JPH04501807A - 尿酸オキシダーゼ活性蛋白質、それをコードした組換え遺伝子、発現ベクター、微生物および形質転換細胞 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （２１）請求項１６−１８の何れか１項記載の発現ベクター１種によｌｌ形質転 換されている、サツカロマイセス・セレビシェ株。

（２２）ロイシンまたはウラシルの合成をつかさどる遺伝子少なくとも１種上に 変異を有する、請求項２１記載の株。

（２３）　Ｌ　Ｅ　Ｕ　２およびＵＲＡ３遺伝子の少なくとも１種上に変異を有 する、請求項２２記載の株。

（２４）下記段階 １）請求項２１−２３記載の株を培養し、２）細胞を溶解し、 ３）溶解物中に含まれる組換え体尿酸オキシダーゼを分離精製すること を含む、組換え体尿酸オキシダーゼの製造法。

（２５）発現に必要な手段と共に、請求項１３記載の組換え体遺伝子を含む、動 物細胞。

（２６）請求項１４記載の組換え体遺伝子を保持する請求項１６記載の発現ベク ターを含む、動物細胞。

明細書 尿酸オキシダーゼ活性蛋白質、それをコードした組換え遺伝子、発現ベクター、 微生物および形質転換細胞本発明は尿酸オキシダーゼ活性を有する新規な蛋白質 に関するものである。さらに本発明は、この蛋白質を含有する薬物ならびにこの 蛋白質を生産する遺伝子工学的手段、特にこの蛋白質をコードする組換え遺伝子 、該遺伝子を持つ発現ベクターおよびこの発現ベクターにより形質転換された真 核細胞または原核微生物に関するものである。

ウリカーゼとも呼ばれる尿酸オキシダーゼ（ＥＣ１，７，３，３、）はプリン減 成経路の酵素である。この酵素は霊長類（例えばヒト）、鳥類、少数の爬虫類ま たはほとんどの昆虫には存在しない。

これはある種の犬（例えばダルマシアン）にも存在しない。

人間において、プリン塩基（アデニンおよびグアニン）はキサンチンに変換され る。キサンチンは以下の反応にしたがってキサンチン酸化酵素により酸化されて 尿酸を生成する：キサンチン＋Ｈ２０＋Ｏｔ　→　尿酸子ｏ２−超過酸化物不均 化酵素の基質であるｏ２−ラジカルは、この酵素によって過酸化水素に変換され る。

血液中に存在する代謝産物である尿酸は普通本質的には可溶性−ナトリウム塩の 形で見いだされる。しかしながらある人々においてはこの尿酸が沈澱して結石を 形成することがある。血液中を循環している尿酸の量の増加である高尿酸血症は 尿酸を軟骨組織に沈澱させ、痛風を引き起こす。高尿酸血症はさらに腎臓にも影 響を及ぼす：尿中および腎臓中の過剰の尿酸は尿酸腎結石症、即ち腎結石の蓄積 を起こし、これは非常に痛く、また腎臓を損傷し得る。この結石は、恐らくは燐 酸および蓚酸塩と結合した尿酸で成り立っている。

尿酸の過剰生産には種々の原因がある：即ち、先天性代謝欠損、レシューナイハ ン症候群、プリンまたは蛋白質の過剰摂取、尿酸排泄薬による処置、血液疾患、 特に癌性血液疾患の細胞融解性物質による（化学療法）または放射線療法による 処置である（ガツトマン・Ａ、　Ｂ、およびＹＵ−Ｔ、Ｆ、（１９６８）アメリ カン・ジャーナル・オン・メディスン４５−７５６−７７９）。

故に、尿酸のアラントイン（尿酸よりずっと可溶性であり、生物学的液体中で到 達する濃度では結晶化しない化合物）への減成を触媒する酵素である尿酸オキシ ダーゼは治療上の価値がある。注射で使用した場合、これは高尿酸血症および腎 結石症の処置に多くの利点、即ち血中尿酸低下作用の速さく２４時間以内に高尿 酸血をほぼ５０％低下させる）、アロプリノール（キサンチン酸化酵素阻害剤） のような他の薬物と比較した結石症に対する腎臓のより良い保護、等がある。現 時点においてこの酵素は主に化学療法における細胞融解剤のためのアジュバント として使用されている。

現在薬物として使用されている尿酸オキシダーゼは、アスペルギルス・フラブス の菌糸体の培養、および抽出による培地からの尿酸オキシダーゼの分離、ならび にこの蛋白質を精製するための幾つかの工程からなる方法によって取得している 。高純度の尿酸オキシダーゼの取得を可能にするこの方法は、それにも関わらず 不利な点がある。事実Ａ、フラブスの生理機能およびとりわけ遺伝的性質は研究 が容易でない（ウォロシャク等、（１９８９）、アプライド・アンド・エンヴア イアランメンタル・ミクロバイオロジー第５５巻８６−９０頁）。このためこの 酵素を大量に生産する菌株を得ることは不可能である。さらに、Ａ、フラブスは アフラトキシンを生産し易く、これは時には分離除去が困難である。したがって 、精製された物質はこの毒素を含んでいないことを確認すべく調べなければなら ない。

故に、Ａ、フラブスのより純粋な尿酸オキシダーゼ、ならびにこれらの不都合性 を克服する遺伝子工学的手段および技術の必要性が存在する。

本出願者は、尿酸オキシダーゼ抽出物と名付けたＡ、フラブスがら抽出される尿 酸オキシダーゼを、この蛋白質に関して既に知られる純度より高い純度まで精製 した。さらに本出願者は、この蛋白質の部分的配列を決定し、この蛋白質の２つ の部分をコードしているヌクレオチドとハイブリダイズできる標識プローブの２ 個のプールを構築した。

次いでこのｃＤＮＡを含む発現ベクターを組み立て、このｃＤＮＡで大腸菌に１ ２菌株を形質転換し、該菌株を培養し、そしてこの細胞溶解物が、予想される分 子量の組換え蛋白質を含有し、尿酸オキシダーゼ活性（アラントインにおいて尿 酸を減成する能力）を有することを立証した。

さらに本出願者は、その配列が、単離されたｃＤＮＡに比べて、真核細胞に通例 のコドンを挿入する目的で導入された変異を伴っている尿酸オキシダーゼをコー ドしている組換え遺伝子を含む真核細胞における発現のための幾つかのベクター を組み立て、これらのベクターによって異なった真核細胞を形質転換し、該細胞 を小容量ならびに大容量（発酵槽）で培養し、そしてこの細胞の溶解物が、尿酸 オキシダーゼ活性を有する５、予想された分子量の組換え蛋白質をかなりの割合 で含有することを見いだした。本出願者はこの組換え蛋白質を精製し、尿酸オキ シダーゼ抽出物と比較して一部性格決定を行なった。

したがって本発明は、少なくとも１６Ｕ／ｍｇの特異的尿酸オキシダーゼ活性を 有する新規な蛋白質であって、以下の配列：Ｓｅｒ　ＡＬａ　ＶａＬ　Ｌｙｓ　 ＡＬａ　ＡＬａ　Ａｒｇ　Ｔｙｒ　ＧＬｙ　しｙｓ　Ａｓｐ　Ａｓｎ　ＶａＬ　 Ａｒｇ　ＶａＬ　Ｔｙｒ@Ｌｙｓ ＶａＬ　Ｈｊｓ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　ＧＬｙ　ＶａＬ　 ＧＬｎ　Ｔｈｒ　Ｖａｔ　Ｔｙｒ　ＧＬｕ　Ｍｅｔ　Ｔｈｒ@ＶａＬ Ｃｙｓ　ＶａＬ　Ｌｅｕ　’Ｌｅｕ　ＧＬｕ　ＧＬｙ　ＧＬｕ　ＩＬｅ　ＧＬｕ 　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｉ　ＡＬａ　Ａｓ吹@Ａｓｎ Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　ＩＬｅ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　ＩＬｅ　 Ｈｉｓ　ＡＬａ　ＡＬａ　）ｌｉｓ　ＶａＬ　ＡＳｎ　ＩＬ■@ＶａＬ Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　ＡＳｐＩＬ：　Ａ ｓｐ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｈｌｓ　Tｅｒ Ｐｈ＝　ＬＬｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＧＬｕ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　 Ａｓｎ　ＶａＬ　ＧＬｎ　ＶａＬ　Ａｓｐ　ＶａＬ　ＶａＬ@ＧＬｕ ＧＬｙ　Ｌｙｓ　ＧＬｙ　ＩＬｅ　Ａｓｐ　ＩＬｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　 Ｌ＝ｕ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＶａＬ　Ｌｅｕ@Ｌｙｓ Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＧＬｎ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　ＧＬｙ　Ｐｈｅ　 Ｌ＝Ｕ　Ａｒｇ　ＡＳＯＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　k＝ｕ Ｌｙｓ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　ＩＬｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　 Ｔｈｒ　Ａｓｐ　ＶａＬ　Ａｓｐ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ@ＧＬｎ Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ｃｔｙ　Ｌｅｕ　ＧＬｎ　ＧＬｕ　 ＶａＬ　ａｒｇ　Ｓｅｔ　Ｈ’＋Ｓ　ＶａＬ　Ｐｒｏ　Ｌｙ刀@Ｐｈｅ Ａｓｐ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ａｒｇ　ＧＬｕ　 ＶａＬ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　ＡＬａ@ＧＬｕ ＡＳｐＡｓｎＳｅｒＡＬａＳｅｒＶａＬＧＬｎＡｔａＴｈｒ＞＋ｅｔＴｙｒｔ、 ｙｓＭ＝ｔＡＬａＧＬｕＧＬｎＩＬｅしｅｕ　ＡＬａ　Ａｒｇ　ＧＬｎ　ＧＬｎ 　Ｌ＝ｕ　ＩＬｅ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　ＶａＬ　ＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｔ　Ｌｅｕ 　Ｐｒｏ　Ａｓｎ@Ｌｙｓ Ｈｌｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＧＬｕ　ＩＬｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　 Ｈｊｓ　ＬｙＳ　ＧＬｙ　Ｌｅｕ　ＧＬｎ　ＡＳｎ　Ｔｈｒ@ＧＬｙ ＬｙｓＡＳｎＡＬａＧＬｕＶａＬＰｈｅＡＬａＰｒ：ＩＧＬｎＳｓｒＡｓｐＰｒ ｏＡｓｎＧＬγＬｅｕＩＬｅＬｙｓＣｙｓ　Ｔｈｒ　ＶａＬ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　 Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　ＬｅＵを持ち、所望により メチオニンが先行し、またはこの配列と実質的程度の相同性が存在する蛋白質に 関するものである。

好ましくは本発明の蛋白質の特異的尿酸オキシダーゼ活性は約３ＯＵ／ｍｇであ る。　この型の好ましい蛋白質は、二次元ゲル上の分析により、約３３．５ｋＤ ａの分子質量および８．　０付近に等電点を示し少なくとも９０％の蛋白質質量 を示す蛋白質である。

好ましくは、ａＣ８グラフトシリカカラム上の液体クロマトグラフィーにより測 定される本発明の蛋白質の純度は、８０％以上である。

この型の興味深い蛋白質は、等電点８．０を有する蛋白質である。好ましくは、 その蛋白質のアミノ末端セリンは、好ましくは４３付近の原子質量単位を有する 遮蔽基、例えばアセチル基を持つ。

さらに本発明は、薬学上許容し得る担体と組み合わせた本発明の蛋白質を含有す る薬物に関するものである。本発明の蛋白質は、その異なった用途においては、 商標「ウリコザイム」　（ヴアイダル１９９０）の下で注射用形態で市販されて いる約８０／ｍｇの特異的尿酸オキシダーゼ活性を有する尿酸オキシダーゼ抽出 物を、有利に置き換えることができる。

さらに本発明は、以下の配列： ＭｅｔＳｅｒＡＬａＶａＬＬｙｓＡＬａＡＬａＡｒｇＴｙｒＧＬｙＬｙｓＡｓｐ ＡｓｎＶａＬＡｒｇＶａＬＴｙｒしｙｓＶａＬＨｉｓＬｙｓＡｓｐＧＬｕＬｙｓ ＴｈｒＧＬｙＶａＬＧＬｎＴｈｒＶａＬＴｙｒＧＬｕＭｅｔＴｈｒＶａＬ　Ｃｙ ｓ　ＶａＬ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＧＬｕ　ＧＬｙ　ＧＬｕ　ＩＬｅ　ＧＬｕ　Ｔｈ ｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　ＡＬａ@Ａｓｐ Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＶａＬ　ＩＬｅ　ＶａＬ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　 ＩＬｅ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　ＩＬｅ　Ｔｙｒ　ＩＬｅ@Ｔｈｒ ＡＬａＬｙｓＧＬｎＡｓｎＰｒｏＶａＬＴｈｒＰｒｏＰｒｏＧＬｕＬｅｕＰｈｅ ＧＬｙＳｅｒＩＬｅＬｅｕＧＬｙＴｈｒ　Ｈｉｓ　Ｐｈｅ　ＩＬｅ　ＧＬｕ　Ｌ ｙｓ　Ｔｙｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　ＩＬｅ　Ｈｉｓ　ＡＬａ　ＡＬａ　Ｈｉｓ　Ｖ ａＬ　Ａｓｎ@ＩＬｅ ＶａＬ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　 ＩＬｅ　Ａｓｐ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ@Ｈｉｓ Ｓｅｒ　Ｐｈｅ　ＩＬｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＧＬｕ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　 Ａｒｇ　Ａｓｎ　ＶａＬ　ＧＬｎ　ＶａＬ　Ａｓｐ　ｖａＬ@ＶａＬ ＧＬｕ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　ＧＬｙ　ＩＬｅ　Ａｓｐ　ＩＬｅ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　 Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　Ｌｅｕ　Ｔｈｒ　ＶａＬ@Ｌｅｕ Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＧＬｎ　Ｐｈｅ　Ｔｒｐ　ＧＬｙ　 Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ@Ｔｈｒ Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　ＩＬｅ　Ｌｅｕ　 Ｓｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　ＶａＬ　Ａｓｐ　ＡＬａ　Ｔｈｒ@Ｔｒｐ ＧＬｎ　Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　Ｌｅｕ　ＧＬｎ　 ＧＬｕ　ＶａＬ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｈｉｓ　ＶａＬ　Ｐｒｏ@Ｌｙｓ Ｐｈｅ　Ａｓｐ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ａｒｇ　 ＧＬｕ　ＶａＬ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ@ＡＬａ ＧＬｕＡｓｐＡｓｎＳｅｒＡＬａＳｅｒＶａＬＧＬｎＡＬａＴｈｒＭｅｔＴｙｒ ＬｙｓＭｅｔＡＬａＧＬｕＧＬｎＩＬｅＬｅｕＡＬａＡｒｇＧＬｎＧｕｎＬｅｕ ＩＬｅＧＬｕＴｈｒＶａＬＧＬｕＴｙｒＳｅｒＬｅｕＰｒｏＡｓｎＬｙｓ　Ｈｌ ｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＧＬｕ　ＩＬｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　Ｈｉ ｓ　Ｌｙｓ　ＧＬｙ　Ｌｅｕ　ＧＬｎ　Ａｓｎ@Ｔｈｒ ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　ＡＬａ　ＧＬｕ　ＶａＬ　Ｐｈｅ　ＡＬａ　Ｐｒｏ　 ＧＬｎ　Ｓｅｒ　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ　ＧＬｙ　Ｌｅｕ@ＩＬｅ Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　ＶａＬ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　 Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕを有する蛋白質をコードしているＤＮＡ配列を 含む組換え遺伝子基こ関するものである。

遺伝暗号の縮重のため、その配列が上記の式に対応する蛋白質をコードしている ＤＮＡ配列は多数ある。原核微生物中での発現に特に好適な一つの好ましいＤＮ Ａ配列は以下の通りである：ＡＴＧＴＣＴＧＣＧＧ　ＴＡＡＡＡＧＣＡＧ（ＧＣ ＧＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＴＧ　ＴＴＣＧＣＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＴ ＣＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧＡ　ＡＧＡＣＣＧＧＴＧＴ　ＣＣＡＧＡＣＧＧＴＧ　 ＴＡＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＴＧＴ　ＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧ　ＧＧＴＧ ＡＧＡＴＴＧ　ＡＧＡＣＣＴＣＴＴＡ　ＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＧ ＣＧ　ＴＣＡＴＴＧＴＣＧＣＡＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＴＴＡＡＧＡＡＣＡ　ＣＣ ＡＴＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＡＧ　’ＣＡＧＡＡＣＣＣＣＧ　ＴＴＡＣＴ ＣＣＴＣＣＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＣＡ　 ＣＴＴＣＡＴＴＧＡＧ　ＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＣＣＧＣＴＣ ＡＣＧＴＣＡＡＣＡＴＴＧＴＣＴ　ＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧ　ＧＡ（ＣＣＧＧＡＴ Ｇ　ＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧ　ＧＣＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＴＣ ＡＴＣＣＧＣＧ　ＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡ　ＧＡＡＧＣＧＧＡＡＴ　ＧＴＧＣＡＧ ＧＴＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＧＡ　ＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＡ　 ＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴ　ＧＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＡ　ＡＧＡＧ ＣＡＣＣＡＡ　ＣＴＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴＧＡＣＧ ＡＧＴＡＣＡＣＣＡＣＡ　ＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡ　（ＣＴＧＧＧＡＣＣＧ　ＴＡ ＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＴＧＣＣＡＣＴＴＧ　ＧＣＡＧＴＧＧ ＡＡＧ　ＡＡＴＴＴＣＡＧＴＧ　ＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡ　ＧＧＴＣＣＧＣＴＣＧ ＣＡＣＧＴＧＣＣＴＡ　ＡＧＴＴＣＧＡＴＧＣＴＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣ ＴＣＧＣＧ　ＡＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＴＴ　ＧＣＴＧＡＡＧＡＴ Ａ　ＡＣＡＧＴＧＣＣＡＧ　ＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＴＡＴＧＴＡＣＡＡＧＡ ＴＧＧＣＡＧＡ　ＧＣＡＡＡＴＣＣＴＧ　ＧＣＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴ ＣＧＡ　ＧＡＣＴＧＴＣＧＡＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＡ　Ｃ ＴＡＴＴＴＣＧＡＡ　ＡＴＣＧＡＣＣ丁ＧＡ　ＧＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧＧＣＣ ＴＣＣＡＡ　ＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡ　ＡＧＡＡＣＧ（ＣＧＡ　ＧＧＴＣＴＴ（Ｇ Ｃ丁　ＣＣＴＣＡＧＴＣＧＧＡＣ（ＣＣＡＡＣＧＧ　ＴＣＴＧＡＴＣＡＡＧ　Ｔ ＧＴＡＣＣＧＴＣＧ　ＧＣＣＧＧ丁ＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧ丁ＣＴＡＡＡＴＴＧ 。

酵母のような真核細胞中での発現に特に好適な、もう一つの好ましいＤＮＡ配列 は、以下の通りである：ＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧ　ＴＴＡＡＧＧＣＴＧＣＴＡＧＡ ＴＡＣＧＧＴ　ＡＡＧＧＡＣＡＡＣＧ　ＴＴＡＧＡＧＴＣＴＡｉｃｃＧｃＡｃＡ ｃＡＣＴＴＣＡＴＴＧＡＧ　ＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧＣＣＧＣ ＴＣＡＣＧＴＣＡＡＣＡＴＴＧＴＣＴ　ＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧ　ＧＡＣＣＣＧＧ ＡＴＧ　ＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧ　ＧＣＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴ ＴＣＡＴＣＣＧＣＧ　ＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡ　ＧＡＡＧＣＧＧＡＡＴ、　ＧＴＧ ＣＡＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＧＡ　ＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴ ＣＡ　ＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴ　ＧＴ（ＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＡ　Ａ ＧＡＧＣＡＣＣＡＡ　ＣＴＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴＧ ＡＣＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＣＡ　（ＴＴＡＡＧＧＡＧＡ　ＣＣＴＧＧＧＡＣＣＧ 　ＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＴＧＣＣＡＣＴＴＧ　ＧＣＡＧ ＴＧＧＡＡＧ　ＡＡＴＴＴＣＡＧＴＧ　ＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡ　ＧＧＴＣＣＧＣ ＴＣＧＣＡＣＧＴＧＣＣＴＡ　ＡＧＴＴＣＧＡＴＧＣＴＡＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣ ＴＧＣＴＣＧＣＧ　ＡＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＴＴ　ＧＣＴＧＡＡ ＧＡＴＡ　ＡＣＡＧＴＧＣＣＡＧ　ＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＴＡＴＧＴＡＣＡ ＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡ　ＧＣＡＡＡＴＣＣＴＧ　ＧＣＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴ ＧＡＴＣＧＡ　ＧＡＣＴＧＴＣＧＡＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣ Ａ　ＣＴＡＴＴＴＣＧＡＡ　ＡＴＣＧＡＣＣ丁ＧＡ　ＧＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧ ＧＣＣＴＣＣＡＡ　ＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡ　ＡＧＡＡＣＧＣＣＧＡ　ＧＧＴＣ丁 ＴＣＧ（Ｔ　ＣＣＴＣＡＧＴＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＧ　ＴＣＴＧＡＴＣＡＡ Ｇ　ＴＧＴＡＣＣＧＴ（Ｇ　Ｇ（ＣＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣＴ動物細 胞中での発現に特に適当なもう一つの好ましｌ、）ＤＮＡ配列は、動物細胞にお ける発現に好都合な非翻訳５′配列の先行する以下の配列である： ５’−ＡＴＧＴＣＣＧＣＡＧＴＡＡＡＡ　ＧＣ垣にｉ、＋：Ｇｃｖ　ＡＣＧＧＣ ＡＡＧＧＡＧＡＡ（ＡＣ（ＡＴＴ　ＴＡＣＡＴＣＡ（ＣＧ　ＣＣＡＡＧＣＡＧＡ Ａ　ＣＣＣＣＧＴＴＡＣ丁　ＣＣ丁ＣＣＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣＧＧＣＴＣＣＡＴ ＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＣＡＣＴＴＣＡ　ＴＴＧＡＧＡＡＧＴＡ　ＣＡＡＣＣＡＣ ＡＴＣＣＡＴＧ（ＣＧＣＴＣＡＣＧＴＣＡＡＣＡＴ　ＴＧＴＣＴＧＣＣＡＣＣＧ ＣＴＧＧＡＣＣＣＧＧＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＡＡＧ　ＣＣＡＣＡＣＣ ＣＴＣＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴ　ＣＣＧＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＡ八ＧＣＧＧ ＡへＴＧＴＧＣＡ　ＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧ　ＧＴＣＧＡＧＧＧＣＡ　ＡＧＧＧＣ ＡＴＣＧＡ　ＴＡＴＣＡＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴＧＴでＣＧ　ＧＣＣＴＧＡＣＣＧ Ｔ　ＧＣＴＧＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＧ（ＴＴＣ ＣＴＧＣＧＴ　ＧＡＣＧＡＧＴＡＣＡ　ＣＣＡＣＡＣＴＴＡＡ　ＧＧＡＧＡＣＣ ＴＧＧ　ＧＡＣＣＧＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡ　ＣＧＴＣＧＡＴＧＣＣＡ （ＴＴＧＧＣＡＧＴ　ＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴ　ＣＡＧＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡ ＧＧＴＣＣＧＣＴＣＧＣＡＣＧ丁　ＧＣＣＴＡＡＧＴＴＣＧＡＴＧＣＴＡＣＣＴ 　ＧＧＧＣＣＡＣＴＧＣＴＣＧＣＧＡＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡ　ＣＴＴＴ ＴＧＣ丁ＧＡ　ＡＧＡＴＡＡＣＡＧＴ　ＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＴ ＡＴ　ＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧ　ＧＣＡＧＡＧＣＡＡＡ　ＴＣＣ丁ＧＧＣＧＣＧ　 ＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡ丁ＣＧＡＧＡＣＴＧ　ＴＣＧＡＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＣ ＣＴＡＡＣＡＡＧＣＡＣＴＡＴＴ　ＴＣＧＡＡＡＴＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧ 　ＣＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＣＣＡＡＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＧＡ ＧＧＴＣＴＴＣＧＣＴＣＣＴＣＡ　ＧＴＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＧＴＣＴＧＡ 　ＴＣＡＡＧＴＧＴＡＣＣＧＴＣＧＧＣ（ＧＧこの型の好ましい非翻訳５゛配列 は、上記の配列のすぐ上流に位置する配列ＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＴを含む 配列である。

上に示したｃＤＮＡ配列によりコードされる蛋白質は、これをアミノ末端メチオ ニン残基から開裂するメチオニルアミノペプチダーゼによるプロセシングを受け 得ることがわかるであろう。

さらに本発明は、その発現に必要な手段を伴う、上に定義された組み替え遺伝子 を有する発現ベクターに関するものである。

原核微生物、特に大腸菌における発現のためには、暗号化配列は、特に、有効な プロモーター、続いて発現される遺伝子の上流のりボゾーム結合部位、さらに、 発現される遺伝子の下流の有効な転写停止配列、を含む発現ベクター中に挿入さ れねばならない。さらにこのプラスミドは複製起点および選択マーカーを含んで いなければならない。これら全ての配列は宿主細胞の機能として選択されねばな らない。

真核細胞における発現のために、本発明に係る発現ベクターは、その発現のため 、真核細胞におけるその複製のため、および形質転換された細胞の選択のために 必要な手段を伴う、上に定義された組み替え遺伝子を有する。好ましくはこのベ クターは、例えば受容真核細胞の変異を補足するために選ばれた選択マーカーを 持ち、これが、組み替え遺伝子のゲノム中または多数コピーベクター中のいずれ かに組み替え遺伝子の大量のコピーを統合させた細胞の選択を可能にする。

動物細胞、特にチャイニーズ・ハムスターの卵巣（ＣＨＯ）における発現のため には、暗号化配列を、有効なプロモーター（例えばＳＶ４０初期プロモーター） の前に２つの発現ユニットを含むプラスミド（例えばｐＢＲ３２２由来の）中に 挿入し、第一のユニットの中に組換え遺伝子を挿入する。開始ＡＴＧ付近の配列 は、好ましくはコザク（Ｍ、コザク（１９７８）、セル、第１５巻１１０９−１ １２３頁）により記載されている一致配列（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓｓｅｑｕｅｎｃ ｅ）の機能として選択する。イントロン配列、例えばマウスα−グロビンのイン トロンは、組み替え遺伝子の上流に挿入でき、ポリアデニル化部位、例えばＳＶ ４０ポリアデニル化配列は、組み替え遺伝子の下流に挿入できる。第二の発現ユ ニットは、ジヒドロ葉酸塩還元酵素（以後ＤＨＦＲと略記される酵素）をコード している選択マーカー（例えばＤＮＡ配列）を含む。このプラスミドを動物細胞 、例えばＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（ＤＨＦＲを発現できない）にトランスフェクト する。そのメトトレキサート耐性について１個のラインを選択する。これは組み 替え遺伝子の大量のコピーをそのゲノム中に統合し、該組み替え遺伝子を十分な レベルで発現した。

酵母、例えばサツカロミセス・セレビシアエのような真核細胞における発現のた めには、暗号化配列は、一方では有効なプロモーターとして認識される配列、そ して他方では転写ターミネータ−の間に挿入されねばならない。発現カセットと 呼ばれるこのプロモーター／暗号化配列／ターミネータ−の列は、酵母用のプラ スミドベクター（単一コピーまたは多数コピー）中にクローニングするか、また は酵母のゲノム中に多数コピーとして統合する。

さらに本発明は、上記発現ベクターによって形質転換された真核細胞に関するも のである。これら真核細胞のうち価値があるのは、サツカロミセス・セレビシア エ種の菌株、特にロイシンまたはウラシルの合成を司る遺伝子のうちの１個、例 えばＬＥＵ２遺伝子またはＵＲＡ３遺伝子に変異を含んでいるものである。

さらに本発明は、その発現に必要な手段と共にこの組み替え遺伝子を含んでいる 動物細胞に関するものである。該組み替え遺伝子は、例えば上記発現ベクターに よるトランスフェクションにより、該発現ベクターを持つウィルスまたはレトロ ウィルスによる感染により、またはミクロ注入により、その細胞内に導入された 。

さらに本発明は、 １）上に定義される形質転換された細胞を培養し；２）その細胞の溶解物を生成 し： ３）得られた溶解液に含まれる尿酸オキシダーゼを分離および精製する： 工程からなる組み替え尿酸オキシダーゼの生産方法に関するものである。

下記の実施例を参考にして本発明がより明確に理解されるであろう。

当業者によく知られている以下の技術の多くは、マニアティス等による「モレキ ュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアルＪ（’１９８４年出版、 ニールド・スプリング・ハーバ−・プレス、ニューヨーク在）の著にその詳細が 記載されている。

実施例１　アスペルギルス・フラブスからのメツセンジャーＲＮＡの単離 尿酸オキシダーゼを生産するＡ、フラブス菌株を、尿酸オキシダーゼの生産に適 当な条件下で、即ち尿酸を含有し、以下の組成ニゲルコース１５ｇ／ｌ、Ｍｇ５ Ｏ，・７Ｈ，０１ｇ／ｌ、ＫＨ！ＰＯ４０，７５ｇ／］、ＣａＣＯ５１，２ｇ／ ｌ、尿酸１．２ｇ／ｌ、ＫＯＨ０，５ｇ／Ｌ大豆油０．６６ｍ１／Ｌ　ＦｅＳＯ ４・７Ｈ！０　１０ｍｇ／ｌ、ＣｕＳＯ４・５Ｈ１０１ｍｇ／ｌ、ＺｎＳＯ４” ７Ｈｚ０　３ｍｇ／ｌ、ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ１ｍｇ／ｌを有する培地中で培養し た。この培地はＩＭのＨｘ　Ｓ　ＯａでｐＨ７に調節し、１２０℃で８０分間滅 菌する。

５１の三角フラスコ中、培地１．５１に胞子約１ないし３．１０’を接種する。

この培養を３０℃で約４０時間振盪（１２０ｒｐｍ）Ｌながらインキュベートす る。ガーゼで濾過することにより菌糸体を回収し、水洗し、液体窒素中で凍結す る。

菌糸体１５ｇ　（湿重量）を融解し、溶菌緩衝液４５ｍ】に再懸濁し、次いで同 容量のビーズ（直径０．４５μｍ）中に入れる。溶菌緩衝液は、グアニジンチオ シアナート４Ｍ１トリス−ＨＣ］１０ｍＭ　（ｐＨ７，６）　、ＥＤＴＡｌｏｍ Ｍ、β−メルカプトエタノール５０ｍ１／Ｉよりなる。この菌糸体懸濁液をツェ ルミューラー破砕器（ビブロジエニック）中で５分間挽く。

破砕した物質を回収しビーズをデカンテーションする。上滑を除き（約４５ｍ１ ）、最終濃度を塩化リチウムに関して３Ｍに戻し、０℃で保存する。

三日後、これを１１００００ｒｐで６０分間遠心する。上清を捨て、残留物を３ ＭのＬｉＣ］　４０ｍ１に取り、再度１１００００ｒｐで１時間３０分間遠心す る。

以下のものを加える：ブロティナーゼＫ（シグマ）４０μｇ／ｍＬ　ＳＤＳ　（ ０，１％ｗ／ｖ）およびＥＤＴＡ２０ｍＭ０この混合物を３７℃で３時間インキ ュベートする。エタノール２容量で沈澱させた後７０％エタノールで洗浄する。

残留物をＴＥ緩衝液（トリス−ＨＣｌ　１０ｍＭ、ＥＤＴＡ１ｍＭＳｐＨ７，５ ）０．５ｍｌ中に取り、混合物をクロロホルムで２回抽出し、エタノールで沈澱 化する。このＲＮＡをアルコール中−８０℃で保存する。

実施例２　ＲＮＡのポリＡ”分画の精製ＲＮＡ約１ｍｇを４℃で２０分間沈澱化 （１５０００ｒｐｍ）Ｌ、次いで７０％エタノールで洗浄し乾燥する。残留物を ＴＥ緩衝缶液ｍ］に取り、ポルテックスで撹拌することにより再懸濁する。製造 者の指示に従ってオリゴｄＴ−セルロース３型（コラボラティブ・リサーチ・Ｉ ｎｃ、、バイオメディカルズ・プロダクト・ディビジョンにより市販）を調製す る。ＲＮＡをこのオリゴｄＴに沈澱させ、穏やかに撹拌してビーズを再懸濁し、 次いで６５℃で１分間加熱する。

懸濁液を０．５ＭＮａＣ１となるよう調節し次いで穏やかに１０分間撹拌する。

次にこれを１１０００ｒｐで１分間遠心し、上溝を除き残留物を０．５ＭＮａＣ １を含有するＴＥ緩衝缶液ｍｌで２回洗浄する。上清を除去する。このビーズを ＴＥ緩衝缶液ｍｌに懸濁し、次いでこの懸濁液を６０℃で１分間加熱し、引続き 傾斜板上で１０分間振盪することによってＲＮＡのポリアデニル化分画（メツセ ンジャーＲＮＡからなる）を溶離する。次いでこれを１１００Ｏｒｐで１分間遠 心すると、一方では溶液中の遊離のｍＲＮＡを含む上清、そして他方では残留物 のセルロースビーズを回収することができる。上の一連の操作（溶離から始まる ）を繰り返す。このようにして得られた上清をプールし、過剰のビーズを遠心に よって除き、常法（マニアティス：Ｏｐ、引用）に従って上清をＮａＣｌを含有 するエタノールで沈澱させる。

実施例３　ｃＤＮＡライブラリーの構築前実施例に記載されるように単離したメ ツセンジャーＲＮＡを用いてベクターｐＴＺ１９Ｒ（ファルマシアにより市販） 中にｃＤＮＡライブラリーを組み立てる。このベクターは独自の制限サイトを含 むポリリンカーを含んでいるプラスミドである。

使用されるクローニング技術はキャバット等により記載されたものである（プラ イマー−アダプター・テクニーク：キャバット等、プロシーディングズ・オン・ ザ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｕ、Ｓ、Ａ、）（１９８６ ）８３巻１６７０−１６７４頁）。

これはまずベクターをＰｓｔｌで消化し、突出した３°端にポリｄＣの尾を付け 、次いで得られたプラスミドをＢａｍＨＩで消化することからなる。ベクターに 対応するフラグメントをセファロースＣＬ４Ｂのカラム（ファルマシア）上で精 製する。故にこれは一方の端にポリｄＣの尾を含み１、他方の端はＢａｍＨＩ型 の粘着末端である。次にこのメツセンジャーＲＮＡを、５’＜ＧＡＴＣＣＧＧＧ ＣＣＣＴＨ！、）＜３の配列を有するプライマーから始まる逆転写に付す。こう してｃＤＮＡはその５′端にＢａｍＨＩ粘着末端に対して相補的な配列ＧＡＴＣ Ｃを有することになる。逆転写酵素の働きにより得られたＲＮＡ−ＤＮＡハイブ リッドをアルカリ加水分解し、これによりＲＮＡが除去できる。次いでこの一本 鎖ｃＤＮＡをセファロースＣＬ４Ｂカラム上で２サイクル精製し、３′端にポリ ｄＧを付加すべくターミナルトランスフェラーゼで処理する。このｃＤＮＡを上 記のごとく調製したベクター中に一本鎖の形で挿入する。プライマーに対し相補 的な第二のオリゴヌクレオチド、アダプターが、ｃｐＮＡの５′端に「解放ゴＢ ａｍＨＩサイトを生み出すために必要である。ベクター、ｃＤＮＡおよびアダプ ターのハイブリダイゼーションの後、組み替え分子をファージＴ４のリガーゼの 働きにより円形とする。次いで一本鎖領域をファージＴ４のＤＮＡポリメラーゼ により修復する。このようにして得られたプラスミドのプールを用いてＭＣ１０ ６１を形質転換し、アンピシリン耐性を獲得させる（カサバダン、チョウおよび コーエン、ジャーナル・オン・バクテリオロジ−（１９８０）１４３巻９７１− ９８０頁）。

実施例４　Ａ、フラブスから抽出された尿酸オキシダーゼの精製およびその性格 決定 １）Ａ、フラブスから抽出された尿酸オキシダーゼの精製Ａ、フラブスから抽出 された８Ｕ／ｍｌ（特異的尿酸オキシダーゼ活性は、ブラッドフォード法（アナ リティカル・バイオケミストリー７２巻２４８−２５４頁）により測定される総 蛋白質重量に対する、実施例９に記載される試験により測定される尿酸オキシダ ーゼ活性の比である）の特異的尿酸オキシダーゼ活性を有する尿酸オキシダーゼ の調製物（ウリコザイム　−　ラボラドワール・タリノ・ミディ）を、レッド− アガロース１２０グラフトアガロース（シグマ）カラム上のクロマトグラフィー 、限外濾過による濃縮およびウルトロゲルＡｃａ（ＩＢＦ）、ポリアクリルアミ ド−アガロースゲル上での濾過により、以下のプロトコルに従って再精製した： 工程ｌニゲラフトアガロース上の親和クロマトグラフィ一温度＝４℃ カラム：ファルマシアに５０／３０ 径＝５Ｑｍｍ 長さ＝３３ｃｍ 樹脂：レッド１２０アガロース（３，０ＯＯＣＬ／Ｒ−０５０３Ｓ　Ｉ　ＧＭＡ ） ゲルの容量−４１０ｍ１ ゲルの高さ＝２０ｃｍ 平衡緩衝液ニゲリシン／ＮａＯＨ２０ｍＭ　ｐＨ８，３溶離緩衝液ニゲリシン／ ＮａＯＨ２０ｍＭ、ＮａＣ１２Ｍ　ｐＨ８，３ コンディショニングの流速：２５０ｍ１／ｈ操作流速＋１６０ｍ１／ｈ 溶出流速：６０ｍ１／ｈ １）定流ポンプを用いてウリコザイムの溶液をカラムの頂点に入れる。

２）級着後、カラムをその２倍容量の平衡緩衝液で洗浄する。

３）以下の組成を有するイオン強度勾配にて溶出するニゲリシン、ＮａＯＨ１２ ０ｍＭ　ｐＨ８，３／グリシン、ＮａＯＨ１２０ｍＭ　＋ＮａＣ１２Ｍ　ｐＨ８ ，３゜この勾配の総容量はカラム容量の１０倍に等しく、これを２つの構成因子 の間で等分する。

クロマトグラフィーの記録はλ＝２８０ｎｍで行なう；１６Ｕ／ｍｇに等しいま たはこれ以上の特異的尿酸オキシダーゼ活性を有する分画を合した後、尿酸オキ シダーゼのプールを集める。

工程２　：　１０ｋＤａ限外濾過膜よりなるバイオバス系を用いる限外濾過によ る尿酸オキシダーゼプールの濃縮工程３： 温度：４℃ カラム：ファルマシアに５０／１００ 径＝５０ｍｍ 長さ”１００ｃｍ 樹脂：アミンおよびヒドロキシ基を有するポリアクリルアミド−アガロース：ウ ルトロゲルＡＣＡ４４　（ＩＢＦ）ゲルの容量＝１．６１ ゲルの高さ＝８０　ｃｍ 平衡緩衝液ニゲリシン／ＮａＯＨ２０ｍＭ　ｐＨ８，３コンデイシヨニングの流 速：４０ｍ１／ｈ操作流速：２４ｍ１／ｈ ｌ）定流ポンプを用いてカラムの頂点に濃縮尿酸オキシダーゼのプールを入れる 。

２）試料を入れた後、緩衝液グリシン／ＮａＯＨ２０ｍＭ　ｐＨ８，３のカラム への供給を続ける。

３）り０７トグラフイー後、ＵＶ吸収値（λ＝２８０ｎｍ）＜０゜０５となるま でＮａＣ１２Ｍで洗浄する。

４℃でＮａＣ１２Ｍの下で保存する。

クロマトグラフィーの記録はλ”２８０　ｎｍで行なう；−２０Ｕ／ｍｇに等し いまたはこれ以上の特異的尿酸オキシダーゼ活性；ならびに −変性条件（ＳＤＳの存在）下における電気泳動および硝酸銀による発色（バイ オラド染色キット）におけるただ２個のバンド、即ち ３３−３４ｋＤａの主要なバンド −７０−７１ｋＤａの副次的バンド を共に有する分画を合した後、尿酸オキシダーゼのプールを集める２）Ａ、フラ ブスから抽出された精製尿酸オキシダーゼの性格決定 ａ）部分的配列決定 精製尿酸オキシダーゼ抽出物のアミノ酸配列についての情報を得るために、ｃＤ ＮＡのクローニングに要するプローブの合成を可能にする、蛋白質の直接アミノ 末端配列決定を試みた。蛋白質のアミノ末端のブロックのためこの配列決定は成 功しなかった（下記のｆ）参照）。

故に、尿酸オキシダーゼの部分的配列を得るため以下の方法を開発したニ ー　蛋白質分解酵素による蛋白質の開裂（酵素トリプシンおよびスタフィロコッ カス・アウレウスのプロテアーゼＶ８を使用）−逆相ＨＰＬＣによる得られたポ リペプチドの分離−精製されたペプチドの配列決定 α）トリプシンによる尿酸オキシダーゼの加水分解、精製およびペプチドの配列 決定 炭酸アンモニウム緩衝液１００ｍＭ（ｐＨ８，９）中の濃度９ｍｇ／ｍｌの尿酸 オキシダーゼを、３０／１（重量）の尿酸オキシダーゼ／トリプシン比で、３０ ℃で２４時間トリプシン（ウォーシングトン、ＴＰＣＫ）により消化した。トリ プシン加水分解の後、消化された尿酸オキシダーゼ６０ａｇを、水中アセトニト リル１％（Ｖ　／　Ｖ　）およびトリフルオロ酢酸０．　１％（Ｖ／Ｖ）で平衡 させたブラウンソーＧ１８グラフトシリカの逆相ＨＰＬＣカラム（カラム：１０ ｘ０．２ｃｍ）に直接注入した。次いでこのペプチドを、水中トリフルオロ酢酸 （０，１％Ｖ　／　Ｖ　）の溶液におけるアセトニトリルの直線勾配（６０分間 でアセトニトリルを１％から６０％に変える）により１５０μｍ／分の速度で溶 出した。カラムから出てきたペプチドを２１８ｎｍにおける光学密度の測定によ り検出した。

溶出グラフを第１図に示す。ここで文字Ｔ（）リブシン）に続く数は、同定され たピークに対応する。

各ピークを集め、−２０℃で保存し、その後、各減成サイクル後に生成するフェ ニルチオヒダントイン誘導体を連続して分析するクロマトグラフ（アプライド・ バイオシステムズのモデル４３０Ａ）を装備した蛋白質シークエンサー（アプラ イド・バイオシステムズのモデル４７０Ａ）で分析した。下記の表Ｉに、同定さ れた９個のピークのペプチド配列を示す。

β）プロテアーゼｖ８による尿酸オキシダーゼの加水分解、精製およびペプチド の配列決定 酢酸アンモニウム緩衝液１００ｍＭ（ｐＨ６，８）中の濃度２ｍｇ／ｍ】の尿酸 オキシダーゼを、６０／１の尿酸オキシダーゼ／プロテアーゼｖ８比で、３０℃ で７２時間スタフィロコッカス・アウレウスのプロテアーゼＶ８（ベーリンガー ーマンハイム）により消化した。消化された尿酸オキシダーゼ１６０μｇを、水 中アセトニトリル１％およびトリフルオロ酢酸０．１％（Ｖ　／　Ｖ　）で平衡 させたブラウンソーＧ１８グラフトシリカの逆相ＨＰＬＣカラム（カラム：　１ ０ｘＯ，２ｃｍ；粒子ニアｘ０．０３μｍ）に注入した。次いでこのペプチドを 、水中トリフルオロ酢酸（０，１％Ｖ　／　Ｖ　）の溶液におけるアセトニトリ ルの直線勾配（６０分間でアセトニトリルを１％から６０％に変える）により１ ５０μｍ／分の速度で溶出した。カラムから出てきたペプチドを２１８ｎｍにお ける光学密度の測定により検出した。

溶出グラフを第２図に示す。ここで文字Ｖ（プロテアーゼＶ８）に続く数は、同 定されたピークに対応する。

各ピークを集め、既に述べた蛋白質シークエンサーで分析するまで一２０℃で保 存した。

下記の第１表に、同定された５個のピークのペプチド配列を示すｂ）特異活性 精製した尿酸オキシダーゼ抽出物は約３０Ｕ／ｍｇの特異活性を有する。

Ｃ）変性条件下での電気泳動 精製した尿酸オキシダーゼ抽出物のＳＤＳ　（ドデシル硫酸ナトリウム）存在下 でのポリアクリルアミドゲル上の電気泳動とこれに続く銀発色は、約３３−３４ ｋＤａの強度の高いバンドおよび約７０７１ｋＤａの極めて強度の低いバンドを 示す。

ｄ）等電点の決定 方法 −ｐＨ領域（３，５−９，５）および（５−８）で、すぐに使えるゲル、即ちフ ァルマシアのＬＫＢアンホラインズ・ゲル板を使用−ＬＫＢ標準蛋白質１０μＩ 　（標準蛋白質の等電点の範囲：３゜５−９．５）ならびに精製尿酸オキシダー ゼ４μｇおよび８μｇ（２個の異なった列で）を入れる。

−１２Ｖ、６℃で１時間３０分間稼働。

−次に２５％エタノール、８％酢酸中のコーマシープルー（０゜１％）で蛋白質 を染色し、次いでエタノール２５％および酢酸８％を含有する溶液で脱色する（ バックグラウンドを除くため）。

−結果：２個の列の各々に、等電点８．１および７．９を有する近接する２個の バンド（二重線）が観察される。

ｅ）二次元ゲル分析 二次元ゲル分析は、蛋白質を、第一段階でその等電点により、そして第二段階で その分子量により分離することを可能にする。

プロトコル 試料コグリシン緩衝液２０ｍＭ　ｐＨ８，３中の精製尿酸オキシダーゼ抽出物の 溶液 試料の調製 −尿酸オキシダーゼ５μｇおよび１０μｇの２個の試料−真空遠心により乾燥し 、以下の組成を有する溶菌緩衝液５μｌ中に取る：尿素２．５Ｍ、３−　（３− コラミドプロピル）ジメチルアンモニオプロパン−１−スルホナート、ＣＩＡＰ Ｓ　（シグマ）、２％（ｖ／ｖ）　、ｐＨ領域５−８および３．５−９．５の両 性アンホラインズ（ＬＫＢ）　、０．４％、およびβ−メルカプトエタノール５ ％。

等電点電気泳動ゲル −尿素９．５Ｍ５ＣＨＡＰＳ５％、ＬＫＢアンホラインズ（ｐＨ（３，５−９， ５）１％；ｐＨ（５−８）１％）、アクリルアミド／ビスアクリルアミド（２８ ，４％／１．７％）最終濃度３．５％、Ｈ７Ｏを含有する溶液を調製する。

−二の溶液を濾過および脱気し、続いて０．０７５％テトラメチルエチレンジア ミン、ティミド（ファルマシア）、および０．０１５％１５％過硫酸アンモニラ 添加する。

−この溶液を管（１６ｘ０．１２ｃｍ）に導入。　−２０℃で一夜重合。

−カソードの溶液二ＮａＯＨ領　ＩＭ、脱気済み。

アノードの溶液：　Ｈｓ　Ｐ　Ｏ４２ｖ　ｍ　Ｍｏ−４ｍＡで４５分間前稼働（ 電圧３００Ｖ−１０００Ｖ）。

−カソードに試料を入れる。

−１００ＯＶ、２０℃で１９時間稼働。

−ゲルをはずし、緩衝液（トリス０．３７５Ｍ　ｐＨ８，８；ＳＤＳ３％；ジチ オトレイトール、ＤＴＴ、５０ｍＭ）中で２０℃で１０分間平衡化。

ＰＡＧＥ／ＳＤＳ変性ゲル −アクリルアミド／ビスアクリルアミド（３０％１０．８％）最終濃度１５％、 トリスＨＣＩ　（ｐＨ８，８）０．３７５Ｍ、ＨｘＯを含有する溶液の調製。

−この溶液を濾過および脱気し、続いてＳＤＳ　（０，１％）、０．０５％過硫 酸アンモニウムおよびティミド０．０５％を添加する−　４℃で一夜重合（１６ ｘ２０ｘ０．１５ｃｍのゲル）。

−平衡後、ＰＡＧＥ／ＳＤＳゲルの表面に等電点電気泳動ゲルを適用し、続いて アガロースで封入する。

−　電気泳動緩衝液＝（トリス−ＨＣ１２５ｍＭ　ｐＨ８，３、グリシン０．１ ９２Ｍ、５Ｄ３０．１％）。

１００ｍＡで稼働　−６℃で６時間 −ゲルを５０％メタノール、１０％酢酸中で固定し、次いで硝酸銀染色（プラム ・Ｈ１エレクトロフォレイシス１９８７年第８巻９３−９９頁の方法）。

−コダックのビセッジ２０００画像分析機でゲルを走査し、各スポットの光学密 度および表面部分を測定し、これにより、スポット間の定量的比率を算出する。

−アマ−ジャム標準蛋白質の存在下で二次元ゲルを調製することにより、この蛋 白質の分子量を決定する。

結果 分子量が３３．５ｋＤａの位である２個のスポットが観察され、一方は８．０の 位の等電点、強度５．２を有する主要なスポット（蛋白質重量の約９３％を示す ）であり、他方は７．４の位の等電点、強度０．４１を有する副次的スポット（ 蛋白質重量の約７％を示す）である。

ｆ）アミノ末端配列およびブロックしているアミノ末端基の質量の決定 α）アミン末端配列がブロックされていることの立証フェニルチオヒダントイン 誘導体のアミノ末端配列を、アプライド・バイオシステム１２ＯＡ型分析機と組 み合わせたアプライド・バイオシステム４７０Ａ型シークエンサーを用いて分析 した。精製した尿酸オキシダーゼ（２００ｐｍｏｌ、アミノ酸分析により確認） を、標準蛋白質β−ラクトグロブリン２０ｐｍｏｌの存在下でシークエンサーに 適用した。

尿酸オキシダーゼの配列に対応するアミノ末端配列は検出されなかった（対照的 に、標準蛋白質のアミノ末端配列が検出され、この事はシークエンサーが作動し ていたことを示している）。

したがってＡ、フラブス尿酸オキシダーゼはアミノ末端がブロックされている。

β）３２個のアミノ酸からなるアミノ末端ペプチドおよびブロックしているアミ ノ末端基の質量の決定 方法：臭化シアンによる消化 精製した尿酸オキシダーゼ抽出物を、エビクロロヒドリンによる架橋デキストラ ンによって得られ、７％蟻酸を含む溶液で平衡化したゲル、セファデックスＧ２ ５　（ＰＤＩＯ−ファルマシア）上のゲル濾過に付し、塩の除去および緩衝液の 交換を可能にする。蟻酸濃度を真空遠心により７０％まで上げる。次いで臭化シ アンを最終濃度０．２Ｍとなるまで加え、アルゴン下で光の不在下に室温で２０ 時間反応を進行させる。

−臭化シアンによる蛋白質の消化より誘導されたペプチドの、イオン交換クロマ トグラフィーによる分離このペプチドを、モノＳ親水性樹脂に基づくイオン交換 カラム（ファルマシア）上で分離した。

緩衝液Ａ：酢酸アンモニウム１０ｍＭ　ｐＨ６，２緩衝液Ｂ：酢酸アンモニウム ＬＭ　ｐＨ６，２流速：０．６ｍｌ／分、２７８ｎｍにおける光学密度の測定に よるピークの検出。

勾配：３０分間で０％のＢから１００％のＢに至る　−１ｍｌの分画を集める。

イオン交換工程から導かれた分画を、ジャゴーおよびフォノ・ジャゴー［（１９ ８７）アナリティカル・バイオケミストリー第１６６巻３６８−３７９頁〕によ り記載された方法に従ってＰＡＧＥ／ＳＤＳゲルにより分析した。

−逆相ＨＰＬＣによるアミノ末端ペプチドの精製およびマス分光測定法によるそ の分析 約４０００Ｄａの分子量を有する（ＰＡＧＥ／ＳＤＳゲルによる）イオン交換工 程から導かれたペプチドを、Ｃ１８グラフトシリカに基づく逆相ＨＰＬＣである ベックマン・アルテックスＣ１８カラム（２５０ｘ２．１ｍｍ）上で精製した。

流速：０．３ｍｌ／分、２１８ｎｍにおける光学密度の測定によりピークを検出 。

緩衝液Ａ：Ｈ２Ｏ１０，１％ＴＦＡ　（）リフルオロ酢酸）緩衝液Ｂニアセトニ トリル１０．ニ 勾配：６０分間で１から５０％のＢに至る第一の逆相ＨＰＬＣ工程後に集められ たペプチドを、異なった勾配の同じ逆相ＨＰＬＣカラムで再度精製した。

勾配＝１０分間で１から５０％のＢに至る集めたピークを、グリセロール＋チオ グリセロールのマトリックスを用いる高速原子衝撃マス分光測定法（ＦＡＢ／Ｍ Ｓ）による分析に付した。

−　キモトリプシンによるアミノ末端ペプチドの消化および逆相ＨＰＬＣによっ て分離されたキモトリプシン分解ペプチドのアミノ酸分析 逆相ＨＰＬＣにより精製されたペプチドの配列を確定するため、該ペプチドをキ モトリプシンで消化した。このキモトリプシン分解ペプチドを、ベックマン・ア ルテックスＣＩ８カラム（２５０ｘ２、１ｍｍ）上の逆相ＨＰＬＣによって分離 した。

流速＋０．３ｍｌ／分、２１８ｎｍにおける光学密度の測定によりピークを検出 。

緩衝液Ａ：Ｈ２Ｏ１０．１１％ＴＦＡ 緩衝液Ｂニアセトニトリル１０缶液８％ＴＦＡ勾配二６０分間で１％のＢから５ ０％のＢに至る　−　ピークを集める。

キモトリプシン分解したペプチドをアプライド・バイオシステムの分析機（４２ ０−１３０Ａ型）上のアミノ酸分析により同定した結果 Ａ．フラブス尿酸オキシダーゼのｃＤＮＡの配列および導き出されたアミノ酸配 列（実施例６参照）の決定に基づいて確立された下記の結論は、以下の観点から のみ理解できるニー　マス分光測定法によるアミノ末端ペプチドの分析マス分光 測定法により決定された２個の分子量、３６８４および３６６６、ならびに臭化 シアンとの反応により修飾されてホモセリン（３　６　４　２）またはホモセリ ンラクトン（３６２４）のいずれかを与えるカルボキシ末端メチオニンを持つ以 下の配列（アミノ末端メチオニン基の開裂および臭化シアンによる最初のメチオ ニン残基の後のペプチド開裂による、Ａ．フラブス尿酸オキシダーゼのｃＤＮＡ から導き出されたアミノ酸配列）：から決定された理論的分子量の間には、約４ ２原子質量単位の差が観察される。

故に、アミノ末端セリン上には、余分の約４２原子質量単位の質量を説明し、恐 らくは該アミノ末端セリンのアセチル化に対応する（ＣＨ３Ｃｏの質量　＝　Ｈ の質量　＝　４２原子質量単位）遮蔽基が存在する。

−　キモトリプシン分解ペプチドのアミノ酸分析この分析は、臭化シアン消化に より得られたアミノ末端ペプチドの配列は上記配列（１）を含むことを明白に示 すことを可能にした。

尿酸オキシダーゼの完全なアミノ酸配列を下に示す。

ｖａＬＨｉｓＬｙｓＡｓｐＧＬｕＬｙｓＴｈｒＧＬｙＶａｔＧＬｎＴｈｒＶａＬ ＴｙｒＧＬｕＭｅｔＴｈｒＶａＬＣｙｓ　ＶａＬ　Ｌｅｕ　Ｌｅｕ　ＧＬｕ　Ｇ Ｌｙ　ＧＬｕ　ＩＬｅ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ａ Ｌａ　Ａｓｐ@Ａｓｎ ５ｅｒ　ＶａＬ　ＩＬｅ　Ｖａｔ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＩＬｅ　 Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ　ＩＬｅ　Ｔｙｒ　ＩＬｅ　Ｔｈｒ@ＡＬａ ＬｙｓＧＬｎＡｓｎＰｒｏＶａＬＴｈｒＰｒｏＰｒｏＧＬｕＬｅｕＰｈｅＧＬｙ ＳｅｒＩＬｅＬｅｕＧＬｙＴｈｒＨｉｓ　Ｐｈｅ　ＩＬｅ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　Ｔ ｙｒ　Ａｓｎ　Ｈｉｓ　ＩＬｅ　Ｈｉｓ　ＡＬａ　ＡＬａ　Ｈｉｓ　ＶａＬ　Ａ ｓｎ　ＩＬｅ@ＶａＬ Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　Ｔｈｒ　Ａｒｇ　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　ＩＬｅ　 Ａｓｐ　ＧＬｙ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ　Ｐｒｏ　Ｈｉｓ@５ｅｒ Ｐｈｅ　ＩＬｅ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　ＧＬｕ　ＧＬｕ　Ｌｙｓ　Ａｒｇ　 Ａｓｎ　ｖａＬ　ＧＬｎ　ＶａＬ　Ａｓｐ　ＶａＬ　ｖａＬ@ＧＬｕ ＧＬｙＬｙｓＧＬｙＩＬｅＡｓｐＩＬｅＬｙｓＳｅｒＳｅｒＬｅｕＳｅｒＧＬｙ ＬｅｕＴｈｒＶａＬＬｅｕＬｙｓＳｅｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＧＬｎ　Ｐ ｈｅ　Ｔｒｐ　ＧＬｙ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　Ａｓｐ　ＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ｔ ｈｒ　Ｔｈｒ@Ｌｅｕ Ｌｙｓ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　Ａｓｐ　Ａｒｇ　ＩＬｅ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　 Ｔｈｒ　Ａｓｐ　ＶａＬ　Ａｓｐ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ@ＧＬｎ Ｔｒｐ　Ｌｙｓ　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｓｅｒ　ＧＬｙ　Ｌｅｕ　ＧＬｎ　ＧＬｕ　 ＶａＬ　Ａｒｇ　Ｓｅｒ　）Ｉｉｓ　ＶａＬ　Ｐｒｏ　Ｌｙ刀@Ｐｈｅ Ａｓｐ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　Ｔｒｐ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　ＡＬａ　Ａｒｇ　ＧＬｕ　 ＶａＬ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　Ｐｈｅ　ＡＬａ@ＧＬｕ Ａｓｐ　Ａｓｎ　Ｓｅｒ　ＡＬａ　Ｓｅｒ　ＶａＬ　ＧＬｎ　ＡＬａ　Ｔｈｒ　 Ｍｅｔ　Ｔｙｒ　Ｌｙｓ　Ｍｅｔ　ＡＬａ　ＧＬｕ　ＧＬｎ@ＩＬｅ Ｌｅｕ　ＡＬａ　Ａｒｇ　ＧＬｎ　ＧＬｎ　Ｌｅｕ　ＩＬｅ　ＧＬｕ　Ｔｈｒ　 ＶａＬ　ＧＬｕ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｎ@Ｌｙｓ Ｈｉｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈｅ　ＧＬｕ　ＩＬｅ　Ａｓｐ　Ｌｅｕ　Ｓｅｒ　Ｔｒｐ　 Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　ＧＬｙ　Ｌｅｕ　ＧＬｎ　Ａｓｎ　Ｔｈｒ@ＧＬｙ ＬｙｓＡｓｎＡＬａＧＬｕＶａＬＰｈｅＡＬａＰｒｏＧＬｎＳｅｒＡｓｐＰｒｏ ＡｓｎＧＬｙＬｅｕＩＬｅＬｙｓＣｙｓ　Ｔｈｒ　ＶａＬ　ＧＬｙ　Ａｒｇ　Ｓ ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｅｕ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｌｅｕ実施例５　細菌のスク リーニング １）標識したプローブの調製 この蛋白質のアミノ酸配列から推定したプローブの２個のプールをバイオサーチ ４６００ＤＮＡ合成機を用いて合成した。第一のプールはＨｉｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈ ｅ−Ｇｌｕ−１ｉｅ−Ａｓｐ残基の配列（Ｔ２７の配列の一部）、即ち５°から ３°に向かって：に対応する。実際にはこのプールは全ての可能な組合せを表わ す２４ｘ３＝４８の異なったオリゴヌクレオチドからなる。第二のプールはＧｉ ｎ−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕアミノ酸残基の配列（Ｖ５の配列 の一部）、即ち５°から３゛に向かって：に対応する。このプールは２’ｘ４＝ ６４の組合せからなる。プローブはターミナルデオキシヌクレオチドトランスフ ェラーゼ（ＴｄＴ）（ＩＢＩ　Ｉｎｃ、により市販）で標識する。

この反応は、「コバルト」反応緩衝液（ＩＢＩ　Ｉｎｃ、により１０倍濃縮液と して供給）：１．４Ｍカコジル酸カリウム　−　ｐＨ７，２，３００ｍＭジチオ トレイトール、１μｍの酵素ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラー ゼ（ＩＢＩ　Ｉｎｃ、）およびＰ３２で標識した５０μＣｉのデオキシシチジル 三燐酸、ｄＣＴＰ、中の溶液としてのオリゴヌクレオチド混合物１１００ｎにつ いて実施する。３７℃で１０分間反応を行ない、次いで０．５ＭのＥＤＴＡＩμ ｍの添加によりこれを停止する。フェノール抽出を行ない、抽出物をバイオゲル ＰＩＯポリアクリルアミドのカラム（バイオラド：１５０−１０５０）で透析す る。

２）尿酸オキシダーゼのｃＤＮＡを含むコロニーのハイブリダイゼーションおよ び検出 グルンシュタインおよびホグネスにより開発されたインジ−トウハイブリダイゼ ーション技術（１９７５、プロシーディングズ・オン・ナショナル・アカデミ− ・オン・サイエンシズ（Ｕ、　Ｓ、　Ａ。

）７２巻３９６１頁）により約４００００コロニーをスクリーニングする。６０ ００の細菌をペトリ皿に蒔き、孤立したコロニーを得る。３７℃で２４時間イン キュベーションした後、各濾紙をプローブの２個のプールのうち片方で処理すべ く、各々の皿を２枚の濾紙に写し、こうして得られた全コロニーをプローブの２ 個のプールで平衡して試験する。

この濾紙を、６ｘＳＳＣ，１０ｘデンハート溶液および１００μｇ／ｍ１の超音 波処理し変性させた鮭の精子ＤＮＡ　（シグマ）を含有する緩衝液中のプローブ の２個のプールのうち一方とハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーシヨンは 温度４２℃で１６時間行なう。５ｘＳＳＣ溶液は２０ｘＳＳＣ溶液の希釈により 得る。２０ｘＳＳＣ緩衝液の調製はマニアティス、フリトウシュおよびサムブル ーフ（ｏ　ｐ、引用）により記載されている。要約するとこの緩衝液は１７５． ３ｇ／ｌのＮａＣ１および８８．　２　ｇ／　Ｉ　（Ｄり：ｒ−ン酸’ｒトリウ ムを含有し、ＮａＯＨ１ＯＮ数滴でｐＨ７に調節する。１０Ｘデンハート溶液は 、最終容量５００ｍ１につきソイコル１ｇ１ポリビニルピロリドン１ｇおよびヒ ト血清アルブミン１ｇを含有する６ｘＳＳＣ溶液中４２℃で洗浄した後（水槽を ５回交換して３時間）、この濾紙をジョゼフ紙で拭き取りオートラジオグラフィ ーにかける。１６時間後に濾紙を展開する。コロニーの約０．５％の分画がプロ ーブの２個のプールとハイブリダイズしていることがわかった。

この分画から５個のコロニーを取り精製した。これらのコロニーの各々からプラ スミドＤＮＡを調製し、このＤＮＡをＢａｍＨＩ、またはＨｊｎｄｌｌｌ、また はＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉの両者で消化することにより分析した。

アガロースゲル上での分析の後、得られた５個のプラスミドがＢａｍＨＩおよび ＨｉｎｄＩＩｒにより直線化されていることがわかった。二重消化はクローニン グされたｃＤＮＡの全体に対応するフラグメントの放出を可能にする。このフラ グメントの大きさは、３つの事例で約１．２ｋｂであり他の２つの事例では約０ ．９ｋｂである。以下の配列決定のために０．９ｋｂフラグメントの１個および １．２ｋｂフラグメントの１個を選び再クローニングした（下記の実施例６参照 ）。

実施例６　尿酸オキシダーゼｃＤＮＡの配列の決定一方で０．９ｋｂフラグメン トの１個（クローン９Ａ）、そして他方では１．２ｋｂフラグメントの１個（ク ローン９Ｃ）を−末鎖ファージＭ１３の複製型のＤＮＡに再クローニングした。

一方で０．９ｋｂフラグメント、他方で１．２ｋｂフラグメントを含むＭ１３ク ローンのＤＮＡをエキソヌクレアーゼで消化して一連の重複するＭ１３クローン を生成させる（方法・ＩＢＩの「サイクロンＩバイオシステム」）。このクロー ンをジデオキシリボヌクレオチド法（サンガー等、ＰＮＡＳ−Ｕ、Ｓ、Ａ、−１ ９７７，１４巻５４６３−５４６７頁）によって配列決定した。

クローン９Ｃのヌクレオチド配列を第３図に示すが、さらにこれは、矢印によっ てクローン９Ａの始まりを、そして星印＊が後に続（ヌクレオチド記号によって 、クローン９Ｃのヌクレオチドとは同一でないクローン９への配列決定されたヌ クレオチドをも示している（２個の配列および、これに続く組み立て（実施例１ ０参照）に使用されるＡｃｃＩおよびＢａｍＨＩ制限サイトを照合した場合）長 い方のフラグメント（クローン９Ｃ）のヌク、レオチド配列は２個の相違の外は 短い方のフラグメント（クローン９Ａ）のヌクレオチド配列と重複していること がわかった（第３図参照）。一方の相違は静止性のものであり、他方はトリプト ファン残基からグリシン残基への変化に対応する。これらの相違は、単離された メツセンジャーＲＮＡにおける相違のため（前記実施例２参照）、またはｃＤＮ Ａライブラリーを構築する際に使用した逆転写酵素の誤りのため（前記実施例３ 参照）か、いずれかによるものであろう。Ａ、フラブス尿酸オキシダーゼはのゲ ノム遺伝子の配列はこの不明確さの克服を可能にするものである：これはトリプ トファン残基である（したがっておそらく逆転写酵素の誤り）。

長い方のフラグメントの場合、ＡＴＧコドン（第３図中１０９の位置）が、その 配列が精製Ａ、フラブス尿尿酸オキジダーゼ部分的配列に相当する（実施例４参 照）、分子量約３４２４０Ｄａの３０２個のアミノ酸のポリペプチドに対応する 解放読み取り枠を解放する。

第４図は、ＡＴＧコドンにより解放されるＤＮＡ配列およびコードされているポ リペプチド、ならびに、コードされているポリペプチドの向い側の矢印によって 、Ａ、フラブス尿酸オキシダーゼをトリプシンおよびプロテアーゼｖ８で加水分 解して得られる配列決定されたペプチド（実施例４参照）を示している。

このポリペプチド配列はＳｅ　ｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕの三つ組で終止することがわ かったが、これはベルオキシソームに存在する酵素に典型的である（グールド・ Ｓ、Ｊ、等、ジャーナル・オン・セル・バイオロジー１０８巻（１９８９）１６ ５７−１６６４頁）。

実施例７　尿酸オキシダーゼｃＤＮＡのための発現ベクターの組み立て 大腸菌における発現のためのベクター、プラスミドｐ４６６を調製した。これは 、複製起点およびアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢＲ３２７のフラグメントか らなる。さらにこれは大腸菌の合成プロモーター（Ｒ，ロドリゲスおよびＭ、チ ェンバリン、「プロモーターズ　−　ストラクチュア・アンド・ファンクション （１９８２）、ブリージャー）、シャインーダルガーノ配列、ならびにこれに続 く唯一のＮｄｅＩおよびＫｐｎＩサイト、転写ターミネータ−（ファージｆｄ由 来）およびＩａｃ　ｉ　遺伝子を含むポリリンカーをも含んでいる。

このプラスミドは、大腸菌中のｈＧＨのための発現プラスミド（ｐ　４６２）か ら、ｈＧＨ遺伝子を持っているフラグメントを尿酸オキシダーゼのｃＤＮＡで１ 換することにより組み立てられる。

これよりプラスミドｐ４６６の組み立てを以下の記述で詳細にわたって記載する が、これは第５．６．７．８および９図に関連するものである。

第５図はプラスミドｐ１６３．１の制限地図を示している。以下の記号に従って 異なった制限セグメントを随意に標識している：−−−−−一＝　プラスミドｐ ＢＲ３２２から誘導されたＤＮＡセグメント 一豊−−＝　複製起点の位置（ＯＲＩ）＝　ｈＧＨの天然前駆体をコードしてい る配列を含むＤＮＡセグメント °、゛、・：°°・′−１−゛・＝　転写ターミネータ−を含むファージｆｄの ＤＮＡセグメント 盃ワＺＺ乙乙＝　トリプトファン−ラクトースＵＶ５ノｈイブリツドのプロモー ター−オペレーターを含むＤＮＡセグメント智■■■■■　＝　β−ラクトマー ゼをコードしているＤＮＡセグメント（ＡｐＲ：アンピシリン耐性） 第６図はプラスミドｐ１６０の制限地図を示しており、そのＰｖｕ　Ｉ　−Ｘｈ ｏ　Ｉ−ＢａｍＨＩ　（１）およびＰｖｕＩ−○ＲＩ−ＢａｍＨＩ（２）フラグ メントはそれぞれプラスミドｐ１６３，１およびｐＢＲ３２７をその起源とし、 小さなりａｍＨＩ　（２）　−ＢａｍＨｌ　（１）フラグメントは下記のフラグ メント３である。

第７図はプラスミドｐ３７３．２の制限地図である。以下の記号に従って異なっ た制限セグメントを随意に標識している：＋−＋−＋”　プラスミドｐＢＲ３２ ７から誘導されたＰｖｕ　１−　Ｂａｎ　ＨＩ配列 一−−−−−＝　プラスミドｐ１６３，１から誘導されたＰｖｕ　Ｉ−Ｘｈｏｌ 配列 ジＺＺ乙２＝　プラスミドｐ１ｓａ、１から誘導されたＸｈｏＩ−ＨｉｎｃＩＩ 配列 上五区ｘＸ乙＝　下記のフラグメント３・　・・°−！゛ニー、−＝　転写ター ミネータ−を含むファージｆｄのＤＮＡセグメント る合成りｇｌｌＩ−ＨｉｎｄＩ　Ｉ　Ｉフラグメント、プラスミドｐ４６２の制 限地図である。

ゼをコードしている遺伝子を含むＮｄｅＩ−ＫｐｎＩフラグメント、プラスミド ｐ４６６の制限地図である。

１）プラスミドｐ３７３，２の組み立て使用する方法は、一般に入手可能な既に 存在するプラスミドから得られるフラグメント、および現在普通に用いられる技 術により合成で調製されるフラグメントを用いる。使用されるクローニング技術 は、Ｔ、マニアテイス、Ｅ、Ｆ、フリトウシュおよびＪ、サムブルーフ（コール ド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（１９８２））により記載されている ものである。このオリゴヌクレオチドはバイオサーチ４６００ＤＮＡ合成機を用 いて合成する。

欧州特許出願Ａ−０２４５１３８号に記載され、１９８６年２月１７日、照会番 号ｌ−５３０の下でＣＮＣＭに寄託されているプラスミドｐ１６３，１　（第５ 図）を、酵素ＰｖｕＩおよびＢａｍＨＩで消化した。このプラスミドはｈＧＨを コードする遺伝子を含んでいる。制限酵素ＸｈｏＩの作用部位を含む、第５図に 示したＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（以後フラグメント１と呼ぶ）を精製 した。

同様にして、当業者に周知のプラスミドｐＢＲ３２７（Ｑ、Ｖ−ソベロン・Ｘｌ 等、ジーン、９巻（１９８０）２８７−３０５頁）を酵素Ｐｖｕ　ＩおよびＢａ ｍＨＩで消化した。複製起点を含むＰｖｕＩ−ＢａｍＨＩフラグメント（以後フ ラグメント２と呼ぶ）を精製した。

次にフラグメント３を調製した。これはｌａｃ　ｉ　遺伝子およびそのプロモー ターを含む合成りａｍＨＩ　（１）−ＢａｍＨＩ　（２）フラグメントであって 、以下の配列を持ち、この中で鎖の２つの端は、第６および７図に描かれたプラ スミド中でフラグメントの方向を明記するために、番号１および２によって特定 している：フラグメント３ ＢａｘｎＨＩ　（１） ５’　ＧＡＴＣＣＧＣＧＧＡＡＧＣＡＴ　ＡＡＡＧＴＧＴＡＡＡ　ＧＣＣＴＧＧ ＧＧＴＧ　ＣＣＴＡＡＴＧｆ、ＧＴＧＡＧＣＴＡＡＣＴＴ　ＡＣＡ７ＴＡＡＴＴ Ｇ　ＣＧＴＴＧＣＧＣＴＣＡＣＴＧＣＣＣＧＣＴ　ｒＴごＣＡＧＴＣＧＧＧＡＡ ＡＣＣＴＧＴＣＧＴＧＣＣＡＧＣ丁Ｇ　ＣＡＴＴＡＡＴＧＡＡ　ＴＣＧＧＣＣＡ ＡＣＧ　ＣＧＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＴＴＧＣＧＴＡＴＴＧＧＧＣＧ　Ｃ ＣＡＧＧＧＴＧＧＴ　ＴＴＴＴＣＴＴＴＴＣＡＣＣＡＧＴＧＡＧＡＣＧＧＧＣＡ ＡＣＡＧ　ＣＴＧＡＴＴＧＣＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＴ　ＧＧ（（ＣＴＧＡＧＡ 　ＧＡＧＴＴＧＣＡＧＣＡＡＧＣＧＧＴＣＣＡ　ＣＧＣＴＧＧＴＴＴＧ　ＣＣＣ ＣＡＣＣＡＣＣＣＧＡＡＡＡＴＣＣＴ　ＧＴＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＡＣＣＧＡＧ ＡＴ　ＡＴＣＣＧＣＡＣＣＡ　ＡＣＧＣＧＣＡＧＣＣＣＧＧＡＣＴＣＧＧＴ　Ａ ＡＴＧＧＣＧＣＧＣＡＴＴＧＣＧＣＣＣＡ　ＧＣＧＣＣＡＴＣＴＧ　ＡＴＣＧＴ ＴＧＧＣＡ　ＡＣＣＡＧＣＡＴＣＧ　ＣＡＧＴＧＧＧＡＡＣＧＡＴＧＣＣＣＴＣ Ａ　ＴＴＣＡＧＣＡＴＴＴ　ＧＣＡＴＧＧＴＴＴＧ　ＴＴＧＡＡＡＡＣＣＧ　Ｇ Ａ（ＡＴＧＧＣＡＣＴＣＣＡＧＴＣＧＣＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＣＧＣＴＡＣＣＧ ＣＣＴ　ＧＡＡＴＴＴＧＡ’ｒＴ　ＱＣＧＡＧＴＧＡＧＡＴＡＴＴＴＡＴＧこＣ ＡＧＣＣＡＧＣＣＡＧ　ＡＣＧＣＡＧＡＣＧＣＧＣＣＧＡＧＡＣＡＧ　ＡＡＣＴ ＴＡＡＴＧＧＧＣＣＣＧＣＴＡＡＣＡＧＣＧＣＧＡＴＴＴ　ＧＣＴＧＧＴＧＡＣ Ｃ（ＡＡＡＣＣＧＡＣＣＡＧＡＴＧＣ丁ＣＣＡＣＧＣＣＣＡＧＴＣＧ　ＣＧＴＡ ＣＣＧＴＣＴ　ＴＣＡＴＧＧＧＡＧＡ　ＡＡＡ丁＾ＡＴＡＣＴ　Ｃ７丁（ｉＡＴ ＧＧＧＴＧＴＣ丁ＧＧＴＣＡＧ　ＡＧＡＣＡＴＣＡＡＧ　ＡＡＡＴＡＡＣＧＣＣ ＧＧＡＡＣＡＴＴＡＧ　ＴＧＣＡＧＧＣＡＧＣＴＴＣＣＡＣＡＧＣＡ　ＡＴＧＧ ＣＡＴＣＣＴ　ＧＧＴＣＡＴＣＣＡＧ　ＣＧＧＡＴＡＧＴＴＡ　ＡＴＧＡ丁ＣＡ ＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＧＣＧ　Ｔ丁Ｇ（ＧＣＧＡＧＡ　ＡＧＡＴＴＧＴＧＣＡ　 ＣＣＧＣ（ＧＣＴＴＴ　ＡＣ；１ＧＧＣＴＴＣＧＡＣＧＣＣ（ＪＣＴＴＣＧＴＴ ＣＴＡＣＣＡ丁　ＣＧＡＣＡＣＣＡＣＣＡＣＧＣＣＣＧＣＡＣＣ（ＡＧＴＴＧＡ ＴＣＧＧＣＧＣＧＡＧＡＴ　ＴＴＡＡＴＣＧＣＣＧ　ＣＧＡＣＡＡＴＴＴＧ　Ｃ ＧＡＣＧＧ（ＧＣＧ　ＴＧＣＡＧＧＧＣ（ＡＧＡＣＴＧＧＡＧＧＴ　ＧＧＣＡＡ ＣＧＣＣＡ　ＡＴＣＡＧＣＡＡＣＧ　ＡＣＴＧＴＴＴＧＣＣＣＧＣＣＡＧＴＴＧ ＴＴＧＴＧＣＣＡＣＧＣＧＧＴＴＧＧＧＡＡＴ　ＧＴＡＡＴＴＣＡＧＣＴ（ＣＧ ＣＣＡＴＣＧ　ＣＣＧＣＴＴＣＣＡＣＴＴＴＴＴＣＣＣＧＣＧＴＴＴＴＣＧＣＡ Ｇ　ＡＡＡＣＧＴＧＧＣＴ　ＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＡＣＧＣＧＧＧＡＡＡ ＣＧＧＴＣＴＧ　ＡＴＡＡＣＡＧＡＣＡ　ＣＣＧＧＣＡＴＡＣ丁　Ｃ丁ＧＣＧＡ ＣＡＴＣＧＴＡＴＡＡＣＧＴＴＡＣＴＧＧ７７ＴＣＡ　（Ａ７７（Ａ（（Ａ（Ｃ （ＴＧＡＡ７ＴＧＡ　ＣＴＣＴＣＴＴＣＣＧ　ＧＧ（ＧＣ丁ＡＴＣＡＴＧＣ（Ａ ＴＡＣＣＧ　ＣＧＡＡＡＧＧ？ＴＴ　ＴＧＣＧ（ＣＡＴＴＣＧＡＴＧＧＴＧＴＣ ＣＧ８ａｍＨ１（２） 次いでフラグメント１．２および３をライゲーションして、第６図に示すプラス ミドｐ１６０を得た。

このプラスミドを制限酵素ＨｉｎｃｌｌおよびＰｓｔｌで部分的に消化した。次 に、複製起点を含み第６図に示されるこの大きなＨｉｎｃＩＩ−ＰｓｔＩフラグ メントを、ｈＧＨの天然前駆体のうち最初の４４アミノ酸をコードする配列、お よびこの配列の上流に調節シグナルを有する合成りＮＡフラグメントである、下 に示されるフラグメント４とライゲーションした。

フラグメント４ ＡＴＧ　ＧＣＴ　ＡＣＣＧＧＡ　ＴＣＣＣＣ４ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＣＴＧ　ＣＴＣ ＣＴＧ　ＧＣＴ　Ｔｒｒ　ＧＧＣＣＴＧ　ＣＴＣＴＧＣＣＴf ＧＡＣＡＡＣＧＣＴＡＴＧＣＴ（ＣＧＣＧＣＣＣＡ了ＣＧＴＣＴＧＣＡＣＣＡＧ ＣＴＧＧＣＣＴＴｒＧＡＣ八ＣＣＴＡＣＣへＧ　ＴｒＧ　ＣＧＡ　ＴＡＣＧＡＧ 　ＧＣＧ　ＣＧＧ　ＧＴＡ　ＧＣＡ　ＣＡＣＧＴＧ　ＧＴ（ＧＡ（ＣＧＳ　ＡＡ Ａ　ＣＴＧ　ＴＧＧfＧＣ ＤＮＡｌ・ＩＬＲＡＨＲＬＨＯＬＡＦＬＴＹＣＡＧＧＡＧｎＴＣＡＡＣＡＡＧＣ ＣＴＡＴＡＴＣＣＣＡλＡＧＣＡＡＣＡＧＡＡＧＴＡ丁ＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＡ ＧＴＣＣＴＣＡＡＡ　Ｃｎ　ＣＴＴ　ＣＧＧ　ＡＴＡ　Ｔ；（ｌ　Ｇ：ＩＴ　二 ＣＣＴＴ　ＧＴ（ｎ（ＡＴＡ　ＡＧＴ　易ＧＱεＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦ μ このフラグメントにおいて、アミノ酸は以下のコードに従った文字によって表わ す： Ａ＝アラニン　Ｍ＝メチオニン Ｃ＝システィン　Ｎ＝アスパラギン Ｄ＝アスパラギン酸　Ｐ＝プロリン Ｅ＝グルタミン酸　Ｑ＝グルタミン Ｆ＝フェニルアラニン　Ｒ＝アルギニンＧ＝グリシン　Ｓ＝セリン Ｈ＝ヒスチジン　Ｔ＝スレオニン ■＝インロイシン　Ｖ＝バリン に＝リジン　Ｗ＝トリプトファン Ｌ＝ロイシン　Ｙ＝チロシン プロモーター配列の−３５（ＴＴＧＣＴＴ）および−１０（ＴＡＴＡＡ、Ｔ）、 ならびに当業者に周知のシャインーダルガーノ配列に、このフラグメント中で連 続して下線を付しである。

プラスミドｐ３８０．１はこのようにして取得した。

次いでプラスミドｐ３８０，１を制限酵素Ｃ１ａｌおよびＮｄｅＩで消化して、 ここから上のフラグメント４の小さなＣ１ａＩ−Ｎｄｅｌフラグメントを除去し 、そしてこれを下記のＣ１ａＩ−Ｎｄｅｌフラグメントに置き換えた： ２）プラスミドｐ４６６の組み立て プラスミドｐ３７３，２を酵素ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで二重消化に付 した。この消化から誘導された大きなフラグメントを精製し、そしてその配列が 、３′端においてＫｐｎＩおよび５ｎａＢＩクローニングサイトが後に続＜ｈＧ Ｈ遺伝子の末端の再形成ｅ　を意図するものである、下に示される合成りＮＡフ ラグメントとラリ　イゲーションした。

ＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣＡＣＡＡＡ ＣＴＣＡＣＡＣＡＡＣＧＡＴＧＡＣＧＣＡＣＴＡＣＴＣＡＡＧＡＡＣＴＡＣＧＧ ＧＣＴＧＣＴＣＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＧＡＡＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＧＴ Ｃ（ＴＧＣＧＴＧＡＴＧＡＧＴＴＣＴＴ（ｉＡＴＧＣＣ（ＧＡＣＧＡＧＡＴＧＡ ＣＧＡＡＧＴＣＣＴＴＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡ（。

ＣＴＣＴＧＴＡＡＧＧＡ　ＣＧＣＧＴＡＧＣＡＣＧＴＣＡＣＧＧＣＧＡＧＡＣＡ ＣＣＴＣＣＣＧＴＣＧＡＣＡＣＣＧＡＡＧＡＴＣＡＴＴｃｃＴＡｃｃｃＴＧｃｃ ｏＡｃＧｒＡｃｃｘＣＣＡＴＧＧＧＡどＧＧＧＡＴＧＣＡＴＧＧＴＴＣＧＡこの フラグメントはＢｇｌｌＩおよびＨｉｎｄｌｌＩ粘着末端を含んでいる。このよ うにして作られた新規プラスミドｐ４６２　（第８図参照）は、したがってＫｐ ｎＩサイトおよびＮｄｅｌサイトを含み、尿酸オキシダーゼｃＤＮＡを含むフラ グメントを発現ベクター中でクローニングするために使用される。

約１．２ｋｂの尿酸オキシダーゼｃＤＮＡを有するｐＴＺ１９Ｒから誘導された ハイブリッドプラスミド（クローン９Ｃ）（実施例３参照）は、唯一のＫｐｎｌ サイトを含む。このサイトはｃＤＮＡクローニングサイトの数塩基対下流に位置 する。さらに尿酸オキシダーゼｃＤＮＡは５′端付近に位置するＡｃｃｌサイト を含んでいる。

故にこのｃＤＮＡの大きな部分を占めるＡｃｃｌ−Ｋｐｎｌフラグメントを単離 精製した。２つの相補的オリゴヌクレオチドもまた合成したが、下に示したその 配列： ５　’　−ＴＡＴＧＴＣＴＧＣＧＧＴＡＡＡＡＧ　ＣＡＧ　ＣＧＣＧ　ＣＴＡＣ ＧＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡ　ＴＧ　ＴＴＣＧ　ＣＧ　ＴＡ（ＡＧＡＣＧＣＣＡＴ丁 ＴＴＣＧ丁ＣＧＣＧＣＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＣＴＧＴＴＡＣＡＡＧＣＧＣＡＧＡ −５’は、ｃＤＮＡの５゛端を再構築することを意図している。このようにして 得られたこの合成フラグメントはＮｄｅＩ末端およびもう１つのＡｃｃＩＩ末端 を持っている。このフラグメントおよび合成配列を、ＫｐｎＩおよびＮｄｅＩに よって切り取られた発現ベクターとライゲーションした。この３フラグメントラ イゲーシヨンは、ｐ４６６と呼ばれる大腸菌尿酸オキシダーゼのための発現ベク ター（第９図参照）の取得を可能にする。このプラスミドを制限酵素による一連 の酵素的加水分解に付したが、これにより、予想される制限サイト、特に尿酸オ キシダーゼをコードしている遺伝子の持つ制限サイトの存在の立証が可能となっ た。

したがってプラスミドｐ４６６は、組み立てにより尿酸オキシダーゼをコードし ている遺伝子を含み、以下の配列を有する：ＡＴＧＴＣ工ＧＣ且Ｇ　ＴＡＡＡＡ ＧＣＡＧＣＧＣＧＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＴＧ　Ｔ二ＣＧ（ＧＴＣＴＡ ＣＡＡＧＧＴＴＣＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧＡ　ＡＧＡＣＣＧＧＴＧＴ　ＣＣＡＧ μＣＧＧＴＧ　ＴＡＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣＧＴＣＴＧＴＧＴ　ＧＣＴＴＣＴＧＧ ＡＧ　ＧＧＴＧＡＧＡＴＴＧ　ＡＧＡＣＣＴＣＴＴＡ　ＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＧ ＡＣＡＡＣＡＧＣＧ　ＴＣＡＴＴＧＴＣＧＣＡＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＴＴＡＡＧ ＡＡＣＡ　ＣＣＡＴＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧＣ（ＡＡＧ　ＣＡＧＡＡＣＣＣＣＧ 　ＴＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣＧＧＣＴＣＣＡ７Ｃ（ＴＧＧＧＣ ＡＣＡＣＡ　ＣＴＴＣＡＴＴＧＡＧ　ＡＡＧＴＡＣＡＡＣＣＡｃｕｃｃＡｒＧｃ 　ＣＧＣＴＣＡＣＧＴＣＡＡＣＡＴＴＧＴＣ丁　ＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧ　ＧＡＣ ＣＣＧＧＡＴＧ　ＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧ　ＧＣＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣ ＴＣＣＴＴＣＡ丁ＣＣＧＣＧ　ＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡ　ＧＡＡＧＣＧＧＡＡＴ　 ＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＧＡ　ＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡ ＴＡＴＣＡ　ＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴ　ＧＴＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧ Ａ　ＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡ　ＣＴＣＧ（ＡＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣ ＧＴＧＡＣＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＣＡ　ＣＴＴＡＡＧＧＡＧＡ　ＣＣＴＧＧＧＡ ＣＣＧ　ＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡＣＧＴＣＧＡＴＧＣＣＡＣＴＴＧ　Ｇ ＣＡＧＴＧＧＡＡＧ　ＡＡＴＴ１’ＣＡＧＴＧ　ＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡ　ＧＧＴ ＣＣＧＣＴＣＧＣＡＣＧＴＧＣＣＴＡ　ＡＧＴＴＣＧＡＴＧＣ丁ＡＣＣＴＧＧＧ ＣＣＡＣＴＧＣＴＣＧＣＧ　ＡＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＴＴ　ＧＣ ＴＧＡＡＧＡＴＡ　ＡＣＡＧＴＧＣＣＡＧ　ＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＴＡＴＧ ＴＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡ　ＧＣＡＡＡＴＣＣＴＧ　ＧＣＧＣＧＣＣＡＧＣ ＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡ　ＧＡＣＴＧＴＣＧＡＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＣＣＴＡＡＣ ＡＡＧＣＡ　ＣＴＡＴＴＴ（ＧＡＡ　ＡＴＣＧＡＣＣＴＧＡ　ＧＣ丁ＧＧＣＡＣ ＡＡＧＧＧＣＣＴＣＣＡＡ　ＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡ　ＡＧＡＡＣＧＣＣＧＡ　Ｇ ＧＴＣＴＴＣＧＣＴ　ＣＣＴＣＡＧＴＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＧ　ＴＣＴＧＡ ＴＣＡＡＧ　ＴＧＴＡＣＣＧＴＣＧ　ＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣ Ｔ（上の配列中、Ａ、フラブスから単離されたｃＤＮＡのヌクレオチドとは異な るヌクレオチドに下線を付しである。これらの相違は、ＡＴＧより下流のヌクレ オチド配列を原核細胞の遺伝子内で通常遭遇する配列によりよく対応させるため に合成Ａｃｃｌ−ＫｐｎＩフラグメント中に導入された。） 実施例８　尿酸オキシダーゼｃＤＮＡの発現大腸菌に１２　ＲＲＩ菌株（ベセス ダ・リサーチ・ラボラトリ−・Ｉｎｃ、）を、アンピシリン耐性を得るためにプ ラスミドｐ４６６で、そして負の制御プラスミドｐＢＲ３２２で形質転換した。

アンピシリン耐性コロニーが両方の場合に得られた。各々の型につき１個のコロ ニーを培地（ＬＢ＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ）中で培養した。３７℃で振 盪しつつ１夜経過後に２個の培養を培地（ＬＢ＋アンピシリン１００μｇ／ｍｌ ）で１００倍に希釈した。１時間培養の後ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チ オガラクトシド）１ｍＭを３時間の間加えた。

ウェスタン・プロットによる尿酸オキシダーゼの免疫的検出１）方法 ３時間のＩＰＴＧの導入後に得られた培養物から、０Ｄ＝１において０．２ｍ３ に相当する等分試料を取る。この等分試料を遠心し上清を除去する。次いで残留 物を、当業者に周知の技術であるウェスタン・プロットに付すが、この技術は以 下の工程からなるニー　トリス−ＨＣｌ０．１２５ＭｐＨ６，８，５Ｄ８４％、 ブロモフェノール・ブルー０．００２％、グリセロール２０％、β−メルカプト エタノール１０％よりなるローディング緩衝液と呼ばれる緩衝液中で１０分間煮 沸することにより、この残留物を可溶化する（ラムリ（Ｕ、　Ｋ、ラムリ、ネイ チャー、２２７巻（１９７０）６８０−６８５頁）により記載されたプロトコル に従う）；−　ラムリ（Ｕ、　Ｋ、ラムリ、ネイチャー、２２７巻（１９７０） ６８０−６８５頁）により記載されたプロトコルに従って、この可溶化物に含ま れる異なった蛋白質を電気泳動的に分離する；そして−ゲルに含まれる該蛋白質 をニトロセルロース膜に移す（Ｈ，トービン等、プロシーディングズ・オン・ザ ・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ・ＵＳＡ第７６巻（１９７９） ４３５０−４３５４頁の技術に従う）。

バーネットの技術（Ｗ、　Ｗ、バーネット、アナリティカル・バイオケミストす ・第１１２巻（１９８１）１９５−２０３頁）に従って実施される免疫的検出は 、以下の連続操作を含む二・　このニトロセルロース膜を緩衝液Ａ（トリス−Ｈ Ｃｌ　１０ｍＭ、ＮａＣ１１７０ｍＭ、ＫＣＩ　ＬｍＭ）で１０分間すすぐ；・ 　ニトロセルロース膜を３７℃で３０分間緩衝液Ｂ（牛血清アルブミンを１００ ｍ１につき３ｇの割合で加えた緩衝液Ａ）と接触させる： ・　ニトロセルロース膜を３７℃で１時間抗血清（Ａ、フラブスを認識するポリ クローナル抗体）と接触させる；・　ニトロセルロース膜を緩衝液Ｂですすぐ； ・　ニトロセルロース膜を３７℃で１時間、０．１マイクロキユリ一／ｍ１の割 合で沃素１２５で標識した蛋白質Ｇの溶液と接触させる： ・　膜を緩衝液Ａですすぐ： ・　膜を２枚の吸着シートの間で乾燥する；・　膜をＸ線フィルムと接触させる ；そして、・　フィルムを感光する。

２）結果 プラスミドｐ４６６によって形質転換された菌株は、見かけの分子量約３３ｋＤ ａの蛋白質を過剰生産し、この蛋白質はＡ、フラブス尿酸オキシダーゼに対する 抗体によって認識され、その対照菌株が存在しないことがわかった。

実施例９　尿酸オキシダーゼ活性の検定前実施例に記載された培養条件下で３時 間ＩＰＴＧを導入した後に得られた培養物から、０Ｄ＝１においてＱ、５ｍｌ相 当量に対応する等分試料を取る。この等分試料を遠心し上溝を除去する。残留物 を０．０５ＭｐＨ８，９のＴＥＡ（トリエタノールアミン）緩衝液１ｍｌ中に取 る。この細胞懸濁液をＷ１０超音波ソニケーター（ストレングス８およびインテ ンシテイ−４に調節する）を用いて水中で３０秒間２回超音波処理する。この抽 出物を１００００ｇで１０分間遠心し、上清を検定に使用する。

プラスミドｐ４６６により形質転換された大腸菌に１２から任意に取った４個の コロニー（コロニーＡ、、Ｂ、、Ｃ＋およびＤ＋）およびプラスミドｐＢＲ３２ ２により形質転換された１個のコロニーについて、上記操作を行なう。

１）原理 尿酸のアラントインへの変換は２９２ｎｍにおける吸収の減少を伴う。この反応 は以下の通りである： 尿酸　アラントイン （２９２ｎｍにおいて吸収） ２）試薬 ａ）ＴＥＡｏ、０５Ｍ　ｐＨ８，９／ＥＤＴＡ緩衝液−ＴＥＡ（分析用試薬　− プロラボｒｅｆ、２８７．４６．２６６）７．５ｇを蒸留水４００ｍ１に溶解す る：−コンプレキソンＩ　Ｉ　Ｉ　（メルク　−ｒｅｆ、８４１８）０゜３７２ ｇを蒸留水５０ｍ１に溶解する；−２つの溶液を合し５００ｍ１とする（溶液１ ）ニー　二の溶液のｐＨを０．２ＮＨＣＩで８．９に調節する：そして−蒸留水 で容量を１０１００Ｏとする（溶液２）。

ｂ）尿酸の保存溶液 −尿酸（カルビオケム　−　ｒｅｆ、６６７１）１００ｍｇを５０ｍ１の溶液１ に溶解する； −０，２ＮＨＣ１でｐＨを８．９に調節する；そして、−蒸留水で容量を１００ ｍ１とする。

得られたこの溶液は４℃で１週間保存できる。

Ｃ）尿酸基質溶液 −尿酸の保存溶液（カルビオケム　−ｒｅｆ、６６７１．）１゜５ｍｌを取りＴ ＥＡ緩衝液（分析用試薬　−プロラボｒｅｆ、２８７．４６．２６６）で１００ ｍ１に希釈する。

この溶液は、その日に使用しなければならない。

３）方法 以下の容量を、２９２ｎｍに調節しサーモスタットで３０℃に調温した分光光度 計の石英セル内に導入するニー　６００μｍの尿酸基質溶液（３０℃に予熱）お よび、−ＴＥＡ　（ｐＨ８，９）２００μＩを加えた上記の上清１００μｍ　（ ３０℃に予熱）。

混合後、光学密度の変化を３０秒ごとに５分間読みとる。これらの読み取り値か ら△Ｅ１即ち毎分の光学密度の変化を導く。

４）結果 Ｕ／ｍｌ　ＯＤＩで表わされる尿酸オキシダーゼの酵素活性Ａを［式中、記号Ｖ ｒ、ｄ、εｌおよびｙ　Ｐ　ｔは、各々反応容量（０，９ｍ１）、希釈因子（２ ）　、２９２ｎｍにおける尿酸の消衰係数（１２，５）および被験試料の容量（ ０，１ｍ１）を表わす］を用いて△Ｅの測定値から算出する。

得られた結果を下の第２表にまとめる。

第２表 上記の表から、プラスミドｐ４６６により形質転換したＥ、コリ細胞は、ＩＰＴ Ｇの存在下、尿酸オキシダーゼ活性生成能があることが明らかである。

実施例１０：酵母の尿酸オキシダーゼｃＤＮＡのための３つの発現ベクターの構 築：　プラスミドｐＥＭＲ４６９、ｐＥＭＲ４７３及びｐＥＭＲ５１５ 利用した方法は、一般に入手可能な既に存在するプラスミドから得られるフラグ メントを用い、フラグメントは一般に用いる技術により合成的に製造した。利用 したクローニング技術は、「モレキュラー・クローニング、ア・ラボラトリイ・ マニュアル」（コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリイ、１９８４）で ティー・マニアティス、イー・エフ・フリツク及びジエイ・サンプルツクにより 記載されたものを用いた。オリゴヌクレオチドは、バイオサーチ４５ＱＱＤＮＡ シンセサイザーを用いて合成する。

以下の記載により、プラスミドｐＥＭＲ４１４、ｐＥＭＲ４６９及びｐＥＭＲ４ ７３の制限地図をそれぞれ示す図１０．１１及び１２参照すれば明瞭に理解され る。これらの図で用いる記号は以下の記載で特定される。部位がクルノウポリメ ラーゼにより平滑になった場合、印“０”を用い、部位がライゲーションにより 除かれた場合、カッコで示す。

１）プラスミドｐＥＭＲ４６９の構築 このプラスミドは、以下の成分の連続ライゲーションにより構築される、シャト ルベクターＥ９　コリ酵母ｐＥＭＲ４１４から構築した。

ｐＢＲ３２２のアンピシリン耐性遺伝子ＡｍｐＲの上流部（ストクリラフ、１９ ７９、コールド・スプリング・シンブ・フォート・パイオル、４３．７７９）及 び内因性２μフラグメント、Ｂ型からなり、そのプロモーター（ＬＥＵ２ｄと呼 ばれる）の除去により部分的に修飾されたＳ、セレビシェの遺伝子、遺伝子位置 ５−ＴＢ（ＲＥＰ３）及び２μフラグメントの複製開始点（ハートレイ及びトネ ルソン、１９８０、ネイチャー、２８６．８６０−８６５）を運ぶプラスミドｐ ＪＤＢ２０７の図１０において土上土丘で示されるＰｓｔＩ　−Ｈｌｎｃｌｌｌ ［’フラグメント（ＢＥＧＧＳ、１９７８：　ジーン・クローニング・イン・イ ースト−ｐ、１７５−２０３：　ジエネテイツク・エンジニアリング、２巻−ウ ィリアムソン−アカデミツク・プレス−ロンドン英国）。本フラグメントのＨｉ ｎｄ　ｍ末端はタレノウポリメラーゼの作用により平滑化された。図１０でＨｉ ｎｄｎ［’により示す。

−そのプロモーターを伴うＵＲＡ３を含む酵母のクロモシームの、図１０におい てＸで示されるＨｉｎｄＩ［［−３ｍａ　Ｉフラグメント（ローズ等、１９８４ 、ジーン、２９、ｐ、１１３−１２４）。このＨｉｎｄ−８ｍａＩフラグメント はプラスミドｐＦＬＩ（チェヴアリア等、１９８０、ジーン１１．１ｌ−１９） から生じる。このプラスミドのＨｉｎｄＩ［［末端は、クルノウポリメラーゼの 作用により平滑にした。

一ラッセル及びスミスにより記載された天然バージョン（ｖｅｒｓｉｏｎ）（ラ ッセル等、（１９８３）ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリイ、２ ５８．２６７４−２６８２）とは、制限部位の導入を意図する少しの塩基対のみ が異なるＡＤＨ２遺伝子のプロモーターの合成バージョンを含む、図１０におい て　により示される。ＳａｍＩ−ＢａｍＨＩフラグメント）。（天然配列は、は んの少し異なる結果で用いることができた。）本フラグメントの配列は以下に示 される。

ＳＭ −酵母ＰＧＫ遺伝子の３゛末端を保有する、図１０において■で示されるＢｇｌ ｌｒ−Ｈｉｎｄｌｆｆフラグメント。本フラグメントは、ヒッツエマン等により 記載されたＰＧＫ遺伝子（１９８２、ヌクレイツク・アシッズ・リサーチ、１０ ，７７９１−７８０８）を保有し、ただ一つのＢｇ■部位を有する酵母クロモシ ームＤＮＡのＨｉｎｄ　ｎＩフラグメントのＢｇｍによる完全消化から生ずる。

本消化で、２つのＨｉｎｄＩＩ［−Ｂｇｎ［フラグメントが得られ、その小さい 方、約０．４Ｋｄのフラグメント、これは酵母ＰＧＫ遺伝子の３′末端を保つ、 を維持する。後者のフラグメントはヒッツエマン等により記載される（前掲書中 ）。Ｂｇ■部位は、先のフラグメントのＢａｍＨＩでクローン化され（ＢａｍＨ Ｉ及びＢｇＩ［［部位は従って消える）、フレノウポリメラーゼの作用により平 滑にされたＨｉｎｄｌｌＩ部位は、以下に記載される、ｐＢＲ３２２のＰｖａＩ Ｉ−ＰｓｔＩフラグメントのＰｖｕｌ１部位でクローン化される。

一複製開始点及びアンピシリン耐性遺伝子Ａｍｐ’の下流部を含む、ｐＢＲ３２ ２の、図１０において’ＫＫＫで示される、Ｐｖｕｌｌ−ＰｓｔＩフラグメント 。

従って、この方法で形成されるプラスミドｐＥＭＲ４１４は以下の成分を含む。

一複製開始点及びＥ、コリ細胞内プラスミドの複製及び選択を可能にするアンピ シリン耐性遺伝子Ａｍｐ’。これらの成分はＥ、コリ細胞内の形質転換を可能に する。

一酵母の複製開始点（ＡＲＳ）、プロモーターを伴わないＳ、セレビシェの遺伝 子位置ＳＴＢ及びＬＥＵ２遺伝子並びにそのプロモーターを伴うＳ、セレビシェ のＵＲＡ３遺伝子。これらの成分は、ニス・セレビシアのプラスミドの複製及び 選択並びに内因性２μプラスミド含有細胞内の十分な分配効力を可能にする。

プラスミドｐＥＭＲ４１４は、制限酵素ＮｈｅＩ及びＣ１ａＩで完全にした。Ｕ ＲＡ３遺伝子を含む小Ｎｈｅ　Ｉ　−Ｃ１ａ　Ｉフラグメント、以下フラグメン トＡという、を精製した。

プラスミドｐＥＭＲ４１４を酵素ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩで完全に消化した。特 にＬＥＵ２ｄ遺伝子及びプラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点を含む大きなＮｈ ｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメント、以下フラグメントＢという、を精製した。

尿酸オキシダーゼｃＤＮＡ配列由来の蛋白質をコードする遺伝子の開始を含む合 成Ｃ１ａＩ−ＡｃｃＩフラグメント（クローン９Ｃ）も、調製した。本フラグメ ントは、コード化するアミノ酸を変化することなく酵母に慣行的であるコドンを 挿入する目的で導入された（シャープ等、１９８６、ヌクレイツク・アシッズ・ リサーチ、１４巻含む。このフラグメント、以下フラグメントＣと呼ぶ、の配列 は以下の通りである（下線のヌクレオチドはクローン９Ｃに関して修飾したもの である）： クローン９Ｃのプラスミド（図３参照）を酵素ＡＣＣＩ及びＢａｒｎＨ１で消化 した。尿酸オキシダーゼｃＤＮＡの末端を含むＡｃｃＩ　−ＢａｍＨＩフラグメ ント、以下フラグメントＤという、を精製した。このフラグメントは以下の配列 を有する。

′　Ｃ丁λ０λλＣ−ＧＴＴＣＡＣλＡＧＧＡＣＧＸＧ　λＡＣｐｃ＝ｃｃＡＡ ｃ？ｃ＝丁ｃｃｒｃｃ？ｃｔ：ｃフラグメントＡＳＢ、Ｃ及びＤをライゲーショ ンして図１１に示すプラスミドｐＥＭＲ４６９とした。図において、印は図１０ におけると同意義であり、新しいＣ１ａＩ−ＡｃｃＩ及びＡｃｃ　Ｉ　−Ｂａｍ ＨＩフラグメントは１ｆｆｉで示される。

２）プラスミドｐＥＭＲ４７３の構築 プラスミドｐＥＭＲ４６９を酵素Ｍ１ｕＩ及び５ｐｈＩで完全に消化した。尿酸 オキシダーゼ遺伝子を含む、大きなＭｌｕ　Ｉ　−Ｓｐｈ　Ｉフラグメントを、 Ｓ、セレビシェのプロモーターＧＡＬ７のＴＡＴＡ組成から上流の配列の部分（ ２００ｂｐ）に相当し、該部分は上流活性化配列（ＵＡＳ）を含み、その配列が 以下に示される、合成フラグメントとをライゲーションした。

この方法で得られるプラスミドｐＥＭＲ４７３は図１２に示され、図において、 印は図］１におけると同意義であり、導入された新しいＭｌｕ　Ｉ　−Ｓｐｈ　 ｒフラグメントは】コロ（により示される。

３）プラスミドｐＥＭＲ５１５の構築 プラスミドｐＥＭＲ４７３を酵素ＸｂａＩで部分的に消化し、酵素Ｍ１ｕＩで完 全に消化した。大きいＸｂａ　Ｉ　−Ｍｌｕ　Ｉフラグメントを精製した。この フラグメントは、特に複製開始点及び２μフラグメントの遺伝子位置の配列、Ｌ ＥＵ２ｄ遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子ＡｍｐＲ，ｐＢ　Ｒ３２２の複製開始 点及び尿酸オキシダーゼ用の発現カセットを含む。一方、それは、ＵＲＡ３遺伝 子及びＸｂａ、ＩとＮｈｅ工部工部間の２μフラグメントの部分のどちらも含ま ない。

大きなＸｂａ　Ｉ　−Ｍｌｕ　Ｉフラグメントは、ＭｌｕＩ及び修飾ＸｂａＩ粘 着性末端を含有する以下の配列アダプターにより再環化した。

修飾ＸｂａＩ ＴＣＴＡＧＧＣＴＡ、ＧＣＧＧＧＣＣＣＧＣＡＴＧ。

この方法で得たプラスミドｐＥＭＲ５１５は、２μフラグメントのＦＬＰ遺伝子 によりコード化したコンビナーゼの標的ＦＲＴ部位の三成分の一つのみを有する 。

プラスミドｐＥＭＲ４６９、ｐＥＭＲ４７３及びｐＥＭＲ５１５は以下の配列を 有する尿酸オキシダーゼをコード化している遺伝子を有する。

ＡＴＧＴＣＴＧＣＴＧ　ＴＴＡＡＧＧＣＴＧＣＴＡＧＡＴＡＣＧＧＴ　ＡＡＧＧ ＡＣＡＡＣＧ　Ｔ丁ＡＧＡＧＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＴＣＡＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧ Ａ　ＡＧＡＣＣＧＧＴＧＴ　ＣＣＡＧＡＣＧＧ丁Ｇ　ＴＡＣＧＡＧＡＴＧＡＣＣ ＧＴＣＴＧＴＧＴ　ＧＣＴＴＣＴＧＧＡＧ　ＧＧＴＧＡＧＡＴＴＧ　ＡＧＡＣＣ ＴＣＴＴＡ　ＣＡＣＣＡＡＧＧＣＣＧＡＣＡＡＣＡＧＣＧ　ＴＣＡＴＴＧＴＣＧ ＣＡＡＣＣＧＡＣＴＣＣＡＴ丁ＡＡＧＡＡＣＡ　ＣＣＡＴＴＴＡＣＡＴＣＡＣＣ ＧＣＣＡＡＧ　ＣＡＧＡＡＣＣＣＣＧ　ＴＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＧＡＧＣＴＧ丁 ＴＣＧＧＣ丁ＣＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣＡＣＡＣＡ　ＣＴＴＣＡＴＴＧＡＧ　ＡＡ ＧＴＡＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡ丁ＧＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＣＡＡＣＡＴＴＧＴ ＣＴ　ＧＣＣＡＣＣＧＣＴＧ　ＧＡＣＣＣＧＧＡＴＧ　ＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧ　 ＧＣＡＡＧＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴＣＣＴＴＣＡＴＣＣＧＣＧ　ＡＣＡＧＣ ＧＡＧＧＡ　ＧＡＡＧＣＧＧＡＡＶ　Ｇ丁ＧＣＡＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧＧＴＣＧ Ａ　ＧＧＧＣＡＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡＴＡＴＣＡ　ＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴ　ＧＴ ＣＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＣＴＧＡ　ＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡ　ＣＴＣＧＣＡ ＧＴ工ＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴＧＡＣＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＣＡ　Ｃ ＴＴＡＡＧＧＡＧＡ　ＣＣＴＧＧＧＡＣＣＧ　ＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣμＣＣＧＡ ＣＧＴＣＧＡＴＧＣＣＡＣＴＴＧ　ＧＣＡＧＴＧＧＡＡＧ　ＡＡＴＴＴＣＡＧＴ Ｇ　ＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡ　ＧＧＴＣＣＧＣＴＣＧＣＡＣＧ丁ＧＣＣ丁Ａ、ＡＧ ＴＴＣＧＡＴＧＣＴＡＣＣＴＧＧＧＩ：ＣＡＣＴＧＣＴＣＧＣＧ　ＡＧＧＴＣＡ ＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＴＴＴＴ　ＧＣＴＧＡＡＧＡＴＡ　ＡＣＡＧＴＧＣＣＡＧ 　ＣＧＴＧＣＡＧＧＣＣＡＣＴＡＴＧＴＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＡＧＡ　ＧＣＡＡ ＡＴＣＣＴＧ　ＧＣＧＣＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＡＴＣＧＡ　ＧＡＣＴＧＴＣＧ ＡＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＣＣＴＡＡＣＡＡＧＣＡ　ＣＴＡＴＴＴＣＧＡＡ　ＡＴ ＣＧＡＣＣＴＧＡ　ＧＣＴＧＧＣＡＣＡＡＧＧＧＣＣＴＣＣＡＡ　ＡＡＣＡＣＣ ＧＧＣＡ　ＡＧＡＡＣＧＣＣＧＡ　ＧＧ丁ＣＴＴＣＧＣＴ　ＣＣＴＣＡＧＴＣＧ ＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＧ　ＴＣＴＧＡ丁ＣＡＡＧ　ＴＧＴＡＣＣＧＴＣＧ　ＧＣ ＣＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡＡＧＴＣＴＡＡＡＴＴＧ。

実施例１１．　プラスミドｐＥＭＲ４６９、ｐＥＭＲ４７３及びｐＥＭＲ５１５ によるＥＭＹ７６１酵素株の形質転換−プラスミドｐＥＭＲ５１５によるＥＭＹ ５００及びＧＲＦ１８酵素株の形質転換−ウラシルの原栄養性またはロイシンの 原栄養性のいずれかの選択を伴う形質転換。

サツカロミセス・セレビシェの３つの非同質遺子系統を受容株として用いた。

−ＥＭＹ７６１株（Ｍａｔａ、　１ｅｕ２．　ｕｒａ３．　ｈｉｓ３．　ｇａｌ ）−ＥＭＹ５００株（Ｍａｔａ、　１ｅｕ２．　ｕｒａ３．　ｐｅｐ４）−ＧＲ Ｆ１８株（Ｍａｔａ、　１ｅｕ２．　ｈｉｓ３）ＧＲＦ１８株はこの分野の当業 者によく知られている（ゲリー・フィフク、エムアイティー、ニーニスエイ）。

ＥＭＹ７６１及びＥＭＹ５００株は、ＧＲＦ１８株に関連する。これらはＧＲＦ １８株を、ＦＬ１００株（番号２８３８３の下にＡＴＣＣに寄託された）から誘 導されたｕｒａ　３株、及びイー・ダブリュー・ジョーンズにより記載された（ イー・ダスリュー・ジョーンズ等（１９７７）ジエネティックス、８５．２３） ２０　Ｂ　１２株（Ｍａｔａ、　ｔｓｐｌ、　ｐｅｐ４）で続けて交雑すること により得た。

ａ　ＲＦ　１８株は、１９８９年１２月２８日に寄託番号ｌ−９２０の下にＣＮ ＣＭに寄託されたＧＲＦ１８　ｐＥＭＲ５１５（ｌｅｕつ株のプラスミドｐＥＭ Ｒ５１５をキユアリング（ｃｕｒｉｎｇ）することにより得ることができ、ＥＭ Ｙ５００株は、１９８９年１２月２８日に寄託番号１−９１９の下にＣＮ　ＣＭ に寄託されたＥＭＹ５００　ｐＥＭＲ５１５（ｌｅａ”）のプラスミドｐＥＭＲ ５１５をキユアリングすることにより得ることができる。

これらの株は、プラスミドｐＥＭＲ４６９及びｐＥＭＲ４７３の各々に存在する ＬＥＵ２ｄ欠損選択マーカー及びＵＲＡ３選択マーカーにより補体することが可 能な変異（ｌｅｕ　２及びｕｒａ　３　）を含む。

１）ウラシルの原栄養性の選択を伴う形質転換ＥＭＹ７６１株のコロニーを１０ ０ｍ１の液体ＹＰＧ培地（以下の表■参照）と呼ばれる培地に接種するのに用い た。細胞密度がｍ１当たり１０４細胞に達したとき、細胞を、この分野の当業者 によく知られており、イトオ等により記載された（イトオ等、１９８３、ジャー ナル・オン・バクテリオロジイ、１５３．１６３−１６８）技術による形質転換 のために酢酸リチウム０．２Ｍで処理した。

ＥＭＹ７６１細胞を、平行して約各１μｇのプラスミドｐＥＭＲ４６９及びｐＥ ＭＲ４７３で形質転換した。形質転換した細胞はウラシルで不含固体培地（以下 の第３表参照）と呼ばれる培地上ウラシル（ｕｒａつ栄養要求性質を選択する。

ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４６９（ｕｒａ”）形質転換株及びＥＭＹ　７６１　ｐ ＥＭＲ４７３（ｕｒａつ形質転換株をこうして維持した。

２）ロイシンの原栄養性の選択を伴う形質転換用いた形質転換技術は、ベッグス 等により記載された（ベッグス等（１９７８）ネイチャー２７５．１０４−１０ ９）ものの変法である。それは、酵母を浸透安定剤、即ちソルビトールＩＭ濃度 の存在下、プロトプラスト化処理に付すことを含む。

正確な形質転換プロトコールは以下に特定される。

ａ）　２００ｍ１の液体ＹＰＧ培地（表■参照）に定常期に培養株の約５Ｘ］、 ０’細胞を接種１１、この方法で接種した培養株を一晩３０℃で撹拌する。

ｂ）培養株の密度がｍ１当り約１０７細胞に達したとき、細胞を４００Ｏｒｐｍ で５分間遠心し、残渣をソルビトールＩＭで洗浄するＣ）細胞を、２５ｍＭ　Ｅ ＤＴＡ及び５ＱｍＭジチオスレイトールを含む５ｍｌのソルビトール溶液ＩＭに 懸濁し、１０分間３０℃でインキュベートする。

ｄ）細胞を１０ｍ１のソルビトールＩＭで１度洗浄し、２０ｍ１のソルビトール に懸濁する。ジモラーゼ−１００７（セイカガク・コーギョウ株式会社から販売 される、アルソバフタ−・ルテウス培養上清をアフィニティカラムで部分精製す ることにより得られ、β−１，３−グルカンラミナリペンタヒドロラーゼを含む 製剤）を最終濃度２０μｇ／ｍｌまで加えて懸濁液を室温で約１５分間インキュ ベートする。

ｅ）細胞を、ソルビトール含有培地（以下の第３表参照）と呼ばれる、ソルビト ール含有培地２０ｍ１に再び懸濁し、２０分間３０℃で緩やかに撹拌しながらイ ンキュベートする。

ｆ）細胞を３分間２５０Ｏｒｐｍで遠心する。

ｇ）細胞を９ｍｌの形質転換緩衝液（ソルビトールＩＭ、トリス−ＨＣｌ　１０ ｇＭ　ｐＨ７，５及びＣａＣ１ｔ　１０１ｎＭ）に再び懸濁する。

ｈ）　０．１．ｍｌの細胞と５μｌのＤＮＡ溶液（約５μｇ）を加えて得られる 懸濁液を１０〜１５分間室温に保持する。

ｉ）１ｍｌの以下の溶液を加える。

ポリエチレングリコールＰＥ０４０００　２０％、トリス−ＨＣｌ　１０ｍＭ　 ｐＨ７，５及びＣａＣ１２１０ｍＭ。

ｊ）　ｉ）で得られる懸濁液Ｑ、］、ｍｌを、予め溶融処理し、約４５℃で溶液 に保ったロイシン不含固体再産生培地（以下の表■参照）を含有する管に注ぐ。

懸濁液をｌ５ｍ１のロイシン不含固体再産生培地の固体化層を含むペトリ皿に注 ぐ。

ｋ）段階Ｊ）をｈ）で得られる細胞懸濁液の残留物で繰り返す。

形質転換株が３日後現れ始める。

ＥＭＹ　７６１　ｐＥＭＲ４６９（ｌｅｕつ、ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ ｌｅｕつ、ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ５１５（ｌｅｕつ、ＧＲＦ１８ｐＥＭＲ５１ ５（ｌｅｕつ及びＥＭＹ　５００　ｐＥＭＲ５１５（ｌｅｕつ形質変換株はこう して維持された。

第３表 実施例１１．１２．１３及び１４で用いた主要培地−ウラシル不含固体培地 アミノ酸のない６．７ｇの酵母窒素塩基（ディフコから）５．０ｇのカゼイン水 和物（ディフコからのカザミノ酸）１０ｇのグルコース ２０ｇの寒天 全成分を蒸留水中で混合し、蒸留水で最終容量１１にする。１５分間１２０℃で オートクレーブにかける。

−ウラシル不含溶体培地 寒天無しでウラシル不含固体培地の処方を用いる。１５分間１２カザミノ酸のな い６．７ｇの酵母窒素塩基ＣＤＩＦＣＯから）２０ｍｇのアデニン ２０ｍｇのウラシル ２０ｍｇの１−トリプトファン ２０ｍｇの１−ヒスチジン ２０ｍｇの１−アルギニン ２０ｍｇの１−メチオニン ３０ｍｇの１−チロシン ３０ｍｇの１−インロイシン ３０ｍｇの１−ロイシン ５０ｍｇの１−フェニルアラニン １００ｍｇの１−グルタミン酸 １５０ｍｇの１−バリン ４００ｍｇの１−ロイシン ２０ｇのグルコース ２０ｇの寒天 蒸留水中に全成分を混合する。蒸留水で最終容量を１１とする。

１５分間１２０℃でオートクレーブにかける。オートクレーブ処理後、２００ｍ ｇの１−スレオニンと１００ｍｇの１−アスパラロイシン不含固体培地の処方を 用い、２０ｇの代わりに３０ｇの寒天を混合し、混合物に１８２ｇのソルビトー ルを加える。

−ロイシン不含液体培地 寒天のないロイシン不含固体培地の処方を用いる。１５分間１２０℃でオートク レーブにかける。オートクレーブ処理後、２００ｍｇの１−スレオニンと１００ ｍｇの１−アスパラギン酸を加える。　−液体ＹＰ培地 １０ｇの酵母エキス（ディフコからのバクト酵母エキス）２０ｇのペプトン（デ ィフコからのバクトベプトン）成分を蒸留水中で混合する。蒸留水で最終容量を １１とする。

１５分間１２０℃でオートクレーブにかける。

−液体ＹＰＧ培地 液体ＹＰ培地の処方を用い、オートクレーブで処理後、グルコースを２０ｇ／ｌ の濃度で加える。

一ソルビトールＹＰＧ培地 液体ＹＰＧ培地の処方を用い、オートクレーブ処理後、ソルビトールをＩＭの濃 度で加える。

−エタノールーグリセリンＹＰ培地 液体ＹＰ培地を用いる。オートクレーブ処理後、ｌＱｍｌのエタノール１００％ （１％最終濃度）及び３０ｇのグリセリンを加える。

−二タノールーグリセリンーガラクトースＹＰ培地液体ＹＰ培地の処方を用いる 。オートクレーブ処理後、１０ｍ１のエタノール１００％、３０グリセリン及び ３０ｇのガラクトースを加える。

実施例１２：ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４６９（ｕｒａ　）、ＥＭＹ７６１　ｐＥ ＭＲ７４３（ｕｒａ　）、ＥＭＹ’　７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｌｅｕ）株によ る、尿酸オキシダーゼｃＤＮＡの三角フラスコ中での発塀−ウニスタンブロッテ ィングによる免疫測定−尿酸オキシダーゼ活性および可溶性蛋白質 １）尿酸オキシダーゼｃＤＮＡの発現 ａ）ウラシル無含有培地上で選択された株ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４６９（ｕｒ ａ　）およびＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａ　）株のコロニーをウラシ ル無含有液体培地（第３表参照、実施例１１）２０ｍｌ！中で培養した。−夜攪 拌しつつ、３０℃に保った後、２種の培地を１０分間、７０００ｒｐｍにて遠心 分離した。残渣を滅菌蒸留水ＩＱｍＪ中に添加し、再度１０分間７０００ｒｐｍ にて遠心分離する。尿酸オキシダーゼの発現物をＥＭＹ７６１　１）ＥＭＲ４６ ９（ｕｒａ　）株につきエタノール−グリセリンＹＰ培地（第３表、実施例１１ 参照）２０ｍＩ中、ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａ　）株につき、エタ ノール−グリセリン−ガラクトースＹＰ培地（第３表、実施例１１参照）２０ｍ ７！中に細胞を添加して行う。培養物は再び３０℃にて２２時間、攪拌下でイン キュベートする。

ｂ）ロイシン無含有培地上選択された株第一段階で、ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４ ６９（ｌｅｕ　）およびＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ４７３（ｌｅｕ　）株の各コロニ ーをロイシン無含有液体培地（第３表、実施例１１）２０ｍＡ！中で培養した。

これによりプラスミド　ｐＥＭＲ４６９およびｐＥＭＲ４７３を担持するＬＥＵ ２ｄ遺伝子によるｌｅｕ　２突然変異の相補性の選択を行うことにより多数のプ ラスミドの複写物を得、かつ維持することが可能である。−夜攪拌しつつ、３０ ℃に保った後、２種の培地を１０分間、７０００ｒｐｍにて遠心分離した。残渣 を滅菌蒸留水１０ｍ／中に添加し、再度１０分間７０００ｒｐｍにて遠心分離す る。尿酸オキシダーゼの発現物をＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ４６９（ｕｒａ　）株に つきエタノール−グリセリンＹＤ培地（第３表、実施例１１参照）２０ｍ／中、 ＥＭＹ７６１ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａ　）株につき、エタノール−グリセリン− ガラクトースＹＰ培地（第３表、実施例１１参照）２０ｍＩ中に細胞を添加して 誘導する。培養物は再び３０℃にて２２時間、攪拌下でインキュベートする。

Ｃ）対照株 非形質転換ＥＭＹ７６１株、すなわち、プラスミドを持たないＥＭＹ７６１株を 上記と同様に培養した。これは一方でエタノール−グリセリン液体ＹＰ培地ＩＱ ｍｆ中誘導および他方で、エタノール−グリセリン−ガラクトースＹＰ培地ＩＱ ｍＡ’中誘導する。

２）サンプルの調製 ａ）　ｌａ）、ｌｂ）およびｌｃ）で培養した細胞を遠心分離にかけ、上清を除 去した。残渣を蒸留水ＩＱｍｌに添加し、１０分間７０００ｒｐ加で遠心分離す る。残渣を同様に洗浄し、ｐＨ８，９のトリエチレンアミン緩衝液、ＴＥＡ約１ ｆｆｌＩに添加する。上記緩衝液中細胞約３００μｌをガラスピーズ（直径４０ ０−５００μ１１１）の存在下溶解し、最終容量を約半分にする。この混合物は ポルテックス中で１分間に４回、激しく撹拌し、試料は粉砕操作中、３０秒は水 中において置（。液体はパスツールピペットでチューブから除きマイクロチュー ブに移す。ガラスピーズをｐＨ８，９のＴＥＡ緩衝液約２００μｍで１回洗浄す る。ビーズはポルテックス中で１分間当たり１回洗浄し、液層はパスツールピペ ットで除き、上記の溶解物に添加する。ついで、溶解物を５分間７０００ｒｐｍ でマイクロチューブ中で遠心分離する。上清液を注意深く除き、−２０℃でウェ スターン・プロッティング、尿酸オキシダーゼ活性および蛋白質測定のために貯 蔵する。溶解した細胞残金はウェスターン・プロッティング（下記３）参照）の ために別に貯蔵する。

さらに、ｌａ）およびｌｂ）で調整した培養物の試料は誘導前に下記の方法で採 取する：培養物２爪ｌを１０分間、７０００ｒｐｍにて遠心分離する。残金を蒸 留水５００μｌに添加し、再び、５分間、７０００ｒｐｍにて遠心分離する。残 金をｐＨ８，９のＴＥＡ緩衝緩衝液約２０エ 溶解する。溶解した細胞の上清および残金を別々に一２０℃にて貯蔵する。

３）ウェスターン・プロッティングによる尿酸オキシダーゼに免疫的測定法。

ａ）操作 当分野の技術者に周知の技術である下記の工程からなる各試料の残金および上清 液をウェスターン・プロッティングにかけるニー　負荷（ｌｏａｄｉｎｇ）緩衝 液と称されるトリス−ＨＣｌ　０．１２５Ｍ　ｐＨ６．８、ＳＤ８　４％、ブロ モフェノール・ブルー　０、００２％、グリセリン　２０％、β−メルカプトメ タノール　１０％からなる緩衝液中で１０分間煮沸して残金を溶解させる（レミ リに記載のプロトコルによる（Ｕ．　Ｋ．　レミリ、ネイチュア、２２７　（１ ９７０）６８０−６８５））；−　レミリ記載のプロトコル（Ｕ．　Ｋ．　レミ リ、ネイチュア、２２７　（１９７０）６８０−６８５）による溶解物中に含ま れる種々の蛋白質の電気泳動的分離：および −　ゲル中の上記蛋白質のニトロセルローズフィルター上への移動（Ｈ．タウビ ンら、プロシーディング・オン・ナショナル・アカデ４３５４）。

バーネットの操作（Ｗ．　Ｗ，バーネット、アナリテイカル・バイオケミストリ ー　１１２．　（１９８１）１９５−２０３）により行われた免疫的測定法は下 記の連続的操作を含む。

・　緩衝液Ａ（１−リス−ＨＣｌ　１０ｍＭ５ＮａＣ１　１７０ｍＭ，ＫＣＬ　 １ｍＭ）１０ｍｌを用いて１０分間ニトロセルローズ・フィルターをすすぐ： ・　緩衝液Ｂ　（１００ｍｌ当たり３ｇの牛血清アルブミンを添加した緩衝液Ａ ）に接触させてニトロセルロース・フィルターをすすぐ： ・　ニトロセルロース・フィルターを免疫血清（Ａ．フラブス、尿酸オキシダー ゼを認識するポリクローナル抗体）に１時間３７°Ｃにて接触させる； ・　ニトロセルロース・フィルターを緩衝液Ｂにてススク。

・　ニトロセルロース・フィルターを、０，１マイクロキユリ一／ｍｌの割合で ヨウ素１２５でラベルしたプロティンＧの溶液に、１時間３７℃にて接触させる ： ・　フィルターを緩衝液Ａにてすすぐ；・　２枚の吸収紙の間でフィルターを乾 燥する；・　フィルターをＸ線フィルムに接触させ、・　フィルムを現像する。

ｂ）結果 ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４６９（ｕｒａ’）、ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４　７　 ３　（ｕ　ｒ　ａつ、ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４６９（ＩｅＵつおよびＥＭＹ７ ６１　ｐＥＭＲ４７３　（ｌｅｕつ株は見かけ（ａｐｐａｒｅｎｔ）の分子量約 ３３ｋＤａを有する蛋白質を産生じ、これはこれはＡ．フラブス尿酸オキシダー ゼに対する抗体によって認識され、これは対照株には含まれない。

非形質導入株は上記の蛋白質を全くまたはほとんど含まないことが判明している 。

残渣と上清液についてのこの蛋白質の量を比較すると上記蛋白質の約８０％は溶 解液中に溶解していることを示す。

４）尿酸オキシダーゼ活性のアッセイ 上記実施例９に記載した工程により溶解した細胞の上清液につき尿酸オキシダー ゼ活性を測定した。

得られた結果を下記第４表に示す。これはグリセリン−エタノールにより誘発さ れた各株、グリセリン−エタノール−ガラクトースにより誘発された各株および 非誘発株につき尿酸オキシダーゼ活性を示したものである。

第４表 株／誘導物質　尿酸オキシダーゼ活性 （Ｕ／ｍｌ） ＥＭＹ７６１／ＹＰエタノール−〈０．１グリセリン−ガラクトース ＥＭＹ７６１／ＹＰエタノール−グリセリン　＜０．ＩＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ ４６９（ｕｒａ　）／（非誘導）０．４ＥＭＹ７６１　ｐＥＩ！Ｒ４６９（ｕｒ ａ　）／ＹＰエタノー　１２ルーグリセリン ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４６９（ｌｅｕ　）／（非誘導）　０．１７ＥＭＹ７６ １　ｐＥＭＲ４６９（ｌｅｕ　）／ＹＰエタノー　３６ルーグリセリン ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａ　）／（非誘導）　＜０．１ＥＭＹ７６ １　ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａ　）／ＹＰエタノー　１２．５ルーグリセリン−ガ ラクトース ＥＩＩＹ７６１．　ｐＥＭＲ４７３（ｌｅｕ　）／（非誘導）　＜０．１ＥＭＹ ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｌｅｕ　）／ＹＰエタノー　１５６３ルーグリセリン −ガラクトース 上記の表は明らかに、これらのプラスミドｐＥＭＲ４６９およびｐＥＭＲ４７３ により形質導入された酵母細胞は導入後、尿酸オキシダーゼ活性の産生が可能で あることを示している。

５）溶解液中の総可溶性蛋白質のアッセイビオラド製蛋白質アッセイキットを溶 解細胞の上溝液中に存在する総蛋白質のアッセイに使用した。蛋白質が近付くと クマシーブリリアントブルー　ｇ−２５０の酸溶液の最大吸収が４６５ｎｍから ５９５ｎｍに変化するという知見に基づくものである（ライスナーら、アナリテ ィカル・バイオケミストリー、６４，５０９　（１９７５））。

ａ）操作 ５９５ｎｍに設定した分光光度計のセル中に次の容量を入れる。

−蒸留水７９０μｌを添加した試料１０μｍ、−濃縮染色試薬（ビオラド）２０ ０μｍ。

各成分を混合し、５９５ｎｍにて光学密度を読み取る。このようにしてＢＳＡ　 （牛血清アルブミン）の濃度増大に対する検量曲線を作成する。溶解液中の総蛋 白質の未知濃度を検量曲線から読む。

結果 得られた結果は下記第４表に示す。総可溶性蛋白質の量（ｍｇ／ｍｌ）および各 グリセリン−エタノールから誘導株、各グリセリン−エタノール−ガラクトース から誘導株および非誘導株の総可溶性蛋白質中の尿酸オキシダーゼのパーセント を示している（ここでは、組換え蛋白質の特定の活性はＡ、フラブスから得られ た尿酸オキシダーゼの活性：　３０Ｕ／ｍｇに一致すると推定している）。

第５表 株／誘導物質　総可溶　総可溶蛋白質 蛋白質　中の尿酸 オキシダーゼ％ ＥＭＹ７６１／グリセリン−エタノール　５．３　＜０．０５ＥＭＹ７６１／グ リセリンーエタノール　５．８　＜０．０５ガラクトース ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４６９（ｕｒａ　）／非誘導　８．５　０．２５ＥＭＹ ７６１　ｐＥＭＲ４６９（ｕｒａ　）／グリセリン　５．３　４．７−エタノー ル ＥＭＹ７６１　ｐｌＪＲ４６９（Ｉｅｕ　）／非誘導　１．７　０．３ＥＭＹ７ ６１　ｐＥＭＲ４６９（ｌｅｕ　）／グリセリン　５．９　２０−エタノール Ｅ１１Ｙ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａ　）／非誘導　１０．３　＜０．０５ ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａ　）／グリセリン　６．５　６．４−エ タノール−ガラクトース ＥＭ１’７６１１）ＥＭＲ４７３（ｌｅｕ　）／非誘導　０．５　＜０．０５Ｅ ＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｌｅｕ　）／グリセリン　３．９　１３−エタノ ール−ガラクトース 形質導入物質および形質導入株（Ｉｅｕつの選択方法により、尿酸オキシダーゼ の生成率が５−２０％変化することが判明する。

実施例１３：２．５７の発酵槽中ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａつ株に よる尿酸オキシダーゼの発現１）発酵プロトコル ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａつ株のコロニーをウラシル無含有液体培 地２００ｍ１中で培養する（第３表、実施例１１）。培養を、撹拌下、ＯＤを約 ３まで一夜継続する。

培養培地Ａ 精製水１１に対し グルコース　３０　ｇ カゼイン加水分解物　３０　ｇ （ＤＩＦＣＯ、カザミノ酸） 酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ）　１５　ｇ酵母抽出物（Ｄ　Ｉ　ＦＣＯ）　２． ５ｇＫｚＨＰＯ４’　３　ｇ ＭｇＳＯイ、７Ｈ２００，５ｇ 追加培地Ｂ 精製水１００ｍＡ’に対し ペプトン加水分解液　３０　ｇ （Ｇ、シェフイールド、ブリマトン） 酵母窒素ベース（ＤＩＦＣＯ）　１５　ｇ酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）　５　ｇ Ｋ２ＨＰＯ４３ｇ Ｍｇｓｏ４．７ＨｚＯ（Ｌ５ｇ ｂ）醗酵条件 タービン２個付総容量２．５１のバイオリアクタ一温度＝３０℃ ｐＨ＝５ 酵素分圧２３０ｍ口Ｈｇ 空気流速＝１１／分 バイオリアクターに培地Ａ１．５１を入れ、接種物１５０ｍ１を接種する。グル コースがＯＤ２゜５から０Ｄ１７にまで消費されたとき、２０重量／容量％でグ ルコース１５０ｍ１容量を添加して、誘導を行う。増殖を継続させ、ついで０Ｄ ３０のとき、追加培地を添加する。

増殖をさらに１５時間継続させ、０Ｄ１０４にて生成物を回収する２）サンプル の調製および分析 サンプルを発酵槽中培養物から実施例９の２）ａ）に記載と同様にして調製する 。２種の試料を採取する：第１、誘導７時間後および第２、誘導２２時間後。

実施例９に記載の下記のテストを細胞の溶解後得られた２種の溶解液につき行っ たニ ー　ウェスタン・プロッティングによる免疫的測定、−総蛋白質のアッセイ つぎのような結果が得られた： ａ）ウェスタン・プロッティングによる免疫的測定２１発酵槽中培養のＥＭＹ７ ６１　ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａＤ株は見掛けの分子量３３ｋＤａを有する蛋白質 を産生じ、Ａ、フラブス尿酸オキシダーゼに対する抗体（上記の抗体は当業者に 周知の技術によりウサギ中で生成される：ベイチュケイチスら、（１９８１）メ ソッド・イン・エンチモロジー、アカデミツク・プレス、ニューヨーク、第７３ 巻、４６頁）により認識され、これは対照株には存在しない。

ｂ）生物学的活性のアッセイ 得られた結果を下記第６表に示す。

第６表 株／誘導時間　Ｕ／ｍｌ ＥＭＹ７６１１）ＥＭＲ４７３（ｕｒａつ／７ｈ９ＥＭＹ７６１１）ＥＭＲ４７ ３（ｕｒａつ／２２ｈ　１２．５培養器で培養したＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４７ ３（ｕｒａつ株は誘導後圧酸オキシダーゼを生成することができることを発見し た。

Ｃ）総可溶蛋白の検出 結果を以下第７表に示す。

株／誘導時間　総可溶蛋白質　総蛋白質中のｍｇ／ｍｌ　尿酸オキシダーゼ％ ＥＭＹ７６１　ｐＥＩＪＲ４７３（ｕｒａ’）／　７ｈ　５．２　５．　７ＥＭ Ｙ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａつ／２２ｈ　６．２　６．にれらの結果から 培養器で培養したＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ４７３（ｕｒａつによる尿酸オキシダ ーゼの合成率が、誘導７および２２時間後で細胞の総蛋白の約５％であることが 示された。

実施例１４ ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ５１５（ｌ　ｅｕつ、ＥＭＹ５００　ｐＥＭＲ５１５（ ＩｅｕつおよびＧＲＦ１８　ｐＥＭＲ５１５（ｌｅｕつ株による尿酸オキシダー ゼｃＤＮＡの三角フラスコ中での発現上記３つの株の各コロニーをロイシンなし の液体培地２０ｍ１中に培養した。

３０℃で１晩撹拌し、３つの培養物を１０分間７０００ｒｐｍで遠心した。細胞 残留物を滅菌蒸留水１０ｍ１中に取り、再び１０分間遠心した。尿酸オキシダー ゼの発現は、エタノール−グリセリン−ガラクトースＹＰ培地（実施例８の第１ 表参照）２０ｍｌ中に細胞を取ることにより誘導した。培養物を再び３０℃２０ 時間撹拌しながらインキュベートした。非形質転換宿主株を対照としてそれぞれ 培養した。

６培養物の各細胞を遠心により再び分離し、上清を除去した。残留物を蒸留水１ ０ｍ］にとり、１０分間７０００ｒｐｍで遠心分離した。このように洗浄した残 留物をｐＨ８，９のＴＥＡ緩衝液約１ｍ】に取り、粒子の粉砕および遠心による 除去を実施例９．２）に記載のように実施した。各培養物の上清を前述のように 尿酸オキシダーゼおよび総蛋白の検出のために使った。得られた生な結果を以下 第８表に示した。

第８表 株／培養条件　尿酸オキシダ　総可溶　可溶蛋白中ダーゼ活性　蛋白　の尿酸オ キシ （Ｕ／ｍ　］　）　（ｍｇ／ｍｌ）　ダーゼ％ＧＲＦ１８　ｐＥＭＲ５１５（ｌ ｅｕつ／ａ）　＜０．１　２．２　＜０．０５ＥＭＹ５００　ｐＥＭＲ５１５（ ｌｅｕつ／ａ）　＜０．１　０．９　＜０．０５ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ５１５ （ｌｅｕつ／ａ）　＜０．１　１．８　＜０．０５ＧＲＦ］、８　ｐＥＭＲ５１ ５（ｌｅｕつ／ｂ）　３８　５．４　２３ＥＭＹ５００　ｐＥＭＲ５１５（ｌｅ ｕつ／ｂ）　２０　２．５　２６ＥＭＹ７６１　ｐＥＭＲ５１５（ｌｅｕつ／ｂ ）　３３　４．２　２６ａ）二株はグルコース存在下培養（非誘導条件）ｂ）二 株はグルコース不存在およびガラクトース存在下培養（誘導）これらの結果は高 いレベルの尿酸オキシダーゼが本発明による発現ベクターにより形質転換した３ つの非同質遺伝子受容体で得ることができることを示した。

実施例１５ ＥＭＹ５００　ｐＥＭＲ５１５株の尿酸オキシダーゼのｃ　ＤＮＡ２．５１培養 器中での発現。組換え尿酸オキシダーゼの精製および部分的特性確認。

１）ＥＭＹ５００　ｐＥＭＲ５１５株の２．５１培養器中での培養。

ＥＭＹ５００　ｐＥＭＲ５１５株の培養を次の方法で実施した。

ａ）三角フラスコ中での前培養段階 ＭＥＳ　（２−［Ｎ−モルフオリノコ−エタンスルホン酸・シグマＭ８２５０番 ）１．２８ｇを補足した成長培地ＭＣＰＡ　（オートクレーブで滅菌可能）９０ ｍｌおよび成長培地ＭＣＰＦ　（限外濾過により滅菌）を含む５００ｍ１三角フ ラスコに、光学密度２．３５に相当する細胞数の２０％グリセリンを含む培地中 のＥＭＹ５００ｐＥＭＲ５１５株の１ｍｌ溶液を移植した。培地ＭＣＰＡおよび ＭＣＰＦの組成は以下の通りである。２４時間３０°Ｃ撹拌下インキュベーショ ン後、培養物の光学密度は約７であった。

ｂ）培養器中での培養器 上記培養を次の組成物を有する培養培地を含む２．５１培養器に移植するために 使用した。

ＭＣＰＡ　９００ｍ１ 十ＭＣＰＦ　２００ｍ１ 培養物のｐＨを培養器により５．５の所定値に調製した。３０℃で培養６−７時 間後、５００ｇ／ｌグルコース溶液７２ｍ］を直線的に９時間以上にわたって加 えた（すなわちグルコース３６ｇ総量）。

Ｃ〕発現段階 前述記載の混合物に、発現培地ＭＥＰＡ　（オートクレーブで滅菌可能）１００ ｍｌおよび次の組成を有する発現培地ＭＥＰＦ（限外濾過で滅菌）１５０ｍｌを 加えた。培養をその後５時間続けた。その後、ガラクトース３０ｇ１グリセリン １５ｇおよびエタノール３６ｇを含む溶液１５０ｍ１を直線的に２０時間加えた 。約１６０の光学密度が得られた。

成長および発現培地の化学組成 一成長培地ＭＣＰＡ　（オートクレーブで滅菌）全量９００ｍ１ ＮＴＡ　にトリロ三酢酸）　１．２ｇ 酵母抽出物（ＤＩＦＣＯ）　６ｇ ＫｚＳＯｎ　１．２ｇ ＮａＣ］　０．６ｇ Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ２０１，２ｇ ＣａＣ］ｚ・２Ｈ２０８４０ｍｇ Ｆ　ｅ　Ｃ１３１，０！’３　ｍ　ｇ グルタミン酸　４．４４ｇ ＨＹＣＡＳＥ　ＳＦ（ノエフイールド・ブロダクブ）　３０　ｇロイシン　２． １６ｇ ヒスチジン　６００ｍｇ メチオニン　１．２ｇ オリゴ要素Ｉ（下記参照）　５ｍｌ 超精製水で全量１１ ＣｕＳＯ４”５Ｈ２０７８０ｍｇ ＨｓＢＯｓ　５ｇ ｚｎｓｏ４・７Ｈ２０３ｇ ＫＩ　Ｉｇ ＭｎＳＯ，・２Ｈ，０３，５ｇ ＦｅＣｌ３”６ＨｚＯ４，８ｇ 濃塩酸１００ｍ１を溶液に加え１，０００ｍ１に調製。

−成長培地ＭＣＰＦ　（限外濾過で滅菌）超精製水で全量２００ｍ１ ＫＨ２ＰＯ４４，８ｇ トリプトファン　４２０ｍｇ ビタミンＩ　（下記参照）　５ｍｌ グルコース　３６ｇ 溶解するまで熱し、室温にもどし、ビタミンＩを加λ、０，２μｍフィルターで 濾過。

ビタミン■のリスト 超精製水で全量１００ｍ１ ビオチン　１．　２ｍｇ 葉酸　１ｍｇ ニアシン　１４４ｍｇ にコチン酸） 塩酸ピリドキシン　６０ｍｇ 塩酸チアミン　２４０ｍｇ パントテン酸カルシウム　１．２ｇ メソイノシトール　２．４ｇ 溶解後１００ｍ１にする。

０．２μｍ滅菌フィルター、冷却。

−発現培地ＭＥＰＡ　（オートクレーブで滅菌可能）超精製水で全量１００ｍ１ ＮＴＡ　１．　２ｇ Ｋ２ＳＯ４２，０８ｇ グルタミン酸　６ｇ ＨＹＣＡＳＥ　ＳＦ（ノエフィールド・１０ダクツ）　２４　ｇロイシン　２． 　１６ｇ ヒスチジン　６００ｍｇ メチオニン　１．２ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０７２０ｍｇ ＣａＣＬ・２Ｈ２０８４０ｍｇ ＦｅＣ１５・、６Ｈ２０１０８ｍｇ オリゴ要素１　５ｍｌ ウラシル　１．２ｇ 濃Ｈ，ＳＯ４＊たは濃ＫＯＨでｐＨ５，５１＝調製。

オートクレーブ２０分１２０℃ 一発現培地ＭＥＰＦ　（限外濾過で滅菌）超精製水で全量１５０ｍ１ ＫＨ２ＰＯ４２，４ｇ トリプトファン　４２０ｍｇ ビタミンＩ　５ｍｌ グリセリン　３６ｇ ガラクトース　４５ｇ 熱で溶解し、室温にもどしビタミンを加え濾過。

２）細胞の粉砕 ２０時間誘導後、６００ｎｍで測定した培養物のＯＤは９８である。培養器ウワ ーｈ８００ｇを１０，０００ｇで５分間遠心し、細胞ケーキを溶解緩衝液（グリ シン２０ｍＭｐＨ８，５）８０ｍｌに取った。細胞を溶解すべき細胞溶液と同容 量のビーズ（直径Ｏ１５０ｍｍ）の存在下、粉砕装置（ビブロゲニツク・ツエル ミューレ・ミルＶＩ４）で２．５分間４℃２回粉砕した。粉砕後、上清を取り、 ビーズを溶解緩衝液８０ｍ１で２回洗浄した。溶解物２１０ｍ１を回収した。上 記溶解物は約３ｍｇ／ｍｌの総蛋白含量および約７．７Ｕ／ｍｌの尿酸オキシダ ーゼ活性を含む（すなわち、３０μ／ｍｇの総蛋白の特異活性を考慮して約８． ５％の総蛋白に対する尿酸オキシダーゼパーセントである）。

３）組換え尿酸オキシダーゼの精製 ａ）精製プロトコール 上記溶解物を以下に記載した２段階精製プロトコールに付した。

段階１：陰イオンクロマトグラフィー 支持体： ＤＥＡＥ　（ジエチルアミノホスフェート）セファロースツアーストフロラ（フ ァルマシア番号１７．０７．０９．９１）圧縮ゲルは７０ｍ１容量である。分離 を室温で実施し、回収分画を０℃で保存する。

分離条件： 緩衝液１（はう酸ナトリウム１０ｍＭ、ｐＨ９，２）から緩衝液２（はう酸ナト リウムｌＱｍＭ、塩化ナトリウムＬＭ）までの塩化物イオン力の勾配を使用した 。緩衝液は前もってガスを除去し、溶出の間０℃に保存した。それぞれの緩衝液 にアジド０．０２％を加えた。

粗抽出物を置き（１０ｍｌ）、カラムに維持しない尿酸オキシダーゼ（１０ｍｌ の分画による）が完全に回収されるまで緩衝液１で溶出した。色素および汚染さ れた蛋白はその後緩衝液２の溶出により除去した。続いて精製は２１４ｎｍでの 溶出物のＯＤを測定した段階２：高速および逆相液体クロマトグラフィー支持体 ： 移植Ｃ８シリカカラム、アクアポア０Ｄ−３００（１００Ｘ２．１ｍｍ）（ブラ ウリーーアブライド・バイオシステムズ社）操作条件： 溶出２ニトリフルオロ酢酸０．　１％を含む超精製水（ミルポアシステムで濾過 ） 溶出２ニトリフルオロ酢酸０．０８％を含むアセトニトリル（分光光度的特性ま たは類似） 流速：０．３ｍｌ／分 勾配はアセトニトリル／ＴＦＡ３５％からアセトニトリル／ＴＦＡ７０％２０分 間にし、５分間７０％で維持する。注入量は一回あたり１ｍｌである。

分画の回収： 分離後、２１８ｎｍの光学密度で測定した。アセトニトリルを真空下遠心により 蒸発した。

ｂ）結果 精製段階１の前後のサンプルを、注入量５０μｌで同じ勾配を用い、前に記載し たグラフトＣ８シリカカラム、アクアポア０Ｄ−３００で液体クロマトグラフィ ーにより分析した。Ａ、フラブスからの精製尿酸オキシダーゼを外部対照として 使用した。出発溶解物では、尿酸オキシダーゼは総蛋白の６３％を示した。精製 段階１後、尿酸オキシダーゼは総蛋白の８４％を示した。段階２後得られた全サ ンプルを次の部分的特性確認に使用した。上記サンプルは確実に尿酸オキシダー ゼを８４％以上含む。

４）組換え尿酸オキシダーゼの部分的特性確認ａ）アミノ酸分析 精製尿酸オキシダーゼの酸加水分解物のアミノ酸分析をアプライド・バイオシス テムズ・モデル４２０−１３０Ａの分析装置で実施した。定量化アミノ酸の配分 は仮定した配列に適合した（重要な違いはなしり。同じ結果がＡ、フラブスから 抽出した精製尿酸オキシダーゼで観察された（実施例４で得られた）。

ｂ）トリプシンペプチドマツプ トリプシンペプチドマツプを精製組換え尿酸オキシダーゼおよび次の条件下実施 例４）で得られた精製尿酸オキシダーゼ抽出物で達成した。

１ｇ／ｍｌの濃度を有する尿酸オキシダーゼ溶液を製造した。即席で１ｍｇ／ｍ ｌの濃度を有するトリプシン溶液を製造した。

２つの溶液を室温で８時間１／３０酵素／基質の割合で一緒に混合した。トリプ シン加水分解物をその後記録装置に連結したＵＶ検出器つきの０１８グラフトシ リカカラム（５μｍ１リクロソーブ２５０Ｘ４．６ｍｍハイクロム番号ＲＰ１８ −５−２５０Ａ）でクロマトグラフィー（液相クロマトグラフィー）した。適用 した勾配は１％アセトニトリル／ＴＦＡから６０％アセトニトリル／ＴＦＡまで を１２０分間であり、その後勾配を６０％で５分間維持した。

得られたペプチドマツプは大変狭い特性をもつ。

５）アミノ末端配列の遮断した性質の決定アミン末端配列をフェニルチオヒダン トイン酸誘導体の分析器であるアプライド・バイオシステムズ・モデル１２０Ａ に連結した配列決定装置であるアプライド・バイオシステムズ・モデル４７０Ａ により分析した。精製組換え尿酸オキシダーゼ（アミノ酸の分析により検出した ２００ピコモル）をβ−ラクトグロブリン（対照蛋白）２０ピコモルの存在下配 列決定した。

尿酸オキシダーゼの配列に相当するアミノ末端配列は検出されないが、対照蛋白 のアミノ末端配列は検出された。

それ故、本発明の組換え尿酸オキシダーゼおよび尿酸オキシダーゼ抽出物はブロ ックされたアミノ末端終結部を有する。

実施例１６　動物細胞中での尿酸オキシダーゼｃＤＮＡ発現ベクター：プラスミ ドｐｓＶ８６０の構築 このベクターは、 ・最初の１６個のアミノ酸を除いた尿酸オキシダーゼをコードする配列を含んで いる小さいＡｃｃＩ−ＳｎａＢＩフラグメント［このフラグメントはプラスミド ｐ４６６（実験室で後記のようにして得られるエシェリヒア・コリ中Ａ・フラブ ス尿酸オキシダーゼの発現ベクターから由来するコと、合成ＨｉｎｄＩ［［−Ａ ｃｃＩフラグメントを、動物細胞中での発現を促進する非翻訳５°配列とＡ・フ ラグス尿酸オキシダーゼをコードする完全配列を含むＨｉｎｄｎ［−５ｎａＢ　 Ｉフラグメントが得られるようにライゲーションすること、および・動物細胞用 発現ベクターすなわちプラスミドｐｓＥ１の多重クローニング部位中のＨｉｎｄ ｍ部位および５ｎａＢＩ部位間のＨｉｎｄｎ［−５ｎａＢＩフラグメント（ポリ リンカーともいう）を挿入することにより得られた。

以下の記述は、プラスミドｐ４６６、プラスミドｐｓＥ１およびプラスミドｐｓ Ｖ８６０の構築を続けて述べるものである。

１）プラスミドｐ４６６の構築 プラスミドｐ４６６すなわちＥ、コリ中における尿酸オキシダーゼｃＤＮＡ発現 ベクターを製造した。これは、複製開始点とアンピシリン耐性遺伝子を含むｐＢ Ｒ３２７のフラグメントを含む。また、これはＥ・コリの合成プロモーター（Ｒ ，ロドリゲおよびＭ、チャンバーリン、「プロモータース：ストラクチュア・ア ンド・ファンクションＪ（１９８２）、ブリーガー）、唯１個のＮｄｅＩ部位お よびＫｐｎＩ部位を含むポリリンカーを従えたシセイン・ダルガルノ配列、転写 ターミネータ−（ファージｆｄ由来）およびｌａｃ　ｉ遺伝子を含むこのプラス ミドは、Ｅ・コリのｈＧＨ発現プラスミド（ｐ４６２）から、ｈＧＨ遺伝子保持 フラグメントを尿酸オキシダーゼｃＤＮＡで置きかえることにより構築した。

プラスミドｐ４６６の構築は、上記実施例７に詳述した。

２）動物細胞用発現ベクター：プラスミドｐｓＥ１の構築使用したストラテジー は、公衆が入手し得る既存プラスミドから得られたフラグメントと、現在普通に 用いられて技術により合成されたフラグメントを用いるものである。使用したク ローニング技術は、Ｔ、マニアテイス、Ｅ、Ｆ、　フリッチおよびＪ、サンプル 、ツクにより「モレキュラー・クローニングニア・ラボラトリ−・マニュアル」 （コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１９８４）に記載された方 法によるものである。オリゴヌクレオチドは、ノくビオサーチ４６００ＤＮＡシ ンセサイザーを用いて合成した。

以下の記述は、第１３図を参照すると明確に理解できるものであり、同図はプラ スミドｐｓＥ１の制限地図を示すが、ライゲーションのため消滅した部位は括弧 で示す。この図中の記号は以下の記述中で示す。

このプラスミドは、下記成分を連続的にライゲーションすることにより構築した 。

１）　−ＰｖｕＩＩ−ＰｖｕＵフラグメント−これは第１３図中に＋＋十十素Ｐ ｖｕｌＩで完全消化して得られる２５２５ｂｐからなる。このフラグメントは、 ファージＦ１の複製開始点（第１３図にＯＲＩ　Ｆｌで示す）、アンピシリン耐 性遺伝子（第１３図にＡｍｐ’で示す）およびＥ・コリでこのプラスミドの複製 をさせる複製開始点（第１３図に０Ｒ４ｐＢＲ３，２２で示す）を含む。最初の Ｐｖｕｍプラント部位は７）で述べたフラグメントのＥｃｏＲＶプラント部位（ これも消滅する）とのライゲーションの際消滅する。

２）　−ＰｖｕＩＩ−ＨｐａＩフラグメント−これは第１３図中に閣の記号で示 し、ＶＡ−１およびＶＡ−ＩＩＲＮＡ情報を含む、５型アデノウイルスＤＮＡの １１２９９位（Ｐｖｕｌｌ制限部位）１０２３９位（ＨｐａｌＪＩ限部位）開の １０６０ｂｐからなる。ＨｐａＩプラント部位は３）で述べたフラグメントのＰ シｕＩＩプラント部位（これも消滅する）とのライゲーションの際消滅する。

３）　−ＰｖｕＩＩ−ＨｉｎｄＩ［［フラグメント−これは第１３図中にコＩｕ Ｉの記号で示し、ＳＶ４０ウィルスＤＮＡ由来で制限酵素ＰｖｕＩＩとＨｉｎｄ ｎ［による完全消化により得られるものである。このフラグメントは、複製開始 点とＳＶ４０ウィルスＤＮＡの初期プロモーター（Ｂ、Ｊ、ヒＡｔン等、ＰＮＡ Ｓ−ＵＳＡ（１９８３）８０巻７２ｉ−７２５頁参照）を含む。

Ｈｉｎｄｍ部位は４）で述べたフラグメントのＨｉｎｄｌｔ＋結合部位とのライ ゲーションの際消滅する。

４）−合成ｒＨｉｎｄｌｔｒ結合部位Ｊ−Ｈｉｎｄｆｆｌフラグメント−これは 第１３図中ニニニの記号で示し、４１９ｂｐからなるもので、後述するその配列 は、ＨＴＬＶＩウィルスの非翻訳５′配列に類似する（バイス等、「モレキュラ ー・バイオロジー・オン・テユモア・ウィルシズ」第２部、第２版（１９８５） 、コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−１１０５７頁参照）。

Ｈｉｎｄｌｆｆ結合部位 ＡＧＣＴＧＧＣＴＣＧＣＡＴＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＣＧＣＧＣＣＣＧＣＣＧ　Ｃ ＣＣＴＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＧ　ＣＣＡＴＣＣＡＣＧＣＣ１−−−−−−−−一 ÷−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−− −−−−＋−−−−−−−−−＋　６O ＣＣＧＡＧ　ＣＧＴＡＧＡＧＡＧＧＡＡＧＴＧ　ＣＧ　ＣＧＧＧ　ＣＧＧ　ＣＧ ＧＧＡＴＧＧＡＣＴＣＣＧＧＣＧＧ　ＴＡＧＧＴＧ　ＣＧＧＧＧＴＧＡＧＴＣＧ ＣＧＴＴＣＴＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＧＣＣＴＧＴＧＧＴＧＣＣＴＣＣＴＧＡＡＣ ＴＧＣＧＴＣＣＧＣＣＧＴＣＴＡ６１−−−−−−−−−＋−−−−−−−−− ＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＊−−−−−−−−−十輌−−−− −−−−＋　P２０ ＣＣＡＣＴＣＡＧＣＧＣＡＡＧＡＣＧＧＣＧＧＡＧＧＧＣＧＧＡＣＡＣＣＡＣＧ ＧＡＧＧＡＣＴＴＧＡＣＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＧＡＴＧＧＴＡＧＧＣＴＣＣＡＡ ＧＧＧＡＧＣＣＧＧＡＣＡＡＡＧＧＣＣＣＧＧＴＣＴＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＣ ＴＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＡ１２１　−−−−−−一−−＋−−−−−−−−−＋ 勢−−−−−−−−十−−−−−−−−−十−−−−−−−−一千−−−−−− −−−{１ａＯ ＣＣＡＴＣＣＧＡＧＧＴＴＣＣＣＴＣＧＧＣＣＴＧＴＴＴＣＣＧＧＧＣＣＡＧＡ ＧＣＴＧＧＡＣＴＣＧＡＧＡＴＴＴＧＡＡＴＧＧＡ７ＧＡＣＴＣＡＧＣＣＧＧＣ 丁ＣＴＣＣＡＣＧＣＴＴＴＧＣＣＴＧＡＣＣ（ＴＧＣＴＴＧＣＴＣＡＡＣＴ（Ｔ Ａ（ＧＴＣＴＴ丁Ｇ丁丁丁１８１　−−−−−−−−−＋−〜−−−−−−−子 −−−−−−〜−−＋　−−−−−−−−−＋−−−−〜−−−−＋へ一−＋− −＋−垂Q４０ （ＴＧＡＧＴ（ＧＧＣＣＧＡＧＡＧＧＴＧ（ＧＡＡＡＣＧＧＡＣＴＧＧＧＡ（Ｇ ＡＡＣＧＡＧＴＴＧＡＧＡＴＧＣＡＧＡＡＡＣＡＡＡＣＧＴＴＴＴＣＴＧＴＴＣ ＴＧＣＧＣＣＧ丁ＴＡＣＡＡＣＴ丁ＣＡＡＧＧＴＡＴＧＣＧＣＴＧＧＧＡＣＣＴ ＧＧＣＡＧＧＣＧＧＣＡＴ２４１−−−−−−−−−＋　−−−−−−−−−＋ 　−−−−−−−−−＋　−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−４−−−− −一一黶{３００ ＧＣＡＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＣＧＣＧＧＣＡＡＴＧＴＴＧＡＡＧＴＴＣＣＡＴＡ ＣＧＣＧＡＣＣＣＴＧＧＡＣＣＧＴＣＣＧＣＣＧＴＡＣ丁ＧＧＧＡＣＣＣＣＴＡ ＧＧＡＡＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＧＴＣＣＴＣＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＣＡＧＧＧＡ ＡＣＡＴＡＧＴＧＧＴＣＣ３０１−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋− −−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−− −−＋R６Ｑ ＧＡＣＣＣＴＧＧＧＧＡＴＣＣＴＴＣＣＣＧＡＡＣＣＣに　ＣＡＧＧＡＧＣＡＣ ＧＧＧＴＴＣＣＧＴＣＣＣＴＴＧＴＡＴＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧＧ、ＡＡＧＧＧＧ ＡＧＣＡＧＡＧＧＣＡＴＣＡＧＧＧＴＧＴ　ＣＣＡＣＴＴＴＧＴＣＴＣＣＧＣＡ ＧＣＴＣＣＴＧＡＧＣＣＴＧＣＡ３６１　−−−−−−−−−＋−−−−−−− −−十−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−−−−−−−−＋−−− −−−−−−{４２０ ＧＴＣＣＴＴＣＣＣＣＴＣＧＴＣＴＣＣＧＴＡＧＴＣＣＣＡＣＡＧＧＴＧＡＡＡ ＣＡＧＡＧＧＣＧＴＣＧＡＧＧＡＣＴＣＧＧＡＣＧＴ５）−合成Ｈｉｎｄｌ［［ −ｒ　ＢａｍＨＩ結合部位」フラグメント−第１３図に××××の記号で示し、 ）７−ジＴ７のＲＮＡポリメラーゼのプロモーターとＳｍａｒクローニング部位 を含むポリリンカーをもつ。

ＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＧＧＣＣ ＧＣＧＧＧＣＣＣＣＴＧＣＡＧＧ　ＡＡＴＴＣＡＣＡＧＣＴＧＡＴＴＡＴＧＣＴ ＧＡＧＴＧＡＴＡＴＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＣＣＣＧＧＧＧＡＣＧ丁ＣＣＴＴＡＡ ＧＣＣＴＡＧＧＧＧＧＣＣＣＡＣＴＧＡＣＴＧＡＣＴＡＧ６）−５４０ｂｐのＢ ａｍＨＴ−ＢｃＩｒフラグメント−第１３図にママママの記号で示し、５Ｕ４０ ウイルスを酵素ＢｃＩＩおよびＢａｍＨＩで完全消化して得られ、上記ウィルス の後記ポリアデニル化部位を含む小さいフラグメントである（Ｍ、フイッジラル ド等、セル２４巻（１９８１）２５１−２６０頁）。ＢａｍＨ？およびＢｃＴ１ 部位はそれぞれ５）で述べたフラグメントのＢａｍＨＩ結合部位および７）で述 べたフラグメントのＢａｍＨ１部位（これも消滅する）とのライゲーションの際 に消滅する。

７）−ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＶフラグメント−第１３図に００００の記号で示し 、１９０ｂｐからなり、プラスミドｐＢＲ３２２を酵素Ｅｃ。

ＲＶおよびＢａ１ＨＩで完全消化して得られる小さいフラグメントである。

３）プラスミドｐｓＶ８６０の構築 プラスミドｐ４６６（第９図参照）を、酵素ＡｃｃＩおよび５ｎａＢＩで完全消 化した。最初の１６個のアミノ酸を除く尿酸オキシダーゼをコードするＤＮＡ配 列をもつ小さなＡｃｅ　Ｉ　−５ｎａＢ　Ｉフラグメントを精製し、下記配列を もつ合成Ｈｉｎｄｕ−Ａｃｃｌフラグメントと一−ω−−−鋤一一＋−神−■− ―−一一◆−−曽−−−−−−４−−−−−−−−−＋−−−−−−−−―◆− −−−−−−−−＋ＡＣＧＧＣＧＧＴＧＡＴＡＣＡＧＧＣＧＴＣＡＴＴＴＴＣＧ ＴＣＧＧＧＣＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＣＴＧＴ丁ＡＣＡＧＧＣＧＣＡＧＡこのライ ゲーションは、クローン９Ｃと同一であり尿酸オキシダーゼをコードする配列お よび動物細胞中での発現を容易にする非翻訳５°配列を含むＨｉｎｄＩ［［−３ ｎａＢ　Ｉフラグメントを得ることを可能にする（Ｍ、　コザック、ヌクレイツ ク・アシツズ・リサーチ１２巻２号（１９８４）８５７−８７２頁）。

Ｈｉｎｄｌ［［−８ｎａＢ　Ｉフラグメントは下記配列を含む。

５’　−ＡＧＣＴＴＧＣＣＧ　ＣＣＡＣＴＡＴＧＴＣＣＧＣＡＧＴＡＡＡＡ　Ｇ ＣＡＧＣＣＣＧＣＴ　ＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＣＡＡＴＧＴＣＣＧＣＧＴＣＴＡＣ ＡＡＧＧ　Ｔ丁ＣＡＣＡＡＧＧＡ　ＣＧＡＧＡＡＧＡＣＣＧＧＴＧＴＣＣＡＧＡ ＣＧＧＴＧＴＡＣＧＡ　ＧＡＴＧＡＣＣＧ丁ＣＴＧＴＧＴＧＣ丁ＴＣＴＧＧＡＧ ＧＧＴＧＡ　ＧＡＴＴＧＡＧＡＣＣＴＣ丁丁ＡＣＡＣＣＡ　ＡＧＧＣＣＧＡＣＡ Ａ　ＣＡＧＣＧＴＣＡＴＴ　ＧＴＣＧＣＡＡＣＣＧ　ＡＣＴＣＣＡＴＴＡＡＧＡ ＡＣＡＣＣＡＴＴ　ＴＡＣＡＴＣＡＣＣＧ　（ＣＡＡＧＣＡＧＡＡ　ＣＣＣＣＧ ＴＴＡＣＴ　ＣＣＴＣＣＣＧＡＧＣＴＧＴＴＣＧＧＣＴＣＣＡＴＣＣＴＧＧＧＣ ＡＣＡＣＡＣＴＴＣＡ　ＴＴＧＡＧＡＡＧＴＡ　ＣＡＡＣＣＡＣＡＴＣＣＡＴＧ ＣＣＧＣＴＣＡＣＧＴＣＡＡＣＡＴ　ＴＧＴＣＴＧＣ（ＡＣＣＧＣＴＧＧＡＣＣ ＣＧＧＡＴＧＧＡＣＡＴＴＧＡＣＧＧＣＡＡＧ　ＣＣＡＣＡＣＣＣＴＣＡＣＴＣ ＣＴＴＣＡＴ　ＣＣＧＣＧＡＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＴＧＴＧＣ Ａ　ＧＧＴＧＧＡＣＧＴＧ　ＧＴＣＧＡＧＧＧＣＡ　ＡＧＧＧＣＡＴＣＧＡ　Ｔ ＡＴＣＡＡＧＴＣＧＴＣＴＣＴＧＴＣＣＧ　ＧＣＣＴＧＡＣＣＧＴ　ＧＣＴＧＡ ＡＧＡＧＣＡＣＣＡＡＣＴＣＧＣＡＧＴＴＣＴＧＧＧＧＣＴＴＣＣＴＧＣＧＴ　 ＧＡＣＧＡＧＴＡＣＡ　ＣＣＡＣＡＣＴ丁ＡＡ　ＧＧＡＧＡＣＣＴＧＧ　ＧＡＣ ＣＧＴＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＡ　ＣＧＴＣＧＡＴＧＣＣＡＣＴＴＧＧＣＡ ＧＴ　ＧＧＡＡＧＡＡＴＴＴ　ＣＡＧＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＧＣ ＴＣＧＣＡＣＧＴ　ＧＣＣＴＡＡＧＴＴＣＧＡＴＧＣＴＡＣＣＴ　ＧＧＧＣＣＡ ＣＴＧＣＴＣＧＣＧＡＧＧＴＣＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡ　ＣＴＴＴＴＧＣＴＧＡ　 ＡＧＡＴＡＡＣＡＧＴ　ＧＣＣＡＧＣＧＴＧＣＡＧＧ（ＣＡＣＴＡ丁　Ｇ丁ＡＣ ＡＡＧＡＴＧ　ＧＣＡＧＡＧＣＡＡＡ　ＴＣＣＴＧＧＣＧＣＧ　ＣＣＡＧＣＡＧ ＣＴＧＡＴＣＧＡＧＡＣＴＧ　ＴＣＧＡＧＴＡＣＴＣＧＴＴＧＣＣＴＡＡＣＡＡ ＧＣＡＣＴＡＴＴ　Ｔ（ＧＡＡＡＴＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＧ　ＣＡＣＡＡＧ ＧＧ（ＣＴＣＣＡＡＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＧＡＧＧＴＣ丁ＴＣ ＧＣＴＣＣＴＣＡ　ＧＴＣＧＧＡＣＣＣＣＡＡＣＧＧＴＣＴＧＡ　ＴＣＡＡＧＴ ＧＴＡＣＣＧＴＣＧＧＣＣＧＧＴＣＣＴＣＴＣＴＧＡ　ＡＧＴＣＴＡＡＡＴＴ　 Ｇついで、Ｈｉｎｄｍ−３ｎａＢ　Ｉフラグメントを、先に酵素Ｈｉｎｄｍおよ びＳｍａＩとインキュベートしたベクターｐｓＥ１に挿入した。これは第１４図 に示すプラスミドｐｓＶ８６０をもたらした。図中、記号は第１３図と同じ意味 で、新しいＨｉｎｄｍ−８ｎａＢ　１部位はニニ＝の記号で示す。（ＳｎａＢ１ 部位とＳｍａ１部位はライゲーションの際消滅する。） 実施例１７　ｃｏｓ細胞中での尿酸オキシダーゼｃＤＮＡの一時的発現。細胞溶 解物中の尿酸オキシダーゼア・ソセイＣＯ８細胞はＳＶ４０ウィルスのＴ抗原を 発現するサルの腎細胞である（Ｙ、グルラマン、セル２３巻（１９８１）１７５ −１８２頁）。この細胞はＳＶ４０ウィルスＤＮＡの複製開始点を含むベクター の複製を許すもので、動物細胞の遺伝子発現の研究に好ましい宿主である。

１）ＣＯ８細胞のトランスフェクションと尿酸オキシダーゼｃＤＮＡの一時的発 現 ＣＯＳ細胞４．１０５個を、直径５ｃｍのベトリ皿（コーニング）中に入れた、 グルタミン０．６ｑ／ｌおよびＮａＨＣＯ３３，７ｑ／ｌを含有しウシ胎仔血清 （ギブコ）５％を補足したダルベツコ修飾イーグル培地（ギブコ）（以下ＤＭＥ Ｍという）中にとり出す。５％炭酸ガス含有大気中３７℃で１６時間培養後、培 地を吸引除去し、細胞をＰＢＳ（ギブコのりん酸緩衝食塩水）３＊Ｉで洗浄する 。ついで、下記混合物を加える。（ＤＭＥＭ＋１０％）ウシ胎仔血清（ギブコ） ）１０００μ！、２ａｇ／ｍｌ濃度の平均分子量５００，０００のジエチルアミ ノエチルデキストラン（ファルマシア）１１０μＡ’、１００ｍＭクロロキン（ シグマ）１．１μ！およびプラスミドｐｓＶ８６０またはプラスミドｐＳＥＩ（ 対照）のＤＮＡ３μ９゜５％炭酸ガス含有大気中３７℃で５時間インキュベーシ ョン後、混合物を細胞から除く。ついで、１０％ジメチルスルホキシド（分光用 、メルク）含有ＰＢ３２ｍｌを加える。室温で１分間インキュベーション後、混 合物を除き細胞をＰＢＳでか２回洗浄する。ウシ胎仔血清２％を補足したＤ　Ｍ 　Ｅ　Ｍ　５　ｍｌを加える。さらに５％炭酸ガス含有大気中３７℃で４日間イ ンキュベーションを続ける。

２）サンプル調製 培地を吸引除去し、ＣｏＳ細胞をＰＢＳ３ｍｊ！で３回すすぐ。ついで、ゴムス パーチルでかき出して細胞をＰＢＳ１ｍＪ中に集める。かき出した後、皿をＰ　 Ｂ　Ｓ　ｌ　ｗｌですすぐ。２つの細胞けんだく液を合わせ、１００’ｒｐｍで １０分間遠心する。上清を除き、細胞残渣をｐＨ８，９の０．０５Ｍ　）リエチ ルアンモニウム（ＴＥＡ）／ＥＤＴＡ緩衝液１４１にけんだくする。

細胞を（氷上）１２Ｗにセットした超音波発生器（ビブラ・セル、ソエックス・ アンド・マテリアル・インコーホレイテッド（ＵＳＡ）製）で１０ｓパルスを用 いて超音波処理することにより溶解する。細胞溶解物を１０．００　Ｏｒｐｍで １０分間遠心し、上清を尿酸オキシダーゼアツセ用に採取する。

３）尿酸オキシダーゼ活性 尿酸オキシダーゼ活性は実施例９記載のように測定した。

結果は下表に示す通りである。

ＣＯ８酸トランスフェクション　尿酸オキシダーゼ活性Ｕ　／ｙｓＪｐｓＶ８６ ０　０．１０５ 尿酸オキシダーゼｃＤＮＡ保持プラスミドｐｓＶ８６０でトランスフェクション したＣｏＳ細胞は感知可能なレベルの尿酸オキシダーゼ活性を発現したのに対し 、対照では尿酸オキシダーゼ活性が認められない。それ故、尿酸オキシダーゼｃ ＤＮＡは発現した。

尿酸オキシダーゼのトリプシン消化生成物の２ｉ８ｎｍにおける光学密度測定に よる溶離図 プロテアーゼｖ８による尿酸オキシダーゼの消化生成物の２１８ｎｍにおける光 学密度測定による溶離図 ｌ　λλλＣＣＣ？ＣλＣフＧＣＣτＣτＣτＣλフτＣＣττＣＣＧ　ＧτＧ ＣＣＣＣＣＣ入フＣＣτＣλλ丁ＣＣλλＣ丁τＣＴ入Ｏλ@６０ １０６１　τλＧこλ７丁ＣλフてＣλＣフτＧτフτ丁丁τλＣＴτＣＣ入　 ”　１　１．。

クローン９Ｃおよびクローン９への一部のヌクレオチド配列第３図中１０９の位 置のＡＴＧから始まるＤＮＡ配列およびコードされたポリペプチド Ａ、フラブス尿酸オキシダーゼのトリプシンおよびプロテアーゼＶ８による加水 分解により得られた配列ペプチドＧコード化ポリペプチド、背反する矢印により 示す。

□　：トリプンンペプチド 中−−−−−一◆　ニブロチアーゼ■８の加水分解により得られたペプチド ｏｌ　Ｔ プラスミド　Ｐイ６３，１ Ｈｉｎｃ　Ｉ［ プラスミド　ｐ　１６０ （Ｈｉｎｃ　ＩＩ　） プラスミド　ｐ３７ジ２ （）！ｉｎｃ　ＩＦ　） プラスミドＰ４６２ （Ｈｉｎｃ　Ｉ［） プラスミド　Ｐ４６６ ｓＬ　Ｉ プラスミド　ｐＥ門Ｒ４１４ Ｎｈｅ　Ｉ ＰｓＬ　Ｉ プラスミド　ｐＥｒ−ＩＲ４６９ ｈｅ　Ｉ ＰｓＬ　Ｉ プラスミド　ｐＥ朋４７３ プラスミド　ビＳ〔１ ブ５スミＦ　ｐ５ＶＢ６０ −−１−１−幽一一甑　ＰＣＴ／ＦＲ９０１００５３２国際調査報告

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. （１）少なくとも１６Ｕ／ｍｇの特異的尿酸オキシダーゼ活性をもち、適当なら ばメチオニンが先行していることもある下記配列【配列があります】 を有するか、または上記配列と実質的な度合いの相同性を有する、蛋白質。
2. （２）少なくとも３０Ｕ／ｍｇの特異的尿酸オキシダーゼ活性を有する、請求項 １記載の蛋白質。
3. （３）２次元ゲル上の分析により、少なくとも蛋白質マスの９０％を示す、約３ ３．５ｋＤａの分子マスおよび８．０附近の等電点のスポットを呈示する、請求 項１または２記載の蛋白質。
4. （４）Ｃ８グラフトシリカカラム上での液体クロマトグラフィーで測定したとき ８０％より高い純度を有する、請求項１−３の何れか１項記載の蛋白質。
5. （５）８．０附近の等電点を有する、請求項１−４の何れか１項記載の蛋白質。
6. （６）好ましくは原子マス４３単位附近の分子マスを有する封鎖基をアミノ末端 セリン上に保持する、請求項１−４の何れか１項記載の蛋白質。
7. （７）請求項１−６の何れか１項記載の蛋白質を含有する医薬。
8. （８）下記配列 【配列があります】 をもつ蛋白質をコードするＤＮＡ配列を有する組換え体遺伝子。
9. （９）原核細胞中での発現を可能にする、請求項８記載の組換え体遺伝子。
10. （１０）ＤＮＡ配列が下記配列 【配列があります】 を含む、請求項９記載の組換え体遺伝子。
11. （１１）真核細胞中での発現を可能にする、請求項８記載の組換え体遺伝子。
12. （１２）ＤＮＡ配列が下記配列 【配列があります】 を含む、請求項１１記載の組換え体遺伝子。
13. （１３）動物細胞中での発現を可能にする、請求項８記載の組換え体遺伝子。
14. （１４）ＤＮＡ配列が動物細胞中での発現を有利にする非翻訳５′配列が先行し ている下記配列 【配列があります】 を含む、請求項１３記載の組換え体遺伝子。
15. （１５）動物細胞中での発現を有利にする非翻訳５′配列が、請求項１４記載の 配列のすぐ上流に位置する配列ＡＧＣＴＴＧＣＣＧＣＣＡＣＴを含む、請求項１ ４記載の組換え体遺伝子。
16. （１６）発現に必要な手段と共に、請求項８−１５の何れか１項記載の組換え体 遺伝子を保持する、発現ベクター。
17. （１７）少なくとも１種の選択マーカーを保持する、請求項１６記載の発現ベク ター。
18. （１８）プラスミドｐＥＭＲ４６９、ｐＥＭＲ４７３およびｐＥＭＲ５１５のう ち１種の特性をもつ、請求項１７記載の発現ベクター。
19. （１９）請求項９記載の組換え体遺伝子を保持する請求項１６記載の発現ベクタ ーにより形質転換されている、原核微生物。
20. （２０）請求項１１記載の組換え体遺伝子を保持する請求項１６−１８の何れか １項記載の発現ベクターの１種により形質転換されている、真核細胞。
21. （２１）請求項１６−１８の何れか１項記載の発現ベクター１種により形質転換 されている、サッカロマイセス・セレビシエ株。
22. （２２）ロイシンまたはウラシルの合成をつかさどる遺伝子少なくとも１種上に 変異を有する、請求項２１記載の株。
23. （２３）ＬＥＵ２およびＵＲＡ３遺伝子の少なくとも１種上に変異を有する、請 求項２２記載の株。
24. （２４）下記段階 １）請求項２１−２３記載の株を培養し、２）細胞を溶解し、 ３）溶解物中に含まれる組換え体尿酸オキシダーゼを分離精製すること を含む、組換え体尿酸オキシダーゼの製造法。
25. （２５）発現に必要な手段と共に、請求項１３記載の組換え体遺伝子を含む、動 物細胞。
26. （２６）請求項１４記載の組換え体遺伝子を保持する請求項１６記載の発現ベク ターを含む、動物細胞。