CN108339114A - 抑制胰岛β细胞凋亡的药物及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种抑制胰岛β细胞凋亡的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原，同时本发明涉及用于抑制胰岛β细胞凋亡的药物。

Description

抑制胰岛β细胞凋亡的药物及其用途

技术领域

本发明涉及一种抑制胰岛β细胞凋亡的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原，同时本发明涉及用于抑制胰岛β细胞凋亡的药物。

背景技术

糖尿病(diabetes mellitus,DM)是一种常见的具有遗传倾向的葡萄糖代谢异常和内分泌障碍性疾病，是由绝对性或相对性胰岛素分泌不足所引起。2015年，全世界有4.15亿糖尿病患者，预计到2040年，糖尿病患病人数将达到6.42亿^[1]。糖尿病是严重危害人类健康的重大疾病之一。

糖尿病的主要表现为糖代谢异常以及脂肪、蛋白质等物质的代谢紊乱，而长期的高血糖状态会导致严重的糖尿病并发症，包括微血管并发症、糖尿病肾病、糖尿病心肌病、糖尿病神经系统病变、糖尿病皮肤病变和糖尿病合并感染等。其中糖尿病肾病以及糖尿病神经系统病变对患者生活质量影响巨大，危害严重。

临床上常见的糖尿病可以分为四种类型：1型糖尿病(type 1 diabetes， T1DM)、2型糖尿病(type 2 diabetes，T2DM)、妊娠期糖尿病、特殊类型糖尿病。其中，以T1DM和T2DM患者最为多见，妊娠期糖尿病和特殊类型糖尿病患者相对较少。

T1DM被认为与遗传因素、环境因素(如病毒感染、致糖尿病化学物质、饮食因素)和自身免疫因素相关。研究表明，T1DM相关的基因位点至少有17个，定位在不同的染色体。环境因素方面，对T1DM发病有影响的环境因素包括病毒感染、致糖尿病化学物质及饮食因素，其中病毒因素最为重要。目前已经发现腮腺炎、风疹病毒、巨细胞病毒等与T1DM发病有关。其机制在于病毒可以直接破坏胰岛β细胞，并在病毒损伤胰岛β细胞后激发自身免疫反应进一步损伤胰岛β细胞。致糖尿病的化学物质如四氧嘧啶、链脲佐菌素(STZ)、喷他脒等作用于胰岛β细胞，导致胰岛β细胞的破坏。自身免疫因素包括体液免疫和细胞免疫。体液免疫表现为患者血液循环中存在多种抗胰岛β细胞的自身抗体。细胞免疫主要表现为在胰岛炎症浸润细胞和胰岛β细胞表面可以观察到HLA-DA抗原的异常表达和IL- 2受体与胰岛细胞表面HLA-1类抗原的过度表达，而外周血的CD4+/CD8+ 比例，以及IL-1、TNF-α、INF-γ水平升高。这些因素导致的病理变化集中于胰岛β细胞破坏，使得体内胰岛素水平绝对降低，引起T1DM，因此 T1DM被考虑是一种自身免疫性疾病。

T2DM是一种多基因遗传性疾病，一般认为它的发生是多源性的，其中环境因素和遗传因素共同作用导致胰岛素抵抗，表现为相同水平浓度的胰岛素因为机体的抵抗作用而无法起到正常水平的作用。而机体为了达到正常血糖水平，将会过量分泌胰岛素以缓解胰岛素使用的“低效”状态，长此以往对胰岛β细胞的要求越来越高，最终导致胰岛β细胞“过度工作”而自身损伤，进展为胰岛素绝对缺乏。

DM的发病机制

DM发病机制复杂，主要与家族遗传倾向、种族异质性、胰岛素受体缺陷、胰岛素受体底物损伤、蛋白酪氨酸磷酸酶相关基因上调、过度免疫炎性反应、脂毒性、氧化应激、及线粒体损伤等相关^[2-3]。

1.游离脂肪酸

游离脂肪酸水平升高既是胰岛素抵抗的发病原因之一，也是胰岛素抵抗状态的重要特征之一。在遗传因素或环境因素的作用下，血液中的游离脂肪酸水平升高，当超过脂肪组织的存储能力就会导致胰岛素抵抗的发生。研究显示，长期的高脂饮食将会导致胰岛β细胞发生功能异常，这是因为高脂饮食除了引发外周胰岛素抵抗还会使腹腔脂肪含量升高和胰岛素抑制脂肪分解能力降低，从而促使游离脂肪酸含量升高，继而抑制胰岛素受体及其底物IRS-l、1RS-2的酪氨酸位点磷酸化，抑制P13K的活性，导致胰岛素信号转导通路受阻形成胰岛素抵抗。

2.炎性反应

1)炎症与胰岛素抵抗

T2DM是一种轻度非特异性炎性疾病。近年来的研究显示，炎症导致胰岛素抵抗的主要机制是炎性因子与胰岛素受体底物的信号转导出现交叉，一方面非特异性炎症产生的炎性因子对IRS/PI3K信号通路出现了阻碍作用，而另一方面炎性因子激活的一系列激酶会诱导IRS的丝、苏氨酸位点的磷酸化从而对正常的酪氨酸磷酸化产生阻碍，最终使得胰岛素信号转导能力下降诱发胰岛素抵抗^[2-3]。

在靶细胞中，胰岛素与其受体结合能激活受体，之后细胞内的信号转导通路产生一系列细胞内转导分子与酶促级联反应完成信号在胞内的逐级传递并放大，信号最后传至靶器官而产生一系列的生物学效应。信号传导通路主要有两条，一个是IRS-1-PI3K-PKB/AKT途径，另一个是丝裂原活化蛋白激酶(Shc/Raf/MAPK)途径。在第一条通路中，首先是在外源性胰岛素和/或葡萄糖刺激下发生胰岛素与其受体结合，从而激活了受体的内源性酪氨酸激酶。激活的酪氨酸激酶在实现自身的磷酸化的同时诱导了胰岛素受体底物IRS的酪氨酸位点磷酸化。活化的IRS迁移至细胞膜上，通过磷酸酪氨酸结合域(PTB)将磷酸酪氨酸锚定在IRS酪氨酸激酶上，酪氨酸磷酸化的IRS通过其SH2结构域招募到PI3K的调节亚单位P85。P85与磷酸肌醇的3磷酸分子结合，将磷脂酰肌醇一磷酸(PIP)转化为磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)及磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3)，它们是胰岛素和其他生长因子的第二信使，是下游信号分子磷酸肌醇依赖的蛋白激酶-1(PDK1)和(或)蛋白激酶c(PKC)的某一亚型的锚定位点。PDK1可以激活蛋白激酶B(PKB，也称为Akt)和某一非典型PKC亚型。激活的PKB一边通过丝/苏氨酸磷酸化让糖原合成激酶-3(GSK3)失活，另一方面激活哺乳动物的雷帕霉素靶点(mTOR)蛋白激酶，从而诱导其下游70ku-S6激酶(p70S6K)磷酸化激活。 mTOR蛋白激酶可作为“ATP感受器”，激活p70s6K而不需要通过Ca₂ ⁺/ cAMP，实现控制蛋白的合成、加强基因的转录、促使胰岛β细胞肥大及其他生物效应。PKB可以直接诱导某些转录因子丝/苏氨酸磷酸化促进细胞有丝分裂的发生^[4-5]。在第二条通路中，Ras的激活可通过两条通路实现。 1)活化的胰岛素受体激活IRS-2蛋白，而IRS-2蛋白可将信号传递给适配蛋白生长因子受体结合蛋白2(Grb2)，再与信号蛋白GDP/GTP交换因子 (mSOS)相互作用进而能活化失活的Ras-GDP转变成的Ras-GT从而实现激活Ras。胰岛素受体直接作用使信号蛋白Shc的酪氨酸磷酸化，然后Shc 与Grb2结合经mSOS途径激活Ras。激活的Ras-GTP招募Raf丝氨酸激酶，依次使MAPK激酶、MAPK磷酸化。激活的MAPK可激活其他蛋白激酶参与诱导基因转录、调控细胞凋亡等过程^[6]。

目前已证实IRS-1的丝氨酸残基可被多种炎症激酶磷酸化，如c-Jun氨基末端激酶(JNK)、IκB激酶β(IκKβ)和蛋白激酶C(PKC)-θ。放射免疫分析法显示丝氨酸307位点是JNK磷酸化IRS-1的主要位点，它的突变会使 JNK诱导的IRS-1磷酸化和TNF对胰岛素引起的IRS-1酪氨酸磷酸化的抑制作用消失。JNK通过磷酸化IRS-1的丝氨酸307，减少了胰岛素受体底物酪氨酸磷酸化，抑制胰岛素信号的转导^[7]。Hiorsumi等发现饮食型肥胖鼠和ob/ob鼠的肝脏、肌肉、脂肪组织中JNK活性显著升高。基因敲除 (JNK1-/-)能够使饮食诱型肥胖鼠胰岛素抵抗现象减弱，缓解ob/ob鼠的肥胖、高血糖和高胰岛素血症。肥胖鼠肝脏组织IRS-1丝氨酸307位点的磷酸化水平比瘦鼠高，可是在基因敲除(JNK1-/-)的肥胖鼠中并未见升高，可见IRS-1的丝氨酸307位点是JNK在体内作用的靶点^[，8]。研究显示TNFα刺激诱导肝细胞胰岛素抵抗的模型中，JNK抑制剂可以完全阻断丝氨酸 307的磷酸化。IκKβ可通过至少两个途径影响胰岛素信号传导，可以是直接诱导IRS-1的Ser307位点磷酸化，也可以通过IκB的磷酸化，进而活化 NF-κB，通过刺激多种炎症因子的表达间接引发胰岛素抵抗。

炎症反应是感染、组织损伤和应激反应后人体免疫系统对抗这些损伤的防御性反应，同时也是糖尿病、心血管疾病和肿瘤的病因或发病机制。

早在1993年，Hotmamisligil等^[9]通过动物实验证明，胰岛素抵抗的肥胖大鼠其脂肪组织中促炎性细胞因子、TNF-α水平高。从此，众多研究者开始探讨炎症与肥胖、胰岛素抵抗之间的关系，并探究其分子发病机制。 2006年Hotmamisligil^[10]第一次提出代谢性炎症(metabolic inflammation) 这一新的医学定义，强调这种低度、慢性的全身炎症主要是由多余的营养物质和代谢物质导致的。代谢性炎症可能存在与典型炎症相类似的分子与信号的传导通路，与既往我们所认识的典型炎症不同的是，代谢性炎症并不存在红、肿、热、痛和功能障碍的症状。正常情况下，机体内环境处于稳态水平，炎症和代谢各自及相互之间均保持一种动态平衡状态。当机体发生代谢紊乱时，打破了机体这种平衡状态，引起免疫系统的失衡，激发炎症信号传导通路，促使机体释放一系列炎症因子，某些炎症因子甚至放大自身炎症反应，形成炎症瀑布效应，进一步使机体发生胰岛素抵抗，从而导致代谢综合征的发生。

研究证明TNF-α与代谢综合征有密切关系。TNF又叫恶液质素，主要由活化的巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞及T淋巴细胞产生，把由巨噬细胞产生分泌的TNF称为TNF-α，把由T淋巴细胞产生分泌的淋巴毒素叫做 TNF-β。TNF-α的生物学活性占TNF总活性的70％～95％，因此目前经常涉及的TNF大多指的是TNF-α。经过多年的研究探讨，目前已明确TNF-α与胰岛素抵抗、自身免疫性疾病、肿瘤、慢性乙型肝炎等多种疾病有关。在胰岛素抵抗的发生发展过程中TNF-α起到至关重要的作用。Swaroop等^[11]通过检测50例T2DM患者的血清TNF-α水平，得出T2DM患者TNF-α水平升高，并且与BMI、空腹胰岛素水平以及稳态模型胰岛素抵抗指数 (HOMA-IR)显著相关，提示TNF-α在T2DM发病机制中起重要作用。还有研究指出，TNF-α可以使胰岛素受体的磷酸化受到抑制，当胰岛素受体的磷酸化受到抑制时可以减少葡萄糖转运蛋白的基因表达，从而使脂蛋白脂酶的活性降低，最终可以造成脂肪的分解^[12]。

2)炎症与胰岛β细胞的凋亡

慢性低度炎症反应与胰岛β细胞功能障碍密切相关。β细胞数量减少导致的胰岛β细胞功能障碍是T2DM发病的另一重要原因，而β细胞的凋亡又是β细胞数量减少最重要的原因。由于遗传或饮食的原因，T2DM患者易发生胰岛素抵抗，患者血糖升高，高血糖状态又能促进IL-6产生，IL-6 不仅可以减少GLUT4表达，降低脂肪细胞对葡萄糖的转运，阻碍糖原合成，降低胰岛素的敏感性；同时也可以促进胰岛细胞分泌IL-6，造成恶性循环。高血糖诱导IL-1β大量产生，通过激活NF-κB、MAPK、Fas、NO等通路导致胰岛细胞凋亡，多种炎症通路相互交叉促进，加剧了胰岛细胞的凋亡，最终导致胰岛功能的衰竭^[13]。此外，IL-1β还可以介导白细胞间的相互作用，并与其他细胞因子如IFN-γ、TNF-α等相互影响制约，在β细胞损伤过程中起着重要的作用。T2DM的血脂异常会引起激素类物质如瘦素和IL- 6水平增加。瘦素可增加IL-1β的释放来诱导β细胞凋亡，还可负相调控胰岛素的分泌^[14]。ROS除导致胰岛素抵抗外，对于胰岛β细胞的损伤也有作用，氧化应激状态下，胰岛素基因转录因子的表达以及胰岛素结合位点明显减少，从而影响胰岛素的产生及分泌。其他脂肪细胞因子如TNF-α和瘦也能降低β细胞的功能^[15]。这些细胞因子的联合作用，对胰岛β细胞功能造成更明显的损伤。此外，部分炎症因子还可作用于胰岛素受体底物2的关键部位，使其丝氨酸/苏氨酸磷酸化，导致胰岛素受体底物2的降解加快，促进胰岛β细胞的凋亡。

3.氧化应激

研究表明，氧化应激是引起T2DM的发生及发展的重要因素。氧化应激是指活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)的产生与机体内抗氧化防御系统的清除之间失衡，导致ROS 和RNS产生过多，造成机体组织细胞及蛋白和核酸等生物大分子损伤^[13]。高血糖是产生氧化应激的主要原因，其通过线粒体电子传递链^[14]、葡萄糖自氧化和多元醇通路等途径^[15]增加机体内的ROS与RNS含量，其中线粒体电子传递链是产生ROS的主要途径。线粒体电子传递链主要涉及酶复合物I～IV、细胞色素c和辅酶Q，在酶复合物I和III中会持续产生少量的超氧产物，包括超氧阴离子，过氧化氢和羟基自由基，而超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶会将超氧产物催化转化成氧气和水。但在肥胖或高血糖条件下，超氧产物会大幅增加，当超氧产物的产生速率超过其移除速率时即会产生氧化应激。

多项研究^[16-18]表明，ROS可直接损伤β细胞，特别是破坏细胞线粒体结构，促进β细胞凋亡；ROS还可通过影响胰岛素信号转导通路间接抑制β细胞功能，如激活核转录因子κB(nuclear transcription factorκB,NF-κB) 信号通路，引起β细胞炎症反应；抑制胰十二指肠同源盒因子1(pancreatic and duodenal homeobox 1,PDX-1)的核质易位，抑制线粒体能量代谢，减少胰岛素合成与分泌等。氧化应激通过NF-κB通路引起β细胞损伤NF-κB为p50和RelA两个亚基组成的二聚体，在静息细胞中，与抑制蛋白IκB结合，以无活性的三聚体形式存在于胞浆中，主要参与细胞对应激、细胞因子、自由基及细菌病毒等刺激的应答及瞬时调控基因表达等^[19]。研究表明，高血糖诱导生成的ROS会通过扰乱细胞内信号转导激活NF-κB，诱导β细胞损伤^[20]。Mariappan等^[21]用吡咯烷二硫代氨基甲酸(PDTC)抑制肥胖 db/db小鼠体内NF-κB表达，发现氧化应激对小鼠β细胞线粒体的损伤程度明显减轻；Hofmann等^[22]利用抗氧化药物α-硫辛酸对糖尿病患者进行治疗，发现患者体内NF-κB活性显著降低，患者病情也有改善；Eldor等^[23]利用转基因技术特异性地抑制小鼠NF-κB的表达，明显降低了STZ诱导后小鼠的糖尿病发病率。

NF-κB作为一种多向核转录因子，激活后参与细胞增殖、细胞凋亡及炎症和免疫等多种基因的调节^[24]。在糖尿病机体中，NF-κB通过调控细胞因子和趋化因子的基因表达，如IL-1(interleukin-1)和MCP- 1(monocyte/macrophage chemoattractant protein-1)因子等，引起胰岛白细胞增多，导致β细胞损伤^[25]。另外NF-κB调控的许多基因产物如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)等又会进一步激活NF-κB，加重β细胞损伤^[26]。

Mahadev等^[27]研究显示，ROS对胰岛素信号传导有调控作用，且这种作用有多面性。在胰岛素刺激下，机体会通过Nox(NADPH oxidase)依赖机制快速产生微量的ROS，后者作为第二信使，主要通过氧化作用抑制 PTP1B的活性促进胰岛素级联反应^[28]，而用DPI(diphenyleneiodonium)抑制Nox后，胰岛素刺激的胰岛素受体(insulin receptor,InsR)与胰岛素受体底物(insulin receptor substrate,IRS)磷酸化下降48％^[29]。Loh等^[30]的研究显示生理性ROS可促进机体对胰岛素的敏感性。虽然在生理状态下，由胰岛素刺激产生的微量ROS会促进胰岛素的作用，但是长期高血糖会使机体通过线粒体途径产生大量ROS^[31]，引起胰岛素抵抗。

InsR和IRS是胰岛素信号传导通路中重要的信号元件：前者是胰岛素信号传导的起始元件，而IRS是前者与通路下游元件的连接桥梁。大量研究表明，氧化应激可通过多个途径干扰InsR和IRS的磷酸化反应，阻碍胰岛素信号传导。IKK是NF-κB的抑制亚基IκB的激活剂，在ROS刺激下 IKK可作为InsR和IRS的丝氨酸/苏氨酸磷酸化激酶，促使InsR和IRS发生丝氨酸磷酸化，正常的酪氨酸磷酸化受抑制，阻碍胰岛素信号传导^[32]。 Brownlee^[33]研究显示，IKK可直接磷酸化IRS 307位的丝氨酸残基，导致 IRS正常的酪氨酸磷酸化减弱，阻碍InsR与IRS的结合，从而引起胰岛素抵抗。

除IKK外，MAPK家族中的多个成员对InsR和IRS也有影响。JNK、细胞外调节蛋白激酶(extracellularregulated protein kinases,ERK)和p38丝裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)是MAPK家族成员，具有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性，在受到氧化应激、细胞因子和G-蛋白偶联受体激动剂等作用下可被激活。多项研究表明，JNK、ERK和p38MAPK的激活会加重InsR 和IRS的丝氨酸/苏氨酸磷酸化程度，使InsR与IRS之间的蛋白结合能力及 IRS活化下游含有SH-2结构域的信号分子的能力降低^[34-36]。

糖尿病高糖状态所致的氧化应激是多种慢性并发症形成的关键原因之一，也是诱发DNA损伤的重要因素^[37]。糖尿病发生时，细胞外液可见持续高糖。在该状态下，线粒体电子传递链产生的电子明显增多，产生过多 ROS，造成细胞内环境和脂质、蛋白质和DNA等生物大分子损伤。机体在有氧代谢途径中产生的活性氧作为一种突变诱导剂，可将DNA链上的鸟嘌呤氧化为8-羟基鸟嘌呤(8-hydroxy-2'-deoxyguanosine,8-OHdG)。在DNA复制过程中，8-OHdG易与腺嘌呤错配，导致G:C到T:A颠换突变，形成 DNA损伤。此外，ROS还会引起其他形式的DNA损伤，包括DNA链断裂、DNA位点突变、DNA双链畸变和原癌基因与肿瘤抑制基因突变等。同时，DNA损伤也可能加剧ROS及氧化应激过程，如DNA损伤可通过 H2AX-还原型辅酶Ⅱ氧化酶1(Nox1)/Rac1通路诱导ROS产生。ROS进一步促使大量Ca₂ ⁺进入线粒体，引起细胞坏死和凋亡，或直接损伤线粒体，引起线粒体功能障碍，进而损伤胰岛β细胞，加剧糖尿病的病理过程^[38]。

ROS除导致胰岛素抵抗外，对于胰岛β细胞的损伤也有作用，氧化应激状态下，胰岛素基因转录因子的表达以及胰岛素结合位点明显减少，从而影响胰岛素的产生及分泌。其他脂肪细胞因子如TNF-α也能降低β细胞的功能^[15]。这些细胞因子的联合作用，对胰岛β细胞功能造成更明显的损伤。此外，部分炎症因子还可作用于胰岛素受体底物2的关键部位，使其丝氨酸/苏氨酸磷酸化，导致胰岛素受体底物2的降解加快，促进胰岛β细胞的凋亡。

从以上可见，氧化应激在糖尿病发生和发展过程中的作用十分复杂。 ROS除直接损伤胰岛β细胞外，还可作为信号分子激活一些应激敏感通路，调节相关因子的表达，引起β细胞凋亡或坏死，抑制胰岛素分泌，诱发胰岛素抵抗，最终引发或加重糖尿病。

DM的治疗

糖尿病通常采用药物治疗，传统的药物治疗包括胰岛素类药物和口服类降糖药物。

胰岛素早期主要是从猪牛等动物的胰脏中提取而来，在人体应用后会发生明显的过敏反应。20世纪90年越来越成熟，使得胰岛素类似物逐渐应用起来，这种胰岛素能明显改变传统类胰岛素的药代动力学，有着低血糖发生率低、起效快、作用持久等优势。目前，随着胰岛素制剂探索的不断深入，一些口服胰岛素制剂已步入试验阶段，但因为技术上的困难，至今尚无有效的口服制剂应用在临床。

传统口服类降糖药物较多，常见的有如下几种：(1)双胍类如二甲双胍。二甲双胍有良好的心血管保护作用，降糖效果也不错，目前已有多个国家将其作为一线药物治疗T2DM。(2)磺脲类：磺脲类属于一种胰岛素促泌剂，刺激胰岛β细胞，使其分泌出胰岛素，达到改善血糖水平的效果。目前，我国允许上市的该类胰岛素主要有格列美脲、格列本脲、格列吡嗪、格列齐特、格列喹酮等，不过从一些研究中显示若长期服用该类药物可能会造成降糖效果失败，极易发生低血糖与体质量增加等并发症。 (3)噻唑烷二酮(thiazolidinedionecompounds，TZD)类：1999年FDA将罗格列酮与吡格列酮批准用在T2DM中，前者可能加重心脏病风险，为此之后被限制作为二线治疗药物使用，同时禁用于心衰病症。2013年6月 FDA对罗格列酮进行重新审核，指出该药物可继续用于临床，甚至放松或完全解除此药及其复方制剂的应用。(4)α-糖苷酶抑制剂：这类胰岛素会抑制小肠黏膜上皮细胞的糖苷酶，进而缓解碳水化合物的吸收作用，导致餐后血糖水平降低。此类药物常用的有伏格列波糖、阿卡波糖及米格列醇等。

现阶段治疗糖尿病的药物主要为传统抗糖尿病药物，包括磺酰脲类、格列奈类、双胍类、噻唑烷二酮类(thiazolidinediones，TZD)、α-葡萄糖苷酶抑制剂及胰岛素等，这些药物均存在不同程度的不良反应，如引发低血糖、胃肠道不适、肥胖等。随着对糖尿病基础理论研究的深入，为了避免传统降糖药物的副作用、对胰岛β细胞带来保护作用，人们也在积极地寻找新的糖尿病治疗靶点。目前发现与糖尿病发病机制相关的靶点主要包括胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)、二肽基肽酶- 4(dipeptide peptidase-4，DPP-4)、钠-葡萄糖共转运蛋白-2(sodium- glucose cotransporter-2，SGLT-2)、糖原合酶激酶-3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)、蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosinephosphates， PTP)、葡萄糖激酶(glucokinase，GK)等。其中基于调整胰高血糖素的药物如胰高血糖素样肽-1(glucagon like peptide-1，GLP-1)类似物、GLP-1受体激动剂及二肽基肽酶-4(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)抑制剂被认为可有效维持血糖稳态、改善β细胞功能、延缓糖尿病发展，甚至逆转糖尿病病程。

对于糖尿病目前尚没有一种有效的药物或手段能完全治愈，目前的药物治疗集中在通过控制血糖在一定的范围降低并延缓并发症的发生。随着对糖尿病发病机制更深入、全面的了解，对于糖尿病的治疗药物研究，也从对传统机制的药物研究过渡到对具有新靶点和新作用机制的药物研究，其中有些已上市，如GLP-1受体激动剂、DPP-4抑制剂及SGLT-2抑制剂等，还有一些药物处在临床或临床前研究阶段，如GPR119受体激动剂、11β-HSD1抑制剂、PTP1B抑制剂及GK激动剂等，其疗效和安全性还有待进一步临床验证。尽管近年来新靶点抗糖尿病药物的出现为DM治疗提供了更多的选择，但由于糖尿病的发病机制复杂，涉及的激素、酶和受体众多，新药物研究领域还存在诸如单靶点药物作用范围较窄、降糖作用较弱、作用于全身系统引起不良反应等问题均有待于进一步研究。因此，人们需要寻找可作用于糖尿病发病机制诸多方面的、更加有效的治疗药物。

本发明发现纤溶酶原能够减轻糖尿病实验小鼠胰腺组织的损伤、控制炎症、减少胰岛β细胞凋亡、修复胰腺组织、恢复胰岛β细胞的分泌功能、降低血糖，是一种有望成为全面针对糖尿病发病机制诸多方面的全新药物。

发明简述

本发明包括下述各项：

1.一种减少受试者胰岛β细胞凋亡的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

2.项1的方法，其中所述纤溶酶原促进胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达。

3.项1或2的方法，其中所述纤溶酶原促进受试者多向核转录因子NF- κB的表达。

4.一种促进糖尿病受试者胰岛β细胞功能修复的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

5.项4的方法，其中所述纤溶酶原通过促进胰岛炎症的修复和减少胰岛β细胞凋亡促进糖尿病受试者胰岛β细胞功能修复。

6.项5的方法，其中所述纤溶酶原促进细胞因子TNF-α、多向核转录因子NF-κB和胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达。

7.一种促进糖尿病受试者细胞因子TNF-α表达的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

8.一种促进糖尿病受试者多向核转录因子NF-κB表达的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

9.一种促进糖尿病受试者胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原

10.一种保护受试者胰岛的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

11.项10的方法，其中所述纤溶酶原减少胰岛胶原沉积。

12.项11的方法，其中所述纤溶酶原减轻胰岛的纤维化。

13.项10-12任一项的方法，其中所述纤溶酶原减轻胰岛细胞凋亡。

14.项10-13任一项的方法，其中所述纤溶酶原促进胰岛胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达。

15.项10-14任一项的方法，其中所述纤溶酶原促进胰岛炎症的修复。

16.项15的方法，其中所述纤溶酶原促进细胞因子TNF-α的表达。

17.项15或16的方法，其中所述纤溶酶原促进受试者多向核转录因子 NF-κB的表达。

18.项10-17任一项的方法，其中所述受试者为糖尿病患者。

19.项18的方法，其中所述糖尿病患者为T1DM或T2DM。

20.项19的方法，其中所述T1DM受试者为PLG活性正常或PLG活性受损受试者。

21.项1-20任一项的方法，其中所述纤溶酶原可与一种或多种其它药物或治疗方法联用。

22.项21的方法，其中所述纤溶酶原可与一种或多种选自如下的药物联用：抗糖尿病药物、抗心脑血管疾病药物、抗血栓药物、抗高血压药物，抗血脂药物、抗凝药物、抗感染药物。

23.项1-22任一项的方法，其中所述纤溶酶原与序列2、6、8、10或 12具有至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性。

24.项1-23任一项的方法，所述纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12 的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、 1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1 个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。

25.项1-24任一项的方法，所述纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。

26.项1-25任一项的方法，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。

27.项1-26任一项的方法，所述纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。

28.项1-26任一项的方法，所述纤溶酶原为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。

29.项1-28任一项的方法，所述纤溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10 或12所示。

30.项1-29任一项的方法，其中所述纤溶酶原是人天然纤溶酶原。

31.项1-30任一项的方法，其中所述受试者是人。

32.项1-31任一项的方法，其中所述受试者缺乏或缺失纤溶酶原。

33.项1-32任一项的方法，所述缺乏或缺失是先天的、继发的和/或局部的。

34.一种用于项1-33任一项的方法的纤溶酶原。

35.一种药物组合物，其包含药学上可接受的载剂和用于项1-33中任一项所述方法的纤溶酶原。

36.一种预防性或治疗性试剂盒，其包含：(i)用于项1-33中任一项所述方法的纤溶酶原和(ii)用于递送所述纤溶酶原至所述受试者的构件(means)。

37.根据项36所述的试剂盒，其中所述构件为注射器或小瓶。

38.项36或37的试剂盒，其还包含标签或使用说明书，该标签或使用说明书指示将所述纤溶酶原投予所述受试者以实施项1-33中任一项所述方法。

39.一种制品，其包含：

含有标签的容器；和

包含(i)用于项1-33中任一项所述方法的纤溶酶原或包含纤溶酶原的药物组合物，其中所述标签指示将所述纤溶酶原或组合物投予所述受试者以实施项1-33中任一项所述方法。

40.项36-38中任一项的试剂盒或项39的制品，还包含另外的一个或多个构件或容器，该构件或容器中含有其他药物。

41.项40的试剂盒或制品，其中所述其他药物选自下组：抗糖尿病药物、抗心脑血管疾病药物、抗血栓药物、抗高血压药物，抗血脂药物、抗凝药物、抗感染药物。

一方面，本发明涉及一种预防和治疗糖尿病的方法，包括给药受试者有效量的纤维蛋白溶酶原或纤溶酶。

另一方面，本发明涉及一种降低糖尿病受试者血糖的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于降低糖尿病受试者血糖的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备降低糖尿病受试者血糖的药物的用途。此外，本发明还涉及用于降低糖尿病受试者血糖的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述血糖选自如下的一项或多项：血清葡萄糖水平、血清果糖胺水平、血清糖化血红蛋白水平。在另一些实施方案中，所述血糖为血清葡萄糖水平。在上述实施方案中，所述糖尿病为T1DM或 T2DM。

另一方面，本发明涉及一种提高糖尿病受试者糖耐量的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于提高糖尿病受试者糖耐量的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备提高糖尿病受试者糖耐量的药物的用途。此外，本发明还涉及用于提高糖尿病受试者糖耐量的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述糖尿病为T2DM。

一方面，本发明涉及一种促进糖尿病受试者餐后血糖下降的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于促进糖尿病受试者餐后血糖下降的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备促进糖尿病受试者餐后血糖下降的药物的用途。此外，本发明还涉及用于促进糖尿病受试者餐后血糖下降的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原在受试者餐前30分钟至1.5小时给予。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原在受试者餐前30分钟至1小时给予。

一方面，本发明涉及一种促进糖尿病受试者对葡萄糖的利用的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于促进糖尿病受试者对葡萄糖的利用的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备促进糖尿病受试者对葡萄糖的利用的药物的用途。此外，本发明还涉及用于促进糖尿病受试者对葡萄糖的利用的纤溶酶原。另一方面，本发明涉及一种促进糖尿病受试者胰岛素分泌的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原还促进糖尿病受试者胰岛素的表达。在上述实施方案中，所述糖尿病为T1DM或T2DM。在一些实施方案中，所述纤溶酶原促进糖尿病受试者进食后的胰岛素分泌。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原促进糖尿病受试者禁食状态下的胰岛素分泌。在一些实施方案中，所述纤溶酶原促进糖尿病受试者应答血糖升高刺激的胰岛素分泌，使血糖回复到正常或接近正常水平。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原在促进所述胰岛素表达和/或分泌的同时，降低受试者胰高血糖素的表达和/或分泌，具体地，所述纤溶酶原通过促进所述胰岛素表达和/或分泌的同时，降低受试者胰高血糖素的表达和/或分泌，实现使受试者血糖回复到正常或接近正常水平。

一方面，本发明涉及一种降低糖尿病受试者胰高血糖素分泌的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于降低糖尿病受试者胰高血糖素分泌的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备降低糖尿病受试者胰高血糖素分泌的药物的用途。此外，本发明还涉及用于降低糖尿病受试者胰高血糖素分泌的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原还降低糖尿病受试者胰高血糖素的表达。在上述实施方案中，所述糖尿病为T1DM或T2DM。在一些实施方案中，所述纤溶酶原降低糖尿病受试者进食后的胰高血糖素分泌。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原降低糖尿病受试者禁食状态下的胰高血糖素分泌。在一些实施方案中，所述纤溶酶原在糖尿病受试者血糖升高状态下降低胰高血糖素的分泌，使血糖回复到正常或接近正常水平。在一些实施方案中，所述纤溶酶原在糖尿病受试者血糖升高状态下降低胰高血糖素的分泌，使血糖回复到正常或接近正常水平。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原在降低受试者胰高血糖素的表达和/或分泌的同时，促进所述胰岛素表达和/或分泌，具体地，所述纤溶酶原通过降低受试者胰高血糖素的表达和/或分泌的同时，促进所述胰岛素表达和/或分泌，实现使受试者血糖回复到正常或接近正常水平。在上述实施方案中，所述纤溶酶原促进胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达。

一方面，本发明涉及一种促进糖尿病受试者胰岛细胞损伤修复的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于促进糖尿病受试者胰岛细胞损伤修复的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备促进糖尿病受试者胰岛细胞损伤修复的药物的用途。此外，本发明还涉及用于促进糖尿病受试者胰岛细胞损伤修复的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原促进胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原促进细胞因子TNF-α的表达。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原促进受试者多向核转录因子NF-κB的表达。在一些实施方案中，所述胰岛细胞损伤为选自下述的一种或多种：胰岛β细胞合成和分泌胰岛素的功能损伤、胰岛组织结构损伤、胰岛胶原沉积、胰岛的纤维化、胰岛细胞凋亡和胰岛分泌胰高血糖素、胰岛素的平衡紊乱、胰岛分泌胰高血糖素和胰岛素的水平不能与受试者血糖水平相适应。在一些实施方案中，所述纤溶酶原使所述糖尿病受试者胰高血糖素分泌减少，胰岛素分泌增加，具体地，所述胰岛胰高血糖素和胰岛素分泌的正常平衡得到修复。

另一方面，本发明涉及一种保护受试者胰岛的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于保护受试者胰岛的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备保护受试者胰岛的药物的用途。此外，本发明还涉及用于保护受试者胰岛的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原减少胰岛胶原沉积。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原减轻胰岛的纤维化。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原减轻胰岛细胞凋亡。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原促进胰岛胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达。在一些实施方案中，所述纤溶酶原促进胰岛炎症的修复。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原促进细胞因子TNF-α的表达。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原促进受试者多向核转录因子NF-κB的表达。在上述实施方案中，所述受试者为糖尿病患者，具体地，所述糖尿病患者为T1DM或 T2DM。在一些实施方案中，所述T1DM受试者为PLG活性正常或PLG活性受损受试者。

另一方面，本发明涉及一种促进糖尿病受试者胰岛炎症修复的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于促进糖尿病受试者胰岛炎症修复的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备促进糖尿病受试者胰岛炎症修复的药物的用途。此外，本发明还涉及促进糖尿病受试者胰岛炎症修复的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原促进细胞因子TNF-α的表达。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原促进受试者多向核转录因子NF-κB的表达。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原减少胰岛胶原沉积。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原减轻胰岛的纤维化。在另一些实施方案中，所述纤溶酶原抑制胰岛细胞凋亡。在上述实施方案中，所述糖尿病患者为T1DM或T2DM，具体地，所述T1DM受试者为PLG活性正常或PLG活性受损受试者。

一方面，本发明涉及一种促进糖尿病受试者细胞因子TNF-α表达的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于促进糖尿病受试者细胞因子TNF-α表达的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备促进糖尿病受试者细胞因子TNF-α表达的药物的用途。此外，本发明还涉及用于促进糖尿病受试者细胞因子TNF-α表达的纤溶酶原。

另一方面，本发明涉及促进糖尿病受试者多向核转录因子NF-κB表达的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于促进糖尿病受试者多向核转录因子NF-κB表达的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备促进糖尿病受试者多向核转录因子NF-κB表达的药物的用途。

另一方面，本发明涉及一种促进胰岛胰岛素受体底物2(IRS-2)表达的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于促进胰岛胰岛素受体底物2(IRS-2)表达的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备促进胰岛胰岛素受体底物2(IRS-2)表达的药物的用途。此外，本发明还涉及用于促进胰岛胰岛素受体底物2(IRS-2)表达的纤溶酶原。

另一方面，本发明涉及一种促进糖尿病受试者胰岛素分泌的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原促进胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达。本发明还涉及纤溶酶原用于促进糖尿病受试者胰岛素分泌的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备促进糖尿病受试者胰岛素分泌的药物的用途。此外，本发明还涉及用于促进糖尿病受试者胰岛素分泌的纤溶酶原。

另一方面，本发明涉及一种促进糖尿病受试者胰岛β细胞数量增加的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于促进糖尿病受试者胰岛β细胞数量增加的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备促进糖尿病受试者胰岛β细胞数量增加的药物的用途。此外，本发明还涉及用于促进糖尿病受试者胰岛β细胞数量增加的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原促进胰岛素受体底物2(IRS-2)表达。

另一方面，本发明涉及一种减少胰岛β细胞凋亡的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于减少胰岛β细胞凋亡的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备减少胰岛β细胞凋亡的药物的用途。此外，本发明还涉及用于减少胰岛β细胞凋亡的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原促进胰岛素受体底物2(IRS-2)表达。

另一方面，本发明涉及一种促进胰岛β细胞损伤修复的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于促进胰岛β细胞损伤修复的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备促进胰岛β细胞损伤修复的药物的用途。本发明还涉及用于促进胰岛β细胞损伤修复的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原促进胰岛素受体底物2(IRS-2)表达。

另一方面，本发明涉及一种促进胰岛β细胞功能恢复的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。本发明还涉及纤溶酶原用于促进胰岛β细胞功能恢复的用途。本发明还涉及纤溶酶原用于制备促进胰岛β细胞功能恢复的药物的用途。此外，本发明还涉及用于促进胰岛β细胞功能恢复的纤溶酶原。在一些实施方案中，所述纤溶酶原促进胰岛素受体底物2(IRS-2) 表达。

在上述实施方案中，所述纤溶酶原可与一种或多种其它药物或治疗方法联用。具体地，所述纤溶酶原可与一种或多种选自如下的药物联用：抗糖尿病药物、抗心脑血管疾病药物、抗血栓药物、抗高血压药物，抗血脂药物、抗凝药物、抗感染药物。

在上述实施方案中，所述纤溶酶原与序列2、6、8、10或12具有至少 75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，并且仍然具有纤溶酶原活性。

在上述实施方案中，所述纤溶酶原的氨基酸如序列2、6、8、10或12 所示。在一些实施方案中，所述纤溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基础上，添加、删除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1- 45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1 个氨基酸，并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。

在上述实施方案中，所述纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。具体地，所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。

在上述实施方案中，纤溶酶原为天然或合成的人纤溶酶原、或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。在一些实施方案中，所述纤溶酶原为来自灵长类动物或啮齿类动物的人纤溶酶原直向同系物或其仍然保留纤溶酶原活性的变体或片段。例如，来自灵长类动物或啮齿类动物的纤维蛋白溶酶原直向同系物，例如来自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、马，狗的纤维蛋白溶酶原直向同系物。最优选，本发明的纤维蛋白溶酶原的氨基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。

在上述实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，其中所述受试者缺乏或缺失纤溶酶原。具体地，所述缺乏或缺失是先天的、继发的和/或局部的。

在一个实施方案中，所述纤维蛋白溶酶原通过全身或局部给药，优选通过以下途径施用：表面、静脉内、肌内、皮下、吸入、椎管内、局部注射、关节内注射或通过直肠。在一个实施方案中，所述局部给药为直接向骨质疏松区域给药，例如通过敷料，导管等方式来进行。

在一个实施方案中，所述纤溶酶原与适当的多肽载体或稳定剂组合施用。在一个实施方案中，所述纤溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001- 800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10- 100mg/kg(以每公斤体重计算)或0.0001-2000mg/cm²、0.001-800 mg/cm²、0.01-600mg/cm²、0.1-400mg/cm²、1-200mg/cm²、1-100 mg/cm²、10-100mg/cm²(以每平方厘米体表面积计算)的剂量施用，优选至少重复一次，优选至少每天施用。在局部施用的情况下，上述剂量还可以根据情况进一步调整。一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含药学上可接受的载剂和用于本发明所述方法的纤溶酶原。

另一方面，本发明涉及一种预防性或治疗性试剂盒，其包含：(i)用于本发明所述方法的纤溶酶原和(ii)用于递送所述纤溶酶原至所述受试者的构件(means)，具体地，所述构件为注射器或小瓶。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含标签或使用说明书，该标签或使用说明书指示将所述纤溶酶原投予所述受试者以实施本发明所述的方法。

另一方面，本发明还涉及一种制品，其包含：含有标签的容器；和(i) 用于本发明所述方法的纤溶酶原或包含纤溶酶原的药物组合物，其中所述标签指示将所述纤溶酶原或组合物投予所述受试者以实施本发明所述方法。

在上述实施方案中，所述试剂盒或制品还包含另外的一个或多个构件或容器，该构件或容器中含有其他药物。在一些实施方案中，所述其他药物选自下组：抗糖尿病药物、抗心脑血管疾病药物、抗血栓药物、抗高血压药物，抗血脂药物、抗凝药物、抗感染药物。

发明详述

“糖尿病”是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点。

“糖尿病并发症”是由糖尿病过程中血糖控制不良导致的身体其他器官或组织的损害或功能障碍，其中包括肝脏、肾脏、心脏、视网膜、神经系统的损害或功能障碍等。据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病。

“胰岛素抵抗”是指各种原因使胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率下降，机体代偿性的分泌过多胰岛素产生高胰岛素血症，以维持血糖的稳定。

“纤溶酶”是存在于血液中的一种非常重要的酶，其能够降解纤维蛋白多聚体。

“纤溶酶原(plasminogen，plg)”是纤溶酶的酶原形式，根据swiss prot 中的序列，按含有信号肽的天然人源plasminogen氨基酸序列(序列4)计算由810个氨基酸组成，分子量约为90kD，主要在肝脏中合成并能够在血液中循环的糖蛋白，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全长的PLG包含七个结构域：位于C末端的丝氨酸蛋白酶结构域、N末端的 Pan Apple(PAp)结构域以及5个Kringle结构域(Kringle1-5)。参照swiss prot 中的序列，其信号肽包括残基Met1-Gly19，PAp包括残基Glu20-Val98， Kringle1包括残基Cys103-Cys181，Kringle2包括残基Glu184-Cys262， Kringle3包括残基Cys275-Cys352，Kringle4包括残基Cys377-Cys454， Kringle5包括残基Cys481-Cys560。根据NCBI数据，丝氨酸蛋白酶域包括残基Val581-Arg804。

Glu-纤溶酶原是天然全长的纤溶酶原，由791个氨基酸组成(不含有 19个氨基酸的信号肽)，编码该序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在体内，还存在一种是从Glu-纤溶酶原的第76-77 位氨基酸处水解从而形成的Lys-纤溶酶原，如序列6所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。δ-plasminogen(δ-plasminogen)是全长纤溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5结构的片段，仅含有Kringle1和丝氨酸蛋白酶域^[39,40]，有文献报道了δ-plasminogen的氨基酸序列(序列8)^[40]，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列7。Mini-plasminogen由Kringle5和丝氨酸蛋白酶域组成，有文献报道其包括残基Val443-Asn791(以不含有信号肽的Glu-plg序列的Glu残基为起始氨基酸)^[41]，其氨基酸序列如序列10所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而Micro-plasminogen 仅含有丝氨酸蛋白酶结构域，有文献报道其氨基酸序列包括残基Ala543- Asn791(以不含有信号肽的Glu-plg序列的Glu残基为起始氨基酸)^[42]，也有专利CN102154253A报道其序列包括残基Lys531-Asn791(以不含有信号肽的Glu-plg序列的Glu残基为起始氨基酸)，本专利序列参考专利 CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，编码该氨基酸序列的 cDNA序列如序列11所示。

本发明的“纤溶酶”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶”可互换使用，含义相同；“纤溶酶原”与“纤维蛋白溶酶原”、“纤维蛋白溶解酶原”可互换使用，含义相同。

在本申请中，所述纤溶酶原“缺乏”的含义为受试者体内纤溶酶原的含量或活性比正常人低，低至足以影响所述受试者的正常生理功能；所述纤溶酶原“缺失”的含义为受试者体内纤溶酶原的含量或活性显著低于正常人，甚至活性或表达极微，只有通过外源提供才能维持正常生理功能。

本领域技术人员可以理解，本发明纤溶酶原的所有技术方案适用于纤溶酶，因此，本发明描述的技术方案涵盖了纤溶酶原和纤溶酶。

在本发明的实施方案中，“衰老”和“早衰”可以互换使用，表示同样的含义。

在循环过程中，纤溶酶原采用封闭的非活性构象，但当结合至血栓或细胞表面时，在PLG激活剂(plasminogen activator，PA)的介导下，其转变为呈开放性构象的活性PLM。具有活性的PLM可进一步将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体，进而溶解血栓。其中PLG的PAp 结构域包含维持纤溶酶原处于非活性封闭构象的重要决定簇，而KR结构域则能够与存在于受体和底物上的赖氨酸残基结合。已知多种能够作为 PLG激活剂的酶，包括：组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、激肽释放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。

“纤溶酶原活性片段”是指在纤溶酶原蛋白中，能够与底物中的靶序列结合并发挥蛋白水解功能的活性片段。本发明涉及纤溶酶原的技术方案涵盖了用纤溶酶原活性片段代替纤溶酶原的技术方案。本发明所述的纤溶酶原活性片段为包含纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶结构域的蛋白质，优选，本发明所述的纤溶酶原活性片段包含序列14、与序列14具有至少80％、90％、 95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列的蛋白质。因此，本发明所述的纤溶酶原包括含有该纤溶酶原活性片段、并且仍然保持该纤溶酶原活性的蛋白。

目前，对于血液中纤维蛋白溶酶原及其活性测定方法包括：对组织纤维蛋白溶酶原激活剂活性的检测(t-PAA)、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抗原的检测(t-PAAg)、对血浆组织纤溶酶原活性的检测(plgA)、血浆组织纤溶酶原抗原的检测(plgAg)、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物活性的检测、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物抗原的检测、血浆纤维蛋白溶酶-抗纤维蛋白溶酶复合物检测(PAP)。其中最常用的检测方法为发色底物法：向受检血浆中加链激酶(SK)和发色底物，受检血浆中的PLG在SK 的作用下，转变成PLM，后者作用于发色底物，随后用分光光度计测定，吸光度增加与纤维蛋白溶酶原活性成正比。此外也可采用免疫化学法、凝胶电泳、免疫比浊法、放射免疫扩散法等对血液中的纤维蛋白溶酶原活性进行测定。

“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物种之间的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也称为直向同源物、垂直同源物。其具体指不同物种中由同一祖先基因进化而来的蛋白或基因。本发明的纤溶酶原包括人的天然纤溶酶原，还包括来源于不同物种的、具有纤溶酶原活性的纤溶酶原直系同源物或直系同系物。

“保守取代变体”是指其中一个给定的氨基酸残基改变但不改变蛋白质或酶的整体构象和功能，这包括但不限于以相似特性(如酸性，碱性，疏水性，等)的氨基酸取代亲本蛋白质中氨基酸序列中的氨基酸。具有类似性质的氨基酸是众所周知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性的碱性氨基酸并可以互换。同样，异亮氨酸是疏水氨基酸，则可被亮氨酸，蛋氨酸或缬氨酸替换。因此，相似功能的两个蛋白或氨基酸序列的相似性可能会不同。例如，基于MEGALIGN算法的70％至99％的相似度(同一性)。“保守取代变体”还包括通过BLAST或FASTA算法确定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能达75％以上更好，最好能达85％以上，甚至达90％以上为最佳，并且与天然或亲本蛋白质或酶相比具有相同或基本相似的性质或功能。

“分离的”纤溶酶原是指从其天然环境分离和/或回收的纤溶酶原蛋白。在一些实施方案中，所述纤溶酶原会纯化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％的纯度(按重量计)，如通过Lowry法所确定的，例如超过99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至同质性，该同质性是通过使用考马斯蓝或银染在还原性或非还原性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定的。分离的纤溶酶原也包括通过生物工程技术从重组细胞制备，并通过至少一个纯化步骤分离的纤溶酶原。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列(具有或没有N端甲硫氨酸残基)的融合物；等等。

关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，氨基酸序列同一性百分数值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。

在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y乘100

其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下， A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。

如本文中使用的，术语“治疗”和“预防”指获得期望的药理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分预防疾病或其症状，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症状，并且包括：(a)预防疾病在受试者体内发生，所述受试者可以具有疾病的素因，但是尚未诊断为具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滞其形成；和(c)减轻疾病和/或其症状，即引起疾病和/或其症状消退。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠，小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。

“治疗有效量”或“有效量”指在对哺乳动物或其它受试者施用以治疗疾病时足以实现对疾病的所述预防和/或治疗的纤溶酶原的量。“治疗有效量”会根据所使用的纤溶酶原、要治疗的受试者的疾病和/或其症状的严重程度以及年龄、体重等而变化。

2.本发明纤溶酶原的制备

纤溶酶原可以从自然界分离并纯化用于进一步的治疗用途，也可以通过标准的化学肽合成技术来合成。当通过化学合成多肽时，可以经液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中将序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接着序贯添加序列中剩余的氨基酸)是适合纤溶酶原化学合成的方法。各种形式的SPPS，诸如Fmoc和Boc可用于合成纤溶酶原。用于固相合成的技术描述于Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284页于The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in PeptideSynthesis,Part A.,Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963)； Stewart等,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford, Ill.(1984)；和Ganesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005 Protein PeptLett.12:723-8中。简言之，用其上构建有肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在偶联/去保护的重复循环后，将附接的固相游离N末端胺与单个受N保护的氨基酸单元偶联。然后，将此单元去保护，露出可以与别的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之后将其切掉。

可以使用标准重组方法来生产本发明的纤溶酶原。例如，将编码纤溶酶原的核酸插入表达载体中，使其与表达载体中的调控序列可操作连接。表达调控序列包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件、和转录终止序列。表达调控可以是载体中的真核启动子系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)。一旦将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的高水平表达及纤溶酶原的收集和纯化的条件下维持宿主。

合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体 DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以有助于对外源用期望的DNA序列转化的那些细胞进行检测。

大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆主题抗体编码多核苷酸的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，beta-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选在操纵基因序列的情况中，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。

其他微生物，诸如酵母也可用于表达。酵母(例如酿酒酵母(S. cerevisiae))和毕赤酵母(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动于特别包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。

在微生物外，哺乳动物细胞(例如在体外细胞培养物中培养的哺乳动物细胞)也可以用于表达本发明的纤溶酶原。参见Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括 CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、和经转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点，启动子和增强子(Queen等,Immnol.Rev.89:49(1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点，和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、 SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等衍生的启动子。参见Co等,J. Immunol.148:1149(1992)。

一旦合成(化学或重组方式)，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，高效液相层析(HPLC)，凝胶电泳等来纯化本发明所述的纤溶酶原。该纤溶酶原是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％纯的或更纯的，例如不含污染物，所述污染物如细胞碎片，除主题抗体以外的大分子，等等。

3.药物配制剂

可以通过将具有所需纯度的纤溶酶原与可选的药用载体，赋形剂，或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkoniumchloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽 (少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂，例如 TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。优选冻干的抗-VEGF抗体配制剂在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作为参考。

本发明的配制剂也可含有需治疗的具体病症所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补并且相互之间没有副作用的那些。例如，抗高血压的药物，抗心律失常的药物，治疗糖尿病的药物等。

本发明的纤溶酶原可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，可置入在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或置入粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。

用于体内给药的本发明的纤溶酶原必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。

本发明的纤溶酶原可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一 定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓 释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J. Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98- 105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸 与乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不 可降解的乙烯－乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同 上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸 共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚 D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分 子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。可以根据相关机理来 设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫 键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、 控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳 定。

4.给药和剂量

可以通过不同方式，例如通过静脉内，腹膜内，皮下，颅内，鞘内，动脉内(例如经由颈动脉)，肌内，鼻内，表面或皮内施用或脊髓或脑投递来实现本发明药物组合物的施用。气溶胶制剂如鼻喷雾制剂包含活性剂的纯化的水性或其它溶液及防腐剂和等渗剂。将此类制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。

在一些情况中，可以以下方式修饰或配制本发明的纤溶酶原药物组合物，从而提供其穿过血脑屏障的能力。

用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。

在一些实施方案中，本发明的纤溶酶原与促进穿过血脑屏障的药剂配制在一起。在一些情况中，本发明的纤溶酶原直接或经接头与促进穿过血脑屏障的载体分子、肽或蛋白质融合。在一些实施方案中，本发明的纤溶酶原与结合内源血脑屏障(BBB)受体的多肽融合。连接纤溶酶原与结合内源 BBB受体的多肽，促进穿过BBB。结合内源BBB受体的合适的多肽包括抗体，例如单克隆抗体，或其抗原结合片段，其特异性结合内源BBB受体。合适的内源BBB受体包括但不限于胰岛素受在一些情况中，抗体是囊封于脂质体中的。参见例如美国专利公开文本No.2009/0156498。

医务人员会基于各种临床因素确定剂量方案。如医学领域中公知的，任一患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用次数和路径、总体健康、和同时施用的其它药物。本发明包含纤溶酶原的药物组合物的剂量范围可以例如为例如每天约0.0001至2000mg/kg，或约0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25 mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受试者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或50mg/kg体重或在1-50mg/kg的范围，或至少 1mg/kg。高于或低于此例示性范围的剂量也涵盖在内，特别是考虑到上述的因素。上述范围中的中间剂量也包含在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其它日程表施用此类剂量。例示性的剂量日程表包括连续几天1-10mg/kg。在本发明的药物施用过程中需要实时评估、定期评估血栓和血栓相关疾病的治疗效果和安全性。

5.治疗效力和治疗安全性

本发明的一个实施方案涉及使用纤溶酶原治疗受试者后，对治疗效力和治疗安全性的判断。常用的骨质疏松症治疗效果监测与评估内容包括随访(不良反应、规范服药、基础措施以及骨折风险因子再评估等)，新发骨折评估(临床骨折、身高降低和影像学检查)、骨密度(bone mineral density， BMD)测量和骨转换生化标志物(bone turnovermarkers，BTM)检测，以及基于这些数据的综合再评估等。其中BMD是目前应用最广泛的疗效监测和评估方法。例如，可以通过双能X线骨密度仪(dual energy X-ray absorptiometry，DXA)、定量CT(quantitative computed tomography， QCT)、单光子吸收测定法(SPA)、或超声波测定法来测量BMD。治疗开始后可每年检测1次BMD，在BMD达到稳定后可以适当延长间隔，例如2 年监测1次。针对BTM，目前在血清学指标中较多使用的骨形成指标是血清1型原胶原N端前肽(procollagen type 1n-terminal propeptide，PINP)，骨吸收指标是血清1型原胶原C末端肽(serum C-terminal telopeptide，S- CTX)。可根据研究进展，适时调整更合理的检测指标。应在开始治疗前检测基线值，应用促形成药物治疗后3个月、应用抑制吸收药物治疗后3～6 个月时进行检测。BTM能够提供骨骼的动态信息，在作用和功能上独立于 BMD，同时也与BMD成为互为补充的监测手段，二者结合起来具有更高的临床价值。一般地，如果治疗后BMD上升或稳定，BTM有预期变化，同时治疗期间无骨折发生，可认为治疗反应良好。此外，本发明还涉及使用纤溶酶原及其变体对受试者进行治疗过程中和治疗后，所述该治疗方案安全性的判断，包括但不限于对药物在受试者体内的血清半衰期、治疗半衰期、半数中毒量(TD50)、半数致死量(LD50)进行统计，或对在治疗过程中或治疗后发生的各种不良事件如致敏反应进行观察。

6.制品或药盒

本发明的一个实施方案涉及一种制品或药盒，其包含本发明纤溶酶原。所述制品优选包括一个容器，标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有组合物，所述组合物可有效治疗本发明的疾病或病症并具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射针穿透的塞子的)。所述组合物中至少一种活性剂为纤溶酶原。所述容器上或所附的标签说明所述组合物用于治疗本发明所述衰老或衰老相关病症。所述制品可进一步包含含有可药用缓冲液的第二容器，诸如磷酸盐缓冲的盐水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可进一步包含从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤物，针和注射器。此外，所述制品包含带有使用说明的包装插页，包括例如指示所述组合物的使用者将纤溶酶原组合物以及治疗伴随的疾病的其它药物给药患者。

附图简述

图1 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛Caspase-3免疫组化染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组Caspase-3的表达(箭头标识)明显低于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能减少胰岛细胞的凋亡，保护糖尿病小鼠胰脏组织。

图2 24-25周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛TUNEL染色观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。本实验结果显示，给纤溶酶原组的阳性细胞数(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组。正常对照组TUNEL阳性染色极低。正常对照组凋亡率约为8％，给溶媒PBS组凋亡率约为93％，给纤溶酶原组凋亡率为约16％。说明纤溶酶原组能显著减少糖尿病小鼠胰岛细胞的凋亡。

图3 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原10、31天后血糖检测结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠的血糖明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。此外，随着给药时间的延长，给溶媒PBS对照组小鼠血糖有升高趋势，而给纤溶酶原组血糖逐渐降低。说明纤溶酶原具有降血糖的作用。

图4给予纤溶酶原对糖尿病鼠血清果糖胺浓度的影响。检测结果显示，给予纤溶酶原后血清果糖胺的浓度明显降低，与给药前相比，统计差异极显著(**表示P<0.01)。说明纤溶酶原能显著降低糖尿病小鼠的血糖。

图5 26周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后血清果糖胺检测结果。检测结果显示，给纤溶酶原组血清果糖胺的浓度明显低于给溶媒PBS对照组，统计差异接近显著(P＝0.06)。说明纤溶酶原能显著降低糖尿病小鼠的血糖水平。

图6 26周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后血浆糖化血红蛋白检测结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠糖化血红蛋白的OD值明显低于给溶媒 PBS对照组，且统计差异极显著(**表示P<0.01)。说明纤溶酶原具有降低糖尿病小鼠血糖的作用。

图7 26周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原10天后IPGTT检测结果。结果显示，腹腔注射葡萄糖后，给纤溶酶原组小鼠血糖水平低于给溶媒PBS对照组，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组糖耐受曲线更加接近正常小鼠组。说明纤溶酶原能明显改善糖尿病小鼠糖耐受能力。

图8 T1DM模型PLG活性正常小鼠给予纤溶酶原10天后禁食后血糖检测结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠血糖明显高于给纤溶酶原组，且统计差异极显著(***表示P<0.001)。说明纤溶酶原能显著降低PLG活性正常小鼠在T1DM模型中的血糖水平。

图9 T1DM模型PLG活性正常小鼠给予纤溶酶原28天后IPGTT检测结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠注射葡萄糖后血糖浓度明显高于给纤溶酶原组，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组糖耐受曲线更加接近正常小鼠。说明纤溶酶原能提高PLG活性正常小鼠在T1DM模型中的糖耐受能力。

图10显示T1DM模型小鼠给予纤溶酶原20天后血糖检测结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠血糖明显高于给纤溶酶原组小鼠，且统计差异显著(P＝0.04)。说明纤溶酶原能促进T1DM小鼠葡萄糖分解能力，从而降低血糖。

图11 26周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后血清胰岛素检测结果。结果显示，给纤溶酶原组血清胰岛素水平明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能有效促进胰岛素的分泌。

图12 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰脏的HE染色图片及胰岛面积比。A、B为给溶媒PBS对照组，C、D为给纤溶酶原组，E为胰岛面积定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组大部分的胰岛发生萎缩，萎缩的胰岛细胞被腺泡(↓标示)所代替，胰岛边缘的腺泡增生，致胰岛与腺泡之间分界不清；给纤溶酶原组大部分的胰岛较之于对照组面积大，且胰岛内未有腺泡增生，只有少数的胰岛内残存有少量的腺泡，胰岛与腺泡之间边界清晰。比较给纤溶酶原组和对照组的胰岛占胰腺的面积比发现，给药组比对照组大近乎一倍。说明纤溶酶原能促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛损伤的修复，从而通过修复损伤的胰岛治疗糖尿病。

图13 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛天狼星红染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠胰岛胶原沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS 对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能改善糖尿病动物胰岛的纤维化。

图14 18周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛胰岛素免疫组化染色结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异接近显著(P＝0.15)。说明纤溶酶原能够促进胰岛功能修复，促进胰岛素的产生和分泌。

图15 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛的胰岛素免疫组化染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能促进胰岛功能修复，促进胰岛素的产生和分泌。

图16 26周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛的胰岛素免疫组化染色结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异极显著(**表示P<0.01)。说明纤溶酶原能有效促进胰岛功能修复，促进胰岛素的产生和分泌。

图17 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰腺组织NF-κB免疫组化染色观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF-κB的表达，从而促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛炎症的修复。

图18 18周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛胰高血糖素免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，胰高血糖素在正常对照小鼠中表达在胰岛周边α细胞区域。与给纤溶酶原组相比，给溶媒PBS对照组胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，胰高血糖素阳性细胞浸润到胰岛的中央区域，且平均光密度定量分析结果统计差异极显著(**表示P<0.01)；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组与 PBS组相比，胰岛形态更接近正常小鼠。说明纤溶酶原能够显著抑制胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，从而促进胰岛损伤的修复。

图19 24-25周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛胰高血糖素免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，胰高血糖素在正常对照小鼠中表达在胰岛周边α细胞区域。与给纤溶酶原组相比，给溶媒PBS对照组胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，阳性细胞浸润到胰岛的中央区域；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组与PBS组相比，胰岛形态更接近正常小鼠。说明纤溶酶原能够显著抑制胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，从而促进胰岛损伤的修复。

图20 26周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛胰高血糖素免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，胰高血糖素在正常对照小鼠中表达在胰岛周边α细胞区域。与给纤溶酶原组相比，给溶媒PBS对照组胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，阳性细胞浸润到胰岛的中央区域，且平均光密度定量分析结果具有统计学差异(*表示P<0.05)；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组与PBS组相比，其形态更接近正常小鼠。说明纤溶酶原能够显著抑制胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，从而促进胰岛损伤的修复。

图21给予纤溶酶原28天后PLG活性正常小鼠在T1DM模型中胰岛胰高血糖素免疫组化观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C 为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组胰高血糖素阳性表达明显多于给溶纤溶酶原组，且平均光密度定量分析结果统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能够显著减少糖尿病小鼠胰岛α细胞分泌胰高血糖素，促进胰岛损伤的修复。

图22 18周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛IRS-2免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组，且统计差异极显著(**表示 P<0.01)；给纤溶酶原组IRS-2表达水平较给溶媒PBS组更接近正常对照组小鼠。说明纤溶酶原能有效增加胰岛细胞IRS-2的表达，改善胰岛素信号转导，减少糖尿病小鼠胰岛β细胞损伤。

图23 24-25周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛IRS-2免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组，且统计差异显著(*表示 P<0.05)；给纤溶酶原组IRS-2表达水平较给溶媒PBS组更接近正常对照组小鼠。说明纤溶酶原能有效增加胰岛细胞IRS-2的表达，改善胰岛素信号转导，减少糖尿病小鼠胰岛β细胞损伤。

图24 26周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛IRS-2免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D 为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛IRS-2阳性表达 (箭头标识)明显少于给纤溶酶原组；给纤溶酶原组IRS-2表达水平较给溶媒PBS组更接近正常对照组小鼠。说明纤溶酶原能有效增加胰岛细胞 IRS-2的表达，改善胰岛素信号转导，减少糖尿病小鼠胰岛β细胞损伤。

图25给予纤溶酶原28天后PLG活性正常T1DM小鼠胰岛IRS-2免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组；给纤溶酶原组IRS-2表达水平较给溶媒PBS 组更接近正常对照组小鼠。说明纤溶酶原能有效增加胰岛细胞IRS-2的表达，改善胰岛素信号转导，减少PLG活性正常T1DM小鼠胰岛β细胞损伤。

图26 26周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛中性粒细胞免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组阳性表达细胞(箭头标识)少于给溶媒 PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组。说明纤溶酶原能减少中性粒细胞的浸润。

图27 T1DM模型中PLG活性受损小鼠给予纤溶酶原28天后胰岛中性粒细胞免疫组化观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C 为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组阳性表达细胞(箭头标识)少于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组。说明纤溶酶原纤溶酶原能减少PLG活性受损小鼠在T1DM模型中胰岛中性粒细胞的浸润。

图28 PLG活性正常小鼠在T1DM模型中给予纤溶酶原28天后胰岛中性粒细胞免疫组化观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C 为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组阳性表达细胞(箭头标识)少于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组。说明纤溶酶原能促进PLG活性正常小鼠在T1DM模型中胰岛中性粒细胞的浸润。

图29 T1DM模型中PLG活性受损小鼠给予纤溶酶原28天后胰岛胰岛素免疫组化观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。免疫组化结果显示，给纤溶酶原组胰岛素阳性表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组。说明纤溶酶原能促进在T1DM模型中的PLG活性受损小鼠胰岛素的合成与分泌。

图30 PLG活性正常小鼠在T1DM模型中给予纤溶酶原28天后胰岛胰岛素免疫组化观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。免疫组化结果显示，给纤溶酶原组胰岛素阳性表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组。说明纤溶酶原促进T1DM模型中PLG活性正常小鼠胰岛素的合成与表达。

图31 PLG活性受损小鼠在T1DM模型中给予纤溶酶原28天后胰岛NF-κB免疫组化观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C 为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能促进炎症修复因子NF-κB的表达，从而促进胰岛炎症的修复。

图32 18周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛NF-κB免疫组化观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。实验结果显示，给纤溶酶原组NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF-κB的表达，从而促进相对年轻(18周龄)糖尿病小鼠胰岛炎症的修复。

图33 26周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛NF-κB免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。本发明实验结果显示，给纤溶酶原组NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒 PBS对照组。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF-κB的表达，从而促进相对年老(26周龄)糖尿病小鼠胰岛炎症的修复。

图34 24-25周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛TNF-α免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。研究结果显示，给纤溶酶原组TNF-α的阳性表达(箭头标识)明显高于给溶媒 PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组。说明纤溶酶原能促进TNF-α的表达，从而促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛损伤修复。

图35 26周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛TNF-α免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。研究结果显示，给纤溶酶原组TNF-α的阳性表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组。说明纤溶酶原能促进TNF-α的表达，从而促进26周龄糖尿病小鼠胰岛损伤修复。

图36显示PLG活性受损小鼠T1DM模型中给予纤溶酶原28天后胰岛 TNF-α免疫组化观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。研究结果显示，给纤溶酶原组TNF-α的阳性表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能促进TNF-α的表达，从而促进PLG活性受损小鼠T1DM模型中胰岛损伤修复。

图37显示PLG活性受损T1DM模型小鼠给予纤溶酶原28天后胰岛 IgM免疫组化观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。本实验研究结果显示，给纤溶酶原组IgM的阳性表达(箭头标识)明显低于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组。说明纤溶酶原能降低IgM的表达，从而减少PLG活性受损小鼠在T1DM模型中胰岛损伤。

图38显示T1DM模型小鼠给予纤溶酶原20天后血清胰岛素检测结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠血清胰岛素浓度明显低于给纤溶酶原组小鼠，且统计差异接近显著(P＝0.08)。说明纤溶酶原能促进T1DM小鼠胰岛素的分泌。

实施例

实施例1纤溶酶原减少糖尿病小鼠胰岛细胞凋亡

24-25周龄db/db雄性小鼠6只，实验开始当天记为第0天并称重，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只和给溶媒PBS对照组2只。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/ 天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭1小时；之后，弃除羊血清液，用PAP 笔圈出组织。兔抗小鼠Caspase-3(Abcam)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次5 分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，其表达越多表明处于凋亡状态的细胞越多^[44]。

本发明的实验结果显示，给纤溶酶原组(图1B)Caspase-3的表达(箭头标识)明显低于给溶媒PBS对照组(图1A)。说明纤溶酶原能够减少胰岛细胞的凋亡。

实施例2纤溶酶原减少24-25周龄糖尿病小鼠胰岛细胞的凋亡

24-25周龄db/db雄性小鼠11只以及db/m雄性小鼠5只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组5 只，给溶媒PBS对照组6只，db/m小鼠作为正常对照组。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS或不注射任何液体，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为 3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，室温孵育7min，0.01M PBS洗3次，每次3分钟。滴加TUNEL 试剂盒(罗氏)试剂1和试剂2混合液体(5:45)，于37℃恒温孵育 40min，0.01M PBS洗3次，每次3分钟。滴加甲醇配制的3％双氧水溶液 (过氧化氢：甲醇＝1:9)室温避光孵育20分钟，0.01M PBS洗3次，每次 3分钟。滴加tunel试剂盒试剂3，37℃恒温孵育30min，0.01MPBS洗3 次，DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染 30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

TUNEL染色可以用来检测组织细胞在凋亡晚期过程中细胞核DNA的断裂情况。

本实验结果显示，给纤溶酶原组(图2C)的阳性细胞数(箭头标识) 明显少于给溶媒PBS对照组(图2B)。正常对照组TUNEL阳性染色极低 (图2A)。正常对照组凋亡率约为8％，给溶媒PBS组凋亡率约为93％，给纤溶酶原组凋亡率约为16％。说明纤溶酶原组能显著减少糖尿病小鼠胰岛细胞的凋亡。

实施例3纤溶酶原降低糖尿病小鼠血糖

24-25周龄db/db雄性小鼠8只，随机分为两组，给纤溶酶原组5只和给溶媒PBS对照组3只。实验开始当天记为第0天并称重分组，第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第10、31天禁食16小时后，用血糖试纸(Roche，Mannheim，Germany)进行血糖检测。

结果显示，给纤溶酶原组小鼠的血糖明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。此外，随着给药时间的延长，给溶媒PBS对照组小鼠血糖有升高趋势，而给纤溶酶原组血糖逐渐降低 (图3)。说明纤溶酶原具有降低糖尿病动物血糖的作用。

实施例4纤溶酶原降低糖尿病小鼠果糖胺水平

24-25周龄db/db雄性小鼠5只，给药前一天每只小鼠眼球静脉丛取血 50μl用以检测血清果糖胺浓度，并记为第0天，第一天开始给予纤溶酶原，连续给药31天。第32天摘除眼球取血，检测血清果糖胺的浓度。果糖胺浓度使用果糖胺检测试剂盒(南京建成，A037-2)进行检测。

果糖胺浓度反映1～3周内血糖的平均水平。结果显示，给予纤溶酶原后血清果糖胺的浓度明显降低，与给药前相比统计差异极显著(图4)。说明纤溶酶原能有效降低糖尿病动物血糖。

实施例5纤溶酶原降低26周龄糖尿病小鼠血清果糖胺水平

26周龄db/db雄性小鼠9只，实验开始当天记为第0天并称重，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。第1天开始给纤溶酶原或PBS，连续给药35天。在第36天处死小鼠，检测血清果糖胺的浓度。果糖胺浓度使用果糖胺检测试剂盒(南京建成，A037-2)进行检测。

检测结果显示，给纤溶酶原组血清果糖胺的浓度明显低于给溶媒PBS对照组，统计差异接近显著(P＝0.06)(图5)。说明纤溶酶原能降低26周龄糖尿病小鼠的血糖果糖胺。

实施例6纤溶酶原降低糖尿病小鼠糖化血红蛋白水平

26周龄db/db雄性小鼠9只，实验开始当天记称重后根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只。第1天开始给纤溶酶原或 PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS 对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第35天小鼠禁食16小时，第36天摘眼球取血，用以检测血浆糖化血红蛋白的浓度。

糖化血红蛋白含量通常可以反映患者近8～12周的血糖控制情况。结果显示，给纤溶酶原组小鼠糖化血红蛋白的浓度明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(图6)。说明纤溶酶原能有效降低糖尿病动物血糖水平。

实施例7纤溶酶原改善糖尿病小鼠糖耐受能力

26周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m小鼠3只。实验开始当天，db/db小鼠称重后并根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只和给溶媒PBS对照组5 只，db/m小鼠作为正常对照组。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药10天。第11天小鼠禁食16小时后，每只小鼠按 5g/kg体重腹腔注射5％葡萄糖溶液，在0，30，60，90，120，180分钟用血糖试纸(Roche，Mannheim，Germany)检测血糖浓度。

腹腔糖耐受检测(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)可检测机体对葡萄糖的耐受能力。现有技术已知糖尿病患者糖耐量是下降的。

实验结果显示，腹腔注射葡萄糖后给纤溶酶原组小鼠血糖水平要低于给溶媒PBS对照组，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组糖耐受曲线更加接近正常小鼠组(图7)。说明纤溶酶原能明显改善糖尿病小鼠糖耐受能力。

实施例8纤溶酶原降低PLG活性正常小鼠在T1DM模型中血糖水平

9-10周龄PLG活性正常雄性小鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组以及给纤溶酶原组，每组各5只。两组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射 200mg/kg链脲佐菌素(STZ)(sigma S0130)诱导T1DM^[43]。STZ注射12天后开始给药并记为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶1mg/0.1ml/ 只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药10天。在第 11天小鼠禁食6小时后，用血糖试纸(Roche，Mannheim，Germany)测定血糖。

结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠血糖明显高于给纤溶酶原组小鼠，且统计差异极显著(图8)。说明纤溶酶原能显著降低PLG活性正常小鼠 T1DM模型的血糖水平。

实施例9纤溶酶原改善T1DM模型小鼠糖耐受水平

9-10周龄PLG活性正常雄性性小鼠15只，随机分为三组，空白对照组、给溶媒PBS对照组以及给纤溶酶原组，每组各5只。给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)诱导 T1DM^[43]，空白对照组不做处理。STZ注射12天后开始给药并记为给药第1 天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。第28天小鼠禁食6小时后，按照5g/kg体重腹腔注射5％葡萄糖溶液，在注射后0、15、30、60、90分钟用血糖试纸(Roche，Mannheim，Germany)检测血糖浓度。

腹腔糖耐受检测(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)可检测机体对葡萄糖的耐受能力。现有技术已知糖尿病患者糖耐量下降。

结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠注射葡萄糖后血糖浓度明显高于给纤溶酶原组，且与给溶媒PBS对照组相比，给纤溶酶原组糖耐受曲线更加接近正常小鼠(图9)。说明纤溶酶原能提高PLG活性正常小鼠T1DM模型的糖耐受能力。

实施例10纤溶酶原提高T1DM模型小鼠葡萄糖分解能力

9-10周龄C57雄性小鼠8只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组以及给纤溶酶原组，每组各4只。给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射200mg/kg链脲佐菌素(STZ)(sigma S0130)诱导T1DM[43]。 STZ注射12天后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。连续给药19天，在第20天小鼠禁食6小时后，以2g/kg体重灌胃20％的葡萄糖，60分钟后，眼眶静脉丛采血并离心取上清，以葡萄糖测定试剂盒(上海荣盛 361500)测定血糖。

结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠血糖明显高于给纤溶酶原组小鼠血糖，且统计差异显著(P＝0.04)(图10)。说明纤溶酶原能提高T1DM小鼠葡萄糖分解能力，从而降低血糖。

实施例11纤溶酶原促进糖尿病小鼠胰岛素分泌功能

26周龄db/db雄性小鼠9只，实验开始当天记为第0天，称重并根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第35天小鼠禁食16小时后，在第36天摘眼球取血，离心取上清，运用胰岛素检测试剂盒(Mercodia AB)按照使用说明检测血清胰岛素水平。

检测结果显示，给纤溶酶原组血清胰岛素水平明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(图11)。说明纤溶酶原能显著提高糖尿病小鼠胰岛素的分泌。

实施例12纤溶酶原对糖尿病小鼠胰腺的保护作用

24-25周龄db/db雄性小鼠7只，实验开始当天记为第0天并称重，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只和给溶媒PBS对照组3只。，第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/ 天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水封片，切片在200和400倍光学显微镜下观察。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图12A，12B)大部分的胰岛发生萎缩，萎缩的胰岛细胞被腺泡(箭头标示)所代替，胰岛边缘的腺泡增生，致胰岛与腺泡之间分界不清；给纤溶酶原组(图12C，12D)大部分的胰岛较之于对照组面积大，且胰岛内未有腺泡增生，只有少数的胰岛内残存少量的腺泡，胰岛与腺泡之间边界清晰。比较给药组和对照组的胰岛占胰腺的面积比发现，给药组比对照组大近乎一倍(图12E)。说明纤溶酶原可促进糖尿病小鼠胰岛损伤的修复，提示纤溶酶原有可能通过促进胰岛损伤的修复，从而从根本上治愈糖尿病。

实施例13纤溶酶原减少糖尿病小鼠胰岛胶原沉积

24-25周龄db/db雄性小鼠16只，实验开始当天记为第0天并称重，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组10只，给溶媒PBS对照组6只。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/ 天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡至水后水洗1次，以0.1％天狼星红染色60分钟后，流水冲洗，苏木素染色1分钟，流水冲洗，1％盐酸酒精和氨水分化返蓝，流水冲洗，烘干后封片，切片在 200倍光学显微镜下观察。

天狼星红染色可使胶原持久染色，作为病理切片特殊染色方法，天狼星红染色可以特异显示胶原组织。

染色结果显示，给纤溶酶原组小鼠(图13B)胰岛胶原沉积(箭头标识)明显低于给溶媒PBS对照组(图13A)，且统计差异显著(图13C)。说明纤溶酶原能降低糖尿病动物胰岛的纤维化。

实施例14纤溶酶原促进18周龄进糖尿病小鼠胰岛素的表达和分泌

18周龄db/db雄性小鼠8只，实验开始当天记为第0天并称重，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各4只。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/ 天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭1小时；之后，弃除羊血清液，用PAP 笔圈出组织。兔抗小鼠胰岛素抗体(Abcam)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次 5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。

结果显示，给纤溶酶原组(图14B)胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组(图14A)，且统计差异接近显著(P＝0.15)(图14C)。说明纤溶酶原能够促进胰岛功能修复，促进胰岛素的表达和分泌。

实施例15纤溶酶原促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛素的表达和分泌

24-25周龄db/db雄性小鼠8只，实验开始当天记为第0天并称重，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组5只和给溶媒PBS对照组3只。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/ 天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭1小时；之后，弃除羊血清液，用PAP 笔圈出组织。兔抗小鼠胰岛素抗体(Abcam)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次 5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。

结果显示，给纤溶酶原组胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒 PBS对照组，且统计差异显著(P＝0.02)(图15)。说明纤溶酶原能有效修复胰岛功能，促进胰岛素的表达和分泌。

实施例16纤溶酶原促进糖尿病小鼠胰岛素合成分泌功能的修复

26周龄db/db雄性小鼠9只，实验开始当天记为第0天并称重，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只给溶媒PBS对照组5只。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第35天小鼠禁食16小时后，在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5 分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；之后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠胰岛素抗体(Abcam)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。

结果显示，给纤溶酶原组胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒 PBS对照组，且统计差异极显著(P＝0.005)(图16)。说明纤溶酶原能有效修复糖尿病鼠胰岛功能，提高胰岛素的表达和分泌。

实施例17纤溶酶原促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛多向核转录因子NF- κB的表达

24-25周龄db/db雄性小鼠10只，实验开始当天记为第0天并称重，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只和给溶媒PBS对照组6只，另取4只 db/m作为正常对照组，正常对照组不做处理。第1天开始给纤溶酶原或 PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS 对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；之后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠NF-κB(Abcam)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30 秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在显微镜下200倍下观察。

NF-κB为转录因子蛋白家族成员，在炎症修复过程中发挥着重要作用^[45]。

本发明实验结果显示，给纤溶酶原组NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(图17)。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF-κB的表达。

实施例18纤溶酶原减少18周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞的增殖，恢复胰岛α细胞的正常分布和降低胰高血糖素的分泌

18周龄db/db雄性小鼠8只以及db/m雄性小鼠3只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各4只，db/m小鼠作为正常对照组。第1天开始给纤溶酶原或PBS。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2 次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭 30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗体 (Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG (HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

胰岛α细胞合成分泌胰高血糖素，主要散在分布于胰岛周边区域。

结果显示，与给纤溶酶原组(图18C)相比，给溶媒PBS对照组(图 18B)胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，阳性细胞浸润到胰岛的中央区域，且平均光密度定量分析结果具有统计学差异(**表示P<0.01) (图18D)；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组的胰岛形态比给溶媒PBS组更接近正常对照组(18A)。说明纤溶酶原能够显著抑制18周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，提示纤溶酶原促进胰岛损伤的修复。

实施例19纤溶酶原减少24-25周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞的增殖，恢复胰岛α细胞的正常分布和降低胰高血糖素的分泌

24-25周龄db/db雄性小鼠11只以及db/m雄性小鼠5只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠称重后随机分为两组，给纤溶酶原组5 只，给溶媒PBS对照组6只，db/m小鼠作为正常对照组。第1天开始给纤溶酶原或PBS。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS或不注射任何液体，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为 3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15 分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2 次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3 次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

胰岛α细胞合成分泌胰高血糖素，主要散在分布于胰岛周边区域。

结果显示，与给纤溶酶原组相(图19C)比给溶媒PBS对照组(图 19B)胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，阳性细胞浸润到胰岛的中央区域；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组的胰岛形态比给溶媒PBS组更接近正常对照组(19A)。说明纤溶酶原能够显著抑制24-25周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，提示纤溶酶原能促进胰岛损伤的修复。

实施例20纤溶酶原抑制26周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞的增殖，恢复胰岛α细胞的正常分布和降低胰高血糖素的分泌

26周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m雄性小鼠3只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠称重后随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只，db/m小鼠作为正常对照组。第1天开始给纤溶酶原或PBS。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒 PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1 次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次 5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam) 二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒 (Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗 5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

胰岛α细胞合成分泌胰高血糖素，主要散在分布于胰岛周边区域。

结果显示，与给纤溶酶原组相(图20C)比给溶媒PBS对照组(图 20B)胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，阳性细胞浸润到胰岛的中央区域，且平均光密度定量分析结果具有统计学差异(**表示P<0.01) (图20D)；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组的胰岛形态比给溶媒PBS组更接近正常对照组(20A)。说明纤溶酶原能够显著抑制26周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，提示纤溶酶原能促进胰岛损伤的修复。

实施例21纤溶酶原减少PLG活性正常小鼠T1DM模型中胰高血糖素的分泌

9-10周龄PLG活性正常雄性性小鼠15只，随机分为三组，空白对照组、给溶媒PBS对照组以及给纤溶酶原组，每组各5只。给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射200mg/kg STZ(Sigma, 货号S0130)诱导T1DM模型^[43]，空白对照组不做处理。注射12天后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟， 0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01MPBS洗2 次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3 次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

胰岛α细胞合成分泌胰高血糖素，主要分布于胰岛周边区域。

结果显示，给溶媒PBS对照组(图21B)胰高血糖素阳性表达明显多于给纤溶酶原组(图21C)，且平均光密度定量分析结果统计差异显著(图 21D)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(21A)。说明纤溶酶原能够显著减少STZ诱导的糖尿病小鼠胰岛α细胞分泌胰高血糖素。

实施例22纤溶酶原促进18周龄糖尿病小鼠胰岛胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达

18周龄db/db雄性小鼠7只以及db/m雄性小鼠3只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组3只，给溶媒PBS对照组4只，db/m小鼠作为正常对照组。第1天开始给纤溶酶原或PBS。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗 1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam) 二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒 (Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗 5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

胰岛素受体底物2((Insulin Receptor Substrate-2,IRS-2)是一种能够被激活的胰岛素受体酪氨酸激酶作用的底物，是胰岛素信号转导途径中重要分子，且对胰岛β细胞的生存非常重要。IRS-2在胰岛β细胞表达增加时对其具有保护效应，且对功能性胰岛β细胞的维持至关重要^[46,47]。

IRS-2免疫组化结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠(图22B)胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组(图22C)，且统计差异极显著(图 22D)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(22A)。说明纤溶酶原能有效增加18周龄糖尿病小鼠胰岛细胞IRS-2的表达。

实施例23纤溶酶原促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛IRS-2的表达

24-25周龄db/db雄性小鼠11只以及db/m雄性小鼠5只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组5 只，给溶媒PBS对照组6只，db/m小鼠作为正常对照组。第1天开始给纤溶酶原或PBS。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS或不注射任何液体，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为 3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15 分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2 次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3 次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

IRS-2免疫组化结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠(图23B)胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组(图23C)，且统计差异显著(图 23D)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组(23A)。说明纤溶酶原能有效增加24-25周龄糖尿病小鼠胰岛细胞IRS-2的表达。

实施例24纤溶酶原促进26周龄糖尿病小鼠胰岛IRS-2的表达

26周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m雄性小鼠3只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只，db/m小鼠作为正常对照组。第1天开始给纤溶酶原或PBS。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗 1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam) 二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒 (Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗 5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

IRS-2免疫组化结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠(图24B)胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组(图24C)；给纤溶酶原组IRS-2表达水平接近正常对照组小鼠(图24A)。说明纤溶酶原能有效增加26周龄糖尿病小鼠胰岛细胞IRS-2的表达。

实施例25纤溶酶原促进PLG活性正常T1DM小鼠胰岛IRS-2的表达

9-10周龄PLG活性正常雄性性小鼠15只，随机分为三组，空白对照组、给溶媒PBS对照组以及给纤溶酶原组，每组各5只。给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射200mg/kg STZ(Sigma, 货号S0130)诱导I型糖尿病^[43]，空白对照组不做处理。注射12天后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶1mg/0.1ml/只/ 天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第 29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗 2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭 30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体 (Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。按DAB 试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200 倍光学显微镜下观察。

IRS-2免疫组化结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠(图25B)胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组(图25C)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(25A)。说明纤溶酶原能有效增加9-10周龄 PLG活性正常小鼠胰岛细胞IRS-2的表达。

实施例26纤溶酶原减少24-26周龄糖尿病小鼠胰岛中性粒细胞的浸润

24-26周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m小鼠3只，db/db小鼠随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只，db/m小鼠作为正常对照组。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/ 只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟， 0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠中性粒细胞抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2 次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3 次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

中心粒细胞是非特异性细胞免疫系统中重要成员，当炎症发生时，它们被趋化性物质吸引到炎症部位。

中心粒细胞免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图26C)阳性表达细胞少于给溶媒PBS对照组(图26B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组(26A)。

实施例27纤溶酶原减少PLG活性受损小鼠在T1DM模型中胰岛中性粒细胞的浸润

9-10周龄PLG活性受损雄性小鼠10只，随机分为三组，空白对照组3 只，给PBS对照组3只，给纤溶酶原组4只。给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)诱导I 型糖尿病^[43]，空白对照组不做处理。注射12天后开始给药并定为给药第1 天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。 PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠中性粒细胞抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒 (Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗 5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在400倍光学显微镜下观察。

中心粒细胞免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图27C)阳性表达细胞(箭头标识)少于给溶媒PBS对照组(图27B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(27A)。

实施例28纤溶酶原减少PLG活性正常小鼠在T1DM模型中胰岛中性粒细胞的浸润

9-10周龄PLG活性正常雄性性小鼠11只，随机分为三组，空白对照组3只，给溶媒PBS对照组4只，给纤溶酶原组4只。给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病^[43]，空白对照组不做处理。注射12天后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2 次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠中心粒细胞抗体 (Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG (HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在400倍光学显微镜下观察。

中心粒细胞免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图28C)阳性表达细胞(箭头标识)少于给溶媒PBS对照组(图28B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(28A)。

实施例29溶酶原促进在T1DM模型中的PLG活性受损小鼠胰岛素的合成与分泌

9-10周龄PLG活性受损雄性性小鼠10只，随机分为三组，空白对照组3只，给PBS对照组3只，给纤溶酶原组4只。给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病^[43]，空白对照组不做处理。注射12天后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1 次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次 5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰岛素抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒 (Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗 5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图29C)胰岛素阳性表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组(图29B，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(29A))。说明纤溶酶原能促进在T1DM模型中的PLG活性受损小鼠胰岛素的合成与分泌。

实施例30纤溶酶原促进T1DM模型中PLG活性正常小鼠胰岛素的合成与表达

9-10周龄PLG活性正常雄性性小鼠11只，随机分为三组，空白对照组3只，给溶媒PBS对照组4只，给纤溶酶原组4只。给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病^[43]，空白对照组不做处理。注射12天后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2 次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰岛素抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体 (Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB 试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200 倍光学显微镜下观察。

免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图30C)胰岛素阳性表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组(图30B)，且给纤溶酶原组比给溶媒 PBS组更接近空白对照组(30A)。说明纤溶酶原促进T1DM模型中PLG 活性正常小鼠胰岛素的合成与表达。

实施例31纤溶酶原促进PLG活性受损小鼠T1DM模型中胰岛多向核转录因子NF-κB的表达

9-10周龄PLG活性受损雄性性小鼠10只，随机分为三组，空白对照组3只，给PBS对照组3只，给纤溶酶原组4只。给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病^[43]，空白对照组不做处理。注射12天后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1 次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次 5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗体(Cell Signal)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam) 二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒 (Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗 5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

NF-κB作为一种多向核转录因子，激活后参与细胞增殖、细胞凋亡及炎症和免疫等多种基因的调节^[24]。

实验结果显示，给纤溶酶原组(图31C)NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组(图31B)。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF-κB的表达。

实施例32纤溶酶原促进18周龄糖尿病小鼠胰岛多向核转录因子NF-κB 的表达

18周龄db/db雄性小鼠7只，实验开始当天记为第0天并称重，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组3只，给溶媒PBS对照组4只。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原 2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药 35天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为 3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15 分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗体(Cell Signal)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2 次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3 次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

本发明实验结果显示，给纤溶酶原组(图32B)NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组(图32A)。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF- κB的表达。

实施例33纤溶酶原抑制26周龄糖尿病小鼠多向核转录因子NF-κB的表达

26周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m雄性小鼠3只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只，db/m小鼠作为正常对照组。第1天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原 2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药 35天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为 3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15 分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗体(Cell Signal)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2 次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3 次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

实验结果显示，给纤溶酶原组(图33C)NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组(图33B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组(33A)。说明纤溶酶原能促进相对年老(26周龄)糖尿病小鼠多向核转录因子NF-κB的表达。

实施例34纤溶酶原促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛TNF-α的表达

24-25周龄db/db雄性小鼠11只以及db/m雄性小鼠5只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组5 只，给溶媒PBS对照组6只，db/m小鼠作为正常对照组。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS或不注射任何液体，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为 3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15 分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠TNF-α抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2 次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3 次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)主要由活化的单核 /巨噬细胞产生，是一种重要的促炎症因子^[48]。

本实验研究结果显示，给纤溶酶原组(图34C)TNF-α的阳性表达明显高于给溶媒PBS对照组(图34B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组(34A)。说明纤溶酶原能促进24-25周龄糖尿病小鼠 TNF-α的表达。

实施例35纤溶酶原抑制26周龄糖尿病小鼠胰岛TNF-α的表达

26周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m雄性小鼠3只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只，db/m小鼠作为正常对照组。第1天开始给纤溶酶原或PBS。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS或不注射任何液体，连续给药35 天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟， 0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠TNF-α抗体(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2 次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3 次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

研究结果显示，给纤溶酶原组(图35C)TNF-α的阳性表达明显高于给溶媒PBS对照组(图35B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组(35A)。说明纤溶酶原能26周龄糖尿病小鼠促进TNF-α的表达。

实施例36纤溶酶原促进PLG活性受损小鼠在T1DM模型中胰岛TNF-α的表达

9-10周龄PLG活性受损雄性性小鼠7只，随机分为两组，给PBS对照组3只，给纤溶酶原组4只。两组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射 200mg/kg STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病^[43]。注射12天后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠抗体TNF-α(Abcam)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam) 二抗室温孵育1小时，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒 (Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗 5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。

本实验研究结果显示，给纤溶酶原组(图36B)TNF-α的阳性表达明 显高于给溶媒PBS对照组(图36A)。说明纤溶酶原能促进PLG活性受损 小鼠T1DM模型TNF-α的表达。

序列表

<110> 深圳瑞健生命科学研究院有限公司

<120> 抑制胰岛β细胞凋亡的药物及其用途

<130> PDK03591

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2376

<212> DNA

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原)核酸序列

<400> 1

gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60

cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120

acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180

aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240

ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300

aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360

gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420

caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480

gagtgtgaag aggaatgtat gcattgcagt ggagaaaact atgacggcaa aatttccaag 540

accatgtctg gactggaatg ccaggcctgg gactctcaga gcccacacgc tcatggatac 600

attccttcca aatttccaaa caagaacctg aagaagaatt actgtcgtaa ccccgatagg 660

gagctgcggc cttggtgttt caccaccgac cccaacaagc gctgggaact ttgtgacatc 720

ccccgctgca caacacctcc accatcttct ggtcccacct accagtgtct gaagggaaca 780

ggtgaaaact atcgcgggaa tgtggctgtt accgtgtccg ggcacacctg tcagcactgg 840

agtgcacaga cccctcacac acataacagg acaccagaaa acttcccctg caaaaatttg 900

gatgaaaact actgccgcaa tcctgacgga aaaagggccc catggtgcca tacaaccaac 960

agccaagtgc ggtgggagta ctgtaagata ccgtcctgtg actcctcccc agtatccacg 1020

gaacaattgg ctcccacagc accacctgag ctaacccctg tggtccagga ctgctaccat 1080

ggtgatggac agagctaccg aggcacatcc tccaccacca ccacaggaaa gaagtgtcag 1140

tcttggtcat ctatgacacc acaccggcac cagaagaccc cagaaaacta cccaaatgct 1200

ggcctgacaa tgaactactg caggaatcca gatgccgata aaggcccctg gtgttttacc 1260

acagacccca gcgtcaggtg ggagtactgc aacctgaaaa aatgctcagg aacagaagcg 1320

agtgttgtag cacctccgcc tgttgtcctg cttccagatg tagagactcc ttccgaagaa 1380

gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcgaccac tgttactggg 1440

acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag 1500

acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt 1560

ggtccctggt gctacacgac aaatccaaga aaactttacg actactgtga tgtccctcag 1620

tgtgcggccc cttcatttga ttgtgggaag cctcaagtgg agccgaagaa atgtcctgga 1680

agggttgtag gggggtgtgt ggcccaccca cattcctggc cctggcaagt cagtcttaga 1740

acaaggtttg gaatgcactt ctgtggaggc accttgatat ccccagagtg ggtgttgact 1800

gctgcccact gcttggagaa gtccccaagg ccttcatcct acaaggtcat cctgggtgca 1860

caccaagaag tgaatctcga accgcatgtt caggaaatag aagtgtctag gctgttcttg 1920

gagcccacac gaaaagatat tgccttgcta aagctaagca gtcctgccgt catcactgac 1980

aaagtaatcc cagcttgtct gccatcccca aattatgtgg tcgctgaccg gaccgaatgt 2040

ttcatcactg gctggggaga aacccaaggt acttttggag ctggccttct caaggaagcc 2100

cagctccctg tgattgagaa taaagtgtgc aatcgctatg agtttctgaa tggaagagtc 2160

caatccaccg aactctgtgc tgggcatttg gccggaggca ctgacagttg ccagggtgac 2220

agtggaggtc ctctggtttg cttcgagaag gacaaataca ttttacaagg agtcacttct 2280

tggggtcttg gctgtgcacg ccccaataag cctggtgtct atgttcgtgt ttcaaggttt 2340

gttacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaa 2376

<210> 2

<211> 791

<212> PRT

<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原)氨基酸序列

<400> 2

Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser Leu Phe Ser

1 5 10 15

Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu Cys Ala Ala

20 25 30

Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe Gln Tyr His

35 40 45

Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg Lys Ser Ser

50 55 60

Ile Ile Ile Arg Met Arg Asp Val Val Leu Phe Glu Lys Lys Val Tyr

65 70 75 80

Leu Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met

85 90 95

Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser

100 105 110

Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu

115 120 125

Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp

130 135 140

Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu

145 150 155 160

Glu Cys Glu Glu Glu Cys Met His Cys Ser Gly Glu Asn Tyr Asp Gly

165 170 175

Lys Ile Ser Lys Thr Met Ser Gly Leu Glu Cys Gln Ala Trp Asp Ser

180 185 190

Gln Ser Pro His Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro Asn Lys

195 200 205

Asn Leu Lys Lys Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Arg Glu Leu Arg Pro

210 215 220

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Asn Lys Arg Trp Glu Leu Cys Asp Ile

225 230 235 240

Pro Arg Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Tyr Gln Cys

245 250 255

Leu Lys Gly Thr Gly Glu Asn Tyr Arg Gly Asn Val Ala Val Thr Val

260 265 270

Ser Gly His Thr Cys Gln His Trp Ser Ala Gln Thr Pro His Thr His

275 280 285

Asn Arg Thr Pro Glu Asn Phe Pro Cys Lys Asn Leu Asp Glu Asn Tyr

290 295 300

Cys Arg Asn Pro Asp Gly Lys Arg Ala Pro Trp Cys His Thr Thr Asn

305 310 315 320

Ser Gln Val Arg Trp Glu Tyr Cys Lys Ile Pro Ser Cys Asp Ser Ser

325 330 335

Pro Val Ser Thr Glu Gln Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Glu Leu Thr

340 345 350

Pro Val Val Gln Asp Cys Tyr His Gly Asp Gly Gln Ser Tyr Arg Gly

355 360 365

Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser Trp Ser Ser

370 375 380

Met Thr Pro His Arg His Gln Lys Thr Pro Glu Asn Tyr Pro Asn Ala

385 390 395 400

Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Ala Asp Lys Gly Pro

405 410 415

Trp Cys Phe Thr Thr Asp Pro Ser Val Arg Trp Glu Tyr Cys Asn Leu

420 425 430

Lys Lys Cys Ser Gly Thr Glu Ala Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val

435 440 445

Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe

450 455 460

Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly

465 470 475 480

Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile

485 490 495

Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys

500 505 510

Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn

515 520 525

Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro

530 535 540

Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val Glu Pro Lys Lys Cys Pro Gly

545 550 555 560

Arg Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln

565 570 575

Val Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu

580 585 590

Ile Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser

595 600 605

Pro Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val

610 615 620

Asn Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu

625 630 635 640

Glu Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala

645 650 655

Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr

660 665 670

Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr

675 680 685

Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val

690 695 700

Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val

705 710 715 720

Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser

725 730 735

Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys

740 745 750

Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro

755 760 765

Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile

770 775 780

Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

785 790

<210> 3

<211> 2433

<212> DNA

<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原（来源于swiss prot）的核酸序列

<400> 3

atggaacata aggaagtggt tcttctactt cttttatttc tgaaatcagg tcaaggagag 60

cctctggatg actatgtgaa tacccagggg gcttcactgt tcagtgtcac taagaagcag 120

ctgggagcag gaagtataga agaatgtgca gcaaaatgtg aggaggacga agaattcacc 180

tgcagggcat tccaatatca cagtaaagag caacaatgtg tgataatggc tgaaaacagg 240

aagtcctcca taatcattag gatgagagat gtagttttat ttgaaaagaa agtgtatctc 300

tcagagtgca agactgggaa tggaaagaac tacagaggga cgatgtccaa aacaaaaaat 360

ggcatcacct gtcaaaaatg gagttccact tctccccaca gacctagatt ctcacctgct 420

acacacccct cagagggact ggaggagaac tactgcagga atccagacaa cgatccgcag 480

gggccctggt gctatactac tgatccagaa aagagatatg actactgcga cattcttgag 540

tgtgaagagg aatgtatgca ttgcagtgga gaaaactatg acggcaaaat ttccaagacc 600

atgtctggac tggaatgcca ggcctgggac tctcagagcc cacacgctca tggatacatt 660

ccttccaaat ttccaaacaa gaacctgaag aagaattact gtcgtaaccc cgatagggag 720

ctgcggcctt ggtgtttcac caccgacccc aacaagcgct gggaactttg tgacatcccc 780

cgctgcacaa cacctccacc atcttctggt cccacctacc agtgtctgaa gggaacaggt 840

gaaaactatc gcgggaatgt ggctgttacc gtgtccgggc acacctgtca gcactggagt 900

gcacagaccc ctcacacaca taacaggaca ccagaaaact tcccctgcaa aaatttggat 960

gaaaactact gccgcaatcc tgacggaaaa agggccccat ggtgccatac aaccaacagc 1020

caagtgcggt gggagtactg taagataccg tcctgtgact cctccccagt atccacggaa 1080

caattggctc ccacagcacc acctgagcta acccctgtgg tccaggactg ctaccatggt 1140

gatggacaga gctaccgagg cacatcctcc accaccacca caggaaagaa gtgtcagtct 1200

tggtcatcta tgacaccaca ccggcaccag aagaccccag aaaactaccc aaatgctggc 1260

ctgacaatga actactgcag gaatccagat gccgataaag gcccctggtg ttttaccaca 1320

gaccccagcg tcaggtggga gtactgcaac ctgaaaaaat gctcaggaac agaagcgagt 1380

gttgtagcac ctccgcctgt tgtcctgctt ccagatgtag agactccttc cgaagaagac 1440

tgtatgtttg ggaatgggaa aggataccga ggcaagaggg cgaccactgt tactgggacg 1500

ccatgccagg actgggctgc ccaggagccc catagacaca gcattttcac tccagagaca 1560

aatccacggg cgggtctgga aaaaaattac tgccgtaacc ctgatggtga tgtaggtggt 1620

ccctggtgct acacgacaaa tccaagaaaa ctttacgact actgtgatgt ccctcagtgt 1680

gcggcccctt catttgattg tgggaagcct caagtggagc cgaagaaatg tcctggaagg 1740

gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 1800

aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 1860

gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 1920

caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 1980

cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 2040

gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 2100

atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 2160

ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 2220

tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 2280

ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 2340

ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 2400

acttggattg agggagtgat gagaaataat taa 2433

<210> 4

<211> 810

<212> PRT

<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原（来源于swiss prot）的氨基酸序列

<400> 4

Met Glu His Lys Glu Val Val Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Lys Ser

1 5 10 15

Gly Gln Gly Glu Pro Leu Asp Asp Tyr Val Asn Thr Gln Gly Ala Ser

20 25 30

Leu Phe Ser Val Thr Lys Lys Gln Leu Gly Ala Gly Ser Ile Glu Glu

35 40 45

Cys Ala Ala Lys Cys Glu Glu Asp Glu Glu Phe Thr Cys Arg Ala Phe

50 55 60

Gln Tyr His Ser Lys Glu Gln Gln Cys Val Ile Met Ala Glu Asn Arg

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Tyr Arg Gly Thr Ser Ser Thr Thr Thr Thr Gly Lys Lys Cys Gln Ser

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<212> DNA

<213> delta-plg（delta-纤溶酶原）核酸序列

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Glu Cys Glu Glu Ala Ala Pro Ser Phe Asp Cys Gly Lys Pro Gln Val

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<213> Mini-plg（小纤维蛋白溶酶原）氨基酸序列

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<213> Micro-plg（微纤维蛋白溶酶原）核酸序列

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<213> Micro-plg（微纤维蛋白溶酶原）氨基酸序列

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100 105 110

Pro Ala Val Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro

115 120 125

Asn Tyr Val Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly

130 135 140

Glu Thr Gln Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu

145 150 155 160

Pro Val Ile Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly

165 170 175

Arg Val Gln Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr

180 185 190

Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys

195 200 205

Asp Lys Tyr Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala

210 215 220

Arg Pro Asn Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr

225 230 235 240

Trp Ile Glu Gly Val Met Arg Asn Asn

245

<210> 13

<211> 684

<212> DNA

<213> 丝氨酸蛋白酶（结构）域的核酸序列

<400> 13

gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 60

aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 120

gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 180

caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 240

cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 300

gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 360

atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 420

ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 480

tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 540

ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 600

ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 660

acttggattg agggagtgat gaga 684

<210> 14

<211> 228

<212> PRT

<213> 丝氨酸蛋白酶（结构）域的氨基酸序列

<400> 14

Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Trp Pro Trp Gln Val

1 5 10 15

Ser Leu Arg Thr Arg Phe Gly Met His Phe Cys Gly Gly Thr Leu Ile

20 25 30

Ser Pro Glu Trp Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys Ser Pro

35 40 45

Arg Pro Ser Ser Tyr Lys Val Ile Leu Gly Ala His Gln Glu Val Asn

50 55 60

Leu Glu Pro His Val Gln Glu Ile Glu Val Ser Arg Leu Phe Leu Glu

65 70 75 80

Pro Thr Arg Lys Asp Ile Ala Leu Leu Lys Leu Ser Ser Pro Ala Val

85 90 95

Ile Thr Asp Lys Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Asn Tyr Val

100 105 110

Val Ala Asp Arg Thr Glu Cys Phe Ile Thr Gly Trp Gly Glu Thr Gln

115 120 125

Gly Thr Phe Gly Ala Gly Leu Leu Lys Glu Ala Gln Leu Pro Val Ile

130 135 140

Glu Asn Lys Val Cys Asn Arg Tyr Glu Phe Leu Asn Gly Arg Val Gln

145 150 155 160

Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Asp Ser Cys

165 170 175

Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Phe Glu Lys Asp Lys Tyr

180 185 190

Ile Leu Gln Gly Val Thr Ser Trp Gly Leu Gly Cys Ala Arg Pro Asn

195 200 205

Lys Pro Gly Val Tyr Val Arg Val Ser Arg Phe Val Thr Trp Ile Glu

210 215 220

Gly Val Met Arg

225

Claims (10)

1.一种减少受试者胰岛β细胞凋亡的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

2.权利要求1的方法，其中所述纤溶酶原促进胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达。

3.权利要求1或2的方法，其中所述纤溶酶原促进受试者多向核转录因子NF-κB的表达。

4.一种促进糖尿病受试者胰岛β细胞功能修复的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

5.权利要求4的方法，其中所述纤溶酶原通过促进胰岛炎症的修复和减少胰岛β细胞凋亡促进糖尿病受试者胰岛β细胞功能修复。

6.权利要求5的方法，其中所述纤溶酶原促进细胞因子TNF-α、多向核转录因子NF-κB和胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达。

7.一种促进糖尿病受试者细胞因子TNF-α表达的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

8.一种促进糖尿病受试者多向核转录因子NF-κB表达的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

9.一种促进糖尿病受试者胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。

10.一种保护受试者胰岛的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。