吸收及620 nm波長之吸收，再將450 nm波長之吸光度至620 nm波長之吸光度之差額(450(△620)nm)，作為測定值而使用。
視床下部之NESFATIN－1表現之解析，係將由組織萃取之胜肽作為樣品，再進行HPLC分劃而實施。由8隻大鼠之腦中切下視床下部，在4 ml之0.1%TFA水溶液中以鐵弗龍(登錄商標)均質器進行均質，再以10,000 rpm離心分離10分鐘回收其上清液。所回收之上清液以0.45 μm孔徑大小之濾膜(Millipore公司)過濾後，通過Sep－PakC18管柱(Waters公司)，再將該管柱以5 ml之0.1%TFA水溶液洗淨。其後，管柱以3 ml之60%乙腈水溶液溶離，將該溶離物以氣化器使之乾燥。將該乾燥物溶解於0.8 ml之0.1%TFA水溶液中，並以10,000 rpm離心分離10分鐘，將該上清液500μl注入於裝置有C18逆相色層分析管柱(納可來蒂斯克公司：COSMOSIL %C18－AR－II，4.6 mmI.D.×250 mm)之HPLC中。在注入後，將溶離物以224 nM下波長之吸光度進行監控，再以1 ml/分鐘之流速之0.1%TFA水溶液流動以洗淨管柱。洗淨後，在原流速下，以0.1%TFA存在下，0至60%乙腈之濃度梯度(△1%/分鐘)之溶液，將溶離物以1 ml之劃分進行回收。所得到之劃分於－80℃冷凍後，進行冷凍乾燥，乾燥後之樣品再各以含有2%BSA之200μl PBS進行溶解，並以EIA法測定該NESFATIN．NESFATIN－1。同樣地，由8隻大鼠所回收之髓液600μl進行乾燥之樣品，製作胜肽樣品，以HPLC進行分劃，再將所溶離之劃分以競合EIA系進行檢討。再者，控制組係將實施例16所製作之重組NESFATIN－1胜肽80μg溶解於100μl之0.1%TFA水溶液中，注入HPLC中，再檢測有NESFATIN－1溶離之劃分。
<結果>
以競合EIA系之標準樣品之測定，所得到之標準反應曲線係如圖19A－1所示。因反應之NESFATIN－1濃度之上升所致競合性標識化NESFATIN－1之結合受阻礙，從而450(△620)nm之吸光度會減少，顯示藉由此系統可測定樣品中之NESFATIN－1濃度。此系中之感應程度係相當於4.6 ng/管(93 ng/ml)。以此競合EIA系測定髓液之NESFATIN－1(NESFATIN)之濃度之結果，係示於圖19A－2中。將髓液直接或稀釋成1/2所測定(以測定後稀釋率換算)之值，係幾乎相同值，顯示存在有約230 ng/ml之NESFATIN－1(NESFATIN)。
將由大鼠之視床下部所萃取之胜肽樣品，以HPLC進行劃分，將該劃分以競合EIA測定NESFATIN－1之存在時，其結果係示於圖19B之b－1中；而由大鼠髓液髓所萃取之胜肽樣品，同樣進行檢討之結果則示於圖19B之b－2中。確認圖19B之b－1及圖19B之b－2二者，皆在第44至45個劃分中，有被認為係NESFATIN－1之競合EIA系中之反應峰部出現。再者，將重組NESFATIN－1以HPLC在同樣之條件下進行分劃時，其結果仍然在第44個劃分中有NESFATIN－1溶離，因此考慮在視床下部及髓液之HPLC分劃中，於競合EIA系下顯示有存在之因子，應係NESFATIN－1者。
實施例22 NESFATIN－1M30之部分胜肽(NESFATIN－1M16、NESFATIN－1M14、及NESFATIN－1M10M)在老鼠腹腔內投予所產生攝食調節上作用之檢討
在實施例20中，由NESFATIN－1所衍生之部分胜肽在攝食抑制作用上之檢討，而發現了NESFATIN－1M30。進而，為了在該30個胺基酸長度所成之結構中，對於具有攝食抑制活性之部位進一步檢討起見，製作了NESFATIN－1M30之部分胜肽，並就其在投予至老鼠之腹腔內時，進行攝食量測定之實驗。
由老鼠NESFATIN－1M30之部分胜肽之16個胺基酸長度所構成之NESFATIN－1M16，由14個胺基酸長度所構成之NESFATIN－1M14，由10個胺基酸長度所構成之NESFATIN－1M10M，係將下述之序列者，向株式會社BIOLOGICA訂購，並以HPLC法作成95%以上純度之合成胜肽而使用。
NESFATIN－1M16：N－ProAspThrGlyLeuTyrTyrAspGluTyrLeuLysGlnValIleGlu－C(序列編號71)NESFATIN－1M14：N－ValLeuGluThrAspProHisPheArgGluLysLeuGlnLys－C(序列編號72)NESFATIN－1M10M：N－LysGlnValIleGluValLeuGluThrAsp－C(序列編號73)
所製作之各胜肽，係以10 pmol溶解於100μl生理食鹽水之形式作為投予用之樣品，而控制組(Cont.)則僅使用生理食鹽水。控制組之生理食鹽水及所調製之胜肽樣品，係以每隻老鼠在腹腔內投予100μl而進行(每群n＝6)。老鼠係使用雄性ICR系大鼠(由日本SLC購得)，其飼育及實驗條件悉與實施例18相同地進行飼育。
在投予後將各老鼠分別地置入籠內，測定0~3小時之間粉末飼料之減少重量而來測定其攝食量。此外，在統計上有意義之差之檢定，則係以分散分析(analysis of variance)來進行。
<結果>
將NESFATIN－1M30之部分胜肽之NESFATIN－1M16(M16)、NESFATIN－1M10M(M10M)、及NESFATIN－1M14(M14)在老鼠腹腔內投予時，其投予後0~3小時之攝食量係如圖20所示。相較於僅投予生理食鹽水之控制組(Cont.)，確認了投予NESFATIN－1M16(M16)、NESFATIN－1M10M(M10M)、及NESFATIN－1M14(M14)之群組中，其攝食上產生了統計上有意義之抑制效果。
實施例23 人類NESFATIN－1M30及老鼠NUCB1－M30對於攝食調節上作用之檢討
在實施例20中係顯示了有關老鼠之NESFATIN－1M30具有攝食抑制之作用者。據此，茲製作人類NESFATIN－1M30，檢討其在投予至人類時對於攝食行動之作用。再者，Nucleobindin－1(NUCB1)係與NEFA/NESFATIN在胜肽之胺基酸序列及基因之鹼基序列上，可形成高相同性之家族之因子。因此，製作一相當於NUCB1之NESFATIN－1M30之部位之NUCB1－1M30，並檢討其投予至老鼠時對於攝食產生之作用。
人類NESFATIN－1M30(序列編號39)及老鼠NUCB1－M30係以化學合成法向股份有限公司BIOLOGICA訂購而合成，並取得純化為95%以上者。
人類NESFATIN－1M30：N－ProAspThrGlyLeuTyrTyrAspGluTyrLeuLysGlnValIleAspValLeuGluThrAspLysHisPheArgGluLysLeuGlnLys－C(序列編號39)老鼠NUCB1－M30：N－ProAspThrGlyLeuTyrTyrHisArgTyrLeuGlnGluValIleAsnValLeuGluThrAspGlyHisPheArgGluLysLeuGlnAla－C(序列編號103)
所製作之人類NESFATIN－1M3o及老鼠NUCBl－M30係以各10 pmol溶解於100μl生理食鹽水之形式作為投予用之樣品。此外，確認有攝食抑制活性之老鼠NESFATIN－1M30，係將實施例20所製作者以與NESFATIN－1M30及NUCB1－M30同樣之用量而作為比較樣品而使用，控制組(Vehicle)則僅以生理食鹽水作為樣品。
控制組之生理食鹽水及所調製之胜肽樣品，係以每隻老鼠在腹腔內投予100μl而進行(每群n＝6)。老鼠係使用雄性ICR系大鼠(由日本SLC購得)，其飼育及實驗條件悉與實施例18相同地進行飼育。
在投予後將各老鼠分別地置入籠內，測定0~3小時之間粉末飼料之減少重量而來測定其攝食量。此外，在統計上有意義之差之檢定，則係以分散分析(analysis of variance)來進行。
此外，對於人類．大鼠．老鼠之NESFATIN及人類．大鼠．老鼠之NUCB1，進行其胺基酸序列之比對。其方法係使用序列編號2、序列編號5及序列編號8之各人類．老鼠．大鼠之NESFATIN之胺基酸序列，以及序列編號84、序列編號88及序列編號92之各人類．大鼠．老鼠之NUCB1之胺基酸序列，而以ClustalW法進行解析。
<結果>
將人類NESFATIN－1M30(人類/NESFATIN－1M30)、老鼠NESFATIN－1M30(老鼠/NESFATIN－1M30)、或老鼠NUCB1－M30(老鼠NUCB1)進行投予時，其投予後0~3小時之攝食量之測定結果係如圖21A所示。在圖21A中，相較於僅投予生理食鹽水之控制組(Vehicle)，確認了投予人類NESFATIN－1M30(人類/NESFATIN－1M30)、老鼠NESFATIN－1M30(老鼠/NESFATIN－1M30)、或老鼠NUCB1－M30(老鼠NUCB1)之群組中，整體而言其攝食上產生了統計上有意義之抑制效果。
再者，人類．大鼠．老鼠之NESFATIN及人類．大鼠．老鼠之NUCB1，其胺基酸序列之比對結果，以及相當於NESFATIN－1之部位及相當於NESFATIN－1M30之部位，係揭示於圖21B~21C中。各種類中相當於NESFATIN及NUCB2之NESFATIN－1之部位，特別在相當於NESFATIN－1M30之部位中，顯示其具有高度之胺基酸序列之保存性。
實施例24 大鼠視床下部之NESFATIN基因表現部位之檢討
在實施例8中係以原位雜合反應法針對腦視床下部之NESFATINmRNA之表現進行解析，惟為進一步就NESFATIN基因之表現部位加以詳細解析起見，茲以使用放射線偵測探針之原位雜合反應法進行檢討。
使用在可自由攝餌狀態下所飼育之8週大雄性正常Wistar系大鼠(由日本SLC購得)(體重220~250 g)，在照明狀態下將大鼠以戊基巴比妥鹽使其深度麻醉，由心臟將溶解於冰冷0.1 M硼酸緩衝液(pH 9.5)之4%多聚甲醛還流使腦固定。自大鼠將其腦取出，以含有10%蔗糖及4%多聚甲醛之0.1 M硼酸緩衝液(pH 9.5)浸漬二日。所固定之腦以乾冰－丙酮冷凍，使用組織切片機製作20μm厚度之切片，再置於載玻片(松浪玻璃製之MAS塗佈載玻片S－9116)上風乾。
放射線偵測之標識探針，其製作係將實施例2使用之NEFA探針製作用之質體，以限制酵素NcoI切斷後再純化之該質體，取0.1μg而使用，加入19μl之含有36 mM Tris鹽酸緩衝液(pH 7.5)、6 mM鹽酸鎂、2 mM亞精胺、8 mM二硫蘇糖醇、25 mM腺核苷3磷酸/鳥核苷3磷酸/胞嘌呤3磷酸、5 mM尿嘧啶3磷酸及5 mM[α－35S]－尿嘧啶3磷酸及1U RNAsinRibonuclease Inhibitor(Promega公司，N2111)之溶液之條件下，加入20U(1μl)之SP6 RNA聚合酵素(Promega公司，P1085)，使其於37℃下反應60分鐘，而製作35S標識化NEFA cRNA探針。在反應後，加入20μl之TNE緩衝液(10 mM Tris－Cl、pH 8.0，0.5M Nacl及0.25 mM EDTA、pH 8.0)使反應停止，再使用NENSORBT M PREP核酸純化卡匣(PerkinElmer,Inc.NLP028001EA)，根據添附之操作手冊進行探針之純化。
所製作之切片標本之載玻片，於進行雜合反應前先行在真空中靜置一夜使其乾燥，其後，以含有10μg/ml之蛋白質酵素K(Sigma公司，P2308)之PBS，於37℃下處理30分鐘後，再以PBS洗淨二次，進而於含有0.25%無水醋酸之0.1 M三乙胺－鹽酸緩衝液(pH 8.0)浸漬處理10分鐘，然後再以2倍濃度之SSC洗淨二次。所洗淨之切片標本依75%乙醇、95%乙醇、99%乙醇之順序脫水後，將其風乾，再於真空中使其乾燥。
所乾燥之切片標本之載玻片，在腦組織切片可被覆蓋之情形下，加入原位雜合反應液(10 mM Tris－HCl緩衝液pH 8.0、30 mM NaCl、10%硫酸葡聚糖、1倍濃度Denhardt’s液、12 mM EDTA、50%脫離子化甲醯胺、0.5 mg/ml酵母tRNA)，在65℃下進行1小時之雜合反應。將雜合溶液丟棄後，以每片載玻片加上80μl之含有106 cpm/ml之35S標識化NEFA cRNA探針及10 mM二硫蘇糖醇之雜合反應液，蓋上蓋玻片置入濕潤箱並於65℃下進行一夜之雜合反應。雜合反應後之載玻片以4倍濃度之SSC洗淨4次後，再以含有20μg/ml之RNAase A之TNE緩衝液(10 mM Tris－Cl、pH 8.0、0.5M NaCl；及0.25 mM EDTA、pH 8.0)於37℃下處理30分鐘，再於室溫下以2倍濃度之SSC洗淨二次，進而在65℃下以0.1倍濃度之SSC在30分鐘內洗淨二次。所洗淨之載玻片依75%乙醇、95%乙醇、99%乙醇之順序脫水後，將其風乾。置有該組織切片之載玻片於X射線下照射7日使其感光後，再浸漬於以水稀釋成2倍之感光乳液(Kodak公司，NTB3)中，使其感光3週。感光後之載玻片以水洗後，以硫菫進行染色，並以顯微鏡觀察因感光所產生之黑點。
此外，大鼠腦中之各部位置之鑑定，係依據巴基思諾(Paxinos G)及華生(Watoson C)所著The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.(Academic Press出版)(USA)1986年記載之方法進行。
<結果>
圖22之A表示含有室傍核(PVN)及視床上核(SON)之組織切片，圖22之B表示含有不確帶(Zi)及弓狀核(Arc)之組織切片，圖22之C表示含有視床外側野(LHA)之組織切片，其各自之原位雜合圖。在PVN、SON、Zi、Arc、LHA之各區域中，放射線標識之NEFA cRNA探針因可見感光暗點而有雜合情形，並且確認NEFA基因有表現。
實施例25 NESFATIN在大鼠腦內之投予而對於攝食行動上作用之檢討
在實施例6中係檢討大鼠在NESFATIN投予後0~1小時/1~3小時/3~6小時之攝食量，惟在此進一步就投予後6~12小時間攝食行動上之作用加以檢討。
實驗上為顯示實施例6之再現性起見，與實施例6同樣地，將重組NESFATIN各以0(僅PBS)、1、4、20 pmol投予至第三腦室內時，測定其投予後0~1小時間之攝餌量。此外，以與實施例6同樣之方法，將5 pmolNESFATIN投予至大鼠腦室內後，測定其在0~1小時/1~3小時/3~6小時及6~12小時之攝餌量。此外，對照群係僅使用生理食鹽水之群組(0 pmol)。再者，在統計上有意義之差之檢測上，係使用分散分析(analysis of variance)者。
<結果>
如圖23之A所示者，NESFATIN在腦室內投予4 pmol或20 pmol時之0~1小時之攝食量，係相較於對照群(0 pmol)而言，確認有統計上有意義之攝餌量降低之情形(p<0.01)者。再如圖23之B所示者，將5 pmol之NESFATIN投予至腦室內之個體，係相較於對照群(0 pmol)而言，確認在0~1小時(p<0.01)、1~3小時(p<0.05)、3~6小時(p<0.001)，有統計上有意義之攝餌量降低之情形者。然而，關於6~12小時間之攝餌量，投予5 pmol之NESFATIN之群組與對照組相比較，則無差異可得確認。
實施例26 飢餓狀態下大鼠之視床下部部位中NESFATIN mRNA及NESFATIN－1胜肽之表現量之檢討
為檢討飢餓狀態下NESFATIN基因之表現，在經過自由攝食及絕食之大鼠腦之視床下部區域中進行原位雜合反應，並測定其自組織至弓狀核、室傍核、外側野、視床上核之NESFATIN mRNA量之增減。此外，為測定同樣進行絕食之室傍核之NESFATIN－1胜肽表現量起見，將經過自由攝食及絕食之大鼠腦之視床下部區域切下，並將萃取之胜肽以競合EIA系進行定量。
大鼠係使用與實施例8相同地可自由攝食粉末飼料之個體(對照群)、48小時不給予飼料僅給予飲用水而進行飼育之個體(絕食群)。視床下部之各部位中NESFATIN mRNA量表現量之定量，係以與實施例24相同之方法製作組織切片，進行原位雜合反應，再以X射線加以感光所得到之影像，以影像分析儀(Imaging Research Inc.MCIDT M Elite)進行測定(Imaki等，Brain Research，Netherlands，1993年，623卷，第223－228頁)。測定在弓狀核、室傍核、外側野、視床上核之部位上之感光像濃度，再將該值由白至黑以256階段之灰階作成比色數值而數值化，再以下述式之比色濃度(Relative Optical Densities)使其數值化，而作為mRNA表現之相對值。
比色濃度＝log10(256/比色數值)
再者，弓狀核、室傍核、外側野、視床上核之各部位之鑑定，係依據巴基思諾(Paxinos G)及華生(Watoson C)所著The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.(Academic Press出版)(USA)1986年記載之方法進行。
大鼠腦之室傍核中之NESFATIN－1胜肽，其定量係如下述所進行者。將與上述相同地經過自由攝食及絕食之大鼠，以斷頭使其犧牲，再立刻將腦以乾冰－丙酮冷凍，再使用組織切片機製作60μm厚度之切片。將組織以Nissl加以染色，在實體顯微鏡下將相當於腦兩側之室傍核部分切下，加以回收。所回收之組織在1.5 ml之微管中以100μl之0.1N鹽酸使用微管槽(Scientific Specialties公司，1005－39)使其均質。經均質之溶液以微離心機在15,000 rpm下離心20分鐘，回收其上清液再以冷凍乾燥除去溶劑。經冷凍乾燥之樣品溶解於100μl之PBS中，再以實施例21所記載之競合EIA測定法，在50μl/井之條件下就NESFATIN－1胜肽量進行定量。
<結果>
圖24之A：係表示在自由攝食群(對照群)與絕食群之大鼠中之腦視床下部區域之弓狀核(Arc)、室傍核(PVN)、外側野(LHA)、及視床上核(SON)之各部位上，將其NESFATIN mRNA表現以原位雜合法之畫面解析加以定量之結果示意圖。在弓狀核、外側野、及視床上核中，相較於自由攝食群(對照群)之NESFATIN mRNA表現值(比色濃度)，在絕食群中其NESFATIN mRNA表現值並無見到任何差異。相對於此，在室傍核中，相較於自由攝食群(對照群)，其NESFATIN mRNA表現量即得到統計上有意義之降低之結果。
圖24之B，則表示在自由攝食群(對照群)與絕食群之大鼠中之腦視床下部區域之室傍核上，將其NESFATIN－1胜肽表現以競合EIA法之畫面解析加以定量之結果示意圖。相較於自由攝食群(對照群)，絕食群在室傍核中，其NESFATIN－1胜肽表現得到了統計上有意義之降低之結果。
以上之結果，顯示了藉由絕食使得在攝食調節上重要之視床下部之室傍核中，其NESFATIN(NEFA)基因及NESFATIN－1表現有顯著降低之情形。
實施例27 NESFATIN－1在大鼠腦室內投予所造成攝食行動上影響之檢討
在實施例12中以NESFATIN之部分胜肽進行投予實驗，顯示僅NESFATIN部分具有攝食抑制活性。進而，為檢測其實驗起見，再就投予後之時間經過對於攝食抑制活性之影響加以檢討。
實驗條件係以與實施例12同樣之條件而進行，在大鼠之第三腦室內，於黑暗期開始前投予5 pmol之NESFATIN－1，再於投予後開始之一小時(0~1小時)、投予1小時後開始之2小時(1~3小時)、投予3小時後開始之3小時(3~6小時)、及投予6小時後開始之6小時(6~12小時)間，將其飼料之減少量(攝餌量)作為攝餌量而進行測量。再者，對照群則測定僅給予生理食鹽水之個體。
<結果>
圖25中，係表示在大鼠第3腦室內投予5 pmol之NESFATIN時，其0~1小時、1~3小時、3~6小時、及6~12小時之攝餌量之示意圖。相對於對照群，在投予NESFATIN－1之群中，其0~1小時、1~3小時、及3~6小時，皆顯示有統計上有意義之攝餌量降低之情形(P<0.01)。然而，6~12小時相對於對照群，則可確認其投予NESFATIN－1之群中，有攝餌量增加之情形(P<0.01)。基於上述之結果，顯示在腦室內投予NESFATIN－1時’其攝食之抑制係暫時的，隨著時間之經過NESFATIN－1之藥理效果會消失，並因此其攝食將會恢復。
實施例28 抗NESFATIN－1抗體之大鼠腦室內投予所導致之攝食亢進作用特異性之檢討
實施例14中係顯示在大鼠腦室內投予對於NESFATIN－1之抗體時，確認具有攝食亢進作用之情形。為檢測其作用係藉由阻礙NESFATIN－1之作用而發揮效果者起見，茲檢討在腦室內投予NESFATIN－1時，是否攝食抑制在投予抗NESFATIN－1抗體時同時會被阻礙。
實驗條件係以與實施例12同樣之條件而進行，於黑暗期開始前，就在大鼠之第三腦室內，僅投予5 pmol之NESFATIN－1之群，以及投予5 pmol之NESFATIN－1及8μg抗NESFATIN－1抗體(Nesfatin－1 IgG)之群，測量其投予後1小時之攝餌量，再與對照群(僅投予生理食鹽水者)相比較。此外，並就已知在腦室投予時具有攝食抑制活性之瘦體素(Rat Leptin：R&D systems公司，598－LP－01M)，將其單獨地(1μg)或與抗NESFATIN－1抗體共同地進行投予之群中，檢討其在攝食上之作用。
<結果>
圖26係表示在大鼠之腦室內，僅投予NESFATIN－1群(NESFATIN－1 IgG/NESFATIN－1/瘦體素：－/＋/－)、投予NESFATIN－1及抗NESFATIN－1抗體群(NESFATIN－1 IgG/NESFATIN－1/瘦體素：＋/＋/－)、投予瘦體素群(NESFATIN－1 IgG/NESFATIN－1/瘦體素：－/－/＋)、投予瘦體素及抗NESFATIN－1抗體群(NESFATIN－1 IgG/NESFATIN－1/瘦體素：＋/－/＋)，其等在投予後1小時之攝餌量示意圖。相較於對照群(NESFATIN－1 lgG/NESFATIN－1/瘦體素：－/－/－)，僅投予NESFATIN之群，其攝餌量有統計上有意義(P<0.01)之減少者，確認在投予NESFATIN－1及抗NESFATIN－1抗體之群中，則其攝餌量可見到與對照群相同程度之亢進效果。相對於此，在投予瘦體素之群中其攝餌量雖有減少，惟並無法確認在投予瘦體素及抗NESFATIN－1抗體之群中，有藉由瘦體素而使攝餌量之抑制發生亢進之效果。基於此結果，考慮該抗NESFATIN－1抗體之攝食亢進作用係因NESFATIN－1之效果被特異性地抑制所致。
實施例29 抗NESFATIN－1抗體之結合特異性之檢討
在實施例28中，係檢討抗NESFATIN－1抗體在腦內投予時，可特異性地阻礙NESFATIN－1之作用者，惟在此進一步就其與已知有攝食調節作用之因子之結合性，藉由使用大鼠之腦萃取物之西方墨漬法進行檢討。
以西方墨漬法進行之解析，係依照實施例3所示方法中，將其一次抗體由抗NAP多株抗體取代為抗NESFATIN－1抗體而進行。又在調查抗NESFATIN－1抗體之結合特異性實驗中，係於西方墨漬法使其與膜反應前，於抗NESFATIN－1抗體上加入NAP1－Ab胜肽(實施例10)，以及已知有攝食調節作用之瘦體素(Rat Leptin：R&D systems公司，598－LP－01M)．α MSH(Melanocyte Stimulating Hormone：株式會社胜肽研究所，4057－v)．CART(Rat Coaine－and Amphetamine－Regulated Transcript，55－102：株式會社胜肽研究所，4351－s)．NPY(Human，Rat Neuropeptide Y：株式會社胜肽研究所，4158－v)．MCH(Human Melanin－Concentrating Hormone：株式會社胜肽研究所，4369－v)．Orexin－A(Human，Rat，Mouse，Bovine Orexin－A：株式會社胜肽研究所，4346－s)之各胜肽，以每1μg抗NESFATIN－1抗體各加入5μg之比例，在室溫下反應1小時後，以上述之方法進行西方墨漬法，檢測其色帶是否有消失之情形。
<結果>
圖27之A係表示使用取自大鼠腦中之蛋白質萃取液，並將抗NESFATIN－1抗體進行西方墨漬法之結果圖。其結果，確認有相當於分子量47.5 kd之NESFATIN聚胜肽之分子處有色帶產生。圖27之B係表示使抗NESFATIN－1抗體及各種胜肽提前反應後，與上述相同地進行西方墨漬時，在47.5 kd附近之色帶附近圖。將抗NESFATIN－1抗體以NAP1－Ab使其反應時，在47.5 kd之色帶消失，此顯示抗NESFATIN－1抗體係先與NAP1－Ab胜肽反應，而使得與NESFATIN之結合部位被阻礙。相對於此，在使其與瘦體素、α MSH、CART、NPY、MCH、Orexin－A反應時，或者不使胜肽與抗NESFATIN－1抗體產生反應時，47.5 kd之色帶皆不消失。基於此一結果，顯示抗NESFATIN－1抗體會特異性地與NESFATIN結合，惟與瘦體素、α MSH、CART、NPY、MCH、Orexin－A等其他攝食相關之胜肽則不會發生反應。
實施例30 大鼠之延髓中NESFATIN表現部位之檢討
在實施例4中，係就大鼠腦之視床下部附近之表現，進行免疫組織化學性解析而檢討。進一步，為檢討大鼠延髓附近之NESFATIN表現，茲同樣地進行免疫組織化學性解析。
使用8週大之Wistar系大鼠(由日本SLC購得)，由與實施例4同樣地調製之標本，製作含有延髓之部分之腦組織切片。此外，免疫組織化學染色之方法亦與實施例4同樣地進行。進而，在對於MAP胜肽之抗體(1μg/ml)上添加NAP胜肽(實施例3)使成100μg/ml，於室溫下使其反應1小時後，再使用該抗體進行免疫組織化學染色實驗而進行。
<結果>
圖28之A係表示以含有延髓之腦組織之免疫組織化學染色圖。在含有延髓之組織之免疫組織染色中，在STN：孤束核中可確認有染色情形，並可確認有NEFA聚胜肽之表現。圖28之B係表示使抗NAP胜肽之抗體提前與NAP胜肽發生反應，再進行免疫組織染色圖。藉由使抗NAP胜肽之抗體提前與NAP胜肽發生反應，而可在圖28之A中確認有染色消失之情形，故顯示在此免疫組織染色圖中，NEFA聚胜肽有特異性地被染色之情形。基於此結即果，顯示該內臟性感覺神經核之參與攝食調節機構者，所謂孤束核之NESFATIN亦有表現之情形。
實施例31 對於正常及瘦體素抵抗性肥胖大鼠投予胰島素增敏劑(troglitazone)以及血中瘦體素與腦內NESFATIN表現上之影響
實施例2中係顯示使用PPAR γ增敏劑之胰島素增敏劑(troglitazone)作為糖尿病治療藥劑，而檢討其在培養細胞上之NESFATIN(NEFA)基因之誘導情形。進一步，為檢討胰島素增敏劑(troglitazone)所致之NESFATIN表現誘導起見，茲對於大鼠投予胰島素增敏劑(troglitazone)，並檢討其在腦內之NESFATIN誘導情形。再者，關於已知同樣地會進行攝食調節之因子之瘦體素，其血中濃度亦一併加以檢討。該檢討係使用正常Zucker大鼠(Zucker ＋/＋：Lean)以及瘦體素抵抗性肥胖大鼠模型動物之Zucker fa/fa。
大鼠係使用8週大之雄Zucker fa/fa(Zucker)系大鼠以及對照動物之Zucker ＋/＋(Lean)系大鼠，由日本查爾斯．李弗購得，以購入後上午6點至下午6點間之12小時進行照明，並以下午6點至隔日上午6點間之12小時保持黑暗之週期下，給予粉末飼料(日本克雷爾公司，CE－2)，在22℃下進行飼育。購入之大鼠在1週以上之預備飼育後，由9至10週大之個體中選擇體重200~250 g間之個體各6隻在實驗上使用。胰島素增敏劑(troglitazone)(troglitazone，TGZ：三共株式會社)之投予，係以0.2%之含量混合於粉末飼料中，使其自由攝食而進行。此外，未投予胰島素增敏劑(troglitazone)之對照組，則使用僅飼育一般粉末飼料之大鼠。在將含有胰島素增敏劑(troglitazone)之飼料或通常飼料連續餵食10日後，測定動物之體重，將其犧牲並採取全血。由所採取之大鼠血液分離血清，使用市售之ELISA套組(株式會社矢內原研究所，YK050)，再根據所添附之操作手冊測定瘦體素之濃度。進一步由該犧牲之大鼠將腦取出，以與實施例3同之方法進行西方墨漬法，將其色帶濃度以影像分析儀(Imaging Research Inc.MCIDT M Basic)進行解析，再將該色帶之呈色程度作成相對值(Units)而列表。
<結果>
圖29之A係表示在正常大鼠(Lean)與Zucker fa/fa大鼠(Zucker)中，將含有胰島素增敏劑(troglitazone)之飼料加以餵餌之群組(TGZ：＋)以及不含有該增敏劑之飼料餵餌之群組(TGZ：－)中，體重表示之示意圖。不論在正常大鼠或在Zucker fa/fa大鼠中，投予胰島素增敏劑(troglitazone)皆無法見到體重上有顯著之差異。此外，不論是否有投予胰島素增敏劑(troglitazone)，相對於正常大鼠而言，在Zucker fa/fa大鼠其體重有統計上有意義(p<0.01)之增重情形。
圖29之B係表示在正常大鼠(Lean)與Zucker fa/fa大鼠(Zucker)中，將含有胰島素增敏劑(troglitazone)之飼料加以餵餌之群組(TGZ：＋)以及不含有該增敏劑之飼料餵餌之群組(TGZ：－)中，血中瘦體素濃度之示意圖。不論在正常大鼠或在Zucker fa/fa大鼠中，藉由投予胰島素增敏劑(troglitazone)其血中之瘦體素濃度皆可得到統計上有意義(p<0.05)之降低結果。此外，不論是否有投予胰島素增敏劑(troglitazone)，相對於正常大鼠而言，在Zucker fa/fa大鼠其血中之瘦體素濃度有統計上有意義(p<0.01)之增高結果。
圖29之C係表示在正常大鼠(Lean)與Zucker fa/fa大鼠(Zucker)中，將含有胰島素增敏劑(troglitazone)之飼料加以餵餌之群組(TGZ：＋)以及不含有該增敏劑之飼料餵餌之群組(TGZ：－)中，由其腦內製作萃取蛋白質樣品，並將以西方墨漬法所得到之色帶濃度作為相對值之示意圖。在正常大鼠中，將含有胰島素增敏劑(troglitazone)之飼料加以餵餌之群組(TGZ：＋)以及不含有該增敏劑之飼料餵餌之群組(TGZ：－)之間，其並無法見到在腦表現之NESFATIN表現量上之差。相對於此，在Zucker fa/fa大鼠，藉由投予胰島素增敏劑(troglitazone)，可得到其腦內之NESFATIN表現量有統計上有意義(P<0.01)之增大結果。再者，不論有無投予胰島素增敏劑(troglitazone)，相對於正常大鼠，在Zucker fa/fa大鼠皆可得到其腦內之NESFATIN表現量有統計上有意義(P<0.01)之增高結果。
基於上述結果，考慮作為糖尿病治療藥劑之胰島素增敏劑(troglitazone)，其在正常動物不會誘導腦內之NESFATIN，惟顯示有瘦體素抵抗性之病態之模型動物上，則可在其腦內誘導NESFATIN之表現。相較於此，瘦體素不會因為胰島素增敏劑(troglitazone)而在正常動物、病態動物中，同時地得到血中濃度上升之結果，相反地其血中濃度會下降。
實施例32 視床下部組織萃取物之HPLC劃分中NESFATIN－1胜肽之檢測
在實施例21中係將萃取自視床下部組織之胜肽作為樣品，進行HPLC分劃，進而使用該劃分以競合EIA測定系來檢討NESFATIN－1之存在。進一步，為檢討該劃分中被檢測出之胜肽係相當於NESFATIN－1之分子起見，茲將視床下部組織萃取物之HPLC劃分以西方墨漬法進行解析。
視床下部組織萃取物之HPLC劃分，其製作係與實施例21同樣地進行，並將該劃分編號(Fraction #)43~47之劃分進行冷凍乾燥。冷凍乾燥後之樣品溶解於100μl之PBS中，使用其中20μl而以聚丙烯醯胺凝膠進行SDS－PAGE，並以與實施例3相同之方法使用抗NESFATIN－1抗體進行西方墨漬法。
<結果>
圖30之A係表示由大鼠視床下部所得之胜肽萃取物，以HPLC進行分劃所得之劃分編號45之西方墨漬圖。以西方墨漬法所檢測之色帶係約9.7 kd之分子量，此係與藉由重組所製作之NESFATIN－1胜肽之分子量幾乎一致(實施例10、圖9C)。圖30之B係表示由大鼠視床下部所得之胜肽萃取物，以HPLC進行分劃所得之劃分編號43~47之西方墨漬圖中，9.7 kd附近之分子量上之部分圖。9.7 kd之色帶係於劃分編號45上最為顯著，其結果係與實施例21中由大鼠視床下部所得之胜肽萃取物，以HPLC進行分劃所得之劃分，再以競合EIA法加以定量時之圖型(圖19B之b－1)為一致者。
由以上之結果，顯示在大鼠之視床下部，存在有相當於NESFATIN－1之分子，以實施例21之方法進行分劃，再以競合EIA法及/或西方墨漬法加以檢測時，即可檢測出相當於NESFATIN－1之分子。
實施例33 大鼠視床下部區域之免疫組織化學染色之特異性檢討
在實施例4中係為就與攝食調節相關之大鼠腦視床下部之NEFA表現部位進行解析起見，而使用大鼠腦切片來進行免疫組織化學性解析。為檢討此染色是否為NESFATIN特異性者，並考慮攝食調節作用為習知之胜肽與抗體之結合性，而再度地進行免疫組織化學性解析。
以與實施例4相同之方法，將各含有大鼠腦之弓狀核及室傍核之組織切片進行免疫組織染色，惟一次抗體則使用抗NESFATIN－1抗體(NESFATIN－1 IgG：實施例10)來取代抗NAP多株抗體。並且，在使一次抗體與組織標本進行反應前，於抗NESFATIN－1抗體上加入NESFATIN－1胜肽(實施例10)，以及已知有攝食調節作用之瘦體素(Rat Leptin：R&D systems公司，598－LP－01M)．α MSH(Melanocyte Stimulating Hormone：株式會社胜肽研究所，4057－v)．CART(Rat Coaine－and Amphetamine－Regulated Transcript，55－102：株式會社胜肽研究所，4351－s)．NPY(Human，Rat Neuropeptide Y：株式會社胜肽研究所，4158－v)之各胜肽，以每1μg抗NESFATIN－1抗體各加入5μg之比例，在室溫下反應1小時後，以免疫組織化學染色法，檢測其抗體反應之特異性。
<結果>
圖31之A係表示在含有大鼠腦之弓狀核之組織切片中，以抗NESFATIN－1抗體進行免疫組織化學染色之結果，以及將一次抗體提前與各種胜肽發生反應後，其進行免疫組織化學染色之結果示意圖。圖31之A中，a－1係大鼠腦之弓狀核以抗NESFATIN－1抗體進行免疫染色，又a－2係將抗NESFATIN－1抗體與NESFATIN－1胜肽提前進行反應時其染色會消失，從而顯示抗NESFATIN－1抗體檢測出可在弓狀核表現之NESFATIN。相對於此，將抗NESFATIN－1抗體各自在瘦體素(圖31之A之a－3)、α MSH(圖31之A之a－4)、CART(圖31之A之a－5)、NPY(圖31之A之a－6)，其弓狀核之免疫染色皆不會消失，顯示這些胜肽並不會結合於抗NESFATIN－1抗體，而在免疫組織化學染色中該抗體也不會與此等胜肽發生反應。
圖31之B係表示在含有大鼠腦之室傍核之組織切片中，以抗NESFATIN－1抗體進行免疫組織化學染色之結果，以及將一次抗體提前與各種胜肽發生反應後，其進行免疫組織化學染色之結果示意圖。在圖31之B中，b－1係大鼠腦之弓狀核以抗NESFATIN－1抗體進行免疫染色，又b－2係將抗NESFATIN－1抗體與NESFATIN－1胜肽提前進行反應時其染色會消失，從而顯示抗NESFATIN－1抗體檢測出可在室傍核表現之NESFATIN。相對於此，將抗NESFATIN－1抗體各自在瘦體素(圖31之B之b－3)、α MSH(圖31之B之b－4)、CART(圖31之B之b－5)、NPY(圖31之B之b－6)，其弓狀核之免疫染色皆不會消失，顯示這些胜肽並不會結合於抗NESFATIN－1抗體，而在免疫組織化學染色中該抗體也不會與此等胜肽發生反應。
基於上述結果，在使用抗NESFATIN－1抗體之免疫組織化學染色中檢測出特異性NESFATIN之表現，顯示在大鼠腦內至少在視床下部區域之弓狀核及室傍核上有NESFATIN表現者。
實施例34 藉由NESFATIN－1連續地投予至大鼠腦室內所造成脂肪組織重量上作用之檢討
為調查NESFATIN－1對於脂肪組織之量之影響，對於大鼠之腦室內持續地投予NESFATIN－1，並解析其脂肪組織等重量之變化。
將NESFATIN－1(每日5 pmol)或僅生理食鹽水(對照群)，使用滲透壓幫浦10日連續地投予至大鼠之第三腦室內(各群係使用5隻及4隻之大鼠)。以滲透壓幫浦對於大鼠之腦室內投予係以與實施例13相同之方法進行。
在10日之NESFATIN－1或僅生理食鹽水之投予後，將各大鼠犧牲，解剖，一併取出其腹部皮下組織、精囊上體脂肪組織、腸間膜脂肪組織、後腹膜脂肪組織(以上為白色脂肪組織)、肩胛股間之褐色脂肪組織，再測定其重量。此外，再採取兩側後胺之腓腹肌，再測定其重量。由所測定之組織重量求出各個體體重之比(組織重量/體重mg/g)。此外，在統計上有意義之差之檢定，則係以分散分析(analysis of variance)來進行。
<結果>
圖32係表示由投予10日之NESFATIN－1或僅生理食鹽水之大鼠中，所取得之各脂肪組織(A~E)及腓腹肌(F)之重量及體重之重量比之結果示意圖。腹部皮下組織(圖32之A)、精囊上體脂肪組織(圖32之B)、腸間膜脂肪組織(圖32之C)中，相較於僅投予生理食鹽水之對照群，投予NESFATIN－1之群則有體重相對於組織重量比，在統計上有意義之降低情形。再者，在後腹膜脂肪組織(圖32之D)中，相較於對照群，則雖在NESFATIN－1投予群可見到其體重相對於組織重量比有降低之情形，惟並無統計上有意義之差存在。進一步，褐色脂肪組織(圖32之E)及腓腹肌(圖32之F)中，在對照群與NESFATIN－1投予群間，其體重相對於組織重量比並無統計上有意義之差存在。
基於上述結果，NESFATIN－1係具有使白色脂肪組織之體重相對於組織重量比，亦即體脂肪率降低之效果。此外，相較於褐色脂肪組織或肌肉組織，則顯示其體重相對於組織重量比並無影響。
實施例35 NESFATIN－1在老鼠腹腔內投予所致之血液生化學係數上影響之檢討
茲檢討NESFATIN－1所顯示之攝食抑制活性、體重增加抑制活性、脂肪組織降低活性，是否會隨著血糖(血中葡萄糖值)或脂質關聯係數(膽固醇值、三酸甘油酯值)之變動而受影響。
大鼠係使用7週大之雄C57BL/6J系大鼠，由日本克雷爾(股)公司購得，以購入後上午6點至下午6點間之12小時進行照明，並以下午6點至隔日上午6點間之12小時保持黑暗之週期下，給予粉未飼料(日本克雷爾公司，CE－2)，在22℃下進行飼育。
在C57BL/6J系大鼠之腹腔內，將實施例16所製作之重組老鼠NESFATIN－1以每100μl生理食鹽水中含有10nmol之量之形式加以溶解而使用，控制組之樣品則僅使用生理食鹽水(Saline)。樣品係以附有26G之注射針之圖倍爾格林注射筒，對於各老鼠(每群5隻)之腹腔中各進行100μl之單次投予，投予時間則於進入黑暗期之前(下午6點)進行。
投予後之各隻老鼠放回各自之籠內，測定投予後0~3小時之間粉末飼料之減少重量而來測定其攝食量。此外，在投予3小時後將各老鼠斷頭犧牲，採取其全血，並分取其血清。關於該血清，使用市售之測定試劑，測定其葡萄糖含量、總膽固醇含量、三酸甘油酯含量(協和醫學，岱密特納－L GLUII、岱密特納－L TCII、岱密特納－L TGII)。
此外，在統計上有意義之差之檢定，則係以分散分析(analysis of variance)來進行。
<結果>
圖33係表示對於老鼠腹腔內投予NESFATIN－1或僅投予生理食鹽水時之攝食量、血中葡萄糖含量、總膽固醇含量、三酸甘油酯含量之測定結果示意圖。
以NESFATIN－1投予時，其攝食量與對照群相比較有統計上有意義之降低情形。相對於此，表示血糖值之血中葡萄糖含量、或脂質相關係數之總膽固醇含量(圖中膽固醇)、三酸甘油酯(圖中三酸甘油酯)含量中，其NESFATIN－1投予群幾乎未見到與對照群有差異存在。
基於上述結果，應認為NESFATIN－1之作用係不受血糖值或血中之脂質相關係數變動影響，而具有攝食抑制活性、體重增加抑制活性、脂肪組織量降低活性者。
〔產業上可利用性〕
根據本發明，藉由使用PPAR γ增敏劑，可以取得與攝食及體重調節相關之因子。再者，藉由使用NESFATIN、NESFATIN－1、及/或NESFATIN－1M30，可以預防或治療肥胖或肥胖症、神經性過食症等代謝、攝食障礙相關之疾病、II型糖尿病、耐糖能力異常、高血壓、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臟病患、腦血管疾病、睡眠時無呼吸症候群、變形性關節症等整形外科性疾病、月經異常、惡性腫瘤等肥胖症相關之疾病。進而，藉由使用可抑制抗體等之NESFATIN、NESFATIN－1、或NESFATIN－1M30之活性之物質，可以預防或治療手術及/或癌症之病患中，其食慾不振或厭食症等營養、攝食障礙之疾病。
圖1：係表示在人類腦髓芽細胞種株細胞HBT185細胞及SQ－5細胞中，以胰島素增敏劑(troglitazone)誘導NEFA基因之表現，以及在使前驅脂肪細胞分化之3T3－L1細胞中，NEFA基因持續地表現，而使用NEFA探針進行之北方墨漬圖。
圖2之A：係表示NEFA基因所編碼之聚胜肽之區域構造之模式圖及在抗NESFATIN抗體製作上使用之NAP胜肽之序列圖。此外，圖2之B，係表示在大鼠之腦萃取物中存在有NEFA基因所編碼之聚胜肽，而使用以NAP胜肽製作之單株抗體進行之西方墨漬圖。
圖3：係表示在大鼠腦之視床下部中，其與攝食調節有關之部位之弓狀核(Arc)、室傍核(PVN)、視床上核(SON)及外側野(LH)中，有NEFA基因表現，而使用對於NAP胜肽之多株抗體進行之免疫組織染色圖。
圖4之A：係表示GST與老鼠成熟型NESFATIN結合形式之GST－NEFA之表現與純化之過程，而使用對於NAP胜肽之多株抗體進行之西方墨漬圖。在圖4之A中，第1~4道(Lane)係各自表示彩虹標記、前誘導細菌(Preinduced bacteria)、後－音波處理小粒(Post－sonicated pellet)、以及純化GSTNAP。再者，圖4之B係表示將GST－NEFA以Thrombin切斷並進行純化之過程，而使用抗NESFATIN抗體之西方墨漬圖。在圖4之B中，第1道為標記，第2道為純化前樣品，第3~6道為洗淨樣品，第7道為純化樣品。
圖5：係表示藉由將重組NESFATIN投予至大鼠第三腦室內，而使大鼠之攝食行動被抑制之示意圖。圖5中，＊ 及＊ ＊ 係各自表示對於對象之群組為統計上有意義之差P<0.05，以及P<0.01者。
圖6：係表示藉由將抗NESFATIN抗體投予至大鼠第三腦室內，而使大鼠之攝食行動產生亢進之示意圖。圖6中，＊ 係表示對於Control IgG為統計上有意義之差P<0.001者。
圖7：係表示在大鼠之視床下部中，NESFATIN基因之表現因使其絕食之故而降低，又因再度使其攝食而表現回復，而為在腦組織之原位雜合圖。在圖7中，A為對照群，B為絕食群，C為再攝食群，其上半段為100倍相，而下半段則為400倍相。
圖8：係表示在大鼠之視床下部中，NESFATIN之表現因使其絕食之故而降低；而在使用抗NESFATIN抗體之免疫組織染色圖之圖8中，A為對照群，B為絕食群。再者，絕食時NESFATIN之表現降低係顯示食慾亢進所導致，而使用抗C－Fos抗體之免疫組織染色圖(C)。圖8中，上半段表示室傍核(PVN)，下半段則表示弓狀核(Arc)。
圖9A：係表示藉由人類、老鼠、及大鼠之NESFATIN胺基酸序列，以及Prohormone Convertase所推定之切斷部位之示意圖。▼則表示預測之Prohormone Convertase之切斷部位。
圖9B：係表示被認為以Prohormone Convertase所生之對於Nesfatin－1、Nesfatin－2、Nesfatin－3、Nesfatin－2/3、以及Nesfatin－1、Nesfatin－2/3、及Nesfatin－3之抗體，其用以製作該抗體之胜肽之NESFATIN中之位置所示模式圖。
圖9C：係表示對於Nesfatin－1及Nesfatin－3之抗體，其係與標的抗原進行結合之西方墨漬圖。在圖9C中，左圖為將NESFATIN－1胜肽進行電泳而以Nesfatin－1 IgG進行西方墨漬之結果，而右圖則為將NESFATIN－3胜肽進行電泳而以NesfatinC2 IgG進行西方墨漬之結果。
圖10：係表示在大鼠腦內有將NESFATIN－1與Prohormone Convertase(PC－1/3或PC－2)同時地進行表現之細胞存在，而使用抗NESFATIN－1抗體及抗PC－1/3抗體或抗PC－2抗體之二重免疫組織色圖。圖10之A之圈1及圈2，係表示大鼠視床下部組織中之免疫組織化學圖上，其Nesfatin－1 IgG之染色圖；而圖10之B之圈1係表示PC－1/3之螢光圖，圖10之B之圈2則係表示PC－2之螢光圖。
圖11：係表示將NESFATIN－1投予至大鼠第三腦室內，而使大鼠之攝食行動受到抑制，惟如投予NESFATIN－2或NESFATIN－3，則不見有攝食行動之變化之示意圖。
圖12：係表示將NESFATIN－1連續地段予至大鼠第三腦室內，而使攝食行動持續地受到抑制(A)；以及持續地使體重增加受到抑制(B)之示意圖。
圖13A：係表示將對於NESFATIN－1之抗體投予至大鼠腦室內，而使大鼠之食慾產生亢進之示意圖。圖13A中，＊ 及＊ ＊ 係各自表示對於控制IgG投予群組為統計上有意義之差P<0.05，以及P<0.001者。
圖13B：係表示相對於NESFATIN，將NESFATIN－1未由NESFATIN被切除之突變株投予至大鼠腦室內時，不產生攝食亢進之示意圖。
圖14：係表示將對於NESFATIN之反意義RNA連續地段予至大鼠腦室內，而攝食行動受到抑制(A)以及體重增加受到抑制(B)之示意圖。圖14中，＊ 及＊ ＊ 係各自表示對於錯義(missense)為統計上有意義之差P<0.05，以及P<0.01者。
圖15：係表示將NESFATIN－1投予至Lean及瘦體素抵抗性之肥胖模型動物之Zucker大鼠腦室內所進行之攝食量測定結果之示意圖。在Zucker大鼠中，與Lean(正常動物)相同地，藉由NESFATIN－1投予腦室內，可確認有攝食抑制之效果。在圖15中，＊ 及＊ ＊ 係各自表示對於生理食鹽水投予群為統計上有意義之差P<0.05，以及P<0.01者。白色方塊以及有斜線之方塊，係各自表示生理食鹽水及NESFATIN－1投予群。
圖16：係表示將NESFATIN－1投予至老鼠腹腔內時，對於攝食量之影響之示意圖。顯示老鼠即使投予在腹腔內，亦確認有NESFATIN－1之攝食抑制活性(A)。再者，有將NESFATIN－1投予至肥胖模型老鼠之Agouti－黃老鼠及其對象老鼠之腹腔內時，其結果之示意圖。不論對於對象老鼠(B)或Agouti－黃老鼠(C)，在進行NESFATIN－1腹腔投予時皆顯示具有相同之效果。
圖17：係表示將NESFATIN－1投予至老鼠之腹腔內及皮下，其對於攝食量之影響之示意圖。NESFATIN－1不論在腹腔內投予(ip)或皮下投予(sc)皆可確認有攝食抑制之效果，惟皮下投予之一方則有效果較遲之表現傾向。在圖17中，＊ 及＊ ＊ 係各自表示對於生理食鹽水投予群為統計上有意義之差P<0.05，以及P<0.05者。
圖18A：係表示NESFATIN－1N23、NESFATIN－1M30、NESFATIN－1C29投予至老鼠腹腔內，對於攝食量所造成之影響之示意圖。NESFATIN－1之部分胜肽中，僅NESFATIN－1M30確認有攝食抑制效果。在圖18A中，＊ 係表示對於生理食鹽水投予群為統計上有意義之差P<0.02者。
圖18B：係表示人類、老鼠及大鼠之NESFATIN－1之胺基酸比對(Alignment)結果與NESFATIN－1N23、NESFATIN－1M30、及NESFATIN－1C29之部位之示意圖。NESFATIN－1M30之部位在種間顯示其胺基酸序列被高度保存。
圖19A－1：係表示在測定NESFATIN或NESFATIN－1之樣品中濃度之競合EIA系之標準曲線圖(A－1)及在髓液之測定結果之表(A－2)。檢量曲線之式：Y＝D＋(A－D)/1＋(Log(X)C^ B)。Plot#1(標準值：濃度值VS測定值)。A＝8.4672E－0.001；B＝4.3850E＋000；C＝3.5938E＋000；D＝－2.8957E－001；R^ 2＝0.9998。
圖19A－2：係表示在測定NESFATIN或NESFATIN－1之樣品中濃度之競合EIA系之標準曲線圖(A－1)及在髓液之測定結果之表(A－2)。
圖19B：係表示將由視床下部組織及髓液所萃取之胜肽樣品以HPLC加以劃分，再將該劃分之NESFATIN－1以競合EIA系進行測定之結果之示意圖(b－1及b－2)。
圖20：係表示將NESFATIN－1M30之部分胜肽投予至老鼠腹腔內，對於攝食量之影響之示意圖。其結果，在投予NESFATIN－1M16(M16)、NESFATIN－1M10M(M10M)、或NESFATIN－M14(M14)之全部情形下，皆可確認有攝食抑制效果。在圖20中，＊ 及＊ ＊ 係各自表示對於生理食鹽水投予群為統計上有意義之差P<0.02，以及P<0.002者。
圖21A：係表示將人類NESFATIN－1M30及老鼠NUCB1－M30投予至老鼠腹腔內對於攝食調節之影響之示意圖。與老鼠NESFATIN－1M30(老鼠/NESFATIN－1M30)一樣地，即使在人類NESFATIN－1M30(人類/NESFATIN－1M30)及老鼠NUCB1－M30(老鼠NUCB1)，皆具有攝食抑制效果。在圖20中，＊ 係表示對於生理食鹽水投予群為統計上有意義之差P<0.02者。
圖21B：係表示人類、大鼠、老鼠之NESFATIN以及人類、大鼠、老鼠之NUCB1之胺基酸序列比對(Alignment)結果，與NESFATIN－1之相當部位及NESFATIN－1M30之相當部位之示意圖。其顯示在各種NESFATIN及NUCB2之NESFATIN－1之相當部位，特別是在NESFATIN－1M30之相當部位中，其胺基酸序列具有高度之保存性。
圖21C：係表示人類、大鼠、老鼠之NESFATIN以及人類、大鼠、老鼠之NUCB1之胺基酸序列比對(Alignment)結果，與NESFATIN－1之相當部位及NESFATIN－1M30之相當部位之示意圖。其係圖21B之延續。
圖22：係表示使用各組織中NEFA探針之原位雜合之圖。圖22之A表示含有室傍核(PVN)及視床上核(SON)之組織切片，圖22之B表示含有不確帶(Zi)及弓狀核(Arc)之組織切片，圖22之C表示含有視床外側野(LHA)之組織切片。
圖23之A：係表示藉由將重組NESFATIN投予至大鼠第3腦室內，而大鼠之攝餌量受到抑制之示意圖。圖23之B，係表示在大鼠第3腦室內之5 pmol NESFATIN投予群(斜線方塊)及對照群(0 pmol之NESFATIN，白色方塊)，其0~1小時、1~3小時、3~6小時、及6~12小時之攝餌量之示意圖。在圖23之A中，＊ 係表示對於0 pmol為優位差P<0.01，而在圖23之B中，＊ 則表示對於0 pmol為優位差P<0.05，＊ ＊ 表示優位差P<0.01者。
圖24之A：係表示在自由攝食群(對照群)與絕食群之大鼠中之腦視床下部區域之弓狀核(Arc)、室傍核(PVN)、外側野(LHA)、及視床上核(SON)之各部位上，將其NESFATIN mRNA表現以原位雜合法之畫面解析加以定量之結果示意圖。圖24之B，則表示在自由攝食群(對照群：白色方塊)與絕食群(斜線方塊)之大鼠中之腦視床下部區域之室傍核上，將其NESFATIN－1胜肽表現以競合EIA法之畫面解析加以定量之結果示意圖。
圖25：係表示在大鼠第3腦室內之5 pmol NESFATIN投予群(斜線方塊)及對照群(0 pmol之NESFATIN－1，白色方塊)，其0~1小時、1~3小時、3~6小時、及6~12小時之攝餌量之示意圖。＊ 係表示對於0 pmol為優位差P<0.01者。
圖26：由左開始，係表示在大鼠之腦室內，僅投予生理食鹽水之對照群(NESFATIN－1 IgG/NESFATIN－1/瘦體素：－/－/－)、僅投予NESFATIN－1群(NESFATIN－1 IgG/NESFATIN－1/瘦體素：－/＋/－)、投予NESFATIN－1及抗NESFATIN－1抗體群(NESFATIN－1 IgG/NESFATIN－1/瘦體素：＋/＋/－)、投予瘦體素群(NESFATIN－1 IgG/NESFATIN－1/瘦體素：－/－/＋)、投予瘦體素及抗NESFATIN－1抗體群(NESFATIN－1 IgG/NESFATIN－1/瘦體素：＋/－/＋)，其等在投予後1小時之攝餌量示意圖。＊ 係表示對於對照群為優位差P<0.01者。
圖27之A：係表示使用取自大鼠腦中之蛋白質萃取液，並將抗NESFATIN－1抗體進行西方墨漬法之結果圖。
圖27之B：係表示使抗NESFATIN－1抗體及各種胜肽提前反應後，進行西方墨漬時之47.5 kd附近之色帶附近圖。在圖27之B中，與抗NESFATIN－1抗體進行反應之胜肽種類，在圖27之B上半段中，有(由左起)無胜肽、NAP1－Ab胜肽(cognate peptide)、瘦體素、α MSH、CART；在圖27之B下半段中，有(由左起)無胜肽、NAP1－Ab胜肽(cognate peptide)、NPY、MCH、Orexin－A。
圖28之A：係表示使用在含有延髓之腦組織之NAP胜肽抗體，其免疫組織化學染色圖。圖28之B，係表示使對於NAP胜肽之抗體提前與NAP胜肽(cognate peptide)發生反應，再進行免疫組織染色圖。
圖29之A：係表示在正常大鼠(Lean)與Zucker fa/fa大鼠(Zucker)中，將含有胰島素增敏劑(troglitazone)之飼料加以餵餌之群組(TGZ：＋)以及不含有該增敏劑之飼料餵餌之群組(TGZ：－)中，體重表示之示意圖。圖29之B：係表示在正常大鼠(Lean)與Zucker fa/fa大鼠(Zucker)中，將含有胰島素增敏劑(troglitazone)之飼料加以餵餌之群組(TGZ：＋)以及不含有該增敏劑之飼料餵餌之群組(TGZ：－)中，血中瘦體素濃度之示意圖。圖29之C：係表示在正常大鼠(Lean)與Zucker fa/fa大鼠(Zucker)中，將含有胰島素增敏劑(troglitazone)之飼料加以餵餌之群組(TGZ：＋)以及不含有該增敏劑之飼料餵餌之群組(TGZ：－)中，腦內之Nesfatin濃度之示意圖。在圖29中，＊ 及＊ ＊ 係各自表示對於正常大鼠(Lean)餵食不含有胰島素增敏劑(troglitazone)之飼料攝餌之群組(TGZ：－)，其統計上有意義之差P<0.05，以及P<0.01；圖29中，#及##係各自表示對於Zucker fa/fa大鼠(Zucker)餵食不含有胰島素增敏劑(troglitazone)之飼料攝餌之群組(TGZ：－)，其統計上有意義之差P<0.05，以及P<0.01者。
圖30之A：係表示由大鼠視床下部所得之胜肽萃取物，以HPLC進行分劃所得之劃分編號45之西方墨漬圖。圖30之B：係表示由大鼠視床下部所得之胜肽萃取物，以HPLC進行分劃所得之劃分編號43~47之西方墨漬圖中，9.7 kd附近之分子量上之部分圖。
圖31之A：係表示在含有大鼠腦之弓狀核之組織切片中，以抗NESFATIN－1抗體進行免疫組織化學染色之結果，以及將抗NESFATIN－1抗體提前與各種胜肽發生反應後，其進行免疫組織化學染色之結果示意圖。圖31之A中，a－1係以抗NESFATIN－1抗體之免疫染色圖，a－2~a－6各為將抗NESFATIN－1抗體提前與NESFATIN－1胜肽(a－2)、瘦體素(a－3)、α MSH(a－4)、CART(a－5)、NPY(a－6)進行反應時之免疫染色圖。
圖31之B：係表示在含有大鼠腦之室傍核之組織切片中，以抗NESFATIN－1抗體進行免疫組織化學染色之結果，以及將抗NESFATIN－1抗體提前與各種胜肽發生反應後，其進行免疫組織化學染色之結果示意圖。在B中，b－1係以抗NESFATIN－1抗體之免疫染色圖，b－2~b－6各為將抗NESFATIN－1抗體提前與NESFATIN－1胜肽(b－2)、瘦體素(b－3)、α MSH(b－4)、CART(b－5)、NPY(b－6)進行反應時之免疫染色圖。
圖32：係表示由投予10日之NESFATIN－1或僅投予生理食鹽水之大鼠中，所取得之腹部皮下脂肪組織(A)、精囊上體脂肪組織(B)、腸管膜脂肪組織(C)、後腹膜脂肪組織(D)、褐色脂肪組織(E)、以及腓腹肌(F)之組織重量，其與各個體重量之比較(組織重量/體重mg/g)結果示意圖。在圖32中，＊ 及＊ ＊ 係各自表示對於生理食鹽水投予群為統計上有意義之差P<0.05，以及P<0.005者。
圖33：係表示對於老鼠腹腔內投予NESFATIN－1或僅投予生理食鹽水時之攝食量、血中葡萄糖含量、總膽固醇含量、三酸甘油酯含量之測定結果示意圖。在圖33中，白色方塊及斜線方塊係各自表示生理食鹽水及Nesfatin－1投予群。
<110> 群馬大學帝人製藥<120> 新穎之生理物質NESFATIN及其相關物質，以及此等之用途<130> X <160> 38 <170> 專利第3.1版<210> 1 <211> 1263 <212> DNA <213> 人類<220> <221> CDS <222> (1)..(1263) <223> <400> 1 <210> 2 <211> 420 <212> PRT <213> 人類<400> 2 <210> 3 <211> 396 <212> PRT <213> 人類<220> <221> mat＿胜<222> (1)..(396) <223> <400> 3 <210> 4 <211> 1263 <212> DNA <213> 老鼠<220> <221> CDS <222> (1)..(1263) <223> <400> 4 <210> 5 <211> 420 <212> PRT <213> 老鼠<400> 5 <210> 6 <211> 395 <212> PRT <213> 老鼠<220> <221> mat＿胜<222> (1)..(395) <223> <400> 6 <210> 7 <211> 1263 <212> DNA <213> 大鼠<220> <221> CDS <222> (1)..(1263) <223> <400> 7 <210> 8 <211> 420 <212> PRT <213> 大鼠<400> 8 <210> 9 <211> 396 <212> PRT <213> 大鼠<220> <221> mat＿胜<222> (1)..(396) <223> <400> 9 <210> 10 <211> 1188 <212> DNA <213> 人類<220> <221> 基因<222> (1)..(1188) <223> <400> 10 <210> 11 <211> 1191 <212> DNA <213> 老鼠<220> <221> 基因<222> (1)..(1191) <223> <400> 11 <210> 12 <211> 1191 <212> DNA <213> 大鼠<220> <221> 基因<222> (1)..(1191) <223> <400> 12 <210> 13 <211> 82 <212> PRT <213> 人類<220> <221> 胜<222> (1)..(82) <223> <400> 13 <210> 14 <211> 82 <212> PRT <213> 老鼠<220> <221> 胜<222> (1)..(82) <223> <400> 14 <210> 15 <211> 82 <212> PRT <213> 大鼠<220> <221> 胜<222> (1)..(82) <223> <400> 15 <210> 16 <211> 79 <212> PRT <213> 大鼠<220> <221> 胜<222> (1)..(79) <223> <400> 16 <210> 17 <211> 231 <212> PRT <213> 大鼠<220> <221> 胜<222> (1)..(231) <223> <400> 17 <210> 18 <211> 246 <212> DNA <213> 人類<220> <221> 基因<222> (1)..(246) <223> <400> 18 <210> 19 <211> 246 <212> DNA <213> 老鼠<220> <221> 基因<222> (1)..(246) <223> <400> 19<210> 20 <211> 246 <212> DNA <213> 大鼠<220> <221> 基因<222> (1)..(246) <223> <400> 20<210> 21 <211> 566 <212> DNA <213> 老鼠<220> <221> 基因<222> (1)..(566) <223> <400> 21 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> 老鼠<220> <221> 基因<222> (1)..(20) <223> <400> 22<210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> 老鼠<220> <221> 基因<222> (1)..(21) <223> <400> 23<210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> 合成<220> <221> 胜<222> (1)..(13) <223> <400> 24<210> 25 <211> 621 <212> PRT <213> 合成<220> <221> PROPEP <222> (1)..(621) <223> <400> 25 <210> 26 <211> 397 <212> PRT <213> 合成<220> <221> 胜<222> (1)..(397) <223> <400> 26 <210> 27 <211> 31 <212> DNA <213> 合成<220> <221> 基因<222> (1)..(31) <223> <400> 27<210> 28 <211> 34 <212> DNA <213> 合成<220> <221> 基因<222> (1)..(34) <223> <400> 28<210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> 老鼠<220> <221> 基因<222> (1)..(18) <223> <400> 29<210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> 老鼠<220> <221> 基因<222> (1)..(18) <223> <400> 30<210> 31 <211> 15 <212> RNA <213> 合成<400> 31<210> 32 <211> 16 <212> PRT <213> 合成<220> <221> 胜<222> (1)..(16) <223> <400> 32<210> 33 <211> 10 <212> PRT <213> 合成<220> <221> 胜<222> (1)..(10) <223> <400> 33<210> 34 <211> 15 <212> PRT <213> 合成<220> <221> 胜<222> (1)..(15) <223> <400> 34<210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> 合成<400> 35<210> 36 <211> 27 <212> DNA <213> 合成<400> 36<210> 37 <211> 53 <212> DNA <213> 合成<400> 37<210> 38 <211> 38 <212> DNA <213> 合成<400> 38<210> 39 <211> 30 <212> PRT <213> 人類<400> 39<210> 40 <211> 30 <212> PRT <213> 大鼠<400> 40<210> 41 <211> 30 <212> PRT <213> 老鼠<400> 41<210> 42 <211> 23 <212> PRT <213> 老鼠<400> 42<210> 43 <211> 29 <212> PRT <213> 老鼠<400> 43<210> 44 <211> 90 <212> DNA <213> 人類<400> 44<210> 45 <211> 90 <212> DNA <213> 大鼠<400> 45 <210> 46 <211> 90 <212> DNA <213> 老鼠<400> 46<210> 47 <211> 312 <212> PRT <213> 大鼠<400> 47 <210> 48 <211> 27 <212> DNA <213> 合成<400> 48<210> 49 <211> 23 <212> DNA <213> 大鼠<400> 49<210> 50 <211> 699 <212> DNA <213> 合成<400> 50 <210> 51 <211> 232 <212> PRT <213> 合成<400> 51 <210> 52 <211> 25 <212> DNA <213> 合成<400> 52<210> 53 <211> 23 <212> DNA <213> 大鼠<400> 53<210> 54 <211> 699 <212> DNA <213> 合成<400> 54 <210> 55 <211> 313 <212> PRT <213> 合成<400> 55 <210> 56 <211> 56 <212> DNA <213> 合成<400> 56<210> 57 <211> 36 <212> DNA <213> 合成<400> 57<210> 58 <211> 38 <212> DNA <213> 合成<400> 58<210> 59 <211> 39 <212> DNA <213> 合成<400> 59<210> 60 <211> 58 <212> DNA <213> 合成<400> 60<210> 61 <211> 397 <212> PRT <213> 合成<400> 61 <210> 62 <211> 86 <212> PRT <213> 合成<400> 62<210> 63 <211> 53 <212> DNA <213> 合成<400> 63<210> 64 <211> 41 <212> DNA <213> 合成<400> 64<210> 65 <211> 16 <212> PRT <213> 人類<400> 65<210> 66 <211> 14 <212> PRT <213> 人類<400> 66<210> 67 <211> 10 <212> PRT <213> 人類<400> 67<210> 68 <211> 16 <212> PRT <213> 大鼠<400> 68<210> 69 <211> 14 <212> PRT <213> 大鼠<400> 69<210> 70 <211> 10 <212> PRT <213> 大鼠<400> 70<210> 71 <211> 16 <212> PRT <213> 老鼠<400> 71<210> 72 <211> 14 <212> PRT <213> 老鼠<400> 72<210> 73 <211> 10 <212> PRT <213> 老鼠<400> 73<210> 74 <211> 48 <212> DNA <213> 人類<400> 74<210> 75 <211> 42 <212> DNA <213> 人類<400> 75<210> 76 <211> 30 <212> DNA <213> 人類<400> 76<210> 77 <211> 48 <212> DNA <213> 大鼠<400> 77<210> 78 <211> 42 <212> DNA <213> 大鼠<400> 78<210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> 大鼠<400> 79<210> 80 <211> 48 <212> DNA <213> 老鼠<400> 80<210> 81 <211> 42 <212> DNA <213> 老鼠<400> 81<210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> 老鼠<400> 82<210> 83 <211> 1386 <212> DNA <213> 人類<220> <221> CDS <222> (1)..(1383) <223> <400> 83 <210> 84 <211> 461 <212> PRT <213> 人類<400> 84 <210> 85 <211> 1308 <212> DNA <213> 人類<220> <221> CDS <222> (1)..(1308) <223> <400> 85 <210> 86 <211> 435 <212> PRT <213> 人類<400> 86 <210> 87 <211> 1380 <212> DNA <213> 大鼠<220> <221> CDS <222> (1)..(1380) <223> <400> 87 <210> 88 <211> 459 <212> PRT <213> 大鼠<400> 88 <210> 89 <211> 1305 <212> DNA <213> 大鼠<220> <221> CDS <222> (1)..(1305) <223> <400> 89 <210> 90 <211> 434 <212> PRT <213> 大鼠<400> 90 <210> 91 <211> 1380 <212> DNA <213> 老鼠<220> <221> CDS <222> (1)..(1380) <223> <400> 91 <210> 92 <211> 459 <212> PRT <213> 老鼠<400> 92 <210> 93 <211> 1305 <212> DNA <213> 老鼠<220> <221> CDS <222> (1)..(1305) <223> <400> 93 <210> 94 <211> 434 <212> PRT <213> 老鼠<400> 94 <210> 95 <211> 77 <212> PRT <213> 人類<400> 95 <210> 96 <211> 77 <212> PRT <213> 大鼠<400> 96<210> 97 <211> 77 <212> PRT <213> 老鼠<400> 97<210> 98 <211> 231 <212> DNA <213> 人類<400> 98 <210> 99 <211> 231 <212> DNA <213> 大鼠<400> 99<210> 100 <211> 231 <212> DNA <213> 老鼠<400> 100<210> 101 <211> 30 <212> PRT <213> 人類<400> 101<210> 102 <211> 30 <212> PRT <213> 大鼠<400> 102<210> 103 <211> 30 <212> PRT <213> 老鼠<400> 103<210> 104 <211> 90 <212> DNA <213> 人類<400> 104<210> 105 <211> 90 <212> DNA <213> 大鼠<400> 105<210> 106 <211> 90 <212> DNA <213> 老鼠<400> 106<210> 107 <211> 16 <212> PRT <213> 人類<400> 107<210> 108 <211> 14 <212> PRT <213> 人類<400> 108<210> 109 <211> 10 <212> PRT <213> 人類<400> 109<210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> 大鼠<400> 110<210> 111 <211> 14 <212> PRT <213> 大鼠<400> 111<210> 112 <211> 10 <212> PRT <213> 大鼠<400> 112<210> 113 <211> 16 <212> PRT <213> 老鼠<400> 113<210> 114 <211> 14 <212> PRT <213> 老鼠<400> 114<210> 115 <211> 10 <212> PRT <213> 老鼠<400> 115<210> 116 <211> 48 <212> DNA <213> 人類<400> 116<210> 117 <211> 42 <212> DNA <213> 人類<400> 117<210> 118 <211> 30 <212> DNA <213> 人類<400> 118<210> 119 <211> 48 <212> DNA <213> 大鼠<400> 119<210> 120 <211> 42 <212> DNA <213> 大鼠<400> 120<210> 121 <211> 30 <212> DNA <213> 大鼠<400> 121<210> 122 <211> 48 <212> DNA <213> 老鼠<400> 122<210> 123 <211> 42 <212> DNA <213> 老鼠<400> 123<210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> 老鼠<400> 124

Claims (18)

  1. 一種分離聚胜肽，其特徵係由序列編號13~15、39~41、65~73、101~103或107~115中任一者所示之胺基酸序列所成者。
  2. 如申請專利範圍第1項之聚胜肽，其為具有體脂肪增加抑制活性。
  3. 一種分離核酸分子，其特徵係編碼如申請專利範圍第1項或第2項之聚胜肽者。
  4. 一種分離核酸分子，其特徵係由序列編號18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示之鹼基序列所成者。
  5. 如申請專利範圍第3項之核酸分子，其為具有體脂肪增加抑制活性。
  6. 一種載體，其特徵係含有如申請專利範圍第3~5項中任一項之核酸分子者。
  7. 一種轉形細胞，其特徵係含有如申請專利範圍第3~5項中任一項之核酸分子者。
  8. 一種用於攝食抑制及/或體重增加抑制之醫藥組成物，其特徵係含有如申請專利範圍第1項或第2項之聚胜肽作為有效成分。
  9. 一種用於攝食抑制及/或體重增加抑制之醫藥組成物，其特徵係含有如申請專利範圍第6項之載體作為有效 成分。
  10. 一種用於攝食抑制及/或體重增加抑制之醫藥組成物，其特徵係含有如申請專利範圍第7項之轉形細胞作為有效成分。
  11. 如申請專利範圍第8項之醫藥組成物，其中該體重增加抑制係體脂肪增加抑制。
  12. 一種抗體，其特徵係與如申請專利範圍第1項或第2項之聚胜肽進行結合。
  13. 一種如申請專利範圍第1項或第2項之聚胜肽的製造方法，其特徵為含有以下步驟者；該步驟為將編碼該聚胜肽的核酸分子導入於載體之步驟；將該載體導入於宿主細胞，構築轉形細胞的步驟；培養該轉形細胞並表現重組蛋白質的步驟；以及由該培養物中純化該重組蛋白質的步驟。
  14. 一種用於預測或診斷攝食亢進或體重增加之狀態之活體外檢定方法，其特徵係包含一種檢測步驟，以檢測哺乳類動物之生體樣品中，含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之任一者所示鹼基序列之核酸分子；或者含有序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115之任一者所示胺基酸序列之聚胜肽之含量者。
  15. 一種用於如申請專利範圍第14項之檢定方法之檢定套組，其特徵係包含：用以檢測含有序列編號10~12、18~20、44~46、74~82、104~106、或116~124之 任一者所示鹼基序列之核酸分子之PCR引子、探針、或DNA晶片；或者認識含有序列編號3、6、9、13~15、39~41、65~73、101~103、或107~115之任一者所示胺基酸序列之聚胜肽之抗體、標準胜肽、或結合競合反應用胜肽修飾體中之至少一者。
  16. 如申請專利範圍第1項之聚胜肽，其中該胺基酸序列係如序列編號13~15中任一者所示者。
  17. 如申請專利範圍第16項之聚胜肽，其中部分胜肽係包含序列編號39~41或65~73中任一者所示之胺基酸序列。
  18. 如申請專利範圍第16項之聚胜肽，其中聚胜肽的N末端係以焦麩醯胺酸、乙醯基、甲醯基或螢光物質所修飾，或聚胜肽的C末端以醯胺基或螢光物質所修飾。
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