JPH0823995A - 宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の製造方法 - Google Patents
宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の製造方法Info
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- JPH0823995A JPH0823995A JP6186602A JP18660294A JPH0823995A JP H0823995 A JPH0823995 A JP H0823995A JP 6186602 A JP6186602 A JP 6186602A JP 18660294 A JP18660294 A JP 18660294A JP H0823995 A JPH0823995 A JP H0823995A
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- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化され
得る蛋白質を分泌産生する宿主細胞をアミノ酸，リン酸
塩，アンモニウム塩および非イオン界面活性剤からなる
群から選択される少なくとも１種を含有する培地中で培
養し、該蛋白質を採取することを特徴とする宿主細胞由
来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の製造方
法。当該蛋白質を採取する方法が、アンモニウム塩の存
在下でカラムクロマト処理をすることを特徴とする宿主
細胞由来のプロテアーゼで低分子され得る蛋白質の製造
方法である。 【効果】 遺伝子工学的手法により製造されるプロテア
ーゼで低分子化されうる蛋白質を完全体の状態で大量に
製造することができる。宿主細胞の増殖の亢進、該蛋白
質の産生量の向上、宿主細胞からの分泌が促進される。
また、培養上清中に分泌された該蛋白質の低分子化を有
効に抑制することができる。
得る蛋白質を分泌産生する宿主細胞をアミノ酸，リン酸
塩，アンモニウム塩および非イオン界面活性剤からなる
群から選択される少なくとも１種を含有する培地中で培
養し、該蛋白質を採取することを特徴とする宿主細胞由
来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の製造方
法。当該蛋白質を採取する方法が、アンモニウム塩の存
在下でカラムクロマト処理をすることを特徴とする宿主
細胞由来のプロテアーゼで低分子され得る蛋白質の製造
方法である。 【効果】 遺伝子工学的手法により製造されるプロテア
ーゼで低分子化されうる蛋白質を完全体の状態で大量に
製造することができる。宿主細胞の増殖の亢進、該蛋白
質の産生量の向上、宿主細胞からの分泌が促進される。
また、培養上清中に分泌された該蛋白質の低分子化を有
効に抑制することができる。
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、宿主細胞由来のプロテ
アーゼで低分子化され得る不安定な蛋白質を安定にかつ
大量に製造する方法に関する。詳細には、遺伝子操作に
より得られる該蛋白質を産生分泌する宿主細胞を、特定
の物質を配合する培地中で培養することによって宿主細
胞の増殖を高めるとともに該蛋白質の産生、分泌を促
し、かつ低分子化を抑制することによる、宿主細胞由来
のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の大量製造方
法に関する。
アーゼで低分子化され得る不安定な蛋白質を安定にかつ
大量に製造する方法に関する。詳細には、遺伝子操作に
より得られる該蛋白質を産生分泌する宿主細胞を、特定
の物質を配合する培地中で培養することによって宿主細
胞の増殖を高めるとともに該蛋白質の産生、分泌を促
し、かつ低分子化を抑制することによる、宿主細胞由来
のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の大量製造方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術・発明が解決しようとする課題】線維素溶
解に係わるプラスミノーゲン活性化因子には、血管内皮
細胞の産生する組織性のｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ（Ｕ
Ｋ）などが知られている。しかし、ウロキナーゼは大量
に用いると、凝固・線溶諸因子の分解並びに活性化を惹
起し、出血傾向を誘起する欠点を有している。これに対
して、本発明者らは人腎細胞によって産生されるヒトウ
ロキナーゼの不活性型前駆物質〔以下、プロウロキナー
ゼという。特開昭６０−６２９８１号公報、J. Biol. C
hem., 260, 12 377 (1985)〕が、血栓を構成する線維で
あるフィブリンに対して特異的な親和性を有し、フィブ
リンを選択的に分解するなどの血栓溶解特性を有し、さ
らに好ましいことに、当該プロウロキナーゼにはウロキ
ナーゼと異なり出血傾向を惹起するという欠点がないこ
とを見出した〔Cell Struc. Func., 10, 151 (1985)
〕。したがって、このような優れた特性を有するプロ
ウロキナーゼは線維素溶解酵素として臨床上の幅広い利
用が期待される。
解に係わるプラスミノーゲン活性化因子には、血管内皮
細胞の産生する組織性のｔ−ＰＡ、ウロキナーゼ（Ｕ
Ｋ）などが知られている。しかし、ウロキナーゼは大量
に用いると、凝固・線溶諸因子の分解並びに活性化を惹
起し、出血傾向を誘起する欠点を有している。これに対
して、本発明者らは人腎細胞によって産生されるヒトウ
ロキナーゼの不活性型前駆物質〔以下、プロウロキナー
ゼという。特開昭６０−６２９８１号公報、J. Biol. C
hem., 260, 12 377 (1985)〕が、血栓を構成する線維で
あるフィブリンに対して特異的な親和性を有し、フィブ
リンを選択的に分解するなどの血栓溶解特性を有し、さ
らに好ましいことに、当該プロウロキナーゼにはウロキ
ナーゼと異なり出血傾向を惹起するという欠点がないこ
とを見出した〔Cell Struc. Func., 10, 151 (1985)
〕。したがって、このような優れた特性を有するプロ
ウロキナーゼは線維素溶解酵素として臨床上の幅広い利
用が期待される。
【０００３】このような状況で、近年プロウロキナーゼ
等の有用な蛋白質を遺伝子組換え技術を用いて大量に製
造しようとする試みがなされている。特に分泌系を有す
る組換体（酵母）を利用する製造は、製造された蛋白質
の単離・精製が簡便であるという利点を有すること等か
らその方法について種々検討されている。しかし、Sacc
haromyces cerevisiaeを宿主細胞とした場合は、培地へ
の分泌量が低く、大量生産が困難であることが報告され
ている〔Gene, 99, 235-241, 1991 、J. Biol. Chem.,
265, (2), 801-807, 1990 〕。また、本発明者らは、ヒ
ト血清アルブミンやインベルターゼの場合に分泌量の増
加効果が得られたピキア酵母(Pichia pastoris) を宿主
細胞として（Bio/Technology, 5, 1305-1308, 1985）、
プロウロキナーゼについて同様に検討したが、ヒト血清
アルブミン等の場合と比較して当該蛋白質の培地への分
泌量は低く、菌体にかなりのプロウロキナーゼが分泌さ
れずに残存していた。
等の有用な蛋白質を遺伝子組換え技術を用いて大量に製
造しようとする試みがなされている。特に分泌系を有す
る組換体（酵母）を利用する製造は、製造された蛋白質
の単離・精製が簡便であるという利点を有すること等か
らその方法について種々検討されている。しかし、Sacc
haromyces cerevisiaeを宿主細胞とした場合は、培地へ
の分泌量が低く、大量生産が困難であることが報告され
ている〔Gene, 99, 235-241, 1991 、J. Biol. Chem.,
265, (2), 801-807, 1990 〕。また、本発明者らは、ヒ
ト血清アルブミンやインベルターゼの場合に分泌量の増
加効果が得られたピキア酵母(Pichia pastoris) を宿主
細胞として（Bio/Technology, 5, 1305-1308, 1985）、
プロウロキナーゼについて同様に検討したが、ヒト血清
アルブミン等の場合と比較して当該蛋白質の培地への分
泌量は低く、菌体にかなりのプロウロキナーゼが分泌さ
れずに残存していた。
【０００４】さらに本発明者らは、当該ピキア酵母をＹ
ＰＭ培地で培養した場合、培養上清にインタクトの蛋白
質と思われる５０Ｋのもの以外に４７Ｋや３０Ｋ前後の
分解物が多く存在していることに気がついた。この４７
Ｋ蛋白質は、ＥＧＦドメインを認識するモノクローナル
抗体によるウェスタンブロットの結果からインタクトな
プロウロキナーゼのＮ末端が欠失したものであると判断
され、培養上清に存在する宿主細胞等に由来するプロテ
アーゼによって、プロウロキナーゼが低分子化されるも
のと考えられた。また、プロウロキナーゼと同様に、宿
主細胞に由来するプロテアーゼにより低分子化されてし
まい、組換えＤＮＡ技術による量産が難しい蛋白質も知
られている（マウスＥＧＦ：Clare J.I.ら、Gene, 105,
205-212, 1991；ヒトＥＧＦ：米国特許ＷＯ９００３４
３１；β−エンドルフィン：Bitter, G.A.ら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA.,81, 5330, 1984等）。従って、こ
のような有用な蛋白質の、臨床分野を始めとする各分野
での実用化を図るために、上記問題を解決し、組換えＤ
ＮＡ技術による有用蛋白質の製造方法の確立が望まれて
いる。
ＰＭ培地で培養した場合、培養上清にインタクトの蛋白
質と思われる５０Ｋのもの以外に４７Ｋや３０Ｋ前後の
分解物が多く存在していることに気がついた。この４７
Ｋ蛋白質は、ＥＧＦドメインを認識するモノクローナル
抗体によるウェスタンブロットの結果からインタクトな
プロウロキナーゼのＮ末端が欠失したものであると判断
され、培養上清に存在する宿主細胞等に由来するプロテ
アーゼによって、プロウロキナーゼが低分子化されるも
のと考えられた。また、プロウロキナーゼと同様に、宿
主細胞に由来するプロテアーゼにより低分子化されてし
まい、組換えＤＮＡ技術による量産が難しい蛋白質も知
られている（マウスＥＧＦ：Clare J.I.ら、Gene, 105,
205-212, 1991；ヒトＥＧＦ：米国特許ＷＯ９００３４
３１；β−エンドルフィン：Bitter, G.A.ら、Proc. Na
tl. Acad. Sci. USA.,81, 5330, 1984等）。従って、こ
のような有用な蛋白質の、臨床分野を始めとする各分野
での実用化を図るために、上記問題を解決し、組換えＤ
ＮＡ技術による有用蛋白質の製造方法の確立が望まれて
いる。
【０００５】本発明はかかる技術的背景の下に、宿主細
胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の醗酵
学的もしくは遺伝子工学的手法による製造に関し、該蛋
白質を、低分子化されることなく大量に製造する方法を
提供することを課題とする。詳細には、宿主細胞に、宿
主細胞由来のプロテアーゼにより低分子化され得る蛋白
質を安定にかつ大量に産生・分泌させ、さらには分泌後
の低分子化をも抑制することにより、該蛋白質を大量に
製造する方法を提供することを課題とする。
胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の醗酵
学的もしくは遺伝子工学的手法による製造に関し、該蛋
白質を、低分子化されることなく大量に製造する方法を
提供することを課題とする。詳細には、宿主細胞に、宿
主細胞由来のプロテアーゼにより低分子化され得る蛋白
質を安定にかつ大量に産生・分泌させ、さらには分泌後
の低分子化をも抑制することにより、該蛋白質を大量に
製造する方法を提供することを課題とする。
【０００６】
【発明が解決するための手段】本発明者らは、上記目的
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、組換え宿主細胞を
酸性アミノ酸，塩基性アミノ酸，リン酸塩，アンモニウ
ム塩および非イオン性界面活性剤から選択される少なく
とも１種を含有する培地中で培養することにより、宿主
細胞由来のプロテアーゼにより低分子化され得る蛋白質
が大量に産生・分泌されること及び培地中での該プロテ
アーゼによる低分子化が抑制されることを見出した。さ
らに、培地上清をアンモニウム塩の存在下でカラムクロ
マト処理することにより、目的の蛋白質の低分子化が効
果的に抑制され、大量の目的蛋白質が培地上清から単離
できることを見出して本発明を完成した。
を達成すべく鋭意研究を重ねた結果、組換え宿主細胞を
酸性アミノ酸，塩基性アミノ酸，リン酸塩，アンモニウ
ム塩および非イオン性界面活性剤から選択される少なく
とも１種を含有する培地中で培養することにより、宿主
細胞由来のプロテアーゼにより低分子化され得る蛋白質
が大量に産生・分泌されること及び培地中での該プロテ
アーゼによる低分子化が抑制されることを見出した。さ
らに、培地上清をアンモニウム塩の存在下でカラムクロ
マト処理することにより、目的の蛋白質の低分子化が効
果的に抑制され、大量の目的蛋白質が培地上清から単離
できることを見出して本発明を完成した。
【０００７】すなわち、本発明は宿主細胞由来のプロテ
アーゼで低分子化され得る蛋白質を分泌産生する宿主細
胞、就中ピキア酵母を酸性アミノ酸，塩基性アミノ酸，
リン酸塩，アンモニウム塩および非イオン界面活性剤か
らなる群から選択される少なくとも１種を含有する培地
中で培養し、得られる培養上清から該蛋白質を採取する
ことを特徴とする宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子
化され得る蛋白質の製造方法である。さらに本発明は、
当該製造方法における培養上清から宿主細胞由来のプロ
テアーゼで低分子化され得る蛋白質を採取する方法が、
アンモニウム塩の存在下でカラムクロマト処理、好まし
くは疎水性カラムクロマト処理および陽イオン交換カラ
ムクロマト処理をすることを特徴とする、宿主細胞由来
のプロテアーゼで分解され得る蛋白質の製造方法であ
る。さらにまた本発明は、プロウロキナーゼを産生分泌
する形質転換体（ピキア酵母）を提供する。
アーゼで低分子化され得る蛋白質を分泌産生する宿主細
胞、就中ピキア酵母を酸性アミノ酸，塩基性アミノ酸，
リン酸塩，アンモニウム塩および非イオン界面活性剤か
らなる群から選択される少なくとも１種を含有する培地
中で培養し、得られる培養上清から該蛋白質を採取する
ことを特徴とする宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子
化され得る蛋白質の製造方法である。さらに本発明は、
当該製造方法における培養上清から宿主細胞由来のプロ
テアーゼで低分子化され得る蛋白質を採取する方法が、
アンモニウム塩の存在下でカラムクロマト処理、好まし
くは疎水性カラムクロマト処理および陽イオン交換カラ
ムクロマト処理をすることを特徴とする、宿主細胞由来
のプロテアーゼで分解され得る蛋白質の製造方法であ
る。さらにまた本発明は、プロウロキナーゼを産生分泌
する形質転換体（ピキア酵母）を提供する。
【０００８】本発明でいう宿主細胞由来のプロテアーゼ
とは、宿主細胞の染色体遺伝子にコードされるプロテア
ーゼをいう。かかるプロテアーゼは、酵母では現在約３
０種類以上見つかっており、液胞（yscA, yscB, yscY)
、ミトコンドリア(yscMpI)、ペリプラズム(yscII) 等
に存在している。細胞内では、蛋白の分解、窒素代謝、
前駆体のプロセッシング等に関与していることが知られ
ている(Hirsch, H. H. et al, Molecular and Cell Bio
logy of Yeasts, p.134-200, 1989)。
とは、宿主細胞の染色体遺伝子にコードされるプロテア
ーゼをいう。かかるプロテアーゼは、酵母では現在約３
０種類以上見つかっており、液胞（yscA, yscB, yscY)
、ミトコンドリア(yscMpI)、ペリプラズム(yscII) 等
に存在している。細胞内では、蛋白の分解、窒素代謝、
前駆体のプロセッシング等に関与していることが知られ
ている(Hirsch, H. H. et al, Molecular and Cell Bio
logy of Yeasts, p.134-200, 1989)。
【０００９】本発明の製造方法が対象とする蛋白質は、
上記の宿主細胞由来のプロテアーゼの作用により低分子
化され得る蛋白質であれば特に限定されない。具体的に
はプロウロキナーゼ，ヒト組織プラスミノーゲン活性化
因子，血液凝固第IX因子，血液凝固第Ｘ因子，プロテイ
ンＣ，インターフェロン，エピダーマルグロスファクタ
ー（以下、ＥＧＦという）およびβ−エンドルフィン等
が例示される。特に好ましくは、プロウロキナーゼであ
る。
上記の宿主細胞由来のプロテアーゼの作用により低分子
化され得る蛋白質であれば特に限定されない。具体的に
はプロウロキナーゼ，ヒト組織プラスミノーゲン活性化
因子，血液凝固第IX因子，血液凝固第Ｘ因子，プロテイ
ンＣ，インターフェロン，エピダーマルグロスファクタ
ー（以下、ＥＧＦという）およびβ−エンドルフィン等
が例示される。特に好ましくは、プロウロキナーゼであ
る。
【００１０】また本発明が対象とする蛋白質は、天然由
来の蛋白質に限定されず、天然の蛋白質が遺伝的に変異
してなる変異体および人工的に修飾してなる誘導体であ
ってもよい。例えばプロウロキナーゼの場合、天然型プ
ロウロキナーゼのエピダーマルグロースファクタードメ
インの全領域もしくはその一部を欠失、または該全領域
もしくはその一部を他のアミノ酸残基で置換してなる蛋
白質分子、プロウロキナーゼのフィンガードメインの全
領域もしくはその一部を欠失、または該残領域もしくは
の一部を他のアミノ酸残基で置換してなる蛋白質等が挙
げられる（特開平３−８７１８０号、特開平３−８７１
８１号、特開平５−９５７８６号公報）。より具体的に
は、天然型プロウロキナーゼのＮ末端から３０２位のア
スパラギン残基をグルタミン酸残基に置換したプロウロ
キナーゼ誘導体、および天然型プロウロキナーゼのＣ末
端側に血栓親和性を有するAnnexin V 蛋白を結合させた
融合蛋白が挙げられる（ＵＳ０７／６９７３６４）。こ
れらの誘導体は、アスパラギン結合型糖鎖の付加しない
無糖鎖型のプロウロキナーゼであり、血栓親和性が高い
ため血栓溶解剤としての応用が期待されるものである。
来の蛋白質に限定されず、天然の蛋白質が遺伝的に変異
してなる変異体および人工的に修飾してなる誘導体であ
ってもよい。例えばプロウロキナーゼの場合、天然型プ
ロウロキナーゼのエピダーマルグロースファクタードメ
インの全領域もしくはその一部を欠失、または該全領域
もしくはその一部を他のアミノ酸残基で置換してなる蛋
白質分子、プロウロキナーゼのフィンガードメインの全
領域もしくはその一部を欠失、または該残領域もしくは
の一部を他のアミノ酸残基で置換してなる蛋白質等が挙
げられる（特開平３−８７１８０号、特開平３−８７１
８１号、特開平５−９５７８６号公報）。より具体的に
は、天然型プロウロキナーゼのＮ末端から３０２位のア
スパラギン残基をグルタミン酸残基に置換したプロウロ
キナーゼ誘導体、および天然型プロウロキナーゼのＣ末
端側に血栓親和性を有するAnnexin V 蛋白を結合させた
融合蛋白が挙げられる（ＵＳ０７／６９７３６４）。こ
れらの誘導体は、アスパラギン結合型糖鎖の付加しない
無糖鎖型のプロウロキナーゼであり、血栓親和性が高い
ため血栓溶解剤としての応用が期待されるものである。
【００１１】本発明で用いられる宿主細胞は、上述のプ
ロテアーゼにより低分子化され得る蛋白質を分泌産生し
うるものであれば特に限定されず、天然に由来するもの
及び遺伝子操作により得られるものの別を問わない。ま
た、既に公知文献に記載されているものの他、今後開発
されるものであっても適宜利用することができる。具体
的には、宿主細胞由来のプロテアーゼにより低分子化さ
れ得る蛋白質をコードする遺伝子を細胞内で発現して該
蛋白質を産生し、かつ菌体外に分泌する機能を有する
菌、大腸菌，酵母，カビおよび枯草菌等が挙げられる。
具体的には酵母菌、中でもピキア属，サッカロマイセス
属であり、より具体的にはピキア・パストリス（Pichia
pastoris)ＧＴＳ１１５（his 4)（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ
−１５８５１）等が例示される。
ロテアーゼにより低分子化され得る蛋白質を分泌産生し
うるものであれば特に限定されず、天然に由来するもの
及び遺伝子操作により得られるものの別を問わない。ま
た、既に公知文献に記載されているものの他、今後開発
されるものであっても適宜利用することができる。具体
的には、宿主細胞由来のプロテアーゼにより低分子化さ
れ得る蛋白質をコードする遺伝子を細胞内で発現して該
蛋白質を産生し、かつ菌体外に分泌する機能を有する
菌、大腸菌，酵母，カビおよび枯草菌等が挙げられる。
具体的には酵母菌、中でもピキア属，サッカロマイセス
属であり、より具体的にはピキア・パストリス（Pichia
pastoris)ＧＴＳ１１５（his 4)（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ
−１５８５１）等が例示される。
【００１２】遺伝子組換え操作により、上記のプロテア
ーゼにより低分子化され得る蛋白質を分泌産生しうる宿
主細胞を調製する方法は、公知並びにそれに準じた手法
を採用することにより実施することができる。例えば、
プロウロキナーゼを産生分泌する宿主の調製方法として
は特開昭６０−１８０５９１号（サッカロマイセス
属）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を産生分泌
する宿主の調製方法としては、Transfusion Medicine,
p303-313, (1986)等が例示される。また、ピキア酵母を
宿主細胞とする場合は、培地中のメタノールによって強
力に誘導されるＡＯＸ遺伝子のプロモーターに目的蛋白
質の遺伝子を常法に従って接続することにより調製する
ことができる。この場合、発現ベクターは、自律増殖型
および染色体組み込み型の両者がともに用いられるが、
好ましくは染色体組み込み型のものである。発現ベクタ
ーとしてより好ましくは、ＡＯＸ遺伝子の５’と３’の
非翻訳領域を両端にもち、ＡＯＸプロモーター，外来遺
伝子，ＡＯＸターミネーターの他に選択マーカーである
ＨＩＳ４遺伝子を有する直鎖型ベクターである。形質転
換は、スフェロプラスト法（Cregg, J, M.ら、Mol. Cel
l. Biol., 5, 3376-3385, 1983) 、アルカリカチオン法
（Ito, H.,ら、J. Bacteriol.,153,(1)163-168, 1983)
のいずれの方法をも使用することができる。また、宿主
細胞として好ましくはヒスチジン要求性（ｈｉｓ−）を
有する株である。かかる株を使用することにより、発現
ベクターの導入の有無を容易に知ることができる。すな
わち、ＨＩＳ４遺伝子を含有するベクターが導入された
宿主細胞は、そのヒスチジン栄養要求性が消失しこれを
クローニングの指標とすることができるのである。な
お、これまでピキア酵母の分泌発現系としては、Ｉｎｖ
ｅｒｔａｓｅ（Tschopp, J, F., ら、Bio/Technology,
5, 1305-1308, 1987) 、マウスＥＧＦ（Clare, J. J.
ら、Gene, 105, 205-212, 1991) 、ウシライソザイム(D
igan, M. E, ら、Bio/Technology, 7, 160-164, 1989)
の高産生の報告があるが、プロウロキナーゼについての
報告はない。
ーゼにより低分子化され得る蛋白質を分泌産生しうる宿
主細胞を調製する方法は、公知並びにそれに準じた手法
を採用することにより実施することができる。例えば、
プロウロキナーゼを産生分泌する宿主の調製方法として
は特開昭６０−１８０５９１号（サッカロマイセス
属）、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子を産生分泌
する宿主の調製方法としては、Transfusion Medicine,
p303-313, (1986)等が例示される。また、ピキア酵母を
宿主細胞とする場合は、培地中のメタノールによって強
力に誘導されるＡＯＸ遺伝子のプロモーターに目的蛋白
質の遺伝子を常法に従って接続することにより調製する
ことができる。この場合、発現ベクターは、自律増殖型
および染色体組み込み型の両者がともに用いられるが、
好ましくは染色体組み込み型のものである。発現ベクタ
ーとしてより好ましくは、ＡＯＸ遺伝子の５’と３’の
非翻訳領域を両端にもち、ＡＯＸプロモーター，外来遺
伝子，ＡＯＸターミネーターの他に選択マーカーである
ＨＩＳ４遺伝子を有する直鎖型ベクターである。形質転
換は、スフェロプラスト法（Cregg, J, M.ら、Mol. Cel
l. Biol., 5, 3376-3385, 1983) 、アルカリカチオン法
（Ito, H.,ら、J. Bacteriol.,153,(1)163-168, 1983)
のいずれの方法をも使用することができる。また、宿主
細胞として好ましくはヒスチジン要求性（ｈｉｓ−）を
有する株である。かかる株を使用することにより、発現
ベクターの導入の有無を容易に知ることができる。すな
わち、ＨＩＳ４遺伝子を含有するベクターが導入された
宿主細胞は、そのヒスチジン栄養要求性が消失しこれを
クローニングの指標とすることができるのである。な
お、これまでピキア酵母の分泌発現系としては、Ｉｎｖ
ｅｒｔａｓｅ（Tschopp, J, F., ら、Bio/Technology,
5, 1305-1308, 1987) 、マウスＥＧＦ（Clare, J. J.
ら、Gene, 105, 205-212, 1991) 、ウシライソザイム(D
igan, M. E, ら、Bio/Technology, 7, 160-164, 1989)
の高産生の報告があるが、プロウロキナーゼについての
報告はない。
【００１３】本発明の製造方法は、宿主細胞由来のプロ
テアーゼにより低分子化され得る蛋白質を分泌産生しう
る宿主細胞を酸性アミノ酸，塩基性アミノ酸，リン酸
塩，アンモニウム塩及び非イオン性界面活性剤からなる
群から選択される少なくとも一種を含有する培地で培養
することを特徴とする。これにより宿主細胞由来のプロ
テアーゼにより低分子化され得る蛋白質を完全体の状態
で培養上清から大量に取得することが可能となる。すな
わち、当該培養方法は、目的蛋白質の宿主細胞内での発
現、産生効率の向上、菌体外への分泌の促進またはプロ
テアーゼによる低分子化の抑制に寄与するものと考えら
れる。
テアーゼにより低分子化され得る蛋白質を分泌産生しう
る宿主細胞を酸性アミノ酸，塩基性アミノ酸，リン酸
塩，アンモニウム塩及び非イオン性界面活性剤からなる
群から選択される少なくとも一種を含有する培地で培養
することを特徴とする。これにより宿主細胞由来のプロ
テアーゼにより低分子化され得る蛋白質を完全体の状態
で培養上清から大量に取得することが可能となる。すな
わち、当該培養方法は、目的蛋白質の宿主細胞内での発
現、産生効率の向上、菌体外への分泌の促進またはプロ
テアーゼによる低分子化の抑制に寄与するものと考えら
れる。
【００１４】本発明で用いられる酸性アミノ酸としては
アスパラギン酸およびグルタミン酸等が、また塩基性ア
ミノ酸としてはアルギニンおよびリジン等が例示され
る。好ましくは、アルギニンおよびグルタミン酸であ
る。また、上記に例示するアミノ酸を１種もしくは数種
組み合わせて用いることもできる。培地中のアミノ酸含
有量は、通常０．０２〜０．５Ｍ程度、好ましくは０．
０５〜０．３Ｍ程度、より好ましくは０．１Ｍ程度であ
る。当該アミノ酸を含有する培地で本発明の宿主細胞を
培養することにより、菌体の増殖が亢進し、また産生さ
れた蛋白質の分解が抑制される効果が得られる。
アスパラギン酸およびグルタミン酸等が、また塩基性ア
ミノ酸としてはアルギニンおよびリジン等が例示され
る。好ましくは、アルギニンおよびグルタミン酸であ
る。また、上記に例示するアミノ酸を１種もしくは数種
組み合わせて用いることもできる。培地中のアミノ酸含
有量は、通常０．０２〜０．５Ｍ程度、好ましくは０．
０５〜０．３Ｍ程度、より好ましくは０．１Ｍ程度であ
る。当該アミノ酸を含有する培地で本発明の宿主細胞を
培養することにより、菌体の増殖が亢進し、また産生さ
れた蛋白質の分解が抑制される効果が得られる。
【００１５】本発明で用いられるリン酸塩としては、リ
ン酸アンモニウムおよびリン酸ナトリウム等が例示され
る。培地中のリン酸塩の含有量は、２〜５ｗ／ｖ％程
度、好ましくは４ｗ／ｖ％程度である。また、本発明で
用いられるアンモニウム塩としては、リン酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム等が例示される。培地中のアンモ
ニウム塩の含有量は、２〜５ｗ／ｖ％程度、好ましくは
４ｗ／ｖ％程度である。
ン酸アンモニウムおよびリン酸ナトリウム等が例示され
る。培地中のリン酸塩の含有量は、２〜５ｗ／ｖ％程
度、好ましくは４ｗ／ｖ％程度である。また、本発明で
用いられるアンモニウム塩としては、リン酸アンモニウ
ム、炭酸アンモニウム等が例示される。培地中のアンモ
ニウム塩の含有量は、２〜５ｗ／ｖ％程度、好ましくは
４ｗ／ｖ％程度である。
【００１６】リン酸塩およびアンモニウム塩として、好
ましくはリン酸アンモニウムの態様であり、より好まし
くは（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 とＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 との組合
せの態様である。培地中の（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 および
ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 の含有量としては総量で２〜５ｗ／ｖ
％、好ましくは４ｗ／ｖ％程度が挙げられる。リン酸塩
およびアンモニウム塩、就中（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 およ
びＮＨ4 Ｈ2ＰＯ4 を含有する培地で本発明の宿主細胞
を培養することにより、宿主細胞から産生分泌されるプ
ロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の分解が有効に抑
制されるという効果が得られる。
ましくはリン酸アンモニウムの態様であり、より好まし
くは（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 とＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 との組合
せの態様である。培地中の（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 および
ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 の含有量としては総量で２〜５ｗ／ｖ
％、好ましくは４ｗ／ｖ％程度が挙げられる。リン酸塩
およびアンモニウム塩、就中（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 およ
びＮＨ4 Ｈ2ＰＯ4 を含有する培地で本発明の宿主細胞
を培養することにより、宿主細胞から産生分泌されるプ
ロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の分解が有効に抑
制されるという効果が得られる。
【００１７】また、本発明で用いられる培地は、さらに
非イオン性界面活性剤を含有していてもよい。用いられ
る非イオン性界面活性剤としては、トライトンＸ−１０
０，トゥイーン２０，トゥイーン８０，ノニデットＰ−
４０等が例示され、好ましくはトライトンＸ−１００で
ある。培地中の非イオン性界面活性剤の含有量は、０．
００５〜０．０３ｗ／ｖ％程度、好ましくは０．０１ｗ
／ｖ％程度である。
非イオン性界面活性剤を含有していてもよい。用いられ
る非イオン性界面活性剤としては、トライトンＸ−１０
０，トゥイーン２０，トゥイーン８０，ノニデットＰ−
４０等が例示され、好ましくはトライトンＸ−１００で
ある。培地中の非イオン性界面活性剤の含有量は、０．
００５〜０．０３ｗ／ｖ％程度、好ましくは０．０１ｗ
／ｖ％程度である。
【００１８】本発明で用いられる培地は、上記酸性アミ
ノ酸，塩基性アミノ酸，リン酸塩，アンモニウム塩また
は非イオン性界面活性剤のうちいずれか少なくとも１種
を含有していればよい。好ましくは全ての成分を含有し
ている態様である。なかでもアルギニン、リン酸アンモ
ニウム〔（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 およびＮＨ4 Ｈ2 Ｐ
Ｏ4 〕およびトライトンＸ−１００を含有することが好
ましい。
ノ酸，塩基性アミノ酸，リン酸塩，アンモニウム塩また
は非イオン性界面活性剤のうちいずれか少なくとも１種
を含有していればよい。好ましくは全ての成分を含有し
ている態様である。なかでもアルギニン、リン酸アンモ
ニウム〔（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 およびＮＨ4 Ｈ2 Ｐ
Ｏ4 〕およびトライトンＸ−１００を含有することが好
ましい。
【００１９】本発明で用いられる培地は、上記の条件を
満たし、かつ宿主細胞が生育，増殖しうるものである限
り、他の配合成分に関しては特に制限されない。他の配
合成分としては、通常のこの分野で用いられる既知の培
地に含まれる成分が例示される。例えば、一般に炭素源
として各種の糖類（グルコース，グリセロール等）、窒
素源として尿素や硝酸塩等、微量栄養素として各種ビタ
ミン、ヌクレオチド等の他、無機塩としてＭｇ，Ｃａ，
Ｆｅ，Ｎａ，Ｋ，Ｍｎ，Ｃｏ，Ｃｕ等が例示される。具
体的には、ＹＮＢ液体培地〔０．７％アミノ酸非含有イ
ーストナイトロジェンベース(Difco社製) 、２％グルコ
ース〕、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト
(Difco社製) 、２％バクトペプトン(Difco社製) 、２％
グルコース〕等が例示される。また、宿主細胞が、メタ
ノール資化性宿主である場合には、メタノール含有培地
を使用することができる。この場合メタノール濃度は、
０．０１〜５％程度であり、具体的にはＹＰＭ培地〔１
％酵母抽出物、２％バクトペプトン、０．０１〜５％メ
タノール〕が例示される。
満たし、かつ宿主細胞が生育，増殖しうるものである限
り、他の配合成分に関しては特に制限されない。他の配
合成分としては、通常のこの分野で用いられる既知の培
地に含まれる成分が例示される。例えば、一般に炭素源
として各種の糖類（グルコース，グリセロール等）、窒
素源として尿素や硝酸塩等、微量栄養素として各種ビタ
ミン、ヌクレオチド等の他、無機塩としてＭｇ，Ｃａ，
Ｆｅ，Ｎａ，Ｋ，Ｍｎ，Ｃｏ，Ｃｕ等が例示される。具
体的には、ＹＮＢ液体培地〔０．７％アミノ酸非含有イ
ーストナイトロジェンベース(Difco社製) 、２％グルコ
ース〕、ＹＰＤ液体培地〔１％イーストエキストラクト
(Difco社製) 、２％バクトペプトン(Difco社製) 、２％
グルコース〕等が例示される。また、宿主細胞が、メタ
ノール資化性宿主である場合には、メタノール含有培地
を使用することができる。この場合メタノール濃度は、
０．０１〜５％程度であり、具体的にはＹＰＭ培地〔１
％酵母抽出物、２％バクトペプトン、０．０１〜５％メ
タノール〕が例示される。
【００２０】よって、本発明で用いられる培地は、従来
公知の培地に上記のアミノ酸、リン酸塩，アンモニウム
塩または非イオン性界面活性剤を添加配合することによ
り簡便に調製することができる。
公知の培地に上記のアミノ酸、リン酸塩，アンモニウム
塩または非イオン性界面活性剤を添加配合することによ
り簡便に調製することができる。
【００２１】また、培地のｐＨは中性、弱塩基性または
弱酸性のいずれであってもよい。好ましくはｐＨ６〜８
である。
弱酸性のいずれであってもよい。好ましくはｐＨ６〜８
である。
【００２２】培養は、上記培地を用いて、常法に準じ
て、菌体が目的の蛋白質を最大量産生し、かつ効率よく
分泌する条件を適宜選択して行うことができる。培養温
度としては、通常１５〜４３℃、好ましくは２０〜３０
℃が挙げられ、培養時間は通常１〜１０００時間程度が
例示される。また必要により通気下で培養することもで
きる。なお、本培養に先立って、同様の条件で前培養す
ることもできる。
て、菌体が目的の蛋白質を最大量産生し、かつ効率よく
分泌する条件を適宜選択して行うことができる。培養温
度としては、通常１５〜４３℃、好ましくは２０〜３０
℃が挙げられ、培養時間は通常１〜１０００時間程度が
例示される。また必要により通気下で培養することもで
きる。なお、本培養に先立って、同様の条件で前培養す
ることもできる。
【００２３】かくして培養した後、培養上清に分泌され
た目的の蛋白質は、培養物から公知の分離、精製手段に
より採取することができる。例えば、培養物を限外濾過
もしくは遠心分離にかけて培養上清を取得し、該培養上
清を硫安沈澱等の塩析、ゲル濾過処理、陰イオン交換
体、陽イオン交換体、疎水性クロマト等の各処理に供す
ることにより、目的蛋白質を精製することができる。よ
り具体的には、本発明が対象とする目的蛋白質は宿主細
胞由来のプロテアーゼにより低分子化されやすいため、
以下の方法により培養上清から精製することが好まし
い。
た目的の蛋白質は、培養物から公知の分離、精製手段に
より採取することができる。例えば、培養物を限外濾過
もしくは遠心分離にかけて培養上清を取得し、該培養上
清を硫安沈澱等の塩析、ゲル濾過処理、陰イオン交換
体、陽イオン交換体、疎水性クロマト等の各処理に供す
ることにより、目的蛋白質を精製することができる。よ
り具体的には、本発明が対象とする目的蛋白質は宿主細
胞由来のプロテアーゼにより低分子化されやすいため、
以下の方法により培養上清から精製することが好まし
い。
【００２４】すなわち、遠心分離法または限外濾過法等
の常法により、分離取得した培養上清を宿主細胞由来の
プロテアーゼが混在する精製の初期段階で、リン酸およ
びアンモニウムを含有する緩衝液を用い、低い蛋白濃度
の条件下でカラムクロマト処理をする方法である。ここ
で用いられる緩衝液としては、アンモニウム塩を含有す
る緩衝液であれば特に限定されない。好ましくは、中性
域（ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７程度）に緩衝能を有
する緩衝液であり、含有するアンモニウム塩の濃度は
０．０５〜１．５Ｍが好ましい。具体的には０．０５〜
１．５Ｍ リン酸アンモニウム緩衝液（ＮＨ4 ＰＯ4 ：
ｐＨ６〜８）が例示される。アンモニウム塩を含有する
緩衝液を用いることにより、本発明が対象とする蛋白質
のプロテアーゼによる低分子化を有効に抑制し、インタ
クトな蛋白質を高い収率で精製取得することができる。
の常法により、分離取得した培養上清を宿主細胞由来の
プロテアーゼが混在する精製の初期段階で、リン酸およ
びアンモニウムを含有する緩衝液を用い、低い蛋白濃度
の条件下でカラムクロマト処理をする方法である。ここ
で用いられる緩衝液としては、アンモニウム塩を含有す
る緩衝液であれば特に限定されない。好ましくは、中性
域（ｐＨ６〜８、好ましくはｐＨ７程度）に緩衝能を有
する緩衝液であり、含有するアンモニウム塩の濃度は
０．０５〜１．５Ｍが好ましい。具体的には０．０５〜
１．５Ｍ リン酸アンモニウム緩衝液（ＮＨ4 ＰＯ4 ：
ｐＨ６〜８）が例示される。アンモニウム塩を含有する
緩衝液を用いることにより、本発明が対象とする蛋白質
のプロテアーゼによる低分子化を有効に抑制し、インタ
クトな蛋白質を高い収率で精製取得することができる。
【００２５】カラムクロマト処理としては、陰イオン交
換カラムクロマト処理、陽イオン交換カラムクロマト処
理、ゲル濾過カラムクロマト処理、疎水性カラムクロマ
ト処理、キレート樹脂カラムクロマト処理等の通常蛋白
質の精製、特に醗酵または遺伝子工学的手法により製造
される蛋白質の精製に用いられるカラムクロマト処理が
例示される。なかでも本発明の好ましい態様としては、
疎水性カラムクロマト処理および陽イオン交換カラムク
ロマト処理の組合せが挙げられる。培養上清から目的蛋
白質を単離する方法として、好ましくはアンモニウム塩
を含有する緩衝液、好ましくはリン酸アンモニウム緩衝
液（ｐＨ６〜８）を用いて疎水性カラムクロマトグラフ
ィーおよび陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行
う方法が挙げられ、かかる方法により、分解物の少ない
インタクトで比活性の高い目的蛋白質を高い収率で単離
することができる。
換カラムクロマト処理、陽イオン交換カラムクロマト処
理、ゲル濾過カラムクロマト処理、疎水性カラムクロマ
ト処理、キレート樹脂カラムクロマト処理等の通常蛋白
質の精製、特に醗酵または遺伝子工学的手法により製造
される蛋白質の精製に用いられるカラムクロマト処理が
例示される。なかでも本発明の好ましい態様としては、
疎水性カラムクロマト処理および陽イオン交換カラムク
ロマト処理の組合せが挙げられる。培養上清から目的蛋
白質を単離する方法として、好ましくはアンモニウム塩
を含有する緩衝液、好ましくはリン酸アンモニウム緩衝
液（ｐＨ６〜８）を用いて疎水性カラムクロマトグラフ
ィーおよび陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行
う方法が挙げられ、かかる方法により、分解物の少ない
インタクトで比活性の高い目的蛋白質を高い収率で単離
することができる。
【００２６】本発明で用いられる疎水性クロマト処理
は、常法に従って行うことができる。疎水性クロマト用
担体としては、炭素数４〜１８のアルキル基（ブチル基
型、オクチル基型、オクチルデシル基型等）、フェニル
基を有する不溶性担体が例示される。好適にはフェニル
基型が挙げられ、具体的にはフェニル−セルロース（商
品名：フェニルセルロファイン、生化学工業社製）、フ
ェニル−アガロース（商品名：フェニル−セファロー
ス、ファルマシア製）等が例示される。吸着、溶出条件
は、精製する目的の蛋白質に応じて好ましい条件を適宜
選択することができる。プロウロキナーゼの場合、接触
条件としてはｐＨ６〜８程度、好ましくはｐＨ７程度、
塩濃度０．５〜１．５Ｍ程度、好ましくは０．５〜０．
８Ｍ程度が挙げられる。溶出条件としてはｐＨ６〜８程
度、好ましくはｐＨ７程度、塩濃度０．１〜１Ｍ程度、
好ましくは０．０５〜０．５Ｍ程度、より好ましくは
０．２Ｍ程度である。
は、常法に従って行うことができる。疎水性クロマト用
担体としては、炭素数４〜１８のアルキル基（ブチル基
型、オクチル基型、オクチルデシル基型等）、フェニル
基を有する不溶性担体が例示される。好適にはフェニル
基型が挙げられ、具体的にはフェニル−セルロース（商
品名：フェニルセルロファイン、生化学工業社製）、フ
ェニル−アガロース（商品名：フェニル−セファロー
ス、ファルマシア製）等が例示される。吸着、溶出条件
は、精製する目的の蛋白質に応じて好ましい条件を適宜
選択することができる。プロウロキナーゼの場合、接触
条件としてはｐＨ６〜８程度、好ましくはｐＨ７程度、
塩濃度０．５〜１．５Ｍ程度、好ましくは０．５〜０．
８Ｍ程度が挙げられる。溶出条件としてはｐＨ６〜８程
度、好ましくはｐＨ７程度、塩濃度０．１〜１Ｍ程度、
好ましくは０．０５〜０．５Ｍ程度、より好ましくは
０．２Ｍ程度である。
【００２７】陽イオン交換体処理もまた、常法に従って
行うことができる。陽イオン交換体としては、陽イオン
交換基を有する不溶性担体であればいずれも使用するこ
とができる。陽イオン交換基としてはカルボキシメチル
（ＣＭ）基型、スルフォプロピル（ＳＰ）基型等が例示
される。好ましくはＳＰ基型であり、具体的には、ＳＰ
−アガロース（商品名：Ｓ−セファロース、ファルマシ
ア社製）、ＳＰ−デキストラン（商品名：ＳＰ−セファ
デックス、ファルマシア社製）等が例示される。吸着、
溶出条件は、精製する目的の蛋白質に応じて好ましい条
件を適宜選択することができる。プロウロキナーゼの場
合、接触条件としては、ｐＨ６〜８程度、好ましくはｐ
Ｈ７程度、塩濃度０．０１〜０．２Ｍ程度が挙げられ
る。溶出条件としては、ｐＨ６〜８程度、好ましくはｐ
Ｈ７程度、塩濃度０．１〜１Ｍ程度が挙げられる。
行うことができる。陽イオン交換体としては、陽イオン
交換基を有する不溶性担体であればいずれも使用するこ
とができる。陽イオン交換基としてはカルボキシメチル
（ＣＭ）基型、スルフォプロピル（ＳＰ）基型等が例示
される。好ましくはＳＰ基型であり、具体的には、ＳＰ
−アガロース（商品名：Ｓ−セファロース、ファルマシ
ア社製）、ＳＰ−デキストラン（商品名：ＳＰ−セファ
デックス、ファルマシア社製）等が例示される。吸着、
溶出条件は、精製する目的の蛋白質に応じて好ましい条
件を適宜選択することができる。プロウロキナーゼの場
合、接触条件としては、ｐＨ６〜８程度、好ましくはｐ
Ｈ７程度、塩濃度０．０１〜０．２Ｍ程度が挙げられ
る。溶出条件としては、ｐＨ６〜８程度、好ましくはｐ
Ｈ７程度、塩濃度０．１〜１Ｍ程度が挙げられる。
【００２８】
【発明の作用・効果】本発明によれば、遺伝子工学的手
法もしくは醗酵法により製造されるプロテアーゼで低分
子化されうる蛋白質を完全体の状態で大量に製造するこ
とができる。すなわち、本発明でいう培地で該蛋白質を
分泌発現する宿主細胞を培養することにより、宿主細胞
の増殖の亢進、該蛋白質の産生量の向上、宿主細胞から
の分泌が促進される。また、本発明によれば、培養上清
中に分泌された該蛋白質の低分子化を有効に抑制するこ
とができる。なかでも、本発明で用いる非イオン性界面
活性剤は、宿主細胞の増殖や蛋白質の分解抑制には直接
寄与しないが、蛋白質の器具等への吸着等による消失を
抑制する効果を奏する。アミノ酸、就中アルギニンやグ
ルタミン酸は宿主細胞の増殖を亢進し、産生される蛋白
質の分解を抑制する効果を奏する。またリン酸アンモニ
ウムは蛋白質の分解を効果的に抑制する。しかもこれら
のものを組み合わせることにより、宿主細胞の増殖およ
び蛋白質の産生分泌は相乗的に向上する。さらに本発明
の単離方法によれば、精製段階で低分子化されやすい蛋
白質の分解を有効に抑制し、完全体の蛋白質を高い収率
で効率よく精製単離することができる。また、本発明に
より、初めてプロウロキナーゼを分泌産生することがで
きるピキア酵母（形質転換体）を提供することができ
る。
法もしくは醗酵法により製造されるプロテアーゼで低分
子化されうる蛋白質を完全体の状態で大量に製造するこ
とができる。すなわち、本発明でいう培地で該蛋白質を
分泌発現する宿主細胞を培養することにより、宿主細胞
の増殖の亢進、該蛋白質の産生量の向上、宿主細胞から
の分泌が促進される。また、本発明によれば、培養上清
中に分泌された該蛋白質の低分子化を有効に抑制するこ
とができる。なかでも、本発明で用いる非イオン性界面
活性剤は、宿主細胞の増殖や蛋白質の分解抑制には直接
寄与しないが、蛋白質の器具等への吸着等による消失を
抑制する効果を奏する。アミノ酸、就中アルギニンやグ
ルタミン酸は宿主細胞の増殖を亢進し、産生される蛋白
質の分解を抑制する効果を奏する。またリン酸アンモニ
ウムは蛋白質の分解を効果的に抑制する。しかもこれら
のものを組み合わせることにより、宿主細胞の増殖およ
び蛋白質の産生分泌は相乗的に向上する。さらに本発明
の単離方法によれば、精製段階で低分子化されやすい蛋
白質の分解を有効に抑制し、完全体の蛋白質を高い収率
で効率よく精製単離することができる。また、本発明に
より、初めてプロウロキナーゼを分泌産生することがで
きるピキア酵母（形質転換体）を提供することができ
る。
【００２９】
【実施例・実験例】本発明をより詳細に説明するため
に、以下に実施例、実験例および参考例を挙げるが、本
発明はこれらにより何ら限定されるものではない。ここ
で用いた全ての酵素は、とくに断らない限り商業的供給
源、例えば宝酒造株式会社等から入手したものである。
酵素反応のための緩衝液および反応条件は特に断らない
限り各酵素の製造元の推奨に従った。
に、以下に実施例、実験例および参考例を挙げるが、本
発明はこれらにより何ら限定されるものではない。ここ
で用いた全ての酵素は、とくに断らない限り商業的供給
源、例えば宝酒造株式会社等から入手したものである。
酵素反応のための緩衝液および反応条件は特に断らない
限り各酵素の製造元の推奨に従った。
【００３０】実施例１ プロウロキナーゼ発現ベクタ
ー、ｐＫＯ１２６の構築 ｐＵＣ１９をＨｉｎｄIII で消化した後に、ＤＮＡポリ
メラーゼのクレノウ断片でfill-in を行い、pXhoI リン
カー[d(pCCTCGAGG)]を付加してライゲーションした。ア
ンピシリン、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピ
ラノシド（ＩＰＴＧ )、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ＧＡＬ）を含
むＬＢ培地中で青色を呈するコロニーから調製したプラ
スミドをｐＫＯ１１０と命名した。当該プラスミドの大
きさはｐＵＣ１９と大差がなく欠失がないことが予想さ
れ、またＸｈｏＩ認識部位を有していることが確認され
た。尚、このプラスミドを有する形質転換体がＩＰＴ
Ｇ、Ｘ−ＧＡＬを含むＬＢ培地上で青色を呈した理由は
挿入したＤＮＡ断片が短く、かつ挿入によって遺伝子の
読み枠がずれなかったためであると推測される。
ー、ｐＫＯ１２６の構築 ｐＵＣ１９をＨｉｎｄIII で消化した後に、ＤＮＡポリ
メラーゼのクレノウ断片でfill-in を行い、pXhoI リン
カー[d(pCCTCGAGG)]を付加してライゲーションした。ア
ンピシリン、イソプロピル−β−Ｄ−チオ−ガラクトピ
ラノシド（ＩＰＴＧ )、５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−ＧＡＬ）を含
むＬＢ培地中で青色を呈するコロニーから調製したプラ
スミドをｐＫＯ１１０と命名した。当該プラスミドの大
きさはｐＵＣ１９と大差がなく欠失がないことが予想さ
れ、またＸｈｏＩ認識部位を有していることが確認され
た。尚、このプラスミドを有する形質転換体がＩＰＴ
Ｇ、Ｘ−ＧＡＬを含むＬＢ培地上で青色を呈した理由は
挿入したＤＮＡ断片が短く、かつ挿入によって遺伝子の
読み枠がずれなかったためであると推測される。
【００３１】ムコール・レニン遺伝子由来のシグナル配
列とプロウロキナーゼｃＤＮＡをinframe で接続した遺
伝子を含む Saccharomyces cerevisiae 用の発現ベクタ
ーであるプラスミドＪＵＫ１（平松ら、Gene, 99, 235-
241, 1991)をＢｇｌIIで部分消化した後に、ＰｓｔＩで
消化して、シグナル配列の一部とプロウロキナーゼｃＤ
ＮＡの一部を含む３３０ｂｐの断片を分離した。なお、
後記配列表配列番号１にプラスミドＪＵＫ１が含有する
ムコール・レニン遺伝子由来のシグナル配列のアミノ酸
配列及び塩基配列を示す。ＯＰＣカラム（アプライド・
バイオシステムズジャパン社製）を用いて精製した５μ
ｇずつのリンカーａとｂ（表１）にＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼとＡＴＰを添加して３７℃で３０分間孵置し
て、５’末端をリン酸化した。
列とプロウロキナーゼｃＤＮＡをinframe で接続した遺
伝子を含む Saccharomyces cerevisiae 用の発現ベクタ
ーであるプラスミドＪＵＫ１（平松ら、Gene, 99, 235-
241, 1991)をＢｇｌIIで部分消化した後に、ＰｓｔＩで
消化して、シグナル配列の一部とプロウロキナーゼｃＤ
ＮＡの一部を含む３３０ｂｐの断片を分離した。なお、
後記配列表配列番号１にプラスミドＪＵＫ１が含有する
ムコール・レニン遺伝子由来のシグナル配列のアミノ酸
配列及び塩基配列を示す。ＯＰＣカラム（アプライド・
バイオシステムズジャパン社製）を用いて精製した５μ
ｇずつのリンカーａとｂ（表１）にＴ４ポリヌクレオチ
ドキナーゼとＡＴＰを添加して３７℃で３０分間孵置し
て、５’末端をリン酸化した。
【００３２】
【表１】
【００３３】これらリンカーａ，ｂを混合して７０℃で
２０分間加熱した後、室温に放置して徐冷した。アニー
リングしたリンカーとプラスミドＪＵＫ１から調製した
３３０ｂｐのＰｓｔＩ−ＢｇｌII断片を混合してライゲ
ーションした後、エタノール沈澱を行いＤＮＡを回収し
た。沈澱をＴＥに溶解後、ＰｓｔＩ−ＢｇｌII断片を混
合してライゲーション後、エタノール沈澱を行いＤＮＡ
を回収した。該沈澱をＴＥに溶解後、ＰｓｔＩ−Ｘｈｏ
Ｉで消化して３６０ｂｐの断片を分離した。この断片を
ｐＫＯ１１０から調製した。２．７ｋｂのＰｓｔＩ−Ｘ
ｈｏＩ断片とライゲーションした後に大腸菌に導入して
形質転換を行った。３９クローンのアンピシリン耐性コ
ロニーからプラスミドを分離した。制限酵素消化による
一次スクリーニングを行い６クローンのプラスミドを選
びだして、導入したリンカー近傍の塩基配列をリキッド
フェーズ・シークエンサー（ファルマシア社製）で調べ
たところ、５クローンの塩基配列は期待通りの配列であ
った（配列表、配列番号２）。２クローンを選び出して
ｐＫＯ１１３およびｐＫＯ１１４（３．０５ｋｂ）と命
名した（図１）。ムコール・レニンのシグナル配列とプ
ロウロキナーゼｃＤＮＡをinframe で接続した遺伝子を
含む Saccharomyces cerevisiae 用の発現ベクターであ
るプラスミドＮ３２２Ｑから調製した８９０ｂｐのＰｓ
ｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ１９にクローニングして
ｐＫＯ１１１を得た。さらにｐＫＯ１１１から８９０ｂ
ｐのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を調製して、該断片をｐ
ＫＯ１１３のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ部位へクローニング
してプラスミドｐＫＯ１１６およびｐＫＯ１１７（３．
９５ｋｂ）を得た（図２）。ｐＫＯ１１６をＢａｍＨＩ
とＫｐｎＩで消化して３．９５ｋｂのＤＮＡ断片を分離
した。一方、プロウロキナーゼｃＤＮＡを含む哺乳類細
胞用発現ベクターであるｐＳＶ−Ｇ１−ＵＫをＢａｍＨ
ＩとＫｐｎＩで消化して３２０ｂｐのＤＮＡ断片を取得
し、ｐＫＯ１１６のＤＮＡ断片（３．９５ｋｂ）にライ
ゲートしてプラスミドｐＫＯ１１８を得た。ｐＫＯ１１
８をＫｐｎＩで消化した後にＴ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて平滑末端とした後、ｐＸｈｏＩリンカー（宝酒造
社製）を付加した。ＸｈｏＩ消化によって、１．５７ｋ
ｂの断片を分離してｐＫＯ１１０のＸｈｏＩサイトへク
ローニングしてプラスミドｐＫＯ１２１を得た。ｐＫＯ
１２１をＸｈｏＩで消化して１．５７ｋｂのＤＮＡ断片
を分離して、ｐＡＯ８０７ＮＸ〔プラスミドｐＨＩＬ−
Ｄ２（インビトロゲン社製）をプラスミドｐＨＩＬ−Ｄ
２をＥｃｏＲＩ消化し、クレノウ断片によりfill-in
し、ｐＸｈｏＩリンカーを付加したのち、ＸｈｏＩ消化
した断片を分離してライゲーション反応を行い調製し
た。〕のクローニング部位であるＥｃｏＲＩ認識部位を
ＸｈｏＩ認識部位に変換したプラスミド〕のＸｈｏＩサ
イトにクローニングをした。インサートの方向が順方向
であるｐＫＯ１２６を分離した（図３、図４）。
２０分間加熱した後、室温に放置して徐冷した。アニー
リングしたリンカーとプラスミドＪＵＫ１から調製した
３３０ｂｐのＰｓｔＩ−ＢｇｌII断片を混合してライゲ
ーションした後、エタノール沈澱を行いＤＮＡを回収し
た。沈澱をＴＥに溶解後、ＰｓｔＩ−ＢｇｌII断片を混
合してライゲーション後、エタノール沈澱を行いＤＮＡ
を回収した。該沈澱をＴＥに溶解後、ＰｓｔＩ−Ｘｈｏ
Ｉで消化して３６０ｂｐの断片を分離した。この断片を
ｐＫＯ１１０から調製した。２．７ｋｂのＰｓｔＩ−Ｘ
ｈｏＩ断片とライゲーションした後に大腸菌に導入して
形質転換を行った。３９クローンのアンピシリン耐性コ
ロニーからプラスミドを分離した。制限酵素消化による
一次スクリーニングを行い６クローンのプラスミドを選
びだして、導入したリンカー近傍の塩基配列をリキッド
フェーズ・シークエンサー（ファルマシア社製）で調べ
たところ、５クローンの塩基配列は期待通りの配列であ
った（配列表、配列番号２）。２クローンを選び出して
ｐＫＯ１１３およびｐＫＯ１１４（３．０５ｋｂ）と命
名した（図１）。ムコール・レニンのシグナル配列とプ
ロウロキナーゼｃＤＮＡをinframe で接続した遺伝子を
含む Saccharomyces cerevisiae 用の発現ベクターであ
るプラスミドＮ３２２Ｑから調製した８９０ｂｐのＰｓ
ｔＩ−ＢａｍＨＩ断片をｐＵＣ１９にクローニングして
ｐＫＯ１１１を得た。さらにｐＫＯ１１１から８９０ｂ
ｐのＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ断片を調製して、該断片をｐ
ＫＯ１１３のＰｓｔＩ−ＢａｍＨＩ部位へクローニング
してプラスミドｐＫＯ１１６およびｐＫＯ１１７（３．
９５ｋｂ）を得た（図２）。ｐＫＯ１１６をＢａｍＨＩ
とＫｐｎＩで消化して３．９５ｋｂのＤＮＡ断片を分離
した。一方、プロウロキナーゼｃＤＮＡを含む哺乳類細
胞用発現ベクターであるｐＳＶ−Ｇ１−ＵＫをＢａｍＨ
ＩとＫｐｎＩで消化して３２０ｂｐのＤＮＡ断片を取得
し、ｐＫＯ１１６のＤＮＡ断片（３．９５ｋｂ）にライ
ゲートしてプラスミドｐＫＯ１１８を得た。ｐＫＯ１１
８をＫｐｎＩで消化した後にＴ４ＤＮＡポリメラーゼを
用いて平滑末端とした後、ｐＸｈｏＩリンカー（宝酒造
社製）を付加した。ＸｈｏＩ消化によって、１．５７ｋ
ｂの断片を分離してｐＫＯ１１０のＸｈｏＩサイトへク
ローニングしてプラスミドｐＫＯ１２１を得た。ｐＫＯ
１２１をＸｈｏＩで消化して１．５７ｋｂのＤＮＡ断片
を分離して、ｐＡＯ８０７ＮＸ〔プラスミドｐＨＩＬ−
Ｄ２（インビトロゲン社製）をプラスミドｐＨＩＬ−Ｄ
２をＥｃｏＲＩ消化し、クレノウ断片によりfill-in
し、ｐＸｈｏＩリンカーを付加したのち、ＸｈｏＩ消化
した断片を分離してライゲーション反応を行い調製し
た。〕のクローニング部位であるＥｃｏＲＩ認識部位を
ＸｈｏＩ認識部位に変換したプラスミド〕のＸｈｏＩサ
イトにクローニングをした。インサートの方向が順方向
であるｐＫＯ１２６を分離した（図３、図４）。
【００３４】実施例２ 形質転換体の取得 実施例１で得られたｐＫＯ１２６（１０μｇ）をザイモ
リレース消化後、塩化カルシウム処理してコンピテント
な状態にしたピキア酵母（Pichia pastoris ＧＴＳ１１
５：ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）懸濁液１００μ
ｌに導入し、ＨＩＳ+ の形質転換体を選択した。該形質
転換体をＳＤ〔０．６７％ 非含有アミノ酸ＹＮＢ，２
％デキストロース〕プレート上でストロークして単一コ
ロニーを分離した。ｐＫＯ１２６を導入した形質転換体
として３０クローンを分離してＳＣ０１〜ＳＣ３０と名
付けた。
リレース消化後、塩化カルシウム処理してコンピテント
な状態にしたピキア酵母（Pichia pastoris ＧＴＳ１１
５：ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）懸濁液１００μ
ｌに導入し、ＨＩＳ+ の形質転換体を選択した。該形質
転換体をＳＤ〔０．６７％ 非含有アミノ酸ＹＮＢ，２
％デキストロース〕プレート上でストロークして単一コ
ロニーを分離した。ｐＫＯ１２６を導入した形質転換体
として３０クローンを分離してＳＣ０１〜ＳＣ３０と名
付けた。
【００３５】上記で得られたプロウロキナーゼ分泌発現
株ＳＣ０１〜ＳＣ３０の中からプロウロキナーゼ産生量
の多い株を選択するために、各株の性状を調べた。 （１）ＨＩＳ４遺伝子の安定性 ＳＣ０２，０６，０８，１０，１２，１３，１８，１
９，２０，２２，２４，２５，２８及びＳＣ２９の１４
株をＹＰＤプレートに蒔き、３０℃で２日間培養した。
単一コロニーを１０クローンづつ、ＨＩＳ+ 選択プレー
ト〔Noble agar 15g, sorbitol 91g, glucose 10g, YNB
(w/o) 3.35g, Biotin 0.2mg/500ml 〕に植菌し、３０℃
で２日間培養した。全てのコロニーの増殖が観察され、
いずれもＨＩＳ４遺伝子を安定に保持しているものと考
えられた。
株ＳＣ０１〜ＳＣ３０の中からプロウロキナーゼ産生量
の多い株を選択するために、各株の性状を調べた。 （１）ＨＩＳ４遺伝子の安定性 ＳＣ０２，０６，０８，１０，１２，１３，１８，１
９，２０，２２，２４，２５，２８及びＳＣ２９の１４
株をＹＰＤプレートに蒔き、３０℃で２日間培養した。
単一コロニーを１０クローンづつ、ＨＩＳ+ 選択プレー
ト〔Noble agar 15g, sorbitol 91g, glucose 10g, YNB
(w/o) 3.35g, Biotin 0.2mg/500ml 〕に植菌し、３０℃
で２日間培養した。全てのコロニーの増殖が観察され、
いずれもＨＩＳ４遺伝子を安定に保持しているものと考
えられた。
【００３６】（２）培養 上記の１４株を３０ｍｌ試験管中５ｍｌのＹＰＭ1 培地
（メタノール１％含有）で３０℃培養を行い、４６，７
０，９９時間後のプロウロキナーゼ活性（ＰＡ活性を指
標として測定）、ＲＰＨＡ、Ａ540 を測定した。その結
果、ＰＡ活性は、ＳＣ０６，０８，１２が比較的高かっ
た。Ａ540 は吸光度が２０以下のもの（ＳＣ０６，０
８，１０，１９，２２）と、３０以上のもの（ＳＣ０
２，１２，１３，１８，２０，２４，２５，２８，２
９）とに大別された。これらの株のうちＵＫ活性が比較
的高く増殖度の悪いＳＣ０６と増殖度の良いＳＣ１２を
５０ｍｌＹＰＭ／３００ｍｌフラスコでメタノール濃度
を１，２，３，４，５％に変えた条件で培養した。その
結果、ＳＣ０６ではメタノール濃度２％および３％の培
地での７１時間培養で約２０ＩＵ／ｍｌ、ＳＣ１２では
メタノール濃度３％の培地での７１時間培養で約４．６
ＩＵ／ｍｌの発現が認められた。
（メタノール１％含有）で３０℃培養を行い、４６，７
０，９９時間後のプロウロキナーゼ活性（ＰＡ活性を指
標として測定）、ＲＰＨＡ、Ａ540 を測定した。その結
果、ＰＡ活性は、ＳＣ０６，０８，１２が比較的高かっ
た。Ａ540 は吸光度が２０以下のもの（ＳＣ０６，０
８，１０，１９，２２）と、３０以上のもの（ＳＣ０
２，１２，１３，１８，２０，２４，２５，２８，２
９）とに大別された。これらの株のうちＵＫ活性が比較
的高く増殖度の悪いＳＣ０６と増殖度の良いＳＣ１２を
５０ｍｌＹＰＭ／３００ｍｌフラスコでメタノール濃度
を１，２，３，４，５％に変えた条件で培養した。その
結果、ＳＣ０６ではメタノール濃度２％および３％の培
地での７１時間培養で約２０ＩＵ／ｍｌ、ＳＣ１２では
メタノール濃度３％の培地での７１時間培養で約４．６
ＩＵ／ｍｌの発現が認められた。
【００３７】（３）ウェスタンブロット ＳＣ０２，０６，１３およびＳＣ２８について、ＹＰＭ
1 培地（メタノール１％）およびＹＰＭ4 培地（メタノ
ール４％）でそれぞれ２日間培養して、得られた培養上
清のウェスタンブロットを行った。ＹＰＭ4 培地の培養
上清に約５０Ｋのバンドが認められ、特にＳＣ０６でそ
のバンドが濃かった。
1 培地（メタノール１％）およびＹＰＭ4 培地（メタノ
ール４％）でそれぞれ２日間培養して、得られた培養上
清のウェスタンブロットを行った。ＹＰＭ4 培地の培養
上清に約５０Ｋのバンドが認められ、特にＳＣ０６でそ
のバンドが濃かった。
【００３８】（４）サザンブロット ＳＣ０２，０６，１０，１２，１９，２２，２９および
ピキア酵母ＧＴＳ１１５からそれぞれＤＮＡを抽出し、
染色体上の発現カセットの存在状態をサザン法により調
べた。プローブはＡＯＸ１プロモーターに相当するｐＨ
ＩＬ−Ｄ２（インビトロゲン社製）をＮｏｔＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ消化した０．９Ｋｂ断片とウロキナーゼの構造遺伝
子に相当するｐＭＴ０１５（ｐＵＣ１８にプロウロキナ
ーゼのｃＤＮＡが組み込まれたベクター）のＸｈｏＩ消
化１．２Ｋｂ断片を使用し、ＫｐｎＩ，ＰｓｔＩ，Ｎｃ
ｏＩで消化したＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーション
を行った。これらの結果から、増殖度が悪くかつＰＡ活
性も低いＳＣ１０，１９および２２株は発現カセットが
シングルコピーでＡＯＸ１サイトに置換された状態で存
在していると予想された。また増殖度は悪いがＰＡ活性
が高いＳＣ０６株は発現カセットがダブルコピーでＡＯ
Ｘ１サイトに置換された状態で存在していた。一方、増
殖度の良いＳＣ０２および１２株は発現カセットがマル
チコピーでＡＯＸ１サイトに挿入された形で組み込まれ
ており、ＳＣ２９株は発現カセットがＡＯＸ１サイト以
外のサイトに組み込まれていると予想された（表２）。
尚、表中Ｓとは、ｓｌｏｗを意味する。
ピキア酵母ＧＴＳ１１５からそれぞれＤＮＡを抽出し、
染色体上の発現カセットの存在状態をサザン法により調
べた。プローブはＡＯＸ１プロモーターに相当するｐＨ
ＩＬ−Ｄ２（インビトロゲン社製）をＮｏｔＩ−Ｅｃｏ
ＲＩ消化した０．９Ｋｂ断片とウロキナーゼの構造遺伝
子に相当するｐＭＴ０１５（ｐＵＣ１８にプロウロキナ
ーゼのｃＤＮＡが組み込まれたベクター）のＸｈｏＩ消
化１．２Ｋｂ断片を使用し、ＫｐｎＩ，ＰｓｔＩ，Ｎｃ
ｏＩで消化したＤＮＡ断片とのハイブリダイゼーション
を行った。これらの結果から、増殖度が悪くかつＰＡ活
性も低いＳＣ１０，１９および２２株は発現カセットが
シングルコピーでＡＯＸ１サイトに置換された状態で存
在していると予想された。また増殖度は悪いがＰＡ活性
が高いＳＣ０６株は発現カセットがダブルコピーでＡＯ
Ｘ１サイトに置換された状態で存在していた。一方、増
殖度の良いＳＣ０２および１２株は発現カセットがマル
チコピーでＡＯＸ１サイトに挿入された形で組み込まれ
ており、ＳＣ２９株は発現カセットがＡＯＸ１サイト以
外のサイトに組み込まれていると予想された（表２）。
尚、表中Ｓとは、ｓｌｏｗを意味する。
【００３９】
【表２】
【００４０】実施例３ 形質転換体の培養 実施例１〜２で得られたプロウロキナーゼ分泌発現ベク
ターＳＣ０６株をＹＰＤ培地で３０℃、２日間２回植え
継ぎながら前培養し、メタノール２％含有のＹＰＭ2 培
地に０．０１％トライトンＸ−１００、０．１Ｍアルギ
ニン塩酸、２％（ＮＨ4 ) 2 ＨＰＯ4 および２％ＮＨ4
Ｈ2 ＰＯ4 を配合してなる培地０．５リットルに５４０
ｎｍの吸光度（Ａ540 ）が０．１となるように植菌し、
３０℃で３日間培養した。
ターＳＣ０６株をＹＰＤ培地で３０℃、２日間２回植え
継ぎながら前培養し、メタノール２％含有のＹＰＭ2 培
地に０．０１％トライトンＸ−１００、０．１Ｍアルギ
ニン塩酸、２％（ＮＨ4 ) 2 ＨＰＯ4 および２％ＮＨ4
Ｈ2 ＰＯ4 を配合してなる培地０．５リットルに５４０
ｎｍの吸光度（Ａ540 ）が０．１となるように植菌し、
３０℃で３日間培養した。
【００４１】実施例４ プロウロキナーゼの単離 (1) フェニルセファロース−カラムクロマトグラフィー 実施例３で得られた培養上清２．８６リットルに、２Ｍ
ＮＨ4 ＰＯ4 （ｐＨ７．０）７７２ｍｌを加えて、最
終濃度０．７Ｍ ＮＨ4 ＰＯ4 となるように調製し、当
該溶液を平衡化用緩衝液０．７Ｍ ＮＨ4 ＰＯ4 （ｐＨ
７．０）で平衡化したフェニルセファロースカラム（５
ｃｍ ｉ．ｄ．×７．８ｃｍ：１５０ｍｌ、ファルマシ
ア社製）に１９０ｍｌ／ｈｒの流速で添加した。添加
後、同平衡化用緩衝液７５０ｍｌで洗浄し（washＩ）、
さらに洗浄用緩衝液〔０．５Ｍ ＮＨ4 ＰＯ4 （ｐＨ
７．０）〕７５０ｍｌで洗浄した（washII）。その後、
溶出用緩衝液〔elute I : ０．２Ｍ ＮＨ4 ＰＯ4 （ｐ
Ｈ７．０）〕１２００ｍｌで１５０ｍｌずつ８本分取
し、さらに溶出用緩衝液〔elute II: ０．０５Ｍ ＮＨ
4ＰＯ4 （ｐＨ７．０）〕７５０ｍｌ、溶出用緩衝液〔e
luteIII: １％トライトンＸ−１００，０．０５Ｍ Ｎ
ａＰＯ4 （ｐＨ７．０）〕１リットルで溶出した。各画
分のＰＡ活性を測定すると、パス溶液及びwashＩにはほ
とんど溶出されず、washIIに６％、elute Ｉに９０％、
elute IIとeluteIIIが各々０．４％であり、elute Ｉに
大部分の活性が認められた。次に、各溶出画分について
抗ＵＫ抗体によるウェスタンブロットを行ったところ、
パス溶液及びwashＩにはバンドは認められず、washIIに
は５０Ｋとび４７Ｋとが同程度存在していた。elute II
にはバンドが認められず、eluteIIIには３０ｋ以下の大
部分の分解物が溶出された。elute Ｉでは画分１及び２
に５０Ｋのバンド以外に４７Ｋの明確なバンドが認めら
れ、画分３以降では５０Ｋのメインバンドの他は４７Ｋ
の含量が少なく、４０Ｋ以下の分解物が多少存在してい
た。そこで、４７Ｋの含量が少なくＰＡ活性が高かった
画分３から画分６をプールして、次のステップに供し
た。
ＮＨ4 ＰＯ4 （ｐＨ７．０）７７２ｍｌを加えて、最
終濃度０．７Ｍ ＮＨ4 ＰＯ4 となるように調製し、当
該溶液を平衡化用緩衝液０．７Ｍ ＮＨ4 ＰＯ4 （ｐＨ
７．０）で平衡化したフェニルセファロースカラム（５
ｃｍ ｉ．ｄ．×７．８ｃｍ：１５０ｍｌ、ファルマシ
ア社製）に１９０ｍｌ／ｈｒの流速で添加した。添加
後、同平衡化用緩衝液７５０ｍｌで洗浄し（washＩ）、
さらに洗浄用緩衝液〔０．５Ｍ ＮＨ4 ＰＯ4 （ｐＨ
７．０）〕７５０ｍｌで洗浄した（washII）。その後、
溶出用緩衝液〔elute I : ０．２Ｍ ＮＨ4 ＰＯ4 （ｐ
Ｈ７．０）〕１２００ｍｌで１５０ｍｌずつ８本分取
し、さらに溶出用緩衝液〔elute II: ０．０５Ｍ ＮＨ
4ＰＯ4 （ｐＨ７．０）〕７５０ｍｌ、溶出用緩衝液〔e
luteIII: １％トライトンＸ−１００，０．０５Ｍ Ｎ
ａＰＯ4 （ｐＨ７．０）〕１リットルで溶出した。各画
分のＰＡ活性を測定すると、パス溶液及びwashＩにはほ
とんど溶出されず、washIIに６％、elute Ｉに９０％、
elute IIとeluteIIIが各々０．４％であり、elute Ｉに
大部分の活性が認められた。次に、各溶出画分について
抗ＵＫ抗体によるウェスタンブロットを行ったところ、
パス溶液及びwashＩにはバンドは認められず、washIIに
は５０Ｋとび４７Ｋとが同程度存在していた。elute II
にはバンドが認められず、eluteIIIには３０ｋ以下の大
部分の分解物が溶出された。elute Ｉでは画分１及び２
に５０Ｋのバンド以外に４７Ｋの明確なバンドが認めら
れ、画分３以降では５０Ｋのメインバンドの他は４７Ｋ
の含量が少なく、４０Ｋ以下の分解物が多少存在してい
た。そこで、４７Ｋの含量が少なくＰＡ活性が高かった
画分３から画分６をプールして、次のステップに供し
た。
【００４２】（２）Ｓセファロースカラムクロマトグラ
フィー （１）で得られた画分３から画分６のプール６００ｍｌ
に１％トライトンＸ−１００ １２ｍｌと水５８８ｍｌ
とを加え、平衡化用緩衝液〔０．０１％トライトンＸ−
１００，０．１Ｍ ＮＨ4 ＰＯ4 （ｐＨ７．０）〕で平
衡化したＳセファロースカラム〔２．５ｃｍ ｉ．ｄ．
×６．１ｃｍ：３０ｍｌ、ファルマシア社製〕に流速６
０ｍｌ／ｈｒで添加した。添加後、平衡化用緩衝液１５
０ｍｌで洗浄し（washＩ）、さらに洗浄用緩衝液〔wash
II: ０．１Ｍ ＮａＣｌ ｉｎ０．０５Ｍ ＮａＰ
Ｏ4 ：ｐＨ７．０，０．０１％トライトンＸ−１００〕
１５０ｍｌで洗浄後、溶出用緩衝液〔０．１〜０．５Ｍ
ＮａＣｌ濃度勾配ｉｎ０．０５Ｍ ＮａＰＯ4 （ｐＨ
７．０）、０．０１％トライトンＸ−１００〕３００ｍ
ｌで溶出した。その結果、パス溶出液、washＩ、washII
には、ＰＡ活性は殆ど認められず、０．２〜０．３Ｍ
ＮａＣｌの溶出画分にＰＡ活性が認められ、Ａ280 の吸
光度と一致した。各画分を銀染色でみると、画分４８ま
ではバンドは認められず画分５０から画分５６に５２ｋ
の薄いバンドが存在し、５０ｋバンドは画分５０から画
分６８に存在しており、濃い５０ｋバンドが存在する画
分５７から画分６２には、多少の分解物が確認された。
フィー （１）で得られた画分３から画分６のプール６００ｍｌ
に１％トライトンＸ−１００ １２ｍｌと水５８８ｍｌ
とを加え、平衡化用緩衝液〔０．０１％トライトンＸ−
１００，０．１Ｍ ＮＨ4 ＰＯ4 （ｐＨ７．０）〕で平
衡化したＳセファロースカラム〔２．５ｃｍ ｉ．ｄ．
×６．１ｃｍ：３０ｍｌ、ファルマシア社製〕に流速６
０ｍｌ／ｈｒで添加した。添加後、平衡化用緩衝液１５
０ｍｌで洗浄し（washＩ）、さらに洗浄用緩衝液〔wash
II: ０．１Ｍ ＮａＣｌ ｉｎ０．０５Ｍ ＮａＰ
Ｏ4 ：ｐＨ７．０，０．０１％トライトンＸ−１００〕
１５０ｍｌで洗浄後、溶出用緩衝液〔０．１〜０．５Ｍ
ＮａＣｌ濃度勾配ｉｎ０．０５Ｍ ＮａＰＯ4 （ｐＨ
７．０）、０．０１％トライトンＸ−１００〕３００ｍ
ｌで溶出した。その結果、パス溶出液、washＩ、washII
には、ＰＡ活性は殆ど認められず、０．２〜０．３Ｍ
ＮａＣｌの溶出画分にＰＡ活性が認められ、Ａ280 の吸
光度と一致した。各画分を銀染色でみると、画分４８ま
ではバンドは認められず画分５０から画分５６に５２ｋ
の薄いバンドが存在し、５０ｋバンドは画分５０から画
分６８に存在しており、濃い５０ｋバンドが存在する画
分５７から画分６２には、多少の分解物が確認された。
【００４３】（３）濃縮 （２）のステップで５２ｋ蛋白が含まれず、５０ｋ蛋白
の含量が多かった画分をプールし、限外濾過膜（FILTRO
N STRRED CELLS: フィルトロン・テクノロジー社製）で
濃縮した。濃縮液１０ｍｌのＰＡ活性は４３０００ＩＵ
／ｍｌであり、９０％の回収率が認められた。また、パ
ス画分５２ｍｌには１０５０ＩＵ／ｍｌのＰＡ活性が認
められた。各ステップ毎に蛋白量（modified Lowry法、
Bensadoun A. & Weinstein D.:Anal. Biochem., 70, 24
1-250, 1976)、、ＰＡ活性、比活性、回収率、精製度を
求めた（表３）。
の含量が多かった画分をプールし、限外濾過膜（FILTRO
N STRRED CELLS: フィルトロン・テクノロジー社製）で
濃縮した。濃縮液１０ｍｌのＰＡ活性は４３０００ＩＵ
／ｍｌであり、９０％の回収率が認められた。また、パ
ス画分５２ｍｌには１０５０ＩＵ／ｍｌのＰＡ活性が認
められた。各ステップ毎に蛋白量（modified Lowry法、
Bensadoun A. & Weinstein D.:Anal. Biochem., 70, 24
1-250, 1976)、、ＰＡ活性、比活性、回収率、精製度を
求めた（表３）。
【００４４】
【表３】
【００４５】フェニルセファロースの溶出段階で蛋白量
は１％程度まで減少し、精製度は６０倍に上昇した。さ
らにＳセファロースの溶出段階で、精製度は１４１倍ま
で上昇し、最後の濃縮液ではＰＡ活性が４．３×１０5
ＩＵ、蛋白量が２．８ｍｇ、比活性が１．５×１０5 Ｉ
Ｕ／ｍｇ、回収率４５％、精製度が１５５倍であった。
は１％程度まで減少し、精製度は６０倍に上昇した。さ
らにＳセファロースの溶出段階で、精製度は１４１倍ま
で上昇し、最後の濃縮液ではＰＡ活性が４．３×１０5
ＩＵ、蛋白量が２．８ｍｇ、比活性が１．５×１０5 Ｉ
Ｕ／ｍｇ、回収率４５％、精製度が１５５倍であった。
【００４６】（４）得られたプロウロキナーゼの性状の
確認 得られた精製プロウロキナーゼの酵素的性状を確認する
ためにＫｍ値を求め、人腎細胞により産生された天然の
プロウロキナーゼ（以下、トロンボリーゼという。）の
Ｋｍ値と比較した。その結果、合成基質Ｓ−２４４４
（発色合成試薬、Kabi-Vitrium社製）に対するＫｍ値は
トロンボリーゼで６９μＭ、本発明のプロウロキナーゼ
で７５μＭとほぼ同一の結果が得られた。また、プラス
ミンによるプロウロキナーゼの活性下の経時的変化もト
ロンボリーゼの場合と比べて大きな差はなかった。
確認 得られた精製プロウロキナーゼの酵素的性状を確認する
ためにＫｍ値を求め、人腎細胞により産生された天然の
プロウロキナーゼ（以下、トロンボリーゼという。）の
Ｋｍ値と比較した。その結果、合成基質Ｓ−２４４４
（発色合成試薬、Kabi-Vitrium社製）に対するＫｍ値は
トロンボリーゼで６９μＭ、本発明のプロウロキナーゼ
で７５μＭとほぼ同一の結果が得られた。また、プラス
ミンによるプロウロキナーゼの活性下の経時的変化もト
ロンボリーゼの場合と比べて大きな差はなかった。
【００４７】さらに得られた精製プロウロキナーゼのＮ
末端アミノ酸配列を決定した。（３）で得られた濃縮液
３０μｌに２Ｘ ＢＪを３０μｌを加え、９５℃で５分
間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧプレート（１０／２０、第一
化学）に１５μｌづつ４レーンにアプライし、電気泳動
後、ＰＶＤＦ膜に７０ｍＡで一夜４℃でブロッティング
した。ブロッティング緩衝液は２５ｍＭトリス，１９２
ｍＭグリシン，２０％メタノールを使用した。ブロッテ
ィング後、膜を蒸留水で５分間２回洗浄し、クマーシー
染色液（０．１％ＣＢＢ Ｒ−２５０ ｉｎ ５０％メ
タノール）１００ｍｌに１０分間漬け、脱色液（５０％
メタノール、１０％酢酸）８０ｍｌで５分間３回脱色
し、さらに蒸留水１００ｍｌで１０分間、６回洗浄し
た。最後に６０％メタノールで１回洗浄し、風乾した。
５０Ｋ付近のバンドを切り取り、このペプチドのＮ末端
アミノ酸分析を行った。この結果、Ｎ末端アミノ酸配列
は、Ser-Asn-Glu-Leu-X-Gln-Val-Pro-Ser-Asn-Cys-Asp-
Cys-Leu-Asn-Gly-Gly-Thr であり、ヒト腎細胞由来のプ
ロウロキナーゼのＮ末端アミノ酸配列と一致した。ま
た、用いた発現ベクターはMucor renninのシグナル配列
にプロウロキナーゼのｃＤＮＡを接続した態様のもので
あるが、正常な位置でプロセッシングを受けプロウロキ
ナーゼを産生することが確認された。
末端アミノ酸配列を決定した。（３）で得られた濃縮液
３０μｌに２Ｘ ＢＪを３０μｌを加え、９５℃で５分
間加熱し、ＳＤＳ−ＰＡＧプレート（１０／２０、第一
化学）に１５μｌづつ４レーンにアプライし、電気泳動
後、ＰＶＤＦ膜に７０ｍＡで一夜４℃でブロッティング
した。ブロッティング緩衝液は２５ｍＭトリス，１９２
ｍＭグリシン，２０％メタノールを使用した。ブロッテ
ィング後、膜を蒸留水で５分間２回洗浄し、クマーシー
染色液（０．１％ＣＢＢ Ｒ−２５０ ｉｎ ５０％メ
タノール）１００ｍｌに１０分間漬け、脱色液（５０％
メタノール、１０％酢酸）８０ｍｌで５分間３回脱色
し、さらに蒸留水１００ｍｌで１０分間、６回洗浄し
た。最後に６０％メタノールで１回洗浄し、風乾した。
５０Ｋ付近のバンドを切り取り、このペプチドのＮ末端
アミノ酸分析を行った。この結果、Ｎ末端アミノ酸配列
は、Ser-Asn-Glu-Leu-X-Gln-Val-Pro-Ser-Asn-Cys-Asp-
Cys-Leu-Asn-Gly-Gly-Thr であり、ヒト腎細胞由来のプ
ロウロキナーゼのＮ末端アミノ酸配列と一致した。ま
た、用いた発現ベクターはMucor renninのシグナル配列
にプロウロキナーゼのｃＤＮＡを接続した態様のもので
あるが、正常な位置でプロセッシングを受けプロウロキ
ナーゼを産生することが確認された。
【００４８】実験例１ 培地中の各添加物の影響 培地中の各添加物のプロウロキナーゼ産生等に対する影
響をみるために、ＹＰＭ2 培地（１％酵母抽出物、２％
バクトペプトン、２％メタノール）の各添加物を添加し
た５種類のメタノール培地を調製した 培地１： YPM2 培地２： YPM2 ＋0.01% TritonX-100 培地３： YPM2 ＋0.1M Arginie-HCl 培地４： YPM2 ＋2% (NH4 ) 2 HPO 4 ＋2% NH 4 H 2 PO
4 培地５： YPM2 ＋0.01% TritonX-100 ＋0.1M Arginie-H
Cl＋2% (NH4 ) 2 HPO 4＋2% NH 4 H 2 PO4 実施例１〜２で得られたプロウロキナーゼ分泌発現ベク
ターＳＣ０６株をＹＰＤ培地で３０℃、２日間２回植え
継ぎながら培養し、３００ｍｌ容のフラスコにいれた上
記５種類（培地１〜培地５）のメタノール培地５０ｍｌ
に５４０ｎｍの吸光度（Ａ540 ）が０．１となるように
植菌し（ｎ＝３）、３０℃で７日間培養した。２４時間
毎にサンプリングを行い、Ａ540 測定、ＰＡ活性測定、
抗ＵＫ抗体によるウェスタンブロットを行った。菌体の
増殖曲線を図５に示す。培地１と培地２はほぼ同じ曲線
を示し、２日目でＡ540 が２１〜２３になり、その後漸
減した。培地３では３日目では４１．４まで上昇し、そ
の後漸減した。培地４と培地５では１日目の増殖は非常
に遅かったが、その後増殖速度が早くなり、培地４では
４日目に３６．４、培地５では４２．１まで増加し、そ
の後漸減した。
響をみるために、ＹＰＭ2 培地（１％酵母抽出物、２％
バクトペプトン、２％メタノール）の各添加物を添加し
た５種類のメタノール培地を調製した 培地１： YPM2 培地２： YPM2 ＋0.01% TritonX-100 培地３： YPM2 ＋0.1M Arginie-HCl 培地４： YPM2 ＋2% (NH4 ) 2 HPO 4 ＋2% NH 4 H 2 PO
4 培地５： YPM2 ＋0.01% TritonX-100 ＋0.1M Arginie-H
Cl＋2% (NH4 ) 2 HPO 4＋2% NH 4 H 2 PO4 実施例１〜２で得られたプロウロキナーゼ分泌発現ベク
ターＳＣ０６株をＹＰＤ培地で３０℃、２日間２回植え
継ぎながら培養し、３００ｍｌ容のフラスコにいれた上
記５種類（培地１〜培地５）のメタノール培地５０ｍｌ
に５４０ｎｍの吸光度（Ａ540 ）が０．１となるように
植菌し（ｎ＝３）、３０℃で７日間培養した。２４時間
毎にサンプリングを行い、Ａ540 測定、ＰＡ活性測定、
抗ＵＫ抗体によるウェスタンブロットを行った。菌体の
増殖曲線を図５に示す。培地１と培地２はほぼ同じ曲線
を示し、２日目でＡ540 が２１〜２３になり、その後漸
減した。培地３では３日目では４１．４まで上昇し、そ
の後漸減した。培地４と培地５では１日目の増殖は非常
に遅かったが、その後増殖速度が早くなり、培地４では
４日目に３６．４、培地５では４２．１まで増加し、そ
の後漸減した。
【００４９】フィブリンプレート法によるＰＡ活性を図
６に示す。培地１では３日目で７１ＩＵ／ｍｌまで上昇
し、その後減少したが、培地２では３倍以上、培地３で
は約４倍の活性上昇が認められた。培地４では培地２よ
りも低く、約２倍程度であった。全ての添加物を加えた
培地５では活性が著しく上昇し、５日目では８６７ＩＵ
／ｍｌであった。
６に示す。培地１では３日目で７１ＩＵ／ｍｌまで上昇
し、その後減少したが、培地２では３倍以上、培地３で
は約４倍の活性上昇が認められた。培地４では培地２よ
りも低く、約２倍程度であった。全ての添加物を加えた
培地５では活性が著しく上昇し、５日目では８６７ＩＵ
／ｍｌであった。
【００５０】２日目から６日目までの培養上清をウエス
タンブロットにより経時的に観察した。培地１ではＰＡ
活性が出現した２日目ですでに完全型プロウロキナーゼ
の５０ＫＤａバンドはほとんど認められず、３３ＫＤａ
と２９ＫＤａのバンドが主であり、その後３３ＫＤａバ
ンドは減少し、２９ＫＤａバンドのみが残った。培地２
の場合も培地１と同様の傾向であった。培地３では２日
目で５０ＫＤａと４７ＫＤａのバンドが等量存在し、３
日目で５０ＫＤａバンドが減少し、５日目以降５０ＫＤ
ａ、４７ＫＤａバンドが消失し、２９ＫＤａから３５Ｋ
Ｄａの分解物が増加した。培地４では３日目までは５０
ＫＤａバンドが主であったが、その後減少した。しか
し、培地３のような２９ＫＤａから３５ＫＤａの分解物
は少なかった。培地５では６日目まで５０ＫＤａのバン
ドが主で分解物は少なかった。
タンブロットにより経時的に観察した。培地１ではＰＡ
活性が出現した２日目ですでに完全型プロウロキナーゼ
の５０ＫＤａバンドはほとんど認められず、３３ＫＤａ
と２９ＫＤａのバンドが主であり、その後３３ＫＤａバ
ンドは減少し、２９ＫＤａバンドのみが残った。培地２
の場合も培地１と同様の傾向であった。培地３では２日
目で５０ＫＤａと４７ＫＤａのバンドが等量存在し、３
日目で５０ＫＤａバンドが減少し、５日目以降５０ＫＤ
ａ、４７ＫＤａバンドが消失し、２９ＫＤａから３５Ｋ
Ｄａの分解物が増加した。培地４では３日目までは５０
ＫＤａバンドが主であったが、その後減少した。しか
し、培地３のような２９ＫＤａから３５ＫＤａの分解物
は少なかった。培地５では６日目まで５０ＫＤａのバン
ドが主で分解物は少なかった。
【００５１】これらの結果から０．０１％トライトンＸ
−１００の添加は、菌の増殖やプロウロキナーゼの分解
抑制には影響しないが、ＰＡ活性は３倍以上増加してお
り、プロウロキナーゼのフラスコへの吸着を著しく抑え
ているものと予想される。０．１Ｍアルギニンの添加で
は菌の増殖を２倍程度促進し、中程度の分解抑制効果を
示した。リン酸アンモニウムの添加は菌の増殖を１．５
〜２倍程度促進し、３日目までは分解を著しく抑制し
た。全てを添加した場合、各添加物の相乗効果が認めら
れ、ＰＡ活性がＹＰＭ培地の約１０倍まで上昇し、分解
も著しく抑制された。
−１００の添加は、菌の増殖やプロウロキナーゼの分解
抑制には影響しないが、ＰＡ活性は３倍以上増加してお
り、プロウロキナーゼのフラスコへの吸着を著しく抑え
ているものと予想される。０．１Ｍアルギニンの添加で
は菌の増殖を２倍程度促進し、中程度の分解抑制効果を
示した。リン酸アンモニウムの添加は菌の増殖を１．５
〜２倍程度促進し、３日目までは分解を著しく抑制し
た。全てを添加した場合、各添加物の相乗効果が認めら
れ、ＰＡ活性がＹＰＭ培地の約１０倍まで上昇し、分解
も著しく抑制された。
【００５２】実験例２ 培地へのトライトンＸ−１０
０及びアルギニン添加の影響 実施例１〜２で調製したプロウロキナーゼ分泌発現株Ｓ
Ｃ０６をＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプ
トン、２％グルコース）で３０℃、一夜培養した。その
後、Ａ540 が０．１の濃度となるように３００ｍｌ容フ
ラスコに入った表４記載の培地各々３０ｍｌに植菌し、
３０℃で７２時間と１４４時間培養した培養液のＡ540
とＰＡ比活性を調べた（表４）。
０及びアルギニン添加の影響 実施例１〜２で調製したプロウロキナーゼ分泌発現株Ｓ
Ｃ０６をＹＰＤ培地（１％酵母抽出物、２％バクトペプ
トン、２％グルコース）で３０℃、一夜培養した。その
後、Ａ540 が０．１の濃度となるように３００ｍｌ容フ
ラスコに入った表４記載の培地各々３０ｍｌに植菌し、
３０℃で７２時間と１４４時間培養した培養液のＡ540
とＰＡ比活性を調べた（表４）。
【００５３】
【表４】
【００５４】０．０１％トライトンＸ−１００添加培地
を用いた７２時間培養では、基本培地での場合と増殖度
は同じであったが、ＰＡ比活性は基本培地の４．６倍で
あった。また、０．１Ｍアルギニン添加系では増殖度が
亢進し、ＰＡ比活性は基本培地の１．６倍であり、０．
０１％トライトンＸ−１００＋０．１Ｍアルギニン添加
系ではＰＡ比活性は、基本培地の１１倍に上昇した。１
４４時間培養後のＰＡ活性は基本培地、０．０１％トラ
イトンＸ−１００添加培地、０．１Ｍ アルギニン添加
培地では７２時間培養後のものと比較して低下傾向であ
ったが、トライトンＸ−１００＋アルギニン添加培地で
は漸増していた。次にこれらの培養上清について抗ＵＫ
抗体によるウェスタンブロットを行った。７２時間培養
の基本培地では３０Ｋ以下の分解物のみが認められ、ト
ライトンＸ−１００添加では４７Ｋ、アルギニン添加で
は５０Ｋのうすいバンドが認められた。トライトンＸ−
１００＋アルギニン添加では５０Ｋと４７Ｋの濃いバン
ドが存在していた。
を用いた７２時間培養では、基本培地での場合と増殖度
は同じであったが、ＰＡ比活性は基本培地の４．６倍で
あった。また、０．１Ｍアルギニン添加系では増殖度が
亢進し、ＰＡ比活性は基本培地の１．６倍であり、０．
０１％トライトンＸ−１００＋０．１Ｍアルギニン添加
系ではＰＡ比活性は、基本培地の１１倍に上昇した。１
４４時間培養後のＰＡ活性は基本培地、０．０１％トラ
イトンＸ−１００添加培地、０．１Ｍ アルギニン添加
培地では７２時間培養後のものと比較して低下傾向であ
ったが、トライトンＸ−１００＋アルギニン添加培地で
は漸増していた。次にこれらの培養上清について抗ＵＫ
抗体によるウェスタンブロットを行った。７２時間培養
の基本培地では３０Ｋ以下の分解物のみが認められ、ト
ライトンＸ−１００添加では４７Ｋ、アルギニン添加で
は５０Ｋのうすいバンドが認められた。トライトンＸ−
１００＋アルギニン添加では５０Ｋと４７Ｋの濃いバン
ドが存在していた。
【００５５】実験例３ 培地へのリン酸塩およびアン
モニウム塩添加の影響 ＳＣ０６株をＹＰＤ培地に３０℃で一夜培養後、Ａ540
が０．１の濃度になるように３００ｍｌ容フラスコに表
５に記載の各培地３０ｍｌに植菌し、３０℃で６５時間
培養した（表５）。
モニウム塩添加の影響 ＳＣ０６株をＹＰＤ培地に３０℃で一夜培養後、Ａ540
が０．１の濃度になるように３００ｍｌ容フラスコに表
５に記載の各培地３０ｍｌに植菌し、３０℃で６５時間
培養した（表５）。
【００５６】
【表５】
【００５７】１％ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋１％（ＮＨ4 ）2
ＨＰＯ4 添加系ではＹＰＭ2 基本培地とＰＡ比活性は同
じであったが、０．６７％ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋１．３３
％（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 添加系では約２倍の活性上昇を
示した。また、２％ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋２％（ＮＨ4 ）
2 ＨＰＯ4 添加系と１．３３％ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋２．
６７％（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 添加系では約３倍の活性上
昇が認められた。一方、（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 単独添加
では２％、４％ともに増殖を抑制し、かつＰＡ活性も認
められなかった。
ＨＰＯ4 添加系ではＹＰＭ2 基本培地とＰＡ比活性は同
じであったが、０．６７％ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋１．３３
％（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 添加系では約２倍の活性上昇を
示した。また、２％ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋２％（ＮＨ4 ）
2 ＨＰＯ4 添加系と１．３３％ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋２．
６７％（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 添加系では約３倍の活性上
昇が認められた。一方、（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 単独添加
では２％、４％ともに増殖を抑制し、かつＰＡ活性も認
められなかった。
【００５８】実験例４ 培地へのトライトンＸ−１０
０、アルギニン、リン酸塩およびアンモニウム塩添加の
影響 同様にして、基本培地にトライトンＸ−１００、アルギ
ニン、リン酸塩及びアンモニウム塩添加を添加して菌体
の増殖およびＰＡ比活性への影響を調べた。
０、アルギニン、リン酸塩およびアンモニウム塩添加の
影響 同様にして、基本培地にトライトンＸ−１００、アルギ
ニン、リン酸塩及びアンモニウム塩添加を添加して菌体
の増殖およびＰＡ比活性への影響を調べた。
【００５９】
【表６】
【００６０】表６から、トライトンＸ−１００＋アルギ
ニン添加系に比べ、さらに２％ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋２％
（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 を添加した場合には増殖が促進さ
れ、ＰＡ活性もさらに１．４倍上昇した。この培養上清
の抗ＵＫ抗体によるウェスタンブロットを行った。ＹＰ
Ｍ2 培地では５０Ｋバンドはなかったが、４％リン酸ア
ンモニウム添加では５０Ｋバンドが認められた。トライ
トンＸ−１００＋アルギニン添加では５０Ｋと４７Ｋの
バンドがあり、４７Ｋの方が濃かったが、さらに４％リ
ン酸アンモニウムを添加した場合には５０Ｋバンドは主
であり、４７Ｋバンドは少なかった。この結果から、４
％リン酸アンモニウム添加は５０Ｋから４７Ｋへの蛋白
質の低分子化を抑制しているものと考えられた（図
７）。
ニン添加系に比べ、さらに２％ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋２％
（ＮＨ4 ）2 ＨＰＯ4 を添加した場合には増殖が促進さ
れ、ＰＡ活性もさらに１．４倍上昇した。この培養上清
の抗ＵＫ抗体によるウェスタンブロットを行った。ＹＰ
Ｍ2 培地では５０Ｋバンドはなかったが、４％リン酸ア
ンモニウム添加では５０Ｋバンドが認められた。トライ
トンＸ−１００＋アルギニン添加では５０Ｋと４７Ｋの
バンドがあり、４７Ｋの方が濃かったが、さらに４％リ
ン酸アンモニウムを添加した場合には５０Ｋバンドは主
であり、４７Ｋバンドは少なかった。この結果から、４
％リン酸アンモニウム添加は５０Ｋから４７Ｋへの蛋白
質の低分子化を抑制しているものと考えられた（図
７）。
【００６１】実験例５ 培地へのグルタミン酸、ベン
ザミジン、アプロチニン、カゼイン水解物、アンモニウ
ム塩、リン酸塩添加の影響 実験例３で効果のあったリン酸アンモニウムについて、
リン酸塩に効果があるのか、アンモニウム塩の効果があ
るのか知るために、ＮＨ4 ＣｌとＮａＰＯ4 の影響を調
べた。また、ＹＰＭ2 に０．０１％トライトンＸ−１０
０を加えた培地を基本培地とし、それに各化合物を添加
して菌体の増殖およびプロウロキナーゼ産生の影響を調
べた。ＳＣ０６をＹＰＤ培地で一夜培養後、Ａ540 が
０．１の濃度になるように各培地５ｍｌ／チューブに植
菌し、３０℃で７０時間培養した。結果を表７に示す。
ザミジン、アプロチニン、カゼイン水解物、アンモニウ
ム塩、リン酸塩添加の影響 実験例３で効果のあったリン酸アンモニウムについて、
リン酸塩に効果があるのか、アンモニウム塩の効果があ
るのか知るために、ＮＨ4 ＣｌとＮａＰＯ4 の影響を調
べた。また、ＹＰＭ2 に０．０１％トライトンＸ−１０
０を加えた培地を基本培地とし、それに各化合物を添加
して菌体の増殖およびプロウロキナーゼ産生の影響を調
べた。ＳＣ０６をＹＰＤ培地で一夜培養後、Ａ540 が
０．１の濃度になるように各培地５ｍｌ／チューブに植
菌し、３０℃で７０時間培養した。結果を表７に示す。
【００６２】
【表７】
【００６３】ＰＡ比活性は０．１Ｍグルタミン酸添加で
は基本培地の５倍に上昇し、０．１Ｍアルギニン添加よ
りも効果的であった。１ｍＭ，１０ｍＭのベンザミジン
添加ではＰＡ活性は低下した。１０ＩＵ／ｍｌアプロチ
ニンはＰＡ比活性に影響しなかった。また、カゼイン水
解物のうち３％カザミノ酸が菌体の増殖を促進し、基本
培地の約８倍のＰＡ活性の上昇が認められた。また、４
％ＮＨ4 Ｃｌは菌体増殖およびプロウロキナーゼの産生
量を抑制した。０．２５Ｍ ＮａＰＯ4 添加ではｐＨ
７．０以下では増殖は促進しているのもかかわらずＰＡ
比活性は低かった。
は基本培地の５倍に上昇し、０．１Ｍアルギニン添加よ
りも効果的であった。１ｍＭ，１０ｍＭのベンザミジン
添加ではＰＡ活性は低下した。１０ＩＵ／ｍｌアプロチ
ニンはＰＡ比活性に影響しなかった。また、カゼイン水
解物のうち３％カザミノ酸が菌体の増殖を促進し、基本
培地の約８倍のＰＡ活性の上昇が認められた。また、４
％ＮＨ4 Ｃｌは菌体増殖およびプロウロキナーゼの産生
量を抑制した。０．２５Ｍ ＮａＰＯ4 添加ではｐＨ
７．０以下では増殖は促進しているのもかかわらずＰＡ
比活性は低かった。
【００６４】これらの培養上清の抗ＵＫ抗体によるウェ
スタンブロットを行った。グルタミン酸、ベンザミンお
よびアプロチニン添加では５０Ｋバンドが主で、４７Ｋ
バンドは少なかった。３％カザミノ酸では５０Ｋと４７
Ｋバンドが同程度存在していた。４％ＮＨ4 Ｃｌでは５
０Ｋバンドのみが認められ３０Ｋ以下の分解物もほとん
どなかった。０．２５Ｍ ＮａＰＯ4 添加ではｐＨ７．
５の培養条件では５０Ｋバンドの下に４７Ｋのうすいバ
ンドが認められた。これらの結果からアンモニウム塩に
５０Ｋ蛋白の分解を著しく抑制する効果が有るように思
われる。
スタンブロットを行った。グルタミン酸、ベンザミンお
よびアプロチニン添加では５０Ｋバンドが主で、４７Ｋ
バンドは少なかった。３％カザミノ酸では５０Ｋと４７
Ｋバンドが同程度存在していた。４％ＮＨ4 Ｃｌでは５
０Ｋバンドのみが認められ３０Ｋ以下の分解物もほとん
どなかった。０．２５Ｍ ＮａＰＯ4 添加ではｐＨ７．
５の培養条件では５０Ｋバンドの下に４７Ｋのうすいバ
ンドが認められた。これらの結果からアンモニウム塩に
５０Ｋ蛋白の分解を著しく抑制する効果が有るように思
われる。
【００６５】次に、上の実験で効果のあったカザミノ
酸、グルタミン酸、アプロチニン、ベンザミジンの添加
実験を行った。結果を表８に示す。
酸、グルタミン酸、アプロチニン、ベンザミジンの添加
実験を行った。結果を表８に示す。
【００６６】
【表８】
【００６７】３０℃、７１時間培養でカザミノ酸の濃度
を２％から５％に変えた場合、ＰＡ活性は２〜３％で
は、約５００ＩＵ／ｍｌであったが、４％以上では低下
の傾向であった。また、３％カザミノ酸に０．１Ｍグル
タミン酸、１０ＩＵ／ｍｌアプロチニン、１ｍＭベンザ
ミンを添加した場合、ＰＡ活性は３％カザミノ酸と同程
度であった。０．２５Ｍ ＮａＰＯ4 添加ではｐＨ７．
５でＰＡ活性が基本培地と同程度であったが、ｐＨ８．
０以上では増殖が抑制され、活性の低下が認められた。
これらの培養上清の抗ＵＫ抗体によるウェスタンブロッ
トを行った。２％から５％カザミノ酸添加ではカザミノ
酸の濃度が高いほど、多少分解は少なかったが、５０Ｋ
と４７Ｋのバンドはほぼ同程度であった。また、３％カ
ザミノ酸にさらにグルタミン酸、アプロチニン、ベンザ
ミジンを添加した場合、５０Ｋから４７Ｋの分解を抑制
することはできなかった。
を２％から５％に変えた場合、ＰＡ活性は２〜３％で
は、約５００ＩＵ／ｍｌであったが、４％以上では低下
の傾向であった。また、３％カザミノ酸に０．１Ｍグル
タミン酸、１０ＩＵ／ｍｌアプロチニン、１ｍＭベンザ
ミンを添加した場合、ＰＡ活性は３％カザミノ酸と同程
度であった。０．２５Ｍ ＮａＰＯ4 添加ではｐＨ７．
５でＰＡ活性が基本培地と同程度であったが、ｐＨ８．
０以上では増殖が抑制され、活性の低下が認められた。
これらの培養上清の抗ＵＫ抗体によるウェスタンブロッ
トを行った。２％から５％カザミノ酸添加ではカザミノ
酸の濃度が高いほど、多少分解は少なかったが、５０Ｋ
と４７Ｋのバンドはほぼ同程度であった。また、３％カ
ザミノ酸にさらにグルタミン酸、アプロチニン、ベンザ
ミジンを添加した場合、５０Ｋから４７Ｋの分解を抑制
することはできなかった。
【００６８】実験１から５の結果から、産生量を上げる
にはトライトンＸ−１００、アルギニン、グルタミン
酸、カザミノ酸が有効であり、５０Ｋ蛋白から４７Ｋ蛋
白の分解を防ぐためにはアンモニウム塩、特にリン酸ア
ンモニウムが効果的であった。
にはトライトンＸ−１００、アルギニン、グルタミン
酸、カザミノ酸が有効であり、５０Ｋ蛋白から４７Ｋ蛋
白の分解を防ぐためにはアンモニウム塩、特にリン酸ア
ンモニウムが効果的であった。
【００６９】実験例６ インビトロでのプロウロキナー
ゼの分解抑制実験 各添加物の分解抑制効果をみるために下記の実験を行っ
た。ピキア酵母ＧＴＳ１１５株をＹＰＭ2 培地で１４４
時間、３０℃で培養し、得られた培養物を０．２２μｍ
のフィルターで濾過して培養上清とした。該培養上清３
０μｌに各添加物（合計１７．５μｌ）および実施例３
に従ってＳＣ０６株の培養上清から精製したプロウロキ
ナーゼ（２．５μｌ）を添加して反応液（５０μｌ）と
し、シリコナイズしたコニカルチューブに入れて３０℃
で２４時間インキュベートし、プロウロキナーゼの分解
の程度をウェスタンブロットで調べた。なお、各添加物
の配合量の割合を表９に示す。
ゼの分解抑制実験 各添加物の分解抑制効果をみるために下記の実験を行っ
た。ピキア酵母ＧＴＳ１１５株をＹＰＭ2 培地で１４４
時間、３０℃で培養し、得られた培養物を０．２２μｍ
のフィルターで濾過して培養上清とした。該培養上清３
０μｌに各添加物（合計１７．５μｌ）および実施例３
に従ってＳＣ０６株の培養上清から精製したプロウロキ
ナーゼ（２．５μｌ）を添加して反応液（５０μｌ）と
し、シリコナイズしたコニカルチューブに入れて３０℃
で２４時間インキュベートし、プロウロキナーゼの分解
の程度をウェスタンブロットで調べた。なお、各添加物
の配合量の割合を表９に示す。
【００７０】
【表９】
【００７１】その結果、０．０１％トライトンＸ−１０
０の添加では、分解の状況は添加物無添加と同程度であ
った。０．１Ｍアルギニン添加では３５ＫＤａ以下の分
解物は少なかったが、４７ＫＤａの分解物がやや見られ
た。リン酸アンモニウム添加および全ての添加では分解
はかなり抑制されていた。
０の添加では、分解の状況は添加物無添加と同程度であ
った。０．１Ｍアルギニン添加では３５ＫＤａ以下の分
解物は少なかったが、４７ＫＤａの分解物がやや見られ
た。リン酸アンモニウム添加および全ての添加では分解
はかなり抑制されていた。
【００７２】実験例７ 分解産物のＮ末端アミノ酸配
列 ＳＣ０６株を添加物無添加のＹＰＭ2 培地で培養する
と、完全体のプロウロキナーゼはＰＡ活性が認められた
２日めで既にほとんど存在せず、短時間で３０ＫＤａ蛋
白（非還元条件）に分解した。この分解物の構造を調べ
るために下記の実験を行った。ＳＣ０６株をＹＰＭ2 培
地５０ｍｌに（３００ｍｌ容フラスコ）植菌して、３０
℃で５日間培養し、その培養液３００ｍｌに１Ｍ トリ
ス塩酸（ｐＨ７．５）１６ｍｌ、１％トライトンＸ−１
００ ３．２ｍｌを添加し、塩酸でｐＨ７．５に調整
後、抗ウロキナーゼ抗体 formyl-cellulofine カラム
（日本チッソ社製)に供して、平衡化用緩衝液〔５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％トライトンＸ
−１００〕で洗浄後、さらに緩衝液〔５０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ト
ライトンＸ−１００〕で洗浄し、溶出液〔０．２Ｍ グ
リシン塩酸（ｐＨ２．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．
０１％トライトンＸ−１００〕で溶出した。ＰＡ活性の
ある溶出液をモルカットＬ（分画分子量10000 、UFP2LG
C24 、ミリポア社製）およびウルトラフリーＣ３−ＬＧ
Ｃ（分画分子量10000 、ミリポア社製）で約100 倍に濃
縮したこのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて３０Ｋ
Ｄａのバンドを切り出して、そこから抽出して得られた
３０ＫＤａ蛋白質のアミノ酸配列を決定した。その結
果、下記のアミノ酸配列をＮ末端に有する２本のピーク
が認められた。 Ile-Ile-Gly-Gly-Glu-Phe-Thr-Thr-Ile-Glu-Asn-Gln- Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe- のアミノ酸配列はプロウロキナーゼのＮ末端から１５
９番目のイソロイシンからの配列に一致し、のアミノ
酸配列はプロウロキナーゼのＮ末端から１３６番目のリ
ジンからの配列に一致した。このことから、３０ＫＤａ
蛋白質は低分子２本鎖タイプのウロキナーゼであると考
えられた。
列 ＳＣ０６株を添加物無添加のＹＰＭ2 培地で培養する
と、完全体のプロウロキナーゼはＰＡ活性が認められた
２日めで既にほとんど存在せず、短時間で３０ＫＤａ蛋
白（非還元条件）に分解した。この分解物の構造を調べ
るために下記の実験を行った。ＳＣ０６株をＹＰＭ2 培
地５０ｍｌに（３００ｍｌ容フラスコ）植菌して、３０
℃で５日間培養し、その培養液３００ｍｌに１Ｍ トリ
ス塩酸（ｐＨ７．５）１６ｍｌ、１％トライトンＸ−１
００ ３．２ｍｌを添加し、塩酸でｐＨ７．５に調整
後、抗ウロキナーゼ抗体 formyl-cellulofine カラム
（日本チッソ社製)に供して、平衡化用緩衝液〔５０ｍ
Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．５）、０．０１％トライトンＸ
−１００〕で洗浄後、さらに緩衝液〔５０ｍＭトリス塩
酸（ｐＨ７．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１％ト
ライトンＸ−１００〕で洗浄し、溶出液〔０．２Ｍ グ
リシン塩酸（ｐＨ２．５）、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．
０１％トライトンＸ−１００〕で溶出した。ＰＡ活性の
ある溶出液をモルカットＬ（分画分子量10000 、UFP2LG
C24 、ミリポア社製）およびウルトラフリーＣ３−ＬＧ
Ｃ（分画分子量10000 、ミリポア社製）で約100 倍に濃
縮したこのサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけて３０Ｋ
Ｄａのバンドを切り出して、そこから抽出して得られた
３０ＫＤａ蛋白質のアミノ酸配列を決定した。その結
果、下記のアミノ酸配列をＮ末端に有する２本のピーク
が認められた。 Ile-Ile-Gly-Gly-Glu-Phe-Thr-Thr-Ile-Glu-Asn-Gln- Lys-Pro-Ser-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Leu-Lys-Phe- のアミノ酸配列はプロウロキナーゼのＮ末端から１５
９番目のイソロイシンからの配列に一致し、のアミノ
酸配列はプロウロキナーゼのＮ末端から１３６番目のリ
ジンからの配列に一致した。このことから、３０ＫＤａ
蛋白質は低分子２本鎖タイプのウロキナーゼであると考
えられた。
【００７３】参考例 ＰＡ活性の測定 ＰＡ活性は、Levin, E,G.,らの方法（フィブリンプレー
ト法、J. Cell Bio.,94, 631-636, 1982 ）に従って測
定した。６０℃の１％寒天溶液に１００ＩＵ／ｍｌのヒ
トトロンビンを１／５０量加えた後、すぐに５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、０．１％ＮａＮ3 中に１％ウシフィブリノーゲ
ンを溶解した３７℃の溶液を等量混合し、水平なプレー
トに添加し、寒天を固化させる。固化した白濁の寒天層
に直径４ｍｍの穴をあけ、サンプルを２０μｌづつこの
穴に添加し、３７℃で１２時間放置する。ＰＡ活性が存
在すると、白濁した寒天層は透明になった溶解円が認め
られるようになる。この溶解円の直径を測定し、プロウ
ロキナーゼの標準品との比較によりＰＡ活性を測定す
る。
ト法、J. Cell Bio.,94, 631-636, 1982 ）に従って測
定した。６０℃の１％寒天溶液に１００ＩＵ／ｍｌのヒ
トトロンビンを１／５０量加えた後、すぐに５０ｍＭリ
ン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、１００ｍＭ Ｎ
ａＣｌ、０．１％ＮａＮ3 中に１％ウシフィブリノーゲ
ンを溶解した３７℃の溶液を等量混合し、水平なプレー
トに添加し、寒天を固化させる。固化した白濁の寒天層
に直径４ｍｍの穴をあけ、サンプルを２０μｌづつこの
穴に添加し、３７℃で１２時間放置する。ＰＡ活性が存
在すると、白濁した寒天層は透明になった溶解円が認め
られるようになる。この溶解円の直径を測定し、プロウ
ロキナーゼの標準品との比較によりＰＡ活性を測定す
る。
【００７４】
【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：５４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：genomic DNA 起源 プラスミドＪＵＫ１ 配列の特徴 1-54 S sig peptide 配列 ATG TTG TTC TCT AAG ATC TCC TCT GAT ATC TTG TTG ACC GCT GCA AGC 48 Met Leu Phe Ser Lys Ile Ser Ser Ala Ile Leu Leu Thr Ala Ala Ser 5 10 15 TTC GCG 54 Phe Ala 18
【００７５】配列番号：２ 配列の長さ：７２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類： 起源 pKO113またはpKO114 配列の特徴 7-60 E sig peptide 61-72 E peptide 配列 CTCGAG ATG TTG TTC TCT AAG ATC TCC TCT GCA ATC TTG TTG ACC GCT 48 Met Leu Phe Ser Lys Ile Ser Ser Ala Ile Leu Leu Thr Ala -15 -10 -5 GCA AGC TTC GCG AGC AAT GAG CTC 72 Ala Ser Phe Ala Ser Asn Glu Leu 1
【図１】プラスミドｐＫＯ１１０、ｐＫＯ１１３および
ｐＫＯ１１４の構築方法を示す図である。
ｐＫＯ１１４の構築方法を示す図である。
【図２】プラスミドｐＫＯ１１６およびｐＫＯ１１７の
構築方法を示す図である。
構築方法を示す図である。
【図３】プラスミドｐＫＯ１２１およびプロウロキナー
ゼ分泌発現ベクターｐＫＯ１２６の構築方法を示す図で
ある。
ゼ分泌発現ベクターｐＫＯ１２６の構築方法を示す図で
ある。
【図４】プロウロキナーゼ分泌発現ベクターｐＫＯ１２
６の制限酵素地図を示す図である。
６の制限酵素地図を示す図である。
【図５】実施例１における５種類のメタノール培地で培
養したピキア酵母ＳＣ０６株の増殖を経時的に示した図
である。○：培地１、△：培地２、□：培地３、×：培
地４、●：培地５
養したピキア酵母ＳＣ０６株の増殖を経時的に示した図
である。○：培地１、△：培地２、□：培地３、×：培
地４、●：培地５
【図６】実施例１における５種類のメタノール培地でピ
キア酵母ＳＣ０６株を培養した培養上清中のＰＡ活性を
経時的に示した図である。○：培地１、△：培地２、
□：培地３、×：培地４、●：培地５
キア酵母ＳＣ０６株を培養した培養上清中のＰＡ活性を
経時的に示した図である。○：培地１、△：培地２、
□：培地３、×：培地４、●：培地５
【図７】実験例４で行ったウエスタンブロット（電気泳
動）の結果を示す。 レーン１：ＹＰＭ2 培地使用 レーン２：ＹＰＭ2 ＋2%ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋ 2%(Ｎ
Ｈ4 ）2 ＨＰＯ4 レーン３および４：ＹＰＭ2 ＋0.01% トライトンX-100
＋0.1M アルギニン レーン５および６：ＹＰＭ2 ＋0.01% トライトンX-100
＋0.1M アルギニン＋2%ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋ 2%(Ｎ
Ｈ4 ）2 ＨＰＯ4
動）の結果を示す。 レーン１：ＹＰＭ2 培地使用 レーン２：ＹＰＭ2 ＋2%ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋ 2%(Ｎ
Ｈ4 ）2 ＨＰＯ4 レーン３および４：ＹＰＭ2 ＋0.01% トライトンX-100
＋0.1M アルギニン レーン５および６：ＹＰＭ2 ＋0.01% トライトンX-100
＋0.1M アルギニン＋2%ＮＨ4 Ｈ2 ＰＯ4 ＋ 2%(Ｎ
Ｈ4 ）2 ＨＰＯ4
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 1/19 8828−4Ｂ // Ｃ１２Ｎ 9/72 15/09 ＺＮＡ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 9/72 Ｃ１２Ｒ 1:84） (72)発明者 田辺 利住 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内 (72)発明者 山内 紘一 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内
Claims (9)
- 【請求項１】 宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化
され得る蛋白質を分泌産生する宿主細胞を酸性アミノ
酸，塩基性アミノ酸，リン酸塩，アンモニウム塩および
非イオン界面活性剤からなる群から選択される少なくと
も１種を含有する培地中で培養し、得られる培養上清か
ら該蛋白質を採取することを特徴とする宿主細胞由来の
プロテアーゼで分解され得る蛋白質の製造方法。 - 【請求項２】 アミノ酸がアルギニン，リジン，グルタ
ミン酸およびアスパラギン酸からなる群から選択される
少なくとも１つであることを特徴とする請求項１に記載
の宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白
質の製造方法。 - 【請求項３】 非イオン界面活性剤が、トライトンＸ−
１００，トゥイーン２０，トゥイーン８０およびノニデ
ットＰ−４０からなる群から選択される少なくとも１つ
であることを特徴とする請求項１または２に記載の宿主
細胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の製
造方法。 - 【請求項４】 宿主細胞が、ピキア酵母であることを特
徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の宿主細胞由来
のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の製造方法。 - 【請求項５】 宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化
され得る蛋白質が、プロウロキナーゼ，ヒト組織プラス
ミノーゲン活性化因子，血液凝固第IX因子，血液凝固第
Ｘ因子，プロテインＣ，インターフェロン，エピダーマ
ルグロースファクター，β−エンドルフィンおよびそれ
らの変異体または誘導体からなる群から選択されるもの
であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載
の宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白
質の製造方法。 - 【請求項６】 プロウロキナーゼを分泌産生するピキア
酵母をアルギニン，リン酸アンモニウムおよびトライト
ンＸ−１００を含有する培地中で培養し、得られる培養
上清からプロウロキナーゼを採取することを特徴とする
プロウロキナーゼの製造方法。 - 【請求項７】 培養上清から宿主細胞由来のプロテアー
ゼで低分子化され得る蛋白質を採取する方法が、アンモ
ニウム塩を含有する緩衝液を用いてカラムクロマト処理
をすることを特徴とするものである請求項１〜６のいず
れかに記載の宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化さ
れ得る蛋白質の製造方法。 - 【請求項８】 カラムクロマト処理が、少なくとも疎水
性カラムクロマトグラフィーおよび陽イオン交換カラム
クロマトグラフィーであることを特徴とする請求項７記
載の宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋
白質の製造方法。 - 【請求項９】 プロウロキナーゼを分泌産生するピキア
酵母。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6186602A JPH0823995A (ja) | 1994-07-14 | 1994-07-14 | 宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の製造方法 |
| PCT/JP1995/001399 WO1996002661A1 (fr) | 1994-07-14 | 1995-07-13 | Procede permettant de produire une proteine dont le poids moleculaire peut etre reduit par une protease originaire d'une cellule hote |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6186602A JPH0823995A (ja) | 1994-07-14 | 1994-07-14 | 宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の製造方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0823995A true JPH0823995A (ja) | 1996-01-30 |
Family
ID=16191440
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6186602A Pending JPH0823995A (ja) | 1994-07-14 | 1994-07-14 | 宿主細胞由来のプロテアーゼで低分子化され得る蛋白質の製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0823995A (ja) |
| WO (1) | WO1996002661A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998044146A1 (fr) * | 1997-04-03 | 1998-10-08 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. | Procede de production de proteines etrangeres |
| EP2905342A4 (en) * | 2012-10-03 | 2016-03-16 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | METHOD FOR PREVENTING POLYPEPTIDE REDUCTION BY ADDITION OF AMINO ACID TO A LIQUID CULTURE MEDIUM |
| JP2018143237A (ja) * | 2017-03-01 | 2018-09-20 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9833098B2 (en) | 2009-07-14 | 2017-12-05 | Loominocity, Inc. | Architecture for routing multi-channel commands via a tree column |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MY103358A (en) * | 1987-04-15 | 1993-06-30 | Novartis Ag | Process for the production of protiens. |
| IL89989A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts |
| JPH07102147B2 (ja) * | 1992-03-16 | 1995-11-08 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの着色抑制方法 |
-
1994
- 1994-07-14 JP JP6186602A patent/JPH0823995A/ja active Pending
-
1995
- 1995-07-13 WO PCT/JP1995/001399 patent/WO1996002661A1/ja active Application Filing
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998044146A1 (fr) * | 1997-04-03 | 1998-10-08 | Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. | Procede de production de proteines etrangeres |
| EP2905342A4 (en) * | 2012-10-03 | 2016-03-16 | Kyowa Hakko Kirin Co Ltd | METHOD FOR PREVENTING POLYPEPTIDE REDUCTION BY ADDITION OF AMINO ACID TO A LIQUID CULTURE MEDIUM |
| US9976163B2 (en) | 2012-10-03 | 2018-05-22 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd | Method for preventing reduction of polypeptide by adding amino acid to culture solution |
| JP2018143237A (ja) * | 2017-03-01 | 2018-09-20 | 三洋化成工業株式会社 | 有用物質の生産方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1996002661A1 (fr) | 1996-02-01 |
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