JPH04234988A - ヒトプロラクチン−プロテインａ融合蛋白発現遺伝子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトプロラクチン（Ｐ
ｒｏｌａｃｔｉｎ　以下ｈＰＬと略す）をプロテインＡ
との融合蛋白として発現させるベクターに関するもので
ある。ｈＰＬは、脳下垂体前葉より分泌される黄体刺激
活性や、乳汁分泌促進活性等を示す分子量約２２ＫＤの
ペプチドホルモンである。ｈＰＬは前記生理活性により
医薬品としての用途が期待される。また脳下垂体腫瘍や
不妊等の診断を目的とする血中濃度測定用抗原、あるい
は免疫原として有用である。

【０００２】

【従来技術】ｈＰＬに限らず一般にホルモン物質を天然
物として取得するためには、入手が制限される臓器等を
原料とする場合が多い。そこで近年では、遺伝子組換え
によって適当なホスト中でこれらの外来蛋白を発現させ
、大量に生産する技術が利用されるようになった。

【０００３】ｈＰＬにおいては、ヒト脳下垂体からのｃ
ＤＮＡクローニング［ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）２５６：４００７，１
９８１、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ９５：１４９１．１９８４
　］や、その増幅（特開昭６１−２０２６９０号公報）
等についての報告がある。しかしｃＤＮＡからｈＰＬを
実際に発現させる技術については、特開平２−４４５号
公報に開示されているのみである。この公開特許は、ヒ
ト脳下垂体よりクローニングしたｈＰＬのｃＤＮＡを、
トリプトファンプロモーターやタックプロモーター等と
組合せて大腸菌中で発現させる技術に関するものである
。したがって発現されたｈＰＬを精製する工程について
は全く触れられていない。

【０００４】一般に遺伝子組み換え技術によって発現さ
せた蛋白の精製は、目的とする蛋白が培養物中の培地や
菌体に由来する多様な蛋白と共存しているため比較的困
難な作業とされている。ことにｈＰＬのように医薬品用
途をも予想して高度に精製する必要がある物質について
は、その精製工程にも高い技術が要求されることは言う
までもない。しかし、これまでｈＰＬについて発現後の
精製工程の改良に関する報告はされていない。

【０００５】一方外来蛋白質を遺伝子組換え技術によっ
て発現させる場合、しばしばβ−ガラクトシダーゼ等と
の融合蛋白として産生されることが行なわれる。この方
法は目的蛋白質の産生による宿主の成育妨害回避、培養
中の蛋白分解酵素作用による目的蛋白の分解防止、更に
は産生された蛋白の検出や分離を助けること等を目的と
するものである。融合蛋白のままで利用できる場合には
この方法は非常に有効であるが、融合蛋白中の目的とす
る蛋白部分のみが必要な場合は、何らかの手段で融合蛋
白を開裂させなければならない。現在ブロムシアンによ
るメチオニン後方の切断、蟻酸によるアミノ酸配列　Ａ
ｓｐ−Ｐｒｏの切断、ヒドロキシルアミンによるアミノ
酸配列　Ａｓｎ−Ｇｌｙの切断等が知られているが、当
然のことながら切断部位の配列が目的蛋白中に存在する
場合には、これらの開裂剤は利用できない。またこのよ
うな化学的な開裂剤は、ペプチド鎖の切断のみならず蛋
白の立体構造等にも影響を与えることもあり、精製工程
に用いる化合物としては好ましくないといえる。

【０００６】これら化学的な開裂剤に対して酵素的にお
だやかな条件で開裂させる技術も公知である。融合蛋白
中の開裂部位に予めコラーゲンを挿入しプロテインＡ−
コラーゲン−目的蛋白という形の融合蛋白を発現させ、
開裂剤としてコラゲナーゼを使うというものである。 ［プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ　Ｓ
ｃｉ．）８１：４６９２，１９８４］コラーゲンが作用
するアミノ酸配列１は、コラーゲン以外ではあまり見ら
れない配列であり、また前記化学的開裂剤の作用部位に
比べ構成アミノ酸数が多いため確率論的にも目的蛋白中
に同じ配列が含まれる可能性が低い。しかも酵素反応と
いうおだやかな反応で開裂が行えるため融合蛋白の発現
〜精製には有利な方法である。しかしベクターの構築に
当たってコラーゲンをコードする遺伝子のクローニング
という繁雑な作業を要求される。 またコラーゲン分子をそのまま挿入することになるので
融合蛋白の分子量が大きくなりやすく、組込み可能なベ
クターの選択や発現効率が制限される。更にコラーゲン
分子の開列後のアミノ酸配列が目的とする蛋白に残るこ
とも予想され、場合によっては目的蛋白の活性に影響を
与えかねない。

【０００７】

【発明が解決しようとする問題点】本発明は、ｈＰＬを
遺伝子組換えによって産生するに当り可能なかぎり精製
しやすい形で発現させることが可能で、しかもベクター
の構築や発現効率の点でも有利な組換え遺伝子の提供を
主な目的とするものである。

【０００８】

【発明の構成】本発明は、ヒトプロラクチン遺伝子と、
プロテインＡの少くともＦｃ結合活性ペプチドフラグメ
ントを含む領域をコードする遺伝子との間に、アミノ酸
配列１（Ｇｌｙ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｘａａ　）
で示されるコラゲナーゼ切断部位をコードする遺伝子を
挿入したヒトプロラクチン−プロテインＡ融合蛋白発現
遺伝子である。

【０００９】本発明におけるｈＰＬ遺伝子はヒト脳下垂
体や胎盤等のｈＰＬ遺伝子を公知の方法でクローニング
することによって得ることができる。クローニングの具
体的な例としては特開昭６１−２０２６９０号公報（ヒ
ト下垂体組織からクローニング）が挙げられる。その他
胎盤組織からガブラー等の方法［ジーン（Ｇｅｎｅ）２
５：Ｐ２６３（１９８３）　］によりクローニングする
ことも可能である。 胎盤を用いる場合は下垂体よりも材料の入手が容易であ
る。

【００１０】一方本発明に用いるプロテインＡの少くと
もＦｃ結合活性ペプチドフラグメントを含む領域（以下
ＰＡと略す）をコードする遺伝子は、公表昭５９−５０
１６９３号公報等に示されたものを利用できる。また最
近ではＰＡとの融合蛋白発現用のベクターが市販されて
いる（たとえばファルマシア製のｐＲＩＴ２Ｔ等）ので
、これを利用すると便利である。

【００１１】次に前記２つのペプチドをコードする遺伝
子の間に挿入するアミノ酸配列１で示されるコラゲナー
ゼ切断部位（以下コラゲナーゼリンカーという）をコー
ドする遺伝子について説明する。この遺伝子の具体的な
塩基配列としては後に示すようなもの等が挙げられるが
、アミノ酸配列１中に任意のアミノ酸を含むためその他
にも数多くの塩基配列を利用しうることは言うまでもな
い。必要な遺伝子はＤＮＡ合成装置により容易に得るこ
とができる。これらコラゲナーゼリンカーをコードする
遺伝子は、前記２つのペプチドをコードする遺伝子との
連結に利用する制限酵素のサイトに合せて適宜塩基を付
加して連結させればよい。これら３者、すなわちＰＡ−
コラゲナーゼリンカー−ｈＰＬをコードする遺伝子が連
結された部分について例示すると図２のようになる。 ここで５’側の実線を付けた部分が前記ベクターｐＲＩ
Ｔ２Ｔに由来するＰＡをコードする遺伝子のＣ末端側を
ＢａｍＨＩで消化したサイトである。一方３’側の実線
を付けた部分がｈＰＬ遺伝子のＮ末端側をＣｌａＩで消
化したサイトを示す。中間の実線の付いていない部分が
コラゲナーゼリンカー（Ｌで示した）をコードする領域
となっている。この例では５’側のＢａｍＨＩ、３’側
のＣｌａＩの消化サイトに合わすため、コラゲナーゼリ
ンカーの５’側にＧｌｙ　、Ｓｅｒ　を付加し、３’側
のＸａａ　をＰｒｏ　に対応するトリプレットとし、３
者を連結している。３者の連結については、従来から利
用されている手法を用いればよい。

【００１２】ｐＲＩＴ２Ｔをベクターに用いた場合には
、マルチクローニングサイトが存在するので利用する制
限酵素の組合わせによってはコラゲナーゼリンカーとし
て例えば図３のような配列を用いることも可能である。

【００１３】このようにして得られた、ＰＡ−コラゲナ
ーゼリンカー−ｈＰＬの３者をコードする遺伝子を発現
させるには、公知のホスト−ベクター系を利用する。例
えばＰＡをコードする配列として前述の市販のベクター
ｐＲＩＴ２Ｔを用いたときには、これを大腸菌に組み込
んで本発明による融合蛋白を発現させることができる。 このベクターはλＣｒｏλｐＲプロモーターを含んでお
り、温度シフトにより高い発現効率が期待できる。発現
された融合蛋白は、必要に応じて超音波による菌体の破
砕や蛋白の可溶化等の処理を加えた後、固定化したＩｇ
Ｇと接触させる。ＰＡを有する本発明による融合蛋白は
、固定化したＩｇＧに特異的に結合するので、１スッテ
ップで高度に精製された融合蛋白を得られる。この段階
でコラゲナーゼを作用させ、固定化したＩｇＧ結合ＰＡ
と分離すればｈＰＬを多く含む分画を得ることができる
。あるいはプロテインＡとＩｇＧとをチオシアン酸塩や
尿素等のカオトロピック剤で解離させ融合蛋白を豊富に
含む分画を得ることもできる。この場合は得られた分画
に対してコラゲナーゼを作用させ、ｈＰＬとプロテイン
Ａを開裂させることになる。

【００１４】コラゲナーゼ（ＥＣ３．４．２４．８）は
、アミノ酸配列１を特異的に認識して２か所のＸａａ　
のＣ末端側を切断する酵素であり、アケロバクター・イ
オファゴス（Ａｃｈｅｒｏｂａｃｔｏｒ　ｉｏｐｈａｇ
ｏｓ　）由来のもの（分子量約７００００）や、クロス
トリジウム・ヒストリティクム（Ｃｈｒｏｓｔｒｉｄｉ
ｕｍ　ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃｕｍ　）由来のもの（分子
量約１０５００）等が知られている。本発明によって発
現されたＰＡ−コラーゲナーゼリンカーｈＰＬ融合蛋白
の開裂に用いるコラゲナーゼの由来は問わないが、他の
プロテアーゼが混入しているとｈＰＬ部分に作用する危
険があるので精製度の高いもののほうが好ましい。回収
率をより高めるために、コラゲナーゼを作用させる前に
融合蛋白をある程度精製しておくと良い。開裂後、更に
精製を進めるためには、ゲル濾過法、イオン交換クロマ
トグラフ法、吸着クロマトグラフ法等の公知の精製技術
を組み合わせればよい。

【００１５】

【作用】本発明の遺伝子によって発現された融合蛋白に
おけるＰＡ部分は、固定化したＩｇＧによる吸着精製を
可能とするものである。またＰＡとｈＰＬの間に挿入し
たコラゲナーゼリンカーは、精製工程で融合蛋白をコラ
ゲナーゼの作用で開裂させるためのものである。以下実
施例に基づいて本発明を更に詳細に説明する。

【００１６】

【実施例】１．ＰＡ−コラゲナーゼリンカー−ｈＰＬ融
合蛋白発現ベクターの構築 ■ｈＰＬ遺伝子のクローニング まずガブラー等の方法によりｈＰＬのｃＤＮＡを調製し
た。１７週目のヒトの胎盤のホモジェネート（グアニジ
ンイソチオシアネート法）を塩化セシウム法によって超
遠心分離してｍＲＮＡ画分を得、更にオリゴｄＴ配列を
用いてポリＡ−ｍＲＮＡを回収した。このポリＡ−ｍＲ
ＮＡ（１０μｇ）をテンプレートとして逆転写酵素（宝
酒造製、以下酵素には全て宝酒造のものを用いた）とオ
リゴｄＴとともにインキュベートして１本鎖ｃＤＮＡを
合成し、更にＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡリガ
ーゼにより２本鎖ｃＤＮＡを合成した。得られた２本鎖
ｃＤＮＡを５単位の大腸菌クレノウ断片（宝酒造製）で
平滑末端処理し、次いでＥｃｏＲＩメチラーゼによりＥ
ｃｏＲＩサイトを消失させた。この２本鎖ｃＤＮＡに５
’末端をリン酸化したＥｃｏＲＩリンカー（東洋紡績製
）０．４μｇを加え、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼにより両端
に連結後、ＥｃｏＲＩで消化し、更にＡＣＡ３４カラム
（バイオラッド製）でＥｃｏＲＩリンカーを連結した２
本鎖ｃＤＮＡを回収した。

【００１７】一方λｇｔ１１ファージベクター（東洋紡
績製）をＥｃｏＲＩで消化し、前記ＥｃｏＲＩ消化２本
鎖ｃＤＮＡ（３０ｎｇ）を加えてＴ４リガーゼにより組
み込んだ。ｉｎ　　ｖｉｔｒｏパッケージング（スタラ
タジーン社のＧｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ　を利用）後
、得られたベクターを用い大腸菌６００ｈ＋ｌ株を宿主
としてλプラ−クライブラリーを作成し（１２０万クロ
ーン）、更にサザンハイブリダイゼーション法によって
ｈＰＬのｃＤＮＡをスクリーニングした。プローブとし
てはｈＰＬのＮ末端をコードする２０個のヌクレオチド
配列（塩基配列　５’ＴＴＧ　ＣＣＣ　ＡＴＣ　ＴＧＴ
　ＣＣＣ　ＧＧＣ　３’　）及びそのアンチセンススト
ランド（塩基配列　５’ＧＣＣ　ＧＧＧＡＣＡ　ＧＡＴ
　ＧＧＧ　ＣＡＡ　３’　）を用いた。

【００１８】その結果、６個のｈＰＬ遺伝子を含むクロ
ーンを確認した。更にこの６クローンについてＥｃｏＲ
Ｉ、ＢａｍＨＩを用いてマッピングを行い、期待される
長さのＤＮＡ断片を得た。また１Ｋｂｐ　のｃＤＮＡ中
の塩基配列をＤＮＡシーケンサー（アプライドバイオシ
ステム製）で調べたところ、ｈＰＬのｃＤＮＡであるこ
とが確認された。上記６クローンのうちの１つをＥｃｏ
ＲＩで消化し、プラスミドベクターｐＵＣ９（宝酒造製
）のＥｃｏＲＩサイトに組み込んでｈＰＬのｃＤＮＡク
ローニングベクター（ｐＲＬ１・２、図１）とした。こ
れを大腸菌に導入し、増幅したものをベクターの構築に
用いた。

【００１９】■コラゲナーゼリンカーをコードするＤＮ
Ａ コラゲナーゼリンカーとしてはアミノ酸配列２に示すペ
プチドを利用した。アミノ酸配列２（Ｐｒｏ　Ｖａｌ　
Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　）をコードするＤＮＡに、前
記ｈＰＬをコードするＤＮＡおよびＰＡのＤＮＡの消化
サイトと連結するための塩基配列を付加した配列５’Ｇ
Ａ　ＴＣＣ　ＣＣＧ　ＧＴＡ　ＧＧＣ　ＣＣＧ　Ｃ　３
’　と　３’Ｇ　ＧＧＣ　ＣＡＴ　ＣＣＧ　ＧＧＣ　Ｇ
ＧＣ　５’　を持つ１本鎖ＤＮＡをＤＮＡシンセサイザ
ー（アプライドバイオシステム製）で合成した。得られ
たＤＮＡは５’末端がリン酸化されていないので、Ｔ４
ポリヌクレオチドキナーゼにより５’末端をリン酸化し
た。この２つの１本鎖ＤＮＡを７５℃で５分間加熱後、
放冷することによってアニールさせ図１中にコラゲナー
ゼリンカーとして示す２本鎖ＤＮＡとした。この２本鎖
ＤＮＡの両端はそれぞれＢａｍＨＩとＣｌａＩの消化サ
イトに連結することができる。

【００２０】■ＰＡ−コラゲナーゼリンカー−ｈＰＬ融
合蛋白発現ベクターの構築 まずｐＵＣ−ＰＬをＣｌａＩ／ＳａｌＩ消化し、アガロ
ース電気泳動によって６００ｂｐのｈＰＬをコードする
ＤＮＡ配列を得た。一方プロテインＡをコードするＤＮ
Ａを組込んだプラスミドベクターｐＲＩＴ２Ｔ（ファル
マシア製）をＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化し、アガロー
ス電気泳動により４．０Ｋｐｂ　の断片を得た。本実施
例で用いたｐＲＩＴ２Ｔはアンピシリン耐性遺伝子を持
っているので、アンピシリン添加培地によってスクリー
ニングを容易に行うことができる。これら２つのＤＮＡ
断片を、■で得たコラゲナーゼリンカーをコードするＤ
ＮＡ断片とＤＮＡライゲーションキット（宝酒造製）に
よって連結し、ＰＡ−コラゲナーゼリンカー−ｈＰＬ融
合蛋白発現ベクターｐＲＩＴ−ＬＫ−ＰＬ１・２を得た
（図１）。このベクターを発現させて得られる融合蛋白
のアミノ酸配列について、コラゲナーゼリンカーを中心
として示すと次のようになる。／の左右がそれぞれＰＡ
のＣ末端側、ｈＰＬのＮ末端側である。 ・・・Ａｒｇ　Ｇｌｙ　Ｓｅｒ／Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌ
ｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ／Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　・・・ このベクターを常法により大腸菌Ｎ−９９Ｃｌ＋に導入
後、アンピシリン加ＳＯＣ寒天培地に接種し、生じたコ
ロニーから抽出したプラスミドをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ
消化したところ、ｈＰＬをコードするＤＮＡが組込まれ
ていることが確認された。 　　寒天培地とするときは更に１５ｇ　のバクトアガー
を加え、またアンピシリンを加えるときは培地をオート
クレーブ滅菌後、ミリポアフィルター（０．２２μ）を
使って無菌的に添加する。

【００２１】２．ＰＡ−コラゲナーゼリンカー−ｈＰＬ
融合蛋白発現ベクター（ｐＲＩＴ−ＬＫ−ＰＬ１・２）
の発現 １−■で得たｐＲＩＴ−ＬＫ−ＰＬ１・２を常法により
大腸菌Ｎ４８３０−１株に導入し、アンピシリン加ＳＯ
Ｃ寒天培地に接種して１０〜２０個の形質転換コロニー
を得た。形質転換コロニーのうち１つをアンピシリン加
ＳＯＣ培地１０ｍｌに接種し２８℃で一晩前培養した。 得られた培養物の３ｍｌを、アンピシリン加ＳＯＣ培地
３００ｍｌ×２本にそれぞれ植え継ぎ、２８℃で６００
ｎｍにおける吸光度が１．５〜２．０になるまで（約６
〜７時間）振とう培養した。続いて予め５７℃に加温し
たＳＯＣ培地３００ｍｌをそれぞれに加え、更に４２℃
で２〜３時間培養した。この急激な温度変化（２８℃→
４２℃）によってｐＲＩＴ−ＬＫ−ＰＬ１・２の発現が
開始され融合蛋白は菌体内に蓄積する。

【００２２】培養後、培養物を３０分間氷冷し５０００
ｒｐｍ　で４℃、１０分間遠心して集菌した菌体を６０
ｍｌ（培養物の１０％）のＴＳＴ緩衝液に懸濁させた。 ＴＳＴ緩衝液：５０ｍＭ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐＨ
７．６） ５００ｍＭ　　塩化ナトリウム ２ｍＭ　　ＥＤＴＡ １ｍＭ　　ＰＭＳＦ （フッ化フェニルメチルスルホニル：蛋白分解酵素阻害
剤） ０．１％　　Ｔｗｅｅｎ２０ 菌体懸濁液を６００ｎｍにおける吸光度が０．６５以下
になるまで超音波処理することにより溶菌させた。溶菌
後１００００ｒｐｍ　で４℃、４０分間遠心して上清を
採取し、発現蛋白を得た。

【００２３】３．融合蛋白からのｈＰＬの精製２と同様
の方法で得られた７２０ｍｌの溶菌上清をＴＳＴ緩衝液
で２ｌ　に希釈した融合蛋白溶液（２８０ｎｍの吸収に
よって測定した蛋白濃度約１８ｇ　／２ｌ　ＴＳＴ緩衝
液）を出発原料に用いた。なおこの溶液中のｈＰＬ含量
をプロラクチン・エンザイムイムノアッセイキット（メ
ディック・バイオテック製、商品名）で定量したところ
、１１．３ｍｇであった。まずこの融合蛋白溶液をＩｇ
Ｇアフィニティカラム（２．５×１６ｃｍ）に通して（
流速５０ｍｌ／時）融合蛋白を吸着させた後、５ｍＭ酢
酸アンモニウム（ｐＨ５．０）２００ｍｌで洗浄し、３
Ｍ　チオシアン酸カリウム１００ｍｌで融合蛋白を溶出
した。ＩｇＧアフィニティカラムは、常法によりブロム
シアンで活性したセファロース４Ｂ（ファルマシア製）
１５ｇ　にヒトＩｇＧ（メリュ製）２００ｍｇを吸着さ
せ、カラムに充填して活性化したものを用いた。

【００２４】ＩｇＧアフィニティカラム溶出液を２８０
ｎｍにおける吸光度測定により追跡し、ピークを示す分
画をプールした。得られた溶出液は、５ｍＭ炭酸アンモ
ニウム溶液で充分に透析を行ってチオシアン酸カリウム
を除いた。透析後の溶出液について、イムノブロット法
を行ったところ、抗ｈＰＬ抗体とは反応しない７０ＫＤ
の大腸菌膜分画、３０ＫＤのプロテインＡ分画と思われ
るバンド等とともに、５０ＫＤの融合蛋白が含まれてい
ることを確認した。またアフィニティカラムに吸着され
ず通過した分画についてもイムノブロット法を行ったと
ころ抗ｈＰＬ抗体と反応性のバンドは見られずｈＰＬは
融合蛋白として完全にＩｇＧアフィニティカラムに吸着
したものと考えられた。このイムノブロット法の結果か
らもわかるように、溶出液には融合蛋白以外の分画も含
まれている。この状態でコラゲナーゼを作用させて融合
蛋白を開裂させることも可能であるが、最終的な収率を
上げるため更にＨＰＬＣと逆相クロマトグラフィーによ
る精製を行った。なおＨＰＬＣと逆相クロマトグラフィ
ーには、ともにウォーターズの６５０Ｅを用いた。ＨＰ
ＬＣの条件は次のとおりである。 カラム：ＤＥＡＥ−５ＰＷ（東ソー製）７．５ｍｍ×１
５ｃｍ 溶出：緩衝液Ａ ２０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）＋３Ｍ　尿素
緩衝液Ｂ ３００ｍＭ食塩＋５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）＋３Ｍ　尿素 緩衝液Ａで平衡化したカラムに材料をアプライし、緩衝
液Ｂのコンケープ・グラジェントにより溶出した。 材料：前記溶出液を緩衝液Ａで十分に透析したものを用
いた

【００２５】３つの大きな蛋白のピークが確認された。 分離された各分画（１ｍｌ）についてディスク電気泳動
を行ったところ、３つのピークのうち中間のピークに融
合蛋白がＰＡと思われる蛋白とともに溶出されていた。 そこでこのピークをプールし逆相クロマトグラフィーに
よる分離を行った。逆相クロマトグラフィーの条件は次
のとおりである。 カラム：フェニル−５ＰＷ　　ＰＲ（東ソー製）７．５
ｍｍ×１０ｃｍ 溶出：緩衝液Ａ ２０％アセトニトリル（ＣＨ３　ＣＮ）＋０．０５％Ｔ
ＦＡ（トリフルオロ酢酸） 緩衝液Ｂ ８０％ＣＨ３　ＣＮ＋０．０５％ＴＦＡ緩衝液Ａで平衡
化したカラムにＨＰＬＣの溶出液をそのままアプライし
、緩衝液Ｂのリニアー・グラジェントにより溶出した。 ２つの大きな蛋白のピークが確認された。分離された各
分画（１ｍｌ）について、ディスク電気泳動を行ったと
ころ、後半の大きなピークに融合蛋白がほぼ純粋な状態
で分離されていることを確認した。この分画をプールし
て凍結乾燥し、コラゲナーゼによる開裂を行うまで保存
した。

【００２６】４．融合蛋白のコラゲナーゼによる開裂条
件の検討３で得た精製融合蛋白８０μｇ　を６０μｌ　
の消化用緩衝液に溶解し、これにコラゲナーゼ（ベーリ
ンガー・マンハイム製、アケロバクター属由来）６μｌ
　（７．５４ｍｇ−１５ＩＵ−／　２ｍｌ・消化用緩衝
液）を加え、３７℃で３時間反応させた。 反応中、１時間ごとに反応液２０μｌ　を分取し、尿素
を加えて反応を停止後１２．５％ＳＤＳ（６Ｍ　尿素含
有）−ＰＡＧＥ及びイムノブロット法によって消化状況
をモニターした。反応開始後２時間で融合蛋白（５０Ｋ
Ｄ）のバンドがほとんど消失してプロテインＡ（３０Ｋ
Ｄ）とｈＰＬ（２０ＫＤ）のバンドが強く現れ、また３
時間経過後もｈＰＬは消化されないことが確認された。

【００２７】５．ｈＰＬの精製及び性状４の方法を融合
蛋白２．０ｍｇ、コラゲナーゼ１６０μｌ　にスケール
アップし、その反応液からｈＰＬを精製した。コラゲナ
ーゼによる２時間の消化後、尿素を６Ｍ　添加して反応
を停止させた。この反応液をそのまま３と同じ逆相クロ
マトグラフィーカラムにアプライした。３つの鋭いピー
クと２つのブロードなピークが認められ、ｈＰＬは２番
目の鋭いピークとして溶出された。この分画をリン酸緩
衝液で透析して精製ｈＰＬ約４６０μｇ　を得た。この
精製ｈＰＬを１２．５％ＳＤＳ（６Ｍ　尿素含有）−Ｐ
ＡＧＥによって分析したところ、ｈＰＬ以外の蛋白をほ
とんど含まないことが確認された。また気相エドマン分
解法によりＮ末端のアミノ酸配列を確認したところ、 　　　１　　　２　　　３　　　４　　　５　　　６　
　　７　　　８　　　９　　１０　　１１　　１２　　
１３　　１４　　１５　　１６　　１７　　Ｇｌｙ　Ｐ
ｒｏ　Ｐｒｏ　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　Ｐｒｏ　Ｉｌｅ　Ｃｙ
ｓ　Ｐｒｏ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ
　Ｃｙｓ　Ｇｌｎ　Ｖａｌ　　　１８　　１９　　２０ 　　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ　 という結果が得られた。４番目のＭｅｔ　から２０番目
のＡｒｇ　まではｈＰＬの配列と同一である。

【００２８】また１８．３μｇ　の精製ｈＰＬを４Ｍ　
メタンスルフォン酸１０ｍｌで１１０℃、２４時間加水
分解しアミノ酸組成を分析したところ、表１に示す結果
が得られ理論値とよく一致した。

【表１】

【００２９】更に市販のプロラクチン・エンザイムイム
ノアッセイキット（メディック・バイオテック製、商品
名）を用いて、市販のｈＰＬ（下垂体から精製・抽出し
たものおよび遺伝子組み換えによって製造されたもの）
との免疫学的反応性の差について確認したところ、図２
に示すとおり両者の間に大きな差は認められなかった。 加えて、Ｎｂ２　リンフォーマセルを用いた生物検定に
より、下垂体から精製・抽出したｈＰＬと同等の生物活
性（馬血清存在下における増殖支持能）が認められた。 一方３で得た融合蛋白を免疫原として得られる抗体につ
いてヒト成長ホルモンやヒト胎盤性ラクトージェンとの
交差性を調査したところ、これら他のホルモンとの交差
性は認められなかった。

【００３０】

【発明の効果】本発明による遺伝子によって発現された
融合蛋白は、ＩｇＧアフィニティクロマトグラフィーを
中心とする操作によって容易に精製することができる。 しかも融合蛋白をＰＡとｈＰＬとに開裂させるためにコ
ラゲナーゼによる酵素反応を利用するので、その反応条
件はおだやかでｈＰＬに対して悪影響を及ぼすことがな
い。このことは実施例にもあるように精製後のｈＰＬの
免疫学的性状や生物活性が下垂体から精製・抽出したｈ
ＰＬと同様であることから明らかである。更にｈＰＬを
単独で発現させた場合、精製には塩析、ゲル濾過他各種
クロマトグラフィー等多くのステップを要するものと考
えられ、加えて菌体中での自己消化も予想されるため高
い吸収は望めない。それに対し本発明による方法では、
菌体からの粗抽出物中のｈＰＬに対しておよそ３０％と
いう高収率でｈＰＬを精製することができる。しかも得
られるｈＰＬは免疫学的にも生物学的にも下垂体から精
製・抽出した市販品と比較して何らそん色のないもので
ある。

【００３１】また、本発明による遺伝子によって発現さ
れた融合蛋白は、免疫増強活性を持つＰＡ部分を有して
いるので、これを免疫原としてそのまま利用できるとい
う付加的な効果も期待できる。

【００３２】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列を決定した方法：Ｓ 他の情報：コラゲナーゼ作用部位ペプチド配列、配列中
Ｘａａ　は任意のアミノ酸を示す 配列 Ｇｌｙ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｘａａ　１　　　　
　　　　　　　　　　　５

【００３３】 配列番号：２ 配列の長さ：５ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 配列を決定した方法：Ｓ 他の情報：コラゲナーゼ作用部位ペプチド配列配列 Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　１　　　　
　　　　　　　　　　　５

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は本発明による遺伝子発現ベクターの構築
を示す模式図である。

【図２】図２はＰＡ−コラゲナーゼリンカー−ｈＰＬを
コードする遺伝子が連結された部分の配列を示す。

【図３】図３は本発明に利用できるコラゲナーゼリンカ
ーをコードする遺伝子の配列例を示す。

【図４】図４は本発明によって得られたｈＰＬと、下垂
体から精製・抽出したｈＰＬ、および市販の組み換えｈ
ＰＬのＥＩＡの結果を示すグラフである。縦軸は４９２
ｎｍにおける吸光度を、横軸はｈＰＬ量を示す。

【符合の説明】図中ＰＡ　　：プロテインＡをコードす
る領域 Ｔ　　　　：プロテインＡのターミネーター配列Ａｍｐ
：アンピリシン耐性遺伝子 λＰＲ：λＰＲプロモーター領域 ｈＰＬ：プロラクチンをコードする領域Ｌ　　　　：コ
ラゲナーゼリンカーをコードする領域ＰＢＲ３２２ｏｒ
ｉ ：ＰＢＲ３２２ｏｒｉ領域

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】　　ヒトプロラクチン遺伝子と、プロテイ
   ンＡの少くともＦｃ結合活性ペプチドフラグメントを含
   む領域をコードする遺伝子との間にアミノ酸配列１（Ｇ
   ｌｙ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ｘａａ　）で示される
   コラゲナーゼ切断部位をコードする遺伝子を挿入したヒ
   トプロラクチン−プロテインＡ融合蛋白発現遺伝子