JP3089245B2 - エンドグルカナーゼをコードする遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明はグルカナーゼをコード
する遺伝子、該遺伝子を含んで成る発現ベクター、及び
該発現ベクターにより形質転換された宿主に関する。

【０００２】

【従来の技術】セルロースはグルコースがβ−１，４−
グリコシド結合でつながった高分子多糖で、地球上で最
も豊富な再生可能な資源であり、木材料および草材料の
主要な構成成分である。使用済み紙製品、及び農産物の
副産物に大量に含まれるセルロースを加水分解すればグ
ルコースが得られる。しかし、セルロースは難分解性の
物質であり、セルロース系バイオマスの有効利用は実用
にまでは至っていない。このセルロースを効率よく加水
分解する酵素がセルラーゼである。セルラーゼの生化学
的解析および本酵素を効率よく生産することはセルロー
ス系バイオマスの有効利用に必要不可欠である。

【０００３】セルラーゼはエンドグルカナーゼ、セロビ
オヒドロラーゼ、β−グルコシダーゼの３種の酵素系に
大別され、これら酵素がセルロースに対し相乗的に作用
してセルロースを効率よく分解するとされている。この
うちエンドグルカナーゼは広い基質特異性を有し、セル
ロース鎖中の内部グリコシド結合を加水分解する。

【０００４】セルラーゼは、多岐にわたる微生物によっ
て生産されており、それぞれのセルラーゼの至適温度、
至適ｐＨ、基質特異性、生成物のかたよりなどの特性の
差から、その利用目的に応じて産業用酵素剤として洗
剤、飼料添加剤、消化剤などの製品の主要成分として用
いられている。しかし、目的によっては微生物から得ら
れる酵素成分の組成や特性が必ずしも適切でない場合も
あり、セルラーゼの特性解明は実用面でも期待されてい
る。

【０００５】これらセルラーゼ成分のそれぞれの遺伝子
を単離し、遺伝子工学的に利用することも検討されてい
る。遺伝子工学の手法を用いることにより、精製度の高
い酵素が取得可能となり、しかも酵素の特性解明や遺伝
子改変による特性改良が可能になると考えられる。

【発明の目的】

【０００６】今回本発明者らは、コルティシウム・ロル
フシイ（Corticium rolfsii）からエンドグルカナーゼ
のｃＤＮＡを単離し、その遺伝子から発現されるエンド
グルカナーゼを確認した。この発明は本菌類に由来する
上記ポリペプチドをコードするセルラーゼ酵素遺伝子配
列を提供する。更に、本発明の目的は上記セルラーゼ酵
素遺伝子配列を含む組換えプラスミドを提供することに
ある。また、本発明の目的は上記遺伝子配列を含み発現
コントロール配列に発現可能な状態で連結された組換え
プラスミドにより形質転換された麹菌のごとき組換え微
生物を提供することにある。

【発明の具体的説明】

【０００７】本発明によって提供される遺伝子にコード
されるタンパク質は、配列表１に記載される配列の１部
又は全部を有するものである。また、前記タンパク質の
誘導体としては、例えばアミノ酸の付加、挿入、削除、
欠失または置換などの改変が生じた配列表１に記載され
るアミノ酸配列を有するタンパク質であって、しかもセ
ルラーゼ活性を依然として保持するものが挙げられる。

【０００８】本発明によって提供される遺伝子にコード
されるタンパク質は、配列表１に記載されるアミノ酸配
列の１〜３７３番までの配列からなるものであるが、ま
た、この配列のＮ末端に更に配列表１の−１７〜−１番
までのアミノ酸配列を有するタンパク質も本発明に包含
される。

【０００９】これらの遺伝子にコードされるタンパク質
はＣ．ロルフシイに由来するものであり、この配列表１
の１〜３７３番までの配列を有するタンパク質は成熟タ
ンパク質であり、−１７〜−１番の配列はシグナルペプ
チドと考えられる。この３７３アミノ酸に基づく分泌さ
れたタンパク質は約４０，０００ドルトンの分子量を有
する。天然タンパク質は、宿主により生産された場合、
ある程度のグリコシル化を含むことが知られている。

【００１０】本発明によって提供されるＤＮＡ配列は、
典型的には配列表２に記載される塩基配列の一部または
全部を有するものである。

【００１１】配列表２に記載される塩基配列はＣ．ロル
フシイのエンドグルカナーゼｃＤＮＡを表したものであ
る。配列表２に記載される塩基配列は、２７残基目のＡ
ＴＧで始まり、塩基配列番号１１９９残基目までのＴＡ
Ａで終了するオープンリーディングフレーム（読みとり
枠）を有する。また、７８残基目〜１１９６残基目の塩
基配列は前記成熟タンパク質に対応する。

【００１２】タンパク質のアミノ酸配列が与えられれ
ば、それをコードするＤＮＡ配列は容易に定まり、配列
表１に記載されるアミノ酸配列の全部又は一部をコード
する種々の塩基配列を選択することができる。従って、
本発明による配列表１に記載されるアミノ酸配列の一部
又は全部をコードするＤＮＡ配列とは配列表２に記載さ
れる一部又は全部の塩基配列に加え、同一のアミノ酸を
コードする塩基配列であって縮重関係にあるコドンを塩
基配列として有する配列も意味するものとする。

【００１３】本発明によって提供されるエンドグルカナ
ーゼをコードする遺伝子の塩基配列は、コルティシウム
属（Ｃｏｒｔｉｃｉｕｍ）では初めて解明されたもの
で、独自性を有する。

【００１４】本発明によるＤＮＡは天然由来のものであ
っても全合成したものであっても良い。また、天然由来
のものの一部を利用して合成を行ったものであっても良
い。ＤＮＡの典型的な取得方法としてはＣ．ロルフシイ
由来の染色体ライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー
から遺伝子工学の分野で慣用されている方法、例えば部
分アミノ酸配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡ
プローブを用いてスクリーニングを行う方法、部分塩基
配列の情報を基にして作製した適当なＤＮＡプライマー
を用いてＰＣＲによりＤＮＡを増幅する方法などが挙げ
られる。

【００１５】本発明によるＤＮＡは以下のようにして決
定した。 （１）ｃＤＮＡライブラリーの作製 Ｃ．ロルフシイをセルラーゼを発現・誘導する培地にて
培養し、集菌して菌体を取得した。この菌体よりｍＲＮ
Ａを調製し、市販されているｃＤＮＡ合成キットを用い
て合成した後、市販発現ベクターに導入してｃＤＮＡラ
イブラリーを作製した。

【００１６】（２）抗エンドグルカナーゼ血清の調製 Ｃ．ロルフシイを同様のセルラーゼ誘導培地にて培養
し、カルボキシメチルセルロース分解活性を指標とし
て、培養上清を種々のカラムクロマトグラフィーを用い
てエンドグルカナーゼを粗精製した。次いで、このエン
ドグルカナーゼをＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動
し、クマシー・ブリリアント・ブルーを用いて染色し、
バンドをゲルごと破砕してアジュバントと共にウサギに
皮下注射した。常法により血清を分画し、ウサギ抗エン
ドグルカナーゼ血清とした。

【００１７】（３）セルラーゼ遺伝子のクローン化 上記（１）により得られたｃＤＮＡライブラリー（例え
ばファージＤＮＡライブラリー）を大腸菌に感染させ、
生じたプラークをＩＰＴＧを染み込ませたニトロセルロ
ースメンブレンへブロットした。上記（２）により得ら
れた抗血清と反応させ、抗ウサギＩｇＧを含む市販キッ
トを用いてウサギ抗エンドグルカナーゼ抗体と反応した
陽性プラークを選択した。

【００１８】（４）塩基配列の決定 上記のようにして選択されたクローン（計６個）につい
てＤＮＡを調製し、常法に従い（例えば、ＤＮＡシーケ
ンサーを用いて）塩基配列を決定した。その結果、４ク
ローンが５’側の位置は異なるものの、同一の塩基配列
を示した。

【００１９】発現ベクター及び形質転換された微生物 また、本発明によれば、前記の本発明によるＤＮＡ配列
を宿主微生物内で複製可能でかつそのＤＮＡ配列がコー
ドするタンパク質を発現可能な状態で含んでなる発現ベ
クターが提供される。又は、大腸菌内で複製可能で、適
当な宿主の染色体ＤＮＡ内に組み込まれ、その宿主微生
物内でそのＤＮＡ配列がコードするタンパク質を発現可
能な状態で含んでなる発現ベクターが提供される。更
に、本発明によれば、この発現ベクターによって形質転
換された微生物が提供される。この宿主−ベクター系は
特に限定されず、例えば、大腸菌、放線菌、枯草菌、酵
母、カビなどを用いた系、およびそれらを用いた他のタ
ンパク質との融合タンパク質発現系などを用いることが
できる。本発明によるベクター構築の手順及び方法は、
遺伝子工学の分野で慣用されているものを用いることが
できる。

【００２０】本発明による発現ベクターは、これを実際
に宿主微生物に導入して所望のタンパク質を発現させる
ためには、前記の本発明によるＤＮＡ配列の他に、その
発現を制御するＤＮＡ配列や微生物を選択するための遺
伝子マーカーを含んでいてもよい。また、この発現ベク
ターはセルラーゼをコードするＤＮＡ配列を反復した形
（タンデム）で含んでいてもよい。これらは常法に従い
発現ベクターに存在させてよく、このベクターによる微
生物の形質転換の方法も、この分野で慣用されているも
のを用いることができる。

【００２１】この形質転換体を適当な培地で培養し、そ
の培養物から上記した本発明によるタンパク質を単離し
て得ることができる。従って、本発明の別の態様によれ
ば、前記の本発明による新規タンパク質の製造法が提供
される。形質転換体の培養及びその条件は、使用する微
生物についてのそれと本質的に同様であってよい。ま
た、培養液からの本発明による新規タンパク質の回収、
精製も常法に従って行うことができる。

【００２２】

【実施例】（１）ｃＤＮＡライブラリーの作製 Ｃ．ロルフシイを下記の組成のセルラーゼ誘導（ＣＩ）
培地中で３０℃、２日間培養した。ＣＩ培地の組成：ア
ビセル（０．４％）、ポリペプトン（１．０％）、酵母
エキス０．５％、硫酸アンモニウム（０．１４％）、硫
酸マグネシウム・７水和物（０．０３％）、尿素（０．
０３％）、Ｔｗｅｅｎ８０（０．０５％）。培養後、遠
心分離（５０００ｒｐｍ，１０分）により菌体を回収
し、アイソジェン（ニッポンジーン社製）中でポリトロ
ンを用いて菌体を破壊しＲＮＡを抽出した。残存アビセ
ルを含む湿菌体重量として８．２ｇを使用し、１．４ｍ
ｇのＲＮＡを得た。このうち１ｍｇのＲＮＡを用いて、
オリゴテックスｄＴ−３０スーパー（宝酒造）に吸着さ
せることにより５．８μｇのｍＲＮＡを精製した。ＺＡ
Ｐ−ｃＤＮＡ合成キット（ストラタジーン社製）を用い
てｃＤＮＡを調製、１．２μｇのｃＤＮＡを取得した。
キット内のλＺＡＰＩＩにライゲーションし、Ｇｉｇａ
ｐａｃｋ Ｇｏｌｄパッケージングエキストラクト（ス
トラタジーン社製）を用いてラムダファージにパッケー
ジし、得られたファージを大腸菌ＸＬ１−Ｂｌｕｅ Ｍ
ＲＦ’株に感染させた。

【００２３】（２）抗エンドグルカナーゼ血清の調製 上記ＣＩ培地中で３０℃、７日間培養後、得られた培養
液を８０００ｒｐｍで１０分間遠心し菌体を除いた。得
られた培養上清を限外ろ過により濃縮、１０ｍＭ酢酸ナ
トリウム緩衝液（ｐＨ６．０）にバッファー交換し、Ｄ
ＥＡＥトヨパールカラムに適用した。非吸着画分を分離
し、硫酸アンモニウムを１．０Ｍとなるように溶解、ブ
チルトヨパールカラムに適用した。１．０〜０Ｍの濃度
勾配をかけた硫酸アンモニウム溶液で溶出し、活性画分
を分画した。活性はＣＭＣを基質とし、還元糖の遊離を
ソモジー・ネルソン法（Ｓｏｍｏｙｉ，Ｍ．Ｊ．Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９５２）１９５，１９）で測定
した。クロマトグラフ処理したエンドグルカナーゼはＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。電気泳動的に分離した
タンパク質はクマシー・ブリリアント・ブルーＲ−２５
０で染色し、検出した。このバンド１００μｇ相当分を
ゲルから切り出し、ゲルごとシリンジ中で細かく破砕、
フロイント完全アジュバントと混合しウサギの背中およ
び腿に４〜５カ所に分けて皮下注射した。２週間後、約
１／２量のグルカナーゼを電気泳動し、同様にバンドを
破砕、フロイント不完全アジュバントと混合、同様に皮
下注射した。１０日後静脈血約２５ｍｌを分取し、遠心
により血餅を除き抗エンドグルカナーゼ血清とした。

【００２４】（３）セルラーゼ遺伝子のクローン化 上記大腸菌ＸＬ−１Ｂｌｕｅ ＭＲＦ’株に、シャーレ
あたり約２００００プラークとなるように常法によりフ
ァージライブラリーを感染させ、４２℃で３．５時間培
養した。直前に１０ｍＭのＩＰＴＧを染み込ませたニト
ロセルロースメンブレンをプラークの出現したシャーレ
に乗せ、３７℃で３．５時間培養した。メンブレンをは
がし、ＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣキット（フナコシ株
式会社）の説明書に基づきメンブレンを洗浄し、上記ウ
サギ抗エンドグルカナーゼ血清および二次抗体としての
抗ウサギＩｇＧを用いて陽性クローンをスクリーニング
した。メンブレン上のスポットと合致するプラークをシ
ャーレから打ち抜き、再スクリーニングにかけた。

【００２５】（４）目的遺伝子のサブクローン化 ６個の陽性プラークを選抜し、ＺＡＰ−ｃＤＮＡ合成キ
ットの説明書に従いｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ
（＋）プラスミドにサブクローン化した。

【００２６】（５）塩基配列の決定 塩基配列解析装置はＤＮＡシーケンサー３７３Ａ（ＰＥ
アプライドバイオシステムズ社製）を用いた。塩基配列
解読反応はダイターミネーター・サイクル・シーケンシ
ング・キット（ＰＥアプライドバイオシステムズ社製）
で、ＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ システム２４００（ＰＥ
アプライドバイオシステムズ社製）を用いて行った。ゲ
ル作製条件、反応条件、泳動条件などは各説明書の詳細
を参照した。解読できた塩基配列を基に順次オリゴヌク
レオチドプライマーを合成し、＋鎖と−鎖の両方の全長
を解読した。

【００２７】（７）組換えプラスミドの調製 取得したＤＮＡ配列にコードされている遺伝子にセルラ
ーゼ活性があることを確認するため、ｐＢｌｕｅｓｃｒ
ｉｐｔ ＳＫ（＋）に組み込まれた本ＤＮＡをＥｃｏＲ
Ｉで消化し、約１．４ｋｂのＤＮＡ断片を回収した。ｐ
Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（ストラタジーン社製）
由来で、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇ
ｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）ａｒｇＢの遺伝子を有
し、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ｏｒｙｚａｅ）ｐｇｋＡ遺伝子のプロモーターとタ
ーミネーターの間に唯一ＥｃｏＲＩ認識切断部位のある
プラスミドｐＢＰＴ（国立醸造試験所よりの分与）に順
向きに本エンドグルカナーゼ遺伝子を導入した。

【００２８】（８）エンドグルカナーゼ遺伝子の発現
（Ｉ） アルギニン要求性のＡ．オリゼーＭ−２−３株（Ｇｏｍ
ｉ，Ｋ． Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．（１９
８７）５１，２５４９）をＤＰ培地中で３０℃で培養し
た。ＤＰ培地の組成：デキストリン（２．０％）、ポリ
ペプトン（１．０％）、硫酸マグネシウム・７水和物
（０．０５％）、硝酸ナトリウム（０．１％）、リン酸
二水素カリウム（０．５％）、ｐＨ６．０。２０時間培
養後、３０００ｒｐｍ、１０分間の遠心によって菌体を
集め、０．４５μｍのフィルターでろ過したプロトプラ
スト化酵素溶液（５ｍｇ／ｍｌ Ｎｏｖｏｚｙｍｅ２３
４、５ｍｇ／ｍｌ Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ Ｏｎｏｚｕｋ
ａ Ｒ−１０、０．８Ｍ塩化ナトリウム、１０ｍＭリン
酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６．０）３０ｍｌに懸濁した。
室温で２〜４時間ゆっくり振盪し、プロトプラスト化さ
せた。滅菌したペーパータオルでろ過し、２０００ｒｐ
ｍで１０分遠心してプロトプラストを回収した。上清を
捨てて０．８Ｍ塩化ナトリウム溶液で２回洗浄し、２０
００ｒｐｍで５分間遠心した。更に緩衝液Ｉ（０．８Ｍ
塩化ナトリウム、１０ｍＭ塩化カルシウム、１０ｍＭト
リス塩酸ｐＨ７．５）で洗浄し、２０００ｒｐｍで５分
間遠心した。プロトプラストを２．５×１０の８乗／ｍ
ｌとなるように、最終容量の４／５の緩衝液Ｉに懸濁
し、１／５量の緩衝液ＩＩ（４０％ポリエチレングリコ
ール４０００、５０ｍＭ塩化カルシウム、５０ｍＭトリ
ス塩酸ｐＨ７．５）および１／１００量のジメチルスル
ホキシドを加えて混合し、０．２ｍｌずつマイクロチュ
ーブに分注し、形質転換用プロトプラストとした。この
形質転換用プロトプラスト懸濁液０．２ｍｌに１μｇ／
μｌのプラスミド溶液１０μｌを添加、充分混合後３０
分間氷冷した。１ｍｌの緩衝液ＩＩを加えて良く混合
し、室温で２０分間放置したのち１０ｍｌの緩衝液Ｉで
希釈した。４℃、２０００ｒｐｍで５分間遠心してプロ
トプラストを回収し、２ｍｌの緩衝液Ｉに懸濁して１ｍ
ｌずつＣＤ培地（ＣＤ培地の組成は、硝酸ナトリウム
０．２％、リン酸水素二カリウム０．１％、硫酸マグネ
シウム・７水和物０．０５％、塩化カリウム０．０５
％、硫酸鉄０．００１％、しょ糖３．０％、寒天２％、
ｐＨ５．５）にのせ、３０℃で培養した。７日間培養後
アルギニン非要求性コロニーを釣菌し、ＧＰ−Ｍ培地に
接種、３０℃、３日間培養した。培養上清をＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥに供したところ４８ｋＤａの強いバンドを検出し
た。この４８ｋＤａタンパク質は、上記（３）セルラー
ゼ遺伝子のスクリーニングで用いたウサギ抗エンドグル
カナーゼ血清と反応した。本培養上清に、０．２２〜
０．２９ユニット／ｍｌのＣＭＣａｓｅ活性を検出し
た。対照標品の本グルコアミラーゼ遺伝子を組み込まな
いｐＢＰＴプラスミドのみで形質転換したＡ．オリゼー
株Ｐ−１の同様の培養上清にはＣＭＣａｓｅ活性を認め
なかった。図１中（ａ）のパネルのレーン１および２
は、それぞれ対照菌株のｐＢＰＴのみで形質転換した
株、及び本グルコアミラーゼ遺伝子形質転換体Ｃ−１の
ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物のアガロースゲル電気
泳動のパターンで、図１（ｂ）はそのサザン解析の結果
である。プローブは本グルコアミラーゼ遺伝子を用い
た。図１で明かであるように、本グルコアミラーゼ遺伝
子形質転換体にのみ約１．４ｋｂに相当するシグナルが
検出できた。図２（ａ）は上記（２）抗エンドグルカナ
ーゼ血清の調製に用いたＣ．ロルフシイ培養上清の粗精
製標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、（ｂ）レーン２はＰ
−１株のＧＰ−Ｍ培地中、３０℃、３日間培養の培養上
清、レーン３は対照菌株Ｃ−１の培養上清、（ｃ）レー
ン２およびレーン３は、同様にそれぞれＰ−１株および
Ｃ−１株培養上清のウエスタンブロット解析の結果であ
る。図２の（ａ）及び（ｂ）の結果よりＣ−１株で発現
されたタンパク質は見かけ上Ｃ．ロルフシイ培養上清中
のエンドグルカナーゼより高分子化していた。

【００２９】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：３９０ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 Met Phe Ile Pro Ile Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Val Asn Ala Gln -15 -10 -5 1 Gln Ser Ala Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Ala Thr Ser Cys 5 10 15 Ile Ser Gly Tyr Tyr Cys Gln Ala Gln Asn Ser Tyr Tyr Ser Gln Cys Val Pro 20 25 30 35 Gly Thr Ala Thr Ser Lys Thr Ala Arg Ser Thr Ser Thr Ala Pro Ser Ser Thr 40 45 50 55 Gly Ser Ser Gly Ala Arg Leu Pro Tyr Leu Gly Gly Val Asn Thr Ala Gly Tyr 60 65 70 Asp Phe Thr Val Asp Thr Thr Gly Thr Phe Thr Gly Thr Gly Val Val Pro Pro 75 80 85 90 Ala Ser Gln Tyr Ala His Phe Ala Asn Glu Gly Ala Asn Leu Phe Arg Ile Pro 95 100 105 Phe Ala Trp Gln Leu Met Thr Pro Thr Leu Gly Gly Ser Ile Asn Gln Thr Phe 110 115 120 125 Phe Gln Ser Glu Tyr Asn Pro Thr Val Gln Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Tyr 130 135 140 145 Val Ile Val Asp Leu His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gln Ile Ile Gly Gln 150 155 160 Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Ala Ser Ile Trp Thr Gln Leu Thr Ser Tyr 165 170 175 180 Tyr Gly Asn Asn Pro Lys Val Ile Phe Gly Leu Met Asn Glu Pro His Asp Leu 185 190 195 Asn Ser Ile Pro Glu Trp Ala Asp Ser Leu Gln Tyr Val Val Asn Ala Val Arg 200 205 210 215 Ala Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Leu Leu Leu Pro Gly Ser Ser Trp Ala Ser Ala 220 225 230 235 Gln Ala Leu Pro Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Leu Leu Gln Ile Thr Asp Pro Leu 240 245 250 Gly Gly Thr Asn Lys Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp Asn 255 260 265 270 Ser Gly Thr His Ser Asn Cys Val Thr Asn Asn Thr Gly Val Leu Gln Thr His 275 280 285 Val Thr Trp Leu Gln Gln Asn Gly Asn Arg Gln Ala Leu Leu Ser Glu Thr Gly 290 295 300 305 Gly Gly Ser Ser Asp Ser Ser Cys Glu Thr Tyr Val Ala Gln Glu Leu Ala Phe 310 315 320 325 Val Gln Ala Asn Lys Asn Asn Ile Ala Gly Phe Ala Ile Trp Ala Ala Gly Ala 330 335 340 Phe Asp Thr Thr Tyr Val Leu Ser Val Thr Pro Asn Ala Asp Gly Ser Asp Gln 345 350 355 360 Pro Leu Trp Ser Ile Ala Val Lys Pro Tyr Leu Pro 365 370

【００３０】 配列番号：２ 配列の長さ：１３７２ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ＤＮＡ 起源 生物名：Ｃ．ロルフシイ（Corticium rolfsii） 配列の特徴 特徴を表す記号：ｓｉｇ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：２７．．７７ 特徴を表す記号：ｍａｔ ｐｅｐｔｉｄｅ 存在位置 ：７８．．１１９６ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置 ：３１８．．３２３ 他の情報 ：ＫｐｎＩ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置 ：５１９．．５２４ 他の情報 ：ＳａｌＩ 特徴を表す記号：ｃｌｅａｖａｇｅ−ｓｉｔｅ 存在位置 ：８４０．．８４５ 他の情報 ：ＫｐｎＩ CTGGTTCTCT CATCTCAACT TACAAA ATG TTC ATT CCC ATT GCA CTA GTT GCA 53 Met Phe Ile Pro Ile Ala Leu Val Ala -15 -10 TTA GCT GCC AGC GTG GTG AAT GCA CAA CAG TCT GCG TGG GGA CAA TGT GGT 104 Leu Ala Ala Ser Val Val Asn Ala Gln Gln Ser Ala Trp Gly Gln Cys Gly -5 1 5 GGT CAG GGC TGG ACT GGT GCC ACT TCT TGT ATC TCT GGT TAT TAC TGC CAA 155 Gly Gln Gly Trp Thr Gly Ala Thr Ser Cys Ile Ser Gly Tyr Tyr Cys Gln 10 15 20 25 GCG CAG AAC TCT TAC TAT AGT CAA TGT GTT CCT GGA ACT GCA ACT TCG AAG 206 Ala Gln Asn Ser Tyr Tyr Ser Gln Cys Val Pro Gly Thr Ala Thr Ser Lys 30 35 40 ACG GCG AGG TCT ACG TCC ACA GCA CCA AGC AGC ACT GGA AGC TCC GGA GCC 257 Thr Ala Arg Ser Thr Ser Thr Ala Pro Ser Ser Thr Gly Ser Ser Gly Ala 45 50 55 60 CGT CTG CCA TAT CTC GGT GGT GTA AAC ACG GCT GGT TAT GAT TTC ACC GTG 308 Arg Leu Pro Tyr Leu Gly Gly Val Asn Thr Ala Gly Tyr Asp Phe Thr Val 65 70 75 GAT ACC ACC GGT ACC TTC ACT GGA ACT GGT GTT GTT CCC CCT GCA TCG CAA 359 Asp Thr Thr Gly Thr Phe Thr Gly Thr Gly Val Val Pro Pro Ala Ser Gln 80 85 90 TAT GCT CAC TTT GCC AAC GAG GGT GCC AAT CTC TTC CGT ATT CCT TTC GCT 410 Tyr Ala His Phe Ala Asn Glu Gly Ala Asn Leu Phe Arg Ile Pro Phe Ala 95 100 105 110 TGG CAA TTG ATG ACT CCC ACT CTC GGT GGT AGC ATT AAC CAA ACC TTC TTC 461 Trp Gln Leu Met Thr Pro Thr Leu Gly Gly Ser Ile Asn Gln Thr Phe Phe 115 120 125 CAG TCC GAG TAC AAC CCA ACC GTC CAG GCT GCT CTG GCC ACC GGT GCT TAC 512 Gln Ser Glu Tyr Asn Pro Thr Val Gln Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Tyr 130 135 140 145 GTC ATC GTC GAC TTG CAC AAC TAT GCT CGA TGG AAC GGC CAG ATC ATT GGC 563 Val Ile Val Asp Leu His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gln Ile Ile Gly 150 155 160 CAG GGT GGT CCG ACA AAC GCA CAA TTT GCC TCG ATC TGG ACT CAG CTC ACG 614 Gln Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Ala Ser Ile Trp Thr Gln Leu Thr 165 170 175 TCC TAC TAC GGC AAC AAC CCT AAA GTC ATC TTT GGC TTG ATG AAC GAG CCT 665 Ser Tyr Tyr Gly Asn Asn Pro Lys Val Ile Phe Gly Leu Met Asn Glu Pro 180 185 190 195 CAT GAT CTC AAT TCA ATC CCC GAG TGG GCG GAC AGT CTC CAA TAC GTC GTC 716 His Asp Leu Asn Ser Ile Pro Glu Trp Ala Asp Ser Leu Gln Tyr Val Val 200 205 210 AAC GCC GTT CGT GCG GCC GGC TCG ACG AAC TAC CTC CTC TTA CCC GGT TCT 767 Asn Ala Val Arg Ala Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Leu Leu Leu Pro Gly Ser 215 220 225 230 TCC TGG GCT AGC GCA CAG GCA CTC CCG ACC GAG GCC GGA CCT TAC CTC CTC 818 Ser Trp Ala Ser Ala Gln Ala Leu Pro Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Leu Leu 235 240 245 CAA ATC ACT GAT CCT CTT GGC GGT ACC AAC AAA CTC ATT TTC GAT GTG CAC 869 Gln Ile Thr Asp Pro Leu Gly Gly Thr Asn Lys Leu Ile Phe Asp Val His 250 255 260 AAG TAC CTC GAC AGC GAC AAC AGT GGC ACC CAC TCC AAC TGC GTT ACG AAC 920 Lys Tyr Leu Asp Ser Asp Asn Ser Gly Thr His Ser Asn Cys Val Thr Asn 265 270 275 280 AAC ACT GGT GTC CTT CAG ACG CAC GTG ACC TGG CTC CAG CAG AAT GGC AAC 971 Asn Thr Gly Val Leu Gln Thr His Val Thr Trp Leu Gln Gln Asn Gly Asn 285 290 295 CGT CAG GCG CTT CTG AGC GAG ACT GGT GGA GGT AGC TCT GAC AGC AGT TGC 1022 Arg Gln Ala Leu Leu Ser Glu Thr Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ser Ser Cys 300 305 310 315 GAG ACA TAT GTT GCC CAA GAG CTT GCA TTC GTT CAA GCC AAC AAG AAT AAC 1073 Glu Thr Tyr Val Ala Gln Glu Leu Ala Phe Val Gln Ala Asn Lys Asn Asn 320 325 330 ATT GCC GGC TTT GCC ATC TGG GCC GCA GGT GCA TTC GAC ACG ACA TAC GTC 1124 Ile Ala Gly Phe Ala Ile Trp Ala Ala Gly Ala Phe Asp Thr Thr Tyr Val 335 340 345 CTT AGC GTC ACC CCG AAC GCG GAC GGC TCG GAT CAG CCC CTC TGG TCT ATT 1175 Leu Ser Val Thr Pro Asn Ala Asp Gly Ser Asp Gln Pro Leu Trp Ser Ile 350 355 360 365 GCC GTC AAA CCT TAT CTG CCT TAAGAAACCT AATCTATTCA AAATCACCAA 1226 Ala Val Lys Pro Tyr Leu Pro 370 TTGAAGTGAA TAAGAGCCAA TGGTTTCTTC TATATATATT TAGTTGTTTA 1276 TCATGGAAAA AAATCCCGTT GTCGTTTGTG TATTAGATAT TTTGGAGAAA 1326 AGTCAATTTA TTTGGTTTCT TGCTTCTCCA AAAAAAAAAA AAAAAA 1372

【００３１】

【発明の効果】この発明はＣ．ロルフシイに由来する特
定のポリペプチドをコードするセルラーゼ遺伝子を提供
する。更に、本発明は該セルラーゼ酵素遺伝子配列を含
む組換えプラスミドを提供する。また、該遺伝子配列を
含み発現コントロール配列に発現可能な状態で連結され
た組換えプラスミドにより形質転換された麹菌のごとき
組換え微生物を提供する。

【００３２】本酵素の生化学的解析及び高効率生産はセ
ルロース系バイオマスの有効利用に資するものである。
遺伝子工学の手法を用いることにより、精製度の高い酵
素が取得可能となり、しかも酵素の特性解明や遺伝子改
変による特性改良が可能になると考えられる。

【図面の簡単な説明】

【図１】（ａ）は、本エンドグルカナーゼ遺伝子形質転
換体及び対照菌株由来ゲノムＤＮＡのＥｃｏＲＩ消化物
のアガロースゲル電気泳動の結果である。（ｂ）は、そ
のサザン解析の結果である。プローブは本エンドグルカ
ナーゼ遺伝子を用いた。

【図２】（ａ）は、Ｃ．ロルフシイ培養上清に含まれる
本エンドグルカナーゼタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥの
結果、（ｂ）は、本エンドグルカナーゼ遺伝子形質転換
体及び対照菌株の発現培地での培養上清のＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥの結果、（ｃ）は、本エンドグルカナーゼ遺伝子形
質転換体及び対照菌株の発現したタンパク質のウエスタ
ン解析の結果である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:69） 審査官 斎藤 真由美 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 ＤＤＢＪ／ＪＰＯＤＢ／Ｇｅｎｅｓｅｑ

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 エンドグルカナーゼをもたらす次のアミ
   ノ酸配列： X-Gln Gln Ser Ala Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Ala Thr Ser Cys Ile Ser Gly Tyr Tyr Cys Gln Ala Gln Asn Ser Tyr Tyr Ser Gln Cys Val Pro Gly Thr Ala Thr Ser Lys Thr Ala Arg Ser Thr Ser Thr Ala Pro Ser Ser Thr Gly Ser Ser Gly Ala Arg Leu Pro Tyr Leu Gly Gly Val Asn Thr Ala Gly Tyr Asp Phe Thr Val Asp Thr Thr Gly Thr Phe Thr Gly Thr Gly Val Val Pro Pro Ala Ser Gln Tyr Ala His Phe Ala Asn Glu Gly Ala Asn Leu Phe Arg Ile Pro Phe Ala Trp Gln Leu Met Thr Pro Thr Leu Gly Gly Ser Ile Asn Gln Thr Phe Phe Gln Ser Glu Tyr Asn Pro Thr Val Gln Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Tyr Val Ile Val Asp Leu His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gln Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Ala Ser Ile Trp Thr Gln Leu Thr Ser Tyr Tyr Gly Asn Asn Pro Lys Val Ile Phe Gly Leu Met Asn Glu Pro His Asp Leu Asn Ser Ile Pro Glu Trp Ala Asp Ser Leu Gln Tyr Val Val Asn Ala Val Arg Ala Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Leu Leu Leu Pro Gly Ser Ser Trp Ala Ser Ala Gln Ala Leu Pro Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Leu Leu Gln Ile Thr Asp Pro Leu Gly Gly Thr Asn Lys Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp Asn Ser Gly Thr His Ser Asn Cys Val Thr Asn Asn Thr Gly Val Leu Gln Thr His Val Thr Trp Leu Gln Gln Asn Gly Asn Arg Gln Ala Leu Leu Ser Glu Thr Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ser Ser Cys Glu Thr Tyr Val Ala Gln Glu Leu Ala Phe Val Gln Ala Asn Lys Asn Asn Ile Ala Gly Phe Ala Ile Trp Ala Ala Gly Ala Phe Asp Thr Thr Tyr Val Leu Ser Val Thr Pro Asn Ala Asp Gly Ser Asp Gln Pro Leu Trp Ser Ile Ala Val Lys Pro Tyr Leu Pro （配列中、x は存 在しないか、または次のアミノ酸配列：Met Phe Ile Pro Ile Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Val Asn Ala を有するリーダー配列を示す）、又は該アミ ノ酸配列において１もしく複数のアミノ酸配列が付加、欠失もしくは置換されて おり且つエンドグルカナーゼの酵素活性をもたらすアミノ酸配列、をコードして いる塩基配列を含んで成るＤＮＡ。
2. 【請求項２】 イントロンを含有している特許請求の範
   囲第１項に記載のＤＮＡ。
3. 【請求項３】 イントロンを含有することなく前記アミ
   ノ酸配列をコードしている特許請求の範囲第１項に記載
   のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 エンドグルカナーゼをもたらす次のアミ
   ノ酸配列： X-Gln Gln Ser Ala Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Ala Thr Ser Cys Ile Ser Gly Tyr Tyr Cys Gln Ala Gln Asn Ser Tyr Tyr Ser Gln Cys Val Pro Gly Thr Ala Thr Ser Lys Thr Ala Arg Ser Thr Ser Thr Ala Pro Ser Ser Thr Gly Ser Ser Gly Ala Arg Leu Pro Tyr Leu Gly Gly Val Asn Thr Ala Gly Tyr Asp Phe Thr Val Asp Thr Thr Gly Thr Phe Thr Gly Thr Gly Val Val Pro Pro Ala Ser Gln Tyr Ala His Phe Ala Asn Glu Gly Ala Asn Leu Phe Arg Ile Pro Phe Ala Trp Gln Leu Met Thr Pro Thr Leu Gly Gly Ser Ile Asn Gln Thr Phe Phe Gln Ser Glu Tyr Asn Pro Thr Val Gln Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Tyr Val Ile Val Asp Leu His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gln Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Ala Ser Ile Trp Thr Gln Leu Thr Ser Tyr Tyr Gly Asn Asn Pro Lys Val Ile Phe Gly Leu Met Asn Glu Pro His Asp Leu Asn Ser Ile Pro Glu Trp Ala Asp Ser Leu Gln Tyr Val Val Asn Ala Val Arg Ala Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Leu Leu Leu Pro Gly Ser Ser Trp Ala Ser Ala Gln Ala Leu Pro Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Leu Leu Gln Ile Thr Asp Pro Leu Gly Gly Thr Asn Lys Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp Asn Ser Gly Thr His Ser Asn Cys Val Thr Asn Asn Thr Gly Val Leu Gln Thr His Val Thr Trp Leu Gln Gln Asn Gly Asn Arg Gln Ala Leu Leu Ser Glu Thr Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ser Ser Cys Glu Thr Tyr Val Ala Gln Glu Leu Ala Phe Val Gln Ala Asn Lys Asn Asn Ile Ala Gly Phe Ala Ile Trp Ala Ala Gly Ala Phe Asp Thr Thr Tyr Val Leu Ser Val Thr Pro Asn Ala Asp Gly Ser Asp Gln Pro Leu Trp Ser Ile Ala Val Lys Pro Tyr Leu Pro （配列中、x は存 在しないか、または次のアミノ酸配列：Met Phe Ile Pro Ile Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Val Asn Ala を有するリーダー配列を示す）、又は該アミ ノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されてお り且つエンドグルカナーゼの酵素活性をもたらすアミノ酸配列、をコードしてい る塩基配列を含んで成る発現ベクター。
5. 【請求項５】 エンドグルカナーゼをもたらす次のアミ
   ノ酸配列： X-Gln Gln Ser Ala Trp Gly Gln Cys Gly Gly Gln Gly Trp Thr Gly Ala Thr Ser Cys Ile Ser Gly Tyr Tyr Cys Gln Ala Gln Asn Ser Tyr Tyr Ser Gln Cys Val Pro Gly Thr Ala Thr Ser Lys Thr Ala Arg Ser Thr Ser Thr Ala Pro Ser Ser Thr Gly Ser Ser Gly Ala Arg Leu Pro Tyr Leu Gly Gly Val Asn Thr Ala Gly Tyr Asp Phe Thr Val Asp Thr Thr Gly Thr Phe Thr Gly Thr Gly Val Val Pro Pro Ala Ser Gln Tyr Ala His Phe Ala Asn Glu Gly Ala Asn Leu Phe Arg Ile Pro Phe Ala Trp Gln Leu Met Thr Pro Thr Leu Gly Gly Ser Ile Asn Gln Thr Phe Phe Gln Ser Glu Tyr Asn Pro Thr Val Gln Ala Ala Leu Ala Thr Gly Ala Tyr Val Ile Val Asp Leu His Asn Tyr Ala Arg Trp Asn Gly Gln Ile Ile Gly Gln Gly Gly Pro Thr Asn Ala Gln Phe Ala Ser Ile Trp Thr Gln Leu Thr Ser Tyr Tyr Gly Asn Asn Pro Lys Val Ile Phe Gly Leu Met Asn Glu Pro His Asp Leu Asn Ser Ile Pro Glu Trp Ala Asp Ser Leu Gln Tyr Val Val Asn Ala Val Arg Ala Ala Gly Ser Thr Asn Tyr Leu Leu Leu Pro Gly Ser Ser Trp Ala Ser Ala Gln Ala Leu Pro Thr Glu Ala Gly Pro Tyr Leu Leu Gln Ile Thr Asp Pro Leu Gly Gly Thr Asn Lys Leu Ile Phe Asp Val His Lys Tyr Leu Asp Ser Asp Asn Ser Gly Thr His Ser Asn Cys Val Thr Asn Asn Thr Gly Val Leu Gln Thr His Val Thr Trp Leu Gln Gln Asn Gly Asn Arg Gln Ala Leu Leu Ser Glu Thr Gly Gly Gly Ser Ser Asp Ser Ser Cys Glu Thr Tyr Val Ala Gln Glu Leu Ala Phe Val Gln Ala Asn Lys Asn Asn Ile Ala Gly Phe Ala Ile Trp Ala Ala Gly Ala Phe Asp Thr Thr Tyr Val Leu Ser Val Thr Pro Asn Ala Asp Gly Ser Asp Gln Pro Leu Trp Ser Ile Ala Val Lys Pro Tyr Leu Pro （配列中、x は存 在しないか、または次のアミノ酸配列：Met Phe Ile Pro Ile Ala Leu Val Ala Leu Ala Ala Ser Val Val Asn Ala を有するリーダー配列を示す）、又は該アミ ノ酸配列において１もしくは複数のアミノ酸が付加、欠失もしくは置換されてお り且つエンドグルカナーゼの酵素活性をもたらすアミノ酸配列、をコードしてい る塩基配列を含んで成る発現ベクターにより形質転換された麹菌のごとき菌類。