CN100529085C - 重组人纤溶酶原Kringle 5(hk5)生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种优化的适合酵母表达的重组人纤溶酶原Kringle 5片段(hK5)的编码序列，高效生产rhK5的方法，以及有关的工程细胞的构建、rhK5的表达和纯化的工艺。优化后的纤溶酶原Kringle 5基因非常适合酵母表达(尤其是多拷贝表达)，具有高表达、高稳定、高分泌的特点。本发明可高效、简便、低成本地获得rhK5纯品。

Description

重组人纤溶酶原Kringle 5(hK5)生产方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种重组人纤溶酶原hK5(HumanPlasminogen  Kringle 5)的生产方法，以及用于该方法的表达载体和宿主菌株。

背景技术

肿瘤是一类常见病和多发病，对人类的生命和健康威胁很大。全世界每年约有500万人死于肿瘤。在有些国家，肿瘤已占据死亡原因的第二位，甚至第一位。

恶性肿瘤细胞，包括癌和肉瘤的细胞，通称为癌细胞。癌细胞是从相应正常组织的细胞转变而来，它既不同于正常细胞，又不同程度地保持着来源组织细胞的某些固有特征。对大多数恶性肿瘤，很容易错过早期发现的机会，可以作出临床诊断时，癌细胞往往已经经历了10-30次倍增，细胞数达到百亿甚至千亿，重10-100g，直径22-47mm。当到达40次倍增时，已发展到万亿个癌细胞，重约1kg，直径100mm；而正常成年人大约有50万亿个细胞(5×10¹³)，此时的癌足以使宿主致死。

五十多年来，在肿瘤治疗领域占主导地位的是直接策略，即所选择的靶目标是肿瘤细胞本身。体外能够杀死肿瘤细胞的细胞毒药物被用作体内化疗侯选药物。直到现在，癌症病人仍主要依赖手术或放疗来切除肿瘤或使原发瘤消退，再紧接着进行放化疗，以消除体内残留的癌细胞。然而，正常细胞也对化疗药物敏感，而且癌细胞的遗传不稳定，经常暴露于化疗下最终导致抗药性。肿瘤治疗的另一方法是间接策略，即抗血管生成治疗，它不直接破坏肿瘤，而是通过限制肿瘤的血液供给，使肿瘤阻止肿瘤生长或使其消退。应用这一策略，肿瘤学家的注意力就不仅仅局限于单独的肿瘤细胞本身，而是总体肿瘤组织，尤其是血管生成过程。基于这种概念，人们采用新方法来寻找新型抗癌药物。

70年代Folkman提出肿瘤是一个涉及肿瘤细胞和内皮细胞交叉旁相互作用的生态系统，血管生成对肿瘤从小的细胞簇转化为大的恶性肿瘤，以及肿瘤的转移都很关键。通过抑制新生血管形成，肿瘤可能会由此产生“饥饿”而导致死亡。在1989年，第一次开始抗血管生成药物的临床试验-将IFN-α用于治疗婴幼儿血管瘤。目前已发现Angiostatin、K5、endostatin、vasostatin、VEGF单克隆抗体等都能抑制或完全阻断小鼠肿瘤的生长。许多抗血管生成试剂，如Marimastat、Primostat、Neovastat、Bay-12-9566m、IFN-α、SU101、retinoids、IM862都已进入或正进行III期临床试验，而MMPs抑制剂、VEGF/R抑制剂、Endostatin、somatostatin结构类似物、COX-2抑制剂等也在临床或基础研究中取得令人振奋的结果。

纤溶酶原含有5个Kringle结构域，其蛋白水解片段显示具有抗血管增生的活性。纤溶酶原Kringle5(K5)能抑制内皮细胞增生，且其活性比血管抑素即(Kringle1～4，angiostatin更强)。而且，K5也抑制内皮细胞迁移。而内皮细胞迁移在血管生成过程中是一个很重要的过程。近期发现，K5能抑制视网膜血管增生，可能具有潜在的治疗糖尿病性视网膜病(早产儿视网膜病和年龄相关性黄斑变性等疾病的价值。K5通过诱导细胞周期停滞而发挥作用，具有高效、高细胞选择性以及短的氨基酸序列的特点，因此具有治疗血管增生性疾病的潜在临床应用价值。

与传统的抗肿瘤化疗药物比较，K5属于抗血管生成疗法，不产生耐药性。研究发现，对BCE细胞的半数致死浓度(ED₅₀)约为50-60nM，远远低于angiostatin的140nM。因此，K5似乎比angiostatin更能抑制bFGF刺激的BCE细胞生长。用大肠杆菌表达正确折叠的重组鼠K5，抑制活性与水解片段得到的人K5相似。在内皮细胞迁移方面，重组K5蛋白同样具有抑制作用，其IC50约为500nM。K5的发现，可更好地了解Pgn的联环区在抑制内皮细胞增生方面的作用。活性测定表明，hK5可显著抑制内皮细胞增殖和新生血管形成。更加令人振奋的是，酵母表达的重组hK5在小鼠体内表现了良好的抗肿瘤活性。

目前国内外多采用大肠杆菌表达hK5，表达产物或是没有活性，需要复杂的变复性工艺才能获得纯品；或是表达量低，不适合产业化。而本发明通过在体外构建携带多拷贝表达盒的重组质粒(该重组质粒含有一种甲醇诱导启动子)，筛选多基因位点整合多拷贝表达盒的工程菌，并通过发酵工艺的改进，同时简便纯化工艺，获得高表达、高得率、极具产业化价值的一种hK5生产方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高效和/或简便/安全的生产hK5的方法。

本发明的另一目的是提供用于该方法的表达载体、宿主细胞和相关序列。

在本发明的第一方面，提供了一种编码人纤溶酶原Kringle 5的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，而且所述核苷酸序列的纤溶酶原Kringle 5编码区与SEQ ID NO：1所示核苷酸序列有95％以上(更佳地98％以上)以上相同性。

在另一优选例中，所述的核苷酸序列(包括DNA)选自下组：

(a)具有SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

(b)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和位于上游的α因子信号肽编码序列构成的核苷酸。

在本发明的第二方面，提供了一种表达载体，它含有本发明上述的编码人纤溶酶原Kringle 5的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述的表达载体是pPIC9K/8α-K5。

在另一优选例中，所述的表达载体携带2-8个表达人纤溶酶原Kringle 5的表达盒，且在所述载体的BamHI/BglII位点插入了人纤溶酶原hK5的编码序列。

在本发明的第三方面，提供了一种工程细胞，它是通过上述的表达载体或本发明上述的序列转化宿主细胞后同源重组而得的，且染色体中整合有人纤溶酶原Kringle 5编码序列。

在另一优选例中，所述的工程细胞是毕赤酵母(Pichia Pastoris)。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母细胞的染色体中整合有2-40个拷贝的人纤溶酶原hK5的编码序列，并且在在甲醇诱导下表达人纤溶酶原hK5。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母的hrK5的表达水平大于或等于500mg/L发酵液，较佳地大于或等于800mg/L发酵液，更佳地大于或等于1000mg/L发酵液。

在本发明的第四方面，提供了一种生产人纤溶酶原Kringle 5的方法，它包括以下步骤：

(a)在适合表达条件下，培养上述的工程细胞，从而分泌表达人纤溶酶原Kringle 5，所述的工程细胞是毕赤酵母；

(b)分离纯化出表达的人纤溶酶原Kringle 5。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母细胞的基因组中整合有2-40拷贝的人纤溶酶原Kringle 5编码序列。

在另一优选例中，所述的毕赤酵母工程细胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。

在另一优选例中，步骤(a)中的培养条件包括：

培养分为培养阶段和诱导阶段，培养阶段培养菌液浓度达到OD₆₀₀为40-200，诱导期时间为24-120hr，发酵及诱导温度保持在28-30℃，微量元素PTM₁量为1-20ml/L，诱导期的pH值为3-9，诱导期甲醇浓度控制在0.5-5％。

在另一优选例中，在培养时还添加添加0.1-5wt％(更佳地1-3％)蛋白胨作为保护剂。

在另一优选例中，步骤(b)的分离条件包括：

(i)对发酵样品通过离心和/或过滤去除菌体，获得发酵上清液；

(ii)通过盐析和/或超滤对发酵上清进行浓缩，获得浓缩液；

(iii)对浓缩液进行层析纯化，所述的层析纯化选自：阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、及其组合，从而获得纯度达到95-99.9％的纯品。

在另一优选例中，提供了一种生产重组人纤溶酶原hK5的方法，该方法包括步骤：

(i)在胞外构建携带多拷贝表达盒的重组质粒；

(ii)在适合的条件下，转染毕赤酵母，使毕赤酵母细胞的基因整合多拷贝人纤溶酶原hK5的编码序列，且在更适合的条件下，工程菌的多个基因位点内均整合多拷贝人纤溶酶原hK5的编码序列；

(iii)在适合的培养条件下，培养毕赤酵母工程细胞，该工程细胞的基因整合有多拷贝的纤溶酶原hK5编码序列，添加诱导剂甲醇后，能大量表达出人纤溶酶原hK5；

(iv)分离纯化出步骤(c)中表达的hK5。

附图说明

图1是本发明α-K5融合基因的获得示意图。图中用PCR的方法分别获得酿酒酵母α-因子前导肽序列与K5基因，同时引入特定的酶切位点(XhoI与EcoRI)，用XhoI消化酶分别消化，连接，以连接液为模板用一对引物PCR扩增，从而获得α-K5融合基因。

图2是单拷贝重组质粒pPIC9K/α-K5的构建示意图。图中采用EcoRI消化pPIC9K质粒与α-K5融合基因，连接，构建插入方向正确的重组质粒pPIC9K/α-K5。

图3是斑点杂交检测高抗性工程菌的hK5基因拷贝数。以K5基因作探针进行点杂交实验，图中1为高抗性筛选获得的工程菌基因组DNA的杂交结果，2为低抗性工程菌基因组DNA的杂交结果，3为毕赤酵母宿主细胞GS115基因组DNA的杂交结果，4为pPIC9K/8α-K5质粒DNA的杂交结果。结果表明，高抗性筛选得到的阳性克隆具有较高的K5基因拷贝数，而毕赤酵母宿主细胞毕赤酵母宿主细胞GS115(阴性对照)则未检测到K5基因。

图4是hK5的生物活性检测结果，即对Ecv304人脐静脉内皮细胞的抑制结果(×100)。其中：

A：用PBS处理的对照细胞；

B：用0.2μg/孔的hK5处理的细胞；

C：用5μg/孔的hK5处理的细胞；

D：用20μg/孔的hK5处理的细胞。

图5是hK5对Vero、OB、KMB17细胞的作用结果，其中：

A.用PBS处理的Vero细胞；

B.用20μg/孔的hK5处理的Vero细胞；

C.用OB处理的OB细胞；

D.用20μg/孔的hK5处理的OB细胞；

E.用PBS处理的KMB17细胞；

F.用20μg/孔的hK5处理的KMB17细胞。

具体实施方式

本发明人通过深入而广泛的研究，发现现有的生产技术中人纤溶酶原Kringle 5的表达量低的主要原因之一是基因序列未经优化。本发明人通过基因编码序列的优化设计，将优化后的人纤溶酶原Kringle 5编码序列(SEQ ID NO：1)转入甲醇利用型毕赤酵母(P.pastoris)，从而实现了rhK5的高水平分泌表达rhK5，在此基础上完成了本发明。

在另一优选例中，本发明人还在胞外构建了携带多拷贝表达盒的重组质粒，该表达载体有助于进一步提高hK5表达产物。

在另一优选例中，还通过优化发酵工艺，不仅提高了hK5表达量，而且简化了分离纯化工艺，在此基础上完成了本发明。

本发明提供了一种优化的，特别适合在酵母细胞中表达的人rhK5编码序列。该序列是根据毕赤酵母密码子偏爱性等原则而设计出的。设计出的rhK5的编码序列用常规方法进行全基因合成，或在通过PCR方法获得的cDNA上进行点突变。

在优化基因的5′端与3′端分别引进特异性酶切位点，用分子克隆的常规方法，将优化基因克隆入表达载体(如pPIC9、pPIC9K等)。然后，转化、整合入P.pastoris宿主细胞染色体，利用常规方法(如G418抗性或Southern印迹法)选出高拷贝转化株，摇瓶表达选出高表达工程细胞。工程细胞可以是快速利用甲醇型(Mut⁺)或慢速利用甲醇型(Mut^s)。

整合入毕赤酵母染色体(或基因组)中的rhK5编码序列的拷贝数没有特别限制，可以为1-50个或更高，通常为2-40个，较佳地为3-30。

在获得工程细胞后，便可在适合的条件下培养工程细胞。凡适合于毕赤酵母生长、表达的培养基都可用于本发明。

hK5氨基酸序列是已知的，如SEQ ID NO：2所示，编码一个全长98个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：2)。

本发明的hK5的编码序列，是根据文献报道的hK5 cDNA序列，依据酵母遗传密码偏爱性进行优化，然后进行全基因合成。

适用于本发明的载体为表达质粒pPIC9K/8α-K5。

适用于本发明的宿主菌是P.pastoris。

通常，在hK5编码序列的5’端与3’端引入特异性酶切位点，与酿酒酵母α-因子前导肽序列以正确的框架进行融合，然后克隆入质粒pPIC9K，构建多拷贝表达盒的重组质粒，转化毕赤酵母宿主菌如P.pastoris GS115，加压筛选，以获得多基因位点插入多拷贝表达盒。通常筛选出的阳性菌株使之生长在加压因子浓度递增的培养平板上。挑选抗性最强的菌株，确定为工程菌。本发明的工程菌属于甲醇诱导型表达菌株。

在发酵表达hK5后，对表达的hK5进行分离。

表达的rhK5存在于培液上清，表达水平占发酵液上清总蛋白50％以上，使纯化复杂度大大下降。通常，发酵样品先以离心、过滤等方式获得发酵液上清，去除菌体。发酵液上清可通过盐析、超滤等方法进行初步纯化后再进行层析纯化，也可直接进行层析纯化。

适用于本发明的层析技术包括阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析等。

(a)凝胶过滤层析：样品超滤浓缩后，可以用凝胶过滤层析去盐及纯化。

(b)离子交换层析(阳离子交换层析、阴离子交换层析)：

样品的缓冲系统以稀释、超滤、沉淀后复溶、透稀或凝胶过滤层析等手段进行更换，直至与对应的离子交换柱平衡液系统相似，且电导水平与缓冲液的电导水平接近，直接上样，盐浓度梯度或pH梯度梯度洗脱。

(c)亲和层析：

选择肝素亲和凝胶介质，盐梯度或肝素梯度洗脱。

经过2-3步纯化，可得到hK5纯品，纯化得率30％以上，纯度95％以上，纯品得率约1.5g/L发酵上清液。

纯化后的hGH可用常规方法制成各种剂型，如冻干粉针剂。选择一定的稳定剂，同时还可添加表面活性剂、抗氧化剂等保护剂，及适当缓冲液进行冷冻干燥。得到的制品具有活性损失小、水分含量低、稳定性好、易于长期保存等特点。

rhK5还可做成水针剂、喷雾剂、微球缓释剂，以及经PEG修饰制成长效制剂等。

在本发明的一个实例中，在体外构建了携带多拷贝表达盒的重组质粒，同时构建高效、稳定表达的hK5工程菌(毕赤酵母)。经发酵培养，甲醇诱导，hK5以可溶形式分泌到发酵液上清；表达水平高，占总蛋白70％左右，表达量达5g/L发酵上清液。由于表达水平较高，hK5又具有天然活性，避免了复杂的复性过程，通过简便、快速的二步纯化方法，即获得高质量的hK5纯品，每升发酵液可得hK5纯品1.5g，产品纯度95％以上。

在本发明的另一个实例中，用上述携带多拷贝表达盒的重组质粒构建的高效、稳定表达的hK5工程菌(毕赤酵母)，与含天然K5序列的重组质粒构建的构建的高效、稳定表达的hK5工程菌(毕赤酵母)表达量进行比较，通过比较，表明在相同表达条件下，优化序列有助于K5表达量的显著提高。

纯化后原液加入适当辅料，制成hK5的注射用粉针剂。

中试研究表明，产品制造工艺稳定，操作简单，周期短，成本低，每升发酵上清液可获得hK5纯品1.5g，采用300升(或者3个100升)发酵罐，每批可生产300g。适合产业化生产。

本发明的优点在于：

(1)表达工艺简单，表达载体含有甲醇诱导的启动子，被甲醇诱导后能高效分泌表达人纤溶酶原hK5，有利于规模化生产。

(2)表达量高。

a.根据酵母遗传密码偏爱性对K5序列进行了优化，提高了K5在酵母中的表达量。

b.通过胞外构建多拷贝表达盒的重组质粒，一次同源重组事件可以实现多个表达盒在多个染色体位点上定位整合，结合加压因子抗性筛选高拷贝的转化子，从而获得具有多基因位点高拷贝的外源基因表达盒重组的毕赤酵母工程菌株。

c.同时控制关键的发酵工艺条件，连续发酵培养使表达产量大大高于目前报道的采用毕赤酵母的表达产量。

(3)纯化工艺简便，回收率高。由于是分泌可溶蛋白，不是以包涵体形式表达，因此简化了纯化工序，使纯化回收率大大提高，使大规模生产hK5成为可能。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验指南(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)；Jan-Christer Janson等人，Proteinpurification(John Wiley & Sonss，Inc.，1998)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

hK5分泌表达系统的构建

1.α-K5融合基因的获得

根据天然人纤溶酶原Kringle 5的氨基酸序列，按毕赤酵母密码子偏爱性等原则，设计目的基因并全基因合成，其序列如SEQ ID NO：1所示的DNA片段。插入pThioHisA(购自Invitrogen公司)的EcoRI位点，构建得到含有hK5编码序列的质粒pThioHisA-hK5。以质粒pThioHisA-hK5为模板，用以下引物进行PCR扩增：

Primer2a：5’-CCGCTCGAGAAAAGAGTTTTGTTGCCAGACGTTG-3’(SEQ ID NO：4)

Primer2b：5’-CGGAATTCCTGCAGTTAGAAAGAAGGAGCAGCACAT-3’(SEQ ID NO：5)

从而得到与酿酒酵母α-因子前导肽序列以正确的框架进行融合的K5基因。

同时，以含有酿酒酵母α-因子前导肽编码序列的质粒pPIC9K(购自Invitrogen公司)为模板，PCR扩增得到α-因子前导肽序列。所用的引物是：

Primer2c：5’-CGGAATTCATCCAAACGATGAGATTTC(SEQ ID NO：6)

Primer2d：5’-CCGCTCGAGAGATACCCCTTCTTC-3’(SEQ ID NO：7)

把纯化后的上述两种PCR产物分别用限制酶XhoI进行消化，对两种酶切产物进行连接。以连接产物为模板进行PCR扩增，得到可用于分泌表达的融合基因α-K5。

2.多拷贝表达盒表达质粒的构建

将α-K5融合基因经EcoRI单酶切，克隆入同样酶切的质粒pPIC9K(见图2)，酶切鉴定，测序。用BamHI+BglII双酶切重组质粒pPIC9K-α-K5，回收小片段(1851bp，对应α-K5表达盒)，插入BamHI单酶切的pPIC9K-α-K5重组质粒，酶切鉴定，选出正向重组子，得到携带同向排列的2拷贝表达盒的重组质粒pPIC9K-2α-K5。以此类推，从pPIC9K-2α-K5出发构建携带4拷贝表达盒的重组质粒pPIC9K-4α-K5，再从pPIC9K-4α-K5出发构建携带8拷贝表达盒的质粒pPIC9K-8α-K5。

酶切鉴定表明，分别获得了插入方向正确且具有单拷贝表达盒的重组质粒pPIC9K-α-K5，携带同向排列的2拷贝表达盒的重组质粒、pPIC9K-2α-K5，携带同向排列的4拷贝表达盒的重组质粒pPIC9K-4α-K5，携带8拷贝表达盒的质粒pPIC9K-8α-K5。

实施例2

重组质粒的转化

将构建好的重组质粒pPIC9K-α-K5、pPIC9K-2α-K5、pPIC9K-4α-K5、pPIC9K-8α-K5分别用SalI酶切线性化，转化感受态常规的毕赤酵母GS115(购自Invitrogen公司)细胞涂布MD平板后72小时，取最大的菌落接种到含0.25mg/ml的G418的YPD平板上，30℃培养48小时，然后将在平板上长出的菌落用2.0mg/mlG418的YPD平板筛选获得高抗性工程菌。得到一批高抗性工程株，在试管中表达筛选获得多个高效表达株。

试验结果：pPIC9K-α-K5、pPIC9K-2α-K5、pPIC9K-4α-K5三个转化组分别获得了能在0.25mg/mlG418的YPD平板上生长的数个克隆，pPIC9K-8α-K5转化组获得了能在2mg/mlG418的YPD平板上生长的数个克隆。

对获得的工程菌中进行鉴定，表明这些毕赤酵母工程菌中含有2-30个拷贝的rhK5。

实施例3

高表达工程菌的获得

分别抽提实施例2中不同抗性工程菌的基因组DNA，并制备hK5基因探针，斑点杂交(Dot Blot)实验检测hK5的整合拷贝数，筛选高拷贝数的阳性克隆。

试验结果：

pPIC9K-8α-K5转化组的高抗性工程菌具有较高外源基因拷贝数(30拷贝以上)，从而获得了具有高拷贝hK5基因的工程菌，而pPIC9K-α-K5、pPIC9K-2α-K5、pPIC9K-4α-K5三个转化组的克隆拷贝数相对较低。

不同抗性工程菌做小摇表达检测：接种单克隆工程菌入YPD培养基中，甲醇诱导48小时后取上清检测，比较不同抗性工程菌的基因表达水平。

试验结果：

pPIC9K-8α-K5转化组获得的具有高拷贝hK5基因的工程菌表达量最高，分泌至培养基中的hK5蛋白浓度超过500mg/L发酵上清液，与其它三组低拷贝的工程菌相比，表达量高出5倍以上。这说明本发明所采用的高拷贝构建策略是成功的和必要的，通过提高拷贝数可以进一步实现hK5的高表达。

实施例4

优化序列对K5表达的影响

重复实施例1的步骤，不同点仅在于使用天然的人K5核苷酸编码序列替换实施例1中密码子经过优化的K5编码序列，从而构建了pPIC9K/8α-K5-N，该表达载体含有天然的人K5序列。

分别接种pPIC9K-8α-K5和pPIC9K-8α-K5-N的单克隆进行小摇表达实验，分别加甲醇诱导后，两种样品每隔12hr取100ml发酵液离心，-20℃冻存，诱导48hr结束。样品检测SDS-PAGE(并扫描)、蛋白含量。

实验结果(见下表)表明在相同培养时间时，pPIC9K-8α-K5菌株的表达明显高于pPIC9K-8α-K5-N菌株。因此，通过本次实验，决定采用pPIC9K-8α-K5菌株。

实施例5

不同启动子对K5表达的影响

用类似的方法构建了pGAPA/8α-K5，该表达载体含有组成型表达启动子(pGAP启动子为GAP)。分别接种pPIC9K-8α-K5和pGAPA/8α-K5的单克隆进行小摇表达实验，在pPIC9K-8α-K5的菌液中加甲醇诱导后，两种样品每隔12hr取100ml发酵液离心，-20℃冻存，诱导48hr结束。样品检测SDS-PAGE(并扫描)、蛋白含量。

实验结果(见下表)表明在相同培养时间时，pPIC9K-8α-K5菌株的表达明显高于pGAPA/8α-K5菌株。因此，通过本次实验，决定采用pPIC9K-8α-K5菌株。

实施例6

发酵阶段添加不同蛋白保护剂对表达水平的影响

准备3个发酵罐。取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1∶10的比例二级接种于250ml BMGY的1L三角烧瓶中，培养4～8hr左右，接种上罐进行发酵，控制pH 5.0、温度30℃、DO＞35％，待溶氧上升后流加50％甘油。待甘油耗尽，溶氧再次上升后用100％甲醇诱导。再将浓度为10％的CA、蛋白胨和Tryptone各300ml流加入罐(5L发酵罐，发酵上清3L)，维持溶氧在35％～70％之间。诱导36小时后结束，收集发酵上清。样品检测SDS-PAGE和蛋白含量。

实验结果：

发酵罐编号	实验条件	表达水平(％)
			1	CA	35.3
2	蛋白胨	65.1
			3	Tryptone	48.6
4	不添加任何蛋白保护剂	30.5

实施例7

发酵阶段不同蛋白胨量对表达水平的影响

取单克隆，接种到BMGY一级种子液中，培养17-20hr；按1∶10的比例二级接种于250ml BMGY的1L三角烧瓶中，培养4～8hr左右，接种上罐进行发酵，控制pH 5.0、温度30℃、DO＞35％，待溶氧上升后流加50％甘油。待甘油耗尽，溶氧再次上升后用100％甲醇诱导。同时取不同体积10％的蛋白胨流加入5L发酵罐(发酵上清3L)，维持溶氧在35％～70％之间。诱导36小时后结束，收集发酵上清。样品检测SDS-PAGE和蛋白含量。

实验结果：

发酵罐编号	蛋白胨加入量(ml)	蛋白胨终浓度(％)	表达水平(％)
				1	30	0.1	53.1
2	150	0.5	59.2
				3	300	1	65.8
4	600	2	68.3
				5	900	3	64.2
6	1200	4	60.2
				7	1500	5	58.7

试验结果表明，蛋白胨的最佳浓度为1％-3％。

实施例8

hK5的纯化

1.对发酵液进行超滤浓缩，将发酵液的缓冲体系替换为磷酸盐溶液PB。

2.超滤浓缩及更换缓冲液：使用Millipore超滤器，超滤膜截流分子量为1KD，超滤时留取浓缩液(作用是去除小分子杂质和盐类)。发酵液上清超滤至体积剩下500ml左右，加入PB，继续超滤；反复此程序，直至样品的电导水平和PB缓冲液的电导水平接近。

3.层析1(阴离子交换层析)：

层析介质：DEAE Sepharose FF

缓冲液：溶液A：PB

溶液B：PB+1M NaCl

上样：将超滤浓缩的hK5溶液上样。

清洗：上样后用6CV的溶液A清洗层析柱。

梯度：清洗后用10CV将溶液B从0％升至100％。

收集：收集hK5样品峰。

4.层析2(疏水层析)：

层析介质：phenyl Sepharose FF

缓冲液：溶液A：PB+1M NaCl

溶液B：PB

上样：将层析1的样品峰上样。

清洗：上样后用6CV的溶液A 清洗层析柱。

梯度：清洗后用10CV将溶液B从0％升至100％。

收集：收集hK5样品峰。

5.层析3(分子筛层析)：

层析介质：Sephadex 75

缓冲液：PB

上样：层析1收集的样品主分。

样品经过此三步纯化，即超滤、阴离子交换层析、分子筛层析以后，纯度提高至95％以上。

实施例9

hK5的生物活性检测

取对数生长期的常规的Ecv304人脐静脉内皮细胞，以1.6×10⁵细胞/ml接种100μl于96孔板中，培养条件为M199培养基加10％新生牛血清，37℃，5％CO₂。约24h后，用含5％新生牛血清的M199培养基更换旧培养基，同时加入不同浓度的重组EhK5或YhK5，37℃ 5％CO₂培养48小时，加20ulMTT(5mg/ml)，反应4小时，加150ulDMSO裂解，570nm比色。结果表明：重组蛋白hK5能明显抑制人脐静脉内皮细胞Ecv304的增殖，表现为细胞变圆、脱落、细胞膜溶解、细胞死亡(见附图5)，抑制效果呈典型的剂量依赖性。对非内皮细胞，如KMB17(人胚肺二倍体细胞株)、Vero(非洲绿猴肾上皮细胞)、OB(新生大鼠颅盖骨成骨细胞)，两种系统表达的重组hK5均未表现任何抑制活性(见附图6)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>上海新生源医药研究有限公司

<120>重组人纤溶酶原Kringle 5(hK5)生产方法

<130>054416

<160>7

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>297

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>hK5的编码序列

<400>1

gttttgttgc cagacgttga aactccatct gaagaagatt gtatgttcgg taatggtaag     60

ggttatagag gtaagagagc tactactgtt actggtactc cttgtcaaga ctgggctgct    120

caagaaccac acagacactc tatcttcact cctgaaacta acccacgtgc tggtttagaa    180

aagaactact gtcgtaaccc tgacggtgac gttggtggtc catggtgtta cactactaac    240

cctagaaagt tgtacgacta ctgtgacgtt ccacaatgtg ctgctccttc tttctaa       297

<210>2

<211>98

<212>PRT

<213>智人

<400>2

Val Leu Leu Pro Asp Val Glu Thr Pro Ser Glu Glu Asp Cys Met Phe

1               5                   10                  15

Gly Asn Gly Lys Gly Tyr Arg Gly Lys Arg Ala Thr Thr Val Thr Gly

            20                  25                  30

Thr Pro Cys Gln Asp Trp Ala Ala Gln Glu Pro His Arg His Ser Ile

        35                  40                  45

Phe Thr Pro Glu Thr Asn Pro Arg Ala Gly Leu Glu Lys Asn Tyr Cys

    50                  55                  60

Arg Asn Pro Asp Gly Asp Val Gly Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asn

65                  70                  75                  80

Pro Arg Lys Leu Tyr Asp Tyr Cys Asp Val Pro Gln Cys Ala Ala Pro

                85                  90                  95

Ser Phe

<210>3

<211>300

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>α信号肽的编码序列

<400>3

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct     60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt    120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat    180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta    240

tctctcgaga aaagagaggc tgaagcttac gtagaattcc ctagggcggc cgcgaattaa    300

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>4

ccgctcgaga aaagagtttt gttgccagac gttg                                34

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

cggaattcct gcagttagaa agaaggagca gcacat    36

<210>6

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

cggaattcat ccaaacgatg agatttc             27

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>7

ccgctcgaga gatacccctt cttc                24

Claims (9)

1.一种编码人纤溶酶原Kringle 5的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，而且所述多核苷酸的纤溶酶原Kringle 5编码区如SEQ ID NO：1所示。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，选自下组：

(a)SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列；

(b)由SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和位于上游的α因子信号肽编码序列构成的核苷酸，所述的α因子信号肽是酿酒酵母α因子前导肽。

3.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求1所述的多核苷酸。

4.一种工程细胞，其特征在于，它是通过权利要求3所述的表达载体或权利要求1所述的多核苷酸转化宿主细胞后同源重组而得的，且染色体中整合有人纤溶酶原Kringle 5编码序列。

5.如权利要求4所述的工程细胞，其特征在于，它是毕赤酵母(PichiaPastoris)。

6.一种生产人纤溶酶原Kringle 5的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(a)培养如权利要求4所述的工程细胞，从而分泌表达人纤溶酶原Kringle5，所述的工程细胞是毕赤酵母；

(b)分离纯化出表达的人纤溶酶原Kringle 5。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母细胞的基因组中整合有2-40拷贝的人纤溶酶原Kringle 5编码序列。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的毕赤酵母工程细胞包括快速利用甲醇型和慢速利用甲醇型。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(b)的分离条件包括：

(i)对发酵样品通过离心和/或过滤去除菌体，获得发酵上清液；

(ii)通过盐析和/或超滤对发酵上清进行浓缩，获得浓缩液；

(iii)对浓缩液进行层析纯化，所述的层析纯化选自：阳离子交换层析、阴离子交换层析、凝胶过滤层析、疏水层析、亲和层析、及其组合，从而获得纯度达到95-99.9％的纯品。

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