JPH02231499A - 免疫グロブリンｇ結合活性を有する新規な蛋白質プロテインｈ、該蛋白質をコードする遺伝子及び該蛋白質の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、人の免疫グロブリンＧ　（ｒｇＧ）のＦｃ領
域と特異的に結合する新規な蛋白質プロテインＨＣＰｒ
ｏｔｅｉｎ旧、該蛋白質をコードする遺伝子及び該蛋白
質の製造法に関する。

微生物細胞由来の蛋白質で免疫グロブリンのＦｃ領域に
親和性を有する蛋白質は、バクテリアルＦｃリセプタ−
（Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｐｃ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ）と
してその存在が知られている　（例えば、Ｂｏｙｌｅら
、ＢＩＤ／ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ　５　　６９７　（１
９８７）参照）。

それらの内で最も良く知られている例はスタフィ口コツ
カス・アウレウス（Ｓｔａ　ｈ　Ｉｏｃｏｃｃｕｓ　　
且匹胚）由来のプロテインＡ（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ）及
びストレブトコッカスＧｌ４８　（Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏ
ｃｃｕｓ　　Ｇｌ４８）由来のプロテインＧ（ＰｒＯｔ
ｅｉ口Ｇ》である。

これらの蛋白質は免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する
事から抗体の定量、精製等に用いられ、生化学研究、臨
床診断薬、モノクローナル抗体の製造等の分野で利用さ
れている。

また、それらの蛋白質を不溶性担体に固定化したものは
、上記の用途の他に、血液中の免疫複合体を吸着、除去
する事による癌、自己免疫疾患の治療等にも用いられて
いる（例えば、Ｃａｎｃｅｒ　　４６６７５　（１９８
０）参照）。

しかしながら、Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａは人を含む多くの動
物種のＩｇＧばかりでなく人のＩｇＡ，　ＩｇＭ等にも
結合する事、又Ｐｒｏｔｅｉｎ　ＧはＩｇＧに特異的で
はあるが人を含む多くの勅物種のＩｇＧと結合する事（
例えば、　Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋ，Ｔｒｅｎｄｓ　　ｉ
ｎ　　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　　５　　７９（１
９８７）参照）から、人のＩｇＧのみを定量、精製、吸
着除去するためにはその結合特異性が広すぎ、例えば他
の動物細胞で生産した人モノクローナル抗体の精製、Ｉ
ｇＧを除去する事による血液浄化等の目的に使用するに
は問題があるものと考えられ、人のＩｇＧに特異的に結
合する蛋白質の開発が望まれている。

人のＩｇＧ　（ＩｇＧ１．　１ｇＧ２．　１ｇＧ３及び
ＩｇＧ４）とは結合するが、ウサギのＩｇＧを除いた多
くの動物種のＩｇＧとは結合しない性質を有する蛋白質
が、グループＡストレプトコッカスの細胞に存在する事
が予想されている（例えば、Ｂｊ６ｒｃｋ　Ｊ．　Ｉｍ
ｍｕｎｏｌ．１３３　９６９（１９８４）参照）が、今
だその様な性質を有する蛋白質は単離されていない。ま
た、グループＡストレプトコッカスから、人のＪｇＧ　
（ＩｇＧＩ，　ＩｇＧ２及びＩｇＧ４）　、ブタＩｇＧ
及びウサギＩｇＧと結合する蛋白質及び人のＩｇＧ３に
特異的に結合する蛋白質の二種類のＩｇＧＦｃ結合性蛋
白質が精製されている（例えば、Ｂｏｙｌｅ　ら、ＢＩ
Ｏ／ＴＢＣ｝ＩＮＯＬＯＧＹ　５　６９７　（１９８７
）参照）が、今だ人のＩｇＧのすべてのサブクラスに結
合する蛋白質は得られていない。

従ッテ、人ノｉｇＧ（ＩｇＧＩ，　ＩｇＧ２，　ＩｇＧ
３及びＩｇＧ４）と特異的に結合し、他の多くの動物種
のＩｇＧ及び人のＩｇＡ，　ＩｇＤ．　ＩｇＥ及びＩｇ
Ｍとは結合しない、ＩｇＧＦＣ結合性蛋白質が存在する
のか否か、又その様な蛋白質を安定に十分量取得し得る
のか否かについては全く不明の状態であった。

本発明者らは、この様な現状のもとで、人の１ｇｃと特
異的に結合する蛋白質を取得すべく研究を重ね、グルー
プＡストレプトコッカスに属するＳ【Ｄ』ユｏｃｏｃμ
ＪＳ　Ｓｐ．　ＡＰＩがこのような性質を有する蛋白質
を生産している事を見い出し、鋭意検討、工夫を重ねた
結果、本発明の蛋白質Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｈがこのような
優れた性質を有する新規な蛋白質である事、又本発明の
遺伝子がＰｒｏｔｅｉｎ　Ｈをコードする遺伝子であり
それを用いてＰｒｏｔｅｉｎ　Ｈを生産する事が可能で
ある事、さらに本発明の製造法によってＰｒｏｔｅｉｎ
　Ｈを大量に生産する事が可能である事を確認し本発明
を完成するに至った。

本発明は、人のＩｇＧを特異的に定量、精製、診断した
り、血液中の余分なＩｇＧを吸着、除去する為に用いら
れる新規な蛋白質Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｈ及びＰｒｏｔｅｉ
ｎ　Ｈを製造する為の遺伝子を提供するとともに、Ｐｒ
ｏｔｅｉｎ　ｆ｛を工業的規模で製造するための方法を
開示するものである。

本発明はまず、グループＡストレプトコッカスに属する
微生物が生産し、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する
能力を有する物質であって、下記の諸性質 ｉ）人のＩｇＧ＜ＩｇＧ１．．　ＩｇＧ２．　１ｇＧ３
及びＩｇＧ４）及びウサギのＩｇＧと結合する ■）マウス、ラット、牛、ヒツジ、ヤギのｌｇＧと結合
しない ｉｉ）人のＩｇＡ，　ＩｇＤ，　！ｇＥ及びＩｇＭと結
合しないを示す新規な蛋白質及び ｉ）人のＩｇＧ　（ＩｇＧ１，　ＩｇＧ２，　ＩｇＧ３
及びＩｇＧ４）、人のＩｇＧＦｃ　、及びウサギのＩｇ
Ｇと強く結合する ｉｉ）豚のＩｇＧと弱く結合する ｉ）マケス、ラット、牛、ヒツジ、ヤギ及び馬のＩｇＧ
と結合しない ｉｖ　）人のＩｇＧＦａｂ，　ＩｇＡ，　ＩｇＤ，　Ｉ
ｇＥ及びＩｇＭと結合しない 性質を示す新規な蛋白質に関する。

本発明では上記の新規な蛋白質をプロテインＨ（Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ旧と称する。

プロテインＨ生産菌株の選択及びプロテインＨの各種の
免疫グロブリンとの結合特性の確認は、例えばラジオア
イソトープ（Ｂｊ６ｒｃｋら、Ｊ．　Ｉｍｍｕｎｏ１．
　１３３　９６９　（１９８４）参照）又は発色基質（
Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋら、Ｊ　．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　
　１６７　８７０　（１９８６）参照）等で標識した蛋
白質を用いた公知の常法に従って行う事ができる。

その様にして選ばれたプロテインＨ生産菌株の一例がＳ
ｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ，　ＡＰＩであり、本
菌株は微工研菌寄第１０３７４号（ＦＥＲＭＰ−１０３
７４　）の番号のもとに微生物工業技術研究所に寄託さ
れている。

プロテインＨは、後述の如くその生産菌、例えばＳｔｒ
ｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＡＰＩの染色体ＤＮＡ
よりプロテインＨ遺伝子を取得し、遺伝子工学的手法に
依って生産、取得する事ができる。Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏ
ｃｃｕｓｓｐ．ＡＰＩの生産するプロテインＨは、その
遺伝子のヌクレオチド配列の解析から第１図に示される
様なアミノ酸配列を有する事が判明しているが、結合特
性に大きな影響を及ぼさない範囲でアミノ酸の置換、又
は挿入、もしくは脱落した蛋白質及びそれらのフラグメ
ントも実質的に本発明のプロテインＨである。

本発明は次に、プロテインＨをコードする遺伝子に関す
る。プロテインＨをコードする遺伝子は次の様にして取
得する事ができる。プロテインＨ生産菌株、例えばＳｔ
ｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＡＰＩを公知の常法
に従って培養し、その細胞より染色体ＤＮＡを取得する
（例えば、Ｆａｈｎｅｓｔｏｃｋら，　Ｊ．　Ｂａｃｔ
ｅｒｉｏｌ．１６７　８７０　（１９８６）参照）。

染色体ＤＮＡを、制限酵素による消化等の生化学的手段
、あるいは剪断力等の物理的手段等によって適当な長さ
のＤＮＡ断片に切断し、適当なクローニングベクター、
例えばλｇｔｌｌ　（例えば、Ｙｏｕｎｇら、Ｐｒｏｃ
．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０　１１９
４（１９８３）参照）等のファージベクター又はｐＵｃ
ｉ８（例えば、Ｍｅｓｓｉｎｇら、Ｇｅｎｅ　３３　１
０３（１９８５）参照）等のプラスミドベクター、の適
当な制限酵素切断部位に挿入した後、適当な宿主細胞、
例えば大腸菌（Ｅ．　　ｃｏｌｉ）に導入する。得られ
た形質転換体中より、人ｒｇＧ又は人１ｇＧＦｃ領域と
結合する蛋白質を生産しているクローンを公知の常法（
例えば、Ｆａｈｎｅｓ　ｔｏｃｋら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒ
ｉｏｌ．　１６７　８７０（１９８６）参照）に従って
選び出す。それらのクローンより、人１ｇＧ又は人１ｇ
ＧＦｃ領域と結合する蛋白質を、後述の如く公知の常法
に従って精製し、各種の免疫グロブリンとの結合特性を
調べ、第２図に示される様な結合特性を有する蛋白質プ
ロテインＨを生産しているクローンを選択する。

この様にして選択されたクローンの一例が、第３図に示
される様なＤＮＡ断片が挿入されている、クローンＦｃ
４及びクローンＦｃｌ６である。

クローンＦｃ４の挿入ＤＮＡ断片について、公知の常法
（例えば、Ｓａｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ　７４　５４６３（１９７７）及
びＣｈｅｎら、ＤＮＡ　４　１６５　（１９８５）参照
）に従って、そのＤＮＡ塩基配列を調べた所第４図に示
される様なＤＮＡ塩基配列であった。

遺伝子を発現させるためには、プロモーターターミネー
ター等の遺伝子発現を制抑するためのＤＮＡ領域が存在
する事が必要であり、第４図に示される遺伝子にはそれ
らのＤＮＡ領域が含まれているが、すでにそれらのＤＮ
Ａ領域を含んでいる各種の発現ベクターを用いて発現さ
せるには、構造遺伝子部分だけから成る遺伝子を用いる
のがより好便である。その様な遺伝子の一例が、第５図
に示される遺伝子であり、第４図の遺伝子から調製する
事も可能であり又公知の常法に従って遺伝子を合成する
事もできる。また、現在では数多くの宿主・ベクター系
が開発されており、それらの中から最も適した宿主・ベ
クター系を選択して使用する事ができるが、各宿主には
各々に適したコドンが存在する事が知られており、それ
らのコドンを使用した遺伝子を用いるのが望ましい。

その様な遺伝子は、第１図に示されるアミノ酸配列に従
って、各々の宿主に適したコドンを用い、公知の常法に
従って合成する事ができる。

本発明はさらに、プロテインＨ遺伝子を含む発現ベクタ
ーで形質転換した宿主細胞を培養する事を特徴とするプ
ロテインＨの製造法に関する。

本製造法は、下記の工程 ｉ）プロテインＨをコードする遺伝子を適当なベクター
に組込む工程 ｉｉ）上記組換えＤＮＡを適当な宿主細胞に導入する工
程 ｉｉｉ）上記組換え体を培養し、プロテインＨを生産す
る工程 ｉｖ　）上記培養物からプロテインＨを単離、精製する
工程 から成る。

第一の工程は、Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　
ＡＰＩの染色体ＤＮＡより取得したプロテインＨ遺伝子
あるいはＤＮＡ合成法によって取得したプロテインＨ遺
伝子を、適当な宿主細胞中で発現させるのに適した適当
なベクターに組込む工程であり、公知の常法に従って該
ベクターを適当な制限酵素で切断した後プロテインＨ遺
伝子を連結すれば良い。

第二の工程は、適当なベクターに連結したプロテインＨ
遺伝子を適当な宿主細胞に導入する工程であり、大腸菌
（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　　ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉ旦ユ、酵母（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍ　ｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の各々の宿
主細胞に適した公知の常法に従って導入すれば良い。

第三の工程は、プロテインＨ遺伝子を保持する組換え体
を培養し、遺伝子を発現させてプロテインＨを生産する
工程であり、各々の宿主細胞及び用いたベクターに適し
た公知の常法に従って培養すれば良い。

第四の工程は、生産されたプロテインＨを上記培養物か
ら単離、精製して取得する工程であり、宿主細胞を超音
波破砕、溶菌酵素処理、摩砕等の公知の常法に従って破
砕し、細胞外に遊離せしめたプロテインＨを、あるいは
培地中に放出されたプロテインＨを、生化学の分野で公
知の常法、例えばイオン交換クロマトグラフィー、ゲル
口過クロマトグラフィ−　　１ｇＧをリガンドにしたア
フィニティクロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフ
ィー、逆相クロマトグラフィー等、を適宜組合わせて単
離、精製すれば良い。

次に本発明を実施例によって具体的に説明するが、実施
例は具体的な認識を得る一助としてのみ挙げられている
ものであり、特許請求の範囲を何ら限定するものではな
い。

性 ヨードジエン（ｒＯＤＯ−ＧＥＮ”，　１，　３，　４
．　６−ｔｅｔｒａｃｈｌｏｒａ−３ａ，６ａ−ｄ：ｐ
ｈｅｎｙＩ　　ｇｌｙｃｏｕｒｉｌ　　　　Ｐｉｅｒｃ
ｅ　Ｃｈｅｍｉｃａ１社製）のジクロルメタン溶液（０
．　１　ｍｇ　／　ｍｌ　）２０μｌをエツペンドルフ
チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　ｔｕｂｅ　）に加え、
傾けて回転させながら窒素ガスを吹きつけて乾固した後
、緩衝液Ａ　［５０ｍＭ　Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　
ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ７．５．０．ｏｌ％Ｐｌｕｒｏｎｉ
ｃ　Ｆ−６８　（ＢＡＳＦ社製）１２００μ１を加え水
浴上にＩＯ分間静置してから同緩衝液を除去した。上記
チューブに１０μｌの０．　５Ｍ　Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅ　　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．　５）及び２５μ１
のＩｇＧ溶液（ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　５　μｇ，ｍｏｕ
ｓｅ　ｒｇＧ　５　μｇ，ｈｕｍａｎ　ＩｇＧＦｃ　３
．３４　μｇ　；　Ｃａｐｐｅ１社製）を加えた後、２
μｌのＮａ　１　２　６　１溶液（ＩＭＳ　３０，　Ｃ
ａｒｒｉｅｒ−ｆｒｅｅ１０Ｑｍｃｉ／　ｍｌ　；　Ａ
ｍｅｒｓｈａｍ社製）を添加し、水冷下１５分間外置（
時々、軽く振り混ぜて）した。この反応液を２００　ｕ
　ｌの緩衝液（１０ｍＭ　Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　
ｂｕｆｆｅｒ　　ｐＨ７．２，　　１５０ｍＭ　ＮａＣ
！）を入れたセラムチューブ（前記の緩衝液Ａ５−で上
記と同様に処理した後使用）に添加し、水浴上５分間静
置した。次に上記の溶液を、緩衝液Ｂ　（３０ｍＭ　Ｎ
ａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｒｅ　ｐＨ７．３，
　１２０ｍＭ　ＮａＣＩ，　０，　ｌ％ＢＳＡ）で平衡
化したＰＤ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社製）に
添加し、同緩衝液Ｂで溶出した。溶出液を０．５１Ｂｌ
づつ分画し、各画分より２μβづつ採取してγ一カウン
ター（Ｒｉａ　Ｇａｍｍａ“ＱｔｌＡＴＲＯ”　　．　
　ＬＫＢ社製）で測定してｆｉｌ標識されたＩｇＧを回
収した。

２，２４ｘｌＯ’　ｃｐｍ／μｇ　（１．１２　ｘｌＯ
”　ｃｐｍ／ｄ）の”Ｉ−ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ．　　８
．９８ＸＩＯ’　ｃｐｍ／＋Ｊ　（３　ｘｌＯ”ｃｐｒ
ｎ／ｄ）の”ｓＩ−ｈｕｍａｎ　ＩｇＧＦｃ及び２．４
２Ｘ１０’　ＣＩ）ｍ／μｇ　（１．２１　ｘｌＯ”　
ｃｐｍ／ｉ）の””ｒ−ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧが得られた
。

一白金耳のＳｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＡＰ
Ｉ細胞を、５一のＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉｔ　ｔ培地（ＤＩ
ＦＣＯ社製）に接種し、３７℃、ＩＯ時間培養した。こ
の培養液２−を１００ｍｊのＴｏｄｄ−｝１ｅｗｉｔｔ
培地に加え、３７℃、１３時間培養した後、遠心分離に
よって集菌した。

菌体細胞を緩衝液Ｃ　　（３０ｍＭ　Ｎａ−Ｐｈｏｓｐ
ｈａｔｅｂｕｆｆｅｒ　　ｐＨ７，２，　　１２０ｍＭ
　ＮａＣＩ，０。０５％　Ｔｗｅｅｎ　　２０．０．０
２％ＮａＮ３）１００−で洗浄後、細胞濃度が１０７〜
１０″’　ｃｒｕ／一となる様に同緩衝液Ｃで希釈した
。　１０’〜ｌＯｃｆｕ／一の各濃度の細胞懸濁液各２
００μｌをセラムラユーブに取り、前記の１２５１標識
したＩｇＧ　（ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　１０ｎｇ，　ｈｕ
ｍａｎ　ＩｇＧＦｃ５．２ｎｇ，ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　
１０ｎｇ）を加え撹拌した後、３７℃２時間静置した。

反応終了後、緩衝液Ｃ、２ｄを加えて撹拌した後遠心分
離を行って細胞を回収した。細胞をさらに２一の緩衝液
Ｃで同様に処理した後、細胞と結合（２た１２１ｉ標識
１ｇＧ量をγ一カウンターで測定した。

第７図に示した結果から明らかな様に鉦匹匹匹ｏｃｃｕ
ｓ　ｓｐ．　ＡＰＩ細胞はｈｕｍａｎ　ＩｇＧ及びｈｕ
ｍａｎ　ＩｇＧＦｃとは結合するが、ｍｏｕｓｅ　Ｉｇ
Ｇとは結合しない事が確認された。

一白金耳のＳｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＡＰ
Ｉ細胞をｌｏｄのＴｏｄｄ−Ｈｅｗｉ　ｔｔ培地に接種
し、３７℃、１３時間培養した。この培養液８ｄを４０
０−のＴｏｄｄ−｝１ｅｗｉ　ｊｔ培地に加え、３７℃
、３時間培養（Ａｓｉｏ＝０．６）ｔ，た後、２２１ｎ
ｌのｌＯ％ｃｙｓｔｅｉｎｅ及び２６ｄの０．４Ｍ　Ｄ
Ｌ−Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅを添加した。１時間培養後、２
５０ｄの１５％ｇｌｙｃｉｎｅを添加してさらに２時間
培養を継続した。

培養終了後、遠心分離によって集菌し、０．２Ｍ酢酸ソ
ーダで洗浄した。洗浄菌体を２７％Ｓｕｃｒｏｓｅ及び
ＩＯｍＭ　ＥＤＴＡを含む緩衝液Ｄ　（０．１５ＭＮａ
Ｃｌ，０．０１５ＭＮａ．−ｃｉｔｒａｔｅ　ｐ８７．
４　〜７．６）４０，７に懸濁し、２５００単位のＭｕ
ｔａｎｏｌｙｓｉｎを加え、３７℃、３時間インキユベ
ートした。この反応液に、４ｄのｌＯ％ＳＤＳ及びｐｒ
ｏｔｅｉｎａｓｅ　Ｋ（０．　２ｗ＋ｇ／　ｍｌ　）を
加え室温で一晩インキユベートした。

反応終了後、フェノール抽出、エーテル抽出を行い、水
層に２倍容の冷エタノールを加え、析出したＤＮＡをガ
ラス棒に巻き取って回収した。

回収したＤＮＡを５−の緩衝液Ｄに溶解し、ＲＮａｓｅ
　Ａ　（１００μｇ／ｍ／）を加え、３７℃、１時間イ
ンキユベートした後、フェノール抽出、エタノール沈澱
を行ってＤＮＡを回収した。

約１■の染色体ＤＮＡが得られた。

実施例３　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｈ遺　　のクローニング
実施例２で得られた染色体ＤＮＡ約１００μｇをｌＯｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ（ｐＨ７．５）及び１　ｄ　Ｅ
ＤＴＡから成る緩衝液２００μｌに溶解し、注射針（２
７Ｇ）を通過させその剪断力によって２〜１０ＫｂのＤ
ＮＡ断片とした。

このＤＮＡ断片約１０μｇを、４０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　（ｐＨ７．５），　５　ｍＭ　ＤＴＴ，　ｌＯｍ
Ｍ　ＭｇＣＩｔ，　ｏ．　１　■／ｍｌ　ＢＳＡ，　５
０μＭ　ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，　ｄＴＴＰ．　ｄＧＴＰ
，　ｄＣＴＰ）及び１０単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ
から成る反応液中で２４°Ｃ，２時間反応させて平滑末
端とした後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行って
ＤＮＡを回収した。平滑末端としたＤＮＡ断片を、ｌ０
０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．　０）．　１００
ｍＭ　ＮａＣｌ，　１　ｍＭ　ＥＤＴＡ，８０μＭ　Ｓ
−ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ及び２００単
位のＥｃｏＲＩ　ｍｅｔｈｙｌａｓｅから成る５０μｌ
の反応液中で３７℃、２０分間反応させてメチル化した
後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行ってＤＮＡを
回収した。メチル化したＤＮＡ断片と市販のすでにリン
酸化されているＥｃｏＲ　［リンカーを、市販のライゲ
ーションキット　（宝酒造社製）を用いて１６°Ｃ，１
２時間反応させて連結した後、緩衝液Ｅ　（１０ｍＭ　
Ｔｒｉｓ−｝１ｃＩ　ｐＨ７，　５，　ｌ００ｍＭ　Ｎ
ａＣ！，　１０ｍＭ　ＭｇＣＩ！＋　ｌｍＭ　ＤＴＴ）
及び２００単位のＥｃｏＲ　Ｉから成る反応液中で３７
℃、１２時間反応させた。

反応終了後、フェノール抽出、イソプロパノール沈澱を
行ってＤＮＡを回収した。

このＤＮＡ約０、５μｇと、市販のすでにＥｃｏＲ　Ｉ
及びｐｈＯｓｐｈａｔａｓｅで処理されたλｇｔｌｌ　
ＤＮＡ約ｌμｇＰｒｏｔｏｃｌｏｎｅ”　λ　ｇｔｌｌ
　　ｓｙｓｔｅｍ　　　二　　Ｐｒｏｍｅｇａ　　Ｂｉ
ｏｔｅｃｈ社製）を、緩衝液Ｆ（６６［ＯＭ　Ｔｒｉｓ
　−ＨＣＩ　ｐｔ｛７．６，　６．６ｍＭ　ＭｇＣＩ，
，　ｌＯｍＭ　ＤＴＴ，Ｏ．　Ｉｎ＋ｌＪ　ＡＴＰ）及
び４００単位のＴ４　ＤＮＡリガーゼから成る１３μ！
の反応液中で、■６℃、１６時間反応させて連結した。

この反応液を、市販のｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ｐａｃｋａｇ
ｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｇｉｇａｐａｃｋ　Ｇｏｌｄ；　　Ｓ
ｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）を用いてファージ粒子とし、
Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＡＰＩの遺伝子
ライブラリーとした。大腸菌ＹＩ０９０株を用いてバッ
ケージング効率を測定した所、３．２　ＸＩＯ’　ｐｆ
Ｕ／μｇλｇｔｌｌ　ＤＮＡの効率であった。

大腸菌Ｙｌ０９０株をＬＢＭ培地［ＬＢ培地（Ｂａｃｔ
ｏ　ｔｒｙｐｔｏｎｅ　　ｉ　％，　　Ｙｅａｓｔ　　
ｅｘｔｒａｃｔ　　Ｏ．　　５％，ＮａＣＩＯ．５％．
ｐＨ７．２）．１０ｍＭ　ＭｇＳＯ＋，０．２　　％ｍ
ａｌｔＯｓｅ，５０　　μｇ／＋＋Ａ’　Ａｍｐｉｃｉ
ｌｌｉｎ　ｌ　中でＡ．．．＝０．６まで生育させた後
、０、２艷の培養液を採取し、遠心分離を行って集菌し
た。

菌体細胞を０．２ｉの緩衝液Ｇ　（１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ
−ＨＣＩｐｔ｛７．　４，　ｌＯｍＭＭｇｓ０４，　ｏ
．　ｏｌ％ｇｅｌａｔｉｎ）に懸濁し、１００μｌの緩
衝液Ｇ及び７．６μｌの遺伝子ライブラリーファージ粒
子液（５　Ｘ　１０’　ｐｆｕ）と混合して３７℃、２
０分間インキユベートした。この反応液に７−のソフト
アガー液（ＬＢＩＪ培地、０．４％ｓｏｆ　ｔａｇａｒ
，　４７°Ｃ）を加え撹拌した後、ＬＢＭ培地で作成し
たプレート　（φ１５０ｍｍ）上に重層した。４２℃で
３時間培養した後、２０ｍＭ　ＩＰＴＧ溶液中に５分間
浸した後に風乾したニトロセルロースフィルター（ＢＡ
８５，φ１４２ｍｍ　；　Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎ
ｄ　Ｓｃｈｕｅｌ１社製）をのせ、さらに３７℃で１６
時間培養した。

培養終了後、ニトロセルロースフィルターを取り除き、
以下室温でゆるやかに振盪しながら次の様に処理した。

ニトロセルロースフィルターを緩衝液旧１０ｍＭ　Ｖｅ
ｒｏｎａｌ　ｂｕｆｆｅｒ　ｐＨ７．４．０．　１５Ｍ
　ＮａＣＩ）５０　ｍｌ中で５分間処理した後、０．２
５％ｇｅｌａｔｉｎ及びｏ．２５％Ｔｗｅｅｎ２０を含
む緩衝液Ｈ　５０１ｎ！中で１時間インキユベートした
。次に、０．１％ｇｅｌａｔｉｎを含む緩衝液Ｈ　４０
一中に２μｇ／ｔｒｉの濃度となる様に溶解したｈｕａ
＋ａｎ　ＩｇＧＦｃ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　（Ｃａｐｐｅ
ｌ社製）と３時間インキユベートシた後、０．１％ｇｅ
ｌａｔｉｎを含む緩衝液Ｈ　４０Ｊで洗浄した（１０分
間、３回）。さらに、０．１％ｇｅｌａｔｉｎを含む緩
衝液Ｈで１，　０００培に希釈したｇｏａｔａｎ目−ｈ
ｕｍａｎ　ＩｇＧＰｃ（Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｃｏｎ
ｊｕｇａｔｅ，ａｆｆｉｎｉｔｙ　ｐｕｒｉｆｉｅｄ　
；　Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）溶液４〇一中で１時間
インキユベートした後、０．１％ｇｅｌａｔｉｎを含む
緩衝ＩＨ　４０ｄ　（１０分間、３回）及び緩衝液Ｋ　
（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７．５，　０．５
Ｍ　ＮａＣｌ）　４０ｄ　（５分間、１回）で洗浄した
。

このフィルターを発色液（２０■４−Ｃｈｌｏｒｏ−１
−ｎａｐｈｔｈｏｌ／６．６　ｙｄ　［Ｉ１ｅｔｈａｎ
ｏＩ，２０ａ　ｌ　Ｈ，Ｃｈ／３３．４ｒｔ緩衝液Ｋ）
中に浸し、３０分間放置して発色させた。

約７万個のプラーク中に１７個の紫色に発色したブラー
クが認められた。これらのブラークをかき取り、５００
μｌの緩衝液Ｇに懸濁し、１０μｌのクロロフォルムを
加え、４０分間放置した後、遠心分離（１０．００Ｏｒ
ｐｍ，　１分間）を行った。この上清を用いて上記の操
作を繰返してシングルプラークアイソレーションを行い
、安定なクローンＦｃ４及びＦｃｌ６を得た。　クロー
ンＦｃ４及びＦｃｌ６の生産する　ＩｇＧＦｃ結合性蛋
白質をＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ法で解析した
ところ、両蛋白質は見掛の分子量が約４５Ｋダルトンで
ある同一分子量の蛋白質であった。

クローンＦｃ４及びＦｃｌ６のフ７−ジ溶液（約１０１
０ｐｆｕ／ｉ）各４００μｌを大腸菌Ｙ１０９０株の培
養液４ｏＯμｌと混合し、前記のソフトアガー液８−を
加え、ＬＢ培地で作成したプレート８枚に重層した。

３７℃で１６時間培養した後、プレート１枚当たり１５
一の緩衝液Ｍ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　・ＨＣＩ　ｐＨ
７．　５，　ＩＯＯｍＭ　ＮａＣＩ８。１ｍＭ　ＭｇＳ
Ｌ．　０．　０１％ｇｅｌａｔｉｎ）を加えて４°Ｃで
３時間振盪した。

この緩衝液を集め、さらにプレート１枚当たり２−の緩
衝液Ｍで洗浄したものを加え１０分間放置した後、２−
のクロロフォルムを添加、撹拌し、遠心分離（７，　０
００ｒｐｍ，　１５分間）を行った。

上溝をさらに遠心分離（１７，　０００ｒｐｍ，　３時
間）して沈澱を回収した。沈澱を０．　５１ｄの緩衝液
Ｍに懸濁し、ＣｓＣＩを０．５■／一となる様に加え、
遠心分離（２２．００Ｏｒｐｍ，　２時間，４℃）を行
ってファージ粒子を回収した。ファージ粒子懸濁液を、
５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　−ＨＣＩ，　ｐＨ８．０，　ＩＯ
ｄ　ＮａＣＩ及びＩＯｍＭ　ＭｇＣＩｔから成る緩衝液
に対して透析した。透析液に、ＥＤＴＡ（終濃度２０ｍ
Ｍ）．　ＳＤＳ　（終濃度０．５％）及びＰｒｏｔｅｉ
ｎａｓｅ　Ｋ　（終濃度５０μｇ／１ｄ）を加え６５℃
、１時間インキユベートした後、フェノール抽出、クロ
ロフォルム抽出を行った。

水層を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８．　０及び
１　ｍＭ　ＥＤＴＡから成る緩衝液に対して透析した後
、エタノール沈澱を行ってＤＮＡを回収した。

得られたファージＤＮＡ約２００μｇを、１０ｍＭ　Ｔ
ｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ７．５及び１　ｍＭ　ＥＤＴＡ
から成る緩衝液２００μｌに溶解し、制限酵素開裂パタ
ーンの解析を行った所、クローンＦｃ４及びＦｃｌ６は
各々第３図に示される様な挿入ＤＮＡ断片を有していた
。

クローンＦｃ４及びＦｃｌ６より調製したファージ粒子
を用い、Ｙｏｕｎｇらの方法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．
　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．ＵＳＡ　８０　１１９４　（１
９８３）参照）に従って、両ファージを大腸菌Ｙｌ０８
９株に溶原化した。

実施例４　　Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｈの抗　結合　異性ファ
ージＦｃ４を溶原化した大腸菌Ｙｌ０８９株を前記のＬ
ＢＭ培地４０ｄ中で２８℃、１６時間培養した後、２Ｉ
！のＬＢＭ培地に添加し２８℃、　１４５分間培養を行
った。

この培養液に、ＩＰＴＧを終濃度がｌｍＭになる様に添
加し、４２℃、４５分間培養した後、培養温度を３７℃
にもどし、さらに１時間培養した。培養終了後、遠心分
離を行って集菌し、５０ｍＭ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂ
ｕｆｆｅｒ（ｐＨ７．　２）、５　ｍＭ　ＥＤＴＡ．　
５　ｍＭ　ｂｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ　・ＨＣＩ及び５　
ｍＭ　Ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅから成る緩衝液１０
０１ｎｌに懸濁してＩＯ分間の超音波破砕を行った。細
胞破砕液を低速遠心して細胞断片を除去した後、超遠心
分離（５０．　ＯＯＯｒｐｍ，　３０分間）を行ってそ
の上清を得た。

この上清を、緩衝液Ｎ　（５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　ｐＨ７．　６．　１５ＯｍＭ　ＮａＣＩ，　　０，０
５％　Ｔｗｅｅｎ　　２０）、２．　５Ｍ　Ｎａｌ　（
ｐ｝１７．　２）及び緩衝液Ｎの各々　４００ｄで洗浄
した後緩衝液Ｎで平衡化したＩＯＪのＩｇＧ−Ｓｅｐｈ
ａｒｏｓｅ（　６　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ；　Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ社製）カラムに添加した。緩衝液Ｎ３００　１
ｒＩでカラムを洗浄した後、４０−の２．５Ｍ　Ｎａｌ
（ｐＨ７．　２）でプロテインＨを溶出した。

溶出液を０．　５ｄずつ分画し、各画分より少量液をサ
ンプリングしてニトロセルロースフィルター上にスポッ
トした後、実施例３で示した発色法によってプロテイン
Ｈ溶出画分を検出した。

プロテインＨ溶出画分を集め、５０ｍＭ　Ｐｈｏｓｐｈ
ａｔｅｂｕｆ　ｆｅｒ（ｐＨ７．　２）、０．　１５Ｍ
　ＮａＣｌ及び０．２５％Ｎａｌから成る緩衝液Ｉ１及
び５０ｍＭ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐ｝
１７．２）及び０．　１５Ｍ　ＮａＣｌから成る緩衝液
５１×２回に対して透析した後、Ａｍ：ｃａｎ　ＹＭ−
５ＣＡｍｉｃｏｎ社製）を用いて約１一に濃縮した。こ
の濃縮液を、５０ｍＭ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ　ｂｕｆｆ
ｅｒ（ｐｔ｛７．５｝及び０．２Ｍ　ＮａＣＩから成る
緩衝液で平衡化した肝ＬＣ用ゲルロ過カラム（７．５φ
ｍｍＸ６０ｃｍ）ＴＳＫｇｅｌ　Ｇ−３０００　ＳＷ（
東洋曹達社製）に添加し、同緩衝液で溶出した（流速０
．４ｄ／ｍｉｎ）。

３４〜３６分の位置に溶出されるプロテインＨ画分を集
めＡｍｉｃｏｎ　ＹＭ−５で濃縮した。この濃縮液を、
０．ＩＭ　Ｇｌｙｃｉｎｅ／ＮａＯＨ（ｐＨ１０．０）
及びｌｍＭ水酸化テトラーｎ−ブチルアンモニウムから
成る緩衝液で平衡化した逆相ＨＰＬＣ力ラム（４．６φ
ｍｍＸ　７．　５　ａｎ　）ＴＳＫｇｅｌＰｈｅｎｙｌ
−５ＰＷ　ＲＰ（東洋曹達社製）に添加し、アセト二１
・リルの直線濃度勾配（０％→６６％，２％／ｍｉｎ）
を用いて溶出した。１６分付近の位置に溶出されるプロ
テインＨ画分を集め、約２一になるまで減圧濃縮した。

この濃縮液を水で平衡化したＰＤ−１０カラム（Ｐｈａ
ｒｍａｃ　ｉａ社製）に添加し、水で溶出して脱塩を行
った。約５３μｇの蛋白質が得られ、その分子量を実施
例３で示した発色法を用いたＷｅｓｔｅｒｎ−ｂｌｏｔ
ｔｉｎｇ法によって測定した所約４５　ＫＤａであった
。

プロテイ：／Ｇ　（ＰｒｏｔｅｉｎＧ　；　Ｇｅｎｅｘ
社製）約ｌＯμｇ及び上記のプロテインＨ約ＩＯμｇを
Ｎ　ａ　＋　２　５　１を用いて、実施例１に示した方
法に従って標識した。

１．２８ｘｌ０７ｃｐｍ／μｇ　（８．５　ｘｌＯ’　
ｃｐｍ／ａ／）の”Ｉ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｇ及び１．６
８　ｘｌＯ’　ｃｐｍ／μｇ　（１．４ｘ１０”　ｃｐ
ｍ／，７）の”’ｌ−Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｈが得られた。

Ｈｕｍａｎ　　ＩｇＧ１，ｈｕｍａｎ　　ＩｇＧ２，ｈ
ｕｍａｎ　　ＩｇＧ３，ｈｕｍａｎＩｇＧ４　（以上Ｐ
ｒｏ　ｒｏｇｅｎ社製）　、ｈｕ＋＋＋ａｎ　ＩｇＭ．
　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ　　ＩｇＡ，　　ｈｕｍａｎ
　　ＩｇＧ，　　ｒａｂｂｉｔ　　ＩｇＧ　，ｓｈｅｅ
ｐ　　ＩｇＧ，ｂｏｖｉｎｅ　ＩｇＧ　．　ｇｏａｔ　
ＩｇＧ　（以上Ｃａｐｐｅｌ社製）、ｈｕｍａｎ　Ｉｇ
Ｄ，　ｈｕｍａｎ　ＩｇＥ（以上Ｓｅｒｏｔｅｃ社製）
　、ｒａｔＩｇＧ　（Ｊａｃｋｓｏｎ　Ｉｍｍｕｎｏｒ
ｅｓｅａｒｃｈ社製）　、ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　（Ｚｙ
ｍｅｄ社製）及びｈｕｍａｎ　ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ　
ＩｇＧを、前記の緩衝液Ｋに溶解し、同緩衝液Ｋで０．
０８〜１０ｎｇ／２００μｌとなる様に希釈した。各々
の希釈液２００μｌをニトロセルロースフィルター（Ｓ
ｃｈ　Ｉｅ　ｉｃｈｅｒａｎｄ　Ｓｃｈｕｅ１１社製》
上に添加し、８１０−ＤＯＴ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用
いて吸着させた。フィルターを緩衝液Ｋ，　０．２５％
ｇｅｌａｔ　ｉｎ及び０．２５％Ｔｗｅｅｎ−２０から
成る緩衝液４０ｍ／中で４２℃、１．５時間インキユベ
ートした後、０．１％ｇｅｌａｔｉｎを含む緩衝液Ｋ　
４０一中で室温１５分間のインキュベーションを２回繰
返して洗浄した。洗浄したフィルターを緩衝液Ｋ，０．
１％ｇｅｌａｔｉｎ及び１２Ｊ−ＰｒｏｔｅｉｎＧ　Ｏ
．５μｇ（１．６　ＸＩＯ’／一）又は目’Ｉ−Ｐｒｏ
ｔｅｉｎ｝ｌ　Ｏ．５　μｇ　（２．ｌＸ　１０’　ｃ
ｐｍ／ｄ＞から成る反応液４０ｍ７！中で室温３時間イ
ンキユベートした。

反応終了後、フィルターを反応液中から取り出し、緩衝
液Ｋ，０．２５％ｇｅｌａｔｉｎ，　０．２５％Ｔｗｅ
ｅｎ−２０及び０．８５Ｍ　ＮａＣＩから成る洗浄液４
ｏ一中で室温１５分間のインキュベーションを４回繰返
して洗浄した。

フィルターを乾燥した後、オートラジオグラフィーを行
って、ＰｒｏｔｅｉｎＧ及びＰｒｏｔｅｉｎ　Ｈの各種
抗体に対する結合特異製を解析した。

第２図に示すオートラジオグラムから明らかな様に、Ｐ
ｒｏｔｅｉｎ　Ｈは、 ｉ　）　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧ　（　ＩｇＧ１．　　Ｉｇ
Ｇ２，　　ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）及びｒａｂｂｉｔ　
ＩｇＧと結合するが、ｉｉ　）　ｍｏｕｓｅ　ＩｇＧ　
，　ｒａｔ　ＩｇＧ　，　ｂｏｖｉｎｅ　ＩｇＧ，Ｓｈ
ｅｅｐＩｇＧ　　．　　ｇｏａｔ　　［ｇＧ，　　ｈｕ
ｍａｎ　　ＩｇＡ，　　ｈｕｍａｎ　　ＩｇＤ，ｈｕｍ
ａｎ　ＩｇＥ及びｈｕｍａｎ　ＩｇＭとは結合しない事
が確認さた。

実施例５　　Ｐｒｏｔｅｉｎ｝ｌ遺伝　のＤＮＡ塩基配
実施例３で得たクローンＦｃ４のファージＤＮＡ約１０
μｇを緩衝液Ｐ　（１０ｍｌＪ　Ｔｒｉｓ　　−ＨＣＩ
　ｐＨ７．５，ｌＯａ＋ＭＭｇＣＩｔ，　ｌ　ｍＭ　Ｄ
ＴＴ）　、３０単位のＳａｃｌ及び４２単位のＫｐｎｌ
を含む１００μｌの反応液中で３７℃、５時間インキユ
ベートした後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行っ
てＤＮＡを回収した。一方、プラスミドｐｕｃ　１Ｂ約
８μｇを緩衝液Ｐ，２０単位のＳａｃｌ及び１４単位の
Ｋｐｎｒを含む３０μｌの反応液中で３７℃ｌＯ時間イ
ンキユベートした後、フェノール抽出、エタノール沈澱
を行ってＤＮＡを回収した。回収したＤＮＡを５０μｌ
の１　１７　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８．　０）に溶解
し、０．３６単位のＢａｃｔｅｒｉａｌ　Ａｌｋａｌｉ
ｎｅ　Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＢＡＰ）を加え６５℃
、３０分間インキユベートした後、さらに０．３６単位
のＢＡＰを加え６５℃、３０分間インキユベートし、フ
ェノール抽出エタノール沈澱を行ってＤＮＡを回収した
。

ＢＡＰ処理した上記のｐＵｃｌ８約０．５μｇとＳａｃ
［及びＫｐｎｌで切断した上記のファージＤＮＡ約０，
１μｇを、前記の緩衝液Ｅ及びＩＯ単位のＴ４　ＤＮＡ
リガーゼから成る３０μｌの反応液中で１６℃、１６時
間インキユベートして連結した。この反応液を用いて大
腸菌Ｊｌｉｌｌ０９株を形質転換し、アンピシリン耐性
の形質転換体を得た。それらの形質転換体よりプラスミ
ドＤＮＡを調製し、制限酵素開裂パターンの解析を行っ
て第６図に示される様なプラスミドｐＰ！｛−　１を含
む形質転換体を選び出した。

プラスミドｐＰＨ−　１約ｌＯμｇを前記の緩衝液Ｅ、
１２単位のＢａｍＨＩ及び１２単位のＰｓｔｌから成る
反応液２５μ！中で３７°０８時間インキユベートした
後、フェノール抽出、エタノール沈澱を行ってＤＮＡを
回収した。回収したＤＮＡをＫｉｌｏ−Ｓｅｑｕｅｎｃ
ｅ用Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　Ｋｉｔ　（宝酒造社製）で処理
した後、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換し、アンビシリ
ン耐性の形質転換体を得た。これらの形質転換体よりプ
ラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素開裂パターンの解析
を行って、第６図に示される様なデリーションプラスミ
ドを含む形質転換体を選び出した。

上記の各々のデリーションプラスミド及びｐＰＨＩ各々
約３μｇを、２　Ｎ　ＮａＯｔ｛２　ａ　ｌ及び２　ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡ２μｌを含む２０μｌの反応液中で室温、
５分間変性させた後、エタノール沈澱を行ってＤＮＡを
回収した。回収したＤＮＡの塩基配列を、ＳＥＱＵ［Ｅ
ＮＡＳＥ（東洋紡社製）、Ｃ　ａ　−”Ｐｌ　ｄＣＴＰ
　（　〜８（１（ｌｃｉ／ｍ　ｒａｏｌｅ　；　Ａｍｅ
ｒｓｈａｍ社製）及びブライ７−Ｍ３（宝酒造社製）を
用いて解析した。

ブラスミドｐＰＨ−　１に含まれるＳｔｒｅ　ｔｏｅｏ
ｃｃｕｓ　ｓｐ．ＡＰＩ染色体ＤＮＡ由来のＤＮＡ断片
の塩基配列は、第４図に示される様な塩基配列であった
。このＤＮＡ断片中には、遺伝子の発限に必要な、プロ
モーター領域、ＳＯ配列、ＡＴＧ開始コドンから始まり
　ＴＡＡ終止コドンで終る３７６（開始のＭｅｔを含む
）個のアミノ酸配列をコードするプロテインＨ構造遺伝
子等が含まれていた。

また、プロテインＨをコードする構造遺伝子は第５図に
示される様に、Ｍｅｔで始まり　Ａｓｎで終る３７６個
のアミノ酸配列をコードしているが、Ｍｅｔから４１番
目のＡｌａまではグラム陽性菌の蛋白質分泌に必要と考
えられているシグナル配列と共通の性質を有している事
から、成熟プロテインＨはＧｌｕから始まりＡｓｎで終
る３３５個のアミノ酸配列から成る蛋白質であると予想
される。

実施例６　紅監土Ω３１ 実施例５で得た組換え体』．赳旦ＪＭ１０９（ｐＰｆ｛
−１）を５０μｇ／一のアンビシリンを含む前記のＬＢ
培地４ｏ一中で３７℃、１６時間培養した。この培養液
を−ヒ記の培地２ｌ中に添加し、３７℃、４．５時間培
養した後、遠心分離を行って集菌した。

菌体細胞をＮｏｓｓａｌら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
　２４１　．３０５５　（１９６６）参照）のコールド
オスモティックショック法（ｃｏｌｄ　ｏｓｍｏｔｉｃ
　ｓｈｏｃｋ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）に従って処理して
ペリプラズム画分（ｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃ　ｆｒａｃ
ｔｉｏロ）を得た後、超音波処理を行って細胞質及び膜
両分（ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ　ａｎｄ　ｍｅｍｂｒａ
ｎｅ　ｆｒａｃｔｉｏｎ）を得た。

細胞質内に存在するβ−ガラクトシダーゼ（βｇａｌａ
ｃｔｏｓｉｄａｓｅ）活性の９５％以上が上記の細胞質
及び膜画分に認められ、ペリプラズム画分内に存在する
β−ラクタマーゼ（β−１ａｃｔａｍａ．ｓｅ）活性の
９５％以上が上記のべリプラズム画分に認められことよ
り、両両分間の相互の混入がほとんどないことが確認さ
れた。

両画分を実施例３で示したＷｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔ
ｉｎｇ法で解析した所、細胞質及び膜画分にのみ実施例
３及び実施例４で示した約４５Ｋダルトンのプロテイン
Ｈが認められた。一方、ペリプラズム画分には約４２Ｋ
ダルトンのプロテインＨが認められた。

実施例６で得られたべリブラズム画分から約４２Ｋダル
トンの見掛けの分子量を有するプロテインＨを実施例４
で示したアフィニティク口マトグラフィー及びゲル濾過
クロマトグラフィーを用いて精製し、約４■のプロテイ
ンＨを得た。精製したプロテインＨのＮ末アミノ酸配列
をアミノ酸シーケンサーを用いて解析した所、Ｇｌｕ−
Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−１　１ｅ−Ａｓｐ−Ｔｒｌｌ
−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕの配列であることが判明し、
実施例５で示した様に４１個のアミノ酸からなるシグナ
ル配列が除去されている事が確認された。

上記のプロテインＨを実施例Ｉに示した方法に従って標
識した。この標識されたプロテインＨを用い、実施例４
に示した方法に従ってプロテインＨの抗体結合特異性を
調べた。実施例４で用いた各種抗体の他にｈｕｍａｎ　
ＩｇＧＦｃ　，　ｈｕｍａｎ　ＩｇＧＦａｂ（以上、ｃ
ａｐｐｅｔ社製）　、ｈｏｒｓｅ　ＩｇＧ　，　ｐｉｇ
　ＩｇＧ（以上、Ｃｏｏｐｅｒ社製）との結合性の同時
に調べた。

第８図に示すオートラジオグラムから明らかな様に、ベ
リブラズム画分に局在するプロテインＨは、 ｉ）人のＩｇＧ　（ＩｇＧ１．　ＩｇＧ２，　［ｇＧ３
及びＩｇＧ４）、人のＩｇＧＦｃ　、及びウサギのＩｇ
Ｇと強《結合するｉ）豚のＩｇＧと弱く結合する ｆｆｉ）マウス、ラット、牛、ヒツジ、ヤギ及び馬のＩ
ｇＧと結合しない ｉｖ）人のＩｇＧＦａｂ，　ＩｇＡ，　ｒｇＤ，　Ｉｇ
Ｅ及びＩｇＭと結合しない 事が、確認された。

【図面の簡単な説明】

第１図は、プロテインＨのアミノ酸配列を表わす。 第２図は、プロテインＨの各種抗体に対する結合特異性
を表わす。 第３図は、ｈｕｍａｎ　ＩｇＧＦｃ結合性蛋白質産生ク
ローンＰｃ４及びＦｃｌ６のＳｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕ
ｓ　ｓｐ，　ＡＰＩ染色体ＤＮＡ由来の挿入ＤＮＡ断片
を表わす。 第４図は、クローンＦｃ４の挿入ＤＮＡ断片の塩基配列
を表わす。 第５図は、プロテインＨ構造遺伝子の塩基配列を表わす
。 第６図は、塩基配列決定に使用したプラスミドｐＰ｝Ｉ
−　１及びそのデリーションプラスミドを表わす。 第７図は、Ｓｔｒｅ　ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐ．　ＡＰ
Ｉ細胞と人及びマウスの■ｇＧとの結合性を表わす。 第８図は、ペリブラズム画分に局在するプロテインＨの
各種抗体に対する結合特異性を表わす。 第　ｌ　図（その１） ■汀ＴＨＲ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＧＬＮ　Ｔｌ｛Ｒ　ＬＹ
Ｓ　ＬＹＳ　ＡＳＮ　ＴＹＲ　ＳＥＲ　ＬＥυ＾ＲＧ　
ＬＹＳ　ＬＥＵ＾ＬＡ　ＧＬＹ　ＰＨＥ　ＡＬＡ　ＡＳ
Ｎ　ＧＬＮ　ＴＨＲ　ＴＨＲ　ＶＡＬ　ＬＹＳ　ＡＬＡ
　ＧＬＵ　ＧＬＹ　ＡＬＡ　ＬＹＳ図（その２） ＬＹＳ　ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＧＬＬＩ　ＡＳＰ　ＬＹＳ　
ＧＬＮ　ＩＬＥ　ＳＥＲ　ＡＳＰ　ＡＬＡ　ＳＥＲ　Ａ
ＲＧ　ＧＬＮ　ＧＬＹＬＥＵ　ＳＥＲ　ＡＲＧ　ＡＳＰ
　ＬＥＵ　ＧＬＵＧＬＬＩ　ＡＬＡ　ＡＳＮ　｝ＩＩｓ
　ＧＬＮ　ＬＹＳ　ＬＥＩＪ　ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＧＬＵ
　Ｈｉｓ　ＧＬＮ　ＬＹＳＬＥＬＩ　ＬＹＳＧＬＬＩ　
ＡＳＰ　ＬＹＳ　ＧＬＮ　　ＩＬＥ　ＳＥＲ　ＡＳＰ　
ＡＬＡ　ＳＥＲ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　ＧＬＹ　ＬＥＵ　Ｓ
ＥＲ　ＡＲＧＡＳＰ　ｕＵ　ＧＬｕ　ＡＬＡ　ＳＥＲ　
ＡＲＧ　ＡＬＡ　ＡＬＡ　ＬＹＳ　ＬＹＳ　ＧＬＵ　Ｌ
ＥＵ　ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＡＳＮＨＩＳ　ＧＬＮ　ＬＹＳ
　ＬＥＬＩ　ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＧＬＵ　ＡＬＡ　ＬＹＳ
　ＡＬＡ　ＬＥＵ　ＬＹＳ　ＧＬＬＩ　ＧＬＮ　ＬＥＬ
ＩＡＬＡ　　ＬＹＳ　　ＧＬＮ　　ＡＬＡ　ＧＬＵ　　
ＧＬＵＳＥＲ　　ＡＳＰ　　ＳＥＲ　　ＧＬＮ　　ＴＨ
Ｒ　　ＰＲＯ　　ＡＳＰ　　丁ＨＲ　　ＬＹＳ　　ＰＲ
Ｏ　　ＧＬＹ　　ＡＳＮ　　ＬＹＳ　　ＡＬＡ　　ＶＡ
ＬＰＲＯ　　ＧＬＹ　　ＬＹＳ　　ＧＬＹ　　ＧＬＮ　
　ＡＬＡ＾ＳＮ　ＬＹＳ　　ＡＬＡ　ＰＲＯ　ＭＥＴ　
ＬＹＳ　ＧＬＵ　ＴＨＲ　ＬＹＳ　ＡＲＧ　ＧＬＮ　Ｌ
ＥＵ　　ＰＲＯ　ＳＥＲ　ＴＨＲＧＬＹ　ＧＬＬＩ　Ｔ
ＨＲ　ＡＬＡ　ＡＳＮ．ＰＲＯ　ＰＨＥ　ＰＨＥ　ＴＨ
Ｒ　ＡＬＡ　ＡＬＡ　ＡＬＡ　ＬＥＤ　ＴＨＲ　ＭＡＬ
ＭＥＴ　ＡＬＡ　ＴＨＲ　ＡＬＡ　ＧＬＹ　ＶＡＬ　Ａ
ＬＡ　ＡＬＡ　ＶＡＬ　ＭＡＬ　ＬＹＳ　ＡＲＧ　ＬＹ
Ｓ　ＧＬＵ　ＧＬＬＩＡＳＮ 第 図（その２） ＧＣＴＧＡＧＣＡＣＣ　　Ａ＾＾ＡＡＣ丁Ｔ＾＾ＴＣＧ
ＴＧＣＡＧＣＴ　　＾＾Ａ＾＾＾ＧＡＧＣ　　ＴＴＧＡ
ＡＧＣＡＡ＾　丁ＣＡＣＣＡＡＡＡ＾＾＾＾＾ＧＣＡＣ
ＴＣ　　ＡＡＡＧＡＡＣ＾＾Ｔ　　ＴＡＧＣＧ＾＾＾Ｃ
Ａ　　ＡＧＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＴＣ＾＾ＧＣＡ　　
Ｃ：ＣＡＣＡＡＧＣＡＧ　　ＧＴＡＣＡ人＾ＡＣＣ　　
Ｔ＾＾ＣＣ＾＾＾ＡＣＴ＾八〇，Ｍｌ；ＡＣＡＧ　ＴＴ
ＡＣＣＡＴＣＡＡ　ＣＡＧＧＴＧ＾＾ＡＣ　ＡＧＣＴＡ
ＡＣＣＣＡ丁ＡＣＴＧＴＴ＾了ＧＩＣＣ＾＾ＣＡＧＣＴ
Ｇ　　ＧＡＧＴＡＧＣＡＧＣ　　ＡＧＴＴＧＴ＾＾＾＾
Ａ丁＾Ｇ＾＾Ｇ＾＾丁　ＧＡＧＧＴＴＡＡＧＧ　　ＡＧ
ＡＧＧＴＣＡＣＡ　　ＡＡＣ丁ＡＡＡＣ＾＾ＡＣＴ＾＾
↑ＡＡＴＣ　　ＧＴＣＴＴＴＧ丁ＴＴ　　丁＾Ｔ＾＾Ｔ
Ｇ＾＾＾　ＡＣＡＴ丁＾＾ＣＧ＾！（１５０　　　　　
　１６６０　　　　　　１６７０　　　　　　１６８０
＾ＴＡＣＴ＾＾ＴＧ＾　＾ＴＡＴＴＡＧＡＡＡ　ＴＡＡ
ＧＡＴＴＧ＾＾　ＡＡＴＡＧＴＡ＾＾＾ＧＴＡ．ＧＣＣ
ＧｉＴＧＧ　　ＣＴＣＴＡＣＴＡＧＧ　　ＡＧＣＴＡＣ
ＡＣＡＡ　　ＣＣＡＧＴＴ丁ＣＡＧ＾＾ＴＴＴＴＧＡＣ
Ｔ　　ＧＧＴＣ丁ＧＧＧＧＡ　　ＡＴＴＣ一９５９− 受 託 番 可 変 更 届 ５． 旧寄託機関の名称 工業技術院微生物工業技術研究所 平成１年 ４月２０日

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）グループＡストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ　Ａ
   　￥Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ￥）に属する微生物が
   生産し、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する能力を有
   し、下記の諸性質： ｉ）人のＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩ
   ｇＧ４）及びウサギのＩｇＧと結合する ｉｉ）マウス、ラット、牛、ヒツジ、ヤギのＩｇＧと結
   合しない ｉｉｉ）人のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭと結合
   しないを示し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動で
   みかけの分子量が約４５Ｋダルトンである蛋白質
2. （２）グループＡストレプトコッカス（Ｇｒｏｕｐ　Ａ
   　￥Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ￥）に属する微生物が
   生産し、免疫グロブリンのＦｃ領域と結合する能力を有
   し、下記の諸性質： ｉ）人のＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩ
   ｇＧ４）、人のＩｇＧＦｃ、及びウサギのＩｇＧと強く
   結合する ｉｉ）豚のＩｇＧと弱く結合する ｉｉｉ）マウス、ラット、牛、ヒツジ、ヤギ及び馬のＩ
   ｇＧと結合しない ｉｖ）人のＩｇＧＦａｂ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及び
   ＩｇＭと結合しない を示し、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動でみかけ
   の分子量が約４２Ｋダルトンである蛋白質
3. （３）生産菌がストレプトコッカスエスピーＡＰ１（￥
   Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ￥ｓｐ．ＡＰ１）である特
   許請求範囲第１項及び第２項記載の蛋白質
4. （４）アミノ酸配列が下記の配列又は、その部分配列で
   ある特許請求の範囲第２項記載の蛋白質 【アミノ酸配列があります】
5. （５）特許請求の範囲第４項記載のアミノ酸配列をコー
   ドする遺伝子
6. （６）ヌクレオチド配列が下記の配列である特許請求の
   範囲第５項記載の遺伝子 【アミノ酸配列があります】
7. （７）下記のヌクレオチド配列で表わされる遺伝子 【アミノ酸配列があります】
8. （８）特許請求の範囲第５項、又は第６項もしくは第７
   項記載の遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主
   細胞を培養する事を特徴とするプロテインＨの製造法
9. （９）宿主細胞が大腸菌（￥Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ￥
   　￥ｃｏｌｉ￥）である特許請求の範囲第８項記載の製
   造法