JP5640230B2 - 新規生理物質ｎｅｓｆａｔｉｎとその関連物質、およびそれらの用途 - Google Patents

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Description

本発明は、調節および／または体重調節に関与する因子の新規の取得方法に関する。また、本発明は、該方法により得られる摂食調節および／または体重調節に関与するポリペプチド、該ポリペプチドをコードする核酸分子、ならびにそれらを用いる摂食抑制および／または体重増加抑制に関連する疾患の治療・予防・診断の手段に関する。また、該ポリペプチドまたは遺伝子の作用を阻害する物質を用いる、食欲亢進および／または体重増加亢進に関連する疾患の治療・予防・診断の手段に関する。さらには、本発明は、該ポリペプチド、該遺伝子、またはそれらの活性を阻害する物質により得られる摂食調節および／または体重調節に関連する疾患のモデル動物、ならびにこれらを利用する該ポリペプチドの作用または発現を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。また、該スクリーニング方法により選別される化合物、および該化合物を利用する疾病の診断手段、治療薬に関する。
肥満とは体重特に白色脂肪組織が過剰にある状態であり、一般的にBody Mass Index（ＢＭＩ）が≧２５kg／ｍ2であることによって分類され、また体脂肪率では成人男性で２５％以上・成人女性で３０％以上であることでも分類される。高脂肪食を中心とした食生活や運動不足は現代において、肥満に分類される人の割合は増加の傾向にある。2000年の厚生労働省による国民栄養調査の結果では、男性においてはこの10年および20年での比較で肥満に分類される人は確実に増えており、40歳から69歳においては約３０％の人が肥満に分類される。また女性においても60歳から69歳における約３０％が肥満に分類される。
過去においては肥満を美容上の問題であると考えられる傾向があったが、現在では肥満そのものよりもそれに随伴する（随伴し得る）健康障害が臨床上の大きな問題点であり、肥満の予防や治療の医学的根拠となっている。そのような状況を受けて、日本肥満学会では、肥満症を「肥満に起因ないし関連する健康障害を合併するか、臨床的にその合併が予測される場合で、医学的に減量を必要とする病態」と定義し、疾患として取り扱うことを提唱している。ここで言う健康障害には、2型糖尿病や耐糖能異常のほかに、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心・脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、変形性関節症などの整形外科的疾患、月経異常などが含まれる（非特許文献１）。また肥満に起因する疾患としては悪性腫瘍が挙げられ、特に乳ガン、子宮ガン、結腸ガン、腎臓ガン、食道ガン、膵臓ガン、肝臓ガン、胆嚢ガンの発症に関して肥満がリスクファクターとなることが報告されている（非特許文献１、非特許文献２および非特許文献３）。さらに近年、メタボリックシンドロームと呼ばれる動脈硬化性疾患（心筋梗塞・脳梗塞など）の危険性を高める複合型リスク症候群が提唱されており、我が国における脳血管障害・心血管障害は全死亡率の３０％を占めることからも注目されている。そのため、日本肥満学会・日本動脈硬化学会・日本糖尿病学会・日本高血圧学会・日本循環器学会・日本腎臓学会・日本血栓止血学会・日本内科学会は合同でその診断基準をまとめ、２００５年４月８日の日本内科学会での記者会見でその基準を公表した。それによると、内臓肥満（内臓脂肪蓄積）をリスクの中心にすえ、ウエストの周囲径が男性では８５ｃｍ以上、女性では９０ｃｍ以上あることに加えて、血清脂質異常（トリグリセリド値が１５０ｍｇ／ｄＬ以上、ＨＤＬコレステロール値が４０ｍｇ／ｄＬ未満の何れかまたは両方）、血圧高値（収縮期血圧が１３０ｍｍＨｇ以上、拡張期血圧が８５ｍｍＨｇの何れかまたは両方）、高血糖（空腹時血糖値が１１０ｍｇ／ｄＬ以上）のうちの２つ以上のリスクを持つ場合をメタボリックシンドロームと診断することとなった（非特許文献４）。この基準を用いた場合、人間ドックを受診した２９０名の成人男子のうち、肥満症と診断された人が６１名（２１％）であったのに対して、メタボリックシンドロームと診断された人は２７名（９％）であり、肥満症に含まれずにメタボリックシンドロームと診断された人も９名（３％）存在したという報告もある（非特許文献５）。
肥満は基本的には摂取するエネルギー（カロリー）の量が消費するエネルギー（カロリー）の量を持続的に上回ることが原因と考えられることから、肥満または肥満症の人に対しては体重特に体脂肪率を下げるため、食事療法や運動療法などを行なうことが推奨されている。しかしながら、それらの療法の継続に対しては食欲の増進・生活習慣の変化への適応・運動負荷への多くのストレスがかかり、それを継続することは多くの困難を乗り越える必要がある。さらに食事療法において摂取カロリーを低下させた場合には、腸管からの栄養吸収率の増大や身体のエネルギー代謝が低下するという現象が見られるいわゆるリバウンド現象が起こることで、食事療法の継続を断念してしまう場合も見られる。肥満症の内科的治療には中枢性食欲抑制薬・熱代謝促進薬・消化吸収阻害薬・脂肪合成阻害薬などが存在するが、現在日本において保険診療で使用可能な薬剤は中枢性食欲抑制剤に分類されるマジンドールのみである。しかもマジンドールは覚醒剤類似の化合物であって、興奮、苛立ち、心血管系への負荷、排尿困難その他の副作用があり、使用が3ヶ月以内も限定されていることなどから使用しやすい薬剤とはいえない（非特許文献６）。
肥満に対して過度の体重の低下（いわゆる「やせ」）や摂食の低下（いわゆる「食欲不振」）は、生体防御（免疫）反応の低下による易感染、造血系障害、無月経または月経不順、不妊症、精神的障害、末梢神経麻痺、低血圧、骨粗鬆症などを引き起こす原因として問題になる。一般的にBMIが＜１８．５Ｋｇ／ｍ2の場合、もしくは体脂肪率が男性では１０％以下、女性では１５％以下の場合をやせに分類する。2000年の厚生労働省による国民栄養調査では、女性においてはBMI＜１８．５Ｋｇ／ｍ2の人の割合は20歳から39歳でこの10年および20年の間で確実に増えており、20〜29歳の人においては約２４％が「やせ」に分類される。これは若年の女性において体型を気にするための意図的な摂食量の調節による可能性もある。しかしながら、この年代層で多発する中枢性摂食異常症の中の神経性食欲不振症（拒食症）などにおいては食欲自体が極度に低下して、栄養状態が悪化して全身衰弱で死亡する場合もある。また、従来胃下垂・胃アトニー・神経性胃炎と言われていた概念を含む食欲が低下する疾患として、Functional dyspepsiaと呼ばれる疾患があり、この疾患は、食後早期の満腹感、食欲低下などの症状を示すと言われている（非特許文献７）。さらに、食欲不振を起こす原因としては癌、炎症性疾患、下垂体・甲状腺・副腎などの機能低下、手術後、過度のストレスなどが挙げられ、このような状態で長期間食欲不振が持続することは身体の衰弱を引き起こす。
このような状況において、近年摂食を調節する生体内因子の研究が盛んに行われており、レプチン・アディポネクチン・グレリンなどの因子と摂食調節との関連についても研究がされている。しかしながら現状ではどのような因子が摂食調節および／または体重調節に中心的に働いているかについてはまだ結論は出ておらず、また上述のような因子が実際に治療に使われるまでには至っていない。中でも、レプチンは摂食調節及び体重調節に関わる因子として注目され、組換え体レプチンの臨床応用が試みられている経緯もあるが、効果が見られるのは肥満患者のうちのごく一部である（非特許文献８）。また、肥満患者においてはレプチンに対する抵抗性を示す患者が多く存在するといわれており、薬効を表すためには大量のレプチンの投与が必要とされており、また投与による効果も患者の個人差が大きいといわれている（非特許文献９）。さらに、近年レプチンの作用は摂食調節及び体重調節に特異的ではなく多くの生理作用を持つことが発見され、レプチンの投与は血圧の上昇作用、血小板凝集作用、酸化ストレスの増大作用等を介しての心血管系への副作用が懸念されるほか、腎臓や肝臓での線維化への関与、さらに発ガンとの関係も示唆されており、治療薬として用いるための問題点も示唆されている（非特許文献１０、非特許文献１１）。
このため、摂食調節および／または体重調節において中心的に働いている因子を同定して、それを肥満および肥満症の治療に応用することが望まれている。しかし、摂食調節および／または体重調節への関与が報告されている因子は少なく、たとえば、糖尿病の治療薬として広く用いられているＰＰＡＲγアゴニストは、摂食調節および／または体重調節への直接的な関与については報告されていない。
一方、ＮＥＦＡ（Nuclear EF-hand acidic）は、NucleobindinII（NUCB２）とも言われ、ＮＥＦＡ遺伝子にコードされるポリペプチドはカルシウム結合ドメイン（ＥＦドメイン）およびＤＮＡ結合ドメインをもっている（非特許文献１２）。ＮＥＦＡはNucleobindinとの相同性が高く、カルシウム反応性をもつEF-handスーパーファミリーと言われるＤＮＡ結合因子の一員であると考えられている（非特許文献１３）。実際にＮＥＦＡにおけるカルシウム結合能や細胞の増殖制御因子であるNecdinとの結合性などについて調べられているが（非特許文献１４および非特許文献１５）、詳細な生理学的作用についての報告はない。またＮＥＦＡは眼科疾患であるUsher’s Syndromeや胃がんの原因遺伝子の可能性について調べられた経緯もある（非特許文献１６および非特許文献１７）。さらに、ＮＥＦＡポリペプチドはそのアミノ末端側にシグナル配列を持ち細胞外に分泌される可能性についても示されているが（非特許文献５）、細胞外に分泌されたことによる生理的・薬理的な作用については全く報告がない。また、ＮＥＦＡと摂食調節および／または体重調節との関係を示唆する報告もない。
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本発明が解決しようとする課題は、摂食調節および／または体重調節に関与する因子の新規の取得方法を提供すること、ならびに該方法により得られる遺伝子、該遺伝子がコードするポリペプチド、または該遺伝子のコードするポリペプチドの情報より得られた新規のポリペプチドを、摂食障害および／または体重調節に関連する疾患の治療・制御・診断の手段として提供することである。また、該遺伝子またはポリペプチドの作用を阻害する物質を、摂食調節および／または体重調節に関連する疾患の治療・制御・診断の手段として提供することである。さらには、該遺伝子もしくはポリペプチド、またはそれらの活性を阻害する物質により得られる、摂食調節および／または体重調節に関連する疾患のモデル動物を提供することである。また、これらを利用する該ポリペプチドの作用または発現を調節する化合物のスクリーニング方法、該スクリーニング方法により選別される化合物、および該化合物を利用する疾病の診断手段、治療薬を提供することである。
本発明者らは、摂食調節および／または体重調節に関与する因子の新規の取得方法を開発すべく種々検討を重ねた結果、ＰＰＡＲγアゴニスト活性を有するチアゾリジンジオン類を用いることにより、摂食抑制および／または体重の減少に関与する遺伝子およびポリペプチドを取得できることを見出した。また、該方法により得られた因子は、これまで機能について報告されていなかったＮＥＦＡであることを見出し、該ポリペプチド性の因子をＮＥＳＦＡＴＩＮと命名した。ＮＥＳＦＡＴＩＮについて検討を行った結果、従来の報告では機能ドメインが示されていなかった部分配列が、摂食抑制および／または体重の減少に対する活性を示すことを見出し、新規のポリペプチドＮＥＳＦＡＴＩＮ−１、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ１６、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ１４およびＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ１０Ｍを開示するに至った。また、ＮＥＦＡ／ＮＥＳＦＡＴＩＮとアミノ酸配列および遺伝子での塩基配列の相同性が高く、同じファミリーに属するNucleobindinI（NUCB１）において、NUCB1のNESFATIN-1M30に相当する部位であるNUCB1-M30でも同様の活性を示すことを見出した。
さらに、ＮＥＳＦＡＴＩＮ、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１もしくはNESFATIN-1M30に結合する抗体が、摂食亢進および体重の増加に対する活性をもつことも見出し、ＮＥＳＦＡＴＩＮ、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１もしくはNESFATIN-1M30の活性阻害が摂食の亢進および体重の増加に効果があることを確認した。
すなわち本発明は以下のものを提供する。
（１）ＰＰＡＲγアゴニスト活性を有するチアゾリジンジオン類の化合物を哺乳類細胞に作用させる工程、および該化合物によって発現誘導される遺伝子を同定する工程を含む、摂食調節および／または体重調節の関連因子の取得方法。
（２）前記チアゾリジンジオン類の化合物が、トログリタゾンである（１）記載の方法。
（３）哺乳類細胞が、肺非小細胞癌細胞株、脂肪細胞または脳神経由来細胞である（１）または（２）記載の方法。
（４）摂食調節および／または体重調節が、摂食抑制および／または体重増加抑制である（１）、（２）または（３）記載の方法。
（５）配列番号６５〜７３または１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（６）配列番号３９〜４１または１０１〜１０３のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（７）配列番号１３〜１５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（８）摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有する、配列番号３、６または９に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（９）配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも６０％以上のホモロジーをもつアミノ酸配列；または配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、その一部のアミノ酸が欠失、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、摂食抑制および／もしくは体重増加抑制活性を有するポリペプチド。
（１０）配列番号３、６もしくは９で示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも６０％以上のホモロジーをもつアミノ酸配列；または配列番号３、６もしくは９で示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、その一部のアミノ酸が欠失、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、摂食抑制および／もしくは体重増加抑制活性を有するポリペプチドであって、配列番号３、６または９のアミノ酸番号８２〜１６２に相当するアミノ酸配列中に、生体内に含まれる切断酵素の認識部位を少なくとも１つ含むポリペプチド。
（１１）Ｎ末端またはＣ末端に少なくとも１つ以上のアミノ酸が付加された（５）〜（１０）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１２）少なくとも１つのアミノ酸残基が、化合物またはペプチドによって修飾された（５）〜（１０）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１３）前記体重増加抑制活性が、体脂肪増加抑制活性である（５）〜（１２）のいずれかに記載のポリペプチド。
（１４）（５）〜（１３）のいずれかに記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
（１５）配列番号７４〜８２または１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子。
（１６）配列番号４４〜４６または１０４〜１０６のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子。
（１７）配列番号１８〜２０に示される塩基配列を含む核酸分子。
（１８）配列番号１０、１１または１２に示される塩基配列を含み、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子。
（１９）配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、１１６〜１２４に示される塩基配列またはその部分配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子。
（２０）前記体重増加抑制活性が、体脂肪増加抑制活性である（１４）〜（１９）のいずれかに記載の核酸分子。
（２１）（１４）〜（２０）のいずれかに記載の核酸分子を含むベクター。
（２２）核酸分子が、該核酸分子の発現を制御する調節性核酸分子の制御下に機能的に結合された（２１）記載のベクター。
（２３）（１４）〜（２０）のいずれかに記載の核酸分子を含む形質転換体。
（２４）前記核酸分子の転写産物を発現する（２３）記載の形質転換体。
（２５）前記核酸分子がコードするポリペプチドを発現する（２３）または（２４）記載の形質転換体。
（２６）形質転換体が、微生物である（２３）、（２４）または（２５）記載の形質転換体。
（２７）微生物が、エッセリシャ・コリである（２６）記載の形質転換体。
（２８）形質転換体が、哺乳類細胞である（２３）、（２４）または（２５）記載の形質転換体。
（２９）形質転換体が、植物細胞である（２３）、（２４）または（２５）記載の形質転換体。
（３０）有効成分として、（５）〜（１３）のいずれかに記載のポリペプチドもしくは該ポリペプチドのアミノ酸配列の一部を含むペプチド、（２１）もしくは（２２）記載のベクター、または（２３）〜（２９）のいずれかに記載の形質転換体を含有する摂食抑制および／または体重増加抑制のための医薬組成物。
（３１）前記体重増加抑制が、体脂肪増加抑制である（３０）記載の医薬組成物。
（３２）肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、整形外科的疾患、月経異常および悪性腫瘍より選択される疾患の患者のための（３０）または（３１）記載の医薬組成物。
（３３）悪性腫瘍が、乳ガン、子宮ガン、結腸ガン、腎臓ガン、食道ガン、膵臓ガン、肝臓ガンまたは胆嚢ガンのいずれかである（３０）または（３１）記載の医薬組成物。
（３４）薬学的に許容される添加剤を含有する（３０）〜（３３）のいずれかに記載の医薬組成物。
（３５）（５）〜（１３）記載のポリペプチドのいずれかと結合する抗体。
（３６）配列番号２４、３２に示すアミノ酸配列からなるペプチドと結合する（３５）記載の抗体。
（３７）（５）〜（１３）のいずれかに記載のポリペプチドの活性または産生を抑制する物質。
（３８）前記ポリペプチドと結合することにより、該ポリペプチドの活性を抑制する（３７）記載の物質。
（３９）前記ポリペプチドの活性を抑制する物質が、（３５）または（３６）記載の抗体である（３７）記載の物質。
（４０）（５）〜（１３）記載のポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制する物質。
（４１）前記遺伝子の発現抑制物質が、アンチセンスオリゴヌクレオチド分子である（４０）記載の遺伝子発現抑制物質。
（４２）アンチセンスオリゴヌクレオチド分子が、配列番号３１に示される塩基配列を含む（４１）記載の遺伝子発現抑制物質。
（４３）遺伝子の発現抑制物質が、ＲＮＡｉ分子である（４０）記載の遺伝子発現抑制物質。
（４４）（４１）もしくは（４２）記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド分子、または（４３）記載のＲＮＡｉ分子の核酸配列と相補的な塩基配列からなる核酸分子を含む、該アンチセンスオリゴヌクレオチド分子または該ＲＮＡｉ分子を製造するためのベクター。
（４５）（３７）〜（４３）のいずれかに記載の物質または（４４）記載のベクターを含有する、食欲亢進または体重増加亢進のための医薬組成物。
（４６）薬学的に許容される添加剤を含有する（４５）記載の医薬組成物。
（４７）（１４）〜（２０）のいずれかに記載の核酸分子、または（２１）〜（２２）のいずれかに記載のベクターを含むトランスジェニック非ヒト生物。
（４８）（１４）〜（２０）のいずれかに記載の核酸分子が発現される、（４７）記載のトランスジェニック非ヒト生物。
（４９）（２３）から（２８）記載の形質転換体のいずれかが導入された（４７）または（４８）記載のトランスジェニック非ヒト生物。
（５０）前記トランスジェニック非ヒト生物が、摂食抑制状態または体重増加抑制状態を示すトランスジェニック非ヒト動物である（４７）、（４８）または（４９）記載のトランスジェニック非ヒト生物。
（５１）前記トランスジェニック非ヒト生物が、トランスジェニック植物である（４７）、（４８）または（４９）記載のトランスジェニック非ヒト生物。
（５２）（３５）もしくは（３６）記載の抗体、（３７）〜（３９）のいずれかに記載の抑制物質、（４０）〜（４３）記載の遺伝子発現抑制物質、または（４４）記載のベクターが導入され、食欲亢進または体重増加亢進を示すトランスジェニック非ヒト動物。
（５３）配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の全領域または一部を欠損させたノックアウト非ヒト動物。
（５４）食欲亢進または体重増加を示す（５３）記載のノックアウト非ヒト動物。
（５５）肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、整形外科的疾患、月経異常および悪性腫瘍より選択される疾患のモデル動物として用いることができる（５２）、（５３）または（５４）記載の非ヒト動物。
（５６）無細胞タンパク質合成法または化学合成法による（５）〜（１３）のいずれかに記載のペプチドの製造方法。
（５７）（２３）〜（２９）のいずれかに記載の形質転換体、（４７）〜（５１）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト生物、または（５２）〜（５５）のいずれかに記載の非ヒト動物、を用いる（５）〜（１３）のいずれかに記載のペプチドの製造方法。
（５８）前記ペプチドと（３５）または（３６）記載の抗体との脱着による精製工程を含む（５６）または（５７）記載の製造方法。
（５９）前記ペプチドをＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、グルタチオン結合担体を用いて精製する工程を含む（５６）または（５７）記載の製造方法。
（６０）前記ペプチドをＨｉｓタグ融合タンパク質として発現させ、金属イオンキレート担体を用いて精製する工程を含む（５６）または（５７）記載の製造方法。
（６１）前記ペプチドをＦＬＡＧタグ融合タンパク質として発現させ、抗ＦＬＡＧタグ抗体の結合した担体を用いて精製する工程を含む（５６）または（５７）記載の製造方法。
（６２）摂食亢進または体重増加の状態を予測または診断するための検定方法であって、哺乳類動物の生体試料中の、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子、または配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの含有量を検出する工程を含む方法。
（６３）哺乳類動物の生体試料中の前記核酸分子または前記ポリペプチドの含有量を、正常個体の生体試料と比較する工程を含む（６２）記載の検定方法。
（６４）哺乳類動物の生体試料中の前記核酸分子または前記ポリペプチドの含有量の低下状態を、摂食亢進または体重増加の状態と判断する工程を含む、（６２）または（６３）記載の検定方法。
（６５）哺乳類動物の生体試料中の前記核酸分子または前記ポリペプチドの含有量の低下状態を、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、整形外科的疾患、月経異常および悪性腫瘍より選択される疾患の発症またはそのおそれがあると判断する工程を含む、（６２）〜（６４）のいずれかに記載の検定方法。
（６６）哺乳類動物の生体試料中の前記核酸分子または前記ポリペプチドの含有量の増加状態を、摂食抑制状態または体重増加抑制の状態と判断する工程を含む、（６２）または（６３）記載の検定方法。
（６７）前記ポリペプチドの含有量の検出を、（３５）または（３６）記載の抗体を用いて行なう（６２）〜（６６）のいずれかに記載の検定方法。
（６８）前記核酸分子の含有量の検出を、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、または１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子を検出するためのＰＣＲプライマー、プローブまたはＤＮＡチップを少なくとも１つ用いて行なう（６２）〜（６６）のいずれかに記載の検定方法。
（６９）（６２）〜（６８）のいずれかに記載の検定方法に用いられる検定キットであって、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子を検出するためのＰＣＲプライマー、プローブもしくはＤＮＡチップ；または配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、または１０７〜１１５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを認識する抗体、標準ペプチドまたは結合競合反応用ペプチド修飾体のうち少なくとも１つ含む検定キット。
（７０）試験物質を哺乳類細胞に接触させる工程、および該細胞における、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、もしくは１０４〜１０６、１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現量の増加を、または該細胞内に含まれるもしくは細胞外に分泌される、配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量の増加を検出する工程を含む、摂食抑制および／または体重増加抑制の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
（７１）哺乳類細胞が、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、または１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現を制御する調節性核酸分子と、レポーター遺伝子の核酸分子とが導入されたものであり、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、または１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現誘導をレポーター遺伝子の発現誘導により検出する（７０）記載のスクリーニング方法。
（７２）哺乳動物に試験物質を投与する工程、および該試験動物の生体試料における配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現の亢進を、または配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの産生亢進を検出する工程を含む、摂食抑制および／または体重増加抑制の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
（７３）（４７）〜（５０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト生物、または（５２）〜（５５）のいずれかに記載の非ヒト動物に試験物質を投与する工程、および該トランスジェニック非ヒト生物または非ヒト動物における摂食の抑制または体重増加の抑制を検出する工程を含む、摂食抑制および／または体重増加抑制の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
（７４）前記摂食抑制および／または体重増加抑制の効果を有する治療剤または予防剤が、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、整形外科的疾患、月経異常および悪性腫瘍より選択される疾患に対する治療剤または予防剤である（７０）〜（７３）のいずれかに記載のスクリーニング方法。
（７５）（７０）〜（７４）のいずれかに記載の方法によって得られた、摂食抑制および／または体重増加抑制の効果を有する治療剤または予防剤。
（７６）前記摂食抑制および／または体重増加抑制の効果を有する治療剤または予防剤が、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、整形外科的疾患、月経異常および悪性腫瘍より選択される疾患に対する治療剤または予防剤である（７５）記載の治療剤または予防剤。
（７７）試験物質を哺乳類細胞に接触させる工程、および該細胞における、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現量の減少を、または該細胞内に含まれるもしくは細胞外に分泌される配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量の減少を検出する工程を含む、摂食亢進および／または体重増加亢進の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
（７８）哺乳類細胞が、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、または１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現を制御する調節性核酸分子と、レポーター遺伝子の核酸分子とが導入されたものであり、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、または１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現抑制をレポーター遺伝子の発現抑制を検出する（７７）記載のスクリーニング方法。
（７９）哺乳動物に試験物質を投与する工程、および該試験動物の生体試料における配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現抑制を、または配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの産生抑制を検出する工程を含む、摂食亢進および／または体重増加亢進の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
（８０）（４７）〜（５０）のいずれかに記載のトランスジェニック非ヒト生物、または（５２）〜（５５）のいずれかに記載の非ヒト動物に試験物質を投与する工程、および該トランスジェニック非ヒト生物または該非ヒト動物における摂食の亢進または体重増加の亢進を検出する工程を含む、摂食亢進および／または体重増加亢進の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
（８１）（７７）〜（８０）のいずれかに記載の方法によって得られた、摂食亢進および／または体重増加亢進の効果を有する治療剤または予防剤。
本発明は、ＰＰＡＲγアゴニストを用いることにより、摂食および体重調節に関与する因子を取得することができる。また、ＮＥＳＦＡＴＩＮ、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ１６、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ１４、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ１０Ｍ、ＮＵＣＢ１−Ｍ３０、ＮＵＣＢ１−Ｍ１６、ＮＵＣＢ１−Ｍ１４、ＮＵＣＢ１−Ｍ１０Ｍを用いることにより、肥満または肥満症、神経性過食症などの代謝・摂食障害に係る疾患、２型糖尿病、耐糖能異常、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、変形性関節症などの整形外科的疾患、月経異常、悪性腫瘍などの肥満症に関連する疾患を予防または治療することができる。さらに、抗体などのＮＥＳＦＡＴＩＮ、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１またはNESFATIN-1M30の活性を抑制する物質を用いることにより、手術後および／または癌の患者における食欲不振や拒食症などの栄養・摂食障害に係る疾患を予防または治療することができる。
＜摂食調節および／または体重調節に関連する因子の取得方法＞
本発明は、ＰＰＡＲγアゴニスト活性を有するチアゾリジンジオン類の化合物を哺乳類細胞に作用させる工程、および該化合物によって発現誘導される遺伝子を同定する工程を含む、摂食調節および／または体重調節の関連因子の取得方法に関する。
本発明において「摂食調節」とは、一定期間内の動物における摂餌またはヒトにおける食事（以下、あわせて摂餌等と言う）の量の調節、または一定期間内に摂餌等によって摂取するカロリーの総量の調節を言う。また、摂食調節には、食欲や満腹感の調節など摂餌等の動機となる事象についての調節も含まれる。
ここで「摂食抑制」とは、摂食調節がなされていない時点と比較して、摂餌等の量もしくは摂餌等によって摂取するカロリーの総量が減少している状態、または摂食調節がなされていない状況下と比較して、摂餌等の量や摂餌等によって摂取するカロリーの総量が増大していく傾向が抑えられている状態を言う。また、摂食抑制には食欲の減退、満腹感の亢進などの状態も含まれる。
一方、ここで「摂食亢進」とは、摂食調節がなされていない時点と比較して、摂餌等の量もしくは摂餌等によって摂取するカロリーの総量が増加している状態、または摂食調節がなされていない状況下と比較して摂餌等の量もしくは摂餌等によって摂取するカロリーの総量が低下していく傾向が抑制された状態を言う。また、食欲亢進には食欲の増大、満腹感の抑制なども含まれる。
「体重調節」とは、ヒトまたは動物において、体重絶対値、体格指数（体重と体長を用いた指標）または体脂肪率を調節することを言う。ここで「体重増加抑制」とは、体重調節がされていない時点と比較して、体重絶対値、体格指数もしくは体脂肪率が低下しているもしくは維持されている状態、または体重調節がなされていない状況下と比較して、体重絶対値、体格指数もしくは体脂肪率が増加していく傾向が抑制されている状況を言う。
なお、本明細書において「体脂肪増加抑制」とは、体重調節されていない時点と比較して体脂肪率が低下しているもしくは維持されている状態、または体重調節がなされていない状況下と比較して、体脂肪率が増加していく傾向が抑制されている状況を言う。また、「体重増加亢進」とは、体重調節がされていない時点と比較して、体重絶対値、体格指数もしくは体脂肪率が増加もしくは維持されている状態、または体重調節がなされていない状況下と比較して、体重絶対値、体格指数もしくは体脂肪率が増加していく傾向が抑制されている状況を言い、本明細書においては「体重減少抑制」とも言う。ヒトの場合、体格指数の代表的なものとして、身長ＢＭＩ（Ｂｏｄｙ Ｍａｓｓ Ｉｎｄｅｘ）が用いられ、その計算は体重（ｋｇ）÷身長（ｍ）÷身長（ｍ）で単位はＫｇ／ｍ2で表される。従って、体重増加抑制または体重増加亢進の効果は、このようなＢＭＩを指標として表すことも可能である。また、体脂肪率は、体重に占められる体脂肪の重量の割合で示され、その測定は、体密度法・体水分法・体内カリウム量測定法・インピーダンス法・二重エネルギーＸ線吸収法・中性子賦活法・近赤外分光法・皮下脂肪厚法・画像法などで行なうことが可能である（日本臨牀 61巻 増刊号６ ｐ357-400 2003年 日本臨牀社刊）。
本発明において、「ＰＰＡＲγアゴニスト活性を有するチアゾリジンジオン類の化合物」とは、たとえば、トログリタゾン、ピオグリタゾン、ロシグリタゾンおよびリボグリタゾンなどが含まれ、なかでもトログリタゾンは最初に臨床的に使用された物質である。
本発明において摂食調節および／または体重調節の関連因子の取得に用いられる哺乳類細胞としては、肺非小細胞癌細胞株、脂肪細胞および脳神経由来細胞などがあげられるが、ＰＰＡＲγを発現している細胞であればとくにこれらに限定されない。
前記化合物を哺乳類細胞に作用させる方法は、たとえば、以下に述べるように、前記細胞を該化合物の刺激下で培養する方法がある（Satoh等 オンコジーン（Oncogene）（England） 2002年 21巻 ｐ2171-2180）。
前記該化合物によって発現誘導される遺伝子の同定は、たとえば、特異的に発現が誘導された遺伝子を、サブトラクション法やＤＮＡアレイ解析などの方法を用いることにより行なうことができる（Satoh等 オンコジーン（Oncogene）（England） 2002年 21巻 ｐ2171-2180）。また、得られたＰＰＡＲγの活性化によって特異的に誘導される遺伝子の中から、細胞外に分泌される因子をコードしているものを選択するためには、その遺伝子の塩基配列を解析して分泌シグナルペプチドがコードされているかによって選択することが可能である。さらに、それらの遺伝子の中から摂食調節および／または体重調節に関与する遺伝子を選択する方法としては、ヒトまたは動物の視床下部を含む脳の試料、および該遺伝子によってコードされているポリペプチドに結合する抗体を用いる組織抽出物での免疫学的検出（実施例３に例示）や組織化学的方法（実施例４および９に例示）などの方法、イン・サイチユ・ハイブリダイゼーション法（in situ hybridization：実施例８に例示）やＲＴ−ＰＣＲ法などを用いる視床下部での発現を確認する方法があげられる。
また、得られた摂食調節および／または体重調節に関与する遺伝子は、その塩基配列を解析することによってコードするポリペプチドのアミノ酸配列を同定することができる。得られたポリペプチドのアミノ酸配列またはその部分的なアミノ酸配列を含むペプチドまたはポリペプチドは、遺伝子工学的または合成化学的な手法を用いて作製することが可能である。
このようにして得られたポリペプチド、または生体内で発現する形で導入された該ペプチドをコードする核酸分子を、試験動物に局所的または全身的に導入し、該動物の摂食量および／または体重の変化を調べることによって、得られたポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする遺伝子の中から、摂食調節および／または体重調節に関連するポリペプチドまたは遺伝子を選択することができる。また別の方法としては、得られたポリペプチドに対して結合する抗体や、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制しうるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子やＲＮＡｉ分子などを試験動物に局所的または全身的に導入し、該動物の摂食量および／または体重の変化を調べることによって、得られたポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする遺伝子の中から、摂食調節および／または体重調節に関連するポリペプチドまたは遺伝子を選択することもできる。
＜摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチド＞
本発明は、前記方法によって得られる摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドに関する。このようなポリペプチドとしては、今まで機能が同定されていなかったＮＥＳＦＡＴＩＮ遺伝子がコードするポリペプチドがあげられ、該ポリペプチドが前記機能を有することは本発明において初めて見出されたものである。本発明において、ＮＥＳＦＡＴＩＮ遺伝子は、食欲を制御していると言われる脳の視床下部に発現することが発見され（実施例４、８、９、２４および２６に例示）、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドは動物の脳内に投与されることによって動物の摂餌量および体重の低下を引き起こすことが見い出された（実施例６および２５に例示）。さらにＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドの機能の抑制またはＮＥＳＦＡＴＩＮ遺伝子の発現を阻害することによって、動物において摂食亢進および体重増加が引き起こされることが示された（実施例７および実施例１５に例示）。
また、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドの例としては、配列番号３、６および９で示されるアミノ酸配列を含むものがあげられる。ヒトのシグナルペプチドを含んだ前駆体ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドを、配列番号２に示す。前駆体ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドは細胞外に分泌された際にはシグナルペプチドが切断されるため、実質的に活性を示すヒトの成熟型ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドは配列番号３に示す形となる。なお、本明細書において、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドは、単にＮＥＳＦＡＴＩＮともいう。
さらに、本発明において前記摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドについての研究を鋭意継続した結果、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有する新規の構造のポリペプチドを発明するに至った。この新規構造のポリペプチドの発見はＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドが細胞外に分泌される際にタンパク質分解酵素によって分解を受ける可能性を想定して、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドに由来する種々のペプチドについての検討によるものである。その結果、配列番号５に示したＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドのアミノ酸番号２５番から１０６番に相当する配列をもつ８２アミノ酸からなるポリペプチドが、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を示すこと、および体脂肪率を低下させることを発見し（実施例１２、実施例１３および実施例３４に例示）、さらにＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドの機能の抑制を阻害することによって、動物において摂食亢進が引き起こされることが示された。このことから、該ポリペプチドをＮＥＳＦＡＴＩＮ−１（配列番号１４）と命名した。ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドはカルシウム結合性およびＤＮＡ結合性のドメインなどを構造内にもっているが、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドはこれらの既知のドメイン構造を含まない配列であり、このＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドを取得することは従来の技術から予期することは全く不可能であった。また、生体内のペプチドホルモンでは、前駆体タンパク質の形で発現され、その後タンパク質分解酵素等で切断される形をとる例も多く知られており、その作用にはプロホルモン・コンバターゼ（Prohormone ConvertaseまたはProprotein Convertase：PC）が関与している例が多く報告されている。配列番号２のヒト全長ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、配列番号５のマウス前駆体ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドおよび配列番号８のラット前駆体ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドには、プロホルモン・コンバターゼのサブタイプであるPC1/3（EC 3.4.21.93、セイダー（Seidah）等 ディーエヌエー・アンド・セル・バイオロジー（ＤＮＡ and Cell Biology）（USA）9巻 1990年 p415-424）やPC2（EC 3.4.21.94、セイダー（Seidah）等 ディーエヌエー・アンド・セル・バイオロジー（ＤＮＡ and Cell Biology）（USA）9巻 1990年 p415-424）によって切断される可能性のある共通の部位が存在し（実施例１０参照）、それぞれ配列番号１３から１５に示すＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ペプチドが切り出される可能性が示された。
また、プロホルモン・コンバターゼによって切断される部位に変異を入れたＮＥＳＦＡＴＩＮ（Ｍｕｔ）をラット脳室内に投与した場合には、摂食の抑制効果が認められないという意外な結果が得られた（実施例１４）。このことから、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドが、生体内で摂食調節および／または体重調節に関与する機能分子である可能性が示されたとともに、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドが機能するためには、プロホルモン・コンバターゼなどの生体内に含まれるプロテアーゼによってプロセスされる過程が重要であることが見出された。
以上より、NESFATIN／NEFAが、プロインスリンのようにホルモンの前駆体として機能することは全く知られておらず、本発明においてNESFATIN／NEFAの発現部位や、PC１／３およびPC2が発現する細胞でのNESFATIN／NEFAの発現を解析し、活性と構造について鋭意検討した結果、初めて見出されたものである。また、プロホルモン・コンバターゼの認識部位であるArg-ArgやLys−Argの配列が存在してもPC1/3・PC2でプロセスされない分泌タンパク質も存在することから、NESFATIN／NEFAからNESFATIN-1が切り出されて摂食抑制および／または体重増加抑制活性を示す事は容易に類推されるものではない。
以上より、本発明は、配列番号１３〜１５に示されるＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドにも関する。該ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドは、前述のとおり、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するものである。マウスのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１４に示す。このような配列をもつＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドは、配列番号１４のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドをプロホルモン・コンバターゼで切断して、逆相クロマトグラフィーなどの手法で精製するか、または後述のＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドに対する抗体に対する結合と遊離の工程を行なうことで取得することができる。
さらにＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドの構造と摂食抑制および／または体重増加抑制活性について鋭意検討を継続した結果、配列番号１４に示したＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドのアミノ酸番号２４番から５３番に相当する配列をもつ３０アミノ酸からなる新規のポリペプチドが、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を示すことを発見し（実施例２０に例示）、該ポリペプチドをNESFATIN-1M30（配列番号４１）と命名した。NESFATIN-1M30ポリペプチドの発見は、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドまたはＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドが生理的もしくは人工的に切断または分解された場合であっても、NESFATIN-1M30に相当する部分を含むポリペプチドが存在すれば、該ポリペプチドは摂食抑制および／または体重増加抑制活性を保有することが示している。
さらに、３０アミノ酸長よりなるNESFATIN-1M30の構造のうち、摂食抑制の活性を持つ部位の活性について検討した。その結果、その部分ペプチドである１６アミノ酸長からなるNESFATIN-1M16、１４アミノ酸長からなるNESFATIN-1M14、１０アミノ酸長からなるNESFATIN-1M10Mは、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を保有することが示された（実施例２２）。
このような配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５に示される８２アミノ酸よりなるＮＥＳＦＡＴＩＮ−１の配列を、既知の摂食調節作用を持つ因子のアミノ酸配列に対する相同性について解析した結果では強い相同性を持つ配列は見つからないことから、これらのNESFATIN-1M30、NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10Mが摂食抑制および／または体重増加抑制活性を示すことを予測することは従来の技術からは不可能であった。また、活性を示さなかったヒト由来のＮＥＳＦＡＴＩＮおよびＮＥＳＦＡＴＩＮ−１であっても、これらNESFATIN-1M30、NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10Mに相当するポリペプチドにおいては、活性を有することも明らかとなった。
すなわち、本発明は、配列番号３９〜４１に示されるNESFATIN-1M30ポリペプチド、配列番号６５、６８もしくは７１に示されるNESFATIN-1M16ポリペプチド、配列番号６６、６９もしくは７２に示されるNESFATIN-1M14ポリペプチド、または配列番号６８、７０もしくは７３に示されるNESFATIN-1M10Mポリペプチドに関する。該NESFATIN-1M30ポリペプチド、NESFATIN-1M16ポリペプチド、NESFATIN-1M14ポリペプチド、およびNESFATIN-1M10Mポリペプチドは、前述のとおり、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するものである。また、ヒトのNESFATIN-1M30ポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３９に示す。さらにここでは、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１３、配列番号１４または配列番号１５に示される配列をもつポリペプチドを除く、配列番号３９、配列番号４０または配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドのうち、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドもＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０ポリペプチドに含まれる。このようなポリペプチドの例としては、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドもしくはＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドが生理的または人工的に切断または分解されたポリペプチドの内、NESFATIN-1M30に相当する配列が含まれるものが挙げられる。
ＮＥＦＡ／ＮＥＳＦＡＴＩＮとアミノ酸配列および遺伝子での塩基配列の相同性が高く、同じファミリーに属するNucleobindinI（NUCB1）において、NUCB1のNESFATIN-1M30に相当する部位であるNUCB1-M30も同様の活性を示すかどうか検討を行なった。その結果、NUCB1-M30も摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有することが明らかとなった（実施例２３）。また、ヒト・ラット・マウスのNESFATINを比較したところ、各種におけるNESFSATINおよびNUCB1のNESFASTIN-1に相当する部位、特にNESFATIN-1M30に相当する部位において、アミノ酸配列の保存性が高いことが示された。以上より、NESFATIN-1M16ポリペプチド、NESFATIN-1M14ポリペプチド、およびNESFATIN-1M10Mポリペプチドと同様、NUCB1の１６アミノ酸長からなるNUCB1-M16、１４アミノ酸長からなるNUCB1-M14、１０アミノ酸長からなるNUCB1-M10Mも、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を保有することが推測される。
すなわち、本発明は、配列番号１０１〜１０３に示されるNUCB1-M30ポリペプチド、配列番号１０７、１１０もしくは１１３に示されるNUCB1-M16ポリペプチド、配列番号１０８、１１１もしくは１１４に示されるNUCB1-M14ポリペプチド、または配列番号１０９、１１２もしくは１１５に示されるNUCB1-M10Mポリペプチドに関する。該NUCB1-M30ポリペプチド、NUCB1-M16ポリペプチド、NUCB1-M14ポリペプチド、およびNUCB1-M10Mポリペプチドは、前述のとおり、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するものである。
また、本発明は、配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３もしくは１０７〜１１５で示されるアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも６０％以上のホモロジーをもつアミノ酸配列からなり、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドにも関する。配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３もしくは１０７〜１１５で示されるアミノ酸配列とのホモロジーは、７０％以上が好ましく、８０％以上がさらに好ましい。その代表的な例としては、ヒト以外の動物種におけるＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０ポリペプチドがあげられる。たとえば、ヒトのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３９）と６０％以上のホモロジーをもつアミノ酸配列からなり、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドとしては、マウスのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０ポリペプチド（配列番号４１）、およびラットのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０ポリペプチド（配列番号４０）などがあげられるが、これらに限定されるものではない。
また、配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３もしくは１０７〜１１５で示されるアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも６０％以上のホモロジーをもつアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドの選択は、該ポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸分子を、試験動物に局所的または全身的に導入し、該動物の摂食量および／または体重を抑制するポリペプチドを選択することによって、行なうことができる。また別の方法としては、前記ポリペプチドに対する抗体や、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制しうるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子やＲＮＡｉ分子などを試験動物に局所的または全身的に導入し、該動物の摂食量および／または体重を抑制するポリペプチドを選択することによって行なうことができる。以下、このようなポリペプチドをＮＥＳＦＡＴＩＮ-1M30改変体、NESFATIN-1M16改変体、NESFATIN-1M14改変体、NESFATIN-1M10M改変体、NUCB1-M30改変体、NUCB1-M16改変体、NUCB1-M14改変体、およびNUCB1-M10M改変体等と言う。
さらに、本発明は、配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３もしくは１０７〜１１５に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、その一部のアミノ酸が欠失、挿入または置換されたアミノ酸配列からなり、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドにも関する。このようなポリペプチドは、たとえば、配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３もしくは１０７〜１１５のアミノ酸配列において、１つ以上のアミノ酸残基を、該アミノ酸と化学的性状または構造的に類似のアミノ酸と置換することにより取得することができる。このような化学的性状または構造的に類似したアミノ酸の置換、すなわち保存性の高いアミノ酸の置換の具体的な態様は、当業者によって広く知られている。たとえば、グリシン（Gly）はプロリン（Pro）、アラニン（Ala）およびバリン（Val）と、ロイシン（Leu）はイソロイシン（Ile）と、グルタミン酸（Glu）はグルタミン（Gln）と、アスパラギン酸（Asp）はアスパラギン（Asn）と、システイン（Cys）はスレオニン（Thr）と、Thrはセリン（Ser）およびAlaと、リジン（Lys）はアルギニン（Arg）と、化学的性状または構造が類似するものである。さらに別の方法としては、アミノ酸の置換し易さを行列として表したアミノ酸マトリックス、例えばＰＡＭ（ウィルバー（Wilbur）、モレキュラー・バイオロジー・アンド・エボリューション（Molecular biology and evolution）（USA） 1985年 ２巻 ｐ434-447）やＢＬＯＳＵＭ（ヘニコフ（Henikoff）等、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）（USA） 1992年 89巻 ｐ10915-10919）などを参照して、そのスコアの高さを勘案してアミノ酸の置換を行うことは、当業者であれば容易に行なうことができる。
また、配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３もしくは１０７〜１１５に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、その一部のアミノ酸が欠失、挿入または置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドのうち、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドの選択は、前述のＮＥＳＦＡＴＩＮ改変体の選択と同様に行なうことができる。また、以下、このようなポリペプチドもＮＥＳＦＡＴＩＮ-1M30改変体等と言う。
さらに、本発明は、配列番号３、６もしくは９で示されるアミノ酸配列のいずれかと少なくとも６０％以上のホモロジーをもつアミノ酸配列；または配列番号３、６もしくは９で示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、その一部のアミノ酸が欠失、挿入もしくは置換されたアミノ酸配列からなり、摂食抑制および／もしくは体重増加抑制活性を有するポリペプチドにも関する。該ポリペプチドを、前述の改変体と同様、以下ＮＥＳＦＡＴＩＮ改変体と言う。当該ＮＥＳＦＡＴＩＮ改変体は、前述のＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０改変体等と同様、配列番号３、６もしくは９で示されるアミノ酸配列とのホモロジーは、７０％以上が好ましく、８０％以上がさらに好ましい。
なお、前述の通り、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドが機能するためには、プロホルモン・コンバターゼなどの生体内に含まれるプロテアーゼによってプロセスされる過程が重要であることが本発明によって明らかとなった。そのため、当該ＮＥＳＦＡＴＩＮ改変体としては、生体内でＮＥＳＦＡＴＩＮ−１、ＮＥＳＦＡＴＩＮ-1M30、NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10M、NUCB1-M30、NUCB1-M16、NUCB1-M14、もしくはNUCB1-M10M（配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３もしくは１０７〜１１５で示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）、またはそれらの改変体を生じるポリペプチドであることが好ましい。このようなＮＥＳＦＡＴＩＮ改変体としては、そのアミノ酸配列中に、生体内に含まれるプロテアーゼなどの切断酵素の認識部位を有することが必要である。このような切断酵素としては、例えば、プロホルモン・コンバターゼ（プロプロテイン・コンバターゼ：PC）などがあげられ、このようなプロホルモン・コンバターゼとしては、例えば、furin、PC1（PC3としても知られる）、PC2、PACE4、PC4、PC6（PC5としても知られる）、LPC（PC7またはPC8としても知られる）などがあげられる（The FASEB Journal, 1216, vol. 17, July 2003）。なお、末梢あるいは脳室内にＮＥＳＦＡＴＩＮ-1等が生じさせるものであればよく、プロテアーゼの種類は特に限定されるものではない。
また同様の理由により、該切断酵素の認識部位の位置も特に限定されるものではないが、ＮＥＳＦＡＴＩＮ改変体であれば、マウス由来ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−２、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−３およびＮＥＳＦＡＴＩＮ−２／３の実験結果より（実施例１０）、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１を生じさせるプロホルモン・コンバターゼの認識部位である、配列番号３、６または９のアミノ酸番号８２・８３と、マウス由来ＮＥＳＦＡＴＩＮに含まれるもう一箇所のプロホルモン・コンバターゼの認識部位である、配列番号３、６または９の１６３・１６４アミノ酸との間、すなわち配列番号３、６または９のアミノ酸番号８２〜１６２に相当するアミノ酸配列中に、生体内に含まれる切断酵素の認識部位を少なくとも１つ含むように設定されることが、生じ得るポリペプチドの活性に影響を与えない点で好ましい。
また、該改変体が、生体内で切断され活性を有するかどうかを含めて、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するものであるかどうかの確認は、前述のＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０改変体等の選択と同様、該ポリペプチド、または該ポリペプチドをコードする核酸分子を、試験動物に局所的または全身的に導入し、該動物の摂食量および／または体重を抑制するポリペプチドを選択することによって、行なうことができる。また別の方法としては、前記ポリペプチドに対する抗体や、該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現を抑制しうるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子やＲＮＡｉ分子などを試験動物に局所的または全身的に導入し、該動物の摂食量および／または体重を抑制するポリペプチドを選択することによって行なうことができる。
本発明のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ-1M30、NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10M、NUCB1-M30、NUCB1-M16、NUCB1-M14、もしくはNUCB1-M10Mは、Ｎ末端またはＣ末端に少なくとも１つ以上のアミノ酸が付加されたものも含む。このようなＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等には、たとえば、配列番号３、配列番号６または配列番号９のアミノ酸配列のＮ末端に、メチオニン残基、アセチル基またはピログルタミン酸等が付加されたもの、およびＮ末端またはＣ末端に適当なタグ配列（典型的にはヒスチジンタグまたはＦＬＡＧタグ）を付加したものが含まれる。このような構成を有するＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等は、金属キレート担体または抗体を用いての精製が容易になるという利点をもつ。また、ＮＥＳＦＡＴＩＮが生体内においてプロホルモン・コンバターゼによりプロセスされた場合には、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１のＣ末端にプロホルモン・コンバターゼ認識部位が付加されたものが生じうると考えられるが、このようなポリペプチドも、本発明のポリペプチドに含まれる。
また、本発明のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ-1M30、NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10M、NUCB1-M30、NUCB1-M16、NUCB1-M14、もしくはNUCB1-M10Mは、少なくとも１つのアミノ酸残基が、化合物またはペプチドによって修飾されたものも含む。このようなＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等には、例えば、配列番号３、配列番号６または配列番号９に示される配列等に、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等以外のペプチドや蛍光物質などを、公知の方法（ハーマンソン（Hermanson）等 バイオコンジュゲート・テクニックス（Bioconjugate techniques）（USA）1996年発行 Academic Press）を用いて酵素的または化学的に会合させて得られるポリペプチドが含まれ、たとえば、オワンクラゲ由来蛍光タンパク質や分泌型アルカリフォスファターゼのアミノ酸配列を付加したもの（いわゆる融合タンパク質）があげられる。たとえば、オワンクラゲ由来蛍光タンパク質との融合タンパク質は、その蛍光強度を測定することによって、分泌型アルカリフォスファターゼとの融合タンパク質は、該酵素とその基質を反応させることによって生じる発色、発光または蛍光の強度を測定することによって、それらの融合タンパク質の存在を容易に検出できる。このようなＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等は、実施例６に記載の方法などで活性を試験することにより、摂食調節および／または体重調節に対する作用を同定することが可能である。
本発明は、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ-1M30、NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10M、NUCB1-M30、NUCB1-M16、NUCB1-M14、もしくはNUCB1-M10Mまたはこれらの改変体（以下纏めて「ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等」という）のいずれか、または該ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等のアミノ酸配列の一部を含むペプチドを有効成分として含有する、摂食抑制および／または体重増加抑制のための医薬組成物に関する。該ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等のアミノ酸配列の一部を含むペプチドとは、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を保持する限度で、該ポリペプチドの一部のアミノ酸配列を欠失させたものを言う。
＜摂食や体重増加が亢進していることが問題となる疾患の治療または予防のための医薬組成物＞
本発明は、前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等のいずれか、または該ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等のアミノ酸配列の一部を含むペプチドを有効成分として含有する、摂食や体重増加が亢進していることが問題となる疾患の治療または予防のための医薬組成物に関する。
本発明のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の薬理学的な効果は、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドのラット第３脳室内への投与（実施例６および２５）、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドのラット第３脳室内への投与（実施例１２、１３、２７および３４）、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドのマウス腹腔内または皮下への投与（実施例１８および実施例１９）、NESFATIN-1M30ポリペプチドのマウス腹腔内への投与（実施例２０）等に例示される結果によって証明されている。また、レプチン抵抗性を示すモデル動物であるＺｕｃｋｅｒ（ｆａ／ｆａ）ラットにおけるＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドの第３脳室内への投与（実施例１７）によって、病態モデル動物での薬理学的な効果を例示し、またヒトの肥満においても問題になっているレプチン抵抗性の病態への薬理学的な効果を例示している。更に、Agouti yellowマウスでの投与実験（実施例１８）によって既知の摂食調節にかかわる因子であるメラノコルチン系とは異なる機構を介して摂食の制御を行う可能性についても薬理学的に示している。これら例示した事実より、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等は摂食や体重増加が亢進していることが問題となる疾患の治療または予防のための医薬組成物として用いることが可能であることが証明されている。
摂食や体重増加が亢進していることが問題となる疾患とは、たとえば肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、整形外科的疾患、月経異常および悪性腫瘍などがあげられる。肥満には、肥満に起因ないし関連する健康障害を合併するか、臨床的にその合併が予測される場合で、医学的に減量を必要とする病態である肥満症が含まれる。整形外科的疾患には、過体重による変形性関節症、腰椎症（変形性脊椎症）、腰痛症（ぎっくり腰）などが含まれる。また、悪性腫瘍には、乳ガン、子宮ガン、結腸ガン、腎臓ガン、食道ガン、膵臓ガン、肝臓ガンおよび胆嚢ガンが含まれる。
また、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるいずれの添加剤を含有してもよい。薬学的に許容される添加剤を用いての製剤は「REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20th EDITION フィラデルフィア科学大学（University of the Sciences in Philadelphia）著 Williams & Wilkins社 2000年12月15日発行」に記載の方法で実施することも可能である。このような医薬組成物の一つの形態としては、無菌の水性液もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製された液剤として供される。このような溶剤として、水性液としては注射用蒸留水、生理食塩水等が挙げられ、それに加えて浸透圧調節剤（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）が添加されたり、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０）などが併用される場合もある。また、溶剤としては油性液が用いられる場合もあり、該油性液の例としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどが併用される場合もある。このような液剤においては適宜、緩衝剤（例えば、リン酸塩類緩衝剤、酢酸塩類緩衝剤）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、アスコルビン酸、エリソルビン酸およびそれらの塩など）着色剤（例えば、銅クロロフィル、β−カロチン、赤色２号、青色１号など）、防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル、フェノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウムなど）増粘剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびそれらの塩等）、安定化剤（例えば人血清アルブミン、マンニトール、ソルビトールなど）、矯臭剤（例えばメントール、柑橘香料など）の添加剤が用いられる場合がある。また別の医薬組成物（上記いくつか「医薬品組成物」の表現と統一するため）の形態としては、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、トローチ剤などの固形剤があげられる。経口用製剤の形で投与する固形剤の場合には、添加剤として、賦形剤（例えば、結晶性セルロース、ラクトース、デンプンなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴールなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）などが用いられる。また、必要に応じて、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルなど）、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの添加剤を用いることができる。さらに別の形態として、粘膜用医薬組成物もあげられ、この製剤においては粘膜への吸着性、滞留性等を付与することを主な目的として添加剤として粘着剤、粘着増強剤、粘稠剤、粘稠化剤等（例えば、ムチン、カンテン、ゼラチン、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、ローカストビンガム、キサンタンガム、トラガントガム、アラビアゴム、キトサン、プルラン、ワキシースターチ、スクラルフェート、セルロースおよびその誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アクリル酸（メタ）アクリル酸アルキル共重合体またはその塩、ポリグリセリン脂肪酸エステルなど）が含有される場合もある。しかしながら、生体に供与される医薬組成物の形態および溶剤や添加剤はこれらに限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択できる。
前記医薬組成物は、症状の改善を目的として、経口または非経口的に投与することができる。経口投与の場合には、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤または懸濁剤、エリキシル剤などの剤型を選択することができる。非経口投与の場合には、たとえば経鼻剤とすることができ、液剤、縣濁剤、固形製剤などを選択できる。また別の非経口投与の形態としては、注射剤とすることができ、注射剤としては、皮下注射剤、静脈注射剤、点滴注射剤、筋肉注射剤、脳室内注射剤または腹腔内注射剤などを選択することができる。またその他の非経口投与に用いる製剤としては、坐剤、舌下剤、経皮剤、経鼻剤以外の経粘膜投与剤なども挙げられる。さらに、ステントや血管内栓塞剤に含有もしくは塗布する態様で、血管内局所投与することもできる。
前記医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間、または該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人１人あたり、１回につき0.1mgから500mgの範囲で、好ましくは0.5mgから200mgの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
また、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子は、遺伝子治療の態様で使用することができる。該遺伝子治療とは、たとえば、該遺伝子を生体に導入することにより治療効果を達成することができるものである。治療効果をもたらすタンパク質をコードする遺伝子を生体に導入し、発現させることによって、疾患を治療する手法は公知である（金田著 日本薬理雑誌 2001年発行117巻 ｐ299〜306）。
またさらに、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子のいずれかが導入され、該ポリペプチドを発現する形の形質転換体、好ましくは導入したい種に移植可能な宿主を用いた形質転換体を投与することによって、該形質転換体より産生されるＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等による治療を行うことも可能である。
＜摂食抑制および／または体重調節抑制活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子＞
さらに、本発明は、前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等のいずれかをコードする核酸分子に関する。前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドをコードする核酸分子としては、ヒトの前駆体ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列からなる核酸分子（配列番号１）、マウスの前駆体ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列からなる核酸分子（配列番号４）、ラットの前駆体ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列からなる核酸分子（配列番号７）、シグナルペプチド部分を除いた成熟型ヒトＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列からなる核酸分子（配列番号１０）、マウスの成熟型ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列からなる核酸分子（配列番号１１）、またはラットの成熟型ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列からなる核酸分子（配列番号１２）などがあげられる。
前記ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドをコードする核酸分子としては、ヒトのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１８）、マウスのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１９）、およびラットのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号２０）などがあげられる。
前記NESFATIN-1M30ポリペプチドをコードする核酸分子としては、ヒトのNESFATIN-1M30ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号４４）、マウスのNESFATIN-1M30ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号４６）、およびラットのNESFATIN-1M30ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号４５）などがあげられる。
NESFATIN-1M16ポリペプチドをコードする核酸分子としては、ヒトのNESFATIN-1M16ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号７４）、マウスのNESFATIN-1M16ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号８０）、およびラットのNESFATIN-1M16ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号７７）などがあげられる。
NESFATIN-1M14ポリペプチドをコードする核酸分子としては、ヒトのNESFATIN-1M14ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号７５）、マウスのNESFATIN-1M14ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号８１）、およびラットのNESFATIN-1M14ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号７８）などがあげられる。
NESFATIN-1M10Mポリペプチドをコードする核酸分子としては、ヒトのNESFATIN-1M10Mポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号７６）、マウスのNESFATIN-1M10Mポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号８２）、およびラットのNESFATIN-1M10Mポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号７９）などがあげられる。
NUCB1-M30ポリペプチドをコードする核酸分子としては、ヒトのNUCB1-M30ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１０４）、マウスのNUCB1-M30ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１０６）、およびラットのNUCB1-M30ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１０５）などがあげられる。
NUCB1-M16ポリペプチドをコードする核酸分子としては、ヒトのNUCB1-M16ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１１６）、マウスのNUCB1-M16ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１２２）、およびラットのNUCB1-M16ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１１９）などがあげられる。
NUCB1-M14ポリペプチドをコードする核酸分子としては、ヒトのNUCB1-M14ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１１７）、マウスのNUCB1-M14ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１２３）、およびラットのNUCB1-M14ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１２０）などがあげられる。
NUCB1-M10Mポリペプチドをコードする核酸分子としては、ヒトのNUCB1-M10Mポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１１８）、マウスのNUCB1-M10Mポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１２４）、およびラットのNUCB1-M10Mポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１２１）などがあげられる。
また、本発明のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等には、前述のとおり、Ｎ末端またはＣ末端に少なくとも１つ以上のアミノ酸が付加されたもの、および少なくとも１つのアミノ酸残基が、化合物またはペプチドによって修飾されたものも含まれる。このようなＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする核酸分子として、たとえば、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドを例にすると、配列番号３、配列番号６または配列番号９の配列のＮ末端に任意のポリペプチドが付加されたポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１０、配列番号１１または配列番号１２の５‘末端に、ATGという塩基配列を持ち、その後ろに付加したいアミノ酸配列をコードするコドンを連ねた塩基配列を付加することによって得ることができる。また、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等のアミノ酸配列のＮ末端および／またはＣ末端に、プロホルモン・コンバターゼ等のプロテアーゼ認識（切断）配列が付加されたポリペプチドをコードする核酸分子も、本発明の核酸分子に含まれるが、これらに限定されるものではない。
その他には、たとえば、配列番号３、配列番号６または配列番号９に示したアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする遺伝子配列の５’または３’末端に、オワンクラゲ由来蛍光タンパク質または分泌型アルカリフォスファターゼをコードする遺伝子配列を、それぞれのタンパク質のアミノ酸配列が翻訳される形で結合した塩基配列からなる核酸分子なども含まれる。
前記ＮＥＳＦＡＴＩＮ等改変体をコードする核酸分子には、配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３もしくは１０７〜１１５で示されるアミノ酸配列のいずれかと、少なくとも６０％以上のホモロジーをもつアミノ酸配列からなり、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子が含まれ、該ホモロジーは７０％以上が好ましく、８０％以上がさらに好ましい。その代表的な例としては、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０ポリペプチドを例にすると、ヒト以外の動物種におけるＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０ポリペプチド等があげられる。たとえば、ヒトのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０ポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号３９）と６０％以上のホモロジーをもつアミノ酸配列からなり、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子としては、マウスのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号４６）、ラットのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号４５）、ヒトのNUCB1-M30ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１０４）、マウスのNUCB1-M30ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１０６）、およびラットのNUCB1-M30ポリペプチドをコードする核酸分子（配列番号１０５）などがあげられるが、これらの核酸分子に限定されるものではない。
また、前記ＮＥＳＦＡＴＩＮ等改変体をコードする核酸分子には、配列番号６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３もしくは１０７〜１１５に示されるアミノ酸配列のいずれかにおいて、その一部のアミノ酸が欠失、挿入または置換されたアミノ酸配列からなり、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子も含まれる。
さらに、本発明は、配列番号４、７、１１、１２、１８、１９、２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、または１１６〜１２４に示される塩基配列または該塩基配列の部分配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子にも関する。このような核酸分子は、配列番号４、７、１０、１１、１２、１８、１９、２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、または１１６〜１２４に示される塩基配列または該塩基配列の部分配列を用いるハイブリダイゼーション法により得ることができる。具体的には任意の生物種に由来するｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片等が挿入されたプラスミドベクターまたはファージベクターを大腸菌等の宿主に導入したライブラリーを作製し、それを適当な選択薬剤を含む寒天培地プレート上で培養する。その後、生じた組換え大腸菌クローンまたはファージクローンをニトロセルロース膜等に移し取って、アルカリや界面活性剤を含む状態で菌体またはファージを溶かして、そこに含まれるＤＮＡを膜に固定化し、その膜に対して配列番号４、７、１０、１１、１２、１８、１９、２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、または１１６〜１２４に示される塩基配列または該塩基配列の部分配列からなるＤＮＡを、32Pなどで標識して一本鎖にしたプローブを溶解した適当なハイブリダイゼーション溶液と適切な温度下で反応させる。反応後、その膜をx2 SSCなどで洗浄して余分なプローブを除去した後、高ストリンジェントな条件、たとえばｘ0.1 SSCで65℃、または中程度にストリンジェントな条件、たとえばｘ0.5 SSCで６５℃の条件で洗浄し、その膜を暗黒下でX線フィルムと接触させて感光させる。数時間から数日の間低温フリーザー等の中で感光させたX線フィルムを現像して感光したスポットを検出し、その膜に転写を行ったもとのプレートの対応する位置にある大腸菌もしくはファージクローンを採取して培養した後、ベクター中に挿入されている遺伝子の配列解析を行うことで、ＮＥＳＦＡＴＩＮ遺伝子、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１遺伝子もしくはNESFATIN-1M30遺伝子と相同性の高い遺伝子を取得できる。また、その遺伝子配列を用いてさらにｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーでのハイブリダイゼーションによるクローンの取得やプライマーエクステンション法などで周辺配列を同定することにより、タンパク質をコードしている遺伝子構造を解明してＮＥＳＦＡＴＩＮ、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０、NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10M、NUCB1-M30、NUCB1-M16、NUCB1-M14、またはNUCB1-M10Mと相同性のある分子の核酸分子を取得できる。さらに、配列番号４、７、１０、１１、１２、１８、１９、２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、または１１６〜１２４に示される塩基配列または該塩基配列の部分配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子のうち、摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドをコードする核酸分子の選択は、該核酸分子がコードするポリペプチド、または該核酸分子を、試験動物に局所的または全身的に導入し、該動物の摂食量および／または体重を抑制する核酸分子を選択することによって、行なうことができる。また別の方法としては、該核酸分子がコードするポリペプチドに対して結合する抗体や、該核酸分子がコードする遺伝子の発現を抑制しうるアンチセンスオリゴヌクレオチド分子やＲＮＡｉ分子などを試験動物に局所的または全身的に導入し、該動物の摂食量および／または体重を抑制する核酸分子を選択することによって行なうことができる。
＜ベクター＞
また、本発明は、前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等のいずれかをコードする核酸分子を含むベクターに関する。このような前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする核酸分子を含むベクターを用いて、微生物などの宿主細胞にＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の遺伝子などを導入した組換え体を作製することによって、該遺伝子を安定的に保存または複製することができる。宿主細胞内で複製される機能をもつベクターに組み込まれたＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子は、組換え体細胞を適当な培地で培養することで、細胞の増殖もしくは細胞内における導入遺伝子のコピー数の増幅によって、該遺伝子の核酸分子を大量に調製することが可能である。
また、該核酸分子は、該核酸分子の発現を制御する調節性核酸分子の制御下に機能的に結合されていてもよい。該核酸分子の発現を制御する調節性核酸分子としては、たとえば、プロモーター配列やエンハンサー配列など、組み込まれた遺伝子を宿主細胞内で発現するための調節配列をコードする核酸分子などがあげられ、当業者であれば適宜選択しうる。ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする核酸分子が、このような調節配列をコードする核酸分子の制御下に組み込まれることにより、任意の宿主細胞（たとえば、微生物、哺乳類細胞、昆虫細胞など）において、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を大量に産生することができる。
また、本発明に使用しうるベクターとして、通常発現しようとする遺伝子の上流にプロモーター、下流にポリアデニル化部位および転写終了配列等を保有する発現ベクターがあげられる。脊椎動物のこのような発現ベクターとしては例えば、SV40の初期プロモーターを保有するpSV2dhfr（Mol. Cell. Biol., 854, 1981）、pcDNA3.1(+)（Invitrogen社）およびpCAGGS（Gene, 108, 193-200, 1991）などがあげられるが、これらに限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択することができる。また、このようなベクターは、摂食抑制または体重増加抑制の治療のために哺乳類細胞に導入することもできる。
宿主として大腸菌を用いる場合には、たとえば、pBR322およびその改良ベクターなどを用いることができるが、これらに限定されず公知の各種菌株およびベクターも利用できる。プロモーターとしては、例えば、大腸菌ラクトース（lac）、大腸菌trp等のプロモーターがあげられるがこれらに限定されない。また、該プロモーターは、いずれも既に特性化されており、当業者が熟知しているものであって、合成的にあるいは、既知のプラスミドから組み立てることができるものである。
具体的な例として、実施例５に、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドをコードする核酸分子をベクターに組み込んで、大腸菌での組換え体を作製することで、摂食抑制および／または体重増加抑制の活性を保持したＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドが調製できたことを示す。また、実施例１６に、配列番号１３から１５に記載のアミノ酸配列をGlutathione-S-Transferase（ＧＳＴ）などとの融合タンパク質として発現させて、グルタチオン固定化担体への吸着・脱着反応を用いて精製したのちに、ＧＳＴ部分を切断して精製することによってＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ペプチドを遺伝子組換え法によって製造できたことを示す。さらに実施例１６ではＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドをコードする核酸分子をベクターに組み込んで、大腸菌での組換え体を作製することで、摂食抑制および／または体重増加抑制の活性を保持したＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドが調製できたことを示す。
また、本発明のベクターは、摂食抑制および／または体重増加抑制のために、遺伝子治療の手法を用いて哺乳類細胞に導入することにより、治療効果を達成することができる。治療効果をもたらすタンパク質、すなわちＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子を哺乳類動物に導入し、発現させることによって、疾患を治療する方法は公知である（金田著 日本薬理雑誌 ２００１年発行１１７巻 ｐ２９９〜３０６）。
＜形質転換体＞
本発明は、前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等のいずれかをコードする核酸分子を含む形質転換体に関する。このような形質転換体は、該ポリペプチドをコードする遺伝子を宿主細胞へ導入して形質転換することによって、得ることができる。形質転換方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（HVJ（センダイウイルス））、ポリエチレングリコール（PEG）、電気的細胞融合法、微小核融合法（染色体移入）が挙げられる。物理学的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（gene gun）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられ、当業者であれば、適宜選択し実施することができる。また、得られる形質転換体は常法に従い培養でき、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等が生産される。培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、その培養も宿主細胞の成育に適した条件下で実施できる。
真核細胞中で目的タンパク質を発現させる手段は、それ自体当該分野では多くの系が周知である。例えば酵母中で発現させる系としては特開昭57-159489号公報に記載された「酵母中でのタンパク質の発現」が挙げられ、植物細胞中で発現させる系としては特許2517813号公報に記載された「生きている細胞に生物学的物質を導入するための改良された方法および装置」または特開2003-274953号に記載された「植物細胞への遺伝子導入方法及び遺伝子導入用の植物細胞処理装置」が挙げられ、昆虫細胞中で発現させる系としては特開昭60-37988号公報に記載された「組換えバキュロウイルス発現ベクターの製法」が挙げられ、哺乳類動物細胞中で発現させる系としては特開平2―171198号公報に記載された「真核性発現の改良」が挙げられるが、もちろんこれら以外にも多数存在する。
形質転換に使用される宿主細胞としては、真核性宿主細胞および原核性宿主細胞のいずれを用いることもできる。真核性宿主細胞には、脊椎動物、酵母、植物細胞および昆虫細胞等が含まれる。植物細胞としては、双子葉または単子葉植物の組織片や組織より分離した細胞、または組織より形成させたカルスに由来する細胞等が挙げられる。脊椎動物細胞としては、例えばCHO細胞、293T細胞およびCOS7細胞等が挙げられる。原核性宿主細胞としては、大腸菌、枯草菌およびストレプトマイセス等があげられ、例えば、大腸菌としてはEcherichia coli K12株等がよく用いられる。また、宿主細胞として脊椎動物を使用した場合には、得られた形質転換体は、摂食抑制または体重増加抑制の治療のための細胞治療の目的で、哺乳類動物に導入することができる。該形質転換体としては、導入されたＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子を発現することが確認されたものが好ましい。また、該形質転換体の投与にあたっては、該形質転換体は各種緩衝剤、生理食塩液等に分散して投与するのが好ましい（特開２００３−３４２２０１公報）。
＜抗体＞
本発明は、前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等のいずれかと結合する抗体に関する。このような抗体は、当業者に周知の技法を用いて得ることができる。本発明に用いる抗体は、ポリクローナル抗体、またはモノクローナル抗体(ミルスタイン（Milstein） 等 ネイチャー（Nature ）（England） 1983年10月6日発行 305巻5934号 ｐ537〜540)であることができる。例えば、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０ポリペプチド、NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10M、NUCB1-M30、NUCB1-M16、NUCB1-M14、またはNUCB1-M10Mに対するポリクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物の血清等から回収することができる。さらに別の例としてはＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の部分配列からなる配列をもつペプチドを感作した哺乳類動物の血清等から回収するとができる。より具体的な例として、実施例３に示しているとおり、配列番号８のアミノ酸番号１４１から１５２に相当する配列のペプチド（配列番号２４）をキャリアタンパク質に結合させ、それを抗原として動物に免疫することで、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等と結合する抗体を得ることが可能である。また、この抗体は動物に投与された場合、該動物に摂食亢進および体重増加の効果を示す（実施例７）。また別の具体的な例としては配列番号８のアミノ酸番号４８から６２に相当する配列のペプチド（配列番号３２）をキャリアタンパク質に結合させ、それを抗原として動物に免疫することで、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等と結合する抗体を得ることが可能である（実施例１０）。この配列番号３２のポリペプチドはヒト・マウス・ラットのＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドおよびNESFATIN-1M30ポリペプチドに共通のアミノ酸配列よりなるため、得られた抗体はこれらのポリペプチドすべてと結合する。また、この抗体は動物に投与された場合、該動物に摂食の亢進および体重の増加の効果を示す（実施例１４）。これ以外にも開示したＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の配列から適宜抗原とするペプチドを作製し、抗体を作製することが可能である。
前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等に対するモノクローナル抗体は、抗原を感作した哺乳動物から免疫細胞を取り出して骨髄腫細胞などと細胞融合させることにより得られたハイブリドーマをクローニングして、その培養物から回収することができる。
このような抗体は、適宜標識して、前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の検出に使用することができる。また、この抗体を標識せずに、該抗体に特異的に結合する物質、例えば、プロテインAやプロテインＧを標識して間接的な検出にも使用することができる。具体的な検出方法としては、例えばELISA法を挙げることができる。
本発明の抗体を得るために使用する抗原は、たとえば、例えば前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｍ３０、NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10M、NUCB1-M30、NUCB1-M16、NUCB1-M14、もしくはNUCB1-M10Mまたはこれらの改変体をコードする核酸分子、またはその一部を発現ベクターに組込み、これを適当な宿主細胞に導入して、形質転換体を作製し、該形質転換体を培養して組換えタンパク質を発現させ、発現させた組換えタンパク質を培養体または培養上清から精製することにより得ることができる。あるいは、該遺伝子によってコードされるアミノ酸配列、または全長ｃＤＮＡによってコードされるアミノ酸配列の部分アミノ酸配列からなるオリゴペプチドを化学的に合成し、免疫原として用いることもできる。免疫する動物としては、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ、ウマ、ハムスターなどが用いられ、当業者であれば適宜選択できる。
＜摂食抑制および／または体重調節抑制活性を有するポリペプチドの活性または発現を抑制する物質＞
本発明における検討において、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドおよびNESFATIN-1M30ポリペプチドに対して結合する抗体を作製し、動物の脳に投与したところ、その動物の摂食量の亢進が見られた（実施例７および実施例１４）。また、ＮＥＳＦＡＴＩＮ遺伝子の発現を抑制するアンチセンスＲＮＡ（オリゴヌクレオチド）を動物の脳内に投与することによって、その動物の摂食量の亢進および体重の増加が見られた（実施例１５）。このことは、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドまたはNESFATIN-1M30ポリペプチドは脳内で実際に摂食調節および／または体重調節に機能していることを示す。さらにＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドまたはNESFATIN-1M30ポリペプチドの末梢（血中）または脳内での濃度の上昇は、摂食抑制および／または体重増加抑制を示し、該ポリペプチドの活性または発現を抑制する物質の作用は、摂食亢進および／または体重増加の亢進を示したことから、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドおよび／またはNESFATIN-1M30ポリペプチドは、生体内で摂食調節および／または体重調節に中心的な働きを担っている因子であることが証明された。それとともに、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドおよび／またはNESFATIN-1M30ポリペプチドの活性を阻害もしくは発現を阻害する物質はそれ自体が、摂食の低下または体重の低下が問題となる疾患や症状、たとえば、拒食症、機能性胃腸症（Functional dyspepsia）、または癌、炎症性疾患、下垂体・甲状腺・副腎などの機能低下、手術後もしくは過度のストレスなどによる摂食抑制および／もしくは体重増加抑制状態への治療・診断・治療薬のスクリーニングなどに用いることができる。
すなわち、本発明は、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチド、NESFATIN-1M30ポリペプチド、NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10M、NUCB1-M30、NUCB1-M16、NUCB1-M14、またはNUCB1-M10Mの活性または産生を阻害する物質に関する。さらに望ましくは、該物質は、摂食亢進および／または体重増加亢進活性を示す物質に関する。ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の活性を抑制する物質としては、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等に結合することを特徴とするものと、それらのポリペプチドとの結合を必ずしも必要としないものが含まれる。前者の例としてはＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等に対する抗体が挙げられ、抗体としては、前述の抗体を使用することができる。後者の例としては、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等に対するドミナントネガティブポリペプチドなどが挙げられる。ここで、ドミナントネガティブとは、野生型に対して量的および質的に優位に働いて、野生型の機能を阻害する変異体である。ドミナントネガティブは、野生型のアミノ酸の一部を欠失、または変換することにより作製することが可能である。
また、本発明は、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチド、NESFATIN-1M30ポリペプチド、NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10M、NUCB1-M30、NUCB1-M16、NUCB1-M14、またはNUCB1-M10Mをコードする遺伝子の発現を抑制する物質に関する。このような物質としては、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子等が挙げられる。ここでNESFATINポリペプチド等をコードする遺伝子とは、NESFATINポリペプチド等をコードする核酸分子における塩基配列の全体または一部を、連続的または非連続的な単位として含む核酸分子をいう。また遺伝子の発現とは、該遺伝子よりNESFATINポリペプチド等をコードする核酸分子が転写される過程、転写された核酸分子を安定化する過程、転写された核酸分子より翻訳によってNESFATINポリペプチド等が生産される過程よりなる。したがって、遺伝子の発現の抑制とは、NESFATINポリペプチド等をコードする遺伝子からの転写、安定化、翻訳の何れかの過程を抑制することをいう。
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドをコードする遺伝子配列を用いることにより、設計することができる。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドとしては、配列番号３１の構造をもつモルホリノ型アンチセンスオリゴヌクレオチドがあげられる。該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、たとえば、実施例１５に示すように、動物に投与することで、該動物の摂食の亢進または体重増加の亢進作用を示す。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞内での分解を避けるために様々な修飾や結合様式が知られており、当業者であれば、適切なアンチセンスオリゴヌクレオチドの構造を選択することができる（カーレック（Ｃｕｒｒｅｃｋ）等 ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Europian Journal of Biochemistry）（ＵＫ） ２００３年 ２７０巻 ｐ１６２８−４８６）。その構造としては、天然型（Ｄ−オリゴ）、ホスホロチオエート型（Ｓ−オリゴ）、メチルホスホネート型（Ｍ−オリゴ）、ホスホロアミデート型（Ａ−オリゴ）、２’−Ｏ−メチル型Ｄ−オリゴ、モルフォリデート型（Ｍｏ−オリゴ）、ポリアミド核酸、などが例示できる。また、長さは１０塩基から７０塩基、好ましくは１５塩基から３０塩基のものを用いる。
ＲＮＡｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ（ＲＮＡｉ、ＲＮＡ干渉）は、２１〜２３残基の二重鎖ＲＮＡが同じ配列を含むターゲットのＲＮＡを分解することにより、その発現を強力に抑制する現象を言う。したがって、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子のｍＲＮＡと同一の塩基配列を有する２本鎖構造を含むＲＮＡは、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の遺伝子の発現抑制に利用することができる。ＲＮＡｉ効果を得るためには、少なくとも２０以上の連続する塩基配列を有する２本鎖構造のＲＮＡを用いることが望ましい。２本鎖構造は、異なるストランドで構成されていても良いし、１つのＲＮＡのステムループ構造によって与えられる２本鎖であってもよい。またそれぞれの鎖の３’側に２塩基のオーバーハングを持たせることにより、遺伝子の発現抑制作用を増強することもできる。ＲＮＡｉの設計に用いる配列および長さや構造については、当業者であれば、様々な改変を試みて、最も遺伝子発現抑制作用の強いＲＮＡｉを至適化することが可能である（ミルハベット（Ｍｉｌｈａｖｅｔ）等 ファーマコロジカル・レビュー（Pharmacological Review）（USA） ２００３年 ５５巻 ｐ629-648）。
また、前記アンチセンスオリゴヌクレオチド分子およびＲＮＡｉ分子は、該分子の核酸配列と相補的な塩基配列からなる核酸分子をベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して形質転換し、形質転換体を培養することによって製造することができる。使用する宿主細胞および形質転換の方法は、前記＜形質転換体＞に記載したように、当業者であれば適宜選択することができる。また、別の方法としてはアンチセンスオリゴヌクレオチド分子およびＲＮＡｉ分子は化学合成法によっても製造することが可能である。
＜食欲亢進または体重増加亢進のための医薬品＞
また、本発明は、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等活性もしくは産生を阻害する物質、またはＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子の発現を抑制する物質を、有効成分として含有する、食欲亢進または体重増加亢進のための医薬組成物に関する。該医薬組成物は、摂食や体重増加が抑制されていることが問題となる疾患や症状に対して使用することができる。摂食や体重増加が抑制されていることが問題となる疾患や症状としては、たとえば拒食症、機能性胃腸症（Functional dyspepsia）、または癌、炎症性疾患、下垂体・甲状腺・副腎などの機能低下、手術後もしくは過度のストレスなどによる摂食抑制および／もしくは体重増加抑制状態などがあげられる。
また、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容されるいずれの添加剤を含有してもよい。薬学的に許容される添加剤を用いての製剤は「REMINGTON: THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20th EDITION フィラデルフィア科学大学（University of the Sciences in Philadelphia）著 Williams & Wilkins社 2000年12月15日発行」に記載の方法で実施することも可能である。このような医薬組成物の一つの形態としては、無菌の水性液もしくは油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製された液剤として供される。このような溶剤として、水性液としては注射用蒸留水、生理食塩水等が挙げられ、それに加えて浸透圧調節剤（例えば、Ｄ−グルコース、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなど）が添加されたり、適当な溶解補助剤、たとえばアルコール（たとえばエタノール）、ポリアルコール（たとえばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン性界面活性剤（たとえばポリソルベート８０、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油５０）などが併用される場合もある。また、溶剤としては油性液が用いられる場合もあり、該油性液の例としてはゴマ油、大豆油などがあげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールなどが併用される場合もある。このような液剤においては適宜、緩衝剤（例えば、リン酸塩類緩衝剤、酢酸塩類緩衝剤）、無痛化剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩酸プロカインなど）、安定剤（例えば、ヒト血清アルブミン、ポリエチレングリコールなど）、保存剤（例えば、アスコルビン酸、エリソルビン酸およびそれらの塩など）着色剤（例えば、銅クロロフィル、β−カロチン、赤色２号、青色１号など）、防腐剤（例えばパラオキシ安息香酸エステル、フェノール、塩化ベンゼトニウム、塩化ベンザルコニウムなど）増粘剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロースおよびそれらの塩等）、安定化剤（例えば人血清アルブミン、マンニトール、ソルビトールなど）、矯臭剤（例えばメントール、柑橘香料など）の添加剤が用いられる場合がある。また別の医薬組成物（上記いくつか「医薬品組成物」の表現と統一するため）の形態としては、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、丸剤、坐剤、トローチ剤などの固形剤があげられる。経口用製剤の形で投与する固形剤の場合には、添加剤として、賦形剤（例えば、結晶性セルロース、ラクトース、デンプンなど）、滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクなど）、結合剤（ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マクロゴールなど）、崩壊剤（例えば、デンプン、カルボキシメチルセルロースカルシウムなど）などが用いられる。また、必要に応じて、防腐剤（例えば、ベンジルアルコール、クロロブタノール、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸プロピルなど）、抗酸化剤、着色剤、甘味剤などの添加剤を用いることができる。
さらに別の形態として、粘膜用医薬組成物もあげられ、この製剤においては粘膜への吸着性、滞留性等を付与することを主な目的として添加剤として粘着剤、粘着増強剤、粘稠剤、粘稠化剤等（例えば、ムチン、カンテン、ゼラチン、ペクチン、カラギーナン、アルギン酸ナトリウム、ローカストビンガム、キサンタンガム、トラガントガム、アラビアゴム、キトサン、プルラン、ワキシースターチ、スクラルフェート、セルロースおよびその誘導体（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリグリセリン脂肪酸エステル、アクリル酸（メタ）アクリル酸アルキル共重合体またはその塩、ポリグリセリン脂肪酸エステルなど）が含有される場合もある。しかしながら、生体に供与される医薬組成物の形態および溶剤や添加剤はこれらに限定されるものではなく、当業者であれば適宜選択できる。
前記医薬組成物は、症状の改善を目的として、経口または非経口的に投与することができる。経口投与の場合には、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、液剤、シロップ剤、乳剤または懸濁剤、エリキシル剤などの剤型を選択することができる。非経口投与の場合には、たとえば経鼻剤とすることができ、液剤、縣濁剤、固形製剤などを選択できる。また別の非経口投与の形態としては、注射剤とすることができ、注射剤としては、皮下注射剤、静脈注射剤、点滴注射剤、筋肉注射剤、脳室内注射剤または腹腔内注射剤などを選択することができる。またその他の非経口投与に用いる製剤としては、坐剤、舌下剤、経皮剤、経鼻剤以外の経粘膜投与剤なども挙げられる。さらに、ステントや血管内栓塞剤に含有もしくは塗布する態様で、血管内局所投与することもできる。
前記医薬組成物の投与量は、患者の年齢、性別、体重、症状、治療効果、投与方法、処理時間、または該医薬組成物に含有される活性成分の種類などにより異なるが、通常成人１人あたり、１回につき0.1mgから500mgの範囲で、好ましくは0.5mgから20mgの範囲で投与することができる。しかし、投与量は種々の条件により変動するため、上記投与量よりも少ない量で十分な場合もあり、また上記の範囲を超える投与量が必要な場合もある。
また、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ分子等は、適当なプロモーター配列の下流に組込み、アンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはＲＮＡｉ効果をもたらすＲＮＡの発現ベクターとして投与することができる。この発現ベクターを対象となる患者の脳内に到達する形で導入すれば、これらの遺伝子のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはＲＮＡｉ効果によって当該遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチドを発現し、当該遺伝子の発現レベルの低下によって摂食抑制および／または体重増加抑制の状態に対し、治療効果を達成することができる。
＜トランスジェニック動物、肥満・肥満症ならびに疾患モデル動物＞
本発明は、前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子、またはそれらを含むベクターを含むトランスジェニック非ヒト動物に関する。詳細には、該遺伝子が、全身性、好ましくは視床下部での発現強度が上昇した、摂食抑制状態または体重増加抑制状態を示すトランスジェニック非ヒト動物に関する。前記ポリペプチドをコードする遺伝子の発現レベルを人為的に増強したトランスジェニック非ヒト動物は、摂食抑制および／または体重増加抑制を示すモデル動物として利用できる。
本発明は、前記摂食抑制および／または体重調節抑制活性を有するポリペプチドの活性または発現を抑制する物質（例えば抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ分子など）が導入され、食欲亢進または体重増加亢進を示すトラスジェニック非ヒト動物に関する。このような物質をコードする遺伝子を導入して産生されたトランスジェニック非ヒト動物は、摂食および体重増加が亢進を示すモデル動物として利用することができる。また、該トランスジェニック非ヒト動物は、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、変形性関節症などの整形外科的疾患、月経異常または悪性腫瘍などの疾患のモデル動物として用いることもできる。
特定の遺伝子を対象として、トランスジェニック動物を得る方法は公知である。すなわち、遺伝子と卵を混合してリン酸カルシウムで処理する方法や、位相差顕微鏡下で前核期卵の核に、微小ピペットで遺伝子を直接導入する方法（マイクロインジェクション法、米国特許第4873191号）、胚性幹細胞（ES細胞）を使用する方法などによってトランスジェニック動物を得ることができる。その他、レトロウイルスベクターに遺伝子を挿入し、卵に感染させる方法、また、精子を介して遺伝子を卵に導入する精子ベクター法等も開発されている。精子ベクター法とは、精子に外来遺伝子を付着またはエレクトロポレーション等の方法で精子細胞内に取り込ませた後に、卵子に受精させることにより、外来遺伝子を導入する遺伝子組換え法である（Lavitranoet Mら, Cell (1989)57, 717-723）。
また、発現ベクターに使用するプロモーターとして、適当な薬剤等の物質により転写が調節されるプロモーターを用いれば、該物質の投与によってトランスジェニック動物における外来性のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子もしくは該ポリペプチドの活性もしくは発現を抑制する物質の発現レベルを調整することができる。
さらに、本発明は、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子の全領域または一部を欠損させたノックアウト動物に関し、該遺伝子を別の遺伝子で置き換えたノックイン動物も本発明に含まれる。例えば、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の遺伝子のノックアウト動物は、摂食亢進および／または体重増加亢進を示すモデル動物として利用できる。
さらに本発明は、前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等そのものが投与された、非ヒト動物からなる摂食および／もしくは体重増加が抑制されたモデル動物、または該ポリペプチドの活性または発現を抑制する物質そのものが投与された、非ヒト動物からなる摂食および体重増加が亢進したモデル動物に関する。摂食および体重増加が亢進した非ヒト動物は、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、変形性関節症などの整形外科的疾患、月経異常または悪性腫瘍などの疾患のモデル動物として利用することもできる。
本発明のモデル動物として用いる動物種は、ヒト以外のあらゆる脊椎動物を利用して作製することができる。具体的には、マウス、ラット、ウサギ、ミニブタ、ヤギ、ヒツジ、サル、イヌ、ネコ、あるいはウシ等の脊椎動物において遺伝子の導入や物質の投与による、モデル動物の作製が可能である。
＜摂食抑制および／または体重増加抑制活性を有するポリペプチドの製造方法＞
本発明は、前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子を発現する前記形質転換体、または該ポリペプチドコードする遺伝子、もしくはそれらを含むベクターを含む前記トランスジェニック非ヒト動物およびトランスジェニック植物を用いる該ポリペプチドの製造方法に関する。
本発明の前記ポリペプチドの製造方法においては、形質転換体またはトランスジェニック非ヒト動物での発現、転写、翻訳などに適するように、前記ＤＮＡ配列、プラスミドおよびウイルスに対して、多くの修飾や変更が可能である。例えば、遺伝暗号の同義性により、タンパク質の暗号領域全体を通して、ヌクレオチドの置換を行うことができる。そのような配列は、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等のアミノ酸配列、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の塩基配列から推定することができ、以下の従来の合成法により組み立てることができる。そのような合成法は、実質上、イタクラらの方法（Itakura et al, Science 198, 1056, 1977）ならびにクレアらの方法（Crea et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765, 1978）に従って行うことができる。従って、本発明のポリペプチドの製造方法において使用される前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子は、特に例示した塩基配列、プラスミドおよびウイルスを利用するものに限定されるものではない。
形質転換体を用いる前記ポリペプチドの製造方法は、該形質転換体を培養することによって達成できる。培養に用いられる培地としては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを適宜選択でき、その培養も宿主細胞の成育に適した条件下で実施できる。
また、前記ポリペプチドは、形質転換体の細胞内、細胞外または細胞膜上に生産される。その他のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子を用いたポリペプチドの製造方法としては、無細胞系タンパク質合成による方法が挙げられ、代表的なものとしては、インビトロ翻訳反応系がある。このインビトロ翻訳反応系においては、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子の５’上流に転写調節を制御する配列、好ましくはSP6プロモーター、T3プロモーター、T7プロモーター等を付加し、その遺伝子を細胞内もしくはインビトロにおいて転写することでＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードするRNA分子を作製し、小麦胚芽、大腸菌、網状赤血球などから調製されたインビトロ転写反応用の細胞抽出物を用いることで行うことができる。その一例としては、澤崎等 蛋白質・核酸・酵素 ２００３年 ４８巻 ｐ５４９−５５４に記載の方法などによって実施することが可能である。このような形質転換体または無細胞系タンパク合成により生産されたポリペプチドは、所望によりその物理学的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作[日本生化学会編 「生化学データブックII」第１版第１刷、株式会社東京化学同人 1980年6月23日発行 ｐ1175〜1259；Arakawa等 バイオケミストリー（Biochemistry）（USA）1986年12月16日発行25巻25号ｐ8274〜8277 (1986); ラングレイ（Langley）等 ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー（Europian Journal of Biochemistry）（Germany）1987年3月2日発行 163巻2号 ｐ313〜321等参照]により分離、精製できる。該方法としては、具体的には例えば通常の再構成処理、タンパク質沈澱剤による処理（塩析法）、遠心分離、浸透圧ショック法、超音波破砕、限外ろ過、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（HPLC）等の各種液体クロマトグラフィー、透析法、これらの組合わせ等を例示できる。前記ポリペプチドとのアフィニティーを利用する精製には、たとえば、前述の前記ポリペプチドと結合する抗体を用いることができ、該ポリペプチドと該抗体との脱着により行うことができる。
また、本発明の前記ポリペプチドの製造方法では、該ポリペプチドにアフィニティータグを融合したタンパク質を形質転換体またはトランスジェニック非ヒト動物を産生させ、該アフィニティータグ融合タンパク質を分離、精製することによっても行なうことができる。該アフィニティータグ融合タンパク質を発現させれば、このタグを利用するアフィニティー精製を実施することが可能である。該アフィニティータグとしては、Glutathione-S-Transferase（ＧＳＴ）、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ、シスク（Sisk）等 ジャーナル・オブ・ヴァイロロジー（Journal of Virology）（USA） 1994年2月発行 68巻2号 ｐ766〜775）およびＦＬＡＧタグ（ホップ（Hopp）等 バイオテクノロジー（Biotechnology）1988年発行 6巻 ｐ1204〜1210）があげられる。
前記ポリペプチドにＧＳＴを融合したＧＳＴ融合タンパク質の場合は、グルタチオン固定化担体を用いることによって、ＧＳＴと該グルタチオン結合担体との吸着・脱着反応を用いて精製し、そののち、ＧＳＴ融合タンパク質からＧＳＴ部分を切断し精製することによって、前記ポリペプチドを製造することができる。
Ｈｉｓタグ融合タンパク質の場合には、金属イオンキレート担体を用いることによって、Ｈｉｓタグと該金属イオンキレート担体との吸着・脱着反応を用いて精製し、そののち、Ｈｉｓタグ融合タンパク質からＨｉｓタグ部分を切断し精製することによって、前記ポリペプチドを製造することができる。
ＦＬＡＧタグ融合タンパク質の場合には、抗ＦＬＡＧタグ抗体の結合した担体を用いることによって、ＦＬＡＧタグと該金属イオンキレート担体との吸着・脱着反応を用いて精製し、そののち、ＦＬＡＧタグ融合タンパク質からＦＬＡＧタグ部分を切断し精製することによって、前記ポリペプチドを製造することができる。
ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドは、前述の方法で取得したＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドを、Protein Convertaseなどのタンパク質分解酵素で処理し、その分解物を逆相クロマトグラフィーで分画し、質量分析等によってＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドの含まれる画分を確認して回収することにより調製することもできる。ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１改変体も、同様にして調製することができる。
このように得られた本発明のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等は、翻訳後にＮ末端を修飾することもでき、本発明にはこのような修飾されたポリペプチド分子も含まれる。たとえば、N末端がピログルタミンに転換されたポリペプチドは、前述の本発明のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を、N末端がグルタミン残基となるように発現させ、得られたポリペプチドを5〜10％酢酸溶液等酸性条件で処理することによって得ることができる（パーク（Park）等 プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）（USA） 1991年3月発行 ｐ22046〜2050）。また、Ｎ末端がアセチル化されたペプチドは、本発明のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を、N末端にαアミノ基をもつ任意のアミノ酸残基となるように発現させ、Sulfo-NHS-Acetateや無水酢酸で処理することによって得ることができる。このようなポリペプチドを翻訳後にＮ末端を修飾する方法は、当技術分野において広く知られている。その他、本発明のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等は、蛍光物質などの化合物で処理して修飾することも可能である（ハーマンソン（Hermanson）等 バイオコンジュゲート・テクニックス（Bioconjugate techniques）（USA）Academic Press 1996年発行）。
トランスジェニック非ヒト動物を用いて前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の製造することも可能である。その方法としては、例えば、前記のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等をコードする遺伝子又はそれらを含むベクターを含むトランスジェニック非ヒト動物トランスジェニック非ヒト動物から採取した、臓器・組織・血液・乳汁等や、それらを細断・粉砕・分画した加工物などから、固形成分を分離した液体成分もしくは、水性溶媒もしくは有機溶媒を用いて抽出した液体成分として、目的のペプチドが含まれる画分を回収することが出来る。目的のポリペプチドは、該画分から、上述の物理学的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作により分離、精製することが可能である。
またトランスジェニック植物を用いて前記ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を製造することも可能である。その方法は、たとえば、特開２００３−１１６３８５号「日本脳炎ワクチンをコードする遺伝子を含むトランスジェニック植物」の公報等を参照することなどによって、実施することが可能である。またトランスジェニック植物の作製方法については、特開２００２−１７１８６号公報などの「トランスジェニック植物」を参照することによって作製することができる。このようなトランスジェニック植物の葉、茎、根、果実、果皮、芽、種子および花弁などの組織やそれらの組織から誘導されたカルス組織などから、また場合によっては該組織を細断、皮剥、粉砕、圧縮した加工物などから、目的のポリペプチドは水性溶媒または有機溶媒を用いての抽出液や圧搾により採取した絞り汁やオイルの中に回収することが可能であり、さらに該ポリペプチドを上述の物理学的性質、化学的性質等を利用した各種の分離操作により分離、精製することが可能である。
本発明の前記ポリペプチドは、化学合成的に合成し取得することもできる。この場合、固相合成法や液相合成法など一般的に用いられるペプチド合成法を利用することができる。ペプチド合成における縮合法やアミノ酸残基の保護、および合成後の保護基の脱離については、公知の方法を利用できる（泉谷等 ペプチド合成の基礎と実験 丸善株式会社 1975年発行、矢島等−日本生化学会編 生化学実験講座１ タンパク質の化学ＩＶ 東京化学同人株式会社 1977年発行）。また、ポリペプチドのペプチド配列全体を一度に合成することも可能であるが、該タンパク質の部分的なペプチドを其々合成してその部分ペプチドを縮合する方法も用いることができる（日本生化学会編 新生化学実験講座 タンパク質IV 合成および発現 東京化学同人株式会社 1991年発行）。
ペプチド合成において用いられるアミノ酸のαアミンは通常tBoc基やFmoc基で保護されているが、最終的に得られるペプチドについてこれらの保護基をつけたまま、または脱保護した形とすることが可能である。また必要に応じて、そのペプチドの脱保護されたアミノ末端を酵素的または化学的に、ピログルタミン酸、アセチル基、ホルミル基または蛍光物質などで修飾された形とすることも可能である（ハーマンソン（Hermanson）等 バイオコンジュゲート・テクニックス（Bioconjugate techniques）（USA）Academic Press 1996年発行）。具体的な例としては、前記本発明のポリペプチドのＮ末端にグルタミンをもつ形で合成し、該ペプチドを５から１０％酢酸溶液等の希酸による処理で環化させることでピログルタミン酸に変化させることができる（パーク（Park）等 プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America）（USA） 1991年3月発行 ｐ22046〜2050）。
また必要に応じて、合成後のポリペプチドのＣ末端にアミド基や蛍光物質などが付加された形の合成ペプチドを作製することも可能である。例えば固相合成法でＣ末端にアミド基を導入した合成ペプチドを得るためには、固相担体（レジン）からペプチドを切断する反応を行った時に、そのＣ末端がアミド化される形の市販のレジンを用いることによって実施することが可能である。またＣ末端に蛍光物質などの修飾を行う方法も公知の方法で行うことができる（ハーマンソン（Hermanson）等 バイオコンジュゲート・テクニックス（Bioconjugate techniques）（USA）Academic Press 1996年発行）。
＜摂食調節および／または体重調節の状態を予測または診断するための検定方法＞
本発明は、哺乳類動物の摂食調節および／または体重調節に関連する疾患の判定、重症度、病態進行のモニタリング、予測、予後または前記医薬品組成物の投与の判断などに用いられる診断のための方法に関する。すなわち、本発明は、試験される哺乳類動物に由来する試料を用いて、該試料に含まれるＮＥＳＦＡＴＩＮをコードする核酸分子（配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子）、またはＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等（配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）の含有量を、正常個体に由来する試料と比較することによる、摂食調節および／または体重調節の状態を予測または診断する方法に関する。なお、正常個体とは、正常または処理を行なっていない個体を意味する。
詳細には、本発明は、試験される哺乳類動物の生体由来の試料における、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子の含有量を正常個体の生体試料と比較して、該遺伝子の発現の低下状態または亢進状態を検出する工程を含む、摂食調節および／または体重調節の状態を予測または診断するための検定方法に関する。
使用される生体試料としては、血液、尿、脳脊髄液、唾液、バイオプシーにより採取された脳組織などがあげられ、なかでも血液が望ましい。試料として使用される血液としては、全血、または全血から得られた血漿もしくは血清があげられる。これらの生体試料の採取方法は公知である。また、これらの生体試料のライセートなどの調製物も試料として使用することができる。あるいは、調製物からｍＲＮＡを抽出すれば、前記核酸分子に対応するｍＲＮＡに対する測定のための試料とすることができる。生体試料のライセートまたはｍＲＮＡの抽出には、市販のキットを利用すると便利である。あるいは、血液、脳脊髄液のような液状の生体試料においては、必要に応じて緩衝液等で希釈してタンパク質や遺伝子について測定のための試料とすることができる。
哺乳類動物の生体試料中の、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子の含有量は、該核酸分子の塩基配列を含むポリヌクレオチド、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる少なくとも１８塩基の長さのオリゴヌクレオチドを、ＰＣＲプライマー、プローブとして使用して測定することができる。この場合当業者であれば、種々のコンピューター・プログラムを用いて、用途に適したプライマーやプローブを設計することができる。このようなポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、アッセイフォーマットに応じて適当な標識を結合することや、適当な支持体に固定化しておくことができる。このようなＰＣＲプライマーおよびプローブは、組換え的に、合成的に製造するか、あるいは当業者に利用可能な任意の手段により製造することができる。たとえば、本発明において使用し得るＰＣＲプライマーとしては、配列番号２２（フォワードプライマー）および配列番号２３（リバースプライマー）などがあげられるが、とくにこれらに限定されるものではない。また、本発明において使用し得るプローブとしては、たとえば、前記プライマーを用いて、鋳型として配列番号２１のＤＮＡ配列を用いて、増幅した断片を標識化することにより得られるものなどがあげられるが（実施例２参照）、とくにこれらに限定されるものではない。
配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子の発現レベルの測定値は、公知の方法によって補正することができる。補正を行なうことにより、試験される生体試料と正常個体の生体試料間で、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子の発現レベルを比較することができる。測定値の補正は、生体試料における各細胞において、発現レベルが大きく変動しない遺伝子（例えば、ハウスキーピング遺伝子）の発現レベルの測定値に基づいて行なうことができる。発現レベルが大きく変動しない遺伝子の例としては、β−アクチン、ＧＡＰＤＨなどがあげられる。
ｍＲＮＡを用いて配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子の発現レベルを測定する場合には、適宜その診断方法に合わせたフォーマットで実施することができる。例えば生体組織から抽出したｍRNAを用いる場合には、ＲＴ−ＰＣＲ法、ノーザンブロティング法などが選択でき、組織標本を用いる場合にはイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション法などを選択できる。例えば実施例８においては、絶食によって食欲が亢進したラットにおいては、ＮＥＳＦＡＴＩＮ遺伝子の発現は抑制され、摂食によって食欲が抑制されている状態ではＮＥＳＦＡＴＩＮ遺伝子の発現が亢進することを、イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション法で示している例が開示されている。
試験試料の配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現量を、正常個体に由来する生体試料と比較して、該遺伝子の発現が低下状態にあることが検出された場合には、摂食亢進または体重増加の状態にあると予測または診断することができ、さらには、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、整形外科的疾患、月経異常および悪性腫瘍より選択される疾患の発症を予測または診断することができる。一方、該遺伝子の発現が亢進状態にあることが検出された場合には、試験された哺乳類動物は、摂食抑制状態または体重増加抑制の状態にあること、さらには、拒食症、機能性胃腸症（Functional dyspepsia）、または癌、炎症性疾患、下垂体・甲状腺・副腎などの機能低下、手術後もしくは過度のストレスなどによる摂食抑制および／もしくは体重増加抑制の病態の状態を予測または診断することができる。
さらに、本発明は、哺乳類動物の生体試料におけるＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等（配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）の含有量を、正常個体の生体試料と比較して、該ポリペプチド含有の低下状態または上昇状態を検出する工程を含む、摂食調節および／または体重調節の状態を予測または診断する方法に関する。該方法は、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を測定することによって行なうことができる。
使用される生体試料としては、血液、尿、脳脊髄液、唾液、バイオプシーにより採取された脳組織などがあげられ、なかでも血液が望ましい。試料として使用される血液としては、全血、または全血から得られた血漿もしくは血清があげられる。これらの生体試料の採取方法は公知である。また、これらの生体試料のライセートなどの調製物も試料として使用することができる。生体試料のライセートの作製には、市販のキットを利用すると便利である。あるいは、血液、脳脊髄液のような液状の生体試料においては、必要に応じて緩衝液等で希釈してタンパク質について測定のための試料とすることができる。
ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の測定は、該ポリペプチドの免疫学的測定法を用いることができ、該免疫学的測定では、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等と結合する抗体を用いることができる。このような抗体としては前述の抗体があげられ、具体的には、実施例３および実施例１０で取得したＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドに由来するペプチドを免疫して取得した抗体、またはＮＥＳＦＡＴＩＮ−１ポリペプチドもしくはNESFATIN-1M30ポリペプチドに由来するペプチドに由来するペプチドを免疫して取得した抗体があげられる。また、これらの抗体に限らず、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等に対するポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体であればとくに限定されず使用できる。
また、本発明の方法に使用される抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な標識を結合することができる。あるいは該抗体は、アッセイフォーマットに応じて適当な支持体に固定化しておくこともできる。
免疫学的測定法は、適宜その診断方法に合わせたフォーマットで実施することが可能である。たとえば血液試料や生体組織のライセートなどを用いる場合には、ELISA法、RIA法、ウエスタンブロティング法などを選択でき、また組織標本を用いる場合には免疫組織化学的手法などを選択できる。より具体的な例としては、実施例に示すようなウエスタンブロティング法、実施例４および１１に示すような免疫組織化学的方法などが挙げられるが、その他抗体を用いて適宜ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の測定系を構築することが可能である。たとえば、実施例３にはウエスタンブロティングの例が、実施例４および９には免疫組織化学的手法による例が、実施例２１にはＥＬＩＳＡ（競合ＥＩＡ）の例が示されている。
試験試料のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の含有量を、正常個体の生体試料と比較して、該ポリペプチド含有が低下状態にあることが検出された場合には、摂食亢進または体重増加亢進の状態にあると予測または診断することができ、さらには、肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、整形外科的疾患、月経異常および悪性腫瘍より選択される疾患の発症を予測または診断することができる。一方、該ポリペプチド含有が上昇状態にあることが検出された場合には、摂食抑制または体重増加抑制の状態にあること、さらには、拒食症、機能性胃腸症（Functional dyspepsia）、または癌、炎症性疾患、下垂体・甲状腺・副腎などの機能低下、手術後もしくは過度のストレスなどによる摂食抑制および／もしくは体重増加抑制の病態の状態を予測または診断することができる。
＜摂食調節および／または体重調節の状態を予測または診断するための検定方法に使用されるキット＞
本発明は、前述の摂食調節および／または体重調節の状態を予測または診断する方法に使用されるキットにも関する。そのようなキットとしては、ＮＥＳＦＡＴＩＮ等をコードする遺伝子（配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子）の発現量を検出するためのキット、またはＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等（配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）の含有量を測定するためのキットなどがあげられる。
ＮＥＳＦＡＴＩＮ等をコードする遺伝子の発現量の検出キットには、該遺伝子を検出するためのＰＣＲプライマー、プローブまたはＤＮＡチップを少なくとも１つ含まれる。
本発明のキットに含まれるＰＣＲプライマーとは、ＮＥＳＦＡＴＩＮ等をコードする遺伝子の塩基配列、またはその相補鎖に相補的な塩基配列からなる少なくとも１８塩基の長さのオリゴヌクレオチドを言い、当業者であれば、本明細書に記載のＮＥＳＦＡＴＩＮ等をコードする遺伝子の塩基配列に基づき適宜調製することができる。たとえば、本発明のキットに含まれるＰＣＲプライマーとしては、配列番号２２（フォワードプライマー）および配列番号２３（リバースプライマー）などがあげられるが、これらに限定されるものではない。また、本発明のキットに含まれるプローブとしては、たとえば、前記プライマーを用いて、鋳型として配列番号２１のＤＮＡ配列を用いて、増幅した断片を標識化することにより得られるものなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。本発明のキットに含まれるＤＮＡチップとは、前記プローブをガラスなどの基盤に固定することにより作製することができる。
そのほか、本発明のキットには、付加的な要素として、試薬や生体試料を希釈するための緩衝液、陽性対照、陰性対照、標識を測定するための基質、反応容器、アッセイプロトコルを記載した指示書などを含めることができる。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくこともできる。また、必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の含有量の測定キットには、該ポリペプチドを認識する抗体、標準ペプチドまたは結合競合反応用ペプチド修飾体が少なくとも１つ含まれる。
本発明のキットに含まれる抗体は、前述の方法に使用される抗体と同様、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を認識する抗体であればよく、とくに限定されるものではない。
本発明のキットに含まれる標準ペプチドとは、前記抗体の、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等との量依存的な結合力を示す標準検量曲線を作成するために使用されるものである。このような標準ポリペプチドとしては、たとえば、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等など、前記抗体が認識するポリペプチドがあげられる。
本発明のキットに含まれる結合競合反応用ペプチド修飾体とは、前記抗体により認識されるペプチドであって、測定対象である生体試料中のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等と該抗体との結合を拮抗する作用を有するペプチドをいう。また、該結合競合反応用ペプチド修飾体は、通常、適当に標識して使用される。
これらを含む本発明のキットは、たとえば、（１）前記結合競合反応用ペプチド修飾体存在下、標準ペプチドと前記抗体より得られる標準検量曲線を作成し、（２）生体試料中、前記結合競合反応用ペプチド修飾体存在下で前記抗体を添加し、（３）結合競合反応用ペプチド修飾体と抗体との結合量を標準検量曲線によって測定することによって、生体試料中に含まれるＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の含有量を測定することができる。
また、相互に結合を阻害しない２種類のＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を認識する抗体を用いて該ポリペプチドの含有量を測定することも可能である。この場合、通常第一の抗体は固相に固定化し、第二の抗体は適当に標識して用いられる。
これらを含む本発明のキットは、たとえば、（１）固定化した第一抗体に標準ペプチドを添加して反応後、更に標識された第二抗体を添加することにより標準検量曲線を作成し、（２）同様に固定化した第一抗体に生体試料を添加して反応後、標識された第二抗体を添加し、（３）生体試料での反応における第二抗体の結合量を標準検量曲線によって測定することによって、生体試料中に含まれるＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等ポリペプチドの含有量を測定することができる。
そのほか、本発明のキットには、付加的な要素として、試薬や生体試料を希釈するための緩衝液、陽性対照、陰性対照、標識を測定するための基質、反応容器、アッセイプロトコルを記載した指示書などを含めることができる。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくこともできる。また、必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることができる。
＜治療候補化合物のスクリーニング方法＞
本発明は、摂食調節および／または体重調節の効果を有する、摂食調節および／または体重調節に関連する疾患または症状の治療または予防候補化合物のスクリーニング方法に関する。
すなわち、本発明は、試験物質を哺乳類細胞に接触させる工程、および該細胞におけるＮＥＳＦＡＴＩＮ等をコードする遺伝子（配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子）の発現誘導を、または該細胞内に含まれるか細胞外に分泌されるＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等（配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド）の量の増加を検出する工程を含む、摂食抑制および／または体重増加抑制の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法に関する。肥満、糖尿病、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、整形外科的疾患、月経異常および悪性腫瘍においては摂食の抑制や体重増加の抑制が必要とされることが示されている。前述のスクリーニング方法により、該疾患に対する治療剤または予防剤を得ることができる。
一方、本発明は、試験物質を哺乳類細胞に接触させる工程、および該細胞におけるＮＥＳＦＡＴＩＮ等をコードする遺伝子の発現抑制を、または該細胞内に含まれるもしくは細胞外に分泌されるＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等の量の減少を検出する工程を含む、摂食亢進および／または体重増加亢進の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法にも関する。拒食症、機能性胃腸症（Functional dyspepsia）、または癌、炎症性疾患、下垂体・甲状腺・副腎などの機能低下、手術後もしくは過度のストレスなどによる摂食抑制および／もしくは体重増加抑制状態においては、摂食の亢進や体重増加の亢進が必要とされることが示されている。前述のスクリーニング方法により、該疾患に対する治療剤または予防剤を得ることができる。
該ポリペプチドまたはそれをコードする遺伝子の発現レベルを、上昇または低下させる化合物とは、遺伝子の転写、安定化もしくは翻訳、またはタンパク質の分泌、活性発現もしくは安定化のいずれかのステップに対し、促進的または抑制的に作用する化合物である。本発明において遺伝子の発現レベルを低下させる化合物とは、これらのステップのいずれかに対して阻害的な作用をもつ化合物である。
本発明の摂食調節および／または体重調節に関連する疾患や症状の治療候補化合物のスクリーニング方法は、in vivoで行うこともin vitroで行うこともできる。このスクリーニングは、例えばin vivoの場合には以下のような工程にしたがって実施することができる。
（1）被験動物に、候補化合物を投与する工程
（2）前記被験動物の生体試料における、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現強度を測定する工程
（3）候補化合物を投与しない対照と比較して、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現強度を上昇させる化合物または低下させる化合物を選択する工程。
ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を産生亢進させる、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現強度を上昇させる化合物は、摂食および／または体重増加を抑制する治療薬の候補となる。そのような活性を有する物質としてはＰＰＡＲγアゴニストなどがあげられるが、これらに限定されるものではない。一方、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を産生抑制させる、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現強度を低下させる化合物は、摂食および／または体重増加を亢進する治療薬の候補となる。このような活性を有する物質としては、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等と結合する抗体、該ポリペプチドをコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＰＡＲγアンタゴニストなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明のスクリーニング方法に使用する被験動物としては、正常動物を用いることが可能であるが、適宜摂食調節および／または体重調節に関連する疾患の病態モデル動物なども用いることが可能である。そのような病態モデル動物の例としてはAgouti Yellow(C57BL/6J-Ay/a)肥満マウスやZucker−fa/fa肥満ラットなどが挙げられ、また本発明のトランスジェニック動物やＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等や該ポリペプチドをコードする遺伝子の活性もしくは発現を抑制する物質を投与されたモデル動物なども用いることが可能である。
ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現強度を測定に関しては、免疫学的測定法やmRNAなどの測定を行うことによって実施できる。免疫学的測定法においては、適宜その測定目的や生体試料に合わせたフォーマットで実施することが可能である。たとえば生体試料が血液試料や生体組織のライセートなどを用いる場合にはELISA法、RIA法、ウエスタンブロティング法などを選択でき、また組織標本を用いる場合には免疫組織化学的手法などを選択できる。ｍＲＮＡを測定する場合には、適宜その測定目的および生体試料に合わせたフォーマットで実施することができる。例えば生体組織から抽出したｍRNAを用いる場合にはＲＴ-ＰＣＲ法、ノーザンブロティング法などが選択でき、組織標本を用いる場合にはイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション法などを選択できる。
in vitroにおけるスクリーニングの例としては、以下のような工程にしたがって実施できる。
（1）哺乳動物由来の細胞または組織に、候補化合物を接触させる工程
（2）前記細胞もしくは組織の試料におけるＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現強度を測定する工程
（3）候補化合物を接触させていない対照と比較して、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現強度を上昇させる化合物または低下させる化合物を選択する工程。
この場合、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を産生亢進させる、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現強度を上昇させる化合物は、摂食および／または体重増加を抑制する治療薬の候補となる。そのような活性をもつ物質としては、ＰＰＡＲγアゴニストなどが挙げられるが、これに限定されるものではない。また、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を産生抑制させる、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現強度を低下させる化合物は、摂食および／または体重増加を亢進する治療薬の候補となる。このような活性をもつ物質としては、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等、と結合する抗体、該ポリペプチドをコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＰＰＡＲγアンタゴニストなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明のスクリーニング方法に使用される被験細胞としては、動物由来の細胞の場合、適宜動物から分離した細胞や、樹立された細胞株などがあげられる。その例としては、肺非小細胞癌細胞株、脂肪細胞、脳もしくは神経に由来する細胞、または細胞株などが挙げられる。また動物由来の組織は適宜動物から取り出した臓器や組織などを用いることができるが、その例としては視床下部を含む形の脳組織スライスなどを用いて実施することが可能である。
ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等、または該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現強度を測定に関しては、免疫学的測定法やmRNAなどの測定を行うことによって実施できる。免疫学的測定法においては、適宜その測定目的や生体試料に合わせたフォーマットで実施することが可能である。たとえば試料が動物由来の細胞による場合にはフローサイトメトリー法や細胞免疫染色などを用いることができ、動物由来の組織を試料として用いる場合には免疫組織化学的手法などを選択できる。試料からのライセートなどの調製物を使用する場合の免疫学的測定法には、ELISA法、RIA法、ウエスタンブロティング法などを選択できる。ｍＲＮＡを測定する場合には、適宜その測定目的および生体試料に合わせたフォーマットで実施することができる。例えば、動物由来の細胞や組織の試料について形態を保ったまま用いる場合にはイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション法などを選択できるし、該試料から抽出したｍRNAを用いる場合にはＲＴ-ＰＣＲ法、ノーザンブロティング法などが選択できる。
また、本発明においてはＰＰＡＲγアゴニストがＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等およびそれをコードする遺伝子の発現を上昇させることを開示している。そのため、上記の工程内の「哺乳動物由来の細胞または組織に、候補化合物を接触させる工程」において、トログリタゾンなどのＰＰＡＲγを、候補化合物を試料に接触させるのと同時か、前後のタイミングで試料に接触させることによって、発現が上昇したＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等、またはそれらをコードする遺伝子の発現を抑制する化合物のスクリーニングが可能であり、該ポリペプチドやそれをコードする遺伝子の発現がＰＰＡＲγを介さない機構で発現を上昇させる化合物のスクリーニングなどを行うことが可能である。
また、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等が細胞に作用した際に生じる、細胞の反応を測定することによっても化合物をスクリーニングすることが可能である。そのようなスクリーニングの例としては、以下のような工程を含むものを挙げられる。
（1）哺乳動物由来の細胞または組織に、候補化合物を接触させる工程
（2）前記細胞または組織の試料に、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等を接触させる工程
（3）候補化合物を接触させていない対照と比較して、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等による、細胞の反応性の有無または強度を測定する工程。
この場合、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等による細胞の反応強度を上昇させる化合物は、摂食および／または体重増加を抑制する治療薬の候補となる。また、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等による細胞の反応強度を低下させる化合物は、摂食および／または体重増加を亢進する治療薬の候補となる。後者のような活性をもつ物質としては、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等と結合する抗体、が挙げられるが、それらに限定されるものではない。
被験細胞としては、動物由来の細胞の場合、適宜動物から分離した細胞や、樹立された細胞株などがあげられる。その例としては、肺非小細胞癌細胞株、脂肪細胞、脳もしくは神経に由来する細胞、または細胞株などが挙げられる。また動物由来の組織は、適宜動物から取り出した臓器や組織などを用いることができるが、その例としては視床下部を含む形の脳組織スライスなどを用いて実施することが可能である。
前記細胞における反応とは、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等が細胞に作動して引き起こされる、物理的・化学的な変化のことを言い、たとえば、細胞の形態、膜電位、細胞の増殖、細胞内カルシウム濃度、遊走反応、細胞内2次メッセンジャー分子（ｃAMP、ｃGMPなど）の濃度などの変化などが挙げられる。
さらに、本発明のスクリーニング方法には、ＮＥＳＦＡＴＩＮ遺伝子のゲノム上の、該遺伝子の発現を制御する転写調節領域を取得し、該転写調節領域の核酸分子を利用するレポーターアッセイ系を利用することができる。レポーターアッセイ系とは、転写調節領域の下流に配置したレポーター遺伝子の発現量を指標として、該転写調節領域に作用する転写調節因子をスクリーニングするアッセイ系を言う。
そのようなスクリーニングの例としては、次の（1）〜（3）の工程を含むものを挙げられる。
（1）ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチドをコードする遺伝子の転写調節領域、およびこの転写調節領域の制御下にレポーター遺伝子を含むベクターを導入した細胞と候補化合物を接触させる工程、
（2）前記レポーター遺伝子の活性を測定する工程、
（3）候補化合物を接触させない対照と比較して、前記レポーター遺伝子の発現レベルを低下させる化合物または上昇させる化合物を選択する工程。
この場合、レポーター遺伝子の発現強度を上昇させる化合物は、摂食および／または体重増加を抑制する治療薬の候補となる。そのような活性を有する物質としては、ＰＰＡＲγアゴニストなどが挙げられるが、それに限定されるものではない。また、レポーター遺伝子の発現強度を低下させる化合物は、摂食および／または体重増加を亢進する治療薬の候補となる。このような活性を有する物質としては、ＮＥＳＦＡＴＩＮポリペプチド等と結合する抗体、該ポリペプチドをコードする遺伝子に対するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＰＰＡＲγアンタゴニストなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。
転写調節領域としては、プロモーター、エンハンサー、通常プロモーター領域に見られるCAATボックス、またはTATAボックスなどがあげられる。レポーター遺伝子としては、CAT（chloramphenicol acetyltransferase）遺伝子、ルシフェラーゼ（luciferase）遺伝子、成長ホルモン遺伝子などを利用することができる。
レポータージーンベクターを導入する細胞としては、動物より分離もしくは樹立された細胞株、または酵母などの非動物細胞などがあげられる。
レポータージーンベクターの宿主への導入方法としては、生物学的方法、物理的方法、化学的方法などを示すことができる。生物学的方法としては、例えば、ウイルスベクターを使用する方法、特異的受容体を利用する方法、細胞融合法（HVJ（センダイウイルス））、ポリエチレングリコール（PEG）、電気的細胞融合法、微小核融合法（染色体移入））が挙げられる。また、物理学的方法としては、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法、ジーンパーティクルガン（gene gun）を用いる方法が挙げられる。化学的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポソーム法、DEAEデキストラン法、プロトプラスト法、赤血球ゴースト法、赤血球膜ゴースト法、マイクロカプセル法が挙げられる。
前述の本発明の各種スクリーニング方法に必要な、ポリヌクレオチド、抗体、細胞株、またはモデル動物は、予め組み合わせてキットとすることができる。これらのキットには、付加的な要素として、標識の検出に用いられる基質化合物、細胞の培養のための培地もしくは容器、陽性もしくは陰性の標準試料、またはキットの使用方法を記載した指示書などを含めることができる。これらの要素は必要に応じて予め混合しておくこともでき、必要に応じて、保存剤や防腐剤を各要素に加えることもできる。
以下、実施例をもって本発明をさらに詳しく説明するが、これらの実施例は本発明を制限するものではない。なお、以下の実施例において、各操作は特に明示がない限り、「Molecular Cloning」（Sambrook, J., Fritsch, E.F. およびManiatis, T.著、Cold Spring Harbor Laboratory Pressより1989年に発刊）に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。動物を用いた実験においては、特に明示がない限り、動物（雄ラット）は午前6時から午後6時までの12時間を明期、午後6時から翌朝午前6時を12時間の暗期の周期での照明下で、22℃の条件で飼育を行い、実験は群馬大学動物実験施設の許可のもとに行われた。
実施例１ ＰＰＡＲγアゴニスト刺激により誘導される遺伝子のクローニング
ＰＰＡＲγによって発現が調節される遺伝子の中から摂食および／または体重調節に作用する遺伝子を同定するために、ＳＱ−５細胞（主としてヒト肺ガン細胞由来）をＰＰＡＲγアゴニストで刺激した場合に特異的に誘導される遺伝子をクローニングし、さらにその中から分泌性の因子として働く可能性のある遺伝子の選定を行った。
ＰＰＡＲγによって肺非小細胞癌で特異的に発現が誘導される遺伝子の取得方法については、Satoh（佐藤）等 オンコジーン（Oncogene）（England）2002年 21巻 p2171〜2180に記載の方法で行った。その方法を以下に簡単に記載する。SQ-5（理研バイオリソースセンター RBC0110）をＰＰＡＲγアゴニストのひとつであるトログリタゾン（三共株式会社）を10-4Mで48時間刺激下において培養したもの、およびトログリタゾンで刺激しなかったSQ-5細胞より、それぞれPoly(A)＋RNA（mRNA）を調製して逆転写反応によって2本鎖ｃDNAを調製した。得られた二本鎖cDNAを用いてトログリタゾンで刺激した細胞から調製したcDNA（テスター）から、無刺激の細胞で発現している細胞のcDNA（ドライバー）を用いて共通に発現している遺伝子を差し引く、サブトラクション法を実施した。サブトラクション法は、テスターおよびドライバーのcDNAを制限酵素Rsa Iで切断した断片を用い、CLONTECH社のPCR-based cloning kitによって、添付のプロトコールに準じて行った。差し引きの反応で残ったcDNAはTAEバッファー（40mM Tris-Acetate、１ｍM EDTA）を用いて１％アガロースゲルでの電気泳動を行い、その後cDNA長が0.5〜2.0kbに相当する長さのものを回収し、pGEM(R)-T Easy Vector System I（プロメガ社 Cat. No. A1360）を用いて添付のプロトコールにしたがい、pGEM(R)-T Easyベクターとライゲーションした。ライゲーションしたベクターを大腸菌DH5α株に導入して、50μg／mlのアンピシリンを含むLB培地で作製した寒天培地上でコロニーを形成させ、得られたコロニーをピックアップすることでトログリタゾン刺激によって特異的に発現が誘導される遺伝子のcDNAを含むクローンを取得した。
各クローンの同定は、クローニングされたcDNAの塩基配列を解析することによって行った。得られた各クローンの大腸菌を50μg／mlのアンピシリンを含む10mlのLB培地で一晩培養し、その菌体よりQIAGEN社QIAprep(R) Spin Miniprep kitを用いて添付のプロトコールにしたがってプラスミドを調製した。
得られた各クローンのプラスミドについて、T7プライマー（Promega社 Cat. No.Q5021）とアプライドバイオシステムズ社のBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit (Cat. No. 4303149）を用いて添付のプロトコールにしたがって、塩基配列解析用反応物を作製し、ABI377型DNAシーケンサー（Perkin-Elmer社）を用いて塩基配列の解析を行った。
その各クローンｃDNAの塩基配列をクエリーとして、EMBLおよびGenbankの核酸配列データベース上の配列とBLAST法を行うことで、すでに全長のcDNA配列が既知のものについてはその配列を取得した。
以上の工程によって全長cDNA配列が得られたものから、分泌性の因子を選択するために、Signal Pソフトウエアで解析してシグナルペプチドを持つタンパク質をコードしているｃDNAを解析した。
＜結果＞
トログリタゾンで刺激したSQ-5細胞から取得したｃDNAを用いて、トログリタゾンで刺激していないSQ-5細胞のｃDNAでサブトラクションを行って得られたクローンは、596クローンであった。それらの内でEMBLおよびGenbankの核酸配列中の登録配列と顕著な相同性が認められたものは213クローンであった。さらにシグナルペプチドの解析によって、9クローンにおいてシグナルペプチド配列をもつことが示唆された。その9クローンの１つは、機能がまだ同定されていないヒトNEFA遺伝子であった（配列番号１）。
実施例２ ＰＰＡＲγアゴニスト刺激による培養細胞株でのNEFA遺伝子の発現誘導
トログリタゾンによるNEFA遺伝子の誘導を確認するため、ＰＰＡＲγを発現している細胞株HTB185およびSQ5、ならびに脂肪細胞株3T3-L1を用いて、Northernブロティング法によるNEFA遺伝子の発現解析を行った。
SQ-5（理研バイオリソースセンター RBC0110）は、10％の牛胎児血清（インビトロジェン−GIBCO社）を含むRPMI1640培地（インビトロジェン−BRL社 Cat. No.11875-085）で継代培養したものを用いた。ヒト脳髄芽細胞腫株HTB185細胞（D283 Med：ATCC HTB185）、およびインスリン・デキサメタゾン・IBMXで分化誘導したマウス胎児線維芽細胞株（前駆脂肪細胞株）3T3-L1細胞（ATCC CL-173）は、10％の牛胎児血清を含むDMEM培地（インビトロジェン−GIBCO社 Cat. No.11995-040）で継代培養したものを用いた。それぞれの培地10mlにサスペンドした各細胞106細胞を直径10cmのディッシュに蒔き込み、細胞が基質に付着した後に、DMSOのみ（コントロール）またはトログリタゾン（三共株式会社）を、10-4M、10-4.5Mまたは10-5Mの濃度になるように培地に添加して、24時間または48時間37℃で5％CO2の条件下で培養を行った。各実験群について5枚のディッシュで処理された細胞を、特定の時間後基質よりはがして集め、ISOGEN（ニッポンジーン社 Cat. No.317-02503）を用いてそのプロトコールに記載の方法で総RNAを抽出・回収した。
NEFA遺伝子を検出するためのプローブの作製は、配列番号２１に記載した565bpの長さのDNA断片を用いて、SP6ポリメラーゼを用いたin vitro転写による標識化を行うことによって作製した。まずMouse Brain ｃDNA Library（Invitrogen社 Cat. No.10655-25）より抽出したプラスミドを鋳型として、以下に記載のプライマーを0.2μMの濃度で用い、変性94℃で1.5分、アニーリング58℃で1分、増幅72℃で2分の反応サイクルを35サイクル行って増幅DNAを作製した（タカラバイオ社Takara Ex TaqTMポリメラーゼCat. No.RR001A 2.5Uを使用）。
NEFAプローブ作製PCR用プライマー：
Forward Primer：５−CCAGTGGAAAATGCAAGGAT−３（配列番号２２）
Reverse Primer：５−TCTTTGCTTCCGGGATGATTA−３（配列番号２３）
得られた増幅DNA産物は、TAEバッファーを用いた２％アガロースゲル電気泳動によって産物の純度を確認した後、pGEM(R)-T Easy Vector System I（プロメガ社 Cat. No. A1360）を用いて添付のプロトコールにしたがい、pGEM(R)-T Easyベクター中にサブクローニングを行い、大腸菌DH5αに導入して50μg／mlのアンピシリンを含むLB培地で作製した寒天培地上でコロニーを形成させた。得られたコロニー数個をそれぞれピックアップし、その大腸菌を50μg／mlのアンピシリンを含む10mlのLB培地で一晩培養し、その菌体よりQIAGEN社QIAprep(R) Spin Miniprep kitを用いて添付のプロトコールにしたがってプラスミドを調製した。T7プライマー（Promega社 Cat. No.Q5021）またはSP6プライマー（Promega社 Cat. No.Q5011）と、アプライドバイオシステムズ社のBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit (Cat. No. 4303149)で用いて添付のプロトコールにしたがって塩基配列解析用反応物を作製し、ABI377型DNAシーケンサー（Perkin-Elmer社）を用いて塩基配列の解析を行った。予想の配列と一致する配列をもち、NEFA由来の増幅遺伝子の５‘側がベクターのT7プロモーター側に向いているクローンを、プローブ作製用のプラスミドを得るクローンとした。そのクローンを50μg／mlのアンピシリンを含む10mlのLB培地で一晩培養し、その菌体よりQIAGEN社プラスミドミニキットを用いて添付のプロトコールにしたがってプラスミドを調製した。調製したプラスミドは制限酵素Nco Iで切断し、フェノール抽出・フェノール／CIAA抽出によって精製し、エタノール沈殿した後にRNA分解酵素を含まないTEバッファー（10mM Tris-HCl 、1mM EDTA、ｐH8.0）に1μg／mlで溶解したものを、プローブ作製用の鋳型プラスミドDNAとして用いた。標識化RNAプローブは鋳型プラスミドDNA1μgより、Promega社Riboprobe(R) System-SP6を用いて2.5μMの[α-32P]UTP（Amersham Bioscience社 Cat. No.PB10203、3000ci/ｍM、10mci/ml）と20UのRNA合成酵素SP6（キットに含まれる）を用いてキット添付のプロトコールに従って作製した。
Northernブロティング用の電気泳動は、各細胞より得られた総RNAを0.66Mの脱イオン化したホルムアルデヒドを含むMOPS緩衝液（20mM 3-(N-morphorino)-propanesulfonic acid、5mM 酢酸ナトリウム、0.5ｍM EDTA）で作製した1.2％アガロースゲルを用い、ホルムアルデヒドを含むMOPS緩衝液で１００V／2時間電気泳動を行った。電気泳動後のゲルから、10倍濃度のSSC（150ｍM NaCl、15ｍM 酢酸ナトリウム）を用いて、ナイロンメンブレン（Perkin-Elmer社 Gene Screen Plus(R) Hybridization Transfer Membrane）にRNAをトランスファーした。トランスファーしたナイロンメンブレンは、Stratagene社 Stratalinkerを用いてUVによるRNAの固定化を行った。その後、ナイロンメンブレンは、プレハイブリダイゼーション液（0.25M NaCl、20mM Tris-HCl pH7.5、2.5mM EDTA、1% SDS、0.5％ウシ血清アルブミン、0.5％ Polyvinylpyrolidone、0.5％ Ficoll、50％脱イオン化ホルムアミド）で43℃3時間プレハイブリダイズを行い、さらに1,000,000cpm／mlの標識RNAプローブを含むハイブリダイゼーション液（0.25M NaCl、20mM Tris-HCl pH7.5、2.5mM EDTA、1% SDS、0.5％ウシ血清アルブミン、0.5％ Polyvinylpyrolidone、0.5％ Ficoll、50％脱イオン化ホルムアミド、10％硫酸デキストラン）中において43℃で一晩ハイブリダイゼーションを行った。ハイブリダイゼーション後のナイロンメンブレンは、２倍濃度のSSCですすいだ後、60℃の0.1％SDSを含む0.2倍濃度のSSC中で30分間ずつ2回ストリンジェントな洗浄を行った。洗浄後のナイロンメンブレンは、増感スクリーン（Cronex社 Lightning Plus）存在下でX線フィルム（Kodak社 XAR film）に一晩暴露することによって、ハイブリダイズしたラベル化RNAプローブを検出した。
＜結果＞
トログリタゾン（TGZ）による細胞株でのNEFA遺伝子の誘導をNorthernブロティング法で解析した結果を図１に示す。図１のレーン１から４はＰＰＡＲγを発現しているヒト脳髄芽細胞腫株HTB185細胞を用いた検討結果である。レーン１と３はHTB185細胞をTGZで刺激していない状態で培養した細胞のRNA（それぞれ24時間、48時間培養）、レーン２と４はトログリタゾン10-4Mでそれぞれ24時間および48時間刺激した細胞のRNAを用いてNEFA遺伝子発現を検出した結果を示す。その結果、TGZ刺激を行っていない細胞ではわずかなNEFA遺伝子の発現しか認められない（レーン１および３）のに対して、TGZで48時間刺激した細胞においては顕著な誘導が認められた（レーン４）。また図のレーン５および６は、ＰＰＡＲγを発現しているSQ-5を用いた検討結果である。レーン５はTGZで刺激していない状態で培養したSQ-5細胞のRNA（24時間培養）、レーン６はTGZ10-4Mで24時間刺激した細胞のRNAを用いてNEFA遺伝子発現を見たものである。その結果TGZ刺激していない細胞では低いレベルでの発現が認められるが（レーン５）、TGZ刺激で24時間培養した細胞では顕著なNEFA遺伝子の発現誘導が認められた（レーン６）。さらに図１のレーン７から１０は、ＰＰＡＲγを発現しているマウス胎児線維芽細胞株（前駆脂肪細胞株）3T3-L1細胞を用いて検討した結果である。レーン７はTGZで刺激していない状態で培養した3T3-L1細胞のRNA（48時間培養）を、レーン８〜10は3T3-L1細胞をTGZでそれぞれ10-5M・10-4.5M・10-4Mで48時間刺激した細胞のRNAを用いて、NEFA遺伝子の発現を検出した結果を示す。その結果、該細胞をTGZで刺激しない場合にもNEFA遺伝子のかなりの発現量が認められ（レーン７）、その発現は10-5Mから10-4MのTGZで刺激した場合にも同様の結果が得られ、NEFA遺伝子は脂肪細胞においてはＰＰＡＲγの刺激に関わらず恒常的に発現していることが認められた。
実施例３ NEFAに対する抗体の作製とラット脳での発現の検証
脂肪細胞に発現している分泌タンパク質は、脳でも発現し摂食調節作用を有する可能性がある脳―脂肪細胞系（The Brain-Adipose Axis）として提唱されている（森 昌朋：肥満研究 2004年 10巻 ｐ１１７−１１９, Shimizu H and Mori M: Nutritional Nuerosci 8: 7-20, 2005）。そこで、脂肪細胞と脳腫瘍細胞に発現しているNEFAに対する抗体を作製して、NEFAの視床下部での発現の局在を検討した。
NEFAに対する抗体の作製のために、抗原として、ラット前駆体NEFAポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号８）の141番目のHisから152番目のSerまでの配列にC末端部位にCysをつけた合成ペプチド（配列番号２４：株式会社ＡＴＰで合成）を用いた（以下、該ペプチドをNAPペプチドと呼ぶ）。NAPペプチド：N-HisLeuAsnHisGlnAsnProAspThrPheGluSerCys-C（配列番号２４）
該合成NAPペプチドはPIERCE社Imject(R) Maleimide Activated Mariculture Keyhole Limpet Hemocyaninを用いて添付のプロトコールに従って、ペプチドをKLH（Keyhole Limpet Hemocyanin）にコンジュゲートした。得られたコンジュゲートはウサギ１羽に対して0.2mgを1回分の免疫に用いた。免疫はコンジュゲート溶液0.25ml（コンジュゲート濃度１mg／ml）と等量のフロイントのコンプリートアジュバント H-37 Ra （和光純薬−Difco社 Cat. No.528-00031）を混合し、毛剃りしたニュージーランドホワイト系のウサギ（今井実験動物試験場より購入）の背部に、５０μlずつ８箇所に皮内注射することで行った。同様の免疫を２週間おきにさらに４回行った後、最後の免疫から１週間後に血液を一部採取して、その血清中の抗体価を免疫したペプチドコンジュゲートを用いたELISA法で確認し、その翌日に動物を屠殺して全血を採取した。得られた血液から血清を作製し、その血清からDEAESepharoseFF（Amersham Bioscience社 Cat. No.17-0709-10）を用いて定法によってウサギIgGを精製した。精製されたウサギIgGは、１mgのNAPペプチドを用いてSulfoLink kit（PIERCE社 Cat. No.44895）により作製したペプチド固定化カラムを用いて、該キット添付のプロトコールに従ってアフィニティー精製した。
得られたNAPペプチドに対する抗体（抗NAPポリクローナル抗体）を用いて、ラット脳におけるNEFAポリペプチドの発現についてウエスタンブロティング法で解析を行った。
ラットの脳からのタンパク質抽出液は、８週齢のWistar系ラット（日本チャールズ・リバー）の脳視床下部（1.7g）を５mlの抽出緩衝液（50mM Tris-HCl pH8.0、150ｍM NaCl、５ｍM EDTA、1％ Nonidet P-40）でホモジナイズして調製した。得られたラットの脳ライセートに等量のSDS-ポリアクリルアミド電気泳動（SDS-PAGE）用の５％のβ-mercaptoethanolを含むLaemmliサンプルバッファー（BIO-RAD社 Cat. No.161-0737）と等量混合して100℃で5分加温した後、常温においてマイクロ遠心機で15,000rpm10分間遠心した上清を回収した。その上清20μlをポリアクリルアミドゲル（BIO-RAD社 レディーゲル10-20％ Cat. No.161-J390V）でTris-glycine/SDSバッファー（25ｍM Tris、192mM glycine、0.1％ SDS、ｐH8.3）を用いて１００Vで1時間電気泳動し、ニトロセルロース膜に転写した。この膜を３％ゼラチン／ＴＢＳで室温で１時間ブロッキングし、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで１回洗浄した。その後、抗NAPポリクローナル抗体１μｇ／ｍｌを含む１％ゼラチン／ＴＢＳ溶液中、室温で終夜反応させた。翌日、ＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで１回洗浄し、約１μｇ／ｍｌの濃度で１％ゼラチン／ＴＢＳ溶液に希釈した抗ウサギＩｇＧヤギポリクローナル抗体パーオキシダーゼコンジュゲート（Cappel社 Cat. No.674371）を室温１時間反応させた。次にＴＢＳ−０．０５％Ｔｗｅｅｎで３回、ＴＢＳで２回洗浄し、HRP発色キット（BIO-RAD社 Cat. No.170-64631）で５分間、室温にて発色させてバンドを検出した。
＜結果＞
NEFAポリペプチドの構造の模式図と抗体の作製に用いたペプチドの配列のNEFA上での位置を図２のＡに、NAPペプチドを免疫して作製したポリクローナル抗体でラットの脳からのタンパク質の抽出液を用いてウエスタンブロティングを行った結果を図２のＢに示す。NAPペプチドに対して作製したポリクローナル抗体でラットの脳のタンパク質抽出液を用いてウエスタンブロティングを行ったところ、約４７．５ｋｄの分子量のところに単一のバンドが認められた（図２Ｂ）。このことからNAPに対する抗体は全長のNEFAを認識すること、またラットの脳内でNEFAが発現していることが明らかになった。
実施例４ ラットの脳視床下部におけるNESFATINの発現部位の検討
摂食調節に関連するラット脳の視床下部におけるNEFA発現部位を解析するため、ラットの脳の切片を用いた免疫組織化学的解析を実施した。８週齢のWistar系ラット（日本SLCより購入）の腹腔内に40mg／kgのペントバルビタール・ナトリウムを注射して麻酔し、開胸して心臓より50mlの生理食塩水（0.85％ NaCl）を注入し、続いて４％パラホルムアルデヒドを含むPBS（20ｍM リン酸緩衝液、150ｍM NaCl ｐH7.2）を400mlペリスタポンプで注入・循環させることによって、脳を灌流固定した。その後脳を摘出し、視床下部を含む部分を切り出して４％パラホルムアルデヒドを含むPBSで４℃一晩固定化した。固定した脳試料は、１０％シュクロースを含むPBSに4時間、１５％シュクロースを含むPBSに4時間、２０％シュクロースを含むPBSで一晩4℃浸漬した。その後脳試料はOCTコンパウンドに浸漬し、ドライアイスーアセトンで凍結して包埋したブロックを作製した。作製したブロックからクライオスタットを用い、−20℃で６μm厚の切片を作製してシランコーティングスライド（マツナミ製MASコートスライド）に乗せて風乾した。スライドに乗せた組織切片は３％過酸化水素水で5分間処理し、PBSで5分間2回洗浄した。さらに組織切片を１０％のヤギ正常血清（株式会社ニチレイ Cat. No.426042）で室温10分間処理することでブロッキングし、0.5％のBSAを含むPBSに希釈した１μg／mlのNAPペプチドに対するポリクローナル抗体（実施例３）を室温で1時間反応させた（Ab群）。スライドをPBSで洗浄した後、ヒストファイン・シンプルステインラットMAX−PO（株式会社ニチレイ Cat. No.414181）反応させ、PBSで5分間3回洗浄した後、シンプルステインDAB溶液（株式会社ニチレイ Cat. No.415172）を用いて発色を行った。発色後のスライドを水洗した後、マイヤー・ヘマトキシリン（武藤化学薬品 Cat. No.3000）で染色を行い、水洗・アルコール脱水・キシレン透徹を行った後、非水溶性封入剤（株式会社ニチレイ Cat. No.415141）を用いてカバーグラスを載せて封入した。封入後のスライドの脳切片を用いて、顕微鏡での観察を行った。
＜結果＞
図３にラット脳の視床下部および第三脳室（３V）領域での組織切片における抗NAPペプチド抗体による組織免疫化学染色の顕微鏡像（２００倍）を示す。図中の視床下部のArc：弓状核、PVN：室傍核、LH：外側野、SON：視床上核に特異的に染色が見られ、これらの部位でのNEFAの発現が示された。以上のことよりNEFAポリペプチドはラットの視床下部特に弓状核、室傍核、視床上核および外側野で発現していることが示された。
また、この成績からNEFA遺伝子によってコードされるNEFAポリペプチドが視床下部の摂食調節に関与する部位で発現が認められたことから、該ポリペプチドをNESFATINと命名した。
実施例５ リコンビナントNESFATINの作製
摂食に関連する視床下部神経核に発現しているNESFATINの性状を確認するために、リコンビナントNESFATINを大腸菌で作製した。マウス成熟型NESFATINポリペプチド（配列番号６）のN末端にGST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）を結合した融合タンパク質（リコンビナントマウスGST-NEFA：配列番号２５）として発現させ、その融合タンパク質をプロテアーゼで処理することによってリコンビナント成熟型マウスNESFATIN（配列番号２６）を精製する方法を用いた。なおラットNESFATINとマウスNESFATINのアミノ酸レベルでの相同性は９６．５％と非常に高い。
リコンビナントマウスGST-NEFA発現用の遺伝子の作製は、まずMouse Brain ｃDNA Library（Invitrogen社 Cat. No.10655-25）より抽出したプラスミドを鋳型として、以下に記載のプライマー（各0.25μM）を用い、変性94℃での変性反応1.5分に続いて、変性94℃で0.5分、アニーリング60℃で0.5分、伸長72℃で2分の反応サイクルを5サイクル行った後、変性94℃で0.5分、アニーリングおよび増幅72℃で2分の反応サイクルを30サイクル行い、増幅DNAを作製した（Stratagene社PfuTurbo(R)ポリメラーゼ、Cat. No.600250を使用）。
リコンビナント成熟型マウスNEFAｃDNA作製PCR用プライマー：
Forward Primer：５−TTGGATCCGTTCCTATCGATGTGGACAAGAC−３（配列番号２７）
Reverse Primer：５−TTGCGGCCGCTTATGTGTGTGGCTCAAACTTCAG−３（配列番号２８）
得られたPCR産物はQIAGEN社MinElute PCR Purification Kitで精製し、制限酵素BamHIおよびNotIで切断し、２％アガロースゲル−TAE電気泳動で1.3ｋｂ程度のバンドを切り出してDNA断片を回収した（QIAGEN社 MinElute Gel Extraction Kit Cat. No. 28604を使用）。その1.3ｋｂのDNA断片を制限酵素BamHIおよびNotIで切断したｐGEM-11Zf(＋)ベクター（Promega社P2411）とライゲーションを行い、大腸菌DH5α株（タカラバイオ社 Cat. No.9057）を形質転換して50μg／mlのアンピシリンを含むLB培地で作製した寒天培地上でコロニーを形成させた。
その得られたコロニーを数個ピックアップして、各クローンから調製したプラスミドについて、塩基配列解析をpUC/M13 Forwardプライマー（Promega社 Cat. No.Q5391、ｐUC/M13 Reverseプライマー（Promega社 Cat. No.Q5401）、マウスNEFA遺伝子内の配列による2種類のプライマーｍSQ1（５−CCTGAACCACCAGAATCC−３：配列番号２９）およびmSQ2（５−AGACTGATGGATTGGACC−３：配列番号３０）を用いて、アプライドバイオシステムズ社のBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit (Cat. No. 4303149)とABI377型DNAシーケンサー（Perkin-Elmer社）によって塩基配列の解析を行った。塩基配列解析によって配列番号１１と一致した塩基配列を持つことが示されたクローンを、50μg／mlのアンピシリンを含む10mlのLB培地で一晩培養し、その菌体よりQIAGEN社QIAprep(R) Spin Miniprep kitを用いて添付のプロトコールにしたがってプラスミドを調製した。
そのプラスミドを制限酵素BamHIおよびNotIで切断し、２％アガロース−TAEゲルで電気泳動を行って1.2ｋｂの大きさのバンドを切り出してDNAを回収した。回収したDNA断片は制限酵素BamHIおよびNotIで切断したｐGEX-４T-1ベクター（アマシャムバイオサイエンス社 Cat. No.27-4580-01）とライゲーションを行い、大腸菌BL21株（アマシャムバイオサイエンス社 Cat. No.27-1542-01）にGene Pulser Xcellエレクトロポレーションシステム（BIO-RAD社 Cat. No.165-2660J1）を用いて形質転換を行い、50μg／mlのアンピシリンを含むLB培地で作製した寒天培地上でコロニーを形成させた。形質転換によって得られた組換え大腸菌は、ｐGEX5’Sequencing PrimerおよびｐGEX3’Sequencing Primer（アマシャムバイオサイエンス社 Cat. No.27-1410-01および27-1411-01）を用いたPCRによってインサートの有無を確認し、さらに実施例２で用いたNEFAプローブ作製PCR用プライマーのセットを用いたPCRによってNEFA遺伝子の挿入を確認した。成熟型NEFAｃDNAがｐGEX-4T-1ベクターに組み込まれたことが確認されたクローンを用いてリコンビナントマウスGST-NEFAタンパク質の発現を行った。10mlの100μg／mlのアンピシリンを含むLB培地を用いて37℃で一晩振盪培養し、そのうちの5mlを500mlの100μg／mlのアンピシリンを含むLB培地に加えて、600ｎｍの波長による吸光度が0.6になるまで37℃で振盪培養した（一部の菌をサンプリング：Preinduced bacteria）。その培地に最終濃度1ｍMになるようにIPTG（Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside：Gibco BRL社）を加え、さらに37℃で3時間振盪培養を行った。培養後、菌体を含む培地を5,000gで15分間4℃で遠心して菌体を回収し、25mlのPBSに懸濁した。懸濁液は−80℃で1時間程度凍らせた後、37℃で素早く解凍して、氷上で超音波処理30秒ｘ5回を施すことによって菌体を破砕した。その後10,000ｇで30分間4℃で遠心してその上清を回収した（沈殿画分をサンプリング：Post-sonicated pellet）。
上清はAKTA-FPLC液体クロマトグラフィーシステム（アマシャムバイオサイエンス社）を用いてPBSで平衡化した5mlスケールのGSTrapFFカラム（アマシャムバイオサイエンス社 Cat.No.17-5131-01）にアプライし、その後50mlのPBSでカラムを洗浄した（流速：1ml／分）。その後溶出バッファー（10ｍM還元型グルタチオン、0.4M Tris-HCl pH8.0、0.2M NaCl）を１ｍｌ／分の流速で流し、1mlずつのフラクションとして回収して280nmの吸光度でタンパク質の含まれている画分を回収した（280ｎmの吸光度が最も高かったフラクション：Purified GST-NEFA）。Preincubation baceteria画分、Post-sonicated pellet画分、Purified GST-NEFA画分の一部を５％のβ-メルカプトエタノールを含むLaemmliサンプルバッファー（BIO-RAD社 Cat. No.161-0737）に溶解し、100℃で5分処理した後にマイクロ遠心機で15,000rpm5分間遠心した上清をポリアクリルアミドゲル（BIO-RAD社 レディーゲル10-20％ Cat. No.161-J390V）でTris-glycine/SDSバッファーを用いて１００Vで1時間電気泳動し、クマシーブリリアントブルー染色液（BIO-RAD社 Bio-Safe CBB G-250 Cat. No.161-0786）で染色した。Purified GST-NEFA画分のほとんどは、PBSで平衡化したHITrap Desaltingカラム（アマシャムバイオサイエンス社 Cat. No.17-1408-01）を用いた液体クロマトグラフによってサンプル中の還元型グルタチオンを除去し、再度PBSで平衡化した5mlスケールのGSTrapFFカラムにアプライした。カラムを１ｍｌ／分の流速で25mlのPBSで洗浄した後、更に15mlのプロテアーゼ反応バッファー（50mM Tris-HCl pH7.5、150ｍM NaCl、１ｍM EDTA、１ｍM DTT）をカラムに通し、20U／mlの濃度のThrombin（アマシャムバイオサイエンス社 Cat. No.27-0846-01）を含む4.6mlのプロテアーゼ反応バッファーをカラムにアプライして、全量がカラムに入ったところで液体クロマトグラフのポンプを止め、室温（22℃）で一晩プロテアーゼによる反応を行った。翌日カラムを１ｍｌ／分の流速でPBSを15ｍｌ流すことによって得られた画分を回収し、得られた画分をHiTrap Benzamidine FFカラム（アマシャムバイオサイエンス社 Cat. No.17-5143-02）を通すことによってThrombinを除去した画分を得た（Prepurified sample）。その画分からリコンビナント成熟型マウスNEFAポリペプチドを精製するため、陰イオン交換樹脂によるクロマトグラフィーによる分画を行った。Prepurified sample（２０ml）をバッファーA（20mM bis-Tris pH6.5、0.1M NaCl、0.1％ CHAPS）で５倍に希釈し、バッファーAで平衡化したHiTrap Q HPカラム（アマシャムバイオサイエンス社 Cat. No.17-1153-01）にアプライし、その後１ml／分の流速でバッファーAで洗浄した（１ｍｌずつのフラクションを回収：Washed sample）。洗浄したカラムをバッファーAおよびバッファーB（20mM bis-Tris pH6.5、1M NaCl、0.1％ CHAPS）を用いて、バッファーBが0〜50％／６０分の直線的濃度勾配になる形で、0.5ｍｌ／分の流速での溶出を行った。この際0.5ｍｌずつのフラクションを取り、280nmの波長による吸光度でタンパク質の含まれている画分を回収した（Purified sample）。この精製の過程で得られたサンプル（Prepurified sample、Washed sample、Purified sample）を一部とり、５％のβ-メルカプトエタノールを含むLaemmliサンプルバッファーと等量混合して100℃で5分加温した後、実施例３に記載の方法と同様にウエスタンプロッティングを行った。この画分をPBSに対して透析を行い、精製された成熟型マウスNEFAポリペプチドを得た。
＜結果＞
図４のＡに組換え体大腸菌でGST-NEFA融合タンパク質を発現させ、GSTrapFFカラムでGST-NEFA融合タンパク質を精製した過程のサンプルを用いたSDS-PAGEでの染色像を示す。図４のＢにGST-NEFA融合タンパク質からThrombinによって成熟マウスNEFAポリペプチドを切り出して、HiTrap Q HPカラムで精製を行った過程でのサンプルにおける抗NAPポリクローナル抗体によるウエスタンブロッティングの結果を示す。図４のＡより、レーン３のIPTGによる発現誘導後に菌体を破砕したPost-sonicated pelletにおいて、レーン２のPreinduced bacteriaサンプルに対して、分子量６５kd産物の顕著な増大が認められた。また、GSTrapFFカラムで精製した画分（Purified sample）において６５kdの主産物が認められたことから、組換え体大腸菌においてリコンビナントマウスGST-NEFA融合タンパク質が発現していることが示された。また図４のＢによると、精製前のサンプル（Prepurified sample）では分子量４７.５ｋｄのThrombinによって切断された成熟型マウスNEFAポリペプチドおよび分子量約６５ｋｄのリコンビナントマウスGST-NEFA融合タンパク質のバンドが検出されたのに加えて、数本のバンドが認められた。一方、Purified sampleにおいては分子量４７.５ｋｄの主要なバンドと６５ｋｄの弱いバンドのみが認められ、ほぼ純粋なリコンビナント成熟型マウスNEFAポリペプチドが得られたことが示された。
実施例６ NESFATINの脳室内投与による摂食行動への作用の検討
得られたリコンビナントNESFATINの動物の摂食行動に対する作用を検証するため、無麻酔下でのラットの第三脳室への脳内投与による実験を行った。
ラットはWistar系ラット（日本SLCより購入）を用い、購入後午前6時から午後6時までの12時間を明期、午後6時から翌朝午前6時を12時間の暗期の周期で、粉末飼料（日本クレア社 CE−2）を与え、22℃において飼育し、実験の間も同様の条件で飼育を継続した。実験にはオスの８〜９週齢Wistar系ラットの内、体重200から250gの間の個体を選別して用いた。投与には生理食塩水（コントロール）、または実施例５で作製したリコンビナントNESFATINを生理食塩水５μｌあたり １ｐmol、４pmol、20pmolに溶解したものを、1個体あたり5μlずつ用いた（各群N=５）。ラットに体重１ｋｇ当たり４０mgのペントバルビタール・ナトリウムを腹腔内に投与して麻酔を行い、頭部を除毛してから脳定位固定装置（David Kopf社 Model962）に固定して、頭皮を切開し、２３G針（ガイドカニューレ）を第３脳室に達するよう（Bregma後方2.5ｍｍ、表面９．５ｍｍ）留置固定した。そのガイドカニューレの固定の１週間後に各実験に供した。手術から回復した後、摂食活動が亢進する暗期に入る直前に、無麻酔下で２９Gの注入用カニューレをガイドカニューレに挿入し、1秒間に１μlの速度で生理食塩水または生理食塩水に溶解した成熟型マウスNESFATIN溶液を５μl投与し、投与後2〜3分程度そのままカニューレを固定してから、注入用カニューレを引き抜き、個別ケージに戻した。以後1時間後、3時間後、6時間後の飼料の重量変化を測定することで摂食量を記録して、摂食行動の指標とした。なお、有意差検定には分散分析（analysis of variance）を用いた。
＜結果＞
第3脳室内にリコンビナントNESFATINを各0（PBSのみ）、1、4、20pmol投与した際の、投与後0〜1時間の間での摂食量を図５のＡに、１〜3時間の間での摂食量を図５のＢに、3〜6時間の間での摂食量を図５のＣにグラフとして示した。0〜1時間、１〜3、3〜6時間のいずれにおいても生理食塩水のみ投与したラットと比較して、リコンビナントNESFATINを投与した群では、投与量依存的に摂食量の低下が認められた。特に20pmolのリコンビナントNESFATINを投与した群では0〜１時間／１〜3時間／３〜6時間（各P＜0.01）のいずれの間においても、それらの摂食量は対照群と比較して有意な摂食抑制作用が認められた。これらの成績よりNESFATINは脳内において摂食行動を抑制する作用を有することが示された。
実施例７ 抗NESFATIN抗体の脳室内投与による摂食行動への作用の検討
NESFATINの摂食調節の作用をさらに検証するため、NESFATINに対する抗体の第3脳室内投与による摂食行動への作用の検討を実施した。
抗体は実施例４で作製した抗NAPペプチド抗体（NAP IgG）を用い、生理食塩水で希釈した抗体５μlをラットに投与した（投与量５μｇ）。コントロールとして、免疫していないウサギより精製されたIgG（Control IgG）を同じ濃度で、同量投与を行った。ラットは、Wistar系ラット（日本SLCより購入）を用い、実施例６と同様に飼育し、オスの８〜９週齢Wistar系ラットのうち、体重200〜250gの間の個体を選別して用いた。投与時期は、摂食行動が少ない明期に入る直前に行い、投与の手技は実施例６に記載の方法と同様に実施した。脳室内投与後〜3時間〜6時間〜9時間の間の粉末飼料の摂食量を測定した。なお、有意差検定にはanalysis of varianceを用いた。
＜結果＞
Control IgGまたは抗NESFATIN 抗体（NAP IgG）を脳室内に投与されたラットにおける０〜３時間の間の摂食量を図６のＡに、３〜６時間の間の摂食量を図６のＢに、６〜１２時間の間の摂食量を図６のＣにグラフとして示している。抗NESFATIN抗体を脳室内投与された個体においては明期における０〜３時間（図６のＡ）、および３〜６時間（図６のＢ）における摂食量は、Control IgGが投与された個体と比べて統計学的に有意に促進する（各P＜0.001）ことが示された。その抗NESFATIN抗体投与群での摂食量の増大は０〜３時間（図６のＡ）ではControl IgG投与群の約９倍、３〜６時間では約１０倍程度であった。しかしながら、６〜９時間の間は暗期となり、Control IgG投与群の摂食行動が開始されたので、有意差は見られなかった。このように、抗NESFATIN抗体投与によりラットの摂食量の亢進が見られたことから、抗NESFATIN抗体は内在性のNESFATINの作用を抑制すること、NESFATINは摂食行動に関与していることが示された。
実施例８ ラット視床下部でのNEFA遺伝子の発現および絶食によるその影響の検討
内因性NESFATINの遺伝子発現が絶食によりどのように変動するのかについて、in situハイブリダイゼーション法により検討した。
脳組織におけるin situハイブリダイゼーション用のプローブは、実施例２で作製した、NEFAプローブ作製用のプラスミドを用いた。制限酵素NcoIで切断して精製した該プラスミド1μgを用いて、ジゴキシゲニン（DIG）RNAラベリングキット（ロッシュ・ダイアグノスティックス社 Cat. No.1175025）を用いて、SP6−RNA転写酵素の反応によってDIG標識化ｃRNAプローブを作製した。SP6−RNA転写酵素の反応は40℃で2時間行い、反応後20μlの反応液に対して２μlの0.2M EDTA（ｐH7.0）を加えて反応を停止させ、そこに2.5μlの３M LiClと75μlの−２０℃に冷やしたエタノールを加えて混合した後、−２０℃で一晩静置した。翌日反応物を4℃に設定したマイクロ遠心機で15,000rpmで20分間遠心分離して上清を除き、沈殿に50μlの70％エタノールを加えて再度遠心分離を行いその上清を除いて、沈殿を乾燥させた。沈殿はDEPC処理水（ニッポンジーン社 Cat. No.314-90205）に溶解し、アガロースゲル電気泳動によってRNA量を定量し、およそ0.1mg／mlのRNA濃度になるようにDEPC処理水で希釈した。得られたｃRNAプローブの長さ（≒450base）を短くするため、この0.1mg／mlの濃度のRNA溶液10μlに対して10μlのDEPC処理水および40μlのCarbonate Buffer（60ｍM 炭酸ナトリウム、40ｍM 炭酸水素ナトリウム、ｐH10.2）を加えて混合し、60℃で30分間反応させた。反応物に対して60μlの中和溶液（３M 酢酸ナトリウム、１％ 酢酸、ｐH6.0）を加え、さらに360μlの−２０℃に冷やしたエタノールを加えて混合した後、−70℃で30分間冷却して4℃に設定したマイクロ遠心機で15,000rpmで20分間遠心分離して上清を除いて沈殿を得た。沈殿は100μlの70％エタノール（−20℃）を加えて再度遠心分離を行いその上清を除いて、沈殿を乾燥させた。乾燥した沈殿は100μlのDEPC処理水に溶解して、アガロースゲル電気泳動によって濃度の測定を行った。得られたプローブの濃度はおよそ50μg／mlで有った。このようにして得られたDIG標識NEFAcRNAプローブをin situハイブリダイゼーションに用いた。
約８週齢のオスのWistar系ラット（日本SLCより購入）（体重220〜250g）を、自由に粉末飼料を摂食できる個体（Normal）、48時間飼料を与えず飲料水のみで飼育した個体（Starvation）、36時間飼料を与えずに飼育した後に再度12時間自由に飼料を摂食できるようにした個体（Re-feeding）に分けて飼育し、実施例５記載の方法と同様に４％パラホルムアルデヒドを含むPBSで灌流固定して脳を取り出した。取り出した脳は視床下部を含む部分を切り出してさらに４％パラホルムアルデヒドを含むPBSで４℃一晩固定を行った。固定した脳組織は実施例４に記載の方法と同様にクライオスタットで10μmの厚さの切片を作製して、シランコーティングスライドグラスの上に載せた。脳組織切片を載せたスライドグラスを恒温器にいれて50℃で2分間処理した後、切片を室温で30分間乾燥させた。切片は再度４％パラホルムアルデヒドを含むPBSで7分間室温処理して固定し、PBSで3分間および2倍濃度のSSCで5分間2回洗浄した。
スライドグラス上の脳組織切片が覆われるように、in situハイブリダイゼーション液（4倍濃度SSC、10％ 硫酸デキストラン、1倍濃度Denhardt’s液、２ｍM EDTA、50％ 脱イオン化ホルムアミド、500μg／ml マス精子DNA）を載せ、37℃で1時間プレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーション終了後、載せてあった液を捨てて、組織が覆われるように200ng／mlの濃度のDIG標識化NEFAｃRNAプローブを含むin situハイブリダイゼーション液を載せて、湿潤箱中で37℃16時間ハイブリダイズを行った。ハイブリダイズ後の脳組織切片の載ったスライドグラスは、37℃で2倍濃度のSSCにより5分間洗浄した後、37℃で60％ホルムアミドを含む0.2倍濃度SSCで5分間ずつ3回洗浄、さらに室温で2倍濃度SSCによって5分間2回洗浄を行った。
洗浄後の脳組織においてハイブリダイズしたプローブは、DIG Nucleic Acid Detection Kit（ロッシュ・ダイアグノスティックス社 Cat. No.11175041）を用いて検出を行ったが、その方法の概要は以下のとおりである。脳組織の載ったスライドグラスを150ｍM NaClを含む100ｍM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液で5分間室温で洗浄し、キットに含まれているBlocking Reagentを飽和させた同緩衝液（ブロッキングバッファー）を用いて室温で30分間ブロッキングを行った。そのスライドグラスにキットに含まれている抗DIG抗体アルカリフォスファターゼコンジュゲートを1／200の濃度にブロッキングバッファーに希釈したものを載せて、室温で2時間反応させた。反応後のスライドグラスは150ｍMのNaClを含む100mM Tris-HCl（pH7.5）緩衝液で5分間2回洗浄した後、検出緩衝液（100mM Tris-HCl pH7.5、100mM NaCl、50mM MgCl2）で10分間洗浄を行った。その後、0.18mg／mlのBCIPと0.34mg／mlのNBTを含む検出緩衝液を載せて、室温で16時間反応させて発色反応を行わせた。そのスライドグラスは１mMのEDTAを含む10ｍM Tris-HCl（pH8.0）で５分間洗浄して、発色反応を停止させた。
さらにそのスライドグラスは蒸留水で5分間洗浄し、１％のmethylene greenで5分間染色を行った後、蒸留水で洗浄し、アルコール脱水・キシレン透徹を行い、非水溶性封入剤（株式会社ニチレイ Cat. No.415141）を用いてカバーグラスを載せて封入した。その後、光学顕微鏡による観察を行った。
＜結果＞
図７のＡに示す対照群に比較して、図７のＢに示す48時間絶食を行った場合の室傍核（PVN）におけるNESFATINのｍRNA発現は顕著に減少しており、図７のＣに示すように絶食後の再摂食によってNESFATINｍRNA遺伝子の発現は回復することが示された。これらの結果は内因性のNESFATINは摂食調節に関与していることが判明した。
実施例９ 飢餓状態におけるラット脳内でのNESFATIN 発現の検討
絶食状態における内因性のNESFATINの変動について免疫組織染色法による検討を行った。
約８週齢のオスのWistar系ラット（日本SLCより購入）（体重220〜250g）の自由に粉末飼料を摂食できる対照群と24時間の絶食を行った絶食群を用い、これらのラットの脳の組織切片を作製して抗NESFATIN抗体を用いた免疫組織化学による解析を実施した。組織切片の作製および免疫組織染色の方法については、実施例４に記載の方法と同様に行った。また摂食に関連する脳の領域における神経細胞の活性化の状態を調べるため、c-Fosに対する抗体を用いて絶食群の脳組織における免疫組織化学的解析を実施した。方法は抗NESFATIN抗体の代わりに500倍に希釈したc-Fos（K-25）抗体（Santa Cruz Biotechnology社 sc-253）を用いて、上記と同様に行った。
＜結果＞
対照群の視床下部における抗NESFATIN抗体（NAP Ab）による免疫組織化学染色の顕微鏡像（２００倍）を図８のＡに、絶食群の視床下部における抗NESFATIN抗体による免疫組織化学染色の顕微鏡像（Ａと同倍率）を図８のＢに、絶食群の視床下部における抗c-Fos抗体による免疫組織化学染色の像（Ａと同倍率）を図８のＣに示す。また図の上段は室傍核の像を、下段は弓状核の像を示す。対照群に比較して絶食群の視床下部においては、室傍核（図８のＢ上段）および弓状核（図８のＢ下段）での染色性は著明に減少しており、絶食によってNESFATINの発現が低下していることが示された。また食欲が亢進している状態ではc-Fosタンパク質の発現が認められた。このことから絶食によって食欲が亢進している状態においては、食欲抑制効果を示すと考えられるNESFATINの発現は低下して、食欲の調節をおこなっていることが考えられる。
実施例１０ NESFATIN-1、NESFATIN-2、NESFATIN-3およびNESFATIN-2/3ペプチドの作製とNESFATIN-1ペプチドに対する抗体、NESFATIN-3およびNESFATIN-2/3に対する抗体の作製
実施例３〜９において、NESFATINが脳の視床下部における発現と摂食および体重調節に対する作用が示された。またこのNESFATINはその前駆体においてはシグナルペプチドを持つことから、細胞外に分泌される可能性が示されている。ある種の活性タンパク質はposttranslational-processにおいてプロホルモン・コンバターゼ（ＰＣ）によって切断されることが知られている。そのため、プロホルモン・コンバターゼの切断部位の配列であるArg−ArgまたはLys−Argの配列が、マウス、ラットおよびヒトのNEFA配列に存在するかを解析した。その結果、マウス、ラットおよびヒトの配列に共通して、N末端から107番目および108番目のアミノ酸配列の位置ならびに199番目および200番目の位置にLys−Argの配列が存在し、188番目および189番目のアミノ酸配列の位置にArg−Argの配列が存在することが判明した（図９Ａ）。そのため、NESFATINの配列のうち、アミノ酸番号25から106に相当する82残基のペプチドをNESFATIN-1（配列番号１５）、およびアミノ酸番号109から187までの79残基のペプチドをNESFATIN-2（配列番号１６）、アミノ酸番号190から420までの231残基よりなるペプチドをNESFATIN-3（配列番号１７）と名づけた。この場合、既知のドメイン構造であるDNA結合領域（アミノ酸番号171〜223）はNESFATIN-2とNESFATIN-3に分断された形に、ネクチン結合領域（アミノ酸番号213〜420）、カルシウム結合領域（アミノ酸番号254〜265および306〜317）およびAsp／Glu-rich領域（アミノ酸番号306〜317）はNESFATIN-3の配列内に含まれる形となるが、NESFATIN-1の配列中においては既知のドメイン構造が含まれていない（図９Ｂ）。そのため、NESFATIN-2とNESFATIN-3の配列よりなるペプチドの部分をNESFATIN-2/3（配列番号４７）と命名した。ラットのNESFATIN-1ペプチド（配列番号１５）、およびNESFATIN-2ペプチド（配列番号１６）の合成は（株）矢内原研究所に依頼し、固相合成によって合成して逆相液体クロマトグラフによって精製した。NESFATIN-3ペプチド（配列番号１７）は、ラット脳から調製したｃDNAを用い、配列番号４８および配列番号４９のプライマーを用いて増幅したDNA（配列番号５０）を取得し、そのDNAを用いてPost Genome Institute Co. LTD (Shimizu Y et al: Nature Biotech 19: 751-755, 2001)により無細胞タンパク質合成法によって作製した。
使用したPCRプライマー：
Forward Primer: 5’-ATGGAATATTTAAAAACGCTGAGTGAG-3’（配列番号４８）
Reverse Primer: 5’-TTATGTGTGTGGCTCAAACTTCA-3’（配列番号４９）
この方法によって作製されたNESFATIN-3はN末端にMetが結合した形の配列となる（配列番号５１）。
同様にNESFATIN-2/3（配列番号４７）は、配列番号５２と配列番号５３のプライマーを用いてラット脳由来のｃDNAから増幅したDNA（配列番号５４）を取得し、無細胞タンパク質合成法によって作製した。
使用したPCRプライマー：
FW 5’-ATGCAAGAAGTAGGAAGACTGAGAA-3’（配列番号５２）
REV 5’-TTATGTGTGTGGCTCAAACTTCA-3’（配列番号５３）
この方法によって作製されたNESFATIN-2/3はN末端にMetが結合した形の配列になる（配列番号５５）。
また、実施例３で作製した抗NAPペプチド抗体とは別の領域についての抗体を作製するために、NAP1ペプチドのアミノ酸番号24から38に相当（配列番号５のマウス前駆体NEFAポリペプチドのアミノ酸番号48から62に相当）する配列のC末端にCysを付加した配列（NAP-1Aｂ：配列番号３２）、NAP-3のアミノ酸番号1から9に相当する配列（配列番号５のマウス前駆体NEFAポリペプチドのアミノ酸番号190から198に相当）、およびNAP-3ペプチドのアミノ酸番号136から149に相当する配列（配列番号５のマウス前駆体NEFAポリペプチドの配列中のアミノ酸番号325から338）に相当する配列のC末端にCysを付加した配列（各NAP-C1 Ab配列番号３３およびNAP-C2 Aｂ：配列番号３４）を作製した。
NAP-1Aｂ：N-ProAspThrGlyLeuTyrTyrAspGluTyrLeuLysGlnValIleCys-C（配列番号３２） NAP-C1 Aｂ：N-GluTyrLeuLysThrLeuSerGluGluCys-C（配列番号３３）
NAP-C2 Aｂ：N-LysGluPheLeuGluProAspSerTrpGluThrLeuAspGlnCys-C（配列番号３４）
NAP-1 Aｂ、NAP-C1 Aｂ、NAP-C2 Aｂの各ペプチドの作製は株式会社ＡＴＰに依頼し、固相合成によって合成して逆相液体クロマトグラフによって精製した。得られたNAP-1 Ab、NAP-C1 Aｂ、NAP-C2 Aｂの各ペプチドは実施例３に記載の方法と同様にKLHとコンジュゲートを作製し、ウサギに免疫することによって各ペプチドに対する抗体を含む血清を作製した。各血清からはDEAEカラムを用いて定法によってウサギIgGを精製し、それぞれNAP-1 IgG（Nesfatin-1 IgG）、NAP-C1 IgG（Nesfatin-C1 IgG）、NAP-C2 IgG（Nesfatin-C2 IgG）とした。
上記で作製したNESFATIN-1ペプチドおよびNESFATIN-3ペプチドをそれぞれSDS-ポリアクリルアミドゲル（１２％）電気泳動法で泳動させ、その後各ペプチドを実施例３と同様の方法で、それぞれNesfatin-1 IgGおよびNesfatinC2 IgG抗体を用いてウエスタンブロティングを行った。
＜結果＞
固相合成法で合成して逆相クロマトグラフィーで精製したNESFATIN-1ペプチド、NESFATIN-2ペプチド、NESFATIN-3ペプチドおよびNESFATIN-2/3ペプチドは、分析用C18逆相クロマトグラフィーによってほぼ単一のピークを示す純度に精製され、そのピークを分取してMASスペクトル解析法（NESFATIN-1およびNESFATIN-2）またはSDS-ポリアクリルアミドゲル（12％ゲル）電気泳動法（NESFATIN-3およびNESFATIN-2/3）によって解析したところ、ほぼ予想されたNESFATIN-1、NESFATIN-2、NESFATIN-3およびNESFATIN-2/3の各ペプチドの分子量と思われるペプチドが、合成されていることが示された。またNAP-1 Aｂ、NAP-C1 Aｂ、NAP-C2 Aｂの各ペプチドとKLHのコンジュゲートを免疫したウサギにおいては、それぞれ3種すべてのペプチドに対しての抗体価の上昇が認められ、各ペプチドに対する抗体（IgG）が得られた。
また、NESFATIN-1ペプチドを泳動してNesfatin-1 IgGでウエスタンブロティングをおこなった結果では9.7ｋｄの所にバンドが認められ、NESFATIN-3ペプチドを泳動してNesfatin-C2 IgGでウエスタンブロティングを行った結果では27.9ｋｄの所にバンドが認められた（図９Ｃ）。このことから、Nesfatin-1 IgGおよびNesfatin-C2 IgGの各抗体は、それぞれNESFATIN-1ペプチドおよびNESFATIN-3（NESFATIN-2/3）に対して結合することが示された。
実施例１１ NAP-1IgGと抗PC抗体による免疫組織化学解析
NESFATINよりNESFATIN-1がプロセシングされることを実証するために、まず、実施例１０で作製したNAP-1 IgG（Nesfatin-1 IgG）と抗プロホルモン・コンバターゼ抗体（抗PC）に対する抗体によるラット視床下部での二重免疫組織染色を行うことによって、NESFATINおよびPCの局在を解析した。
脳組織切片の作製は以下の方法で行った。８週齢のWistar系ラット（日本チャールズ・リバーより購入）の腹腔に40mg／kgのペントバルビタール・ナトリウムを注射して麻酔し、開胸して心臓より50mlの生理食塩水（0.85％ NaCl）を注入し、続いて４％パラホルムアルデヒドを含むPBS（20ｍM リン酸緩衝液、150ｍM NaCl ｐH7.2）を400mlペリスタポンプで注入・循環させることによって、脳を灌流固定した。その後脳を摘出し、視床下部を含む部分を切り出して４％パラホルムアルデヒドを含むPBSで４℃一晩固定化した。固定した脳試料は１０％シュクロースを含むPBSに4時間、１５％シュクロースを含むPBSに4時間、２０％シュクロースを含むPBSで一晩4℃浸漬した。その後脳試料はOCTコンパウンドに浸漬し、ドライアイスーアセトンで凍結して包埋したブロックを作製した。作製したブロックからクライオスタットを用い、−20℃で６μm厚の切片を作製してシランコーティングスライド（マツナミ製MASコートスライド）に乗せて風乾した。スライドに乗せた組織切片は３％過酸化水素水で5分間処理し、PBSで5分間2回洗浄した。
脳組織切片を乗せたスライドグラスは、１０％のヤギ正常血清（株式会社ニチレイ Cat. No.426042）で室温10分間処理することでブロッキングし、１／５００に0.5％のBSAを含むPBSで希釈したNAP-1 IgG（Nesfatin-1 IgG：実施例１０）を室温で1時間反応させた。抗体を反応させたスライドグラスは、PBSによって5分間3回洗浄し、ヒストファイン・シンプルステインラットMAX−PO（株式会社ニチレイ Cat. No.414181）反応させてPBSによる洗浄を行った後、4-Chloro-1-Naphtol（ICN社 Cat. No. 980611：4-Chloro-1-Naphtol Stabilized Chromogen）によって発色を行った。発色を行った後のスライドグラスをPBSで5分間3回洗浄した後、スライドグラスを0.1Mグリシン緩衝液（ｐH2.2）に1.5時間（30分ごとに該緩衝液を交換）に漬け、その後PBSで5分間3回洗浄を行った。さらにスライドグラスは１０％のヤギ正常血清（株式会社ニチレイ Cat. No.426042）で、室温10分間処理してブロッキングを行った。この時点まで処理したスライドグラスを2つの群に分けて、片方はプロホルモン・コンバターゼのサブタイプであるPC1およびPC3を認識する抗体（PC-1/3：Chemicon社 Cat. No.AB1260）を、もう一方についてはプロホルモン・コンバターゼのサブタイプであるPC2を認識する抗体（PC-2：Chemicon社 Cat. No.AB1262）を、0.5％のBSAを含むPBSに希釈した抗体液として、1時間室温で反応させた。スライドグラスはその後PBSで5分間3回洗浄し、各スライドグラスを0.5％のBSAを含むPBSで1/200に希釈したヤギ抗ウサギIgG−Alexa594コンジュゲート（Molecular Probes社 Cat. No. A11008）を室温で30分間反応させた。その後スライドグラスをPBSで5分間3回洗浄し、軽く風乾させた後グリセロールとカバーグラスで封入し、カバーグラスの周囲を透明マニキュアで封じて標本を作製した。標本は共焦点レーザー顕微鏡（Ｂｉｏ―Ｒａｄ社ＭＲＣ―１０２４ ｃｏｎｆｏｃａｌ ｌａｓｅｒ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ＋ニコン社 Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｅ８００ ｕｐｒｉｇｈｔ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）によって、４−Ｃｈｌｏｒｏ−１−Ｎａｐｈｔｏｌの染色を位相差像として、Ａｌｅｘａ５９４の蛍光をＫｒｙｐｔｏｎ―Ａｒｇｏｎレーザー（波長：５６８ｎｍ）での励起光を用いて６０５±３０ ｎｍのバンドパスフィルターを用いた蛍光像として観察した。
＜結果＞
ラットの視床下部組織における免疫組織化学像において、Nesfatin-1 IgGによる染色像を図１０のＡの丸１および丸２に、PC-1/3による蛍光像を図１０のＢの丸１に、PC-2による蛍光像を図１０のＢの丸２に示す。図１０のＡの丸１と図１０のＢの丸２、図１０のＡの丸２と図１０のＢの丸２は、同じ視野における発色像と蛍光像を現している。図１０のＡの丸１および丸２に示されているように、Nesfatin-1 IgGにより染色される細胞がラット視床下部細胞に認められた。これらの多くの細胞では抗PC-1/3抗体および抗PC-2抗体による染色像はNesfatin-1 IgG陽性細胞と一致していた。このことからNESFATINが発現している細胞において、プロホルモン・コンバターゼであるPC1/3およびPC2が共発現していることが示され、このことからNESFATINがプロホルモン・コンバターゼによってプロセシングを受ける可能性が示唆された。
実施例１２ NESFATIN-1、NESFATIN-2、NESFATIN-3およびNESFATIN-2/3の脳内投与による摂食量調節に対する作用の検討
NESFATINのどの部位に摂食抑制活性部位があるのかを検証した。
脳室内投与に用いた投与試料は、生理食塩水のみ（Vehicle群）、または実施例１０で作製したNESFATIN-1、NESFATIN-2、NESFATIN-3もしくはNESFATIN-2/3をそれぞれ生理食塩水で溶解し、１個体あたり25pmolを第３脳室内に暗期直前に投与した。ラットは、Wistar系ラット（日本SLCより購入）を用い、実施例６と同様に飼育し、オスの８〜９週齢Wistar系ラットのうち、体重200〜250gの間の個体を選別して用いた（N=５）。ラットでの脳室内投与実験の手技および摂食量の測定に関しては実施例６に記載の方法と同様に行った。なお摂食量の測定は、投与直後からの１時間（０〜１hr）および投与１時間後からの２時間（１〜３hr）の間の飼料の減少量を摂食量として計測した。
また、上記と同様の条件において、試料としてNESFATIN-1のみをラット１個体あたり１、５または25pmolを第３脳室内に暗期直前に投与した実験についても行った。この実験においては投与直後から１時間（０〜１hr）の摂食量を測定した。
＜結果＞
図１１のＡに示すように対照群（Cont）に比較し、NESFATIN-2、NESFATIN-3およびNESFATIN-2/3を脳室内に投与しても、摂食量の有意な変動は認められなかった（０〜１hr：図１１のＡのａ−１、１〜３hr：図１１のＡのａ−２）。一方２５pmolのNESFATIN-1の脳室内投与によって著明な摂食抑制効果が認められた。また図１１のＢに示すようにNESFATIN-1をラット１個体あたり１、５または25pmolを脳室内に投与した場合、生理食塩水のみを投与した場合（0）に対して、NESFATIN-1の投与量の増加に伴い、摂食量が低下する現象が認められ、特に５ｐmolまたは25ｐmol投与した場合においては有意な摂食の減少が認められた。これらの成績より、NESFATINの摂食抑制活性はNESFATIN-1に局在することが判明した。
実施例１３ NESFATIN-1の脳室内連続投与における摂食量と体重の変化
さらにNESFATIN-1を連続的に脳室内に投与したときの摂食および体重の変化への影響について検討した。
NESFATIN-1の投与は、浸透圧ポンプにより１０日間連続して脳室内に投与を行った。動物は約８週齢Wistar系オスのラット（日本SLCより購入）のうち、体重が200〜250gの範囲のものを選定して用いた。ラットに体重１ｋｇ当たり４０mgのペントバルビタール・ナトリウムを腹腔内に投与して麻酔を行い、頭部を除毛してから脳定位固定装置（David Kopf社 Model962）に固定して、頭皮を切開し、２３G針（ガイドカニューレ）の先端が第３脳室に達するよう（Bregma後方２．５ｍｍ、表面９．５ｍｍ）留置固定し、そのガイドカニューレの固定の１週間後に各実験に供した。浸透圧ポンプはAlzet社Model2002を用い、0.22μmのMillex GVフィルタ−（Millipore社）で滅菌した生理食塩水に溶解したNESFATIN-1（NESFATIN-1投与群）、または滅菌生理食塩水のみ（対照群）を、使用直前に浸透圧ポンプ内に注入し、使用する前日から滅菌生理食塩水につけてプライミングを行なった。各試料を注入した浸透圧ポンプは注入用カニューレに接続されているチューブに接続し、あらかじめ埋め込んだガイドカニューレを通して、注入用カニューレの先端がラットの第３脳室に入るように固定した。この状態での使用では、24時間あたり12μlの速度で第三脳室に試料が注入されたこととなり、NESFATIN-1投与群においては１日あたり５pmolのNESFATIN-1が脳室内に投与されたことになる。浸透圧ポンプを埋め込んだラットは麻酔がさめたことを確認して、個別ケージに入れて粉末試料および飲料水を自由に摂取できるような条件で飼育を行った。摂食量の測定は、カニューレおよび浸透圧ポンプを埋め込んだ翌日より、毎日午前9時に残存している飼料の重量を測定し、前日の飼料重量との差を求めることによって一日（24時間）の摂餌量を算定した。また、投与開始６日後より摂餌量の測定の際に体重を測定し、その体重の変化についても記録した。
＜結果＞
図１２のＡに示すように、NESFATIN-1投与群においては投与開始後１日目より摂食量の減少が見られ、測定期間中対照群と比較して摂食量の低下が維持された。また図１２Ｂのに示すように、体重増加の速度はNESFATIN-1投与群においては対照群と比較して有意に減少することが示された。
実施例１４ 抗NESFATIN-1抗体または抗NESFATIN-3抗体の脳内投与および変異型ＮＥＳＦＡＴＩＮの脳内投与による摂食調節の検討
実施例１２および１３において、NESFATIN-1ペプチドの脳内投与による摂食量低下効果が見出された。さらにこの事実を確認するため、NESFATIN-1を認識するNAP-1 IgG（Nesfatin-1 IgG）、またはNESFATIN-３を認識するNAP-C1 IgG（Nesfatin-C1 IgG）またはNAP-C2 IgG（Nesfatin-C2 IgG）をラットの脳室内に投与し、摂食量への影響を検討した。また、NESFATINがプロホルモン・コンバターゼによって切断されることによってNESFATIN-1が生じることと摂食調節との関係を調べるため、配列番号２６の配列の内、アミノ酸番号８４番と８５番に相当するLys・Argの配列をAla・Alaに置き換えた配列の変異体（KR−AAミュータント：Mut）を作製してラットの脳内投与による効果を検討した。
脳室内投与に用いた投与試料は、生理食塩水に免疫していないウサギより精製されたIgG（Control群）、または実施例１１で作製したNAP-1 IgG（Nesfatin-1 IgG）、NAP-C1 IgG（Nesfatin-C1 IgG）もしくはNAP-C2 IｇG（Nesfatin-C2 IgG）をそれぞれ 生理食塩水に溶解し、１個体あたり5μl（５μｇ）を第３脳室内に投与した。ラットは、Wistar系ラット（日本SLCより購入）を用い、実施例６と同様に飼育し、オスの８〜９週齢Wistar系ラットのうち、体重200〜250gの間の個体を選別して用いた。ラットでの脳室内投与実験の手技および摂食量の測定に関しては実施例７に記載の方法と同様に行った。なお、摂食量の測定は、投与直後からの３時間（０〜３hr）および投与３時間後からの３時間（３〜６hr）の間の飼料の減少量を摂食量として計測した。
KR−AAミュータントの作製は、実施例５で取得した成熟型マウスNESFATIN遺伝子を改変して、発現することによって実施した。実施例５で取得した成熟型マウスNESFATIN遺伝子がｐGEM-11Zf(+)にクローニングされたプラスミドを用い、PCR法によって2種類の断片を作製した。1つ目のDNA断片は該プラスミド5ngを用い、mNucB2-F360[Sac2Thr]プライマーとmNucB2[KR-AA]R583プライマーのセットでPCRを行い作製した。
mNucB2-F360[Sac2Thr]：5’-GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTGTTCCTATCGATGTGGACAAGACCAA-3’（配列番号５６）
mNucB2[KR-AA]R583：5’-CTTCTTGAGCAGCCAGCTCATCCAGTCTCGTCCTCA-3’（配列番号５７）
反応条件は、変性90℃での変性反応1分に続いて、変性98℃で10秒、アニーリング60℃で30秒、伸長68℃で1分の反応サイクルを20サイクル行い、増幅DNAを作製した（Stratagene社PfuTurbo(R)ポリメラーゼ、Cat. No.600250を使用）。
また1番目のDNA断片の同様に該プラスミド5ng DNA断片を用い、mNucB2[KR-AA]F612プライマーとmNucB2-R1527[NotI]プライマーのセットでPCRを行い作製した。
mNucB2[KR-AA]F612：5’-GAGCTGGCTGCTCAAGAAGTAGGAAGACTGCGGATGCT-3’（配列番号５８）
mNucB2-R1527[NotI]：5’-GGTTGCGGCCGCACTTTATGTGTGTGGCTCAAACTTCAG-3’（配列番号５９）
PCR条件は1番目のDNA断片の増幅と同様である。
２種類のDNA断片を作製するため、上記の2種類のＰＣＲ反応後のサンプルを、50μlあたり各５μｌとなるように反応液に加え、各0.25μMのHis-Thr-For[SpeI]プライマーと前述のmNucB2-R1527[NotI]プライマーで、1倍濃度のPfu buffer、2.5unitsのPfuTurbo DNA polymerase（以上Stratagene社）および0.2ｍMのｄNTPｓ（Promega社：C1141）の反応液で、変性90℃での変性反応1分に続いて、変性98℃で10秒、アニーリング60℃で30秒、伸長68℃で1分の反応サイクルを20サイクル行い、増幅DNAを作製した。
His-Thr-For[SpeI]：5’-GGTTACTAGTGGTTCTGGTCATCACCATCACCATCACTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGT-3’（配列番号６０）
得られたPCR産物は１％アガロースゲル電気泳動によって増幅バンドを回収し、QIAEX−IIキット（QIAGEN社）を用いて精製した。回収した増幅DNAは制限酵素SpeIおよびNotIで消化し、同じくSpeIとNotIで消化したpET41a(+)ベクター（Novagen社）にライゲーション（Quick DNA Ligation Kit（New England BioLab社）を行なってクローニングした。そのクローニングされたDNAは実施例５と同様にDNA塩基配列を解析して導入した変異部分およびその他の塩基配列に間違えが無いクローンを取得し、KR-AAミュータント発現用のベクターを得ることが出来た。発現・精製についても実施例５と同様の方法で実施した。得られたKR-AAミュータントのアミノ酸配列を配列番号６１に示す。また、Wt（正常なNESFATIN）は実施例５で作製したものを用いた。得られたKR-AAミュータント（Mut）および正常NESFATIN（Wt）の各ポリペプチド各５ｐｍｏｌを、実施例６と同様の方法でラットの第３脳室内に投与した。投与１時間後、３時間後、６時間後および１２時間後の飼料の重量変化を測定することにより摂取量を算定し、摂取行動の指標とした。
＜結果＞
第3脳室内にControl IgG、NAP-1 IgG（Nesfatin-1 IgG）、NAP-C1 IｇG（Nesfatin-C1 IgG）またはNAP-C2 IgG（Nesfatin-C2 IgG）を投与した各群における、投与後０〜３時間の間での摂食量を図１３Ａのａ−１に、３〜６時間の間での摂食量を図１３Ａのａ−２に、６〜９時間の間での摂食量を図１３Ａのａ−３にグラフとして示した。０〜３時間（図１３Ａのａ−１）、３〜６時間（図１３Ａのａ−２）においてはControl IgG投与ラットと比較して、NAP-1IgG（Nesfatin-1 IgG）を投与した個体では、有意に摂食量の増加が認められた（０〜３時間ではP<0.001、３〜６時間ではP＜0.05）が、NAP-C1 IgG（Nesfatin-C1 IgG）またはNAP-C2 IgG（Nesfatin-C2 IgG）を投与した群においてはVehicle群に対して有意な摂食量の差は見られなかった。また６〜９時間での結果においては、Control IgG群、NAP-1 IgG（Nesfatin-1 IgG）群、NAP-C1 IｇG（Nesfatin-C1 IgG）群およびNAP-C2 IgG（Nesfatin-C2 IgG）群の各群において、有意な摂食量の差は認められなかった。この結果より、NESFATIN-1に対する抗体によって、内在性のNESFATIN-1の機能が阻害されることによって摂食量が増大することが示された。これにより、実施例１３の検証によりNESFATIN-1ペプチドが脳室内投与による摂食抑制作用を示すのに加えて、NESFATIN-1の機能を阻害する物質が摂食量の増大効果を有することが示された。
またリコンビナントマウスNESFATIN（Wt）およびアミノ酸番号８４番と８５番に相当するLys・Argの配列をAla・Alaに置き換えた配列の変異体（Mut）５ｐｍｏｌをラット脳室内に投与した際の摂食量への影響を調べた結果を図１３Ｂに示す。図１３Ｂのうちｂ-１は投与後０〜１時間の摂食量、ｂ−２は１〜３時間の摂食量、ｂ−３は３〜６時間の摂食量を示している。ｂ−１からｂ−３に示しているように、Wt（正常なNESFATIN）５ｐｍｏｌを投与したラットにおいては各時間において有意な摂食抑制活性が認められるのに対して、プロホルモン・コンバターゼによって切断される部位に変異を入れたNESFATIN（Mut）では摂食の抑制効果は認められなかった。このことから、NESFATINが機能するためには、NESFATIN-1がプロホルモン・コンバターゼなどによってプロセスされる過程が重要であることが示された。
実施例１５ NEFA遺伝子に対するアンチセンスRNAの連続的脳室内投与による摂食および体重への影響の検討
NESFATIN（NEFA）遺伝子の発現と摂食および体重調節との関係を、さらに詳細に調べるため、NESFATIN遺伝子の発現を抑制するアンチセンスRNAを連続的に第3脳室に投与し、その影響について検討を行った。
NESFATIN遺伝子に対するアンチセンスRNAは翻訳開始部位（translational start site）を挟み込む配列である以下の配列のモルホリノRNAを用いた。
NESFATINアンチセンスRNA
５−ATGGTCCTCCACCTCATCTTCAGAG−３（配列番号３１）
NESFATINアンチセンスＲＮＡの投与は、浸透圧ポンプにより１２日間連続して脳室内に投与を行った。動物は約８週齢Wistar系オスのラット（日本SLCより購入）のうち、体重が200〜250gの範囲のものを選定して用いた。ラットに体重１ｋｇ当たり４０mgのペントバルビタール・ナトリウムを腹腔内に投与して麻酔を行い、頭部を除毛してから脳定位固定装置（David Kopf社 Model962）に固定して、頭皮を切開し、２３G針（ガイドカニューレ）を第３脳室に達するよう（Bregma後方2.5ｍｍ、表面９．５ｍｍ）留置固定し、そのガイドカニューレの固定の１週間後に各実験に供した。浸透圧ポンプはAlzet社Model2002を用い、使用する前日から滅菌生理食塩水につけてプライミングを行い、0.22μmのMillex GVフィルタ−で滅菌したNESFATINアンチセンスＲＮＡを生理食塩水に溶解した溶液（Antisense投与群）、または同様に滅菌したミスセンスＲＮＡ(ATCGTGCTCCACGTCATCTACACAG)を滅菌生理食塩水に溶解した溶液（対照群）を、使用直前に浸透圧ポンプ内に注入した。各試料を注入した浸透圧ポンプは、注入用カニューレに接続されているチューブに接続し、あらかじめ埋め込んだガイドカニューレを通して、注入用カニューレの先端がラットの第３脳室内に入るように固定した。この状態での使用では、２４時間あたり１２μlの速度で第三脳室に試料が注入され、アンチセンスＲＮＡおよびミスセンスＲＮＡはそれぞれ、１日あたり４０μｇ注入した。浸透圧ポンプを埋め込んだラットは麻酔がさめたことを確認して、個別ケージに入れて粉末試料および飲料水を自由に摂取できるような条件で飼育を行った。摂食量の測定は、カニューレおよび浸透圧ポンプを埋め込んだ翌日より、毎日午前9時に残存している飼料の重量を測定し、前日の飼料重量との差を求めることによって１日（24時間）の摂餌量を算定した。また、投与開始６日後より摂餌量の測定の際に体重を測定し、その体重の変化についても記録した。
投与開始後１２日目に各群の個体を屠殺し、脳の視床下部を取り出して抽出された試料を用いて、Nesfatin-1 Abによるウエスタンブロッティング法によってNESFATINの発現を確認した。ウエスタンブロッティングは、実施例３および１２と同様の方法で行った。ウエスタンブロッティングによる発色で染色されたバンドは、デンシトメトリーによってバンドの濃度を測定した。
＜結果＞
対照群およびNESFATINアンチセンスRNAを投与したAntisense投与群の24時間あたりでの摂食量の変化を図１４のＡに、体重の変化を図１４のＢに示している。摂食量（図１４のＡ）は、対照群に比較して、Antisense投与群においては開始後１日目より摂食量の増大が認められ、その摂食量は測定期間中（投与開始12日まで）は常に対照群を上回っていた。また、体重の変化（図１４のＢ）においては投与開始後6日における体重は対照群およびAntisense投与群において差が見られなかったが、投与7日目以降において、Antisense投与群において対照群に比して有意な体重増加（P＜0.05）が見られ、その差は９日から１１日までの測定期間においてより拡大していった。１２日に屠殺したラットの視床下部を用いたNESFATIN-1のウエスタンブロティングの解析においては、対照群（デンシトメトリーによるバンド強度が14.3±1.2AU）に比較して、Antisense投与群（デンシトメトリーによるバンド強度が8.5±0.7AU）では有意にNESFATIN-1の発現が減少していた。この結果より、脳室内へのNESFATINアンチセンスRNA投与は、NESFATIN-1の発現を抑制し、摂食量および体重増加の亢進の効果を奏することが認められた。
実施例１６ 組換え体によるリコンビナントNESFATIN-1の製造
NESFATIN-1をより大量に調整するため、組換え体を用いてリコンビナントNESFATIN-1を製造する方法について検討を行った。
マウスNESFATIN-1をコードする遺伝子を取得し、そのN末端にGST（グルタチオン−S−トランスフェラーゼ）とヒスチジンタグの遺伝子を結合し、翻訳後のタンパク質においてヒスチジンタグのアミノ酸配列とマウスNESFATIN-1のアミノ酸配列の間にトロンビンによる切断部位（-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-）が介在する形となるように、発現ベクターを構築した。マウスNESFATIN-1の遺伝子の取得は、mouse Brain cDNA（Clontech社）を用いて2回のPCR（Nested PCR）を行うことで行った。１回目のPCRは以下のForward（ｍNucB2-F337：配列番号３５）およびReverse（ｍNucB2-R712：配列番号３６）を各１００ｐMの濃度で、Pyrobest DNA polymerase（タカラバイオ（株）R005A）、添付の反応バッファーおよびｄNTPを使用し、添付のプロトコールに従って反応を行った。PCR反応は９０℃1分の反応の後、９８℃10秒・６８℃1分の温度サイクルを30サイクル、その後６８℃で2分間反応させる温度条件で行った。
Forward Primer (mNucB2-F337)：5’-GCACGCTGAC CGCTC TGGAAG-3’（配列番号３５）
Reverse Primer (mNucB2-R712)：5’-CAAATGTGTT AGGAT TCTGGTGGTTCA-3’（配列番号３６）
得られたPCR産物0.5μｌを用いて、２回目のPCRを以下のForward（ｍNucB2-N3[SacI-Thr]）およびReverse（mNucB2-R389[NotI]）プライマーが１００ｐMを用いて、１回目のＰＣＲと同様に、Pyrobest DNA polymeraseを用いてPCR反応を行った。PCR反応は９０℃1分の反応に続いて、９８℃10秒・６０℃30秒・６８℃１分の温度サイクルを２０サイクル行った後、６８℃で2分間反応させる温度条件で行った。
Forward Primer (mNucB2-N3[SacII-Thr])：5’-GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTCCTATCGATGTGGACAAGACCAA -3’（配列番号３７）
Reverse Primer (mNucB2-R589[NotI])：5’-GGTTGCGGCCGCTTACCTCT TCAGCTCATCCAGTCTCG-3’（配列番号３８）
2回目のPCRを行ったPCR反応サンプルは、フェノール／クロロホルム抽出によって精製した後、制限酵素SacIIおよびNotIで切断し、アガロースゲル電気泳動を行って、約300ｂｐの長さに相当するバンドを切り出し、QIAEX-IIキット（QIAGEN社）によって精製した。精製された約300ｂｐのPCR産物は、制限酵素SacIIおよびNotIで切断されたｐET41a（＋）プラスミドベクター（Novagen社）に、Quick DNA ligase kit（New England Bio Lab社）を用いてライゲーションを行った。ライゲーションを行ったベクターを大腸菌J409株に導入し、得られた形質転換体8個について小スケールでのプラスミド抽出を行い、得られたプラスミドを用いて組み込まれたNESFATIN-1遺伝子の配列をアプライドバイオシステムズ社のBigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kitおよびABI377型DNAシーケンサー（Perkin-Elmer社）を用いて塩基配列の解析を行った。その結果正しいNESFATIN-1の配列を持つ遺伝子が組み込まれている発現ベクターが得られ、これをpET41a(+)GST-His-LVPRGS-mNAP1と命名した。
得られたpET41a(+)GST-His-LVPRGS-mNAP1を大腸菌BL21（DE3）Codon Plus RIPLに導入して発現させることで、GST・ヒスチジンタグ・トロンビン切断配列・NESFATIN-1の融合タンパク質（GST-His-LVPRGS-mNAP1）の発現を行った。pET41a(+)GST-His-LVPRGS-mNAP1を大腸菌BL21（DE3）Codon Plus RIPLに導入してカナマイシンを含むLB培地で選択して得たクローンを、１０ｍｌのカナマイシンを含むLB倍地で３７℃において培養した。培養は、その培養液の600ｎｍの波長による吸光度が0.8になった時点で停止した。その培養液３ｍｌを１００mlのカナマイシンを含むLB培地に植え継ぎ、さらに３７℃で培養してその培養液の600ｎｍの波長による吸光度が0.8になった時点で１００ｍMのIPTGを１ml加えてタンパク質の発現を誘導した。IPTG添加後、さらに３７℃で３時間振盪培養を行った。その培養液を8000rpmで20分間（4℃）で遠心分離して、大腸菌の菌体を回収した。
得られた大腸菌の菌体からGST-His-LVPRGS-mNAP1融合タンパク質を抽出して、ニッケルキレートカラム（Ni-NTA agarose）を用いて精製を行った。菌体を２０ｍｌの１倍濃度のComplete−EDTA free（ロッシュ・ダイアグノスティックス社）および０．５倍濃度のBugBuster（メルク社Novagen Cat.No.70584）を含むSonication Buffer（50mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2mM DTT, pH7.5）に懸濁し、氷水中で１０分間超音波による破砕を行った。超音波処理後のサンプルは１５，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、その上清を回収した。得られた上清１０mlを、Lysis Buffer（50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM イミダゾール, pH8.0）で平衡化した１ｍｌのNi-NTA agaroseカラムにアプライし、さらに１０ｍｌのWash Buffer（50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM イミダゾール, pH8.0）で２回洗浄を行った。洗浄後のカラムを２．５mlのElution Buffer（50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM イミダゾール, pH8.0）で２回溶出を行い、溶出されたGST-His-LVPRGS-mNAP1融合タンパク質を含む画分を回収した。残りの菌体からの抽出上清も同様に処理して、GST-His-LVPRGS-mNAP1融合タンパク質を含む画分を回収した。
GST-His-LVPRGS-mNAP1融合タンパク質からGSTおよびヒスチジンタグの部分を除去してさらに精製すると共に、炎症性物質として作用する大腸菌由来のリポポリサッカライド（LPS）を除去するため、GST-His-LVPRGS-mNAP1融合タンパク質がGSTレジンに結合した状態でのトロンビン処理および逆相クロマトグラフィーによる精製を行った。なお、これ以降の処理におけるBufferは、LPSを含まないことを確認したものを使用した。Ni-NTA agaroseカラムでの精製で得られたGST-His-LVPRGS-mNAP1融合タンパク質を含む画分７．２ｍｌを１倍濃度のGST Bind/Wash Buffer（メルク社Novagen Cat.No.70571）で洗浄して、最終的に３ｍｌGST Bind/Wash Bufferで懸濁したGSTレジン（メルク社Novagen Cat.No.70541）（７．２ｍｌ相当）に添加して、２０℃で１時間弱く攪拌した。遠心分離によってレジンを回収した後、該レジンを３６ｍｌのGST Bind/Wash Bufferで２回洗浄した。洗浄後のレジンに20units／ｍｌのトロンビンをPBSに溶解したもの3.6mlを加えて懸濁し、２０℃で弱い攪拌状態において20時間反応を行った。反応後のレジンはポアサイズ0.22μmのフィルター付カップ（Millipore）に1.8mlずつ分注して、3,000rpmで2分間遠心して、ろ過されたトロンビン処理後サンプルを回収した。得られたトロンビン処理後サンプル450μlに対して50μlの酢酸を加え、C18逆相クロマトグラフィーのサンプルとした。逆相クロマトグラフィーは0.1％トリフルオロ酢酸存在下でアセトニトリルのグラジエントによる溶出法を用い、そのグラジエントは10％アセトニトリル：10分／１０から20％アセトニトリル勾配：60分／３０から４０％アセトニトリル勾配：40分／４０から６０％アセトニトリル勾配：5分に設定して行った。カラムから溶出されたタンパク質は、波長２８０ｎｍの吸光度を測定することでモニタリングした。アセトニトリルのグラジエントで溶出を行った画分についてSDS-PAGE法およびウエスタンブロッティング法で調べたところ、NESFATIN-1はアセトニトリル濃度36.2％の所で溶出されることが判明した。そのため、この画分を回収し、凍結乾燥を行った後、注射用蒸留水に再度溶解したものを用いて、吸光度によるタンパク質濃度およびエンドスペーシー（生化学工業）によるLPSの含有量の測定を行った。
＜結果＞
100ｍｌの培養液からNi-NTA-agaroseで精製された粗精製GST-His-LVPRGS-mNAP1は約７ｍｇであり、トロンビン処理およびC18逆相クロマトグラフィーで高度に精製されたNESFATIN-1の回収量は４７２．５μｇであった。また高度に精製されたNESFATIN-1に含有するLPSの量は1μgのNESFATIN-1に対して約４ｐｇであった。さらに高度に精製されたNESFATIN-1を実施例１３と同様の方法でラットの脳室内に投与したところ、ラットの摂食抑制および体重増加の抑制効果が認められた。このことから組換え体を用いた発現と精製によって、活性を有するNESFATIN-1の製造が可能であることが示された。
実施例１７ Zucker fa/faラットの第３脳室内投与によるNESFATIN-1の脳内投与による摂食量調節に対する作用の検討
従来の技術に記述したように、肥満および／または肥満症の患者においてはレプチン抵抗性を示す事例が多く見られ、そのことが病態や治療においての問題となっている。そのため、レプチン抵抗性の病態モデル動物であるZucker fa/faラット（Michael等 Nature Genetics 1996年13巻 ｐ18 - 19 ）を用いてNESFATIN-1の摂食量調節における効果を検討した。
ラットは８週齢の雄のZucker fa/fa（Zucker）系ラットおよび対照動物としてZucker +/+（Lean）系ラットを日本チャールス・リバーより購入し、購入後午前6時から午後6時までの12時間を明期、午後6時から翌朝午前6時を12時間の暗期の周期で、粉末飼料（日本クレア社 CE−2）を与え、22℃において飼育し、実験の間も同様の条件で飼育を継続した。購入したラットは1週間以上予備飼育を行った後、９から10週齢の個体の中から体重が２００〜２５０ｇの個体を選別して実験に用いた。
投与に用いた試料は、実施例１６で作製したリコンビナントのマウスNESFATIN-1を５μlのPBSあたり５pmol含む形で溶解したものを用い、コントロールの試料としては生理食塩水（Saline）のみを用いた。調製した試料は、ZuckerラットおよびLeanラットを5匹ずつの群（Zucker／NESFATIN-1群、Lean／NESFATIN-1群、Zucker／Saline群、Lean／Saline群）について、各ラットの第３脳室内に５μlずつ投与した。投与時期は、摂食行動が亢進する暗期に入る直前に行い、投与の手技は実施例６に記載の方法と同様に実施した。
脳室内への投与後、各ラットの０〜１時間、１〜３時間および３〜６時間の間での粉末飼料の減少重量を測定することで摂食量を測定した。なお、有意差検定にはanalysis of varianceを用いた。
＜結果＞
LeanラットへNESFATIN-1を投与した群（Lean／NESFATIN-1群）および生理食塩水を投与した群（Lean／Saline群）の摂食量の測定結果を図１５のＡに、ZuckerラットへNESFATIN-1を投与した群（Zucker／NESFATIN-1群）および生理食塩水を投与した群（Zucker／Saline）の摂食量の測定結果を図１５のＢに示す。コントロール動物のLeanラットでの結果（図１５のＡ）では、投与後０〜１時間および１〜３時間の摂食量は、Saline群比較してNESFATIN-1投与群において低下していることが認められた（Ｐ＜0.001）。また、３〜６時間の摂食量には差が見られなかった。レプチン抵抗性モデル動物であるZuckerにおいても、Leanと同様に投与後０〜１時間、１〜３時間においてSaline群比較してNESFATIN-1投与群に有意な摂食量の低下が認められ（Ｐ＜0.001）、また、３〜６時間においても有意に低下（Ｐ＜0.05）していることが認められた（図１５のＢ）。このことから、NESFATIN-1の摂食抑制作用はレプチンの作用を介さずに機能することが示され、レプチン抵抗性の状態でも効果があるものと解釈される。
実施例１８ マウスにおけるNESFATIN-1の腹腔内投与における摂食量調節に対する作用の検討
ラットの脳室内投与の実験によって、NESFATINおよびNESFATIN-1が摂食量の調節に関与することが示されたが、それ以外の動物種での効果を検討するため、マウスでの投与実験を行った。また、実際の医薬品としての実用性を考えると、末梢への投与によっても効果が示されることが重要と考え、投与経路として腹腔への投与を選択した。さらにAgouti タンパク質の過剰発現によってMC3R/MC4Rの摂食抑制機能が阻害されている肥満モデル動物である、Agouti-yellow（C57BL/6J-Ay/a）マウスへの投与実験も行った。
実験動物は７週齢の雄のICR系マウスを日本エス・エル・シー（株）より購入し、購入後午前6時から午後6時までの12時間を明期、午後6時から翌朝午前6時を12時間の暗期の周期で、ペレット飼料（日本クレア社 CE−2）を自由摂食させ、22℃において飼育し、実験の間も同様の条件で飼育を継続した。購入したマウスは1週間以上予備飼育を行った後、８から９週齢の個体の中から体重が３５〜４０ｇの個体を選別して実験に用いた。
投与に用いた試料は、実施例１６で作製したリコンビナントのマウスNESFATIN-1を２００μlの生理食塩水あたりそれぞれ２ｎmol、１０ｎmolもしくは５０ｎmolの量を含む形で溶解したものを用い、コントロールの試料としては生理食塩水（Saline）のみを用いた。試料は２５Gの注射針を付けたツベルクリン注射筒で各マウス（各群５匹）の腹腔に２００μｌずつ単回投与し、投与の時間は暗期に入る直前（午後6時）に行った。
また肥満モデル動物の実験においては、対象群としてC57BL/6J系のマウスおよび肥満モデル動物としてAgouti-yellowマウスを用い、これらの動物は日本チャールズ・リバー（Jackson Lab.）より購入した。飼育条件、使用マウスの週齢等はICRマウスと同様であるが、対象群のマウスは体重２５〜２８ｇの個体を、Agouti-yellowマウスは３１〜３８gの個体を選別して用いた。投与に用いた試料はリコンビナントのマウスNESFATIN-1を２００μlの生理食塩水あたり１０ｎmolの量を含む形で溶解したものを用い、コントロールの試料としては生理食塩水（Saline）のみを用いた（各群１６匹）。その他の条件は上記と同様に行った。
投与を行った各マウスは個別ケージに入れ、投与後０〜３時間の間で減少したペレット飼料の重量を測定することで摂食量を測定した。なお、有意差検定にはanalysis of varianceを用いた。
＜結果＞
ICRマウスの腹腔内にNESFATIN-1もしくは生理食塩水を投与した時の、投与後０〜３時間の摂食量の測定結果を図１６のＡに示す。図１６のＡの結果においては、NESFATIN-1をマウス1匹あたり２ｎｍｏｌ、１０ｎｍｏｌおよび５０ｎｍｏｌ投与したマウスにおいてコントロール（Saline群）と比較して摂食量の低下が認められ、特に１０ｎｍｏｌ（ｐ＜0.05）および５０ｎｍｏｌ（ｐ＜0.005）においては統計的に有意な摂食量の低下が認められた。このことから、NESFATIN-1はラットだけではなく、マウスでも摂食抑制を示す事から、多くの種で摂食の調節作用に関与すること、また脳内だけではなく、腹腔のような末梢からの投与でも摂食抑制作用に有効なことが示された。またＮＥＳＦＡＴＩＮ−１は腹腔内に投与した場合でも投与後早期に摂食抑制の効果があることが示された。
また、肥満モデルマウスにおける実験において、対象群のマウス（C57BL/6J）に生理食塩水（Cont）またはNESFATIN-1（１０pmol）を投与したときの摂食量の測定結果を図１６のＢに、肥満モデルマウスのAgouti-yellowマウスに生理食塩水（Cont）またはNESFATIN-1（１０pmol）を投与したときの摂食量の測定結果を図１６のＣに示す。その結果、対象群のマウスにおいてもAgouti-yellowマウスにおいてもNESFATIN-1を腹腔内に投与したマウスはコントロールに比較して、有意に摂食量が低下していた。Agouti-yellowマウスはAgoutiタンパク質の過剰発現によって、MC3R/MC4Rのリガンドであるメラノコルチンによる摂食抑制が働かなくなっている肥満モデルであることから、マウスでの投与実験においても、実施例１７におけるZucker（fa/fa）ラットの結果でレプチン抵抗性を示すモデルでの薬理活性が示されたことと、同様に既知のAgouti／メラノコルチン系の摂食抑制とは独立した機構によって摂食の調節を行うことが示唆された。
実施例１９ マウスにおけるNESFATIN-1の腹腔内投与および皮下投与における摂食量調節に対する作用の検討
実施例１８においてNESFATIN-1はマウスの腹腔内投与でも摂食抑制作用に有効なことが開示したが、別の末梢投与の例として、NESFATIN-1の皮下への投与での効果についても検討を行った。
投与に用いた試料は、実施例１６で作製したリコンビナントのマウスNESFATIN-1を２００μlの生理食塩水あたり10ｎmolの量を含む形で溶解したものを用い、コントロールの試料としては生理食塩水（Saline）のみを用いた。試料は２５Gの注射針を付けたツベルクリン注射筒で各マウスの腹腔または背部皮下に２００μｌずつ単回投与し、投与の時間は暗期に入る直前（午後6時）に行った。その他の条件としては、実施例１８と同様に行った。
＜結果＞
マウスの腹腔内（ip）もしくは皮下（sc）にNESFATIN-1（10nmol）または生理食塩水（0）を投与した時の０〜３時間での摂食量の測定結果を図１７のＡに、０〜１４時間の摂食量を図１７のＢに示す。図１７のＡにおいては、生理食塩水投与群（0）に対して、腹腔内（ip）および皮下（sc）へNESFATIN-1を10nmol投与した群では摂食量が低下する傾向が見られ、特に腹腔内投与においては統計的に有意（P<0.05）な低下が認められた。図１７のＢにおいても同様に、生理食塩水投与群（0）に対して、腹腔内（ip）および皮下（sc）へNESFATIN-1を10nmol投与した群では摂食量が低下する傾向が見られたが、腹腔内（ip）へ投与した群ではその摂食量の低下に有意差が見られず、皮下（sc）に投与した群において生理食塩水投与群に対する有意な低下（P<0.005）が認められた。図１７のＡとＢの結果においては、NESFATIN-1を腹腔内に投与したほうが早期に摂食抑制効果が認められ、皮下に投与したほうがやや遅れて効果が認められる傾向がある。このことから、末梢投与においては、腹腔内への投与のみならず皮下への投与でもNESFATIN-1が摂食抑制作用に有効であることが示された。また、脳で作用する薬剤にとって末梢投与で効果を得ることが出来るかが実用上重要であり、その点においてNESFATIN-1は実施例１８および１９の結果から医薬品として用いる有用性をもつことが示された。
実施例２０ NESFATIN-1の部分ポリペプチド（NESFATIN-1N23、NESFATIN-1M30、NESFATIN-1C29）のマウス腹腔内投与による摂食調節への作用の検討
実施例１０および１２において、NESFATINにおけるプロホルモン・コンバターゼによる切断部位から、NESFATIN-1を発明するに至った。しかしながら、NESFATIN-1の機能を解析する上では該ポリペプチドの機能部位を特定することが重要であり、また、医薬品への応用においてはそのペプチドのアミノ酸長が短いほうが製造、投与量、抗原性などの点で有利と考えられる。そのため、さらにその８２アミノ酸長よりなるNESFATIN-1の構造のうち、摂食抑制の活性を持つ部位をさらに詳細に検討するため、NESFATIN-1の部分ペプチドを作製し、それをマウスの腹腔内に投与したときに摂食量を測定する実験を行った。
マウスのNESFATINの配列に由来する、マウスNESFATIN-1のアミノ酸配列（配列番号１４）のうち、アミノ末端からのアミノ酸番号で、１から２３までの配列をNESFATIN-1N23、２４から５３までをNESFATIN-1M30、５４から８２までをNESFATIN-1C29とそれぞれ命名した。
NESFATIN-1N23：ValProIleAspValAspLysThrLysValHisAsnThrGluProValGluAsnAlaArgIleGluPro（配列番号４２）
NESFATIN-1M30：ProAspThrGlyLeuTyrTyrAspGluTyrLeuLysGlnValIleGluValLeuGluThrAspProHisPheArgGluLysLeuGlnLys（配列番号４１）
NESFATIN-1C29：AlaAspIleGluGluIleArgSerGlyArgLeuSerGlnGluLeuAspLeuValSerHisLysValArgThrArgLeuAspGluLeu（配列番号４３）
NESFATIN-1N23、NESFATIN-1M30、NESFATIN-1C29の各ポリペプチドは株式会社バイオロジカに外注し、ＨＰＬＣ法で９５％以上の精製度で作られた合成ペプチドを用いた。それぞれのポリペプチドは、それぞれ生理食塩水２００μｌあたり５０ｎｍｏｌが含まれる形で溶解したものを試料として用い、コントロールとしては生理食塩水（Vehicle）のみを試料として用いた。試料は２５Gの注射針を付けたツベルクリン注射筒で各マウス（各群５匹）の腹腔に２００μｌずつ単回投与し、投与の時間は暗期に入る直前（午後6時）に行った。マウスはオスのICR系マウス（日本エス・エル・シー）を用い、飼育および実験条件としては実施例１８と同様に行なった。
投与を行った各マウスは個別ケージに入れ、投与後０〜３時間の間で減少したペレット飼料の重量を測定することで摂食量を測定した。なお、有意差検定にはanalysis of varianceを用いた。
また、ヒト、ラットおよびマウスのNESFATIN-1のアミノ酸配列アライメントによる比較も実施した。ヒトNESFATIN-1（配列番号１３）、マウスNESFATIN-1（配列番号１４）およびラットNESFATIN-1（配列番号１５）のアミノ酸配列を用い、CLUSTAL-W法（ヒギンス（Higgins）ら ヌクレイック・アシッド・リサーチ（Nucleic Acids Research） 1994年22巻 ｐ4673-4680）によってアライメントを行った。
＜結果＞
マウスの腹腔内に生理食塩水（Vehicle）、NESFATIN-1N23（-N23）、NESFATIN-1M30（-M30）およびNESFATIN-1C29（-C29）を投与した各群の、投与後０〜3時間の摂食量の測定結果を図１８Ａに示す。生理食塩水を投与したコントロール群（Vehicle）に比較して、NESFATIN-1M30を投与した群（N-1b）においては有意（P<0.02）な摂食量の低下が認められた。しかしながら、NESFATIN-1N23を投与した群（N-1a）およびNESFATIN-1C29を投与した群（N-1ｃ）においては有意な摂食量の低下もしくは亢進は認められなかった。このことから、NESFATIN-1M30はNESFATIN-1（およびNESFATIN）の摂食抑制活性にとって最も重要な機能部位であることが示された。また、NESFATIN-1M30も腹腔内投与によって摂食抑制の活性が見られたことから、該ポリペプチドも医薬品への実用化への可能性が示された。 また、ヒト、マウスおよびラットのNESFATIN-1のアミノ酸アライメントの結果とNESFATIN-1N23、NESFATIN-1M30およびNESFATIN-1C29の部位を図１８Ｂに示す。NESFATIN-1M30の部位は種間でアミノ酸配列が高く保存されていることが示された。
実施例２１ EIA系の構築と視床下部組織におけるNESFAIN-1ペプチドの検出
実施例１１において、ラットの視床下部の細胞においてNESFATIN-1に対する抗体（Nesfatin-1 IgG）とプロホルモン・コンバターゼ（PC1/3およびPC2）に対する抗体での結果から、NESFATINとプロホルモン・コンバターゼが同じ細胞で発現し、NESFATIN-1が産生されている可能性が示された。それをさらに検討するため、NESFATINまたはNESFATIN-1を検出する競合EIA系を構築し、さらにラットの視床下部組織より抽出したサンプルを逆相クロマトグラフHPLCで分画したパターンと合成により作製したNESFATIN-1のパターンとの比較を行った。
競合的EIA系は実施例１０で作製したNesfatin-1 IgGとビオチン標識をおこなったNESFATIN-1ペプチドを用いて作製した。Nesfatin-1 IgGを１０μｇ／ｍｌのPBSに溶解したものを９６ウェルのELISAプレート（住友ベークライト：MS-8596F）に50μl／ウェルずつ分注し、プレートシールで密閉して４℃で１晩静置して抗体を固定化した。抗体を固定化したプレートは各ウェルをPBSで洗浄した後、１０％のウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSを２５０μｌ／ウェルずつ分注して室温で２時間放置した。その後プレートの各ウェルをPBSで３回洗浄し、抗体固定化プレートを作製した。
標識化したNESFATIN-1を作製するため、NESFATIN-1のC末端にシステイン残基が付加された形のNESFATIN-1を作製した（NESFATIN-1Cys：配列番号６２）。作製方法は実施例１６と同様であるが、NESFATIN-1Cysをコードする核酸を取得するためのPCRは以下のプライマーセットで行った。
Forward Primer ：5’-GGTTCCGCGGGTCTGGTTCCGCGTGGTTCTCCTATCGATGTGGACAAGACCAA-3’（配列番号 ６３）
Reverse Primer ：5’- GGTTGCGGCCGCTTAACACCTCTTCAGCTCATCCAGTCTCG-3’（配列番号 ６４）
実施例１６に記載の方法と同様に発現・精製を行ったNESFATIN-1Cysは、50ｍMの２−メルカプトエタノールアミン、１ｍMのEDTAを含む0.1Mリン酸緩衝液（ｐH６．０）に溶解し、３７℃で９０分間処理した後、0.1％になるようにトリフルオロ酢酸（TFA）を加え、Sep-PakC18カラム（Waters社）にのせ、カラムを0.1％TFA、10%アセトニトリル水溶液10mlで洗浄後、3mlの0.1％TFA、60％アセトニトリル水溶液で溶出した。溶出物は凍結乾燥後、5mg／mlになるように0.1Mリン酸緩衝液（ｐH７．０）に溶解し、そこへ１／４０容のジメチルホルムアミド（DMF）で溶解した２０ｍｇ／ｍｌのBiotin (Long Arm) Maleimide（VECTOR Lab.）を加え、室温で3時間反応させた。Biotin (Long Arm) Maleimideを反応させたNESFATIN-1Cysは0.1％になるようにTFAを加え、逆相C１８カラム（ナカライ・テスク社：COSMOSIL（登録商標） 5C18-AR-300 20.0mml.D.×150mm）を装着したHPLCにアプライし、２１０ｎｍでの波長での吸光度をモニターしながら、0.1％TFA水溶液、それに続いて0.1％TFAを含む２０％アセトニトリル水溶液で溶出物の吸光度が確認できなくなるまで洗浄を行い、その後２０〜６０％のアセトニトリルによるグラディエントを掛けた水溶液を送液して、２１０ｎｍの吸光度における最大のピークを示す画分を分取した。得られた画分は凍結乾燥した後PBSに溶解して、それを標識化NESFATIN-1として用いた。
標識化したNESFATIN-1は1μg／ｍｌになるように２％のBSAを含むPBSに溶解した。標準曲線の作成は実施例１６で作製したリコンビナントNESFATIN-1を6000ng／mlの濃度になるように２％のBSAを含むPBSで希釈し、それを2倍公比で２％のBSAを含むPBSで希釈したものを用いた（標準試料：6000、3000、1500、750.0、375.0、187.5、93.8ng／ml）。作製した標識化NESFATIN-1と標準試料は各50μlずつをマイクロテストチューブに入れて混合し、抗体固定化プレートのウェルに各50μlずつ分注した。また、生体試料の例としてラットから採取した髄液をそのまま、または２％のBSAを含むPBSで2倍に希釈した試料を50μlと標識化NESFATIN-1溶液50μlをマイクロテストチューブないで混合し、各50μlを抗体固定化プレートのウェルに分注した（検体）。分注後の抗体固定化プレートは1時間室温で静置した後、ウェル内の反応試料を捨て、0.2％のTween-20を含むPBSで3回洗浄した。その後、２％のBSAおよび0.2％のTween20を含むPBSで1/1,000に希釈したAvidin-Peroxidase（Sigma社A7419-2ML）を各ウェルに50μl分注して室温で３０分間静置した。反応後、各ウェルの溶液を除き、0.2％のTween20を含むPBSで4回洗浄後、TBS（50ｍM Tris-HCl、0.15M NaCl、ｐH8.0）で2回洗浄を行った。洗浄後の抗体固定化プレートの各ウェルに、50μlのPeroxidase基質のTMB（PIERCE社：1-Step（登録商標） TurboTMB）を加え、30分間室温で反応させた。その後各ウェルに50μlの0.5N硫酸を加えて反応を停止させ、吸光プレートリーダーで450ｎｍの波長の吸収と620ｎｍMの波長の吸収を測定し、450ｎｍの波長の吸光度から620ｎｍの波長の吸光度を引いたもの（450（Δ620）ｎｍ）を測定値とした。
視床下部でのNESFATIN-1の発現の解析は、組織から抽出したペプチドを試料にして、HPLCによる分画をおこなうことで実施した。８匹のラット脳から視床下部を切り出し、４mlの0.1％TFA水溶液中でテフロン（登録商標）ホモジナイザーを用いてホモジナイズし、10,000rpmで10分間遠心分離してその上清を回収した。回収した上清は0.45μmのポアサイズのフィルター（Millipore社）で濾過した後、Sep-PakC18カラム（Waters社）を通し、そのカラムを５ｍｌの0.1％TFA水溶液で洗浄した。その後、カラムに3mlの60％アセトニトリル水溶液で溶出し、その溶出物をエバポレーターで乾燥させた。その乾燥物を0.8mlの0.1％TFA水溶液に溶解し、10,000rpmで10分間遠心分離して、その上清500μlをC18逆相クロマトカラム（ナカライ・テスク社：COSMOSIL %C18-AR-II、4.6mmI.DX250mm）を装着したHPLC装置にインジェクションした。試料をインジェクションした後、溶出物を224ｎM の波長での吸光度をモニターしながら、1ml／分の流速で0.1％TFA水溶液を流してカラムを洗浄した。洗浄後、流速はそのままで、0.1％TFA存在下、0から60％のアセトニトリルの濃度勾配（Δ１％／分）での送液を行い、溶出物を１mlずつのフラクションとして回収した。得られたフラクションは−80℃で凍結した後、凍結乾燥を行い、乾燥後のサンプルは各200μlの2％BSAを含むPBSに溶解して、競合EIA法でNESFATIN・NESFATIN-1を測定した。同様に、8匹のラットから回収した髄液600μlを乾燥させた試料から、ペプチドサンプルを作製して、HPLCでの分画を行い、溶出される画分を競合EIA系で検討した。またコントロールとして、実施例１６で作製したリコンビナントNESFATIN-1ペプチド80μgを100μlの0.1％TFA水溶液に溶かして、HPLCにインジェクションし、NESFATIN-1が溶出される画分を検出した。
＜結果＞
競合EIA系での標準試料の測定によって得られた標準反応曲線を図１９A-１に示す。反応させたNESFATIN-1の濃度が上昇することによって競合的に標識化NESFATIN-1の結合が阻害され、450（Δ620）ｎｍの吸光度が減少することがしめされ、この系によって試料中のNESFATIN-1の濃度が測定できることが示された。この系の感度は4.6ng/tube（93ng/ml）のNESFATIN-1に相当する。この競合EIA系で髄液でのNESFATIN-1（NESFATIN）の濃度を測定した結果を図１９A-2に示す。髄液をそのまま、若しくは1/2に希釈して測定（測定後希釈率で換算）した値は、ほぼ同じ値を示し、約230ng/mlのNESFATIN-1（NESFATIN）が存在することが示された。
ラットの視床下部から抽出したペプチドサンプルをHPLCで分画し、その画分でのNESFATIN-1の存在を競合EIAで測定した結果を図１９Bのb-1に、ラットの髄液から抽出したペプチドサンプルで同様の検討を行った結果を図１９Bのb-2に示す。図１９Bのb-1および図１９Bのb-2の両者とも、４４から４５番目の画分にNESFATIN-1と思われる競合EIA系での反応ピークが認められた。なお、リコンビナントNESFATIN-1をHPLCで同様の条件で分画した時の結果では、やはり４４番目の画分にNESFATIN-1が溶出されることから、視床下部および髄液のHPLC分画で競合EIA系で存在が示された因子は、NESFATIN-1であると考えられる。
実施例２２ NESFATIN-1M30の部分ポリペプチド（NESFATIN-1M16、NESFATIN-1M14、NESFATIN-1M10M）のマウス腹腔内投与による摂食調節への作用の検討
実施例２０において、NESFATIN-1に由来する部分ペプチドの摂食抑制作用の検討から、NESFATIN-1M30を発明するに至った。さらにその３０アミノ酸長よりなるNESFATIN-1M30の構造のうち、摂食抑制の活性を持つ部位をさらに詳細に検討するため、NESFATIN-1M30の部分ペプチドを作製し、それをマウスの腹腔内に投与したときに摂食量を測定する実験を行った。
マウスNESFATIN-1M30の部分ペプチドである１６アミノ酸長からなるNESFATIN-1M16、１４アミノ酸長からなるNESFATIN-1M14、１０アミノ酸長からなるNESFATIN-1M10Mは、以下の配列のものを、株式会社バイオロジカに外注し、ＨＰＬＣ法で９５％以上の精製度で作られた合成ペプチドを用いた。
NESFATIN-1M16：N-ProAspThrGlyLeuTyrTyrAspGluTyrLeuLysGlnValIleGlu-C（配列番号７１）
NESFATIN-1M14：N-ValLeuGluThrAspProHisPheArgGluLysLeuGlnLys-C（配列番号７２）
NESFATIN-1M10M ：N-LysGlnValIleGluValLeuGluThrAsp-C（配列番号７３）
作製した各ペプチドは10pmolが100μlに溶けているように生理食塩水に溶解したものを投与用の試料として用い、コントロール（Cont.）としては生理食塩水のみを用いた。コントロールとしての生理食塩水および調製したペプチド試料はマウス1匹あたり100μlずつ腹腔内に投与した（各群ｎ＝６）。マウスはオスのICR系マウス（日本エス・エル・シー）を用い、飼育および実験条件としては実施例１８と同様に行なった。
投与を行った各マウスは個別ケージに入れ、投与後０〜３時間の間で減少したペレット飼料の重量を測定することで摂食量を測定した。なお、有意差検定にはanalysis of varianceを用いた。
＜結果＞
マウスの腹腔内にNESFATIN-1M30の部分ペプチドであるNESFATIN-1M16（M16）、NESFATIN-1M10M（M10M）またはNESFATIN-M14（M14）を投与した際の、投与後０〜３時間における摂食量を図２０に示す。生理食塩水のみ投与したコントロール群（Cont.）に比較してNESFATIN-1M16（M16）、NESFATIN-1M10M（M10M）またはNESFATIN-M14（M14）を投与した群では総て摂食の有意な抑制効果が認められた。
実施例２３ ヒトNESFATIN-1M30およびマウスNUCB1-M30の摂食調節への作用の検討
実施例２０においてはマウスのNESFATIN-1M30が摂食抑制の作用を有することについて示した。そのことからヒトのNESFATIN-1M30を作製し、マウスに投与したときの摂食行動への作用を検討した。またNucleobindin-1（NUCB1）はNEFA／NESFATINとペプチドでのアミノ酸配列および遺伝子での塩基配列の相同性が高いファミリーを形成する因子である。したがって、NUCB1のNESFATIN-1M30に相当する部位であるNUCB1-M30を作製し、マウスに投与して摂食への作用を検討した。
ヒトのNESFATIN-1M30（配列番号３９）およびマウスNUCB1-M30は化学合成法によりバイオロジカ（株）に外注して合成し、９５％の以上に精製したものを取得した。
ヒトNESFATIN-1M30：
N-ProAspThrGlyLeuTyrTyrAspGluTyrLeuLysGlnValIleAspValLeuGlu ThrAspLysHisPheArgGluLysLeuGlnLys-C（配列番号３９）
マウスNUCB1-M30：
N-ProAspThrGlyLeuTyrTyrHisArgTyrLeuGlnGluValIleAsnValLeuGluThrAspGlyHisPheArgGluLysLeuGlnAla-C（配列番号１０３）
作製したヒトのNESFATIN-1M30およびマウスNUCB1-M30は各10pmolが100μｌに含まれる形で生理食塩水に溶解して投与の試料とした。また、摂食抑制活性が認められたマウスのNESFATIN-1M30は実施例２０で作製したものをNESFATIN-1M30およびNUCB1-M30と同様の用量で用いたものを比較試料として用い、コントロール（Vehicle）としては生理食塩水のみを試料とした。
コントロールとしての生理食塩水および調製したペプチド試料はマウス1匹あたり100μlずつ腹腔内に投与した（各群ｎ＝６）。マウスはオスのICR系マウス（日本エス・エル・シー）を用い、飼育および実験条件としては実施例１８と同様に行なった。
投与を行った各マウスは個別ケージに入れ、投与後０〜３時間の間で減少したペレット飼料の重量を測定することで摂食量を測定した。なお、有意差検定にはanalysis of varianceを用いた。
またヒト・ラット・マウスのNESFATINおよびヒト・ラット・マウスのNUCB1のアミノ酸配列のアライメントを行った。方法は、配列番号２、配列番号５および配列番号８の各ヒト・マウス・ラットのNESFATINのアミノ酸配列、および配列番号８４、配列番号８８および配列番号９２の各ヒト・ラット・マウスのNUCB1のアミノ酸配列を用いて、ClustalW法での解析を行った。
＜結果＞
ヒトNESFATIN-1M30（human／NESFATIN-1M30）、マウスNESFATIN-1M30（Mouse／NESFATIN-1M30）またはマウスNUCB1-M30（Mouse NUCB1）を投与した際の、投与後０〜３時間の摂食量の測定結果を図２１Ａに示す。図２１Ａにおいて、生理食塩水のみを投与したコントロール群（Vehicle）に比較して、ヒトNESFATIN-1M30（human／NESFATIN-1M30）、マウスNESFATIN-1M30（Mouse／NESFATIN-1M30）またはマウスNUCB1-M30（Mouse NUCB1）を投与した群では総て有意に摂食が抑制される効果が認められた。
またヒト・ラット・マウスのNESFATINおよびヒト・ラット・マウスのNUCB1のアミノ酸配列のアライメントの結果とNESFATIN-1に相当する部位およびNESFATIN-1M30に相当する部位を図２１B〜２１Cに示している。各種におけるNESFSATINおよびNUCB2のNESFASTIN-1に相当する部位、特にNESFATIN-1M30に相当する部位において、アミノ酸配列の保存性が高いことが示された。
実施例２４ ラット視床下部でのNESFATIN遺伝子発現部位の検討
実施例８において脳視床下部におけるNESFATINｍRNAの発現をin situハイブリダイゼーション法で解析を実施したが、NESFATIN遺伝子が発現している部位をさらに詳細に解析するため、ラジオアイソトーププローブを用いたin situハイブリダイゼーション法による検討を実施した。
自由に摂餌できる状態で飼育した８週齢のオスの正常Wistar系ラット（日本SLCより購入）（体重220〜250g）を用い、明期にラットをペントバルビタールで深麻酔をかけ、心臓から氷冷した0.1 M ホウ酸緩衝液（ｐH９．５）に溶解した４％パラホルムアルデヒドを還流することで脳を固定した。ラットから脳を取り出し、１０％ショ糖と４％パラホルムアルデヒドを含む0.1 M ホウ酸緩衝液（ｐH９．５）に２日間浸漬した。固定した脳はドライアイスーアセトンで凍結し、クリオスタットで２０μmの厚さの切片を作製して、スライドグラス（松浪ガラス製MASコートスライドS-9116）に乗せた。
ラジオアイソトープ標識プローブの作製は、実施例２で用いたNEFAプローブ作製用のプラスミドを制限酵素NcoIで切断して精製した該プラスミド0.1μgを用い、36mM トリス塩酸緩衝液（pH 7.5）、6 mM 塩酸マグネシウム、2 mM スペルミジン、8 mM ジチオスライトール、25 mM アデノシン３リン酸/グアノシン３リン酸/シトシン３リン酸、5 mM ウラシル３リン酸と５ｍM [α-35S] -ウラシル３リン酸及び1 U RNAsin（登録商標） Ribonuclease Inhibitor (Promega社 N2111)を含む溶液１９μlの条件で、２０U（１μｌ）のSP6 RNA Polymerase（プロメガ社 P1085）を加えて37℃で60分反応させることで３５S標識化NEFA cRNAプローブを作製した。反応後、２０μlのTNE緩衝液（10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.5 M NaCl, and 0.25 mM EDTA, pH8.0）を加えて反応を停止させ、NENSORBTM PREP Nucleic Acid Purification Cartridges（PerkinElmer, Inc. NLP028001EA）を用いて添付のプロトコールにしたがってプローブの精製を行った。
作製した切片標本のスライドグラスはハイブリダイズを行う前に１晩真空下で乾燥させ、その後10μｇ／ｍｌのProteaseK（Sigma社 P2308）を含むPBSで３７℃３０分処理した後、PBSで2回洗浄し、さらに0.25％の無水酢酸を含む0.1Mトリエチルアミン−塩酸緩衝液（ｐH８．０）に室温で10分漬ける処理を行い、その後２倍濃度のSSCで2回洗浄した。洗浄した切片標本は７５％エタノール・９５％エタノール・９９％エタノールに順番につけて脱水を行った後、風乾して、さらに真空下で乾燥させた。
乾燥させた切片標本のスライドグラスは脳組織切片が覆われるように、in situハイブリダイゼーション液（10ｍM トリス塩酸緩衝液 ｐH8.0、30ｍM NaCl、10％ 硫酸デキストラン、1倍濃度Denhardt’s液、12ｍM EDTA、50％ 脱イオン化ホルムアミド、0.5mg／ml 酵母ｔRNA）を載せ、６５℃で1時間プレハイブリダイゼーションを行った。プレハイブリダイゼーション液を捨てた後、スライドグラスあたり８０μｌの106 cpm/mlの３５S 標識化NEFA cRNAプローブと 10 mM ジチオスライトールを含むハイブリダイゼーション液を乗せ、カバーグラスを乗せて湿潤箱に入れて６５℃で一晩ハイブリダイズを行った。ハイブリダイゼーション後のスライドグラスは４倍濃度のSSCで4回洗浄した後、20μg／ｍｌのRNAase Aを含むTNE緩衝液（10 mM Tris-Cl, pH 8.0, 0.5 M NaCl, and 0.25 mM EDTA, pH8.0）で37℃30分処理し、室温で2倍濃度のSSCで2回洗浄して、さらに65℃で0.1倍濃度のSSCで30分間2回洗浄を行った。洗浄後のスライドグラスは７５％エタノール・９５％エタノール・９９％エタノールに順番につけて脱水を行った後、風乾した。その組織切片を乗せたスライドグラスはX線フィルムに7日間当てて感光を行った後、水で２倍に薄めた感光エマルジョン（Kodak社 NTB3）に漬けて3週間感光させた。感光後スライドグラスは水洗後、Thionineによる染色を行い、顕微鏡で感光によって生じた黒いスポットの観察を行った。
なお、ラットの脳における各部の位置の同定はパキシノス（Paxinos G）とワトソン（Watoson C）著The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. （Academic Press出版）（USA）1986年に従った。
＜結果＞
図２２のＡには室傍核（PVN）と視床上核（SON）を含む組織切片、図２２のＢには不確帯（Zi）と弓状核（Arc）を含む組織切片、図２２のＣには視床外側野（LHA）を含む組織切片におけるin situハイブリダイゼーションの像を示している。PVN、SON、Zi、Arc、LHAの各領域でラジオアイソトープ標識NEFAcRNAプローブがハイブリダイズしたことで感光したスポットが見られ、NEFA遺伝子の発現が認められた。
実施例２５ ラットの脳室内へのNESFATIN投与による摂食行動への作用の検討
実施例６においてはラットのNESFATIN投与後０〜１時間／１〜３時間／３〜６時間における摂食量を検討したが、さらに投与後６〜12時間における摂食行動への作用についても検討を行った。
実験は実施例６の再現性を示すため、実施例６と同様に、第3脳室内にリコンビナントNESFATINを各0（PBSのみ）、1、4、20pmol投与した際の、投与後0〜1時間の間での摂餌量を測定した。また、実施例６と同様の方法で、ラット脳室内に５ｐmolのNESATINを投与した後、０〜１時間／１〜３時間／３〜６時間および６〜12時間における摂餌量の測定をおこなった。なお対照群としては、生理食塩水のみ（０ｐmol）投与した群を用いた。なお、有意差検定にはanalysis of varianceを用いた。
＜結果＞
図２３のＡに示すように、NESFATINの脳室内投与を４ｐmolまたは20ｐmol投与した際の０〜１時間の摂食量は、対照群（0ｐmol）に比較して有意な摂餌量の低下が認められた（ｐ＜0.01）。また図２３のＢに示すように、５ｐmolのNESFATINを脳室内に投与された個体は、対照群（0ｐmol）に比較して、０〜１時間（p<0.01）、１〜3時間（p<0.05）、３〜6時間（p<0.001）で有意な摂餌量の低下が認められた。しかしながら、６〜12時間の間の摂餌量については、５ｐmolのNESFATINを投与した群と対照群と比較して差は認められなかった。
実施例２６ 飢餓状態におけるラット視床下部の部位におけるNESFATIN ｍRNAおよびNESFATIN-1ペプチドの発現量の検討
飢餓状態におけるNESFATIN遺伝子の発現を検討するため、自由摂食および絶食させたラット脳の視床下部領域でin situハイブリダイゼーションを行い、その組織から弓状核・室傍核・外側野・視床上核でのNESFATINのｍRNA量の増減を測定した。また同様に絶食による室傍核でのNESFATIN-1ペプチドの発現量を測定するため、自由摂食および絶食させたラット脳の視床下部領域を切り出し、抽出したペプチドを競合EIA系で定量を行った。
ラットは実施例８と同様に自由に粉末飼料を摂食できる個体（対照群）、48時間飼料を与えず飲料水のみで飼育した個体（絶食群）を用いた。視床下部の各部位におけるNESFATINのmRNA発現量の定量は、実施例２４と同様の方法で組織切片を作製して、in situハイブリダイゼーションを行い、X線フィルムに感光させて得られた像をイメージアナライザー（Imaging Research Inc. MCIDTM Elite）で測定することにより行った（Imaki等 ブレイン・リサーチ（Brain Research）（Netherlands）1993年 623巻 ｐ223-228）。弓状核・室傍核・外側野・視床上核における部位での感光像の濃度を測定し、その値を白から黒を２５６段階のグレースケールで比色数値として数値化し、以下の式で比色濃度（Relative Optical Densities）として数値化し、ｍRNA発現の相対値とした。
Relative Optical Densities＝log10（256/比色数値）
なお、弓状核・室傍核・外側野・視床上核の各部位の同定は、パキシノス（Paxinos G）とワトソン（Watoson C）著The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. （Academic Press出版）（USA）1986年に従った。
ラット脳の室傍核におけるNESFATIN-1ペプチドの定量は以下のように行った。上記と同様に自由摂食および絶食させたラットを断頭によって屠殺し、すぐに脳をドライアイスーエタノールで凍らせ、クリオスタットで６０μｍの厚さの切片を作製した。組織をNissl染色し、実体顕微鏡下で脳の両側の室傍核に相当する部分を切り出して回収した。回収した組織は１．５mlのマイクロチューブ中で100μlの0.1N塩酸中でマイクロチューブ・ペッセル（Scientific Specialties社 1005-39）を用いてホモジナイズした。ホモジナイズした溶液はマイクロ遠心機で15,000rpmで20分間遠心し、その上清を回収して凍結乾燥で溶媒を除去した。凍結乾燥したサンプルは100μlのPBSに溶解し、実施例２１に記載した競合EIAの測定法で５０μｌ／ウェルの条件でNESFATIN-1ペプチド量を定量した。
＜結果＞
図２４のＡは自由摂食群（対照群）と絶食群のラットにおける脳視床下部領域における弓状核（Arc）・室傍核（PVN）・外側野（LHA）および視床上核（SON）の各部位でのNESFATIN ｍRNA発現をin situハイブリダイゼーション法による画像解析で定量した結果を示している。弓状核・外側野・視床上核においては自由摂食群（対照群）でのNESFATIN ｍRNAの発現の値（比色濃度）に対して絶食群においてのNESFATIN ｍRNA発現の値には差は見られなかった。それに対して室傍核においては自由摂食群（対照群）に対して絶食群のNESFATIN ｍRNAの発現量は有意に低下しているという結果が得られた。
図２４のＢは自由摂食群（対照群）と絶食群のラットにおける脳視床下部領域のうち室傍核におけるNESFATIN-1ペプチドの発現を競合EIA法による画像解析で定量した結果を示している。自由摂食群（対照群）に対して絶食群では室傍核でのNESFATIN-1ペプチドの発現が有意に低下していることが示された。
以上の成績は、絶食により摂食の調節に重要である視床下部の室傍核でNESFATIN（NEFA）遺伝子およびNESFATIN-1の発現が顕著に低下することを示している。
実施例２７ NESFATIN-1のラット脳室内への投与による摂食行動への影響の検討
実施例１２においてNESFATINの部分ペプチドの投与による実験でNESATIN-1の部分のみが摂食抑制活性があることを示した。さらにその実験を検証するため、投与後の時間経過による摂食抑制活性について検討を実施した。
実験条件は実施例１２と同様に行ない、ラットの第三脳室内に５ｐmolのNESFATIN-1を暗期の始まる直前に投与し、投与直後からの１時間（０〜１hr）、投与１時間後からの２時間（１〜３hr）、投与後3時間後からの3時間（３〜６hr）および投与後６時間からの6時間（６〜１２hr）の間での飼料の減少量（摂餌量）を摂餌量として計測した。なお、対照群として、生理食塩水のみを投与した個体の摂餌量を測定した。
＜結果＞
図２５にはラットの第三脳室内に５ｐmolのNESFATIN-1を投与したときの、０〜１hr、１〜３hr、３〜６hrおよび６〜１２hrでの摂食量を示している。対照群に対してNESFATIN-1を投与された群では０〜１hr、１〜３hrおよび３〜６hrにおいては有意に摂餌量の低下が認められた（p<0.01）。それに対して６〜１２hrでは対照群に比較してNESFATIN-1を投与された群では摂餌量の増加が認められた（p<0.01）。以上の成績から脳室内にNESFATIN-1が投与された場合における摂食の抑制は一時的なものであり、時間経過によるNESFATIN-1の薬理効果の消失と、それによる摂食の回復が認められることが示された。
実施例２８ 抗NESFATIN-1抗体のラット脳室内投与による摂食亢進作用の特異性の検討
実施例１４ではラット脳室内にNESFATIN-1に対する抗体を投与したときに、摂食亢進作用が認められることを示した。その作用がNESFATIN-1の作用を阻害することによる効果であることを検証するため、脳室内にNESFATIN-1を投与したときに摂食抑制が抗NESFATIN-1抗体を同時に投与することによって阻害されるかの検討を行った。
実験条件は実施例１２と同様に行ない、暗期に入る直前のラットの第三脳室内に５ｐmolのNESFATIN-1のみを投与した群、５ｐmolのNESFATIN-1と８μｇの抗NESFATIN-1抗体（Nesfatin-1 IgG）を投与した群での投与後１時間の摂餌量を計測して、対象群（生理食塩水のみを投与）を比較した。また脳室投与で摂食抑制活性があることが知られているレプチン（Rat Leptin：R＆D systems社 598-LP-01M）を単独（１μg）またはレプチンと抗NESFATIN-1抗体とを投与した群での摂食への作用も検討した。
＜結果＞
図２６はラットの脳室内にNESFATIN-1のみを投与した群（NESFATIN-1 IgG／NESFATIN-1／Leptin：−／＋／−）、NESFATIN-1と抗NESFATIN-1抗体を投与した群（NESFATIN-1 IgG／NESFATIN-1／Leptin：＋／＋／−）、Leptinを投与した群（NESFATIN-1 IgG／NESFATIN-1／Leptin：−／−／＋）、Leptinと抗NESFATIN-1抗体を投与した群（NESFATIN-1 IgG／NESFATIN-1／Leptin：＋／−／＋）の投与後１時間の摂餌量を表したグラフである。対照群（NESFATIN-1 IgG／NESFATIN-1／Leptin：−／−／−）に比較してNESFATINのみ投与した群では摂餌量が有意（p<0.01）に減少するのに対して、NESFATIN-1と抗NESFATIN-1抗体を投与した群では摂餌量が対照群と同程度まで亢進する効果が認められた。それに対してLeptinを投与した群でも摂餌量が減少するのが、Leptinと抗NESFATIN-1抗体を投与した群ではLeptinによる摂餌量の抑制を亢進させる効果は認められなかった。この成績から、抗NESFATIN-1抗体による摂食亢進作用はNESFATIN-1の効果を特異的に抑制することによると考えられる。
実施例２９ 抗NESFATIN-1抗体の結合特異性の検討
実施例２８においては抗NESFATIN-1抗体の脳内投与においてNESFATIN-1の作用を特異的に阻害することについて検討したが、さらに現状知られている摂食調節作用があることが知られている因子との結合性をラットの脳抽出物を用いたウエスタンブロティング法で検討した。
ウエスタンブロティングによる解析は実施例３に示した方法において、1次抗体を抗NAPポリクローナル抗体から抗NESFATIN-1抗体に置き換えた方法で行った。また抗NESFATIN-1抗体の結合特異性を調べる実験として、ウエスタンブロティングでメンブレンに反応させる前に、抗NESFATIN-1抗体をNAP1-Abペプチド（実施例１０）、および摂食調節作用の知られているLeptin（Rat Leptin：R＆D systems社 598-LP-01M）・αMSH（Melanocyte Stimulating Hormone：株式会社ペプチド研究所 4057-ｖ）・CART（Rat Coaine- and Amphetamine-Regulated Transcript 55-102：株式会社ペプチド研究所 4351-ｓ）・NPY（Human, Rat Neuropeptide Y：株式会社ペプチド研究所 4158-ｖ）・MCH（Human Melanin-Concentrating Hormone：株式会社ペプチド研究所 4369-ｖ）・Orexin-A（Human, Rat, Mouse, Bovine Orexin-A：株式会社ペプチド研究所 4346-ｓ）の各ペプチドを抗NESFATIN-1抗体１μgあたりそれぞれ５μｇ加えて、室温で1時間反応させた後、上記の方法でウエスタンブロティングを行って、バンドが消失するかを検討した。
＜結果＞
図２７のＡはラットの脳からのタンパク質抽出液を用いて抗NESFATIN-1抗体でウエスタンブロティングを行った像を示している。その結果分子量４７．５ｋｄのNESFATINポリペプチドに相当する分子量の所にバンドが認められた。図２７のＢは抗NESFATIN-1抗体と各種ペプチドを前もって反応させた後に上記と同様にウエスタンブロティングを行ったときの４７．５ｋｄ付近のバンド付近の像を示している。抗NESFATIN-1抗体をNAP1-Abで反応させた場合は４７．５ｋｄのバンドは消失し、これは抗NESFATIN-1抗体が先にNAP1-Abペプチドと反応することでNESFATINとの結合部位がブロックされたことを示している。それに対してLeptin、αMSH、CART、NPY、MCH、Orexin-Aと反応させた場合、またペプチドを抗NESAFATIN-1抗体反応させなかった場合には４７．５ｋｄのバンドは消失しなかった。この成績から抗NESFATIN-1抗体はNESFATINと特異的に結合するが、Leptin、αMSH、CART、NPY、MCH、Orexin-A等の他の摂食関連ペプチドとは反応しないことが示された。
実施例３０ ラットの延髄におけるNESFATINの発現部位の検討
実施例４においてはラット脳の視床下部付近における発現について免疫組織化学的解析を実施して検討した。さらにラットの延髄付近におけるNESFATINの発現を検討するため、同様に免疫組織化学的解析を実施した。
８週齢のWistar系ラット（日本SLCより購入）を用い、実施例４と同様に調製した標本から延髄を含む部分の脳組織切片を作製した。また免疫組織化学染色の方法も実施例４と同様に行なった。さらに、NAPペプチドに対する抗体（１μｇ／ml）にNAPペプチド（実施例３）を１００μg／mlになるように添加して、室温で1時間反応させた後、その抗体を用いて免疫組織化学染色を行う実験も実施した。
＜結果＞
図２８のＡは延髄を含む脳組織での免疫組織化学染色の像を示している。延髄を含む組織における免疫組織染色においては、STN：孤束核において染色が認められ、NEFAポリペプチドの発現が認められた。図２８のＢはNAPペプチドに対する抗体をNAPペプチドと前もって反応させてから免疫組織染色を行った像を示している。抗NAPペプチド抗体をNAPペプチドと前もって反応させたことにより、図２８のＡで認められた染色が消失することから、この免疫組織染色においてはNEFAポリペプチドが特異的に染色されていることが示された。この成績から、内臓性感覚神経核であり、摂食調節機構に関与しているといわれる孤束核でもNESFATINが発現していることが示された。
実施例３１ 正常およびレプチン抵抗性肥満ラットへのトログリタゾン投与と血中レプチンおよび脳内NESFATIN発現への影響
実施例２においては糖尿病治療薬として用いられていたPPARγアゴニストであるトログリタゾンによる培養細胞でのNESFATIN（NEFA）遺伝子の誘導について検討した。さらにトログリタゾンによるNESFATINの発現誘導を検討するため、トログリタゾンをラットに与え、脳内でのNESFATIN誘導について検討した。また、同様に摂食調節を行なう因子として知られるレプチンの血中濃度についても検討を行なった。検討は正常Zuckerラット（Zucker +/+：Lean）とレプチン抵抗性肥満モデル動物であるZucker fa/faを用いて行った。
動物は８週齢の雄のZucker fa/fa（Zucker）系ラットおよび対照動物としてZucker +/+（Lean）系ラットを日本チャールズ・リバーより購入し、購入後午前6時から午後6時までの12時間を明期、午後6時から翌朝午前6時を12時間の暗期の周期で、粉末飼料（日本クレア社 CE−2）を与え、22℃において飼育した。購入したラットは1週間以上予備飼育を行った後、９から10週齢の個体の中から体重が２００〜２５０ｇの個体を選別して各群６匹ずつ実験に用いた。トログリタゾン（TGZ：三共株式会社）の投与は０．２％の含量で粉末飼料中に混合し、自由摂食をさせて行った。またトログリタゾンを投与していない対照としては通常の粉末飼料のみで飼育したラットを用いた。トログリタゾンを含む飼料または通常の飼料を10日間与え続けて飼育した後、動物は体重を測定し、屠殺して全血を採血した。採取したラットの血液からは血清を分離し、市販のELISAキット（株式会社矢内原研究所 YK050）を用い、その添付のプロトコールに従ってレプチンの濃度を測定した。さらに屠殺したラットから脳を取り出し、実施例３と同様の方法でウエスタンブロティングを行い、そのバンドの濃度をイメージアナライザー（Imaging Research Inc. MCIDTM Basic）で解析し、そのバンドの発色の程度を相対値（Units）として表した。
＜結果＞
図２９のＡは正常ラット（Lean）とZucker fa/faラット（Zucker）にトログリタゾンを含む飼料を摂餌させた群（TGZ：＋）と含まない飼料を摂餌させた群（TGZ：−）における体重を表したグラフである。正常ラットにおいてもZucker fa/faラットにおいても、トログリタゾンを与えたことによる体重の顕著な差は見られなかった。また、トログリタゾンを与えたか否かに関わらず、正常ラットに対してZucker fa/faラットでは有意（p＜0.01）に体重が重かった。
図２９のＢは正常ラット（Lean）とZucker fa/faラット（Zucker）にトログリタゾンを含む飼料を摂餌させた群（TGZ：＋）と含まない飼料を摂餌させた群（TGZ：−）における血中のレプチン濃度を表したグラフである。正常ラットにおいてもZucker fa/faラットにおいても、トログリタゾンを与えたことにより血中のレプチン濃度は有意（p＜0.05）に低下する結果が得られた。また、トログリタゾンを与えたか否かに関わらず、正常ラットに対してZucker fa/faラットでは有意（ｐ＜0.01）に血中のレプチン濃度が高いという結果が得られた。
図２９のＣは正常ラット（Lean）とZucker fa/faラット（Zucker）にトログリタゾンを含む飼料を摂餌させた群（TGZ：＋）と含まない飼料を摂餌させた群（TGZ：−）から脳のタンパク抽出サンプルを作製して、ウエスタンブロティングで得られたバンドの濃度を相対値として表したグラフである。正常ラットにおいてはトログリタゾンを含む飼料を摂餌させた群（TGZ：＋）と含まない飼料を摂餌させた群（TGZ：−）の間では脳で発現しているNESFATINの発現量に差は見られなかった。それに対してZucker fa/faラットではトログリタゾンを与えたことにより、脳内のNESFATINの発現量が有意（p＜0.01）に増大する結果が得られた。また、トログリタゾンを与えたか否かに関わらず、正常ラットに対してZucker fa/faラットでは有意（p＜0.01）に脳内のNESFATINの発現量が高いという結果が得られた。
以上の成績から、糖尿病治療薬として用いられていたトログリタゾンは正常動物では脳内のNESFATINを誘導しないが、レプチン抵抗性の病態を示すモデル動物では脳内でのNESFATINの発現を誘導しうることが考えられる。それに対してレプチンはトログリタゾンによっては正常動物、病態動物共に血中濃度の上昇は得られず、逆に血中濃度が下がることが考えられる。
実施例３２ 視床下部組織抽出物のHPLC画分におけるNESFAIN-1ペプチドの検出
実施例２１においては視床下部組織から抽出したペプチドを試料にして、HPLCによる分画をおこない、さらにその画分を用いて競合EIA測定系によりNESFATIN-1の存在を検討した。さらにこの画分において検出されているペプチドがNESFATIN-1に相当する分子であることを検討するため、視床下部組織抽出物のHPLC画分をウエスタンブロッティング法で解析した。
視床下部組織抽出物のHPLC画分の作製は実施例２１と同様に行い、その画分番号（Fraction #）４３〜４７の画分を凍結乾燥した。凍結乾燥後のサンプルは１００μlのPBSに溶解し、そのうちの20μlを用いて１２％ポリアクリルアミドゲルによるSDS-PAGEを行い、実施例３と同様の方法で抗NESFATIN-1抗体を用いてウエスタンブロッティングを行った。
＜結果＞
図３０のＡはラットの視床下部からのペプチド抽出物をHPLCで分画して得られた画分番号４５のウエスタンブロッティングの像を示している。ウエスタンブロッティングで検出したバンドは約９．７ｋｄの分子量であり、これはリコンビナントで作製したNESFATIN-1ペプチドの分子量とほぼ一致した（実施例１０、図９Ｃ）。図３０のＢはラットの視床下部からのペプチド抽出物をHPLCで分画して得られた画分番号４３〜４７のウエスタンブロッティングの像における９．７ｋｄ付近の分子量における部分の像を示している。９．７ｋｄのバンドは画分番号４５で一番強く認められ、この結果は実施例２１においてラットの視床下部からのペプチド抽出物をHPLCで分画して得られた画分を競合EIA法で定量した際のパターン（図１９Ｂのｂ−１）と一致した。
以上の成績からラットの視床下部にはNESFTATIN-1に相当する分子が存在し、実施例２１の方法で分画して競合EIA法および／またはウエスタンブロッティング法で検出を行うことでNESFATIN-1に相当する分子が検出できることが示された。
実施例３３ ラット視床下部領域における免疫組織化学染色の特異性の検討
実施例４において摂食調節に関連するラット脳の視床下部におけるNEFA発現部位を解析するため、ラットの脳の切片を用いた免疫組織化学的解析を実施した。この染色がNESFATIN特異的なものであるかを検討するため、摂食調節作用が公知であるペプチドと抗体との結合性を考慮して、再度免疫組織化学的解析を実施した。
実施例４と同様の方法でラット脳の弓状核および室傍核をそれぞれ含む組織切片で免疫組織染色を行ったが、一次抗体として抗NAPポリクローナル抗体の代わりに抗NESFATIN-1抗体（NESFATIN-1 IgG：実施例１０）を用いた。また一次抗体を組織標本と反応させる前に、抗NESFATIN-1抗体をNESFATIN-1ペプチド（実施例１０）、および摂食調節作用の知られているLeptin（Rat Leptin：R＆D systems社 598-LP-01M）・αMSH（Melanocyte Stimulating Hormone：株式会社ペプチド研究所 4057-ｖ）・CART（Rat Coaine- and Amphetamine-Regulated Transcript 55-102：株式会社ペプチド研究所 4351-ｓ）・NPY（Human, Rat Neuropeptide Y：株式会社ペプチド研究所 4158-ｖ）の各ペプチドを抗NESFATIN-1抗体１μｇあたりそれぞれ５μg添加して室温で1時間反応させた後、免疫組織化学染色に用いることで抗体の反応の特異性を検証した。
＜結果＞
図３１のＡはラット脳の弓状核を含む組織切片において抗NESFATIN-1抗体で免疫組織化学染色を行った結果および、一次抗体を各種ペプチドと前もって反応させた後に免疫組織化学染色を行った結果を示している。図３１のＡのａ−１はラット脳の弓状核が抗NESFATIN-1抗体で免疫染色されること、またａ−２では抗NESFATIN-1抗体をNESFATIN-1ペプチドと前もって反応させたときにはその染色が消失することから、抗NESFATIN-1抗体は弓状核で発現しているNESFATINを検出していることが示された。それに対して、抗NESFATIN-1抗体をそれぞれLeptin（図３１のＡのａ−３）、αMSH（図３１のＡのａ−４）、CART（図３１のＡのａ−５）、NPY（図３１のＡのａ−６）では弓状核での免疫染色は消失せず、これらのペプチドは抗NESFATIN-1抗体に結合しないことが示され、免疫組織化学染色において該抗体がこれらのペプチドに反応していないことが示された。
図３１のＢはラット脳の室傍核を含む組織切片において抗NESFATIN-1抗体で免疫組織化学染色を行った結果および、一次抗体を各種ペプチドと前もって反応させた後に免疫組織化学染色を行った結果を示している。図３１Ｂのｂ−１はラット脳の弓状核が抗NESFATIN-1抗体で免疫染色されること、またｂ−２では抗NESFATIN-1抗体をNESFATIN-1ペプチドと前もって反応させたときにはその染色が消失することから、抗NESFATIN-1抗体は室傍核で発現しているNESFATINを検出していることが示された。それに対して、抗NESFATIN-1抗体をそれぞれLeptin（図３１のＢのｂ−３）、αMSH（図３１のＢのｂ−４）、CART（図３１のＢのｂ−５）、NPY（図３１のＢのｂ−６）では弓状核での免疫染色は消失せず、これらのペプチドは抗NESFATIN-1抗体に結合しないことが示され、免疫組織化学染色において該抗体がこれらのペプチドに反応していないことが示された。
以上の成績から抗NESFATIN-1抗体を用いた免疫組織化学染色においては特異的にNESFATINの発現を検出しており、ラット脳内で少なくとも視床下部領域の弓状核および室傍核でNESFATINが発現していることが示された。
実施例３４ ラット脳室内へのNESFATIN-1の連続的投与による脂肪組織重量への作用の検討
NESFATIN-1の脂肪組織の量に対する影響を調べるため、ラットの脳室内に持続的にNESFATIN-1を投与して、脂肪組織等の重量の変化を解析した。
NESFATIN-1（一日あたり５ｐmol）または生理食塩水のみ（対照群）をラットの第三脳室内に浸透圧ポンプを用いて10日間連続的に投与した（各群５匹および4匹のラットを使用）。ラットへの浸透圧ポンプによる脳室内投与は実施例１３と同様の方法で行った。
10日間のNESFATIN-1または生理食塩水のみの投与を行った後、各ラットを屠殺して、解剖を行って腹部皮下脂肪組織、精巣上体脂肪組織、腸間膜脂肪組織、後腹膜脂肪組織（以上白色脂肪組織）、肩甲骨間の褐色脂肪組織を総て切り出して重量を測定した。また両側の後肢の腓腹筋も採取して、重量を測定した。測定した組織重量からは各個体の体重との比を求めた（組織重量／体重 mg／ｇ）。なお、有意差検定にはanalysis of varianceを用いた。
＜結果＞
図３２は10日間のNESFATIN-1または生理食塩水のみの投与を行ったラットから取得した各脂肪組織（Ａ〜Ｅ）および腓腹筋（Ｆ）の重量と体重との重量比を求めた結果のグラフである。腹部皮下脂肪組織（図３２のＡ）、精巣上体脂肪組織（図３２のＢ）、腸間膜脂肪組織（図３２のＣ）においては生理食塩水のみを投与した対照群に比較して、NESFATIN-1を投与した群においては有意に体重あたりの組織重量比の低下が認められた。また後腹膜脂肪組織（図３２のＤ）においては対照群に比較してNESFATIN-1投与群では体重あたりの組織重量比が低下する傾向が見られたものの、有意な差は認められなかった。さらに褐色脂肪組織（図３２のＥ）および腓腹筋（図３２のＦ）においては対照群とNESFATIN-1投与群の間で体重あたりの組織重量比の有意な差は認められなかった。
以上の成績から、NESFATIN-1は白色脂肪組織の体重あたりの組織重量比、すなわち体脂肪率を低下させる効果があることが示された。また褐色脂肪組織や筋組織に対してはその体重あたりの組織重量比には影響しないことも示された。
実施例３５ マウス腹腔内へのNESFATIN-1投与による血液生化学パラメーターへの影響の検討
NESFATIN-1で示された摂食抑制活性、体重増加抑制活性、脂肪組織量低下活性が血糖（血中グルコース値）や脂質関連パラメーター（コレステロール値、トリグリセロライド値）の変動を伴うかについて検討を行った。
実験動物は７週齢の雄のC57BL/6J系マウスを日本クレア（株）より購入し、購入後午前6時から午後6時までの12時間を明期、午後6時から翌朝午前6時を12時間の暗期の周期で、ペレット飼料（日本クレア社 CE−2）を自由摂食させ、２２℃において飼育した。
C57BL/6Jマウスの腹腔内に実施例１６で作製したリコンビナントのマウスNESFATIN-1を１００μlの生理食塩水１０ｎｍｏｌの量を含む形で溶解したものを用い、コントロールの試料としては生理食塩水（Saline）のみを用いた。試料は２６Gの注射針を付けたツベルクリン注射筒で各マウス（各群５匹）の腹腔に１００μｌずつ単回投与し、投与の時間は暗期に入る直前（午後６時）に行った。
投与を行った各マウスは個別ケージに入れ、投与後０〜３時間の間で減少したペレット飼料の重量を測定することで摂食量を測定した。また投与後３時間後に各マウスを断頭屠殺して全血採血を行い、血清を分取した。その血清についてグルコース含量、総コレステロール含量、トリグリセライド含量を市販の測定試薬を用いて測定した（協和メディックス デミタナ−L GLUII、デミタナ−L TCII、デミタナ−L TGII）。
なお、有意差検定にはanalysis of varianceを用いた。
＜結果＞
図３３はマウス腹腔内にNESFATIN-1または生理食塩水のみを投与したときの摂餌量、血中グルコース含量、総コレステロール含量、トリグリセライド含量の測定結果を示したグラフである。
NESFATIN-1の投与によって摂食量は対照群と比較して有意に低下していた。それに対して血糖値を表す血中グルコース含量（図中グルコース）、また脂質関連パラメーターである総コレステロール含量（図中コレステロール）、トリグリセライド含量（図中トリグリセリド）においてはNESFATIN-1投与群では対照群とほとんど差が見られなかった。
以上の成績より、NESFATIN-1の作用は血糖値や血中の脂質関連パラメーターの変動を起こさずに摂食抑制活性、体重増加抑制活性、脂肪組織量低下活性を示すものと考えられる。
本発明によれば、ＰＰＡＲγアゴニストを用いることにより、摂食および体重調節に関与する因子を取得することができる。また、NESFATIN、NESFATIN-1および/またはNESFATIN-1M30を用いることにより、肥満または肥満症、神経性過食症などの代謝・摂食障害に係る疾患、２型糖尿病、耐糖能異常、高血圧、高脂血症、高尿酸血症、脂肪肝、心臓疾患、脳血管疾患、睡眠時無呼吸症候群、変形性関節症などの整形外科的疾患、月経異常、悪性腫瘍などの肥満症に関連する疾患を予防または治療することができる。さらに、抗体などのNESFATIN、NESFATIN-1またはNESFATIN-1M30の活性を抑制する物質を用いることにより、手術後および／または癌の患者における食欲不振や拒食症などの栄養・摂食障害に係る疾患を予防または治療することができる。
図１は、ヒト脳髄芽細胞腫株細胞HBT185細胞およびSQ-5細胞において、トログリタゾンによってNEFA遺伝子の発現が誘導されること、前駆脂肪細胞に分化させた３T3-L1細胞においてNEFA遺伝子が定常的に発現していることを示す、NEFAプローブを用いたNorthernブロティング像である。 図２のＡは、NEFA遺伝子がコードするポリペプチドのドメイン構造の模式図と抗NESFATIN抗体作製に用いたNAPペプチドの配列を示す図である。また、図２のＢは、ラットの脳抽出物にNEFA遺伝子がコードするポリペプチドが存在することを示す、NAPペプチドで作製したポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロティング像である。 図３は、ラット脳の視床下部において、摂食調節に関与する部位である弓状核（Arc）、室傍核（PVN）、視床上核（SON）および外側野（LH）においてNEFA遺伝子が発現していることを示す、NAPペプチドに対するポリクローナル抗体を用いた免疫組織染色像である。 図４のＡは、GSTとマウス成熟型NESFATINを結合した形であるGST-NEFAの発現と精製の過程を示す、NAPペプチドに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロティング像である。図４のＡにおいて、レーン１〜４は、それぞれ、レインボーマーカー、Preinduced bacteria、Post-sonicated pellet、および精製ＧＳＴＮＡＰを示す。また、図４のＢはGST-NEFAをThrombinで切断して精製を行った過程を示す、抗NESFATIN抗体を用いたウエスタンブロティング像である。図４のＢにおいて、レーン１はマーカー、レーン２は精製前サンプル、レーン３〜６は洗浄サンプル、レーン７は精製サンプルを示す。 図５は、ラット第３脳室内にリコンビナントNESFATINを投与することによって、ラットの摂食行動が抑制されることを示したグラフである。図５において＊および＊＊は、それぞれ、対象群に対する有意差Ｐ＜０．０５、およびＰ＜０．０１を示す。 図６は、ラット第３脳室内に抗NESFATIN抗体を投与することによって、ラットの摂食行動が亢進されることを示したグラフである。図６において＊は、Control IgGに対する有意差Ｐ＜０．００１を示す。 図７は、ラット視床下部でのNESFATIN遺伝子の発現が絶食をさせることで低下すること、また再度摂食をさせることで発現が回復することを示す、脳組織でのin situハイブリダイゼーション像である。図７においてＡは対象群、Ｂは絶食群、Ｃは再摂食群を示し、上段は１００倍像、下段は４００倍像を示す。 図８は、ラット視床下部でのNESFATINの発現が絶食をさせることで低下することを示す、抗NESFATIN抗体を用いた免疫組織染色像である図８において、Ａは対象群、Ｂは絶食群を示す。また、絶食時におけるNESFATINの発現低下が食欲亢進によるものであることを示す、抗C-Fos抗体を用いた免疫組織染色像である（Ｃ）。図８において上段は室傍核（ＰＶＮ）、下段は弓状核（Ａｒｃ）を示す。 図９Ａは、ヒト、マウスおよびラットのNESFATINのアミノ酸配列と、Prohormone Convertaseによる推定切断部位を示す図である。下向き黒三角は、予想されるProhormone Convertaseによる切断部位を示す。 図９Ｂは、Prohormone Convertaseによって生じると考えられるNesfatin-1、Nesfatin-2、Nesfatin-3、Nesfatin-2/3、ならびにNesfatin-1、Nesfatin-2/3およびNesfatin-3に対する抗体を作製するためのペプチドのNESFATINにおける位置を示した模式図である。 図９Ｃは、Nesfatin-1およびNesfatin-3に対する抗体が、目的の抗原と結合することを示している、ウエスタンブロッティングの図である。図９Ｃにおいて左図は、NESFATIN-1ペプチドを泳動してNesfatin-1 IgGでウエスタンブロティングをおこなった結果を、右図はNESFATIN-3ペプチドを泳動してNesfatinC2 IgGでウエスタンブロティングを行った結果を示す。 図１０は、ラット脳内においてNESFATIN-1とProhormone Convertase（PC-1/3もしくはPC-2）を同時に発現している細胞の存在を示す、抗NESFATIN-1抗体および抗PC-1/3抗体または抗PC-2抗体を用いた二重免疫組織染色像である。図１０のＡの丸１および丸２は、ラットの視床下部組織における免疫組織化学像におけるNesfatin-1 IgGによる染色像を、図１０のＢの丸１はPC-1/3による蛍光像を、図１０のＢの丸２はPC-2による蛍光像を示す。 図１１は、ラット第３脳室内にNESFATIN-1を投与することでラットの摂食行動が抑制されるが、NESFATIN-2またはNESFATIN-3を投与しても摂食行動に変化が見られないことを示すグラフである。 図１２は、ラットの第3脳室内に連続的にNESFATIN-1を投与することによって、持続的に摂食行動が抑制されること（A）、および持続的に体重増加が抑制されること（B）を示すグラフである。 図１３Ａは、ラットの脳室内にNESFATIN-1に対する抗体を投与することによってラットの食欲が亢進することを示すグラフである。図１３Ａにおいて、＊および＊＊は、それぞれ、Control IgG投与群に対する有意差Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．００１を示す。 図１３Ｂは、NESFATINに対してNESFATINからNESFATIN-1が切り出されない変異体をラット脳室内に投与したときには摂食の亢進が起こらないことを示したグラフである。 図１４は、ラットの脳室内に連続的にNESFATINに対するアンチセンスRNAを投与することで、摂食行動が抑制されること（A）および体重増加が抑制されること（B）を示すグラフである。図１４において、＊および＊＊は、それぞれ、ミスセンスに対する有意差Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．０１を示す。 図１５は、Ｌｅａｎおよびレプチン抵抗性の肥満モデル動物であるＺｕｃｋｅｒラットの脳室内にＮＥＳＦＡＴＩＮ−１を投与したことによる摂食量の測定結果を示したグラフである。ＺｕｃｋｅｒラットにおいてはＬｅａｎ（正常動物）と同様に、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１の脳室内投与によって摂食の抑制の効果が認められる。図１５において、＊および＊＊は、それぞれ、生理食塩水投与群に対する有意差Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．００１を示す。白色ボックスおよびハッチングしたボックスは、それぞれ、生理食塩水およびＮＥＳＦＡＴＩＮ−１投与群を示す。 図１６は、マウスの腹腔内にＮＥＳＦＡＴＩＮ−１を投与したときの摂食量への影響を示したグラフである。マウスにおいて腹腔内への投与においても、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１の摂食抑制活性が認められることを示している（A）。また肥満モデルマウスであるAgouti-yellowマウスとその対象マウスの腹腔内にNESFATIN-1を投与した場合の結果のグラフを表している。対象マウス（B）においてもAgouti-yellowマウス（C）においてもNESFATIN-1の腹腔投与は同様な効果があることを示している。 図１７は、マウスの腹腔内および皮下へのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１の投与による摂食量への影響を示したグラフである。ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１は腹腔内投与（ｉｐ）でも皮下投与（ｓｃ）でも摂食抑制効果が認められるが、皮下投与の方が効果が遅れて発現する傾向が認められた。図１７において、＊および＊＊は、それぞれ、生理食塩水投与群に対する有意差Ｐ＜０．０５およびＰ＜０．００５を示す。 図１８Ａは、マウスの腹腔内へのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｎ２３、NESFATIN-1M30、ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１Ｃ２９の投与による摂食量への影響を示したグラフである。ＮＥＳＦＡＴＩＮ−１の部分ペプチドのうち、NESFATIN-1M30のみが摂食抑制効果を示すことが認められた。図１８Ａにおいて、＊は、生理食塩水投与群に対する有意差Ｐ＜０．０２を示す。 図１８Ｂは、ヒト、マウスおよびラットのNESFATIN-1のアミノ酸アライメントの結果とNESFATIN-1N23、NESFATIN-1M30およびNESFATIN-1C29の部位を示した図である。NESFATIN-1M30の部位は種間でアミノ酸配列が高く保存されていることが示された。 図１９A-1は、NESFATINまたはNESFATIN-1の試料中の濃度を測定する競合EIA系での標準曲線を表すグラフ（A-1）および髄液での測定結果を表す表（A-2）である。検量曲線の式：Y=D+(A-D)/1+(Log(X)/C^B)。Plot#1（標準値：濃度値ＶＳ測定値）。A=8.4672E-001; B=4.3850E+000; C=3.5938E+000; D=-2.8957E-001; R^2=0.9998。 図１９A-2は、NESFATINまたはNESFATIN-1の試料中の濃度を測定する競合EIA系での標準曲線を表すグラフ（A-1）および髄液での測定結果を表す表（A-2）である。 図１９Ｂは、視床下部組織および髄液から抽出したペプチドサンプルをHPLCで分画して、その画分のNESFATIN-1を競合EIA系で測定した結果を表すグラフである（b-１およびb-2）。 図２０は、マウス腹腔内へのNESFATIN-1M30の部分ペプチドの投与による摂食量への影響を示したグラフである。NESFATIN-1M16（M16）、NESFATIN-1M10M（M10M）またはNESFATIN-M14（M14）を投与した総ての場合において、摂食抑制効果が認められた。図２０において、＊および＊＊は、それぞれ、生理食塩水投与群に対する有意差Ｐ＜０．０２およびＰ＜０．００２を示す。 図２１Ａは、マウス腹腔内へのヒトNESFATIN-1M30およびマウスNUCB1-M30の摂食調節への影響を示したグラフである。マウスNESFATIN-1M30（Mouse／NESFATIN-1M30）と同様にヒトNESFATIN-1M30（human／NESFATIN-1M30）およびマウスNUCB1-M30（Mouse NUCB1）でも摂食抑制効果があることを示している。図２０において、＊は、生理食塩水投与群に対する有意差Ｐ＜０．０２を示す。 図２１Ｂは、ヒト・ラット・マウスのNESFATINおよびヒト・ラット・マウスのNUCB1のアミノ酸配列のアライメントの結果とNESFATIN-1に相当する部位およびNESFATIN-1M30に相当する部位を示している図である。各種におけるNESFSATINおよびNUCB2のNESFASTIN-1に相当する部位、特にNESFATIN-1M30に相当する部位において、アミノ酸配列の保存性が高いことが示されている。 図２１Ｃは、ヒト・ラット・マウスのNESFATINおよびヒト・ラット・マウスのNUCB1のアミノ酸配列のアライメントの結果とNESFATIN-1に相当する部位およびNESFATIN-1M30に相当する部位を示している図であり、図２１Ｂの続きを表す。 図２２は、各組織におけるＮＥＦＡプローブを用いたin situハイブリダイゼーションの像を示している。図２２のＡは室傍核（PVN）と視床上核（SON）を含む組織切片、図２２のＢは不確帯（Zi）と弓状核（Arc）を含む組織切片、図２２のＣは視床外側野（LHA）を含む組織切片を示す。 図２３のＡは、ラット第３脳室内にリコンビナントNESFATINを投与することによって、ラットの摂餌量が抑制されることを示すグラフである。図２３のＢは、ラット第三脳室内への５ｐｍｏｌのＮＥＳＦＡＴＩＮ投与群（ハッチングしたボックス）と対象群（０ｐｍｏｌのＮＥＳＦＡＴＩＮ、白色ボックス）の、０〜１時間、１〜３時間、３〜６時間および６〜１２時間の摂餌量を示す図である。図２３のＡにおいて、＊は０ｐｍｏｌに対する優位差ｐ＜０．０１を示し、図２３のＢにおいて、＊は０ｐｍｏｌに対する優位差ｐ＜０．０５を、＊＊は優位差ｐ＜０．０１を示す。 図２４のＡは、自由摂食群（対照群）と絶食群のラットにおける脳視床下部領域における弓状核（Arc）・室傍核（PVN）・外側野（LHA）および視床上核（SON）の各部位でのNESFATIN ｍRNA発現をin situハイブリダイゼーション法による画像解析で定量した結果を示す。図２４のＢは、自由摂食群（対照群：白色ボックス）と絶食群（ハッチングしたボックス）のラットにおける脳視床下部領域のうち室傍核におけるNESFATIN-1ペプチドの発現を競合EIA法による画像解析で定量した結果を示している。 図２５は、ラット第三脳室内への５ｐｍｏｌのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１投与群（ハッチングしたボックス）と対象群（０ｐｍｏｌのＮＥＳＦＡＴＩＮ−１、白色ボックス）の、０〜１時間、１〜３時間、３〜６時間および６〜１２時間の摂餌量を示す図である。＊は、０ｐｍｏｌに対する優位差ｐ＜０．０１を示す。 図２６は、左から、ラットの脳室内に、生理食塩水のみを投与した対象群（NESFATIN-1 IgG／NESFATIN-1／Leptin：−／−／−）、NESFATIN-1のみを投与した群（NESFATIN-1 IgG／NESFATIN-1／Leptin：−／＋／−）、NESFATIN-1と抗NESFATIN-1抗体を投与した群（NESFATIN-1 IgG／NESFATIN-1／Leptin：＋／＋／−）、Leptinを投与した群（NESFATIN-1 IgG／NESFATIN-1／Leptin：−／−／＋）、Leptinと抗NESFATIN-1抗体を投与した群（NESFATIN-1 IgG／NESFATIN-1／Leptin：＋／−／＋）の投与後１時間の摂餌量を表したグラフである。＊は、対象群に対する優位差ｐ＜０．０１を示す。 図２７のＡは、ラットの脳からのタンパク質抽出液を用いて抗NESFATIN-1抗体でウエスタンブロティングを行った像を示している。図２７のＢは抗NESFATIN-1抗体と各種ペプチドを前もって反応させた後にウエスタンブロティングを行ったときの４７．５ｋｄ付近のバンド付近の像を示している。図２７のＢにおいて、抗NESFATIN-1抗体と反応させたペプチドの種類は、図２７のＢ上段においては、左から、ペプチドなし、NAP1-Abペプチド（cognate peptide）、Leptin、αＭＳＨ、ＣＡＲＴを示し、図２７のＢ下段においては、左から、ペプチドなし、NAP1-Abペプチド（cognate peptide）、ＮＰＹ、ＭＣＨ、Ｏｒｅｘｉｎ−Ａを示す。 図２８のＡは、延髄を含む脳組織でのＮＡＰペプチド抗体を用いた免疫組織化学染色の像を示している。図２８のＢは、NAPペプチドに対する抗体をNAPペプチド（cognate peptide）と前もって反応させてから免疫組織染色を行った像を示している。 図２９のＡは、正常ラット（Lean）とZucker fa/faラット（Zucker）に、トログリタゾンを含む飼料を摂餌させた群（TGZ：＋）と含まない飼料を摂餌させた群（TGZ：−）における体重を表したグラフである。図２９のＢは、正常ラット（Lean）とZucker fa/faラット（Zucker）に、トログリタゾンを含む飼料を摂餌させた群（TGZ：＋）と含まない飼料を摂餌させた群（TGZ：−）における血中のレプチン濃度を表したグラフである。図２９のＣは、正常ラット（Lean）とZucker fa/faラット（Zucker）に、トログリタゾンを含む飼料を摂餌させた群（TGZ：＋）と含まない飼料を摂餌させた群（TGZ：−）における脳内のNesfatin濃度を表したグラフである。図２９において、＊および＊＊は、それぞれ、正常ラット（Lean）においてトログリタゾンを含まない飼料を摂餌させた群（TGZ：−）に対する有意差ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１を示し、図２９において、＃および＃＃は、それぞれ、Zucker fa/faラット（Zucker）においてトログリタゾンを含まない飼料を摂餌させた群（TGZ：−）に対する有意差ｐ＜０．０５およびｐ＜０．０１を示す。 図３０のＡは、ラットの視床下部からのペプチド抽出物をHPLCで分画して得られた画分番号４５のウエスタンブロッティングの像を示している。図３０のＢは、ラットの視床下部からのペプチド抽出物をHPLCで分画して得られた画分番号４３〜４７のウエスタンブロッティングの像における９．７ｋｄ付近の分子量における部分の像を示している。 図３１のＡは、ラット脳の弓状核を含む組織切片において抗NESFATIN-1抗体で免疫組織化学染色を行った結果、および抗NESFATIN-1抗体を各種ペプチドと前もって反応させた後に免疫組織化学染色を行った結果を示している。図３１のＡにおいて、ａ−１は抗NESFATIN-1抗体での免疫染色像、ａ−２〜ａ−６は、それぞれ、抗NESFATIN-1抗体をNESFATIN-1ペプチド（ａ−２）、Leptin（ａ−３）、αMSH（ａ−４）、CART（ａ−５）、NPY（ａ−６）と前もって反応させたときの免疫染色像を示している。 図３１のＢは、ラット脳の室傍核を含む組織切片において抗NESFATIN-1抗体で免疫組織化学染色を行った結果、および抗NESFATIN-1抗体を各種ペプチドと前もって反応させた後に免疫組織化学染色を行った結果を示している。Ｂにおいて、ｂ−１は抗NESFATIN-1抗体での免疫染色像、ｂ−２〜ｂ−６は、それぞれ、抗NESFATIN-1抗体をNESFATIN-1ペプチド（ｂ−２）、Leptin（ｂ−３）、αMSH（ｂ−４）、CART（ｂ−５）、NPY（ｂ−６）と前もって反応させたときの免疫染色像を示している。 図３２は、10日間のNESFATIN-1または生理食塩水のみの投与を行ったラットから取得した腹部皮下脂肪組織（Ａ）、精巣上体脂肪組織（Ｂ）、腸管膜脂肪組織（Ｃ）、後腹膜脂肪組織（Ｄ）、褐色脂肪組織（Ｅ）および腓腹筋（Ｆ）の組織重量の、各個体重量との比（組織重量／体重 ｍｇ／ｇ）を表した結果のグラフである。図３２において、＊および＊＊は、それぞれ、生理食塩水投与群に対する有意差ｐ＜０．０５およびｐ＜０．００５を示す。 図３３は、マウス腹腔内にNESFATIN-1または生理食塩水のみを投与したときの摂食量、血中グルコース含量、総コレステロール含量、トリグリセライド含量の測定結果を示したグラフである。図３３において白色ボックスおよびハッチングしたボックスは、それぞれ、生理食塩水およびＮｅｓｆａｔｉｎ−１投与群を示す。

Claims (27)

  1. 配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、または１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  2. 配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上のホモロジーをもつアミノ酸配列から成る、摂食抑制および／もしくは体重増加抑制活性を有するポリペプチド。
  3. 前記体重増加抑制活性が、体脂肪増加抑制活性である、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドをコードする核酸分子。
  5. 配列番号１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、または１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列からなる核酸分子。
  6. 請求項４または５に記載の核酸分子を含むベクター。
  7. 請求項４または５に記載の核酸分子を含む形質転換体。
  8. 有効成分として、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項６に記載のベクター、または請求項７に記載の形質転換体を含有する、摂食抑制および／または体重増加抑制のための医薬組成物。
  9. 前記体重増加抑制が、体脂肪増加抑制である、請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 配列番号１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、または１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体。
  11. 請求項４または５に記載の核酸分子が導入されたトランスジェニック非ヒト生物。
  12. 前記トランスジェニック非ヒト生物が、摂食抑制状態または体重増加抑制状態を示すトランスジェニック非ヒト動物である、請求項１１に記載のトランスジェニック非ヒト動物。
  13. 請求項１０に記載の抗体が導入され、食欲または体重増加が亢進しているトランスジェニック非ヒト動物。
  14. 請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチドの製造方法。
  15. 摂食亢進または体重増加の状態を予測または診断するための検定方法であって、
    哺乳類動物の生体試料中の、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子；または配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの含有量を検出する工程を含む方法。
  16. 請求項１５に記載の検定方法に用いられる、摂食亢進または体重増加の状態を予測または診断するための検定キットであって、
    配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子を検出するためのＰＣＲプライマー、プローブもしくはＤＮＡチップ；または配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列からなるポリペプチドと特異的に結合する抗体、標準ペプチドまたは結合競合反応用ペプチド修飾体のうち少なくとも１つを含む、検定キット。
  17. 試験物質が接触された哺乳類細胞における、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現量の増加、または該細胞内に含まれるもしくは細胞外に分泌される配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量の増加を検出する工程
    を含む、摂食抑制および／または体重増加抑制の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
  18. 試験物質が投与された哺乳動物由来の生体試料における、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現の亢進を、または配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの産生亢進を検出する工程
    を含む、摂食抑制および／または体重増加抑制の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
  19. 請求項１３に記載の非ヒト動物、または配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の全領域もしくは一部を欠損させたノックアウト非ヒト動物に試験物質を投与する工程、および
    該非ヒト動物における摂食の抑制または体重増加の抑制を検出する工程
    を含む、摂食抑制および／または体重増加抑制の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
  20. 試験物質が接触された哺乳類細胞における、配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現量の減少を、または該細胞内に含まれるもしくは細胞外に分泌される配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの量の減少を検出する工程
    を含む、摂食亢進および／または体重増加亢進の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
  21. 試験物質が投与された哺乳動物由来の生体試料における配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む遺伝子の発現抑制を、または配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチドの産生抑制を検出する工程
    を含む、摂食亢進および／または体重増加亢進の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
  22. 請求項１１または１２に記載の非ヒト動物に試験物質を投与する工程、および
    該非ヒト動物における摂食の亢進または体重増加の亢進を検出する工程
    を含む、摂食亢進および／または体重増加亢進の効果を有する治療剤または予防剤のスクリーニング方法。
  23. 有効成分として、配列番号３、６、９、１３〜１５、３９〜４１、６５〜７３、１０１〜１０３、もしくは１０７〜１１５のいずれかに示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、または配列番号１０〜１２、１８〜２０、４４〜４６、７４〜８２、１０４〜１０６、もしくは１１６〜１２４のいずれかに示される塩基配列を含む核酸分子を含むベクターもしくは形質転換体を含有する、摂食抑制および／または体重増加抑制のための医薬組成物。
  24. 前記アミノ酸配列が、配列番号１３〜１５のいずれかに示される、請求項１に記載のポリペプチド。
  25. 配列番号１３〜１５のいずれかに示されるアミノ酸配列と少なくとも８５％以上のホモロジーをもつアミノ酸配列から成る、請求項２に記載のポリペプチド。
  26. 配列番号３９〜４１または６５〜７３のいずれかに示されるアミノ酸配列から成る、請求項２４に記載のポリペプチドの部分ペプチド。
  27. Ｎ末端がピログルタミン酸、アセチル基、ホルミル基もしくは蛍光物質で化学的に修飾されているか、またはＣ末端がアミド基もしくは蛍光物質で化学的に修飾されている、請求項２４〜２６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
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