JPH01501037A - 有機化合物の又はそれに関連する改良 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 有機化合物の又はそれに関連する改良 本発明は、リグニンの改質及び分解酵素に関する。リグニンは、置換したシンナ ミルアルコール前駆体のフリーラジカル重合により形成される複合ポリマーであ り、そしてそれは乾燥木材重量の１５−３５％を構成する。製紙工程を通じて、 セルロース繊維が相互に会合でき、最終製品に強度をもたらすために、セルロー ス繊維がそれらを包み込んでいるリグニンマトリックスから遊離されねばならな い。このポリマーの分離は、リグニンの除去により達成され化学パルプとするこ とができ、声だリグニンを残存さすことにより砕木パルプを高収率で得ることが できる。漂白工程を通じて、リグニンが除去されそして得られるパルプは増白さ れる。

リグニンは生物的攻撃に対して高い抵抗性を有する。いがなる生物体も単独炭素 源としてのリグニン上で増殖することは示されていなかった。しかしながら、複 合リグニンポリマーは、さまざまなより高等な菌類の純粋培養物により完全に分 解される。木材の白腐れ菌類（ｗｈｉｔｅ−ｒｏｔ　ｆｕｎｇｉ）によるリグニ ン生分解の最も広範囲にわたる生理学上の研究は、コルチクラセア（Ｃｏｒｔｉ ｃｒａｃｅａｅ）科の単一のメンバー、ファネロキート・クリソスポリウム・パ ルプ（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅｃｈｒ　ｓｏｓ　ｏｒｉｕｍ　Ｂｕｒｄｓ） について行なわれてきた。

限、定された実験室条件下で、カビのリグニン分解は、培養のほぼ最初の３日間 は観察されない、その後、培養が炭素又は窒素について欠乏してくると、その培 養の４日又は５日において初めてリグニン分解が観察され、そして６日で最高に なる。炭素又は窒素の欠乏に応じるリグニン分解の誘導は、カビのリグニン代謝 が二次代謝現象であることを示す。

今のところカビのリグニン分解は、いくつかの理由により工業的には実施不能で ある。リグニン分解活性は二次代謝の結果としてのみ誘導されるため、リグニン 分解の速度は許容できない程遅い、従って、初期増殖期間のあとに飢餓を続ける ことが要求される。さらにまた、菌類はそれらの一次栄養源としてセルロース繊 維を代謝し、パルプ収率の低下及び品質の悪いパルプ製品をもたらす。

ＰＣＴ出！ｆｌＷ０８７１００５５０は、Ｐ、クリソスポリウム（Ｐ。

仕■肚鉦杜」）から導かれるｒＬＤＭ”　６と命名されるリグニン分解酵素の調 製を開示する（リグニンを分解しそして改質する酵素ｒＬＤＭ”は、Ｒｅｐｌｉ ｇｅｎ社、Ｃａ＋ａｂｒｉｄｇｅ、　ＭＡ、の商標である）。

この調製物は実質的に純粋であり、そしてまた、それ故に他のルｏＭＴＨ及び分 解性の生来のプロテアーゼを実質的に排除する。該酵素は、プロトヘム■の酸化 型（Ｆｅ”）として固定されたヘム構成単位に結合したタンパク組成（アポタン パク）から成る。このｒＬＤＭ”　６製品は木材のパルプ化や排水処理における 使用のために望ましい性質を有する。上記ｒＬＤＭ””は過酸化水素の存在下で ベラトリルアルコールからベラトリルアルコールへの酸化を促進しうる特異な性 質により特徴付けられるペルオキシダーゼ活性を示す、またさらに該ルＤＭＴＭ の次の物理的パラメーターも開示されていた：（１）ＳＤＳにより決定された分 子量；（２）アミノ酸組成； （３）ヘム含有量； （４）抗体反応に対する相同性； （５）リグニンモデル物質に対する比活性；及び（６）特定の酢酸ナトリウム重 量モル濃度でのＦＰＬＣカラムからの溶出。

ｒＬＤＭ”　６　（７）調製は、ＷＯ３７１００５５０中に開示されるように行 うことができるが、ｒＬＤＭ”　５タンパクをコードするＤＮＡをクローンする ことができ、そして適当な宿主で発現されうるならば、より効率的なｒＬＤＭ” 　６の生産が遺伝子工学操作により実現されうろことが予期できるであろう、し かしながら、これらは決して既に完成しているものでもなく、そしてまた上記先 行技術文献はどのようにクローニングまたは発現が達成できるかについていかな る示唆も提供していないため、異種宿主においてＰ、クリソスポリウム（Ｐ、ｃ ｈｒ　ｓｏｓ　ｏｒｉｕｍ）遺伝子の活性を発現しうるかどぅがは予測可能でな かった。

本発明は、上記リグニナーゼタンパクをコードするＤＮＡ配列のクローニング及 び適当な宿主細胞におけるその発現により、そしてさらにプロトヘム■と該組換 えリグニナーゼタンパクを再構成することにより組換えｒＬＤＭＴＭ６リグニナ ーゼ酵素を提供する。

従って、本発明はＰ、クリソスポリウム（Ｐ、ｃｈ■５ｏｓ−シト１μリ−に由 来する原型そのもののｒＬＤＭ”　６タンパクをコ−ドするＤＮＡ配列を提供し 、そしてその配列は第１表に示される。該ＤＮＡ配列から上記タンパクのアミノ 酸配列は、同表に示したように推測されている。

ｒＬＤＭ”　６タンパクをコードするＤＮＡ配列のクローニングは、フェロカエ テ・クリソスポリウム（Ｐｈａｎｅｒｏｃｈａｅｔｅ劇匡り和」ツわ１り一の発 酵により十分な量のＲＮＡを調製することから始められた。増大した量のＲＮＡ は、５Ｃ２６（ＮＲＲＬ１５９７Ｂ）と称される＾ＴＣＣ２４７２５のＵＶ誘導 変異株から調製された。

逆転写酵素でｍＲＮＡの複写後、リグニン改質又はリグニン分解酵素を含む二次 代謝に関与する遺伝子をコードするＤＮＡ配列を含んで成るシーンバンクを構築 した＊　ｒＬＤＭ”　５に対して反応性の抗体が、該バンクのプローブとして用 いられた。

ファージＤＮＡが標準的な操作を使用し、上記クローンの単離物から調製された 。その後、コンピテント宿主中でのｒＬＤＭ”６タンパクのその後の発現のため の適当なベクター中に該ＤＮＡが挿入された。

上記へふと共に再構成した場合に、実質的に同じルＤＭ”　６酵素活性を示しう る広汎な種々の改良した組換えｒＬＤＭ”タンパクもまた本発明の態様に包含さ れる。　ｒＬＤＭ”にタンパクは、もっとも確実に存在する他の生来の対立遺伝 子から発現されるため、構造的変形物が公知の方法により組み立てられることが できるし、又天然起源のものであることもできる。

ヘムと共に再構成した場合、遺伝子工学による変形のルＤＭＴＭ６タンパクもま た、リグニナーゼ活性を有しうろことが示された０例えば、その正常なＮ−末端 における１以上のアミノ酸で延長される成熟ルＤＭ”６配列を含んでなるタンパ クは、以下に記載されるように調製された。その上にアミノ酸によってその正常 なＣ−末端において延長した上記成熟配列を含んでなるタンパクもまた、アンバ ー宿主における発現プラスミドの発現を惹起することによる本明細書に示される ように゛生産することができる。

またさらに、原型のｒＬＤＭ”　６タンパクについて見い出されたＤＮＡ配列に 対してハイブリダイズするＤＮＡ配列から発現されるもとのタンパクのサブフラ グメント（ｓｕｂｆｒａｇａ＋ｅｎｔ）も改質ルＤＭ”６タンパクの定義内にあ る。

原型の組換えｒＬＤＭ”　６タンパク又はその改質ｒＬＤＭ”　６タンパクを上 記ヘムと共に再構成した場合は、リグニンを分解し又改質する天然の酵素と同様 の態様で使用することができ：そしてクラフトリグニン、例えば微粉砕木材リグ ニンにおける無漂白クラフトパルプ中に見い出され、例えば熱機械パルプ中に見 い出されるもの、及びリグニンモデル化合物に対して活性を有する。

また、上記ルＤＭ”６タンパクに対する遺伝子は、プローブとしてｒＬＤＭ”　 ６タンパクのｃＤＮＤＮＡの部分的配列を用いることにより、ゲノムＤＮＡ、い わゆるゲノムクローンがら単離することができる。その操作方法は先行技術文献 に周知である（Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｔ、Ｆｒ１ｔｓｃｈ、　Ｅ、Ｆ、及びＳａ ｍｂｒｏｏｋ＋　Ｊ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　：　Ａ　ｐ　Ｍａｎ ｕａｌ＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎ Ｙ＋　１９８２参照）、このようにして得られた該ゲノムクローンは種々の宿主 のための適当なベクターに挿入することができる。

第１表に記載されるようなりＮＡ配列に加えて、生来の対立遺伝子を含有する変 形ＤＮＡ配列、及び遺伝子工学による変形のＤＮＡ配列及び再構成した場合ｒＬ ＤＭ”　６酵素活性を示しうるルＤＭ”６タンパクをコードする変形ＤＮＡ配列 も、また本発明の態様の範囲内となる。

ｒＬＤＭ”　６タンパクについてコードするものとして見い出されるＤＮＡ配列 の中の１以上の修正を表わす対立遺伝子は、例えば、少なくとも約２０−約３０ ０のヌクレオチドを有する本明細書に記載されるような、ルＤＭ”６の成熟配列 についてコードするＤＮＡから切断される標識付けした１又は複数の適当な長さ のＤＮＡを用いてＰ、クリソスポリウム又は同様に木材を分解する菌類から導か れる適当なｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡバンクをプローブすることによって天然源 から得ることができる。

またさらに、既に確立した公知の技術、例えば部位特異的突然変異誘発、ループ アラ）　（ｌｏｏｐ−ｏｕｔ）法及びヌクレオチドを置換するための他の公知方 法を用いることによりルＤＭ”　６タンパクについてコードするところの本明細 書に記載したゲノムＤＮＡ配列又はｃＤＮＡから、上述した改良タンパクをコー ドする変形のＤＮＡ配列を直接調製することができる。

原型のれＤＭ”６タンパク及び変形ｒＬＤＭ”　６タンパクのヌクレオチド配列 を手にすることにより当業者は容易にルＤＭ”　６タンパクについてコードする 同一の他の等価なヌクレオチド配列を評価することができる０周知のごとく、遺 伝暗号の冗長性のため異るヌクレオチド配列が同一のタンパクをコードでき、そ こで、はとんどのアミノ酸が１以上のヌクレオチドトリプレン）　（ｃｏｄｏｎ ）によってコードされる。従って、本発明の主題の態様は、単に本明細書に開示 される特定のヌクレオチド配列にとどまらず、上記ヘムで再構成した場合に実質 的に同一のルＤＩＤ”　６リグニナーゼ活性を有する分子についてコードする全 ての均等なヌクレオチド配列をもまた包含する。

さらにまた、ｒＬＤＭ”　６タンパクについてコードするヌクレオチド配列が本 明細書に開示されるため、本技術分野において周知の方法による“シーンマシー ン（ｇｅｎｅ　ｍａｃｈｉｎｅ）　”によって合成することもできる。

それで、本発明の広範な態様において、本発明により提供されるヌクレオチド配 列は、リグニナーゼ活性を有するタンパクについてコードし、そしてストリンジ ェントなハイブリダイジング条件（例えば、２．５×生理的クエン酸緩衝液中、 ６０℃）下で、本明細書の表！に開示するところの成熟ｒＬＤＭ”６タンパクに ついてコードする配列とハイブリッドするそれらのｃＤＮＡ及び／又はゲノムＤ ＮＡ配列を包含する。

しかしながら、また同様に認識されるであろうが、典型的には異種の又は非生来 の宿主系での発現を増大する目的のために、原型のままの配列をコードするｃＤ ＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡが、同種のタンパクについてコードする非常に非類 似のＤＮＡ配列を調製するために実質的に変形され又は修復されるであろう、従 って、最もその広い態様において、ルＤＭｉに６特有のリグニナーゼ活性を有し 得るｒＬＤＭ”　６及び変形したｒＬＤＭ”　６についてコードする、単離した 組換えＤＮＡ配列又は合成りＮＡ配列を本発明は提供する。

ｒＬＤＭ”　６遺伝子の安定な維持及び発現を可能とする条件下で、広範囲な種 々の方法が、該遺伝子を微生物宿主に導入するために利用できる。遺伝子の発現 のための転写調節シグナル及び翻訳調節シグナル、それらの調節制御下における 遺伝子及び宿主生物体における配列と相同なりＮＡ配列（これにより組み込みが 生ずる）を、及び／又は宿主において機能的である複製系（これにより組み込み 又は安定な維持が起こる）を含有するＤＮＡ構成物を提供できる。

ルＤＭ”６又はｒＬＤＭ”　６の生物活性サブフラグメントについてコードする 本質的に純粋なヌクレオチド配列が、発現クローニングベクターの適当な制限酵 素部位に連結され得る。もし必要ならば、リンカ−分子を使用してヌクレオチド 配列に複数の部位が加えらえ得る（例えば、Ｎｏｒｒｉｓ、　Ｋ、Ｅ、ら（１９ ７９）Ｇｅｎｅユニ　３５５−３６２、参照）、その後、連結したＤＮＡはコン ピテント原核細胞又は真核細胞を形質転換するために使用することができる。

ｒＬＤＭ？Ｍ６タンパクはサツカロミセス・セレビシアエーΩμ匹ルシ男ｕμ狙 　ｃｅｒｅν１ｓｉａｅ）由来の誘導性ガラクトースオペロンを含有するプラス ミドを用い、上記微生物において発現することができる（Ｂｒｏａｃｈ、　Ｊ、 Ｒ，＋　Ｌｉ＋　Ｙ、＋　Ｗｕ、　Ｌ、Ｃ，及びＪａｙａｒｗ、Ｍ＋　”Ｅｘｐ ｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅ ｓｉｏｎ”（１９８３）　８３頁、編者Ｍ、Ｉｎｏｕｙｅ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ 　ｐｒｅｓ３％参照）、これらのプラスミドは、ＹＥｐ５１及びＹＥｐ５２と称 され（Ｂｒｏａｃｈ。

Ｊ、Ｒ，ら、（１９８３）同上）、そしてＥ、コリー（Ｅ、並置）復製起点、β −ラクタマーゼについての遺伝子、酵母ＬＥＵ　２遺伝子、２ＪＭの複製起源及 び２ｎの環状ＲＥＰ　３遺伝子座を含有する０組換え遺伝子の発現は、酵母ＧＡ Ｌ遺伝子プロモーターによって誘導される。

他の酵母プロモーター、例えばアルコールデヒドロゲナーゼ（Ｂｅｎｎｅｔｚｅ ｎ、　Ｊル及び）ｔａｌｌ、　Ｂ、Ｄ、　（１９８２）　Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ ｍ。

２５７　：　３０１８　；　Ａｍｍｅｒｅｒ、　Ｇ、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　 Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　（１９８３）νｏ１．１０Ｌ１９２頁、参照）、ホスホ グリセレートキナーゼ（Ｄｅｒｙｎｃｋ、　Ｒ，、Ｈｉｔｚｅｍａｎｎ、　Ｒ， Ａ、＋　Ｇｒａｙ、　Ｐ、Ｗ、、　Ｇｏｅｄｄｅｌ＋Ｄ、Ｖ、　Ｅｘｐｅｒｉｍ ｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏ ｎ（１９８３）　２４７頁、編者Ｍ、Ｉｎｏｕｙｅ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒ ｅｓｓ）　、）リオースホスフェート　イソメラーゼ（Ａｌｂｅｒ、　Ｔ、及び Ｋａｗａｓａｋｉ。

Ｇ、　（１９８２）　Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔ、 　１　：　４１９−４３４）、又はエノラーゼ（Ｉｎｎｅｓ、　Ｍ、Ａ、ら（１ ９８５）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２６　：　２１）が同様な態様な使用することが できる。

ｒＬＤＭ’ゝ６遺伝子は、糸状菌アスペルギルス旦■肛■旦■）により発現され 得るが、これは該菌類が−Ｐ、クリソスポリウムと類縁であるからである。アス ペルギルス旦肚肛■旦旦）において遺伝子発現のために用いることができる好ま しい宿主ベクターは、”Ｂｕｘｔｏｎ、　Ｆ、Ｐ、、　Ｇｗｙｎｎｅ、　０．１ ．及びＤａｖｉｓ。

Ｒ，Ｗ、　Ｇｅｎｅ　［１９８５）　３７　：　２０７−２１４”に記載されて いるベクターである。

ｒＬＤＭ”　６タンパクは、哺乳動物細胞中で、例えばＯｋａｙａｍａ−Ｂｅｒ ｇクローニング系（Ｏｋａｙａｍａ、　Ｈ，及びＢｅｒｇ、　Ｐ、　（１９８３ ）　Ｍｏ１ｅｃ。

ａｎｄ　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、　３　：　２８０−２８９）、ワタシニアウイル ス発現系−（Ｍｏｓｓ＋　Ｂ、（１９８５）　Ｉａ＋ｍｕｎｏｌｏｇｙ　Ｔｏｄ ａｙ６　：　２４３　；　Ｃｈａｋｒａｂａｒｔｉ。

Ｓ、、Ｂｒｅｃｈｌｉｎｇ、Ｋ、ｌ　Ｍｏ５ｓ＋　Ｂ、（１９８５）　Ｍｏ１ｅ ｃ、ａｎｄ　Ｃｅ１ｌ。

Ｂｉｏｌ、５　：３４０３）又はマウスレトロウィルスから誘導されるベクター （Ｍｕｌｌｉｇａｎ　Ｒ，Ｃ，Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔ ｉｏｎ　ｏｆ　ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　（１９８３）　１５５頁、編者 Ｍ、Ｉｎｏｕｙｅ、　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）を使用して、発現せしめ ることができる。

上記リグニナーゼタンパクは、リグニン及びリグニンから誘導される物質に対し てペルオキシダーゼ活性を示すためにはヘムと再構成されねばならないため、ま た本発明は、酸化還元系の存在下でのヘムとアポタンパク質との反応工程を含ん でなる活性ヘムタンパク質に再構成するための方法を提供する。

さらに、組換りグニナーゼ酵素は、本発明の組換えリグニナーゼタンパクを用い ることにより前記方法により得られた。

該組換リグニナーゼ酵素は、精製した天然のｒＬＤＭＴＭ５と同じリグニナーゼ 活性を示す。組換えＤＮＡ技術により調製された上記酵素は、セルロース又はヘ ミセルロースに有意な攻撃をすることなく、リグニンを分解／改質するために適 用される。天然の酵素のごとく、該ｒＬＤＭＴＭ６酵素は、直ちに作用しそして 単離された天然の菌類を用いる場合に必要とされるところの、いかなる代謝誘導 も要求されない。

本明細書におけるペルオキシダーゼタンパク、リグニナーゼアポ−タンパク又は リグニナーゼタンパクの語は、ヘムと再構成されていないタンパクであって、そ してヘムと再構成された場合にペルオキシダーゼ活性及び／又はリグニナーゼ、 活性を有し得るタンパクを意味する。

またプロトヘム■の語は、プロトヘム■の酸化されたＦ　ｅ”型を意味する。

またリグニナーゼ酵素とは、プロトヘム■と再構築されたりグニナーゼタンパク をいう。

！圧旦ｌ立 本出願に記載された培養物の次の寄託が、微生物の寄託のためのブタペスト条約 の規定に従い、Ｔｈｅ　ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｕ１ｔ ｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ（ＮＲＲＬ）、　Ｎｏｒｔｈｅｒ　Ｒｅｇｉｏｎ ａｌＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｕ、Ｓ、　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏ ｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ＋　１８１５Ｎｏｒｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　 ５ｔｒｅｅｔ、　Ｐｅｏｒｉａ、　ｌ１ｌｉｎｏｉｓ、　ｔｌｓＡになされＥ、 ｃｏ￥１（ｐＬｎ１０５）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１５６１９８６年１２月３１日 Ｅ、ｃｏｌｉ（ｐＬｎ１０６）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１５７１９８６年１２月３ １日Ｅ、匹且（ｐＢＳＲ３）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０６８１９８６年５月１日り 並置に１２　ＪＭ１０５　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０６７１９８６年５月１日Ｅ、ｃ ｏｌｉ（ｐＲＥＶ２．２）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０９１１９８６年７月３０日Ｓ 、ｃｅｒｅｒｉｓｉａｅ（ｐＬｎｌｏｏｌ）　ＮＲＲＬ　Ｙ−１８１６３１９８ ７年１月１４日口皿五に所 第１図：クローン３−１及びクローン３−２の制限酵素部位の地図及び推定の大 きさ。

第２図：成熟ルＤＭ”６のＮ−末端配列第３図：クローン３−２由来の始まり部 分の配列を伴う成熟ｒＬＤＭ”　６ＯＮ−末端配列の整列第４図：再構成ｒＬＤ Ｍ”　６の活性の回復の経時変化第５図：　ｐＬｎ１０６の物理的地図 第６図：　ｐＬｎ１０６構築の略式図 第７図：　ｐＲＥＶ　２．２及び複数のクローニング部位の略式間第８図：　ｐ Ｌｎ１０５の構築についての略式間第９図：　ｐＴＰＨの構築についての略式図 第１０図：　ｐＬｎｌｏｏｌの構築についての略式固成の記載は、本発明を実施 するための方法を説明する例である。特に別の記載がないかぎり、全てのパーセ ンテージは重量によったものであり、そして全ての溶媒の混合割合は容量によっ ている。

王抜及グ林料 ｏ＋ＲＮＡの抽出、ｃＤＮＡライブラリーの調製、細胞の形質転換、及びベクタ ーの構築等について使用される技、術のほとんどは、当該技術分野で広〈実施さ れていて、そしてほとんどの通常の実施者が具体的な条件及び具体的方法を記載 する一般的な提供先を熟知するものである。これらの方法は、例えばＭａｎｉａ ｔｉｓ、　Ｔ、＋　Ｆｒ１ｔｓｈ、　Ｅ、Ｆ及びＳａｇｎｂｒｏｏｋ＋　Ｊ、、 　（１９８２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　■並亘し：　Ａ　只蝕胆旦■Ｍａｎｕａ１ ．　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　ｔｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、　Ｎｅｗ 　Ｙｏｒｋ、に記載されている。

従って、微生物細胞からのＤＮＡの抽出、制限酵素消化の実施、ＤＮＡ断片の電 気泳動、プラスミドの切断及び再結合及びＤ　Ｎ　Ａの挿入、Ｄ　Ｎ　Ａの連結 、細胞の形質転換、タンパクの電気泳動、並びにＤＮＡの配列決定は遺伝子工学 分野におけるそれらの上記の技術の範囲内のものとなる。

ここ使用される全ての制限エンドヌクレアーゼは、ＢｅｔｈｅｓｄａＲｅｓｅａ ｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、　ＭＯ）又は Ｎｅｗ　ＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、　ＭＡ）から購入さ れ、そして供給者の指示に基づき使用された。

ＤＮＡ配列の決定は、Ｍａｘａ−及びＧ１１ｂｅｒｔの方法（Ｍａ、ｘａｍ。

Ａ、及びＧ１１ｂｅｒｔ、　Ｗ、　（１９７７）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａ ｄ、Ｓｃｉ、ＤＮＡ　７４　：５６０）及びＨｅ１ｄｅｃｋｅｒらの方法（Ｈｅ ｉｄｅｃｋｅｒ、　Ｇ、、　Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ。

及びＧｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、　Ｂ、　（１９８０）　Ｇｅｎｅ　１０　：　６９ ）を用いて実施された。

アガロースゲル電気泳動は、トリス−酢酸塩ゲル緩衝液（該ゲル及び１系列の実 験に対する緩衝液中、８０＋ｅＭのＴｒｉｓ−ＨＣｊ！　、　ｐＨ８，Ｏ：　４ ０ｍＭの酢酸ナトリウム；３６＋ａＭのＮａＣ１；２ｇＭのＮａｇ　ＥＤＴＡ） を２系列用いて実施された０分析用ゲルは、水平ゲル箱中の“サブマリンゲル（ ｓｕｂｓ＋ａｒｉｎｅ　ｇｅｌｓ）”として日常的に扱われた。ＤＮＡバンドは 、エチジウムプロミド（ＥｔＢｒ）後−着色（ｐｏｓｔ−ｓｔａｉｎｉｎｇ）　 （１系列のゲル緩衝液１−当たり０．５■）により、そしてその後ＵＶ−透過モ デルＴＭ　−３６（Ｕｌｔｒａ　Ｖｉｏｌｅｔ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社製、Ｓａｎ 　Ｇａｂｒｉｅｌ、　Ｃ＾）の使用により視覚化された。

分取用アガロースゲルからのＤＮＡの抽出は、単一のゲル系のＥｔＢｒ−着色バ ンドの位置の視覚化により開始された。興味の対象のＤＮＡ断片を含有するゲル 切片が、手動的に采のＭ酢酸アンモニウム、１０＋＋＋Ｍ　ＥＤＴＡ　、１０＋ Ｍ酢酸マグネシウム、０．１％５ＤＳ）と共に２０ｇのニードル（ｎｅｅｄ　ｌ ｅ）を通して流された。１ｇＭの酢酸アンモニウム、１０ａＨのＥＤＴＡで飽和 された等量のフェノールが加えられ、そして２３℃において一晩中ロータリーシ ェーカー上のエフペンドルフチューブ中で抽出が実施された。その後、該チェー プは、微量遠心により水層の分離に先立って３０分間氷上に放置された。

飽和フェノール溶液による上記水層の抽出が３−４度繰り返えされた後、クロロ ホルム抽出そしてその後エタノール沈澱が続けられた。１５ｋｂより小さいＤＮ Ａ断片の通常の回収率は約４０％であった。

−ＲＮＡの悴 Ｐ、クリソスポリウム（Ｐ、ｃｈｒ　ｓｏｓ　ｏｒｉｕｍ）　ＮＲＲＬ１５９７ Ｂを、グルコースを補給しそしてｐｕｔｓに緩衝液で調整した窒素制限微量元素 培地において増殖せしめた。

発酵培養物中のりグニナーゼ活性は、ベラトリルアルコールからベラトリルアル デヒドへの酸化速度を決定する一般的な方法により定期的に測定された。

発酵における細胞外流体からの新規なｒＬＤＭ”の単離及び精製は、限外濾過及 び陰イオン交換カラムを用いるＦＰＬＣにより達成された。

」人し１及条作 ＮＲＲＬ１５９７Ｂの培養は、１２５ｒｎ！のエーレンマイヤーフラスコ中で静 置増殖として、ディスク発酵容器中で、１１もしくは２Ｉｌの振盪エーレンマイ ヤーフラスコ中で、又は２（ｌの発酵装置中で増殖された。培養の最初の２つの タイプは、窒素制限Ｂ１１１／グルコース培地と命名した次の培地において増殖 された。

１．０８Ｘ　１０−”Ｍの酒石酸アンモニウム、１．４７Ｘ　１０−”ＭのＫＨ ！ＰＯ，，２，０３Ｘ　１０−３ＭのＭｇ５０ｍ・７１（２０，６，８Ｘ　１０ −’ＭのＣａＣ１ｇ　”　２１ｈＯ，２，９６ｘ　１０−’Ｍの塩酸チアミン及 び１０ｍ１−Ｌ−’の微量元素溶液、該微量元素溶液は、？、８Ｘ１０−”Ｍの ニトリロ−酢酸、１．２Ｘ１０−”ＭのＭｇＳＯ４・７Ｈ！０．１．７　Ｘ　１ ０−”ＭのＮａＣ１，３，５９Ｘ　１０−’ＭのＦｅＳＯ４・７Ｂ！０．７．７ ５Ｘ　１０−’ＭのＣｏＣ１ｇ　、９．０　×１０−’ＭのＣａＣ１ｔ　、３． ４８Ｘ１０−’ＭのＺｎ５Ｏａ　・７　ＨｚＯ，４Ｘ　１０−’ＭのＣｕ５Ｏａ 　・５ＨｚＯ５２、Ｉ　Ｘ　１０−’ＭのＡＩＫ（５０４）！・１２Ｂ宜０．１ ．６　Ｘ　１０−’ＭのＨｓＢＯｓ　、４．　Ｉ　Ｘ　１０．−’ＭのＮａＴ’ １ｏＯａ　・２　ＨＩ３及び２．９ｘｌＯ−”ＭのＭｎ５Ｏａ　”　Ｈ，Ｏを含 有する。

上記培地は、１０％（重量／Ｉりのグルコースが補給され、そして７倍の微量金 属（基本水準＋６倍）及び０．０４Ｍのベラトリルアルコールを含有する１０． ｈＭ酒石酸アンモニウムによりｐａ４．ｓに緩衝化された。振盪フラスコ培養及 び２０ｆｆｉ発酵は、０．１％Ｔｗｅｅｎ　８０を添加する他は上記と同じ培地 であった。

１０−の培地を含有する１２５ｄ静置エーレンマイヤー・フラスコは、０．５− の菌糸接種物で接種され、そして１日当たり０・３・及び６回０：にさらされた 。

ディスク発酵容器は２ｊ！の培地を含有した。接種は１０〇−の菌糸接種物の添 加によった。接種後１日以内に、筋をつけたディスクは、薄い菌糸マットにより 覆われた。回転生物学的接触装置（ｒｏｔａｔｉｎｇ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　 ｃｏｎｔａｃｔｏｒｓ）（ＲＢＣｓ）は、１分当たり１００ｇ＋７の０２により カバー中の開口部を通して連続的にフランシュされた。

それぞれ３００＠ｌ又は６００−の培地を含有する１１又は２１の振盪エーレン マイヤー・フラスコは、５０ｍ１又は１００−の上記菌糸接種物で接種された。

該フラスコは３９℃で２５ＯｒｐｍにおいてＮｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　ｉｎ ｃｕｂａｔｏｒ（Ｎｅｗ　Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ。

Ｅｄｉｓｏｎ、　ＮＪ）により振盪された。培養物は１日当たり０，２゜４及び ６回０２にさらされた。

１０−１１の培地を含有する２０Ｉ！ヴアーチス（Ｖｉｒｔｉｓ）発酵槽（シリ ーズ４３）（Ｔｈｅ　Ｖｉｒｔｉｓ　Ｃｏ、＋　Ｉｎｃ−＋　Ｇａｒｄｉｎｅｒ 、　ＮＹ）は、７日経過したりグニナーゼ陽性のＩ　Ｉ！（３００Ｗｉ）振盪エ ーレンマイヤー・フラスコからホモジナイズしていない菌体で接種された。その 発酵槽の羽根は３００ｒｐ霧で回転せしめた。酸素は、コーニングシリコン性０ ．０５８インチ医療用チューブ約５０フイート（Ｃｏｒｎｉｎｇ　Ｇｌａｓｓ　 Ｗｏｒｋ、　Ｃｏｒｎｉｎｇ＋　ＮＹ）を通した拡散により導入された。酸素流 は３００ｍ／分に等しかった。

（Ｂ）１グニナーゼアーセイ フラスコ又はＲＢＣｓ中のりグニナーゼ活性は、ベラトリルアルコールからベラ トリルアルデヒドの酸化（以下、ｖｅｒａｔｒｙｌａｌｃｏｈｏｌ　ｏｘｉｄａ ｔｉｏｎについてｒＶＡＯＪと略記される）速度を決定することにより定期的に 測定された。　２７５Ｊの細胞外流体又は約０．５ｎの精製酵素、２＋ｓＭベラ トリルアルコール、０．４１の）！２０□及びおのおの２０５Ｍ又は１００＋＋ Ｈの酒石酸ナトリウムをＯｏ、５−の最終容量（ｐＨ２，９）として反応混合物 に含有せしめた。反応はｉ、０□の添加により開始されそして３１０ｎｍにおい てモニターされた。標準として血清アルブミン（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌ　 Ｃｏ、、　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ＋　ＭＯ）を用い、Ｂｒａｄｆｏｒｄ＋　Ｍ、Ｍ、 。

（Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　７２　：　２４Ｂ−２５４（１９７６）　）に より、又はタンパク溶液の４０９ｎｍの吸光度を用い、そしてリグニナーゼの吸 光係数からタンパク量を計算することによりタンパクは決定された。

（Ｃ）リグニナーゼのＵ 上記のごとく調製された細胞外流体は、ミリボア０．４５Ｊｍフィルター（Ｍｉ ｌｌｉｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、　Ｂｅｄｆｏｒｄ、　ＭＡ）を通し て予め濾過され、次いでアミコン（Ｄａｎｖｅｒｓ、　ＭＡ）　ＹＭＩＯフィル ターを通して２０倍に濃縮され（今後、この濃縮物はリグニン分解混合物、ＬＭ ”にと称される）、そして１０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）に対して透 析され、そしてさらに０．４５１！ｍフィルター（Ａｃｒｏｄｉｓｃ　Ｌｏｗ　 Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｂｉｎｄｉｎｇ、　Ｇｅｌｍａｎ、　Ａｎｎ　Ａｒｂｏｒ。

Ｍｌ）を通して濾過された。ＨＰＬＣ（高性能液体クロマトグラフィー）は、濾 過されたＬＭＴＮを用いて、ＬＤＣ／Ｍｉｌｔｏｎ　Ｒｏｙ（Ｍｉｌｔｏｎ　Ｒ ｏｙ　Ｃｏ、、　Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、　ＮＹ）固定４１０ｎｍ波長検出器を装 備されたＧ１１ｓｏｎ（Ｇｉｌｓｏｎ　Ｃｏ、、　Ｉｎｃ、、　Ｗｏｒｔｈｉｎ ｇｔｏｎ＋　０）１）システムにより行われ、そして該カラム由来のそれらの溶 出物からりグニナーゼを精製するために、Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｐｉｓｃａｔａ ｗａｙ。

ＮＪ）　ＦＰＬＣガｏｎｏ　Ｑ陰イオン交換カラムを用いＧ１１ｓｏｎの可変波 長検出器により）ＩＰＬｃが実施された。移動相は、１０ｍＭから１Ｍの酢酸ナ トリウム（ｐＨ６，０）のダラージエントから成り、そして典型的な調製法とし ては、４１０ｔ＋＋ｏ及び２Ｂ０ｎｍにおいて絶え間な（モニターしながら１分 当たり２献の流速で４０分間以上通用された。目的の各リグニナーゼが、カラム （Ｋｉｒｋら、（１９８６）　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｏｒｂ、　Ｔｅｃｈｎｏｌ 、８　：２７−３２）から特定の酢酸ナトリウム　モル濃度で溶出した。

（Ｄ）ボッアク１ルアミパル＋＃°（ＰＡＧＥＰ、クリソスポリウム（Ｐ、０Ｄ 慢郊ｌこ口ｍ１−（ＮＲＲＬ　１５９７８）によって生産されるリグニナーゼは 、Ｌａｅ＊ｍｌｉ＋　Ｕ、）［（Ｎａｔｕｒｅ２２７　（１９７０）　：　６８ ０−６８５）による５ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動により分析 された０本来のスラブゲル法は、０ｒｎｓｔｅｉｎ＋　Ｌ、　（Ａｎｎ、　Ｎ、 Ｙ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　１２１　［１９６４）　：３２１−３４９）及びＤ ａｖｉｓ、　Ｂ、Ｊ、（Ａｎｎ、　Ｎ、Ｙ、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　１２１（１ ９６４）　：　４０４−４２７）により行われていた。電気泳動での分離後、タ ンパクはクーマシーブル着色するか、又はウェスターンプロット分析を用いる標 準的な方法により視覚化された。

■叉二尺Ｎ人皿製 総ＲＮＡは、Ｐ、クリソスポリウム（Ｐ、ｃｈｒ　ｓｏｓ　ｏｒｉｕａ＋）のベ ラトリル　アルコールを酸化する発酵培養物から調製された。収穫しそして洗浄 した菌体は液体窒素により凍結され、そして細胞溶解のために乳鉢及び乳棒で破 砕された。その後、上記菌体粉末は、グアニジウム　チオシアネート変性溶液に 懸濁しそしてＣ５ＣＪ中で遠心した。ＲＮＡバンドを単離し、そしてマニアテス マニアル（Ｍａｎｉａｔｉｓ　Ｍａｎｕａｌ）に記載されるように、ｐｏｌｙ　 Ａ”　ｍＲＮＡを得るためにオリゴ（ｄＴ）−モルロース　カラムを通して流さ れた。

貫主二並■璽製 例２に得られるｐｏｌｙ　Ａ”　ｍＲＮＡ　１０　ＲがオリゴｄＴ＋ｚ−＋ｓで プライムされ、そして本質的にはＧｕｂ、１ｅｒ及びＨｏｆｆｍａｎに記載され ているように逆転写酵素により複写された（Ｇｕｂｌｅｒ＋　ｕ、及びＨｏｆｆ ｍａｎ、　Ｂ、Ｊ、　（１９８３）　Ｇｅｎｅ　２５　：　２６３−２６９）。

ｃＤＮＡは、周知及び商業的に入手可能なベクターラムダ（ｌａｍｂｄａ）−ｇ ｔｌｌ中にクローン化された（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、及びＤａｖｉｓ。

Ｒ，Ｗ、　（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　 ８０　：　１１９４−１１９８　；Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅ ｍ＋　Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ、　ＣＡから入手可能）、二重鎖ｃＤＮＡは、Ｅｃｏ 　ＲＩメチラーゼ酵素（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ。

Ｂｅｒｅｒｌｙ、　ＭＡ）及びＳ−アデノシル−メチオニンにより供給者の勧め に従ってメチル化され、そして３つのＥｃｏ　Ｒ１リンカ−（ＧＧＡＡＴＴＣＣ ，ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧ及びＣＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧＧ）の混合物と連結された 。これらのリンカ−は、すべての３つの翻訳読み取りわくが得られうろことを確 実にする。

ＥｃｏＲＩ　リンカ−が連結されたｃＤＮＡは、Ｅｃｏ　Ｒ１エンドヌクレアー ゼにより切断され、そして１％アガロースゲルより６００から２．０００塩基対 の両分が単離された。　ＥｃｏＲＩにより開裂され精製されたこのｃＤＮＡは、 ＥｃｏＲＩで切断され、フォスファターゼで処理されたラムダ−ｇｔｌｌ　ＤＮ Ａと連結され、次いでファージに充填されそしてＬ　装置Ｙ１０８Ｂ　（ＡＴＣ Ｃ３７１９５）を感染させるために使用された。

４−　スクｌ−ニング ＨＰＬＣ精製されたＰ、クリソスポリウム（Ｌ　劇ｇ償上齢−ＬＤ？！’”６に 対して反応性のラビット抗−ルＤｌ’！”抗体は、Ｙｏｕｎｇ・らにより開示さ れたように上記６０．０−２，０００ｂｐ　ｃＤＮＡがら誘導されたバンクをプ ローブするために使用された（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ。

及びｆｌａｖｉｓ、　Ｒ，Ｗ、　（１９８３）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、　８０　：　１１９４−１１９８）　、交叉反応性クローンが検出され た。

ファージＤＮＡが、一般的な方法によって上記交叉反応性クローンの個々の単離 物から調製され（例えば、Ｈａｎ５ａｔ５ｓｔＴ、゛らを参照）、そしてｃＤＮ Ａ挿入部の大きさを明らかにするためにＥｃｏ　Ｒ１により消化された。３−１ と称されるクローンの挿入部の大きさは、概ね５２ｏｂｐである。またさらに、 約６５０ｂｐの類似の挿入部を他の４つのクローンが含有したが、それらをクロ ーン３−２が代表する。

第１図は、クローン３−１及びクローン３−２のＤＮＡ挿入部の制限酵素地図を 示す、クローン３−１は、Ｅｃｏ　Ｒ１リンカ−配列に隣接する予期したオリゴ ｄＴ区域（ｃＤＮＡ合成をプライムするために用いた）を含有する。

５−ｒＬＤＭ”５　７バク（７）Ｎ　（Ｄ　−−ＬｒＬＤＭ”　６は、変異株５ Ｃ２６由来のＰ、クリソスポリウム（Ｐ。

並■放肚匹ｊ３３７１の細胞外増殖培養物がら、）［ｉｒｋらにより記載されて いるような陰イオン交換ＨＰＬＣによって精製された（Ｋｉｒｋ、　Ｔ、に−＋ 　Ｃｒｏａｎ＋　ｓ、ＩＴｉｅｎ＊　Ｍ、＋　Ｍｕｒｔａｇｈ＋　Ｋ−Ｅ、及び Ｆａｒｒｅｌｌ、　Ｒ，Ｌ、　０９８６）　Ｅｎｚｙｍｅ　Ｍｉｃｒｏｂ、　Ｔ ｅｃｈｎｏｌ、８　：　２７−３２）、この単離物は、ＨＰＬＣにょるＮ−末端 アミノ酸分析に供された（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ＋　Ｍ、及びＨｏｏｄ、　ｔ 、、　（１９８３）　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎＥｎｚｙｍｏｌ、　３Ｊ、、　＝　 ２２７．４８６）、該Ｎ−末端分析の結果は第２図に示される。

この系においてシスティンは検出されない、そしてそのため第３番目、第１４番 目及び第１５番目のアミノ酸はブランクとして記載された。

６−１グニ　−ゲルＤＭ”　６　ンパク　コードするロ　１の盈付旦 クローン３−２の仮定した５′端からのＤＮＡ配列情報の解析は、第３図に示さ れるように実験的に決定した成熟タンパクＮ−末端と一致する配列を示した。ク ローン３−１及びクローン３−２の１４５ｂｐ領域が完全に一致することが示さ れるため、それらの共通のＳｓｔ　１部位におけるクローン３−２及びクローン ３−１を一緒にスプライシングすることにより完全な鎖長のｃＤＮＡが再構築さ れ約１２８０ｂｐのｈ虹Ｒ１−虱１−Ｅｃｏ　Ｒ１断片をもたらす、該断片の配 列は、第１表に示される。

このＲ乞Ｒ１−虱１−旺Ｒ１断片（以下ｒＲ１断片」という）は、Ｅｃｏ　Ｒ１ により消化されたプラスミドｐＲＥＶ２．２　（米国特許出願出願番号第８９２ ６８０号に開示）にクローンされた。得られるプラスミドはｐＬｎ１０２である 。

これは、それぞれ、タンパクの予測したＮ−末端半分及びＣ末端半分が個々に見 い出されることでかなり非−標準的なりローニング方法を意味する。

Ｒ１断片が適当な発現ベクター、例えばプラスミドに適切に挿入され、そしてそ のベクターが非−アンバー抑制細菌を形質転換するために用いられる場合、培養 においてその宿主細菌は、第１表に示されるところの１−位のＡｌａがら３４５ −位における停止シグナルの直前のＡｌａ（３４４−位）におけるア熟ルＤ「８ ６タンパクを発現する。　Ｅ、ｃｏｌｉ　ＪＭ１０３のごときアンバー抑制宿主 が、上記ベクターにより形質転換される場合、第１表に示されるアミノ酸配列の Ｃ−末端は、アミノ酸位置３６１のｃｔｙであり、そしてそれは３６２−位にお ける強力な停止シグナルの前に位置する。　ｃＤＮＡ配列から予測される成熟ｒ ＬＤ）！ｌ”　６アボータンパクのアミノ酸配列は、ｌ−位のＡｌａから３４４ −位のＡｌａまで拡がる、３４４残基から成る。

７−−スミ”ＢＳＲ３（７）”” 成熟ルＤＭ”６アポタンパク配列の始まりにおけるＡｌａ用コドンの部分はＢｓ ｓ　１１１サイ）　（ＧＣＧＣＧＣ）部位の一部分を含み、該部位の残部はＡｌ ａコドンに先行しそしてマイナス１−位におけるＡｒｇ用ＣＧＣコドンのすべて を含有するため、ｒＬＤＭ”６アボタンパクについてコードする標準情報のすべ てを含有するＢｓｓ　ＨＩＩ−Ｓｓｔ　Ｉ−Ｅｃ虹ＲＩ　ＤＮ＾断片をクローニ ングプラスミドｐＬｎ１０２　（例６）から、まず最初に切断することにより切 り出し、そして得られる５′端突出部をフレノウフラグメントのＤＮＡポリメラ ーゼ処理によりフィルインし、こうしてアミノ酸Ａｌａ及びＡｒｇをコードする ＤＮＡを完全に再構成する。得られる直鎖状にされそして処理されたプラスミド ＤＮＡは、その後所望の断片を取り出すためにエンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１ で消化された。ゲル単離後、この断片は第７図に示されるプラスミドｐＲＥＶ２ ．２を有するタンパク融合系として発現プラスミドｐＢｓＲ３を調製するために 用いられた。第７図に示されるように、プラスミドｐＲＥＶ２．２は、プロモー ター（Ｐ）の下流に複数のクローニングサイト（ＭＣ５＞を包含する。

複数クローニン多゛サイト内の制限サイトは、第７図中の直線化したＭＣ５部分 に示される。ｐＢＳＲ３を調製するために、プラスミドｐＲＥＶ２．２が制限エ ンドヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１及びＥｃｏ　ＲＶで完全消化され、そして得られ た直鎖状のプラスミドを、上記で得られそして改良されＢｓｓ　ｌｌｌ−５ｓｔ 　Ｉ−Ｅｃｏ　ＲＩと標準的な連結方法によって連結した。従って、ｐＢＳＲ３ 中のＧＣＣ（第１表中の９１−位、９２−位及び９３位）で始まる成熟タンパク をコードする配列は、その５′又は上流末端においてＡｒｇをコードするＣＧＣ に先行され、今度は、これは２９アミノ酸をコードする８７ｂｐにより直接先行 され、これが今度はｎｅｔをコードするＡＴＣにより直接先行される。そこで、 ｐＢＳＲ３は、ｒＬＤＭＴＭ６アボタンパクの成熟配列を有するアミノ酸配列を コードしており、この成熟配列はその通常の末端において、Ｎ−末端としてＭｅ ｔを有する３エアミノ酸の断片により先行されている。非アンバー宿主における ｐＢＳＲ３の発現は、次の例８に記載される。

８−Ｅ、　ｃｏｌｉ（ＢＳＲ３）　の　えｒＬＤＭ”　６　ンパクの固及乏迫班 ２０ｆｆｉ発酵槽のＬ　吐（ｐＢＳＲ３）（ＮＲＲＬ　Ｂ−１８０６８）は、改 良２％酵母エキストラクト培地で酸素を制御することなり２４−３２時間増殖さ れた。この培地組成は次のとおりである：戒−一二分　−」し− 酵母エキストラクト　２０．Ｏｇ　／　１カゼインペプトン　２０．０　ｇ　／ 　Ｉ！カザミノ酸　２０．０　ｇ　／　７！ ＫＨ！Ｐ０．　２．０　ｇ　／　１ ）ｈＨＰＯ４２，Ｏｇ　／　Ｉ ＮａＪＰＯ＜　’　７８ｚＯ２，Ｏｇ　／　１クロラムフエニコール　１００． ０　ｇ　／　ｊ！採集した細胞の既知量が細胞溶解されそして５ＯＳ−ＰＡＧＥ により分析され、次いでクマーシーブルータンパク着色によす視覚化された場合 、見かけの分子量約４１，０００を有するタンパクバンドが未−形質転換細胞の 対照に比較しより顕著になった。

このバンドがｒＬＤＭ”　６アボタンバクを示すことが、天然のｒＬＤＭ”　６ に対する抗体反応を用いるウエスターンブロフト分析により確認され（Ｔｏｓ１ １ｂｉｎ＋　Ｉｆ、、　５ｔａｅｈｅｌｉｎ、　Ｔ、及びＧｏｒｄｏｎ　＋Ｊ、 　（１９７９）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７６　： 　４３５０−４３５４）、そしてこれにより主な免疫反応性タンパクがこの分子 量に一致することも明らかにされた。このタンパクはグリコジル化されておらず 、天然（工、クリソスポリウム産生）のタンパクから識別される。

細胞が連続的にリゾチーム及びビーズ　ミル処理により細胞溶解された場合、組 換えｒＬＤＭ”　６アボタンバクは、遠心後のペレット画分のみに検出された。

次に、組換えルｎＭＴＭ６タンパクの可溶化のために、上記ペレット画分は４− ８Ｍ尿素溶液又は約６Ｍグアニジン溶液で処理される。８Ｍ尿素の使用はそのｒ ＬＤＭ”タンパクの９０〜９５％を可溶化するが、一方、４Ｍ尿素溶液は５０％ のタンパクを可溶化するだけである。

４Ｍの尿素溶液（ｐ）１８のＴＥｌｊ（街液、５０ｒｎＨのＴｒｉｓ　−）ＣＩ 及びＩ　ＯＩＭ　ＥＤＴＡを加えた４Ｍ尿素）が、上記細胞溶解ペレ。

トに加えられる場合、次に上澄から単離されるペレット中には、まだ５０％のタ ンパクが残存する。引き続いて、８Ｍ尿素溶液の添加は残存する５０％を十分な 又は殆んど完全な可溶化を可能にする。従って、上記の方法により９５％以上の タンパクが可溶化され得る。

１０＋ｏＭジチオスレイトールの添加は、４Ｍ尿素溶液における可溶化の効果を 殆んど８Ｍ尿素溶液の水準まで高めることが見い出された。

９−　ブースミドＬｎ１０４の牙。リ プラスミドｐＢＳＲ３（例７）が変形ｐＢＳＲ３を調製するための−ｉ的なルー プ−アラ）　（ｌｏｏｐ−ｏｕｔ）実験の原料とされ、そこにおいては、開始Ａ ＴＧ及び１−位のＡｌａのためのＣＧＣ間のヌクレオチド配列中のコドンの１つ （１−位ＡｌａのためのＧＣＣの前のＡｒｇについてコードするＣＧＣ）を除く すべてが切除された。この結果を得るため、プラスミドｐＢＳＲ３が制限エンド ヌクレアーゼＥｃｏ　Ｒ１及びＮｄｅ　Ｉで処理され、リグニナーゼをコードす る配列を含有する得られる断片がゲル単離されたｐＢＳＲ３の他の部分が制限エ ンドヌクレアーゼＰｓｔ　Ｉで処理することにより直鎖状にされ、次いでゲル単 離された。

その後、これらの単離された２つの断片が、所望のループ−アウト効果を奏する ために設計されそして配列ＴＴＡＡＴＧＡＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＡＴＧＣＧＣＧ ＣＣＡＣＣＴＧＴＴＣＣＡＡＣＧＧを有する一重鎖（７）４０塩基ヌクレオチド と混合された。得られたヘテロ二重鎖をＤＮＡポリメラーゼ処理し、そして得ら れる系を常法で処理し所望の発現プラスミドを単離して、これをｐＬｎ１０４と 命名した。　ｐＬｎ１０４でＥ、コリー（Ｅ、ｃｏｌｉ）　ＪＭ１０５を形質転 換し、そして好結果の形質転換体を培養すると、正常なＮ−末端に先行するＡｒ ｇを伴う成熟ｒＬＤＭ”　６のアミノ酸配列を担持する３４５個のアミノ酸のリ グニナーゼタンパクが発現した。

１０−　ブースミ′Ｌｎ１０５の ｐＲＥＶ２．２から得られるＥ、コリ（Ｅ、ｃｏｌｉ）のプロモーター及び上記 成熟タンパクの１−位ＡｌａについてコードするＧＣＣの直前に位置付けられる べき開始ＡＴＧコドンに先行する標準的非コードリポソーム結合サイトを含有す るオリゴヌクレオチドの前記プロモーターの下流への連結を用いるオペロンフュ ージョン（ｏｐｅｒｏｎ　ｆｕｓｉｏｎ）としてプラスミドｐＬｎ１０５は構築 された。従って、ｐＬｎ　１０５は該成熟タンパクのＮ−末端に先行するＮｅｔ を有するアミノ酸配列をコードするように設計されている。第８図がら要約する と、プラスミドｐＬｎ１０５は制限エンドヌクレアーゼＢｓｓ　ＩＩＩによるク ローニングプラスミドｐＬｎ１０２　（例６）（約１２８０ｂｐのＥｃｏ　Ｒ１ −５ｓｔ　Ｉ　−Ｅｃｏ　Ｒ１断片とＥｃｏ　ＲＩ切断ｐＲＥＶ２．２との簡単 な連結により調製された）の消化によって調製された０次に、得られる直鎖状の プラスミドが、標準的方法によりＳ１ヌクレアーゼで消化され、これによって、 Ｂｓｓ　ＨＩＩ消化により生成された５′突出部が除去された。その後、得られ る断片がプラスミドｐＲＥＶ２．２の複数クローニングサイト部位において切断 される制限エンドヌクレアーゼＢｉｎ　ｄｌＮで消化された。得られる大きな断 片は、その後標準的な連結方法によりオリゴヌクレオチドＡＧＣＴＡＴＡＡＴＧ ＡＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴＡＴＧＧＣＴＡＴＴＡＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＡＴＡＣ ＣＧと連結された（上記成熟タンパクの１−ＡｌａについてコードするＧＣＣを 再創製する目的で）。なおこのオリゴヌクレオチドは、開始するメチオニン（Ａ 　Ｔ　Ｇ）コドン及びアラニンコドンのＧＣ部に付着された非コードリポソーム 結合サイトＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴを含有する。　ｐＬｎ１０５は宿主Ｅ、コリ　 （Ｅ、ｃｏ旦）３月１０３　（ＮＲＲＬ　Ｂ−３９４０３）において発現された 。Ｎ−末端はメチオニン−アラニン−スレオニン、その他第１表どおりのものと して発現する。メチオニンは単離されたほとんどのｒＬＤＭ”６においては検出 されながった。

１１−ブースミドＬｎ１０６の　′ プラスミドｐＬｎ１０６は、第６図に示される略図で示されるように構築された 。第６図に基づき要約すると、ＲＥＶ２．２のＭ　ＣＳ　領域内で切断する制限 エンドヌクレアーゼＢａａ　ＩＩＩ及びＳｍａ　ＩでプラスミドｐＲＥＶ２．２ が消化された。得られる約３．９８０ｂｐのＤＮＡの大きな断片が消化断片がら 単離された。プラスミドｐＬｎ１０５が制限エンドヌクレアーゼＢａｇ旧（これ はｐＲＥＶ２．２由来のＭＣ３部位で切断する）及びＮａｅ　Ｉ　（コれは１１ ７０−位及び１１７１位のヌクレオチド間を切断する）で消化され、そして得ら れる約１．１１８ｂｐの断片が消化断片がら単離された。

次に、約３．９８０ｂｐ及び約１，１１８ｂｐ上記の単離された断片が標準的な 連結方法を用いて一緒に連結された。得られるプラスミドｐＬｎ１０６は、゛第 １表に示すように、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性のための各遺伝 子、複製起点、Ｅ。

コリ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）プロモーター、配列ＧＧＡＧＴＣＣＣＴＴの非コードリ ポソーム結合サイト、ＡＴＧ開始コドン、並びに９１−位において初まり（ＧＣ Ｃ・・・・・・”）　、１１７０−位まで（・・・・・・ＧＴＧＧＣＣ）のりそ して１１２２−位まで伸びる（終りは、ＧＧＴＧＣＴ）　ｒＬＤＭ”６をコード する配列を包含する。

２−Ｅ、コＩＬｎ１０６　にお番る　えｒＬＤＭ丁Ｍ５アポえ之バＬΩ光里 プラスミドｐＬｎ１０６が、標準的な方法によってＥ、ｃｏ旦。

５Ｇ２０２５１　（ＮＲＲＬ　１５９１Ｂ）に形質転換され、そしてｒＬＤＭ丁 Ｍ６アボタンパクの発現を誘導するために例７のような培養により、２０１発酵 が増殖された。採集した細胞が連続的にリゾチーム及びビーズ　ミル処理により 細胞溶解された。遠心後、組例８と同様に、組換えｒＬＤ？ｌ”　６アボタンバ クが不溶性のベレット画分から単離された。タンパク溶液は、４Ｍの尿素、５０ ＋＋＋Ｈの酢酸ナトリウム（ｐＨ６）、及び１０ｍＭのジチオスレイトール（Ｄ ＴＴ）で抽出することにより３０％まで精製され、そして３０秒〜３分間ＰＯＬ ＹＴＲＯＮ　（Ｂｒｉｎｋｍａｎ　Ｉｎ５ｔｒｕ＊ｅｎｔｓ＋Ｗｅｓｔｂｕｒｙ 、　ＮＹ）で再懸濁された０次に、上澄抽出物が適当な遠心によりベレットから 分離された。タンパク溶液が緩衝液Ａ　（４Ｍの尿素、５０＋ｅＭの酢酸ナトリ ウム（ｐＨ６）、及び５ｍＭ　ＤＴＴ）中のＤＥＡＥ−ＳＥＰ）ＩＡＲＯｓＥ陰 イオン交換カラム（ＰｈａｒＷｌａｃｉａ。

Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、　ＮＪ）にかけられた、Ｏから０．５−１．０Ｍ　Ｎａ Ｃ１のダラージエントが緩衝液Ａにおいて実施された。百分が集められそして５ ＤＳ−ポリアクリルアミドスラブゲル電気泳動により分析された（例１参照）、 ｉｉｔ気泳動分離後、タンパクはクマーシープルー着色により視覚化された。Ｅ 、コリ（Ｌ　装置’）　５Ｇ２０２５１株（ＮＲＲＬ　Ｂ−１５９１８）からこ の方法により調製されたｒＬＤＭ”　５の見かけの大きさは約３９．５キロダル トン（ｋｄ）である。Ｅ、コリ　（ＥＬｃｏｌｉ）中のｐＬｎ１０６がら調製さ れたｒＬＤＭ”　６はグリコジル化されておらず、それは天然の（Ｐ、クリソス ポリウム産生）タンパクから識別される。

ＤＥＡＥ−セファロースカラムから集められた画分は、さらにまた抗−ｒＬＤＭ ”　６リグニナ一ゼ抗体とのそれらの免疫反応性について検査された。最も強い 免疫活性画分が集められ（２５ａｆ）、そし７４Ｍ（７）尿素、５０　ｍＭ（７ ）ＫＨｚＰＯｎ　（ｐＨ７，０）及び４＋ａＭ（ＤＤＴＴ中サイジングカラム、 Ｓ　−３００（４００ｇａＺ）　セファクリル（Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ）　（Ｐｈ ａｒｍａｃｉａ）にかけられた、このサイジングカラムからの百分（各１０Ｉｎ りの免疫活性が再び検査され、そして最も強い活性のものが集められた。この集 めた画分を５Ｏ５−ＰＡＧＥにより試験した場合、クマーシープルー着色パター ンを走査することにより判定したところ約２ｏ％ｒＬＤＭ”　６であることが明 らかになった。

このように調製されたｒＬＤＭ”　６の最初の８個のＮ−末端アミノ酸は、Ａｌ ａ　Ｔｈｒ　＝　Ｓｅｒ　Ａｓｎ　Ｇａｙ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒであることが決定さ れた。なお、この系のブランクは一般にシスティン残・基である。従って、開始 ＡＴＧコドンがコードするメチオニンが、これらの発酵及び調製条件下では存在 することが見い出せなかった。Ｎ−末端メチオニンは、Ｅ、コリ　（Ｅ、ｃｏｌ ｉ）株、発現レベル及び精製方法に応じて、他のルＤＭ”６の調製物中には存在 する可能性がある。

３−　えｒＬＤＭ”　６　’グニ　−ゼの従来、Ｐ、クリソスポリウム（Ｐ、ａ ｈ■ｄ由来のりグニナーゼ又は組換えリグニナーゼのヘムとの再構成の成功例は 示されていなかった。

ｒＬＤＭ”　６の良好な活性を実現するために、出発物質は凍結細胞か又は直前 に採集した細胞であることができる。タンパク溶液は例１０に記載されるように 調製される。尿素抽出混合物は室温では６時間以内で攪拌するのがよく、そして 即座にその抽出物は遠心の重力に応じて３０分から１５時間遠心される。陰イオ ン交換カラムが直ちに実施され、もし集めたｒＬＤＭ”　６を含有する百分が一 ２０℃に維持されないならば、その集めた画分は２４時間以内に再構成プロトコ ールに供され、そして−２０℃に維持される場合にはそれらは再構成の前にかな り長く貯蔵することができる。

少なくとも、２６ユニツトの比活性（ベラトリルアルコールからベラトリルアル デヒド生成７分／ｒＬＤＭ”６の■）に対応するｒＬＤＭ”　６の活性を有する 、好結果の再構成は、５−１００％純度の範囲内にあるｒＬＤＭ”　６調製物に より達成された。これらのｒＬＤＭ”　６　Ｕ４製物は、クローンｐＬｎ１０５ か又はクローンｐＬｎ１０６を発現する細胞から調製された（例１０　、１１及 び１２参照）、これらの調製物は、典型的には０．１−０．３ＭＮａＣｊ！であ る陰イオン交換カラムからの溶出緩衝液中に０．１−１■／−のタンパク濃度で 存在することができる。またさらに、酵素を再構成するために用いる上記タンパ ク調製物は、例１２に記載したように、ＤＥＡＥセファロースカラムから採集し た百分のサイジングカラムにおける溶出後に得ることもできる。

サイジングカラムから単離したルＤＭ”Ｍ　６タンパクは、２０％の純度が推測 される。

再構成法を実施するに先立って、ＤＥＡＥ−セファロースカラム又はサイジング カラムから得られたタンパク溶液は、まず最初にタンパク溶液から尿素を除去す るために透析されねばならない、緩衝剤を加えたタンパク溶液中のＤＴＴの存在 のために、タンパクはその還元した形態下で再構成のために用いられる。

使用された１の方法は次のとおりである：約２０％の総タンパクを示す組換えｒ ＬＤＭ”　６を含有するサイジングカラムから集めた百分は、３■／−の総タン パク濃度で４Ｍの尿素、５０ｍＭのＩＫＨｚＰＯａ　（ｐＨ７，０”）　、及び ４ｍＭＤＴＴの緩衝溶液中に存在する。尿素を除去するために、上記タンパク溶 液が４℃で一晩中、５０ｓ＋ＭのＴｒｉｓ−Ｃ１（ｐＨ８，０）　、１　ｓ＋Ｍ 　ＤＴＴ、及び２０％（Ｖ／Ｖ）グリセリンから成る２００倍過剰の緩衝液に対 して透析された。透析後、直前に０．　Ｉ　ＮＫＯＨに溶解した４倍モル過剰の ブトロヘムＩＸ　（Ｓｉｇｍａ）がこの透析タンパク溶液に加えられた。その後 、コノ混合液は５０ｍＭ（７）Ｔｒｉｓ−Ｃ／！　（ｐＨ８，０）　−１１ｎＨ の還元型グルタチオン及び１００ｍの酸化型グルタチオンに対して、４℃で一晩 中透析される。最後に、そのサンプルは１０ｍ１’ｌの酢酸ナトリウムを含有す る水溶液（ｐ）１６．０）に対して、４℃で一晩中透析される。また、この再構 成方法の変形のものも効果があることが証明されている。１つの変法は、プロト ヘムを加える前に還元型及び酸化型のグルタチオンを含有する溶液に対してｒＬ ＤＭ”　６タンパク溶液を透析することから成る。実験の一例は次のとおりであ る：上記したようにサイジングカラムから得られたタンパク溶液が、５０ｍＭの Ｔｒｉｓ−Ｃｊ！　（ｐＨ８，０）　、１　ｍＭの還元型グルタチオン及び１０ ０声の酸化型グルタチオンを含んでなる２００倍過剰の緩衝液に対し、４℃で一 晩中透析される。その後、４倍モル過剰のプロトヘムが透析したタンパク溶液に 加えられ、そして、最後に、得られた溶液が１１０１ＩＩの酢酸ナトリウムを含 有する水溶液に対して、４℃で一晩中、ｐＨ６，０においてさらに透析される。

再構成は、４０９ｎｍにおけるソーレー（Ｓｏｒｅｔ）吸収帯の存在によって示 される。

概括的に、再構成プロトコールは、 （ａ）１倍−１０倍モル過剰のヘムをアポタンパクの溶液に加えること； （ｂ）（ａ）で得られた溶液を０．１　５ｍＭの還元型スルフヒドリル酸化還元 系、及び１０−５０Ｍの酸化型スルフヒドリル酸化還元系を含んでなる溶液に対 し、ｐＦ１５−ｐＨ１０においてを含んでなる。

また、好ましい透析溶液は、５−３０％（Ｖ／Ｖ）グリセリンを含んでいてもよ く、より好ましくは２０％グリセリンを含んでいてもよい。

概括的に、変更された再構成プロトコールは、（ａ）アポタンパクの緩衝化した 溶液を１　５ｍＭの還元型スルフヒドリル酸化還元系、及びＩＭ−５００団の酸 化型スルフヒドリル酸化還元系を含んでなる透析溶液に対し、ｐ）１５−ｐＨ１ ｏで透析すること； （ｂ）１倍−１０倍モル過剰のヘムを（ａ）で得られたアポタンパクの溶液に添 加すること、 により特徴付けられる。

２つの再構成方法の（ｂ）により得られた溶液の過剰なヘムを除去するために、 適当な水溶液に対し、ｐＨ４−１）Ｈ８にてさらに透析してもよい。

再構成方法が良好なベラトリルアルコール酸化の比活性を有する生成物を与えな いならば、それらが高い比活性のｒＬＤＭＴＭ６をもたらし得る、再活性化方法 と称される種々の方法がある。かかる再活性方法の１つは、冒頭の再構成した物 質を１０　２００ｒｒ＋Ｈのリン酸カリウム又は同等な緩衝液（ｐＨ５−７）に おいて０．１■／ｄ−０，５＊／ｌＩｉのｒＬＤＭ”　６の濃度まで希釈するこ とである。４倍モル過剰（ｒＬＤＭ丁Ｍ６に対して）のプロトヘム■を加えるこ と、４℃−３７℃で１−２４時間インキュベートし、そして４℃−３７℃で４− ２４時間、１１０−２００１１Ｉのリン酸カリウム又は同等の緩衝液（ｐＨ５− ７）における透析工程を繰り返すことである。それに代わる方法は、冒頭の再構 成した物質を希釈を伴なわず、４倍過剰のプロトヘム■を加え、次に１０−２０ ０ａ＋Ｍのリン酸カリウム又は同等の緩衝液（ｐＨ５−７）におけるセファデッ クスＧ−５０カラムを通して流がす、　ｒＬＤｌｌ”　６物質を含有して得られ る溶出物は処理前の物質に対して優れた比活性を有する。

１４−　えｒＬＤＭ”　６　’グニ　−ゼの２例１３に記載されたように得られ た再構成した組換えリグニナーゲルＤＭ”６は、リグニンモデル化合物アッセイ において及びリグニンに対して活性を有することが証明された。

使用されたリグニンモデル化合物アッセイは、（１）ベラトリルアルコール酸化 （ＶＡＯ）アッセイ、（２）１，２゜４．５−テトラメトキシベンゼン（ＴＭＢ ）アッセイ、及ヒ（３）アドラーオールＣａｄ１ｅｒｏｌ）アッセイである。

ＶＡＯアフセイは、Ｃ，芳香族アルコールのアルデヒドへの酸化についての試験 であり、そして例１に記載されるものと同様である。

ＴＭＢアッセイは、脱メトキシレーションについての試験である。基質の１モル 当たり１モルの過酸化水素を消費するりグニナーゼ反応生成物は、２モルのメタ ノール及び２．５−メトキシベンゾキノンである０反応条件は、２−５鱈の精製 酵素、２０１Ｍの酒石酸ナトリウム（ｐＨ２，５）　、６４−過酸化水素、及び １ｍＭの１．２，４．５−テトラメトキシベンゼンである。該反応は、アリール 陽イオンラジカル中間体種の黄色を表示する４５０ｎｓ＋においてモニターされ る・アドラーオールアンセイは、Ｃ１ｙＣ：　Ａ結合の開裂そして得られるＣヶ アルデヒドへの酸化についての試験である。この反応条件及びモニターリングは 、アルブロールがベラトリルアルコールに置き代えられる以外はＶＡＯアフセイ と同一である。

リグニンアッセイは、ＹＳＩ２５１００ｘｉｄａｓｅ　ｐｒｏｂｅを備えるＹＳ Ｉａ＋ｏｄｅｌ　２５０ｘｉｄａｓｅ　ｍｅｔｅｒ　（Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉ ｎｇｓ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ　Ｃｏ−＋Ｉｎｃ−＋　Ｙｅｌｌｏｗ　Ｓｐｒｉ ｎｇｓ＋　ＯＨ）を用いて経時的な過酸化水素消費の速度を測定することにより 実施される０反応条件は、４０−の過酸化水素及びベラトリルアルコールを２０ −２５０ｘ／ｄの微粉砕木材リグニンか、又はクラフトリグニンがで置き代えた 以外は、上記ＶＡＯアフセイと同一である。

チャート■は、Ｅ、コリ　（Ｌ　並置）　ＮＲＲＬ　Ｂ−１８１５７（非−アン バー宿主）（例１２参照）から発現され、そして例１３に記載されるように再構 成したｒＬＤＭ”　５タンパクのＶＡＯ及びＴＭＢアッセイにより測定した代表 的な比活性、及びＰ。

クリソスポリウムｒＬＤＭ”　６内の天然リグニナーゼが主成分である蓄積物の 比活性を比較して示す。ｒＬＤＭ”　６酵素についてのアドラーオールによる比 活性はＰ、クリソスポリウムｒＬＤＭ”６酵素のそれと同等であった。

チャートＩ モデル化合物に対するリグニナーゼ活性ＶＡＯ（単位／ｍｇ）　＋　ＴＭＢ　（ Ａｕ／ａｔ）　”再構成ｒＬＤＭ”　６　２５．５　５１０Ｐ、曹牙即止　２２ ．９　４２２ ′″ＴＭＢアフセイの比活性は、ｒＬＤＭ”　５のミリグラム当たり、１分当た りの４５０ｎｍにおける吸収の増加として表示される。

＋ＶＡＯアッセイの比活性は、ミリグラムｒＬＤＭ”０６当たりの国際単位（１ 分間に生じるベラトリルアルデヒドのマイクログラム）として表示した。

添加５分後に実施した、リグニンに対する再構成組換えリグニナーゼの比活性は 、インジエリンＡＴ（クラフトリグニン）においては　７６．９単位／■ルＤＭ ”６及びタエダマツ（ｌｏｂｌｏｌｌｙ　ｐｉｎｅ）粉砕木材リグニンにおいて は６６．０単位／■ｒＬＤＭ”　６である（単位は、１分間単たりの過酸化水素 の１ナノモルの消費量を表わす）。

再構成における最終段階は、１０＋ａＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６，０）に対す る透析である。この最後の透析後の保管により再構成ルＤＭ”６の活性は増大す る。第４図に、４℃における８日間以上の保管による再構成ｒＬＤＭ”　６につ いてのＶＡＯ活性の増大を示す、０日は、サンプルが１０５Ｍの酢酸ナトリウム （ｐＨ６，０）透析物として取り出された日を表わす、該ＶＡＯアンセイは前記 のように実施される。８日間を越えるものの活性は、１０倍に増大した。５日の 保管後、その活性は増大しないが、かなり安定に存続する。Ｐ、クリソスポリウ ムリグニナーゼは、透析及び４℃での保管後に活性の増大をほとんど示さない。

再構成ｒＬＤＭ”　６の経時的な活性のこの増大は、またさらに過酸化水素消費 アッセイにおけるリグニンに対するアッセイ及び上記ＴＭＢアッセイにおけるリ グニンに対するアッセイにおいても観察された。単離後の活性の増大は、天然の Ｐ。

クリソスポリウム物質については観察されなかった。

過酸物の消費から計算した７日保管のルＤＭ”６の活性は、７６．９車位／　ｍ ｇ　ｒＬＤＭ”　６である。但し、ここで単位は、３９．１単位／■ルＤ？ｌ” 　６の６日保管酵素に対する１分間当たりの１ナノモル過酸化水素の消費を表わ す。活性の増大は温度に依存するようである。チャート２は、第４図において使 用されそして示された同じ再構成ルＤＭ”６物質に対して行った実験からのデー タを示す、他の前記の例の目標とするタンパク生成物の再構成は、低度のＶＡＯ 活性を示したｐＢＳＲ３（例７）を除き、同様なＶＡＯ活性を持つリグニナーゼ タンパクをもｒＬＤＭＴＭ６の活性増大の温度依存性室温に放置した二重反復試 験は、４℃に放置した二重反復試験の２６％以上の活性を増大した。

１５−ブースミドＬｎ１００１の　びＳ、セレビシェ−にお番る　えルＤＭ”６ の 酵母トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰ、Ｉ）転写プロモーター及びターミネ ータ−間の９１−位に始まり１１７２−位に終わる（第１表参照）　ｒＬＤＭ” ５のヌクレオチド配列を含有する挿入部と直鎖状の酵母−Ｅ、コリシャトルベク ターＹＥｐ　６（Ｓｔｒｕｈｌ、　Ｋ、ら、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓ ｃｉ、７６　：　１０３５−１０３９　（１９７９））との連結によりｐＬｎｌ ｏｏｌは構築され；またこの挿入部は、さらにＴＰＡプロモーターとｒＬＤＭ” 　６コ一ド配列との間にインベルターゼ　シグナル配列（ＩＮＶ−ｓｓ）（Ｃａ ｒｌｓｏｎ、　Ｍ、、　Ｔａｕｓｓｉｎｇ＋Ｒ，、Ｋｕｓｔｕ、　Ｓ、及びＢｏ ｓｔｅｉｎ、　Ｄ、、　Ｈｏ１．Ｂｉｏｌ、　（１９８３）　４３９−４４７） をコードする追加の６６個のｂｐオリゴヌクレオチドを含んでなり、そのためＳ 、セレビシェ−で発現される場合にはルＤ「８６タンパクの排泄が可能となり得 る。

この挿入部は、別々の５′部分及び３′部位として構築され、これは第２段階と してＹＥｐ　６中で結合される。

Ａ）ブースミドＴＰＲこれから（ＴＰＩプロモー　−がその′　゛　れ）の 第９図から要約すると、Ｍ１３ｎ＋ｐｌＯの旧ｎｄＴＩＩ及びＢａａ）Ｉ　Ｉサ イトがＴＰＩプロモーターの５′端及び３′端にそれぞれ隣接しているＭＴＰＩ ベクターを得る目的で、ＴＰＩプロ°モ゛−ターを含有しそしてＳａｌ　Ｉリン カ−を両端に有するｐＴＰＩＣ−１０（Ａｌｂｅｒ、　Ｔ、及びＫａｗａｓａｋ ｉ、　Ｇ、Ｊ、Ｍｏ１ｅｃ、　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎ。

土：４１９−４３４　［１９８２））の１２００ｂｐのＢｇｌｌｌ−Ｂｇｌｌｌ 断片が予め５ａｉｌによって消化されたＭ１３＋ａｐｌＯベクター（Ｍｅｓｓｉ ｎｇ、　Ｊ。

及びＶｉｅｒａ、　Ｊ、　Ｇｅｎｅ　（１９８２）　１５）−：　２６９−．２ ７６）と連結される。

その後、オリゴヌクレオチドに指令される突然変異（Ｖｌａｓｕｋ。

Ｇ、Ｐ、及びＩｎｏｕｙｅ、　Ｓ、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　Ｍａｎｉｐｕｌ ａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　（ｋｌｉ者、Ｈ，Ｉｎｏｕ ｙｅ）　Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　：　２９１−３０３）並びに（Ｉｔａ ｋｕｒａ、　ｘ、Ｉ　Ｒｏｓｓｉ＋　Ｊ、Ｊ、及びＷａｌｌａｃｅ、　Ｒ，Ｂ、 （１９８４）Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　５３　：　３２３−３５６） が引き起こされ、こうしてＴＰＩのＮ−末端メチオニンのコドンの直後にＨａｅ ｌｌｌサイトが創製される。

ＴＰＩプロモーターを含有するＢａ１Ｉ旧−旧ｎｄｌｌｌ断片刃（ＭＴＰＩから 取り出される。プラスミドｐＴＰＲは、この断片と予めＢａａ旧及び旧ｎｄ１１ １によって消化されたｐＢＲ３２２とのライゲーションの生産物である。

Ｂ）５′−０の　！に只　よ゛な） ＴＰＩプロモーターが適当な１０００ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｈａｅｌｌｌ断片とし てプラスミドｐＴＲ５からゲル単離される。

Ｒ１断片を含有するプラスミドが、Ｂｓ５）ＩＩＩ及びＫｐｎ　Ｉで直鎖状にさ れる（Ｋｐｎ　Ｉは、７２８−位及び７２９位のヌクレオチド間のルＤＭ？Ｍ６ をコードする配列を切断する）　、　６３７ｂ、断片は、アガロースゲルから単 離されるルＤＭ”６をコードする配列の５′端を含有している。

その配列が そしてインベルターゼのシグナル配列を含有する５６ｂｐ断片が、プラント５′ 端及び３′端に重なるＢｓ５ＨＩＩを有するように設計され、そして４個のオリ ゴヌクレオチドとして合成されるｉｌＡはコーディング鎖の５′の４０塩基であ り、ＩＢはコーディング鎖の３′の２２塩基であり、２Ａは非−コーディング鎖 の５′の４５塩基であり、そして２Ｂは非−コーディング鎖の３′２１塩基であ る。コンカテマーの形成を防止するために、ＩＢ及び２Ｂのみがキナーゼ処理さ れた。４つのオリゴヌクレオチドがアニーリングされそして連結され、次いで得 られるＩＮＶｓｓ断片がゲル単離された。

約１０００ｂｐのＥｃｏＲＩ−）１ａｅＩＩＩ断片、６３７ｂｐのＢｓ５ＨＩＩ 　−Ｋｐｎｌ断片及び５ｓｂｐ断片が一緒にＥｃｏＲＩ　−Ｋｐｎｌ−消化ｐＬ ｌｃ１９　（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ、　Ｃ，Ｖｉｅｒａ、　Ｊ、及びＭ ｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、（１９８５））に連結される。

Ｃ”）３二１４Ｉｌ策（第１０図に示すような）ＴＰ１転写ターミネータ−を含 有するプラスミドｐＴＰＩｃ−１０由来の約７００ｂｐ　ＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲ Ｖ断片がゲル単離される。

また、ｒＬＤＭ”　６をコードする配列の４４４ｂｐ　Ｎａｅｌ−Ｋｐｎｌ断片 がゲル単離される。

上記７００ｂｐ及び４４４ｂｐ断片がＥｃｏＲＩ−Ｋｐｎ　Ｉ−消化ｐｔｌｃ１ ９に連結される。

Ｄ）ル旦別し■盪象（第１０図に示すような）５′部を含有するＫｐｎｌ　−Ｅ ｃｏＲＩ断片及び３′部を含有するＫｐｎＩ　−ＥｃｏＲＩ断片が、それぞれＢ ）及びＣ）において構築されたプラスミドからゲル単離され、次いでＥｃｏＲＩ で消化されたＹＥｐ　６に連結される。

得られるプラスミド、ｐＬｎｌｏｏｌで宿主Ｓ、セレビシェ−ＤＢＹ７４７（Ｌ ｌｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ、　Ｂｅｒｋｅｌｅｙ＋　 Ｙｅａｓｔ　ＧｅｎｅｔｉｃＳｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ）を形質転換した。ＤＢ Ｙ７４７　（ｐＬｎｌｏｏｌ）が、ロイシン、ウラシル、トリプトファン、メチ オニン、カザミノ酸（Ｄｉｆｃｏ、　Ｄｅｔｒｏｉｔ、旧）及びグルコースを補 給した最少培地に接種され、そして激しく撹拌しながら３０℃で１８時間インキ ュベートされる。他方、宿主は０．６７％の酵母の窒素源、２％のグリコース及 び０．５％のカザミノ酸（Ｄｉｒｃｏ）を含有する合成培地で増殖することがで きた。細胞を採取し、そしてビーズ粉砕により細胞溶解される。不溶性細胞ペレ ７）由来の分子の大きさが４１ｋｄの主要なｒＬＤＭ”　６タンパクは、Ｐ。

クリソスポリウムｒＬＤＭ”　６に対して調製したポリクローナル抗体との免疫 学的反応によって検出される。

第　１　表 Ｒ１断片のヌクレオチド配列（ｒＬＤＭＴＭ６アボタンバクをコードする配列を 包含する）及びｒＬＤＭ”　６アポタンバクの推定アミノ酸配列 １位−ＧＡＡ　ＴＴＣＣＧＡ　ＧＡＧ　ＡＧＡ　ＴＡＧ　ＣＴＧ　ＣＧＡ　ＡＧ Ａ　ＧＣＴ　ＧＣＴ　ＡＴＣＴＣＴ　ＣＴＣＧＣＴ　ＣＴＣＴＴＧ　ＣＴＣＴＣ Ｇ　ＧＣＴ　ＧＣＧ　ＡＡＣＧＣＧ　ＧＣＴ←−←＜　Ｃ←　０口 ■−Ｑ−←（３）０α 第　１　表（続　き） ＧＧＣＡＡＧ　ＡＣＣＡＴＣＡＡＡ　ＧＡＣＧＴＴ　ＧＡＧ　ＣＡＧ　ＧＣＧ　 ＴＧＴ　ＧＣＧＧＬＹ　ＬＹＳ　ＴＨＲＩＬＥ　ＬＹＳ　ＡＳＰ　ＶＡＬ　ＧＬ Ｕ　ＧＬＮ　ＡＬＡ　ＣＹＳ　ＡＬＡＧＡＧ　ＡＣＣＣＣＣＴＴＣＣＣＧ　ＡＣ Ｔ　ＣＴＣＡＣＣＡＣＴ　ＣＴＣＣＣＧ　ＧＧＣＧＬＵ　ＴＨＲＰＲＯＰＨＥ　 ＰＲＯＴＨＲＬＥＤ　ＴＨＲＴＨＲＬＥＤ　ＰＲＯＧＬＹＣＣＣＧＡＧ　ＡＣＧ 　ＴＣＣＣＴＣＣＡＧ　ＣＧＣＡＴＣＣＣＴ　ＣＣＧ　ＣＣＴ　ＣＣＧＰＲＯＧ ＬＵ　Ｔ）ＩＲＳＥＲＶＡＬ　ＧＬＮ　ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＰＲＯＰＲＯＰＲＯＰ ｌ？０ＧＧＴ　ＧＣＴτＡＧ　ＡＴＧ　ＡＴＴ　ＣＣＡ　ＴＡＣＡＧＡ　ＡＴＡ 　ＣＧＣＣＴＣＧＡＡＧＬＹ　ＡＬＡ　車本＊　ＭＥＴ　ＩＬＥ　ＰＲＯ丁ＹＲ ＡＲＧ　ＩＬＥ　ＡＲＧ　ＬＥＩＩ　ＧＬＩＩＰＲＯＴ）ＩＲＶＡＬ　ＴＨＲＶ ＡＬ　ＡＬＡ　ＧＬＹＣＴＴ　ＣＧＧ　ＣＴＴ　ＴＡＣＴＡＧ　ＡＴＴ　ＴＣＡ 　ＴＣＣＡＴＴ　ＧＴＡ　ＴＣＴ　ＣＴＧＣＡＴ　ＣＴＧ　ＡＣＴ　ＡＣＧ　Ａ ＡＴ　ＣＴＴ　ＡＴＴ　ＣＧＴ　ＣＴＡ　ＣＴＣＴＣＴ　ＴＡ八へＡＡ　ＡＡＡ 　ＡＡＡ　ＡＡＣＣＧＧ　ＡＡＴ第１表において、コーディング配列のＤＮＡヌ クレオチドが、ＤＮＡがコードするアミノ酸配列と一致するトリプレット又はコ ドンとして直鎖状にグープ化されている。ヌクレオ千ドはそれらが現われる位置 の線上かまたは矢印を用いるかによって第１表の種々の位置に番号付けされてい る。また第１表は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸タンパク配 列をも示し、そしてかかるタンパク配列におけるアミノ酸（及び停止）は、それ らの現われる位置の線の下の九カフコ中に番号付けされている（正の番号付けは ｌｉｄされた成熟配列の最初のアミノ酸から始まる）。停止シグナルを表示する ヌクレオチドトリブレット（コドン）には、予測されるアミノ酸配列中に３個の 星印が割り当てられていて、コドンＴＡＧにサプレフシング宿主において効果的 なターミネータ−でないことが理解される；そのためタンパクは次のＴＡＡコド ンまで延長される。これに対して、サプレッサーを含有しない宿主においては、 タンパクはＴＡＧコドンにおいて停止するであろう。その菌株中でタンパクが発 現される特定のサプレッサー菌株は、上記３個の星印によって示されたアンバー 停止コドンにどのアミノ酸が取り込まれるかを決定するであろう。

１−位のＡｌａＯ前のヌクレオチド配列の部分は人工物であるか又はさもなけれ ば天然のｍＲＮＡによってコードされる予測されるシグナル配列と無関係である ことが確認された。

鍋 緘 魅 喧　。

＝ そ ト −末端配列 Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｃ１ｙ　Ａ！Ｐ　＾１ｉＳｃｒ　−−八１ａ　Ｔｒｐ厭 ■ °（ 区 ！ ’／　へ 口　°（ 井　／′Ｘ も　Ｉ Ｎｃｚ　ｗ　込 −ｅ　７馳／−一一一＝−１８１８、 ＝　１ 匂　怜 １鍋　ａｔ 一〇１ も フ欅　（０≦ Ｖ−膝 手続補正書（方式） 平成１年１月−日 １、事件の表示 ｐＣＴ／ＥＰ８７１００５０７ ２　発明の名称 有機化合物の又はそれに関連する改良 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　サンド　アクチェンゲゲルシャフト４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号５、補正命令の日付 ６、補正の対象 図面翻訳文（第１図〜１０図） ７、補正の内容 図面の浄書（内容に変更なし） ８、添付書類の目録 浄書図面（第１図〜１０図）　１通 国際調査報告 ｍｍａｔｎ−＾−１，ｌｌ１１４Ｍ　ｋ＋、？Ｃ？／五Ｐ　８７１００５０７国 際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．リリグナーゼタンパクをコードする単離された組換えＤＮＡ配列又は合成Ｄ ＮＡ配列。 ２．次のアミノ酸配列を含んでなるリリグナーゼタンパクをコードするＤＮＡ： 【配列があります】３．次のアミノ酸配列を含んでなるリリグナーゼタンパクを コードするＤＮＡ： 【配列があります】 ４．ＡｌａをコードするＮ−末端コドンがＭｅｔをコードするＡＴＣに先行され る請求の範囲第２項又は第３項記載のＤＮＡ配列。 ５．天然起源のゲノムＤＮＡ配列である前記請求の範囲のいずれかの１項に記載 のＤＮＡ配列。 ６．ストリンジェントハイブリダイゼーション条件下で請求の範囲第２、第３項 及び第４項において定義されるＤＮＡに対してハイプリダイズする配列をコード するＤＮＡ。 ７．その５′端がシグナル配列に使用可能に連結されている前記請求の範囲のい ずれかの１項に記載のＤＮＡ配列。 ８．原核及び／又は真核宿主における発現のための調節配列に作用可能に連結さ れている前記請求の範囲のいずれかの１項に記載のＤＮＡ配列。 ９．請求の範囲第１項から第８項のいずれかの１項において定義されるＤＮＡ配 列を含有し、そしてそれを発現させることができる転移ベクター。 １０．ｐＢＳＲ３，ｐＬｎ１０４，ｐＬｎ１０５，ｐＬｎ１０６及びｐＬｎ１０ ０１から選ばれるプラスミド。 １１．請求の範囲第１項から第８項のいずれかの１項において定義されたＤＮＡ 配列で形質転換された組換え宿主細胞。 １２．請求の範囲第１１項の形質転換細胞を培養することを含んでなるリリグナ ーゼタンパクの製造方法。 １３．請求の範囲第１２項の方法によって得られる組換えリリグナーゼタンパク 。 １４．次のアミノ酸配列を含んでなる非−グリコシル化リリグナーゼタンパク： 【配列があります】 １５．次のアミノ酸配列を含んでなる非−グリコシル化リリグナーゼタンパク： 【配列があります】 １６．Ｎ−末端のＡｌａにＭｅｔが先行するものであることを特徴とする請求の 範囲第１４項又は第１５項記載のリグナーゼタンパク。 １７．酸化還元系の存在下でアボタンパクとヘムとを反応せしめる工程を含んで なる活性ヘミニックプロテインを再構成するための方法。 １８．（ａ）アボタンパクの溶液を酸化還元系を含有する透析溶液に対して透析 すること、 （ｂ）（ａ）において得られるアボタンパク溶液にヘムを加えること を含んでなる請求の範囲第１７項記載の方法。 １９．（ａ）の透析溶液が５から３０％（ｖ／ｖ）のグリセリンを含有する、請 求の範囲第１８項記載の方法。 ２０．（ａ）アボタンパクの溶液にヘムを加える、（ｂ）（ａ）において得られ る溶液を酸化還元系を含有する透析溶液に対して透析する、こと を含んでなる請求の範囲第１７項記載の方法。 ２１．（ｂ）において得られる透析溶液を水溶液に対して透析することを含んで なる請求の範囲第１８項、第１９項又は第２０項に記載の方法。 ２２．酸化還元系がスルフヒドリル酸化還元系である、請求の範囲第１７項−第 ２１項のいずれかの１項に記載の方法。 ２３．透析溶液がｐＨ５から０における０．１から５ｍＭの還元型スルフヒドリ ルの醇化還元系及び１０から５００μＭの酸化型スルフヒドリルの酸化還元系を 含有する、請求の範囲第１８項から第２２項のいずれかの１項に記載の方法。 ２４．前記酸化還元系がグルタチオンである、請求の範囲第１７項から第２３項 のいずれかの１項に記載の方法。 ２５．ヘムをアボタンパクの溶液に１−倍から１０−倍モル過剰に加える、請求 の範囲第１７項から第２４項のいずれかの１項に記載の方法。 ２６．ヘムをアボタンパクの溶液に４−倍モル過剰に加える、請求の範囲第１７ 項から第２５項のいずれかの１項に記載の方法。 ２７．タンパクが還元型である、請求の範囲第１７項から第２６項のいずれかの １項に記載の方法。 ２８．タンパクがペルオキシダーゼタンパクである、請求の範囲第１７項から第 ２７項のいずれかの１項に記載の方法。 ２９．タンパクがリリグナーゼタンパクでありそしてヘムがプロトヘムＩＸであ ることを特徴とする請求の範囲第１７項から第２８項のいずれかの１項に記載の 方法。 ３０．タンパクが請求の範囲第１３，１４，１５又は１６項に記載されるりリグ ナーゼタンパクである、請求の範囲第１７項から第２９項のいずれかの１項に記 載の方法。 ３１．請求の範囲第１７項から第３０項のいずれかの１項に記載の方法によって 得られる活性ヘミニックタンパク。 ３２．請求の範囲第１７項から第３０項のいずれかの１項に記載の方法によって 得られるリグニナーゼ酵素。