JPH08507695A

JPH08507695A - Ｅｇ ▲ｉｉｉ▼セルラーゼの精製及び分子クローニング

Info

Publication number: JPH08507695A
Application number: JP6521125A
Authority: JP
Inventors: ウォード，マイケル; エー．クラークソン，キャサリン; エー．レアナス，エドムンド; ディー．ローチ，ジェフリー; エル．ウェイス，ジェフリー
Original assignee: ジェネンカーインターナショナル，インコーポレイティド
Priority date: 1993-03-17
Filing date: 1994-03-11
Publication date: 1996-08-20
Also published as: EP0689598A1; WO1994021801A2; CA2158357A1; FI954330A; US5475101A; CA2158357C; US5753484A; FI954330A0; WO1994021801A3

Abstract

(57)【要約】本発明はトリコデルマ・ロンジブラシアトゥム（Trichoderma longibrachiatum）から単離した精製EG IIIセルラーゼ酵素並びにその分泌型（成熟）及び非分泌型（プレタンパク質）形態のアミノ酸配列に関する。本発明は更にEG IIIセルラーゼ酵素をエンコードするDNAフラグメント及び配列に関する。また、トリコデルマ種又は遺伝子的に改変されたトリコデルマ種の株から獲得した精製又は高濃度EG IIIセルラーゼのいづれかを単離するための方法を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 EG IIIセルラーゼの精製及び分子クローニング関連文献のクロスリファレンス本願は1992年４月３日に提出された米国出願第07／862,846号の一部係属出願であり、尚それは1991年５月30日に提出された米国出願第07／707,647号の一部係属出願であり、尚それは1991年３月13日に提出された米国出願第07／668,640 号の一部係属出願であり、尚それは1990年10月５日に提出され、現在放棄に至っている米国出願第07／593,919号の一部係属出願である。本願はまた1991年３月2 9日に提出された米国出願第07／678,865号の一部係属出願でもあり、それは1990 年10月５日に提出され、現在放棄に至っている米国特許出願第07／793,919号の一部係属出願である。この５つの出願の開示内容はその内容全体を引用することで本明細書に組入れる。発明の背景１．発明の分野本発明はトリコデルマ・ロンジブラシアトゥム（Trichoderma longibrachiatu m）から単離した精製EG IIIセルラーゼ酵素並びにその分泌型及び非分泌型形態の両者におけるアミノ酸配列に関する。本発明は更にEG IIIセルラーゼ酵素をエンコードするDNA配列に関する。本発明は更にトリコデルマ種又はトリコデルマ種の遺伝子的に改変された株から獲得された、精製浴の、且つ高濃度のEG IIIセルラーゼを単離する方法に関する。２．当業界の状況セルラーゼはセルロース（β−１，４−グルカン結合）を加水分解し、これによりグルコース、セロビオース、セロオリゴ糖等の形成をもたらしめる酵素として当業界において公知である。セルラーゼは菌類、細菌等において生産（発現）されるが、一定の菌類、特に菌類トリコデルマ属の種（特にトリコデルマ・ロンジブラシアトゥム）により生産されたセルラーゼが最も注目を浴び、その理由は結晶状のセルロースを分解することのできる完璧なセルラーゼ系が発酵手順を介して大量に容易に生産されるからである。上記に関係して、Woodら「Methods in Enzymology」、160，25、頁234以降（1 988）は、完璧な菌類セルラーゼ系は、エクソ−セロビオヒドロラーゼ（EC 3.2. 1.91）（「CBH」）、エンドグルカナーゼ（EC 3.2.1.4）（「EG」）及びβ−グルコシダーゼ（EC 3.2.1.21）（「BG」）と同定されているものを含むいく種かの酵素分類物を含んで成ることを開示している。CBH，EG及びBGの菌類セルラーゼ分類物は更に各分類に属している複数の成分を含むものへと広げることができる。CBH及びEGは様々な菌類源から単離されている。 CBH，EG及びBG成分を含んで成る完璧なセルラーゼ系は結晶性セルロースをグルコースに効率的に変換するのに必要とされる。単離成分は結晶性セルロースを加水分解するうえでは、たとえできたとしても効率的ではない。更に、セルラーゼ成分間で、特にそれらが異なる分類のものであるとき、相乗的関係が認められている。他方、単独で、又は組合せられて使用されるセルラーゼ及びその成分は、洗剤において柔軟剤として、且つ綿布帛等の感触をよくするために有用であることも当業界において知られている。しかしながら、洗剤においてトリコデルマ種、そして特にトリコデルマ・ロンジブラシアトゥム由来のEG Ｉ及びEG II成分を使用するのに問題がある。詳しくは、かかる成分は酸性pHにおいてその最大活性を有しており、一方、ほとんどの洗濯用洗剤は中性又はアルカリ性（ pH＞７〜約10）での使用のために配合されている。米国出願第07／668,640号において洗剤における１又は複数種の酸性エンドグルカナーゼの使用は、綿含有布帛の柔軟性、色調保持／回復、及び感触における向上を、アルカリ条件下での処理のときでさえも供するであろうことを開示しているが、米国出願第07／707,64 7号はトリコデルマ種のEG III成分が、トリコデルマ・ロンジブラシアトゥムのE G Ｉ及びEG II成分に比べて、洗剤において優れた、且つ予期し得ない利点を供する発見に関連している。洗濯洗剤におけるその使用に加えて、EG IIIセルラーゼは、1991年５月30日に提出された米国出願第07／707,647号（引用することで本明細書に組入れる）において開示されているような、色調の保持／回復、柔軟性及び感触の所望の向上を供するのに十分な活性がある中間的なpHでの適当な溶液における予備洗浄工程において使用できうる。 EG IIIセルラーゼの有色布帛のストーンウォッシング工程において更なる用途を有しており、それにおいては布帛上への着色剤の再付着は精製EG IIIを使用することにより下げることができうる。この工程は1992年９月３日に提出された米国出願第07／954,113号（引用することで本明細書に組入れる）に開示されている。更に、EG IIIセルラーゼの中性からアルカリ性の条件下での高い活性は綿含有布帛を処理するための繊維加工並びに緑蔵飼料及び堆肥加工において有利であろう。即ち、商業的用途のため、精製状態のEG IIIを単離する又はEGIIIに富むセルラーゼ生成物を分泌するトリコデルマ株を作り上げることへの関心が高まりつつある。この分野における他の者は、トリコデルマからの低分子量エンドグルカナーゼの精製を述べている（Shoemakerら（1981）Trends in the Biology of Ferm entations for Fuels and Chemicals（Hollaender，Rabson，Rogers，Pietro，Valentine and W olfe，Eds.），Plenum Publishing Corp.，New York；Hakanssonら（1978）Bioc him．Biophys．Acta 524：385-392；Beldmanら（1985）Eur.J Biochem．146：30 1-308；Ulker and Sprey（1990）FEMS Microbiol.Lett．69：215-220及びSprey and Ulker（1992）FEMS Microbiol.Lett．92：253-258）。しかしながら、あるとしても、どれが本明細書に記載のEG IIIと同一のタンパク質を示すかを決定することはできない。例えば、Ulker and Sprey（1990）により単離されたタンパク質はそのアミノ末端においてアルギニンを有することが決定された。しかしながら、本明細書において報告する遺伝子をエンコードするEG IIIのDNA配列は、E G IIIがそのアミノ末端においてグルタミン残基を有していることを示唆する。 EG IIIの様々な用途に関し、本発明は菌類セルラーゼ組成物から精製した、EG III、即ちそのアミノ酸配列及びEG IIIをエンコードするDNA配列の完全なる特性化に関する。本明細書に記載のEG IIIセルラーゼの完全なる特性化は、遺伝子操作及び／又は大スケールタンパク質精製手順を介する価格的に有効な商業的EG IIIセルラーゼ生成物を供するであろう。発明の概要トリコデルマ種由来の単独エンドグルカナーゼ成分、いわゆるEG IIIはここで均質となるまで精製され、そしてその完全なアミノ酸配列及びこのセルラーゼをエンコードするDNA配列が決定された。従って、本発明の一態様はSEQ ID NO：11に示すようなEG IIIセルラーゼをエンコードするDNAフラグメント又はその改変体であって、約22〜27キロダルトンの分子量及びエンドグルカナーゼ活性を特徴とするものに関する。約5.5〜6.0の最適pH域がトリコデルマ・ロンジブラシアトゥムにおけるEG IIIの成熟及び分泌型について決定された。別の態様において、本発明はSEQ ID NO：９及びSEQ ID NO：10においてそれぞれ示すようなEG IIIセルラーゼ酵素の前駆体（プレタンパク質）及び成熟（分泌）型、又はその誘導体であって約22〜27キロダルトンの分子量及びエンドグルカナーゼ活性を有する〔AS？〕分泌型EG IIIタンパク質を供するものに関する。本発明はまた、商業的に入手できうる水性セルラーゼタンパク質混合物又は野生型トリコデルマ種株由来の完全セルラーゼ組成物からの精製EG IIIセルラーゼ酵素の製造方法に関する。別の態様において、本発明の遺伝子的に改変したトリコデルマ種の株を利用することにより精製された又は高濃度のEG IIIを単離する方法に関連し、ここでは少なくとも１種以上のエクソ−セロビオヒドロラーゼ成分、CBH Ｉ及びCBH II、並びにエンドグルカナーゼ成分、EG Ｉ及びEG IIが、EG IIIの製造のために不活性化されている。より詳しくは、このトリコデルマ種の株は、CBH Ｉ，CBH II， EG Ｉ及びEG IIの全てが不活性化されているように遺伝子的に改変されている。上記のトリコデルマ種の遺伝子的に改変した株から製造したタンパク質混合物中に存在している高濃度のEG IIIは、その混合物を濾過と限外濾過段階との組合せに委ねた後に獲得できうる。他方、上記の改変株から製造されたタンパク質混合物の中に存在しているEG IIIは、ポリエチレングリコールとカラムクロマトグラフィー工程との組合せを利用して均質となるまで更に精製することができうる。本発明の更なる態様は、上記の遺伝子的に改変したトリコデルマ種の株であって更にEG IIIを過剰発現するものに由来する精製された又は高濃度EG IIIセルラーゼ酵素を製造するための方法に関する。過剰発現式遺伝子改変株から製造された高濃度EG III又は精製EG IIIは、この株から製造されたタンパク質混合物を上記の濃縮及び／又は精製手順にかけた後に製造される。図面の簡単な説明図１は、トリコデルマ・ロンジブラシアトゥムEG IIIから獲得したペプチドのアミノ酸配列とアーウィニア・キャロトバラvarキャロトバラ（Erwinia carotov ara var carotovara）（E.carot EG）アスペルギルス・アキュレアトゥス（Aspe rgillus aculeatus）（A.aculeatus EG）由来の成熟形態エンドグルカナーゼの配列との整合を示す。図２はEG IIIエンコード遺伝子を含むトリコデルマ・ロンジブラシアトゥムゲノムDNAのクローンした重複HindIII及びAsp 718フラグメントの制限地図である。転写の方向はEG IIIコード領域の上の矢印により示している。図３はトリコデルマ・ロンジブラシアトゥムEG IIIエンコード遺伝子のゲノム DNA配列を示す。EG IIIの推定アミノ酸配列はDNA配列の下に示している。矢印は 16個のアミノ酸シグナル配列の最後の残基と成熟タンパク質の最初の残基との間の推定シグナルペプチダーゼ解裂部位を示している。２つのイントロンを下方の枠文字において示している。糸状菌イントロンのスプライシングにかかわると考えられる共通配列に対合する配列に下線を付した（Gurrら（1987）Gene Structu re in Enkaryotic Microbes（Kinghorn編），IRL Press，Oxford，UK）。発明の詳細な説明本発明はトリコデルマから獲得した精製EG IIIセルラーゼタンパク質及びこのタンパク質をエンコードするDNA配列に関する。別の観点において、本発明はトリコデルマ種又は遺伝子的に改変したトリコデルマ種の株から獲得した精製又は高濃度EG IIIセルラーゼを単離する方法に関する。本明細書において、一定の用語を、請求の範囲の発明の内容を明らかにするために開示及び定義しておく。「EG IIIセルラーゼ」なる語は、トリコデルマ種由来のエンドグルカナーゼ成分を意味し、約5.5〜6.0の最適pH、約7.2〜8.0の等電点（pI）及び約22〜27キロダルトンの分子量を特定とする。トリコデルマ・ロンジブラシアトゥム由来のEG IIIセルラーゼは、約5.5〜6.0の最適pH、約7.4の推定等電点（pI）及びポリアクリルアミドゲル電気泳動により判定された約22〜27キロダルトンの見かけ上の分子量を有する。トリコデルマ・ビリデ由来のEG IIIセルラーゼは約5.5の最適p H、約7.7の等電点（pI）及び約23.5キロダルトンの分子量を有する。精製EG IIIの最適pHはレマゾール・ブリリアント・ブルー・カルボキシメチルセルロース（RBB-CMC）アッセイでその最高の活性を測定することにより決定する。各精製段階後に回収されたEG III（以下に実施例に記載）をRBB-CMCアッセイを利用するEG活性により決定する。EG III活性は以下の手順を利用して40℃で計算する。５〜10μｌの回収EG IIIを、最終溶液中での必須量の酵素を供するのに十分な濃度で加える。２重量％のRBB-CMC（Megazyme，６ Altona Place，North Rocks ，N.S.W．2151オーストラリアより市販）を、0.5pH毎の4.0〜8.0に範囲しうるpH の0.05Ｍのクエン酸／リン酸バッファーに加える。その溶液をボルテックスに付し、そして40℃で30分インキュベートし、次いで氷浴の中で５〜10分冷却する。1000μｌのメチルセロソルブ含有の0.3Ｍの酢酸ナトリウム及び0.02Ｍの酢酸亜塩を加え、遠心し、そしてその上清液をキュベットの中に注ぎ入れる。各キュベット中の溶液の光学密度（OD）を590nmで測定する。高いODレベルは高い酵素活性レベルに対応する。 EG IIIセルラーゼは適当な発酵条件下でEG IIIを生産する任意のトリコデルマ種の株から精製できうる。EG IIIの特定の起源は限定されないが、好適な起源はトリコデルマ・ロンジブラシアトゥム及びトリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）である。トリコデルマ・ロンジブラシアトゥム由来の特に好適なEG III 起源はGenec or International，Inc.，180 Kimball Way，South San Francisco ，CA 94080より市販のCytolase 123セルラーゼである。その高いpHを理由に、EG IIIは、トリコデルマ種により発現される高pIキシラナーゼ及びその他の高pI成分が一般に見い出される等電点電気泳動ゲル領域において見い出される。実際には、EG IIIとして同定されたバンドはEG Ｉ又はIIのいづれかの分解産物であると仮定されていた。しかしながら、EG Ｉ及びII欠失型セルラーゼ（米国出願第0 7／593,919及び07／668,640号の方法で調製）のゲル等電点電気泳動は、このバンドがEG Ｉ又はIIのいづれかの分解産物によらないことを示している（引用することで本明細書に組入れる米国出願第07／862,846号を参照のこと）。 EG IIは以前、一部の著者により学名「EG III」で呼ばれていたが、現在では「EG II」なる語を学名は利用している。いかなる状況においても、EG IIタンパク質はEG IIIタンパク質とは、以降に示す実施例２の表Ｉにより明らかな通り、その分子量、pI及び最適pHにおいて実質的に相違する。「セルラーゼタンパク質」とは、野生型菌類源又は遺伝子的に改変した微生物に由来するエクソ−セロビオヒドロラーゼ（CBH）タンパク質、エンドグルカナーゼ（EG）タンパク質及びβ−グルコシダーゼ（BG）タンパク質のいづれか又は全てを含むセルラーゼタンパク質を意味する。「エンドグルカナーゼ（EG）成分」とは、トリコデルマ種のEG成分、例えばトリコデルマ・ロンジブラシアトゥムのEG Ｉ，EG II及びEG III成分を意味する。「エクソ−セロビオヒドロラーゼ（CBH）成分」とは、トリコデルマ種のCBH成分、例えばトリコデルマ・ロンジブラシアトゥムのCBH Ｉ及びCBH II成分を意味する。トリコデルマ種由来の完璧なセルラーゼ系（「完全セルラーゼ」）から精製EG IIIセルラーゼを獲得するのに適当ないくつかの手順が米国出願第07／707,647 、07／678,865及び07／862,846号に以前述べられている。本明細書に記載の実施例は、完全セルラーゼを、ポリエチレングリコール8000を用いる抽出工程に続く種々の分画カラムを用いる反復分画による精製手順にかけることによる、EG III セルラーゼの均質に至るまでの完全精製を開示している。本質的に純粋なEG IIIセルラーゼは、本明細書に記載の精製手順を経て均質に至るまで精製することのできうる高濃度EG IIIセルラーゼを生産せしめるように遺伝子的に改変された微生物によって調製できうる。更に、非常に高濃度のEG IIIセルラーゼが遺伝子的に改変された微生物により調製されうる。次に細胞培養物を濾過して細胞を除去し、次いでEG IIIを濃縮するように限外濾過にかける。様々な塩類、糖類及び／又は保存剤の配合は商品をもたらしうる。他方、高濃度EG IIIセルラーゼは上記の遺伝子的に改変された微生物から、EG IIIを更に濃縮するために用いるポリエチレングリコール（PEG）8 000を使用する抽出工程によって調製できうる。次いでPEGを除き、そして濃縮EG IIIを塩類、糖類及び／又は保存剤と配合せしめてよい。例えば、精製EG III又は高濃度EG III成分のいづれかにとってのセルラーゼタンパク質混合物は、エクソ−セロビオヒドロラーゼCBH Ｉ及びCBH II並びにエンドグルカナーゼEG Ｉ及びEG IIをエンコードする遺伝子が除去されている遺伝子的に改変されたトリコデルマ種の株に由来しうる。別の実施例において、EG III タンパク質は、EG III遺伝子の複数のコピーが挿入されている株の中で過剰生産されうる。本件においては、EG IIIコード領域は別のプロモーター、例えばCBH Ｉ−エンコード遺伝子に由来するものに作動連結されていてよい。EG IIIエンコード遺伝子の複数のコピーは、他の分泌型酵素、例えばセルラーゼ又はキシラナーゼの一部又は全てをエンコードする遺伝子が不活性化されている株の中に挿入してよい。即ち、上記のEG IIIのいく種かの起源は、実施例に記載の方法により、公知の配列決定法を利用して、EG IIIタンパク質の一部又は全体のアミノ酸配列を決定するために利用することができうる。本発明は約22〜27kDの分子量、約7.2〜8.0のpI、及び約5.5〜6.0の最適pH域を有し、更には添付のSEQ ID NO：９（天然配列）及びSEQ ID NO：10（課題の分泌型配列）において示しているアミノ酸配列を有するものとして特定される精製EG IIIセルラーゼ酵素、又は上記と同じ生化学的特徴を示し、且つSEQ ID NO：10 と70％以上の配列同一性を有するその誘導体に関する。EG IIIの誘導体の類似の生化学的特徴には、約5.5〜約7.0に範囲する最適pHが含まれうる。「誘導体」なる語は、天然もしくは分泌型配列のＣ−及びＮ−末端のいづれかもしくは両者への１もしくは複数個のアミノ酸残基の付加、天然もしくは分泌型配列における１もしくは複数箇所での１もしくは複数個のアミノ酸残基の置換、天然もしくは分泌型配列のいづれかもしくは両末端での１もしくは複数個のアミノ酸残基の欠失、又は天然もしくは分泌型配列内における１もしくは複数箇所での１もしくは複数個のアミノ酸残基の欠失もしくは挿入により示される上記の配列の誘導体であってSEQ ID NO：10と少なくとも70％の配列同一性が保持されているものを意味する。「プレタンパク質又は天然配列」なる語は、分泌性シグナル配列の解裂及び細胞の外への成熟EG IIIの分泌前の前駆EG IIIのアミノ酸配列を意味する。即ち、プレタンパク質アミノ酸配列はＮ−末端において分泌シグナル配列を含む。「分泌型又は成熟配列」なる語は、分泌性シグナル配列のなくなったEG IIIのアミノ酸配列である。本発明はまた、上記の分泌型EG IIIセルラーゼ又はそのタンパク質の前駆体をエンコードするDNA配列を含んで成るトリコデルマ・ロンジブラシアトゥムのゲノムに由来するDNA配列に関連する。特に、本発明のDNA配列は添付の配列表におけるSEQ ID NO：１又はその改変体に関連する。DNA配列の適切な「改変」の例は、ヌクレオチドの置換、欠失又は挿入であって、上記の生化学的特徴を有するEG IIIの別の形態をもたらしめるものである。改変DNA配列の別の例は、当業界に公知の方法によるEG III mRNAの逆転写を介する相補性DNA（cDNA）の単離物であろう。以下の実施例３に記載の物質に至るまで精製されたEG IIIセルラーゼの一部のアミノ酸配列を、この情報をエンコードするのに重要な遺伝子をクローンするため、合成DNAプローブをデザインするのに使用した。EG IIIをエンコードする遺伝子の配列は公知の技術によって更に操作し、そして最終的に様々なトリコデルマ種の株もしくはその他の微生物に挿入して、商品化のための高生産性生物を獲得することができうる。例えば、1990年10月５日提出された米国出願第07／593, 919号、及び1991年３月13日に提出された米国出願第07／668,640号を参照のこと。これらは共に、改変微生物が１又は複数種のセルラーゼ遺伝子を発現することができなくなり、そして実際には別のセルラーゼを過剰生産するようにする、トリコデルマ・ロンジブラシアトゥムを遺伝子操作するための方法を開示している。1990年10月５日に提出された米国出願第07／593,919号及び1991年３月13日に提出された米国出願第07／668,649号の開示内容は引用することで本明細書に組入れる。トリコデルマ・ロンジブラシアトゥム内の特定の遺伝子は、遺伝子の一部もしくは全体の欠失、又は遺伝子への別のDNA配列の挿入により失活させることができる。例えば、メジャーをセルラーゼ（CBH Ｉ，CBH II，EG Ｉ又はEG II）をエンコードする遺伝子の一部又は全体が失活している株を作り上げることが可能である。その結果、これらの株から獲得した培養上清液はこれらのメジャーなセルラーゼ酵素を含まないであろう。換言すれば、本明細書に引用することで組入れる米国出願第07／862,846号において既に提唱されているように、これはEG III の精製を簡単にするであろう。トリコデルマ・ロンジブラシアトゥムによるEG IIIの過剰生産は、EG IIIをエンコードする遺伝子の複数のコピーをこの菌類のゲノムの中に挿入することにより達成できうる（引用することで本明細書に組入れる米国出願第07／954,113号に記載のEG Ｉについて既に例示されている）。EG IIIの生産性を最大とするため、EG IIIコード領域を、例えばCBH Ｉをエンコードする別の遺伝子から獲得した効率性の高いプロモーター領域に作動連結することが所望されうる。更に、メジャーなセルラーゼをエンコードする遺伝子が失活しているトリコデルマ・ロンジブラシアトゥムの株をEG IIIの過剰生産用宿主とて使用することが所望されうる。EG IIIの分泌は、自分自身の分泌シグナルを有する EG III天然プレタンパク質のコード領域を利用することにより達せられるであろう。しかしながら、成熟EG IIIの分泌は、別のシグナル配列を採用したとき、又はEG IIIが別の分泌型タンパク質に付加された融合タンパク質として生産されたときにも可能でありうる。例えば、CBH Ｉのシグナル配列は、EG IIIの効率的な分泌を可能にするため、成熟EG IIIについてのコード領域と融合させることができる。EG IIIのコード領域は、例えば、別のセルラーゼ（例えばCBH Ｉ）もしくはその一部、又は別の分泌型酵素（例えばプロテアーゼもしくはアミラーゼ）もしくはその一部についてのコード領域に融合させて、分泌型融合タンパク質が生産されるようにすることができる。更に、EG IIIをエンコードする遺伝子を別の微生物、例えば限定することなく、酵母種、例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピチア・パストリス（Pichia pastoris）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hanse nula polymorpha）、クルイベロマイセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、シャニオマイセス・オシデンタリス（Shanniomyces occidentalis）等において発現することが可能である。例えば、PCT出願公開番号WO 85／04672号を参照のこと。これらの択一物、即ち非トリコデルマ宿主における発現を得るため、EG IIIをコードするDNA配列（EG IIIをエンコードする遺伝子のイントロンを除いた直後）を、その特定の宿主由来の遺伝子から獲得したプロモーター及びターミネーター配列と機能的に組合せる。また、別の宿主に由来する分泌シグナル配列をエンコードするDNA配列をEG III分泌シグナル配列をエンコードするDNA配列と交換することができる。他の生物におけるEG IIIの生産及び分泌は、実質的に純粋な状態でEG IIIを得ることを可能にしうる。クローンしたEG IIIをエンコードするDNAは他の糸状菌類由来の類似の遺伝子をクローンするのにデザインされた実験において分子プローブとして使用できる。これにより、限定することなく、トリコデルマ、ヒュミコラ、アスペルギルス、ニューロスポラ（Neurospora）、アクレモニウム（Acremonium）（クリソスポリウム：Chrysosporium）、ペニシリウム（Penicillium）、ファネロシャーテ（ Phanaerochaete）又はトラメテス（Trametes）を含む生物からEG III様酵素をエンコードする遺伝子をクローンすることが可能でありうる。「EG III様」とは、本明細書においては、RBB-CMCアッセイに基づき約5.5〜7.0の最適pHを有し、且つID SEQ NO：10に示すアミノ酸配列と少なくとも50％の同一性を有することを特徴とする上記の属に由来する酵素と定義する。以下の実施例は本発明を説明するために提供し、本発明の範囲を限定するものではない。実施例実施例１はシトラーゼ123セルロース（トリコデルマ・ロンジブラシアトウムより獲得でき、且つGenecor International，Inc.，South San Francisco，CAより入手できる完璧な菌類セルラーゼ組成物）からの精製手順を介するEG IIIの単離を示す。EG IIIを含む完璧なセルラーゼ組成物は、Rapidase RL（商標）（Gis t-brocades，オランダより）の商標名で販売されているものを含むその他の起源からも入手できる。更に、完璧な菌類セルラーゼ組成物は、市販され、且つアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションに寄託されているトリコデルマ・ロンジブラシアトゥム株の発酵培養物において見い出せうる。 EG IIIの単離の効率性を高めるため、EG IIIを過剰生産するように、並びに／又はEG Ｉ，EG II，CBH Ｉ及び／もしくはCBH II成分のうちの１又は複数種を生産できないように遺伝子的に改変したトリコデルマ・ロンジブラシアトゥムを採用することが所望されうる。これは例えば以下に説明するPEG抽出によるEG III のより効率的な単離を必然的にもたらしめるであろう。トリコデルマ・ロンジブラシアトゥムのいくつかのこれらの株の製造は1991年３月13日提出の米国出願第 07／668,640号に開示されている。実施例１ EG IIIセルラーゼ酵素の大スケール抽出 100リットルの無細胞セルラーゼ濾液を約30℃に温めた。温めた材料を約４％w t／volのPEG8000（ポリエチレングリコール、約8000のMW）にし、次いで約10％w t／volの無水硫酸ナトリウムとした。その混合物は二相液体混合物を形成した。それらの相をSA−１ディスクスタック遠心機を用いて分離させた。それらの相を銀染色等電点電気泳動ゲルを用いて分析した。EG III及びキシラナーゼについての分画及び濃縮が得られた。回収組成物は約20〜50重量％のEG IIIを含んでいた。上記の手順に関し、約8000より実質的に低い分子量を有するポリエチレングリコールの利用は不適切な分離を供した；一方、約8000より実質的に高い分子量を有するポリエチレングリコールは回収組成物における所望の酵素の排除をもたらしめた。硫酸ナトリウムの量に関し、約10％wt／volより実質的に高い硫酸ナトリウムレベルは沈殿の問題を起こした；一方、約10％wt／volより実質的に低い硫酸ナトリウムのレベルは劣る分離をもたらすか、又はその溶液は単相のままであり続けた。 PEG抽出由来の高濃度EG III溶液を、オメガシリーズ接線方向フロー8,000限外濾過膜（Filtron Technology Corp.，Northborough，MA）を用いて10mM、pH 4.0 のクエン酸／リン酸バッファーに対して透析した。その溶液を平衡（pH 4.0、10 mMのクエン酸／リン酸）SPトリスアクリルカラムに載せた。EGIII成分を250mMの塩化ナトリウムで溶出させた。実施例２分画を介する均質に至るまでのEG IIIの精製アミノ酸配列分析を行うために均質に至るまでEG IIIを単離するため、実施例１に記載のEG III組成物をカラムクロマトグラフィーにかけた。更なる分画をMo no-S-HR ５／５カラム（Pharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，NJより入手可能）を用いるFPLC系で行った。このFPLC系は、液体クロマトグラフィーコントローラー、２台のポンプ、デュアル・パス・モニター、フラクションコレクター及びチャートレコーダー（全てPharmacia LKB Biotechnology，Piscataway，N Jより入手可能）より成る。分画は実施例１において調製したEG IIIサンプル５m lを10mMのクエン酸ナトリウムpH４で予め平衡にしておいた20mlのSephadex G-25 カラムにより脱塩することによって行った。この溶液を10mMのクエン酸ナトリウムpH 4.0で予め平衡にしておいたmono-S-HR ５／５カラムに載せ、そして０〜20 0mMの水性NaCl勾配により0.5ml／分の流速で溶離させ、１mlのフラクションでサンプルを集めた。EG IIIは２本のフラクションの中で回収され、そしてSDSゲル電気泳動により純度が90％以上であることが決定された。以上のようにして精製したEG IIIは以下の特徴を有し、トリコデルマ・ロンジブラシアトゥムから単離した他のエンドグルカナーゼと対比させた。上記の表からわかる通り、EG IIIはトリコデルマ・ロンジブラシアトゥムの他のエンドグルカナーゼ成分に比べて高めの最適pH及び高めのpIを有する。EG III はアルカリpH下で有意なRBB-CMC活性を保持することも示されいる（米国出願第0 7／862,846号に開示）。同様に、トリコデルマ種の他の株由来のEG IIIセルラーゼを上記と同様の方法で精製できる。例えば、トリコデルマ・ビリデ由来のEG IIIセルラーゼがVorage nら、Methods in Enzymology，160：243-249に記載されている。この文献には、 EG IIIセルラーゼが約23.5キロダルトンの分子量、5.5の最適pH及び7.7のpIを有すると記載している。実施例３ EG IIIのアミノ酸配列決定精製EG IIIをシアノゲンブロミド又はトリプシンのいづれかでの処理により以下の通りにして解裂せしめて小さめのペプチドを生成せしめた。まず、EG IIIを、１mg／mlのEG III溶液100μｌに900μｌのアセトンを加えることによりに沈殿させた。−20℃で10分インキュベート後、沈殿したEG IIIを遠心により集め、そしてそのペレットを乾かした。シアノゲンブロミド処理のため、EG IIIペレットを88％のギ酸中の６Ｍの尿素100μｌに溶かした； 200mg／mlのシアノゲンブロミド溶液10μｌを加え、そしてその混合物を25℃で４時間インキュベートした。トリプシン処理のため、EG IIIペレットを50μｌのトリス（pH 8.0）、２Ｍの尿素、0.5％のトリフルオロ酢酸（TFA）に溶かした。５μｇのトリプシンを加え、そしてその混合物を37℃で４時間インキュベートした。得られるペプチドを個別に高圧液体クロマトグラフィー（HPLC）により、以下の通りにして精製した。Synchropak RP-4カラムを0.5％のトリエチルアミン（TE A）及び0.5％のトリフルオロ酢酸を含む脱イオン水で平衡にした。そのサンプルを載せ、次いで99％のアセトニトリル、0.5％のTEA、0.5％のTFAの１％／分の勾配で溶離させた。これらのペプチドのアミノ末端領域のアミノ酸配列を全自動装置を用いるEdma n法により決定した（Edman，P．and Begg.G.（1967）Eur.J.Biochem．１：80-91 ）。得られた配列を以下に示す。シアノゲンブロミドはメチオニン残基の後ろでタンパク質を解裂することが知られているため、以下に示すペプチド１及びペプチド２は共に、完全タンパク質におけるメチオニンの前にあると予測されるであろう。ペプチド１（ID SEQ NO：１）シアノゲンブロミド解裂により獲得：ペプチド２（ID SEQ NO：２）シアノゲンブロミド解裂により獲得：ペプチド３（ID SEQ NO：３）トリプシン解裂により獲得：ぺプチド４（ID SEQ NO：４）トリプシン解裂により獲得：ペプチド５（ID SEQ NO：５）トリプシン解裂により獲得：上記のペプチド配列をアスペルギルス・アキュレアトゥス（Ooiら（1990）Cur r.Genet．18：217-222; Ooiら（1990）Nucl.Acids Res．18：5884）及びアーウィニア・キャロトバラ・subsp.キャロトバラ（Saarilahtら、Gene 90：9-14）由来のエンドグルカナーゼの既知のアミノ酸配列と対比させ、そして類似性が認められた（図１）。実施例４ EG IIIをエンコードする遺伝子のクローニングオリゴヌクレオチドの３種の縮重プールを以下に示す配列に従って合成した。これらのプールのうちの１つ（１）は、５′末端にEcoRＩ制限部位を含め、且つアスパラギン酸コドンの最初の２個のヌクレオチドのみを用いてアミノ酸配列AN VAYDをエンコードすることのできる可能な全てのDNA配列を含むようにデザインしてある。他の２つのプールは、５′末端にPstＩ制限部位を有し、かつ末端ロイシンコドンの最初の２個のヌクレオチドのみを用いてアミノ酸配列ELMIWLをエンコードすることのできる可能な全てのDNA配列の逆相補をそれらの間で含むようにデザインしてある。プール１（256通りの27mer）（ID SEQ NO：６）プール２（48通りの25mer）（ID SEQ NO：７）プール３（24通りの25mer）（ID SEQ NO：８）これらのプライマーは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）手順を利用する約100bp .のＴ．ロンジブラシアトゥムDNAフラグメントを増幅するため、対で（１と２ａ、又は１と２ｂのいづれか）利用できうる。相補性DNA（cDNA）を、唯一の炭素源としての結晶性セルロースを伴う増殖によりセルラーゼ生産について誘発せしめたＴ．ロンジブラシアトゥムの培養物から抽出したポリ（A）RNAから市販のキット（Invitrogen Corp．San Diego，CA）を用いて調製した。PCRを鋳型としてこのDNAを用い、且つプライマーとして上記のオリゴヌクレオチドを用いて行った。最良のオリゴヌクレオチドの組合せは、プール２ａと組合せたプール１のようであり、プライマーとしてこれらを用いる 100bpのDNAフラグメントの最大富化が増殖された。この100bpのDNAフラグメントをゲル精製し、EcoRＩ及びPstＩで消化し、そしてEcoRＩ及びPstＩで切っておいたM13mp19 DNAとリゲートさせた。Ｅ．コリ（E.coli）へのトランスフェクションを経て、DNA配列分析のため、個々のM13プラークから一本鎖DNAを単離した。1 00bpのDNAフラグメントを含むクローンを同定し、その配列はEG IIIタンパク質の予測部をエンコードすることが示唆された。全DNAをＴ．ロンジブラシアトゥム株RL-P37から抽出し、そして様々な制限酵素で消化した。その消化DNAをアガロースゲル電気泳動にかけ、ナイロン膜に転写し、そして100bpのPCRフラグメントを含むＭ13クローン由来の放射性ラベルDN Aとハイブリダイズさせた。このサザン分析から、EG IIIをコードする領域がゲノムDNAの３kbのAsp 718フラグメント上にあることが決定された。遺伝子ライブラリーを、Asp 718消化RL-P37ゲノムDNAをサイズ分画（約３kb）し、そしてこれをAsp 71 8消化pUC219とリゲートすることにより構築した。プラスミドpUC219はpUC119（W ilsonら（1989）Gene 77：69-78）から、その多重クローニング部位がBglII，Cl aＩ及びXhoＩのための制限部位を含むように拡張せしめることにより、誘導されたものである。Ｅ．コリ細胞へのリゲートDNAの形質転換及びアンピシリン耐性についての選別を経て、得られるコロニーをプローブとして100bpのPCRフラグメントを用いるコロニーハイブリダイゼーションによってスクリーンした。DNAを陽性クローンから単離し、そして制限地図を作製した（図２参照のこと）。EG IIIの100bpのP CRフラグメントはEG IIIをエンコードする遺伝子を含むクローン化３kbのAsp 71 8フラグメントの一端の非常に近くでハイブリダイズすることが認められた。その結果、EG IIIについての全遺伝子を獲得するため、RL-P37ゲノムDNAの重複Hin dIIIフラグメントをクローンする必要がある。 EG IIIをコードする領域のDNA配列及び一部のフランキングDNAを決定し、そして図３に示す。このDNA配列とOoiらにより開示されたＡ．アキュレアトゥスエンドグルカナーゼ遺伝子のそれとの同一性に基づき、出願人はコード領域の開始及び終わりを区別でき、且つそのコード領域に介在している２つのイントロンを同定できた。これらのイントロンはその５′及び３′末端、並びに内部の６bpの配列において、菌類のイントロンをスプライスするのに重要であると考えられている共通配列と一致する配列を含む。出願人は、EG IIIが最初にそのアミノ末端において16個のアミノ酸分泌シグナル配列を有するプレタンパク質として合成されると推定する。もし本当なら、シグナル配列の最後の３個のアミノ酸はAla Leu Alaであり、これはタンパク質分泌の際にシグナル配列を除去するのを担うシグナルペプチダーゼにとっての共通解裂部位と一致する。Perlman，D．and Halvorson，H.O.（1983）J.M ol.Biol．167：391-409を参照のこと。シグナル配列を除去するためのシグナルペプチダーゼによる解裂は、アミノ末端残基がGlnである219個のアミノ酸のタンパク質をもたらすであろう。一方、Ulker and Sprey（（1990）FEMS Microbiol. Lett．69：215-220）により精製された低分子量エンドグルカナーゼはアミノ末端残基としてArgを、そして約235個のアミノ酸を有するものと考えられる。Hank anssonらにより精製されたエンドグルカナーゼは197個のアミノ酸残基を含むものと判定された。以上の発明は理解のし易さのために若干詳しく説明してきたが、様々な変更が本発明の範囲を逸脱することなくなされうることが理解されるであろう。配列表（１）一般情報：（ｉ）出願人：Ward，Michael Clarkson，Kathleen A． Weiss，Geoffrey L． Larenas，Edmund Lorch，Jeffrey D．（ii）発明の名称：Purification and Molecular Cloning of EG III Cellulase （iii）配列の数：11 （iv）連絡先：（Ａ）あて先：Genencor International （Ｂ）通り：180 Kimball Way （Ｃ）市：South San Francisco （Ｄ）州：CA （Ｅ）国：USA （Ｆ）郵便番号：94080 （ｖ）コンピューター読取フォーム：（Ａ）媒体タイプ：Floppy disk （Ｂ）コンピューター：IMB PC compatible （Ｃ）作動システム：PC-DOS／MS-DOS （Ｄ）ソフトウェアー：PatentIn Release♯1.0，Version♯1.25 （vi）現出願人のデーター：（Ａ）出願番号：（Ｂ）出願日：（Ｃ）分類：（viii）代理人／代理店情報：（Ａ）名称：Krupen，Karen （Ｂ）登録番号：34,647 （ix）通信情報：（Ａ）電話：415742-7218 （Ｂ）テレファックス：415 742-7217 （２）SEQ ID NO:1についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：28アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：ペプチド（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：１：（２）SEQ ID NO:２についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：26アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：ペプチド（xi）配列の詳細：SEQ ID NO:２：（２）SEQ ID NO:３についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：14アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：ペプチド（xi）配列の詳細：SEQ ID NO:３：（２）SEQ ID NO:４についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：７アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：ペプチド（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：４：（２）SEQ ID NO：５についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：９アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：ペプチド（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：５：（２）SEQ ID NO：６についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：27塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：６：（２）SEQ ID NO:７についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：25塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）（xi）配列の詳細：SEQ ID NO:７：（２）SEQ ID NO：８についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：25塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）（xi）配列の詳細：SEQ ID NO:８：（２）SEQ ID NO:９についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：234アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：タンパク質（xi）配列の詳細：SEQ ID NO:９：（２）SEQ ID NO：10についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：218アミノ酸（Ｂ）タイプ：アミノ酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：タンパク質（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：10：（２）SEQ ID NO：11についての情報：（ｉ）配列の特徴：（Ａ）長さ：1050塩基対（Ｂ）タイプ：核酸（Ｃ）鎖の数：一本鎖（Ｄ）トポロジー：直鎖（ii）分子のタイプ：DNA（ゲノム）（xi）配列の詳細：SEQ ID NO：11：

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｒ 1:885） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:885）Ｃ１２Ｒ 1:885） (72)発明者クラークソン，キャサリンエー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94110, サンフランシスコ，トゥエンティーエイスストリート 53 (72)発明者レアナス，エドムンドエー. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94070, サンカルロス，カプリノウェイ 352 (72)発明者ローチ，ジェフリーディー. アメリカ合衆国，ウィスコンシン 54016, ハドソン，＃202，サーティーンスストリートサウス 527 (72)発明者ウェイス，ジェフリーエル. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94117, サンフランシスコ，＃６，グラッタンストリート 275

Claims

【特許請求の範囲】１．ID SEQ NO：11に示すDNA配列を含んで成るEG III酵素をエンコードするDN A配列又はその改変体。２．ID SEQ NO：９に示すアミノ酸配列又はその誘導体を有するEG III酵素。３．エンドグルカナーゼ活性を示し、ID SEQ NO：10に示すアミノ酸配列を有するEG III酵素、又はRBB-CMCアッセイによる決定に従いエンドグルカナーゼ活性を示すその誘導体。４．ID SEQ NO：10の配列と50％以上の相同性を有するアミノ酸配列を有し、且つRBB-CMCアッセイによる決定に従いエンドグルカナーゼ活性を示し、そして約5.5〜7.0の最適pHを有するEG III様酵素。５．ID SEQ NO：10を示すアミノ酸配列又はその誘導体及び追加のシグナル配列を有する、エンドグルカナーゼ活性を示すEG III酵素。６．ID SEQ NO：10に示すアミノ酸配列又はその誘導体及びその配列に融合された分泌性タンパク質又はその一部を有する融合タンパク質。７．ID SEQ NO：10に示す配列を有する精製EG IIIセルラーゼを単離するための方法であって：ａ）EG IIIを除く実質的に全てのセルラーゼタンパク質がEG IIIのほとんどない水性相に保持され、そしてEG IIIセルラーゼ成分がEG IIIに富むポリエチレングリコール相に保持される条件下で、有効な量のポリエチレングリコールをセルラーゼタンパク質の水性混合物に加える；ｂ）このポリエチレングリコールをEＧ IIIに富むポリエチレングリコール相から除去する；そしてｃ）濾過したEG IIIをカラムクロマトグラフィーにかけて精製EG IIIを得る；段階を含んで成る方法。８．前記水性混合物が無細胞セルラーゼ混合物である、請求項６記載の方法。９．前記水性混合物を、エクソ−セロビオヒドロラーゼ又はエンドグルカナーゼ遺伝子のうちの少なくとも１又は数種が失活しているように遺伝子的に改変されたトリコデルマ種の株の発酵培養から獲得する、請求項６記載の方法。 10．前記水性混合物を、CBH Ｉ，CBH II，EG Ｉ及びEG IIが失活しているように遺伝子的に改変されたトリコデルマ種の株の発酵培養物から獲得する、請求項６記載の方法。 11．前記トリコデルマ種の株がゲノムの中に挿入された追加のEG III遺伝子を有する、請求項10記載の方法。 12．ポリエチレングリコールの添加前に無機塩を前記水性混合物に添加する、請求項７記載の方法。 13．ID SEQ NO：10に示す配列又はその誘導体を有する高濃度EG IIIセルラーゼを獲得するための方法であって：ａ）CBH Ｉ，CBH II、EG Ｉ及びEG IIのうちの少なくとも１種をエンコードする遺伝子が失活している遺伝子的に改変されたトリコデルマ種の株に由来する発酵培養物を用意する；ｂ）前記発酵培養物を濾過する；そしてｃ）段階ｂを経た発酵培養物を限外濾過する；段階を含んで成る方法。 14．ID SEQ NO：10に示す配列又はその誘導体を有する高濃度EG IIIセルラーゼを獲得するための方法であって：ａ）CBH Ｉ，CBH II、EG Ｉ及びEG IIをエンコードする遺伝子が失活している遺伝子的に改変されたトリコデルマ種の株に由来する発酵培養物を用意する；ｂ）前記発酵培養物を濾過する；そしてｃ）段階ｂを経た発酵培養物を限外濾過する；段階を含んで成る方法。 15．前記遺伝子的に改変されたトリコデルマ種の株がEG IIIを過剰発現するように更に改変されている、請求項13又は14記載の方法。 16．ID SEQ NO：10に示す配列又はその誘導体を有する高濃度EG IIIセルラーゼを獲得するための方法であって：ａ）CBH Ｉ，CBH II、EG Ｉ及びEG IIのうちの少なくとも１種又は複数種をエンコードする遺伝子が失活している遺伝子的に改変されたトリコデルマ種の株由来の発酵培養物を用意する；ｂ）EG IIIを除く実質的に全てのセルラーゼタンパク質がEG IIIのほとんどない水性相に保持され、そしてEG IIIセルラーゼ成分がEG IIIに富むポリエチレングリコール相に保持される条件下で、有効な量のポリエチレングリコールをセルラーゼタンパク質の水性混合物に加える；ｃ）このポリエチレングリコールをEG IIIに富むポリエチレングリコール相から除去する；段階を含んで成る方法。 17．ID SEQ NO：10に示す配列又はその誘導体を有する高濃度EG IIIセルラーゼを獲得するための方法であって：ａ）CBH Ｉ，CBH II、EG Ｉ及びEG IIをエンコードする遺伝子が失活している遺伝子的に改変されたトリコデルマ種の株由来の発酵培養物を用意する；ｂ）EG IIIを除く実質的に全てのセルラーゼタンパク質がEG IIIのほとんどない水性相に保持され、そしてEG IIIセルラーゼ成分がEG IIIに富むポリエチレングリコール相に保持される条件下で、有効な量のポリエチレングリコールをセルラーゼタンパク質の水性混合物に加える；ｃ）このポリエチレングリコールをEG IIIに富むポリエチレングリコール相から除去する；段階を含んで成る方法。 18．前記遺伝子的に改変されたトリコデルマ種の株がEG IIIを過剰発現するように更に改変されている、請求項16又は17記載の方法。 19．ポリエチレングリコールの添加前に前記水性混合物に無機塩を加える、請求項16又は17記載の方法。