KR20080028888A - 신규 생리 물질 ｎｅｓｆａｔｉｎ과 그 관련 물질, 및그들의 용도 - Google Patents

신규 생리 물질 ｎｅｓｆａｔｉｎ과 그 관련 물질, 및그들의 용도 Download PDF

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KR20080028888A
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마사토모 모리
히로유키 시미즈
히로시 에구치
마사노리 야마모토
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데이진 화-마 가부시키가이샤
고쿠리츠다이가쿠호진 군마다이가쿠
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Abstract

본 발명은, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관여하는 인자의 신규 취득 방법, 및 그 방법에 의해 얻어지는 유전자, 그 유전자가 코드하는 폴리펩티드, 또는 그 유전자가 코드하는 폴리펩티드의 정보로부터 얻어진 신규 폴리펩티드를, 섭식 장해 및/또는 체중 조절에 관련되는 질환의 치료·제어·진단의 수단으로서 제공하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 그 유전자 또는 폴리펩티드의 작용을 저해하는 물질을, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관련되는 질환의 치료·제어·진단의 수단으로서 제공하는 것에 관한 것이기도 하다. PPARγ 애고니스트 활성을 갖는 티아졸리딘디온류를 사용함으로써, 섭식 억제 및/또는 체중 감소에 관여하는 유전자 및 폴리펩티드를 취득할 수 있다. 그 방법에 의해 얻어진 NESFATIN 등은, 섭식 장해 및/또는 체중 조절에 관련되는 질환의 치료·제어·진단의 수단으로서 사용할 수 있다.

Description

신규 생리 물질 ＮＥＳＦＡＴＩＮ과 그 관련 물질, 및 그들의 용도{NOVEL PHYSIOLOGICAL SUBSTANCE NESFATIN, SUBSTANCE RELEVANT THERETO, AND USE OF THE SUBSTANCES}
본 발명은, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관여하는 인자의 신규 취득 방법에 관한 것이다. 또, 본 발명은, 그 방법에 의해 얻어지는 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관여하는 폴리펩티드, 그 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자, 그리고 그들을 사용하는 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제에 관련되는 질환의 치료·예방·진단의 수단에 관한 것이다. 또한, 그 폴리펩티드 또는 유전자의 작용을 저해하는 물질을 사용하는, 식욕 항진 및/또는 체중 증가 항진에 관련되는 질환의 치료·예방·진단의 수단에 관한 것이다. 또한, 본 발명은, 그 폴리펩티드, 그 유전자, 또는 그들 활성을 저해하는 물질에 의해 얻어지는 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관련되는 질환의 모델 동물, 그리고 이들을 이용하는 그 폴리펩티드의 작용 또는 발현을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 또, 그 스크리닝 방법에 의해 선별되는 화합물, 및 그 화합물을 이용하는 질병의 진단 수단, 치료약에 관한 것이다.
비만이란 체중 특히 백색 지방 조직이 과잉에 있는 상태이고, 일반적으로 Body Mass Index (BMI) 가 ≥25㎏/㎡ 인 것에 의해 분류되고, 또 체지방률에서는 성인 남성에서 25% 이상·성인 여성에서 30% 이상인 것으로도 분류된다. 고지방식을 중심으로 한 식생활이나 운동 부족은 현대에 있어서, 비만으로 분류되는 사람의 비율은 증가 경향에 있다. 2000 년의 후생 노동성에 의한 국민 영양 조사의 결과에서는, 남성에 있어서는 이 10 년 및 20 년의 비교에서 비만으로 분류되는 사람은 확실히 증가되어 있고, 40 세부터 69 세에 있어서는 약 30% 의 사람이 비만으로 분류된다. 또한 여성에 있어서도 60 세부터 69 세에 있어서의 약 30% 가 비만으로 분류된다.
과거에는 비만을 미용상의 문제라고 생각하는 경향이 있었지만, 현재에는 비만 그 자체보다 그것에 수반되는 (수반될 수 있는) 건강 장해가 임상 상의 큰 문제점이며, 비만의 예방이나 치료의 의학적 근거가 되고 있다. 그와 같은 상황을 받아들여, 일본 비만 학회에서는, 비만증을 「비만에서 기인 내지 관련되는 건강 장해를 합병하거나, 임상적으로 그 합병이 예측되는 경우, 의학적으로 감량을 필요로 하는 병태」 로 정의하고, 질환으로서 다루는 것을 제창하고 있다. 여기에서 말하는 건강 장해에는, 2 형 당뇨병이나 내당능 이상 외에, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심·뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 변형성 관절증 등의 정형외과적 질환, 월경 이상 등이 포함된다 (마쯔자와 유지 일본 임상 주식회사 일본 임상사 발행 2003 년 7 월 28 일 61 권 증간호 6 「비만증」 p5-8). 또 비만에서 기인하는 질환으로는 악성 종양을 들 수 있고, 특히 유방암, 자궁암, 결장암, 신장암, 식도암, 췌장암, 간장암, 담낭암의 발증에 관해서 비만이 리스크 팩터 가 되는 것이 보고되어 있다 (마쯔자와 유지 일본 임상 주식회사 일본 임상사 발행 2003 년 7 월 28 일 61 권 증간호 6 「비만증」 p5-8 ; Abu-Abid 등 Journal of medicine (USA) 2002 년 1 월 1 일 33 권 1-4 호 p73-86 ; 및 Nair 등 Hepatology (USA) 2002 년 7 월 1 일 36 권 1 호 p150-155). 또한, 최근 메타볼릭 신드롬으로 불리는 동맥 경화성 질환 (심근경색·뇌경색 등) 의 위험성을 높이는 복합형 리스크 증후군이 제창되어 있고, 일본에서의 뇌혈관 장해·심혈관 장해는 전체 사망률의 30% 를 차지하는 점에서도 주목받고 있다. 그 때문에, 일본 비만 학회·일본 동맥 경화 학회·일본 당뇨병 학회·일본 고혈압 학회·일본 순환기 학회·일본 신장 학회·일본 혈전 지혈 학회·일본 내과 학회는 합동으로 그 진단 기준을 정리하여, 2005 년 4 월 8 일의 일본 내과 학회에서의 기자 회견에서 그 기준을 공표하였다. 그것에 의하면, 내장 비만 (내장 지방 축적) 을 리스크의 중심에 놓고, 웨이스트의 주위 직경이 남성에서는 85㎝ 이상, 여성에서는 90㎝ 이상인 것에 추가하여, 혈청 지질 이상 (트리글리세리드값이 150㎎/dL 이상, HDL 콜레스테롤값이 40㎎/dL 미만의 어느 하나 또는 양방), 혈압고값 (수축기 혈압이 130mmHg 이상, 확장기 혈압이 85mmHg 의 어느 하나 또는 양방), 고혈당 (공복시 혈당값이 110㎎/dL 이상) 중의 2 개 이상의 리스크를 갖는 경우를 메타볼릭 신드롬이라고 진단하게 되었다 (일본 내과 학회 잡지 메타볼릭 신드롬 진단 기준 검토 위원회 2005 년 4 월호 94 권 p794-809). 이 기준을 사용한 경우, 검진을 받은 290 명의 성인 남자 중, 비만증이라고 진단된 사람이 61 명 (21%) 이었던 것에 대하여, 메타볼릭 신드롬이라고 진단된 사람은 27 명 (9%) 이고, 비만증에 포함되지 않고 메타볼릭 신드롬이라고 진단된 사람도 9 명 (3%) 존재했다는 보고도 있다 (의학의 발자취 타카하시 카즈오, 사이토 야스시 2005 년 213 권 6 호 p549-554).
비만은 기본적으로는 섭취하는 에너지 (칼로리) 의 양이 소비되는 에너지 (칼로리) 의 양을 지속적으로 웃도는 것이 원인이라고 생각되므로, 비만 또는 비만증인 사람에 대해서는 체중 특히 체지방률을 낮추기 위해, 식사 요법이나 운동 요법 등을 실시하는 것이 추장되고 있다. 그러나, 그들 요법의 계속에 대해서는 식욕의 증진·생활 습관의 변화에 대한 적응·운동 부하에 대한 많은 스트레스가 가해져 그것을 계속하는 것은 많은 곤란을 극복할 필요가 있다. 또한, 식사 요법에 있어서 섭취 칼로리를 저하시킨 경우에는, 장관으로부터의 영양 흡수율의 증대나 신체의 에너지 대사가 저하된다는 현상이 보이는 이른바 리바운드 현상이 일어나 식사 요법을 계속하는 것을 단념하는 경우도 볼 수 있다. 비만증의 내과적 치료에는 중추성 식욕 억제약·열대사 촉진약·소화 흡수 저해약·지방 합성 저해약 등이 존재하는데, 현재 일본에서 보험 진료로 사용 가능한 약제는 중추성 식욕 억제제로 분류되는 마진돌뿐이다. 또한, 마진돌은 각성제와 유사한 화합물로서, 흥분, 초조함, 심혈관계에 대한 부하, 배뇨 곤란, 그 밖의 부작용이 있고, 사용이 3 개월 이내로 한정되어 있는 점 등에서 사용하기 쉬운 약제라고는 할 수 없다 (노발티스파마사 「사노렉스정 0.5㎎」 첨부 문서).
비만에 대하여 과도한 체중 저하 (이른바 「여윔」) 나 섭식의 저하 (이른바 「식욕 부진」) 는, 생체 방어 (면역) 반응의 저하에 따른 감염 용이, 조혈계 장해, 무월경 또는 월경 불순, 불임증, 정신적 장해, 말초 신경 마비, 저혈압, 골다 공증 등을 야기하는 원인으로서 문제가 된다. 일반적으로 BMI 가 <18.5Kg/㎡ 인 경우, 또는 체지방률이 남성에서는 10% 이하, 여성에서는 15% 이하인 경우를 여윔으로 분류한다. 2000 년의 후생 노동성에 의한 국민 영양 조사에서는, 여성에서는 BMI<18.5Kg/㎡ 인 사람의 비율은 20 세 내지 39 세에서 이 10 년 및 20 년 동안 확실히 증가되어 있고, 20∼29 세인 사람에 있어서는 약 24% 가 「여윔」 으로 분류된다. 이것은 젊은 여성에 있어서 체형을 신경쓰기 위한 의도적인 섭식량의 조절에 의한 가능성도 있다. 그러나, 이 년대층에서 다발하는 중추성 섭식 이상증 중의 신경성 식욕 부진증 (거식증) 등에 있어서는 식욕 자체가 극도로 저하되고, 영양 상태가 악화되어 전신 쇠약으로 사망하는 경우도 있다. 또한, 종래 위하수·위아토니·신경성 위염으로 알려져 있던 개념을 포함하는 식욕이 저하되는 질환으로서, Functional dyspepsia 로 불리는 질환이 있고, 이 질환은, 식후 조기의 만복감, 식욕 저하 등의 증상을 나타낸다고 알려져 있다 (Talley 등 Gut (England) 1999 년 45 권 Suppl 2 : p1137-1142). 또한, 식욕 부진을 일으키는 원인으로는 암, 염증성 질환, 하수체·갑상선·부신 등의 기능 저하, 수술 후, 과도한 스트레스 등을 들 수 있고, 이러한 상태에서 장기간 식욕 부진이 지속되는 것은 신체의 쇠약을 야기한다.
이러한 상황에 있어서, 최근 섭식을 조절하는 생체내 인자의 연구가 활발히 행해지고 있고, 렙틴·아디포넥틴·그레린 등의 인자와 섭식 조절의 관련에 대해서도 연구되고 있다. 그러나 현재의 상황에서는 어떠한 인자가 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 중심적으로 작용하고 있는지에 대해서는 아직 결론은 나와 있지 않 고, 또 상기 서술한 인자가 실제로 치료에 쓰이는 것 까지는 이르러 있지 않다. 그 중에서도, 렙틴은 섭식 조절 및 체중 조절에 관련되는 인자로서 주목받고, 재조합체 렙틴의 임상 응용이 시도되고 있는 경위도 있지만, 효과가 보이는 것은 비만 환자 중 극히 일부이다 (마쯔다 모리히로, 시모무라 이이치로 일본 임상 주식회사 일본 임상사 2003 년 7 월 28 일 발행 61 권 증간호 6 「비만증」 p325-328). 또, 비만 환자에 있어서는 렙틴에 대한 저항성을 나타내는 환자가 많이 존재한다고 알려져 있고, 약효를 나타내기 위해서는 대량의 렙틴 투여를 필요로 하고, 또한 투여에 따른 효과도 환자의 개인차가 크다고 알려져 있다 (Heymsfield 등 Journal of American Medical Association (USA) 1999 년 282 권 p1568-1575). 또한, 최근 렙틴의 작용은 섭식 조절 및 체중 조절에 특이적이 아니라 많은 생리 작용을 갖는 것이 발견되어, 렙틴의 투여는 혈압의 상승 작용, 혈소판 응집 작용, 산화 스트레스의 증대 작용 등을 통한 심혈관계에 대한 부작용이 우려되는 것 외에, 신장이나 간장에서의 섬유화에 대한 관여, 또한 발암과의 관계도 시사되어 있고, 치료약으로서 사용하기 위한 문제점도 시사되어 있다 (Concidine 등 Seminars in Vascular Medicine (USA) 2005 년 5 권 1 호 p15-24, 및 오가와 요시히로, 스가나미 타카요시 Adiposcience 후지메디컬 출판 2005 년 2 권 2 호 p118-12).
이 때문에, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 있어서 중심적으로 작용하고 있는 인자를 동정하여, 그것을 비만 및 비만증의 치료에 응용하는 것이 요구되고 있다. 그러나, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 대한 관여가 보고되어 있는 인자는 적고, 예를 들어 당뇨병의 치료약으로서 널리 사용되고 있는 PPARγ 애고니스트 는, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 대한 직접적인 관여에 대해서는 보고되어 있지 않다.
한편, NEFA (Nuclear EF-hand acidic) 는 NucleobindinⅡ (NUCB2) 라고도 불리고, NEFA 유전자에 코드되는 폴리펩티드는 칼슘 결합 도메인 (EF 도메인) 및 DNA 결합 도메인을 갖고 있다 (Barnikol-Watanabe 등 Biological chemistry Hoppe-Seyler (Germany) 1994 년 375 권 8 호 p497-512). NEFA 는 Nucleobindin 과의 상동성이 높고, 칼슘 반응성을 갖는 EF-hand 수퍼 패밀리라고 불리는 DNA 결합 인자의 일원이라고 생각되고 있다 (Karabinos 등 Molecular biology and evolution (USA) 1996 년 13 권 7 호 p990-998). 실제로 NEFA 에서의 칼슘 결합능이나 세포의 증식 제어 인자인 Necdin 과의 결합성 등에 대하여 조사되어 있는데 (Kroll 등 Biochemical and biophysical research communications (USA) 1999 년 260 권 1 호 p1-8, 및 Taniguichi 등 The Journal of biological chemistry (USA) 2000 년 275 권 41 호 p31674-37681), 상세한 생리학적 작용에 대한 보고는 없다. 또한 NEFA 는 안과 질환인 Usher's Syndrome 이나 위암의 원인 유전자일 가능성에 대해서 조사된 경위도 있다 (DeAngelis 등 Biochimica et biophysica acta (Netherlands) 1998 년 407 권 1 호 p84-91, 및 Line 등 British journal of cancer (England) 2002 년 86 권 11 호 p1824-1830). 또한, NEFA 폴리펩티드는 그 아미노 말단측에 시그널 배열을 가지며, 세포 외로 분비될 가능성에 대해서도 나타나 있는데 (의학의 발자취 타카하시 카즈오, 사이토 야스시 2005 년 213 권 6 호 p549-554), 세포 외로 분비된 것에 의한 생리적·약리적인 작용에 대해서는 전 혀 보고가 없다. 또, NEFA 와 섭식 조절 및/또는 체중 조절과의 관계를 시사하는 보고도 없다.
발명의 개시
본 발명이 해결하고자 하는 과제는, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관여하는 인자의 신규 취득 방법을 제공하는 것, 그리고 그 방법에 의해 얻어지는 유전자, 그 유전자가 코드하는 폴리펩티드, 또는 그 유전자가 코드하는 폴리펩티드의 정보로부터 얻어진 신규 폴리펩티드를, 섭식 장해 및/또는 체중 조절에 관련되는 질환의 치료·제어·진단의 수단으로서 제공하는 것이다. 또한, 그 유전자 또는 폴리펩티드의 작용을 저해하는 물질을, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관련되는 질환의 치료·제어·진단의 수단으로서 제공하는 것이다. 나아가서는, 그 유전자 또는 폴리펩티드, 또는 그들 활성을 저해하는 물질에 의해 얻어지는, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관련되는 질환의 모델 동물을 제공하는 것이다. 또한, 이들을 이용하는 그 폴리펩티드의 작용 또는 발현을 조절하는 화합물의 스크리닝 방법, 그 스크리닝 방법에 의해 선별되는 화합물, 및 그 화합물을 이용하는 질병의 진단 수단, 치료약을 제공하는 것이다.
본 발명자들은, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관여하는 인자의 신규 취득 방법을 개발하기 위해 여러 가지 검토를 거듭한 결과, PPARγ 애고니스트 활성을 갖는 티아졸리딘디온류를 사용함으로써, 섭식 억제 및/또는 체중 감소에 관여하는 유전자 및 폴리펩티드를 취득할 수 있는 것을 알아냈다. 또한, 그 방법에 의해 얻어진 인자는, 지금까지 기능에 대해서 보고되어 있지 않던 NEFA 인 것을 알아내고, 그 폴리펩티드성 인자를 NESFATIN 으로 명명하였다. NESFATIN 에 대해서 검토한 결과, 종래의 보고에서는 기능 도메인이 나타나 있지 않던 부분 배열이, 섭식 억제 및/또는 체중 감소에 대한 활성을 나타내는 것을 알아내고, 신규 폴리펩티드 NESFATIN-1, NESFATIN-1M30, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14 및 NESFATIN-1M10M 을 개시하기에 이르렀다. 또한, NEFA/NESFATIN 과 아미노산 배열 및 유전자에서의 염기 배열의 상동성이 높고, 동일한 패밀리에 속하는 NucleobindinⅠ (NUCB1) 에 있어서, NUCB1 의 NESFATIN-1M30 에 상당하는 부위인 NUCB1-M30 에서도 동일한 활성을 나타내는 것을 알아냈다.
또한, NESFATIN, NESFATIN-1 또는 NESFATIN-1M30 에 결합하는 항체가 섭식 항진 및 체중 증가에 대한 활성을 갖는 것도 알아내고, NESFATIN, NESFATIN-1 또는 NESFATIN-1M30 의 활성 저해가 섭식의 항진 및 체중 증가에 효과가 있는 것을 확인하였다.
즉 본 발명은 이하의 것을 제공한다.
(1) PPARγ 애고니스트 활성을 갖는 티아졸리딘디온류의 화합물을 포유류 세포에 작용시키는 공정, 및 그 화합물에 의해 발현 유도되는 유전자를 동정하는 공정을 포함하는 섭식 조절 및/또는 체중 조절 관련 인자의 취득 방법.
(2) 상기 티아졸리딘디온류의 화합물이 트로글리타존인 (1) 에 기재된 방법.
(3) 포유류 세포가 폐비소세포암 세포주, 지방 세포 또는 뇌신경 유래 세포인 (1) 또는 (2) 에 기재된 방법.
(4) 섭식 조절 및/또는 체중 조절이 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제인 (1), (2) 또는 (3) 에 기재된 방법.
(5) 배열 번호 65∼73 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드.
(6) 배열 번호 39∼41 또는 101∼103 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드.
(7) 배열 번호 13∼15 에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드.
(8) 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 배열 번호 3, 6 또는 9 에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드.
(9) 배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나와 적어도 60% 이상의 호몰로지를 갖는 아미노산 배열 ; 또는 배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나에 있어서, 그 일부의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 아미노산 배열로 이루어지고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드.
(10) 배열 번호 3, 6 또는 9 로 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나와 적어도 60% 이상의 호몰로지를 갖는 아미노산 배열 ; 또는 배열 번호 3, 6 또는 9 로 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나에 있어서, 그 일부의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 아미노산 배열로 이루어지고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드로서, 배열 번호 3, 6 또는 9 의 아미노산 번호 82∼162 에 상당하는 아미노산 배열 중에, 생체 내에 포함되는 절단 효소의 인식 부위를 적어도 1 개 포함하는 폴리펩티드.
(11) N 말단 또는 C 말단에 적어도 1 개 이상의 아미노산이 부가된 (5)∼(10) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
(12) 적어도 1 개의 아미노산 잔기가 화합물 또는 펩티드에 의해 수식된 (5)∼(10) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
(13) 상기 체중 증가 억제 활성이 체지방 증가 억제 활성인 (5)∼(12) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드.
(14) (5)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자.
(15) 배열 번호 74∼82 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자.
(16) 배열 번호 44∼46 또는 104∼106 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자.
(17) 배열 번호 18∼20 에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자.
(18) 배열 번호 10, 11 또는 12 에 나타내는 염기 배열을 포함하고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자.
(19) 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106, 116∼124 에 나타내는 염기 배열 또는 그 부분 배열과 스트리전트 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자.
(20) 상기 체중 증가 억제 활성이 체지방 증가 억제 활성인 (14)∼(19) 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자.
(21) (14)∼(20) 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
(22) 핵산 분자가, 그 핵산 분자의 발현을 제어하는 조절성 핵산 분자의 제어 하에 기능적으로 결합된 (21) 에 기재된 벡터.
(23) (14)∼(20) 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자를 포함하는 형질 전환체.
(24) 상기 핵산 분자의 전사 산물을 발현하는 (23) 에 기재된 형질 전환체.
(25) 상기 핵산 분자가 코드하는 폴리펩티드를 발현하는 (23) 또는 (24) 에 기재된 형질 전환체.
(26) 형질 전환체가 미생물인 (23), (24) 또는 (25) 에 기재된 형질 전환체.
(27) 미생물이 에쉐리키아 콜리(Escherichia coli)인 (26) 에 기재된 형질 전환체.
(28) 형질 전환체가 포유류 세포인 (23), (24) 또는 (25) 에 기재된 형질 전환체.
(29) 형질 전환체가 식물 세포인 (23), (24) 또는 (25) 에 기재된 형질 전환체.
(30) 유효 성분으로서, (5)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드의 아미노산 배열의 일부를 포함하는 펩티드, (21) 또는 (22) 에 기재된 벡터, 또는 (23)∼(29) 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체를 함유하는 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제를 위한 의약 조성물.
(31) 상기 체중 증가 억제가 체지방 증가 억제인 (30) 에 기재된 의약 조성물.
(32) 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 정형외과적 질환, 월경 이상 및 악성 종양에서 선택되는 질환의 환자를 위한 (30) 또는 (31) 에 기재된 의약 조성물.
(33) 악성 종양이 유방암, 자궁암, 결장암, 신장암, 식도암, 췌장암, 간장암 또는 담낭암 중 어느 하나인 (30) 또는 (31) 에 기재된 의약 조성물.
(34) 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 (30)∼(33) 중 어느 하나에 기재된 의약 조성물.
(35) (5)∼(13) 에 기재된 폴리펩티드 중 어느 하나와 결합하는 항체.
(36) 배열 번호 24, 32 에 나타내는 아미노산 배열로 이루어지는 펩티드와 결합하는 (35) 에 기재된 항체.
(37) (5)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 폴리펩티드의 활성 또는 생성을 억제하는 물질.
(38) 상기 폴리펩티드와 결합함으로써, 그 폴리펩티드의 활성을 억제하는 (37) 에 기재된 물질.
(39) 상기 폴리펩티드의 활성을 억제하는 물질이 (35) 또는 (36) 에 기재된 항체인 (37) 에 기재된 물질.
(40) (5)∼(13) 에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현을 억제하는 물질.
(41) 상기 유전자의 발현 억제 물질이 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자인 (40) 에 기재된 유전자 발현 억제 물질.
(42) 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자가 배열 번호 31 에 나타내는 염기 배열을 포함하는 (41) 에 기재된 유전자 발현 억제 물질.
(43) 유전자의 발현 억제 물질이 RNAi 분자인 (40) 에 기재된 유전자 발현 억제 물질.
(44) (41) 또는 (42) 에 기재된 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자, 또는 (43) 에 기재된 RNAi 분자의 핵산 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 포함하는, 그 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자 또는 그 RNAi 분자를 제조하기 위한 벡터.
(45) (37)∼(43) 중 어느 하나에 기재된 물질 또는 (44) 에 기재된 벡터를 함유하는 식욕 항진 또는 체중 증가 항진을 위한 의약 조성물.
(46) 약학적으로 허용되는 첨가제를 함유하는 (45) 에 기재된 의약 조성물.
(47) (14)∼(20) 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자, 또는 (21)∼(22) 중 어느 하나에 기재된 벡터를 포함하는 트랜스제닉 비인간 생물.
(48) (14)∼(20) 중 어느 하나에 기재된 핵산 분자가 발현되는 (47) 에 기재된 트랜스제닉 비인간 생물.
(49) (23) 내지 (28) 에 기재된 형질 전환체 중 어느 하나가 도입된 (47) 또는 (48) 에 기재된 트랜스제닉 비인간 생물.
(50) 상기 트랜스제닉 비인간 생물이 섭식 억제 상태 또는 체중 증가 억제 상태를 나타내는 트랜스제닉 비인간 동물인 (47), (48) 또는 (49) 에 기재된 트랜스제닉 비인간 생물.
(51) 상기 트랜스제닉 비인간 생물이 트랜스제닉 식물인 (47), (48) 또는 (49) 에 기재된 트랜스제닉 비인간 생물.
(52) (35) 또는 (36) 에 기재된 항체, (37)∼(39) 중 어느 하나에 기재된 억제 물질, (40)∼(43) 에 기재된 유전자 발현 억제 물질, 또는 (44) 에 기재된 벡터가 도입되고, 식욕 항진 또는 체중 증가 항진을 나타내는 트랜스제닉 비인간 동물.
(53) 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 전체 영역 또는 일부를 결손시킨 녹아웃 비인간 동물.
(54) 식욕 항진 또는 체중 증가를 나타내는 (53) 에 기재된 녹아웃 비인간 동물.
(55) 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 정형외과적 질환, 월경 이상 및 악성 종양에서 선택되는 질환의 모델 동물로서 사용할 수 있는 (52), (53) 또는 (54) 에 기재된 비인간 동물.
(56) 무세포 단백질 합성법 또는 화학 합성법에 의한 (5)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 펩티드의 제조 방법.
(57) (23)∼(29) 중 어느 하나에 기재된 형질 전환체, (47)∼(51) 중 어느 하나에 기재된 트랜스제닉 비인간 생물, 또는 (52)∼(55) 중 어느 하나에 기재된 비인간 동물을 사용하는 (5)∼(13) 중 어느 하나에 기재된 펩티드의 제조 방법.
(58) 상기 펩티드와 (35) 또는 (36) 에 기재된 항체의 탈착에 의한 정제 공정을 포함하는 (56) 또는 (57) 에 기재된 제조 방법.
(59) 상기 펩티드를 GST 융합 단백질로서 발현시키고, 글루타티온 결합 담체를 사용하여 정제하는 공정을 포함하는 (56) 또는 (57) 에 기재된 제조 방법.
(60) 상기 펩티드를 His 태그 융합 단백질로서 발현시키고, 금속 이온 킬레이트 담체를 사용하여 정제하는 공정을 포함하는 (56) 또는 (57) 에 기재된 제조 방법.
(61) 상기 펩티드를 FLAG 태그 융합 단백질로서 발현시키고, 항 FLAG 태그 항체가 결합한 담체를 사용하여 정제하는 공정을 포함하는 (56) 또는 (57) 에 기재된 제조 방법.
(62) 섭식 항진 또는 체중 증가 상태를 예측 또는 진단하기 위한 검정 방법으로서, 포유류 동물의 생체 시료 중의, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자, 또는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드의 함유량을 검출하는 공정을 포함하는 방법.
(63) 포유류 동물의 생체 시료 중의 상기 핵산 분자 또는 상기 폴리펩티드의 함유량을, 정상 개체의 생체 시료와 비교하는 공정을 포함하는 (62) 에 기재된 검정 방법.
(64) 포유류 동물의 생체 시료 중의 상기 핵산 분자 또는 상기 폴리펩티드의 함유량의 저하 상태를 섭식 항진 또는 체중 증가 상태라고 판단하는 공정을 포함하는 (62) 또는 (63) 에 기재된 검정 방법.
(65) 포유류 동물의 생체 시료 중의 상기 핵산 분자 또는 상기 폴리펩티드의 함유량의 저하 상태를, 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 정형외과적 질환, 월경 이상 및 악성 종양에서 선택되는 질환의 발증 또는 그 우려가 있다고 판단하는 공정을 포함하는 (62)∼(64) 중 어느 하나에 기재된 검정 방법.
(66) 포유류 동물의 생체 시료 중의 상기 핵산 분자 또는 상기 폴리펩티드의 함유량의 증가 상태를, 섭식 억제 상태 또는 체중 증가 억제 상태라고 판단하는 공정을 포함하는 (62) 또는 (63) 에 기재된 검정 방법.
(67) 상기 폴리펩티드의 함유량의 검출을, (35) 또는 (36) 에 기재된 항체를 사용하여 실시하는 (62)∼(66) 중 어느 하나에 기재된 검정 방법.
(68) 상기 핵산 분자의 함유량의 검출을, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자를 검출하기 위한 PCR 프라이머, 프로브 또는 DNA 칩을 적어도 1 개 사용하여 실시하는 (62)∼(66) 중 어느 하나에 기재된 검정 방법.
(69) (62)∼(68) 중 어느 하나에 기재된 검정 방법에 사용되는 검정 키트로서, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자를 검출하기 위한 PCR 프라이머, 프로브 또는 DNA 칩 ; 또는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 인식하는 항체, 표준 펩티드 또는 결합 경합 반응용 펩티드 수식체 중 적어도 1 개 포함하는 검정 키트.
(70) 시험 물질을 포유류 세포에 접촉시키는 공정, 및 그 세포에 있어서의, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82 또는 104∼106, 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현량의 증가를, 또는 그 세포 내에 포함되거나 또는 세포 외로 분비되는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드의 양의 증가를 검출하는 공정을 포함하는 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
(71) 포유류 세포가, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현을 제어하는 조절성 핵산 분자와, 리포터 유전자의 핵산 분자가 도입된 것이고, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현 유도를 리포터 유전자의 발현 유도에 의해 검출하는 (70) 에 기재된 스크리닝 방법.
(72) 포유 동물에게 시험 물질을 투여하는 공정, 및 그 시험 동물의 생체 시료에 있어서의 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현의 항진을, 또는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드의 생성 항진을 검출하는 공정을 포함하는 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
(73) (47)∼(50) 중 어느 하나에 기재된 트랜스제닉 비인간 생물, 또는 (52)∼(55) 중 어느 하나에 기재된 비인간 동물에게 시험 물질을 투여하는 공정, 및 그 트랜스제닉 비인간 생물 또는 비인간 동물에 있어서의 섭식 억제 또는 체중 증가 억제를 검출하는 공정을 포함하는, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
(74) 상기 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 효과를 갖는 치료제 또는 예방제가, 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 정형외과적 질환, 월경 이상 및 악성 종양에서 선택되는 질환에 대한 치료제 또는 예방제인 (70)∼(73) 중 어느 하나에 기재된 스크리닝 방법.
(75) (70)∼(74) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 효과를 갖는 치료제 또는 예방제.
(76) 상기 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 효과를 갖는 치료제 또는 예방제가, 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 정형외과적 질환, 월경 이상 및 악성 종양에서 선택되는 질환에 대한 치료제 또는 예방제인 (75) 에 기재된 치료제 또는 예방제.
(77) 시험 물질을 포유류 세포에 접촉시키는 공정, 및 그 세포에 있어서의, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현량의 감소를, 또는 그 세포 내에 포함되거나 또는 세포 외로 분비되는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드의 양의 감소를 검출하는 공정을 포함하는 섭식 항진 및/또는 체중 증가 항진의 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
(78) 포유류 세포가 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현을 제어하는 조절성 핵산 분자와, 리포터 유전자의 핵산 분자가 도입된 것이고, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현 억제를 리포터 유전자의 발현 억제를 검출하는 (77) 에 기재된 스크리닝 방법.
(79) 포유 동물에게 시험 물질을 투여하는 공정, 및 그 시험 동물의 생체 시료에 있어서의 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현 억제를, 또는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드의 생성 억제를 검출하는 공정을 포함하는 섭식 항진 및/또는 체중 증가 항진의 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
(80) (47)∼(50) 중 어느 하나에 기재된 트랜스제닉 비인간 생물, 또는 (52)∼(55) 중 어느 하나에 기재된 비인간 동물에게 시험 물질을 투여하는 공정, 및 그 트랜스제닉 비인간 생물 또는 그 비인간 동물에 있어서의 섭식의 항진 또는 체중 증가의 항진을 검출하는 공정을 포함하는 섭식 항진 및/또는 체중 증가 항진의 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
(81) (77)∼(80) 중 어느 하나에 기재된 방법에 의해 얻어진 섭식 항진 및/또는 체중 증가 항진의 효과를 갖는 치료제 또는 예방제.
도 1 은, 인간 뇌수 아세포종 주세포 HBT185 세포 및 SQ-5 세포에 있어서, 트로글리타존에 의해 NEFA 유전자의 발현이 유도되는 것, 전구 지방 세포에 분화시킨 3T3-L1 세포에 있어서 NEFA 유전자가 정상적으로 발현하고 있는 것을 나타내는, NEFA 프로브를 사용한 Northern 블로팅 이미지이다.
도 2 의 A 는, NEFA 유전자가 코드하는 폴리펩티드의 도메인 구조의 모식도와 항 NESFATIN 항체 제조에 사용한 NAP 펩티드의 배열을 나타내는 도면이다. 또한, 도 2 의 B 는, 래트의 뇌 추출물에 NEFA 유전자가 코드하는 폴리펩티드가 존재하는 것을 나타내는, NAP 펩티드로 제조한 폴리클로날 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 이미지이다.
도 3 은, 래트 뇌의 시상하부에서, 섭식 조절에 관여하는 부위인 궁상핵 (Arc), 실방핵 (PVN), 시상상핵 (SON) 및 외측야 (LH) 에 있어서 NEFA 유전자가 발현하고 있는 것을 나타내는, NAP 펩티드에 대한 폴리클로날 항체를 사용한 면역 조 직 염색 이미지이다.
도 4 의 A 는, GST 와 마우스 성숙형 NESFATIN 을 결합한 형태인 GST-NEFA 의 발현과 정제 과정을 나타내는, NAP 펩티드에 대한 폴리클로날 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 이미지이다. 도 4 의 A 에서, 레인 1∼4 는, 각각 레인보우 마커, Preinduced bacteria, Post-sonicated pellet, 및 정제 GSTNAP 를 나타낸다. 또, 도 4 의 B 는 GST-NEFA 를 Thrombin 으로 절단하여 정제한 과정을 나타내는, 항 NESFATIN 항체를 사용한 웨스턴 블로팅 이미지이다. 도 4 의 B 에서, 레인 1 은 마커, 레인 2 는 정제 전 샘플, 레인 3∼6 은 세정 샘플, 레인 7 은 정제 샘플을 나타낸다.
도 5 는, 래트 제 3 뇌실 내에 리콤비난트 NESFATIN 을 투여함으로써, 래트의 섭식 행동이 억제되는 것을 나타낸 그래프이다. 도 5 에 있어서 * 및 ** 는, 각각 대상군에 대한 유의차 P<0.05 및 P<0.01 을 나타낸다.
도 6 은, 래트 제 3 뇌실 내에 항 NESFATIN 항체를 투여함으로써, 래트의 섭식 행동이 항진되는 것을 나타낸 그래프이다. 도 6 에 있어서 * 는, Control IgG 에 대한 유의차 P<0.001 을 나타낸다.
도 7 은, 래트 시상하부에서의 NESFATIN 유전자의 발현이 절식시킴으로써 저하되는 것, 또한 다시 섭식시킴으로써 발현이 회복하는 것을 나타내는, 뇌 조직에서의 in situ 하이브리다이제이션 이미지이다. 도 7 에 있어서 A 는 대상군, B 는 절식군, C 는 재섭식군을 나타내고, 상단은 100 배 이미지, 하단은 400 배 이미지를 나타낸다.
도 8 은, 래트 시상하부에서의 NESFATIN 의 발현이 절식시킴으로써 저하되는 것을 나타내는, 항 NESFATIN 항체를 사용한 면역 조직 염색 이미지인 도 8 에 있어서, A 는 대상군, B 는 절식군을 나타낸다. 또한, 절식시에 있어서의 NESFATIN 의 발현 저하가 식욕 항진에 의한 것임을 나타내는, 항 C-Fos 항체를 사용한 면역 조직 염색 이미지이다 (C). 도 8 에 있어서 상단은 실방핵 (PVN), 하단은 궁상핵 (Arc) 을 나타낸다.
도 9A 는, 인간, 마우스 및 래트의 NESFATIN 의 아미노산 배열과, Prohormone Convertase 에 의한 추정 절단 부위를 나타내는 도면이다. ▼ 는, 예상되는 Prohormone Convertase 에 의한 절단 부위를 나타낸다.
도 9B 는, Prohormone Convertase 에 의해 생긴다고 생각되는 Nesfatin-1, Nesfatin-2, Nesfatin-3, Nesfatin-2/3, 그리고 Nesfatin-1, Nesfatin-2/3 및 Nesfatin-3 에 대한 항체를 제조하기 위한 펩티드의 NESFATIN 에서의 위치를 나타낸 모식도이다.
도 9C 는, Nesfatin-1 및 Nesfatin-3 에 대한 항체가 목적으로 하는 항원과 결합하는 것을 나타내고 있는 웨스턴 블로팅의 도면이다. 도 9C 에서 좌측 도면은 NESFATIN-1 펩티드를 영동하여 Nesfatin-1 IgG 로 웨스턴 블로팅을 실시한 결과를, 우측 도면은 NESFATIN-3 펩티드를 영동하여 NesfatinC2 IgG 로 웨스턴 블로팅을 실시한 결과를 나타낸다.
도 10 은, 래트 뇌 내에서 NESFATIN-1 과 Prohormone Convertase (PC-1/3 또는 PC-2) 를 동시에 발현하고 있는 세포의 존재를 나타내는, 항 NESFATIN-1 항체 및 항 PC-1/3 항체 또는 항 PC-2 항체를 사용한 이중 면역 조직 염색 이미지이다. 도 10 의 A 의 동그라미 1 및 동그라미 2 는, 래트의 시상하부 조직에 있어서의 면역 조직 화학 이미지에 있어서의 Nesfatin-1 IgG 에 의한 염색 이미지를, 도 10의 B 의 동그라미 1 은 PC-1/3 에 의한 형광 이미지를, 도 10 의 B 의 동그라미 2 는 PC-2 에 의한 형광 이미지를 나타낸다.
도 11 은, 래트 제 3 뇌실 내에 NESFATIN-1 을 투여함으로써 래트의 섭식 행동이 억제되는데, NESFATIN-2 또는 NESFATIN-3 을 투여해도 섭식 행동에 변화가 보이지 않는 것을 나타내는 그래프이다.
도 12 는, 래트의 제 3 뇌실 내에 연속적으로 NESFATIN-1 을 투여함으로써, 지속적으로 섭식 행동이 억제되는 것 (A), 및 지속적으로 체중 증가가 억제되는 것 (B) 을 나타내는 그래프이다.
도 13A 는, 래트의 뇌실 내에 NESFATIN-1 에 대한 항체를 투여함으로써 래트의 식욕이 항진되는 것을 나타내는 그래프이다. 도 13A 에서, * 및 ** 는, 각각 Control IgG 투여군에 대한 유의차 P<0.05 및 P<0.001 을 나타낸다.
도 13B 는, NESFATIN 에 대하여 NESFATIN 에서 NESFATIN-1 이 절단되지 않은 변이체를 래트 뇌실 내에 투여했을 때에는 섭식의 항진이 일어나지 않는 것을 나타낸 그래프이다.
도 14 는, 래트의 뇌실 내에 연속적으로 NESFATIN 에 대한 안티센스 RNA 를 투여함으로써, 섭식 행동이 억제되는 것 (A) 및 체중 증가가 억제되는 것 (B) 을 나타내는 그래프이다. 도 14 에 있어서, * 및 ** 는, 각각 미스센스에 대한 유 의차 P<0.05 및 P<0.01 을 나타낸다.
도 15 는, Lean 및 렙틴 저항성 비만 모델 동물인 Zucker 래트의 뇌실 내에 NESFATIN-1 을 투여한 것에 의한 섭식량의 측정 결과를 나타낸 그래프이다. Zucker 래트에 있어서는 Lean (정상 동물) 과 동일하게, NESFATIN-1 의 뇌실내 투여에 의해 섭식 억제 효과가 관찰된다. 도 15 에 있어서, * 및 ** 는, 각각 생리 식염수 투여군에 대한 유의차 P<0.05 및 P<0.001 을 나타낸다. 백색 박스 및 해칭한 박스는, 각각 생리 식염수 및 NESFATIN-1 투여군을 나타낸다.
도 16 은, 마우스의 복강 내에 NESFATIN-1 을 투여했을 때의 섭식량에 대한 영향을 나타낸 그래프이다. 마우스에 있어서 복강 내에 대한 투여에 있어서도, NESFATIN-1 의 섭식 억제 활성이 관찰되는 것을 나타내고 있다 (A). 또한 비만 모델 마우스인 Agouti-yellow 마우스와 그 대상 마우스의 복강 내에 NESFATIN-1 을 투여한 경우의 결과의 그래프를 나타내고 있다. 대상 마우스 (B) 에 있어서도 Agouti-yellow 마우스 (C) 에 있어서도 NESFATIN-1 의 복강 투여는 동일한 효과가 있는 것을 나타내고 있다.
도 17 은, 마우스의 복강내 및 피하에 대한 NESFATIN-1 의 투여에 의한 섭식량에 대한 영향을 나타낸 그래프이다. NESFATIN-1 은 복강내 투여 (ip) 로도 피하 투여 (sc) 로도 섭식 억제 효과가 관찰되는데, 피하 투여가 효과가 늦게 발현하는 경향이 관찰되었다. 도 17 에 있어서, * 및 ** 는, 각각 생리 식염수 투여군에 대한 유의차 P<0.05 및 P<0.005 를 나타낸다.
도 18A 는, 마우스의 복강 내에 대한 NESFATIN-1N23, NESFATIN-1M30, NESFATIN-1C29 의 투여에 의한 섭식량에 대한 영향을 나타낸 그래프이다. NESFATIN-1 의 부분 펩티드 중, NESFATIN-1M30 만이 섭식 억제 효과를 나타내는 것이 관찰되었다. 도 18A 에서, * 는, 생리 식염수 투여군에 대한 유의차 P<0.02 를 나타낸다.
도 18B 는, 인간, 마우스 및 래트의 NESFATIN-1 의 아미노산 얼라인먼트의 결과와 NESFATIN-1N23, NESFATIN-1M30 및 NESFATIN-1C29 의 부위를 나타낸 도면이다. NESFATIN-1M30 의 부위는 종 사이에서 아미노산 배열이 높게 보존되어 있는 것이 나타났다.
도 19A-1 은, NESFATIN 또는 NESFATIN-1 의 시료 중의 농도를 측정하는 경합 EIA 계에서의 표준 곡선을 나타내는 그래프 (A-1) 및 수액에서의 측정 결과를 나타내는 표 (A-2) 이다. 검량 곡선의 식 : Y=D+(A-D)/1+(Log(X)/C^B). Plot#1 (표준값 : 농도값 VS 측정값). A=8.4672E-001 ; B=4.3850E+000 ; C=3.5938E+000 ; D=-2.8957E-001 ; R^2=0.9998.
도 19A-2 는, NESFATIN 또는 NESFATIN-1 의 시료 중의 농도를 측정하는 경합 EIA 계에서의 표준 곡선을 나타내는 그래프 (A-1) 및 수액에서의 측정 결과를 나타내는 표 (A-2) 이다.
도 19B 는, 시상하부 조직 및 수액으로부터 추출한 펩티드 샘플을 HPLC 로 분획하고, 그 획분의 NESFATIN-1 을 경합 EIA 계로 측정한 결과를 나타내는 그래프이다 (b-1 및 b-2).
도 20 은, 마우스 복강 내에 대한 NESFATIN-1M30 의 부분 펩티드의 투여에 의한 섭식량에 대한 영향을 나타낸 그래프이다. NESFATIN-1M16 (M16), NESFATIN-1M10M (M10M) 또는 NESFATIN-M14 (M14) 를 투여한 모든 경우에 있어서, 섭식 억제 효과가 관찰되었다. 도 20 에 있어서, * 및 ** 는, 각각 생리 식염수 투여군에 대한 유의차 P<0.02 및 P<0.002 를 나타낸다.
도 21A 는, 마우스 복강 내에 대한 인간 NESFATIN-1M30 및 마우스 NUCB1-M30 의 섭식 조절에 대한 영향을 나타낸 그래프이다. 마우스 NESFATIN-1M30 (Mouse/NESFATIN-1M30) 과 동일하게 인간 NESFATIN-1M30 (human/NESFATIN-1M30) 및 마우스 NUCB1-M30 (Mouse NUCB1) 에서도 섭식 억제 효과가 있는 것을 나타내고 있다. 도 20 에 있어서, * 는, 생리 식염수 투여군에 대한 유의차 P<0.02 를 나타낸다.
도 21B 는, 인간·래트·마우스의 NESFATIN 및 인간·래트·마우스의 NUCB1 의 아미노산 배열의 얼라인먼트 결과와 NESFATIN-1 에 상당하는 부위 및 NESFATIN-1M30 에 상당하는 부위를 나타내고 있는 도면이다. 각종의 NESFSATIN 및 NUCB2 의 NESFASTIN-1 에 상당하는 부위, 특히 NESFATIN-1M30 에 상당하는 부위에 있어서, 아미노산 배열의 보존성이 높은 것이 나타나 있다.
도 21C 는, 인간·래트·마우스의 NESFATIN 및 인간·래트·마우스의 NUCB1 의 아미노산 배열의 얼라인먼트의 결과와 NESFATIN-1 에 상당하는 부위 및 NESFATIN-1M30 에 상당하는 부위를 나타내고 있는 도면이고, 도 21B 의 계속을 나타낸다.
도 22 는, 각 조직에 있어서의 NEFA 프로브를 사용한 in situ 하이브리다이 제이션의 이미지를 나타내고 있다. 도 22 의 A 는 실방핵 (PVN) 과 시상상핵 (SON) 을 포함하는 조직 절편, 도 22 의 B 는 불확정 구역 (Zi) 과 궁상핵 (Arc) 을 포함하는 조직 절편, 도 22 의 C 는 시상외측야 (LHA) 를 포함하는 조직 절편을 나타낸다.
도 23 의 A 는, 래트 제 3 뇌실 내에 리콤비난트 NESFATIN 을 투여함으로써, 래트의 섭이량이 억제되는 것을 나타내는 그래프이다. 도 23 의 B 는, 래트 제 3 뇌실 내에 대한 5pmol 의 NESFATIN 투여군 (해칭한 박스) 과 대상군 (0pmol 의 NESFATIN, 백색 박스) 의 0∼1 시간, 1∼3 시간, 3∼6 시간 및 6∼12 시간의 섭이량을 나타내는 도면이다. 도 23 의 A 에서, * 는 0pmol 에 대한 우위차 p<0.01 을 나타내고, 도 23 의 B 에서, * 는 0pmol 에 대한 우위차 p<0.05 를, ** 는 우위차 p<0.01 을 나타낸다.
도 24 의 A 는, 자유 섭식군 (대조군) 과 절식군의 래트에 있어서의 뇌 시상하부 영역에서의 궁상핵 (Arc)·실방핵 (PVN)·외측야 (LHA) 및 시상상핵 (SON) 의 각 부위에서의 NESFATIN mRNA 발현을 in situ 하이브리다이제이션법에 의한 화상 해석으로 정량한 결과를 나타낸다. 도 24 의 B 는, 자유 섭식군 (대조군 : 백색 박스) 과 절식군 (해칭한 박스) 의 래트에 있어서의 뇌 시상하부 영역 중 실방핵에서의 NESFATIN-1 펩티드의 발현을 경합 EIA 법에 의한 화상 해석으로 정량한 결과를 나타내고 있다.
도 25 는, 래트 제 3 뇌실 내에 대한 5pmol 의 NESFATIN-1 투여군 (해칭한 박스) 과 대상군 (0pmol 의 NESFATIN-1, 백색 박스) 의 0∼1 시간, 1∼3 시간, 3∼ 6 시간 및 6∼12 시간의 섭이량을 나타내는 도면이다. * 는, 0pmol 에 대한 우위차 p<0.01 을 나타낸다.
도 26 은, 좌로부터 래트의 뇌실 내에 생리 식염수만을 투여한 대상군 (NESFATN-1 IgG/NESFATIN-1/Leptin : -/-/-), NESFATIN-1 만을 투여한 군 (NESFATN-1 IgG/NESFATIN-1/Leptin : -/+/-), NESFATIN-1 과 항 NESFATIN-1 항체를 투여한 군 (NESFATN-1 IgG/NESFATIN-1/Leptin : +/+/-), Leptin 을 투여한 군 (NESFATN-1 IgG/NESFATIN-1/Leptin : -/-/+), Leptin 과 항 NESFATIN-1 항체를 투여한 군 (NESFATN-1 IgG/NESFATIN-1/Leptin : +/-/+) 의 투여 후 1 시간의 섭이량을 나타낸 그래프이다. * 는, 대상군에 대한 우위차 p<0.01 을 나타낸다.
도 27 의 A 는, 래트의 뇌로부터의 단백질 추출액을 사용하여 항 NESFATIN-1 항체로 웨스턴 블로팅을 실시한 이미지를 나타내고 있다.
도 27 의 B 는, 항 NESFATIN-1 항체와 각종 펩티드를 미리 반응시킨 후에 웨스턴 블로팅을 실시했을 때의 47.5kd 부근의 밴드 부근의 이미지를 나타내고 있다. 도 27 의 B 에서, 항 NESFATIN-1 항체와 반응시킨 펩티드의 종류는, 도 27 의 B 상단에 있어서는, 좌로부터 펩티드 없음, NAP1-Ab 펩티드 (cognate peptide), Leptin, αMSH, CART 를 나타내고, 도 27 의 B 하단에 있어서는, 좌로부터 펩티드 없음, NAP1-Ab 펩티드 (cognate peptide), NPY, MCH, Orexin-A 를 나타낸다.
도 28 의 A 는, 연수를 포함하는 뇌 조직에서의 NAP 펩티드 항체를 사용한 면역 조직 화학 염색의 이미지를 나타내고 있다. 도 28 의 B 는, NAP 펩티드에 대한 항체를 NAP 펩티드 (cognate peptide) 와 미리 반응시키고 나서 면역 조직 염 색을 실시한 이미지를 나타내고 있다.
도 29 의 A 는, 정상 래트 (Lean) 와 Zucker fa/fa 래트 (Zucker) 에, 트로글리타존을 함유하는 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : +) 과 함유하지 않은 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : -) 에 있어서의 체중을 나타낸 그래프이다. 도 29 의 B 는, 정상 래트 (Lean) 와 Zucker fa/fa 래트 (Zucker) 에, 트로글리타존을 함유하는 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : +) 과 함유하지 않은 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : -) 에 있어서의 혈중의 렙틴 농도를 나타낸 그래프이다. 도 29 의 C 는, 정상 래트 (Lean) 와 Zucker fa/fa 래트 (Zucker) 에, 트로글리타존을 함유하는 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : +) 과 함유하지 않은 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : -) 에 있어서의 뇌내의 Nesfatin 농도를 나타낸 그래프이다. 도 29 에 있어서, * 및 ** 는, 각각 정상 래트 (Lean) 에 있어서 트로글리타존을 함유하지 않은 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : -) 에 대한 유의차 p<0.05 및 p<0.01 을 나타내고, 도 29 에 있어서, # 및 ## 는, 각각 Zucker fa/fa 래트 (Zucker) 에 있어서 트로글리타존을 함유하지 않은 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : -) 에 대한 유의차 p<0.05 및 p<0.01 을 나타낸다.
도 30 의 A 는, 래트의 시상하부로부터의 펩티드 추출물을 HPLC 로 분획하여 얻어진 획분 번호 45 의 웨스턴 블로팅의 이미지를 나타내고 있다. 도 30 의 B는, 래트의 시상하부로부터의 펩티드 추출물을 HPLC 로 분획하여 얻어진 획분 번호 43∼47 의 웨스턴 블로팅의 이미지에 있어서의 9.7kd 부근의 분자량에 있어서의 부분의 이미지를 나타내고 있다.
도 31 의 A 는, 래트 뇌의 궁상핵을 포함하는 조직 절편에 있어서 항 NESFATIN-1 항체로 면역 조직 화학 염색을 실시한 결과, 및 항 NESFATIN-1 항체를 각종 펩티드와 미리 반응시킨 후에 면역 조직 화학 염색을 실시한 결과를 나타내고 있다. 도 31 의 A 에서, a-1 은 항 NESFATIN-1 항체에서의 면역 염색 이미지, a-2∼a-6 은, 각각 항 NESFATIN-1 항체를 NESFATIN-1 펩티드 (a-2), Leptin (a-3), αMSH (a-4), CART (a-5), NPY (a-6) 과 미리 반응시켰을 때의 면역 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 31 의 B 는, 래트 뇌의 실방핵을 포함하는 조직 절편에 있어서 항 NESFATIN-1 항체로 면역 조직 화학 염색을 실시한 결과, 및 항 NESFATIN-1 항체를 각종 펩티드와 미리 반응시킨 후에 면역 조직 화학 염색을 실시한 결과를 나타내고 있다. B 에서, b-1 은 항 NESFATIN-1 항체에서의 면역 염색 이미지, b-2∼b-6 은, 각각 항 NESFATIN-1 항체를 NESFATIN-1 펩티드 (b-2), Leptin (b-3), αMSH (b-4), CART (b-5), NPY (b-6) 과 미리 반응시켰을 때의 면역 염색 이미지를 나타내고 있다.
도 32 는, 10 일간의 NESFATIN-1 또는 생리 식염수만 투여한 래트로부터 취득한 복부 피하 지방 조직 (A), 정소상체 지방 조직 (B), 장관막 지방 조직 (C), 후복막 지방 조직 (D), 갈색 지방 조직 (E) 및 비복근 (F) 의 조직 중량의, 각 개체 중량과의 비 (조직 중량/체중 ㎎/g) 를 나타낸 결과의 그래프이다. 도 32 에 있어서, * 및 ** 는, 각각 생리 식염수 투여군에 대한 유의차 p<0.05 및 p<0.005 를 나타낸다.
도 33 은, 마우스 복강 내에 NESFATIN-1 또는 생리 식염수만을 투여했을 때 의 섭식량, 혈중 글루코오스 함량, 총 콜레스테롤 함량, 트리글리세리드 함량의 측정 결과를 나타낸 그래프이다. 도 33 에 있어서 백색 박스 및 해칭한 박스는, 각각 생리 식염수 및 Nesfatin-1 투여군을 나타낸다.
본 발명은, PPARγ 애고니스트를 사용함으로써, 섭식 및 체중 조절에 관여하는 인자를 취득할 수 있다. 또한, NESFATIN, NESFATIN-1, NESFATIN-1M30, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M, NUCB1-M30, NUCB1-M16, NUCBl-M14, NUCB1-M10M 을 사용함으로써, 비만 또는 비만증, 신경성 과식증 등의 대사·섭식 장해에 관련되는 질환, 2 형 당뇨병, 내당능 이상, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 변형성 관절증 등의 정형외과적 질환, 월경 이상, 악성 종양 등의 비만증에 관련되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 항체 등의 NESFATIN, NESFATIN-1 또는 NESFATIN-1M30 의 활성을 억제하는 물질을 사용함으로써, 수술 후 및/또는 암 환자에 있어서의 식욕 부진이나 거식증 등의 영양·섭식 장해에 관련되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
<섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관련되는 인자의 취득 방법>
본 발명은, PPARγ 애고니스트 활성을 갖는 티아졸리딘디온류의 화합물을 포유류 세포에 작용시키는 공정, 및 그 화합물에 의해 발현 유도되는 유전자를 동정하는 공정을 포함하는 섭식 조절 및/또는 체중 조절 관련 인자의 취득 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 「섭식 조절」 이란, 일정 기간 내의 동물에 있어서의 섭이 또는 인간에 있어서의 식사 (이하, 모두 섭이 등이라고 한다) 량의 조절, 또는 일정 기간 내에 섭이 등에 의해 섭취하는 칼로리의 총량의 조절을 말한다. 또한, 섭식 조절에는, 식욕이나 만복감의 조절 등 섭이 등의 동기가 되는 사상에 대한 조절도 포함된다.
여기에서 「섭식 억제」 란, 섭식 조절이 되어 있지 않은 시점과 비교하여, 섭이 등의 양 또는 섭이 등에 의해 섭취하는 칼로리의 총량이 감소하고 있는 상태, 또는 섭식 조절이 되어 있지 않은 상황 하와 비교하여, 섭이 등의 양이나 섭이 등에 의해 섭취하는 칼로리의 총량이 증대해 가는 경향이 억제되어 있는 상태를 말한다. 또, 섭식 억제에는 식욕의 감퇴, 만복감의 항진 등의 상태도 포함된다.
한편, 여기에서 「섭식 항진」 이란, 섭식 조절이 되어 있지 않은 시점과 비교하여, 섭이 등의 양 또는 섭이 등에 의해 섭취하는 칼로리의 총량이 증가하고 있는 상태, 또는 섭식 조절이 되어 있지 않은 상황 하와 비교하여 섭이 등의 양 또는 섭이 등에 의해 섭취하는 칼로리의 총량이 저하되어 가는 경향이 억제된 상태를 말한다. 또한, 식욕 항진에는 식욕의 증대, 만복감의 억제 등도 포함된다.
「체중 조절」 이란, 인간 또는 동물에 있어서, 체중 절대값, 체격 지수 (체중과 몸 길이를 사용한 지표) 또는 체지방률을 조절하는 것을 말한다. 여기에서 「체중 증가 억제」 란, 체중 조절이 되어 있지 않은 시점과 비교하여, 체중 절대값, 체격 지수 또는 체지방률이 저하되어 있거나 또는 유지되어 있는 상태, 또는 체중 조절이 되어 있지 않은 상황 하와 비교하여, 체중 절대값, 체격 지수 또는 체지방률이 증가해 가는 경향이 억제되어 있는 상황을 말한다.
또, 본 명세서에 있어서 「체지방 증가 억제」 란, 체중 조절되어 있지 않은 시점과 비교하여 체지방률이 저하되어 있거나 또는 유지되어 있는 상태, 또는 체중 조절이 되어 있지 않은 상황 하와 비교하여, 체지방률이 증가해 가는 경향이 억제되어 있는 상황을 말한다. 또한, 「체중 증가 항진」 이란, 체중 조절이 되어 있지 않은 시점과 비교하여, 체중 절대값, 체격 지수 또는 체지방률이 증가 또는 유지되어 있는 상태, 또는 체중 조절이 되어 있지 않은 상황 하와 비교하여, 체중 절대값, 체격 지수 또는 체지방률이 증가해 가는 경향이 억제되어 있는 상황을 말하고, 본 명세서에 있어서는 「체중 감소 억제」 라고도 한다. 인간의 경우, 체격 지수의 대표적인 것으로서, 신장 BMI (Boby Mass Index) 가 사용되고, 그 계산은 체중 (㎏)÷신장 (m)÷신장 (m) 으로 단위는 ㎏/㎡ 로 표시된다. 따라서, 체중 증가 억제 또는 체중 증가 항진의 효과는, 이러한 BMI 를 지표로 하여 나타내는 것도 가능하다. 또한, 체지방률은, 체중에 차지하는 체지방의 중량의 비율로 나타나고, 그 측정은, 체밀도법·체수분법·체내 칼륨량 측정법·임피던스법·이중 에너지 X 선 흡수법·중성자 부활법·근적외 분광법·피하지방 두께법·화상법 등으로 실시하는 것이 가능하다 (일본 임상 61 권 증간호 6 p357-400 2003 년 일본 임상사 간행).
본 발명에 있어서, 「PPARγ 애고니스트 활성을 갖는 티아졸리딘디온류의 화합물」 이란, 예를 들어 트로글리타존, 피오글리타존, 로시글리타존 및 리보글리타존 등이 포함되고, 그 중에서도 트로글리타존은 최초로 임상적으로 사용된 물질이 다.
본 발명에 있어서 섭식 조절 및/또는 체중 조절 관련 인자의 취득에 사용되는 포유류 세포로는, 폐비소세포암 세포주, 지방 세포 및 뇌신경 유래 세포 등을 들 수 있는데, PPARγ 를 발현하고 있는 세포이면 특별히 이들에 한정되지 않는다.
상기 화합물을 포유류 세포에 작용시키는 방법은, 예를 들어 이하에 서술하는 바와 같이, 상기 세포를 그 화합물의 자극 하에서 배양하는 방법이 있다 (Satoh 등 Oncogene (England) 2002 년 21 권 p2171-2180).
상기 그 화합물에 의해 발현 유도되는 유전자의 동정은, 예를 들어 특이적으로 발현이 유도된 유전자를, 서브트랙션법이나 DNA 어레이 해석 등의 방법을 사용함으로써 실시할 수 있다 (Satoh 등 Oncogene (England) 2002 년 21 권 p2171-2180). 또, 얻어진 PPARγ 의 활성화에 의해 특이적으로 유도되는 유전자 중에서, 세포 외로 분비되는 인자를 코드하고 있는 것을 선택하기 위해서는, 그 유전자의 염기 배열을 해석하여 분비 시그널 펩티드가 코드되어 있는지에 따라 선택하는 것이 가능하다. 또한, 그들 유전자 중에서 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관여하는 유전자를 선택하는 방법으로는, 인간 또는 동물의 시상하부를 포함하는 뇌의 시료, 및 그 유전자에 의해 코드되어 있는 폴리펩티드에 결합하는 항체를 사용하는 조직 추출물에서의 면역학적 검출 (실시예 3 에 예시) 이나 조직 화학적 방법 (실시예 4 및 9 에 예시) 등의 방법, in situ hybridization (실시예 8 에 예시) 이나 RT-PCR 법 등을 사용하는 시상하부에서의 발현을 확인하는 방법을 들 수 있다.
또한, 얻어진 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관여하는 유전자는, 그 염기 배열을 해석함으로써 코드하는 폴리펩티드의 아미노산 배열을 동정할 수 있다. 얻어진 폴리펩티드의 아미노산 배열 또는 그 부분적인 아미노산 배열을 포함하는 펩티드 또는 폴리펩티드는 유전자 공학적 또는 합성 화학적인 수법을 사용하여 제조하는 것이 가능하다.
이와 같이 하여 얻어진 폴리펩티드, 또는 생체 내에서 발현하는 형태로 도입된 그 펩티드를 코드하는 핵산 분자를, 시험 동물에 국소적 또는 전신적으로 도입하고, 그 동물의 섭식량 및/또는 체중의 변화를 조사함으로써, 얻어진 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자 중에서, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관련되는 폴리펩티드 또는 유전자를 선택할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 얻어진 폴리펩티드에 대하여 결합하는 항체나, 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자나 RNAi 분자 등을 시험 동물에 국소적 또는 전신적으로 도입하고, 그 동물의 섭식량 및/또는 체중의 변화를 조사함으로써, 얻어진 폴리펩티드 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자 중에서, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관련되는 폴리펩티드 또는 유전자를 선택할 수도 있다.
<섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드>
본 발명은, 상기 방법에 의해 얻어지는 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이다. 이러한 폴리펩티드로는, 지금까지 기능이 동정되어 있지 않던 NESFATIN 유전자가 코드하는 폴리펩티드를 들 수 있고, 그 폴리펩티드가 상기 기능을 갖는 것은 본 발명에 있어서 처음으로 알게된 것이다. 본 발명에 있어서, NESFATIN 유전자는, 식욕을 제어하고 있다고 알려진 뇌의 시상하부에 발현하는 것이 발견되었고 (실시예 4, 8, 9, 24 및 26 에 예시), NESFATIN 폴리펩티드는 동물의 뇌내에 투여됨으로써 동물의 섭이량 및 체중의 저하를 야기하는 것이 발견되었다 (실시예 6 및 25 에 예시). 또한, NESFATIN 폴리펩티드의 기능 억제 또는 NESFATIN 유전자의 발현을 저해함으로써, 동물에 있어서 섭식 항진 및 체중 증가가 야기되는 것이 나타났다 (실시예 7 및 실시예 15 에 예시).
또, NESFATIN 폴리펩티드의 예로는, 배열 번호 3, 6 및 9 로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 것을 들 수 있다. 인간의 시그널 펩티드를 포함한 전구체 NESFATIN 폴리펩티드를 배열 번호 2 에 나타낸다. 전구체 NESFATIN 폴리펩티드는 세포 외로 분비되었을 때에는 시그널 펩티드가 절단되기 때문에, 실질적으로 활성을 나타내는 인간의 성숙형 NESFATIN 폴리펩티드는 배열 번호 3 에 나타내는 형태가 된다. 또, 본 명세서에 있어서, NESFATIN 폴리펩티드는, 단지 NESFATIN 이라고도 한다.
또한, 본 발명에 있어서 상기 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 NESFATIN 폴리펩티드에 대한 연구를 예의 계속한 결과, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 신규 구조의 폴리펩티드를 발명하기에 이르렀다. 이 신규 구조의 폴리펩티드의 발견은 NESFATIN 폴리펩티드가 세포 외로 분비될 때 단백질 분해 효소에 의해 분해를 받을 가능성을 상정하여, NESFATIN 폴리펩티드에서 유 래되는 여러 가지 펩티드에 대한 검토에 따른 것이다. 그 결과, 배열 번호 5 에 나타낸 NESFATIN 폴리펩티드의 아미노산 번호 25 번 내지 106 번에 상당하는 배열을 갖는 82 아미노산으로 이루어지는 폴리펩티드가, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 나타내는 것, 및 체지방률을 저하시키는 것을 발견하고 (실시예 12, 실시예 13 및 실시예 34 에 예시), 또한 NESFATIN-1 폴리펩티드의 기능 억제를 저해함으로써, 동물에 있어서 섭식 항진이 야기되는 것이 나타났다. 이로부터, 그 폴리펩티드를 NESFATIN-1 (배열 번호 14) 로 명명하였다. NESFATIN 폴리펩티드는 칼슘 결합성 및 DNA 결합성의 도메인 등을 구조 내에 갖고 있는데, NESFATIN-1 폴리펩티드는 이들 이미 알려진 도메인 구조를 포함하지 않는 배열이고, 이 NESFATIN-1 폴리펩티드를 취득하는 것은 종래의 기술로부터 예기하는 것은 전혀 불가능하였다. 또, 생체 내의 펩티드 호르몬에서는, 전구체 단백질의 형태로 발현되고, 그 후 단백질 분해 효소 등으로 절단되는 형태를 취하는 예도 많이 알려져 있고, 그 작용에는 프로호르몬·컨버타제 (Prohormone Convertase 또는 Proprotein Convertase : PC) 가 관여하고 있는 예가 많이 보고되어 있다. 배열 번호 2 의 인간 전장 (全長) NESFATIN 폴리펩티드, 배열 번호 5 의 마우스 전구체 NESFATIN 폴리펩티드 및 배열 번호 8 의 래트 전구체 NESFATIN 폴리펩티드에는, 프로호르몬·컨버타제의 서브타입인 PC1/3 (EC 3.4.21.93, Seidah 등 DNA and Cell Biology (USA) 9 권 1990 년 p415-424) 이나 PC2 (EC 3.4.21.94, Seidah 등 DNA and Cell Biology (USA) 9 권 1990 년 p415-424) 에 의해 절단될 가능성이 있는 공통의 부위가 존재하고 (실시예 10 참조), 각각 배열 번호 13 내지 15 에 나타내는 NESFATIN-1 펩티드가 절단될 가능성이 나타났다.
또, 프로호르몬·컨버타제에 의해 절단되는 부위에 변이를 넣은 NESFATIN (Mut) 을 래트 뇌실 내에 투여한 경우에는, 섭식 억제 효과가 관찰되지 않는다는 의외의 결과가 얻어졌다 (실시예 14). 이로부터, NESFATIN-1 폴리펩티드가, 생체 내에서 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관여하는 기능 분자일 가능성이 나타난 것과 함께, NESFATIN 폴리펩티드가 기능하기 위해서는, 프로호르몬·컨버타제 등의 생체 내에 함유되는 프로테아제에 의해 프로세스되는 과정이 중요한 것을 알아냈다.
이상으로부터, NESFATIN/NEFA 가 프로인슐린과 같이 호르몬의 전구체로서 기능하는 것은 전혀 알려져 있지 않고, 본 발명에 있어서 NESFATIN/NEFA 의 발현 부위나, PC1/3 및 PC2 가 발현하는 세포에서의 NESFATIN/NEFA 의 발현을 해석하고, 활성과 구조에 대하여 예의 검토한 결과, 처음으로 발견된 것이다. 또한, 프로호르몬·컨버타제의 인식 부위인 Arg-Arg 나 Lys-Arg 의 배열이 존재해도 PC1/3·PC2 로 프로세스되지 않은 분비 단백질도 존재하는 점에서, NESFATIN/NEFA 로부터 NESFATIN-1 이 절단되어 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 나타내는 것은 용이하게 유추되는 것이 아니다.
이상으로부터, 본 발명은, 배열 번호 13∼15 에 나타내는 NESFATIN-1 폴리펩티드에 관한 것이기도 하다. 그 NESFATIN-1 폴리펩티드는, 상기 서술한 바와 같이, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 것이다. 마우스의 NESFATIN-1 폴리펩티드의 아미노산 배열을 배열 번호 14 에 나타낸다. 이러한 배열을 갖는 NESFATIN-1 폴리펩티드는, 배열 번호 14 의 NESFATIN 폴리펩티드를 프로호르몬·컨버타제로 절단하고, 역상 크로마토그래피 등의 수법으로 정제하거나, 또는 후술하는 NESFATIN-1 폴리펩티드에 대한 항체에 대한 결합과 유리 공정을 실시함으로써 취득할 수 있다.
또한, NESFATIN-1 폴리펩티드의 구조와 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성에 대해서 예의 검토를 계속한 결과, 배열 번호 14 에 나타낸 NESFATIN 폴리펩티드의 아미노산 번호 24 번 내지 53 번에 상당하는 배열을 갖는 30 아미노산으로 이루어지는 신규 폴리펩티드가, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 나타내는 것을 발견하고 (실시예 20 에 예시), 그 폴리펩티드를 NESFATIN-1M30 (배열 번호 41) 으로 명명하였다. NESFATIN-1M30 폴리펩티드의 발견은, NESFATIN 폴리펩티드 또는 NESFATIN-1 폴리펩티드가 생리적 또는 인공적으로 절단 또는 분해된 경우이어도, NESFATIN-1M30 에 상당하는 부분을 포함하는 폴리펩티드가 존재하면, 그 폴리펩티드는 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 보유하는 것을 나타내고 있다.
또, 30 아미노산 길이로 이루어지는 NESFATIN-1M30 의 구조 중, 섭식 억제 활성을 갖는 부위의 활성에 대해서 검토하였다. 그 결과, 그 부분 펩티드인 16 아미노산 길이로 이루어지는 NESFATIN-1M16, 14 아미노산 길이로 이루어지는 NESFATIN-1M14, 10 아미노산 길이로 이루어지는 NESFATIN-1M10M 은, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 보유하는 것이 나타났다 (실시예 22).
이러한 배열 번호 13, 배열 번호 14 또는 배열 번호 15 에 나타내는 82 아미 노산으로 이루어지는 NESFATIN-1 의 배열을, 이미 알려진 섭식 조절 작용을 갖는 인자의 아미노산 배열에 대한 상동성에 대해서 해석한 결과에서는 강한 상동성을 갖는 배열은 발견되지 않으므로, 이들 NESFATIN-1M30, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M 이 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 나타내는 것을 예측하는 것은 종래의 기술로부터는 불가능하였다. 또한, 활성을 나타내지 않은 인간 유래의 NESFATIN 및 NESFATIN-1 이어도, 이들 NESFATIN-1M30, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M 에 상당하는 폴리펩티드에 있어서는, 활성을 갖는 것도 분명해졌다.
즉, 본 발명은, 배열 번호 39∼41 에 나타내는 NESFATIN-1M30 폴리펩티드, 배열 번호 65, 68 또는 71 에 나타내는 NESFATIN-1M16 폴리펩티드, 배열 번호 66, 69 또는 72 에 나타내는 NESFATIN-1M14 폴리펩티드, 또는 배열 번호 68, 70 또는 73 에 나타내는 NESFATIN-1M10M 폴리펩티드에 관한 것이다. 그 NESFATIN-1M30 폴리펩티드, NESFATIN-1M16 폴리펩티드, NESFATIN-1M14 폴리펩티드, 및 NESFATIN-1M10M 폴리펩티드는, 상기 서술한 바와 같이, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 것이다. 또한, 인간의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드의 아미노산 배열을 배열 번호 39 에 나타낸다. 또한, 여기에서는, 배열 번호 3, 배열 번호 6, 배열 번호 9, 배열 번호 13, 배열 번호 14 또는 배열 번호 15 에 나타내는 배열을 갖는 폴리펩티드를 제외한, 배열 번호 39, 배열 번호 40 또는 배열 번호 41 에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드 중, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드도 NESFATIN-1M30 폴리펩티드에 포함된다. 이러한 폴리펩티드의 예로는, NESFATIN 폴리펩티드 또는 NESFATIN-1 폴리펩티드가 생리적 또는 인공적으로 절단 또는 분해된 폴리펩티드 중, NESFATIN-1M30 에 상당하는 배열이 포함되는 것을 들 수 있다.
NEFA/NESFATIN 과 아미노산 배열 및 유전자에서의 염기 배열의 상동성이 높고, 동일한 패밀리에 속하는 NucleobindinⅠ (NUCB1) 에 있어서, NUCB1 의 NESFATIN-1M30 에 상당하는 부위인 NUCB1-M30 도 동일한 활성을 나타내는지를 검토하였다. 그 결과, NUCB1-M30 도 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 것이 분명해졌다 (실시예 23). 또, 인간·래트·마우스의 NESFATIN 을 비교한 결과, 각종에 있어서의 NESFSATIN 및 NUCB1 의 NESFASTIN-1 에 상당하는 부위, 특히 NESFATIN-1M30 에 상당하는 부위에 있어서, 아미노산 배열의 보존성이 높은 것이 나타났다. 이상으로부터, NESFATIN-1M16 폴리펩티드, NESFATIN-1M14 폴리펩티드, 및 NESFATIN-1M10M 폴리펩티드와 동일하게, NUCB1 의 16 아미노산 길이로 이루어지는 NUCB1-M16, 14 아미노산 길이로 이루어지는 NUCB1-M14, 10 아미노산 길이로 이루어지는 NUCB1-M10M 도, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 보유하는 것이 추측된다.
즉, 본 발명은, 배열 번호 101∼103 에 나타내는 NUCB1-M30 폴리펩티드, 배열 번호 107, 110 또는 113 에 나타내는 NUCB1-M16 폴리펩티드, 배열 번호 108, 111 또는 114 에 나타내는 NUCB1-M14 폴리펩티드, 또는 배열 번호 109, 112 또는 115 에 나타내는 NUCB1-M10M 폴리펩티드에 관한 것이다. 그 NUCB1-M30 폴리펩티드, NUCB1-M16 폴리펩티드, NUCB1-M14 폴리펩티드, 및 NUCB1-M10M 폴리펩티드는, 상기 서술한 바와 같이, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 것이다.
또한, 본 발명은, 배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 로 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나와, 적어도 60% 이상의 호몰로지를 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이기도 하다. 배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 로 나타내는 아미노산 배열과의 호몰로지는, 70% 이상이 바람직하고, 80% 이상이 더욱 바람직하다. 그 대표적인 예로는, 인간 이외의 동물종에 있어서의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드를 들 수 있다. 예를 들어, 인간의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드의 아미노산 배열 (배열 번호 39) 과 60% 이상의 호몰로지를 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드로는, 마우스의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드 (배열 번호 41), 및 래트의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드 (배열 번호 40) 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 로 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나와, 적어도 60% 이상의 호몰로지를 갖는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드 중, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드의 선택은, 그 폴리펩티드, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자를, 시험 동물에 국소적 또는 전신적으로 도입하고, 그 동물의 섭식량 및/또는 체중을 억제하는 폴리펩티드를 선택함으로써 실시할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 상기 폴리펩티드에 대한 항체나, 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자나 RNAi 분자 등을 시험 동물에 국소적 또는 전신적으로 도입하고, 그 동물의 섭식량 및/또는 체중을 억제하는 폴리펩티드를 선택함으로써 실시할 수 있다. 이하, 이러한 폴리펩티드를 NESFATIN-1M30 개변체, NESFATIN-1M16 개변체, NESFATIN-1M14 개변체, NESFATIN-1M10M 개변체, NUCB1-M30 개변체, NUCB1-M16 개변체, NUCB1-M14 개변체, 및 NUCB1-M10M 개변체 등이라고 한다.
또한, 본 발명은, 배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 에 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나에 있어서, 그 일부의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 아미노산 배열로 이루어지고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이기도 하다. 이러한 폴리펩티드는, 예를 들어 배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 의 아미노산 배열에 있어서, 1 개 이상의 아미노산 잔기를, 그 아미노산과 화학적 성상 또는 구조적으로 유사한 아미노산과 치환함으로써 취득할 수 있다. 이러한 화학적 성상 또는 구조적으로 유사한 아미노산의 치환, 즉 보존성이 높은 아미노산 치환의 구체적인 양태는, 당업자에게 널리 알려져 있다. 예를 들어, 글리신 (Gly) 은 프롤린 (Pro), 알라닌 (Ala) 및 발린 (Val) 과, 류신 (Leu) 은 이소류신 (Ile) 과, 글루타민산 (Glu) 은 글루타민 (Gln) 과, 아스파라긴산 (Asp) 은 아스파라긴 (Asn) 과, 시스테인 (Cys) 은 트레오닌 (Thr) 과, Thr 은 세린 (Ser) 및 Ala 와, 리신 (Lys) 은 아르기닌 (Arg) 과, 화학적 성상 또는 구조가 유사한 것이다. 또 다른 방법으로는, 아미노산의 치환 용이성을 행렬로 나타낸 아미노산 매트릭스, 예를 들어 PAM (Wilbur, Molecular biology and evolution (USA) 1985 년 2 권 p434-447) 이나 BLOSUM (Henikoff 등, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (USA) 1992 년 89 권 p10915-10919) 등을 참조하고, 그 스코어의 높이를 감안하여 아미노산을 치환하는 것은, 당업자이면 용이하게 실시할 수 있다.
또, 배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 에 나타내는 아미노산 배열의 어느 하나에 있어서, 그 일부의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드 중, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드의 선택은, 상기 서술한 NESFATIN 개변체의 선택과 동일하게 실시할 수 있다. 또, 이하, 이러한 폴리펩티드도 NESFATIN-1M30 개변체 등이라고 한다.
또한, 본 발명은, 배열 번호 3, 6 또는 9 로 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나와 적어도 60% 이상의 호몰로지를 갖는 아미노산 배열 ; 또는 배열 번호 3, 6 또는 9 로 나타내는 아미노산 배열의 어느 하나에 있어서, 그 일부의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 아미노산 배열로 이루어지고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드에 관한 것이기도 하다. 그 폴리펩티드를, 상기 서술한 개변체와 동일하게, 이하 NESFATIN 개변체라고 한다. 당해 NESFATIN 개변체는, 상기 서술한 NESFATIN-1M30 개변체 등과 동일하게, 배열 번호 3, 6 또는 9 로 나타내는 아미노산 배열과의 호몰로지는, 70% 이상이 바람직하고, 80% 이상이 더욱 바람직하다.
또, 상기 서술한 바와 같이, NESFATIN 폴리펩티드가 기능하기 위해서는, 프로호르몬·컨버타제 등의 생체 내에 함유되는 프로테아제에 의해 프로세스되는 과정이 중요한 것이 본 발명에 의해 분명해졌다. 그 때문에, 당해 NESFATIN 개변체로는, 생체 내에서 NESFATIN-1, NESFATIN-1M30, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M, NUCB1-M30, NUCB1-M16, NUCB1-M14, 또는 NUCB1-M10M (배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 로 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드), 또는 그들의 개변체를 생성시키는 폴리펩티드인 것이 바람직하다. 이러한 NESFATIN 개변체로는, 그 아미노산 배열 중에, 생체 내에 함유되는 프로테아제 등의 절단 효소의 인식 부위를 갖는 것이 필요하다. 이러한 절단 효소로는, 예를 들어 프로호르몬·컨버타제 (프로프로테인·컨버타제 : PC) 등을 들 수 있고, 이러한 프로호르몬·컨버타제로는, 예를 들어 furin, PC1 (PC3 으로서도 알려져 있다), PC2, PACE4, PC4, PC6 (PC5 로서도 알려져 있다), LPC (PC7 또는 PC8 로서도 알려져 있다) 등을 들 수 있다 (The FASEB Journal, 1216, vol.17, July 2003). 또, 말초 또는 뇌실 내에 NESFATIN-1 등을 생성시키는 것이면 되고, 프로테아제의 종류는 특별히 한정되는 것이 아니다.
또한 동일한 이유에 의해, 그 절단 효소의 인식 부위의 위치도 특별히 한정되는 것은 아니지만, NESFATIN 개변체이면, 마우스 유래 NESFATIN-1, NESFATIN-2, NESFATIN-3 및 NESFATIN-2/3 의 실험 결과로부터 (실시예 10), NESFATIN-1 을 생성시키는 프로호르몬·컨버타제의 인식 부위인, 배열 번호 3, 6 또는 9 의 아미노산 번호 82·83 과, 마우스 유래 NESFATIN 에 포함되는 다른 1 지점의 프로호르몬·컨 버타제의 인식 부위인, 배열 번호 3, 6 또는 9 의 163·164 아미노산의 사이, 즉 배열 번호 3, 6 또는 9 의 아미노산 번호 82∼162 에 상당하는 아미노산 배열 중에, 생체 내에 포함되는 절단 효소의 인식 부위를 적어도 1 개 포함하도록 설정되는 것이, 발생할 수 있는 폴리펩티드의 활성에 영향을 주지 않는 점에서 바람직하다.
또, 그 개변체가, 생체 내에서 절단되어 활성을 갖는지를 포함하여, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 것인지의 확인은, 상기 서술한 NESFATIN-1M30 개변체 등의 선택과 마찬가지로, 그 폴리펩티드, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자를, 시험 동물에 국소적 또는 전신적으로 도입하고, 그 동물의 섭식량 및/또는 체중을 억제하는 폴리펩티드를 선택함으로써 실시할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 상기 폴리펩티드에 대한 항체나, 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자나 RNAi 분자 등을 시험 동물에 국소적 또는 전신적으로 도입하고, 그 동물의 섭식량 및/또는 체중을 억제하는 폴리펩티드를 선택함으로써 실시할 수 있다.
본 발명의 NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드, NESFATIN-1M30, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M, NUCB1-M30, NUCB1-M16, NUCB1-M14, 또는 NUCB1-M10M 은, N 말단 또는 C 말단에 적어도 1 개 이상의 아미노산이 부가된 것도 포함한다. 이러한 NESFATIN 폴리펩티드 등에는, 예를 들어 배열 번호 3, 배열 번호 6 또는 배열 번호 9 의 아미노산 배열의 N 말단에, 메티오닌 잔기, 아세틸기 또는 피로글루타민산 등이 부가된 것, 및 N 말단 또는 C 말단에 적당 한 태그 배열 (전형적으로는 히스티딘 태그 또는 FLAG 태그) 을 부가한 것이 포함된다. 이러한 구성을 갖는 NESFATIN 폴리펩티드 등은, 금속 킬레이트 담체 또는 항체를 사용한 정제가 용이해진다는 이점을 갖는다. 또한, NESFATIN 이 생체 내에서 프로호르몬·컨버타제에 의해 프로세스된 경우에는, NESFATIN-1 의 C 말단에 프로호르몬·컨버타제 인식 부위가 부가된 것이 생성될 수 있는 것으로 생각되는데, 이러한 폴리펩티드도, 본 발명의 폴리펩티드에 포함된다.
또한, 본 발명의 NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드, NESFATIN-1M30, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M, NUCB1-M30, NUCB1-M16, NUCB1-M14, 또는 NUCB1-M10M 은, 적어도 1 개의 아미노산 잔기가, 화합물 또는 펩티드에 의해 수식된 것도 포함한다. 이러한 NESFATIN 폴리펩티드 등에는, 예를 들어 배열 번호 3, 배열 번호 6 또는 배열 번호 9 에 나타내는 배열 등에, NESFATIN 폴리펩티드 등 이외의 펩티드나 형광 물질 등을, 공지된 방법 (Hermanson 등 Bioconjugate techniques (USA) 1996 년 발행 Academic Press) 을 사용하여 효소적 또는 화학적으로 회합시켜 얻어지는 폴리펩티드가 포함되고, 예를 들어 발광 해파리 유래 형광 단백질이나 분비형 알칼리 포스파타아제의 아미노산 배열을 부가한 것 (이른바 융합 단백질) 을 들 수 있다. 예를 들어, 발광 해파리 유래 형광 단백질과의 융합 단백질은, 그 형광 강도를 측정함으로써, 분비형 알칼리 포스파타아제와의 융합 단백질은, 그 효소와 그 기질을 반응시킴으로써 발생하는 발색, 발광 또는 형광의 강도를 측정함으로써, 그들 융합 단백질의 존재를 용이하게 검출할 수 있다. 이러한 NESFATIN 폴리펩티드 등은, 실시예 6 에 기재된 방법 등으 로 활성을 시험함으로써, 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 대한 작용을 동정하는 것이 가능하다.
본 발명은, NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드, NESFATIN-1M30, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M, NUCB1-M30, NUCB1-M16, NUCB1-M14, 또는 NUCB1-M10M 또는 이들의 개변체 (이하 통합하여 「NESFATIN 폴리펩티드 등」 이라고 한다) 중 어느 하나, 또는 그 NESFATIN 폴리펩티드 등의 아미노산 배열의 일부를 포함하는 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제를 위한 의약 조성물에 관한 것이다. 그 NESFATIN 폴리펩티드 등의 아미노산 배열의 일부를 포함하는 펩티드란, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 유지하는 한도에서, 그 폴리펩티드의 일부의 아미노산 배열을 결실시킨 것을 말한다.
<섭식이나 체중 증가가 항진하고 있는 것이 문제가 되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물>
본 발명은, 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등의 어느 하나, 또는 그 NESFATIN 폴리펩티드 등의 아미노산 배열의 일부를 포함하는 펩티드를 유효 성분으로서 함유하는 섭식이나 체중 증가가 항진하고 있는 것이 문제가 되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 NESFATIN 폴리펩티드 등의 약리학적인 효과는, NESFATIN 폴리펩티드의 래트 제 3 뇌실 내에 대한 투여 (실시예 6 및 25), NESFATIN-1 폴리펩티드의 래트 제 3 뇌실 내에 대한 투여 (실시예 12, 13, 27 및 34), NESFATIN-1 폴리펩티 드의 마우스 복강내 또는 피하에 대한 투여 (실시예 18 및 실시예 19), NESFATIN-1M30 폴리펩티드의 마우스 복강 내에 대한 투여 (실시예 20) 등에 예시되는 결과에 의해 증명되어 있다. 또한, 렙틴 저항성을 나타내는 모델 동물인 Zucker (fa/fa) 래트에 있어서의 NESFATIN-1 폴리펩티드의 제 3 뇌실 내에 대한 투여 (실시예 17) 에 의해, 병태 모델 동물에서의 약리학적인 효과를 예시하고, 또한 인간의 비만에 있어서도 문제로 되어 있는 렙틴 저항성의 병태에 대한 약리학적인 효과를 예시하고 있다. 또한, Agouti yellow 마우스에서의 투여 실험 (실시예 18) 에 의해 이미 알려진 섭식 조절에 관계되는 인자인 멜라노콜틴계와는 다른 기구를 통해 섭식 제어를 실시할 가능성에 대해서도 약리학적으로 나타내고 있다. 이들 예시한 사실로부터, NESFATIN 폴리펩티드 등은 섭식이나 체중 증가가 항진하고 있는 것이 문제가 되는 질환의 치료 또는 예방을 위한 의약 조성물로서 사용하는 것이 가능한 것이 증명되어 있다.
섭식이나 체중 증가가 항진하고 있는 것이 문제가 되는 질환이란, 예를 들어 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 정형외과적 질환, 월경 이상 및 악성 종양 등을 들 수 있다. 비만에는, 비만에서 기인 내지 관련되는 건강 장해를 합병하거나, 임상적으로 그 합병이 예측되는 경우, 의학적으로 감량을 필요로 하는 병태인 비만증이 포함된다. 정형외과적 질환에는, 과체중에 의한 변형성 관절증, 요추증 (변형성 척추증), 요통증 (허리병) 등이 포함된다. 또한, 악성 종양에는, 유방암, 자궁암, 결장암, 신장암, 식도암, 췌장암, 간장암 및 담낭암이 포함된다.
또한, 본 발명의 의약 조성물은, 약학적으로 허용되는 어느 첨가제를 함유해도 된다. 약학적으로 허용되는 첨가제를 사용한 제제는 「REMINGTON : THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20th EDITION 필라델피아 과학 대학 (University of the Sciences in Philadelphia) 저 Williams & Wilkins 사 2000 년 12 월 15 일 발행」 에 기재된 방법으로 실시하는 것도 가능하다. 이러한 의약 조성물의 하나의 형태로는, 무균의 수성액 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제된 액제로서 제공된다. 이러한 용제로서, 수성액으로는 주사용 증류수, 생리 식염수 등을 들 수 있고, 그것에 추가하여 삼투압 조절제 (예를 들어, D-글루코오스, D-소르비톨, D-만니톨, 염화 나트륨 등) 가 첨가되거나, 적당한 용해 보조제, 예를 들어 알코올 (예를 들어 에탄올), 폴리알코올 (예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면 활성제 (예를 들어 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 50) 등이 병용되는 경우도 있다. 또한, 용제로는 유성액이 사용되는 경우도 있고, 그 유성액의 예로는 참기름, 대두유 등을 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질, 벤질알코올 등이 병용되는 경우도 있다. 이러한 액제에 있어서는 적절히 완충제 (예를 들어, 인산염류 완충제, 아세트산염류 완충제), 무통화제 (예를 들어, 염화 벤잘코늄, 염산 프로카인 등), 안정제 (예를 들어, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예를 들어, 아스코르브산, 에리소르브산 및 그들의 염 등), 착색제 (예를 들어, 구리 클로로필, β-카로틴, 적색 2 호, 청색 1 호 등), 방부제 (예를 들어 파라옥시벤조산 에스테르, 페놀, 염 화 벤제토늄, 염화 벤잘코늄 등), 증점제 (예를 들어 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 및 그들의 염 등), 안정화제 (예를 들어 사람 혈청 알부민, 만니톨, 소르비톨 등), 교취제 (예를 들어 멘톨, 감귤향료 등) 의 첨가제가 사용되는 경우가 있다. 또 다른 의약 조성물 (상기 몇 개 「의약품 조성물」 의 표현과 통일하기 위해) 의 형태로는, 산제, 정제, 과립제, 캡슐제, 환제, 좌제, 트로키제 등의 고형제를 들 수 있다. 경구용 제제의 형태로 투여하는 고형제의 경우에는, 첨가제로서 부형제 (예를 들어, 결정성 셀룰로오스, 락토오스, 전분 등), 활택제 (예를 들어, 스테아르산 마그네슘, 탤크 등), 결합제 (히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 마크로골 등), 붕괴제 (예를 들어, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘 등) 등이 사용된다. 또한, 필요에 따라, 방부제 (예를 들어, 벤질알코올, 클로로부탄올, 파라옥시벤조산 메틸, 파라옥시벤조산 프로필 등), 항산화제, 착색제, 감미제 등의 첨가제를 사용할 수 있다. 또 다른 형태로서, 점막용 의약 조성물도 들 수 있고, 이 제제에 있어서는 점막에 대한 흡착성, 체류성 등을 부여하는 것을 주된 목적으로 하여 첨가제로서 점착제, 점착 증강제, 점조제, 점조화제 등 (예를 들어, 뮤신, 한천, 젤라틴, 펙틴, 카라기난, 알긴산 나트륨, 로커스트빈검, 잔탄검, 트라가칸트검, 아라비아 고무, 키토산, 풀루란, 전분, 수크랄페이트, 셀룰로오스 및 그 유도체 (예를 들어, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리글리세린지방산 에스테르, 아크릴산 (메트)아크릴산 알킬 공중합체 또는 그 염, 폴리글리세린 지방산 에스테르 등) 가 함유되는 경우도 있다. 그러나, 생체에 공여되는 의약 조성물의 형태 및 용제나 첨가제는 이들에 한정 되는 것이 아니고, 당업자이면 적절히 선택할 수 있다.
상기 의약 조성물은, 증상의 개선을 목적으로 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 경구 투여의 경우에는, 과립제, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 시럽제, 유제 또는 현탁제, 엘릭시르제 등의 제형을 선택할 수 있다. 비경구 투여의 경우에는, 예를 들어 경비제로 할 수 있고, 액제, 현탁제, 고형 제제 등을 선택할 수 있다. 또 다른 비경구 투여의 형태로는, 주사제로 할 수 있고, 주사제로는, 피하 주사제, 정맥 주사제, 점적 주사제, 근육 주사제, 뇌실내 주사제 또는 복강내 주사제 등을 선택할 수 있다. 또한 그 밖의 비경구 투여에 사용하는 제제로는, 좌제, 설하제, 경피제, 경비제 이외의 경점막 투여제 등도 들 수 있다. 또한, 스텐트나 혈관내 전색제에 함유 또는 도포하는 양태로, 혈관내 국소 투여할 수도 있다.
상기 의약 조성물의 투여량은, 환자의 연령, 성별, 체중, 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간, 또는 그 의약 조성물에 함유되는 활성 성분의 종류 등에 따라 다르지만, 통상 성인 1 명당, 1 회에 대하여 0.1㎎ 내지 500㎎ 의 범위에서, 바람직하게는 0.5㎎ 내지 200㎎ 의 범위에서 투여할 수 있다. 그러나, 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동되므로, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또한 상기 범위를 초과하는 투여량이 필요한 경우도 있다.
또, NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자는, 유전자 치료의 양태에서 사용할 수 있다. 그 유전자 치료란, 예를 들어 그 유전자를 생체에 도입함으로써 치료 효과를 달성할 수 있는 것이다. 치료 효과를 가져오는 단백질을 코드 하는 유전자를 생체에 도입하고, 발현시킴으로써, 질환을 치료하는 수법은 공지되어 있다 (카네다 저 일본 약리 잡지 2001 년 발행 117 권 p299∼306).
또한, NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자 중 어느 하나가 도입되고, 그 폴리펩티드를 발현하는 형태의 형질 전환체, 바람직하게는 도입하고 싶은 종에 이식 가능한 숙주를 사용한 형질 전환체를 투여함으로써, 그 형질 전환체로부터 생성되는 NESFATIN 폴리펩티드 등에 의한 치료를 실시하는 것도 가능하다.
<섭식 억제 및/또는 체중 조절 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자>
또한, 본 발명은, 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등의 어느 하나를 코드하는 핵산 분자에 관한 것이다. 상기 NESFATIN 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자로는, 인간의 전구체 NESFATIN 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자 (배열 번호 1), 마우스의 전구체 NESFATIN 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자 (배열 번호 4), 래트의 전구체 NESFATIN 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자 (배열 번호 7), 시그널 펩티드 부분을 제거한 성숙형 인간 NESFATIN 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자 (배열 번호 10), 마우스의 성숙형 NESFATIN 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자 (배열 번호 11), 또는 래트의 성숙형 NESFATIN 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자 (배열 번호 12) 등을 들 수 있다.
상기 NESFATIN-1 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자로는, 인간의 NESFATIN-1 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 18), 마우스의 NESFATIN-1 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 19), 및 래트의 NESFATIN-1 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 20) 등을 들 수 있다.
상기 NESFATIN-1M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자로는, 인간의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 44), 마우스의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 46), 및 래트의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 45) 등을 들 수 있다.
NESFATIN-1M16 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자로는, 인간의 NESFATIN-1M16 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 74), 마우스의 NESFATIN-1M16 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 80), 및 래트의 NESFATIN-1M16 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 77) 등을 들 수 있다.
NESFATIN-1M14 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자로는, 인간의 NESFATIN-1M14 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 75), 마우스의 NESFATIN-1M14 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 81), 및 래트의 NESFATIN-1M14 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 78) 등을 들 수 있다.
NESFATIN-1M10M 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자로는, 인간의 NESFATIN-1M10M 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 76), 마우스의 NESFATIN-1M10M 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 82), 및 래트의 NESFATIN-1M10M 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 79) 등을 들 수 있다.
NUCB1-M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자로는, 인간의 NUCB1-M30 폴리펩 티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 104), 마우스의 NUCB1-M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 106), 및 래트의 NUCB1-M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 105) 등을 들 수 있다.
NUCB1-M16 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자로는, 인간의 NUCB1-M16 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 116), 마우스의 NUCB1-M16 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 122), 및 래트의 NUCB1-M16 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 119) 등을 들 수 있다.
NUCB1-M14 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자로는, 인간의 NUCB1-M14 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 117), 마우스의 NUCB1-M14 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 123), 및 래트의 NUCB1-M14 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 120) 등을 들 수 있다.
NUCB1-M10M 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자로는, 인간의 NUCB1-M10M 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 118), 마우스의 NUCB1-M10M 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 124), 및 래트의 NUCB1-M10M 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 121) 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 NESFATIN 폴리펩티드 등에는, 상기 서술한 바와 같이, N 말단 또는 C 말단에 적어도 1 개 이상의 아미노산이 부가된 것, 및 적어도 1 개의 아미노산 잔기가 화합물 또는 펩티드에 의해 수식된 것도 포함된다. 이러한 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 핵산 분자로서, 예를 들어 NESFATIN 폴리펩티드를 예로 하면, 배열 번호 3, 배열 번호 6 또는 배열 번호 9 의 배열의 N 말단에 임의의 폴리펩티드가 부가된 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자는, 배열 번호 10, 배열 번호 11 또는 배열 번호 12 의 5' 말단에, ATG 라는 염기 배열을 가지며, 그 뒤에 부가하고 싶은 아미노산 배열을 코드하는 코돈을 늘어 놓은 염기 배열을 부가함으로써 얻을 수 있다. 또, NESFATIN 폴리펩티드 등의 아미노산 배열의 N 말단 및/또는 C 말단에, 프로호르몬·컨버타제 등의 프로테아제 인식 (절단) 배열이 부가된 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자도 본 발명의 핵산 분자에 포함되는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
그 외에는, 예를 들어 배열 번호 3, 배열 번호 6 또는 배열 번호 9 에 나타낸 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드를 코드하는 유전자 배열의 5' 또는 3' 말단에, 발광 해파리 유래 형광 단백질 또는 분비형 알칼리 포스파타아제를 코드하는 유전자 배열을, 각각의 단백질의 아미노산 배열이 번역되는 형태로 결합한 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자 등도 포함된다.
상기 NESFATIN 등 개변체를 코드하는 핵산 분자에는, 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 로 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나와, 적어도 60% 이상의 호몰로지를 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자가 포함되고, 그 호몰로지는 70% 이상이 바람직하고, 80% 이상이 더욱 바람직하다. 그 대표적인 예로는, NESFATIN-1M30 폴리펩티드를 예로 하면, 인간 이외의 동물종에 있어서의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 예를 들어, 인간의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드의 아미노산 배열 (배열 번호 39) 과 60% 이상의 호몰로 지를 갖는 아미노산 배열로 이루어지고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자로는, 마우스의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 46), 래트의 NESFATIN-1M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 45), 인간의 NUCB1-M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 104), 마우스의 NUCB1-M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 106), 및 래트의 NUCB1-M30 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 105) 등을 들 수 있는데, 이들 핵산 분자에 한정되는 것은 아니다.
또, 상기 NESFATIN 등 개변체를 코드하는 핵산 분자에는, 배열 번호 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 에 나타내는 아미노산 배열의 어느 하나에 있어서, 그 일부의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 아미노산 배열로 이루어지고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자도 포함된다.
또한, 본 발명은, 배열 번호 4, 7, 11, 12, 18, 19, 20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 에 나타내는 염기 배열 또는 그 염기 배열의 부분 배열과, 스트리전트 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자에 관한 것이기도 하다. 이러한 핵산 분자는, 배열 번호 4, 7, 10, 11, l2, 18, 19, 20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 에 나타내는 염기 배열 또는 그 염기 배열의 부분 배열을 사용하는 하이브리다이제이션법에 의해 얻을 수 있다. 구체적으로는 임의의 생물종에서 유래되는 cDNA 또는 게놈 DNA 단편 등이 삽입된 플라스미드 벡터 또는 파지 벡터를 대장균 등의 숙주에 도입한 라이브러리를 제조하고, 그것을 적당한 선택 약제를 함유하는 한천 배지 플레이트 상에서 배양한다. 그 후, 생성된 재조합 대장균 클론 또는 파지 클론을 니트로셀룰로오스막 등에 모사하고, 알칼리나 계면 활성제를 함유하는 상태에서 균체 또는 파지를 녹이고, 거기에 포함되는 DNA 를 막에 고정화시키고, 그 막에 대하여 배열 번호 4, 7, 10, 11, 12, 18, 19, 20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 에 나타내는 염기 배열 또는 그 염기 배열의 부분 배열로 이루어지는 DNA 를, 32P 등으로 표지하여 1 개 사슬로 한 프로브를 용해한 적당한 하이브리다이제이션 용액과 적절한 온도 하에서 반응시킨다. 반응 후, 그 막을 x2 SSC 등으로 세정하여 여분의 프로브를 제거한 후, 높은 스트리전트 조건, 예를 들어 x0.1 SSC 로 65℃, 또는 중간 정도로 스트리전트 조건, 예를 들어 x0.5 SSC 로 65℃ 의 조건에서 세정하고, 그 막을 암흑 하에서 X 선 필름과 접촉시켜 감광시킨다. 수시간 내지 수일간 저온 프리저 등 안에서 감광시킨 X 선 필름을 현상하여 감광한 스폿을 검출하고, 그 막에 전사한 원래의 플레이트의 대응하는 위치에 있는 대장균 또는 파지 클론을 채취하여 배양한 후, 벡터 중에 삽입되어 있는 유전자의 배열 해석을 실시함으로써, NESFATIN 유전자, NESFATIN-1 유전자 또는 NESFATIN-1M30 유전자와 상동성이 높은 유전자를 취득할 수 있다. 또한, 그 유전자 배열을 사용하여 추가로 cDNA 또는 게놈 라이브러리에서의 하이브리다이제이션에 의한 클론의 취득이나 프라이머 익스텐션법 등으로 주변 배열을 동정함으로써, 단백질을 코드하고 있는 유전자 구조를 해명하여 NESFATIN, NESFATIN-1, NESFATIN-1M30, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M, NUCB1-M30, NUCB1-M16, NUCB1-M14, 또는 NUCB1-M10M 과 상동성이 있는 분자의 핵산 분자를 취득할 수 있다. 또한, 배열 번호 4, 7, 10, 11, 12, 18, 19, 20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 에 나타내는 염기 배열 또는 그 염기 배열의 부분 배열과, 스트리전트 조건 하에서 하이브리다이즈하는 핵산 분자 중, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자의 선택은, 그 핵산 분자가 코드하는 폴리펩티드, 또는 그 핵산 분자를, 시험 동물에 국소적 또는 전신적으로 도입하고, 그 동물의 섭식량 및/또는 체중을 억제하는 핵산 분자를 선택함으로써 실시할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 그 핵산 분자가 코드하는 폴리펩티드에 대하여 결합하는 항체나, 그 핵산 분자가 코드하는 유전자의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자나 RNAi 분자 등을 시험 동물에 국소적 또는 전신적으로 도입하고, 그 동물의 섭식량 및/또는 체중을 억제하는 핵산 분자를 선택함으로써 실시할 수 있다.
<벡터>
또, 본 발명은, 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등의 어느 하나를 코드하는 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 핵산 분자를 포함하는 벡터를 사용하여, 미생물 등의 숙주 세포에 NESFATIN 폴리펩티드 등의 유전자 등을 도입한 재조합체를 제조함으로써, 그 유전자를 안정적으로 보존 또는 복제할 수 있다. 숙주 세포 내에서 복제되는 기능을 갖는 벡터에 삽입된 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자는, 재조합체 세 포를 적당한 배지에서 배양함으로써, 세포의 증식 또는 세포 내에서의 도입 유전자의 카피수의 증폭에 의해, 그 유전자의 핵산 분자를 대량으로 조제하는 것이 가능하다.
또한, 그 핵산 분자는, 그 핵산 분자의 발현을 제어하는 조절성 핵산 분자의 제어하에 기능적으로 결합되어 있어도 된다. 그 핵산 분자의 발현을 제어하는 조절성 핵산 분자로는, 예를 들어 프로모터 배열이나 인핸서 배열 등, 삽입된 유전자를 숙주 세포 내에서 발현하기 위한 조절 배열을 코드하는 핵산 분자 등을 들 수 있고, 당업자이면 적절히 선택할 수 있다. NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 핵산 분자가, 이러한 조절 배열을 코드하는 핵산 분자의 제어하에 삽입됨으로써, 임의의 숙주 세포 (예를 들어, 미생물, 포유류 세포, 곤충 세포 등) 에 있어서, NESFATIN 폴리펩티드 등을 대량으로 생성시킬 수 있다.
또, 본 발명에 사용할 수 있는 벡터로서, 통상 발현하고자 하는 유전자의 상류에 프로모터, 하류에 폴리아데닐화 부위 및 전사 종료 배열 등을 보유하는 발현 벡터를 들 수 있다. 척추 동물의 이러한 발현 벡터로는, 예를 들어 SV40 의 초기 프로모터를 보유하는 pSV2dhfr (Mol. Cell. Biol., 854, 1981), pcDNA3.1 (+) (Invitrogen 사) 및 pCAGGS (Gene, 108, 193-200, 1991) 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것이 아니라, 당업자이면 적절히 선택할 수 있다. 또한, 이러한 벡터는, 섭식 억제 또는 체중 증가 억제의 치료를 위해 포유류 세포에 도입할 수도 있다.
숙주로서 대장균을 사용하는 경우에는, 예를 들어 pBR322 및 그 개량 벡터 등을 사용할 수 있는데, 이들에 한정되지 않고 공지된 각종 균주 및 벡터도 이용할 수 있다. 프로모터로는, 예를 들어 대장균 락토오스 (lac), 대장균 trp 등의 프로모터를 들 수 있는데 이들에 한정되지 않는다. 또한, 그 프로모터는 모두 이미 특성화되어 있고, 당업자가 숙지하고 있는 것으로서, 합성적으로 또는 이미 알려진 플라스미드로부터 조립할 수 있는 것이다.
구체적인 예로서, 실시예 5 에, NESFATIN 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자를 벡터에 삽입하여, 대장균에서의 재조합체를 제조함으로써, 섭식 억제/또는 체중 증가 억제의 활성을 유지한 NESFATIN 폴리펩티드를 조제할 수 있었던 것을 나타낸다. 또한, 실시예 16 에, 배열 번호 13 내지 15 에 기재된 아미노산 배열을 Glutathione-S-Transferase (GST) 등과의 융합 단백질로서 발현시키고, 글루타티온 고정화 담체에 대한 흡착·탈착 반응을 사용하여 정제한 후, GST 부분을 절단하여 정제함으로써 NESFATIN-1 펩티드를 유전자 재조합법에 의해 제조할 수 있었던 것을 나타낸다. 또한 실시예 16 에서는 NESFATIN-1 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자를 벡터에 삽입하여, 대장균에서의 재조합체를 제조함으로써, 섭식 억제/또는 체중 증가 억제 활성을 유지한 NESFATIN-1 폴리펩티드를 조제할 수 있었던 것을 나타낸다.
또, 본 발명의 벡터는, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제를 위해, 유전자 치료 수법을 사용하여 포유류 세포에 도입함으로써, 치료 효과를 달성할 수 있다. 치료 효과를 가져오는 단백질, 즉 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자를 포유류 동물에 도입하고, 발현시킴으로써, 질환을 치료하는 방법은 공지되어 있다 (가네다 저 일본 약리 잡지 2001 년 발행 117 권 p299∼306).
<형질 전환체>
본 발명은, 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등의 어느 하나를 코드하는 핵산 분자를 포함하는 형질 전환체에 관한 것이다. 이러한 형질 전환체는, 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자를 숙주 세포에 도입하여 형질 전환함으로써, 얻을 수 있다. 형질 전환 방법으로는, 생물학적 방법, 물리적 방법, 화학적 방법 등을 나타낼 수 있다. 생물학적 방법으로는, 예를 들어 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 특이적 수용체를 이용하는 방법, 세포 융합법 (HVJ (센다이 바이러스)), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 전기적 세포 융합법, 미소핵 융합법 (염색체 이입) 을 들 수 있다. 물리학적 방법으로는, 마이크로 인젝션법, 일렉트로포레이션법, 진 파티클 건 (gene gun) 을 사용하는 방법을 들 수 있다. 화학적 방법으로는, 인산 칼슘 침전법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법, 프로토플라스트법, 적혈구 고스트법, 적혈구막 고스트법, 마이크로캡슐법을 들 수 있고, 당업자이면, 적절히 선택하여 실시할 수 있다. 또한, 얻어지는 형질 전환체는 통상적인 방법에 따라서 배양할 수 있고, NESFATIN 폴리펩티드 등이 생산된다. 배양에 사용되는 배지로는, 채용한 숙주 세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적절히 선택할 수 있고, 그 배양도 숙주 세포의 육성에 적합한 조건 하에서 실시할 수 있다.
진핵 세포 중에서 목적 단백질을 발현시키는 수단은, 그 자체 당해 분야에서는 많은 계가 주지되어 있다. 예를 들어 효모 중에서 발현시키는 계로는 일본 공개특허공보 소57-159489호에 기재된 「효모 중에서의 단백질의 발현」 을 들 수 있고, 식물 세포 중에서 발현시키는 계로는 일본 특허 제2517813호에 기재된 「살아 있는 세포에 생물학적 물질을 도입하기 위한 개량된 방법 및 장치」 또는 일본 공개특허공보 2003-274953호에 기재된 「식물 세포에 대한 유전자 도입 방법 및 유전자 도입용 식물 세포 처리 장치」 를 들 수 있고, 곤충 세포 중에서 발현시키는 계로는 일본 공개특허공보 소60-37988호에 기재된 「재조합 바큐로 바이러스 발현 벡터의 제법」 을 들 수 있고, 포유류 동물 세포 중에서 발현시키는 계로는 일본 공개특허공보 평2-171198호에 기재된 「진핵성 발현의 개량」 을 들 수 있는데, 물론 이들 이외에도 다수 존재한다.
형질 전환에 사용되는 숙주 세포로는, 진핵성 숙주 세포 및 원핵성 숙주 세포의 어느 것을 사용할 수도 있다. 진핵성 숙주 세포에는, 척추 동물, 효모, 식물 세포 및 곤충 세포 등이 포함된다. 식물 세포로는, 쌍떡잎 또는 외떡잎 식물의 조직편이나 조직으로부터 분리한 세포, 또는 조직으로부터 형성시킨 캘러스에서 유래되는 세포 등을 들 수 있다. 척추 동물 세포로는, 예를 들어 CHO 세포, 293T 세포 및 COS7 세포 등을 들 수 있다. 원핵성 숙주 세포로는, 대장균, 고초균 및 스트렙토마이세스 등을 들 수 있고, 예를 들어 대장균으로는 Echerichia coli K12 주 등이 자주 사용된다. 또한, 숙주 세포로서 척추 동물을 사용한 경우에는, 얻어진 형질 전환체는, 섭식 억제 또는 체중 증가 억제의 치료를 위한 세포 치료의 목적에서, 포유류 동물에 도입할 수 있다. 그 형질 전환체로는, 도입된 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자를 발현하는 것이 확인된 것이 바람직하다. 또한, 그 형질 전환체의 투여에 있어서는, 그 형질 전환체는 각종 완충제, 생리 식염액 등에 분산시켜 투여하는 것이 바람직하다 (일본 공개특허공보2003-342201호).
<항체>
본 발명은, 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등의 어느 하나와 결합하는 항체에 관한 것이다. 이러한 항체는, 당업자에게 주지된 기법을 사용하여 얻을 수 있다. 본 발명에 사용하는 항체는, 폴리클로날 항체, 또는 모노클로날 항체 (Milstein 등 Nature (England) 1983 년 10 월 6 일 발행 305 권 5934 호 p537∼540) 일 수 있다. 예를 들어, NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드, NESFATIN-1M30 폴리펩티드, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M, NUCB1-M30, NUCB1-M16, NUCB1-M14, 또는 NUCB1-M10M 에 대한 폴리클로날 항체는, 항원을 감작한 포유 동물의 혈청 등으로부터 회수할 수 있다. 또 다른 예로는 NESFATIN 폴리펩티드 등의 부분 배열로 이루어지는 배열을 갖는 펩티드를 감작한 포유류 동물의 혈청 등으로부터 회수할 수 있다. 보다 구체적인 예로서, 실시예 3 에 나타내고 있는 바와 같이, 배열 번호 8 의 아미노산 번호 141 내지 152 에 상당하는 배열의 펩티드 (배열 번호 24) 를 캐리어 단백질에 결합시키고, 그것을 항원으로 하여 동물에 면역시킴으로써, NESFATIN 폴리펩티드 등과 결합하는 항체를 얻는 것이 가능하다. 또한, 이 항체는 동물에게 투여된 경우, 그 동물에 섭식 항진 및 체중 증가 효과를 나타낸다 (실시예 7). 또 다른 구체적인 예로는 배열 번호 8 의 아미노산 번호 48 내지 62 에 상당하는 배열의 펩티드 (배열 번호 32) 를 캐리어 단백질에 결합시키고, 그것을 항원으로 하여 동물에 면역시킴으로써, NESFATIN 폴리펩티드 등과 결합하는 항체를 얻는 것이 가능하다 (실시예 10). 이 배열 번호 32 의 폴리펩티드는 인간·마우스·래트의 NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드 및 NESFATIN-1M30 폴리펩티드에 공통된 아미노산 배열로 이루어지므로, 얻어진 항체는 이들 폴리펩티드 모두와 결합한다. 또한, 이 항체는 동물에게 투여된 경우, 그 동물에 섭식 항진 및 체중 증가 효과를 나타낸다 (실시예 14). 이 이외에도 개시한 NESFATIN 폴리펩티드 등의 배열로부터 적절히 항원으로 하는 펩티드를 제조하고, 항체를 제조하는 것이 가능하다.
상기 NESFATIN 폴리펩티드 등에 대한 모노클로날 항체는, 항원을 감작한 포유 동물로부터 면역 세포를 취출하여 골수종 세포 등과 세포 융합시킴으로써 얻어진 하이브리도마를 클로닝하여, 그 배양물로부터 회수할 수 있다.
이러한 항체는, 적절히 표지하여 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등의 검출에 사용할 수 있다. 또, 이 항체를 표지하지 않고, 그 항체에 특이적으로 결합하는 물질, 예를 들어 프로테인 A 나 프로테인 G 를 표지하여 간접적인 검출에도 사용할 수 있다. 구체적인 검출 방법으로는, 예를 들어 ELISA 법을 들 수 있다.
본 발명의 항체를 얻기 위해 사용하는 항원은, 예를 들어 상기 NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드, NESFATIN-1M30, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M, NUCB1-M30, NUCB1-M16, NUCB1-M14, 또는 NUCB1-M10M 또는 이들 개변체를 코드하는 핵산 분자, 또는 그 일부를 발현 벡터에 삽입하고, 이것을 적당한 숙주 세포에 도입하고, 형질 전환체를 제조하고, 그 형질 전환체를 배양하여 재조합 단백질을 발현시키고, 발현시킨 재조합 단백질을 배양체 또는 배양 상청으로부 터 정제함으로써 얻을 수 있다. 또는, 그 유전자에 의해 코드되는 아미노산 배열, 또는 전장 cDNA 에 의해 코드되는 아미노산 배열의 부분 아미노산 배열로 이루어지는 올리고펩티드를 화학적으로 합성하고, 면역원으로서 사용할 수도 있다. 면역시키는 동물로는, 마우스, 래트, 토끼, 염소, 말, 햄스터 등이 사용되며, 당업자이면 적절히 선택할 수 있다.
<섭식 억제 및/또는 체중 조절 억제 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성 또는 발현을 억제하는 물질>
본 발명에 있어서의 검토에 있어서, NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드 및 NESFATIN-1M30 폴리펩티드에 대하여 결합하는 항체를 제조하고, 동물의 뇌에 투여한 결과, 그 동물의 섭식량의 항진이 보였다 (실시예 7 및 실시예 14). 또, NESFATIN 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 RNA (올리고뉴클레오티드) 를 동물의 뇌내에 투여함으로써, 그 동물의 섭식량의 항진 및 체중 증가가 보였다 (실시예 15). 이것은, NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드 또는 NESFATIN-1M30 폴리펩티드는 뇌내에서 실제로 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 기능하고 있는 것을 나타낸다. 또한, NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드 또는 NESFATIN-1M30 폴리펩티드의 말초 (혈중) 또는 뇌내에서의 농도의 상승은, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제를 나타내고, 그 폴리펩티드의 활성 또는 발현을 억제하는 물질의 작용은, 섭식 항진 및/또는 체중 증가의 항진을 나타냈기 때문에, NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드 및/또는 NESFATIN-1M30 폴리펩티드는, 생체 내에서 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 중심적인 기능을 담당하고 있는 인자인 것이 증명되었다. 그와 함께, NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드 및/또는 NESFATIN-1M30 폴리펩티드의 활성을 저해 또는 발현을 저해하는 물질은 그 자체가, 섭식의 저하 또는 체중의 저하가 문제가 되는 질환이나 증상, 예를 들어 거식증, 기능성 위장증 (Functional dyspepsia), 또는 암, 염증성 질환, 하수체·갑상선·부신 등의 기능 저하, 수술 후 또는 과도의 스트레스 등에 의한 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 상태에 대한 치료·진단·치료약의 스크리닝 등에 사용할 수 있다.
즉, 본 발명은, NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드, NESFATIN-1M30 폴리펩티드, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M, NUCB1-M30, NUCB1-M16, NUCB1-M14, 또는 NUCB1-M10M 의 활성 또는 생성을 저해하는 물질에 관한 것이다. 더욱 바람직하게는, 그 물질은, 섭식 항진 및/또는 체중 증가 항진 활성을 나타내는 물질에 관한 것이다. NESFATIN 폴리펩티드 등의 활성을 억제하는 물질로는, NESFATIN 폴리펩티드 등에 결합하는 것을 특징으로 하는 것과, 그들 폴리펩티드와의 결합을 반드시 필요로 하지 않는 것이 포함된다. 전자의 예로는 NESFATIN 폴리펩티드 등에 대한 항체를 들 수 있고, 항체로는, 상기 서술한 항체를 사용할 수 있다. 후자의 예로는, NESFATIN 폴리펩티드 등에 대한 도미난트 네거티브 폴리펩티드 등을 들 수 있다. 여기에서, 도미난트 네거티브란, 야생형에 대하여 양적 및 질적으로 우위로 작용하여, 야생형의 기능을 저해하는 변이체이다. 도미난트 네거티브는, 야생형 아미노산의 일부를 결실, 또는 변환함으로써 제조하는 것이 가능하다.
또, 본 발명은, NESFATIN 폴리펩티드, NESFATIN-1 폴리펩티드, NESFATIN-1M30 폴리펩티드, NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M, NUCB1-M30, NUCB1-M16, NUCB1-M14, 또는 NUCB1-M10M 을 코드하는 유전자의 발현을 억제하는 물질에 관한 것이다. 이러한 물질로는, 예를 들어 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi 분자 등을 들 수 있다. 여기에서 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자란, NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 핵산 분자에 있어서의 염기 배열의 전체 또는 일부를, 연속적 또는 비연속적인 단위로서 포함하는 핵산 분자를 말한다. 또한 유전자의 발현이란, 그 유전자로부터 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 핵산 분자가 전사되는 과정, 전사된 핵산 분자를 안정화하는 과정, 전사된 핵산 분자로부터 번역에 의해 NESFATIN 폴리펩티드 등이 생산되는 과정으로 이루어진다. 따라서, 유전자의 발현의 억제란, NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자로부터의 전사, 안정화, 번역 중 어느 하나의 과정을 억제하는 것을 말한다.
상기 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 NESFATIN 폴리펩티드를 코드하는 유전자 배열을 사용함으로써 설계할 수 있다. 이러한 안티센스 올리고뉴클레오티드로는, 배열 번호 31 의 구조를 갖는 모르폴리노형 안티센스 올리고뉴클레오티드를 들 수 있다. 그 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 실시예 15 에 나타내는 바와 같이, 동물에게 투여함으로써, 그 동물의 섭식 항진 또는 체중 증가의 항진 작용을 나타낸다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는, 세포 내에서의 분해를 피하기 위해 다양한 수식이나 결합 양식이 알려져 있고, 당업자이면, 적절한 안티센스 올리고뉴클레오티드의 구조를 선택할 수 있다 Curreck 등 Europian Journal of Biochemistry (UK) 2003 년 270 권 p1628-486). 그 구조로는, 천연형 (D-올리고), 포스포로티오에이트형 (S-올리고), 메틸포스포네이트형 (M-올리고), 포스포로아미데이트형 (A-올리고), 2'-O-메틸형 D-올리고, 모르폴리데이트형 (Mo-올리고), 폴리아미드핵산 등을 예시할 수 있다. 또, 길이는 10 염기 내지 70 염기, 바람직하게는 15 염기 내지 30 염기의 것을 사용한다.
RNAinterference (RNAi, RNA 간섭) 는, 21∼23 잔기의 이중 사슬 RNA 가 동일한 배열을 포함하는 타깃의 RNA 를 분해함으로써, 그 발현을 강력히 억제하는 현상을 말한다. 따라서, NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자의 mRNA 와 동일한 염기 배열을 갖는 2 개 사슬 구조를 포함하는 RNA 는, NESFATIN 폴리펩티드 등의 유전자의 발현 억제에 이용할 수 있다. RNAi 효과를 얻기 위해서는, 적어도 20 이상의 연속하는 염기 배열을 갖는 2 개 사슬 구조의 RNA 를 사용하는 것이 바람직하다. 2 개 사슬 구조는, 다른 스트랜드로 구성되어 있어도 되고, 1 개의 RNA 의 스템 루프 구조에 의해 주어지는 2 개 사슬이어도 된다. 또 각각의 사슬의 3' 측에 2 염기의 오버행을 갖게 함으로써, 유전자의 발현 억제 작용을 증강시킬 수도 있다. RNAi 의 설계에 사용하는 배열 및 길이나 구조에 대해서는, 당업자이면, 다양한 개변을 시도하여, 가장 유전자 발현 억제 작용이 강한 RNAi 를 최적화하는 것이 가능하다 (Milhavet 등 Pharmacological Review) (USA) 2003 년 55 권 p629-648).
또, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자 및 RNAi 분자는, 그 분자의 핵산 배열과 상보적인 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 벡터에 삽입하고, 이것을 숙주 세포에 도입하여 형질 전환하고, 형질 전환체를 배양함으로써 제조할 수 있다. 사용하는 숙주 세포 및 형질 전환 방법은, 상기 <형질 전환체> 에 기재된 바와 같이, 당업자이면 적절히 선택할 수 있다. 또한, 다른 방법으로는 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자 및 RNAi 분자는 화학 합성법에 의해서도 제조하는 것이 가능하다.
<식욕 항진 또는 체중 증가 항진을 위한 의약품>
또, 본 발명은, NESFATIN 폴리펩티드 등 활성 또는 생성을 저해하는 물질, 또는 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자의 발현을 억제하는 물질을, 유효 성분으로서 함유하는 식욕 항진 또는 체중 증가 항진을 위한 의약 조성물에 관한 것이다. 그 의약 조성물은, 섭식이나 체중 증가가 억제되어 있는 것이 문제가 되는 질환이나 증상에 대하여 사용할 수 있다. 섭식이나 체중 증가가 억제되어 있는 것이 문제가 되는 질환이나 증상으로는, 예를 들어 거식증, 기능성 위장증 (Functional dyspepsia), 또는 암, 염증성 질환, 하수체·갑상선·부신 등의 기능 저하, 수술 후 또는 과도의 스트레스 등에 의한 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 상태 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 의약 조성물은, 약학적으로 허용되는 어느 첨가제를 함유해도 된다. 약학적으로 허용되는 첨가제를 사용한 제제는 「REMINGTON : THE SCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY 20th EDITION 필라델피아 과학 대학 (University of the Sciences in Philadelphia) 저 Williams & Wilkins 사 2000 년 12 월 15 일 발행」 에 기재된 방법으로 실시하는 것도 가능하다. 이러한 의약 조성물의 하나의 형태로는, 무균의 수성액 또는 유성액에 용해, 현탁 또는 유화함으로써 조제된 액제로서 제공된다. 이러한 용제로서, 수성액으로는 주사용 증류수, 생리 식염수 등을 들 수 있고, 그것에 추가하여 삼투압 조절제 (예를 들어, D-글루코오스, D-소르비톨, D-만니톨, 염화 나트륨 등) 가 첨가되거나, 적당한 용해 보조제, 예를 들어 알코올 (예를 들어 에탄올), 폴리알코올 (예를 들어 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜), 비이온성 계면 활성제 (예를 들어 폴리소르베이트 80, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 50) 등이 병용되는 경우도 있다. 또한, 용제로는 유성액이 사용되는 경우도 있고, 그 유성액의 예로는 참기름, 대두유 등을 들 수 있고, 용해 보조제로서 벤조산 벤질, 벤질알코올 등이 병용되는 경우도 있다. 이러한 액제에 있어서는 적절히 완충제 (예를 들어, 인산염류 완충제, 아세트산염류 완충제), 무통화제 (예를 들어, 염화 벤잘코늄, 염산 프로카인 등), 안정제 (예를 들어, 인간 혈청 알부민, 폴리에틸렌글리콜 등), 보존제 (예를 들어, 아스코르브산, 에리소르브산 및 그들의 염 등), 착색제 (예를 들어, 구리 클로로필, β-카로틴, 적색 2 호, 청색 1 호 등), 방부제 (예를 들어 파라옥시벤조산 에스테르, 페놀, 염화 벤제토늄, 염화 벤잘코늄 등), 증점제 (예를 들어 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로스 및 그들의 염 등), 안정화제 (예를 들어 사람 혈청 알부민, 만니톨, 소르비톨 등), 교취제 (예를 들어 멘톨, 감귤향료 등) 의 첨가제가 사용되는 경우가 있다. 또 다른 의약 조성물 (상기 몇 개 「의약품 조성물」 의 표현과 통일하기 위해) 의 형태로는, 산제, 정제, 과립제, 캡슐제, 환제, 좌제, 트로키 제 등의 고형제를 들 수 있다. 경구용 제제의 형태로 투여하는 고형제의 경우에는, 첨가제로서 부형제 (예를 들어, 결정성 셀룰로오스, 락토오스, 전분 등), 활택제 (예를 들어, 스테아르산 마그네슘, 탤크 등), 결합제 (히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 마크로골 등), 붕괴제 (예를 들어, 전분, 카르복시메틸셀룰로오스칼슘 등) 등이 사용된다. 또한, 필요에 따라, 방부제 (예를 들어, 벤질알코올, 클로로부탄올, 파라옥시벤조산 메틸, 파라옥시벤조산 프로필 등), 항산화제, 착색제, 감미제 등의 첨가제를 사용할 수 있다.
또 다른 형태로서, 점막용 의약 조성물도 들 수 있고, 이 제제에 있어서는 점막에 대한 흡착성, 체류성 등을 부여하는 것을 주된 목적으로 하여 첨가제로서 점착제, 점착 증강제, 점조제, 점조화제 등 (예를 들어, 뮤신, 한천, 젤라틴, 펙틴, 카라기난, 알긴산 나트륨, 로커스트빈검, 잔탄검, 트라가칸트검, 아라비아 고무, 키토산, 풀루란, 전분, 수크랄페이트, 셀룰로오스 및 그 유도체 (예를 들어, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리글리세린지방산 에스테르, 아크릴산 (메트)아크릴산 알킬 공중합체 또는 그 염, 폴리글리세린 지방산 에스테르 등) 가 함유되는 경우도 있다. 그러나, 생체에 공여되는 의약 조성물의 형태 및 용제나 첨가제는 이들에 한정되는 것이 아니고, 당업자이면 적절히 선택할 수 있다.
상기 의약 조성물은, 증상의 개선을 목적으로 경구 또는 비경구적으로 투여할 수 있다. 경구 투여의 경우에는, 과립제, 산제, 정제, 캡슐제, 액제, 시럽제, 유제 또는 현탁제, 엘릭시르제 등의 제형을 선택할 수 있다. 비경구 투여의 경우에는, 예를 들어 경비제로 할 수 있고, 액제, 현탁제, 고형 제제 등을 선택 할 수 있다. 또 다른 비경구 투여의 형태로는, 주사제로 할 수 있고, 주사제로는, 피하 주사제, 정맥 주사제, 점적 주사제, 근육 주사제, 뇌실내 주사제 또는 복강내 주사제 등을 선택할 수 있다. 또한 그 밖의 비경구 투여에 사용하는 제제로는, 좌제, 설하제, 경피제, 경비제 이외의 경점막 투여제 등도 들 수 있다. 또한, 스텐트나 혈관내 전색제에 함유 또는 도포하는 양태로, 혈관내 국소 투여할 수도 있다.
상기 의약 조성물의 투여량은, 환자의 연령, 성별, 체중, 증상, 치료 효과, 투여 방법, 처리 시간, 또는 그 의약 조성물에 함유되는 활성 성분의 종류 등에 따라 다르지만, 통상 성인 1 명당, 1 회에 대하여 0.1㎎ 내지 500㎎ 의 범위에서, 바람직하게는 0.5㎎ 내지 200㎎ 의 범위에서 투여할 수 있다. 그러나, 투여량은 여러 가지 조건에 따라 변동되므로, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또한 상기 범위를 초과하는 투여량이 필요한 경우도 있다.
또한, 상기 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 분자 등은, 적당한 프로모터 배열의 하류에 삽입하고, 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 효과를 가져오는 RNA 의 발현 벡터로서 투여할 수 있다. 이 발현 벡터를 대상이 되는 환자의 뇌내에 도달하는 형태로 도입하면, 이들 유전자의 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 RNAi 효과에 의해 당해 유전자의 발현을 억제하는 폴리뉴클레오티드를 발현하고, 당해 유전자의 발현 레벨의 저하에 의해 섭식 억제 및/체중 증가 억제 상태에 대하여 치료 효과를 달성할 수 있다.
<트랜스제닉 동물, 비만·비만증, 그리고 질환 모델 동물>
본 발명은, 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자, 또는 그들을 포함하는 벡터를 포함하는 트랜스제닉 비인간 동물에 관한 것이다. 상세하게는, 그 유전자가, 전신성, 바람직하게는 시상하부에서의 발현 강도가 상승된, 섭식 억제 상태 또는 체중 증가 억제 상태를 나타내는 트랜스제닉 비인간 동물에 관한 것이다. 상기 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현 레벨을 인위적으로 증강시킨 트랜스제닉 비인간 동물은, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제를 나타내는 모델 동물로서 이용할 수 있다.
본 발명은, 상기 섭식 억제 및/또는 체중 조절 억제 활성을 갖는 폴리펩티드의 활성 또는 발현을 억제하는 물질 (예를 들어 항체, 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi 분자 등) 이 도입되고, 식욕 항진 또는 체중 증가 항진을 나타내는 트랜스제닉 비인간 동물에 관한 것이다. 이러한 물질을 코드하는 유전자를 도입하여 생성된 트랜스제닉 비인간 동물은, 섭식 및 체중 증가가 항진을 나타내는 모델 동물로서 이용할 수 있다. 또한, 그 트랜스제닉 비인간 동물은, 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 변형성 관절증 등의 정형외과적 질환, 월경 이상 또는 악성 종양 등의 질환의 모델 동물로서 사용할 수도 있다.
특정한 유전자를 대상으로 하여 트랜스제닉 동물을 얻는 방법은 공지되어 있다. 즉, 유전자와 난자를 혼합하여 인산 칼슘으로 처리하는 방법이나, 위상차 현미경 하에서 전핵기란 (前核期卵) 의 핵에, 미소 피펫으로 유전자를 직접 도입하는 방법 (마이크로인젝션법, 미국 특허 제4873191호), 배성간세포 (ES 세포) 를 사 용하는 방법 등에 의해 트랜스제닉 동물을 얻을 수 있다. 그 밖에, 레트로 바이러스 벡터에 유전자를 삽입하고, 난자에 감염시키는 방법, 또한 정자를 통해 유전자를 난자에 도입하는 정자 벡터법 등도 개발되어 있다. 정자 벡터법이란, 정자에 외래 유전자를 부착 또는 일렉트로포레이션 등의 방법으로 정자 세포 내에 들어가게 한 후, 난자에 수정시킴으로써, 외래 유전자를 도입하는 유전자 재조합법이다 (Lavitranoet M 등, Cell (1989) 57, 717-723).
또, 발현 벡터에 사용하는 프로모터로서, 적당한 약제 등의 물질에 의해 전사가 조절되는 프로모터를 사용하면, 그 물질의 투여에 의해 트랜스제닉 동물에 있어서의 외래성 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자 또는 그 폴리펩티드의 활성 또는 발현을 억제하는 물질의 발현 레벨을 조정할 수 있다.
또한, 본 발명은, NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자의 전체 영역 또는 일부를 결손시킨 녹아웃 동물에 관하여, 그 유전자를 별도의 유전자로 치환한 녹인 동물도 본 발명에 포함된다. 예를 들어, NESFATIN 폴리펩티드 등의 유전자의 녹아웃 동물은, 섭식 항진 및/또는 체중 증가 항진을 나타내는 모델 동물로서 이용할 수 있다.
또, 본 발명은, 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등 그 자체가 투여된, 비인간 동물로 이루어지는 섭식 및/또는 체중 증가가 억제된 모델 동물, 또는 그 폴리펩티드의 활성 또는 발현을 억제하는 물질 그 자체가 투여된 비인간 동물로 이루어지는 섭식 및 체중 증가가 항진된 모델 동물에 관한 것이다. 섭식 및 체중 증가가 항진된 비인간 동물은, 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심 장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 변형성 관절증 등의 정형외과적 질환, 월경 이상 또는 악성 종양 등의 질환의 모델 동물로서 이용할 수도 있다.
본 발명의 모델 동물로서 사용하는 동물종은, 인간 이외의 모든 척추 동물을 이용하여 제조할 수 있다. 구체적으로는, 마우스, 래트, 토끼, 미니 돼지, 염소, 양, 원숭이, 개, 고양이, 또는 소 등의 척추 동물에 있어서 유전자의 도입이나 물질의 투여에 의한, 모델 동물의 제조가 가능하다.
<섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드의 제조 방법>
본 발명은, 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자를 발현하는 상기 형질 전환체, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자, 또는 그들을 포함하는 벡터를 포함하는 상기 트랜스제닉 비인간 동물 및 트랜스제닉 식물을 사용하는 그 폴리펩티드의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 상기 폴리펩티드의 제조 방법에 있어서는, 형질 전환체 또는 트랜스제닉 비인간 동물에서의 발현, 전사, 번역 등에 적합하도록, 상기 DNA 배열, 플라스미드 및 바이러스에 대하여 많은 수식이나 변경이 가능하다. 예를 들어, 유전 암호의 동의성에 의해, 단백질의 암호 영역 전체를 통해 뉴클레오티드의 치환을 실시할 수 있다. 그와 같은 배열은, NESFATIN 폴리펩티드 등의 아미노산 배열, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 염기 배열로부터 추정할 수 있고, 이하의 종래의 합성법에 의해 조립할 수 있다. 그와 같은 합성법은, 실질상, 이타쿠라 등의 방법 (Itakura et al, Science 198, 1056, 1977), 그리고 쿠레아 등의 방법 (Crea et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765, 1978) 에 따라서 실시할 수 있다. 따라서, 본 발명의 폴리펩티드의 제조 방법에 있어서 사용되는 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자는, 특별히 예시한 염기 배열, 플라스미드 및 바이러스를 이용하는 것에 한정되는 것은 아니다.
형질 전환체를 사용하는 상기 폴리펩티드의 제조 방법은, 그 형질 전환체를 배양함으로써 달성할 수 있다. 배양에 사용되는 배지로는, 채용한 숙주 세포에 따라 관용되는 각종의 것을 적절히 선택할 수 있고, 그 배양도 숙주 세포의 육성에 적합한 조건 하에서 실시할 수 있다.
또한, 상기 폴리펩티드는, 형질 전환체의 세포내, 세포외 또는 세포막 상에 생산된다. 그 밖의 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자를 사용한 폴리펩티드의 제조 방법으로는, 무세포계 단백질 합성에 의한 방법을 들 수 있고, 대표적인 것으로는, 인비트로 번역 반응계가 있다. 이 인비트로 번역 반응계에서는, NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자의 5' 상류에 전사 조절을 제어하는 배열, 바람직하게는 SP6 프로모터, T3 프로모터, T7 프로모터 등을 부가하고, 그 유전자를 세포내 또는 인비트로에 있어서 전사함으로써 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 RNA 분자를 제조하고, 소맥배아, 대장균, 망상 적혈구 등에서 조제된 인비트로 전사 반응용 세포 추출물을 사용함으로써 실시할 수 있다. 그 일례로는, 사와자키 등 단백질·핵산·효소 2003 년 48 권 p549-554 에 기재된 방법 등에 의해 실시하는 것이 가능하다. 이러한 형질 전환체 또는 무세포계 단백 합성에 의해 생산된 폴리펩티드는, 원하는 바에 따라 그 물리학적 성질, 화학적 성질 등을 이용한 각종 분리 조작 [일본 생화학회편 「생화학 데이터북 Ⅱ」 제 1 판 제 1 쇄, 주식회사 동경화학동인 1980 년 6 월 23 일 발행 p1175∼1259 ; Arakawa 등 Biochemistry (USA) 1986 년 12 월 16 일 발행 25 권 25 호 p8274∼8277 (1986) ; Langley 등 Europian Journal of Biochemistry (Germany) 1987 년 3 월 2 일 발행 163 권 2 호 p313∼321 등 참조] 에 의해 분리, 정제할 수 있다. 그 방법으로는, 구체적으로는 예를 들어 통상의 재구성 처리, 단백질 침전제에 의한 처리 (염석법), 원심 분리, 삼투압 쇼크법, 초음파 파쇄, 한외 여과, 겔 여과, 흡착 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 어피니티 크로마토그래피, 고속 액체 크로마토그래피 (HPLC) 등의 각종 액체 크로마토그래피, 투석법, 이들의 조합 등을 예시할 수 있다. 상기 폴리펩티드와의 어피니티를 이용하는 정제에는, 예를 들어 상기 서술한 상기 폴리펩티드와 결합하는 항체를 사용할 수 있고, 그 폴리펩티드와 그 항체의 탈착에 의해 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 상기 폴리펩티드의 제조 방법에서는, 그 폴리펩티드에 어피니티 태그를 융합한 단백질을 형질 전환체 또는 트랜스제닉 비인간 동물을 생성시키고, 그 어피니티 태그 융합 단백질을 분리, 정제함으로써도 실시할 수 있다. 그 어피니티 태그 융합 단백질을 발현시키면, 이 태그를 이용하는 어피니티 정제를 실시하는 것이 가능하다. 그 어피니티 태그로는, Glutathione-S-Transferase (GST), 폴리히스티딘 태그 (His 태그, Sisk 등 Journal of Virology (USA) 1994 년 2 월 발행 68 권 2 호 p766∼775) 및 FLAG 태그 (Hopp 등 Biotechnology 1988 년 발행 6 권 p1204∼1210) 를 들 수 있다.
상기 폴리펩티드에 GST 를 융합한 GST 융합 단백질의 경우에는, 글루타티온 고정화 담체를 사용함으로써, GST 와 그 글루타티온 결합 담체의 흡착·탈착 반응을 사용하여 정제하고, 그 후, GST 융합 단백질로부터 GST 부분을 절단하여 정제함으로써, 상기 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
His 태그 융합 단백질의 경우에는, 금속 이온 킬레이트 담체를 사용함으로써, His 태그와 그 금속 이온 킬레이트 담체의 흡착·탈착 반응을 사용하여 정제하고, 그 후, His 태그 융합 단백질로부터 His 태그 부분을 절단하여 정제함으로써, 상기 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
FLAG 태그 융합 단백질의 경우에는, 항 FLAG 태그 항체가 결합한 담체를 사용함으로써, FLAG 태그와 그 금속 이온 킬레이트 담체의 흡착·탈착 반응을 사용하여 정제하고, 그 후, FLAG 태그 융합 단백질로부터 FLAG 태그 부분을 절단하여 정제함으로써, 상기 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
NESFATIN-1 폴리펩티드는, 상기 서술한 방법으로 취득한 NESFATIN 폴리펩티드를, Protein Convertase 등의 단백질 분해 효소로 처리하고, 그 분해물을 역상 크로마토그래피로 분획하고, 질량 분석 등에 의해 NESFATIN-1 폴리펩티드가 포함되는 획분을 확인하여 회수함으로써 조제할 수도 있다. NESFATIN-1 개변체도 동일하게 하여 조제할 수 있다.
이와 같이 얻어진 본 발명의 NESFATIN 폴리펩티드 등은, 번역 후에 N 말단을 수식할 수도 있고, 본 발명에는 이러한 수식된 폴리펩티드 분자도 포함된다. 예를 들어, N 말단이 피로글루타민으로 전환된 폴리펩티드는, 상기 서술한 본 발명의 NESFATIN 폴리펩티드 등을, N 말단이 글루타민 잔기가 되도록 발현시키고, 얻어 진 폴리펩티드를 5∼10% 아세트산 용액 등 산성 조건에서 처리함으로써 얻을 수 있다 (Park 등 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America) (USA) 1991 년 3 월 발행 p22046∼2050). 또한, N 말단이 아세틸화된 펩티드는, 본 발명의 NESFATIN 폴리펩티드 등을, N 말단에 α 아미노기를 갖는 임의의 아미노산 잔기가 되도록 발현시키고, Sulfo-NHS-Acetate 나 무수 아세트산으로 처리함으로써 얻을 수 있다. 이러한 폴리펩티드를 번역 후에 N 말단을 수식하는 방법은, 당 기술 분야에서 널리 알려져 있다. 그 밖에, 본 발명의 NESFATIN 폴리펩티드 등은, 형광 물질 등의 화합물로 처리하여 수식하는 것도 가능하다 (Hermanson 등 Bioconjugate techniques (USA) Academic Press 1996 년 발행).
트랜스제닉 비인간 동물을 사용하여 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등을 제조하는 것도 가능하다. 그 방법으로는, 예를 들어 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등을 코드하는 유전자 또는 그들을 포함하는 벡터를 포함하는 트랜스제닉 비인간 동물 트랜스제닉 비인간 동물로부터 채취한 장기·조직·혈액·유즙 등이나, 그들을 세단 (細斷)·분쇄·분획한 가공물 등으로부터, 고형 성분을 분리한 액체 성분 또는, 수성 용매 또는 유기 용매를 사용하여 추출한 액체 성분으로서, 목적으로 하는 펩티드가 함유되는 획분을 회수할 수 있다. 목적으로 하는 폴리펩티드는, 그 획분으로부터, 상기 서술한 물리학적 성질, 화학적 성질 등을 이용한 각종 분리 조작에 의해 분리, 정제하는 것이 가능하다.
또한 트랜스제닉 식물을 사용하여 상기 NESFATIN 폴리펩티드 등의 제조 방법 하는 것도 가능하다. 그 방법은, 예를 들어 일본 공개특허공보 2003-116385호 「일본 뇌염 백신을 코드하는 유전자를 포함하는 트랜스제닉 식물」 의 공보 등을 참조하는 것 등에 의해 실시하는 것이 가능하다. 또한 트랜스제닉 식물의 제조 방법에 대해서는, 일본 공개특허공보 2002-17186호 등의 「트랜스제닉 식물」 을 참조함으로써 제조할 수 있다. 이러한 트랜스제닉 식물의 잎, 줄기, 뿌리, 과실, 과피, 싹, 종자 및 꽃잎 등의 조직이나 그들 조직으로부터 유도된 캘러스 조직 등으로부터, 또한 경우에 따라서는 그 조직을 세단, 피박 (皮剝), 분쇄, 압축한 가공물 등으로부터, 목적으로 하는 폴리펩티드는 수성 용매 또는 유기 용매를 사용한 추출액이나 압착에 의해 채취한 짠 즙이나 오일 중에 회수하는 것이 가능하고, 또한 그 폴리펩티드를 상기 서술한 물리학적 성질, 화학적 성질 등을 이용한 각종 분리 조작에 의해 분리, 정제하는 것이 가능하다.
본 발명의 상기 폴리펩티드는, 화학 합성적으로 합성하여 취득할 수도 있다. 이 경우, 고상 합성법이나 액상 합성법 등 일반적으로 사용되는 펩티드 합성법을 이용할 수 있다. 펩티드 합성에 있어서의 축합법이나 아미노산 잔기의 보호, 및 합성 후의 보호기의 탈리에 대해서는, 공지된 방법을 이용할 수 있다 (이즈미타니 등 펩티드 합성의 기초와 실험 마루젠 주식회사 1975 년 발행, 야지마 히토시-일본 생화학회 편 생화학 실험 강좌 1 단백질의 화학 Ⅳ 동경화학동인 주식회사 1977 년 발행). 또, 폴리펩티드의 펩티드 배열 전체를 한번에 합성하는 것도 가능한데, 그 단백질의 부분적인 펩티드를 각각 합성하여 그 부분 펩티드를 축합하는 방법도 사용할 수 있다 (일본 생화학회 편 신생화학 실험강좌 단백질 Ⅳ 합성 및 발현 동경화학동인 주식회사 1991 년 발행).
펩티드 합성에 있어서 사용되는 아미노산의 α 아민은 통상 tBoc 기나 Fmoc 기로 보호되어 있는데, 최종적으로 얻어지는 펩티드에 대해서 이들 보호기를 유지한 채, 또는 탈보호한 형태로 하는 것이 가능하다. 또한 필요에 따라, 그 펩티드의 탈보호된 아미노 말단을 효소적 또는 화학적으로, 피로글루타민산, 아세틸기, 포르밀기 또는 형광 물질 등으로 수식된 형태로 하는 것도 가능하다 (Hermanson 등 Bioconjugate techniques (USA) Academic Press 1996 년 발행). 구체적인 예로는, 상기 본 발명의 폴리펩티드의 N 말단에 글루타민을 갖는 형태로 합성하고, 그 펩티드를 5 내지 10% 아세트산 용액 등의 희산에 의한 처리로 고리화시킴으로써 피로글루타민산으로 변화시킬 수 있다 (Park 등 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (USA) 1991 년 3 월 발행 p22046∼2050).
또한 필요에 따라, 합성 후의 폴리펩티드의 C 말단에 아미드기나 형광 물질 등이 부가된 형태의 합성 펩티드를 제조하는 것도 가능하다. 예를 들어 고상 합성법으로 C 말단에 아미드기를 도입한 합성 펩티드를 얻기 위해서는, 고상 담체 (레진) 로부터 펩티드를 절단하는 반응을 실시했을 때, 그 C 말단이 아미드화되는 형태의 시판되는 레진을 사용함으로써 실시하는 것이 가능하다. 또한 C 말단에 형광 물질 등의 수식을 실시하는 방법도 공지된 방법으로 실시할 수 있다 (Hermanson 등 Bioconjugate techniques (USA) Academic Press 1996 년 발행).
<섭식 조절 및/또는 체중 조절의 상태를 예측 또는 진단하기 위한 검정 방 법>
본 발명은, 포유류 동물의 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관련되는 질환의 판정, 중증도, 병태 진행의 모니터링, 예측, 예후 또는 상기 의약품 조성물의 투여 판단 등에 사용되는 진단을 위한 방법에 관한 것이다. 즉, 본 발명은, 시험되는 포유류 동물에서 유래되는 시료를 사용하여, 그 시료에 포함되는 NESFATIN 을 코드하는 핵산 분자 (배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자), 또는 NESFATIN 폴리펩티드 등 (배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드) 의 함유량을, 정상 개체에서 유래되는 시료와 비교하는 것에 의한, 섭식 조절 및/또는 체중 조절 상태를 예측 또는 진단하는 방법에 관한 것이다. 또, 정상 개체란, 정상 또는 처리를 실시하고 있지 않은 개체를 의미한다.
상세하게는, 본 발명은, 시험되는 포유류 동물의 생체 유래의 시료에 있어서의, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자의 함유량을 정상 개체의 생체 시료와 비교하여, 그 유전자의 발현 저하 상태 또는 항진 상태를 검출하는 공정을 포함하는, 섭식 조절 및/또는 체중 조절 상태를 예측 또는 진단하기 위한 검정 방법에 관한 것이다.
사용되는 생체 시료로는, 혈액, 오줌, 뇌 척수액, 타액, 생체검사에 의해 채취된 뇌 조직 등을 들 수 있고, 그 중에서도 혈액이 바람직하다. 시료로서 사 용되는 혈액으로는, 전혈 (全血), 또는 전혈로부터 얻어진 혈장 또는 혈청을 들 수 있다. 이들 생체 시료의 채취 방법은 공지되어 있다. 또한, 이들 생체 시료의 라이세이트 등의 조제물도 시료로서 사용할 수 있다. 또는, 조제물로부터 mRNA 를 추출하면, 상기 핵산 분자에 대응하는 mRNA 에 대한 측정을 위한 시료로 할 수 있다. 생체 시료의 라이세이트 또는 mRNA 의 추출에는, 시판되는 키트를 이용하면 편리하다. 또는, 혈액, 뇌 척수액과 같은 액상의 생체 시료에 있어서는, 필요에 따라 완충액 등으로 희석하여 단백질이나 유전자에 대해서 측정을 위한 시료로 할 수 있다.
포유류 동물의 생체 시료 중의, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자의 함유량은, 그 핵산 분자의 염기 배열을 포함하는 폴리뉴클레오티드, 또는 그 상보 사슬에 상보적인 염기 배열로 이루어지는 적어도 18 염기의 길이의 올리고뉴클레오티드를, PCR 프라이머, 프로브로서 사용하여 측정할 수 있다. 이 경우 당업자이면, 여러 가지 컴퓨터·프로그램을 사용하여, 용도에 적합한 프라이머나 프로브를 설계할 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드는, 어세이 포맷에 따라 적당한 표지를 결합하는 것이나, 적당한 지지체에 고정화시켜 둘 수 있다. 이러한 PCR 프라이머 및 프로브는, 재조합적으로, 합성적으로 제조하거나, 또는 당업자가 이용 가능한 임의의 수단에 의해 제조할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 PCR 프라이머로는, 배열 번호 22 (포워드 프라이머) 및 배열 번호 23 (리버스 프라이머) 등을 들 수 있는데, 특별히 이들 에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 있어서 사용할 수 있는 프로브로는, 예를 들어 상기 프라이머를 사용하여, 주형으로서 배열 번호 21 의 DNA 배열을 사용하여, 증폭한 단편을 표지화함으로써 얻어지는 것 등을 들 수 있는데 (실시예 2 참조), 특별히 이들에 한정되는 것은 아니다.
배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자의 발현 레벨의 측정값은, 공지된 방법에 의해 보정할 수 있다. 보정을 실시함으로써, 시험되는 생체 시료와 정상 개체의 생체 시료 사이에서, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자의 발현 레벨을 비교할 수 있다. 측정값의 보정은, 생체 시료에 있어서의 각 세포에 있어서, 발현 레벨이 크게 변동되지 않는 유전자 (예를 들어, 하우스키핑 유전자) 의 발현 레벨의 측정값에 기초하여 실시할 수 있다. 발현 레벨이 크게 변동되지 않는 유전자의 예로는, β-액틴, GAPDH 등을 들 수 있다.
mRNA 를 사용하여 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자의 발현 레벨을 측정하는 경우에는, 적절히 그 진단 방법에 맞춘 포맷으로 실시할 수 있다. 예를 들어 생체 조직으로부터 추출한 mRNA 를 사용하는 경우에는, RT-PCR 법, 노던 블로팅법 등을 선택할 수 있고, 조직 표본을 사용하는 경우에는 인·시츄·하이브리다이제이션법 등을 선택할 수 있다. 예를 들어 실시예 8 에 있어서는, 절식에 의해 식욕이 항진된 래트에 있어서는, NESFATIN 유전자의 발현은 억제되고, 섭식에 의해 식욕이 억제되어 있는 상태에서는 NESFATIN 유전자의 발현이 항진되는 것을, 인·시츄·하이브리다이제이션법으로 나타내고 있는 예가 개시되어 있다.
시험 시료의 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현량을, 정상 개체에서 유래되는 생체 시료와 비교하여, 그 유전자의 발현이 저하 상태에 있는 것이 검출된 경우에는, 섭식 항진 또는 체중 증가 상태에 있다고 예측 또는 진단할 수 있고, 나아가서는 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 정형외과적 질환, 월경 이상 및 악성 종양에서 선택되는 질환의 발증을 예측 또는 진단할 수 있다. 한편, 그 유전자의 발현이 항진 상태에 있는 것이 검출된 경우에는, 시험된 포유류 동물은, 섭식 억제 상태 또는 체중 증가 억제 상태에 있는 것, 나아가서는 거식증, 기능성 위장증 (Functional dyspepsia), 또는 암, 염증성 질환, 하수체·갑상선·부신 등의 기능 저하, 수술 후 또는 과도의 스트레스 등에 의한 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제의 병태의 상태를 예측 또는 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은, 포유류 동물의 생체 시료에 있어서의 NESFATIN 폴리펩티드 등 (배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드) 의 함유량을, 정상 개체의 생체 시료와 비교하여, 그 폴리펩티드 함유의 저하 상태 또는 상승 상태를 검출하는 공정을 포함하는, 섭식 조절 및/또는 체중 조절 상태를 예측 또는 진단하는 방법에 관한 것이다. 그 방법은, NESFATIN 폴리펩티드 등을 측정함으로써 실시할 수 있다.
사용되는 생체 시료로는, 혈액, 오줌, 뇌 척수액, 타액, 생체검사에 의해 채취된 뇌 조직 등을 들 수 있고, 그 중에서도 혈액이 바람직하다. 시료로서 사용되는 혈액으로는, 전혈, 또는 전혈로부터 얻어진 혈장 또는 혈청을 들 수 있다. 이들 생체 시료의 채취 방법은 공지되어 있다. 또한, 이들 생체 시료의 라이세이트 등의 조제물도 시료로서 사용할 수 있다. 생체 시료의 라이세이트의 제조에는, 시판되는 키트를 이용하면 편리하다. 또는, 혈액, 뇌 척수액과 같은 액상 생체 시료에 있어서는, 필요에 따라 완충액 등으로 희석하여 단백질에 대해서 측정을 위한 시료로 할 수 있다.
NESFATIN 폴리펩티드 등의 측정은, 그 폴리펩티드의 면역학적 측정법을 사용할 수 있고, 그 면역학적 측정에서는, NESFATIN 폴리펩티드 등과 결합하는 항체를 사용할 수 있다. 이러한 항체로는 상기 서술한 항체를 들 수 있고, 구체적으로는, 실시예 3 및 실시예 10 에서 취득한 NESFATIN 폴리펩티드에서 유래되는 펩티드를 면역시켜 취득한 항체, 또는 NESFATIN-1 폴리펩티드 또는 NESFATIN-1M30 폴리펩티드에서 유래되는 펩티드에서 유래되는 펩티드를 면역시켜 취득한 항체를 들 수 있다. 또한, 이들 항체에 한정되지 않고, NESFATIN 폴리펩티드 등에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체이면 특별히 한정되지 않고 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 방법에 사용되는 항체는, 어세이 포맷에 따라 적당한 표지를 결합할 수 있다. 또는 그 항체는, 어세이 포맷에 따라 적당한 지지체에 고정화시켜 둘 수도 있다.
면역학적 측정법은, 적절히 그 진단 방법에 맞춘 포맷으로 실시하는 것이 가능하다. 예를 들어 혈액 시료나 생체 조직의 라이세이트 등을 사용하는 경우에는, ELISA 법, RIA 법, 웨스턴 블로팅법 등을 선택할 수 있고, 또한 조직 표본을 사용하는 경우에는 면역 조직 화학적 수법 등을 선택할 수 있다. 보다 구체적인 예로는, 실시예에 나타내는 웨스턴 블로팅법, 실시예 4 및 11 에 나타내는 면역 조직 화학적 방법 등을 들 수 있는데, 그 밖에 항체를 사용하여 적절히 NESFATIN 폴리펩티드 등의 측정계를 구축하는 것이 가능하다. 예를 들어, 실시예 3 에는 웨스턴 블로팅의 예가, 실시예 4 및 9 에는 면역 조직 화학적 수법에 의한 예가, 실시예 21 에는 ELISA (경합 EIA) 의 예가 나타나 있다.
시험 시료의 NESFATIN 폴리펩티드 등의 함유량을, 정상 개체의 생체 시료와 비교하여, 그 폴리펩티드 함유가 저하 상태에 있는 것이 검출된 경우에는, 섭식 항진 또는 체중 증가 항진의 상태에 있다고 예측 또는 진단할 수 있고, 나아가서는 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 정형외과적 질환, 월경 이상 및 악성 종양에서 선택되는 질환의 발증을 예측 또는 진단할 수 있다. 한편, 그 폴리펩티드 함유가 상승 상태에 있는 것이 검출된 경우에는, 섭식 억제 또는 체중 증가 억제 상태에 있는 것, 나아가서는 거식증, 기능성 위장증 (Functional dyspepsia), 또는 암, 염증성 질환, 하수체·갑상선·부신 등의 기능 저하, 수술 후 또는 과도의 스트레스 등에 의한 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제의 병태의 상태를 예측 또는 진단할 수 있다.
<섭식 조절 및/또는 체중 조절 상태를 예측 또는 진단하기 위한 검정 방법에 사용되는 키트>
본 발명은, 상기 서술한 섭식 조절 및/또는 체중 조절 상태를 예측 또는 진단하는 방법에 사용되는 키트에 관한 것이기도 하다. 그와 같은 키트로는, NESFATIN 등을 코드하는 유전자 (배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자) 의 발현량을 검출하기 위한 키트, 또는 NESFATIN 폴리펩티드 등 (배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드) 의 함유량을 측정하기 위한 키트 등을 들 수 있다.
NESFATIN 등을 코드하는 유전자의 발현량의 검출 키트에는, 그 유전자를 검출하기 위한 PCR 프라이머, 프로브 또는 DNA 칩이 적어도 1 개 포함된다.
본 발명의 키트에 포함되는 PCR 프라이머란, NESFATIN 등을 코드하는 유전자의 염기 배열, 또는 그 상보 사슬에 상보적인 염기 배열로 이루어지는 적어도 18 염기의 길이의 올리고뉴클레오티드를 말하고, 당업자이면, 본 명세서에 기재된 NESFATIN 등을 코드하는 유전자의 염기 배열에 기초하여 적절히 조제할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트에 포함되는 PCR 프라이머로는, 배열 번호 22 (포워드 프라이머) 및 배열 번호 23 (리버스 프라이머) 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 키트에 포함되는 프로브로는, 예를 들어 상기 프라이머를 사용하여, 주형으로서 배열 번호 21 의 DNA 배열을 사용하고, 증폭시킨 단편을 표지화함으로써 얻어지는 것 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것 은 아니다. 본 발명의 키트에 포함되는 DNA 칩이란, 상기 프로브를 유리 등의 기반에 고정시킴으로써 제조할 수 있다.
그 밖에, 본 발명의 키트에는, 부가적인 요소로서, 시약이나 생체 시료를 희석하기 위한 완충액, 양성 대조, 음성 대조, 표지를 측정하기 위한 기질, 반응 용기, 어세이 프로토콜을 기재한 지시서 등을 포함시킬 수 있다. 이들 요소는 필요에 따라 미리 혼합해 둘 수도 있다. 또한, 필요에 따라, 보존제나 방부제를 각 요소에 추가할 수 있다.
NESFATIN 폴리펩티드 등의 함유량의 측정 키트에는, 그 폴리펩티드를 인식하는 항체, 표준 펩티드 또는 결합 경합 반응용 펩티드 수식체가 적어도 1 개 포함된다.
본 발명의 키트에 포함되는 항체는, 상기 서술한 방법에 사용되는 항체와 동일하게, NESFATIN 폴리펩티드 등을 인식하는 항체이면 되고, 특별히 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 키트에 포함되는 표준 펩티드란, 상기 항체의, NESFATIN 폴리펩티드 등과의 양 의존적인 결합력을 나타내는 표준 검량 곡선을 작성하기 위해 사용되는 것이다. 이러한 표준 폴리펩티드로는, 예를 들어 NESFATIN 폴리펩티드 등, 상기 항체가 인식하는 폴리펩티드를 들 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 결합 경합 반응용 펩티드 수식체란, 상기 항체에 의해 인식되는 펩티드로서, 측정 대상인 생체 시료 중의 NESFATIN 폴리펩티드 등과 그 항체의 결합을 길항하는 작용을 갖는 펩티드를 말한다. 또한, 그 결합 경합 반응용 펩티드 수식체는, 통상 적당히 표지하여 사용된다.
이들을 포함하는 본 발명의 키트는, 예를 들어 (1) 상기 결합 경합 반응용 펩티드 수식체 존재하, 표준 펩티드와 상기 항체로부터 얻어지는 표준 검량 곡선을 작성하고, (2) 생체 시료 중, 상기 결합 경합 반응용 펩티드 수식체 존재 하에서 상기 항체를 첨가하고, (3) 결합 경합 반응용 펩티드 수식체와 항체의 결합량을 표준 검량 곡선에 의해 측정함으로써, 생체 시료 중에 포함되는 NESFATIN 폴리펩티드 등의 함유량을 측정할 수 있다.
또한, 서로 결합을 저해하지 않는 2 종류의 NESFATIN 폴리펩티드 등을 인식하는 항체를 사용하여 그 폴리펩티드의 함유량을 측정하는 것도 가능하다. 이 경우, 통상 제 1 항체는 고상에 고정화시키고, 제 2 항체는 적당히 표지하여 사용된다.
이들을 포함하는 본 발명의 키트는, 예를 들어 (1) 고정화시킨 제 1 항체에 표준 펩티드를 첨가하여 반응시킨 후, 추가로 표지된 제 2 항체를 첨가함으로써 표준 검량 곡선을 작성하고, (2) 동일하게 고정화시킨 제 1 항체에 생체 시료를 첨가하여 반응시킨 후, 표지된 제 2 항체를 첨가하고, (3) 생체 시료에서의 반응에 있어서의 제 2 항체의 결합량을 표준 검량 곡선에 의해 측정함으로써, 생체 시료 중에 포함되는 NESFATIN 폴리펩티드 등 폴리펩티드의 함유량을 측정할 수 있다.
그 밖에, 본 발명의 키트에는, 부가적인 요소로서, 시약이나 생체 시료를 희석하기 위한 완충액, 양성 대조, 음성 대조, 표지를 측정하기 위한 기질, 반응 용기, 어세이 프로토콜을 기재한 지시서 등을 포함시킬 수 있다. 이들 요소는 필 요에 따라 미리 혼합해 둘 수도 있다. 또한, 필요에 따라, 보존제나 방부제를 각 요소에 추가할 수 있다.
<치료 후보 화합물의 스크리닝 방법>
본 발명은, 섭식 조절 및/또는 체중 조절 효과를 갖는 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관련되는 질환 또는 증상의 치료 또는 예방 후보 화합물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
즉, 본 발명은, 시험 물질을 포유류 세포에 접촉시키는 공정, 및 그 세포에 있어서의 NESFATIN 등을 코드하는 유전자 (배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자) 의 발현 유도를, 또는 그 세포 내에 포함되거나 세포 외로 분비되는 NESFATIN 폴리펩티드 등 (배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드) 의 양의 증가를 검출하는 공정을 포함하는, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 비만, 당뇨병, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 정형외과적 질환, 월경 이상 및 악성 종양에 있어서는 섭식 억제나 체중 증가 억제가 필요하게 되는 것이 나타나 있다. 상기 서술한 스크리닝 방법에 의해, 그 질환에 대한 치료제 또는 예방제를 얻을 수 있다.
한편, 본 발명은, 시험 물질을 포유류 세포에 접촉시키는 공정, 및 그 세포에 있어서의 NESFATIN 등을 코드하는 유전자의 발현 억제를, 또는 그 세포 내에 포 함되거나 또는 세포 외로 분비되는 NESFATIN 폴리펩티드 등의 양의 감소를 검출하는 공정을 포함하는, 섭식 항진 및/또는 체중 증가 항진의 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법에 관한 것이기도 하다. 거식증, 기능성 위장증 (Functional dyspepsia), 또는 암, 염증성 질환, 하수체·갑상선·부신 등의 기능 저하, 수술 후 또는 과도의 스트레스 등에 의한 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 상태에 있어서는, 섭식의 항진이나 체중 증가의 항진이 필요하게 되는 것이 나타나 있다. 상기 서술한 스크리닝 방법에 의해, 그 질환에 대한 치료제 또는 예방제를 얻을 수 있다.
그 폴리펩티드 또는 그것을 코드하는 유전자의 발현 레벨을 상승 또는 저하시키는 화합물이란, 유전자의 전사, 안정화 또는 번역, 또는 단백질의 분비, 활성 발현 또는 안정화 중 어느 하나의 단계에 대하여, 촉진적 또는 억제적으로 작용하는 화합물이다. 본 발명에 있어서 유전자의 발현 레벨을 저하시키는 화합물이란, 이들 단계 중 어느 하나에 대하여 저해적인 작용을 갖는 화합물이다.
본 발명의 섭식 조절 및/또는 체중 조절에 관련되는 질환이나 증상의 치료 후보 화합물의 스크리닝 방법은, in vivo 에서 실시할 수도 있고, in vitro 에서 실시할 수도 있다. 이 스크리닝은, 예를 들어 in vivo 의 경우에는 이하와 같은 공정에 따라서 실시할 수 있다.
(1) 피험 동물에게 후보 화합물을 투여하는 공정
(2) 상기 피험 동물의 생체 시료에 있어서의, NESFATIN 폴리펩티드 등, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현 강도를 측정하는 공정
(3) 후보 화합물을 투여하지 않은 대조와 비교하여, NESFATIN 폴리펩티드 등, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현 강도를 상승시키는 화합물 또는 저하시키는 화합물을 선택하는 공정.
NESFATIN 폴리펩티드 등을 생성 항진시키거나, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현 강도를 상승시키는 화합물은, 섭식 및/또는 체중 증가를 억제하는 치료약의 후보가 된다. 그와 같은 활성을 갖는 물질로는 PPARγ 애고니스트 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다. 한편, NESFATIN 폴리펩티드 등을 생성 억제시키거나, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현 강도를 저하시키는 화합물은, 섭식 및/또는 체중 증가를 항진하는 치료약의 후보가 된다. 이러한 활성을 갖는 물질로는, NESFATIN 폴리펩티드 등과 결합하는 항체, 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, PPARγ 앤타고니스트 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법에 사용하는 피험 물질로는, 정상 동물을 사용하는 것이 가능한데, 적절히 섭식 조절 및/체중 조절에 관련되는 질환의 병태 모델 동물 등도 사용하는 것이 가능하다. 그와 같은 병태 모델 동물의 예로는 Agouti Yellow (C57BL/6J-Ay/a) 비만 마우스나 Zucker-fa/fa 비만 래트 등을 들 수 있고, 또한 본 발명의 트랜스제닉 동물이나 NESFATIN 폴리펩티드 등이나 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 활성 또는 발현을 억제하는 물질이 투여된 모델 동물 등도 사용하는 것이 가능하다.
NESFATIN 폴리펩티드 등, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현 강 도의 측정에 관해서는, 면역학적 측정법이나 mRNA 등의 측정을 실시함으로써 실시할 수 있다. 면역학적 측정법에 있어서는, 적절히 그 측정 목적이나 생체 시료에 맞춘 포맷으로 실시하는 것이 가능하다. 예를 들어 생체 시료가 혈액 시료나 생체 조직의 라이세이트 등을 사용하는 경우에는 ELISA 법, RIA 법, 웨스턴 블로팅법 등을 선택할 수 있고, 또한 조직 표본을 사용하는 경우에는 면역 조직 화학적 수법 등을 선택할 수 있다. mRNA 를 측정하는 경우에는, 적절히 그 측정 목적 및 생체 시료에 맞춘 포맷으로 실시할 수 있다. 예를 들어 생체 조직으로부터 추출한 mRNA 를 사용하는 경우에는 RT-PCR 법, 노던 블로팅법 등을 선택할 수 있고, 조직 표본을 사용하는 경우에는 인·시츄·하이브리다이제이션법 등을 선택할 수 있다.
in vitro 에서의 스크리닝의 예로는, 이하와 같은 공정에 따라서 실시할 수 있다.
(1) 포유 동물 유래의 세포 또는 조직에, 후보 화합물을 접촉시키는 공정
(2) 상기 세포 또는 조직의 시료에 있어서의 NESFATIN 폴리펩티드 등, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현 강도를 측정하는 공정
(3) 후보 화합물을 접촉시키고 있지 않은 대조와 비교하여, NESFATIN 폴리펩티드 등, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현 강도를 상승시키는 화합물 또는 저하시키는 화합물을 선택하는 공정.
이 경우, NESFATIN 폴리펩티드 등을 생성 항진시키거나, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현 강도를 상승시키는 화합물은, 섭식 및/또는 체중 증가 를 억제하는 치료약의 후보가 된다. 그와 같은 활성을 갖는 물질로는, PPARγ 애고니스트 등을 들 수 있는데, 이것에 한정되는 것은 아니다. 또한, NESFATIN 폴리펩티드 등을 생성 억제시키거나, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현 강도를 저하시키는 화합물은, 섭식 및/또는 체중 증가를 항진하는 치료약의 후보가 된다. 이러한 활성을 갖는 물질로는, NESFATIN 폴리펩티드 등과 결합하는 항체, 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 또는 PPARγ 앤타고니스트 등을 들 수 있는데, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 스크리닝 방법에 사용되는 피험 세포로는, 동물 유래의 세포의 경우, 적절히 동물로부터 분리한 세포나, 수립된 세포주 등을 들 수 있다. 그 예로는, 폐비소세포암 세포주, 지방 세포, 뇌 또는 신경에서 유래되는 세포, 또는 세포주 등을 들 수 있다. 또한 동물 유래의 조직은 적절히 동물로부터 취출한 장기나 조직 등을 사용할 수 있는데, 그 예로는 시상하부를 포함하는 형태의 뇌 조직 슬라이스 등을 사용하여 실시하는 것이 가능하다.
NESFATIN 폴리펩티드 등, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현 강도의 측정에 관해서는, 면역학적 측정법이나 mRNA 등의 측정을 실시함으로써 실시할 수 있다. 면역학적 측정법에 있어서는, 적절히 그 측정 목적이나 생체 시료에 맞춘 포맷으로 실시하는 것이 가능하다. 예를 들어 시료가 동물 유래의 세포에 의한 경우에는 플로사이트메트리법이나 세포 면역 염색 등을 사용할 수 있고, 동물 유래의 조직을 시료로서 사용하는 경우에는 면역 조직 화학적 수법 등을 선택할 수 있다. 시료로부터의 라이세이트 등의 조제물을 사용하는 경우의 면역학 적 측정법에는, ELISA 법, RIA 법, 웨스턴 블로팅법 등을 선택할 수 있다. mRNA 를 측정하는 경우에는, 적절히 그 측정 목적 및 생체 시료에 맞춘 포맷으로 실시할 수 있다. 예를 들어, 동물 유래의 세포나 조직의 시료에 대해서 형태를 유지한 채 사용하는 경우에는 인·시츄·하이브리다이제이션법 등을 선택할 수 있고, 그 시료로부터 추출한 mRNA 를 사용하는 경우에는 RT-PCR 법, 노던 블로팅법 등을 선택할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서는 PPARγ 애고니스트가 NESFATIN 폴리펩티드 등 및 그것을 코드하는 유전자의 발현을 상승시키는 것을 개시하고 있다. 그 때문에, 상기 공정 내의 「포유 동물 유래의 세포 또는 조직에, 후보 화합물을 접촉시키는 공정」 에 있어서, 트로글리타존 등의 PPARγ 를, 후보 화합물을 시료에 접촉시키는 것과 동시에 또는 전후의 타이밍으로 시료에 접촉시킴으로써, 발현이 상승한 NESFATIN 폴리펩티드 등, 또는 그들을 코드하는 유전자의 발현을 억제하는 화합물의 스크리닝이 가능하고, 그 폴리펩티드나 그것을 코드하는 유전자의 발현이 PPARγ 를 통하지 않은 기구로 발현을 상승시키는 화합물의 스크리닝 등을 실시하는 것이 가능하다.
또, NESFATIN 폴리펩티드 등이 세포에 작용했을 때 발생하는, 세포의 반응을 측정함으로써도 화합물을 스크리닝하는 것이 가능하다. 그와 같은 스크리닝의 예로는, 이하와 같은 공정을 포함하는 것을 들 수 있다.
(1) 포유 동물 유래의 세포 또는 조직에, 후보 화합물을 접촉시키는 공정
(2) 상기 세포 또는 조직의 시료에, NESFATIN 폴리펩티드 등을 접촉시키는 공정
(3) 후보 화합물을 접촉시키고 있지 않은 대조와 비교하여, NESFATIN 폴리펩티드 등에 의한, 세포의 반응성 유무 또는 강도를 측정하는 공정.
이 경우, NESFATIN 폴리펩티드 등에 의한 세포의 반응 강도를 상승시키는 화합물은, 섭식 및/또는 체중 증가를 억제하는 치료약의 후보가 된다. 또한, NESFATIN 폴리펩티드 등에 의한 세포의 반응 강도를 저하시키는 화합물은, 섭식 및/또는 체중 증가를 항진하는 치료약의 후보가 된다. 후자와 같은 활성을 갖는 물질로는, NESFATIN 폴리펩티드 등과 결합하는 항체를 들 수 있는데, 그들에 한정되는 것은 아니다.
피험 세포로는, 동물 유래의 세포의 경우, 적절히 동물로부터 분리한 세포나, 수립된 세포주 등을 들 수 있다. 그 예로는, 폐비소세포암 세포주, 지방 세포, 뇌 또는 신경에서 유래되는 세포, 또는 세포주 등을 들 수 있다. 또한 동물 유래의 조직은, 적절히 동물로부터 취출한 장기나 조직 등을 사용할 수 있는데, 그 예로는 시상하부를 포함하는 형태의 뇌 조직 슬라이스 등을 사용하여 실시하는 것이 가능하다.
상기 세포에 있어서의 반응이란, NESFATIN 폴리펩티드 등이 세포에 작동하여 야기되는, 물리적·화학적인 변화를 말하고, 예를 들어 세포의 형태, 막 전위, 세포의 증식, 세포내 칼슘 농도, 유주 반응, 세포내 2 차 메신저 분자 (cAMP, cGMP 등) 의 농도 등의 변화 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 스크리닝 방법에는, NESFATIN 유전자의 게놈 상의, 그 유전 자의 발현을 제어하는 전사 조절 영역을 취득하고, 그 전사 조절 영역의 핵산 분자를 이용하는 리포터 어세이계를 이용할 수 있다. 리포터 어세이계란, 전사 조절 영역의 하류에 배치한 리포터 유전자의 발현량을 지표로 하여, 그 전사 조절 영역에 작용하는 전사 조절 인자를 스크리닝하는 어세이계를 말한다.
그와 같은 스크리닝의 예로는, 다음의 (1)∼(3) 의 공정을 포함하는 것을 들 수 있다.
(1) NESFATIN 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 전사 조절 영역, 및 이 전사 조절 영역의 제어하에 리포터 유전자를 포함하는 벡터를 도입한 세포와 후보 화합물을 접촉시키는 공정,
(2) 상기 리포터 유전자의 활성을 측정하는 공정,
(3) 후보 화합물을 접촉시키지 않은 대조와 비교하여, 상기 리포터 유전자의 발현 레벨을 저하시키는 화합물 또는 상승시키는 화합물을 선택하는 공정.
이 경우, 리포터 유전자의 발현 강도를 상승시키는 화합물은, 섭식 및/또는 체중 증가를 억제하는 치료약의 후보가 된다. 그와 같은 활성을 갖는 물질로는, PPARγ 애고니스트 등을 들 수 있는데, 그것에 한정되는 것은 아니다. 또한, 리포터 유전자의 발현 강도를 저하시키는 화합물은, 섭식 및/또는 체중 증가를 항진하는 치료약의 후보가 된다. 이러한 활성을 갖는 물질로는, NESFATIN 폴리펩티드 등과 결합하는 항체, 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, PPARγ 앤타고니스트 등을 들 수 있는데, 그들에 한정되는 것은 아니다.
전사 조절 영역으로는, 프로모터, 인핸서, 통상 프로모터 영역에 보이는 CAAT 박스, 또는 TATA 박스 등을 들 수 있다. 리포터 유전자로는, CAT (chloramphenicol acetyltransferase) 유전자, 루시페라아제 (luciferase) 유전자, 성장 호르몬 유전자 등을 이용할 수 있다.
리포터 진 벡터를 도입하는 세포로는, 동물로부터 분리 또는 수립된 세포주, 또는 효모 등의 비동물 세포 등을 들 수 있다.
리포터 진 벡터의 숙주에 대한 도입 방법으로는, 생물학적 방법, 물리적 방법, 화학적 방법 등을 나타낼 수 있다. 생물학적 방법으로는, 예를 들어 바이러스 벡터를 사용하는 방법, 특이적 수용체를 이용하는 방법, 세포 융합법 (HVJ (센다이 바이러스)), 폴리에틸렌글리콜 (PEG), 전기적 세포 융합법, 미소핵 융합법 (염색체 이입)) 을 들 수 있다. 또한, 물리학적 방법으로는, 마이크로인젝션법, 일렉트로포레이션법, 진 파티클 건 (gene gun) 을 사용하는 방법을 들 수 있다. 화학적 방법으로는, 인산 칼슘 침전법, 리포솜법, DEAE 덱스트란법, 프로토플라스트법, 적혈구 고스트법, 적혈구막 고스트법, 마이크로캡슐법을 들 수 있다.
상기 서술한 본 발명의 각종 스크리닝 방법에 필요한 폴리뉴클레오티드, 항체, 세포주, 또는 모델 동물은, 미리 조합하여 키트로 할 수 있다. 이들 키트에는, 부가적인 요소로서, 표지의 검출에 사용되는 기질 화합물, 세포의 배양을 위한 배지 또는 용기, 양성 또는 음성의 표준 시료, 또는 키트의 사용 방법을 기재한 지시서 등을 포함시킬 수 있다. 이들 요소는 필요에 따라 미리 혼합해 둘 수도 있고, 필요에 따라 보존제나 방부제를 각 요소에 추가할 수도 있다.
이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하는데, 이들 실시예는 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 또, 이하의 실시예에 있어서, 각 조작은 특별히 명시가 없는 한, 「Molecular Cloning」 (Sambrook, J., Fritsch, E. F. 및 Maniatis, T. 저, Cold Spring Harbor Laboratory Press 로부터 1989 년에 발간) 에 기재된 방법에 의해 실시하거나, 또는 시판되는 시약이나 키트를 사용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라서 사용하였다. 동물을 사용한 실험에 있어서는, 특별히 명시가 없는 한, 동물 (수컷 래트) 은 오전 6 시부터 오후 6 시까지의 12 시간을 명기, 오후 6 시부터 다음날 아침 오전 6 시를 12 시간의 암기의 주기로 조명 하에서, 22℃ 의 조건에서 사육하고, 실험은 군마 대학 동물 실험 시설의 허가하에 실시되었다.
실시예 1 PPARγ 애고니스트 자극에 의해 유도되는 유전자의 클로닝
PPARγ 에 의해 발현이 조절되는 유전자 중에서 섭식 및/또는 체중 조절에 작용하는 유전자를 동정하기 위해, SQ-5 세포 (주로 인간 폐암 세포 유래) 를 PPARγ 애고니스트로 자극한 경우에 특이적으로 유도되는 유전자를 클로닝하고, 또한 그 중에서 분비성 인자로서 작용할 가능성이 있는 유전자를 선정하였다.
PPARγ 에 의해 폐비소세포암에서 특이적으로 발현이 유도되는 유전자의 취득 방법에 대해서는, Satoh 등 Oncogene (England) 2002 년 21 권 p2171∼2180 에 기재된 방법으로 실시하였다. 그 방법을 이하에 간단히 기재한다. SQ-5 (리켄 바이오리소스 센터 RBC0110) 를 PPARγ 애고니스트의 하나인 트로글리타존 (산쿄 주식회사) 을 10-4M 으로 48 시간 자극 하에서 배양한 것, 및 트로글리타존으로 자극하지 않은 SQ-5 세포로부터, 각각 Poly(A) + RNA (mRNA) 를 조제하여 역전사 반응에 의해 2 개 사슬 cDNA 를 조제하였다. 얻어진 2 개 사슬 cDNA 를 사용하여 트로글리타존으로 자극한 세포로부터 조제한 cDNA (테스터) 로부터, 무자극 세포에서 발현하고 있는 세포의 cDNA (드라이버) 를 사용하여 공통으로 발현하고 있는 유전자를 빼는, 서브트랙션법을 실시하였다. 서브트랙션법은, 테스터 및 드라이버의 cDNA 를 제한 효소 RsaⅠ 로 절단한 단편을 사용하고, CLONTECH 사의 PCR-based cloning kit 에 의해, 첨부한 프로토콜에 준하여 실시하였다. 서브트랙션 반응에서 남은 cDNA 는 TAE 버퍼 (40mM Tris-Acetate, 1mM EDTA) 를 사용하여 1% 아가로오스 겔에서의 전기 영동을 실시하고, 그 후 cDNA 길이가 0.5∼2.0kb 에 상당하는 길이의 것을 회수하고, pGEM(R)-T Easy Vector System Ⅰ (프로메가사 Cat. No. A1360) 을 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라서, pGEM(R)-T Easy 벡터와 라이게이션하였다. 라이게이션한 벡터를 대장균 DH5α 주에 도입하고, 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 LB 배지에서 제조한 한천 배지 상에서 콜로니를 형성시키고, 얻어진 콜로니를 픽업함으로써 트로글리타존 자극에 의해 특이적으로 발현이 유도되는 유전자의 cDNA 를 포함하는 클론을 취득하였다.
각 클론의 동정은, 클로닝된 cDNA 의 염기 배열을 해석함으로써 실시하였다. 얻어진 각 클론의 대장균을 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 10㎖ 의 LB 배지에 서 하룻밤 배양하고, 그 균체로부터 QIAGEN 사 QIAprep(R) Spin Miniprep kit 를 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라서 플라스미드를 조제하였다.
얻어진 각 클론의 플라스미드에 대해서, T7 프라이머 (Promega 사 Cat. No. Q5021) 와 어플라이드 바이오시스템즈사의 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit (Cat. No. 4303149) 를 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라서, 염기 배열 해석용 반응물을 제조하고, ABI377 형 DNA 시퀀서 (Perkin-Elmer 사) 를 사용하여 염기 배열을 해석하였다.
그 각 클론 cDNA 의 염기 배열을 쿼리(query)로 하여, EMBL 및 Genbank 의 핵산 배열 데이터 베이스 상의 배열과 BLAST 법을 실시함으로써, 이미 전장의 cDNA 배열이 이미 알려진 것에 대해서는 그 배열을 취득하였다.
이상의 공정에 의해 전장 cDNA 배열이 얻어진 것으로부터, 분비성 인자를 선택하기 위해, Signal P 소프트웨어로 해석하여 시그널 펩티드를 갖는 단백질을 코드하고 있는 cDNA 를 해석하였다.
<결과>
트로글리타존으로 자극한 SQ-5 세포로부터 취득한 cDNA 를 사용하여, 트로글리타존으로 자극하지 않은 SQ-5 세포의 cDNA 에서 서브트랙션을 실시하여 얻어진 클론은 596 클론이었다. 그들 중에서 EMBL 및 Genbank 의 핵산 배열 중의 등록 배열과 현저한 상동성이 관찰된 것은 213 클론이었다. 또한, 시그널 펩티드의 해석에 의해, 9 클론에 있어서 시그널 펩티드 배열을 갖는 것이 시사되었다. 그 9 클론의 1 개는, 기능이 아직 동정되어 있지 않은 인간 NEFA 유전자이었다 (배열 번호 1).
실시예 2 PPARγ 애고니스트 자극에 의한 배양 세포주에서의 NEFA 유전자의 발현 유도
트로글리타존에 의한 NEFA 유전자의 유도를 확인하기 위해, PPARγ 를 발현하고 있는 세포주 HTB185 및 SQ5, 그리고 지방 세포주 3T3-L1 을 사용하여, Northern 블로팅법에 의한 NEFA 유전자의 발현 해석을 실시하였다.
SQ-5 (리켄 바이오리소스 센터 RBC0110) 는 10% 의 소 태아 혈청 (인비트로젠-GIBCO 사) 을 포함하는 RPMI1640 배지 (인비트로젠-BRL 사 Cat. No.11875-085) 에서 계대 배양한 것을 사용하였다. 인간 뇌수 아세포종주 HTB185 세포 (D283 Med : ATCC HTB185), 및 인슐린·덱사메타존·IBMX 에서 분화 유도된 마우스 태아 섬유아세포주 (전구 지방 세포주) 3T3-L1 세포 (ATCC CL-173) 는, 10% 의 소 태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지 (인비트로젠-GIBCO 사 Cat. No.11995-040) 에서 계대 배양한 것을 사용하였다. 각각의 배지 10㎖ 에 서스펜드한 각 세포 106 세포를 직경 10㎝ 의 디쉬에 뿌려 넣고, 세포가 기질에 부착한 후, DMSO 만 (컨트롤) 또는 트로글리타존 (산쿄 주식회사) 을, 10-4M, 10-4.5M 또는 10-5M 의 농도가 되도록 배지에 첨가하여, 24 시간 또는 48 시간 37℃ 에서 5% CO2 의 조건 하에서 배양을 실시하였다. 각 실험군에 대해서 5 장의 디쉬에서 처리된 세포를, 특정한 시간 후 기질로부터 벗겨 모으고, ISOGEN (닛폰진사 Cat. No.317-02503) 을 사용하여 그 프 로토콜에 기재된 방법으로 총 RNA 를 추출·회수하였다.
NEFA 유전자를 검출하기 위한 프로브의 제조는, 배열 번호 21 에 기재된 565bp 의 길이의 DNA 단편을 사용하여, SP6 폴리머라아제를 사용한 in vitro 전사에 의한 표지화를 실시함으로써 제조하였다. 먼저 Mouse Brain cDNA Library (Invitrogen 사 Cat. No.10655-25) 로부터 추출한 플라스미드를 주형으로 하여, 이하에 기재된 프라이머를 0.2μM 의 농도로 사용하고, 변성 94℃ 에서 1.5 분, 어닐링 58℃ 에서 1 분, 증폭 72℃ 에서 2 분의 반응 사이클을 35 사이클 실시하여 증폭 DNA 를 제조하였다 (다카라바이오사 Takara Ex TaqTM 폴리머라아제 Cat. No.RR001A 2.5U 를 사용).
NEFA 프로브 제조 PCR 용 프라이머 :
Figure 112007092849294-PCT00001
얻어진 증폭 DNA 산물은, TAE 버퍼를 사용한 2% 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 산물의 순도를 확인한 후, pGEM(R)-T Easy Vector System Ⅰ (프로메가사 Cat. No.A1360) 을 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라서, pGEM(R)-T Easy 벡터 중에 서브클로닝을 실시하고, 대장균 DH5α 에 도입하여 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 LB 배지에서 제조한 한천 배지 상에서 콜로니를 형성시켰다. 얻어진 콜로니 수개 를 각각 픽업하고, 그 대장균을 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 10㎖ 의 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, 그 균체로부터 QIAGEN 사 QIAprep(R) Spin Miniprep kit 를 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라서 플라스미드를 조제하였다. T7 프라이머 (Promega 사 Cat. No.Q5021) 또는 SP6 프라이머 (Promega 사 Cat. No.Q5011) 와, 어플라이드 바이오시스템즈사의 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit (Cat. No.4303149) 에서 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라서 염기 배열 해석용 반응물을 제조하고, ABI377 형 DNA 시퀀서 (Perkin-Elmer 사) 를 사용하여 염기 배열을 해석하였다. 예상 배열과 일치하는 배열을 가지며, NEFA 유래의 증폭 유전자의 5' 측이 벡터의 T7 프로모터측을 향하고 있는 클론을, 프로브 제조용 플라스미드를 얻는 클론으로 하였다. 그 클론을 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 10㎖ 의 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, 그 균체로부터 QIAGEN 사 플라스미드 미니키트를 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라서 플라스미드를 조제하였다. 조제한 플라스미드는 제한 효소 Nco Ⅰ 로 절단하고, 페놀 추출·페놀/CIAA 추출에 의해 정제하고, 에탄올 침전한 후에 RNA 분해 효소를 포함하지 않는 TE 버퍼 (10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH8.0) 에 1㎍/㎖ 로 용해한 것을, 프로브 제조용 주형 플라스미드 DNA 로서 사용하였다. 표지화 RNA 프로브는 주형 플라스미드 DNA 1㎍ 으로부터, Promega 사 Riboprobe(R) System-SP6 을 사용하여 2.5μM 의 [α-32P]UTP (Amersham Bioscience 사 Cat. No.PB10203, 3000ci/mM, 10mci/㎖) 와 20U 의 RNA 합성 효소 SP6 (키트에 포함된다) 을 사용하여 키트 첨부한 프로토콜에 따 라서 제조하였다.
Northern 블로팅용 전기 영동은, 각 세포로부터 얻어진 총 RNA 를 0.66M 의 탈이온화한 포름알데히드를 함유하는 MOPS 완충액 (20mM 3-(N-morphorino)-propanesulfonic acid, 5mM 아세트산 나트륨, 0.5mM EDTA) 으로 제조한 1.2% 아가로오스 겔을 사용하고, 포름알데히드를 함유하는 MOPS 완충액으로 100V/2 시간 전기 영동을 실시하였다. 전기 영동 후의 겔로부터, 10 배 농도의 SSC (150mM NaCl, 15mM 아세트산 나트륨) 를 사용하여, 나일론 멤브레인 (Perkin-Elmer 사 Gene Screen Plus(R) Hybridization Transfer Membrane) 에 RNA 를 트랜스퍼하였다. 트랜스퍼한 나일론 멤브레인은, Stratagene 사 Stratalinker 를 사용하여 UV 에 의한 RNA 의 고정화를 실시하였다. 그 후, 나일론 멤브레인은, 프리하이브리다이제이션액 (0.25M NaCl, 20mM Tris-HCl pH7.5, 2.5mM EDTA, 1% SDS, 0.5% 소 혈청 알부민, 0.5% Polyvinylpyrolidone, 0.5% Ficoll, 50% 탈이온화 포름아미드) 으로 43℃ 3 시간 프리하이브리다이즈를 실시하고, 추가로 1,000,000cpm/㎖ 의 표지 RNA 프로브를 포함하는 하이브리다이제이션액 (0.25M NaCl, 20mM Tris-HCl pH7.5, 2.5mM EDTA, 1% SDS, 0.5% 소 혈청 알부민, 0.5% Polyvinylpyrolidone, 0.5% Ficoll, 50% 탈이온화 포름아미드, 10% 황산 덱스트란) 중에 있어서 43℃ 에서 하룻밤 하이브리다이제이션을 실시하였다. 하이브리다이제이션 후의 나일론 멤브레인은, 2 배 농도의 SSC 로 헹군 후, 60℃ 의 0.1% SDS 를 포함하는 0.2 배 농도의 SSC 중에서 30 분간씩 2 회 스트리전트 세정을 실시하였다. 세정 후의 나일 론 멤브레인은, 증감 (增感) 스크린 (Cronex 사 Lightning Plus) 존재 하에서 X 선 필름 (Kodak 사 XAR film) 에 하룻밤 폭로시킴으로써, 하이브리다이즈한 라벨화 RNA 프로브를 검출하였다.
<결과>
트로글리타존 (TGZ) 에 의한 세포주에서의 NEFA 유전자의 유도를 Northern 블로팅법으로 해석한 결과를 도 1 에 나타낸다. 도 1 의 레인 1 내지 4 는 PPARγ 을 발현하고 있는 인간 뇌수 아세포종주 HTB185 세포를 사용한 검토 결과이다. 레인 1 과 3 은 HTB185 세포를 TGZ 로 자극하지 않은 상태에서 배양한 세포의 RNA (각각 24 시간, 48 시간 배양), 레인 2 와 4 는 트로글리타존 10-4M 으로 각각 24 시간 및 48 시간 자극한 세포의 RNA 를 사용하여 NEFA 유전자 발현을 검출한 결과를 나타낸다. 그 결과, TGZ 자극을 하지 않은 세포에서는 약간의 NEFA 유전자의 발현밖에 관찰되지 않는 (레인 1 및 3) 것에 대해, TGZ 로 48 시간 자극한 세포에 있어서는 현저한 유도가 관찰되었다 (레인 4). 또한 도면의 레인 5 및 6 은, PPARγ 를 발현하고 있는 SQ-5 를 사용한 검토 결과이다. 레인 5 는 TGZ 로 자극하지 않은 상태에서 배양한 SQ-5 세포의 RNA (24 시간 배양), 레인 6 은 TGZ 10-4M 으로 24 시간 자극한 세포의 RNA 를 사용하여 NEFA 유전자 발현을 본 것이다. 그 결과 TGZ 자극하지 않은 세포에서는 낮은 레벨에서의 발현이 관찰되는데 (레인 5), TGZ 자극으로 24 시간 배양한 세포에서는 현저한 NEFA 유전자의 발현 유도가 관찰되었다 (레인 6). 또한 도 1 의 레인 7 내지 10 은, PPARγ 를 발현하고 있는 마우스 태아 섬유아세포주 (전구 지방 세포주) 3T3-L1 세포를 사용하여 검토한 결과이다. 레인 7 은 TGZ 로 자극하지 않은 상태에서 배양한 3T3-L1 세포의 RNA (48 시간 배양) 를, 레인 8∼10 은 3T3-L1 세포를 TGZ 로 각각 10-5M·10-4.5M·10-4M 으로 48 시간 자극한 세포의 RNA 를 사용하여, NEFA 유전자의 발현을 검출한 결과를 나타낸다. 그 결과, 그 세포를 TGZ 로 자극하지 않은 경우에도 NEFA 유전자의 상당한 발현량이 관찰되고 (레인 7), 그 발현은 10-5M 내지 10-4M 의 TGZ 로 자극한 경우에도 동일한 결과가 얻어지고, NEFA 유전자는 지방 세포에 있어서는 PPARγ 의 자극에 관계 없이 항상적으로 발현하고 있는 것이 관찰되었다.
실시예 3 NEFA 에 대한 항체의 제조와 래트 뇌에서의 발현의 검증
지방 세포에 발현하고 있는 분비 단백질은, 뇌에서도 발현하여 섭식 조절 작용을 가질 가능성이 있는 뇌-지방 세포계 (The Brain-Adipose Axis) 로서 제창되어 있다 (모리 마사토모 : 비만 연구 2004 년 10 권 p117-119, Shimizu H and Mori M : Nutritional Nuerosci 8 : 7-20, 2005). 그래서, 지방 세포와 뇌 종양 세포에 발현하고 있는 NEFA 에 대한 항체를 제조하여, NEFA 의 시상하부에서의 발현의 국재를 검토하였다.
NEFA 에 대한 항체의 제조를 위해, 항원으로서, 래트 전구체 NEFA 폴리펩티드의 아미노산 배열 (배열 번호 8) 의 141 번째의 His 내지 152 번째의 Ser 까지의 배열에 C 말단 부위에 Cys 를 붙인 합성 펩티드 (배열 번호 24 : 주식회사 ATP 에 서 합성) 를 사용하였다 (이하, 그 펩티드를 NAP 펩티드라고 한다).
Figure 112007092849294-PCT00002
그 합성 NAP 펩티드는 PIERCE 사 Imject(R) Maleimide Activated Mariculture Keyhole Limpet Hemocyanin 을 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라서, 펩티드를 KLH (Keyhole Limpet Hemocyanin) 에 콘쥬게이트하였다. 얻어진 콘쥬게이트는 토끼 1 마리에 대하여 0.2㎎ 을 1 회분의 면역에 사용하였다. 면역은 콘쥬게이트 용액 0.25㎖ (콘쥬게이트 농도 1㎎/㎖) 와 등량의 프로인드 완전 애주번트 H-37 Ra (와코 순약-Difco 사 Cat. No.528-00031) 를 혼합하고, 털을 깎은 뉴질랜드 화이트계 토끼 (이마이 실험 동물 시험장으로부터 구입) 의 등부에, 50㎕ 씩 8 지점에 피내 주사함으로써 실시하였다. 동일한 면역을 2 주일마다 추가로 4 회 실시한 후, 최후의 면역으로부터 1 주일 후에 혈액을 일부 채취하고, 그 혈청 중의 항체가를 면역시킨 펩티드 콘쥬게이트를 사용한 ELISA 법으로 확인하고, 그 다음날에 동물을 도살하여 전혈을 채취하였다. 얻어진 혈액으로부터 혈청을 제조하고, 그 혈청으로부터 DEAESepharoseFF (Amersham Bioscience 사 Cat. No.17-0709-10) 를 사용하여 정법에 의해 토끼 IgG 를 정제하였다. 정제된 토끼 IgG 는, 1㎎ 의 NAP 펩티드를 사용하여 SulfoLink kit (PIERCE 사 Cat. No.44895) 에 의해 제조한 펩티드 고정화 칼럼을 사용하여, 그 키트 첨부한 프로토콜에 따라서 어피니티 정제하였다.
얻어진 NAP 펩티드에 대한 항체 (항 NAP 폴리클로날 항체) 를 사용하여, 래트 뇌에 있어서의 NEFA 폴리펩티드의 발현에 대해서 웨스턴 블로팅법으로 해석하였다.
래트의 뇌로부터의 단백질 추출액은, 8 주령의 Wistar 계 래트 (닛폰 찰즈·리버) 의 뇌 시상하부 (1.7g) 를 5㎖ 의 추출 완충액 (50mM Tris-HCl pH8.0, 150mM NaCl, 5mM EDTA, 1% Nonidet P-40) 으로 호모지나이즈하여 조제하였다. 얻어진 래트의 뇌 라이세이트에 등량의 SDS-폴리아크릴아미드 전기 영동 (SDS-PAGE) 용의 5% 의 β-mercaptoethanol 을 함유하는 Laemmli 샘플 버퍼 (BIO-RAD 사 Cat. No.161-0737) 와 등량 혼합하여 100℃ 에서 5 분 가온한 후, 상온에서 마이크로 원심기로 15,000rpm 10 분간 원심한 상청을 회수하였다. 그 상청 20㎕ 를 폴리아크릴아미드 겔 (BIO-RAD 사 레디겔 10-20% Cat. No.161-J390V) 로 Tris-glycine/SDS 버퍼 (25mM Tris, 192mM glycine, 0.1% SDS, pH8.3) 를 사용하여 100V 에서 1 시간 전기 영동하고, 니트로셀룰로오스막에 전사하였다. 이 막을 3% 젤라틴/TBS 에서 실온에서 1 시간 블로킹하고, TBS-0.05% Tween 에서 3 회, TBS 에서 1 회 세정하였다. 그 후, 항 NAP 폴리클로날 항체 1㎍/㎖ 를 포함하는 1% 젤라틴/TBS 용액 중, 실온에서 밤새 반응시켰다. 다음날, TBS-0.05% Tween 에서 3 회, TBS 에서 1 회 세정하고, 약 1㎍/㎖ 의 농도로 1% 젤라틴/TBS 용액에 희석한 항 토끼 IgG 염소 폴리클로날 항체 퍼옥시다아제 콘쥬게이트 (Cappel 사 Cat. No.674371) 를 실온 1 시간 반응시켰다. 다음으로 TBS-0.05% Tween 에서 3 회, TBS 에서 2 회 세정하고, HRP 발색 키트 (BIO-RAD 사 Cat. No.170-64631) 로 5 분 간, 실온에서 발색시켜 밴드를 검출하였다.
<결과>
NEFA 폴리펩티드의 구조의 모식도와 항체의 제조에 사용한 펩티드 배열의 NEFA 상에서의 위치를 도 2 의 A 에, NAP 펩티드를 면역시켜 제조한 폴리클로날 항체로 래트의 뇌로부터의 단백질 추출액을 사용하여 웨스턴 블로팅을 실시한 결과를 도 2 의 B 에 나타낸다. NAP 펩티드에 대하여 제조한 폴리클로날 항체로 래트의 뇌의 단백질 추출액을 사용하여 웨스턴 블로팅을 실시한 결과, 약 47.5kd 의 분자량 부분에 단일의 밴드가 관찰되었다 (도 2B). 이로부터 NAP 에 대한 항체는 전장의 NEFA 를 인식하는 것, 또한 래트의 뇌내에서 NEFA 가 발현하고 있는 것이 명확해졌다.
실시예 4 래트의 뇌 시상하부에서의 NESFATIN 의 발현 부위의 검토
섭식 조절에 관련되는 래트 뇌의 시상하부에서의 NEFA 발현 부위를 해석하기 위해, 래트의 뇌의 절편을 사용한 면역 조직 화학적 해석을 실시하였다. 8 주령의 Wistar 계 래트 (닛폰 SLC 로부터 구입) 의 복강 내에 40㎎/㎏ 의 펜토바르비탈·나트륨을 주사하여 마취하고, 개흉하여 심장으로부터 50㎖ 의 생리 식염수 (0.85% NaCl) 를 주입하고, 이어서 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS (20mM 인산 완충액, 150mM NaCl pH7.2) 를 400㎖ 페리스타 펌프로 주입·순환시킴으로써, 뇌를 관류 고정시켰다. 그 후 뇌를 적출하고, 시상하부를 포함하는 부분을 절단하여 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 로 4℃ 하룻밤 고정화시켰다. 고정시킨 뇌 시료는, 10% 수크로오스를 함유하는 PBS 에 4 시간, 15% 수크로오스를 함유하는 PBS 에 4 시간, 20% 수크로오스를 함유하는 PBS 로 하룻밤 4℃ 침지하였다. 그 후 뇌 시료는 OCT 화합물에 침지하고, 드라이아이스-아세톤으로 동결시켜 포매 (包埋) 한 블록을 제조하였다. 제조한 블록으로부터 크라이오스타트를 사용하고, -20℃ 에서 6㎛ 두께의 절편을 제조하여 실란 코팅 슬라이드 (마쯔나미 제조 MAS 코트 슬라이드) 에 놓아 바람에 건조시켰다. 슬라이드에 놓은 조직 절편은 3% 과산화 수소수로 5 분간 처리하고, PBS 로 5 분간 2 회 세정하였다. 또한, 조직 절편을 10% 의 염소 정상 혈청 (주식회사 니치레이 Cat. No.426042) 으로 실온 10 분간 처리함으로써 블로킹하고, 0.5% 의 BSA 를 함유하는 PBS 에 희석한 1㎍/㎖ 의 NAP 펩티드에 대한 폴리클로날 항체 (실시예 3) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다 (Ab 군). 슬라이드를 PBS 로 세정한 후, 히스토파인·심플스테인 래트 MAX-PO (주식회사 니치레이 Cat. No.414181) 반응시키고, PBS 로 5 분간 3 회 세정한 후, 심플스테인 DAB 용액 (주식회사 니치레이 Cat. No.415172) 을 사용하여 발색을 실시하였다. 발색 후의 슬라이드를 수세한 후, 마이어·헤마톡실린 (무토 화학 약품 Cat. No.3000) 으로 염색하고, 수세·알코올 탈수·자일렌 투철 (透徹) 을 실시한 후, 비수용성 봉입제 (주식회사 니치레이 Cat. No.415141) 를 사용하여 커버글라스를 얹어 봉입하였다. 봉입 후의 슬라이드의 뇌 절편을 사용하여 현미경으로 관찰하였다.
<결과>
도 3 에 래트 뇌의 시상하부 및 제 3 뇌실 (3V) 영역에서의 조직 절편에 있어서의 항 NAP 펩티드 항체에 의한 조직 면역 화학 염색의 현미경 이미지 (200 배) 를 나타낸다. 도면 중의 시상하부의 Arc : 궁상핵, PVN : 실방핵, LH : 외측야, SON : 시상상핵에 특이적으로 염색이 보이고, 이들 부위에서의 NEFA 의 발현이 나타났다. 이상으로부터 NEFA 폴리펩티드는 래트의 시상하부 특히 궁상핵, 실방핵, 시상상핵 및 외측야에서 발현하고 있는 것이 나타났다.
또, 이 성적으로부터 NEFA 유전자에 의해 코드되는 NEFA 폴리펩티드가 시상하부의 섭식 조절에 관여하는 부위에서 발현이 관찰되었기 때문에, 그 폴리펩티드를 NESFATIN 으로 명명하였다.
실시예 5 리콤비난트 NESFATIN 의 제조
섭식에 관련되는 시상하부 신경핵에 발현하고 있는 NESFATIN 의 성상을 확인하기 위해, 리콤비난트 NESFATIN 을 대장균에서 제조하였다. 마우스 성숙형 NESFATIN 폴리펩티드 (배열 번호 6) 의 N 말단에 GST (글루타티온-S-트랜스페라아제) 를 결합한 융합 단백질 (리콤비난트 마우스 GST-NEFA : 배열 번호 25) 로서 발현시키고, 그 융합 단백질을 프로테아제로 처리함으로써 리콤비난트 성숙형 마우스 NESFATIN (배열 번호 26) 을 정제하는 방법을 사용하였다. 또 래트 NESFATIN 과 마우스 NESFATIN 의 아미노산 레벨에서의 상동성은 96.5% 로 매우 높다.
리콤비난트 마우스 GST-NEFA 발현용 유전자의 제조는, 먼저 Mouse Brain cDNA Library (Invitrogen 사 Cat. No.10655-25) 로부터 추출한 플라스미드를 주형으로 하여, 이하에 기재된 프라이머 (각 0.25μM) 를 사용하고, 변성 94℃ 에서의 변성 반응 1.5 분에 계속하여, 변성 94℃ 에서 0.5 분, 어닐링 60℃ 에서 0.5 분, 신장 72℃ 에서 2 분의 반응 사이클을 5 사이클 실시한 후, 변성 94℃ 에서 0.5 분, 어닐링 및 증폭 72℃ 에서 2 분의 반응 사이클을 30 사이클 실시하고, 증폭 DNA 를 제조하였다 (Stratagene 사 PfuTurbo(R) 폴리머라아제, Cat. No.600250 을 사용).
리콤비난트 성숙형 마우스 NEFA cDNA 제조 PCR 용 프라이머 :
Figure 112007092849294-PCT00003
얻어진 PCR 산물은 QIAGEN 사 MinElute PCR Purification Kit 에서 정제하고, 제한 효소 BamHI 및 NotI 로 절단하고, 2% 아가로오스 겔-TAE 전기 영동으로 1.3kb 정도의 밴드를 절단하여 DNA 단편을 회수하였다 (QIAGEN 사 MinElute Gel Extraction Kit Cat. No.28604 를 사용). 그 1.3kb 의 DNA 단편을 제한 효소 BamHI 및 NotI 로 절단한 pGEM-11Zf (+) 벡터 (Promega 사 P2411) 와 라이게이션을 실시하고, 대장균 DH5α 주 (타카라바이오사 Cat. No.9057) 를 형질 전환하여 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 LB 배지에서 제조한 한천 배지 상에서 콜로니를 형성시켰다.
그 얻어진 콜로니를 수개 픽업하고, 각 클론으로부터 조제한 플라스미드에 대해서, 염기 배열 해석을 pUC/M13 Forward 프라이머 (Promega 사 Cat. No.Q5391, pUC/M13 Reverse 프라이머 (Promega 사 Cat. No.Q5401), 마우스 NEFA 유전자 내의 배열에 의한 2 종류의 프라이머 mSQ1 (5-CCTGAACCACCAGAATCC-3 : 배열 번호 29) 및 mSQ2 (5-AGACTGATGGATTGGACC-3 : 배열 번호 30) 를 사용하여, 어플라이드 바이오시스템즈사의 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit (Cat. No.4303149) 와 ABI377 형 DNA 시퀀서 (Perkin-Elmer 사) 에 의해 염기 배열을 해석하였다. 염기 배열 해석에 의해 배열 번호 11 과 일치한 염기 배열을 갖는 것이 나타난 클론을, 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 10㎖ 의 LB 배지에서 하룻밤 배양하고, 그 균체로부터 QIAGEN 사 QIAprep(R) Spin Miniprep kit 를 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라서 플라스미드를 조제하였다.
그 플라스미드를 제한 효소 BamHI 및 NotI 로 절단하고, 2% 아가로오스-TAE 겔로 전기 영동을 실시하여 1.2kb 의 크기의 밴드를 절단하여 DNA 를 회수하였다. 회수한 DNA 단편은 제한 효소 BamHI 및 NotI 로 절단한 pGEX-4T-1 벡터 (아머샴 바이오사이언스사 Cat. No.27-4580-01) 와 라이게이션을 실시하고, 대장균 BL21 주 (아머샴 바이오사이언스사 Cat. No.27-1542-01) 에 Gene Pulser Xcell 일렉트로포레이션 시스템 (BIO-RAD 사 Cat. No.165-2660J1) 을 사용하여 형질 전환하고, 50㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 LB 배지에서 제조한 한천 배지 상에서 콜로니를 형성시켰다. 형질 전환에 의해 얻어진 재조합 대장균은, pGEX5' Sequencing Primer 및 pGEX3' Sequencing Primer (아머샴 바이오사이언스사 Cat. No.27-1410-01 및 27-1411-01) 를 사용한 PCR 에 의해 인서트의 유무를 확인하고, 또한 실시예 2 에서 사용한 NEFA 프로브 제조 PCR 용 프라이머의 세트를 사용한 PCR 에 의해 NEFA 유전자의 삽입을 확인하였다. 성숙형 NEFA cDNA 가 pGEX-4T-1 벡터에 삽입된 것이 확인된 클론을 사용하여 리콤비난트 마우스 GST-NEFA 단백질의 발현을 실시하였다. 10㎖ 의 100㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 LB 배지를 사용하여 37℃ 에서 하룻밤 진탕 배양하고, 그 중의 5㎖ 를 500㎖ 의 100㎍/㎖ 의 앰피실린을 함유하는 LB 배지에 첨가하고, 600㎚ 의 파장에 의한 흡광도가 0.6 이 될 때까지 37℃ 에서 진탕 배양하였다 (일부의 균을 샘플링 : Preinduced bacteria). 그 배지에 최종 농도 1mM 이 되도록 IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside : Gibco BRL 사) 를 첨가하고, 추가로 37℃ 에서 3 시간 진탕 배양하였다. 배양 후, 균체를 포함하는 배지를 5,000g 에서 15 분간 4℃ 에서 원심하여 균체를 회수하고, 25㎖ 의 PBS 에 현탁하였다. 현탁액은 -80℃ 에서 1 시간 정도 얼게 한 후, 37℃ 에서 민첩하게 해동시키고, 빙상에서 초음파 처리 30 초 × 5 회를 실시함으로써 균체를 파쇄하였다. 그 후 10,000g 에서 30 분간 4℃ 에서 원심하여 그 상청을 회수하였다 (침전 획분을 샘플링 : Post-sonicated pellet).
상청은 AKTA-FPLC 액체 크로마토그래피 시스템 (아머샴 바이오사이언스사) 을 사용하여 PBS 로 평형화한 5㎖ 스케일의 GSTrapFF 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 Cat. No.17-5131-01) 에 어플라이하고, 그 후 50㎖ 의 PBS 로 칼럼을 세정하였다 (유속 : 1㎖/분). 그 후, 용출 버퍼 (10mM 환원형 글루타티온, 0.4M Tris-HCl pH8.0, 0.2M NaCl) 를 1㎖/분 의 유속으로 흐르게 하고, 1㎖ 씩의 프랙션으로서 회수하여 280㎚ 에 의한 흡광도로 단백질이 포함되어 있는 획분을 회수하였다 (280㎚ 의 흡광도가 가장 높았던 프랙션 : Purified GST-NEFA). Preincubation baceteria 획분, Post-sonicated pellet 획분, Purified GST-NEFA 획분의 일부를 5% 의 β-메르캅토에탄올을 함유하는 Laemmli 샘플 버퍼 (BIO-RAD 사 Cat. No.161-0737) 에 용해시키고, 100℃ 에서 5 분 처리한 후에 마이크로 원심기로 15,000rpm 5 분간 원심한 상청을 폴리아크릴아미드 겔 (BIO-RAD 사 레디겔 10-20% Cat. No.161-J390V) 로 Tris-glycine/SDS 버퍼를 사용하여 100V 에서 1 시간 전기 영동하고, 쿠마시 브릴리언트 블루 염색액 (BIO-RAD 사 Bio-Safe CBB G-250 Cat. No.161-0786) 으로 염색하였다. Purified GST-NEFA 획분의 대부분은, PBS 로 평형화한 HITrap Desalting 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 Cat. No.17-1408-01) 을 사용한 액체 크로마토그래프에 의해 샘플 중의 환원형 글루타티온을 제거하고, 다시 PBS 로 평형화한 5㎖ 스케일의 GSTrapFF 칼럼에 어플라이하였다. 칼럼을 1㎖/분의 유속으로 25㎖ 의 PBS 로 세정한 후, 추가로 15㎖ 의 프로테아제 반응 버퍼 (50mM Tris-HCl pH7.5, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT) 를 칼럼에 통과시키고, 20U/㎖ 의 농도의 Thrombin (아머샴 바이오사이언스사 Cat. No.27-0846-01) 을 함유하는 4.6㎖ 의 프로테아제 반응 버퍼를 칼럼에 어플라이하고, 전량이 칼럼에 들어갔을 때 액체 크로마토그래프의 펌프를 멈추고, 실온 (22℃) 에서 하룻밤 프로테아제에 의한 반응을 실시하였다. 다음날 칼럼을 1㎖/분의 유속으로 PBS 를 15㎖ 흐르게 함으로써 얻어진 획분을 회수하고, 얻어진 획분을 HiTrap Benzamidine FF 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 Cat. No.17-5143-02) 을 통과시킴으로써 Thrombin 을 제거한 획분을 얻었다 (Prepurified sample). 그 획분으로부터 리콤비난트 성숙형 마우스 NEFA 폴리펩티드를 정제하기 위해, 음이온 교환 수지에 의한 크로마토그래피에 의한 분획을 실시하였다. Prepurified sample (20㎖) 을 버퍼 A (20mM bis-Tris pH6.5, 0.1M NaCl, 0.1% CHAPS) 로 5 배로 희석하고, 버퍼 A 로 평형화한 HiTrap Q HP 칼럼 (아머샴 바이오사이언스사 Cat. No.17-1153-01) 에 어플라이하고, 그 후 1㎖/분의 유속으로 버퍼 A 로 세정하였다 (1㎖ 씩의 프랙션을 회수 : Washed sample). 세정한 칼럼을 버퍼 A 및 버퍼 B (20mM bis-Tris pH6.5, 1M NaCl, 0.1% CHAPS) 를 사용하여, 버퍼 B 가 0∼50%/60 분의 직선적 농도 구배가 되는 형태로, 0.5㎖/분의 유속으로 용출을 실시하였다. 이 때 0.5㎖ 씩의 프랙션을 취하고, 280㎚ 의 파장에 의한 흡광도로 단백질이 포함되어 있는 획분을 회수하였다 (Purified sample). 이 정제 과정에서 얻어진 샘플 (Prepurified sample, Washed sample, Purified sample) 을 일부 취하고, 5% 의 β-메르캅토에탄올을 함유하는 Laemmli 샘플 버퍼와 등량 혼합하여 100℃ 에서 5 분 가온한 후, 실시예 3 에 기재된 방법과 동일하게 웨스턴 블로팅을 실시하였다. 이 획분을 PBS 에 대하여 투석하고, 정제된 성숙형 마우스 NEFA 폴리펩티드를 얻었다.
<결과>
도 4 의 A 에 재조합체 대장균으로 GST-NEFA 융합 단백질을 발현시키고, GSTrapFF 칼럼으로 GST-NEFA 융합 단백질을 정제한 과정의 샘플을 사용한 SDS-PAGE 로 염색 이미지를 나타낸다. 도 4 의 B 에 GST-NEFA 융합 단백질로부터 Thrombin 에 의해 성숙 마우스 NEFA 폴리펩티드를 절단하여, HiTrap Q HP 칼럼으로 정제한 과정에서의 샘플에 있어서의 항 NAP 폴리클로날 항체에 의한 웨스턴 블로팅의 결과를 나타낸다. 도 4 의 A 로부터, 레인 3 의 IPTG 에 의한 발현 유도 후 에 균체를 파쇄한 Post-sonicated pellet 에 있어서, 레인 2 의 Preinduced bacteria 샘플에 대하여, 분자량 65kd 산물의 현저한 증대가 관찰되었다. 또한, GSTrapFF 칼럼으로 정제한 획분 (Purified sample) 에 있어서 65kd 의 주산물이 관찰되었기 때문에, 재조합체 대장균에 있어서 리콤비난트 마우스 GST-NEFA 융합 단백질이 발현하고 있는 것이 나타났다. 또한 도 4 의 B 에 의하면, 정제 전의 샘플 (Prepurified sample) 에서는 분자량 47.5kd 의 Thrombin 에 의해 절단된 성숙형 마우스 NEFA 폴리펩티드 및 분자량 약 65kd 의 리콤비난트 마우스 GST-NEFA 융합 단백질의 밴드가 검출된 것에 추가하여, 수개의 밴드가 관찰되었다. 한편, Purified sample 에서는 분자량 47.5kd 의 주요한 밴드와 65kd 의 약한 밴드만이 관찰되고, 거의 순수한 리콤비난트 성숙형 마우스 NEFA 폴리펩티드가 얻어진 것이 나타났다.
실시예 6 NESFATIN 의 뇌실내 투여에 의한 섭식 행동에 대한 작용의 검토
얻어진 리콤비난트 NESFATIN 의 동물의 섭식 행동에 대한 작용을 검증하기 위해, 무마취 하에서의 래트의 제 3 뇌실에 대한 뇌내 투여에 의한 실험을 실시하였다.
래트는 Wistar 계 래트 (닛폰 SLC 로부터 구입) 를 사용하고, 구입 후 오전 6 시부터 오후 6 시까지의 12 시간을 명기, 오후 6 시부터 다음날 아침 오전 6 시를 12 시간의 암기의 주기로, 분말 사료 (닛폰 쿠레아사 CE-2) 를 주고, 22℃ 에서 사육하고, 실험 동안에도 동일한 조건에서 사육을 계속하였다. 실험에는 수컷 8∼9 주령 Wistar 계 래트 중, 체중 200 내지 250g 사이의 개체를 선별하여 사용하 였다. 투여에는 생리 식염수 (컨트롤), 또는 실시예 5 에서 제조한 리콤비난트 NESFATIN 을 생리 식염수 5㎕ 당 1pmol, 4pmol, 20pmol 에 용해시킨 것을, 1 개체당 5㎕ 씩 사용하였다 (각 군 N=5). 래트에 체중 1㎏ 당 40㎎ 의 펜토바르비탈·나트륨을 복강 내에 투여하여 마취하고, 두부 (頭部) 를 제모하고 나서 뇌정위 고정 장치 (David Kopf 사 Model962) 에 고정시키고, 두피를 절개하고, 23G 바늘 (가이드 카뉼레) 을 제 3 뇌실에 도달하도록 (Bregma 후방 2.5㎜, 표면 9.5㎜) 유치 고정시켰다. 그 가이드 카뉼레의 고정 1 주일 후에 각 실험에 제공하였다. 수술로부터 회복한 후, 섭식 활동이 항진되는 암기에 들어가기 직전에, 무마취 하에서 29G 의 주입용 카뉼레를 가이드 카뉼레에 삽입하고, 1 초동안 1㎕ 의 속도로 생리 식염수 또는 생리 식염수에 용해시킨 성숙형 마우스 NESFATIN 용액을 5㎕ 투여하고, 투여 후 2∼3 분 정도 그대로 카뉼레를 고정시키고 나서, 주입용 카뉼레를 뽑아 내어 개별 케이지로 되돌렸다. 이후 1 시간 후, 3 시간 후, 6 시간 후의 사료의 중량 변화를 측정함으로써 섭식량을 기록하여 섭식 행동의 지표로 하였다. 또, 유의차 검정에는 분산 분석 (analysis of variance) 을 사용하였다.
<결과>
제 3 뇌실 내에 리콤비난트 NESFATIN 을 각 0 (PBS 만), 1, 4, 20pmol 투여했을 때의, 투여 후 0∼1 시간동안의 섭식량을 도 5 의 A 에, 1∼3 시간동안의 섭식량을 도 5 의 B 에, 3∼6 시간동안의 섭식량을 도 5 의 C 에 그래프로서 나타냈다. 0∼1 시간, 1∼3, 3∼6 시간의 어느 때에 있어서도 생리 식염수만 투여한 래트와 비교하여, 리콤비난트 NESFATIN 을 투여한 군에서는, 투여량 의존적으로 섭 식량의 저하가 관찰되었다. 특히 20pmol 의 리콤비난트 NESFATIN 을 투여한 군에서는 0∼1 시간/1∼3 시간/3∼6 시간 (각 P<0.01) 의 어느 때에 있어서도, 그들의 섭식량은 대조군과 비교하여 유의한 섭식 억제 작용이 관찰되었다. 이들 성적으로부터 NESFATIN 은 뇌내에서 섭식 행동을 억제하는 작용을 갖는 것이 나타났다.
실시예 7 항 NESFATIN 항체의 뇌실내 투여에 의한 섭식 행동에 대한 작용의 검토
NESFATIN 의 섭식 조절 작용을 더욱 검증하기 위해, NESFATIN 에 대한 항체의 제 3 뇌실내 투여에 의한 섭식 행동에 대한 작용의 검토를 실시하였다.
항체는 실시예 4 에서 제조한 항 NAP 펩티드 항체 (NAP IgG) 를 사용하고, 생리 식염수로 희석한 항체 5㎕ 를 래트에 투여하였다 (투여량 5㎍). 컨트롤로서, 면역시키지 않은 토끼로부터 정제된 IgG (Control IgG) 를 동일한 농도로, 동량 투여하였다. 래트는, Wistar 계 래트 (닛폰 SLC 로부터 구입) 를 사용하고, 실시예 6 과 동일하게 사육하고, 수컷 8∼9 주령 Wistar 계 래트 중, 체중 200∼250g 사이의 개체를 선별하여 사용하였다. 투여 시기는, 섭식 행동이 적은 명기에 들어가기 직전에 실시하고, 투여 수법은 실시예 6 에 기재된 방법과 동일하게 실시하였다. 뇌실내 투여 후∼3 시간∼6 시간∼9 시간동안의 분말 사료의 섭식량을 측정하였다. 또, 유의차 검정에는 analysis of variance 를 사용하였다.
<결과>
Control IgG 또는 항 NESFATIN 항체 (NAP IgG) 를 뇌실 내에 투여된 래트에 있어서의 0∼3 시간동안의 섭식량을 도 6 의 A 에, 3∼6 시간동안의 섭식량을 도 6 의 B 에, 6∼12 시간동안의 섭식량을 도 6 의 C 에 그래프로서 나타내고 있다. 항 NESFATIN 항체를 뇌실내 투여된 개체에 있어서는 명기에서의 0∼3 시간 (도 6 의 A), 및 3∼6 시간 (도 6 의 B) 에 있어서의 섭식량은, Control IgG 가 투여된 개체와 비교하여 통계학적으로 유의하게 촉진되는 (각 P<0.001) 것이 나타났다. 그 항 NESFATIN 항체 투여군에서의 섭식량의 증대는 0∼3 시간 (도 6 의 A) 에서는 Control IgG 투여군의 약 9 배, 3∼6 시간에서는 약 10 배 정도이었다. 그러나, 6∼9 시간동안에는 암기가 되고, Control IgG 투여군의 섭식 행동이 개시되었기 때문에, 유의차는 보이지 않았다. 이와 같이, 항 NESFATIN 항체 투여에 의해 래트의 섭식량의 항진이 보였기 때문에, 항 NESFATIN 항체는 내재성 NESFATIN 의 작용을 억제하는 것, NESFATIN 은 섭식 행동에 관여하고 있는 것이 나타났다.
실시예 8 래트 시상하부에서의 NEFA 유전자의 발현 및 절식에 의한 그 영향의 검토
내인성 NESFATIN 의 유전자 발현이 절식에 의해 어떻게 변동되는지에 대하여, in situ 하이브리다이제이션법에 의해 검토하였다.
뇌 조직에 있어서의 in situ 하이브리다이제이션용 프로브는, 실시예 2 에서 제조한 NEFA 프로브 제조용 플라스미드를 사용하였다. 제한 효소 NcoI 로 절단하여 정제한 그 플라스미드 1㎍ 을 사용하고, 디곡시게닌 (DIG) RNA 라벨링 키트 (로슈·다이아그노스틱스사 Cat. No.1175025) 를 사용하여, SP6-RNA 전사 효소의 반응에 의해 DIG 표지화 cRNA 프로브를 제조하였다. SP6-RNA 전사 효소 반응은 40℃ 에서 2 시간 실시하고, 반응 후 20㎕ 의 반응액에 대하여 2㎕ 의 0.2M EDTA (pH7.0) 를 첨가하여 반응을 정지시키고, 거기에 2.5㎕ 의 3M LiCl 과 75㎕ 의 -20℃ 로 식힌 에탄올을 첨가하여 혼합한 후, -20℃ 에서 하룻밤 정치 (靜置) 하였다. 다음날 반응물을 4℃ 로 설정한 마이크로 원심기로 15,000rpm 으로 20 분간 원심 분리하여 상청을 제거하고, 침전에 50㎕ 의 70% 에탄올을 첨가하고 다시 원심 분리를 실시하여 그 상청을 제거하고, 침전을 건조시켰다. 침전은 DEPC 처리수 (닛폰 진사 Cat. No.314-90205) 에 용해시키고, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 RNA 량을 정량하고, 약 0.1㎎/㎖ 의 RNA 농도가 되도록 DEPC 처리수로 희석하였다. 얻어진 cRNA 프로브의 길이 (≒450base) 를 짧게 하기 위해, 이 0.1㎎/㎖ 농도의 RNA 용액 10㎕ 에 대하여 10㎕ 의 DEPC 처리수 및 40㎕ 의 Carbonate Buffer (60mM 탄산나트륨, 40mM 탄산수소나트륨, pH10.2) 를 첨가하여 혼합하고, 60℃ 에서 30 분간 반응시켰다. 반응물에 대하여 60㎕ 의 중화 용액 (3M 아세트산 나트륨, 1% 아세트산, pH6.0) 을 첨가하고, 추가로 360㎕ 의 -20℃ 로 식힌 에탄올을 첨가하여 혼합한 후, -70℃ 에서 30 분간 냉각시켜 4℃ 로 설정한 마이크로 원심기에서 15,000rpm 으로 20 분간 원심 분리하여 상청을 제거하고 침전을 얻었다. 침전은 100㎕ 의 70% 에탄올 (-20℃) 을 첨가하여 다시 원심 분리하여 그 상청을 제거하고, 침전을 건조시켰다. 건조시킨 침전은 100㎕ 의 DEPC 처리수에 용해시키고, 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 농도를 측정하였다. 얻어진 프로브의 농도는 약 50㎍/㎖ 이었다. 이렇게 하여 얻어진 DIG 표지 NEFAcRNA 프로브를 in situ 하이브리다이제이션에 사용하였다.
약 8 주령의 수컷 Wistar 계 래트 (닛폰 SLC 로부터 구입) (체중 220∼250g) 를, 자유롭게 분말 사료를 섭식할 수 있는 개체 (Normal), 48 시간 사료를 주지 않고 음료수만으로 사육한 개체 (Starvation), 36 시간 사료를 주지 않고 사육한 후에 다시 12 시간 자유롭게 사료를 섭식할 수 있도록 한 개체 (Re-feeding) 로 나눠 사육하고, 실시예 5 에 기재된 방법과 동일하게 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 로 관류 고정시켜 뇌를 취출하였다. 취출한 뇌는 시상하부를 포함하는 부분을 절단하여 추가로 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 로 4℃ 하룻밤 고정시켰다. 고정시킨 뇌 조직은 실시예 4 에 기재된 방법과 동일하게 크라이오스타트로 10㎛ 의 두께의 절편을 제조하여, 실란 코팅 슬라이드글라스 상에 놓았다. 뇌 조직 절편을 놓은 슬라이드글라스를 항온기에 넣어 50℃ 에서 2 분간 처리한 후, 절편을 실온에서 30 분간 건조시켰다. 절편은 다시 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 로 7 분간 실온 처리하여 고정시키고, PBS 로 3 분간 및 2 배 농도의 SSC 로 5 분간 2 회 세정하였다.
슬라이드글라스 상의 뇌 조직 절편이 덮이도록, in situ 하이브리다이제이션액 (4 배 농도 SSC, 10% 황산 덱스트란, 1 배 농도 Denhardt's 액, 2mM EDTA, 50% 탈이온화 포름아미드, 500㎍/㎖ 송어 정자 DNA) 을 놓고, 37℃ 에서 1 시간 프리하이브리다이제이션을 실시하였다. 프리하이브리다이제이션 종료 후, 얹어 놓은 액을 버리고, 조직이 덮이도록 200ng/㎖ 의 농도의 DIG 표지화 NEFAcRNA 프로브를 포함하는 in situ 하이브리다이제이션액을 놓고, 습윤 박스 중에서 37℃ 16 시간 하이브리다이즈를 실시하였다. 하이브리다이즈 후의 뇌 조직 절편이 놓인 슬라 이드글라스는, 37℃ 에서 2 배 농도의 SSC 에 의해 5 분간 세정한 후, 37℃ 에서 60% 포름아미드를 함유하는 0.2 배 농도 SSC 로 5 분간씩 3 회 세정, 추가로 실온에서 2 배 농도 SSC 에 의해 5 분간 2 회 세정하였다.
세정 후의 뇌 조직에 있어서 하이브리다이즈한 프로브는, DIG Nucleic Acid Detection Kit (로슈·다이아그노스틱스사 Cat. No.11175041) 를 사용하여 검출했는데, 그 방법의 개요는 이하와 같다. 뇌 조직이 놓인 슬라이드글라스를 150mM NaCl 을 함유하는 100mM Tris-HCl (pH7.5) 완충액으로 5 분간 실온에서 세정하고, 키트에 함유되어 있는 Blocking Reagent 를 포화시킨 동 완충액 (블로킹 버퍼) 을 사용하여 실온에서 30 분간 블로킹하였다. 그 슬라이드글라스에 키트에 포함되어 있는 항 DIG 항체 알칼리 포스파타아제 콘쥬게이트를 1/200 의 농도로 블로킹 버퍼에 희석한 것을 놓고, 실온에서 2 시간 반응시켰다. 반응 후의 슬라이드글라스는 150mM 의 NaCl 을 함유하는 100mM Tris-HCl (pH7.5) 완충액으로 5 분간 2 회 세정한 후, 검출 완충액 (100mM Tris-HCl pH7.5,100mM NaCl,50mM MgCl2) 으로 10 분간 세정하였다. 그 후, 0.18㎎/㎖ 의 BCIP 와 0.34㎎/㎖ 의 NBT 를 함유하는 검출 완충액을 놓고, 실온에서 16 시간 반응시켜 발색 반응을 실시시켰다. 그 슬라이드글라스는 1mM 의 EDTA 를 함유하는 10mM Tris-HCl (pH8.0) 로 5 분간 세정하여 발색 반응을 정지시켰다.
또한, 그 슬라이드글라스는 증류수로 5 분간 세정하고, 1% 의 methylene green 으로 5 분간 염색한 후, 증류수로 세정하고, 알코올 탈수·자일렌 투철을 실 시하고, 비수용성 봉입제 (주식회사 니치레이 Cat. No.415141) 를 사용하고 커버글라스를 놓아 봉입하였다. 그 후, 광학 현미경에 의해 관찰하였다.
<결과>
도 7 의 A 에 나타내는 대조군과 비교하여, 도 7 의 B 에 나타내는 48 시간 절식한 경우의 실방핵 (PVN) 에 있어서의 NESFATIN 의 mRNA 발현은 현저히 감소되어 있고, 도 7 의 C 에 나타내는 바와 같이 절식 후의 재섭식에 의해 NESFATINmRNA 유전자의 발현은 회복되는 것이 나타났다. 이들 결과는 내인성 NESFATIN 은 섭식 조절에 관여하고 있는 것이 판명되었다.
실시예 9 기아 상태에 있어서의 래트 뇌내에서의 NESFATIN 발현의 검토
절식 상태에 있어서의 내인성 NESFATIN 의 변동에 대해서 면역 조직 염색법에 의해 검토하였다.
약 8 주령의 수컷 Wister 계 래트 (닛폰 SLC 로부터 구입) (체중 220∼250g) 의 자유롭게 분말 사료를 섭식할 수 있는 대조군과 24 시간의 절식을 한 절식군을 사용하고, 이들 래트의 뇌의 조직 절편을 제조하여 항 NESFATIN 항체를 사용한 면역 조직 화학에 의한 해석을 실시하였다. 조직 절편의 제조 및 면역 조직 염색 방법에 대해서는, 실시예 4 에 기재된 방법과 동일하게 실시하였다. 또한 섭식에 관련되는 뇌의 영역에서의 신경 세포의 활성화 상태를 조사하기 위해, c-Fos 에 대한 항체를 사용하여 절식군의 뇌 조직에 있어서의 면역 조직 화학적 해석을 실시하였다. 방법은 항 NESFATIN 항체 대신에 500 배로 희석한 c-Fos (K-25) 항체 (Santa Cruz Biotechnology 사 sc-253) 를 사용하여 상기와 동일하게 실시하였다.
<결과>
대조군의 시상하부에 있어서의 항 NESFATIN 항체 (NAP Ab) 에 의한 면역 조직 화학 염색의 현미경 이미지 (200 배) 를 도 8 의 A 에, 절식군의 시상하부에 있어서의 항 NESFATIN 항체에 의한 면역 조직 화학 염색의 현미경 이미지 (A 와 동배율) 를 도 8 의 B 에, 절식군의 시상하부에 있어서의 항 c-Fos 항체에 의한 면역 조직 화학 염색의 이미지 (A 와 동배율) 를 도 8 의 C 에 나타낸다. 또한 도면의 상단은 실방핵의 이미지를, 하단은 궁상핵의 이미지를 나타낸다. 대조군과 비교하여 절식군의 시상하부에서는, 실방핵 (도 8 의 B 상단) 및 궁상핵 (도 8 의 B 하단) 에서의 염색성은 현저히 감소되어 있고, 절식에 의해 NESFATIN 의 발현이 저하되어 있는 것이 나타났다. 또한 식욕이 항진되어 있는 상태에서는 c-Fos 단백질의 발현이 관찰되었다. 이로부터 절식에 의해 식욕이 항진되어 있는 상태에 있어서는, 식욕 억제 효과를 나타낸다고 생각되는 NESFATIN 의 발현은 저하되되어 식욕 조절을 하고 있는 것으로 생각된다.
실시예 10 NESFATIN-1, NESFATIN-2, NESFATIN-3 및 NESFATIN-2/3 펩티드의 제조와 NESFATIN-1 펩티드에 대한 항체, NESFATIN-3 및 NESFATIN-2/3 에 대한 항체의 제조
실시예 3∼9 에 있어서, NESFATIN 이 뇌의 시상하부에서의 발현과 섭식 및 체중 조절에 대한 작용이 나타났다. 또한 이 NESFATIN 은 그 전구체에 있어서는 시그널 펩티드를 가지므로, 세포 외로 분비될 가능성이 나타나 있다. 어느 종류의 활성 단백질은 post translational-process 에서 프로호르몬·컨버타제 (PC) 에 의해 절단되는 것이 알려져 있다. 그 때문에, 프로호르몬·컨버타제의 절단 부위의 배열인 Arg-Arg 또는 Lys-Arg 의 배열이, 마우스, 래트 및 인간의 NEFA 배열에 존재하는지를 해석하였다. 그 결과, 마우스, 래트 및 인간의 배열에 공통적으로, N 말단으로부터 107 번째 및 108 번째의 아미노산 배열의 위치, 그리고 199 번째 및 200 번째의 위치에 Lys-Arg 의 배열이 존재하고, 188 번째 및 189 번째의 아미노산 배열의 위치에 Arg-Arg 의 배열이 존재하는 것이 판명되었다 (도 9A). 그 때문에, NESFATIN 의 배열 중, 아미노산 번호 25 내지 106 에 상당하는 82 잔기의 펩티드를 NESFATIN-1 (배열 번호 15), 및 아미노산 번호 109 내지 187 까지의 79 잔기의 펩티드를 NESFATIN-2 (배열 번호 16), 아미노산 번호 190 내지 420 까지의 231 잔기로 이루어지는 펩티드를 NESFATIN-3 (배열 번호 17) 으로 명명하였다. 이 경우, 이미 알려진 도메인 구조인 DNA 결합 영역 (아미노산 번호 171∼223) 은 NESFATIN-2 와 NESFATIN-3 으로 분단된 형태로, 넥틴 결합 영역 (아미노산 번호 213∼420), 칼슘 결합 영역 (아미노산 번호 254∼265 및 306∼317) 및 Asp/Glu-rich 영역 (아미노산 번호 306∼317) 은 NESFATIN-3 의 배열 내에 포함되는 형태가 되는데, NESFATIN-1 의 배열 중에 있어서는 이미 알려진 도메인 구조가 포함되어 있지 않다 (도 9B). 그 때문에, NESFATIN-2 와 NESFATIN-3 의 배열로 이루어지는 펩티드의 부분을 NESFATIN-2/3 (배열 번호 47) 으로 명명하였다. 래트의 NESFATIN-1 펩티드 (배열 번호 15), 및 NESFATIN-2 펩티드 (배열 번호 16) 의 합성은 (주) 야나이하라 연구소에 의뢰하고, 고상 합성에 의해 합성하여 역상 액체 크로마토그래프에 의해 정제하였다. NESFATIN-3 펩티드 (배열 번호 17) 는, 래트 뇌로부터 조제한 cDNA 를 사용하고, 배열 번호 48 및 배열 번호 49 의 프라이머를 사용하여 증폭한 DNA (배열 번호 50) 를 취득하고, 그 DNA 를 사용하여 Post Genome Institute Co. LTD (Shimizu Y et al : Nature Biotech 19 : 751-755, 2001) 에 의해 무세포 단백질 합성법에 의해 제조하였다.
사용한 PCR 프라이머 :
Figure 112007092849294-PCT00004
이 방법에 의해 제조된 NESFATIN-3 은 N 말단에 Met 가 결합한 형태의 배열이 된다 (배열 번호 51).
동일하게 NESFATIN-2/3 (배열 번호 47) 은, 배열 번호 52 와 배열 번호 53 의 프라이머를 사용하여 래트 뇌 유래의 cDNA 에서 증폭한 DNA (배열 번호 54) 를 취득하고, 무세포 단백질 합성법에 의해 제조하였다.
사용한 PCR 프라이머 :
Figure 112007092849294-PCT00005
이 방법에 의해 제조된 NESFATIN-2/3 은 N 말단에 Met 가 결합한 형태의 배열이 된다 (배열 번호 55).
또, 실시예 3 에서 제조한 항 NAP 펩티드 항체와는 다른 영역에 대한 항체를 제조하기 위해, NAP1 펩티드의 아미노산 번호 24 내지 38 에 상당 (배열 번호 5 의 마우스 전구체 NEFA 폴리펩티드의 아미노산 번호 48 내지 62 에 상당) 하는 배열의 C 말단에 Cys 를 부가한 배열 (NAP-1Ab : 배열 번호 32), NAP-3 의 아미노산 번호 1 내지 9 에 상당하는 배열 (배열 번호 5 의 마우스 전구체 NEFA 폴리펩티드의 아미노산 번호 190 내지 198 에 상당), 및 NAP-3 펩티드의 아미노산 번호 136 내지 149 에 상당하는 배열 (배열 번호 5 의 마우스 전구체 NEFA 폴리펩티드의 배열 중의 아미노산 번호 325 내지 338) 에 상당하는 배열의 C 말단에 Cys 를 부가한 배열 (각 NAP-C1 Ab 배열 번호 33 및 NAP-C2 Ab : 배열 번호 34) 을 제조하였다.
Figure 112007092849294-PCT00006
NAP-1 Ab, NAP-C1 Ab, NAP-C2 Ab 의 각 펩티드의 제조는 주식회사 ATP 에 의뢰하고, 고상 합성에 의해 합성하여 역상 액체 크로마토그래프에 의해 정제하였다. 얻어진 NAP-1 Ab, NAP-C1 Ab, NAP-C2 Ab 의 각 펩티드는 실시예 3 에 기재된 방법과 동일하게 KLH 와 콘쥬게이트를 제조하고, 토끼에 면역시킴으로써 각 펩티드에 대한 항체를 포함하는 혈청을 제조하였다. 각 혈청으로부터는 DEAE 칼럼을 사용하여 정법에 의해 토끼 IgG 를 정제하고, 각각 NAP-1 IgG (Nesfatin-1 IgG), NAP-C1 IgG (Nesfatin-C1 IgG), NAP-C2 IgG (Nesfatin-C2 IgG) 로 하였다.
상기에서 제조한 NESFATIN-1 펩티드 및 NESFATIN-3 펩티드를 각각 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (12%) 전기 영동법으로 영동시키고, 그 후 각 펩티드를 실시예 3 과 동일한 방법으로, 각각 Nesfatin-1 IgG 및 Nesfatin C2 IgG 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 실시하였다.
<결과>
고상 합성법으로 합성하여 역상 크로마토그래피로 정제한 NESFATIN-1 펩티드, NESFATIN-2 펩티드, NESFATIN-3 펩티드 및 NESFATIN-2/3 펩티드는, 분석용 C18 역상 크로마토그래피에 의해 거의 단일의 피크를 나타내는 순도로 정제되고, 그 피크를 분취하여 MAS 스펙트럼 해석법 (NESFATIN-1 및 NESFATIN-2) 또는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 (12% 겔) 전기 영동법 (NESFATIN-3 및 NESFATIN-2/3) 에 의해 해석한 결과, 거의 예상된 NESFATIN-1, NESFATIN-2, NESFATIN-3 및 NESFATIN-2/3 의 각 펩티드의 분자량으로 생각되는 펩티드가 합성되어 있는 것이 나타났다. 또한 NAP-1 Ab, NAP-C1 Ab, NAP-C2 Ab 의 각 펩티드와 KLH 의 콘쥬게이트를 면역시킨 토끼에 있어서는, 각각 3 종 모두의 펩티드에 대한 항체가의 상승이 보이고, 각 펩티드에 대한 항체 (IgG) 가 얻어졌다.
또한, NESFATIN-1 펩티드를 영동하여 Nesfatin-1 IgG 로 웨스턴 블로팅을 실시한 결과에서는 9.7kd 에 밴드가 보이고, NESFATIN-3 펩티드를 영동하여 Nesfatin-C2 IgG 로 웨스턴 블로팅을 실시한 결과에서는 27.9kd 에 밴드가 보였다 (도 9C). 이로부터, Nesfatin-1 IgG 및 Nesfatin-C2 IgG 의 각 항체는, 각각 NESFATIN-1 펩티드 및 NESFATIN-3 (NESFATIN-2/3) 에 대하여 결합하는 것이 나타났다.
실시예 11 NAP-1 IgG 와 항 PC 항체에 의한 면역 조직 화학 해석
NESFATIN 으로부터 NESFATIN-1 이 프로세싱되는 것을 실증하기 위해, 먼저 실시예 10 에서 제조한 NAP-1 IgG (Nesfatin-1 IgG) 와 항 프로호르몬·컨버타제 항체 (항 PC) 에 대한 항체에 의한 래트 시상하부에서의 이중 면역 조직 염색을 실시함으로써, NESFATIN 및 PC 의 국재를 해석하였다.
뇌 조직 절편의 제조는 이하의 방법으로 실시하였다. 8 주령의 Wister 계 래트 (닛폰 찰즈·리버로부터 구입) 의 복강에 40㎎/㎏ 의 펜토바르비탈·나트륨을 주사하여 마취하고, 개흉하여 심장으로부터 50㎖ 의 생리 식염수 (0.85% NaCl) 를 주입하고, 이어서 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS (20mM 인산 완충액, 150mM NaCl pH7.2) 를 400㎖ 페리스타 펌프로 주입·순환시킴으로써, 뇌를 관류 고정시켰다. 그 후 뇌를 적출하고, 시상하부를 포함하는 부분을 절단하여 4% 파라포름알데히드를 함유하는 PBS 로 4℃ 하룻밤 고정화시켰다. 고정시킨 뇌 시료는 10% 수크로오스를 함유하는 PBS 에 4 시간, 15% 수크로오스를 함유하는 PBS 에 4 시간, 20% 수크로오스를 함유하는 PBS 로 하룻밤 4℃ 침지하였다. 그 후 뇌 시료는 OCT 화합물에 침지하고, 드라이아이스-아세톤으로 동결시켜 포매한 블록을 제조하였다. 제조한 블록으로부터 크라이오스타트를 사용하고, -20℃ 에서 6㎛ 두께의 절편을 제조하여 실란 코팅 슬라이드 (마쯔나미 제조 MAS 코트 슬라이드) 에 놓아 바람에 건조시켰다. 슬라이드에 놓은 조직 절편은 3% 과산화 수소수로 5 분간 처리하고, PBS 로 5 분간 2 회 세정하였다.
뇌 조직 절편을 놓은 슬라이드글라스는, 10% 의 염소 정상 혈청 (주식회사 니치레이 Cat. No.426042) 으로 실온 10 분간 처리함으로써 블로킹하고, 1/500 로 0.5% 의 BSA 를 함유하는 PBS 로 희석한 NAP-1 IgG (Nesfatin-1 IgG : 실시예 10) 를 실온에서 1 시간 반응시켰다. 항체를 반응시킨 슬라이드글라스는, PBS 에 의해 5 분간 3 회 세정하고, 히스토파인·심플스테인 래트 MAX-PO (주식회사 니치레이 Cat. No.414181) 반응시키고, PBS 에 의해 세정한 후, 4-Chloro-1-Naphtol (ICN 사 Cat. No.980611 : 4-Chloro-1-Naphtol Stabilized Chromogen) 에 의해 발색을 실시하였다. 발색을 실시한 후의 슬라이드글라스를 PBS 로 5 분간 3 회 세정한 후, 슬라이드글라스를 0.1M 글리신 완충액 (pH2.2) 에 1.5 시간 (30 분마다 그 완충액을 교환) 담그고, 그 후 PBS 로 5 분간 3 회 세정하였다. 또한 슬라이드글라스는 10% 의 염소 정상 혈청 (주식회사 니치레이 Cat. No.426042) 으로, 실온 10 분간 처리하여 블로킹하였다. 이 시점까지 처리한 슬라이드글라스를 2 개의 군으로 나누고, 일방은 프로호르몬·컨버타제의 서브타입인 PC1 및 PC3 을 인식하는 항체 (PC-1/3 : Chemicon 사 Cat. No.AB1260) 를, 다른 일방에 대해서는 프로호르몬·컨버타제의 서브타입인 PC2 를 인식하는 항체 (PC-2 : Chemicon 사 Cat. No.AB1262) 를, 0.5% 의 BSA 를 포함하는 PBS 에 희석한 항체액으로서, 1 시간 실온에서 반응시켰다. 슬라이드글라스는 그 후 PBS 로 5 분간 3 회 세정하고, 각 슬라이드글라스를 0.5% 의 BSA 를 포함하는 PBS 로 1/200 로 희석한 염소 항 토끼 IgG-Alexa594 콘쥬게이트 (Molecular Probes 사 Cat. No.A11008) 를 실온에서 30 분간 반응시켰다. 그 후 슬라이드글라스를 PBS 로 5 분간 3 회 세정하고, 가볍게 바람에 건조시킨 후 글리세롤과 커버글라스로 봉입하고, 커버글라스의 주위를 투명 매뉴큐어로 봉하여 표본을 제조하였다. 표본은 공초점 레이저 현미경 (Bio-Rad 사 MRC-1024 confocal laser scanning equipment + 니콘사 Eclipse E800 upright microscope) 에 의해, 4-Chloro-1-Naphtol 의 염색을 위상차 이미지로서, Alexa 594 의 형광을 Krypton-Argon 레이저 (파장 : 568㎚) 에서의 여기광을 사용하여 605±30㎚ 의 밴드 패스 필터를 사용한 형광 이미지으로서 관찰하였다.
<결과>
래트의 시상하부 조직에 있어서의 면역 조직 화학 이미지에 있어서, Nesfatin-1 IgG 에 의한 염색 이미지를 도 10 의 A 의 동그라미 1 및 동그라미 2 에, PC-1/3 에 의한 형광 이미지를 도 10 의 B 의 동그라미 1 에, PC-2 에 의한 형광 이미지를 도 10 의 B 의 동그라미 2 에 나타낸다. 도 10 의 A 의 동그라미 1 과 도 10 의 B 의 동그라미 2, 도 10 의 A 의 동그라미 2 와 도 10 의 B 의 동그라미 2 는, 동일한 시야에 있어서의 발색 이미지와 형광 이미지를 나타내고 있다. 도 10 의 A 의 동그라미 1 및 동그라미 2 에 나타나 있는 바와 같이, Nesfatin-1 IgG 에 의해 염색되는 세포가 래트 시상하부 세포에 관찰되었다. 이들 많은 세포에서는 항 PC-1/3 항체 및 항 PC-2 항체에 의한 염색 이미지는 Nesfatin-1 IgG 양성 세포와 일치하고 있었다. 이로부터 NESFATIN 이 발현하고 있는 세포에 있어서, 프로호르몬·컨버타제인 PC1/3 및 PC2 가 공발현하고 있는 것이 나타나고, 이로부터 NESFATIN 이 프로호르몬·컨버타제에 의해 프로세싱을 받을 가능성이 시사되었다.
실시예 12 NESFATIN-1, NESFATIN-2, NESFATIN-3 및 NESFATIN-2/3 의 뇌내 투여에 의한 섭식량 조절에 대한 작용의 검토
NESFATIN 의 어느 부위에 섭식 억제 활성 부위가 있는지를 검증하였다.
뇌실내 투여에 사용한 투여 시료는, 생리 식염수만 (Vehicle 군), 또는 실시예 10 에서 제조한 NESFATIN-1, NESFATIN-2, NESFATIN-3 또는 NESFATIN-2/3 을 각각 생리 식염수로 용해하고, 1 개체당 25pmol 을 제 3 뇌실 내에 암기 직전에 투여하였다. 래트는, Wistar 계 래트 (닛폰 SLC 로부터 구입) 를 사용하고, 실시예 6 과 동일하게 사육하고, 수컷 8∼9 주령 Wistar 계 래트 중, 체중 200∼250g 사이의 개체를 선별하여 사용하였다 (N=5). 래트에서의 뇌실내 투여 실험 수법 및 섭식량의 측정에 관해서는 실시예 6 에 기재된 방법과 동일하게 실시하였다. 또 섭식량의 측정은, 투여 직후부터의 1 시간 (0∼1hr) 및 투여 1 시간 후부터의 2 시간 (1∼3hr) 사이의 사료의 감소량을 섭식량으로서 계측하였다.
또, 상기와 동일한 조건에 있어서, 시료로서 NESFATIN-1 만을 래트 1 개체당 1, 5 또는 25pmol 을 제 3 뇌실 내에 암기 직전에 투여한 실험에 대해서도 실시하였다. 이 실험에 있어서는 투여 직후부터 1 시간 (0∼1hr) 의 섭식량을 측정하였다.
<결과>
도 11 의 A 에 나타내는 바와 같이 대조군 (Cont) 과 비교하여, NESFATIN-2, NESFATIN-3 및 NESFATIN-2/3 을 뇌실 내에 투여해도, 섭식량의 유의한 변동은 관찰되지 않았다 (0∼1hr : 도 11 의 A 의 a-1, 1∼3hr : 도 11 의 A 의 a-2). 한편, 25pmol 의 NESFATIN-1 의 뇌실내 투여에 의해 현저한 섭식 억제 효과가 관찰되었다. 또한 도 11 의 B 에 나타내는 바와 같이 NESFATIN-1 을 래트 1 개체당 1, 5 또는 25pmol 을 뇌실 내에 투여한 경우, 생리 식염수만을 투여한 경우 (0) 에 대하여, NESFATIN-1 의 투여량의 증가에 따라 섭식량이 저하되는 현상이 관찰되고, 특히 5pmol 또는 25pmol 투여한 경우에 있어서는 유의한 섭식의 감소가 관찰되었다. 이들 성적으로부터, NESFATIN 의 섭식 억제 활성은 NESFATIN-1 에 국재하는 것이 판명되었다.
실시예 13 NESFATIN-1 의 뇌실내 연속 투여에 있어서의 섭식량과 체중의 변화
또한, NESFATIN-1 을 연속적으로 뇌실 내에 투여했을 때의 섭식 및 체중의 변화에 대한 영향에 대해서 검토하였다.
NESFATIN-1 의 투여는, 삼투압 펌프에 의해 10 일간 연속하여 뇌실 내에 투여하였다. 동물은 약 8 주령 Wistar 계 수컷 래트 (닛폰 SLC 로부터 구입) 중, 체중이 200∼250g 범위의 것을 선정하여 사용하였다. 래트에 체중 1㎏ 당 40㎎ 의 펜토바르비탈·나트륨을 복강 내에 투여하여 마취하고, 두부를 제모하고 나서 뇌정위 고정 장치 (David Kopf 사 Model962) 에 고정시키고, 두피를 절개하고, 23G 바늘 (가이드 카뉼레) 의 선단을 제 3 뇌실에 도달하도록 (Bregma 후방 25㎜, 표면 9.5㎜) 유치 고정시키고, 그 가이드 카뉼레의 고정 1 주일 후에 각 실험에 제공하였다. 삼투압 펌프는 Alzet 사 Model2002 를 사용하고, 0.22㎛ 의 Millex GV 필터 (Millipore 사) 로 멸균한 생리 식염수에 용해한 NESFATIN-1 (NESFATIN-1 투여군), 또는 멸균 생리 식염수만 (대조군) 을, 사용 직전에 삼투압 펌프 내에 주입하고, 사용하기 전날부터 멸균 생리 식염수에 담궈 프라이밍을 실시하였다. 각 시료를 주입한 삼투압 펌프는 주입용 카뉼레에 접속되어 있는 튜브에 접속하고, 미리 매립한 가이드 카뉼레를 통해서, 주입용 카뉼레의 선단이 래트의 제 3 뇌실에 들어가도록 고정시켰다. 이 상태에서의 사용에서는, 24 시간당 12㎕ 의 속도로 제 3 뇌실에 시료가 주입된 것이 되고, NESFATIN-1 투여군에 있어서는 1 일당 5pmol 의 NESFATIN-1 이 뇌실 내에 투여된 것이 된다. 삼투압 펌프를 매립한 래트는 마취가 풀린 것을 확인하고, 개별 케이지에 넣어 분말 시료 및 음료수를 자유롭게 섭취할 수 있는 조건에서 사육하였다. 섭식량의 측정은, 카뉼레 및 삼투압 펌프를 매립한 다음날부터, 매일 오전 9 시에 잔존하고 있는 사료의 중량을 측정하고, 전일의 사료 중량과의 차이를 구함으로써 1 일 (24 시간) 의 섭이량을 산정하였다. 또한, 투여 개시 6 일 후부터 섭이량의 측정시에 체중을 측정하고, 그 체중 변화에 대해서도 기록하였다.
<결과>
도 12 의 A 에 나타내는 바와 같이, NESFATIN-1 투여군에 있어서는 투여 개시 후 1 일째부터 섭식량의 감소가 보이고, 측정 기간 중 대조군과 비교하여 섭식량의 저하가 유지되었다. 또 도 12B 에 나타내는 바와 같이, 체중 증가 속도는 NESFATIN-1 투여군에 있어서는 대조군과 비교하여 유의하게 감소하는 것이 나타났다.
실시예 14 항 NESFATIN-1 항체 또는 항 NESFATIN-3 항체의 뇌내 투여 및 변이형 NESFATIN 의 뇌내 투여에 의한 섭식 조절의 검토
실시예 12 및 13 에 있어서, NESFATIN-1 펩티드의 뇌내 투여에 의한 섭식량 저하 효과가 발견되었다. 또한, 이 사실을 확인하기 위해, NESFATIN-1 을 인식하는 NAP-1 IgG (Nesfatin-1 IgG), 또는 NESFATIN-3 을 인식하는 NAP-C1 IgG (Nesfatin-C1 IgG) 또는 NAP-C2 IgG (Nesfatin-C2 IgG) 를 래트의 뇌실 내에 투여하고, 섭식량에 대한 영향을 검토하였다. 또한, NESFATIN 이 프로호르몬·컨버타제에 의해 절단됨으로써 NESFATIN-1 이 생성되는 것과 섭식 조절의 관계를 조사하기 위해, 배열 번호 26 의 배열 중, 아미노산 번호 84 번과 85 번에 상당하는 Lys·Arg 의 배열을 Ala·Ala 로 치환한 배열의 변이체 (KR-AA 뮤턴트 : Mut) 를 제조하여 래트의 뇌내 투여에 의한 효과를 검토하였다.
뇌실내 투여에 사용한 투여 시료는, 생리 식염수에 면역시키지 않은 토끼로부터 정제된 IgG (Control 군), 또는 실시예 11 에서 제조한 NAP-1 IgG (Nesfatin-1 IgG), NAP-C1 IgG (Nesfatin-C1 IgG) 또는 NAP-C2 IgG (Nesfatin-C2 IgG) 를 각각 생리 식염수에 용해하고, 1 개체당 5㎕ (5㎍) 를 제 3 뇌실 내에 투여하였다. 래트는, Wistar 계 래트 (닛폰 SLC 로부터 구입) 를 사용하고, 실시예 6 과 동일하게 사육하고, 수컷 8∼9 주령 Wistar 계 래트 중, 체중 200∼250g 사이의 개체를 선별하여 사용하였다. 래트에서의 뇌실내 투여 실험 수법 및 섭식량의 측정에 관해서는 실시예 7 에 기재된 방법과 동일하게 실시하였다. 또 섭식량의 측정은, 투여 직후로부터의 3 시간 (0∼3hr) 및 투여 3 시간 후부터의 3 시간 (3∼6hr) 사이의 사료의 감소량을 섭식량으로서 계측하였다.
KR-AA 뮤턴트의 제조는, 실시예 5 에서 취득한 성숙형 마우스 NESFATIN 유전자를 개변하여 발현함으로써 실시하였다. 실시예 5 에서 취득한 성숙형 마우스 NESFATIN 유전자가 pGEM-11Zf (+) 에 클로닝된 플라스미드를 사용하고, PCR 법에 의해 2 종류의 단편을 제조하였다. 첫 번째 DNA 단편은 그 플라스미드 5ng 을 사용하고, mNucB2-F360 [Sac2Thr] 프라이머와 mNucB2 [KR-AA] R583 프라이머의 세트로 PCR 을 실시하여 제조하였다.
Figure 112007092849294-PCT00007
Figure 112007092849294-PCT00008
반응 조건은, 변성 90℃ 에서의 변성 반응 1 분에 이어, 변성 98℃ 에서 10 초, 어닐링 60℃ 에서 30 초, 신장 68℃ 에서 1 분의 반응 사이클을 20 사이클 실시하고, 증폭 DNA 를 제조하였다 (Stratagene 사 PfuTurbo(R) 폴리머라아제, Cat. No.600250 을 사용).
또한 2 번째의 1 번째의 DNA 단편과 동일하게 그 플라스미드 5ng DNA 단편을 사용하고, mNucB2 [KR-AA] F612 프라이머와 mNucB2-R1527 [NotI] 프라이머의 세트로 PCR 을 실시하여 제조하였다.
Figure 112007092849294-PCT00009
PCR 조건은 1 번째의 DNA 단편의 증폭과 동일하다.
2 종류의 DNA 단편을 제조하기 위해, 상기 2 종류의 PCR 반응 후의 샘플을, 50㎕ 당 각 5㎕ 가 되도록 반응액에 첨가하고, 각 0.25μM 의 His-Thr-For [SpeI] 프라이머와 상기 서술한 mNucB2-R1527 [NotI] 프라이머로, 1 배 농도의 Pfu buffer, 2.5units 의 PfuTurbo DNA polymerase (이상 Stratagene 사) 및 0.2mM 의 dNTPs (Promega 사 : C1141) 의 반응액으로, 변성 90℃ 에서의 변성 반응 1 분에 이어, 변성 98℃ 에서 10 초, 어닐링 60℃ 에서 30 초, 신장 68℃ 에서 1 분의 반응 사이클을 20 사이클 실시하여 증폭 DNA 를 제조하였다.
Figure 112007092849294-PCT00010
(배열 번호 60)
얻어진 PCR 산물은 1% 아가로오스 겔 전기 영동에 의해 증폭 밴드를 회수하고, QIAEX-Ⅱ 키트 (QIAGEN 사) 를 사용하여 정제하였다. 회수한 증폭 DNA 는 제한 효소 SpeI 및 NotI 로 소화하고, 동일하게 SpeI 과 NotI 로 소화한 pET41a (+) 벡터 (Novagen 사) 에 라이게이션 (Quick DNA Ligation Kit (New England BioLab 사) 을 실시하여 클로닝하였다. 그 클로닝된 DNA 는 실시예 5 와 동일하게 DNA 염기 배열을 해석하여 도입한 변이 부분 및 그 밖의 염기 배열에 에러가 없는 클론을 취득하고, KR-AA 뮤턴트 발현용 벡터를 얻을 수 있었다. 발현·정제에 대해서도 실시예 5 와 동일한 방법으로 실시하였다. 얻어진 KR-AA 뮤턴트의 아미노산 배열을 배열 번호 61 에 나타낸다. 또, Wt (정상의 NESFATIN) 는 실시예 5 에서 제조한 것을 사용하였다. 얻어진 KR-AA 뮤턴트 (Mut) 및 정상 NESFATIN (Wt) 의 각 폴리펩티드 각 5pmol 을, 실시예 6 과 동일한 방법으로 래트의 제 3 뇌실 내에 투여하였다. 투여 1 시간 후, 3 시간 후, 6 시간 후 및 12 시간 후의 사료의 중량 변화를 측정함으로써 섭취량을 산정하여 섭취 행동의 지표로 하였다.
<결과>
제 3 뇌실 내에 Control IgG, NAP-1 IgG (Nesfatin-1 IgG), NAP-C1 IgG (Nesfatin-C1 IgG) 또는 NAP-C2 IgG (Nesfatin-C2 IgG) 를 투여한 각 군에 있어서의, 투여 후 0∼3 시간동안의 섭식량을 도 13A 의 a-1 에, 3∼6 시간동안의 섭식량을 도 13A 의 a-2 에, 6∼9 시간동안의 섭식량을 도 13A 의 a-3 에 그래프로서 나타냈다. 0∼3 시간 (도 13A 의 a-1), 3∼6 시간 (도 13A 의 a-2) 에 있어서는 Control IgG 투여 래트와 비교하여, NAP-1 IgG (Nesfatin-1 IgG) 를 투여한 개체에서는, 유의하게 섭식량의 증가가 관찰되었는데 (0∼3 시간에서는 P<0.001, 3∼6 시간에서는 P<0.05), NAP-C1 IgG (Nesfatin-C1 IgG) 또는 NAP-C2 IgG (Nesfatin-C2 IgG) 를 투여한 군에 있어서는 Vehicle 군에 대하여 유의한 섭식량의 차이는 보이지 않았다. 또한 6∼9 시간에서의 결과에 있어서는, Control IgG 군, NAP-1 IgG (Nesfatin-1 IgG) 군, NAP-C1 IgG (Nesfatin-C1 IgG) 군 및 NAP-C2 IgG (Nesfatin-C2 IgG) 군의 각 군에 있어서, 유의한 섭식량의 차이는 관찰되지 않았다. 이 결과로부터, NESFATIN-1 에 대한 항체에 의해, 내재성 NESFATIN-1 의 기능이 저해됨으로써 섭식량이 증대하는 것이 나타났다. 이에 의해, 실시예 13 의 검증에 의해 NESFATIN-1 펩티드가 뇌실내 투여에 의한 섭식 억제 작용을 나타내 는 것에 추가하여, NESFATIN-1 의 기능을 저해하는 물질이 섭식량의 증대 효과를 갖는 것이 나타났다.
또 리콤비난트 마우스 NESFATIN (Wt) 및 아미노산 번호 84 번과 85 번에 상당하는 Lys·Arg 의 배열을 Ala·Ala 로 치환한 배열의 변이체 (Mut) 5pmol 을 래트 뇌실 내에 투여했을 때의 섭식량에 대한 영향을 조사한 결과를 도 13B 에 나타낸다. 도 13B 중 b-1 은 투여 후 0∼1 시간의 섭식량, b-2 는 1∼3 시간의 섭식량, b-3 은 3∼6 시간의 섭식량을 나타내고 있다. b-1 내지 b-3 에 나타내고 있는 바와 같이, Wt (정상의 NESFATIN) 5pmol 을 투여한 래트에 있어서는 각 시간에 있어서 유의한 섭식 억제 활성이 관찰되는 것에 대하여, 프로호르몬·컨버타제에 의해 절단되는 부위에 변이를 넣은 NESFATIN (Mut) 에서는 섭식 억제 효과는 관찰되지 않았다. 이로부터, NESFATIN 이 기능하기 위해서는, NESFATIN-1 이 프로호르몬·컨버타제 등에 의해 프로세스되는 과정이 중요한 것이 나타났다.
실시예 15 NEFA 유전자에 대한 안티센스 RNA 의 연속적 뇌실내 투여에 의한 섭식 및 체중에 대한 영향의 검토
NESFATIN (NEFA) 유전자의 발현과 섭식 및 체중 조절의 관계를, 더욱 상세하게 조사하기 위해, NESFATIN 유전자의 발현을 억제하는 안티센스 RNA 를 연속적으로 제 3 뇌실에 투여하고, 그 영향에 대해서 검토하였다.
NESFATIN 유전자에 대한 안티센스 RNA 는 번역 개시 부위 (translational start site) 를 끼워 넣는 배열인 이하의 배열의 모르폴리노 RNA 를 사용하였다.
NESFATIN 안티센스 RNA
Figure 112007092849294-PCT00011
NESFATIN 안티센스 RNA 의 투여는, 삼투압 펌프에 의해 12 일간 연속하여 뇌실 내에 투여하였다. 동물은 약 8 주령 Wistar 계 수컷 래트 (닛폰 SLC 로부터 구입) 중, 체중이 200∼250g 범위의 것을 선정하여 사용하였다. 래트에 체중 1㎏ 당 40㎎ 의 펜토바르비탈·나트륨을 복강 내에 투여하여 마취하고, 두부를 제모하고 나서 뇌정위 고정 장치 (David Kopf 사 Model962) 에 고정시키고, 두피를 절개하고, 23G 바늘 (가이드 카뉼레) 을 제 3 뇌실에 도달하도록 (Bregma 후방 2.5㎜, 표면 9.5㎜) 유치 고정시키고, 그 가이드 카뉼레의 고정 1 주일 후에 각 실험에 제공하였다. 삼투압 펌프는 Alzet 사 Model2002 를 사용하고, 사용하기 전날부터 멸균 생리 식염수에 담궈 프라이밍을 실시하고, 0.22㎛ 의 Millex GV 필터로 멸균한 NESFATIN 안티센스 RNA 를 생리 식염수에 용해한 용액 (Antisense 투여군), 또는 동일하게 멸균한 미스센스 RNA
Figure 112007092849294-PCT00012
를 멸균 생리 식염수에 용해한 용액 (대조군) 을, 사용 직전에 삼투압 펌프 내에 주입하였다. 각 시료를 주입한 삼투압 펌프는, 주입용 카뉼레에 접속되어 있는 튜브에 접속하고, 미리 매립한 가이드 카뉼레를 통해서, 주입용 카뉼레의 선단이 래트의 제 3 뇌실 내에 들어가도록 고정시켰다. 이 상태에서의 사용에서는, 24 시간당 12㎕ 의 속도로 제 3 뇌실에 시료가 주입되고, 안티센스 RNA 및 미스센스 RNA 는 각각 1 일당 40㎍ 주입하였다. 삼투압 펌프를 매립한 래트는 마취가 풀린 것을 확인하고, 개별 케이지에 넣어 분말 시료 및 음료수를 자유롭게 섭취할 수 있는 조건에서 사육하였다. 섭식량의 측정은, 카뉼레 및 삼투압 펌프를 매립한 다음날부터, 매일 오전 9 시에 잔존하고 있는 사료의 중량을 측정하고, 전일의 사료 중량과의 차이를 구함으로써 1 일 (24 시간) 의 섭이량을 산정하였다. 또한, 투여 개시 6 일 후부터 섭이량의 측정시에 체중을 측정하고, 그 체중 변화에 대해서도 기록하였다.
투여 개시 후 12 일째에 각 군의 개체를 도살하고, 뇌의 시상하부를 취출하여 추출된 시료를 사용하고, Nesfatin-1 Ab 에 의한 웨스턴 블로팅법에 의해 NESFATIN 의 발현을 확인하였다. 웨스턴 블로팅은, 실시예 3 및 12 와 동일한 방법으로 실시하였다. 웨스턴 블로팅에 의한 발색으로 염색된 밴드는, 덴시토메트리에 의해 밴드의 농도를 측정하였다.
<결과>
대조군 및 NESFATIN 안티센스 RNA 를 투여한 Antisense 투여군의 24 시간당의 섭식량의 변화를 도 14 의 A 에, 체중 변화를 도 14 의 B 에 나타내고 있다. 섭식량 (도 14 의 A) 은, 대조군과 비교하여 Antisense 투여군에 있어서는 개시 후 1 일째부터 섭식량의 증대가 관찰되고, 그 섭식량은 측정 기간 중 (투여 개시 12 일까지) 에는 항상 대조군을 웃돌고 있었다. 또, 체중 변화 (도 14 의 B) 에 있어서는 투여 개시 후 6 일에 있어서의 체중은 대조군 및 Antisense 투여군에 있어서 차이가 보이지 않았지만, 투여 7 일째 이후, Antisense 투여군에 있어서 대조군에 비하여 유의한 체중 증가 (P<0.05) 가 보이고, 그 차이는 9 일 내지 11 일 까지의 측정 기간에 있어서 보다 확대되어 갔다. 12 일째에 도살된 래트의 시상하부를 사용한 NESFATIN-1 의 웨스턴 블로팅의 해석에 있어서는, 대조군 (덴시토메트리에 의한 밴드 강도가 14.3±1.2AU) 과 비교하여, Antisense 투여군 (덴시토메트리에 의한 밴드 강도가 8.5±0.7AU) 에서는 유의하게 NESFATIN-1 의 발현이 감소되어 있었다. 이 결과로부터, 뇌실 내에 대한 NESFATIN 안티센스 RNA 투여는, NESFATIN-1 의 발현을 억제하고, 섭식량 및 체중 증가의 항진 효과를 나타내는 것이 관찰되었다.
실시예 16 재조합체에 의한 리콤비난트 NESFATIN-1 의 제조
NESFATIN-1 을 보다 대량으로 조정하기 위해, 재조합체를 사용하여 리콤비난트 NESFATIN-1 을 제조하는 방법에 대해서 검토하였다.
마우스 NESFATIN-1 을 코드하는 유전자를 취득하고, 그 N 말단에 GST (글루타티온-S-트랜스페라아제) 와 히스티딘 태그의 유전자를 결합하고, 번역 후의 단백질에 있어서 히스티딘 태그의 아미노산 배열과 마우스 NESFATIN-1 의 아미노산 배열 사이에 트롬빈에 의한 절단 부위 (-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-) 가 개재되는 형태가 되도록 발현 벡터를 구축하였다. 마우스 NESFATIN-1 의 유전자의 취득은, mouse Brain cDNA (Clontech 사) 를 사용하여 2 회의 PCR (Nested PCR) 을 실시함으로써 실시하였다. 1 회째의 PCR 은 이하의 Forward (mNucB2-F337 : 배열 번호 35) 및 Reverse (mNucB2-R712 : 배열 번호 36) 를 각 100pM 의 농도로, Pyrobest DNA polymerase (타카라바이오 (주) R005A), 첨부한 반응 버퍼 및 dNTP 를 사용하고, 첨부한 프로토콜에 따라서 반응을 실시하였다. PCR 반응은 90℃ 1 분의 반응 후, 98℃ 10 초·68℃ 1 분의 온도 사이클을 30 사이클, 그 후 68℃ 에서 2 분간 반응시키는 온도 조건에서 실시하였다.
Figure 112007092849294-PCT00013
얻어진 PCR 산물 0.5㎕ 를 사용하여, 2 회째의 PCR 을 이하의 Forward (mNucB2-N3 [SacI-Thr]) 및 Reverse (mNucB2-R389 [NotI]) 프라이머가 100pM 을 사용하여, 1 회째의 PCR 과 동일하게, Pyrobest DNA polymerase 를 사용하여 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 90℃ 1 분의 반응에 이어, 98℃ 10 초·60℃ 30 초·68℃ 1 분의 온도 사이클을 20 사이클 실시한 후, 68℃ 에서 2 분간 반응시키는 온도 조건에서 실시하였다.
Figure 112007092849294-PCT00014
2 회째의 PCR 을 실시한 PCR 반응 샘플은, 페놀/클로로포름 추출에 의해 정제한 후, 제한 효소 SacII 및 NotI 로 절단하고, 아가로오스 겔 전기 영동을 실시하여 약 300bp 의 길이에 상당하는 밴드를 절단하고, QIAEX-II 키트 (QIAGEN 사) 에 의해 정제하였다. 정제된 약 300bp 의 PCR 산물은, 제한 효소 SacII 및 NotI 로 절단된 pET41a (+) 플라스미드 벡터 (Novagen 사) 에, Quick DNA ligase kit (New England Bio Lab 사) 를 사용하여 라이게이션을 실시하였다. 라이게이션을 실시한 벡터를 대장균 J409 주에 도입하고, 얻어진 형질 전환체 8 개에 대해서 작은 스케일에서의 플라스미드 추출을 실시하고, 얻어진 플라스미드를 사용하여 삽입된 NESFATIN-1 유전자의 배열을 어플라이드 바이오시스템즈사의 BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction kit 및 ABI377 형 DNA 시퀀서 (Perkin-Elmer 사) 를 사용하여 염기 배열 해석을 실시하였다. 그 결과 정확한 NESFATIN-1 의 배열을 갖는 유전자가 삽입되어 있는 발현 벡터가 얻어지고, 이것을 pET41a (+) GST-His-LVPRGS-mNAP1 로 명명하였다.
얻어진 pET41a (+) GST-His-LVPRGS-mNAP1 을 대장균 BL21 (DE3) Codon Plus RIPL 에 도입하여 발현시킴으로써, GST·히스티딘 태그·트롬빈 절단 배열·NESFATIN-1 의 융합 단백질 (GST-His-LVPRGS-mNAP1) 의 발현을 실시하였다. pET41a (+) GST-His-LVPRGS-mNAP1 을 대장균 BL21 (DE3) Codon Plus RIPL 에 도입하여 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 선택하여 얻은 클론을, 10㎖ 의 카나마이신을 함유하는 LB 배지에서 37℃ 에서 배양하였다. 배양은, 그 배양액의 600㎚ 의 파장에 의한 흡광도가 0.8 이 된 시점에서 정지시켰다. 그 배양액 3㎖ 를 100㎖ 의 카나마이신을 함유하는 LB 배지에 심고, 추가로 37℃ 에서 배양하여 그 배양액의 600㎚ 의 파장에 의한 흡광도가 0.8 이 된 시점에서 100mM 의 IPTG 를 1㎖ 첨가하여 단백질의 발현을 유도하였다. IPTG 첨가 후, 추가로 37℃ 에서 3 시간 진탕 배양을 실시하였다. 그 배양액을 8000rpm 으로 20 분간 (4℃) 원심 분리하여 대장균의 균체를 회수하였다.
얻어진 대장균의 균체로부터 GST-His-LVPRGS-mNAP1 융합 단백질을 추출하고, 니켈 킬레이트 칼럼 (Ni-NTA agarose) 을 사용하여 정제하였다. 균체를 20㎖ 의 1 배 농도의 Complete-EDTA free (로슈·다이아그노스틱스사) 및 0.5 배 농도의 BugBuster (메르크사 Novagen Cat. No.70584) 를 함유하는 Sonication Buffer (50mM KH2PO4, 50mM NaCl, 2mM DTT, pH7.5) 에 현탁시키고, 빙수 중에서 10 분간 초음파에 의한 파쇄를 실시하였다. 초음파 처리 후의 샘플은 15,000rpm 으로 20 분간 원심 분리하여 그 상청을 회수하였다. 얻어진 상청 10㎖ 를, Lysis Buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 10mM 이미다졸, pH8.0) 로 평형화한 1㎖ 의 Ni-NTA agarose 칼럼에 어플라이하고, 추가로 10㎖ 의 Wash Buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM 이미다졸, pH8.0) 로 2 회 세정하였다. 세정 후의 칼럼을 2.5㎖ 의 Elution Buffer (50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM 이미다졸, pH8.0) 로 2 회 용출을 실시하고, 용출된 GST-His-LVPRGS-mNAP1 융합 단백질을 함유하는 획분을 회수하였다. 나머지 균체로부터의 추출 상청도 동일하게 처리하여, GST-His-LVPRGS-mNAP1 융합 단백질을 함유하는 획분을 회수하였다.
GST-His-LVPRGS-mNAP1 융합 단백질로부터 GST 및 히스티딘 태그 부분을 제거하여 추가로 정제함과 함께, 염증성 물질로서 작용하는 대장균 유래의 리포폴리사카라이드 (LPS) 를 제거하기 위해, GST-His-LVPRGS-mNAP1 융합 단백질이 GST 레진에 결합한 상태에서의 트롬빈 처리 및 역상 크로마토그래피에 의한 정제를 실시하였다. 또, 이 이후의 처리에 있어서의 Buffer 는, LPS 를 포함하지 않은 것을 확인한 것을 사용하였다. Ni-NTA agarose 칼럼에서의 정제로 얻어진 GST-His-LVPRGS-mNAP1 융합 단백질을 함유하는 획분 7.2㎖ 를 1 배 농도의 GST Bind/Wash Buffer (메르크사 Novagen Cat. No.70571) 로 세정하고, 최종적으로 3㎖ GST Bind/Wash Buffer 에서 현탁시킨 GST 레진 (메르크사 Novagen Cat. No.70541) (7.2㎖ 상당) 에 첨가하여, 20℃ 에서 1 시간 약하게 교반하였다. 원심 분리에 의해 레진을 회수한 후, 그 레진을 36㎖ 의 GST Bind/Wash Buffer 에서 2 회 세정하였다. 세정 후의 레진에 20units/㎖ 의 트롬빈을 PBS 에 용해한 것 3.6㎖ 를 첨가하여 현탁시키고, 20℃ 에서 약한 교반 상태에 있어서 20 시간 반응을 실시하였다. 반응 후의 레진은 포아사이즈 0.22㎛ 의 필터 부착 컵 (Millipore) 에 1.8㎖ 씩 분주하고, 3,000rpm 으로 2 분간 원심하여 여과된 트롬빈 처리 후 샘플을 회수하였다. 얻어진 트롬빈 처리 후 샘플 450㎕ 에 대하여 50㎕ 의 아세트산을 첨가하고, C18 역상 크로마토그래피의 샘플로 하였다. 역상 크로마토그래피는 0.1% 트리플루오로아세트산 존재 하에서 아세토니트릴의 그라디언트에 의한 용출법을 사용하고, 그 그라디언트는 10% 아세토니트릴 : 10 분/10 내지 20% 아세토니트릴 구배 : 60 분/30 내지 40% 아세토니트릴 구배 : 40 분/40 내지 60% 아세토니트릴 구배 : 5 분으로 설정하여 실시하였다. 칼럼으로부터 용출된 단백질은, 파장 280㎚ 의 흡광도를 측정함으로써 모니터링하였다. 아세토니트릴의 그라디언트로 용출한 획분에 대해서 SDS-PAGE 법 및 웨스턴 블로팅법으로 조사한 결과, NESFATIN-1 은 아세토니트릴 농도 36.2% 일 때 용출되는 것이 판명되었다. 그 때문에, 이 획분을 회수하고, 동결 건조시킨 후, 주사용 증류수에 다시 용해시킨 것을 사용하여, 흡광도에 의한 단백질 농도 및 엔도스페시 (생화학 공업) 에 의한 LPS 의 함유량을 측정하였다.
<결과>
100㎖ 의 배양액으로부터 Ni-NTA-agarose 로 정제된 조 (粗) 정제 GST-His-LVPRGS-mNAP1 은 약 7㎎ 이고, 트롬빈 처리 및 C18 역상 크로마토그래피로 고도로 정제된 NESFATIN-1 의 회수량은 472.5㎍ 이었다. 또한 고도로 정제된 NESFATIN-1 에 함유하는 LPS 의 양은 1㎍ 의 NESFATIN-1 에 대하여 약 4pg 이었다. 더욱 고도로 정제된 NESFATIN-1 을 실시예 13 과 동일한 방법으로 래트의 뇌실 내에 투여한 결과, 래트의 섭식 억제 및 체중 증가 억제 효과가 관찰되었다. 이로부터 재조합체를 사용한 발현과 정제에 의해, 활성을 갖는 NESFATIN-1 의 제조가 가능한 것이 나타났다.
실시예 17 Zucker fa/fa 래트의 제 3 뇌실내 투여에 의한 NESFATIN-1 의 뇌내 투여에 의한 섭식량 조절에 대한 작용의 검토
종래의 기술에 기술한 바와 같이, 비만 및/또는 비만증의 환자에 있어서는 렙틴 저항성을 나타내는 사례가 많이 보이고, 그것이 병태나 치료에 있어서의 문제가 되고 있다. 그 때문에, 렙틴 저항성의 병태 모델 동물인 Zucker fa/fa 래트 (Michael 등 Nature Genetics 1996 년 13 권 p18-19) 를 사용하여 NESFATIN-1 의 섭식량 조절에 있어서의 효과를 검토하였다.
래트는 8 주령 수컷의 Zucker fa/fa (Zucker) 계 래트 및 대조 동물로서 Zucker +/+ (Lean) 계 래트를 닛폰 찰즈·리버로부터 구입하고, 구입 후 오전 6 시 부터 오후 6 시까지의 12 시간을 명기, 오후 6 시부터 다음날 아침 오전 6 시를 12 시간의 암기의 주기로, 분말 사료 (닛폰 쿠레아사 CE-2) 를 주고, 22℃ 에서 사육하고, 실험하는 동안에도 동일한 조건에서 사육을 계속하였다. 구입한 래트는 1 주일 이상 예비 사육을 실시한 후, 9 내지 10 주령의 개체 중에서 체중이 200∼250g 의 개체를 선별하여 실험에 사용하였다.
투여에 사용한 시료는, 실시예 16 에서 제조한 리콤비난트의 마우스 NESFATIN-1 을 5㎕ 의 PBS 당 5pmol 함유하는 형태로 용해시킨 것을 사용하고, 컨트롤 시료로는 생리 식염수 (Saline) 만을 사용하였다. 조제한 시료는, Zucker 래트 및 Lean 래트를 5 마리씩의 군 (Zucker/NESFATIN-1 군, Lean/NESFATIN-1 군, Zucker/Saline 군, Lean/Saline 군) 에 대해서, 각 래트의 제 3 뇌실 내에 5㎕ 씩 투여하였다. 투여 시기는, 섭식 행동이 항진되는 암기에 들어가기 직전에 실시하고, 투여 수법은 실시예 6 에 기재된 방법과 동일하게 실시하였다.
뇌실 내에 대한 투여 후, 각 래트의 0∼1 시간, 1∼3 시간 및 3∼6 시간동안의 분말 사료의 감소 중량을 측정함으로써 섭식량을 측정하였다. 또, 유의차 검정에는 analysis of variance 를 사용하였다.
<결과>
Lean 래트에 NESFATIN-1 을 투여한 군 (Lean/NESFATIN-1 군) 및 생리 식염수를 투여한 군 (Lean/Saline 군) 의 섭식량의 측정 결과를 도 15 의 A 에, Zucker 래트에 NESFATIN-1 을 투여한 군 (Zucker/NESFATIN-1 군) 및 생리 식염수를 투여한 군 (Zucker/Saline) 의 섭식량의 측정 결과를 도 15 의 B 에 나타낸다. 컨트롤 동물의 Lean 래트에서의 결과 (도 15 의 A) 에서는, 투여 후 0∼1 시간 및 1∼3 시간의 섭식량은, Saline 군과 비교하여 NESFATIN-1 투여군에 있어서 저하되어 있는 것이 관찰되었다 (P<0.001). 또, 3∼6 시간의 섭식량에는 차이가 보이지 않았다. 렙틴 저항성 모델 동물인 Zucker 에서도, Lean 과 동일하게 투여 후 0∼1 시간, 1∼3 시간에 있어서 Saline 군과 비교하여 NESFATIN-1 투여군에 유의한 섭식량의 저하가 관찰되고 (P<0.001), 또한, 3∼6 시간에 있어서도 유의하게 저하 (P<0.05) 되어 있는 것이 관찰되었다 (도 15 의 B). 이로부터, NESFATIN-1 의 섭식 억제 작용은 렙틴의 작용을 통하지 않고 기능하는 것이 나타나고, 렙틴 저항성의 상태에서도 효과가 있는 것으로 해석된다.
실시예 18 마우스에 있어서의 NESFATIN-1 의 복강내 투여에 있어서의 섭식량 조절에 대한 작용의 검토
래트의 뇌실내 투여의 실험에 의해, NESFATIN 및 NESFATIN-1 이 섭식량의 조절에 관여하는 것이 나타났는데, 그 이외의 동물종에서의 효과를 검토하기 위해, 마우스에서의 투여 실험을 실시하였다. 또한, 실제의 의약품으로서의 실용성을 생각하면, 말초에 대한 투여에 의해서도 효과가 나타나는 것이 중요하다고 생각하여, 투여 경로로서 복강에 대한 투여를 선택하였다. 또한 Agouti 단백질의 과잉 발현에 의해 MC3R/MC4R 의 섭식 억제 기능이 저해되어 있는 비만 모델 동물인, Agouti-yellow (C57BL/6J-Ay/a) 마우스에 대한 투여 실험도 실시하였다.
실험 동물은 7 주령의 수컷 ICR 계 마우스를 닛폰 SLC (주) 로부터 구입하 고, 구입 후 오전 6 시부터 오후 6 시까지의 12 시간을 명기, 오후 6 시부터 다음날 아침 오전 6 시를 12 시간의 암기의 주기로, 펠릿 사료 (닛폰 쿠레아사 CE-2) 를 자유 섭식시키고, 22℃ 에서 사육하고, 실험하는 동안에도 동일한 조건에서 사육을 계속하였다. 구입한 마우스는 1 주일 이상 예비 사육을 실시한 후, 8 내지 9 주령의 개체 중에서 체중이 35∼40g 의 개체를 선별하여 실험에 사용하였다.
투여에 사용한 시료는, 실시예 16 에서 제조한 리콤비난트의 마우스 NESFATIN-1 을 200㎕ 의 생리 식염수당 각각 2nmol, 10nmol 또는 50nmol 의 양을 함유하는 형태로 용해시킨 것을 사용하고, 컨트롤 시료로는 생리 식염수 (Saline) 만을 사용하였다. 시료는 25G 의 주사바늘을 부착한 투베르쿨린 주사기로 각 마우스 (각 군 5 마리) 의 복강에 200㎕ 씩 단회 투여하고, 투여 시간은 암기에 들어가기 직전 (오후 6 시) 에 실시하였다.
또한 비만 모델 동물의 실험에 있어서는, 대상군으로서 C57BL/6J 계의 마우스 및 비만 모델 동물로서 Agouti-yellow 마우스를 사용하고, 이들 동물은 닛폰 찰즈·리버 (Jackson Lab.) 로부터 구입하였다. 사육 조건, 사용 마우스의 주령 등은 ICR 마우스와 동일한데, 대상군의 마우스는 체중 25∼28g 의 개체를, Agouti-yellow 마우스는 31∼38g 의 개체를 선별하여 사용하였다. 투여에 사용한 시료는 리콤비난트의 마우스 NESFATIN-1 을 200㎕ 의 생리 식염수당 10nmol 의 양을 함유하는 형태로 용해시킨 것을 사용하고, 컨트롤 시료로는 생리 식염수 (Saline) 만을 사용하였다 (각 군 16 마리). 그 밖의 조건은 상기와 동일하게 실시하였다.
투여한 각 마우스는 개별 케이지에 넣고, 투여 후 0∼3 시간동안 감소한 펠 릿 사료의 중량을 측정함으로써 섭식량을 측정하였다. 또, 유의차 검정에는 analysis of variance 를 사용하였다.
<결과>
ICR 마우스의 복강 내에 NESFATIN-1 또는 생리 식염수를 투여했을 때의, 투여 후 0∼3 시간의 섭식량의 측정 결과를 도 16 의 A 에 나타낸다. 도 16 의 A 의 결과에 있어서는, NESFATIN-1 을 마우스 1 마리당 2nmol, 10nmol 및 50nmol 투여한 마우스에 있어서 컨트롤 (Saline 군) 과 비교하여 섭식량의 저하가 관찰되고, 특히 10nmol (p<0.05) 및 50nmol (p<0.005) 에 있어서는 통계적으로 유의한 섭식량의 저하가 관찰되었다. 이로부터, NESFATIN-1 은 래트뿐만 아니라, 마우스에서도 섭식 억제를 나타내므로, 많은 종 (種) 에서 섭식 조절 작용에 관여하는 것, 또한 뇌내뿐만 아니라, 복강과 같은 말초로부터의 투여라도 섭식 억제 작용에 유효한 것이 나타났다. 또한 NESFATIN-1 은 복강 내에 투여한 경우에도 투여 후 조기에 섭식 억제 효과가 있는 것이 나타났다.
또한, 비만 모델 마우스에 있어서의 실험에 있어서, 대상군의 마우스 (C57BL/6J) 에 생리 식염수 (Cont) 또는 NESFATIN-1 (10pmol) 을 투여했을 때의 섭식량의 측정 결과를 도 16 의 B 에, 비만 모델 마우스의 Agouti-yellow 마우스에 생리 식염수 (Cont) 또는 NESFATIN-1 (10pmol) 을 투여했을 때의 섭식량의 측정 결과를 도 16 의 C 에 나타낸다. 그 결과, 대상군의 마우스에 있어서도 Agouti-yellow 마우스에 있어서도 NESFATIN-1 을 복강 내에 투여한 마우스는 컨트롤과 비교하여, 유의하게 섭식량이 저하되어 있었다. Agouti-yellow 마우스는 Agouti 단백질의 과잉 발현에 의해, MC3R/MC4R 의 리간드인 멜라노콜틴에 의한 섭식 억제가 작용하지 않게 되어 있는 비만 모델이므로, 마우스에서의 투여 실험에 있어서도, 실시예 17 에 있어서의 Zucker (fa/fa) 래트의 결과에서 렙틴 저항성을 나타내는 모델에서의 약리 활성이 나타난 것과, 동일하게 이미 알려진 Agouti/멜라노콜틴계 섭식 억제와는 독립된 기구에 의해 섭식 조절을 실시하는 것이 시사되었다.
실시예 19 마우스에 있어서의 NESFATIN-1 의 복강내 투여 및 피하 투여에 있어서의 섭식량 조절에 대한 작용의 검토
실시예 18 에 있어서 NESFATIN-1 은 마우스의 복강내 투여에서도 섭식 억제 작용에 유효한 것이 개시되었는데, 다른 말초 투여의 예로서, NESFATIN-1 의 피하에 대한 투여에서의 효과에 대해서도 검토하였다.
투여에 사용한 시료는, 실시예 16 에서 제조한 리콤비난트의 마우스 NESFATIN-1 을 200㎕ 의 생리 식염수당 10nmol 의 양을 함유하는 형태로 용해시킨 것을 사용하고, 컨트롤 시료로는 생리 식염수 (Saline) 만을 사용하였다. 시료는 25G 의 주사바늘을 부착한 투베르쿨린 주사기로 각 마우스의 복강 또는 등부 피하에 200㎕ 씩 단회 투여하고, 투여 시간은 암기에 들어가기 직전 (오후 6 시) 에 실시하였다. 그 밖의 조건으로는, 실시예 18 과 동일하게 실시하였다.
<결과>
마우스의 복강내 (ip) 또는 피하 (sc) 에 NESFATIN-1 (10nmol) 또는 생리 식염수 (0) 를 투여했을 때의 0∼3 시간에서의 섭식량의 측정 결과를 도 17 의 A 에, 0∼14 시간의 섭식량을 도 17 의 B 에 나타낸다. 도 17 의 A 에서는, 생리 식 염수 투여군 (0) 에 대하여, 복강내 (ip) 및 피하 (sc) 에 NESFATIN-1 을 10nmol 투여한 군에서는 섭식량이 저하되는 경향이 보이고, 특히 복강내 투여에 있어서는 통계적으로 유의 (P<0.05) 한 저하가 관찰되었다. 도 17 의 B 에서도 동일하게, 생리 식염수 투여군 (0) 에 대하여, 복강내 (ip) 및 피하 (sc) 에 NESFATIN-1 을 10nmol 투여한 군에서는 섭식량이 저하되는 경향이 보였는데, 복강내 (ip) 에 투여한 군에서는 그 섭식량의 저하에 유의차가 보이지 않고, 피하 (sc) 에 투여한 군에 있어서 생리 식염수 투여군에 대한 유의한 저하 (P<0.005) 가 관찰되었다. 도 17 의 A 와 B 의 결과에 있어서는, NESFATIN-1 을 복강 내에 투여하는 것이 조기에 섭식 억제 효과가 관찰되고, 피하에 투여한 것이 약간 늦게 효과가 관찰되는 경향이 있다. 이로부터, 말초 투여에 있어서는, 복강 내에 대한 투여뿐만 아니라 피하에 대한 투여에서도 NESFATIN-1 이 섭식 억제 작용에 유효한 것이 나타났다. 또한, 뇌에서 작용하는 약제에 있어서 말초 투여로 효과를 얻을 수 있는지가 실용상 중요하고, 그 점에서 NESFATIN-1 은 실시예 18 및 19 의 결과로부터 의약품으로서 사용하는 유용성을 갖는 것이 나타났다.
실시예 20 NESFATIN-1 의 부분 폴리펩티드 (NESFATIN-1N23, NESFATIN-1M30, NESFATIN-1C29) 의 마우스 복강내 투여에 의한 섭식 조절에 대한 작용의 검토
실시예 10 및 12 에 있어서, NESFATIN 에서의 프로호르몬·컨버타제에 의한 절단 부위로부터, NESFATIN-1 을 발명하기에 이르렀다. 그러나, NESFATIN-1 의 기능을 해석하는 데 있어서는 그 폴리펩티드의 기능 부위를 특정하는 것이 중요하고, 또한, 의약품에 대한 응용에 있어서는 그 펩티드의 아미노산 길이가 짧은 것이 제조, 투여량, 항원성 등의 점에서 유리하다고 생각된다. 그 때문에, 추가로 그 82 아미노산 길이로 이루어지는 NESFATIN-1 의 구조 중, 섭식 억제 활성을 갖는 부위를 더욱 상세하게 검토하기 위해, NESFATIN-1 의 부분 펩티드를 제조하고, 그것을 마우스의 복강 내에 투여했을 때 섭식량을 측정하는 실험을 실시하였다.
마우스의 NESFATIN 의 배열에서 유래되는 마우스 NESFATIN-1 의 아미노산 배열 (배열 번호 14) 중, 아미노 말단으로부터의 아미노산 번호로, 1 내지 23 까지의 배열을 NESFATIN-1N23, 24 내지 53 까지를 NESFATIN-1M30, 54 내지 82 까지를 NESFATIN-1C29 로 각각 명명하였다.
Figure 112007092849294-PCT00015
NESFATIN-1N23, NESFATIN-1M30, NESFATIN-1C29 의 각 폴리펩티드는 주식회사 바이오로지카에 외주하고, HPLC 법으로 95% 이상의 정제도로 제조된 합성 펩티드를 사용하였다. 각각의 폴리펩티드는, 각각 생리 식염수 200㎕ 당 50nmol 이 함유되는 형태로 용해시킨 것을 시료로서 사용하고, 컨트롤로는 생리 식염수 (Vehicle) 만을 시료로서 사용하였다. 시료는 25G 의 주사바늘을 부착한 투베르쿨린 주사기로 각 마우스 (각 군 5 마리) 의 복강에 200㎕ 씩 단회 투여하고, 투여 시간은 암기에 들어가기 직전 (오후 6 시) 에 실시하였다. 마우스는 수컷 ICR 계 마우스 (닛폰 SLC) 를 사용하고, 사육 및 실험 조건으로는 실시예 18 과 동일하게 실시하였다.
투여한 각 마우스는 개별 케이지에 넣고, 투여 후 0∼3 시간동안 감소한 펠릿 사료의 중량을 측정함으로써 섭식량을 측정하였다. 또, 유의차 검정에는 analysis of variance 를 사용하였다.
또한, 인간, 래트 및 마우스의 NESFATIN-1 의 아미노산 배열 얼라인먼트에 의한 비교도 실시하였다. 인간 NESFATIN-1 (배열 번호 13), 마우스 NESFATIN-1 (배열 번호 14) 및 래트 NESFATIN-1 (배열 번호 15) 의 아미노산 배열을 사용하고, CLUSTAL-W 법 (Higgins 등 Nucleic Acids Research 1994 년 22 권 p4673-4680) 에 의해 얼라인먼트를 실시하였다.
<결과>
마우스의 복강 내에 생리 식염수 (Vehicle), NESFATIN-1N23 (-N23), NESFATIN-1M30 (-M30) 및 NESFATIN-1C29 (-C29) 를 투여한 각 군의, 투여 후 0∼3 시간의 섭식량의 측정 결과를 도 18A 에 나타낸다. 생리 식염수를 투여한 컨트롤군 (Vehicle) 과 비교하여, NESFATIN-1M30 을 투여한 군 (N-1b) 에 있어서는 유의 (P<0.02) 한 섭식량의 저하가 관찰되었다. 그러나, NESFATIN-1N23 을 투여한 군 (N-1a) 및 NESFATIN-1C29 를 투여한 군 (N-1c) 에 있어서는 유의한 섭식량의 저하 또는 항진은 관찰되지 않았다. 이로부터, NESFATIN-1M30 은 NESFATIN-1 (및 NESFATIN) 의 섭식 억제 활성에 있어서 가장 중요한 기능 부위인 것이 나타났 다. 또, NESFATIN-1M30 도 복강내 투여에 의해 섭식 억제 활성이 보였기 때문에, 그 폴리펩티드도 의약품에 대한 실용화로의 가능성이 나타났다.
또한, 인간, 마우스 및 래트의 NESFATIN-1 의 아미노산 얼라인먼트 결과와 NESFATIN-1N23, NESFATIN-1M30 및 NESFATIN-1C29 의 부위를 도 18B 에 나타낸다. NESFATIN-1M30 의 부위는 종 사이에서 아미노산 배열이 높게 보존되어 있는 것이 나타났다.
실시예 21 EIA 계의 구축과 시상하부 조직에 있어서의 NESFAIN-1 펩티드의 검출
실시예 11 에 있어서, 래트의 시상하부의 세포에 있어서 NESFATIN-1 에 대한 항체 (Nesfatin-1 IgG) 와 프로호르몬·컨버타제 (PC1/3 및 pC2) 에 대한 항체에서의 결과로부터, NESFATIN 과 프로호르몬·컨버타제가 동일한 세포에서 발현하고, NESFATIN-1 이 생성되어 있을 가능성이 나타났다. 그것을 더욱 검토하기 위해, NESFATIN 또는 NESFATIN-1 을 검출하는 경합 EIA 계를 구축하고, 추가로 래트의 시상하부 조직으로부터 추출한 샘플을 역상 크로마토그래프 HPLC 로 분획한 패턴과 합성에 의해 제조한 NESFATIN-1 의 패턴을 비교하였다.
경합적 EIA 계는 실시예 10 에서 제조한 Nesfatin-1 IgG 와 비오틴 표지를 실시한 NESFATIN-1 펩티드를 사용하여 제조하였다. Nesfatin-1 IgG 를 10㎍/㎖ 의 PBS 에 용해시킨 것을 96 웰의 ELISA 플레이트 (스미토모 베크라이트 : MS-8596F) 에 50㎕/웰씩 분주하고, 플레이트 시일로 밀폐하여 4℃ 에서 하룻밤 정치하여 항체를 고정화시켰다. 항체를 고정화시킨 플레이트는 각 웰을 PBS 로 세정 한 후, 10% 의 소 혈청 알부민 (BSA) 을 함유하는 PBS 를 250㎕/웰씩 분주하여 실온에서 2 시간 방치하였다. 그 후 플레이트의 각 웰을 PBS 로 3 회 세정하고, 항체 고정화 플레이트를 제조하였다.
표지화한 NESFATIN-1 을 제조하기 위해, NESFATIN-1 의 C 말단에 시스테인 잔기가 부가된 형태의 NESFATIN-1 을 제조하였다 (NESFATIN-1 Cys : 배열 번호 62). 제조 방법은 실시예 16 과 동일한데, NESFATIN-1Cys 를 코드하는 핵산을 취득하기 위한 PCR 은 이하의 프라이머 세트로 실시하였다.
Figure 112007092849294-PCT00016
실시예 16 에 기재된 방법과 동일하게 발현·정제를 실시한 NESFATIN-1Cys 는, 50mM 의 2-메르캅토에탄올아민, 1mM 의 EDTA 를 함유하는 0.1M 인산 완충액 (pH6.0) 에 용해시키고, 37℃ 에서 90 분간 처리한 후, 0.1% 가 되도록 트리플루오로아세트산 (TFA) 을 첨가하고, Sep-PakC18 칼럼 (Waters 사) 에 놓고, 칼럼을 0.1% TFA, 10% 아세토니트릴 수용액 10㎖ 로 세정한 후, 3㎖ 의 0.1% TFA, 60% 아세토니트릴 수용액으로 용출하였다. 용출물은 동결 건조시킨 후, 5㎎/㎖ 가 되 도록 0.1M 인산 완충액 (pH7.0) 에 용해시키고, 거기에 1/40 용량의 디메틸포름아미드 (DMF) 로 용해시킨 20㎎/㎖ 의 Biotin (Long Arm) Maleimide (VECTOR Lab.) 를 첨가하고, 실온에서 3 시간 반응시켰다. Biotin (Long Arm) Maleimide 를 반응시킨 NESFATIN-1Cys 는 0.1% 가 되도록 TFA 를 첨가하고, 역상 C18 칼럼 (나카라이·테스크사 : COSMOSIL (등록 상표) 5C18-AR-300 20.0mml.D.×150㎜) 을 장착한 HPLC 에 어플라이하고, 210㎚ 에서의 파장에서의 흡광도를 모니터하면서, 0.1% TFA 수용액, 그것에 계속하여 0.1% TFA 를 함유하는 20% 아세토니트릴 수용액으로 용출물의 흡광도를 확인할 수 없게 될 때까지 세정하고, 그 후 20∼60% 의 아세토니트릴에 의한 그라디언트를 건 수용액을 송액하고, 210㎚ 의 흡광도에 있어서의 최대 피크를 나타내는 획분을 분취하였다. 얻어진 획분은 동결 건조시킨 후 PBS 에 용해시키고, 그것을 표지화 NESFATIN-1 로서 사용하였다.
표지화한 NESFATIN-1 은 1㎍/㎖ 가 되도록 2% 의 BSA 를 함유하는 PBS 에 용해시켰다. 표준 곡선의 작성은 실시예 16 에서 제조한 리콤비난트 NESFATIN-1 을 6000ng/㎖ 의 농도가 되도록 2% 의 BSA 를 함유하는 PBS 로 희석하고, 그것을 2 배 공비로 2% 의 BSA 를 함유하는 PBS 로 희석한 것을 사용하였다 (표준 시료 : 6000, 3000, 1500, 750.0, 375.0, 187.5, 93.8ng/㎖). 제조한 표지화 NESFATIN-1 과 표준 시료는 각 50㎕ 씩을 마이크로 테스트 튜브에 넣어 혼합하고, 항체 고정화 플레이트의 웰에 각 50㎕ 씩 분주하였다. 또한, 생체 시료의 예로서 래트로부터 채취한 수액을 그대로, 또는 2% 의 BSA 를 함유하는 PBS 로 2 배로 희석한 시료를 50㎕ 와 표지화 NESFATIN-1 용액 50㎕ 를 마이크로 테스트 튜브 내에서 혼합하고, 각 50㎕ 를 항체 고정화 플레이트의 웰에 분주하였다 (검체). 분주 후의 항체 고정화 플레이트는 1 시간 실온에서 정치한 후, 웰내의 반응 시료를 버리고, 0.2% 의 Tween-20 을 함유하는 PBS 로 3 회 세정하였다. 그 후, 2% 의 BSA 및 0.2% 의 Tween20 을 함유하는 PBS 로 1/1,000 로 희석한 Avidin-Peroxidase (Sigma 사 A7419-2ML) 를 각 웰에 50㎕ 분주하여 실온에서 30 분간 정치하였다. 반응 후, 각 웰의 용액을 제거하고, 0.2% 의 Tween20 을 함유하는 PBS 로 4 회 세정한 후, TBS (50mM Tris-HCl, 0.15M NaCl, pH8.0) 로 2 회 세정하였다. 세정 후의 항체 고정화 플레이트의 각 웰에, 50㎕ 의 Peroxidase 기질의 TMB (PIERCE 사 : 1-Step (등록 상표) TurboTMB) 를 첨가하고, 30 분간 실온에서 반응시켰다. 그 후 각 웰에 50㎕ 의 0.5N 황산을 첨가하여 반응을 정지시키고, 흡광 플레이트 리더로 450㎚ 의 파장의 흡수와 620㎚M 의 파장의 흡수를 측정하고, 450㎚ 의 파장의 흡광도로부터 620㎚ 의 파장의 흡광도를 뺀 것 (450(Δ620)㎚) 을 측정값으로 하였다.
시상하부에서의 NESFATIN-1 의 발현의 해석은, 조직으로부터 추출한 펩티드를 시료로 하여, HPLC 에 의한 분획을 실시함으로써 실시하였다. 8 마리의 래트 뇌로부터 시상하부를 절단하고, 4㎖ 의 0.1% TFA 수용액 중에서 테플론 (등록 상표) 호모지나이저를 사용하여 호모지나이즈하고, 10,000rpm 으로 10 분간 원심 분리하여 그 상청을 회수하였다. 회수한 상청은 0.45㎛ 의 포어사이즈의 필터 (Millipore 사) 로 여과한 후, Sep-PakC18 칼럼 (Waters 사) 을 통과시키고, 그 칼럼을 5㎖ 의 0.1% TFA 수용액으로 세정하였다. 그 후, 칼럼에 3㎖ 의 60% 아세토니트릴 수용액으로 용출하고, 그 용출물을 증발기로 건조시켰다. 그 건조물을 0.8㎖ 의 0.1% TFA 수용액에 용해시키고, 10,000rpm 으로 10 분간 원심 분리하고, 그 상청 500㎕ 를 C18 역상 크로마토칼럼 (나카라이·테스크사 : COSMOSIL %C18-AR-Ⅱ, 4.6mmI.DX250㎜) 을 장착한 HPLC 장치에 인젝션하였다. 시료를 인젝션한 후, 용출물을 224nM 의 파장에서의 흡광도를 모니터하면서, 1㎖/분의 유속으로 0.1% TFA 수용액을 흐르게 하여 칼럼을 세정하였다. 세정 후, 유속은 그대로이고, 0.1% TFA 존재하, 0 내지 60% 의 아세토니트릴의 농도 구배 (Δ1%/분) 에서의 송액을 실시하고, 용출물을 1㎖ 씩의 프랙션으로서 회수하였다. 얻어진 프랙션은 -80℃ 에서 동결시킨 후, 동결 건조시켜 건조 후의 샘플은 각 200㎕ 의 2% BSA 를 함유하는 PBS 에 용해시키고, 경합 EIA 법으로 NESFATIN·NESFATIN-1 을 측정하였다. 동일하게, 8 마리의 래트로부터 회수한 수액 600㎕ 를 건조시킨 시료로부터, 펩티드 샘플을 제조하고, HPLC 에서의 분획을 실시하여 용출되는 획분을 경합 EIA 계에서 검토하였다. 또한 컨트롤로서, 실시예 16 에서 제조한 리콤비난트 NESFATIN-1 펩티드 80㎍ 을 100㎕ 의 0.1% TFA 수용액에 녹이고, HPLC 에 인젝션하고, NESFATIN-1 이 용출되는 획분을 검출하였다.
<결과>
경합 EIA 계에서의 표준 시료의 측정에 의해 얻어진 표준 반응 곡선을 도 19A-1 에 나타낸다. 반응시킨 NESFATIN-1 의 농도가 상승함으로써 경합적으로 표지화 NESFATIN-1 의 결합이 저해되고, 450(Δ620)㎚ 의 흡광도가 감소하는 것이 나타나고, 이 계에 의해 시료 중의 NESFATIN-1 의 농도를 측정할 수 있는 것이 나타났다. 이 계의 감도는 4.6ng/tube (93ng/㎖) 의 NESFATIN-1 에 상당한다. 이 경합 EIA 계에서 수액에서의 NESFATIN-1 (NESFATIN) 의 농도를 측정한 결과를 도 19A-2 에 나타낸다. 수액을 그대로, 또는 1/2 로 희석하여 측정 (측정 후 희석률로 환산) 한 값은, 거의 동일한 값을 나타내고, 약 230ng/㎖ 의 NESFATIN-1 (NESFATIN) 이 존재하는 것이 나타났다.
래트의 시상하부에서 추출한 펩티드 샘플을 HPLC 로 분획하고, 그 획분에서의 NESFATIN-1 의 존재를 경합 EIA 에서 측정한 결과를 도 19B 의 b-1 에, 래트의 수액으로부터 추출한 펩티드 샘플에서 동일한 검토를 실시한 결과를 도 19B 의 b-2 에 나타낸다. 도 19B 의 b-1 및 도 19B 의 b-2 의 양자 모두, 44 내지 45 번째의 획분에 NESFATIN-1 로 생각되는 경합 EIA 계에서의 반응 피크가 관찰되었다. 또, 리콤비난트 NESFATIN-1 을 HPLC 로 동일한 조건에서 분획했을 때의 결과에서는, 역시 44 번째의 획분에 NESFATIN-1 이 용출되므로, 시상하부 및 수액의 HPLC 분획에서 경합 EIA 계에서 존재가 나타난 인자는 NESFATIN-1 이라고 생각된다.
실시예 22 NESFATIN-1M30 의 부분 폴리펩티드 (NESFATIN-1M16, NESFATIN-1M14, NESFATIN-1M10M) 의 마우스 복강내 투여에 의한 섭식 조절에 대한 작용의 검토
실시예 20 에 있어서, NESFATIN-1 에서 유래되는 부분 펩티드의 섭식 억제 작용의 검토로부터, NESFATIN-1M30 을 발명하기에 이르렀다. 또한, 그 30 아미노산 길이로 이루어지는 NESFATIN-1M30 의 구조 중, 섭식 억제 활성을 갖는 부위를 더욱 상세하게 검토하기 위해, NESFATIN-1M30 의 부분 펩티드를 제조하고, 그것을 마우스의 복강 내에 투여했을 때 섭식량을 측정하는 실험을 실시하였다.
마우스 NESFATIN-1M30 의 부분 펩티드인 16 아미노산 길이로 이루어지는 NESFATIN-1M16, 14 아미노산 길이로 이루어지는 NESFATIN-1M14, 10 아미노산 길이 로 이루어지는 NESFATIN-1M10M 은, 이하의 배열의 것을, 주식회사 바이오로지카에 외주하고, HPLC 법으로 95% 이상의 정제도로 제조된 합성 펩티드를 사용하였다.
Figure 112007092849294-PCT00017
제조한 각 펩티드는 10pmol 이 100㎕ 에 용해되어 있는 바와 같이 생리 식염수에 용해시킨 것을 투여용 시료로서 사용하고, 컨트롤 (Cont.) 로는 생리 식염수만을 사용하였다. 컨트롤로서의 생리 식염수 및 조제한 펩티드 시료는 마우스 1 마리당 100㎕ 씩 복강 내에 투여하였다 (각 군 n=6). 마우스는 수컷 ICR 계 마우스 (닛폰 SLC) 를 사용하고, 사육 및 실험 조건으로는 실시예 18 과 동일하게 실시하였다.
투여한 각 마우스는 개별 케이지에 넣고, 투여 후 0∼3 시간동안 감소한 펠릿 사료의 중량을 측정함으로써 섭식량을 측정하였다. 또, 유의차 검정에는 analysis of variance 를 사용하였다.
<결과>
마우스의 복강 내에 NESFATIN-1M30 의 부분 펩티드인 NESFATIN-1M16 (M16), NESFATIN-1M10M (M10M) 또는 NESFATIN-M14 (M14) 를 투여했을 때의, 투여 후 0∼3 시간에 있어서의 섭식량을 도 20 에 나타낸다. 생리 식염수만 투여한 컨트롤군 (Cont.) 과 비교하여 NESFATIN-1M16 (M16), NESFATIN-1M10M (M10M) 또는 NESFATIN- M14 (M14) 를 투여한 군에서는 모두 섭식의 유의한 억제 효과가 관찰되었다.
실시예 23 인간 NESFATIN-1M30 및 마우스 NUCB1-M30 의 섭식 조절에 대한 작용의 검토
실시예 20 에 있어서는 마우스의 NESFATIN-1M30 이 섭식 억제 작용을 갖는 것에 대해서 나타냈다. 그로부터 인간의 NESFATIN-1M30 을 제조하고, 마우스에 투여했을 때의 섭식 행동에 대한 작용을 검토하였다. 또한 Nucleobindin-1 (NUCB1) 은 NEFA/NESFATIN 과 펩티드에서의 아미노산 배열 및 유전자에서의 염기 배열의 상동성이 높은 패밀리를 형성하는 인자이다. 따라서, NUCB1 의 NESFATIN-1M30 에 상당하는 부위인 NUCB1-M30 을 제조하고, 마우스에 투여하여 섭식에 대한 작용을 검토하였다.
인간의 NESFATIN-1M30 (배열 번호 39) 및 마우스 NUCB1-M30 은 화학 합성법에 의해 바이오로지카 (주) 에 외주하여 합성하고, 95% 이상으로 정제한 것을 취득하였다.
Figure 112007092849294-PCT00018
(배열 번호 103)
제조한 인간의 NESFATIN-1M30 및 마우스 NUCB1-M30 은 각 10pmol 이 100㎕ 에 함유되는 형태로 생리 식염수에 용해시켜 투여 시료로 하였다. 또한, 섭식 억제 활성이 관찰된 마우스의 NESFATIN-1M30 은 실시예 20 에서 제조한 것을 NESFATIN-1M30 및 NUCB1-M30 과 동일한 용량으로 사용한 것을 비교 시료로서 사용하고, 컨트롤 (Vehicle) 로는 생리 식염수만을 시료로 하였다.
컨트롤로서의 생리 식염수 및 조제한 펩티드 시료는 마우스 1 마리당 100㎕ 씩 복강 내에 투여하였다 (각 군 n=6). 마우스는 수컷 ICR 계 마우스 (닛폰 SLC) 를 사용하고, 사육 및 실험 조건으로는 실시예 18 과 동일하게 실시하였다.
투여한 각 마우스는 개별 케이지에 넣고, 투여 후 0∼3 시간동안 감소한 펠릿 사료의 중량을 측정함으로써 섭식량을 측정하였다. 또, 유의차 검정에는 analysis of variance 를 사용하였다.
또한 인간·래트·마우스의 NESFATIN 및 인간·래트·마우스의 NUCB1 의 아미노산 배열의 얼라인먼트를 실시하였다. 방법은, 배열 번호 2, 배열 번호 5 및 배열 번호 8 의 각 인간·마우스·래트의 NESFATIN 의 아미노산 배열, 및 배열 번호 84, 배열 번호 88 및 배열 번호 92 의 각 인간·래트·마우스의 NUCB1 의 아미노산 배열을 사용하여 ClustalW 법으로의 해석을 실시하였다.
<결과>
인간 NESFATIN-1M30 (human/NESFATIN-1M30), 마우스 NESFATIN-1M30 (Mouse/NESFATIN-1M30) 또는 마우스 NUCB1-M30 (Mouse NUCB1) 을 투여했을 때의, 투여 후 0∼3 시간의 섭식량의 측정 결과를 도 21A 에 나타낸다. 도 21A 에 있어서, 생리 식염수만을 투여한 컨트롤군 (Vehicle) 과 비교하여, 인간 NESFATIN- 1M30 (human/NESFATIN-1M30), 마우스 NESFATIN-1M30 (Mouse/NESFATIN-1M30) 또는 마우스 NUCB1-M30 (Mouse NUCB1) 을 투여한 군에서는 모두 유의하게 섭식이 억제되는 효과가 관찰되었다.
또한 인간·래트·마우스의 NESFATIN 및 인간·래트·마우스의 NUCB1 의 아미노산 배열의 얼라인먼트 결과와 NESFATIN-1 에 상당하는 부위 및 NESFATIN-1M30 에 상당하는 부위를 도 21B∼21C 에 나타내고 있다. 각종 NESFSATIN 및 NUCB2 의 NESFASTIN-1 에 상당하는 부위, 특히 NESFATIN-1M30 에 상당하는 부위에 있어서, 아미노산 배열의 보존성이 높은 것이 나타났다.
실시예 24 래트 시상하부에서의 NESFATIN 유전자 발현 부위의 검토
실시예 8 에 있어서 뇌 시상하부에서의 NESFATINmRNA 의 발현을 in situ 하이브리다이제이션법으로 해석을 실시했는데, NESFATIN 유전자가 발현하고 있는 부위를 더욱 상세하게 해석하기 위해, 라디오아이소토프 프로브를 사용한 in situ 하이브리다이제이션법에 의한 검토를 실시하였다.
자유롭게 섭이할 수 있는 상태에서 사육한 8 주령의 수컷 정상 Wistar 계 래트 (닛폰 SLC 로부터 구입) (체중 220∼250g) 를 사용하고, 명기에 래트를 펜토바르비탈로 깊이 마취하고, 심장으로부터 수냉시킨 0.1M 붕산 완충액 (pH9.5) 에 용해시킨 4% 파라포름알데히드를 환류함으로써 뇌를 고정시켰다. 래트로부터 뇌를 취출하고, 10% 자당과 4% 파라포름알데히드를 함유하는 0.1M 붕산 완충액 (pH9.5) 에 2 일간 침지하였다. 고정시킨 뇌는 드라이아이스-아세톤으로 동결시키고, 크라이오스타트로 20㎛ 의 두께의 절편을 제조하여 슬라이드글라스 (마쯔 나미글라스 제조 MAS 코트슬라이드 S-9116) 에 놓았다.
라디오아이소토프 표지 프로브의 제조는, 실시예 2 에서 사용한 NEFA 프로브 제조용 플라스미드를 제한 효소 NcoI 로 절단하여 정제한 그 플라스미드 0.1㎍ 을 사용하고, 36mM 트리스 염산 완충액 (pH7.5), 6mM 염산 마그네슘, 2mM 스페르미딘, 8mM 디티오트레이톨, 25mM 아데노신 3인산/구아노신 3인산/시토신 3인산, 5mM 우라실 3인산과 5mM [α-35S]-우라실 3인산 및 1U RNAsin® Ribonuclease Inhibitor (Promega 사 N2111) 를 함유하는 용액 19㎕ 의 조건에서, 20U (1㎕) 의 SP6 RNA Polymerase (프로메가사 P1085) 를 첨가하여 37℃ 에서 60 분 반응시킴으로써 35S 표지화 NEFA cRNA 프로브를 제조하였다. 반응 후, 20㎕ 의 TNE 완충액 (10mM Tris-Cl, pH8.0, 0.5M NaCl, and 0.25mM EDTA, pH8.0) 을 첨가하여 반응을 정지시키고, NENSORBTM PREP Nucleic Acid Purification Cartridges (PerkinElmer, Inc. NLP028001EA) 를 사용하여 첨부한 프로토콜에 따라서 프로브를 정제하였다.
제조한 절편 표본의 슬라이드글라스는 하이브리다이즈를 실시하기 전에 하룻밤 진공 하에서 건조시키고, 그 후 10㎍/㎖ 의 ProteaseK (Sigma 사 P2308) 를 함유하는 PBS 로 37℃ 30 분 처리한 후, PBS 로 2 회 세정하고, 추가로 0.25% 의 무수 아세트산을 함유하는 0.1M 트리에틸아민-염산 완충액 (pH8.0) 에 실온에서 10 분 담그는 처리를 실시하고, 그 후 2 배 농도의 SSC 로 2 회 세정하였다. 세정한 절편 표본은 75% 에탄올·95% 에탄올·99% 에탄올에 순서대로 담궈 탈수한 후, 바람에 건조시키고, 다시 진공 하에서 건조시켰다.
건조시킨 절편 표본의 슬라이드글라스는 뇌 조직 절편이 덮이도록, in situ 하이브리다이제이션액 (10mM 트리스 염산 완충액 pH8.0, 30mM NaCl, 10% 황산 덱스트란, 1 배 농도 Denhardt's 액, 12mM EDTA, 50% 탈이온화 포름아미드, 0.5㎎/㎖ 효모 tRNA) 을 놓고, 65℃ 에서 1 시간 프리하이브리다이제이션을 실시하였다. 프리하이브리다이제이션액을 버린 후, 슬라이드글라스당 80㎕ 의 106cpm/㎖ 의 35S 표지화 NEFA cRNA 프로브와 10mM 디티오트레이톨을 함유하는 하이브리다이제이션액을 놓고, 커버글라스를 놓아 습윤 박스에 넣어 65℃ 에서 하룻밤 하이브리다이즈를 실시하였다. 하이브리다이제이션 후의 슬라이드글라스는 4 배 농도의 SSC 로 4 회 세정한 후, 20㎍/㎖ 의 RNAase A 를 함유하는 TNE 완충액 (10mM Tris-Cl, pH8.0, 0.5M NaCl, and 0.25mM EDTA, pH8.0) 으로 37℃ 30 분 처리하고, 실온에서 2 배 농도의 SSC 로 2 회 세정하고, 추가로 65℃ 에서 0.1 배 농도의 SSC 로 30 분간 2 회 세정하였다. 세정 후의 슬라이드글라스는 75% 에탄올·95% 에탄올·99% 에탄올에 순서대로 담궈 탈수한 후, 바람에 건조시켰다. 그 조직 절편을 놓은 슬라이드글라스는 X 선 필름에 7 일간 대어 감광한 후, 물로 2 배로 묽게 한 감광 에멀션 (Kodak 사 NTB3) 에 담궈 3 주간 감광시켰다. 감광 후 슬라이드글라스는 수세 후, Thionine 에 의한 염색을 실시하여 현미경으로 감광에 의해 생긴 검은 스폿을 관찰하였다.
또, 래트의 뇌에 있어서의 각 부의 위치의 동정은 팍시노스 (Paxinos G) 와 와토손 (Watoson C) 저 The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. (Academic Press 출판) (USA) 1986 년에 따랐다.
<결과>
도 22 의 A 에는 실방핵 (PVN) 과 시상상핵 (S0N) 을 포함하는 조직 절편, 도 22 의 B 에는 불확정 구역 (Zi) 과 궁상핵 (Arc) 을 포함하는 조직 절편, 도 22 의 C 에는 시상외측야 (LHA) 를 포함하는 조직 절편에 있어서의 in situ 하이브리다이제이션의 이미지를 나타내고 있다. PVN, SON, Zi, Arc, LHA 의 각 영역에서 라디오아이소토프 표지 NEFAcRNA 프로브가 하이브리다이즈함으로써 감광한 스폿이 보이고, NEFA 유전자의 발현이 관찰되었다.
실시예 25
래트의 뇌실 내에 대한 NESFATIN 투여에 의한 섭식 행동에 대한 작용의 검토
실시예 6 에 있어서는 래트의 NESFATIN 투여 후 0∼1 시간/1∼3 시간/3∼6 시간에 있어서의 섭식량을 검토했는데, 추가로 투여 후 6∼12 시간에 있어서의 섭식 행동에 대한 작용에 대해서도 검토하였다.
실험은 실시예 6 의 재현성을 나타내기 위해, 실시예 6 과 동일하게, 제 3 뇌실 내에 리콤비난트 NESFATIN 을 각 0 (PBS 만), 1, 4, 20pmol 투여했을 때의, 투여 후 0∼1 시간동안의 섭이량을 측정하였다. 또한, 실시예 6 과 동일한 방법으로, 래트 뇌실 내에 5pmol 의 NESATIN 을 투여한 후, 0∼1 시간/1∼3 시간/3∼6 시간 및 6∼12 시간에 있어서의 섭이량을 측정하였다. 또 대조군으로는, 생리 식염수만 (0pmol) 투여한 군을 사용하였다. 또, 유의차 검정에는 analysis of variance 를 사용하였다.
<결과>
도 23 의 A 에 나타내는 바와 같이, NESFATIN 의 뇌실내 투여를 4pmol 또는 20pmol 투여했을 때의 0∼1 시간의 섭식량은, 대조군 (0pmol) 과 비교하여 유의한 섭이량의 저하가 관찰되었다 (p<0.01). 또한 도 23 의 B 에 나타내는 바와 같이, 5pmol 의 NESFATIN 이 뇌실 내에 투여된 개체는, 대조군 (0pmol) 과 비교하여, 0∼1 시간 (p<0.01), 1∼3 시간 (p<0.05), 3∼6 시간 (p<0.001) 에서 유의한 섭이량의 저하가 관찰되었다. 그러나, 6∼12 시간동안의 섭이량에 대해서는, 5pmol 의 NESFATIN 을 투여한 군과 대조군을 비교하여 차이는 관찰되지 않았다.
실시예 26 기아 상태에 있어서의 래트 시상하부의 부위에 있어서의 NESFATIN mRNA 및 NESFATIN-1 펩티드의 발현량의 검토
기아 상태에 있어서의 NESFATIN 유전자의 발현을 검토하기 위해, 자유 섭식 및 절식시킨 래트 뇌의 시상하부 영역에서 in situ 하이브리다이제이션을 실시하고, 그 조직으로부터 궁상핵·실방핵·외측야·시상상핵에서의 NESFATIN 의 mRNA 량의 증감을 측정하였다. 또한 동일하게 절식에 의한 실방핵에서의 NESFATIN-1 펩티드의 발현량을 측정하기 위해, 자유 섭식 및 절식시킨 래트 뇌의 시상하부 영역을 절단하고, 추출한 펩티드를 경합 EIA 계에서 정량하였다.
래트는 실시예 8 과 동일하게 자유롭게 분말 사료를 섭식할 수 있는 개체 (대조군), 48 시간 사료를 주지 않고 음료수만으로 사육한 개체 (절식군) 를 사용하였다. 시상하부의 각 부위에서의 NESFATIN 의 mRNA 발현량의 정량은, 실시예 24 와 동일한 방법으로 조직 절편을 제조하고, in situ 하이브리다이제이션을 실시 하고, X 선 필름에 감광시켜 얻어진 이미지를 이미지 애널라이저 (Imaging Research Inc. MCIDTM Elite) 로 측정함으로써 실시하였다 (Imaki 등 Brain Research (Netherlands) 1993 년 623 권 p223-228). 궁상핵·실방핵·외측야·시상상핵에 있어서의 부위에서의 감광 이미지의 농도를 측정하고, 그 값을 백에서 흑을 256 단계의 그레이스케일로 비색 수치로서 수치화하고, 이하의 식으로 비색 농도 (Relative Optical Densities) 로서 수치화하고, mRNA 발현의 상대값으로 하였다.
Relative Optical Densities=log 10 (256/비색 수치)
또, 궁상핵·실방핵·외측야·시상상핵의 각 부위의 동정은, 팍시노스 (Paxinos G) 와 와토손 (Watoson C) 저 The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. (Academic Press 출판) (USA) 1986 년에 따랐다.
래트 뇌의 실방핵에서의 NESFATIN-1 펩티드의 정량은 이하와 같이 실시하였다. 상기와 동일하게 자유 섭식 및 절식시킨 래트를 단두에 의해 도살하고, 바로 뇌를 드라이아이스-에탄올로 얼리고, 크라이오스타트로 60㎛ 의 두께의 절편을 제조하였다. 조직을 Nissl 염색하고, 실체 현미경 하에서 뇌 양측의 실방핵에 상당하는 부분을 절단하여 회수하였다. 회수한 조직은 1.5㎖ 의 마이크로튜브 중에서 100㎕ 의 0.1N 염산 중에서 마이크로튜브·막자 (Scientific Specialties 사 1005-39) 를 사용하여 호모지나이즈하였다. 호모지나이즈한 용액은 마이크로 원심기로 15,000rpm 으로 20 분간 원심하고, 그 상청을 회수하여 동결 건조에 의해 용매를 제거하였다. 동결 건조시킨 샘플은 100㎕ 의 PBS 에 용해시키고, 실시예 21 에 기재한 경합 EIA 의 측정법으로 50㎕/웰의 조건에서 NESFATIN-1 펩티드량을 정량하였다.
<결과>
도 24 의 A 는 자유 섭식군 (대조군) 과 절식군의 래트에 있어서의 뇌 시상하부 영역에서의 궁상핵 (Arc)·실방핵 (PVN)·외측야 (LHA) 및 시상상핵 (SON) 의 각 부위에서의 NESFATIN mRNA 발현을 in situ 하이브리다이제이션법에 의한 화상 해석으로 정량한 결과를 나타내고 있다. 궁상핵·외측야·시상상핵에서는 자유 섭식군 (대조군) 에서의 NESFATIN mRNA 의 발현의 값 (비색 농도) 에 대하여 절식군에 있어서의 NESFATIN mRNA 발현의 값에는 차이는 보이지 않았다. 그것에 대하여 실방핵에서는 자유 섭식군 (대조군) 에 대하여 절식군의 NESFATIN mRNA 의 발현량은 유의하게 저하되어 있다는 결과가 얻어졌다.
도 24 의 B 는 자유 섭식군 (대조군) 과 절식군의 래트에 있어서의 뇌 시상하부 영역 중 실방핵에서의 NESFATIN-1 펩티드의 발현을 경합 EIA 법에 의한 화상 해석으로 정량한 결과를 나타내고 있다. 자유 섭식군 (대조군) 에 대하여 절식군에서는 실방핵에서의 NESFATIN-1 펩티드의 발현이 유의하게 저하되어 있는 것이 나타났다.
이상의 성적은, 절식에 의해 섭식 조절에 중요한 시상하부의 실방핵에서 NESFATIN (NEFA) 유전자 및 NESFATIN-1 의 발현이 현저히 저하되는 것을 나타내고 있다.
실시예 27 NESFATIN-1 의 래트 뇌실 내에 대한 투여에 의한 섭식 행동에 대한 영향의 검토
실시예 12 에 있어서 NESFATIN 의 부분 펩티드의 투여에 의한 실험에서 NESATIN-1 의 부분만이 섭식 억제 활성이 있는 것을 나타냈다. 또한 그 실험을 검증하기 위해, 투여 후의 시간 경과에 따른 섭식 억제 활성에 대해서 검토를 실시하였다.
실험 조건은 실시예 12 와 동일하게 실시하고, 래트의 제 3 뇌실 내에 5pmol 의 NESFATIN-1 을 암기가 시작되기 직전에 투여하고, 투여 직후부터의 1 시간 (0∼1hr), 투여 1 시간 후부터의 2 시간 (1∼3hr), 투여 후 3 시간 후부터의 3 시간 (3∼6hr) 및 투여 후 6 시간부터의 6 시간 (6∼12hr) 동안의 사료의 감소량 (섭이량) 을 섭이량으로서 계측하였다. 또, 대조군으로서, 생리 식염수만을 투여한 개체의 섭이량을 측정하였다.
<결과>
도 25 에는 래트의 제 3 뇌실 내에 5pmol 의 NESFATIN-1 을 투여했을 때의, 0∼1hr, 1∼3hr, 3∼6hr 및 6∼12hr 에서의 섭식량을 나타내고 있다. 대조군에 대하여 NESFATIN-1 이 투여된 군에서는 0∼1hr, 1∼3hr 및 3∼6hr 에서는 유의하게 섭이량의 저하가 관찰되었다 (p<0.01). 그것에 대하여 6∼12hr 에서는 대조군과 비교하여 NESFATIN-1 이 투여된 군에서는 섭이량의 증가가 관찰되었다 (p<0.01). 이상의 성적으로부터 뇌실 내에 NESFATIN-1 이 투여된 경우에 있어서의 섭식 억제는 일시적인 것이고, 시간 경과에 따른 NESFATIN-1 의 약리 효과의 소실과, 그에 따른 섭식의 회복이 관찰되는 것이 나타났다.
실시예 28 항 NESFATIN-1 항체의 래트 뇌실내 투여에 의한 섭식 항진 작용의 특이성의 검토
실시예 14 에서는 래트 뇌실 내에 NESFATIN-1 에 대한 항체를 투여했을 때, 섭식 항진 작용이 관찰되는 것을 나타냈다. 그 작용이 NESFATIN-1 의 작용을 저해하는 것에 따른 효과인 것을 검증하기 위해, 뇌실 내에 NESFATIN-1 을 투여했을 때 섭식 억제가 항 NESFATIN-1 항체를 동시에 투여함으로써 저해되는지 검토하였다.
실험 조건은 실시예 12 와 동일하게 실시하고, 암기에 들어가기 직전의 래트의 제 3 뇌실 내에 5pmol 의 NESFATIN-1 만을 투여한 군, 5pmol 의 NESFATIN-1 과 8㎍ 의 항 NESFATIN-1 항체 (Nesfatin-1 IgG) 를 투여한 군에서의 투여 후 1 시간의 섭이량을 계측하여, 대상군 (생리 식염수만을 투여) 을 비교하였다. 또한 뇌실 투여에서 섭식 억제 활성이 있는 것이 알려져 있는 렙틴 (Rat Leptin : R&D systems 사 598-LP-01M) 을 단독 (1㎍) 또는 렙틴과 항 NESFATIN-1 항체를 투여한 군에서의 섭식에 대한 작용도 검토하였다.
<결과>
도 26 은 래트의 뇌실 내에 NESFATIN-1 만을 투여한 군 (NESFATN-1 IgG/NESFATIN-1/Leptin : -/+/-), NESFATIN-1 과 항 NESFATIN-1 항체를 투여한 군 (NESFATN-1 IgG/NESFATIN-1/Leptin : +/+/-), Leptin 을 투여한 군 (NESFATN-1 IgG/NESFATIN-1/Leptin : -/-/+), Leptin 과 항 NESFATIN-1 항체를 투여한 군 (NESFATN-1 IgG/NESFATIN-1/Leptin : +/-/+) 의 투여 후 1 시간의 섭이량을 나타낸 그래프이다. 대조군 (NESFATN-1 IgG/NESFATIN-1/Leptin : -/-/-) 과 비교하여 NESFATIN 만 투여한 군에서는 섭이량이 유의 (p<0.01) 하게 감소하는 것에 대하여, NESFATIN-1 과 항 NESFATIN-1 항체를 투여한 군에서는 섭이량이 대조군과 동일한 정도까지 항진되는 효과가 관찰되었다. 그것에 대하여 Leptin 을 투여한 군에서도 섭이량이 감소하는 것이, Leptin 과 항 NESFATIN-1 항체를 투여한 군에서는 Leptin 에 의한 섭이량의 억제를 항진시키는 효과는 관찰되지 않았다. 이 성적으로부터, 항 NESFATIN-1 항체에 의한 섭식 항진 작용은 NESFATIN-1 의 효과를 특이적으로 억제하는 것에 의한다고 생각된다.
실시예 29 항 NESFATIN-1 항체의 결합 특이성의 검토
실시예 28 에 있어서는 항 NESFATIN-1 항체의 뇌내 투여에 있어서 NESFATIN-1 의 작용을 특이적으로 저해하는 것에 대해서 검토했는데, 또한 현재 상황에서 알려져 있는 섭식 조절 작용이 있는 것이 알려져 있는 인자와의 결합성을 래트의 뇌 추출물을 사용한 웨스턴 블로팅법으로 검토하였다.
웨스턴 블로팅에 의한 해석은 실시예 3 에 나타낸 방법에 있어서, 1 차 항체를 항 NAP 폴리클로날 항체로부터 항 NESFATIN-1 항체로 치환한 방법으로 실시하였다. 또한 항 NESFATIN-1 항체의 결합 특이성을 조사하는 실험으로서, 웨스턴 블로팅으로 멤브레인에 반응시키기 전에, 항 NESFATIN-1 항체를 NAP1-Ab 펩티드 (실시예 10), 및 섭식 조절 작용이 알려져 있는 Leptin (Rat Leptin : R&D systems 사 598-LP-01M)·αMSH (Melanocyte Stimulating Hormone : 주식회사 펩티드 연구 소 4057-v)·CART (Rat Coaine- and Amphetamine-Regulated Transcript 55-102 : 주식회사 펩티드 연구소 4351-s)·NPY (Human, Rat Neuropeptide Y : 주식회사 펩티드 연구소 4158-v)·MCH (Human Melanin-Concentrating Hormone : 주식회사 펩티드 연구소 4369-v)·Orexin-A (Human, Rat, Mouse, Bovine Orexin-A : 주식회사 펩티드 연구소 4346-s) 의 각 펩티드를 항 NESFATIN-1 항체 1㎍ 당 각각 5㎍ 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 상기 방법으로 웨스턴 블로팅을 실시하여 밴드가 소실되는지를 검토하였다.
<결과>
도 27 의 A 는 래트의 뇌로부터의 단백질 추출액을 사용하여 항 NESFATIN-1 항체로 웨스턴 블로팅을 실시한 이미지를 나타내고 있다. 그 결과 분자량 47.5kd 의 NESFATIN 폴리펩티드에 상당하는 분자량일 때 밴드가 관찰되었다. 도 27 의 B 는 항 NESFATIN-1 항체와 각종 펩티드를 미리 반응시킨 후 상기와 동일하게 웨스턴 블로팅을 실시했을 때의 47.5kd 부근의 밴드 부근의 이미지를 나타내고 있다. 항 NESFATIN-1 항체를 NAP1-Ab 로 반응시킨 경우에는 47.5kd 의 밴드는 소실되고, 이것은 항 NESFATIN-1 항체가 먼저 NAP1-Ab 펩티드와 반응함으로써 NESFATIN 과의 결합 부위가 블록된 것을 나타내고 있다. 그것에 대하여 Leptin, αMSH, CART, NPY, MCH, Orexin-A 와 반응시킨 경우, 또한 펩티드를 항 NESAFATIN-1 항체 반응시키지 않은 경우에는 47.5kd 의 밴드는 소실되지 않았다. 이 성적으로부터 항 NESFATIN-1 항체는 NESFATIN 과 특이적으로 결합하는데, Leptin, αMSH, CART, NPY, MCH, Orexin-A 등의 다른 섭식 관련 펩티드와는 반응하 지 않는 것이 나타났다.
실시예 30 래트의 연수에서의 NESFATIN 의 발현 부위의 검토
실시예 4 에 있어서는 래트 뇌의 시상하부 부근에서의 발현에 대해서 면역 조직 화학적 해석을 실시하여 검토하였다. 또한 래트의 연수 부근에 있어서의 NESFATIN 의 발현을 검토하기 위해, 동일하게 면역 조직 화학적 해석을 실시하였다.
8 주령의 Wistar 계 래트 (닛폰 SLC 로부터 구입) 를 사용하고, 실시예 4 와 동일하게 조제한 표본으로부터 연수를 포함하는 부분의 뇌 조직 절편을 제조하였다. 또한 면역 조직 화학 염색 방법도 실시예 4 와 동일하게 실시하였다. 또한, NAP 펩티드에 대한 항체 (1㎍/㎖) 에 NAP 펩티드 (실시예 3) 를 100㎍/㎖ 가 되도록 첨가하고, 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 그 항체를 사용하여 면역 조직 화학 염색을 실시하는 실험도 실시하였다.
<결과>
도 28 의 A 는 연수를 포함하는 뇌 조직에서의 면역 조직 화학 염색의 이미지를 나타내고 있다. 연수를 포함하는 조직에 있어서의 면역 조직 염색에 있어서는, STN : 고속핵에서 염색이 관찰되고, NEFA 폴리펩티드의 발현이 관찰되었다. 도 28 의 B 는 NAP 펩티드에 대한 항체를 NAP 펩티드와 미리 반응시키고 나서 면역 조직 염색을 실시한 이미지를 나타내고 있다. 항 NAP 펩티드 항체를 NAP 펩티드와 미리 반응시킴으로써, 도 28 의 A 에서 관찰된 염색이 소실되므로, 이 면역 조직 염색에 있어서는 NEFA 폴리펩티드가 특이적으로 염색되어 있는 것이 나타 났다. 이 성적으로부터, 내장성 감각 신경핵이고, 섭식 조절 기구에 관여하고 있다고 여겨지는 고속핵에서도 NESFATIN 이 발현하고 있는 것이 나타났다.
실시예 31 정상 및 렙틴 저항성 비만 래트에 대한 트로글리타존 투여와 혈중 렙틴 및 뇌내 NESFATIN 발현에 대한 영향
실시예 2 에 있어서는 당뇨병 치료약으로서 사용되고 있던 PPARγ 애고니스트인 트로글리타존에 의한 배양 세포에서의 NESFATIN (NEFA) 유전자의 유도에 대해서 검토하였다. 또한, 트로글리타존에 의한 NESFATIN 의 발현 유도를 검토하기 위해, 트로글리타존을 래트에 주고, 뇌내에서의 NESFATIN 유도에 대해서 검토하였다. 또한, 동일하게 섭식 조절을 실시하는 인자로서 알려진 렙틴의 혈중 농도에 대해서도 검토하였다. 검토는 정상 Zucker 래트 (Zucker+/+ : Lean) 와 렙틴 저항성 비만 모델 동물인 Zucker fa/fa 를 사용하여 실시하였다.
동물은 8 주령의 수컷 Zucker fa/fa (Zucker) 계 래트 및 대조 동물로서 Zucker+/+ (Lean) 계 래트를 닛폰 찰즈·리버로부터 구입하고, 구입 후 오전 6 시부터 오후 6 시까지의 12 시간을 명기, 오후 6 시부터 다음날 아침 오전 6 시를 12 시간의 암기의 주기로, 분말 사료 (닛폰 쿠레아사 CE-2) 를 주고, 22℃ 에서 사육하였다. 구입한 래트는 1 주일 이상 예비 사육을 실시한 후, 9 내지 10 주령의 개체 중에서 체중이 200∼250g 의 개체를 선별하여 각 군 6 마리씩 실험에 사용하였다. 트로글리타존 (TGZ : 산쿄 주식회사) 의 투여는 0.2% 의 함량으로 분말 사료 중에 혼합하고, 자유 섭식시켜 실시하였다. 또한 트로글리타존을 투여하지 않은 대조로는 통상의 분말 사료만으로 사육한 래트를 사용하였다. 트로글 리타존을 함유하는 사료 또는 통상의 사료를 10 일간 계속 주어 사육한 후, 동물은 체중을 측정하고, 도살하여 전혈을 채혈하였다. 채취한 래트의 혈액으로부터는 혈청을 분리하고, 시판되는 ELISA 키트 (주식회사 야나이하라 연구소 YK050) 를 사용하고, 그 첨부한 프로토콜에 따라서 렙틴의 농도를 측정하였다. 또한, 도살된 래트로부터 뇌를 취출하고, 실시예 3 과 동일한 방법으로 웨스턴 블로팅을 실시하고, 그 밴드의 농도를 이미지 애널라이저 (Imaging Research Inc. MCIDTM Basic) 로 해석하고, 그 밴드의 발색 정도를 상대값 (Units) 으로서 나타냈다.
<결과>
도 29 의 A 는 정상 래트 (Lean) 와 Zucker fa/fa 래트 (Zucker) 에 트로글리타존을 함유하는 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : +) 과 함유하지 않은 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : -) 에 있어서의 체중을 나타낸 그래프이다. 정상 래트에 있어서도 Zucker fa/fa 래트에 있어서도, 트로글리타존을 준 것에 의한 체중의 현저한 차이는 보이지 않았다. 또한, 트로글리타존을 줬는지의 여부에 관계 없이, 정상 래트에 대하여 Zucker fa/fa 래트에서는 유의 (P<0.01) 하게 체중이 무거웠다.
도 29 의 B 는 정상 래트 (Lean) 와 Zucker fa/fa 래트 (Zucker) 에 트로글리타존을 함유하는 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : +) 과 함유하지 않은 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : -) 에 있어서의 혈중의 렙틴 농도를 나타낸 그래프이다. 정상 래트에 있어서도 Zucker fa/fa 래트에 있어서도, 트로글리타존을 준 것에 의해 혈중의 렙틴 농도는 유의 (p<0.05) 하게 저하되는 결과가 얻어졌다. 또한, 트로글 리타존을 줬는지의 여부에 관계 없이, 정상 래트에 대하여 Zucker fa/fa 래트에서는 유의 (p<0.01) 하게 혈중의 렙틴 농도가 높다는 결과가 얻어졌다.
도 29 의 C 는 정상 래트 (Lean) 와 Zucker fa/fa 래트 (Zucker) 에 트로글리타존을 함유하는 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : +) 과 함유하지 않은 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : -) 으로부터 뇌의 단백 추출 샘플을 제조하여, 웨스턴 블로팅으로 얻어진 밴드의 농도를 상대값으로서 나타낸 그래프이다. 정상 래트에 있어서는 트로글리타존을 함유하는 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : +) 과 함유하지 않은 사료를 섭이시킨 군 (TGZ : -) 사이에서는 뇌에서 발현하고 있는 NESFATIN 의 발현량에 차이는 보이지 않았다. 그것에 대하여 Zucker fa/fa 래트에서는 트로글리타존을 준 것에 의해, 뇌내의 NESFATIN 의 발현량이 유의 (p<0.01) 하게 증대되는 결과가 얻어졌다. 또한, 트로글리타존을 줬는지의 여부에 관계 없이, 정상 래트에 대하여 Zucker fa/fa 래트에서는 유의 (p<0.01) 하게 뇌내의 NESFATIN 의 발현량이 높다는 결과가 얻어졌다.
이상의 성적으로부터, 당뇨병 치료약으로서 사용되고 있던 트로글리타존은 정상 동물에서는 뇌내의 NESFATIN 을 유도하지 않지만, 렙틴 저항성의 병태를 나타내는 모델 동물에서는 뇌내에서의 NESFATIN 의 발현을 유도할 수 있는 것으로 생각된다. 그것에 대하여 렙틴은 트로글리타존에 의해서는 정상 동물, 병태 동물 모두 혈중 농도의 상승은 얻어지지 않고, 반대로 혈중 농도가 내려가는 것으로 생각된다.
실시예 32 시상하부 조직 추출물의 HPLC 획분에 있어서의 NESFAIN-1 펩티드 의 검출
실시예 21 에 있어서는 시상하부 조직으로부터 추출한 펩티드를 시료로 하여, HPLC 에 의한 분획을 실시하고, 또한 그 획분을 사용하여 경합 EIA 측정계에 의해 NESFATIN-1 의 존재를 검토하였다. 또한, 이 획분에 있어서 검출되어 있는 펩티드가 NESFATIN-1 에 상당하는 분자인 것을 검토하기 위해, 시상하부 조직 추출물의 HPLC 획분을 웨스턴 블로팅법으로 해석하였다.
시상하부 조직 추출물의 HPLC 획분의 제조는 실시예 21 과 동일하게 실시하고, 그 획분 번호 (Fraction #) 43∼47 의 획분을 동결 건조시켰다. 동결 건조 후의 샘플은 100㎕ 의 PBS 에 용해시키고, 그 중의 20㎕ 를 사용하여 12% 폴리아크릴아미드 겔에 의한 SDS-PAGE 를 실시하고, 실시예 3 과 동일한 방법으로 항 NESFATIN-1 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 실시하였다.
<결과>
도 30 의 A 는 래트의 시상하부로부터의 펩티드 추출물을 HPLC 로 분획하여 얻어진 획분 번호 45 의 웨스턴 블로팅의 이미지를 나타내고 있다. 웨스턴 블로팅으로 검출한 밴드는 약 9.7kd 의 분자량이고, 이것은 리콤비난트로 제조한 NESFATIN-1 펩티드의 분자량과 거의 일치하였다 (실시예 10, 도 9C). 도 30 의 B 는 래트의 시상하부로부터의 펩티드 추출물을 HPLC 로 분획하여 얻어진 획분 번호 43∼47 의 웨스턴 블로팅의 이미지에 있어서의 9.7kd 부근의 분자량에 있어서의 부분의 이미지를 나타내고 있다. 9.7kd 의 밴드는 획분 번호 45 에서 가장 강하게 관찰되고, 이 결과는 실시예 21 에 있어서 래트의 시상하부로부터의 펩티드 추출물을 HPLC 로 분획하여 얻어진 획분을 경합 EIA 법으로 정량했을 때의 패턴 (도 19B 의 b-1) 과 일치하였다.
이상의 성적으로부터 래트의 시상하부에는 NESFTATIN-1 에 상당하는 분자가 존재하고, 실시예 21 의 방법으로 분획하여 경합 EIA 법 및/또는 웨스턴 블로팅법으로 검출함으로써 NESFATIN-1 에 상당하는 분자를 검출할 수 있는 것이 나타났다.
실시예 33 래트 시상하부 영역에서의 면역 조직 화학 염색의 특이성의 검토
실시예 4 에 있어서 섭식 조절에 관련되는 래트 뇌의 시상하부에서의 NEFA 발현 부위를 해석하기 위해, 래트의 뇌의 절편을 사용한 면역 조직 화학적 해석을 실시하였다. 이 염색이 NESFATIN 특이적인 것인지를 검토하기 위해, 섭식 조절 작용이 공지되어 있는 펩티드와 항체의 결합성을 고려하여, 다시 면역 조직 화학적 해석을 실시하였다.
실시예 4 와 동일한 방법으로 래트 뇌의 궁상핵 및 실방핵을 각각 포함하는 조직 절편으로 면역 조직 염색을 실시했는데, 1 차 항체로서 항 NAP 폴리클로날 항체 대신에 항 NESFATIN-1 항체 (NESFATIN-1 IgG : 실시예 10) 를 사용하였다. 또한 1 차 항체를 조직 표본과 반응시키기 전에, 항 NESFATIN-1 항체를 NESFATIN-1 펩티드 (실시예 10), 및 섭식 조절 작용이 알려져 있는 Leptin (Rat Leptin : R&D systems 사 598-LP-01M)·αMSH (Melanocyte Stimulating Hormone : 주식회사 펩티드 연구소 4057-v)·CART (Rat Coaine- and Amphetamine-Regulated Transcript 55-102 : 주식회사 펩티드 연구소 4351-s)·NPY (Human, Rat Neuropeptide Y : 주식회사 펩티드 연구소 4158-v) 의 각 펩티드를 항 NESFATIN-1 항체 1㎍ 당 각각 5㎍ 첨 가하여 실온에서 1 시간 반응시킨 후, 면역 조직 화학 염색에 사용함으로써 항체의 반응 특이성을 검증하였다.
<결과>
도 31 의 A 는 래트 뇌의 궁상핵을 포함하는 조직 절편에 있어서 항 NESFATIN-1 항체로 면역 조직 화학 염색을 실시한 결과, 및 1 차 항체를 각종 펩티드와 미리 반응시킨 후 면역 조직 화학 염색을 실시한 결과를 나타내고 있다. 도 31 의 A 의 a-1 은 래트 뇌의 궁상핵이 항 NESFATIN-1 항체로 면역 염색되는 것, 또한 a-2 에서는 항 NESFATIN-1 항체를 NESFATIN-1 펩티드와 미리 반응시켰을 때에는 그 염색이 소실되므로, 항 NESFATIN-1 항체는 궁상핵에서 발현하고 있는 NESFATIN 을 검출하고 있는 것이 나타났다. 그것에 대하여, 항 NESFATIN-1 항체를 각각 Leptin (도 31 의 A 의 a-3), αMSH (도 31 의 A 의 a-4), CART (도 31 의 A 의 a-5), NPY (도 31 의 A 의 a-6) 에서는 궁상핵에서의 면역 염색은 소실되지 않고, 이들 펩티드는 항 NESFATIN-1 항체에 결합되지 않는 것이 나타나고, 면역 조직 화학 염색에 있어서 그 항체가 이들 펩티드에 반응하지 않는 것이 나타났다.
도 31 의 B 는 래트 뇌의 실방핵을 포함하는 조직 절편에 있어서 항 NESFATIN-1 항체로 면역 조직 화학 염색을 실시한 결과, 및 1 차 항체를 각종 펩티드와 미리 반응시킨 후에 면역 조직 화학 염색을 실시한 결과를 나타내고 있다. 도 31B 의 b-1 은 래트 뇌의 궁상핵이 항 NESFATIN-1 항체로 면역 염색되는 것, 또한 b-2 에서는 항 NESFATIN-1 항체를 NESFATIN-1 펩티드와 미리 반응시켰을 때에는 그 염색이 소실되므로, 항 NESFATIN-1 항체는 실방핵에서 발현하고 있는 NESFATIN 을 검출하고 있는 것이 나타났다. 그것에 대하여, 항 NESFATIN-1 항체를 각각 Leptin (도 31 의 B 의 b-3), αMSH (도 3 의 B 의 b-4), CART (도 31 의 B 의 b-5), NPY (도 31 의 B 의 b-6) 에서는 궁상핵에서의 면역 염색은 소실되지 않고, 이들 펩티드는 항 NESFATIN-1 항체에 결합되지 않는 것이 나타나고, 면역 조직 화학 염색에 있어서 그 항체가 이들 펩티드에 반응하지 않는 것이 나타났다.
이상의 성적으로부터 항 NESFATIN-1 항체를 사용한 면역 조직 화학 염색에 있어서는 특이적으로 NESFATIN 의 발현을 검출하고 있고, 래트 뇌내에서 적어도 시상하부 영역의 궁상핵 및 실방핵에서 NESFATIN 이 발현하고 있는 것이 나타났다.
실시예 34 래트 뇌실 내에 대한 NESFATIN-1 의 연속적 투여에 의한 지방 조직 중량에 대한 작용의 검토
NESFATIN-1 의 지방 조직의 양에 대한 영향을 조사하기 위해, 래트의 뇌실 내에 지속적으로 NESFATIN-1 을 투여하여 지방 조직 등의 중량의 변화를 해석하였다.
NESFATIN-1 (1 일당 5pmol) 또는 생리 식염수만 (대조군) 을 래트의 제 3 뇌실 내에 삼투압 펌프를 사용하여 10 일간 연속적으로 투여하였다 (각 군 5 마리 및 4 마리의 래트를 사용). 래트에 대한 삼투압 펌프에 의한 뇌실내 투여는 실시예 13 과 동일한 방법으로 실시하였다.
10 일간의 NESFATIN-1 또는 생리 식염수만 투여한 후, 각 래트를 도살하고, 해부하여 복부 피하 지방 조직, 정소상체 지방 조직, 장간막 지방 조직, 후복막 지방 조직 (이상 백색 지방 조직), 견갑골 사이의 갈색 지방 조직을 모두 절단하여 중량을 측정하였다. 또한 양측의 뒷다리의 비복근도 채취하여 중량을 측정하였다. 측정한 조직 중량으로부터는 각 개체의 체중과의 비를 구하였다 (조직 중량/체중 ㎎/g). 또, 유의차 검정에는 analysis of variance 를 사용하였다.
<결과>
도 32 는 10 일간의 NESFATIN-1 또는 생리 식염수만 투여한 래트로부터 취득한 각 지방 조직 (A∼E) 및 비복근 (F) 의 중량과 체중의 중량비를 구한 결과의 그래프이다. 복부 피하 지방 조직 (도 32 의 A), 정소상체 지방 조직 (도 32 의 B), 장간막 지방 조직 (도 32 의 C) 에 있어서는 생리 식염수만을 투여한 대조군과 비교하여, NESFATIN-1 을 투여한 군에 있어서는 유의하게 체중당 조직 중량비의 저하가 관찰되었다. 또한 후복막 지방 조직 (도 32 의 D) 에 있어서는 대조군과 비교하여 NESFATIN-1 투여군에서는 체중당 조직 중량비가 저하되는 경향이 보였지만, 유의한 차이는 관찰되지 않았다. 또한 갈색 지방 조직 (도 32 의 E) 및 비복근 (도 32 의 F) 에 있어서는 대조군과 NESFATIN-1 투여군 사이에서 체중당 조직 중량비의 유의한 차이는 관찰되지 않았다.
이상의 성적으로부터, NESFATIN-1 은 백색 지방 조직의 체중당 조직 중량비, 즉 체지방률을 저하시키는 효과가 있는 것이 나타났다. 또한 갈색 지방 조직이나 근조직에 대해서는 그 체중당 조직 중량비에는 영향을 미치지 않는 것도 나타났다.
실시예 35 마우스 복강 내에 대한 NESFATIN-1 투여에 의한 혈액 생화학 파라미터에 대한 영향의 검토
NESFATIN-1 로 나타난 섭식 억제 활성, 체중 증가 억제 활성, 지방 조직량 저하 활성이 혈당 (혈중 글루코오스값) 이나 지질 관련 파라미터 (콜레스테롤값, 트리글리세리드값) 의 변동을 수반하는지에 대하여 검토하였다.
실험 동물은 7 주령의 수컷 C57BL/6J 계 마우스를 닛폰 쿠레아 (주) 로부터 구입하고, 구입 후 오전 6 시부터 오후 6 시까지의 12 시간을 명기, 오후 6 시부터 다음날 아침 오전 6 시를 12 시간의 암기의 주기로, 펠릿 사료 (닛폰 쿠레아사 CE-2) 를 자유 섭식시키고, 22℃ 에서 사육하였다.
C57BL/6J 마우스의 복강 내에 실시예 16 에서 제조한 리콤비난트의 마우스 NESFATIN-1 을 100㎕ 의 생리 식염수 10nmol 의 양을 함유하는 형태로 용해시킨 것을 사용하고, 컨트롤의 시료로는 생리 식염수 (Saline) 만을 사용하였다. 시료는 26G 의 주사바늘을 부착한 투베르쿨린 주사기로 각 마우스 (각 군 5 마리) 의 복강에 100㎕ 씩 단회 투여하고, 투여 시간은 암기에 들어가기 직전 (오후 6 시) 에 실시하였다.
투여한 각 마우스는 개별 케이지에 넣고, 투여 후 0∼3 시간동안 감소한 펠릿 사료의 중량을 측정함으로써 섭식량을 측정하였다. 또한 투여 후 3 시간 후에 각 마우스를 단두 도살하여 전혈 채혈하고, 혈청을 분취하였다. 그 혈청에 대해서 글루코오스 함량, 총 콜레스테롤 함량, 트리글리세리드 함량을 시판되는 측정 시약을 사용하여 측정하였다 (쿄와 메딕스 데미타나 L GLUII, 데미타나 L TCII, 데미타나 L TGII).
또, 유의차 검정에는 analysis of variance 를 사용하였다.
<결과>
도 33 은 마우스 복강 내에 NESFATIN-1 또는 생리 식염수만을 투여했을 때의 섭이량, 혈중 글루코오스 함량, 총 콜레스테롤 함량, 트리글리세리드 함량의 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
NESFATIN-1 의 투여에 의해 섭식량은 대조군과 비교하여 유의하게 저하되어 있었다. 그것에 대하여 혈당값을 나타내는 혈중 글루코오스 함량 (도면 중 글루코오스), 또한 지질 관련 파라미터인 총 콜레스테롤 함량 (도면 중 콜레스테롤), 트리글리세리드 함량 (도면 중 트리글리세리드) 에 있어서는 NESFATIN-1 투여군에서는 대조군과 거의 차이가 보이지 않았다.
이상의 성적으로부터, NESFATIN-1 의 작용은 혈당값이나 혈중의 지질 관련 파라미터의 변동을 일으키지 않고 섭식 억제 활성, 체중 증가 억제 활성, 지방 조직량 저하 활성을 나타내는 것으로 생각된다.
본 발명에 의하면, PPARγ 애고니스트를 사용함으로써, 섭식 및 체중 조절에 관여하는 인자를 취득할 수 있다. 또, NESFATIN, NESFATIN-1 및/또는 NESFATIN-1M30 을 사용함으로써, 비만 또는 비만증, 신경성 과식증 등의 대사·섭식 장해에 관련되는 질환, 2 형 당뇨병, 내당능 이상, 고혈압, 고지혈증, 고요산혈증, 지방간, 심장 질환, 뇌혈관 질환, 수면시 무호흡 증후군, 변형성 관절증 등의 정형외과적 질환, 월경 이상, 악성 종양 등의 비만증에 관련되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다. 또한, 항체 등의 NESFATIN, NESFATIN-1 또는 NESFATIN-1M30 의 활성을 억제하는 물질을 사용함으로써, 수술 후 및/또는 암 환자에 있어서의 식욕 부진이나 거식증 등의 영양·섭식 장해에 관련되는 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Gunma University Teijin Pharma Limited <120> A Novel Physiologically Active Compound, NESFATIN, Related Compounds thereof and their Use <130> X <160> 38 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1263 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1263) <223> <400> 1 atg agg tgg agg acc atc ctg cta cag tat tgc ttt ctc ttg att aca 48 Met Arg Trp Arg Thr Ile Leu Leu Gln Tyr Cys Phe Leu Leu Ile Thr 1 5 10 15 tgt tta ctt act gct ctt gaa gct gtg cct att gac ata gac aag aca 96 Cys Leu Leu Thr Ala Leu Glu Ala Val Pro Ile Asp Ile Asp Lys Thr 20 25 30 aaa gta caa aat att cac cct gtg gaa agt gcg aag ata gaa cca cca 144 Lys Val Gln Asn Ile His Pro Val Glu Ser Ala Lys Ile Glu Pro Pro 35 40 45 gat act gga ctt tat tat gat gaa tat ctc aag caa gtg att gat gtg 192 Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Asp Glu Tyr Leu Lys Gln Val Ile Asp Val 50 55 60 ctg gaa aca gat aaa cac ttc aga gaa aag ctc cag aaa gca gac ata 240 Leu Glu Thr Asp Lys His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Lys Ala Asp Ile 65 70 75 80 gag gaa ata aag agt ggg agg cta agc aaa gaa ctg gat tta gta agt 288 Glu Glu Ile Lys Ser Gly Arg Leu Ser Lys Glu Leu Asp Leu Val Ser 85 90 95 cac cat gtg agg aca aaa ctt gat gaa ctg aaa agg caa gaa gta gga 336 His His Val Arg Thr Lys Leu Asp Glu Leu Lys Arg Gln Glu Val Gly 100 105 110 agg tta aga atg tta att aaa gct aag ttg gat tcc ctt caa gat ata 384 Arg Leu Arg Met Leu Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ser Leu Gln Asp Ile 115 120 125 ggc atg gac cac caa gct ctt cta aaa caa ttt gat cac cta aac cac 432 Gly Met Asp His Gln Ala Leu Leu Lys Gln Phe Asp His Leu Asn His 130 135 140 ctg aat cct gac aag ttt gaa tcc aca gat tta gat atg cta atc aaa 480 Leu Asn Pro Asp Lys Phe Glu Ser Thr Asp Leu Asp Met Leu Ile Lys 145 150 155 160 gcg gca aca agt gat ctg gaa cac tat gac aag act cgt cat gaa gaa 528 Ala Ala Thr Ser Asp Leu Glu His Tyr Asp Lys Thr Arg His Glu Glu 165 170 175 ttt aaa aaa tat gaa atg atg aag gaa cat gaa agg aga gaa tat tta 576 Phe Lys Lys Tyr Glu Met Met Lys Glu His Glu Arg Arg Glu Tyr Leu 180 185 190 aaa aca ttg aat gaa gaa aag aga aaa gaa gaa gag tct aaa ttt gaa 624 Lys Thr Leu Asn Glu Glu Lys Arg Lys Glu Glu Glu Ser Lys Phe Glu 195 200 205 gaa atg aag aaa aag cat gaa aat cac cct aaa gtt aat cac cca gga 672 Glu Met Lys Lys Lys His Glu Asn His Pro Lys Val Asn His Pro Gly 210 215 220 agc aaa gat caa cta aaa gag gta tgg gaa gag act gat gga ttg gat 720 Ser Lys Asp Gln Leu Lys Glu Val Trp Glu Glu Thr Asp Gly Leu Asp 225 230 235 240 cct aat gac ttt gac ccc aag aca ttt ttc aaa tta cat gat gtc aat 768 Pro Asn Asp Phe Asp Pro Lys Thr Phe Phe Lys Leu His Asp Val Asn 245 250 255 agt gat gga ttc ctg gat gaa caa gaa tta gaa gcc cta ttt act aaa 816 Ser Asp Gly Phe Leu Asp Glu Gln Glu Leu Glu Ala Leu Phe Thr Lys 260 265 270 gag ttg gag aaa gta tat gac cct aaa aat gaa gag gat gat atg gta 864 Glu Leu Glu Lys Val Tyr Asp Pro Lys Asn Glu Glu Asp Asp Met Val 275 280 285 gaa atg gaa gaa gaa agg ctt aga atg agg gaa cat gta atg aat gag 912 Glu Met Glu Glu Glu Arg Leu Arg Met Arg Glu His Val Met Asn Glu 290 295 300 gtt gat act aac aaa gac aga ttg gtg act ctg gag gag ttt ttg aaa 960 Val Asp Thr Asn Lys Asp Arg Leu Val Thr Leu Glu Glu Phe Leu Lys 305 310 315 320 gcc aca gaa aaa aaa gaa ttc ttg gag cca gat agc tgg gag aca tta 1008 Ala Thr Glu Lys Lys Glu Phe Leu Glu Pro Asp Ser Trp Glu Thr Leu 325 330 335 gat cag caa cag ttc ttc aca gag gaa gaa cta aaa gaa tat gaa aat 1056 Asp Gln Gln Gln Phe Phe Thr Glu Glu Glu Leu Lys Glu Tyr Glu Asn 340 345 350 att att gct tta caa gaa aat gaa ctt aag aag aag gca gat gag ctt 1104 Ile Ile Ala Leu Gln Glu Asn Glu Leu Lys Lys Lys Ala Asp Glu Leu 355 360 365 cag aaa caa aaa gaa gag cta caa cgt cag cat gat caa ctg gag gct 1152 Gln Lys Gln Lys Glu Glu Leu Gln Arg Gln His Asp Gln Leu Glu Ala 370 375 380 cag aag ctg gaa tat cat cag gtc ata cag cag atg gaa caa aaa aaa 1200 Gln Lys Leu Glu Tyr His Gln Val Ile Gln Gln Met Glu Gln Lys Lys 385 390 395 400 tta caa caa gga att cct cca tca ggg cca gct gga gaa ttg aag ttt 1248 Leu Gln Gln Gly Ile Pro Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Leu Lys Phe 405 410 415 gag cca cac att taa 1263 Glu Pro His Ile 420 <210> 2 <211> 420 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Arg Trp Arg Thr Ile Leu Leu Gln Tyr Cys Phe Leu Leu Ile Thr 1 5 10 15 Cys Leu Leu Thr Ala Leu Glu Ala Val Pro Ile Asp Ile Asp Lys Thr 20 25 30 Lys Val Gln Asn Ile His Pro Val Glu Ser Ala Lys Ile Glu Pro Pro 35 40 45 Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Asp Glu Tyr Leu Lys Gln Val Ile Asp Val 50 55 60 Leu Glu Thr Asp Lys His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Lys Ala Asp Ile 65 70 75 80 Glu Glu Ile Lys Ser Gly Arg Leu Ser Lys Glu Leu Asp Leu Val Ser 85 90 95 His His Val Arg Thr Lys Leu Asp Glu Leu Lys Arg Gln Glu Val Gly 100 105 110 Arg Leu Arg Met Leu Ile Lys Ala Lys Leu Asp Ser Leu Gln Asp Ile 115 120 125 Gly Met Asp His Gln Ala Leu Leu Lys Gln Phe Asp His Leu Asn His 130 135 140 Leu Asn Pro Asp Lys Phe Glu Ser Thr Asp Leu Asp Met Leu Ile Lys 145 150 155 160 Ala Ala Thr Ser Asp Leu Glu His Tyr Asp Lys Thr Arg His Glu Glu 165 170 175 Phe Lys Lys Tyr Glu Met Met Lys Glu His Glu Arg Arg Glu Tyr Leu 180 185 190 Lys Thr Leu Asn Glu Glu Lys Arg Lys Glu Glu Glu Ser Lys Phe Glu 195 200 205 Glu Met Lys Lys Lys His Glu Asn His Pro Lys Val Asn His Pro Gly 210 215 220 Ser Lys Asp Gln Leu Lys Glu Val Trp Glu Glu Thr Asp Gly Leu Asp 225 230 235 240 Pro Asn Asp Phe Asp Pro Lys Thr Phe Phe Lys Leu His Asp Val Asn 245 250 255 Ser Asp Gly Phe Leu Asp Glu Gln Glu Leu Glu Ala Leu Phe Thr Lys 260 265 270 Glu Leu Glu Lys Val Tyr Asp Pro Lys Asn Glu Glu Asp Asp Met Val 275 280 285 Glu Met Glu Glu Glu Arg Leu Arg Met Arg Glu His Val Met Asn Glu 290 295 300 Val Asp Thr Asn Lys Asp Arg Leu Val Thr Leu Glu Glu Phe Leu Lys 305 310 315 320 Ala Thr Glu Lys Lys Glu Phe Leu Glu Pro Asp Ser Trp Glu Thr Leu 325 330 335 Asp Gln Gln Gln Phe Phe Thr Glu Glu Glu Leu Lys Glu Tyr Glu Asn 340 345 350 Ile Ile Ala Leu Gln Glu Asn Glu Leu Lys Lys Lys Ala Asp Glu Leu 355 360 365 Gln Lys Gln Lys Glu Glu Leu Gln Arg Gln His Asp Gln Leu Glu Ala 370 375 380 Gln Lys Leu Glu Tyr His 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ctg gag gaa ttc ctg aga 960 Ile Asp Asn Asn Lys Asp Arg Leu Val Thr Leu Glu Glu Phe Leu Arg 305 310 315 320 gct aca gag aag aaa gaa ttc ctg gag cct gat agc tgg gag aca ctg 1008 Ala Thr Glu Lys Lys Glu Phe Leu Glu Pro Asp Ser Trp Glu Thr Leu 325 330 335 gac cag caa cag tta ttc acc gag gac gag ctt aaa gag tat gaa agc 1056 Asp Gln Gln Gln Leu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Lys Glu Tyr Glu Ser 340 345 350 att att gct atc caa gag aac gag ctt aag aag agg gcg gaa gag ctg 1104 Ile Ile Ala Ile Gln Glu Asn Glu Leu Lys Lys Arg Ala Glu Glu Leu 355 360 365 cag aaa cag aag gag gat ctg cag cgg cag cac gac cac ctc gag gcg 1152 Gln Lys Gln Lys Glu Asp Leu Gln Arg Gln His Asp His Leu Glu Ala 370 375 380 cag aag cag gag tat cat cag gcc gtc cag cac ctg gaa cag aag aaa 1200 Gln Lys Gln Glu Tyr His Gln Ala Val Gln His Leu Glu Gln Lys Lys 385 390 395 400 ctt caa caa ggc att gct cca tca ggg cca gcg gga gag ctg aag ttt 1248 Leu Gln Gln Gly Ile Ala Pro Ser Gly Pro Ala Gly Glu Leu Lys Phe 405 410 415 gag cca cac aca 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tgaagaggat 780 gatatggtag aaatggaaga agaaaggctt agaatgaggg aacatgtaat gaatgaggtt 840 gatactaaca aagacagatt ggtgactctg gaggagtttt tgaaagccac agaaaaaaaa 900 gaattcttgg agccagatag ctgggagaca ttagatcagc aacagttctt cacagaggaa 960 gaactaaaag aatatgaaaa tattattgct ttacaagaaa atgaacttaa gaagaaggca 1020 gatgagcttc agaaacaaaa agaagagcta caacgtcagc atgatcaact ggaggctcag 1080 aagctggaat atcatcaggt catacagcag atggaacaaa aaaaattaca acaaggaatt 1140 cctccatcag ggccagctgg agaattgaag tttgagccac acatttaa 1188 <210> 11 <211> 1191 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> gene <222> (1)..(1191) <223> <400> 11 gttcctatcg atgtggacaa gaccaaagta cacaacactg agccagtgga aaatgcaagg 60 atagagccac cagatactgg actttattat gatgaatacc tcaagcaagt gattgaagtc 120 ttggaaacag atccacattt cagagaaaag ctccagaaag cagacataga ggagataagg 180 agcgggaggc tgagtcaaga gctggactta gtaagtcaca aagtgaggac gagactggat 240 gagctgaaga ggcaagaagt aggaagactg cggatgctca tcaaagctaa gctggatgcc 300 cttcaagaca ctggcatgaa tcaccacctt cttctgaagc agtttgaaca 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agataaggag cgggaggctg agtcaagagc tggacttagt aagtcacaaa 180 gtgaggacga gactggatga gctgaagagg caagaagtag gaagactgcg gatgctcatc 240 aaagctaagc tggatgccct tcaagacact ggcatgaatc accaccttct tctgaagcag 300 tttgaacacc tgaaccacca gaatcctaac acatttgaat ccagagattt ggatatgcta 360 atcaaagcag ctaccgcgga tctggagcaa tatgaccgga ctcggcatga agagtttaag 420 aagtacgaga tgatgaagga acacgagcgg agagagtatt taaaaacgct gagtgaggag 480 aagaggaaag aagaagagtc taagtttgaa gagatgaaga ggaagcacga agaccacccc 540 aaagttaatc atcccggaag caaaga 566 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> gene <222> (1)..(20) <223> <400> 22 ccagtggaaa atgcaaggat 20 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> gene <222> (1)..(21) <223> <400> 23 tctttgcttc cgggatgatt a 21 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Synthetic <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(13) <223> <400> 24 His Leu Asn His Gln Asn Pro Asp Thr Phe Glu Ser Cys 1 5 10 <210> 25 <211> 621 <212> PRT <213> Synthetic <220> <221> PROPEP <222> (1)..(621) <223> <400> 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tacatgatgt taacaacgat ggattcctgg atgaacaaga attagaagca 240 ctattcacaa gagagttgga gaaagtgtat aacccacaaa atgcagagga cgatatgata 300 gaaatggaag aggagaggct caggatgaga gaacacgtca tgagtgagat tgataacaac 360 aaagaccgat tggtgactct ggaggaattc ctgagagcta cagagaagaa agaattcctg 420 gagcctgata gctgggagac actggaccag caacagttat tcaccgagga cgagcttaaa 480 gagtatgaaa gcattattgc tatccaagag aacgagctta agaagagggc ggaagagctg 540 cagaaacaga aggaggatct gcagcggcag cacgaccacc tcgaggcgca gaagcaggag 600 tatcatcagg ccgtccagca cctggaacag aagaaacttc aacaaggcat tgctccatca 660 gggccagcgg gagagctgaa gtttgagcca cgtatgtaa 699 <210> 55 <211> 313 <212> PRT <213> Synthetic <400> 55 Met Gln Glu Val Gly Arg Leu Arg Met Leu Ile Lys Ala Lys Leu Asp 1 5 10 15 Ala Leu Gln Asp Thr Gly Met Asn His His Leu Leu Leu Lys Gln Phe 20 25 30 Glu His Leu Asn His Gln Asn Pro Asp Thr Phe Glu Ser Lys Asp Leu 35 40 45 Asp Met Leu Ile Lys Ala Ala Thr Ala Asp Leu Glu Gln Tyr Asp Arg 50 55 60 Thr Arg His Glu Glu Phe Lys Lys Tyr Glu Met Met Lys Glu 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gcg gag gac atc 240 Asp Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala Ala Asn Ala Glu Asp Ile 65 70 75 80 aag agc ggg aag ctg agc cga gag ctg gac ttt gtc agc cac cac gtc 288 Lys Ser Gly Lys Leu Ser Arg Glu Leu Asp Phe Val Ser His His Val 85 90 95 cgc acc aag ctg gat gag ctc aag cga cag gag gtg tca cgg ctg cgg 336 Arg Thr Lys Leu Asp Glu Leu Lys Arg Gln Glu Val Ser Arg Leu Arg 100 105 110 atg ctg ctc aag gcc aag atg gac gcc gag cag gat ccc aat gta cag 384 Met Leu Leu Lys Ala Lys Met Asp Ala Glu Gln Asp Pro Asn Val Gln 115 120 125 gtg gat cat ctg aat ctc ctg aaa cag ttt gaa cac ctg gac cct cag 432 Val Asp His Leu Asn Leu Leu Lys Gln Phe Glu His Leu Asp Pro Gln 130 135 140 aac cag cat aca ttc gag gcc cgc gac ctg gag ctg ctg atc cag acg 480 Asn Gln His Thr Phe Glu Ala Arg Asp Leu Glu Leu Leu Ile Gln Thr 145 150 155 160 gcc acc cgg gac ctt gcc cag tac gac gca gcc cat cat gaa gag ttc 528 Ala Thr Arg Asp Leu Ala Gln Tyr Asp Ala Ala His His Glu Glu Phe 165 170 175 aag cgc tac gag atg ctt aag gaa cac gag aga cgg cgt tat ctg gag 576 Lys Arg Tyr Glu Met Leu Lys Glu His Glu Arg Arg Arg Tyr Leu Glu 180 185 190 tca ctg gga gag gag cag aga aag gag gcg gag agg aag ctg gaa gag 624 Ser Leu Gly Glu Glu Gln Arg Lys Glu Ala Glu Arg Lys Leu Glu Glu 195 200 205 caa cag cgc cgg cac cgc gag cac cct aaa gtc aac gtg cct ggc agc 672 Gln Gln Arg Arg His Arg Glu His Pro Lys Val Asn Val Pro Gly Ser 210 215 220 caa gcc cag ttg aag gag gtg tgg gag gag ctg gat gga ctg gac ccc 720 Gln Ala Gln Leu Lys Glu Val Trp Glu Glu Leu Asp Gly Leu Asp Pro 225 230 235 240 aac agg ttt aac ccc aag acc ttc ttc ata ctg cat gat atc aac agt 768 Asn Arg Phe Asn Pro Lys Thr Phe Phe Ile Leu His Asp Ile Asn Ser 245 250 255 gat ggt gtc ctg gat gag cag gag ctg gag gca ctc ttc acc aag gag 816 Asp Gly Val Leu Asp Glu Gln Glu Leu Glu Ala Leu Phe Thr Lys Glu 260 265 270 ctg gag aaa gtg tac gac cca aag aat gag gag gac gac atg cgg gag 864 Leu Glu Lys Val Tyr Asp Pro Lys Asn Glu Glu Asp Asp Met Arg Glu 275 280 285 atg gag gag gag cga ctg cgc atg cgg gag cat gtg atg aag aat gtg 912 Met Glu Glu Glu Arg Leu Arg Met Arg Glu His Val Met Lys Asn Val 290 295 300 gac acc aac cag gac cgc ctc gtg acc ctg gag gag ttc ctc gca tcc 960 Asp Thr Asn Gln Asp Arg Leu Val Thr Leu Glu Glu Phe Leu Ala Ser 305 310 315 320 act cag agg aag gag ttt ggg gac acc ggg gag ggc tgg gag aca gtg 1008 Thr Gln Arg Lys Glu Phe Gly Asp Thr Gly Glu Gly Trp Glu Thr Val 325 330 335 gag atg cac cct gcc tac acc gag gaa gag ctg agg cgc ttt gaa gag 1056 Glu Met His Pro Ala Tyr Thr Glu Glu Glu Leu Arg Arg Phe Glu Glu 340 345 350 gag ctg gct gcc cgg gag gca gag ctg aat gcc aag gcc cag cgc ctc 1104 Glu Leu Ala Ala Arg Glu Ala Glu Leu Asn Ala Lys Ala Gln Arg Leu 355 360 365 agc cag gag aca gag gct cta ggg cgg tcc cag ggc cgc ctg gag gcc 1152 Ser Gln Glu Thr Glu Ala Leu Gly Arg Ser Gln Gly Arg Leu Glu Ala 370 375 380 cag aag aga gag ctg cag cag gct gtg ctg cac atg gag cag cgg aag 1200 Gln Lys Arg Glu Leu Gln Gln Ala Val Leu His Met Glu Gln Arg Lys 385 390 395 400 cag cag cag cag cag cag caa ggc cac aag gcc ccg gct gcc cac cct 1248 Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gly His Lys Ala Pro Ala Ala His Pro 405 410 415 gag ggg cag ctc aag ttc cac cca gac aca gac gat gta cct gtc cca 1296 Glu Gly Gln Leu Lys Phe His Pro Asp Thr Asp Asp Val Pro Val Pro 420 425 430 gct cca gcc ggt gac cag aag gag gtg gac act tca gaa aag aaa ctt 1344 Ala Pro Ala Gly Asp Gln Lys Glu Val Asp Thr Ser Glu Lys Lys Leu 435 440 445 ctc gag cgg ctc cct gag gtt gag gtg ccc cag cat ctg tga 1386 Leu Glu Arg Leu Pro Glu Val Glu Val Pro Gln His Leu 450 455 460 <210> 84 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 84 Met Pro Pro Ser Gly Pro Arg Gly Thr Leu Leu Leu Leu Pro Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Leu Leu Leu Arg Ala Val Leu Ala Val Pro Leu Glu Arg Gly 20 25 30 Ala Pro Asn Lys Glu Glu Thr Pro Ala Thr Glu Ser Pro Asp Thr Gly 35 40 45 Leu Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val Ile Asp Val Leu Glu Thr 50 55 60 Asp Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala Ala Asn Ala Glu Asp Ile 65 70 75 80 Lys Ser Gly Lys Leu 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Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(1380) <223> <400> 87 atg cct acc tct gtg ccc cgc ggg gcg cct ttc ctt ctc cta cca cct 48 Met Pro Thr Ser Val Pro Arg Gly Ala Pro Phe Leu Leu Leu Pro Pro 1 5 10 15 tta ctg atg ctg tct gct gtg ctg gca gtg cct gtg gac cgc gca gca 96 Leu Leu Met Leu Ser Ala Val Leu Ala Val Pro Val Asp Arg Ala Ala 20 25 30 cct cat cag gag gac aac cag gcc act gag acc ccg gac aca ggc ctg 144 Pro His Gln Glu Asp Asn Gln Ala Thr Glu Thr Pro Asp Thr Gly Leu 35 40 45 tac tac cat cgg tac ctc cag gag gtc atc aac gtg cta gag aca gat 192 Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val Ile Asn Val Leu Glu Thr Asp 50 55 60 ggg cac ttc cgg gag aag ctg caa gct gcc aac gct gag gac att aag 240 Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala Ala Asn Ala Glu Asp Ile Lys 65 70 75 80 agt gga aag ctg agt caa gag ctg gac ttc gtc agc cac aac gtc cgc 288 Ser Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu Asp Phe Val Ser His Asn Val Arg 85 90 95 acc aag ctg gat gag ctc aag cga cag gag gta tca agg ctt cgg atg 336 Thr Lys Leu Asp 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aag aag gtt cca gag cag ccc 1344 Asp Gln Lys Asp Val Pro Ala Ser Glu Lys Lys Val Pro Glu Gln Pro 435 440 445 cct gtg ctg cca cag ctg gat tct cag cat tta taa 1380 Pro Val Leu Pro Gln Leu Asp Ser Gln His Leu 450 455 <210> 88 <211> 459 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 88 Met Pro Thr Ser Val Pro Arg Gly Ala Pro Phe Leu Leu Leu Pro Pro 1 5 10 15 Leu Leu Met Leu Ser Ala Val Leu Ala Val Pro Val Asp Arg Ala Ala 20 25 30 Pro His Gln Glu Asp Asn Gln Ala Thr Glu Thr Pro Asp Thr Gly Leu 35 40 45 Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val Ile Asn Val Leu Glu Thr Asp 50 55 60 Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala Ala Asn Ala Glu Asp Ile Lys 65 70 75 80 Ser Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu Asp Phe Val Ser His Asn Val Arg 85 90 95 Thr Lys Leu Asp Glu Leu Lys Arg Gln Glu Val Ser Arg Leu Arg Met 100 105 110 Leu Leu Lys Ala Lys Met Asp Ala Lys Gln Glu Pro Asn Leu Gln Val 115 120 125 Asp His Met Asn Leu Leu Lys Gln Phe Glu His Leu Asp Pro Gln Asn 130 135 140 Gln His Thr Phe Glu Ala Arg Asp Leu Glu Leu Leu Ile 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gac att aag agt gga aag ctg agt caa gag ctg gac 192 Ala Asn Ala Glu Asp Ile Lys Ser Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu Asp 50 55 60 ttc gtc agc cac aac gtc cgc acc aag ctg gat gag ctc aag cga cag 240 Phe Val Ser His Asn Val Arg Thr Lys Leu Asp Glu Leu Lys Arg Gln 65 70 75 80 gag gta tca agg ctt cgg atg ctg ctc aag gcc aag atg gat gca aag 288 Glu Val Ser Arg Leu Arg Met Leu Leu Lys Ala Lys Met Asp Ala Lys 85 90 95 cag gag cct aac ttg cag gtg gac cac atg aac ctt ctg aag cag ttt 336 Gln Glu Pro Asn Leu Gln Val Asp His Met Asn Leu Leu Lys Gln Phe 100 105 110 gaa cac ctg gac cct cag aac cag cac acg ttt gag gct cgg gac cta 384 Glu His Leu Asp Pro Gln Asn Gln His Thr Phe Glu Ala Arg Asp Leu 115 120 125 gag ctg ctg atc cag acg gcc acc cga gac ctc gcc cag tat gac gct 432 Glu Leu Leu Ile Gln Thr Ala Thr Arg Asp Leu Ala Gln Tyr Asp Ala 130 135 140 gca cac cat gaa gag ttc aaa cgc tac gag atg ctc aag gaa cat gag 480 Ala His His Glu Glu Phe Lys Arg Tyr Glu Met Leu Lys Glu His Glu 145 150 155 160 cga aga cgt tac ctg gag tct ctg gga gag gag cag cgg aag gag gct 528 Arg Arg Arg Tyr Leu Glu Ser Leu Gly Glu Glu Gln Arg Lys Glu Ala 165 170 175 gag agg aag cta caa gag cag cag cgc aga cac cgg gaa cac ccc aaa 576 Glu Arg Lys Leu Gln Glu Gln Gln Arg Arg His Arg Glu His Pro Lys 180 185 190 gtc aat gtt cct ggc agc caa gcc cag ttg aag gag gtg tgg gag gag 624 Val Asn Val Pro Gly Ser Gln Ala Gln Leu Lys Glu Val Trp Glu Glu 195 200 205 cta gat gga ttg gac ccc aac agg ttc aac ccc aag acc ttc ttc ata 672 Leu Asp Gly Leu Asp Pro Asn Arg Phe Asn Pro Lys Thr Phe Phe Ile 210 215 220 ctg cat gac atc aac agc gat ggt gtc cta gat gag caa gaa ctg gaa 720 Leu His Asp Ile Asn Ser Asp Gly Val Leu Asp Glu Gln Glu Leu Glu 225 230 235 240 gct ctg ttt acc aag gag ctg gag aag gtg tac gac ccg aag aac gag 768 Ala Leu Phe Thr Lys Glu Leu Glu Lys Val Tyr Asp Pro Lys Asn Glu 245 250 255 gag gac gac atg agg gag atg gag gag gag cgg ctg cgc atg cgg gag 816 Glu Asp Asp Met Arg Glu Met Glu Glu Glu Arg Leu Arg Met Arg Glu 260 265 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gag gac agc cag gcc act gag acc ccg gac acg ggc ctg 144 Pro Pro Gln Glu Asp Ser Gln Ala Thr Glu Thr Pro Asp Thr Gly Leu 35 40 45 tac tac cac cgg tac ctc cag gag gtc atc aac gtg cta gag aca gat 192 Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val Ile Asn Val Leu Glu Thr Asp 50 55 60 ggg cac ttc cgg gag aag ctg cag gct gcc aac gct gag gac att aag 240 Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala Ala Asn Ala Glu Asp Ile Lys 65 70 75 80 agt gga aag ctg agc caa gag ctg gac ttc gtc agc cac aac gtc cga 288 Ser Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu Asp Phe Val Ser His Asn Val Arg 85 90 95 acc aag ctg gat gag ctc aag cga cag gag gtg tcg agg ctg cgg atg 336 Thr Lys Leu Asp Glu Leu Lys Arg Gln Glu Val Ser Arg Leu Arg Met 100 105 110 ctg ctc aag gcc aag atg gat gca aag cag gag ccc aac ttg cag gtg 384 Leu Leu Lys Ala Lys Met Asp Ala Lys Gln Glu Pro Asn Leu Gln Val 115 120 125 gac cac atg aac ctc ctg aag cag ttt gag cac ctg gac cct cag aac 432 Asp His Met Asn Leu Leu Lys Gln Phe Glu His Leu Asp Pro Gln Asn 130 135 140 cag cac acg 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Lys Leu Gln Glu Gln Gln Arg Arg His Arg Glu His Pro Lys 180 185 190 Val Asn Val Pro Gly Ser Gln Ala Gln Leu Lys Glu Val Trp Glu Glu 195 200 205 Leu Asp Gly Leu Asp Pro Asn Arg Phe Asn Pro Lys Thr Phe Phe Ile 210 215 220 Leu His Asp Ile Asn Ser Asp Gly Val Leu Asp Glu Gln Glu Leu Glu 225 230 235 240 Ala Leu Phe Thr Lys Glu Leu Glu Lys Val Tyr Asp Pro Lys Asn Glu 245 250 255 Glu Asp Asp Met Arg Glu Met Glu Glu Glu Arg Leu Arg Met Arg Glu 260 265 270 His Val Met Lys Asn Val Asp Thr Asn Gln Asp Arg Leu Val Thr Leu 275 280 285 Glu Glu Phe Leu Ala Ser Thr Gln Arg Lys Glu Phe Gly Asp Thr Gly 290 295 300 Glu Gly Trp Lys Thr Val Glu Met Ser Pro Ala Tyr Thr Glu Glu Glu 305 310 315 320 Leu Lys Arg Phe Glu Glu Glu Leu Ala Ala Arg Glu Ala Glu Leu Asn 325 330 335 Ala Arg Ala Gln Arg Leu Ser Gln Glu Thr Glu Ala Leu Gly Arg Ser 340 345 350 Gln Asp Arg Leu Glu Ala Gln Lys Arg Glu Leu Gln Gln Ala Val Leu 355 360 365 Gln Met Glu Gln Arg Lys Gln Gln Leu Gln Glu Gln Ser Ala Pro Pro 370 375 380 Ser Lys Pro Asp Gly Gln Leu Gln Phe Arg Ala Asp Thr Asp Asp Ala 385 390 395 400 Pro Val Pro Ala Pro Ala Gly Asp Gln Lys Asp Val Pro Ala Ser Glu 405 410 415 Lys Lys Val Pro Glu Gln Pro Pro Glu Leu Pro Gln Leu Asp Ser Gln 420 425 430 His Leu <210> 95 <211> 77 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 95 Val Pro Leu Glu Arg Gly Ala Pro Asn Lys Glu Glu Thr Pro Ala Thr 1 5 10 15 Glu Ser Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val 20 25 30 Ile Asp Val Leu Glu Thr Asp Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala 35 40 45 Ala Asn Ala Glu Asp Ile Lys Ser Gly Lys Leu Ser Arg Glu Leu Asp 50 55 60 Phe Val Ser His His Val Arg Thr Lys Leu Asp Glu Leu 65 70 75 <210> 96 <211> 77 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 96 Val Pro Val Asp Arg Ala Ala Pro His Gln Glu Asp Asn Gln Ala Thr 1 5 10 15 Glu Thr Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val 20 25 30 Ile Asn Val Leu Glu Thr Asp Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala 35 40 45 Ala Asn Ala Glu Asp Ile Lys Ser Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu Asp 50 55 60 Phe Val Ser His Asn Val Arg Thr Lys Leu Asp Glu Leu 65 70 75 <210> 97 <211> 77 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 97 Val Pro Val Asp Arg Ala Ala Pro Pro Gln Glu Asp Ser Gln Ala Thr 1 5 10 15 Glu Thr Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val 20 25 30 Ile Asn Val Leu Glu Thr Asp Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala 35 40 45 Ala Asn Ala Glu Asp Ile Lys Ser Gly Lys Leu Ser Gln Glu Leu Asp 50 55 60 Phe Val Ser His Asn Val Arg Thr Lys Leu Asp Glu Leu 65 70 75 <210> 98 <211> 231 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 gtccccctgg agcgaggggc gcccaacaag gaggagaccc ctgcgactga gagtcccgac 60 acaggcctgt actaccaccg gtacctccag gaggtcatcg atgtactgga gacggatggg 120 catttccgag agaagctgca ggctgccaat gcggaggaca tcaagagcgg gaagctgagc 180 cgagagctgg actttgtcag ccaccacgtc cgcaccaagc tggatgagct c 231 <210> 99 <211> 231 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 99 gtgcctgtgg accgcgcagc acctcatcag gaggacaacc aggccactga gaccccggac 60 acaggcctgt actaccatcg gtacctccag gaggtcatca acgtgctaga gacagatggg 120 cacttccggg agaagctgca agctgccaac gctgaggaca ttaagagtgg aaagctgagt 180 caagagctgg acttcgtcag ccacaacgtc cgcaccaagc tggatgagct c 231 <210> 100 <211> 231 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 100 gtgcccgtgg accgcgcagc acctcctcag gaggacagcc aggccactga gaccccggac 60 acgggcctgt actaccaccg gtacctccag gaggtcatca acgtgctaga gacagatggg 120 cacttccggg agaagctgca ggctgccaac gctgaggaca ttaagagtgg aaagctgagc 180 caagagctgg acttcgtcag ccacaacgtc cgaaccaagc tggatgagct c 231 <210> 101 <211> 30 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 101 Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val Ile Asp 1 5 10 15 Val Leu Glu Thr Asp Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala 20 25 30 <210> 102 <211> 30 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 102 Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val Ile Asn 1 5 10 15 Val Leu Glu Thr Asp Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala 20 25 30 <210> 103 <211> 30 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 103 Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val Ile Asn 1 5 10 15 Val Leu Glu Thr Asp Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala 20 25 30 <210> 104 <211> 90 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 cccgacacag gcctgtacta ccaccggtac ctccaggagg tcatcgatgt actggagacg 60 gatgggcatt tccgagagaa gctgcaggct 90 <210> 105 <211> 90 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 105 ccggacacag gcctgtacta ccatcggtac ctccaggagg tcatcaacgt gctagagaca 60 gatgggcact tccgggagaa gctgcaagct 90 <210> 106 <211> 90 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 106 ccggacacgg gcctgtacta ccaccggtac ctccaggagg tcatcaacgt gctagagaca 60 gatgggcact tccgggagaa gctgcaggct 90 <210> 107 <211> 16 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 107 Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val Ile Asp 1 5 10 15 <210> 108 <211> 14 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 108 Val Leu Glu Thr Asp Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala 1 5 10 <210> 109 <211> 10 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 109 Gln Glu Val Ile Asp Val Leu Glu Thr Asp 1 5 10 <210> 110 <211> 16 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 110 Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val Ile Asn 1 5 10 15 <210> 111 <211> 14 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 111 Val Leu Glu Thr Asp Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala 1 5 10 <210> 112 <211> 10 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <400> 112 Gln Glu Val Ile Asn Val Leu Glu Thr Asp 1 5 10 <210> 113 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 113 Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln Glu Val Ile Asn 1 5 10 15 <210> 114 <211> 14 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 114 Val Leu Glu Thr Asp Gly His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Ala 1 5 10 <210> 115 <211> 10 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 115 Gln Glu Val Ile Asn Val Leu Glu Thr Asp 1 5 10 <210> 116 <211> 48 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 cccgacacag gcctgtacta ccaccggtac ctccaggagg tcatcgat 48 <210> 117 <211> 42 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 gtactggaga cggatgggca tttccgagag aagctgcagg ct 42 <210> 118 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 caggaggtca tcgatgtact ggagacggat 30 <210> 119 <211> 48 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 119 ccggacacag gcctgtacta ccatcggtac ctccaggagg tcatcaac 48 <210> 120 <211> 42 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 120 gtgctagaga cagatgggca cttccgggag aagctgcaag ct 42 <210> 121 <211> 30 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <400> 121 caggaggtca tcaacgtgct agagacagat 30 <210> 122 <211> 48 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 122 ccggacacgg gcctgtacta ccaccggtac ctccaggagg tcatcaac 48 <210> 123 <211> 42 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 123 gtgctagaga cagatgggca cttccgggag aagctgcagg ct 42 <210> 124 <211> 30 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 124 caggaggtca tcaacgtgct agagacagat 30

Claims (33)

  1. PPARγ 애고니스트 활성을 갖는 티아졸리딘디온류의 화합물을 포유류 세포에 작용시키는 공정, 및 그 화합물에 의해 발현 유도되는 유전자를 동정하는 공정을 포함하는 섭식 조절 및/또는 체중 조절 관련 인자의 취득 방법.
  2. 배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드.
  3. 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 배열 번호 3, 6 또는 9 에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드.
  4. 배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나와 적어도 60% 이상의 호몰로지를 갖는 아미노산 배열 ; 또는 배열 번호 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열의 어느 하나에 있어서, 그 일부의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 아미노산 배열로 이루어지고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드.
  5. 배열 번호 3, 6 또는 9 로 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나와 적어도 60% 이상의 호몰로지를 갖는 아미노산 배열 ; 또는 배열 번호 3, 6 또는 9 로 나타내는 아미노산 배열 중 어느 하나에 있어서, 그 일부의 아미노산이 결실, 삽입 또는 치환된 아미노산 배열로 이루어지고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드로서,
    배열 번호 3, 6 또는 9 의 아미노산 번호 82∼162 에 상당하는 아미노산 배열 중에, 생체 내에 포함되는 절단 효소의 인식 부위를 적어도 1 개 포함하는 폴리펩티드.
  6. 제 3 항, 제 4 항 또는 제 5 항에 있어서,
    상기 체중 증가 억제 활성이 체지방 증가 억제 활성인 폴리펩티드.
  7. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자.
  8. 배열 번호 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106, 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자.
  9. 배열 번호 10, 11 또는 12 에 나타내는 염기 배열을 포함하고, 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자.
  10. 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106, 116∼124 에 나타내는 염기 배열 또는 그 부분 배열과 스트리전트 조건 하에서 하이브리다이즈하고, 또한 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 핵산 분자.
  11. 제 7 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 체중 증가 억제 활성이 체지방 증가 억제 활성인 핵산 분자.
  12. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  13. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자를 포함하는 형질 전환체.
  14. 유효 성분으로서, 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드 또는 그 부분 펩티드, 제 12 항에 기재된 벡터, 또는 제 13 항에 기재된 형질 전환체를 함유하는 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제를 위한 의약 조성물.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 체중 증가 억제가 체지방 증가 억제인 의약 조성물.
  16. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드와 결합하는 항체.
  17. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드의 활성 또는 생성을, 또는 그 폴리펩티드를 코드하는 유전자의 발현을 억제하는 물질.
  18. 제 17 항에 기재된 물질을 함유하는 식욕 항진 및/또는 체중 증가 항진을 위한 의약 조성물.
  19. 제 7 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 기재된 핵산 분자가 도입된 트랜스제닉 비인간 생물.
  20. 제 19 항에 있어서,
    상기 트랜스제닉 비인간 생물이 섭식 억제 상태 또는 체중 증가 억제 상태를 나타내는 트랜스제닉 비인간 동물인 트랜스제닉 비인간 동물.
  21. 제 16 항에 기재된 항체, 또는 제 17 항에 기재된 억제 물질이 도입되고, 식욕 또는 체중 증가가 항진되고 있는 트랜스제닉 비인간 동물.
  22. 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106, 116∼124 에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 전체 영역 또는 일부를 결손시킨 녹아웃 비인간 동물.
  23. 제 2 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 기재된 폴리펩티드의 제조 방법.
  24. 섭식 항진 또는 체중 증가 상태를 예측 또는 진단하기 위한 검정 방법으로서,
    포유류 동물의 생체 시료 중의, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자 ; 또는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드의 함유량을 검출하는 공정을 포함하는 방법.
  25. 제 24 항에 기재된 검정 방법에 사용되는 검정 키트로서,
    배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자를 검출하기 위한 PCR 프라이머, 프로브 또는 DNA 칩 ; 또는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드를 인식하는 항체, 표준 펩티드 또는 결합 경합 반응용 펩티드 수식체 중 적어도 1 개 포함하는 검정 키트.
  26. 시험 물질을 포유류 세포에 접촉시키는 공정, 및
    그 세포에 있어서의, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82 또는 104∼106, 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현량의 증가, 또는 그 세포 내에 포함되거나 또는 세포 외로 분비되는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드의 양의 증가를 검출하는 공정
    을 포함하는 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
  27. 포유 동물에게 시험 물질을 투여하는 공정, 및
    그 시험 동물의 생체 시료에 있어서의 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82 또는 104∼106, 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현의 항진을, 또는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드의 생성 항진을 검출하는 공정
    을 포함하는 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
  28. 제 19 항 내지 제 22 항에 기재된 비인간 동물에게 시험 물질을 투여하는 공정, 및
    그 비인간 동물에 있어서의 섭식 억제 또는 체중 증가 억제를 검출하는 공정
    을 포함하는 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
  29. 제 26 항 내지 제 28 항 중 어느 한 항에 기재된 스크리닝 방법에 의해 얻어진 섭식 억제 및/또는 체중 증가 억제 효과를 갖는 치료제 또는 예방제.
  30. 시험 물질을 포유류 세포에 접촉시키는 공정, 및
    그 세포에 있어서의, 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현량의 감소를, 또는 그 세포 내에 포함되거나 또는 세포 외로 분비되는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드의 양의 감소를 검출하는 공정
    을 포함하는 섭식 항진 및/또는 체중 증가 항진의 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
  31. 포유 동물에게 시험 물질을 투여하는 공정, 및
    그 시험 동물의 생체 시료에 있어서의 배열 번호 10∼12, 18∼20, 44∼46, 74∼82, 104∼106 또는 116∼124 중 어느 하나에 나타내는 염기 배열을 포함하는 유전자의 발현 억제를, 또는 배열 번호 3, 6, 9, 13∼15, 39∼41, 65∼73, 101∼ 103 또는 107∼115 중 어느 하나에 나타내는 아미노산 배열을 포함하는 폴리펩티드의 생성 억제를 검출하는 공정
    을 포함하는 섭식 항진 및/또는 체중 증가 항진의 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
  32. 제 19 항 내지 제 22 항에 기재된 비인간 동물에게 시험 물질을 투여하는 공정, 및
    그 비인간 동물에 있어서의 섭식의 항진 또는 체중 증가의 항진을 검출하는 공정
    을 포함하는 섭식 항진 및/또는 체중 증가 항진의 효과를 갖는 치료제 또는 예방제의 스크리닝 방법.
  33. 제 30 항 내지 제 32 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어진 섭식 항진 및/또는 체중 증가 항진의 효과를 갖는 치료제 또는 예방제.
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