JPH05505943A

JPH05505943A - コラーゲン結合タンパク質およびその製造方法

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Publication number: JPH05505943A
Application number: JP91517169A
Authority: JP
Inventors: グス、ベンクト　ミカエル; フック、マグナス; ヨンソン、ハンス; リンドバーグ、キエル　マーティン; パティ、ジョセフ; シグナス、ラールス　クリスター; スウィタルスキー、リーチ　エム
Original assignee: アルファーレーバル　アグリ　インターナショナル　アクチボラグ
Priority date: 1990-10-22
Filing date: 1991-10-22
Publication date: 1993-09-02
Also published as: NO922421D0; DE69120390T2; AU8751891A; CA2071950C; EP0506923B1; ES2090357T3; IE913694A1; HU9202074D0; AU652587B2; DE69120390D1; NO970113L; EP0506923A1; ATE139541T1; HU219679B; FI922865A0; NO970113D0; IE76292B1; SE9003374D0; WO1992007002A1; NO922421L

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】コラーゲン結合タンパク質およびその製造方法技術分野本発明は、コラーゲン結合タンパク質ならびに雑種ＤＮＡ分子、例えば前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むファージまたはプラスミドに関する。更に本発明は、前記分子を含む微生物および前記タンパク質を生産する微生物の使用、ならびに前記タンパク質の合成による調製に関する。特に本発明は、５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃ−ｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓコラーゲン結合タンパク質またはその機能的に活性なタンパク質をコードするクローン化された遺伝子、クローン化された遺伝子またはそれらの一部を含有するベクター、およびこれらのベクターにより形質転換された微生物、ならびに５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓコラーゲン結合タンパク質（ＣＢＰ）（また５ｖｉｔａｌｓｋｙ等１９８９によりコラーゲンレセプターとも称せられる）の生合成を指定する遺伝子のクローニング、およびＣＢＰまたはＣＢＰ様タンパク質を生産する、クローン化された遺伝子によって形質転換された生物の使用に関する。本発明はまた診断目的のためにこの遺伝子を使用することを記載する。

本発明の目的は、コラーゲン結合タンパク質を得ることにある。

別の目的は、例えば前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドを使用して遺伝子工学技術によって前記タンパク質を得ることにある。

更に別の目的は、化学合成により前記タンパク質を調製する可能性を得ることにある。

さらに他の目的は、次の説明から明らかになるであるＰＣＴ特許出願公開ＷＯ− １１５１０５５５３号は、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲンおよび／またはラミニン結合能力を有する細菌細胞表面タンパク質を開示している。その特許には、いろいろな細菌がフィブロネクチン、フィブリノーゲン、コラーゲンおよび／またはラミニンに結合する能力を有することが示されている。

Ｓ、ａｕｒｅｕｓに対するコラーゲンの結合に関してはいくつかの研究が報告されてきた。

（Ｃａｒｒｅｔ　ａｔ　ａｌ　１９８５゜Ｓｗｔｔａｌｓｋｊ等１９８９は、Ｓ、ａｕｒｅｕｓ表面タンパク質の単離および特性確認について報告し、それらをコラーゲンレセプターとして同定した。細胞壁からタンパク質を遊離するためにリソスタフィンを使用し、続いてイオン交換クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム沈殿およびゲル濾過により、１３５ｋＤａの見掛けＭ「を持つタンパク質を精製することが可能であった。また１３５ｋＤａタンパク質に対して育成された抗体かＳ、ａｕｒｅｕｓ　Ｃｏｗａｎ　１細胞に対するコラーゲンの結合を阻害することも示された。

発明の説明今や驚くべきことにコラーゲン結合性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む雑種ＤＮＡ分子を得ることが可能なことが発見された。以下から明らかなように、次のヌクレオチド配列が前記タンパク質をコードする遺伝子中に存在する。

ＴＡＣＡＡＡＡＣＣＡ　ＡＡＡＴＴＡＣＧＡＡ　ＴＧＡＡＣＡＧＣＡＡ　ＡＡＡＧＡＧ？Ｉ’ＴＧ　？Ｉ’Ａ入Ｔ入ＡＴＴＣＧＡＡＴＴＡＡＣＡＡ　ＡＧＧＴＣＡＡＡＧＧ　ＴＴＡＴＡＣＡＡＣＡ　ＣＡＴＧＴＧＧＡＴＡ　ＡＣＡＡＴＧＡＴＡＴそれによってこのヌクレオチドは上記読み取り（こお（＼てヌクレオチド１番で出発する次のタンノくク質をコードする。したがって第２図に示される前段に存在するヌクレオチドは信号系の一部である。

ＡｌａＧｌｕＬｙｓＰｒｏ工１ｅＧｌｕＴｈｒＴｈｒＳｅｒ工１ｅｓａｒＧ１ｙＧｌｕＬｙｓＶａｌＴｒｐＡｓｐＡｓｐＬｙｓＡｓｐＡｓｎＧｌｙＡｓｎＬｅｕ工１ｅＶａｌＴｈｒＡｇｎＬｙｇＴｙｒＴｈｒＰｒｏＧｌｕＴｈｒＴｈｒＳｓｒ工１ｅｓｅｒＧｌｙＧｌｕＬｙｓＶａｌＴｒｐＡ！！ＩｐＡｓｐＬｙｓＡｓｐｋｓｎＧｌｎＪｕｐＧｌｙＬｙｇＡｒｇＰｒｏＧ１ｕＬｙｓＶａｌＳｅｒＶａｕｓｎＬｅｕＡｌｌｐＨｉｓｓＶａｌＬｙｇＡｓｐＴｙｒＴｈｒＴｈｒＡｓｐ工１山ｎＧｌｙＴｈｒＴｈｒ工１ｅ’ｒｈｒＪｕｎＬｙｓＴｙｒＴｈｒＸｌｅＧｌｕＹｈｒＶａｌ’Ｉ’ｈｒＧ１ｕＡｊｐＨｉｓＶａＩＬＹ！ＩＡＳｐ訂−ｈｒＴｈｒＡｓｐ工１ａＪｕｓｎＧｌｙＴｈｒ上記の単一文字アミノ酸配列において、次の省略形を使用した。

Ａ　Ａｌａ１アラニンＲ　Ａｒｇ，アルギニンＮ　ＡｓｎｓアスパラギンＤ　Ａｓｐ，アスパラギン酸Ｅ　Ｇ　１　ｕ　ｓグルタミン酸Ｑ　Ｇｌｎ，グルタミンＨ　Ｈｉｓ，ヒスチジンＩ　ｌｉｅ，イソロイシンＬ　Ｌ　ｅ　ｕ　ｓロイシンＫ　Ｌｙｓ，リジンＭＭｅｔ，メチオニンＦ　Ｐｈｅ，フエニルアラニンＰ　Ｐ　ｒ　ｏ　ｓプロリンＳ　Ｓｅｒ，セリンＴ　Ｔｈｒ、スレオニンＷＴｒｐ，｝リブトファン本発明は更に前紀コラーゲン結合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはファージを含む。

本発明は更に上記に係る少なくとも１個の雑種ＤＮＡ分子を含有する微生物を含む。Ｅ．ｃｏｌｉ菌株ＴＧＩに関するブラスミドｐｓＡｃ１０４はＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａ＋ｕｌｕｎｇ　ｖａｎｔｌｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ　（Ｄ　Ｓ　Ｍ）に寄託され、それにより寄託番号Ｄ　Ｓ　Ｍ６１９９を割り当てられた。

本発明は、Ｓ、ａｕｒ−ｅｕｓ細胞からａ離されて精製される天然のＣＢＰに比べて改善されたＣＢＰ特性を有するＣＢＰをコードするクローン化された遺伝子を提供する。その遺伝子はＳ、ａｕｒ−ｅｕｓ　ａｎから得られ、クローニングベクトル中へ挿入される。組換えベクターで形質転換された原核生物の細胞を開示する。

本発明は更に、本明細書でｃｂｐ遺伝子と称するＣＢＰをコードする遺伝子のヌクレオチド配列の同定を提供する。推論されたアミノ酸配列はブドウ球菌の細胞表面タンパク質に類似するいくつかの明確な特徴を持つ分子を明らかにする。

本発明はまた組換えＣＢＰの生産および精製のための手順を提供する。これは分子がそのコラーゲン結合性を保持するようなやり方でなされ、従ってこの組換えＣＢＰは天然の非遊離Ｓ、ａｕｒｅｕｓ　ＣＢ　Ｐに似ている。

本発明は更に診断目的のためｃｂｐ遺伝子の使用を提供する。臨床Ｓ、ａｕｒｅｕｓ単離物においてｃｂρ遺伝子の存在を特異的に認めるために選ばれた遺伝子プローブを使用した。−例として、患者から分離されたＳ、ａｕｒｅｕｓ菌株の表面上のＣＢＰの存在と敗血症性関節炎との相関関係はすべての試験した菌株中のｃｂｐ遺伝子の存在により確かめることができる。

タンパク質ＡのＩｇＧ結合領域のような適当な担体り特表千５−５０５９４３　（５）ンパク質もまた該アミノ酸配列に結合することができる。

本発明を次に示す実施例を参照して説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

図面の簡単な説明第１図：（Ａ）、相同性の領域を示すｐ１６およびＣＣ０ＬＲ６Ａにおける挿入物の単純化制限地図、ＭＣ３は多クローニング位置を示す省略形。（Ｂ）、異なる領域をコードするｃｂｐ遺伝子の略図。Ｓは領域Ａおよび反復性Ｂ領域が後に続く提案された信号配列、Ｗは細胞壁延在領域であり、Ｍは膜固定領域である。

第２図；ｐ１６およびｃｃＯＬＲ６Ａにおける挿入物から組み立てられた配列のヌクレオチド配列および推論されたアミノ酸配列。異なる領域は矢印およびリポソーム結合位置（ＢＲＳ）類似の配列によって示される。ｐ１６における挿入の５′末端および３′末端およびｃＣＯＬＲ６Ａにおける挿入の５′末端が示されている。

図面の説明文第３図：抗コラーゲンアドヒーシン（ａｎｔｉ−ｃａｌ　Ｉａｇｅｎａｄｈｅｓｉｎ）抗体でプローブしたＳ、ａｕｒｅｕｓの臨床単離物のライゼートのウェスタンプロット。菌株のりソスタフインライゼートはゲル電気泳動により分離し、イモピロン−Ｐ膜上にエレクトロプロットした。レーンａ　：　Ｃｏｗａｎ　ｓｂ：＃７、Ｃ：　Ｒ１２、ｄ：Ｒ１３、ｅ：Ｒ１４、ｆ：Ｒ１５、ｇ：Ｒ１６、ｈ：フィリップス、およびｉ：＃９゜第４図：　Ｓ、ａｕｒｅｕＳのコラーケンアドヒーシン正菌株および負菌株のコラ−ケン（パネルＡ）および軟骨（パネルＤ）に対する時間依存付着。抗アドヒーシン抗体によるこの付着の阻害（パネル日およびＤ、それぞれコラーゲンおよび軟骨）。２Ｎのコラーゲンアドヒーシン正菌株−９，ａｕｒｅｕｓフィリップス（Δ）およびＲ１４（０）並びに１種のアドヒーシン負菌味−＃９（釦の１２５■標識細胞を指定された期間コラーゲンフートされたウェル（ｗｅｌｌ）と共にまたは軟骨片と共にインキュベートした。

コラーゲンアドヒーシン正Ｓ、ａｕｒｅｕｓ菌株フィリップスの軟骨に対する付着（パネルＣ）および抗アドヒーシン抗体（パネルＦ）によるこの付着の阻害（パネルＦ）の電子顕微鏡による検査。

第５図；コラーゲンアドヒーシン（ｃｏｌｌａｇｅｎ　ａｄｈｅｓ−ｉｎ）（０）または組換え形のＳ、ａ、ｕｒｅｕｓフィブロネクチンレセプター（・、ＺＺＦＲ）でコートされたポリスチレンビーズによる１２５Ｉ標識コラーゲンの軟骨に対する結合または付着。パネルＡ一時間の函数としてのタンパク質コートされたビーズに対する１２５■−コラーゲンの結合。

パネルＢ−抗体による１２５ニーコラーゲンの結合の阻害。

識ビーズの付着の阻ＩＦ（パネルＤ）。この実験において１μｇのアドヒーシンタンパク質を１０８ポリスチレンビーズに結合させた。対照ビーズを同モル濃度のフィブロネクチンレセプターでコートした。ビーズ上の未反応位置をウシ血清アルブミンで飽和させた。軟骨に付着されたコラーゲンアドヒーシン（パネルＥ）またはフィブロネクチンレセプタータンパク質（パネルＦ）の走査電子顕微鏡による検査。

第６　ｒ１４　：　Ｓ、ａｕｒｅｕｓコラーゲンアドヒーシン内にコラーゲン結合領域を局在化するために使用される発現構成。

実施例ＩＥ、　ｃｏｌｔ中のｃｂｐ遺伝子クローニングおよび同定Ｓ、ａｕｒｅｕｓＣＢ　Ｐをコードする遺伝子を分離するために、２種類の市販の（Ｃ１ｏｎｔａｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、　Ｉｎｃ、　Ｐａｌ。

Ａｌｔｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）　Ｓ、ａｕｒｅｕｓ菌株（菌株ＦＤＡ５７４およびＦＤＡ４８５）について、放射能標識コラーゲンを結合するかどうかを試験した。

これは５ｖｉｔａｌｓｋ［等１９８９によって行った。菌株５７４はコラーゲンを結合することが発見され、従って同じ菌株の遺伝子ライブラリー（同じ会社から得られた、ｃ　ａ　ｔ　＃ＸＬ１５（１１Ｂ　）をＣＢＰ活性の発現のためスクリーンした。供給者の手順（ρｒｏｔｏ−ｃｏｌｌ）を使用して（この手順に加えて分子遺伝学上の適切な手順を包含する一般的な研究（「分子生物学における現在の手順Ｊ　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｌｓ　Ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＢｉｏ！ｏｇｙ）第１巻および第２巻、（＾ｕｓｕｂｅｌ　、Ｆ、Ｍ、編、Ｒ１１１ｒｅｎｔ　、Ｒ，Ｅ、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ、Ｄ、Ｄ、Ｍｏｏｒｅ、！、Ｇ、５ｅｉｄＬｌａｎ、Ｊ、Ａ。

Ｓｓ＋ｉｔｈ、Ｕ、５ｔｒｕｈ１．Ｇｒｅｅｎｅ、Ｖｉｌｅｙ　［ｎｔｅｒｓｃｌｅｎｃｅ）　、および「分子クローニングＪ　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）研究室マ二ｘアル（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｓ＋ａｎｕａｌ）、（Ｍａｎｌａｔｉｓ、Ｔ、Ｆｒｉ　Ｌｓｃｈ。

ＩＥ、Ｆ、およびＪ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９ｇ２）Ｃｏｉｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｔｆａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｖ　Ｙｏｒｋに見出される）が使用された組換えｌａｍｂｄａ　ｇｔ　ＩＩファージをＥ、ｃｏｌ［菌株Ｙ１０９０上て平板培養した。９０ｍｍ板当り１０．０００〜１００．０００　Ｐ　Ｆ　Ｕを持つ寒天板を選んだ。各板からのプラークをニトロセルロース゛（ＮＣ）フィルター（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆５ｃｈｕｌ　Ｉ）　へレプリカ法により転移した。ＣＢＰ活性を発現するプラークを検出するために２種の相異なる方法を使用した。第一の方法においてフィルターを１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭトリスｐＨ７，５、Ｌ、３６％ミルク粉（脱脂）を含有する溶液中で３７℃で１時間（または室温（ＲＴ）で−夜）ブレインキュベートした。インキュベーンラン後フィルターを上記と同種であるが１２５−１標識ウンタイプ■コラーゲンを補った溶液に転移し、フィルターをＲＴで一夜インキユベートした。翌日フィルターを３７℃で１５０ｍＭのＮ　ａ　Ｃ！　、０．０５９６　Ｔｗｅｅｎ２０を含有する溶液にて１０分間３回洗浄し、ＲＴで乾燥し、数日間オートラジオグラフしてコラーゲン結合活性を発現するクローンを検出した。

他のスクリーン方法において天然コラーゲンレセプターを認識するポリクローナルウサギＩｇＧがらの精製Ｆａｂ−断片を使用してＣＢＰ活性を発現するクローンを検出した。この型のＦａｂ−断片調製は以前Ｓｖｉ　ｔａｌｓｋｉ符表千５ −５０５９４３　（６）等１９８９によりコラーゲンレセプターを同定し特性確認するために使用された。この他の方法においてレプリカ培養されたＮＣ−フィルターを、非特異性結合を遮断するために３７℃で４５分間１５０ｍＭのＮ　ａ　Ｃ１ｓ　１０　ｍＭのトリスｐＨ７，５，３％（Ｗ／Ｖ）ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する溶液中でブレインキュベートした。

遮断後、フィルターを最終濃度０．０５％（ＰＢＳ−Ｔ）までＴｗｅｅｎ２０を補った、また１：４００の希釈でウサギ抗コラーゲンレセプターＦａｂ断片を含有したリン酸緩衝食塩水を含有する溶液に転移した。ＲＴで２．５時間インキュベート後、フィルターをＰＢＳ−Ｔ中で１０分間づつ３回洗浄し続いてＰＢＳ− Ｔ中で１４３０００に希釈した２次ヤギ抗つサギＩｇＧアルカリ性ホスファターゼ複合体（Ｂｌｏ−Ｒａｄ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｔｅｓ、Ｒ［ｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ、ＵＳＡ、Ｃａｔ＃１７０−８５１８）を添加して結合された１次Ｆａｂ−断片を検出した。ＲＴで１時間インキュベート後フィルターをＰＢＳ−Ｔ中で１０分間づつ３回洗浄した。結合された標識２次抗体を製造者の使用説明書（Ｂｌｏ −Ｒａｄ　、免疫−プロットアルカリ性ホスファターゼ検定キットの使用のためのＢＣＩ　Ｐ／ＮＢＴ発色溶液の調製のための使用説明書）による着色反応により検出した。

上記の方法を使用していくつかのＣＢＣ活性発現組替えラムダファージを同定し分離することができた。

これらの中２つをさらなる研究のために選んだ。それらはそれぞれラムダｃｏｌｌｌおよびｃＣＯＬＲ６Ａと称せられな。

サブクローニングラムダｃｏｌｌｌ：精製ラムダｃｏｌｌｌＤＮ　Ａ　ヲＥｃｏＲＩて開裂し、スティッキーエンドをｄＮＴＰとともにＫｌｅｎｏｗ断片を使用して充填した。Ｓ、ａｕｒｅｕｓ染色体由来の平滑末端を持つＤＮＡ断片をＳ… ａ１て開裂したＰＵ　Ｃ１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｌ　Ｋ　Ｂ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｕｐｐｓａｌａ。

Ｓｗｅｄｅｎ）中に結合させた。凍結能力を有するＥ、ｃｏｌ［ＴＧＩ細胞に形質転換組換えクローンをＣＢＦの発現について試験した。すべてのＣＢＰ発現クローンは約４ｋｂの挿入物を持つ組換えプラスミドを抱いていることがワカった。ｐ１６と称せられるそのようなりローンの１種をさらなる研究のために選び、このクローンの挿入物の模式的地図を第１図Ａに示す。

ラムダｃｏｌｌｌと同様の方法によって２種の他のラムダクローンがゲノムライブラリーをスクリーンすることにより生成された。純粋なポジティブの大規模な培養物を得てＤＮＡを分離した。クローンのＥｃｏＲＩ消化は結果として２種の相違する大きさを持つ挿入物を生じる。クローンＩＡは３．２ｋ　ｂの挿入物を有し、３Ｂは４．５ｋｂの挿入物を有した。２種のうちの大きい方をさらなる特性ｆｌｉＸＥのために使用した。λＧＴＩＩクローン３Ｂからの精製挿入ＤＮＡＱ、５１ｃｂ）をＥｃｏＲＩ消化ｐｕｃ１８に結合し、サブクローンｃｃＯＬＲ６Ａを作り出すＥ、ｃｏｌｉＴＢ−１細胞に形質転換した。また配列決定のためにＭ１３ｍｐ１８／ＪＭＩＯＩにサブクローンした。

サブクローンｃＣＯＬＲ６ＡからのＣｓ　Ｃ１２精製プラスミドＤＮＡを次いてさまさまな制限エンドヌクレアーゼを使用して地図を作成した。Ｉ’ｓｔｌ消化で２種の断片２．９ｋ　ｂおよび１．７ｋｂを得た。両方の断片を配列決定したａ　２．９ｋ　ｂ　ＥｃｏＲ［’　Ｐ　ｓ　ｔ　ｌ断片はサブクローンλＣ０ＬＬｌに部分的に重複する。サブクローンＣＣ０ＬＲ６Ａは３種の反復部すべて、細胞壁領域、および膜延在領域を含有する。このクローンにおける挿入の模式的地図を第１図Ａに示す。

ハイブリッド形成実験ならびに比較制限酵素消化は、ｐ１６とｃｃＯＬＲ６Ａは互いに部分的に重複することを示した（第１図Ａ）。

実施例２；ＤＮＡおよびアミノ酸配列データｃｂｐ遺伝子のヌクレオチド配列を決定するために、５ｅｑｕｅｎａｓｅキツト（Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔｅｓ　Ｂｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＩＪｓＡ製）に含まれた手順に従って、ｐ１６およびＣＣ００ＬＲ６Ａにおける挿入物を分析した。挿入物からのヌクレオチド配列を比較することにより、２種の挿入物は部分的に相同性であることが確認された（第１図Ａおよび第２図）。これらの配列を組立て、かつオープンリーディングフレームを探すことにより、１１８５個の推論されたアミノ酸配列に対応する３、５５５　ｎ　ｅのオーブンリーディングフレームが使用されたという法論が下された（第２図）。

推定されたアミノ酸配列内にいくつかの反復性および相同性領域があった。これを模式的に第１図Ｂに示す。

Ｎ末端から出発して信号配列に似た構造が明らかにされた。これはＣＢＰがＳ、ａｕｒｅｕｓの細胞表面タンパク質であることから予測されたことと一致する。

この領域に続いて、Ａと称せられる領域に続いてＢ１、Ｂ２およびＢ３と称せられる１８７個のアミノ酸の反復性伸長部があることが発見された。これらの領域に直接続いて、いくつかのプロリン残基を含有する反復性、親水性構造からなるＷと称せられる領域がある。この領域はブドウ球菌タンパク質Ａ　（Ｇｕｓｓ等１９８４）およびＦ　ｎ　Ｂ　Ｐ　Ａ　（Ｓ！ｇｎａｓ等１９８９）および連鎖画法タンパク質Ｇ　（Ｇｕｓｓ等１９１１６）およびＭタンパク質（Ｈｏｌ　ｌ　ｆｎｇｓｈｅａｄ等１９８６）に等円９８６類似の構造に似ている。二の領域は細胞壁へのタンパク質の結合を仲介すると考えられる。Ｃ末端に最も近いアミノ酸配列は疎水性残基の長い伸長部およびこれに続く若干の荷電アミノ酸からなる。Ｍと称せられるこの領域はタンパク質ＡＳＦｎＢＰ　Ａ、タンパク質ＧおよびＭタンパク質のＣ末端に構造が類似している。

推定されたＣＢＰの予測された分子量はおおよそ１３３ｋｂ（仮定された信号配列、Ｓを含めて）であり、それは天然の遊離レセプター（Ｓｖ！　Ｌａｌｓｋｉ等１９８９）について報告された１　３５　ｋ　ｄの分子量に非常に近い。

完全なｃｂｐ遺伝子をコードするプラスミドを構成するために、Ｓ、ａｕｒｅｕｓのＦＤＡ５７４染色体ＤＮＡを精製し特表千５−５０５９４３　（７）てｌ１ｌｎｄ　ＩＩＩ／Ｐｓｔ　１て二重開裂した。３２−ｐＨ識オリゴヌクレオチドプローブ（５’　−ＡＴＴＡＡＡＧＣＧＴＴＧＣＣＴＡＧＴＧＧ−３’　）を使用するサザン転移実験の手引きによって、これらの酵素による開裂はｃｂｐ遺伝子の３′末端に対応するおおよそ３．２ｋｂの断片を発生することが知られていた。これらの酵素による開裂後、染色体ＤＮＡをアガロースゲル中で電気泳動により分離した。正しい寸法に大ざっばに対応するゲル薄片を切り取り、ＤＮＡ断片を溶離して精製した。精製断片をＨｉｎｄｍ／Ｐｓｔ　１で予め二重開裂されたｐＵｃ１８に結合した。

結合の後Ｅ、ｃｏ目　ＴＧｌに形質転換し、その結果生じる組換えクローンを同じプローブによるコロニー、ハイブリッド形成を使用して正しい断片を得るためにスクリーンした。放射性プローブによってハイブリッド形成する１種の正クローンをさらなる研究のために選んだ。Ｅ、ｃ。

ＩＩ　ｐｓＡｃｌｏｏと称せられるこのクローンを旧ｎｄｌＩｒで開裂し、ｐ１６からの精製されたおおよその１．８ｋｂの１ｌｉｎｄ　ｍ断片（ｃｂｐ遺伝子の５′末端をコードする、第１図）をｐｓＡｃｌｏｏに結合した。Ｅ、ｃｏｌｆに形質転換後、正しい配向がおおよそ１．８ｋｂのフラグメントを有するＴＧｌ組換えクローンを同定し、分離した。Ｅ。

ｃｏＨｐｓＡｃ１０４と称せられる１種のそのようなりローンをさらなる研究のために選んだ。このクローンにおける挿入物は完全なｃｂｐ遺伝子を提供した。

クローンはまたＣＢＰの発現のために試験されたとき正であった（実施例３参照）。このクローンはＤｅｕｔｓｃｈｅ　Ｓａｍｍｌｕｎｇｖａｎ　Ｍｉｋｒｏａｒｇａｎｉｓｍｅｎに寄託された、寄託番号６１９９である。

ン結合検定を使用して、全ｃｂｐ遺伝子またはその部分を含有するＥ、ｃｏｌｉクローンを、これらのクローンからのライゼート（ＣＢＰ活性を含有する）がｔ２５−■コラーゲンのＳ、ａｕｒｅｕｓ　Ｃｏｗａｎ　Ｉ細胞に対する結合を阻害できるかどうかについて試験した。それぞれのＥ、ｃｏＨをアンピシリンを補充して最終濃度５０μｇ／ｍｌにした１ｕｒｉａＢｒｏｔｈ中で一夜増殖した。

バクテリアを回転沈降させ、上澄みを捨てた（これはＣＢＰ活性の大部分が細胞内に発見されたから）。このバクテリア沈殿物を５０ｍＭのトリスｐＨ８，５０ｍＭのＥＤＴＡおよびリソチーム１ｍｇ／ｍｌを含有する溶液に元の容積の１／１０に再懸濁し、続いて完全な溶菌まで３７℃でインキュベートした。溶離されたバクテリアを遠心分離にかけて細胞破片を取除き、上澄みを処理した。この上澄み（典型的に使用された体積は１００〜２００μｌてあった）が１２５−ＩコラーゲンのＣｏｗａｎ　Ｉ細胞に対する結合を阻害する能力を測定した。対照として同じ方法で処理したＥ、ｃｏｌｉＴＧｒ　ｐＵｃ１８を使用した。ＣＢＰ活性の存在は、γカウンターで測定したときＣｏｗａｎ　Ｉ細胞に結合された放射性コラーゲンの著しい（ある場合には６６９６まて）減少として測定することができた。この方法で測定された３種のクローンＥ、ｃｏｌ［ＴＧＩ　ｐ１６、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＴＧｌ　ｐｓＡｃ１０４およびＥ、ｃｏｌｉ　ＴＧｆ　ｐｃＡｌは、有意の阻害活性を全く示さなかった対照Ｅ、ｃｏｌｉ　ＴＧｌ　ｐＵｃ１８と比較して高い阻害活性を示した。この結果は、精製または部分的に精製された天然コラーゲンレセプターはＳ、ａｕｒｅｕｓ　Ｃｏｖａｎ　Ｉ細胞に対するコラーゲンの結合を阻害できなかったことを発見した５ｗ１ｔａｌｓ−ｋｉ等１９８９による発見と対照的である。この事実の法論は、発現された組換えＣＢＰはその本来の特徴をブドウ球菌からの遊離タンパク質よりも多く残したということである。

組み換えＥ、ｃｏｌｉライゼート中にＣＢＰ活性を検出することができたけれども、固定化コラーゲンまたはゼラチンを使用してＣＢＰをアフィニティー精製することはできなかった。上述の組み換えクローンからのライゼートを用いる「ウェスタン転移」実験においてであるが、実施例１に記載されたＦａｂ−断片を使用して、高分子量の断片に対応するバンドを検出することは可能であった。

これらは推定アミノ酸配列を用いる計算から予想されるものと同一寸法であった。

固定化コラーゲンを使用して、組み換え生成されたＣＢＰをアフィニティー精製することが不成功であったので、別の研究方法を使用した。この研究方法はｃｂｐ遺伝子またはその遺伝子の部分をいわゆるアフィニティティルをコードする別の遺伝子に融合することである（酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　ｅｎｚｙｉｏｌｏｇｙ、バート１８５）。

試験されるアフィニティティルはＩｇＧ−結合ドメイン（Ｕｈｌｅ’　ｎ等１９８４）をコードするタンパク質Ａ遺伝子からの部分である。それゆえタンパク質Ａからの上述のドメインをコードするベクターを使用した。暦、Ｕｈｌｅ’　ｎ博士からの贈り物であった、ｐＮｓＥＱｌと称せられるこノヘクターはＩｇＧ結合ドメイン（Ｅ、ＤＳＡ、ＢおよびＣ）に加えてＩｇＧ−ドメインの両側にある２種の多クローニング部位（ＭＣ３）を含有する。これは開裂によって、精製することができて他のベクターに挿入できるＩｇＧ−結合ドメインをコードするＤＮＡ断片の遊離を結果として生じる両ＭＳＣに認識部位を有する制限酵素（制限位置がＩｇＧ−結合ドメイン中に存在しないという条件で）を選ぶことを可能にする。ｃｂｐ遺伝子のヌクレオチド配列はすてに決定されていたので、ｐ１６がｃｂｐ遺伝子のＮ−末端部分をコードすることは知られており、決定はＣ末端の融合であった。これは次の方法でなされた。ｐ１６をＥｃｏＲＩで開裂しく第１図）、タンパク質ＡのＩｇＧ結余結分部分−ドするｐＮｓＥＱｌがらの精製ＥｃｏＲＩ−ＤＮＡ断片をプラスミドに結合した。形特表千５−５０５９４３　（Ｂ）質転換後挿入されたタンパク質Ａ断片の正しい配向を有する組み換えクローンを同定し、分離した。Ｅ、ｃｏｌｉｐｃＡｌと称せられるこれらのクローンの１種をさらなる研究のために選んた。このクローンの細胞ライゼートは、実施例３において測定されたようにコラーゲン結合を阻害することに加えて、タンパク質ＡＩｇＧ−結合活性も示した。次の工程はＩｇＧ−セファロースＦＦ（Ｐｈａｎｌｌａｃｊａ　Ｌ　Ｋ　Ｂ　Ｂ＋ｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）上で推定された融合タンパク質をアフィニティー精製することを試みることであった。同し製造業者のタンパク質Ａマニュアルを使用して細胞ライゼートからの融合タンパク質をアフィニティー精製する二とができた。精製タンパク質を分析するために５ＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、ゲルをクーマシーブリリアントブルーで着色したとき異なる分子量に対応するいくつかのバンドが現われることが示された。しかしながら、主要なバンドは推定されたアミノ酸配列から計算されたように全長融合タンパク質の対応する分子量を有していた。ＣＢＰ活性を測定したとき、この精製タンパク質調製品は対応する細胞ライゼートと同様に効率的にＳ、ａｕｒｅｕｓ　Ｃｏｖａｎ　１に対する放射性コラーゲンの結合を阻害できた。これはまたＳｗｉ　ｔａ−Ｉｓｋｉ　等１９８９により提出された結果に比べて改善である。

結論は、本発明を実施することにより以前に報告された方法に比べてより良い方法でその生物学的性質を保持するＳ、ａｕｒｅｕｓ　ＣＢ　Ｐを生成しかつ精製することが可能になったということである。

実施例５診断手段としてのＣＢＰ　遺伝子の使用反覆部Ｂ１、Ｂ２およびＢ３の両側にあるＣＢＰの領域と泪捕的な２種のオリゴヌクレオチド（ＪＰ−１゜５’　−ＡＧＴ−ＧＧＴ−ＴＡＣ−ＴＡＡ−ＴＡＣ−ＴＧ−３′およびＪＰ−２，５’　−ＣＡＧ−ＧＡＴ−ＡＧＡ−ＴＩＧ−ＧＴＴ−ＴＡ−３’　）を組み立てた（Ｏ１ｉｇｏ’５Ｅｔｃ）。１２５Ｉ−コラーゲンと結合する二とが知られていた６種の異なるＳ、ａｕｒｅｕｓ菌株からのゲノムＤＮＡ（表１）をＬｉｎｄｂｅｒｇにより以前に記載されたように分離した。ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）をＣｅｔｕｓ／Ｐｅｒｋｉｎ　−Ｅｌｍｅｒ　ＤＮＡ　Ｔｈｅｒｒｌｏｃｙｌｅｒによって行った。反応混合物（１００ｇ　１）は１ｍＭの各プライマ、２００ｍＭの各ｄＮＴＰ、１ｍＭのトリス−ＨＣ１（ｐＨ８，３）　、５ｍＭのＫＣＩ、１５ｍＭのＭｇ　Ｃ１２，０，００１％のゼラチン、３υｇの鋳型ＤＮＡ、および２．５υのＡ１１ｌ）Ｉｉ　Ｔａｑ　ＤＮＡポリメラーゼを含有していた。反応混合物を鉱物油１００μ！で上塗りし、９４℃で２分間の変性、５５℃で２分間のアニーリング期間、および７２℃で３分間のエクステンション期間からなる３０サイクル増幅を行った。増幅後、１５μｌのＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル（Ｓｅａｋｅｍ　ＧＴＧ、　ＦＭＣＩｎｃ、、　ＲｏｃｋｌａｎｄＭａｉｎｅ）上で分析した。

異なるＳ、ａｕｒｅｕｓ　分離物からのゲノムＤＮＡのＰＣＲ分析は２種のはっきりと異なる寸法の生成物を示した。

ＦＤＡ５７４、Ｃｏｗａｎ　、および＃１３はすべての１６７７ｂｐの遺伝子生成物を有し、一方フィリソブス、＃７、および＃　ｔ４３’ｌｌは１ｌｌｌｌｂ　ｐの遺伝子生成物を持７た。

既知の非コラーゲン結合剤であるＳ、ａｕｒｅｕｓ　Ｎｅｗｍａｎは検出可能なＰＣＲ生成物を全く持たなかった。反覆物の寸法と試験されたいろいろなＳ、ａｕｒｅｕｓ菌株からの精製天然コラーゲンレセプターの評価された分子量の間には直接的な相関がある。さらなる配列分析によって、１８７７　ｂｐのＰＣＲ生成物は各長さ５６０ｂｐの３反覆単位に対応することが明らかである。Ｈｌｌｌｂ　ｐのＰＣＲ生成物は従って各長さ５６０ｂｐの２反覆に対応する。これらのデータはそれぞれ１３５ｋｄおよび１１５ｋｄの精製天然コラーゲンレセプターの評価された分子量と非常に相関する。

追加のＰＣＲ分析をプライマＪＰ−３（５’　−ＡＴＡ−ＴＧＡ−ＡＴＴ−ＣＧＡ−ＧＴＡ−ＴＡＡ−ＧＧＡ−ＧＧＧ−ＧＴＴ−３’　）およびＪＰ−４（５’ 　−ＡＴＴ−ＣＴＧ−ＣＡＧ−ＡＧＡ−ＡＣＴ−ＡＡＧ−ＡＡＴ−ＡＧＣ−ＣＴＴ−３’　）を使用して行った。これらのプライマはそれぞれ５′および３′末端で無傷のＣＢＰ−遺伝子の側面にある。同様のＰＣＲパラメータを使用して、無傷の遺伝子をＳ、ａｕｒｅｕｓゲノムＤＮＡから分離することに成功した。もう一度２種のはっきりと相違する大きさの遺伝子生成物が発見された。面白いことに、３反覆を持ったＳ、ａｕｒｅｕｓ分離物は３．５ｋｂに対応するｃｂｐ遺伝子を持った。２反覆だけを持ったＳ、ａｕｒｅｕｓ閑株は３．０ｋｂのＣｂｐ遺伝子を持っていた。この研究は、！３．ａｕｒｅｕｓ分離物からのｃｂｐ遺伝子の大きさは反復単位の数に直接比例するという直接的な証拠を提供する。

無傷のｃｂｐ遺伝子の発現。無傷の遺伝子を包含する３、５ｋｂＰＣＲ生成物（プライマＪＰ−３、ＪＰ−４）を原核生物の発現ベクターｐＫＫ２２３−３、Ｐｈａｒｍａｃｌａ−ＬＫＢにクローンした。このベクターはクローンされた遺伝子の発現を推進するＩＰＴＧ誘導可能ｔａＣプロモーターを含有する。誘導によって、５〜１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥのクーマシー染色は１３５ｋｄのタンパク質を示した。これは天然コラーゲンレセプターの予測分子量に匹敵する。４）このタンパク質はウェスターンプロットおよび官能性生物学的検定により間もなく確認される以前の結果は、抗体はコラーゲンアドヒーシン正（ＣＡ＋）菌株Ｓ、ａｕｒｅｕｓ　Ｃｏｖａｎの全細胞に対して生じ、その精製コラーゲンコートーシンは相同性菌株に対する１２５■−標識コラーゲンの結合を効率的に阻害することを示した（Ｓｖｉｔａｌｓｋｌ等、１９８９）　、これらの抗体はまたコラーゲンと結合するすべての菌株に対する１２５Ｉ−コラーゲンの結合を効率的に阻害したが、それはコラーゲン繊維５−５０５９４３　（９）ン結合部位の免疫学的交差反応性を示す。これらの抗体により認識される細胞表面タンパク質を試験するために、これらはいろいろなＳ、ａｕｒｅｕｓ分離物から調製されたりソスタフィンライゼートのウニスターンプロトをプローブするために使用された。１ノソスタフイン消化はＳ、ａｕｒｅｕｓの細胞表面から多数のタンパク質を遊離し、およそ３゜バンドがゲルのクーマシーブリリアントブルー染色によりライゼート中に見えるようにすることができる（ＳｖＩ−ｔａｌＳｋｉ等、１９８９）　。抗アドヒーシン抗体は菌株Ｃｏｖａｎのライゼート中のＭｒ１３５ｋｄの成分を認識したが（第３図、レーンａ）、それは我々の先の観察と一致する（Ｓｗｉｔａｌｓｋｉ等、１９８９）　。他のフラーゲンアドヒーシン正菌株（ＣＡ＋）のライゼート中に検出された主な免疫反応タンパク質は分子量がまちまちであり、１１ｏｋｄまたは１３５ｋｄとして与えられた（第３図、レーンｂ〜ｈ）。免疫反応性タンパク質の見掛は寸法と菌株またはその起源（骨、滑液）のコラーゲン結合能力の間に相関は全く観察されなかった。試験された９種の非結合コラーゲンＳ、ａｕｒｅｕｓ菌株はどれも免疫反応性タンパク質を発現しなかった（図３、レーンｉ）。

コラーゲンアドヒーシンを発現する能力とコラーゲンに富む組織内の感染の観察された局在化の間の関係は、コラーゲン含有基質に対するバクテリア付着における細胞表面アドヒーシンの役割を分析するように本発明者等を促した。本発明者等は最初にタイプ■コラーゲンでコートされた表面に対するバクテリアの付着を研究した。

結果は、コラーゲンコートされた表面は表面に局在化されたコラーゲンアドヒーシンを発現する菌株に対する優れた付着基質であることを示した。付着は時間依存性でかつ飽和でき、３時間のインキュベーション後平衡に達する（第４Ａ図）。それぞれ１３５ｋｄまたは１１０ｋｄのアドヒーシンを発現する菌株１４およびフィリップスはコラーゲンコートされた基質に同じ数で付着されたから、付着するバクテリアの数はアドヒーシンの大きさにより影響されない。バクテリアをＳ、ａｕｒｅｕｓ菌株Ｃｏｖａｎからのコラーゲンアドヒーシンに対して、抗アドヒーシン抗体と共にブレインキュベートしたとき、付着は濃度依存的に阻害された（第４Ｂ図）。これはコラーゲンアドヒーシン内のコラーゲン結合部位の免疫学的交差反応性に関する以前の観察を確認した。アドヒーシン負菌株（ＣＡ− ）の付着は抗アドヒーシン抗体と一緒のプレインキュベージタンにより影響されなかった。

軟骨に対するＳ、ａｕｒｅｕｓの付着続いて、本発明者等は感染性の関節炎の進行の初期のできごとをまねるモデルにより、軟骨へのバクテリアの付着を研究した。このモデルにおいて軟骨の均一な小片を１２５■−表面標識Ｓ、ａυｒｅｕｓと共にインキュベートした。

骨の軟骨と組織学的に同一であるウシの鼻の軟骨を本研究において使用した。軟骨組織で得たデータはコラーゲンコートした表面の結果と酷似していた。ＣＡ十菌株のみが軟骨に付着しく第４Ｄ図）、コラーゲンコートされた基質に付着するＣＡ十菌株に見られる反応速度現象と類似の反応速度現象を示した。この付着は抗アドヒーシン抗体と一緒のプレインキュベージジンにより完全に阻害することができた（第４ＥＩＭ）。これらのデータは、組織コラーゲンの認識はバクテリアにとって軟骨上に定着するために充分であり得ることを示す。電子顕微鏡による検査は以前に提出された定量的な観察を確認した。

１２５、−コラーゲンと結合し、ウェスターンプロット上に免疫反応性タンパク質を持つＳ、ａｕｒｅｕｓ菌株は、軟骨組織に多数付着し、モしてコラーゲン繊維に優先的に付着することを見ることができる（第４Ｃ図）。付着するバクテリアの数は抗アドヒーシン抗体の存在下において劇的に減少した（第４Ｆ図）、電子顕微鏡による検査の観察結果は、骨組織に対するバクテリアの付着は生物学的に機能するコラーゲンアドヒーシンを発現する能力に実際に関連することを示した。

人工バクチリアの創造「人ロバクチリア」をコラーゲンアドヒーシンタンパク質でポリスチレンビーズ（直径でブドウ球菌０．８〜１．０μｍに対し１．２μｍ）を共有結合的にコーティングすることにより調製した。これらのビーズを次いで無傷のバクテリアによって行われた実験と類似する一連の実験で試験した。コラーゲンアドヒーシン（ＣＡ）コートされたビーズはＳ、ａｕｒｅｕｓのＣＡ十菌株（Ｓｐｅｚｉａｌｅ等、１９８Ｂ）の場合と同様の方法で１２５Ｉ−コラーゲンに結合したが、他のブドウ状球菌細胞表面成分であるフィブロネクチンレセプター（Ｆｌｏｃｋ等、１９８７）でコートしたビーズは結合しなかった第５Ａ図）。この結合は抗ＣＡ抗体により抑止されたが、前免疫抗体は結合を効率的に阻害しなかっただ（第５Ｂ図）。「人ロバクチリア」がコラーゲンに付着する能力（データを示さない）または軟膏に付着する能力について検定されたとき、本発明者等はＣＡビーズは、Ｓ、ａｕｒｅＵＳのＣＡ十菌株の場合と同一の、時間依存性をもって基質に付着したが、フィブロネクチンレセプターでコートされたビーズは有意のレベルで付着しないことを発見した（第５Ｃ図）。抗ＣＡ抗体は用量依存的に軟骨に対するＣＡビーズの付着を阻害したが、前免疫抗体は効果が全くなかった（第５Ｄ図）。もう一度定量性結合データについて電子顕微鏡による検査の観察により裏付けを行った。ＣＡコートされたビーズは軟性組織、特にコラーゲン繊維に多数付着した（第５Ｅ図）が、フィブロネクチンレセプターでコートされたビーズは付着しなかった（ｊＲ５Ｆ図）。

コラーゲンアドヒーシン内のコラーゲン結合領域の局在化さまざまな発現構成物がコラーゲン結合領域を特異的に局在化する企てにおいてＥ、ｃｏｌｉ中に創造された。２種特表千５−５０５９４３　（１ｏ）の相違する型の発現ベクター、ｐＫＫ２２３−３およびｐＧＥＸ−２７がこれらの実験に利用されたか、その２番目のものがグルタチオン−８−トランスフェラーゼと融合したコラーゲンアドヒーシンを生じる。現在までコラーゲン結合活性を証明できたアドヒーシンの最小の領域は構成物ｐＧＥＸ−１，１内に含有される。この融合タンパク質はおおよそ６８ｋＤａであり、その４１ｋＤａはコラーゲンアドヒーシンにより発現される。第６図に示されるように、コラーゲン結合活性はｃｎａ遺伝子のＡ領域内に局在化する。

本発明のコラーゲン結合タンパク質は免疫化に使用することができ、それによってタンパク質は、好ましくは反応する大きな抗原を創り出すために融合タンパク質との組合せで、宿主哺乳動物に免疫反応を引き起こす用量で注射される。かくしてコラーゲン結合タンパク質はブドウ球菌感染により引き起こされた乳腺炎に対する反御動物のワクチン注射に使用することができる。

さらに、コラーゲン結合タンパク質は、懸濁液中のコラーゲン結合タンパク質を使用する傷治療により開いた皮ふの傷における感染を遮断することに使用できる。

従ってコラーゲン結合タンパク質は傷の治療、例えばタンパク質レセプターを遮断すること、または免疫化（ワクチン注射）のために使用できる。後者の場合には、宿主の体はコラーゲン結合タンパク質を含むバクテリア菌株の侵入に対して保護することのできる、特異的抗体を生成する。これによって抗体は損傷された組織に対するバクテリア菌株の付着を遮断する。敗血症性関節炎の治療もまた含まれる。

組織損傷の集落化（ｃｏｌｏｎｉｚｉｎｇ）の例は次のとおりである。

ａ）傷が機械的外傷、化学的損傷、および／または熱的損傷により引き起こされた皮ふおよび結合性組織の傷の場合の集落化；ｂ）口腔の、または乳腺、尿道、または膣の中のような粘膜上の傷の集落化；Ｃ）上皮および内皮と関連して最小の組織損傷（小病巣）にさらされた（乳腺炎、心弁感染、ヒップ交換外科）結合性組織タンパク質における集落化。

人を含む哺乳動物における免疫化（ワクチン注射）の目的のために、本発明のＣＢＰ、またはポリペプチドを使用するとき、該タンパク質、またはポリペプチドは殺菌された、等張性食塩水溶液に、場合によっては医薬的に許容し得る分散剤を添加して、分散させられる。種々のアジュバントを組織内での放出を維持するために更に使用することができ、従って該タンパク質またはペプチドを体の免疫防衛組織に対しより長い時間さらす。

免疫化を得るために適する用量は、体重ｋｇおよび免疫化の注射当り０．５〜５ μｇのＣＢＰ、またはポリペプチドである。持久性の免疫化を得るために、ワクチン注射は１〜３週間の間隔で、１回より多い連続的回数で、好ましくは３回にわたって行われるべきである。

本発明のＣＢＰ、またはポリペプチドを、局所的投与のために使用するときは、該タンパク質を濃度２５〜２５０μｇ／ｍ＋に等偏食塩水溶液に分散する。次いで傷表面の完全な湿潤を得るために必要なたけの量によって傷を治療する。したがって平均的な傷に対しては、わずかに２ｍｌの溶液をこの方法で使用する。このタンパク質溶液を使用する治療の後で、傷を等張生理的食塩水または別の適当な傷治療溶液で適当に洗浄する。

さらに、本発明のコラーゲン結合タンパク質および最小コラーゲン結合部位ポリペプチドは、ブドウ球菌菌株によりもたらされる細菌性感染を診断するために使用できる。これにより本発明のコラーゲン結合タンパク質は、小さなラテックスまたは５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（商標）ビーズ等の固体担体上に固定化される。すると抗体を含む血清は通過して固定化されたＣＢＰと反応することができる。次いで凝集物を既知の方法により測定する。

さらに、ＣＢＰ、またはポリペプチドはＥＬＩ　ＳＡ試験（酵素結合免疫吸着剤検定：　Ｅ　Ｅｎｇｖａｌｌ、Ｍｅｄ、Ｂｉｏｌ旦１９３、　（１９７７））に使用できる。これによりポリスチレンミクロタイター板のウェル（Ｗｅｌｌ）はＣＢＰによってコートされ、４℃で一夜インキユベートされる。次いで板をＴｖｅｅｎ２０を０．０５％含有するＰＢＳを使用して充分に洗浄し、乾燥する。患者の血清の連続した希釈をＰＢＳ−Ｔｖｅｅｎ中で行ない、ウェルへ添加し、３０℃で１．５時間インキュベートした。酵素と複合した抗ヒト−ＩｇＧ、または酵素と複合した抗ウシ−１ｇＧをそれぞれすすいだ後、セイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼをウェルに添加し、３０℃で１．５時間インキュベートした。次いでＩｇＧがそれらに結合し、そしてすすいだ後、酵素基質を添加したが、アルカリ性ホスファターゼの場合にはｐ−ニトロホスフェートを、またはペルオキシダーゼを使用した場合にはオルトフェニレンジアミン基質（○ＰＤ）をそれぞれ添加した。このようにして次にウェルを含む板を０．０５５％ＯＰＤ、および０　、０５５％Ｈ２Ｏ２を含有するクエン酸緩衝液を使用してすすぎ、３０℃で１０分間インキュベートした。各ウェルに４Ｎの）Ｅ２ＳＯ４溶液を添加して酵素反応を停止させた。色の発現を分光光度計を使用して測定した。

使用された酵素基質の種類次第で蛍光測定もまた使用できる。

ブドウ球菌感染を診断するための別の方法は、ＣＢＰヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に基づ＜ＤＮＡ遺伝子プローブ法を使用することによる。乳腺炎を診断する場合には試料の乳を、存在するバクテリアを収集する膜を通して流す。アルカリ中のバクテリアの自動分解は放出された一本鎖ＤＮＡを膜に結合する。次に酵素法的に、または放射性同位元素により標識されたＤＮＡ遺伝子プローブが当該ＤＮＡ配列を含む膜に添加され、それによりＤＮＡ遺伝子プローブは出現する配列に付着する。次いて酵素または放射性同位元素は既知の方法により容易に測定することができる。

上記の用語コラーゲン結合タンパク質はポリペプチド配列もまた包含し、該ポリペプチド配列は完全タンパク質の最小コラーゲン結合部位を形成するものである。

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Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、　Ｈ，Ｓ、　Ｊａｃｏｂ　ａｎｄ　Ｌ、　Ｔ、　Ｆｕｒｃｈｔ、　１９Ｅ１５．　Ａｍ、　Ｊ、　Ｐａｔｈｏｌ。

１２０＝１３−２１゜第２図（その２）＾τＴττんん＾＾Ｃ＾Ｊ請丁パＡＧＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣ；丁＾丁人Ｃ＾ｉｉフＣ＾丁人＾ＧＣ＾丁メツ、ＡＣメ、＾τ＾τＣＣｃ第２図（その３）２！ＯＬ　−−−−−−−−−−−−−−−−−−−◆−−−−−−−−−◆− −−−−−−−一◆−−−−−−−−◆−−−−−−−−−氈@２Ｘ６０ｒ１ａＬ＊ｕＬｙｇ０１ｕ！１叡０１ｕ＾１ａＦｔｏ＾ｒＨ？ｒｏＴｙｒＴｈｒＦｈｔＡｔｐＬγＳ＾ｔ＞ＬｙｙｃｌｕＴｙｒ？ｒ。

第２図（その４）３９６２　ＣＡＣメＪＴ７ＪτＺＪＣＣｆｉＪｋＣＡＣＧＣＪＪＪ−ｋＣＣＡＣＣＡＡＣ７ＧｆｉＪＪ、ＴＣメＪＪ、ＧＴＴＣ人σＴτＡ？`？ｅメ、ＡＣＡ？ ′″−一−−−−呼一＋−−＋＋＋１６−−〜−−−−一−−”−−一一＋＋＋＃軸軸軸−−−中−−−−−−一−−拳　４口２゜Ａ′μ“７１″°６″″ＧＬ ″Ａ″斧１ｙＬγ′轡？ｒｏＴｈｒＧ１ｕｌ）“１γ”゛）Ｇ１ｕＬ°ν）ぺ１ μ・ｐ　第２図（その５）ａｂ　ｃｄ　ｅｆｇ　ｈ　ｉ第３図２、クチｌ＋７１を着ｆｆｉ　／ｍｍ２（！１０３）第５図浄昏内容に変更なし）要約本発明は、コラーゲン結合活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするＳ、ａｕｒｅｕｓがらのヌクレオチド配列を含む新規な組換え雑種ＤＮＡ分子に関する。

（第２図）。

ら手続補正書動式）％式％１、事件の表示平成３年特許願第５１７１６９号（ＰＣＴ／ＳＥ　９１１００７０７）２、発明の名称コラーゲン結合タンパク質およびその製造方法３、補正をする者事件との関係　特許出願人アルファーレーバル　アグリ　インターナショナルアクチボラグ４、代　理　人　（郵便番号１０５）その訳文、明細書、請求の範囲、要約および図面の中の説明の翻訳文７、補正の内容別紙のとおり明細書、請求の範囲、要約および図面の中の説明の翻訳文の浄書　（内容に変更なし）田瞥謹査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．コラーゲン結合活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするＳ．ａｕｒｅｕｓからのヌクレオチド配列を含む雑種ＤＮＡ分子。
２．コラーゲン結合活性を有するタンパク質またはポリペプチドをコードするＳ．ａｕｒｅｕｓからのヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはファージ。
３．寄託番号ＤＳＭ６１９９を有するＥ．ｃｏｌｉＴＧ１中に含まれるプラスミドｐＳＡＣ１０４。
４．前記コラーゲン結合タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ菌株。
５．請求の範囲第１項〜第３項に記載の組み換えＤＮＡ分子により形質転換された微生物。
６．次のヌクレオチド配列：ＧＣＡ【配列があります】を含むことを特徴とする請求の範囲第１項に記載の雑種ＤＮＡ分子。
７．請求の範囲第６項に記載の１個またはそれ以上のヌクレオチド配列を含むプラスミドまたはファージ。
８．請求の範囲第７項に記載のプラスミドまたはファージを少なくとも含有する微生物。
９．ａ）請求の範囲第１項に記載の少なくとも１個の雑種ＤＮＡ分子が微生物中に導入され、ｂ）前記微生物が成長促進培地に培養され、そしてｃ）こうして生成されたタンパク質がイオン交換クロマトグラフィ、硫酸アンモニウム沈殿およびゲル濾過により分離される、コラーゲン結合タンパク質またはポリペプチドを生産する方法。
１０．アミノ酸残基がＣ−末端セリンから出発して前記タンパク質またはポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列に基づいて作り上げられ、それが適切なアミノ酸と段階的に反応させられ、それによってＮ−末端でアラニンと最終的に反応させられて前記コラーゲン結合タンパク質またはポリペプチドを生成する、請求の範囲第１項に記載のコラーゲン結合タンパク質またはポリペプチドを生産するための化学的合成方法。
１１．少なくとも１つのアミノ酸配列【配列があります】を含むコラーゲン結合タンパク質またはポリペプチド。