CN109125715A - 一种调控glp-1/glp-1r的方法和药物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及纤溶酶原调控GLP‑1/GLP‑1R及治疗GLP‑1/GLP‑1R相关病症的用途。

Description

一种调控GLP-1/GLP-1R的方法和药物
技术领域
本发明涉及纤溶酶原通过调控GLP-1/GLP-1R治疗GLP-1/GLP-1R相关疾病的用途。
背景技术
GLP-1是一种内源性促进胰岛素分泌的激素，主要是由肠内L-细胞分泌。小肠L细胞胰高血糖素原基因表达产生胰高血糖素原(proglucagon,PG)，经激素原转化酶1/3(prohormoneconvertase,PC1/3)处理后释放GLP-1肽前体。内肽酶催化GLP-1(1-37)裂解成两个肽段，其中GLP-1(7-37)经酰胺化酶处理后形成GLP-1(7-36)酰胺。虽然α细胞内胰高血糖素基因表达也能产生PG，但是α细胞中的激素原转化酶2(PC2)优先将PG转化为胰高血糖素，故α细胞正常情况下不能合成GLP-1。但在应激或者病理生理状态下(如2型糖尿病)，α细胞能适应性产生GLP-1。
GLP-1能促进胰岛β细胞分泌胰岛素和血糖正常化且不发生低血糖，抑制α细胞产生胰高血糖素，并延缓胃排空，抑制食欲，减轻体重，促进β细胞增殖，抑制其凋亡，在调节胰岛细胞功能过程中发挥重要作用[1]。
糖尿病同肥胖症具有并发趋势，临床上也公认将控制患者体重列入到2型糖尿病治疗指南中。研究发现在糖尿病的进展中GLP-1和胰岛素的分泌间存在负反馈调节，而患2型糖尿病的病人存在肠-胰岛轴的损伤，并伴随着餐后循环血液中脂质升高[2]。在实验性糖尿病小鼠模型中发现，β细胞脂肪毒性损伤后影响了GLP-1的功能，高脂血症的治疗可促进GLP-1诱导胰岛素分泌[3]。目前在已经过验证的治疗方案中，只有胰高血糖素样肽受体激动剂(glucagon-like peptide-1receptor agonists,GLP-1RAs)可以实现对患者的体重和血糖水平同时调控。GLP-1作为GLP-1受体激动剂研究的基础，具有血糖依赖性的促进胰岛素分泌作用。其可以通过抑制食欲和减缓胃排空来达到减轻体重的作用[4]。
GLP-1不仅在外周降低血糖保护胰岛细胞，改善的症状，而且在中枢神经系统作为一种神经递质，对细胞增殖、神经发生和细胞凋亡起到营养作用。GLP-1R在啮齿类动物及人脑内分布较广泛[5]，丘脑、小脑、脑干、穹窿、后区、外侧膈核、尾壳、海马和大脑皮层均有表达。GLP-1通过血脑屏障能在相应脑区与其受体结合发挥作用。GLP-1可调节神经细胞的多种生理过程，例如:细胞存活及神经元轴突生长；抵御体外培养神经细胞的兴奋性、氧化损伤和死亡；降低神经元β前体蛋白(βAPP)；降低内源性Aβ水平；保护神经元抵御多种凋亡性刺激及诱导体外培养神经细胞的分化的功能[6]。关于Aβ毒性损害的动物实验研究发现，Aβ可以诱发严重的长时程增强(long-term potention,LTP)抑制，而这一损害可以被GLP-1的类似物逆转[7]，啮齿类动物脑室内注射Aβ后，通过Morris水迷宫评估显示出空间学习和记忆能力不足，然而，予以GLP-1类似物处理可以改善动物在这两方面的表现[8]。另外，科学家还发现，GLP-1及其类似物可以改善记忆和大脑中的突触可塑性[9]。
GLP-1受体功能调节相当复杂，它与多种内、外源性多肽相互作用，导致下游多条信号通路级联激活。GLP-1受体基因多态性现象早就发现，而且可能和肥胖及糖尿病的发生有关[10]。
本发明发现了纤溶酶原在调控GLP-1/GLP-1受体通路以及治疗该GLP-1/GLP-1受体通路相关病症中的用途。
发明内容
本发明涉及如下各项：
1.一种通过调控GLP-1/GLP-1R治疗疾病的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。
2.项1的方法，其中所述疾病为糖代谢紊乱相关疾病、脂肪代谢紊乱相关疾病或GLP-1/GLP-1R相关神经系统疾病。
3.项2的方法，其中所述疾病为选自如下的一种或多种疾病：糖尿病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经痛、糖尿病性视网膜疾病、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脑出血、脑栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨质疏松、认知障碍、帕金森综合征、脊髓侧索硬化症、阿尔茨海默病、炎性肠病、消化不良、胃肠道溃疡。
4.一种调控GLP-1/GLP-1R功能的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。
5.项4的方法，其中所述纤溶酶原促进GLP-1和/或GLP-1R的表达。
6.一种治疗GLP-1/GLP-1R相关病症的方法，包括给药受试者有效量的纤溶酶原。
7.项6的方法，其中所述GLP-1/GLP-1R相关病症包括如下的一种或多种：血糖升高、糖耐量下降、血脂升高、肥胖、脂肪肝、认知障碍。
8.项6的方法，其中所述GLP-1/GLP-1R相关病症包括如下的一种或多种：糖尿病、糖尿病并发症、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脑出血、脑栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨质疏松、认知障碍、帕金森综合征、侧索硬化症、阿尔茨海默病、炎性肠病、消化不良、胃肠道溃疡。
9.根据项1-8任一项的方法，其中所述纤溶酶原为与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的蛋白质。
10.项1-9任一项的方法，其中所述纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。
11.项10的方法，其中所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。
12.根据项1-11任一项的方法，其中所述纤溶酶原可与一种或多种其它药物或治疗方法联用。
13.根据项12的方法，其中所述纤溶酶原可与一种或多种选自如下的药物或疗法联用：治疗糖尿病的药物或疗法、治疗动脉粥样硬化的药物或疗法、治疗心脑血管疾病的药物或疗法、治疗血栓的药物或疗法、治疗高血压的药物或疗法，降血脂的药物或疗法、治疗脂肪肝的药物或疗法、治疗帕金森氏病的药物或疗法、治疗阿尔茨海默病的药物或疗法、抗感染药物或疗法。
14.用于治疗GLP-1/GLP-1R相关病症的药物，包含有效量的纤溶酶原。
15.用于治疗GLP-1/GLP-1R相关病症的制品或试剂盒，包含装有有效量的纤溶酶原的容器，以及纤溶酶原治疗GLP-1/GLP-1R相关病症的使用说明书。
16.项14或15的药物、制品或试剂盒，其中所述GLP-1/GLP-1R相关病症包括如下的一种或多种：血糖升高、糖耐量下降、血脂升高、肥胖、脂肪肝、认知障碍。
17.项14或15的药物、制品或试剂盒，其中所述GLP-1/GLP-1R相关病症包括如下的一种或多种：糖尿病、糖尿病并发症、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脑出血、脑栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨质疏松、认知障碍、帕金森综合征、侧索硬化症、阿尔茨海默病、炎性肠病、消化不良、胃肠道溃疡。
18.纤溶酶原在制备通过调控GLP-1/GLP-1R治疗疾病的药物中的用途。
19.项18的用途，其中所述疾病为糖代谢紊乱相关疾病、脂肪代谢紊乱相关疾病或GLP-1/GLP-1R相关神经系统疾病。
20.项19的用途，其中所述疾病为选自如下的一种或多种疾病：糖尿病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经痛、糖尿病性视网膜疾病、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脑出血、脑栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨质疏松、认知障碍、帕金森综合征、侧索硬化症、阿尔茨海默病、炎性肠病、消化不良、胃肠道溃疡。
21.纤溶酶原在制备调控GLP-1/GLP-1R功能的药物中的用途。
22.项21的用途，其中所述纤溶酶原促进GLP-1和/或GLP-1R的表达。
23.纤溶酶原在制备治疗GLP-1/GLP-1R相关病症的药物中的用途。
24.项23的用途，其中所述GLP-1/GLP-1R相关病症包括如下的一种或多种：血糖升高、糖耐量下降、血脂升高、肥胖、脂肪肝、认知障碍。
25.项23的用途，其中所述GLP-1/GLP-1R相关病症包括如下的一种或多种：糖尿病、糖尿病并发症、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脑出血、脑栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨质疏松、认知障碍、帕金森综合征、侧索硬化症、阿尔茨海默病、炎性肠病、消化不良、胃肠道溃疡。
26.根据项18-25任一项的用途，其中所述纤溶酶原为与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的蛋白质。
27.项18-26任一项的用途，其中所述纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。
28.项27的用途，其中所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。
29.根据项18-28任一项的用途，其中所述纤溶酶原可与一种或多种其它药物或治疗方法联用。
30.根据项29的用途，其中所述纤溶酶原可与一种或多种选自如下的药物或疗法联用：治疗糖尿病的药物或疗法、治疗动脉粥样硬化的药物或疗法、治疗心脑血管疾病的药物或疗法、治疗血栓的药物或疗法、治疗高血压的药物或疗法，降血脂的药物或疗法、治疗脂肪肝的药物或疗法、治疗帕金森氏病的药物或疗法、治疗阿尔茨海默病的药物或疗法、抗感染药物或疗法。
定义：
“糖尿病”是由遗传因素、免疫功能紊乱、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各种致病因子作用于机体导致胰岛功能减退、胰岛素抵抗等而引发的糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱综合征，临床上以高血糖为主要特点。
“糖尿病并发症”是由糖尿病过程中血糖控制不良导致的身体其他器官或组织的损害或功能障碍，其中包括肝脏、肾脏、心脏、视网膜、神经系统的损害或功能障碍等。据世界卫生组织统计，糖尿病并发症高达100多种，是目前已知并发症最多的一种疾病。
“纤溶酶”是存在于血液中的一种非常重要的酶，其能够降解纤维蛋白多聚体。
“纤溶酶原(plasminogen，plg)”是纤溶酶的酶原形式，根据swiss prot中的序列，按含有信号肽的天然人源plasminogen氨基酸序列(序列4)计算由810个氨基酸组成，分子量约为90kD，主要在肝脏中合成并能够在血液中循环的糖蛋白，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全长的PLG包含七个结构域：位于C末端的丝氨酸蛋白酶结构域、N末端的Pan Apple(PAp)结构域以及5个Kringle结构域(Kringle1-5)。参照swiss prot 中的序列，其信号肽包括残基Met1-Gly19，PAp包括残基Glu20-Val98，Kringle1包括残基Cys103-Cys181，Kringle2包括残基Glu184-Cys262，Kringle3包括残基Cys275-Cys352，Kringle4包括残基Cys377-Cys454，Kringle5包括残基Cys481-Cys560。根据NCBI数据，丝氨酸蛋白酶域包括残基Val581-Arg804。
Glu-纤溶酶原是天然全长的纤溶酶原，由791个氨基酸组成(不含有19个氨基酸的信号肽)，编码该序列的cDNA序列如序列1所示，其氨基酸序列如序列2所示。在体内，还存在一种是从Glu-纤溶酶原的第76-77位氨基酸处水解从而形成的Lys-纤溶酶原，如序列6所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列5所示。δ-plasminogen(δ-plasminogen)是全长纤溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5结构的片段，仅含有Kringle1和丝氨酸蛋白酶域[11,12]，有文献报道了δ-plasminogen的氨基酸序列(序列8)[12]，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列7。Mini-plasminogen由Kringle5和丝氨酸蛋白酶域组成，有文献报道其包括残基Val443-Asn791(以不含有信号肽的Glu-plg序列的Glu残基为起始氨基酸)[13]，其氨基酸序列如序列10所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而Micro-plasminogen仅含有丝氨酸蛋白酶结构域，有文献报道其氨基酸序列包括残基Ala543-Asn791(以不含有信号肽的Glu-plg序列的Glu残基为起始氨基酸)[14]，也有专利CN102154253A报道其序列包括残基Lys531-Asn791(以不含有信号肽的Glu-plg序列的Glu残基为起始氨基酸)，本专利序列参考专利CN102154253A，其氨基酸序列如序列12所示，编码该氨基酸序列的cDNA序列如序列11所示。
本发明的“纤溶酶”与“纤维蛋白溶酶”、“纤维蛋白溶解酶”可互换使用，含义相同；“纤溶酶原”与“纤维蛋白溶酶原”、“纤维蛋白溶解酶原”可互换使用，含义相同。
本领域技术人员可以理解，本发明纤溶酶原的所有技术方案适用于纤溶酶，因此，本发明描述的技术方案涵盖了纤溶酶原和纤溶酶。
在循环过程中，纤溶酶原采用封闭的非活性构象，但当结合至血栓或细胞表面时，在PLG激活剂(plasminogen activator，PA)的介导下，其转变为呈开放性构象的活性PLM。具有活性的PLM可进一步将纤维蛋白凝块水解为纤维蛋白降解产物和D-二聚体，进而溶解血栓。其中PLG的PAp结构域包含维持纤溶酶原处于非活性封闭构象的重要决定簇，而KR结构域则能够与存在于受体和底物上的赖氨酸残基结合。已知多种能够作为PLG激活剂的酶，包括：组织纤溶酶原激活剂(tPA)、尿激酶纤溶酶原激活剂(uPA)、激肽释放酶和凝血因子XII(哈格曼因子)等。
“纤溶酶原活性片段”是指在纤溶酶原蛋白中，能够与底物中的靶序列结合并发挥蛋白水解功能的活性片段。本发明涉及纤溶酶原的技术方案涵盖了用纤溶酶原活性片段代替纤溶酶原的技术方案。本发明所述的纤溶酶原活性片段为包含纤溶酶原的丝氨酸蛋白酶结构域的蛋白质，优选，本发明所述的纤溶酶原活性片段包含序列14、与序列14具有至少80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列的蛋白质。因此，本发明所述的纤溶酶原包括含有该纤溶酶原活性片段、并且仍然保持该纤溶酶原活性的蛋白。
目前，对于血液中纤维蛋白溶酶原及其活性测定方法包括：对组织纤维蛋白溶酶原激活剂活性的检测(t-PAA)、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抗原的检测(t-PAAg)、对血浆组织纤溶酶原活性的检测(plgA)、血浆组织纤溶酶原抗原的检测(plgAg)、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物活性的检测、血浆组织纤维蛋白溶酶原激活剂抑制物抗原的检测、血浆纤维蛋白溶酶-抗纤维蛋白溶酶复合物检测(PAP)。其中最常用的检测方法为发色底物法：向受检血浆中加链激酶(SK)和发色底物，受检血浆中的PLG在SK的作用下，转变成PLM，后者作用于发色底物，随后用分光光度计测定，吸光度增加与纤维蛋白溶酶原活性成正比。此外也可采用免疫化学法、凝胶电泳、免疫比浊法、放射免疫扩散法等对血液中的纤维蛋白溶酶原活性进行测定。
“直系同源物或直系同系物(ortholog)”指不同物种之间的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也称为直向同源物、垂直同源物。其具体指不同物种中由同一祖先基因进化而来的蛋白或基因。本发明的纤溶酶原包括人的天然纤溶酶原，还包括来源于不同物种的、具有纤溶酶原活性的纤溶酶原直系同源物或直系同系物。
“保守取代变体”是指其中一个给定的氨基酸残基改变但不改变蛋白质或酶的整体构象和功能，这包括但不限于以相似特性(如酸性，碱性，疏水性，等)的氨基酸取代亲本蛋白质中氨基酸序列中的氨基酸。具有类似性质的氨基酸是众所周知的。例如，精氨酸、组氨酸和赖氨酸是亲水性的碱性氨基酸并可以互换。同样，异亮氨酸是疏水氨基酸，则可被亮氨酸，蛋氨酸或缬氨酸替换。因此，相似功能的两个蛋白或氨基酸序列的相似性可能会不同。例如，基于MEGALIGN算法的70％至99％的相似度(同一性)。“保守取代变体”还包括通过BLAST或FASTA算法确定具有60％以上的氨基酸同一性的多肽或酶，若能达75％以上更好，最好能达85％以上，甚至达90％以上为最佳，并且与天然或亲本蛋白质或酶相比具有相同或基本相似的性质或功能。
“分离的”纤溶酶原是指从其天然环境分离和/或回收的纤溶酶原蛋白。在一些实施方案中，所述纤溶酶原会纯化(1)至大于90％、大于95％、或大于98％的纯度(按重量计)，如通过Lowry法所确定的，例如超过99％(按重量计)，(2)至足以通过使用旋转杯序列分析仪获得N端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至同质性，该同质性是通过使用考马斯蓝或银染在还原性或非还原性条件下的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)确定的。分离的纤溶酶原也包括通过生物工程技术从重组细胞制备，并通过至少一个纯化步骤分离的纤溶酶原。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指任何长度的氨基酸的聚合形式，其可以包括遗传编码的和非遗传编码的氨基酸，化学或生物化学修饰的或衍生化的氨基酸，和具有经修饰的肽主链的多肽。该术语包括融合蛋白，包括但不限于具有异源氨基酸序列的融合蛋白，具有异源和同源前导序列(具有或没有N端甲硫氨酸残基)的融合物；等等。
关于参照多肽序列的“氨基酸序列同一性百分数(％)”定义为在必要时引入缺口以实现最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式实现，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员能决定用于比对序列的适宜参数，包括对所比较序列全长实现最大对比需要的任何算法。然而，为了本发明的目的，氨基酸序列同一性百分数值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生的。
在采用ALIGN-2来比较氨基酸序列的情况中，给定氨基酸序列A相对于给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：
分数X/Y乘100
其中X是由序列比对程序ALIGN-2在该程序的A和B比对中评分为相同匹配的氨基酸残基的数目，且其中Y是B中的氨基酸残基的总数。应当领会，在氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等的情况下，A相对于B的％氨基酸序列同一性会不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。除非另有明确说明，本文中使用的所有％氨基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALIGN-2计算机程序获得的。
如本文中使用的，术语“治疗”和“预防”指获得期望的药理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分预防疾病或其症状，和/或部分或完全治愈疾病和/或其症状，并且包括：(a)预防疾病在受试者体内发生，所述受试者可以具有疾病的素因，但是尚未诊断为具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滞其形成；和(c)减轻疾病和/或其症状，即引起疾病和/或其症状消退。
术语“个体”、“受试者”和“患者”在本文中可互换使用，指哺乳动物，包括但不限于鼠(大鼠，小鼠)、非人灵长类、人、犬、猫、有蹄动物(例如马、牛、绵羊、猪、山羊)等。
“治疗有效量”或“有效量”指在对哺乳动物或其它受试者施用以治疗疾病时足以实现对疾病的所述预防和/或治疗的纤溶酶原的量。“治疗有效量”会根据所使用的纤溶酶原、要治疗的受试者的疾病和/或其症状的严重程度以及年龄、体重等而变化。
2.本发明纤溶酶原的制备
纤溶酶原可以从自然界分离并纯化用于进一步的治疗用途，也可以通过标准的化学肽合成技术来合成。当通过化学合成多肽时，可以经液相或固相进行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中将序列的C末端氨基酸附接于不溶性支持物，接着序贯添加序列中剩余的氨基酸)是适合纤溶酶原化学合成的方法。各种形式的SPPS，诸如Fmoc和Boc可用于合成纤溶酶原。用于固相合成的技术描述于Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284页于The Peptides:Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in PeptideSynthesis,Part A.,Merrifield,等J.Am.Chem.Soc.,85:2149-2156(1963)；Stewart等,Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006Mini Rev.Med Chem.6:3-10和Camarero JA等2005Protein PeptLett.12:723-8中。简言之，用其上构建有肽链的功能性单元处理小的不溶性多孔珠。在偶联/去保护的重复循环后，将附接的固相游离N末端胺与单个受N保护的氨基酸单元偶联。然后，将此单元去保护，露出可以与别的氨基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之后将其切掉。
可以使用标准重组方法来生产本发明的纤溶酶原。例如，将编码纤溶酶原的核酸插入表达载体中，使其与表达载体中的调控序列可操作连接。表达调控序列包括但不限于启动子(例如天然关联的或异源的启动子)、信号序列、增强子元件、和转录终止序列。表达调控可以是载体中的真核启动子系统，所述载体能够转化或转染真核宿主细胞(例如COS或CHO细胞)。一旦将载体掺入合适的宿主中，在适合于核苷酸序列的高水平表达及纤溶酶原的收集和纯化的条件下维持宿主。
合适的表达载体通常在宿主生物体中作为附加体或作为宿主染色体DNA的整合部分复制。通常，表达载体含有选择标志物(例如氨苄青霉素抗性、潮霉素抗性、四环素抗性、卡那霉素抗性或新霉素抗性)以有助于对外源用期望的DNA序列转化的那些细胞进行检测。
大肠杆菌(Escherichia coli)是可以用于克隆本发明纤溶酶原蛋白编码多核苷酸的原核宿主细胞的例子。适合于使用的其它微生物宿主包括杆菌，诸如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和其他肠杆菌科(enterobacteriaceae)，诸如沙门氏菌属(Salmonella)、沙雷氏菌属(Serratia)、和各种假单胞菌属(Pseudomonas)物种。在这些原核宿主中，也可以生成表达载体，其通常会含有与宿主细胞相容的表达控制序列(例如复制起点)。另外，会存在许多公知的启动子，诸如乳糖启动子系统，色氨酸(trp)启动子系统，beta-内酰胺酶启动子系统，或来自噬菌体λ的启动子系统。启动子通常会控制表达，任选在操纵基因序列的情况中，并且具有核糖体结合位点序列等，以启动并完成转录和翻译。
其他微生物，诸如酵母也可用于表达。酵母(例如酿酒酵母(S.cerevisiae))和毕赤酵母(Pichia)是合适的酵母宿主细胞的例子，其中合适的载体根据需要具有表达控制序列(例如启动子)、复制起点、终止序列等。典型的启动子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。诱导型酵母启动于特别包括来自醇脱氢酶、异细胞色素C、和负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子。
在微生物外，哺乳动物细胞(例如在体外细胞培养物中培养的哺乳动物细胞)也可以用于表达本发明的纤溶酶原。参见Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合适的哺乳动物宿主细胞包括CHO细胞系、各种Cos细胞系、HeLa细胞、骨髓瘤细胞系、和经转化的B细胞或杂交瘤。用于这些细胞的表达载体可以包含表达控制序列，如复制起点，启动子和增强子(Queen等,Immnol.Rev.89:49(1986))，以及必需的加工信息位点，诸如核糖体结合位点，RNA剪接位点，多聚腺苷酸化位点，和转录终止子序列。合适的表达控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳头瘤病毒、巨细胞病毒等衍生的启动子。参见Co等,J.Immunol.148:1149(1992)。
一旦合成(化学或重组方式)，可以依照本领域的标准规程，包括硫酸铵沉淀，亲和柱，柱层析，高效液相层析(HPLC)，凝胶电泳等来纯化本发明所述的纤溶酶原。该纤溶酶原是基本上纯的，例如至少约80％至85％纯的，至少约85％至90％纯的，至少约90％至95％纯的，或98％至99％纯的或更纯的，例如不含污染物，所述污染物如细胞碎片，除本发明纤溶酶原蛋白以外的大分子，等等。
3.药物配制剂
可以通过将具有所需纯度的纤溶酶原与可选的药用载体，赋形剂，或稳定剂(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成冻干制剂或水溶液制备治疗配制剂。可接受的载体、赋形剂、稳定剂在所用剂量及浓度下对受者无毒性，并包括缓冲剂例如磷酸盐，柠檬酸盐及其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和蛋氨酸；防腐剂(例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化己烷双胺；氯化苄烷铵(benzalkoniumchloride)，苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；间甲酚)；低分子量多肽(少于约10个残基)；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸，谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成盐反离子如钠；金属复合物(例如锌-蛋白复合物)；和/或非离子表面活性剂。
本发明的配制剂也可含有需治疗的具体病症所需的一种以上的活性化合物，优选活性互补并且相互之间没有副作用的那些。例如，治疗如下一种或多种疾病的药物：糖尿病、糖尿病并发症、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脑出血、脑栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨质疏松、认知障碍、帕金森综合征、阿尔茨海默病、炎性肠病、消化不良和胃肠道溃疡。
本发明的纤溶酶原可包裹在通过诸如凝聚技术或界面聚合而制备的微胶囊中，例如，可置入在胶质药物传送系统(例如，脂质体，白蛋白微球，微乳剂，纳米颗粒和纳米胶囊)中或置入粗滴乳状液中的羟甲基纤维素或凝胶-微胶囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中。这些技术公开于Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
用于体内给药的本发明的纤溶酶原必需是无菌的。这可以通过在冷冻干燥和重新配制之前或之后通过除菌滤膜过滤而轻易实现。
本发明的纤溶酶原可制备缓释制剂。缓释制剂的适当实例包括具有一定形状且含有糖蛋白的固体疏水聚合物半通透基质，例如膜或微胶囊。缓释基质实例包括聚酯、水凝胶(如聚(2-羟基乙基-异丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12:98-105(1982))或聚(乙烯醇)，聚交酯(美国专利3773919,EP 58,481)，L-谷氨酸与乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22:547(1983))，不可降解的乙烯－乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出处同上)，或可降解的乳酸-羟基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羟基乙酸共聚物和亮氨酰脯氨酸(leuprolide)乙酸酯组成的可注射的微球体)，以及聚D-(-)-3-羟丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能持续释放分子100天以上，而一些水凝胶释放蛋白的时间却较短。可以根据相关机理来设计使蛋白稳定的合理策略。例如，如果发现凝聚的机理是通过硫代二硫键互换而形成分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸性溶液中冻干、控制湿度、采用合适的添加剂、和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。
4.给药和剂量
可以通过不同方式，例如通过静脉内，腹膜内，皮下，颅内，鞘内，动脉内(例如经由颈动脉)，肌内，鼻内，表面或皮内施用或脊髓或脑投递来实现本发明药物组合物的施用。气溶胶制剂如鼻喷雾制剂包含活性剂的纯化的水性或其它溶液及防腐剂和等渗剂。将此类制剂调节至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。
在一些情况中，可以以下方式修饰或配制本发明的纤溶酶原药物组合物，从而提供其穿过血脑屏障的能力。
用于胃肠外施用的制备物包括无菌水性或非水性溶液、悬浮液和乳剂。非水性溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯，如油酸乙酯。水性载体包括水、醇性/水性溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。胃肠外媒介物包含氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、或固定油。静脉内媒介物包含液体和营养补充物、电解质补充物，等等。也可以存在防腐剂和其他添加剂，诸如例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂、和惰性气体，等等。
在一些实施方案中，本发明的纤溶酶原与促进穿过血脑屏障的药剂配制在一起。在一些情况中，本发明的纤溶酶原直接或经接头与促进穿过血脑屏障的载体分子、肽或蛋白质融合。在一些实施方案中，本发明的纤溶酶原与结合内源血脑屏障(BBB)受体的多肽融合。连接纤溶酶原与结合内源BBB受体的多肽，促进穿过BBB。结合内源BBB受体的合适的多肽包括抗体，例如单克隆抗体，或其抗原结合片段，其特异性结合内源BBB受体。在一些情况中，所述抗体是囊封于脂质体中的。参见例如美国专利公开文本No.2009/0156498。
医务人员会基于各种临床因素确定剂量方案。如医学领域中公知的，任一患者的剂量取决于多种因素，包括患者的体型、体表面积、年龄、要施用的具体化合物、性别、施用次数和路径、总体健康、和同时施用的其它药物。本发明包含纤溶酶原的药物组合物的剂量范围可以例如为例如每天约0.0001至2000mg/kg，或约0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受试者体重。例如，剂量可以是1mg/kg体重或50mg/kg体重或在1-50mg/kg的范围，或至少1mg/kg。高于或低于此例示性范围的剂量也涵盖在内，特别是考虑到上述的因素。上述范围中的中间剂量也包含在本发明的范围内。受试者可以每天、隔天、每周或根据通过经验分析确定的任何其它日程表施用此类剂量。例示性的剂量日程表包括连续几天1-10mg/kg。在本发明的药物施用过程中需要实时评估、定期评估治疗效果和安全性。
5.制品或药盒
本发明的一个实施方案涉及一种制品或药盒，其包含本发明纤溶酶原。所述制品优选包括一个容器，标签或包装插页。适当的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各种材料如玻璃或塑料制成。所述容器含有组合物，所述组合物可有效治疗本发明的疾病或病症并具有无菌入口(例如所述容器可为静脉内溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射针穿透的塞子的)。所述组合物中至少一种活性剂为纤溶酶原。所述容器上或所附的标签说明所述组合物用于治疗本发明所述病症。所述制品可进一步包含含有可药用缓冲液的第二容器，诸如磷酸盐缓冲的盐水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可进一步包含从商业和使用者角度来看所需的其它物质，包括其它缓冲液，稀释剂，过滤物，针和注射器。此外，所述制品包含带有使用说明的包装插页，包括例如指示所述组合物的使用者将纤溶酶原组合物以及治疗伴随的疾病的其它药物给药患者。
附图简述
图1A-C 14-15周龄db/db小鼠给予纤溶酶原28天胰腺GLP-1免疫染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛GLP-1的表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。结果表明，纤溶酶原能够促进相对年轻糖尿病小鼠胰岛GLP-1的表达。
图2A-B 23-25周龄db/db小鼠给予纤溶酶原28天胰腺GLP-1免疫染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛GLP-1的表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组。结果表明，纤溶酶原能够促进相对年老糖尿病小鼠胰岛GLP-1的表达。
图3A-C PLG+/+小鼠在T1DM模型中给予纤溶酶原28天后胰岛GLP-1染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛GLP-1的表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组，且统计差异显著(**表示P<0.01)。结果表明，纤溶酶原能够促进I型糖尿病小鼠胰岛GLP-1的表达。
图4A-C 24-25周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛胰高血糖素免疫组化染色观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，胰高血糖素在正常对照小鼠中表达在胰岛周边α细胞区域。与给纤溶酶原组相比，给溶媒PBS对照组胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，阳性细胞浸润到胰岛的中央区域；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组与PBS组相比，胰岛形态更接近正常小鼠。说明纤溶酶原能够显著抑制胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，从而促进胰岛损伤的修复。
图5A-D 27周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛胰高血糖素免疫组化染色观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，胰高血糖素在正常对照小鼠中表达在胰岛周边α细胞区域。与给纤溶酶原组相比，给溶媒PBS对照组胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，阳性细胞浸润到胰岛的中央区域，且平均光密度定量分析结果具有统计学差异(*表示P<0.05)；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组与PBS组相比，其形态更接近正常小鼠。说明纤溶酶原能够显著抑制胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，从而促进胰岛损伤的修复。
图6A-D给予纤溶酶原28天后PLG+/+小鼠在T1DM模型中胰岛胰高血糖素免疫组化染色观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组胰高血糖素阳性表达明显多于给纤溶酶原组，且平均光密度定量分析结果统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能够显著减少糖尿病小鼠胰岛α细胞分泌胰高血糖素，促进胰岛损伤的修复。
图7 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原第11、32天血糖检测结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠的血糖明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。此外，随着给药时间的延长，给溶媒PBS对照组小鼠血糖有升高趋势，而给纤溶酶原组血糖逐渐降低。说明纤溶酶原具有降血糖的作用。
图8给予纤溶酶原对糖尿病鼠血清果糖胺浓度的影响。检测结果显示，给予纤溶酶原后血清果糖胺的浓度明显降低，与给药前相比，统计差异极显著(**表示P<0.01)。说明纤溶酶原能显著降低糖尿病小鼠的血清果糖胺水平。
图9 27周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后血清果糖胺检测结果。检测结果显示，给纤溶酶原组血清果糖胺的浓度明显低于给溶媒PBS对照组，统计差异接近显著(P＝0.06)。说明纤溶酶原能显著降低糖尿病小鼠的血清果糖胺水平。
图10 27周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后血浆糖化血红蛋白检测结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠糖化血红蛋白的OD值明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异极显著(**表示P<0.01)。说明纤溶酶原具有降低糖尿病小鼠血浆糖化血红蛋白的作用。
图11 27周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原10天后IPGTT检测结果。结果显示，腹腔注射葡萄糖后，给纤溶酶原组小鼠血糖水平低于给溶媒PBS对照组，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组糖耐受曲线更加接近正常小鼠组。说明纤溶酶原能明显改善糖尿病小鼠糖耐受能力。
图12 T1DM模型PLG+/+小鼠给予纤溶酶原10天后禁食后血糖检测结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠血糖明显高于给纤溶酶原组，且统计差异极显著(***表示P<0.001)。说明纤溶酶原能显著降低PLG+/+小鼠在T1DM模型中的血糖水平。
图13 T1DM模型PLG+/+小鼠给予纤溶酶原28天后IPGTT检测结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠注射葡萄糖后血糖浓度明显高于给纤溶酶原组，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组糖耐受曲线更加接近正常小鼠。说明纤溶酶原能提高PLG+/+小鼠在T1DM模型中的糖耐受能力。
图14 T1DM模型小鼠给予纤溶酶原20天后血糖检测结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠血糖明显高于给纤溶酶原组小鼠，且统计差异显著(P＝0.04)。说明纤溶酶原能促进T1DM小鼠葡萄糖分解能力，从而降低血糖。
图15 27周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后血清胰岛素检测结果。结果显示，给纤溶酶原组血清胰岛素水平明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能有效促进胰岛素的分泌。
图16A-E 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰脏的HE染色图片及胰岛面积比统计分析结果。A、B为给溶媒PBS对照组，C、D为给纤溶酶原组，E为胰岛面积定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组大部分的胰岛发生萎缩，萎缩的胰岛细胞被腺泡(箭头标识)所代替，胰岛边缘的腺泡增生，致胰岛与腺泡之间分界不清；给纤溶酶原组大部分的胰岛较之于对照组面积大，且胰岛内未有腺泡增生，只有少数的胰岛内残存有少量的腺泡，胰岛与腺泡之间边界清晰。比较给纤溶酶原组和对照组的胰岛占胰腺的面积比发现，给药组比对照组大近乎一倍。说明纤溶酶原能促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛损伤的修复，从而通过修复损伤的胰岛治疗糖尿病。
图17A-C 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛天狼星红染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠胰岛胶原沉积(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能改善糖尿病动物胰岛的纤维化。
图18A-B 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛Caspase-3免疫组化染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组Caspase-3的表达(箭头标识)明显低于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能减少胰岛细胞的凋亡，保护糖尿病小鼠胰脏组织。
图19A-C 17-18周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛胰岛素免疫组化染色结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异接近显著(P＝0.15)。说明纤溶酶原能够促进胰岛功能修复，促进胰岛素的产生和分泌。
图20A-C 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛的胰岛素免疫组化染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能促进胰岛功能修复，促进胰岛素的产生和分泌。
图21A-C 27周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛的胰岛素免疫组化染色结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异极显著(**表示P<0.01)。说明纤溶酶原能有效促进胰岛功能修复，促进胰岛素的产生和分泌。
图22A-D 24-25周龄糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰腺组织NF-κB免疫组化染色观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组NF-κB的表达(箭头标识)接近正常对照小鼠，并且明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF-κB的表达，从而促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛炎症的修复。
图23A-D 17-18周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛胰高血糖素免疫组化染色观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，胰高血糖素在正常对照小鼠中表达在胰岛周边α细胞区域。与给纤溶酶原组相比，给溶媒PBS对照组胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，胰高血糖素阳性细胞浸润到胰岛的中央区域，且平均光密度定量分析结果统计差异极显著(**表示P<0.01)；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组与PBS组相比，胰岛形态更接近正常小鼠。说明纤溶酶原能够显著抑制胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，从而促进胰岛损伤的修复。
图24A-D 17-18周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛IRS-2免疫组化染色观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组，且统计差异极显著(**表示P<0.01)；给纤溶酶原组IRS-2表达水平较给溶媒PBS组更接近正常对照组小鼠。说明纤溶酶原能有效增加胰岛细胞IRS-2的表达，改善胰岛素信号转导，减少17-18周龄糖尿病小鼠胰岛β细胞损伤。
图25A-D 24-25周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛IRS-2免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组，且统计差异显著(*表示P<0.05)；给纤溶酶原组IRS-2表达水平较给溶媒PBS组更接近正常对照组小鼠。说明纤溶酶原能有效增加胰岛细胞IRS-2的表达，改善胰岛素信号转导，减少糖尿病小鼠胰岛β细胞损伤。
图26A-C 27周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛IRS-2免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组；给纤溶酶原组IRS-2表达水平较给溶媒PBS组更接近正常对照组小鼠。说明纤溶酶原能有效增加胰岛细胞IRS-2的表达，改善胰岛素信号转导，减少糖尿病小鼠胰岛β细胞损伤。
图27A-C给予纤溶酶原28天后PLG+/+T1DM小鼠胰岛IRS-2免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组；给纤溶酶原组IRS-2表达水平较给溶媒PBS组更接近正常对照组小鼠。说明纤溶酶原能有效增加胰岛细胞IRS-2的表达，改善胰岛素信号转导，减少PLG+/+T1DM小鼠胰岛β细胞损伤。
图28A-C 27周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛中性粒细胞免疫组化染色观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组阳性表达细胞(箭头标识)少于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组。说明纤溶酶原能减少中性粒细胞的浸润。
图29A-C T1DM模型中PLG-/-小鼠给予纤溶酶原28天后胰岛中性粒细胞免疫组化染色观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组阳性表达细胞(箭头标识)少于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组。说明纤溶酶原能减少PLG-/-小鼠在T1DM模型中胰岛中性粒细胞的浸润。
图30A-C在T1DM模型中PLG+/+小鼠给予纤溶酶原28天后胰岛中性粒细胞免疫组化染色观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组阳性表达细胞(箭头标识)少于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组。说明纤溶酶原能减少PLG+/+小鼠在T1DM模型中胰岛中性粒细胞的浸润。
图31A-C T1DM模型中PLG-/-小鼠给予纤溶酶原28天后胰岛胰岛素免疫组化染色观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。免疫组化结果显示，给纤溶酶原组胰岛素阳性表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组。说明纤溶酶原能促进在T1DM模型中的PLG-/-小鼠胰岛素的合成与分泌。
图32A-C PLG+/+小鼠在T1DM模型中给予纤溶酶原28天后胰岛胰岛素免疫组化染色观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。免疫组化结果显示，给纤溶酶原组胰岛素阳性表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组。说明纤溶酶原促进T1DM模型中PLG+/+小鼠胰岛素的合成与表达。
图33A-C PLG-/-小鼠在T1DM模型中给予纤溶酶原28天后胰岛NF-κB免疫组化染色观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。结果显示，给纤溶酶原组NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能促进炎症修复因子NF-κB的表达，从而促进胰岛炎症的修复。
图34A-B 17-18周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛NF-κB免疫组化染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。实验结果显示，给纤溶酶原组NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF-κB的表达，从而促进相对年轻(17-18周龄)糖尿病小鼠胰岛炎症的修复。
图35A-C 27周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛NF-κB免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。本发明实验结果显示，给纤溶酶原组NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF-κB的表达，从而促进相对年老(27周龄)糖尿病小鼠胰岛炎症的修复。
图36A-C 24-25周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛TNF-α免疫组化观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。研究结果显示，给纤溶酶原组TNF-α的阳性表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组。说明纤溶酶原能促进TNF-α的表达，从而促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛损伤修复。
图37A-C 27周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后胰岛TNF-α免疫组化染色观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。研究结果显示，给纤溶酶原组TNF-α的阳性表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组。说明纤溶酶原能促进TNF-α的表达，从而促进27周龄糖尿病小鼠胰岛损伤修复。
图38A-B PLG-/-小鼠T1DM模型中给予纤溶酶原28天后胰岛TNF-α免疫组化染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组。研究结果显示，给纤溶酶原组TNF-α的阳性表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组。说明纤溶酶原能促进TNF-α的表达，从而促进PLG-/-小鼠T1DM模型中胰岛损伤修复。
图39A-C PLG-/-T1DM模型小鼠给予纤溶酶原28天后胰岛IgM免疫组化观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。本实验研究结果显示，给纤溶酶原组IgM的阳性表达(箭头标识)明显低于给溶媒PBS对照组，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组。说明纤溶酶原能降低IgM的表达，从而减少PLG-/-小鼠在T1DM模型中胰岛损伤。
图40A-C 24-25周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛TUNEL染色观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组。本实验结果显示，正常对照组TUNEL阳性染色极低。给纤溶酶原组的阳性细胞数(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组。正常对照组凋亡率约为8％，给溶媒PBS组凋亡率约为93％，给纤溶酶原组凋亡率为约16％。说明纤溶酶原组能显著减少糖尿病小鼠胰岛细胞的凋亡。
图41 T1DM模型小鼠给予纤溶酶原20天后血清胰岛素检测结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠血清胰岛素浓度明显低于给纤溶酶原组小鼠，且统计差异接近显著(P＝0.08)。说明纤溶酶原能促进T1DM小鼠胰岛素的分泌。
图42A-D 24-25周龄的糖尿病小鼠给予纤溶酶原31天后胰岛GLP-1R染色观察结果。A为正常对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛GLP-1R表达(箭头标识)明显少于正常对照小鼠，给纤溶酶原组小鼠胰岛GLP-1R的表达虽然也少于正常对照组，但明显多于给溶媒PBS对照组，且统计差异极为显著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。实验结果表明纤溶酶原能够促进糖尿病小鼠胰岛GLP-1R的表达。
图43A-D高脂血症模型小鼠给予纤溶酶原30天胰腺GLP-1R免疫染色观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛GLP-1R表达(箭头标识)明显少于正常对照小鼠，给纤溶酶原组小鼠胰岛GLP-1R的表达虽然也少于空白对照组，但明显多于给溶媒PBS对照组，且统计差异极为显著(**表示P<0.01)。实验结果表明纤溶酶原能够促进高脂血症模型小鼠胰岛GLP-1R的表达。
图44A-C 14-15周龄db/db小鼠给予纤溶酶原28天胰腺GLP-1R免疫染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛GLP-1R的表达明显少于给纤溶酶原组，且统计差异接近显著(P＝0.09)。结果表明，纤溶酶原能够促进相对年轻(14-15周龄)糖尿病小鼠胰岛GLP-1R的表达。
图45A-C动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后肝脏GLP-1R免疫组化染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠肝脏GLP-1R的表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组，且统计差异极为显著(***表示
P<0.001)。该结果表明，纤溶酶原能够促进动脉粥样硬化模型小鼠GLP-1R的表达，有可能促进肝脏脂肪合成、分泌、吸收或氧化，减少血中脂类水平，改善高脂血症。
图46A-C高脂血症模型小鼠给予纤溶酶原30天肝脏GLP-1R免疫染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠肝脏GLP-1R的表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组，且统计差异接近显著(P＝0.09)。该结果表明，纤溶酶原能够促进高脂血症模型小鼠肝脏GLP-1R的表达，有可能促进肝脏脂肪合成、分泌、吸收或氧化，减少血中脂类水平，改善高脂血症。
图47A-C MPTP诱导的帕金森模型小鼠给予纤溶酶原14天后黑质GLP-1R免疫染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠黑质GLP-1R的表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。该结果表明，纤溶酶原能够促进帕金森模型小鼠黑质GLP-1R的表达。
图48给予纤溶酶原28天高热量饲料诱导的肥胖模型小鼠体重变化计算结果。结果展示为第29天体重减去第1天体重的数值。结果显示，空白对照组体重改变并不明显，给纤溶酶原组体重明显下降，与给溶媒PBS对照组相比，统计差异显著(*为P<0.05)。说明纤溶酶原能够促进肥胖模型小鼠体重的降低。
图49给予纤溶酶原28天高热量饲料诱导的肥胖模型小鼠体重指数统计结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠体重指数明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*为P<0.05，**为P<0.01)，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组小鼠的体重指数更加接近空白对照组。说明纤溶酶原能够显著降低肥胖模型小鼠的体重指数，减轻肥胖。
图50给予纤溶酶原28天高热量饲料诱导的肥胖模型小鼠Lee's指数统计结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠Lee's指数明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*为P<0.05)，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组小鼠的Lee's指数更加接近空白对照组。说明纤溶酶原能够显著降低肥胖模型小鼠的Lee's指数，减轻肥胖。
图51给予纤溶酶原28天高热量饲料诱导的肥胖模型小鼠腹腔脂肪系数统计结果。结果显示，给纤溶酶原组腹腔脂肪系数明显低于给溶媒PBS对照组，统计差异显著(*为P<0.05)，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组小鼠腹腔脂肪含量更加接近空白对照组。说明纤溶酶原能够显著降低肥胖模型小鼠腹腔脂肪的沉积。
图52A-D给予纤溶酶原28天高热量饲料诱导的肥胖模型小鼠腹腔脂肪H&E染色脂肪空泡面积统计结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组平均脂肪空泡的面积明显小于给溶媒PBS对照组，统计差异极为显著(**表示P<0.01)，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组脂肪空泡面积更加接近空白对照小鼠。说明纤溶酶原能够显著地降低肥胖模型小鼠脂肪细胞的大小，减少腹腔脂肪沉积。
图53A-C 24-25周糖尿病小鼠给予纤溶酶原35天后肝脏油红O染色图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。。结果显示，给纤溶酶原组小鼠肝脏的脂质沉积面积要显著小于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能减少脂肪在糖尿病小鼠肝脏中的沉积。
图54A-C ApoE动脉粥样硬化模型小鼠给予纤溶酶原30天后肝脏油红O染色代表性图片。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠肝脏脂肪沉积明显少于给溶媒PBS对照组，且定量分析统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能减少脂肪在动脉粥样硬化模型小鼠肝脏中的沉积。
图55A-C 16周高脂血症模型小鼠给予纤溶酶原30天后肝脏油红O染色观察结果。A为给溶媒PBS对照组，B为给纤溶酶原组，C为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠肝脏脂肪沉积明显少于给溶媒PBS对照组，且定量分析统计差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能改善脂肪在高脂血症模型小鼠肝脏中的沉积。
图56A-D Cuprizone诱导脱髓鞘模型小鼠给予纤溶酶原14天脑胼胝体LFB染色结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，空白对照组胼胝体髓鞘形态基本正常，给纤溶酶原组胼胝体髓鞘阳性着色(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*为P<0.05)。说明纤溶酶原能够促进cuprizone诱导脱髓鞘模型小鼠胼胝体髓鞘的再生。
图57A-D Cuprizone诱导脱髓鞘模型小鼠给予纤溶酶原14天脑神经丝蛋白(NFP)免疫染色观察结果。A为空白对照组，B为给溶媒PBS对照组，C为给纤溶酶原组，D为定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠胼胝体NFP的表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组，统计差异显著(*为P<0.05)，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组胼胝体NFP的表达更加接近空白对照组。说明纤溶酶原能够促进NFP的表达，从而促进神经纤维再生。
图58A-C糖尿病烧伤模型小鼠给予纤溶酶原后烧伤皮肤蛋白基因产物9.5(Protein gene product 9.5,PGP 9.5)免疫染色结果。A为PGP9.5染色代表性图片。其中，A中的a-c分别为给溶媒PBS对照组第4、8、15天代表性图片，d-f为给纤溶酶原组第4、8、15天代表性图片；B为给药第4天和第8天免疫染色定量分析结果；C为给药第15天定量分析结果。结果显示，给纤溶酶原组小鼠烧伤皮肤PGP9.5阳性表达高于给溶媒PBS对照组，且在第8天两组小鼠PGP9.5的表达接近差异显著，在第15天两组差异显著(*表示P<0.05)。说明纤溶酶原能够促进糖尿病烧伤皮肤神经再生。
实施例
以下实施例中使用的人纤溶酶原来自捐赠者血浆，基于文献[15-17]所描述的方法并进行工艺优化，从血浆中纯化所得。纤溶酶原单体的纯度>95％。
实施例1纤溶酶原促进14-15周龄糖尿病小鼠胰岛GLP-1的表达
14-15周龄db/db雄性小鼠12只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各6只。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1抗体(Wuhan Boster Biological Technology,PB0742)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
胰高血糖素样肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)是一种肠促胰岛素的激素，在正常情况下表达量低，其表达能够促进胰岛素的分泌且抑制胰高血糖素的分泌[18]。
结果显示，给溶媒PBS对照组(图1A)小鼠胰岛GLP-1的表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组(图1B)，且统计差异显著(图1C)(*表示P<0.05)。结果表明，纤溶酶原能够促进相对年轻(14-15周龄)糖尿病小鼠胰岛GLP-1的表达。
实施例2纤溶酶原促进23-25周龄糖尿病小鼠胰岛GLP-1的表达
23-25周龄db/db雄性小鼠13只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组(7只)和给溶媒PBS对照组(6只)。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1抗体(Wuhan Boster Biological Technology,PB0742)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
结果显示，给溶媒PBS对照组(图2A)小鼠胰岛GLP-1的表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组(图2B)。结果表明，纤溶酶原能够促进相对年老(23-25周龄)糖尿病小鼠胰岛GLP-1的表达。
实施例3纤溶酶原促进T1DM模型中PLG+/+小鼠胰岛GLP-1表达
9-10周龄PLG+/+雄性小鼠8只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各4只。两组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射200mg/kg STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病[19]。注射12天后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1(Wuhan BosterBiological Technology,PB0742)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
结果显示，给溶媒PBS对照组(图3A)小鼠胰岛GLP-1的表达明显少于给纤溶酶原组(图3B)，且统计差异显著(图3C)(**表示P<0.01)。结果表明，纤溶酶原能够促进T1DM小鼠胰岛GLP-1的表达。
实施例4纤溶酶原减少24-25周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞的增殖，恢复胰岛α细胞的正常分布并降低胰高血糖素的分泌
24-25周龄db/db雄性小鼠11只以及db/m雄性小鼠5只，db/db小鼠称重后随机分为两组，给纤溶酶原组5只，给溶媒PBS对照组6只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS或不注射任何液体，连续给药31天；正常对照组小鼠不做给药处理。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗体(Abcam,ab92517)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
胰岛α细胞合成分泌胰高血糖素，主要散在分布于胰岛周边区域。
结果显示，与给纤溶酶原组(图4C)相比，给溶媒PBS对照组(图4B)胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，阳性细胞浸润到胰岛的中央区域；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组的胰岛形态比给溶媒PBS组更接近正常对照组(图4A)。说明纤溶酶原能够显著抑制24-25周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，提示纤溶酶原能促进胰岛损伤的修复。
实施例5纤溶酶原抑制27周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞的增殖，恢复胰岛α细胞的正常分布并降低胰高血糖素的分泌
27周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m雄性小鼠3只，db/db小鼠称重后随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天；正常对照组小鼠不做给药处理。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗体(Abcam,ab92517)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
胰岛α细胞合成分泌胰高血糖素，主要散在分布于胰岛周边区域。
结果显示，与给纤溶酶原组(图5C)相比，给溶媒PBS对照组(图5B)胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，阳性细胞浸润到胰岛的中央区域，且平均光密度定量分析结果具有统计学差异(*表示P<0.05)(图5D)；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组的胰岛形态比给溶媒PBS组更接近正常对照组(图5A)。说明纤溶酶原能够显著抑制27周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，提示纤溶酶原能促进胰岛损伤的修复。
实施例6纤溶酶原减少PLG+/+小鼠T1DM模型中胰高血糖素的分泌
9-10周龄PLG+/+雄性小鼠15只，根据体重随机分为两组，空白对照组(5只)和模型组(10只)。模型组小鼠禁食4小时后，按照200mg/kg体重单次腹腔注射STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病[19]，空白对照组单次腹腔注射0.25ml柠檬酸钠溶液(pH4.5)。STZ注射12天后用血糖仪测量血糖，模型组小鼠根据血糖随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。分组后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天；空白对照组小鼠不做给药处理。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗体(Abcam,ab92517)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
胰岛α细胞合成分泌胰高血糖素，主要分布于胰岛周边区域。
结果显示，给溶媒PBS对照组(图6B)胰高血糖素阳性表达(箭头标识)明显多于给纤溶酶原组(图6C)，且平均光密度定量分析结果统计差异显著(*表示P<0.05)(图6D)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(图6A)。说明纤溶酶原能够显著减少STZ诱导的T1DM小鼠胰岛α细胞分泌胰高血糖素。
实施例7纤溶酶原降低糖尿病小鼠血糖
24-25周龄db/db雄性小鼠8只，随机分为两组，给纤溶酶原组5只和给溶媒PBS对照组3只。实验开始当天记为第0天并称重分组，第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第10、31天禁食16小时后，在第11、32天用血糖试纸(Roche，Mannheim，Germany)进行血糖检测。
结果显示，给纤溶酶原组小鼠的血糖明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)。此外，随着给药时间的延长，给溶媒PBS对照组小鼠血糖有升高趋势，而给纤溶酶原组血糖逐渐降低(图7)。说明纤溶酶原具有降低糖尿病动物血糖的作用。
实施例8纤溶酶原降低糖尿病小鼠果糖胺水平
24-25周龄db/db雄性小鼠5只，给药前一天每只小鼠眼球静脉丛取血50μl用以检测血清果糖胺浓度，并记为第0天，第1天开始给予纤溶酶原，按照2mg/0.2ml/只/天尾静脉注射人源纤溶酶原，连续给药31天。第32天摘除眼球取血，检测血清果糖胺的浓度。果糖胺浓度使用果糖胺检测试剂盒(南京建成，A037-2)进行检测。
果糖胺浓度反映1～3周内血糖的平均水平。结果显示，给予纤溶酶原后血清果糖胺的浓度明显降低，与给药前相比统计差异极显著(**表示P<0.01)(图8)。说明纤溶酶原能有效降低糖尿病动物血清果糖胺水平。
实施例9纤溶酶原降低27周龄糖尿病小鼠血清果糖胺水平
27周龄db/db雄性小鼠9只，实验开始当天记为第0天并称重，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。第1天开始给纤溶酶原或PBS，连续给药35天。在第36天处死小鼠，检测血清果糖胺的浓度。果糖胺浓度使用果糖胺检测试剂盒(南京建成，A037-2)进行检测。
检测结果显示，给纤溶酶原组血清果糖胺的浓度明显低于给溶媒PBS对照组，统计差异接近显著(P＝0.06)(图9)。说明纤溶酶原能降低27周龄糖尿病小鼠的血清果糖胺浓度。
实施例10纤溶酶原降低糖尿病小鼠糖化血红蛋白水平
27周龄db/db雄性小鼠9只，小鼠称重后根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只。分组后开始给药定为第1天，开始给予纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第35天小鼠禁食16小时，第36天摘眼球取血，用以检测血浆糖化血红蛋白的浓度。
糖化血红蛋白含量通常可以反映患者近8～12周的血糖控制情况。
结果显示，给纤溶酶原组小鼠糖化血红蛋白的OD值明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异极显著(**表示P<0.01)(图10)。说明纤溶酶原具有降低糖尿病小鼠血浆糖化血红蛋白的作用。
实施例11纤溶酶原改善糖尿病小鼠糖耐受能力
27周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m小鼠3只。db/db小鼠称重后根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只和给溶媒PBS对照组5只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药10天；正常对照小鼠不做给药处理。第11天小鼠禁食16小时后，每只小鼠按5g/kg体重腹腔注射5％葡萄糖溶液，在0，30，60，90，120，180分钟用血糖试纸(Roche，Mannheim，Germany)检测血糖浓度。
腹腔糖耐受检测(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)可检测机体对葡萄糖的耐受能力。现有技术已知糖尿病患者糖耐量是下降的。
实验结果显示，腹腔注射葡萄糖后给纤溶酶原组小鼠血糖水平要低于给溶媒PBS对照组，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组糖耐受曲线更加接近正常小鼠组(图11)。说明纤溶酶原能明显改善糖尿病小鼠糖耐受能力。
实施例12纤溶酶原降低PLG+/+小鼠在T1DM模型中血糖水平
9-10周龄PLG+/+雄性小鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组以及给纤溶酶原组，每组各5只。两组小鼠禁食4小时后单次腹腔注射200mg/kg链脲佐菌素(STZ)(sigmaS0130)诱导T1DM[19]。STZ注射12天后开始给药并记为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药10天。在第11天小鼠禁食6小时后，用血糖试纸(Roche，Mannheim，Germany)测定血糖。
结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠血糖明显高于给纤溶酶原组小鼠，且统计差异极显著(***表示P<0.001)(图12)。说明纤溶酶原能显著降低PLG+/+小鼠T1DM模型的血糖水平。
实施例13纤溶酶原改善T1DM模型小鼠糖耐受能力
9-10周龄PLG+/+雄性小鼠15只，根据体重随机分为两组，空白对照组(5只)和模型组(10只)。模型组小鼠禁食4小时后，按照200mg/kg体重单次腹腔注射STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病[19]，空白对照组单次腹腔注射0.25ml柠檬酸钠溶液(pH4.5)。STZ注射12天后用血糖仪测量血糖，模型组小鼠根据血糖随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。分组后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天；空白对照组小鼠不做给药处理。第28天小鼠禁食6小时后，按照5g/kg体重腹腔注射5％葡萄糖溶液，在注射后0、15、30、60、90分钟用血糖试纸(Roche，Mannheim，Germany)检测血糖浓度。
腹腔糖耐受检测(Intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)可检测机体对葡萄糖的耐受能力。现有技术已知糖尿病患者糖耐量下降。
结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠注射葡萄糖后血糖浓度明显高于给纤溶酶原组，且与给溶媒PBS对照组相比，给纤溶酶原组糖耐受曲线更加接近正常小鼠(图13)。说明纤溶酶原能提高PLG+/+小鼠T1DM模型的糖耐受能力。
实施例14纤溶酶原提高T1DM模型小鼠葡萄糖分解能力
9-10周龄C57雄性小鼠8只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组以及给纤溶酶原组，每组各4只。给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组小鼠禁食4小时后，按照200mg/kg体重单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(sigma S0130)诱导T1DM[19]。STZ注射12天后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。连续给药19天，在第20天小鼠禁食6小时后，以2g/kg体重灌胃20％的葡萄糖，60分钟后，眼眶静脉丛采血并离心取上清，以葡萄糖检测试剂盒(上海荣盛361500)测定血糖。
结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠血糖明显高于给纤溶酶原组小鼠血糖，且统计差异显著(P＝0.04)(图14)。说明纤溶酶原能提高T1DM小鼠葡萄糖分解能力，从而降低血糖。
实施例15纤溶酶原促进糖尿病小鼠胰岛素分泌
27周龄db/db雄性小鼠9只，实验开始当天记为第0天，称重并根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第35天小鼠禁食16小时后，在第36天摘眼球取血，离心取上清，运用胰岛素检测试剂盒(Mercodia AB)按照使用说明检测血清胰岛素水平。
检测结果显示，给纤溶酶原组血清胰岛素水平明显高于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05)(图15)。说明纤溶酶原能显著促进糖尿病小鼠胰岛素的分泌。
实施例16纤溶酶原对糖尿病小鼠胰腺的保护作用
24-25周龄db/db雄性小鼠7只，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只和给溶媒PBS对照组3只。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(H&E染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水封片，切片在200和400倍光学显微镜下观察。
结果显示，给溶媒PBS对照组(图16A，16B)大部分的胰岛发生萎缩，萎缩的胰岛细胞被腺泡(箭头标识)所代替，胰岛边缘的腺泡增生，致胰岛与腺泡之间分界不清；给纤溶酶原组(图16C，16D)大部分的胰岛较之于对照组面积大，且胰岛内未有腺泡增生，只有少数的胰岛内残存少量的腺泡，胰岛与腺泡之间边界清晰。比较给药组和对照组的胰岛占胰腺的面积比发现，给纤溶酶原组比对照组大近乎一倍(图16E)。说明纤溶酶原可促进糖尿病小鼠胰岛损伤的修复。
实施例17纤溶酶原减少糖尿病小鼠胰岛胶原沉积
24-25周龄db/db雄性小鼠16只，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组10只，给溶媒PBS对照组6只。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡至水后水洗1次，以0.1％天狼星红染色60分钟后，流水冲洗，苏木素染色1分钟，流水冲洗，1％盐酸酒精和氨水分化返蓝，流水冲洗，烘干后封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
天狼星红染色可使胶原持久染色，作为病理切片特殊染色方法，天狼星红染色可以特异显示胶原组织。
染色结果显示，给纤溶酶原组小鼠(图17B)胰岛胶原沉积(箭头标识)明显低于给溶媒PBS对照组(图17A)，且统计差异显著(*表示P<0.05)(图17C)。说明纤溶酶原能降低糖尿病动物胰岛的纤维化。
实施例18纤溶酶原减少糖尿病小鼠胰岛细胞凋亡
24-25周龄db/db雄性小鼠6只，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只和给溶媒PBS对照组2只。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；之后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠Caspase-3抗体((WuhanBoster Biological Technology,BA2142)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在400倍光学显微镜下观察。
Caspase-3是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，其表达越多表明处于凋亡状态的细胞越多[20]。
本发明的实验结果显示，给纤溶酶原组(图18B)Caspase-3的表达(箭头标识)明显低于给溶媒PBS对照组(图18A)。说明纤溶酶原能够减少胰岛细胞的凋亡。
实施例19纤溶酶原促进17-18周龄糖尿病小鼠胰岛素的表达和分泌
17-18周龄db/db雄性小鼠8只，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各4只。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；之后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠胰岛素抗体(Abcam，ab63820)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜观察。
结果显示，给纤溶酶原组(图19B)胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组(图19A)，且统计差异接近显著(P＝0.15)(图19C)。说明纤溶酶原能够促进胰岛功能修复，促进胰岛素的表达和分泌。
实施例20纤溶酶原促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛素的表达和分泌
24-25周龄db/db雄性小鼠8只，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组5只和给溶媒PBS对照组3只。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；之后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠胰岛素抗体(Abcam，ab63820)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
结果显示，给纤溶酶原组(图20B)胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组(图20A)，且统计差异显著(P＝0.02)(图20C)。说明纤溶酶原能有效修复胰岛功能，促进胰岛素的表达和分泌。
实施例21纤溶酶原促进糖尿病小鼠胰岛素合成分泌功能的修复
27周龄db/db雄性小鼠9只，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只给溶媒PBS对照组5只。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第35天小鼠禁食16小时后，在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭1小时；之后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠胰岛素抗体(Abcam，ab63820)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
结果显示，给纤溶酶原组(图21B)胰岛素的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组(图21A)，且统计差异极显著(P＝0.005)(图21C)。说明纤溶酶原能有效修复糖尿病小鼠胰岛功能，提高胰岛素的表达和分泌。
实施例22纤溶酶原促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛多向核转录因子NF-κB的表达
24-25周龄db/db雄性小鼠10只，根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只和给溶媒PBS对照组6只，另取4只db/m作为正常对照组，正常对照组不做处理。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。以3％双氧水孵育15分钟，水洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭1小时；之后，弃除羊血清液，用PAP笔圈出组织。兔抗小鼠NF-κB(Cell Signaling，8242)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度脱水透明并封片，切片200倍光学显微镜下观察。
NF-κB为转录因子蛋白家族成员，在炎症修复过程中发挥着重要作用[21]。
本发明实验结果显示，给纤溶酶原组(图22C)NF-κB的表达(箭头标识)接近正常对照小鼠(图22A)，明显高于给溶媒PBS对照组(图22B)，且统计差异显著(*表示P<0.05)(图22D)。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF-κB的表达，从而促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛炎症的修复。
实施例23纤溶酶原减少17-18周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞的增殖，恢复胰岛α细胞的正常分布并降低胰高血糖素的分泌
17-18周龄db/db雄性小鼠8只以及db/m雄性小鼠3只，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各4只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天；正常对照小鼠不做给药处理。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰高血糖素抗体(Abcam,ab92517)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
胰岛α细胞合成分泌胰高血糖素，主要散在分布于胰岛周边区域。
结果显示，与给纤溶酶原组(图23C)相比，给溶媒PBS对照组(图23B)胰高血糖素阳性细胞(箭头标识)明显增多，阳性细胞浸润到胰岛的中央区域，且平均光密度定量分析结果具有统计学差异(**表示P<0.01)(图23D)；给纤溶酶原组胰高血糖素阳性细胞散在的分布于胰岛周边，给纤溶酶原组的胰岛形态比给溶媒PBS组更接近正常对照组(图23A)。说明纤溶酶原能够显著抑制17-18周龄糖尿病小鼠胰岛α细胞增殖及胰高血糖素的分泌，修正胰岛α细胞分布紊乱，提示纤溶酶原促进胰岛损伤的修复。
实施例24纤溶酶原促进17-18周龄糖尿病小鼠胰岛胰岛素受体底物2(IRS-2)的表达
17-18周龄db/db雄性小鼠7只以及db/m雄性小鼠3只，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组3只，给溶媒PBS对照组4只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天；正常对照小鼠不做给药处理。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗体(Abcam，ab134101)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
胰岛素受体底物2((Insulin Receptor Substrate-2,IRS-2)是一种能够被激活的胰岛素受体酪氨酸激酶作用的底物，是胰岛素信号转导途径中重要分子，且对胰岛β细胞的生存非常重要。IRS-2在胰岛β细胞表达增加时对其具有保护效应，且对功能性胰岛β细胞的维持至关重要[22-23]。
IRS-2免疫组化结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠(图24B)胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组(图24C)，且统计差异极显著(**表示P<0.01)(图24D)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(图24A)。说明纤溶酶原能有效增加17-18周龄糖尿病小鼠胰岛细胞IRS-2的表达。
实施例25纤溶酶原促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛IRS-2的表达
24-25周龄db/db雄性小鼠11只以及db/m雄性小鼠5只，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组5只，给溶媒PBS对照组6只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药31天；正常对照小鼠不做给药处理。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗体(Abcam，ab134101)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
IRS-2免疫组化结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠(图25B)胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组(图25C)，且统计差异显著(*表示P<0.05)(图25D)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组(图25A)。说明纤溶酶原能有效增加24-25周龄糖尿病小鼠胰岛细胞IRS-2的表达。
实施例26纤溶酶原促进27周龄糖尿病小鼠胰岛IRS-2的表达
27周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m雄性小鼠3只，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天；正常对照小鼠不做给药处理。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗体(Abcam，ab134101)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
IRS-2免疫组化结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠(图26B)胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组(图26C)；给纤溶酶原组IRS-2表达水平接近正常对照组小鼠(图26A)。说明纤溶酶原能有效增加27周龄糖尿病小鼠胰岛细胞IRS-2的表达。
实施例27纤溶酶原促进PLG+/+T1DM小鼠胰岛IRS-2的表达
9-10周龄PLG+/+雄性小鼠15只，根据体重随机分为两组，空白对照组(5只)和模型组(10只)。模型组小鼠禁食4小时后，按照200mg/kg体重单次腹腔注射STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病[19]，空白对照组单次腹腔注射0.25ml柠檬酸钠溶液(pH4.5)。STZ注射12天后用血糖仪测量血糖，模型组小鼠根据血糖随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。分组后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天；空白对照组小鼠不做给药处理。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠IRS-2抗体(Abcam，ab134101)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
IRS-2免疫组化结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠(图27B)胰岛IRS-2阳性表达(箭头标识)明显少于给纤溶酶原组(图27C)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(图27A)。说明纤溶酶原能有效增加胰岛细胞IRS-2的表达，改善胰岛素信号转导，减少PLG+/+T1DM小鼠胰岛β细胞损伤。
实施例28纤溶酶原减少24-26周龄糖尿病小鼠胰岛中性粒细胞的浸润
24-26周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m小鼠3只，db/db小鼠随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只，db/m小鼠作为正常对照组。实验开始当天记为第0天称重分组，实验第二天开始给纤溶酶原或PBS并记为第1天。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。EDTA修复30分钟，室温冷却10分钟后水轻柔冲洗。以3％双氧水孵育15分钟，PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加大鼠抗小鼠中性粒细胞抗体(cedarlane，CL8993AP)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗大鼠IgG(HRP)抗体(Abcam,ab97057)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在400倍光学显微镜下观察。
中心粒细胞是非特异性细胞免疫系统中重要成员，当炎症发生时，它们被趋化性物质吸引到炎症部位。
中心粒细胞免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图28C)阳性表达细胞少于给溶媒PBS对照组(图28B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组(图28A)。说明纤溶酶原能减少糖尿病小鼠胰岛中性粒细胞的浸润。
实施例29纤溶酶原减少PLG-/-小鼠在T1DM模型中胰岛中性粒细胞的浸润
9-10周龄PLG-/-雄性小鼠10只，根据体重随机分为两组，空白对照组(3只)和模型组(7只)。模型组小鼠禁食4小时后，按照200mg/kg体重单次腹腔注射STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病[19]，空白对照组单次腹腔注射0.25ml柠檬酸钠溶液(pH4.5)。STZ注射12天后用血糖仪测量血糖，模型组小鼠根据血糖随机分为两组，给溶媒PBS对照组(3只)和给纤溶酶原组(4只)。分组后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天；空白对照组小鼠不做给药处理。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。EDTA修复30分钟，室温冷却10分钟后水轻柔冲洗。以3％双氧水孵育15分钟，PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加大鼠抗小鼠中性粒细胞抗体(cedarlane，CL8993AP)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗大鼠IgG(HRP)抗体(Abcam,ab97057)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在400倍光学显微镜下观察。
中心粒细胞免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图29C)阳性表达细胞(箭头标识)少于给溶媒PBS对照组(图29B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(图29A)。说明纤溶酶原能减少PLG-/-小鼠在T1DM模型中胰岛中性粒细胞的浸润。
实施例30纤溶酶原减少PLG+/+小鼠在T1DM模型中胰岛中性粒细胞的浸润
9-10周龄PLG+/+雄性小鼠15只，根据体重随机分为两组，空白对照组(5只)和模型组(10只)。模型组小鼠禁食4小时后，按照200mg/kg体重单次腹腔注射STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病[19]，空白对照组单次腹腔注射0.25ml柠檬酸钠溶液(pH4.5)。STZ注射12天后用血糖仪测量血糖，模型组小鼠根据血糖随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。分组后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天；空白对照组小鼠不做给药处理。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。EDTA修复30分钟，室温冷却10分钟后水轻柔冲洗。以3％双氧水孵育15分钟，PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加大鼠抗小鼠中性粒细胞抗体(cedarlane，CL8993AP)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗大鼠IgG(HRP)抗体(Abcam,ab97057)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在400倍光学显微镜下观察。
中心粒细胞免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图30C)阳性表达细胞(箭头标识)少于给溶媒PBS对照组(图30B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(图30A)。说明纤溶酶原能减少PLG+/+小鼠在T1DM模型中胰岛中性粒细胞的浸润。
实施例31纤溶酶原促进在T1DM模型中的PLG-/-小鼠胰岛素的合成与分泌
9-10周龄PLG-/-雄性小鼠10只，根据体重随机分为两组，空白对照组(3只)和模型组(7只)。模型组小鼠禁食4小时后，按照200mg/kg体重单次腹腔注射STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病[19]，空白对照组单次腹腔注射0.25ml柠檬酸钠溶液(pH4.5)。STZ注射12天后用血糖仪测量血糖，模型组小鼠根据血糖随机分为两组，给溶媒PBS对照组(3只)和给纤溶酶原组(4只)。分组后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天；空白对照组小鼠不做给药处理。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰岛素抗体(Abcam，ab63820)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图31C)胰岛素阳性表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组(图31B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(图31A)。说明纤溶酶原能促进在T1DM模型中的PLG-/-小鼠胰岛素的合成与分泌。
实施例32纤溶酶原促进T1DM模型中PLG+/+小鼠胰岛素的合成与表达
9-10周龄PLG+/+雄性小鼠15只，根据体重随机分为两组，空白对照组(5只)和模型组(10只)。模型组小鼠禁食4小时后，按照200mg/kg体重单次腹腔注射STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病[19]，空白对照组单次腹腔注射0.25ml柠檬酸钠溶液(pH4.5)。STZ注射12天后用血糖仪测量血糖，模型组小鼠根据血糖随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各5只。分组后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天；空白对照组小鼠不做给药处理。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠胰岛素抗体(Abcam，ab63820)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
免疫组化结果显示，给纤溶酶原组(图32C)胰岛素阳性表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组(图32B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(图32A)。说明纤溶酶原促进T1DM模型中PLG+/+小鼠胰岛素的合成与表达。
实施例33纤溶酶原促进PLG-/-小鼠T1DM模型中胰岛多向核转录因子NF-κB的表达
9-10周龄PLG-/-雄性小鼠10只，根据体重随机分为两组，空白对照组(3只)和模型组(7只)。模型组小鼠禁食4小时后，按照200mg/kg体重单次腹腔注射STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病[19]，空白对照组单次腹腔注射0.25ml柠檬酸钠溶液(pH4.5)。STZ注射12天后用血糖仪测量血糖，模型组小鼠根据血糖随机分为两组，给溶媒PBS对照组(3只)和给纤溶酶原组(4只)。分组后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天；空白对照组小鼠不做给药处理。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗体(Cell Signaling，8242)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
实验结果显示，给纤溶酶原组(图33C)NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组(图33B)。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF-κB的表达，从而促进胰岛炎症的修复。
实施例34纤溶酶原促进17-18周龄糖尿病小鼠胰岛多向核转录因子NF-κB的表达
17-18周龄db/db雄性小鼠7只，小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组3只，给溶媒PBS对照组4只。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗体(Cell Signaling，8242)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
本发明实验结果显示，给纤溶酶原组(图34B)NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组(图34A)。说明纤溶酶原能促进多向核转录因子NF-κB的表达，从而促进相对年轻(17-18周龄)糖尿病小鼠胰岛炎症的修复。
实施例35纤溶酶原促进27周龄糖尿病小鼠多向核转录因子NF-κB的表达
27周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m雄性小鼠3只，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天；正常对照小鼠不做给药处理。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠NF-κB抗体(Cell Signaling，8242)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
实验结果显示，给纤溶酶原组(图35C)NF-κB的表达(箭头标识)明显高于给溶媒PBS对照组(图35B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组(图35A)。说明纤溶酶原能促进相对年老(27周龄)糖尿病小鼠多向核转录因子NF-κB的表达，从而促进其胰岛炎症的修复。
实施例36纤溶酶原促进24-25周龄糖尿病小鼠胰岛TNF-α的表达
24-25周龄db/db雄性小鼠11只以及db/m雄性小鼠5只，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组5只，给溶媒PBS对照组6只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS或不注射任何液体，连续给药31天；正常对照小鼠不做给药处理。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠TNF-α抗体(Abcam，ab34674)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)主要由活化的单核/巨噬细胞产生，是一种重要的促炎症因子[24]。
本实验研究结果显示，给纤溶酶原组(图36C)TNF-α的阳性表达明显高于给溶媒PBS对照组(图36B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组(图36A)。说明纤溶酶原能促进24-25周龄糖尿病小鼠TNF-α的表达，促进胰岛损伤的修复。
实施例37纤溶酶原促进27周龄糖尿病小鼠胰岛TNF-α的表达
27周龄db/db雄性小鼠9只以及db/m雄性小鼠3只，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组4只，给溶媒PBS对照组5只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药35天；正常对照小鼠不做给药处理。在第36天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠TNF-α抗体(Abcam，ab34674)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
研究结果显示，给纤溶酶原组(图37C)TNF-α的阳性表达明显高于给溶媒PBS对照组(图37B)，且给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近正常对照组(图37A)。说明纤溶酶原能促进27周龄糖尿病小鼠TNF-α的表达，促进胰岛损伤的修复。
实施例38纤溶酶原促进PLG-/-小鼠在T1DM模型中胰岛TNF-α的表达
9-10周龄PLG-/-雄性小鼠10只，根据体重随机分为两组，空白对照组(3只)和模型组(7只)。模型组小鼠禁食4小时后，按照200mg/kg体重单次腹腔注射STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病[19]，空白对照组单次腹腔注射0.25ml柠檬酸钠溶液(pH4.5)。STZ注射12天后用血糖仪测量血糖，模型组小鼠根据血糖随机分为两组，给溶媒PBS对照组(3只)和给纤溶酶原组(4只)。分组后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天；空白对照组小鼠不做给药处理。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠TNF-α抗体(Abcam，ab34674)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
本实验研究结果显示，给纤溶酶原组(图38B)TNF-α的阳性表达明显高于给溶媒PBS对照组(图38A)。说明纤溶酶原能促进PLG-/-小鼠在T1DM模型中胰岛TNF-α的表达，促进胰岛损伤的修复。
实施例39纤溶酶原减轻PLG-/-小鼠在T1DM模型中胰岛损伤
9-10周龄PLG-/-雄性性小鼠10只，根据体重随机分为两组，空白对照组(3只)和模型组(7只)。模型组小鼠禁食4小时后，按照200mg/kg体重单次腹腔注射STZ(sigma S0130)诱导I型糖尿病[19]，空白对照组单次腹腔注射0.25ml柠檬酸钠溶液(pH4.5)。STZ注射12天后用血糖仪测量血糖，模型组小鼠根据血糖随机分为两组，给溶媒PBS对照组3只，给纤溶酶原组4只。分组后开始给药并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天；空白对照组小鼠不做给药处理。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加山羊抗鼠IgM(HRP)抗体(Abcam,ab97230)室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
IgM抗体在清除凋亡和坏死细胞过程中发挥着重要作用，组织器官损伤局部IgM抗体的水平与损伤程度呈正相关[25-26]。因此，检测组织器官局部IgM抗体的水平能够反映该组织器官的损伤情况。
研究结果显示，给纤溶酶原组(图39C)IgM的阳性表达明显低于给溶媒PBS对照组(图39B)，给纤溶酶原组比给溶媒PBS组更接近空白对照组(图39A)。说明纤溶酶原能降低IgM的表达，提示纤溶酶原能减轻PLG-/-小鼠在T1DM模型中的胰岛损伤。
实施例40纤溶酶原减少24-25周龄糖尿病小鼠胰岛细胞的凋亡
24-25周龄db/db雄性小鼠11只以及db/m雄性小鼠5只，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组5只，给溶媒PBS对照组6只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS或不注射任何液体，连续给药31天；正常对照小鼠不做给药处理。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，室温孵育7min，0.01M PBS洗3次，每次3分钟。滴加TUNEL试剂盒(罗氏)试剂1和试剂2混合液体(5:45)，于37℃恒温孵育40min，0.01M PBS洗3次，每次3分钟。滴加甲醇配制的3％双氧水溶液(过氧化氢：甲醇＝1:9)室温避光孵育20分钟，0.01M PBS洗3次，每次3分钟。滴加tunel试剂盒试剂3，37℃恒温孵育30min，0.01M PBS洗3次，DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在400倍光学显微镜下观察。
TUNEL染色可以用来检测组织细胞在凋亡晚期过程中细胞核DNA的断裂情况。
本实验结果显示，正常对照组TUNEL阳性染色极低(图40A)。给纤溶酶原组(图40C)的阳性细胞数(箭头标识)明显少于给溶媒PBS对照组(图40B)。正常对照组凋亡率约为8％，给溶媒PBS组凋亡率约为93％，给纤溶酶原组凋亡率约为16％。说明纤溶酶原组能显著减少糖尿病小鼠胰岛细胞的凋亡。
实施例41纤溶酶原改善T1DM模型小鼠胰岛素分泌
9-10周龄C57雄性小鼠13只，小鼠禁食4小时后按照200mg/kg体重单次腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(sigma，S0130)诱导T1DM[19]。STZ注射12天后测量血糖，并根据血糖随机分为两组，给溶媒PBS对照组(6只)和给纤溶酶原组(7只)。分组后开始给药，并定为给药第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。连续给药20天，在第21天小鼠禁食6小时后，眼球静脉丛取血，离心取上清，运用胰岛素检测试剂盒(Mercodia AB)，按照使用说明检测血清胰岛素浓度。
结果显示，给溶媒PBS对照组小鼠胰岛素浓度明显低于给纤溶酶原组小鼠，且统计差异接近显著(P＝0.08)(图41)。说明纤溶酶原能促进T1DM小鼠胰岛素的分泌。
实施例42纤溶酶原促进24-25周龄糖尿病小鼠胰腺GLP-1R的表达
24-25周龄db/db雄性小鼠11只以及db/m雄性小鼠5只，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组5只，给溶媒PBS对照组6只，db/m小鼠作为正常对照组。开始给药定为第1天，并开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS或不注射任何液体，连续给药31天；正常对照小鼠不做给药处理。在第32天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗体(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
胰高血糖素样肽1受体(glucagon-like peptide 1receptor，GLP-1R)是胰高血糖素受体家族成员之一，是一种G蛋白偶联受体，能通过促进胰岛素的分泌调节血糖水平[27-28]。
结果显示，给溶媒PBS对照组(图42B)小鼠胰岛GLP-1R表达(箭头标识)明显少于正常对照小鼠(图42A)，给纤溶酶原组(图42C)小鼠胰岛GLP-1R的表达虽然也少于正常对照组，但明显多于给溶媒PBS对照组，且统计差异极为显著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)(图42D)。实验结果表明纤溶酶原能够促进糖尿病小鼠胰岛GLP-1R的表达。
实施例43纤溶酶原促进高脂血症模型小鼠胰腺GLP-1R的表达
9周龄雄性C57小鼠17只，饲喂3％胆固醇高脂饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司)4周，诱导高脂血症[29-30]，此模型定为3％胆固醇高脂血症模型，成模后的小鼠继续饲喂3％胆固醇高脂饲料。另取相同周龄的雄性野生型小鼠5只作为空白对照组，实验期间饲喂普通维持饲料。在给药前三天每只小鼠取血50μL，检测总胆固醇，小鼠根据总胆固醇浓度和体重随机分为两组，给纤溶酶原组(9只)和给溶媒PBS对照组(8只)。开始给药记为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药30天；空白对照组小鼠不做给药处理。于第31天处死小鼠，取材胰腺于4％多聚甲醛固定24-48小时。固定后的组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗体(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
结果显示，给溶媒PBS对照组(图43B)小鼠胰岛GLP-1R表达(箭头标识)明显少于正常对照小鼠(图43A)，给纤溶酶原组(图43C)小鼠胰岛GLP-1R的表达虽然也少于空白对照组，但明显多于给溶媒PBS对照组，且统计差异极为显著(**表示P<0.01)(图43D)。实验结果表明纤溶酶原能够促进高脂血症模型小鼠胰岛GLP-1R的表达。
实施例44纤溶酶原促进14-15周龄糖尿病小鼠胰腺GLP-1R的表达
14-15周龄db/db雄性小鼠12只，实验开始当天记为第0天并称重，db/db小鼠根据体重随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各6只。第1天开始给纤溶酶原或PBS，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原2mg/0.2ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药28天。在第29天处死小鼠，取胰脏在4％多聚甲醛中固定。固定后的胰脏组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗体(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
结果显示，给溶媒PBS对照组(图44A)小鼠胰岛GLP-1R的表达明显少于给纤溶酶原组(图44B)，且统计差异接近显著(图44C)(P＝0.09)。结果表明，纤溶酶原能够促进相对年轻(14-15周龄)糖尿病小鼠胰岛GLP-1R的表达。
实施例45纤溶酶原促进动脉粥样硬化模型小鼠肝脏GLP-1R的表达
6周龄18-22g的雄性APOE小鼠19只，高脂模型饲料(TP2031,南通特洛菲饲料科技有限公司)饲喂16周，建立动脉粥样硬化模型[31-32]。在给药前三天称量所有小鼠称重并眼球静脉丛取血50μL，测定血浆TC、HDL，计算动脉粥样硬化指数。随机取一只小鼠，剩余小鼠根据动脉粥样硬化指数随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组各9只。分组后开始给药，并记为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药30天。于第31天处死小鼠，取材肝脏于4％多聚甲醛固定24-48小时。固定后的组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗体(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
结果显示，给纤溶酶原组(图45B)小鼠肝脏GLP-1R的表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组(图45A)，且统计差异极为显著(图45C)(***表示P<0.001)。该结果表明，纤溶酶原能够促进动脉粥样硬化模型小鼠肝脏GLP-1R的表达，有可能促进肝脏脂肪合成、分泌、吸收或氧化，减少血中脂类水平，改善高脂血症。
实施例46纤溶酶原促进高脂血症模型小鼠肝脏GLP-1R的表达
9周龄雄性C57小鼠17只，饲喂3％胆固醇高脂饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司)4周，诱导高脂血症[29-30]，此模型定为3％胆固醇高脂血症模型，成模后的小鼠继续饲喂3％胆固醇高脂饲料。在给药前三天每只小鼠取血50μL，检测总胆固醇，小鼠根据总胆固醇浓度和体重随机分为两组，给纤溶酶原组(9只)和给溶媒PBS对照组(8只)。分组后开始给药，并记为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，连续给药30天。于第31天处死小鼠，取材肝脏于4％多聚甲醛固定24-48小时。固定后的组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗体(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
结果显示，给纤溶酶原组(图46B)小鼠肝脏GLP-1R的表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组(图46A)，且统计差异接近显著(P＝0.09)(图46C)。该结果表明，纤溶酶原能够促进高脂血症模型小鼠肝脏GLP-1R的表达，有可能促进肝脏脂肪合成、分泌、吸收或氧化，减少血中脂类水平，改善高脂血症。
实施例47纤溶酶原促进帕金森模型小鼠黑质GLP-1R的表达
取9周龄C57雄性小鼠12只，造模前提前一天称重，小鼠按照30mg/kg体重每天腹腔注射5mg/ml MPTP溶液，连续注射5天，建立帕金森模型[33-34]。MPTP溶液配制：用注射器吸取10ml去离子水，加入到100mg MPTP粉末(sigma，M0896)中，配制成10mg/ml的母液，然后吸取1ml母液于安瓶中，再加入1ml去离子水，最终浓度为5mg/ml。造模完成后小鼠随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各6只小鼠，并开始给药，记为第1天，给纤溶酶原组小鼠按照1mg/0.1ml/只/天尾静脉注射纤溶酶原溶液，给溶媒PBS对照组尾静脉给予相同体积PBS，持续给药14天。第15天，小鼠处死后，快速取出大脑于4％多聚甲醛固定24-48小时。固定后的脑组织组织经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。定位切片黑质，切片厚度为4μm，切片脱蜡复水后水洗1次。PAP笔圈出组织，以3％双氧水孵育15分钟，0.01MPBS洗2次，每次5分钟。5％的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封闭30分钟；时间到后，弃除羊血清液，滴加兔抗小鼠GLP-1R抗体(NOVUS,NBP1-97308)4℃孵育过夜，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，0.01M PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories,Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水冲洗5分钟。梯度酒精脱水，二甲苯透明并中性树胶封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
帕金森氏病的特点是黑质纹状体神经元多巴胺能信号缺失，而黑质纹状体也表达GLP-1R[35]。
结果显示，给纤溶酶原组(图47B)小鼠黑质GLP-1R的表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组(图47A)，且统计差异显著(图47C)(*表示P<0.05)。该结果表明，纤溶酶原能够促进帕金森模型小鼠黑质GLP-1R的表达。
实施例48纤溶酶原对肥胖小鼠体重和脂肪含量的影响
小鼠模型和分组
取8周龄的C57雄性小鼠14只，根据体重随机分为两组，空白对照组4只和模型组10只。空白对照组小鼠饲喂正常的维持饲料；模型组小鼠饲喂脂肪热量45％高脂饲料造模(TP23000，南通特洛菲饲料科技有限公司)12周，建立肥胖模型[36]。此文中脂肪热量45％高脂饲料简称为高热量饲料。12周后，模型组小鼠称重，根据体重再次随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各5只。人源纤溶酶原溶于PBS中。给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1mL/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，空白对照组不进行任何处理。上述实验动物连续给药28天(开始给药定为第1天)，第29天进行如下处理和检测。
检测和结果
体重检测
上述实验动物在第1和29天称量体重，计算体重的改变。结果展示为第29天体重减去第1天体重的数值。
结果显示，空白对照组体重改变并不明显，给纤溶酶原组体重明显下降，与给溶媒PBS对照组相比，统计差异显著(*为P<0.05)(图48)。说明纤溶酶原能够促进肥胖模型小鼠体重的降低。
体重指数测定
在第29天对上述小鼠称量体重后，测量小鼠体长，计算体重指数。体重指数＝体重(kg)/体长2(m)。
体重指数是目前国际上常用的衡量人体胖瘦程度以及是否健康的一个标准。体重指数同样可作为肥胖模型动物胖瘦程度的指标[37-38]。结果显示，给纤溶酶原组小鼠体重指数明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*表示P<0.05，**表示P<0.01)，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组小鼠的体重指数更加接近空白对照组(图49)。说明纤溶酶原能够显著降低肥胖模型小鼠的体重指数，减轻肥胖。
Lee’s指数测定
上述小鼠在第29天称量体重后，测量小鼠体长，计算Lee's指数。
Lee's指数是反应肥胖程度的有效指数[39-40]。结果显示，给纤溶酶原组小鼠Lee's指数明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*为P<0.05)，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组小鼠的Lee's指数更加接近空白对照组(图50)。说明纤溶酶原能够显著降低肥胖模型小鼠的Lee's指数，减轻肥胖。
腹腔脂肪量检测
上述小鼠在第29天称量体重后，处死取材腹腔脂肪称重。腹腔脂肪系数(％)＝(腹腔脂肪重量/体重)*100。
结果显示，给纤溶酶原组小鼠腹腔脂肪系数明显低于给溶媒PBS对照组，且统计差异显著(*为P<0.05)，并且接近空白对照组小鼠脂肪系数(图51)。说明纤溶酶原能够显著降低肥胖模型小鼠腹腔脂肪的沉积。
腹腔皮下脂肪空泡的面积检测
在第29天处死上述小鼠，取材其腹腔脂肪于4％多聚甲醛固定24-48小时。固定后的组织样本经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。组织切片厚度为4μm，切片脱蜡复水并用苏木素和伊红染色(HE染色)，1％盐酸酒精分化，氨水返蓝，并酒精梯度脱水封片，切片在200倍光学显微镜下观察。运用Image-pro plus图像处理软件，分析脂肪空泡的面积。
肥胖机体能量摄入超过能量消耗时，大量的脂质蓄积在脂肪细胞中，导致脂肪脂肪组织扩张即脂肪细胞增大，脂肪空泡面积增大[41]。
结果显示，给纤溶酶原组(图52C)脂肪空泡的面积明显小于给溶媒PBS对照组(图52B)，统计差异极为显著(**表示P<0.01)(图52D)，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组脂肪空泡面积更加接近空白对照小鼠(图52A)。说明纤溶酶原能够显著减少肥胖模型小鼠脂肪细胞的大小，减少腹腔脂肪沉积。
实施例49纤溶酶原减少脂质在肝脏中的沉积研究一
24-25周龄雄性db/db小鼠10只，随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组各5只。实验开始当天记为第0天并称重分组，第1天开始给纤溶酶原或PBS。给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2ml/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组尾静脉注射给予相同体积的PBS，连续给药35天。在第36天处死小鼠取肝脏组织于4％多聚甲醛固定24-48小时，分别于15％、30％蔗糖中4℃过夜沉底，OCT包埋，冰冻切片厚度8μm，油红O染色15分钟，75％酒精分化5秒，苏木素染核30秒，甘油明胶封片。切片在200倍光学显微镜下观察。
油红O染色可显示脂质沉积，反映脂质沉积的程度[42]。
染色结果显示，给纤溶酶原组(图53B)小鼠肝脏的脂质沉积面积显著小于给溶媒PBS对照组(图53A)，且统计差异显著(P＝0.02)(图53C)。说明纤溶酶原能减少脂肪在糖尿病小鼠肝脏中的沉积。
实施例50纤溶酶原减少脂质在肝脏中的沉积研究二
6周龄雄性ApoE小鼠13只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲，TP2031)16周以诱导动脉粥样硬化模型[31-32]。成模后的小鼠继续饲喂高脂高胆固醇饲料。在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组7只，给纤溶酶原组6只。开始给药记为第1天，给纤溶酶原组小鼠尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS，给药30天。给药期间小鼠继续饲喂模型饲料。于第31天处死小鼠，取材肝脏组织于4％多聚甲醛固定24-48小时，分别于15％、30％蔗糖中4℃过夜沉底，OCT包埋，冰冻切片厚度8μm，油红O染色15分钟，75％酒精分化5秒，苏木素染核30秒，甘油明胶封片。切片在200倍光学显微镜下观察。
染色结果显示，给纤溶酶原组(图54B)小鼠肝脏脂肪沉积明显少于给溶媒PBS对照组(图54A)，且定量分析统计差异显著(P＝0.02)(图54C)。说明纤溶酶原能减少脂肪在动脉粥样硬化模型小鼠肝脏中的沉积。
实施例51纤溶酶原减少脂质在肝脏中的沉积研究三
6周龄雄性C57小鼠11只饲喂高脂高胆固醇饲料(南通特洛菲，货号TP2031)16周以诱导高脂血症模型[29-30]，此模型定为16周高脂血症模型。成模后的小鼠继续饲喂高胆固醇饲料。在给药前三天每只取血50μl以检测总胆固醇(T-CHO)含量，并根据T-CHO含量随机分为两组，给溶媒PBS对照组6只，给纤溶酶原组5只。开始给药记为第1天，给纤溶酶原组尾静脉注射人源纤溶酶原1mg/0.1ml/只/天，给溶媒PBS对照组尾静脉注射同体积的PBS。。给药期间小鼠继续饲喂模型饲料。给药30天，并于第31天处死小鼠，取肝脏于4％多聚甲醛固定24-48小时，分别于15％、30％蔗糖中4℃过夜沉底，OCT包埋，冰冻切片厚度8μm，油红O染色15分钟，75％酒精分化5秒，苏木素染核30秒，甘油明胶封片。切片在200倍光学显微镜下观察。
结果显示，给纤溶酶原组(图55B)小鼠肝脏脂肪沉积明显少于给溶媒PBS对照组(图55A)，且定量分析统计差异显著(*表示P<0.05)(图55C)。说明纤溶酶原能消减脂肪在高脂血症模型小鼠肝脏中的沉积。
实施例52纤溶酶原促进cuprizone诱导脱髓鞘模型小鼠胼胝体髓鞘再生
取8周龄C57雄性小鼠20只，随机分为2组，空白对照组6只，模型组14只。空白对照组小鼠饲喂正常维持饲料，模型组小鼠饲喂0.2％cuprizone模型饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司)，饲喂6周，诱导小鼠髓鞘脱落模型[43]。6周后模型组小鼠根据体重再次随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各7只。给纤溶酶原组小鼠按照1mg/0.1ml/只/天尾静脉注射给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组以相同方式给予相同体积的PBS，空白对照组小鼠不做注射处理，连续给药14天。给药期间所有小鼠饲喂正常维持饲料。开始给药定为第1天，第15天解剖小鼠取脑于4％多聚甲醛固定，脱水包埋。固定后的组织样本经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。脑组织冠状切片厚度为3μm，脱蜡至水后，用髓鞘染色液进行LFB染色。梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在光学显微镜下，观察拍照。
LFB(luxol fast blue)染色运用固蓝染色法染髓鞘，是研究皮质脊髓束定位、髓鞘病变、损伤和再生修复形态学观察的有效方法[44-45]。
结果显示，空白对照组(图56A)胼胝体髓鞘形态基本正常，给纤溶酶原组(图56C)胼胝体髓鞘阳性着色(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组(图56B)，且统计差异显著(图56D)(*为P<0.05)。说明纤溶酶原能够促进cuprizone诱导脱髓鞘模型小鼠胼胝体髓鞘的再生。
实施例53纤溶酶原促进受损神经中神经丝蛋白的表达
取8周龄C57雄性小鼠20只，随机分为2组，空白对照组6只，模型组14只。空白对照组小鼠饲喂正常维持饲料，模型组小鼠饲喂0.2％cuprizone模型饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司)，饲喂6周，诱导小鼠髓鞘脱落模型[43]。6周后模型组小鼠根据体重再次随机分为两组，给纤溶酶原组和给溶媒PBS对照组，每组各7只。给纤溶酶原组小鼠按照1mg/0.1ml/只/天尾静脉注射给予纤溶酶原，给溶媒PBS对照组以相同方式给予相同体积的PBS，空白对照组小鼠不做注射处理，连续给药14天。给药期间所有小鼠饲喂正常维持饲料。开始给药定为第1天，第15天解剖小鼠取脑于4％多聚甲醛固定，脱水包埋。固定后的组织样本经酒精梯度脱水和二甲苯透明后进行石蜡包埋。脑组织冠状切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。柠檬酸修复30分钟，室温冷却10分钟后水轻柔冲洗。以3％双氧水孵育15分钟，用PAP笔圈出组织。10％的羊血清(Vector laboratories，Inc.,USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液。兔源抗NFP抗体(Abcam，ab207176)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vectorlaboratories，Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水返蓝5分钟，然后PBS洗1次。梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
神经丝蛋白(Neurofilament protein,NFP)是构成神经细胞轴突中间丝的蛋白质。其功能是提供弹性使神经纤维易于伸展和防止断裂，在维持细胞骨架、稳定细胞形态和轴突转运方面均有十分重要意义[46]。
结果显示，给纤溶酶原组(图57C)小鼠胼胝体NFP的表达(箭头标识)明显多于给溶媒PBS对照组(图57B)，统计差异显著(*为P<0.05)(图57D)，且与给溶媒PBS对照组相比给纤溶酶原组胼胝体NFP的表达更加接近空白对照组(图57A)。说明纤溶酶原能够促进NFP的表达，从而促进神经纤维再生。
实施例54纤溶酶原促进皮肤神经再生
取雌性db/db小鼠30只，实验前测未禁食血糖(血糖大于等于15mM)并称量体重，小鼠分别按照血糖和体重随机分为两组，给溶媒PBS对照组和给纤溶酶原组，每组各15只。所有小鼠按照50mg/kg体重腹腔注射戊巴比妥钠，麻醉小鼠。小鼠麻醉后，在背部脱去一部分毛发。铜块在沸水中加热至95-100℃，取出后立即垂直轻触于小鼠脱毛部位6秒钟，接触时不要有额外压力，建立皮肤烧伤模型[47]。建立模型5min后开始给药，给纤溶酶原组小鼠按2mg/0.2mL/只/天尾静脉注射纤溶酶原，给溶媒PBS对照组尾静脉给予相同体积的PBS。开始给药定为第1天，第4、8天两组小鼠各取5只，处死后取材烧伤皮肤。第15天处死剩余小鼠，取材烧伤皮肤。皮肤于4％多聚甲醛固定24-48小时，进行石蜡包埋。切片厚度为3μm，切片脱蜡复水后水洗1次。柠檬酸修复30分钟，室温冷却10分钟后水轻柔冲洗。以3％双氧水孵育15分钟，用PAP笔圈出组织。10％的羊血清(Vector laboratories，Inc.,USA)封闭1小时；时间到后，弃除羊血清液。兔源抗PGP9.5抗体(Abcam，ab10404)4℃孵育过夜，PBS洗2次，每次5分钟。山羊抗兔IgG(HRP)抗体(Abcam)二抗室温孵育1小时，PBS洗2次，每次5分钟。按DAB试剂盒(Vector laboratories，Inc.,USA)显色，水洗3次后苏木素复染30秒，流水返蓝5分钟，然后PBS洗1次。梯度脱水透明并封片，切片在200倍光学显微镜下观察。
蛋白基因产物9.5(Protein gene product 9.5,PGP 9.5)，是一种神经纤维中的特异性泛素羟基水解酶，作为一种神经轴突标记物，抗PGP9.5抗体可以与任何无髓鞘或有髓鞘的神经纤维相结合[48-49]。
结果显示，给纤溶酶原组小鼠烧伤皮肤PGP9.5阳性表达高于给溶媒PBS对照组，且在给药第8天两组小鼠PGP9.5的表达接近差异显著，在给药第15天两组差异显著(*表示P<0.05)(图58)。说明纤溶酶原能够促进糖尿病烧伤皮肤神经再生。A为PGP9.5染色代表性图片，a-c分别为给溶媒PBS对照组第4、8、15天代表性图片，d-f为给纤溶酶原组第4、8、15天代表性图片；B为给药第4天和第8天免疫染色定量分析结果；C为给药第15天定量分析结果。
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<170> SIPOSequenceListing 1.0
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<211> 2376
<212> DNA
<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原核酸序列)
<400> 1
gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60
cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120
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gatgaaaact actgccgcaa tcctgacgga aaaagggccc catggtgcca tacaaccaac 960
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ggtgatggac agagctaccg aggcacatcc tccaccacca ccacaggaaa gaagtgtcag 1140
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agtgttgtag cacctccgcc tgttgtcctg cttccagatg tagagactcc ttccgaagaa 1380
gactgtatgt ttgggaatgg gaaaggatac cgaggcaaga gggcgaccac tgttactggg 1440
acgccatgcc aggactgggc tgcccaggag ccccatagac acagcatttt cactccagag 1500
acaaatccac gggcgggtct ggaaaaaaat tactgccgta accctgatgg tgatgtaggt 1560
ggtccctggt gctacacgac aaatccaaga aaactttacg actactgtga tgtccctcag 1620
tgtgcggccc cttcatttga ttgtgggaag cctcaagtgg agccgaagaa atgtcctgga 1680
agggttgtag gggggtgtgt ggcccaccca cattcctggc cctggcaagt cagtcttaga 1740
acaaggtttg gaatgcactt ctgtggaggc accttgatat ccccagagtg ggtgttgact 1800
gctgcccact gcttggagaa gtccccaagg ccttcatcct acaaggtcat cctgggtgca 1860
caccaagaag tgaatctcga accgcatgtt caggaaatag aagtgtctag gctgttcttg 1920
gagcccacac gaaaagatat tgccttgcta aagctaagca gtcctgccgt catcactgac 1980
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ttcatcactg gctggggaga aacccaaggt acttttggag ctggccttct caaggaagcc 2100
cagctccctg tgattgagaa taaagtgtgc aatcgctatg agtttctgaa tggaagagtc 2160
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gttacttgga ttgagggagt gatgagaaat aattaa 2376
<210> 2
<211> 791
<212> PRT
<213> 不含有信号肽的天然纤溶酶原(Glu-PLG，Glu-纤维蛋白溶酶原氨基酸序列)
<400> 2
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50 55 60
Ile Ile Ile Ala Met Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Leu Val Thr
65 70 75 80
Leu Ser Gly Cys Leu Thr Gly Ala Gly Leu Ala Thr Ala Gly Thr Met
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Gly Cys Gly Gly Gly Cys Met His Cys Ser Gly Gly Ala Thr Ala Gly
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180 185 190
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195 200 205
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Thr Cys Pro Thr Thr Ala Pro Ala Leu Ala Thr Gly Leu Cys Ala Ile
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Pro Ala Cys Thr Thr Pro Pro Pro Ser Ser Gly Pro Thr Thr Gly Cys
245 250 255
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275 280 285
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Cys Ala Ala Pro Ala Gly Leu Ala Ala Pro Thr Cys His Thr Thr Ala
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Ser Gly Val Ala Thr Gly Thr Cys Leu Ile Pro Ser Cys Ala Ser Ser
325 330 335
Pro Val Ser Thr Gly Gly Leu Ala Pro Thr Ala Pro Pro Gly Leu Thr
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Pro Val Val Gly Ala Cys Thr His Gly Ala Gly Gly Ser Thr Ala Gly
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370 375 380
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Val Val Ala Ala Ala Thr Gly Cys Pro Ile Thr Gly Thr Gly Gly Thr
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<212> DNA
<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原(来源于swiss prot的核酸序列)
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<211> 810
<212> PRT
<213> 含有信号肽的天然纤溶酶原(来源于swiss prot的氨基酸序列)
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Ala Ile Leu Gly Cys Gly Gly Gly Cys Met His Cys Ser Gly Gly Ala
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275 280 285
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Leu Gly Pro Thr Cys Pro Thr Thr Ala Pro Ser Val Ala Thr Gly Thr
340 345 350
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355 360 365
Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Ala Val Gly Thr Pro Ser Gly Gly Ala
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645 650 655
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660 665 670
Leu Ala Leu Thr Ile Leu Gly Gly Val Thr Ser Thr Gly Leu Gly Cys
675 680 685
Ala Ala Pro Ala Leu Pro Gly Val Thr Val Ala Val Ser Ala Pro Val
690 695 700
Thr Thr Ile Gly Gly Val Met Ala Ala Ala
705 710
<210> 7
<211> 1245
<212> DNA
<213> delta-plg(delta-纤溶酶原核酸序列)
<400> 7
gagcctctgg atgactatgt gaatacccag ggggcttcac tgttcagtgt cactaagaag 60
cagctgggag caggaagtat agaagaatgt gcagcaaaat gtgaggagga cgaagaattc 120
acctgcaggg cattccaata tcacagtaaa gagcaacaat gtgtgataat ggctgaaaac 180
aggaagtcct ccataatcat taggatgaga gatgtagttt tatttgaaaa gaaagtgtat 240
ctctcagagt gcaagactgg gaatggaaag aactacagag ggacgatgtc caaaacaaaa 300
aatggcatca cctgtcaaaa atggagttcc acttctcccc acagacctag attctcacct 360
gctacacacc cctcagaggg actggaggag aactactgca ggaatccaga caacgatccg 420
caggggccct ggtgctatac tactgatcca gaaaagagat atgactactg cgacattctt 480
gagtgtgaag aggcggcccc ttcatttgat tgtgggaagc ctcaagtgga gccgaagaaa 540
tgtcctggaa gggttgtagg ggggtgtgtg gcccacccac attcctggcc ctggcaagtc 600
agtcttagaa caaggtttgg aatgcacttc tgtggaggca ccttgatatc cccagagtgg 660
gtgttgactg ctgcccactg cttggagaag tccccaaggc cttcatccta caaggtcatc 720
ctgggtgcac accaagaagt gaatctcgaa ccgcatgttc aggaaataga agtgtctagg 780
ctgttcttgg agcccacacg aaaagatatt gccttgctaa agctaagcag tcctgccgtc 840
atcactgaca aagtaatccc agcttgtctg ccatccccaa attatgtggt cgctgaccgg 900
accgaatgtt tcatcactgg ctggggagaa acccaaggta cttttggagc tggccttctc 960
aaggaagccc agctccctgt gattgagaat aaagtgtgca atcgctatga gtttctgaat 1020
ggaagagtcc aatccaccga actctgtgct gggcatttgg ccggaggcac tgacagttgc 1080
cagggtgaca gtggaggtcc tctggtttgc ttcgagaagg acaaatacat tttacaagga 1140
gtcacttctt ggggtcttgg ctgtgcacgc cccaataagc ctggtgtcta tgttcgtgtt 1200
tcaaggtttg ttacttggat tgagggagtg atgagaaata attaa 1245
<210> 8
<211> 414
<212> PRT
<213> delta-plg(delta-纤溶酶原氨基酸序列)
<400> 8
Gly Pro Leu Ala Ala Thr Val Ala Thr Gly Gly Ala Ser Leu Pro Ser
1 5 10 15
Val Thr Leu Leu Gly Leu Gly Ala Gly Ser Ile Gly Gly Cys Ala Ala
20 25 30
Leu Cys Gly Gly Ala Gly Gly Pro Thr Cys Ala Ala Pro Gly Thr His
35 40 45
Ser Leu Gly Gly Gly Cys Val Ile Met Ala Gly Ala Ala Leu Ser Ser
50 55 60
Ile Ile Ile Ala Met Ala Ala Val Val Leu Pro Gly Leu Leu Val Thr
65 70 75 80
Leu Ser Gly Cys Leu Thr Gly Ala Gly Leu Ala Thr Ala Gly Thr Met
85 90 95
Ser Leu Thr Leu Ala Gly Ile Thr Cys Gly Leu Thr Ser Ser Thr Ser
100 105 110
Pro His Ala Pro Ala Pro Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Gly Gly Leu
115 120 125
Gly Gly Ala Thr Cys Ala Ala Pro Ala Ala Ala Pro Gly Gly Pro Thr
130 135 140
Cys Thr Thr Thr Ala Pro Gly Leu Ala Thr Ala Thr Cys Ala Ile Leu
145 150 155 160
Gly Cys Gly Gly Ala Ala Pro Ser Pro Ala Cys Gly Leu Pro Gly Val
165 170 175
Gly Pro Leu Leu Cys Pro Gly Ala Val Val Gly Gly Cys Val Ala His
180 185 190
Pro His Ser Thr Pro Thr Gly Val Ser Leu Ala Thr Ala Pro Gly Met
195 200 205
His Pro Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Gly Thr Val Leu Thr Ala
210 215 220
Ala His Cys Leu Gly Leu Ser Pro Ala Pro Ser Ser Thr Leu Val Ile
225 230 235 240
Leu Gly Ala His Gly Gly Val Ala Leu Gly Pro His Val Gly Gly Ile
245 250 255
Gly Val Ser Ala Leu Pro Leu Gly Pro Thr Ala Leu Ala Ile Ala Leu
260 265 270
Leu Leu Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Ala Leu Val Ile Pro Ala
275 280 285
Cys Leu Pro Ser Pro Ala Thr Val Val Ala Ala Ala Thr Gly Cys Pro
290 295 300
Ile Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Pro Gly Ala Gly Leu Leu
305 310 315 320
Leu Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Gly Ala Leu Val Cys Ala Ala Thr
325 330 335
Gly Pro Leu Ala Gly Ala Val Gly Ser Thr Gly Leu Cys Ala Gly His
340 345 350
Leu Ala Gly Gly Thr Ala Ser Cys Gly Gly Ala Ser Gly Gly Pro Leu
355 360 365
Val Cys Pro Gly Leu Ala Leu Thr Ile Leu Gly Gly Val Thr Ser Thr
370 375 380
Gly Leu Gly Cys Ala Ala Pro Ala Leu Pro Gly Val Thr Val Ala Val
385 390 395 400
Ser Ala Pro Val Thr Thr Ile Gly Gly Val Met Ala Ala Ala
405 410
<210> 9
<211> 1104
<212> DNA
<213> Mini-plg (小纤维蛋白溶酶原 核酸序列)
<400> 9
gtcaggtggg agtactgcaa cctgaaaaaa tgctcaggaa cagaagcgag tgttgtagca 60
cctccgcctg ttgtcctgct tccagatgta gagactcctt ccgaagaaga ctgtatgttt 120
gggaatggga aaggataccg aggcaagagg gcgaccactg ttactgggac gccatgccag 180
gactgggctg cccaggagcc ccatagacac agcattttca ctccagagac aaatccacgg 240
gcgggtctgg aaaaaaatta ctgccgtaac cctgatggtg atgtaggtgg tccctggtgc 300
tacacgacaa atccaagaaa actttacgac tactgtgatg tccctcagtg tgcggcccct 360
tcatttgatt gtgggaagcc tcaagtggag ccgaagaaat gtcctggaag ggttgtaggg 420
gggtgtgtgg cccacccaca ttcctggccc tggcaagtca gtcttagaac aaggtttgga 480
atgcacttct gtggaggcac cttgatatcc ccagagtggg tgttgactgc tgcccactgc 540
ttggagaagt ccccaaggcc ttcatcctac aaggtcatcc tgggtgcaca ccaagaagtg 600
aatctcgaac cgcatgttca ggaaatagaa gtgtctaggc tgttcttgga gcccacacga 660
aaagatattg ccttgctaaa gctaagcagt cctgccgtca tcactgacaa agtaatccca 720
gcttgtctgc catccccaaa ttatgtggtc gctgaccgga ccgaatgttt catcactggc 780
tggggagaaa cccaaggtac ttttggagct ggccttctca aggaagccca gctccctgtg 840
attgagaata aagtgtgcaa tcgctatgag tttctgaatg gaagagtcca atccaccgaa 900
ctctgtgctg ggcatttggc cggaggcact gacagttgcc agggtgacag tggaggtcct 960
ctggtttgct tcgagaagga caaatacatt ttacaaggag tcacttcttg gggtcttggc 1020
tgtgcacgcc ccaataagcc tggtgtctat gttcgtgttt caaggtttgt tacttggatt 1080
gagggagtga tgagaaataa ttaa 1104
<210> 10
<211> 367
<212> PRT
<213> Mini-plg(小纤维蛋白溶酶原氨基酸序列)
<400> 10
Val Ala Thr Gly Thr Cys Ala Leu Leu Leu Cys Ser Gly Thr Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Val Ala Pro Pro Pro Val Val Leu Leu Pro Ala Val Gly Thr
20 25 30
Pro Ser Gly Gly Ala Cys Met Pro Gly Ala Gly Leu Gly Thr Ala Gly
35 40 45
Leu Ala Ala Thr Thr Val Thr Gly Thr Pro Cys Gly Ala Thr Ala Ala
50 55 60
Gly Gly Pro His Ala His Ser Ile Pro Thr Pro Gly Thr Ala Pro Ala
65 70 75 80
Ala Gly Leu Gly Leu Ala Thr Cys Ala Ala Pro Ala Gly Ala Val Gly
85 90 95
Gly Pro Thr Cys Thr Thr Thr Ala Pro Ala Leu Leu Thr Ala Thr Cys
100 105 110
Ala Val Pro Gly Cys Ala Ala Pro Ser Pro Ala Cys Gly Leu Pro Gly
115 120 125
Val Gly Pro Leu Leu Cys Pro Gly Ala Val Val Gly Gly Cys Val Ala
130 135 140
His Pro His Ser Thr Pro Thr Gly Val Ser Leu Ala Thr Ala Pro Gly
145 150 155 160
Met His Pro Cys Gly Gly Thr Leu Ile Ser Pro Gly Thr Val Leu Thr
165 170 175
Ala Ala His Cys Leu Gly Leu Ser Pro Ala Pro Ser Ser Thr Leu Val
180 185 190
Ile Leu Gly Ala His Gly Gly Val Ala Leu Gly Pro His Val Gly Gly
195 200 205
Ile Gly Val Ser Ala Leu Pro Leu Gly Pro Thr Ala Leu Ala Ile Ala
210 215 220
Leu Leu Leu Leu Ser Ser Pro Ala Val Ile Thr Ala Leu Val Ile Pro
225 230 235 240
Ala Cys Leu Pro Ser Pro Ala Thr Val Val Ala Ala Ala Thr Gly Cys
245 250 255
Pro Ile Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gly Gly Thr Pro Gly Ala Gly Leu
260 265 270
Leu Leu Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile Gly Ala Leu Val Cys Ala Ala
275 280 285
Thr Gly Pro Leu Ala Gly Ala Val Gly Ser Thr Gly Leu Cys Ala Gly
290 295 300
His Leu Ala Gly Gly Thr Ala Ser Cys Gly Gly Ala Ser Gly Gly Pro
305 310 315 320
Leu Val Cys Pro Gly Leu Ala Leu Thr Ile Leu Gly Gly Val Thr Ser
325 330 335
Thr Gly Leu Gly Cys Ala Ala Pro Ala Leu Pro Gly Val Thr Val Ala
340 345 350
Val Ser Ala Pro Val Thr Thr Ile Gly Gly Val Met Ala Ala Ala
355 360 365
<210> 11
<211> 750
<212> DNA
<213> Micro-plg(微纤维蛋白溶酶原核酸序列)
<400> 11
gccccttcat ttgattgtgg gaagcctcaa gtggagccga agaaatgtcc tggaagggtt 60
gtaggggggt gtgtggccca cccacattcc tggccctggc aagtcagtct tagaacaagg 120
tttggaatgc acttctgtgg aggcaccttg atatccccag agtgggtgtt gactgctgcc 180
cactgcttgg agaagtcccc aaggccttca tcctacaagg tcatcctggg tgcacaccaa 240
gaagtgaatc tcgaaccgca tgttcaggaa atagaagtgt ctaggctgtt cttggagccc 300
acacgaaaag atattgcctt gctaaagcta agcagtcctg ccgtcatcac tgacaaagta 360
atcccagctt gtctgccatc cccaaattat gtggtcgctg accggaccga atgtttcatc 420
actggctggg gagaaaccca aggtactttt ggagctggcc ttctcaagga agcccagctc 480
cctgtgattg agaataaagt gtgcaatcgc tatgagtttc tgaatggaag agtccaatcc 540
accgaactct gtgctgggca tttggccgga ggcactgaca gttgccaggg tgacagtgga 600
ggtcctctgg tttgcttcga gaaggacaaa tacattttac aaggagtcac ttcttggggt 660
cttggctgtg cacgccccaa taagcctggt gtctatgttc gtgtttcaag gtttgttact 720
tggattgagg gagtgatgag aaataattaa 750
<210> 12
<211> 249
<212> PRT
<213> Micro-plg(微纤维蛋白溶酶原氨基酸序列)
<400> 12
Ala Pro Ser Pro Ala Cys Gly Leu Pro Gly Val Gly Pro Leu Leu Cys
1 5 10 15
Pro Gly Ala Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Thr Pro
20 25 30
Thr Gly Val Ser Leu Ala Thr Ala Pro Gly Met His Pro Cys Gly Gly
35 40 45
Thr Leu Ile Ser Pro Gly Thr Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Gly
50 55 60
Leu Ser Pro Ala Pro Ser Ser Thr Leu Val Ile Leu Gly Ala His Gly
65 70 75 80
Gly Val Ala Leu Gly Pro His Val Gly Gly Ile Gly Val Ser Ala Leu
85 90 95
Pro Leu Gly Pro Thr Ala Leu Ala Ile Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ser
100 105 110
Pro Ala Val Ile Thr Ala Leu Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro
115 120 125
Ala Thr Val Val Ala Ala Ala Thr Gly Cys Pro Ile Thr Gly Thr Gly
130 135 140
Gly Thr Gly Gly Thr Pro Gly Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Gly Leu
145 150 155 160
Pro Val Ile Gly Ala Leu Val Cys Ala Ala Thr Gly Pro Leu Ala Gly
165 170 175
Ala Val Gly Ser Thr Gly Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr
180 185 190
Ala Ser Cys Gly Gly Ala Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Pro Gly Leu
195 200 205
Ala Leu Thr Ile Leu Gly Gly Val Thr Ser Thr Gly Leu Gly Cys Ala
210 215 220
Ala Pro Ala Leu Pro Gly Val Thr Val Ala Val Ser Ala Pro Val Thr
225 230 235 240
Thr Ile Gly Gly Val Met Ala Ala Ala
245
<210> 13
<211> 684
<212> DNA
<213> 丝氨酸蛋白酶(结构域的核酸序列)
<400> 13
gttgtagggg ggtgtgtggc ccacccacat tcctggccct ggcaagtcag tcttagaaca 60
aggtttggaa tgcacttctg tggaggcacc ttgatatccc cagagtgggt gttgactgct 120
gcccactgct tggagaagtc cccaaggcct tcatcctaca aggtcatcct gggtgcacac 180
caagaagtga atctcgaacc gcatgttcag gaaatagaag tgtctaggct gttcttggag 240
cccacacgaa aagatattgc cttgctaaag ctaagcagtc ctgccgtcat cactgacaaa 300
gtaatcccag cttgtctgcc atccccaaat tatgtggtcg ctgaccggac cgaatgtttc 360
atcactggct ggggagaaac ccaaggtact tttggagctg gccttctcaa ggaagcccag 420
ctccctgtga ttgagaataa agtgtgcaat cgctatgagt ttctgaatgg aagagtccaa 480
tccaccgaac tctgtgctgg gcatttggcc ggaggcactg acagttgcca gggtgacagt 540
ggaggtcctc tggtttgctt cgagaaggac aaatacattt tacaaggagt cacttcttgg 600
ggtcttggct gtgcacgccc caataagcct ggtgtctatg ttcgtgtttc aaggtttgtt 660
acttggattg agggagtgat gaga 684
<210> 14
<211> 228
<212> PRT
<213> 丝氨酸蛋白酶(结构域的氨基酸序列)
<400> 14
Val Val Gly Gly Cys Val Ala His Pro His Ser Thr Pro Thr Gly Val
1 5 10 15
Ser Leu Ala Thr Ala Pro Gly Met His Pro Cys Gly Gly Thr Leu Ile
20 25 30
Ser Pro Gly Thr Val Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Gly Leu Ser Pro
35 40 45
Ala Pro Ser Ser Thr Leu Val Ile Leu Gly Ala His Gly Gly Val Ala
50 55 60
Leu Gly Pro His Val Gly Gly Ile Gly Val Ser Ala Leu Pro Leu Gly
65 70 75 80
Pro Thr Ala Leu Ala Ile Ala Leu Leu Leu Leu Ser Ser Pro Ala Val
85 90 95
Ile Thr Ala Leu Val Ile Pro Ala Cys Leu Pro Ser Pro Ala Thr Val
100 105 110
Val Ala Ala Ala Thr Gly Cys Pro Ile Thr Gly Thr Gly Gly Thr Gly
115 120 125
Gly Thr Pro Gly Ala Gly Leu Leu Leu Gly Ala Gly Leu Pro Val Ile
130 135 140
Gly Ala Leu Val Cys Ala Ala Thr Gly Pro Leu Ala Gly Ala Val Gly
145 150 155 160
Ser Thr Gly Leu Cys Ala Gly His Leu Ala Gly Gly Thr Ala Ser Cys
165 170 175
Gly Gly Ala Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Pro Gly Leu Ala Leu Thr
180 185 190
Ile Leu Gly Gly Val Thr Ser Thr Gly Leu Gly Cys Ala Ala Pro Ala
195 200 205
Leu Pro Gly Val Thr Val Ala Val Ser Ala Pro Val Thr Thr Ile Gly
210 215 220
Gly Val Met Ala
225

Claims (17)

1.有效量的纤溶酶原在制备通过调控GLP-1/GLP-1R治疗疾病的药物中的用途。
2.权利要求1的用途，其中所述疾病为糖代谢紊乱相关疾病、脂肪代谢紊乱相关疾病或GLP-1/GLP-1R相关神经系统疾病。
3.权利要求2的用途，其中所述疾病为选自如下的一种或多种疾病：糖尿病、糖尿病性肾病、糖尿病性神经痛、糖尿病性视网膜疾病、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脑出血、脑栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨质疏松、认知障碍、帕金森综合征、脊髓侧索硬化症、阿尔茨海默病、炎性肠病、消化不良、胃肠道溃疡。
4.有效量的纤溶酶原在制备调控GLP-1/GLP-1R功能的药物中的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述纤溶酶原促进GLP-1和/或GLP-1R的表达。
6.有效量的纤溶酶原在制备用于治疗GLP-1/GLP-1R相关病症的药物中的用途。
7.权利要求6的用途，其中所述GLP-1/GLP-1R相关病症包括如下的一种或多种：血糖升高、糖耐量下降、血脂升高、肥胖、脂肪肝、认知障碍。
8.权利要求6的用途，其中所述GLP-1/GLP-1R相关病症包括如下的一种或多种：糖尿病、糖尿病并发症、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脑出血、脑栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨质疏松、认知障碍、帕金森综合征、侧索硬化症、阿尔茨海默病、炎性肠病、消化不良、胃肠道溃疡。
9.根据权利要求1-8任一项的用途，其中所述纤溶酶原为与序列2、6、8、10或12具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的蛋白质。
10.权利要求1-9任一项的用途，其中所述纤溶酶原是包含纤溶酶原活性片段、并且仍然具有纤溶酶原活性的蛋白质。
11.权利要求10的用途，其中所述纤溶酶原选自Glu-纤溶酶原、Lys-纤溶酶原、小纤溶酶原、微纤溶酶原、delta-纤溶酶原或它们的保留纤溶酶原活性的变体。
12.根据权利要求1-11任一项的用途，其中所述纤溶酶原可与一种或多种其它药物或治疗方法联用。
13.根据权利要求12的用途，其中所述纤溶酶原可与一种或多种选自如下的药物或疗法联用：治疗糖尿病的药物或疗法、治疗动脉粥样硬化的药物或疗法、治疗心脑血管疾病的药物或疗法、治疗血栓的药物或疗法、治疗高血压的药物或疗法，降血脂的药物或疗法、治疗脂肪肝的药物或疗法、治疗帕金森氏病的药物或疗法、治疗阿尔茨海默病的药物或疗法、抗感染药物或疗法。
14.用于治疗GLP-1/GLP-1R相关病症的药物，包含有效量的纤溶酶原。
15.用于治疗GLP-1/GLP-1R相关病症的制品或试剂盒，包含装有有效量的纤溶酶原的容器，以及纤溶酶原治疗GLP-1/GLP-1R相关病症的使用说明书。
16.权利要求14或15的药物、制品或试剂盒，其中所述GLP-1/GLP-1R相关病症包括如下的一种或多种：血糖升高、糖耐量下降、血脂升高、肥胖、脂肪肝、认知障碍。
17.权利要求14或15的药物、制品或试剂盒，其中所述GLP-1/GLP-1R相关病症包括如下的一种或多种：糖尿病、糖尿病并发症、高脂血症、动脉粥样硬化、高血压、冠心病、心肌梗塞、脑血栓、脑出血、脑栓塞、肥胖症、脂肪肝、肝硬化、骨质疏松、认知障碍、帕金森综合征、侧索硬化症、阿尔茨海默病、炎性肠病、消化不良、胃肠道溃疡。
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