CN101914150B

CN101914150B - 一种多肽及其在制药中的应用

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Publication number: CN101914150B
Application number: CN2010101478775A
Authority: CN
Inventors: 刘建宁
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-03-12
Filing date: 2010-03-12
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2030-03-12
Also published as: EP2229952A1; CN101914150A; US20100235935A1; US8541367B2; EP2229952B1

Abstract

本发明属于生物制药及糖尿病领域，公开了一种多肽及其在制药中的应用。该多肽是(a)或(b)：(a)是由SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列组成的多肽；(b)是在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有降血糖和/或降血脂作用的由(a)衍生的多肽。该多肽及其纤溶酶抑制物具有降血糖以及降低血液中甘油三酯、总胆固醇或低密度脂蛋白的作用，可用于制备降血糖的药物或降血脂的药物，尤其是制备治疗糖尿病的药物。

Description

一种多肽及其在制药中的应用

技术领域

本发明属于生物制药及糖尿病领域，涉及一种多肽(NUCB2的肽段，例如：pladin或nesfatin-1)及其在制药中的应用。

背景技术

糖尿病的发病率在全世界范围内正以一种惊人的速率增加，尤其是在发展中国家。糖尿病人体内的过多血糖会损害血管、神经、眼部以及肾脏的机能，最终会导致严重的心血管疾病、神经症、目盲和肾衰竭。因此，如何控制血糖是糖尿病治疗中的需要面对的最关键的问题。

对于缺乏胰岛素的I型糖尿病人而言，在食物摄入之前注射胰岛素可以预防高血糖症的发生。而对于体内胰岛素表达量减少或胰岛素耐受的病人，即II型糖尿病人而言，血糖水平上升是引起发病和死亡的诸多复杂因素之一。现在有许多药物被用来控制II型糖尿病人的血糖水平，其中包括1)磺脲类，可以促进胰岛释放胰岛素；2)二甲双胍，可以减少肝脏的葡萄糖产生；3)格列酮类，作为过氧化物酶体增殖体活化受体-γ(PPAR-γ)的激动剂，可以刺激胰岛素受体下游的信号通路；4)α-葡萄糖苷酶抑制剂，可以干扰肠对葡萄糖的吸收；5)肠促胰岛素，作为胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1receptor)的激动剂可以促进胰岛素分泌；6)二肽基肽酶-IV抑制剂(DPP-IV inhibitors)，可以抑制内源性GLP-1的降解并增强胰岛素分泌；最后，还有胰岛素本身可以抑制葡萄糖的产生并提高葡萄糖的利用率(Moller，2001)。但是，真正能治疗II型糖尿病的药物尚未被发现，因为上述药物在使用和功效上都有各自的限制。

在研究中应用突变体小鼠有助于探明主导能量消耗的调控回路，并进一步理解肥胖症和糖尿病的病因。其中一个著名的实例是关于瘦素(leptin)的研究，缺失了leptin(lep^-/-)或leptin受体(lepr^-/-)的小鼠会产生肥胖、糖尿病、不育、摄食过度和乏力等症状(Chua et al.，1996)。

下丘脑可以分泌表达一系列的分子参与对饮食行为的调控。核连蛋白2(nucleobindin 2，NUCB2或称为NEFA)就是一种由下丘脑分泌的包含396个氨基酸的蛋白，在人类、小鼠与大鼠种群中高度保守。由NEFA基因编码的多肽包含一个钙离子结合结构域(EF结构域)和一个DNA结合结构域。NEFA与nucleobindin具有高度的同源性，被认为是能够与钙离子反应的DNA结合因子超家族(EF超家族)中的一员。

NUCB2注射到大鼠脑部后会促进其食欲减退和体重下降。NUCB2在翻译后期经过激素原转化酶的切割后会生成一个N端片段Nesfatin-1(NEFA/nucleobindin2编码的影响食欲和肥胖的蛋白)和两个C端肽段，Nesfatin-2和Nesfatin-3。Nesfatin-1保留了NUCB2的所有引起食欲降低的性质。侧脑室(i.c.v.)或腹腔(i.p.)注射Nesfatin-1都会抑制食物的摄入并导致体重下降。在体内，NUCB2向Nesfatin-1的转化对其活性而言是必需的。Nesfatin-1被发现存在于下丘脑的离散的细胞核中，其很可能在此参与激活了一条不依赖于leptin的黑皮质素(melanocortin)信号通路。Nesfatin-1可以通过不饱和系统双向出入血脑屏障(BBB)。

NUCB2同样也在脂肪组织细胞系3T3L1中表达，这意味着Nesfatin-1除了在脑部和外周部分并影响脑功能以外还有其他作用。大鼠体内的Nesfatin-1可以刺激钙离子的注入并且与一个目前尚不明确的G蛋白偶联受体发生相互作用。

虽然纤溶酶原(plasminogen)系统的主要功能是使纤维蛋白降解，但是其在脑部也具有一定的神经学功能。纤溶酶原及其激活剂(TPA和uPA)在发育中及成熟的脑部组织中均有表达，包括在海马椎体神经元和树突中。有报道认为，纤溶酶(plasmin)参与了在中脑垂体中源自前阿黑皮素前体(POMC precursor)的激素的形成过程(Selvarajanet al.，2001)。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有降血糖和/或降血脂作用的多肽。

本发明的另一个目的是提供上述多肽在制药中的应用。

在先前的报道中，Nesfatin-1被认为是一种通过下丘脑中的melanocortin信号影响食欲从而抑制食物摄入的分子。在此本发明提出，在db/db小鼠模型中，Nesfatin-1除了抑制食欲之外，还能从外周改善糖尿病症状。我们假设Nesfatin-1是plasmin的一种可能的底物，基于这一假设，我们设计了plasminogen、leptin受体和leptin基因双缺失的小鼠模型来研究肥胖(ob/ob)和糖尿病(db/db)动物体内Nesfatin-1增加所产生的影响。在db/db和ob/ob动物模型中，基因双敲除的小鼠与对照组相比下丘脑的Nesfatin-1表达量显著增加、食物摄入明显减少，体重增加。纤溶酶原缺失后，db/db小鼠的高血糖和高胰岛素水平也趋于正常。我们发现，Nesfatin-1在血清中的含量高于在下丘脑中，并且在自由进食时高于空腹时。有趣的是，我们还发现脑部的组织型纤溶酶原激活剂含量在自由进食时低于空腹时，与Nesfatin-1的蛋白水解酶灭活作用相关。我们认为在外周血中的Nesfatin-1能够，至少是部分被plasmin降解，这主要是基于以下两点发现：其一是静脉注射的氨甲环酸(AMCA)和抑肽酶(aprotinin)对纤溶酶原基因敲除的db/db小鼠具有类似的作用，其二是静脉注射的Nesfatin-1在plg^-/-小鼠中被清除的速率比在plg^+/+小鼠中慢很多。给db/db小鼠外周注射Nesfatin-1可以显著降低其血糖水平。由于Nesfatin-1的作用是胰岛素依赖性的，将其发展成一种新的治疗II型糖尿病的药物是非常有希望的。

本发明还发现了一种天然存在的含有69个氨基酸的NUCB2肽段(命名为Pladin，源自plasma anti-diabetic nucb2 peptide or plasmin related anti-diabetic nucb2 peptide)。Pladin在plasminogen、leptin受体和leptin基因双缺失的小鼠血清中的水平均有所上升，在纤溶酶原缺失时具有抗糖尿病的作用。给db/db小鼠静脉注射重组Pladin可以显著降低其血糖水平。Pladin的抗高血糖作用对于时间、剂量以及胰岛素都呈现依赖性，并且只在外周起作用。通过定点突变的研究表明，plasmin在Pladin的灭活过程中具有重要作用。与Nesfatin-1一样，重组Pladin也具有抑制食欲的作用。为了避免神经心理学方面的影响，我们还设计了一种具有长期作用的Pladin，其在体内并不会进入脑部。我们认为，Pladin作为一种新型的胰岛素辅助药物，将会带给我们新的II型糖尿病的治疗方案。

本发明的目的是通过下列技术方案实现的：

一种(a)或(b)的多肽：

(a)：由SEQ ID NO：22所示的氨基酸序列组成的多肽；

(b)：在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有降血糖和/或降血脂作用的由(a)衍生的多肽。

所述的多肽，该多肽是SEQ ID NO：22除Ser¹⁹以外的位点经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有降血糖和/或降血脂作用的由(a)衍生的多肽。

所述的多肽，该多肽是由SEQ ID NO：24所示的氨基酸序列组成的多肽。

一种多肽，该多肽是氨基酸序列包含(a)或(b)所述多肽的氨基酸序列且具有降血糖和/或降血脂作用的多肽。

所述的多肽，该多肽是(c)或(d)的多肽：

(c)：由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：25所示的氨基酸序列组成的多肽。

(d)：在(c)中的氨基酸序列经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有降血糖和/或降血脂作用的由(c)衍生的多肽。

所述的多肽，该多肽为是SEQ ID NO：23除Ser⁶⁵以外的位点经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有降血糖和/或降血脂作用的由SEQ ID NO：23衍生的多肽。

所述的多肽，该多肽为SEQ ID NO：23中发生Arg¹³→Ala、Lys²⁸→Ala、Lys⁴³Lys⁴⁶→Ala、Lys⁶⁷→Ala、Lys²→Ala或Arg⁵³Arg⁵⁶→Ala取代的氨基酸序列组成的多肽。

以上任一多肽、该多肽(即以上任一多肽)的乙酰化产物、该多肽与白蛋白的复合物、该多肽降解水解酶的抑制物、或者含有该多肽及其降解水解酶抑制物的组合物在制备降血糖药物和/或降血脂药物中的应用。

所述的应用，其中降血糖药物为治疗糖尿病的药物；降血脂药物为降低血液中甘油三酯、总胆固醇或低密度脂蛋白的药物。

所述的应用，其中糖尿病为I型或II型糖尿病。

所述的应用，其中该多肽降解水解酶的抑制物为纤溶酶抑制物，优选抑肽酶、氨甲环酸、氨基己酸或它们的类似物。

以下是本发明的详细说明

接下来的内容用来描述本发明。用来的描述本发明的术语如果缺少明确的定义，应给出其通俗意思以被该领域的普通读者所理解。

本文中的“Pladin”是一段自然存在的含有69个氨基酸的nucb2多肽片段[取plasmaanti-diabetic nucb2 peptide或plasmin related anti-diabetic nucb2 peptide(抗糖尿病或与抗糖尿病相关的nucb2多肽)的词头而命名为Pladin]，这在本次应用中首次发现。

本文的nucleobindin是一类含有可结合Ca²⁺的EF手型构象的多功能蛋白质。迄今为止，已有两类nucleobindin被确定，分别为NUCB1和NUCB2。这里的NUCB2即nucleobindin 2，也叫NEFA(DNA binding/EF-hand/acidic protein)。尽管NUCB1和NUCB2分别被两个单独的互不相联的基因所表达，但二者具有高度同源性，氨基酸序列相似度达62％。NUCB1和NUCB2的主要特征是含有很多功能区，包括一个信号肽，一个亮氨酸/异亮氨酸富含区，一个推测的核定位信号区以及一个DNA结合区，两个可结合Ca²⁺的EF手型构象和一个亮氨酸拉链区。

本文利用纤溶酶原缺失的db/db或ob/ob小鼠揭示了纤溶酶原/纤溶酶对代谢平衡如食欲，体重和血糖的直接影响。更为重要的是，基于这些发现，我们利用比较血浆蛋白组学的方法找到了一个存在于血浆的抗糖尿病的多肽pladin。由于pladin的活性主要被纤溶酶所抑制，因此它被认为是纤溶酶原缺失的db/db小鼠具有抗糖尿病的主要原因。

相比于其它所有的抗高血糖的药物，pladin无疑是一类新的胰岛素辅助剂。在模拟II型糖尿病的高血糖db/db小鼠中，静脉注射10nmol rPladin可以显著维持6小时的低血糖而不需要借助任何的胰岛素。其作用是剂量，时间和胰岛素依赖的，并且是在外周血中。Nesfatin-1是之前报道过的一个含82个氨基酸的可以抑制饮食的nucb2多肽(SEQID NO：18)，我们通过静脉注射，腹腔注射和侧脑室注射rPladin发现具有同样的抑制饮食的效果。相反，我们还发现在db/db小鼠上静脉注射nesfatin-1可以降低血糖，这和rPladin相似。Nesfatin-1被推测是位于nucb2上一段可以被激素原转化酶酶解的位置。Nesfatin-1的降糖作用在以往的报道中被忽视了，原因可能是采用的是腹腔注射和非高血糖动物。虽然Pladin可以在脑内作用影响饮食，但它的抗高血糖作用却发现仅仅在外周。在db/db小鼠上限制卡路里和侧脑室注射rPladin均不能影响血糖和胰岛素水平。另外，饥饿不会影响db/db小鼠血液内的胰岛素水平。

Nesfatin-1的半衰期为9到10分钟中，同样，我们发现rPladin在血液循环中的半衰期也低于10分钟。然而，其抗高血糖作用却可以维持6小时以上(图13A)，说明了它的的胞内信号可以持续很久。虽然pladin抗高血糖的细胞内机制还不清楚，但肯定和胰岛素的信号通路有关。在一个体外实验中，我们发现rPladin的抗高血糖作用可以被PPAR-γ的抑制剂(GW9662)和AMPK抑制剂(Compound C)所阻断，PPAR-γ和AMPK是胰岛素信号通路中的两个关键元素。我们将pladin乙酰化或者将Lys或Arg突变为Ala以避免被纤溶酶酶解，发现这样的pladin在血液循环中的半衰期可以显著延长，这个结果吻合了我们认为pladin的活性主要被纤溶酶抑制的推测。同时，将pladin和血清蛋白偶联可以显著防止血管外排斥，尽管该偶联没有使pladin的蛋白水解活性失活。在本文提到的实验中，通过乙酰化和偶联化，rPladin的活性可以上升到36小时，这两个反应可以通过重组技术实现，用来提高pladin的稳定性。

此外，由于AMCA(氨甲环酸)在临床上可以减少手术中的失血并且在高糖的db/db小鼠上能够有效模拟pladin的作用(图12A-E)，因此AMCA被成功应用于术后高血糖症。在4位术后血糖为10-12mmol/L的病人上使用10mg/kg的AMCA，血糖快速下降至6.8-9.2mmol/L。

虽然pladin被发现天然存在于血液循环中，但并不清楚它是如何从它的前体nucb2转化而来并释放到血液中的。Nucb2的mRNA及其相关蛋白已发现存在于胃粘膜，旁心室，丘脑下部的视上核以及胰岛中(Gonzalez et al.，2009；Oh-I et al.，2006；Stengel et al.，2009)，当动物饥饿时在丘脑下部的含量会下调(Oh-I et al.，2006)。我们发现在野生型和db/db小鼠中，相对于自由喂食，饥饿可以显著降低血浆中pladin的水平，这和之前的发现一致。Pladin和胰岛素的作用类似，密切调节血糖的代谢和饮食，这说明了它在机体代谢调控中的重要性。因此，对pladin更深入的研究将有助于我们更好的了解能量代谢和对II型糖尿病的创新性治疗。

本文提出了一个通过使用有效剂量的多肽如Nesfatin-1，pladin(plasma anti-diabeticnucb2 peptide)，或其中的功能等价体，用于制备治疗糖尿病的药物。一般而言，给药方式可包括静脉注射，皮下注射或者口服。在一实验方案中，多肽来自于人源或啮齿目动物。Nesfatin-1和pladin的功能等价体就是指能体现它们功能的东西，比如Nesfatin-1的同源肽，pladin的同源肽，或者其中的一段衍生肽等，但并不局限于这些。利用标准方法学，利用一个很常见的技术便可以很容易地测定Nesfatin-1或pladin的功能片段。比如通过重组技术获得切割过的Nesfatin-1或pladin或者Nesfatin-1或pladin的部分片度，然后利用本文前面介绍的检测方法来检测它们的抗糖尿病活性。此外，Nesfatin-1或pladin的突变体同样可以检测。本实验方法中使用的分子包括Nesfatin-1或pladin的完整肽段，部分片段和突变体。在一实验方案中，pladin，nesfatin-1和二者的功能等价体均包括了SEQ IDNO：22或者SEQ IDNO：24的氨基酸序列。在另一实验方案中，pladin突变了Arg¹³或Lys²⁸。然而在另一实验方案中，多肽是一个偶联分子用来提高分子量。一个很常见的技术即通过偶联常见的载体蛋白如血清蛋白，免疫球蛋白，Fc段，载脂蛋白等很容易地构建一个高分子量的nesfatin-1，pladin或二者的功能等价体。这样偶联的nesfatin-1或pladin可以降低血糖但不会穿过血脑屏障。另外，多肽还可以被修饰，如pladin被乙酰化等。

本文同时提出了一个通过使用有效剂量的多肽如Nesfatin-1，pladin(plasmaanti-diabetic nucb2 peptide)，或其中的功能等价体，从而降低血液中甘油三脂，总胆固醇或LDL的方法。多肽的描述和应用案例已经在上面阐述过。

以上方法(上述降低血液中血糖，甘油三脂，总胆固醇或LDL的方法)可用于治疗II型糖尿病，也可以用于治疗I型糖尿病，但对于I型糖尿病则需要胰岛素(insulin)的辅助治疗。另外，以上方法同样可以降低体重或抑制饮食。

本文同样提出了一个通过使用有效剂量的纤溶酶抑制剂，以提高外周Nesfatin-1或pladin(plasma anti-diabetic nucb2 peptide)的水平，从而治疗糖尿病的方法。纤溶酶抑制剂有抑肽酶，AMCA(氨甲环酸)，EACA(ε-氨基己酸)或其类似物，但并不局限于这些。

本文还提出了一个通过使用有效剂量的纤溶酶抑制剂，以提高外周Nesfatin-1或pladin(plasma anti-diabetic nucb2 peptide)的水平，从而降低血液中甘油三脂，总胆固醇或LDL的方法。纤溶酶抑制剂有抑肽酶，AMCA(氨甲环酸)，EACA(ε-氨基己酸)或其类似物，但并不局限于这些。

本文同时还提出了多肽作为药物治疗糖尿病或降低血液中甘油三脂，总胆固醇或LDL的用途。这些多肽已经在前面讨论过，其用途可用于治疗II型糖尿病，或者联合胰岛素治疗I型糖尿病。

本发明还提供了将纤溶酶抑制剂制备成治疗糖尿病或者降低血液中甘油三酯、胆固醇或低密度脂蛋白的药物的用途。纤溶酶抑制剂有例如抑肽酶，AMCA(氨甲环酸)，EACA(ε-氨基己酸)以及它们的类似物，但并不仅限于这些。

本发明还提供了一种纤溶酶原基因纯合阻断的转基因糖尿病或者肥胖鼠类，相比纤溶酶原基因没有被阻断的糖尿病或者肥胖鼠类，这些鼠血糖血糖较低或者体重较轻。在一个实施例中，这些转基因鼠类还包含有纯合的瘦素或者瘦素受体基因阻断。在一个实施例中，这些转基因鼠类是小鼠。这种转基因动物在药物筛选、以及nesfatin-1或paldin的清除实验等一系列研究中将会起到很大作用。

本发明还提供了一种用于筛选能够提高外周血或者脑中nesfatin-1或paldin含量的试剂的方法，该方法包括如下步骤：(1)给实验对象注射待筛选的试剂；(2)从实验对象收集血液或者脑组织样本；(3)检测样本中的nesfatin-1或者pladin，如果相比取自用对照物质处理的实验对象的样本，nesfatin-1或者pladin的含量有增加，则指示该待筛选试剂能够提高外周血或者脑中nesfatin-1或paldin的含量。在一个实施例中，该筛选方法中所用的实验对象是上面述及的转基因鼠类。在一个实施例中，nesfatin-1或paldin的含量是利用下面描述的高效液相色谱法来测定的。在另外一个实施例中，nesfatin-1或paldin的含量是通过一系列利用抗nesfatin-1或paldin的抗体的实验方法(例如酶联免疫吸附法)来测定的。

本发明还提供了一种重组的pladin(plasma anti-diabetic nucb2 peptide)或与其功能相同的物质。在一个实施例中，pladin或者其功能相同物质包含有SEQ ID NO：19-25中的任意一个序列。在另一个实施例中，pladin的序列在第13位的精氨酸或者第28位的赖氨酸处有突变。

本申请书中引用了大量的参考文献，这些参考文献的引用，是为了更好地描述本发明所处的技术发展水平。

本发明的有益效果：

本发明提供的一系列多肽、该多肽的乙酰化产物、该多肽与白蛋白的复合物、该多肽降解水解酶的抑制物、或者含有该多肽及其降解水解酶抑制物的组合物等具有较好的降血糖和/或降血脂的作用，可用于制备降血糖和/或降血脂的药物，尤其可用于制备治疗糖尿病的药物，具有很好的应用前景。

附图说明

图中的数据均以图例说明中指出的平均值±标准偏差(SEM)体现。所有数据均代表至少三次不同实验。不同组数据间的比较均依照学生T检验双尾法进行，当p值小于0.05时认定组别差异显著。

图1表示(a)小鼠Nesfatin-1的氨基酸序列。箭头所示之处为可能的plasmin酶切位点。(b)Nesfatin-1被plasmin完全消化2小时后的片段。

图2表示用HPLC检测下丘脑中Nesfatin-1的含量，其中表示(a)各小鼠基因型中，(b)表示空腹时与自由进食时。数据以平均值±标准偏差(SEM)体现，平行样本数为四(每个样本含4份下丘脑样品)。

图3表示plg^-/-lepr^-/-小鼠比对同窝小鼠(包括plg^+/+lepr^-/-)的下丘脑中编码神经肽的mRNA的表达量。所有检测均采用定量实时PCR进行，并对mRNA的表达量采用gadph(其中(a)为agrp，(b)为npy，(c)为pomc)归一化处理。数据以平均值±标准偏差(SEM)体现，平行样本数为三。

图4表示(a)小鼠下丘脑组织抽提物的SDS-PAGE明胶酶谱：control-TPA(tissueplasminogen activator，组织型纤溶酶原激活剂)标准品，ff-自由进食，f-空腹；(b)小鼠的血清Nesfatin-1水平；(c)注射Nesfatin-1或缓冲盐溶液之后的小鼠的血糖水平；(d)静脉注射的Nesfatin-1的剂量依赖性；(e)静脉注射的Nesfatin-1的时间依赖性；(f)野生型小鼠的静脉葡萄糖耐量试验(IGTT)；(g)Nesfatin-1对链脲霉素(Streptozotocin)诱导的I型糖尿病C57BL/6J小鼠的影响，每组含4只雄性小鼠。数据以平均值±标准偏差(SEM)体现(*表示p＜0.05，**表示p＜0.01)，小鼠的数量标注在括弧中，saline(生理盐水，下同)。

图5表示(a)给db/db小鼠静脉注射AMCA和aprotinin 30分钟后的血清Nesfatin-1水平。图5a中显示的“saline”组的Nesfatin-1水平低于“ff db/db”组是因为注射后血液稀释所导致的。(b)静脉注射3天AMCA(15mg/日)后的体重下降情况。(c)静脉注射3天AMCA(15mg/日)后的食物摄入量变化。小鼠的数量标注在括弧中。

图6表示弓状核AgRP的免疫组织化学结果，其中(a)为plg^+/+lepr^+/+小鼠；(b)为plg^-/-lepr^+/+小鼠；(c)为plg^-/-lepr^-/-小鼠；(d)为plg^+/+lepr^-/-小鼠。

图7表示缺失纤溶酶原时db/db小鼠和ob/ob小鼠的体重与食物摄入减少情况，以及归一化的db/db小鼠的血糖和血清胰岛素水平。其中(A，C)为plg/lepr小鼠和(B，D)为plg/lep小鼠在24周饲料喂养后的体重情况，及其在5、10、15、20周龄时的每日食物摄入情况；(E)为空腹的超龄小鼠血糖水平；(F)为12周龄的小鼠血清胰岛素水平；(G)16～18周龄的小鼠在腹膜葡萄糖耐量试验(IP-GTT)中的血糖水平。数据以平均值±标准偏差(SEM)体现(*表示p＜0.05，**表示p＜0.01，对照于肥胖小鼠)，小鼠的数量标注在括弧中。

图8表示重组Pladin的抗高血糖作用的时间、剂量及胰岛素依赖性，其中(A)为plg^-/-lepr^-/-小鼠和plg^+/+lepr^-/-小鼠的血清Pladin水平；(B)为注射了重组Pladin的小鼠血糖水平；(C)为静脉注射的重组Pladin的剂量依赖效应；(D)为静脉注射的重组Pladin的时间依赖效应；(E)为静脉注射重组Pladin后的野生型小鼠的静脉注射葡萄糖耐量试验(IV-GTT)结果；(F)为重组Pladin对链脲霉素(Streptozotocin)诱导的I型糖尿病C57BL/6J小鼠的影响，每组含4只雄性小鼠。数据以平均值±标准偏差(SEM)体现(*表示p＜0.05，**表示p＜0.01)，小鼠的数量标注在括弧中。

图9表示对重组Pladin的结构鉴定，其中(A)用RP-C18-HPLC分析血清Pladin水平，样本为自由喂食的野生型小鼠的25μL血清；(B)用MALDI-TOF测定Pladin的相对分子质量；(C)用MALDI-TOF/TOF测定酶切Pladin肽段并推导其氨基酸序列。

图10表示重组Pladin的减少食欲的作用与其抗高血糖的作用不相关。(A)侧脑室(i.c.v.)和腹腔(i.p.)注射Nesfatin-1或重组Pladin的大鼠0-3小时内的食物摄入情况。(B)侧脑室(i.c.v.)、腹腔(i.p.)以及静脉(i.v.)注射Nesfatin-1或重组Pladin的db/db小鼠的血糖水平。(C)限制热量摄入超过7周的db/db小鼠的空腹血糖水平。(D)限制热量摄入超过7周的db/db小鼠的血清胰岛素水平。数据以平均值±标准偏差(SEM)体现(*表示p＜0.05)，小鼠的数量标注在括弧中。

图11表示Pladin在体外被plasmin灭活。(A)小鼠Pladin的氨基酸序列。箭头所示之处为可能的plasmin酶切位点。(B)重组Pladin及其变体被plasmin完全消化。(C)用重组Pladin和plamin消化过的重组Pladin注射db/db小鼠后的血糖水平。数据以平均值±标准偏差(SEM)体现(*表示p＜0.05)，小鼠的数量标注在括弧中。

图12表示AMCA、GW9662、复合物C(Compound C)、罗格列酮(rosiglitazone)、纤溶酶原基因敲除(plg^-/-)以及空腹对血清Pladin水平的影响。(A)静脉注射15mgAMCA10分钟后db/db小鼠的血清Pladin水平。图12A中显示的“saline”组的Pladin水平低于“free fed db/db”组是因为注射后血液稀释所导致的。(B)静脉注射3天AMCA(15mg/日)后的体重下降情况。(C)静脉注射3天AMCA(15mg/日)中第三天的食物摄入情况。(D)从2周龄起连续每日注射AMCA10周后的db/db小鼠的空腹血糖水平，以缓冲盐溶液为对照。(E)静脉注射10nmol的重组Pladin10分钟后的野生型及plg^-/-鼠的血清Pladin水平。(F)注射重组Pladin、GW9662、Compound C和rosiglitazone3小时后的db/db小鼠的血糖水平。自由进食和空腹的野生型和db/db小鼠的血清Pladin水平。数据以平均值±标准偏差(SEM)体现(*表示p＜0.05，**表示p＜0.01)，小鼠的数量标注在括弧中。

图13表示plasmin抵抗突变体、第65位丝氨酸、乙酰化作用以及与白蛋白偶联对重组Pladin的抗高血糖活性的影响，用(A)重组Pladin、(B-H)各种突变体、(I)重组Pladin-白蛋白、(J)乙酰化重组Pladin以及(K)乙酰化重组Pladin-白蛋白静脉注射db/db小鼠后的血糖水平，每组含5只db/db小鼠。数据以平均值±标准偏差(SEM)体现(*表示p＜0.05)。

图14表示plasmin抵抗突变体(A90、A91和A92)对重组Pladin的抗高血糖活性的影响，用10nmol的重组Pladin及突变体静脉注射db/db小鼠后的血糖水平，每组含5只db/db小鼠。

图15是注射Nesfatin-1显著降低血液中甘油三酯，总胆固醇和低密度脂蛋白而非高密度脂蛋白含量的数据。图中84p是nesfatin-1的代号。取各小鼠血清，送南京大学校医院测量血脂指标，包括甘油三酯，总胆固醇，高密度脂蛋白总胆固醇，低密度脂蛋白总胆固醇。图中标为standard数据表示的是人正常血清中的含量的正常值的上限。比较ob/ob组总给药与不给药情况，发现，84P(nesfatin-1)对于甘油三酯，和总胆固醇的改善比较明显。图中各组别括号内数据为小鼠周龄。

图16表示给db/db小鼠分别注射10nmol/只rNesfatin-1、0.45μg/克体重的GW9662、20μg/克体重的Compound C、10μg/克体重的罗格立酮后三小时的血糖值。数据以平均值±标准偏差(SEM)体现(*表示p＜0.05，**表示p＜0.01)，小鼠的数量标注在括弧中。

图17静脉注射白蛋白-nesfatin-1偶联物在6小时内显著降低了db/db小鼠的血糖水平(p＜0.01)。图中“BSA+84p”代表白蛋白与nesfatin-1单体偶联物。图中“BSA+n84p”代表白蛋白与nesfatin-1多体偶联物。db/db小鼠周龄为12-16周，每实验组5只小鼠。测量药物注射后三小时的血糖值。

图18表示给每只db/db小鼠分别静脉注射生理盐水、10nmol rPladin、30nmol的合成多肽(SEQ ID NO：22)、30nmol的合成多肽(SEQ ID NO：24)、5nmol的78个氨基酸的重组蛋白质多肽(SEQ ID NO：25)后三小时的血糖值(p＜0.01)。数据以平均值±标准偏差(SEM)体现。db/db小鼠周龄为12-16周，每实验组6只小鼠。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行进一步阐述，使得本发明更容易被理解，但并不限制本发明。

以下实施例中没有详细描述的实验操作步骤均系本领域技术人员熟悉的操作步骤。

实施例1：Nesfatin-1介导纤溶酶原在肥胖及糖尿病动物体内的作用

Nesfatin-1是一段假设来自于NUCB2的多肽片段，在近期被鉴定为一种与下丘脑中黑皮质素信号相关联的食欲减退因子。在脑室或者腹腔中注射nesfatin-1能够减少进食，进而降低体重。nesfatin-1的氨基酸序列，从小鼠到人，都是高度保守的，并且拥有几个公认的纤溶酶的酶切位点(图1a)。因此，nesfatin-1被假设能够介导纤溶酶原在肥胖及糖尿病动物体内的作用。

为了证明这个假设，我们利用基因工程化的大肠杆菌表达并纯化了重组的nesfatin-1。将其与纤溶酶共同孵育，如预期般nesfatin-1被迅速降解了(图1b)。有趣的是，相比基因型为plg^-/-lepr^-/-的非肥胖的同窝对照，基因型为plg^+/+lepr^-/-的动物下丘脑中nesfatin-1的浓度显著偏低(图2a)，说明纤溶酶原或者纤溶酶至少在一定程度上导致了nesfatin-1的减少。plg^-/-lepr^-/-动物下丘脑中nesfatin-1的浓度与该动物的进食和体重情况是相关联的。相比自由进食的小鼠，饥饿小鼠下丘脑中nesfatin-1的浓度往往更低(图2b)。此外，纤溶酶原的缺失，为研究因摄食过度而肥胖的动物体内浓度长期偏高的nesfatin-1所带来的影响提供了一条独特的途径，因为nesfatin-1在体内半衰期很短暂，通过脑室或者腹腔注射无法达到这一目的。随后又发现，相比基因型为plg^+/+lepr^-/-的动物，基因型为plg^-/-lepr^-/-的动物体内agrp和npy减少了，pomc则增加了(图3)，这与先前关于脑室注射nesfatin-1不改变pomc，npy和agrp表达的报道并不一致。而该研究组最近报道，腹腔注射nesfatin-1能够上调pomc的表达，这与目前的发现是一致的。

就逻辑而言，nesfatin-1的水解减少需要纤溶酶的生成。当实验动物从自由进食状态改变为饥饿状态时，下丘脑中组织型纤溶酶原激活剂(TPA)的活性确实增加了(图4a)，与下丘脑中nesfatin-1浓度的变化具有很好的关联性(图2)。这是第一次显示TPA/纤溶酶原系统与饮食习惯有关，之前该系统被认为与学习过程相关。人们普遍认为喂食能够有效地促进动物的学习过程。Nesfatin-1似乎将大脑的这两个重要功能联系了起来。

如上所述，db/db小鼠的糖尿病症状在plg^-/-lepr^-/-基因型的小鼠中被消除了，这一点令人惊叹，但这并不能用nesfatin-1的食欲减退作用来解释。db/db小鼠，无论是通过饥饿、热量摄入限制还是脑室注射nesfatin-1，都很少能够使得糖尿病症状得到改善。因此，纤溶酶原缺失带来的抗糖尿病作用也许是在发生在外周血中的，而并不是通过神经系统。静脉注射100μg nesfatin-1能显著降低自由进食的db/db小鼠的血糖浓度，但是对饥饿的db/db小鼠和瘦的野生型小鼠没有作用(图4c)。这个抗糖尿病效果是呈剂量和时间依赖性的(图4d，e)。虽然nesfatin-1在循环血液中的半衰期仅有10分钟，但是它的作用能持续6小时以上，暗示存在着一种持久的胞内机制。在用野生型小鼠进行的IGTT实验中，静脉注射1.5g/kg葡萄糖后，100μg nesfatin-1能显著增强血糖的吸收，而在注射1g/kg葡萄糖的小鼠上没有这个现象(图4f)。因为nesfatin-1只能对足以诱导胰岛素分泌的高血糖起作用，所以它的降糖作用或许是胰岛素依赖性的。而事实上，在链脲霉素诱导的I型糖尿病小鼠中，只有当同时皮下注射胰岛素的时候，nesfatin-1才能起到降糖作用(图4g)。

下丘脑中组织型纤溶酶原激活剂活性的酶谱法测定

如之前报道²的一样，下丘脑中TPA(组织型纤溶酶原激活剂)的活性通过酶谱法来检测。从饥饿或者非饥饿的小鼠上取出下丘脑，匀浆，离心。将含有相同蛋白量的上清与样品缓冲液混合制备成样品，在含有3mg/ml酪蛋白和4.5mg/ml纤溶酶原的密度为10％的SDS-PAGE胶中电泳分离。阳性对照为0.1ng的人源TPA(Genentech，San Francisco，CA)。电泳后，将胶浸泡在复性缓冲液(0.02％NaN₃，200mM NaCl，50mM Tris-HCl，2.5％Triton X-100，pH 8.3)中室温孵育30分钟，然后在反应缓冲液(0.02％NaN₃，200mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 8.3)中37℃反应18小时。为了使TPA的条带清晰可见，反应后的胶用考马斯亮蓝R-250染色，然后脱色直至空白条带在蓝色背景上显现出来。

高效液相色谱法检测血清中nesfatin-1

将下丘脑匀浆，匀浆缓冲液为含有蛋白酶抑制剂cocktail(Roche，Indianapolis，IN)的乙酸，超声处理匀浆液破碎成团的核酸后，95℃加热15分钟。然后在4℃将样品以13,200rpm的转速离心30分钟。收集上清，以Bradford法(Thermo-Fisher Sci.Rockford，IL)测定蛋白浓度。小鼠眼球取血，分离血清。利用Waters Delta 600E/2487/717高效液相色谱系统对下丘脑匀浆液或者血清样本进行分析，上样量分别为下丘脑匀浆液约100mg蛋白或者血清25μL，所用的分析柱为C18反相柱(4.6x250mm/5μm，Hambon，张家港，中国)。梯度洗脱Nesfatin-1，时间梯度为0分钟-20分钟，相应的浓度梯度为20％-40％溶剂B(溶剂A：0.1％三氟乙酸的水溶液，溶剂B：0.1％三氟乙酸的乙腈溶液)，洗脱液流速为1ml每分钟。以纯化的nesfatin-1为标准品来确认nesfatin-1在柱上的保留时间并绘制标准曲线。收集对应保留时间的洗脱液后进行质谱分析。

链脲霉素诱导的I型糖尿病小鼠

实验采用10周龄的雄性C57BL/6J小鼠，连续两天腹腔注射链脲霉素的柠檬酸钠溶液(pH 4.5)，剂量为100mg/kg/day。尾静脉取血，用葡糖氧化酶法检测血糖浓度。当小鼠早晨时的血糖浓度大于16mM时，认为糖尿病模型造模成功。如果小鼠血糖高于30mM，则给每只小鼠注射16ng猪胰岛素(万邦，徐州，中国)以防止血糖过高带来危险。胰岛素每两天注射一次，保持血糖在16-30mM的范围内，并同时防止小鼠过度消瘦。实验时，每只链脲霉素诱导的I型糖尿病小鼠尾静脉注射100μg Nesfatin-1或同时合并2ng胰岛素皮下给药。

实施例2：尾静脉注射纤溶酶抑制剂对血液中nesfatin-1浓度的影响

Nesfatin-1在外周血中被清除的方式现在并不清楚。先前报道过外周血中有微量的纤溶酶生成，并在我们的实验中被证实了。通过尾静脉给db/db小鼠注射AMCA和抑肽酶这两种纤溶酶的抑制剂，外周血中nesfatin-1浓度增加的同时，小鼠的进食减少，体重降低了(图5)。另外，尾静脉注射的nesfatin-1在plg^-/-基因型的小鼠外周血中清除速率要明显慢于plg^+/+的小鼠。因此，我们认为外周血中的nesfatin-1至少有部分是由纤溶酶降解的。与nesfatin-1能够穿透血脑屏障的报道相一致，AMCA也能带来食欲减退作用，说明大脑中的nesfatin-1至少部分来自于外周血。Nesfatin-1能够增加大鼠的紧张和恐惧相关行为，证实其对大鼠的神经有影响。但是注射白蛋白-nesfatin-1融合蛋白在有效降低血糖的同时，并不影响大鼠的行为，证明该融合蛋白不能通过血脑屏障进入大脑。

尽管之前曾经发现TPA/纤溶酶原系统能够影响脂肪细胞的分化，但这是第一次发现该系统通过水解nesfatin-1使其失活进而直接影响食欲、体重和血糖浓度等一系列关系到体内能量稳态的方面。更重要的是，在这里列出的数据表明，外周血中的nesfatin-1有显著的抗糖尿病作用，这将为今后II型糖尿病的治疗提供新的方法。

实施例3：神经肽的定量PCR检测

对神经肽mRNA定量PCR(q-PCR)的检测，使用CFX96TM实时系统(Bio-Rad，Hercules，CA)和SYBR Green I荧光染料的检测方法。简而言之，将24小时禁食的小鼠的下丘脑组织取出匀浆，使用RNAiso试剂(TaKaRa，Dalian，CN)提取总RNA，并逆转录成单链cDNA。我们利用下丘脑cDNA的标准曲线确定神经肽mRNA的相对表达量，并通过qPCR对总RNA和gadph RNA进行调整。实时RT-PCR使用的引物如下：agrp正向引物：5′-TGT GTA AGG CTG CAC GAG TC(SEQ ID NO：10)；agrp反向引物：5′-GGC AGTAGC AAA AGG CAT TG(SEQ ID NO：11)；agrp Tm：61℃；npy正向引物：5′-AGG CTTGAA GAC CCT TCC AT(SEQ ID NO：12)；npy反向引物：5′-ACA GGC AGA CTG GTTTCA GG(SEQ ID NO：13)；npy Tm：61℃；pomc正向引物：5′-CGC CCG TGT TTC CA(SEQ ID NO：14)；pomc反向引物：5′-TGA CCC ATG ACG TAC TTC C(SEQ ID NO：15)；pomc Tm：58℃；gadph正向引物：5′-AAC GAC CCC TTC ATT GAC(SEQ ID NO：16)；gadph反向引物：5′-TCC ACG ACA TAC TCA GCA C(SEQ ID NO：17)；gadph Tm：60℃。全部样品均做三个平行样，结果取平均值。

实施例4：下丘脑AgRP的免疫组织化学

小鼠经过48小时禁食后，用戊巴比妥钠深度麻醉，并先后用20mL缓冲液和4％多聚甲醛(溶于PBS，pH7.4)进行心脏灌流。取出大脑后固定过夜，然后保存于含30％蔗糖的PBS中。为检测AgRP的免疫荧光，将20μm的冰冻切片固定于多聚甲醛中，在含1％BSA的PBS中孵育20分钟，然后在同样溶剂的兔源AgRP抗体(1∶4000，Phoenix Pharmaceuticals，Burlingame，CA)中4℃孵育1天。用PBS洗涤三次后，切片在Cy2-偶联的羊抗兔IgG(1∶250，Jackson，West Grove，PA)中室温孵育2小时，然后PBS洗涤三次，用甘油缓冲(pH8.5)封片。如图6所示，与plg+/+lepr-/-相比，plg-/-lepr-/-中下丘脑agrp和npy表达下调，而pomc表达上调。

实施例5：提高外周或脑nesfatin-1物质的高效液相色谱法筛选试验

血样和脑组织样品取自注射过多种药物的小鼠(例如化合物，蛋白，肽类或核酸)，然后如上所述进行高效液相色谱分析，测量并记录样品中的nesfatin-1含量。当发现某个样品中的nesfatin-1比对照组高20％时，该组别小鼠所注射的物质将被认为能够提高外周和脑部nesfatin-1的含量。

实施例6：利用纤溶酶或纤溶酶原激活物灭活Nesfatin-1

给病人每天静脉注射高于5mg纤溶酶或纤溶酶原激活物(例如组织纤溶酶原激活物，尿激酶型纤溶酶原激活物，链激酶或葡激酶)。该病人血液或脑部的nesfatin-1的含量可能降低或失去活性，其摄食量、食欲、血糖或体重可能升高。

实施例7：注射Nesfatin-1显著降低血液中甘油三酯，总胆固醇和低密度脂蛋白而非高密度脂蛋白的含量

给ob/ob小鼠尾静脉注射100μg Nesfatin-1，3小时后取其血样进行血脂分析。注射nesfatin-1小鼠血液中的甘油三酯，总胆固醇和低密度脂蛋白均有不低于5％的降低，而高密度脂蛋白却不受影响(图15)。

实施例8：由PPAR-Gamma和AMPK介导Nesfatin-1的抗糖尿病作用

将PPAR-Gamma的不可逆抑制剂GW9662以每克体重0.45μg的剂量尾静脉注射于db/db小鼠。30分钟后，再尾静脉注射100μg nesfatin-1，6小时内检测其血糖水平。

注射nesfatin-1前注射过GW9662的小鼠血糖水平没有下降。相反，没有预先注射GW9662的db/db小鼠，注射nesfatin-1后其血糖水平显著降低(见上文)。因此，在db/db小鼠中GW9662完全抑制了nesfatin-1的抗糖尿病作用，表明nesfatin-1的抗糖尿病作用是由PPAR-Gamma介导的(图16)。

Compound C是5’-单磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)的专一性抑制剂。将其以每千克体重20mg的剂量腹腔注射于db/db小鼠，接着尾静脉注射100μg nesfatin-1，6小时内检测其血糖水平。

注射nesfatin-1前注射过化合物C的小鼠血糖水平没有下降。相反，没有预先注射化合物C的db/db小鼠，注射nesfatin-1后其血糖水平显著降低。因此，在db/db小鼠中化合物C完全抑制了nesfatin-1的抗糖尿病作用，表明nesfatin-1的抗糖尿病作用也能由AMPK介导(图16)。

实施例9：Nesfatin-1大分子量类似物

人们发现nesfatin-1能够在神经心理学方面影响大鼠，这体现在增加其焦虑感和恐惧相关的行为。有效降低血糖水平却无法穿透血脑屏障(BBB)的大分子量nesfatin-1类似物的制备方法如下。例如，我们可将nesfatin-1和白蛋白经化学偶联制得大分子化合物。

白蛋白-nesfatin-1偶联物的合成

20mg nesfatin-1(0.002mmol)溶解于5mL 0.1M PBS(pH7.2)形成澄清溶液，4mg(0.01mmol)SMPT(4-琥珀酰亚胺氧羰基-a-甲基-[2-硫代吡啶]甲苯)溶解于乙腈至10mg/ml的浓度。将SMPT溶液逐滴加入nesfatin-1溶液中，同时快速搅拌。该混合物室温搅拌过夜，然后对0.1M PBS和10mM EDTA透析出去多余的物质并改换溶液体系。84mg牛血清白蛋白(0.0013mmol)溶解于8mL PBS-EDTA溶液，然后加入到处理过的nesfatin-1溶液中。利用分光光度计测量离去基团吡啶-2-硫酮(343nm处最大吸收)来衡量偶联效果。室温反应48小时后，多余的吡啶-2-硫酮用0.4mg半胱氨酸中和。经尺寸排阻色谱去除游离的和修饰的nesfatin-1，即得到偶联物。在整个反应过程中，用10％SDS-PAGE检测对偶联反应进行的程度。

尽管SMPT分子的摩尔数多出4倍，分析高效液相色谱依然在溶液中检测出约20-30％游离的nesfatin-1。48小时后，偶联反应基本停止，此时343nm处光吸收没有显著增加。SDS-PAGE结果同样显示，48小时反应后没有明显变化。从SDS-PAGE结果估算，白蛋白-nesfatin-1偶联产物的产率约50-60％。

实施例10：大分子量nesfatin-1类似物能够不穿透血脑屏障降低血糖水平

将I¹²⁵标记的白蛋白-nesfatin-1偶联产物静脉注射于db/db小鼠和C57B1/6J小鼠体内。在注射后的0、3、5、10、30和60分钟时取出脑组织，用伽玛计数器测量其放射性。相同量的放射性NaI¹²⁵作为阳性对照。

将250μg白蛋白-nesfatin-1偶联产物尾静脉注射于db/db小鼠。6小时内检测其血糖水平。在任意时间点均未在小鼠脑部测得放射性。相反，在脑部注射NaI¹²⁵的小鼠中，3-30分钟时脑部能检测到放射性，随时间推移逐渐降低。上述结果表明，白蛋白-nesfatin-1偶联产物不能穿过血脑屏障从循环系统进入脑部。静脉注射白蛋白-nesfatin-1偶联产物在6小时内显著地将db/db小鼠的血糖水平降低50％(图17)。

实施例11：实验操作程序

动物饲养

C57BLKS/J Lepr^+/-小鼠，C57Bl/6J plg^+/-和lep^+/-小鼠购自Jackson实验室(BarHarbor，ME)。所有的实验动物均饲养于无特定的病原体(SPF)的环境中，12小时明暗周期，自由摄食。在动物实验中的所有程序都符合美国国立卫生研究院(NIH)动物饲养指南，并经实验动物伦理委员会的批准。

plg^-/-lepr^-/-、plg^-/-lep^-/-小鼠的建立和基因分型

将plg^+/-小鼠与lepr^+/-和lep^+/-小鼠杂交生成plg^+/-lepr^+/-和plg^+/-lep^+/-小鼠。这些小鼠将用于在db/db和ob/ob小鼠中建立纤溶酶原缺陷型，即plg^-/-lepr^-/-和plg^-/-lep^-/-小鼠。

小鼠剪尾，提取基因组DNA，PCR，将小鼠基因型分为：lepr野生型、lepr突变型、lep野生型、lep突变型、纤溶酶原野生型和纤溶酶原突变型。引物序列如下：

lepr-wild-type-F：5′-TAC ATT TTG ATG GAG GG-3′(SEQ ID NO：1)；lepr-mutant-F：5′-TACATT TTG ATG GAG GT-3(SEQ ID NO：2)；lepr-same-R：5′-GGA ATC TAA TAT GGA AG-3′(SEQ ID NO：3)；lep-wild-type-F：5′-TGA CCT GGA GAA TCT CC-3′(SEQ ID NO：4)；lep-mutant-F：5′-TGA CCT GGA GAA TCT CT-3′(SEQ ID NO：5)；lep-same-R：5′-CAT CCAGGC TCT CTG GC-3′(SEQ ID NO：6)；plg-wild-type-F：5′-TGT GGG CTC TAA AGA TGGAAC TCC-3′(SEQ ID NO：7)；plg-mutant-F：5′-GTG CGA GGC CAG AGG CCA CTT GTGTAG CG-3′(SEQ ID NO：8)；plg-same-R：5′-TGT GGG CTC TAA AGA TGG AACTCC-3′(SEQ ID NO：9)。

体重、进食量、空腹血糖及血清胰岛素测定

将断奶后的小鼠饲养在标准饮食环境中，并监控至少24周。每周进行体重测定，每日记录饮食量，并且在5、10和15周龄时计算该周的平均值。在小鼠8、16和24周龄时进行18小时的禁食，尾静脉取血，用血糖仪(Roche，Indianapolis，IN)测定空腹血糖。用ELISA(ALPCO，Salem，NH)测定血清胰岛素水平。每种基因型(plg^+/+lepr^-/-、plg^-/-lepr^-/-、plg^+/+lepr^+/+、and plg^-/-epr^+/+)的两种性别至少各8只小鼠将用于研究。

葡萄糖耐受性试验(GTT)

在腹腔葡萄糖耐受性试验(IP-GGT)中(Zheng et al，2004)，12周龄小鼠置于洁净的笼盒中，于下午4点禁食，次日上午10点按每克体重1mg的剂量静脉注射葡萄糖，测定注射前以及注射后的第10、20、30、60、90、120和180分钟的血糖水平。

在静脉葡萄糖耐受性试验(IV-GGT)中，小鼠按每克体重1mg或1.5mg的剂量静脉注射葡萄糖并置于洁净笼盒中，测定注射前以及注射后的第5、10、20、30、60和120分钟的血糖水平。

用高效液相色谱分离Pladin

采用眼球摘除术取血制备新鲜小鼠血清。将glg^-/-lepr^-/-和db/db小鼠血清直接利用Waters Delta 600E/2487/717高效液相色谱分离系统，利用C18反相柱(4.6x250mm，5μm，Hambon，Zhangjiagang，CN)进行分析，用20％-40％乙腈(含0.1％TFA)以1ml/分钟的流速线性梯度洗脱20分钟(Enriori et al.，2007)。从plg^-/-lepr^-/-小鼠血清洗脱得到的与db/db小鼠相比不同组分被收集并用Applied Biosystems 4800蛋白质组学分析仪(AppliedBiosystems)进行分子量测定。采用分子量3000至20000道尔顿的范围进行线性模式分析获得质谱结果。

蛋白质质谱鉴定

HPLC-C18分离得到的样品用15％SDS-PAGE进一步分离。每个样品的整条泳道被切割成1.5mm宽的凝胶片，用胰蛋白酶消化后通过串联质谱用Applied Biosystems 4800蛋白质组学分析仪进行分析。在反射模式下，对其进行肽质量指纹图谱分析(PMF)就二级串联质谱分析(MS/MS)。利用MASCOT对蛋白序列数据库进行搜索确定目标蛋白(http://www.matrixscience.com/Matrix Science)。搜索参数如下：允许误差-0.3Da；修饰类型-氧化(M)脲甲基化(C)；酶-胰蛋白酶。

脑室(i.c.v.)注射

实验动物先预置一安全留置针，并在脑室注射前进行至少一周的清洗。未经麻醉，在5分钟内将总共5μL待测物质如nesfatin-1(25pmol)或rPladin(25pmol)注入第三脑室。该实验在黑暗期(18:00点)开始时进行，动物自由摄食饮水。脑室注射3小时后进行进食量检测。

静脉(i.v.)或腹腔(i.p.)注射

未经麻醉，小鼠放置于固定管中，将总共150μL的待测物质如nesfatin-1或rPladin尾静脉注射。放回笼盒中，自由摄食饮水。在腹腔注射实验中，将总体积为200μL的待测物质直接腹腔注射于未经麻醉的小鼠体内。

链脲菌素(STZ)诱导的1型糖尿病小鼠

10周龄的雄性C57BL/6J小鼠，连续两天以100μg/g/day的剂量腹腔注射链脲菌素(溶于100mmol/L柠檬酸钠(pH 4.5))。尾静脉取血，用葡萄糖氧化酶实验测量血糖水平。在注射链脲菌素后，当空腹血糖读数超过16mmol/L时，该小鼠被认为是1型糖尿病的小鼠。如果血糖水平高于30mmol/L，则立即对该鼠注射16ng猪胰岛素(万邦，徐州，中国)避免血糖过高带来的危险。对STZ诱导的1型糖尿病小鼠静脉注射rPladin(10nmol/只)，或静脉注射同剂量rPladin的同时皮下注射胰岛素(2ng/只)。

热量限制

将8周龄db/db小鼠分成以下两组，热量限制(CR)和自由摄食饮水组。对比于后者的自由摄食，CR组逐渐进行30％的热量限制如前所述(Miller等，2002)，第一周热量摄入为对照组的90％，第二周80％，剩余时间均为70％。

重组Pladin的定点突变和基因表达

利用E.coli的优化密码子，根据pladin的氨基酸序列合成编码pladin的cDNA，并插入表达His标记的载体pladin-pET28a。构建的载体转染到E.coli菌株Rosetta细胞中。在10升细菌培养物中加入1mmol/L IPTG诱导蛋白表达。通过Ni-NTA Superflow(QIAGEN)亲和层析将His标记的rPladin从可溶性裂解物中纯化出来。肠激酶切割之后，rPladin用反相-C18柱高效液相色谱法进一步纯化。rPladin的定点突变是以pladin-pET28a质粒作为模板，用突变BEST试剂盒(TaKaRa)。对重组nesfatin-1也进行同样的操作。

乙酰化和白蛋白偶联

用N-乙酰基咪唑乙酰化rPladin(Furth and Hope，1970)，经制备型反相-C18-高效液相色谱纯化后用质谱进行鉴定。同时，rPladin和乙酰化rPladin通过SMPT与牛血清白蛋白进行偶联(Ding et al.，2003)。偶联物通过排阻色谱纯化并通过10％SDS-PAGE和凝胶过滤高效液相色谱法进行分析鉴定。

PPAR-γ拮抗剂GW9662和AMPK抑制剂化合物C对rPladin降血糖作用的影响

将16到18周龄的db/db mice静脉注射0.45μg/g的GW9662(Sigma，St.Louis，MO)或腹腔注射20μg/g的罗格列酮(Sigma，St.Louis，MO)或化合物C(Sigma，St.Louis，MO)，然后随机静脉注射10nmol rPladin或相同体积的缓冲液。注射后3小时，用血糖仪(Roche，Indianapolis，IN)检测血糖水平。

统计分析

如图表说明所述，数据表示为平均数±平均标准差(±SEM)的形式。所有数据均代表至少两次不同实验。用双尾学生t检验对单个数据点进行比较。当P值小于0.05时，认为有统计学意义上的显著差异。

实施例12：Plasminogen(纤溶酶原)缺陷型的db/db与ob/ob小鼠血糖与血清中胰岛素含量正常，小鼠体重减少

曾有报道纤溶酶原缺陷的小鼠与同龄野生型小鼠比较体重略有下降(Hoover-Plow etal.，1999)。虽然体重差别并不明显，但这个结果仍然引起了我们的关注。我们将瘦素基因敲除的ob/ob小鼠与瘦素受体基因敲除db/db小鼠又进行了纤溶酶原的基因敲除，以此来观察纤溶酶原缺陷对肥胖小鼠是否也存在体重的影响。瘦素或其受体基因敲出后的小鼠具有肥胖，糖尿病症状，不育，贪食以及活动少等特征(Chua et al.，1996)。这篇专利中我们发现纤溶酶原敲除后不仅这两种小鼠的体重有明显下降，db/db小鼠的糖尿病症状也得到显著改善。plg^-/-lepr^-/-与plg^-/-lep^-/-小鼠的体重及食物的摄取与同龄的plg^+/+lepr^-/-及原型db/db肥胖小鼠相比明显下降。lepr^-/-db/db小鼠的高血糖与高胰岛素特征经纤溶酶原敲除后趋向正常(见图7)。在腹腔葡萄糖耐受实验(IP-GTT)中，plg^-/-lepr^-/-小鼠与plg^+/+lepr^-/-相比对腹腔注射葡萄糖反应有较好的耐受性。

实施例13：Pladin的发现

在plg^-/-lepr^-/-的db/db小鼠的血清中，我们发现了一个天然的与一般的db/db小鼠的血清比较含量高出很多的多肽(见图8A)。通过HPLC C18柱纯化后(见图9A)，经MALDI-TOF质谱鉴定其分子量为8，119Dalton(见图9B)。经胰蛋白酶酶解及MALDI-TOF二级质谱鉴定其序列为TKVHNTEPVENARIEPPDTGLYYDEYLKQVIEVLETDPHFREKLQKADIEEIRSGRLSQELDLVSHKVR(SEQ ID NO：23)(见图9C-E)。通过Blast软件分析发现这个多肽是nucb2(nucleobindin-2)的片段序列。我们把它取名为Pladin，是Plasmin anti-diabetic抗糖尿病(或与抗糖尿病相关)的nucb2多肽的缩写。Pladin在正常小鼠，大鼠，兔子及人的血浆中均存在。之前有报道nucb2片段含82个氨基酸残基的多肽nesfatin-1，nesfatin-1被推断为nucb2在激素原转换酶蛋白水解作用下的产物(Oh-I et al.，2006)。作为一个影响食欲的分子，nesfain-1从没有被报道过对糖代谢有影响，而这82个氨基酸序列中包含有pladin中的69个氨基酸残基。为了进一步研究这些nucb2多肽，我们以pET28a为载体在大肠杆菌中表达制备重组的pladin(rPladin)与nesfatin-1，并通过HPLC-C18纯化。(重组和纯化的技术为本领域技术人员熟知的技术)

实施例14：rPladin的降血糖作用是时间，剂量与胰岛素依赖的

自由喂养的db/db小鼠的血糖可高达25mmol/L.静脉注射10mmol的rPladin能明显降低db/db这类小鼠的血糖，但对瘦的野生型鼠或是饥饿状态的db/db鼠却没有显著作用(见图8B)。另外这种降血糖的作用是剂量与时间依赖的(见图8C，D)。在做野生型老鼠的静脉注射葡萄糖耐受实验中发现10nmmol rPladin能明显提高注射1.5g/kg小鼠葡萄糖的血糖吸收，却不能提高注射1.0g/kg小鼠葡萄糖的血糖吸收(见图8E)。静脉注射rPladin不能明显地影响小鼠包括db/db在内的血中胰岛素含量。从这些结果我们推测rPladin的降血糖作用是胰岛素依赖的。事实证明，在不分泌胰岛素的链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病模型鼠中静脉注射rPladin不能降血糖，但皮下注射胰岛素后，rPladin的降血糖作用变得明显(见图8F)。

实施例15：rPladin减少食欲的作用与降血糖活性不相关

与nesfatin-1相似，每只大鼠30nmol的腹腔注射或25pmol的脑室注射rPladin或nesfatin-1能明显降低大鼠的食欲(见图10A)，有趣的是我们首次发现静脉注射10nmol的nesfatin-1能降低db/db小鼠的血糖浓度，而腹部注射却没有此功能(见图10B)。

将25pmol的rPladin或nesfatin-1脑室注射到db/db小鼠，小鼠进食量明显减少，而小鼠的高血糖并没有降低(见图10B)。结果说明降血糖作用是外周性的而不是神经性的，与降低食欲的作用没有关系。

实施例16：热量限制不能使db/db小鼠的血糖降低

因为纤溶酶原缺陷db/db小鼠血清中pladin含量较高，在改善糖尿病症状的同时能明显减少食物的摄取(见图8A)，是否是因为进食量的减少而导致血糖降低？实验证明db/db小鼠的热量限制不能改变血中高血糖与血清中的胰岛素含量(见图10C，D)。这也意味着进食量的减少不是导致纤溶酶原缺陷降血糖功能的关键因素。

实施例17：纤溶酶能使Pladin失活

仔细观察pladin的氨基酸序列，我们可以发现有几个可能可以被纤溶酶酶切的位点(见图11A)。当rPladin与纤溶酶在体外温育一段时间，rPladin迅速降解(见图11B)同时降血糖的作用也消失了(见图11C)。另外pladin中赖氨酸被丙氨酸取代的两个变体A4(Lys²⁸→Ala)，A5(Lys²⁸→Ala)以及乙酰基化后的rPladin能抵抗纤溶酶的降解作用(见图11B)。

从图11的数据中我们推测plasmin会使rPladin失活，这可能是导致纤溶酶原缺陷的db/db小鼠的血糖正常的部分原因。尽管plasmin被公认为是在外周生成(Cushman etal.，1999；Folsom et al.，2001；Sakkinen et al.，1999)，但不能确定除了finbin外血液中是否还存在plasmin的其他底物。为了证明plasmin会使rPladin失活这一假设，我们做了以下实验。

首先，氨甲环酸(AMCA)作为一个plasmin的特异性抑制剂用来模仿纤溶酶原缺陷的db/db小鼠模型。小鼠静脉注射15mg的氨甲环酸10分钟后，血清中pladin的含量提高了(见图12A)，而同样的量连续注射三天后，小鼠的食物摄取与体重减少(见图12BC)。在db/db小鼠两周龄时每天注射一次15mg氨甲环酸，连续注射10周后，小鼠在禁食状态下血糖也有明显的下降(见图12D)。

其二，rPladin静脉注射纤溶酶原缺陷的db/db小鼠后清除得很慢，而静脉注射正常小鼠却清除得很快(见图12E)，说明plamsin可能是导致rPladin在体内降解的酶。

其三，乙酰基化rPladin的制备，与未修饰的rPladin相比乙酰基化的rPladin分子量增加了252(8，369versus 8，117Dalton)，它在280nm波长处没有任何吸收。因此推测有三个Tyr与三个Lys被乙酰基化。乙酰基化的rPladin仍然有降血糖活性而且保持活性的时间较未修饰的rPladin长，从6小时延长到12小时(见图13A，J)。体外实验也证明了乙酰基化的r-Pladin能抵制plasmin的酶降解作用。这些结果说明被乙酰基化的氨基酸对pladin降血糖作用没有影响(但降血糖时间延长了)，而plasmin对这些赖氨酸位点的酶降解作用是导致pladin失活的重要原因。

最后，为了降低plasmin对rPladin的降解作用，我们合成了一系列将蛋白中的精氨酸与赖氨酸取代为丙氨酸的位点突变体。13位的精氨酸与28位的赖氨酸被丙氨酸取代的突变体能明显地延长体内的活性，它们能将活性时间从6小时分别延长到12小时与18小时(见图13BC)。体外实验证明它们能抵制plasmin的酶降解作用(见图11B)。53位的精氨酸与56位的精氨酸被丙氨酸取带后，其抗血糖的活性减低至五分之一，说明了多肽片段RSGRLS(53-58)是pladin的降血糖作用所需要的区域之一(见图13E)。其他的突变体如2位，43位，46位与67位的赖氨被丙氨酸取带后，它们对pladin的活性改变并不明显(见图13D，G，H)。

总结这些数据，我们得出结论：pladin是被plasmin或是plasmin类似的对碱性氨基酸有特异性识别的蛋白水解酶降解导致失活。显然纤溶酶原缺陷的db/db小鼠之所以能有正常的血糖是因为plasmin降解Pladin的作用消失所致。

实施例18：Ser⁶⁵是降血糖功能的关键位点

65位的丝氨酸被丙氨酸取代后，rPladin的降血糖作用完全消失，可能意味着65位丝氨酸的磷酸化与去磷酸化过程与胰岛素的信号转导有重要的关联作用(见图13F)。

实施例19：乙酰化Pladin与白蛋白的偶联物不能进入脑部却能有效地降低血糖

因为nesfatin-1被认为是通过神经性途径来影响大鼠增加其焦虑感与恐惧感(Meraliet al.，2008)，我们将白蛋白与乙酰基化的rPladin偶联，偶联后的产物能有效地降低血糖并能将降血糖的有效时间延长到36个小时(见图13K)，而偶联物并不进入脑部(数据未列出)。有趣的是，当白蛋白与未修饰的Pladin偶联后，活性的有效时间与Pladin本身没有区别(见图13I)，这说明pladin与白蛋白的偶联并没有起到降低蛋白酶降解Pladin的作用。

实施例20：罗格列酮不影响rPladin体内的降血糖作用，但GW9662与Compound C会消除其降血糖作用

若小鼠预先注射PPAR-γ拮抗剂GW9662与AMPK抑制剂Compound C，rPladin的降血糖作用就会消失。而预先注射PPAR-γ激动剂罗格列酮却对rPladin的降血糖作用没有影响(见图12F)。这说明了rPladin的降血糖作用与胰岛素的信号转导有密切联系。

实施例21：rPladin突变体

rPladin的突变体A90可显著增加体内降血糖作用的持续时间。A90的体内活性作用时间由6小时显著增加至24小时以上(图14)。

A90

TKVHNTEPVENARIEPPDTGLYYDEYAKAAAAALETDPHFREKLQKADIEEIRSGRLSQELDLVSHKVR(SEQ ID NO：19)

rPladin的突变体A91可显著增加体内降血糖作用的持续时间。A91的体内活性作用时间由6小时显著增加至24小时以上(图14)。

A91

TKVHNTEPVENARIEPPDTGLYYDEYSAAAALETDPHFREKLQKADIEEIRSGRLSQELDLVSHKVR(SEQ ID NO：20)

rPladin的突变体A92可显著增加体内降血糖作用的持续时间。A92的体内活性作用时间由6小时增加至12小时以上(图14)。

A92

TKVHNTEPVENARIEPPDTGLYYDEYAALETDPHFREKLQKADIEEIRSGRLSQELDLVSHKVR(SEQ ID NO：21)

实施例22：Pladin降血糖作用的关键序列

一段含有20个氨基酸ADIEEIRSGR LSQELDLVSH(SEQ ID NO：22)的合成多肽，即pladin的C末端序列，具有降血糖作用。当通过静脉注射给予db/db小鼠时，它的降血糖活性是等摩尔的rPladin的1/3(图18)。

实施例23：一段和Pladin关键序列(20个氨基酸残基)具有同源性的NUCB1多肽

一段含有20个氨基酸ANAEDIKSGKLSQELDFVSH(SEQ ID NO：24)的合成多肽，即NUCB1的一段序列，被发现同pladin的关键序列(SEQ ID NO：22)具有高度同源性。它具有降血糖作用，当通过静脉注射给予db/db小鼠时，同等摩尔的关键序列多肽(SEQ ID NO：22)的降血糖活性相同(图18)。它们的氨基酸序列排列如下：

ADIEEIRSGR LSQELDLVSH(SEQ ID NO：22)

ANAEDIKSGK LSQELDFVSH(SEQ ID NO：24)

实施例24：NUCB1的降血糖作用

基于实施例23中的实验结果，表达了一段含有78个氨基酸的重组蛋白质多肽(SEQID NO：25)，即NUCB1的N末端序列，此段序列包括了SEQ ID NO：24。它也具有降血糖作用，当通过静脉注射给予db/db小鼠后3小时内，它的降血糖活性至少是等摩尔的rPladin或nesfatin-1的2倍(图18)。SEQ ID NO：25同pladin具有68％的同源性。

VPVDRAAPPQ EDSQATETPD TGLYYHRYLQ EVINVLETDG HFREKLQAANAEDIKSGKLS QELDFVSHNV RTKLDELK(SEQ ID NO：25)

pladin(SEQ ID NO：23)与NUCB1肽段(SEQ ID NO：25)的序列对比：

--TKVHNTEPVENARIEPPDTGLYYDEYLKQVIEVLETDPHFRE(来源于SEQ IDNO：23)

VPVDRAAPPQEDSQATETPDTGLYYHRYLQEVINVLETDGHFRE(来源于SEQ IDNO：25)

KLQKADIEEIRSGRLSQELDLVSHKVR(来源于SEQ ID NO：23)

KLQAANAEDIKSGKLSQELDFVSHNVRTKLDELK(来源于SEQ ID N0：25)

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序列表

<110>刘建宁

<120>一种多肽及其在制药中的应用

<150>US 61/159,574

<151>2009-03-12

<150>US 61/253,603

<151>2009-10-21

<160>25

<210>1

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>聚合酶链反应鉴定基因型用引物

<400>1

tacattttga tggaggg 17

<210>2

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>聚合酶链反应鉴定基因型用引物

<400>2

tacattttga tggaggt 17

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>聚合酶链反应鉴定基因型用引物

<400>3

ggaatctaat atggaag 17

<210>4

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>聚合酶链反应鉴定基因型用引物

<400>4

tgacctggag aatctcc 17

<210>5

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>聚合酶链反应鉴定基因型用引物

<400>5

tgacctggag aatctct 17

<210>6

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>聚合酶链反应鉴定基因型用引物

<400>6

catccaggct ctctggc 17

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>聚合酶链反应鉴定基因型用引物

<400>7

tgtgggctct aaagatggaa ctcc 24

<210>8

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>聚合酶链反应鉴定基因型用引物

<400>8

gtgcgaggcc agaggccact tgtgtagcg 29

<210>9

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>聚合酶链反应鉴定基因型用引物

<400>9

tgtgggctct aaagatggaa ctcc 24

<210>10

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实时逆转录聚合酶链反应引物

<400>10

tgtgtaaggc tgcacgagtc 20

<210>11

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实时逆转录聚合酶链反应引物

<400>11

ggcagtagca aaaggcattg 20

<210>12

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实时逆转录聚合酶链反应引物

<400>12

aggcttgaag acccttccat 20

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实时逆转录聚合酶链反应引物

<400>13

acaggcagac tggtttcagg 20

<210>14

<211>14

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实时逆转录聚合酶链反应引物

<400>14

cgcccgtgtt tcca 14

<210>15

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实时逆转录聚合酶链反应引物

<400>15

tgacccatga cgtacttcc 19

<210>16

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实时逆转录聚合酶链反应引物

<400>16

aacgaccctt cattgac 17

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>实时逆转录聚合酶链反应引物

<400>17

ccacgacata ctcagcac 18

<210>18

<211>82

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>小鼠nesfat in-1的氨基酸序列

<400>18

Val Pro Ile Asp Val Asp Lys Thr Lys Val His Asn Thr Glu Pro

1 5 10 15

Val Glu Asn Ala Arg Ile Glu Pro Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr

20 25 30

Asp Glu Tyr Leu Lys Gln Val Ile Glu Val Leu Glu Thr Asp Pro

35 40 45

His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Lys Ala Asp Ile Glu Glu Ile Arg

50 55 60

Ser Gly Arg Leu Ser Gln Glu Leu Asp Leu Val Ser His Lys Val

65 70 75

Arg Thr Arg Leu Asp Glu Leu

80

<210>19

<211>69

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>rPladin的突变体A90的氨基酸序列

<400>19

Thr Lys Val His Asn Thr Glu Pro Val Glu Asn Ala Arg Ile Glu

1 5 10 15

Pro Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Asp Glu Tyr Ala Lys Ala Ala

20 25 30

Ala Ala Ala Leu Glu Thr Asp Pro His Phe Arg Glu Lys Leu Gln

35 40 45

Lys Ala Asp Ile Glu Glu Ile Arg Ser Gly Arg Leu Ser Gln Glu

50 55 60

Leu Asp Leu Val Ser His Lys Val Arg

65

<210>20

<211>67

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>rPladin的突变体A91的氨基酸序列

<400>20

Thr Lys Val His Asn Thr Glu Pro Val Glu Asn Ala Arg Ile Glu

1 5 10 15

Pro Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Asp Glu Tyr Ser Ala Ala Ala

20 25 30

Ala Leu Glu Thr Asp Pro His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Lys Ala

35 40 45

Asp Ile Glu Glu Ile Arg Ser Gly Arg Leu Ser Gln Glu Leu Asp

50 55 60

Leu Val Ser His Lys Val Arg

65

<210>21

<211>64

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>rPladin的突变体A92的氨基酸序列

<400>21

Thr Lys Val His Asn Thr Glu Pro Val Glu Asn Ala Arg Ile Glu

1 5 10 15

Pro Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Asp Glu Tyr Ala Ala Leu Glu

20 25 30

Thr Asp Pro His Phe Arg Glu Lys Leu Gln Lys Ala Asp Ile Glu

35 40 45

Glu Ile Arg Ser Gly Arg Leu Ser Gln Glu Leu Asp Leu Val Ser

50 55 60

His Lys Val Arg

<210>22

<211>20

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>合成多肽的氨基酸序列

<400>22

Ala Asp Ile Glu Glu Ile Arg Ser Gly Arg Leu Ser Gln Glu Leu

1 5 10 15

Asp Leu Val Ser His

20

<210>23

<211>69

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>经胰蛋白酶酶解及MALDI-TOF二级质谱鉴定的氨基酸序列

<400>23

Thr Lys Val His Asn Thr Glu Pro Val Glu Asn Ala Arg Ile Glu

1 5 10 15

Pro Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr Asp Glu Tyr Leu Lys Gln Val

20 25 30

Ile Glu Val Leu Glu Thr Asp Pro His Phe Arg Glu Lys Leu Gln

35 40 45

Lys Ala Asp Ile Glu Glu Ile Arg Ser Gly Arg Leu Ser Gln Glu

50 55 60

Leu Asp Leu Val Ser His Lys Val Arg

65

<210>24

<211>20

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>经胰蛋白酶酶解及MALDI-TOF二级质谱鉴定的氨基酸序列

<400>24

Ala Asn Ala Glu Asp Ile Lys Ser Gly Lys Leu ser Gln Glu Leu

1 5 10 15

Asp Phe Val Ser His

20

<210>25

<211>78

<212>PRT

<213>未知

<220>

<223>重组蛋白质NUCB1多肽的氨基酸序列

<400>25

Val Pro Val Asp Arg Ala Ala Pro Pro Gln Glu Asp Ser Gln Ala

1 5 10 15

Thr Glu Thr Pro Asp Thr Gly Leu Tyr Tyr His Arg Tyr Leu Gln

20 25 30

Glu Val Ile Asn Val Leu Glu Thr Asp Gly His Phe Arg Glu Lys

35 40 45

Leu Gln Ala Ala Asn Ala Glu Asp Ile Lys Ser Gly Lys Leu Ser

50 55 60

Gln Glu Leu Asp Phe Val Ser His Asn Val Arg Thr Lys Leu Asp

65 70 75

Glu Leu Lys

Claims

1.一种（a）、（b）、（c）或（d）的多肽：

（a）：由SEQ ID NO:22所示的氨基酸序列组成的多肽；

（b）：由SEQ ID NO:24所示的氨基酸序列组成的多肽；

（c）：由SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO:23或SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列组成的多肽；

（d）由SEQ ID NO:23中发生Arg¹³→Ala、Lys²⁸→Ala、Lys⁴³Lys⁴⁶→Ala、Lys⁶⁷→Ala、Lys²→Ala或Arg⁵³Arg⁵⁶→Ala取代的氨基酸序列组成的多肽。

2.权利要求1中任一多肽、该多肽的乙酰化产物、该多肽与白蛋白的复合物、该多肽降解水解酶的抑制物、或者含有该多肽及其降解水解酶抑制物的组合物在制备降血糖药物和/或降血脂药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于降血糖药物为治疗糖尿病的药物；降血脂药物为降低血液中甘油三酯、总胆固醇或低密度脂蛋白的药物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于糖尿病为I型或II型糖尿病。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于该多肽降解水解酶的抑制物为纤溶酶抑制物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于该多肽降解水解酶的抑制物是抑肽酶、氨甲环酸或氨基己酸。