TWI624267B - 纖溶酶原在製備預防或治療糖尿病性視網膜病變的藥劑上的用途及包括纖溶酶原用於預防或治療糖尿病性視網膜病變之藥劑 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及纖溶酶原在預防或治療由糖尿病引起的視網膜病變方面的作用，進而為治療不同類型的糖尿病相關的視網膜病變提供全新的治療策略。

Description

纖溶酶原在製備預防或治療糖尿病性視網膜病變的藥劑上的用途及包括纖溶酶原用於預防或治療糖尿病性視網膜病變之藥劑
本發明涉及纖溶酶原在抑制糖尿病引起的內臟器官及其血管的組織細胞損傷、神經、視網膜組織細胞損傷方面的用途，同時涉及纖溶酶原在預防或治療由糖尿病引起的視網膜病變方面的用途，進而為預防和/或治療糖尿病引起的不同類型的視網膜病變提供全新的預防和/或治療策略。
糖尿病是一組由多種遺傳和環境因素共同作用導致胰島素分泌減少或胰島素作用缺陷而引起體內糖、蛋白質、脂肪、水及電解質代謝紊亂的內分泌、代謝症候群。其以慢性血糖水準升高為特徵，久病導致眼、腎、肝臟等器官的慢性併發症。糖尿病本身及其併發症嚴重危害人類健康，糖尿病及其併發症的治療已成為全球性的重大公共衛生問題。
糖尿病性視網膜病變是最常見的糖尿病眼病，常造成視力減退或失明。據統計，50%的糖尿病患者在病程的10年左右將出現該病變，15年以上則達80%。糖尿病病情越重，年齡越大，發病的機率越高。
纖溶酶是纖溶酶原啟動系統(PA系統)的關鍵組分。它是一種廣譜的蛋白酶，能夠水解細胞外基質(ECM)的幾個組分，包括纖維蛋白、明膠、纖連蛋白、層粘連蛋白和蛋白聚糖[1]此外，纖溶酶能將一些金屬蛋白酶 前體(pro-MMP)啟動形成具有活性的金屬蛋白酶(MMP)。因此纖溶酶被認為是胞外蛋白水解作用的一個重要的上游調節物[2,3]。纖溶酶是由纖溶酶原藉由兩種生理性的PA：組織型纖溶酶原啟動劑(tPA)或尿激酶型纖溶酶原啟動劑(uPA)蛋白水解形成的。由於纖溶酶原在血漿和其他體液中相對水準較高，傳統上認為PA系統的調節主要藉由PA的合成和活性水準實現。PA系統組分的合成受不同因素嚴格調節，如激素、生長因數和細胞因數。此外，還存在纖溶酶和PA的特定生理抑制劑。纖溶酶的主要抑制劑是α2-抗纖溶酶(α2-antiplasmin)。某些細胞表面具有直接水解活性的uPA特異性細胞表面受體(uPAR)[4,5]。
纖溶酶原(plasminogen，plg)是一個單鏈糖蛋白，分子量約為92kDa[6,7]。纖溶酶原主要在肝臟合成，大量存在於胞外液中。血漿中纖溶酶原含量約為2μM。因此纖溶酶原是組織和體液中蛋白質水解活性的一個巨大的潛在來源[8,9]。纖溶酶原存在兩種分子形式：谷氨酸-纖溶酶原(Glu-plasminogen)和賴氨酸-纖溶酶原(Lys-plasminogen)。天然分泌和未裂解形式的纖溶酶原具有一個氨基末端(N-末端)谷氨酸，因此被稱為谷氨酸-纖溶酶原。然而，在纖溶酶存在時，谷氨酸-纖溶酶原在Lys76-Lys77處水解成為賴氨酸-纖溶酶原。與谷氨酸-纖溶酶原相比，賴氨酸-纖溶酶原與纖維蛋白具有更高的親和力，並可以更高的速率被PAs啟動。這兩種形式的纖溶酶原的Arg560-Val561肽鍵可被uPA或tPA切割，導致二硫鍵連接的雙鏈蛋白酶纖溶酶的形成[10]。纖溶酶原的氨基末端部分包含五個同源三環，即所謂的kringle，羧基末端部分包含蛋白酶結構域。一些kringle含有介導纖溶酶原與纖維蛋白及其抑制劑α2-AP特異性相互作用的賴氨酸結合位點。最新發現一個38kDa的纖維蛋白溶酶原為片段，其中包括kringle1-4，是血管生成的有 效抑制劑。這個片段被命名為血管抑素，可藉由幾個蛋白酶水解纖溶酶原產生。
纖溶酶的主要底物是纖維蛋白，纖維蛋白的溶解是預防病理性血栓形成的關鍵[11]。纖溶酶還具有對ECM幾個組分的底物特異性，包括層粘連蛋白、纖連蛋白、蛋白聚糖和明膠，表明纖溶酶在ECM重建中也起著重要作用[7,12,13]。間接地，纖溶酶還可以藉由轉化某些蛋白酶前體為活性蛋白酶來降解ECM的其他組分，包括MMP-1、MMP-2、MMP-3和MMP-9。因此，有人提出，纖溶酶可能是細胞外蛋白水解的一個重要的上游調節器[14]。此外，纖溶酶具有啟動某些潛在形式的生長因數的能力[15-17]。在體外，纖溶酶還能水解補體系統的組分並釋放趨化補體片段。
現有的治療方法主要包括基礎治療，即控制血糖的基礎上藉由定期的眼部檢查和針對眼部病症進行輔助治療。我們以自發糖尿病小鼠作為研究物件驚奇地發現溶酶原和/或纖溶酶在抑制內臟器官、血管、神經和視網膜的組織損傷方面，以及在預防或治療糖尿病性視網膜病變方面具有良好的治療效果，且安全性高。因此，纖溶酶原有可能成為一種新的用於治療包括視網膜病變在內的糖尿病併發症策略。
一方面，本發明涉及一種修復受試者糖尿病引起的內臟器官組織細胞損傷的方法，包括給藥所述受試者纖溶酶原或纖溶酶。一方面，本發明還涉及纖溶酶原或纖溶酶用於修復受試者糖尿病引起的內臟器官組織細胞損傷的用途，包括給藥所述受試者纖溶酶原或纖溶酶。在一個實施例中，所述內臟器官包括肝臟、心臟、腎臟。同時，本發明還涉及修復受試 者糖尿病引起的神經和視網膜組織損傷的方法，以及纖溶酶原或纖溶酶用於修復受試者糖尿病引起的神經和視網膜組織損傷的用途，包括給藥所述受試者纖溶酶原或纖溶酶。
本發明還涉及預防和/或治療受試者糖尿病引起的視網膜病變的方法，以及纖溶酶原或纖溶酶用於預防和/或治療受試者糖尿病引起的視網膜病變的用途，包括給藥所述受試者纖溶酶原或纖溶酶。
在一個實施例中，所述視網膜病變包括糖尿病引發的視網膜新生血管的形成、視網膜炎症、視網膜萎縮、視網膜細胞凋亡、視網膜組織結構損傷、視網膜血管損傷。在一個實施例中，所述纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施例中，所述纖維蛋白溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施例中，所述纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施例中，所述纖溶酶原全身或局部施用，包括表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內或直腸施用、局部注射使用，和/或藉由在角膜上的基因槍局部施用、藉由結膜下注射、前房內注射、經由滴眼劑在角膜上、經由顳緣注射入前室、基質內注射、與電脈衝組合的角膜應用、角膜內注射、視網膜下注射，玻璃體內注射和眼內注射施用。在一個實施例中，所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物，包括抗糖尿病藥物、抗心腦血管疾病藥物、抗血栓藥物、抗高血壓藥物，抗血脂藥物、抗感染藥物以及其它預防和/或治療伴隨疾病的常規藥物，聯合施用。
在一個實施例中，所述受試者為哺乳動物，較佳為人。
在一個實施例中，所述由糖尿病引起的視網膜病變是由糖尿病引起的微血管病變導致。
在一個實施例中，所述受試者纖溶酶或者纖溶酶原低下。具體地，所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。
在一個實施例中，纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施例中，纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施例中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施例中，纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施例中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個實施例中，纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、馬，狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最佳，本發明的纖維蛋白溶酶原的胺基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
上述纖溶酶原可以單獨施用，也可以與其它藥物聯合施用，還可以與視網膜病變的藥物預防和/或治療外的其它療法，例如鐳射治療等，聯合施用。
在一個實施例中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施例中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。
另一方面，本發明涉及纖溶酶原或纖溶酶在製備修復受試者糖尿病引起的內臟器官及其血管組織損傷的藥物、製品、藥盒中的用途。在一個實施例中，所述內臟器官包括肝臟、心臟、腎臟。同時，本發明涉及纖溶酶原或纖溶酶在製備修復受試者糖尿病引起的神經和視網膜組織損傷的藥物、製品、藥盒中的用途。本發明還涉及纖溶酶原或纖溶酶在製備預防和/或治療受試者糖尿病引起的視網膜病變的藥物、製品、藥盒中的用途。在一個實施例中，所述視網膜病變包括視網膜新生血管的形成、視網膜炎症、視網膜萎縮、視網膜細胞凋亡、視網膜組織結構損傷、視網膜血管凋亡。
在一個實施例中，所述纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施例中，所述纖維蛋白 溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施例中，所述纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施例中，所述纖溶酶原全身或局部施用，包括表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內或直腸施用、局部注射使用，和/或藉由在角膜上的基因槍局部施用、藉由結膜下注射、前房內注射、經由滴眼劑在角膜上、經由顳緣注射入前室、基質內注射、與電脈衝組合的角膜應用、角膜內注射、視網膜下注射，玻璃體內注射和眼內注射施用。在一個實施例中，所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物，包括抗糖尿病藥物、抗心腦血管疾病藥物、抗血栓藥物、抗高血壓藥物，抗血脂藥物、抗感染藥物以及其它預防和/或治療伴隨疾病的常規藥物，聯合施用。
在一個實施例中，所述受試者為哺乳動物，較佳為人。
在一個實施例中，所述由糖尿病引起的視網膜病變是由糖尿病引起的微血管病變導致。
在一個實施例中，所述受試者纖溶酶或者纖溶酶原低下。具體地，所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。
在一個實施例中，纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施例中，纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施例中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍 然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施例中，纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施例中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個實施例中，纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、馬，狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最佳，本發明的纖維蛋白溶酶原的胺基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
上述纖溶酶原可以單獨施用，也可以與其它藥物聯合施用，還可以與視網膜病變的藥物預防和/或治療外的其它療法，例如鐳射治療等，聯合施用。
在一個實施例中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施例中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。
另一方面，本發明涉及用於修復受試者糖尿病引起的內臟器官及其血管的組織損傷的纖溶酶原或纖溶酶，以及用於修復受試者糖尿病引 起的內臟器官及其血管的組織損傷的、包含纖溶酶原或纖溶酶的藥物組合物、或包含該組合物的製品或藥盒。在一個實施例中，所述內臟器官包括肝臟、心臟、腎臟。同時，本發明涉及用於修復受試者糖尿病引起的神經和視網膜組織損傷的纖溶酶原或纖溶酶，以及用於修復受試者糖尿病引起的神經和視網膜組織損傷的、包含纖溶酶原或纖溶酶的藥物組合物、或包含該組合物的製品或藥盒。本發明還涉及用於預防和/或治療受試者糖尿病引起的視網膜病變的纖溶酶原或纖溶酶，以及用於預防和/或治療受試者糖尿病引起的視網膜病變的、包含纖溶酶原或纖溶酶的藥物組合物、以及包含該組合物的製品或藥盒。在一個實施例中，所述視網膜病變包括視網膜新生血管的形成、視網膜炎症、視網膜萎縮、視網膜細胞凋亡、視網膜組織結構損傷、視網膜血管凋亡。
在一個實施例中，所述纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施例中，所述纖維蛋白溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施例中，所述纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施例中，所述纖溶酶原全身或局部施用，包括表面、靜脈內、肌內、皮下、吸入、椎管內或直腸施用、局部注射使用，和/或藉由在角膜上的基因槍局部施用、藉由結膜下注射、前房內注射、經由滴眼劑在角膜上、經由顳緣注射入前室、基質內注射、與電脈衝組合的角膜應用、角膜內注射、視網膜下注射，玻璃體內注射和眼內注射施用。在一個實施例中，所述纖溶酶原可與一種或多種其它藥物，包括抗糖尿病藥物、 抗心腦血管疾病藥物、抗血栓藥物、抗高血壓藥物，抗血脂藥物、抗感染藥物以及其它預防和/或治療伴隨疾病的常規藥物，聯合施用。
在一個實施例中，所述受試者為哺乳動物，較佳為人。
在一個實施例中，所述由糖尿病引起的視網膜病變是由糖尿病引起的微血管病變導致。
在一個實施例中，所述受試者纖溶酶或者纖溶酶原低下。具體地，所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。
在一個實施例中，纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施例中，纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施例中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施例中，纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施例中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個實施例中，纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、馬，狗的纖維蛋白溶酶原直向同 系物。最佳，本發明的纖維蛋白溶酶原的胺基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
上述纖溶酶原可以單獨施用，也可以與其它藥物聯合施用，還可以與視網膜病變的藥物預防和/或治療外的其它療法，例如鐳射治療等，聯合施用。
在一個實施例中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施例中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。
在一個實施例中，所述製品或藥盒包含含有有效劑量的纖溶酶原/纖溶酶的容器。較佳，該製品或藥盒進一步包含含有一種或多種其它藥物的容器。該製品或藥盒還可包含使用說明書，說明所述纖溶酶原或纖溶酶可以用於預防和/或治療所述由糖尿病引起的內臟器官及其血管組織損傷、神經或視網膜組織損傷、或所述視網膜病症，並且可以進一步說明，所述纖溶酶原或纖溶酶可以在其它藥物或療法施用之前，同時，和/或之後施用。
在一個實施例中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施例中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10- 100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。
另一方面，本發明涉及纖溶酶原在製備預防和/或治療受試者的糖尿病性眼微血管病變的藥物、製品或藥盒中的用途。本發明還涉及一種新的預防和/或治療受試者的糖尿病性眼微血管病變的方法，或纖溶酶原或纖溶酶用於預防和/或治療受試者的糖尿病性眼微血管病變的用途，包括向所述受試者給藥纖溶酶原或纖溶酶。本發明的另一方面涉及用於預防和/或治療受試者的糖尿病性眼微血管病變的纖溶酶原或纖溶酶、或用於預防和/或治療受試者的糖尿病性眼微血管病變的、包含纖溶酶原或纖溶酶的藥物組合物、或用於預防和/或治療受試者的糖尿病性眼微血管病變的、包含纖溶酶原或纖溶酶的製品或藥盒。
在一個實施例中，所述纖維蛋白溶酶原與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性。在一個實施例中，纖維蛋白溶酶原是在序列2、6、8、10或12的基礎上，添加、刪除和/或取代1-100、1-90、1-80、1-70、1-60、1-50、1-45、1-40、1-35、1-30、1-25、1-20、1-15、1-10、1-5、1-4、1-3、1-2、1個胺基酸，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施例中，纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段、並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。在一個實施例中，纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋 白溶酶原、δ-纖溶酶原或其任意組合。在一個實施例中，纖溶酶原是選自如下的保守取代變體：Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、δ-纖溶酶原或微纖維蛋白溶酶原。在一個實施例中，纖維蛋白溶酶原為人天然纖維蛋白溶酶原，例如序列2所示的纖溶酶原的直向同系物，例如，來自靈長類動物或齧齒類動物的纖維蛋白溶酶原直向同系物，例如來自大猩猩，恒河猴、鼠、牛、馬，狗的纖維蛋白溶酶原直向同系物。最佳，本發明的纖維蛋白溶酶原的胺基酸序列如序列2、6、8、10或12所示。
上述對糖尿病性眼微血管病變的預防和治療包括抑制視網膜無細胞毛細血管的形成、改善視網膜萎縮病變、修復視網膜的炎症、和/或抑制視網膜細胞和血管細胞的凋亡。
在一個實施例中，所述纖溶酶原與適當的多肽載體或穩定劑組合施用。在一個實施例中，所述纖溶酶原以每天0.0001-2000mg/kg、0.001-800mg/kg、0.01-600mg/kg、0.1-400mg/kg、1-200mg/kg、1-100mg/kg、10-100mg/kg(以每公斤體重計算)或0.0001-2000mg/cm2、0.001-800mg/cm2、0.01-600mg/cm2、0.1-400mg/cm2、1-200mg/cm2、1-100mg/cm2、10-100mg/cm2(以每平方釐米體表面積計算)的劑量施用，較佳至少重複一次，較佳至少每天施用。在局部施用的情況下，上述劑量還可以根據情況進一步調整。
一方面，本發明涉及纖溶酶原或纖溶酶在製備預防和/或治療受試者糖尿病導致的機體組織和內臟器官損傷(損害)的藥物、製品、藥盒中的用途。在一個實施例中，所述組織和內臟器官損傷(損害)包括對大腦、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、神經、視網膜、皮膚、胃腸道的損傷(損害)。一方 面，本發明涉及纖溶酶原在製備預防和/或治療受試者的糖尿病併發症的藥物、製品、藥盒中的用途。在一個實施例中，所述糖尿病併發症為糖尿病引發的糖尿病性大腦病變、糖尿病性心臟病變、糖尿病性肝臟病變、糖尿病性腎臟病變、糖尿病性肺臟病變、糖尿病性神經病變，、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性皮膚病變。
一方面，本發明涉及一種製藥方法，包括將纖溶酶原或纖溶酶與藥學可接受的載體製備成用於預防和/或治療受試者糖尿病導致的機體組織和內臟器官損傷(損害)的藥物、製品、藥盒。在一個實施例中，所述組織和內臟器官損傷(損害)包括對大腦、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、神經、視網膜、皮膚、胃腸道的損傷(損害)。一方面，本發明涉及一種製藥方法，包括將纖溶酶原或纖溶酶與藥學可接受載體製備成預防和/或治療受試者的糖尿病併發症的藥物、製品或藥盒。在一個實施例中，所述糖尿病併發症為糖尿病引發的糖尿病性大腦病變、糖尿病性心臟病變、糖尿病性肝臟病變、糖尿病性腎臟病變、糖尿病性肺臟病變、糖尿病性神經病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性皮膚病變。
一方面，本發明涉及用於預防和/或治療受試者糖尿病導致的機體組織和內臟器官損傷(損害)的纖溶酶原或纖溶酶、包含纖溶酶原或纖溶酶的藥物組合物、製品、藥盒。在一個實施例中，所述組織和內臟器官損傷(損害)包括對大腦、心臟、肝臟、腎臟、肺臟、神經、視網膜、胃腸道、皮膚的損傷(損害)。一方面，本發明涉及用於預防和/或治療受試者的糖尿病併發症的纖溶酶原、包含纖溶酶原的藥物組合物、製品或藥盒。在一個實施例中，所述糖尿病併發症為糖尿病引發的糖尿病性大腦病變、糖尿病性 心臟病變、糖尿病性肝臟病變、糖尿病性肺臟病變糖尿病性腎臟病變、糖尿病性神經病變，、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性皮膚病變。
一方面，本發明涉及一種預防和/或治療受試者糖尿病導致的機體組織和內臟器官損傷(損害)的方法，包括給藥受試者纖溶酶原或纖溶酶、包含纖溶酶原或纖溶酶的藥物組合物、製品、藥盒。本發明還涉及纖溶酶原或纖溶酶、包含纖溶酶原或纖溶酶的藥物組合物、製品、藥盒用於預防和/或治療受試者糖尿病導致的機體組織和內臟器官損傷(損害)的用途。在一個實施例中，所述組織和內臟器官損傷(損害)包括對大腦、心臟、肝臟、肺臟、腎臟、神經、視網膜、胃腸道、皮膚的損傷(損害)。一方面，本發明涉及一種預防和/或治療受試者的糖尿病併發症的方法，包括給藥受試者纖溶酶原或纖溶酶、包含纖溶酶原或纖溶酶的藥物組合物、製品或藥盒。本發明還包括纖溶酶原或纖溶酶、包含纖溶酶原或纖溶酶的藥物組合物、製品或藥盒用於預防和/或治療受試者的糖尿病併發症的用途。在一個實施例中，所述糖尿病併發症為糖尿病引發的糖尿病性大腦病變、糖尿病性心臟病變、糖尿病性肝臟病變、糖尿病性肺臟病變、糖尿病性腎臟病變、糖尿病性神經病變、糖尿病性視網膜病變、糖尿病性皮膚病變。
在一個實施例中，所述受試者纖維蛋白溶酶或者纖維蛋白溶酶原低下。具體地，所述低下是先天的、繼發的和/或局部的。
本發明明確涵蓋了屬於本發明實施例之間的技術特徵的所有組合，並且這些組合後的技術方案在本申請中已經明確公開，就像上述技術方案已經單獨且明確公開一樣。另外，本發明還明確涵蓋各個實施例及其要素的所有亞組合，並且在本文中公開，就像每一個此類亞組合單獨且明確在本文中公開一樣。
發明詳述
1. 定義
「糖尿病」是由遺傳因素、免疫功能紊亂、微生物感染及其毒素、自由基毒素、精神因素等等各種致病因數作用於機體導致胰島功能減退、胰島素抵抗等而引發的糖、蛋白質、脂肪、水和電解質等一系列代謝紊亂症候群，臨床上以高血糖為主要特點。
「糖尿病併發症」是由糖尿病過程中血糖控制不良導致的身體其他器官或組織的損害或功能障礙，其中包括肝臟、腎臟、心臟、視網膜、神經系統的損害或功能障礙等。據世界衛生組織統計，糖尿病併發症高達100多種，是目前已知併發症最多的一種疾病。
「糖尿病性微血管病變」指糖尿病患者機體各器官或組織微循環不同程度的異常導致的微血管病變。微血管病變形成的過程大致為：微循環功能性改變，內皮損傷，基膜增厚，血粘度增高，紅細胞聚集，血小板粘附和聚集，最後導致微血栓形成和/或微血管閉塞。「糖尿病性眼微血管病變」指由糖尿病導致的眼部微血管病變。
上述「糖尿病性微血管病變」導致組織或器官局部血管損傷、血流不暢、細胞缺氧、形成血凝塊、血栓和炎症，並進一步影響周邊的組織及器官功能，進而導致「糖尿病併發症」，因此，本發明權利要求技術方案中提到「糖尿病性微血管病變」和「糖尿病併發症」術語時，都涵蓋了糖尿病引發的血栓形成。
「糖尿病性視網膜病變」指由糖尿病引起的視網膜組織學和功能變化的病變主要由糖尿病引起的微血管病變導致。糖尿病性視網膜病變是最常見的糖尿病眼病，常造成視力減退或失明。據統計，50%的糖尿病 患者在病程的10年左右將出現該病變，15年以上則達80%。糖尿病病情越重，年齡越大，發病的機率越高。
「纖溶酶」是存在於血液中的一種非常重要的酶，能將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體。
「纖溶酶原」是纖溶酶的酶原形式，根據swiss prot中的序列，按含有信號肽的天然人源纖溶酶原胺基酸序列(序列4)計算由810個胺基酸組成，分子量約為92kD，主要在肝臟中合成並能夠在血液中迴圈的糖蛋白，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列3所示。全長的纖溶酶原包含七個結構域：位於C末端的絲氨酸蛋白酶結構域、N末端的Pan Apple(PAp)結構域以及5個Kringle結構域(Kringle1-5)。參照swiss prot中的序列，其信號肽包括殘基Met1-Gly19，PAp包括殘基Glu20-Val98，Kringle1包括殘基Cys103-Cys181，Kringle2包括殘基Glu184-Cys262，Kringle3包括殘基Cys275-Cys352，Kringle4包括殘基Cys377-Cys454，Kringle5包括殘基Cys481-Cys560。根據NCBI資料，絲氨酸蛋白酶域包括殘基Val581-Arg804。
Glu-纖溶酶原是天然全長的纖溶酶原，由791個胺基酸組成(不含有19個胺基酸的信號肽)，編碼該序列的cDNA序列如序列1所示，其胺基酸序列如序列2所示。在體內，還存在一種是從Glu-纖溶酶原的第76-77位胺基酸處水解從而形成的Lys-纖溶酶原，如序列6所示，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列5所示。δ-纖溶酶原(δ-plasminogen)是全長纖溶酶原缺失了Kringle2-Kringle5結構的片段，僅含有Kringle1和絲氨酸蛋白酶域[18,19]，有文獻報導了δ-纖溶酶原的胺基酸序列(序列8)[19]，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列7。小纖溶酶原(Mini-plasminogen)由Kringle5 和絲氨酸蛋白酶域組成，有文獻報導其包括殘基Val443-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基酸)[20]，其胺基酸序列如序列10所示，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列9所示。而微纖溶酶原(Micro-plasminogen)僅含有絲氨酸蛋白酶結構域，有文獻報導其胺基酸序列包括殘基Ala543-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基酸)[21]，也有專利文獻CN102154253A報導其序列包括殘基Lys531-Asn791(以不含有信號肽的Glu-纖溶酶原序列的Glu殘基為起始胺基酸)，本專利序列參考專利文獻CN102154253A，其胺基酸序列如序列12所示，編碼該胺基酸序列的cDNA序列如序列11所示。
本發明的「纖溶酶」與「纖維蛋白溶酶」、「纖維蛋白溶解酶」可互換使用，含義相同；「纖溶酶原」與「纖維蛋白溶酶原」、「纖維蛋白溶解酶原」可互換使用，含義相同。
在迴圈過程中，纖溶酶原採用封閉的非活性構象，但當結合至血栓或細胞表面時，在纖溶酶原啟動劑(plasminogen activator，PA)的介導下，其轉變為呈開放性構象的活性纖溶酶。具有活性的纖溶酶可進一步將纖維蛋白凝塊水解為纖維蛋白降解產物和D-二聚體，進而溶解血栓。其中纖溶酶原的PAp結構域包含維持纖溶酶原處於非活性封閉構象的重要決定簇，而KR結構域則能夠與存在於受體和底物上的賴氨酸殘基結合。已知多種能夠作為纖溶酶原啟動劑的酶，包括：組織纖溶酶原啟動劑(tPA)、尿激酶纖溶酶原啟動劑(uPA)、激肽釋放酶和凝血因數XII(哈格曼因數)等。
「纖溶酶原活性片段」是指在纖溶酶原蛋白中，能夠與底物中的靶序列結合並發揮蛋白水解功能的活性片段。本發明涉及纖溶酶原的技術方案涵蓋了用纖溶酶原活性片段代替纖溶酶原的技術方案。本發明所述 的纖溶酶原活性片段為包含纖溶酶原的絲氨酸蛋白酶域的蛋白質，較佳，本發明所述的纖溶酶原活性片段包含序列14、與序列14具有至少80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%同源性的胺基酸序列的蛋白質。因此，本發明所述的纖溶酶原包括含有該纖溶酶原活性片段、並且仍然保持該纖溶酶原活性的蛋白。
目前，對於血液中纖維蛋白溶酶原及其活性測定方法包括：對組織纖維蛋白溶酶原啟動劑活性的檢測(t-PAA)、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抗原的檢測(t-PAAg)、對血漿組織纖溶酶原活性的檢測(plgA)、血漿組織纖溶酶原抗原的檢測(plgAg)、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抑制物活性的檢測、血漿組織纖維蛋白溶酶原啟動劑抑制物抗原的檢測、血漿纖維蛋白溶酶-抗纖維蛋白溶酶複合物檢測(PAP)。其中最常用的檢測方法為發色底物法：向受檢血漿中加鏈激酶(SK)和發色底物，受檢血漿中的PLG在SK的作用下，轉變成PLM，後者作用於發色底物，隨後用分光光度計測定，吸光度增加與纖維蛋白溶酶原活性成正比。此外也可採用免疫化學法、凝膠電泳、免疫比濁法、放射免疫擴散法等對血液中的纖維蛋白溶酶原活性進行測定。
「直系同源物或直系同系物(ortholog)」指不同物種之間的同源物，既包括蛋白同源物也包括DNA同源物，也稱為直向同源物、垂直同源物。其具體指不同物種中由同一祖先基因進化而來的蛋白或基因。本發明的纖維蛋白溶酶原包括人的天然纖維蛋白溶酶原，還包括來源於不同物種的、具有纖維蛋白溶酶原活性的纖維蛋白溶酶原直系同源物或直系同系物。
「保守取代變體」是指其中一個給定的胺基酸殘基改變但不改變蛋白質或酶的整體構象和功能，這包括但不限於以相似特性(如酸性，鹼性，疏水性，等)的胺基酸取代親本蛋白質中胺基酸序列中的胺基酸。具有類似性質的胺基酸是眾所周知的。例如，精氨酸、組氨酸和賴氨酸是親水性的鹼性胺基酸並可以互換。同樣，異亮氨酸是疏水胺基酸，則可被亮氨酸，蛋氨酸或纈氨酸替換。因此，相似功能的兩個蛋白或胺基酸序列的相似性可能會不同。例如，基於MEGALIGN演算法的70%至99%的相似度(同一性)。「保守取代變體」還包括藉由BLAST或FASTA演算法確定具有60%以上的胺基酸同一性的多肽或酶，若能達75%以上更好，最好能達85%以上，甚至達90%以上為最佳，並且與天然或親本蛋白質或酶相比具有相同或基本相似的性質或功能。
「分離的」纖溶酶原是指從其天然環境分離和/或回收的纖溶酶原蛋白。在一些實施例中，所述纖溶酶原會純化(1)至大於90%、大於95%、或大於98%的純度(按重量計)，如藉由Lowry法所確定的，例如超過99%(按重量計)，(2)至足以藉由使用旋轉杯序列分析儀獲得N端或內部胺基酸序列的至少15個殘基的程度，或(3)至同質性，該同質性是藉由使用考馬斯藍或銀染在還原性或非還原性條件下的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)確定的。分離的纖溶酶原也包括藉由生物工程技術從重組細胞製備，並藉由至少一個純化步驟分離的纖溶酶原。
術語「多肽」、「肽」和「蛋白質」在本文中可互換使用，指任何長度的胺基酸的聚合形式，其可以包括遺傳編碼的和非遺傳編碼的胺基酸，化學或生物化學修飾的或衍生化的胺基酸，和具有經修飾的肽主鏈的多肽。該術語包括融合蛋白，包括但不限於具有異源胺基酸序列的融合 蛋白，具有異源和同源前導序列(具有或沒有N端甲硫氨酸殘基)的融合物；等等。
關於參照多肽序列的「胺基酸序列同一性百分數(%)」定義為在必要時引入缺口以實現最大百分比序列同一性後，且不將任何保守替代視為序列同一性的一部分時，候選序列中與參照多肽序列中的胺基酸殘基相同的胺基酸殘基的百分率。為測定百分比胺基酸序列同一性目的的對比可以以本領域技術範圍內的多種方式實現，例如使用公眾可得到的電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。本領域技術人員能決定用於比對序列的適宜參數，包括對所比較序列全長實現最大對比需要的任何演算法。然而，為了本發明的目的，胺基酸序列同一性百分數值是使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生的。
在採用ALIGN-2來比較胺基酸序列的情況中，給定胺基酸序列A相對於給定胺基酸序列B的%胺基酸序列同一性(或者可表述為具有或包含相對於、與、或針對給定胺基酸序列B的某一%胺基酸序列同一性的給定胺基酸序列A)如下計算：分數X/Y乘100
其中X是由序列比對程式ALIGN-2在該程式的A和B比對中評分為相同匹配的胺基酸殘基的數目，且其中Y是B中的胺基酸殘基的總數。應當領會，在胺基酸序列A的長度與胺基酸序列B的長度不相等的情況下，A相對於B的%胺基酸序列同一性會不等於B相對於A的%胺基酸序列同一性。除非另有明確說明，本文中使用的所有%胺基酸序列同一性值都是依照上一段所述，使用ALJGN-2電腦程式獲得的。
如本文中使用的，術語「治療」和「處理」指獲得期望的藥理和/或生理效果。所述效果可以是完全或部分預防疾病或其症狀，和/或部分或完全治癒疾病和/或其症狀，並且包括：(a)預防疾病在受試者體內發生，所述受試者可以具有疾病的素因，但是尚未診斷為具有疾病；(b)抑制疾病，即阻滯其形成；和(c)減輕疾病和/或其症狀，即引起疾病和/或其症狀消退。
術語「個體」、「受試者」和「患者」在本文中可互換使用，指哺乳動物，包括但不限於鼠(大鼠、小鼠)、非人靈長類、人、犬、貓、有蹄動物(例如馬、牛、綿羊、豬、山羊)等。
「治療有效量」或「有效量」指在對哺乳動物或其它受試者施用以治療疾病時足以實現對疾病的所述預防和/或治療的纖溶酶原的量。「治療有效量」會根據所使用的纖溶酶原、要治療的受試者的疾病和/或其症狀的嚴重程度以及年齡、體重等而變化。
2. 本發明纖溶酶原的製備
纖溶酶原可以從自然界分離並純化用於進一步的治療用途，也可以藉由標準的化學肽合成技術來合成。當藉由化學合成多肽時，可以經液相或固相進行合成。固相多肽合成(SPPS)(其中將序列的C末端胺基酸附接於不溶性支援物，接著序貫添加序列中剩餘的胺基酸)是適合纖溶酶原化學合成的方法。各種形式的SPPS，諸如Fmoc和Boc可用于合成纖溶酶原。用於固相合成的技術描述於Barany和Solid-Phase Peptide Synthesis；第3-284頁於The Peptides：Analysis,Synthesis,Biology.第2卷：Special Methods in Peptide Synthesis,Part A.,Merrifield，等J.Am.Chem.Soc.,85：2149-2156(1963)；Stewart等，Solid Phase Peptide Synthesis,2nd ed.Pierce Chem.Co.,Rockford,Ill.(1984)；和Ganesan A.2006 Mini Rev.Med Chem.6：3-10和Camarero JA等2005 Protein Pept Lett.12：723-8中。簡言之，用其上構建有肽鏈的功能性單元處理小的不溶性多孔珠。在偶聯/去保護的重複迴圈後，將附接的固相游離N末端胺與單個受N保護的胺基酸單元偶聯。然後，將此單元去保護，露出可以與別的胺基酸附接的新的N末端胺。肽保持固定在固相上，之後將其切掉。
可以使用標準重組方法來生產本發明的纖溶酶原。例如，將編碼纖溶酶原的核酸插入表達載體中，使其與表達載體中的調控序列可操作連接。表達調控序列包括但不限於啟動子(例如天然關聯的或異源的啟動子)、信號序列、增強子元件、和轉錄終止序列。表達調控可以是載體中的真核啟動子系統，所述載體能夠轉化或轉染真核宿主細胞(例如COS或CHO細胞)。一旦將載體摻入合適的宿主中，在適合於核苷酸序列的高水準表達及纖溶酶原的收集和純化的條件下維持宿主。
合適的表達載體通常在宿主生物體中作為附加體或作為宿主染色體DNA的整合部分複製。通常，表達載體含有選擇標誌物(例如氨苄青黴素抗性、潮黴素抗性、四環素抗性、卡那黴素抗性或新黴素抗性)以有助於對外源用期望的DNA序列轉化的那些細胞進行檢測。
大腸桿菌(Escherichia coli)是可以用於複製標的抗體編碼多核苷酸的原核宿主細胞的例子。適合於使用的其它微生物宿主包括桿菌，諸如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)和其他腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，諸如沙門氏菌屬(Salmonella)、沙雷氏菌屬(Serratia)、和各種假單胞菌屬(Pseudomonas)物種。在這些原核宿主中，也可以生成表達載體，其通常會含有與宿主細胞相容的表達控制序列(例如複製起點)。另外，會存在許多公 知的啟動子，諸如乳糖啟動子系統，色氨酸(trp)啟動子系統，β-內醯胺酶啟動子系統，或來自噬菌體λ的啟動子系統。啟動子通常會控制表達，任選在操縱基因序列的情況中，並且具有核糖體結合位點序列等，以啟動並完成轉錄和翻譯。
其他微生物，諸如酵母也可用於表達。酵母(例如釀酒酵母(S.cerevisiae))和畢赤酵母(Pichia)是合適的酵母宿主細胞的例子，其中合適的載體根據需要具有表達控制序列(例如啟動子)、複製起點、終止序列等。典型的啟動子包含3-磷酸甘油酸激酶和其它糖分解酶。誘導型酵母啟動於特別包括來自醇脫氫酶、異細胞色素C、和負責麥芽糖和半乳糖利用的酶的啟動子。
在微生物外，哺乳動物細胞(例如在體外細胞培養物中培養的哺乳動物細胞)也可以用於表達並生成本發明的纖溶酶原(例如編碼標的抗-Tau抗體的多核苷酸)。參見Winnacker,From Genes to Clones,VCH Publishers,N.Y.,N.Y.(1987)。合適的哺乳動物宿主細胞包括CHO細胞系、各種Cos細胞系、HeLa細胞、骨髓瘤細胞系、和經轉化的B細胞或雜交瘤。用於這些細胞的表達載體可以包含表達控制序列，如複製起點，啟動子和增強子(Queen等，Immunol.Rev.89：49(1986))，以及必需的加工資訊位元點，諸如核糖體結合位點、RNA剪接位點、多聚腺苷酸化位點，和轉錄終止子序列。合適的表達控制序列的例子是白免疫球蛋白基因、SV40、腺病毒、牛乳頭瘤病毒、巨細胞病毒等衍生的啟動子。參見Co等，J.Immunol.148：1149(1992)。
一旦合成(化學或重組方式)，可以依照本領域的標準規程，包括硫酸銨沉澱、親和柱、柱層析、高效液相層析(HPLC)、凝膠電泳等來純化 本發明所述的纖溶酶原。該纖溶酶原是基本上純的，例如至少約80%至85%純的，至少約85%至90%純的，至少約90%至95%純的，或98%至99%純的或更純的，例如不含污染物，所述污染物如細胞碎片，除標的抗體以外的大分子，等等。
3. 藥物配製劑
可以藉由將具有所需純度的纖溶酶原與可選的藥用載體，賦形劑，或穩定劑(Remington's Pharmaceutical Sciences,16版，Osol,A.ed.(1980))混合形成凍乾製劑或水溶液製備治療配製劑。可接受的載體、賦形劑、穩定劑在所用劑量及濃度下對受者無毒性，並包括緩衝劑例如磷酸鹽，檸檬酸鹽及其它有機酸；抗氧化劑包括抗壞血酸和蛋氨酸；防腐劑(例如十八烷基二甲基苄基氯化銨；氯化己烷雙胺；氯化苄烷銨(benzalkonium chloride)，苯索氯銨；酚、丁醇或苯甲醇；烷基對羥基苯甲酸酯如甲基或丙基對羥基苯甲酸酯；鄰苯二酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；間甲酚)；低分子量多肽(少於約10個殘基)；蛋白質如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；胺基酸如甘氨酸、穀氨醯胺、天冬醯胺、組氨酸、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖及其它碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖、或糊精；螯合劑如EDTA；糖類如蔗糖、甘露醇、岩藻糖或山梨醇；成鹽反離子如鈉；金屬複合物(例如鋅-蛋白複合物)；和/或非離子表面活性劑，例如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。較佳凍乾的抗-VEGF抗體配製劑在WO 97/04801中描述，其包含在本文中作為參考。
本發明的配製劑也可含有需治療的具體病症所需的一種以上的活性化合物，較佳活性互補並且相互之間沒有副作用的那些。例如，抗高血壓的藥物、抗心律失常的藥物、治療糖尿病的藥物等。
本發明的纖溶酶原可包裹在藉由諸如凝聚技術或介面聚合而製備的微膠囊中，例如，可置入在膠質藥物傳送系統(例如，脂質體，白蛋白微球，微乳劑，奈米顆粒和奈米膠囊)中或置入粗滴乳狀液中的羥甲基纖維素或凝膠-微膠囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊中。這些技術公開於Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition,Osol,A.Ed.(1980)。
用於體內給藥的本發明的纖溶酶原必需是無菌的。這可以藉由在冷凍乾燥和重新配製之前或之後藉由除菌濾膜過濾而輕易實現。
本發明的纖溶酶原可製備緩釋製劑。緩釋製劑的適當實例包括具有一定形狀且含有糖蛋白的固體疏水聚合物半通透基質，例如膜或微膠囊。緩釋基質實例包括聚酯、水凝膠(如聚(2-羥基乙基-異丁烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15：167-277(1981)；Langer,Chem.Tech.,12：98-105(1982))或聚(乙烯醇)、聚交酯(美國專利3773919,EP 58,481)、L-谷氨酸與γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman，等，Biopolymers 22：547(1983))，不可降解的乙烯-乙烯乙酸酯(ethylene-vinyl acetate)(Langer，等，出處同上)，或可降解的乳酸-羥基乙酸共聚物如Lupron DepotTM(由乳酸-羥基乙酸共聚物和亮氨醯脯氨酸(leuprolide)乙酸酯組成的可注射的微球體)，以及聚D-(-)-3-羥丁酸。聚合物如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-羥基乙酸能持續釋放分子100天以上，而一些水凝膠釋放蛋白的時間卻較短。可以根據相關機理來設計使蛋白穩定的合理策略。例如，如果發現凝聚的機理是藉由硫代二硫鍵互換 而形成分子間S-S鍵，則可藉由修飾巰基殘基、從酸性溶液中凍乾、控制濕度、採用合適的添加劑、和開發特定的聚合物基質組合物來實現穩定。
4. 給藥和劑量
可以藉由不同方式，例如藉由靜脈內、腹膜內、皮下、顱內、鞘內、動脈內(例如經由頸動脈)、肌內、鼻內、眼內、表面或皮內施用或脊髓或腦投遞來實現本發明藥物組合物的施用。氣溶膠製劑如鼻噴霧製劑包含活性劑的純化的水性或其它溶液及防腐劑和等滲劑。眼內施用時需要將此類製劑調節至與眼結膜相容的pH和等滲狀態。
用於胃腸外施用的製備物包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液和乳劑。非水性溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄欖油，和可注射有機酯，如油酸乙酯。水性載體包括水、醇性/水性溶液、乳劑或懸浮液，包括鹽水和緩衝介質。胃腸外媒介物包含氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、或固定油。靜脈內媒介物包含液體和營養補充物、電解質補充物，等等。也可以存在防腐劑和其他添加劑，諸如例如，抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、和惰性氣體，等等。
醫務人員會基於各種臨床因素確定劑量方案。如醫學領域中公知的，任一患者的劑量取決於多種因素，包括患者的體型、體表面積、年齡、要施用的具體化合物、性別、施用次數和路徑、總體健康、和同時施用的其它藥物。本發明包含纖溶酶原的藥物組合物的劑量範圍可以為例如每天約0.0001至2000mg/kg，或約0.001至500mg/kg(例如0.02mg/kg，0.25mg/kg，0.5mg/kg，0.75mg/kg，10mg/kg，50mg/kg等等)受試者體重。例如，劑量可以是1mg/kg體重或50mg/kg體重或在1-50mg/kg的範圍，或至少1mg/kg。高於或低於此例示性範圍的劑量也涵蓋在內，特別是 考慮到上述的因素。上述範圍中的中間劑量也包含在本發明的範圍內。受試者可以每天、隔天、每週或根據藉由經驗分析確定的任何其它日程表施用此類劑量。例示性的劑量日程表包括連續幾天1-10mg/kg。在本發明的藥物施用過程中需要即時評估、定期評估糖尿病視網膜病變及其相關病症的治療效果和安全性。
5. 治療效力和治療安全性
本發明的一個實施例涉及使用纖溶酶原纖溶酶治療受試者後，對治療效力和治療安全性的判斷。其中對所述治療效力的判斷方法包括但不限於：1)受試者視力的矯正，使用本發明中的纖溶酶原對受試者進行治療後，預期患者的視力將得到恢復或改善，例如，預期患者視力、立體視覺、對比敏感度、暗適應、色覺及視野將得到恢復或改善；2)電生理檢查，包括例如視網膜電圖、眼電圖、視覺誘發電位等；3)眼底檢查包括直接、間接眼底鏡檢查、三面鏡下裂隙燈檢查、眼底螢光血管造影、OCT等；4)視神經檢查，包括對受試者神經病變、眼外肌麻痹、調節障礙及視神經萎縮等的檢查，預期受試者在接受本發明的纖溶酶原治療後，視神經功能將得到恢復或改善；5)屈光不正，血糖升高可引起房水滲透壓降低，房水滲入晶狀體內，晶狀體屈光度發生改變而成近視，當血糖降低時房水滲透壓升高，晶狀體內水分外滲，形成相對的遠視，預期受試者在接受本發明的纖溶酶原治療後，視神經功能將得到恢復或改善；6)眼壓檢查，預期受試者在接受本發明的纖溶酶原治療後眼壓恢復正常或得到改善，如在10~21mmHg間。此外，本發明還涉及使用纖溶酶原對受試者進行治療過程中和治療後，需要對藥物的不良反應進行監測和評估。
6. 製品或藥盒
本發明的一個實施例涉及一種製品或藥盒，其包含可用於治療由糖尿病引起的視網膜病變及其相關病症的本發明纖溶酶原。所述製品較佳包括一個容器，標籤或包裝插頁。適當的容器有瓶子，小瓶，注射器等。容器可由各種材料如玻璃或塑膠製成。所述容器含有組合物，所述組合物可有效治療本發明的疾病或病症並具有無菌入口(例如所述容器可為靜脈內溶液包或小瓶，其含有可被皮下注射針穿透的塞子的)。所述組合物中至少一種活性劑為纖溶酶原。所述容器上或所附的標籤說明所述組合物用於治療本發明所述由糖尿病引起的視網膜病變及其相關病症。所述製品可進一步包含含有可藥用緩衝液的第二容器，諸如磷酸鹽緩衝的鹽水，林格氏溶液以及葡萄糖溶液。其可進一步包含從商業和使用者角度來看所需的其它物質，包括其它緩衝液，稀釋劑，過濾物，針和注射器。此外，所述製品包含帶有使用說明的包裝插頁，包括例如指示所述組合物的使用者將纖溶酶原組合物以及治療伴隨的疾病的其它藥物給藥患者。
圖1顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續31天給藥纖溶酶原後體重變化。結果顯示纖溶酶原對動物體重影響不大。
圖2顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續31天給藥纖溶酶原後視網膜HE觀察結果。
圖3顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續31天給藥纖溶酶原後視網膜PAS染色觀察結果。
圖4顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續31天給藥纖溶酶原後視網膜VEGF免疫染色結果。
圖5顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續15天給藥纖溶酶原後血清中D-二聚體的含量檢測結果。
圖6顯示24-25周齡的糖尿病小鼠在連續31天給藥纖溶酶原後視網膜Bcl-2免疫染色結果。
圖7顯示24-25周齡的db/db小鼠在給藥纖溶酶原31天后血清心肌肌鈣蛋白I濃度檢測結果。
圖8顯示24-25周齡的db/db小鼠在連續31天給藥纖溶酶原後腎臟Bcl-2免疫染色觀察結果。
圖9顯示24-25周齡的db/db小鼠在連續31天給藥纖溶酶原後腎臟纖維蛋白免疫染色觀察結果。
圖10顯示24-25周糖尿病小鼠給予PBS(A)或纖溶酶原(B)31天后血清ALT檢測結果。
圖11顯示24-25周齡的db/db小鼠在連續31天給藥纖溶酶原後肝臟纖維蛋白免疫染色觀察結果。
圖12顯示24-25周齡的db/db小鼠在給藥纖溶酶原後第0、4、7、11、16天檢測機械觸誘發痛感應能力的結果。
圖13顯示24-25周齡的db/db小鼠在給藥纖溶酶原後第0、4、7、11、16天檢測冷刺激感應能力的結果。
圖14顯示24-25周糖尿病後期神經損傷小鼠纖溶酶原15天后坐骨神經纖維蛋白免疫組化染色觀察結果。
圖15顯示24-25周糖尿病小鼠給予纖溶酶原31天腎臟IgM免疫染色觀察結果。
1. 實驗動物：
使用C57BLKS來源的db/db糖尿病小鼠，以C57BLKS來源db/+雜合子小鼠作為正常對照，其購買于南京生物醫藥研究所。在db/db小鼠中10周齡以上血糖水準高於15mM的小鼠用於實驗，對照組用同齡的血糖水準低於7.8mM的db/+雜合子小鼠。動物飼養于符合國標的實驗動物使用環境。
2. 實驗設計：
入選小鼠隨機分為2組，即db/db模型組(模型組)和db/db纖溶酶原治療組(治療組)。入選的db/db小鼠在24-25周齡發生視網膜病變，其後開始藉由尾靜脈注射方式對其給予纖溶酶原，給藥劑量約為2mg/0.2mL/鼠/天，實驗週期31天，開始給予纖溶酶原的當天記為實驗第一天。給予纖溶酶原前一天和實驗後每週對所有組動物進行相關檢測。
3. 視網膜血管準備及其PAS染色和無細胞毛細血管計數：
參照文獻[22-24]報導，準備視網膜血管。具體流程如下：小鼠眼球摘除後立即用4%多聚甲醛PBS緩衝液中固定過夜。從眼球分離視網膜後在室溫條件下用水沖洗過夜，之後在37℃條件下用3%胰酶(Invitrogen，Grand Island，NY)消化2-3h。組織轉移到純淨水中，在解剖顯微鏡下從周圍附著組織上分離出視網膜血管，固定在乾淨的載玻片上，自然乾燥充分後在PAS溶液中染色，水沖洗後行脫水並封片。製備的視網膜血管在顯微鏡下觀察。PAS染色密度用Image-Pro Plus 6.0軟體進行分析。
隨機計數視網膜中部4-6視野中的無細胞毛細血管數量。無細胞核僅有毛細血管壁的毛細管稱為無細胞毛細血管[25]。資料用每10mm2中無細胞毛細血管數來表示。
4. 視網膜石蠟切片HE染色：
小鼠眼球摘取後在4%多聚甲醛PBS緩衝液中固定24-48小時，固定後的眼球經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。之後進行石蠟切片和HE染色，顯微鏡下觀察視網膜病變。
5. 視網膜VEGF、bcl-2、F4/80、纖維蛋白免疫組化染色 [22,26] ：
眼球進行常規石蠟切片，脫蠟複水後，切片高溫修復15min。雙氧水培養15分鐘。10%的正常羊血清液(Vectorlaboratories,Inc.,USA)封閉1小時，一抗4℃培養過夜，TBS沖洗，滴加二抗，室溫培養1小時，顯色。蘇木素複染、梯度脫水透明並封片，備觀察。每個眼球選取2張結構完整的視網膜切片，每張切片隨機選取5個視野，Image-Pro Plus 6.0影像處理軟體分析各組染色區的平均光密度值。
實施例1纖溶酶原對糖尿病小鼠體重的影響
24-25周齡db/db雄鼠20隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各10隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第0、4、7、11、16、21、26、31天分別稱體重。
結果顯示，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組在第0、4、7、11、16、21、26、31天體重無顯著差異(圖1)，說明纖溶酶原對動物體重影響不大。
實施例2纖溶酶原對糖尿病小鼠視網膜的保護作用
24-25周齡db/db雄鼠20隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各10隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶 原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天犧牲小鼠並取左側眼球在4%多聚甲醛中固定24小時。固定後的眼球經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水並用蘇木素和伊紅染色(HE染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水封片，切片在顯微鏡下400倍下觀察。
糖尿病視網膜病變中視網膜會發生萎縮，視網膜的外網層(outerplexiform layer，OPL)、外核層(outer nuclear layer，ONL)、感光層(photoreceptor layer，PL)以及整個視網膜變薄[27]。因此，以上四個厚度參數可以用來判斷視網膜損傷情況。
結果顯示，給溶媒PBS對照組小鼠視網膜內各層結構疏鬆，細胞排列不規則，視網膜節細胞和內核層細胞排列紊亂，視網膜色素上皮細胞增生(圖2之A部分)；給纖溶酶原組與給溶媒PBS對照組比較，視網膜內各層細胞排列整齊，並可觀察到視網膜OPL、ONL、PL的厚度以及總厚度在給纖溶酶原組中較厚(圖2之B部分)。說明注射纖溶酶原能夠促進糖尿病小鼠視網膜損傷的修復。
實施例3纖溶酶原改善糖尿病晚期小鼠視網膜的損傷
24-25周齡db/db雄鼠20隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各10隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天犧牲小鼠並取左側眼球在多聚甲醛固定液中固定24小時。固定後的眼球剝離出視網膜後，置於1mL 3%胰酶(Solarbio)的 EP管中，在搖床中37℃震盪消化2-3h。待視網膜出現軟化、脫落的現象後小心的將視網膜移入裝有蒸餾水的EP管中，於搖床中37℃震盪2-3h，使視網膜上多餘的組織脫落。輕柔的吹打視網膜，使其只剩血管層後在玻片上鋪片，自然風乾。視網膜於Schiff氏液染色(PAS染色)，1%鹽酸酒精分化，氨水返藍，並酒精梯度脫水二甲苯透明後封片，在顯微鏡下400倍下觀察。
相關研究顯示，糖尿病會引起視網膜病變，導致視網膜血管內皮細胞增生，周細胞丟失以及無細胞血管的形成[28,29]。
從實驗結果可以看出，與纖溶酶原組(圖3之B部分)相比，給溶媒PBS對照組(圖3之A部分)db/db鼠視網膜毛細血管管徑粗細不一，血管管壁增厚深染，血管內皮細胞(△)增生，周細胞(↓)明顯減少，而給纖溶酶原組病理改變明顯減輕；定量分析發現給纖溶酶原組與給溶媒PBS對照組相比無細胞血管長度(圖3之C部分)顯著減小，並且統計學分析結果顯示顯著差異。說明纖溶酶原能夠顯著促進糖尿病後期小鼠視網膜損傷的修復。
實施例4纖溶酶原促進糖尿病小鼠視網膜損傷的修復
24-25周齡db/db雄鼠20隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各10隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天取眼球在4%多聚甲醛中固定24小時，固定後的眼球經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水培養15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。10%的正常羊血清液封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液，用 PAP筆圈出組織。兔抗小鼠VEGF抗體(Abcam)4℃培養過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫培養1小時，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories，Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下400倍下觀察。
VEGF是血管內皮生長因數，在機體血管損傷的情況下其表達升高[30,31]。因此，VEGF的表達能夠反映血管損傷的情況。
結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖4之A部分)視網膜各層中VEGF的表達顯著高於給纖溶酶原組(圖4之B部分)，說明注射纖溶酶原抑制視網膜VEGF的表達，促進糖尿病小鼠視網膜損傷的修復。
實施例5纖溶酶原糖促進糖尿病造成的視網膜微血栓的溶解
24-25周齡db/db雄鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥15天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。最後一次給藥24小時後摘眼球取血，全血靜置後血清用於檢測血液中D-二聚體(D-dimer)含量。
結果顯示，給藥15天后，血清中D-二聚體的含量顯著上升(圖5)，說明給藥纖溶酶原後，由於糖尿病造成的視網膜微血栓顯著溶解。
實施例6纖溶酶原促進糖尿病小鼠視網膜凋亡抑制蛋白的表達
24-25周齡db/db雄鼠20隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各10隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶 原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天取眼球在4%多聚甲醛中固定24小時。固定後的眼球經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水培養15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。10%的正常羊血清液封閉1小時；之後棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠Bcl-2抗體(Abcam)4℃培養過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫培養1小時，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories，Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下400倍下觀察。
Bcl-2為細胞凋亡抑制蛋白，在凋亡刺激因數作用下會下調表達[32,33]。結果顯示，給溶媒PBS對照組(圖6之A部分)視網膜中Bcl-2的表達要顯著地低於給纖溶酶原組(圖6之B部分)。說明纖溶酶原促進糖尿病小鼠視網膜細胞凋亡抑制分子Bcl-2的表達，從而能夠抑制視網膜細胞的凋亡。
實施例7纖溶酶原促進糖尿病晚期心肌損傷的修復
24-25周齡db/db雄鼠28隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組12隻，給纖溶酶原組16隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。第32天摘除眼球取血，以3500r/min離心15-20分鐘，並取上清檢測進行心肌肌鈣蛋白I的濃度測定。
心肌肌鈣蛋白I(cardiac troponin,CTNI)是心肌損傷的重要標誌物，其血清濃度能夠反映心肌損傷的程度[34]。結果顯示，給纖溶酶原組心 肌肌鈣蛋白I的濃度要明顯的低於給溶媒PBS對照組，且具有極顯著的統計學差異(圖7)。說明纖溶酶原能夠極顯著促進糖尿病後期小鼠心肌損傷的修復。
實施例8纖溶酶原促進糖尿病晚期小鼠腎臟凋亡抑制因數Bcl-2的表達
24-25周齡db/db雄鼠20隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各10隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天犧牲小鼠並取腎臟在10%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的腎臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水培養15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。10%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠Bcl-2抗體(Abcam)4℃培養過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫培養1小時，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.，USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。
Bcl-2為細胞凋亡抑制蛋白，在凋亡刺激因數作用下會下調表達[32,33]。Bcl-2免疫組化結果顯示，給纖溶酶原組(圖8之B部分)腎小管上皮細胞陽性表達著色要明顯深於給溶媒PBS對照組(圖8之A部分)，且前者的著色範圍更廣。定量分析結果與觀察結果一致，且具有顯著差異(如圖8 之C部分)。這表明纖溶酶原促進糖尿病小鼠腎臟細胞凋亡抑制分子Bcl-2的表達，從而能夠抑制糖尿病小鼠腎臟組織細胞凋亡。
實施例9纖溶酶原促進糖尿病晚期小鼠腎臟纖維蛋白水解
24-25周齡db/db雄鼠20隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各10隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天犧牲小鼠並取腎臟在10%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的腎臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水培養15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。10%的正常羊血清液(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時；時間到後，棄除羊血清液，用PAP筆圈出組織。兔抗小鼠纖維蛋白(原)抗體(Abcam)4℃培養過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫培養1小時，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下200倍下觀察。
纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，在組織存在損傷的情況下，作為機體對損傷的一種應激反應，纖維蛋白原水解成纖維蛋白沉積在損傷部位[35-37]。因此，可將纖維蛋白水準作為損傷程度的一個標誌。
結果顯示，給纖溶酶原組(圖9之B部分)比給溶媒PBS對照組(圖9之A部分)纖維蛋白原陽性著色淺。說明注射纖溶酶原能夠降低糖尿病 小鼠沉積的纖維蛋白，反映出纖溶酶原對糖尿病小鼠的腎臟損傷的修復作用。
實施例10纖溶酶原促進糖尿病小鼠肝臟損的修復
25-28周齡db/db雄鼠9隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組3隻，給纖溶酶原組6隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。給纖溶酶原31天后摘眼球采全血，待血清析出後4℃ 3500r/min離心10分鐘，取上清液進行檢測。本實驗使用谷丙轉氨酶檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號C009-2)，運用賴氏比色法(Reitman-Frankel)檢測血清中谷丙轉氨酶(ALT)的含量。
谷丙轉氨酶是肝臟健康狀態的一個重要指標[38,39]，谷丙轉氨酶的正常參考值區間為9~50U/L。檢測結果顯示，給溶媒PBS對照組血清中ALT的含量顯著高於正常生理指標，而給纖溶酶原組已經恢復到了體內的正常水準，並且給纖溶酶原組顯著低於給溶媒PBS對照組，且具有統計學差異(圖10)。說明在糖尿病晚期模型小鼠中，注射纖溶酶原能有效地修復肝損傷。
實施例11纖溶酶原促進糖尿病晚期小鼠肝臟組織的炎症修復
24-25周齡db/db雄鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。給纖溶酶原31天后犧牲小鼠並取肝臟組織在10%中性福 馬林固定液中固定24小時。固定後的肝臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水培養15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。10%正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時，時間到後甩去血清，用PAP筆圈出組織。針對F4/80的兔多株抗體(Abcam)4℃培養過夜，TBS洗2次，每次5分鐘。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫培養1小時，TBS洗2次。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下400倍下觀察。
F4/80巨噬細胞標誌物，可以表示炎症反應的程度和階段。結果顯示，給纖溶酶原組(圖11之B部分)與給溶媒PBS對照組(圖11之A部分)相比，給纖溶酶原組小鼠的F4/80陽性表達明顯降低，說明給纖溶酶原後肝臟組織炎症減少。圖11之C部分為F4/80免疫組化陽性表達數定量分析結果，給纖溶酶原組F4/80表達量顯著減少，且具有統計學差異，說明纖溶酶原能夠顯著減輕糖尿病小鼠肝臟的炎症。
實施例12纖溶酶原促進糖尿病後期神經損傷小鼠對機械觸誘發痛感應能力的修復
24-25周齡db/db雄鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組並開始做生理實驗，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥15天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在給纖溶酶原後第0、4、7、11、16天用Von-Frey纖維絲(Stoelting，USA)檢測動物對機械性損傷的敏感程度。以 2.0g力為起始力，先檢測其左腳。若5次刺激有2次有縮爪反應即為陽性，若為陽性即用小一級的力再對其右腳進行刺激；若為陰性，則用大一級的力對其右腳進行刺激，如此左右腳交替刺激，刺激間隔為5分鐘，總共刺激6次，然後根據S.R.Chaplan et al.(1994)[40]介紹的方法計算其50%縮爪的閾值。
研究發現，與給溶媒PBS對照組相比，給纖溶酶原組的糖尿病小鼠機械觸誘發痛反應均一性增加，且在第16天檢測時發現與給溶媒PBS對照組相比出現了極顯著差異(圖12)，說明纖溶酶原修復了神經損傷晚期的糖尿病小鼠對機械觸誘發痛(mechanical allodynia)的感應能力。
實施例13纖溶酶原對糖尿病後期神經損傷小鼠冷刺激感應的修復
24-25周齡db/db雄鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組並開始做生理實驗，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥15天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在給藥後第0、4、7、11、16天用去針頭注射器擠出一滴丙酮液珠並輕觸db/db鼠足底，使其覆蓋整個足底。從左腳開始，每隔3分鐘輪流刺激其左右腳，共刺激10次，並統計縮爪反應次數。反應百分比=縮爪次數/刺激次數計100%。
實驗結果顯示，在第0和第4天時，給纖溶酶原組和給溶媒PBS對照組對丙酮刺激並無顯著差異，而第7天開始觀察到顯著差異，在第16天則觀察到極顯著差異，P值<0.0001(圖13)，說明給藥15天后，糖尿病小鼠幾乎完全恢復了對冷刺激的反應，表明了纖溶酶原極顯著地修復了糖尿病後期的神經對冷刺激感應能力。
實施例14纖溶酶原減少糖尿病後期神經損傷小鼠神經組織纖維蛋白水準
24-25周齡db/db雄鼠10隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各5隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥15天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第16天犧牲小鼠並取坐骨神經在10%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的坐骨神經經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次，然後用PAP筆圈出組織。以3%TBS稀釋的雙氧水培養15分鐘，水洗3次。10%正常羊血清(Vector laboratories,Inc.,USA)封閉1小時，吸走多餘血清。兔抗小鼠纖維蛋白(原)抗體(Abcam)室溫培養1小時或4℃培養過夜，TBS洗3次。山羊抗兔IgG(HRP)抗體(Abcam)二抗室溫培養1小時，TBS洗3次。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下400倍下觀察。
纖維蛋白原是纖維蛋白的前體，在組織存在損傷的情況下，作為機體對損傷的一種應激反應，纖維蛋白原水解成纖維蛋白，因此可將纖維蛋白水準作為損傷程度的一個標誌[35-37]。纖維蛋白也是組織損傷後形成血栓的主要成分，因此，也可將纖維蛋白水準作為血栓的一個標誌。
研究發現，與給溶媒PBS對照組(圖14之A部分)相比，給纖溶酶原組(圖14之B部分)的小鼠其坐骨神經纖維蛋白的水準降低，說明纖溶 酶原具有降解纖維蛋白水準的功能，損傷得到一定程度的修復，也說明纖溶酶原能夠促進神經組織周圍血栓的溶解。
實施例15纖溶酶原減輕糖尿病晚期小鼠腎臟的損傷
24-25周齡db/db雄鼠8隻，隨機分為兩組，給溶媒PBS對照組和給纖溶酶原組，每組各4隻。實驗開始當天記為第0天稱重分組，實驗第二天開始給纖溶酶原或PBS並記為第1天，連續給藥31天。給纖溶酶原組小鼠按2mg/0.2mL/隻/天尾靜脈注射纖溶酶原，給溶媒PBS對照組給予相同體積的PBS。在第32天檢測生理指標結束，犧牲小鼠並取腎臟在10%中性福馬林固定液中固定24小時。固定後的腎臟組織經酒精梯度脫水和二甲苯透明後進行石蠟包埋。組織切片厚度為5μm，切片脫蠟複水後水洗1次。以3%雙氧水培養15分鐘，水洗2次，每次5分鐘。山羊抗鼠IgM(HRP)抗體(Abcam)室溫培養1小時，TBS洗2次，每次5分鐘。按DAB試劑盒(Vector laboratories,Inc.,USA)顯色，水洗3次後蘇木素複染30秒，流水沖洗5分鐘。梯度脫水透明並封片，切片在顯微鏡下400倍下觀察。
IgM抗體在清除凋亡和壞死細胞過程中發揮著重要作用，細胞的凋亡和壞死細胞越多，局部IgM抗體水準越高[41-43]。因此，局部IgM抗體水準能夠反映組織器官的損傷情況。
結果顯示，給纖溶酶原組(圖15之B部分)小鼠腎小球IgM的陽性著色淺於給溶媒PBS對照組(圖15之A部分)，並且範圍也較對照組小，統計分析結果與觀察結果一致(圖15之C部分)，這表明注射纖溶酶原後腎小球的損傷明顯的改善，反映出纖溶酶原對糖尿病小鼠的機體損傷有顯著保護和修復功能。
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<210> 1
<211> 2376
<212> DNA
<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)核酸序列
<400> 1
<210> 2
<211> 791
<212> PRT
<213> 不含有信號肽的天然纖溶酶原(Glu-PLG，Glu-纖維蛋白溶酶原)胺基酸序列
<400> 2
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> 含有信號肽的天然纖溶酶原(來源於swiss prot)的胺基酸序列
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<212> PRT
<213> 絲氨酸蛋白酶(結構)域的胺基酸序列
<400> 14

Claims (12)

  1. 一種纖溶酶原在製備預防或治療受試者糖尿病引起的視網膜病變之藥劑上的用途，其中該纖溶酶原係為與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之用途，其中該視網膜病變包括糖尿病引發的視網膜新生血管的形成、視網膜炎症、視網膜萎縮、視網膜細胞凋亡、視網膜組織結構損傷。
  3. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該纖溶酶原係為包含序列2、6、8、10或12所示之蛋白質。
  4. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。
  5. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ(delta)-纖溶酶原或其任意組合。
  6. 如申請專利範圍第1項或第2項所述之用途，其中該藥劑係藉由將該纖溶酶原與可選的藥用載體、賦形劑、或穩定劑混合形成。
  7. 一種包含纖溶酶原用於預防或治療受試者糖尿病引起的視網膜病變之藥劑，其中該纖溶酶原係為與序列2、6、8、10或12具有至少80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%序列同一性，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。
  8. 如申請專利範圍第7項所述之藥劑，其中該視網膜病變包括糖尿病引發的視網膜新生血管的形成、視網膜炎症、視網膜萎縮、視網膜細胞凋亡、視網膜組織結構損傷。
  9. 如申請專利範圍第7項或第8項所述之藥劑，其中該纖溶酶原係為序列2、6、8、10或12所示之蛋白質。
  10. 如申請專利範圍第7項或第8項所述之藥劑，其中該纖溶酶原是包含纖溶酶原活性片段，並且仍然具有纖維蛋白溶酶原活性的蛋白質。
  11. 如申請專利範圍第7項或第8項所述之藥劑，其中該纖溶酶原選自Glu-纖維蛋白溶酶原、Lys-纖維蛋白溶酶原、小纖維蛋白溶酶原、微纖維蛋白溶酶原、δ(delta)-纖溶酶原或其任意組合。
  12. 如申請專利範圍第7項或第8項所述之藥劑，其中該藥劑係藉由將該纖溶酶原與可選的藥用載體、賦形劑、或穩定劑混合形成。
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