FI105333B - Kollageeniä sitova proteiini tai polypeptidi sekä sen valmistaminen - Google Patents
Kollageeniä sitova proteiini tai polypeptidi sekä sen valmistaminen Download PDFInfo
- Publication number
- FI105333B FI105333B FI922865A FI922865A FI105333B FI 105333 B FI105333 B FI 105333B FI 922865 A FI922865 A FI 922865A FI 922865 A FI922865 A FI 922865A FI 105333 B FI105333 B FI 105333B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- collagen
- protein
- cbp
- polypeptide
- plasmid
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 18
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 17
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 17
- 102100027287 Serpin H1 Human genes 0.000 title claims description 56
- 108050008290 Serpin H1 Proteins 0.000 title claims description 56
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 7
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 45
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 17
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 17
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 43
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 22
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 21
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 13
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 9
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 7
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 3
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000010397 one-hybrid screening Methods 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 claims 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 claims 1
- GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GVUVRRPYYDHHGK-VQVTYTSYSA-N 0.000 claims 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 claims 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 abstract description 50
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 abstract description 49
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 abstract description 49
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 42
- 101710196256 Collagen adhesin Proteins 0.000 description 29
- 241000894007 species Species 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 17
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 16
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 10
- 102000009268 Collagen Receptors Human genes 0.000 description 9
- 108010048623 Collagen Receptors Proteins 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 description 7
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 7
- 101150069831 CBP gene Proteins 0.000 description 6
- 108010042918 Integrin alpha5beta1 Proteins 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 102100027974 Semaphorin-3A Human genes 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 108010037896 heparin-binding hemagglutinin Proteins 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 101000632261 Homo sapiens Semaphorin-3A Proteins 0.000 description 4
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 4
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 4
- 108090000988 Lysostaphin Proteins 0.000 description 4
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 4
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 4
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 4
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 4
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000004575 Infectious Arthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 3
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 3
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 3
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 3
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 3
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 201000001223 septic arthritis Diseases 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 102000000503 Collagen Type II Human genes 0.000 description 2
- 108010041390 Collagen Type II Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 2
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 241001051053 Garcinia cowa Species 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 2
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000295644 Staphylococcaceae Species 0.000 description 2
- 206010041925 Staphylococcal infections Diseases 0.000 description 2
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000010065 bacterial adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000002964 excitative effect Effects 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 101150029062 15 gene Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150098072 20 gene Proteins 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000158640 Acanthodactylus aureus Species 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 238000008940 Alkaline Phosphatase assay kit Methods 0.000 description 1
- 101100393868 Arabidopsis thaliana GT11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101001026147 Arabidopsis thaliana Glutathione S-transferase U17 Proteins 0.000 description 1
- 206010053555 Arthritis bacterial Diseases 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035404 Autolysis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010057248 Cell death Diseases 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 101100042266 Gallus gallus SEMA3A gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000000174 L-prolyl group Chemical group [H]N1C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[C@@]1([H])C(*)=O 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710091872 Putative fusion protein Proteins 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 108010088160 Staphylococcal Protein A Proteins 0.000 description 1
- 108700011201 Streptococcus IgG Fc-binding Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000004520 agglutination Effects 0.000 description 1
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000003367 anti-collagen effect Effects 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 101150043616 cna gene Proteins 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 102000021124 collagen binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091011142 collagen binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000003709 heart valve Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000004816 latex Substances 0.000 description 1
- 229920000126 latex Polymers 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000002184 nasal cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- -1 respectively Proteins 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028043 self proteolysis Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000011149 sulphuric acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000003685 thermal hair damage Effects 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 210000003708 urethra Anatomy 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/305—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F)
- C07K14/31—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
- C07K2319/23—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a GST-tag
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/705—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a protein-A fusion
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
105333
Kollageeniä sitova proteiini tai polypeptidi sekä sen valmistaminen - Kollagen bindande protein eller polypeptid och dess framstälining 5 Esillä oleva keksintö kohdistuu kollageeniä sitovaan proteiiniin sekä hybridi-DNA-molekyyleihin, esimerkiksi plasmideihin ja faageihin, jotka käsittävät kyseistä proteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin. Lisäksi keksintö kohdistuu mikro-organismeihin, jotka käsittävät näitä molekyylejä, ja niiden 10 käyttöön mainitun proteiinin valmistuksessa sekä kyseisen proteiinin synteettiseen valmistamiseen. Keksintö kohdistuu erityisesti kloonattuun geeniin, joka koodaa Stafylococcus aureus -kollageeniä sitovaa proteiinia tai sen funktionaali -sesti aktiivisia osia, vektoreihin, jotka sisältävät kloona-15 tun geenin tai sen osia, ja mikro-organismeihin, jotka on transformoitu näillä vektoreilla samoin kuin geenin kloonami-seen, joka määrittelee Staphylococcus aureus -kollageenia sitovan proteiinin (CBP) biosynteesin (Switalski et ai. 1989 nimittävät sitä myös kollageenireseptoriksi) ja kloonatulla 20 geenillä transformoitujen organismien käyttöön CBP:n tai CBP:n kaltaisten proteiinien valmistamiseksi. Keksintö kuvaa myös tämän geenin käyttöä diagnostisiin tarkoituksiin.
Esillä olevan keksinnön kohteena on saada aikaan kollageeniä 25 sitova proteiini.
Lisäkohteena on saada aikaan kyseinen proteiini geeniteknologialla käyttämällä esimerkiksi plasmidia, joka käsittää sanottua proteiinia koodaavan nukleotidisekvenssin.
30 5 . Lisäkohteena on saada aikaan mahdollisuus sanotun proteiinin valmistamiseksi kemiallisella synteesillä.
9
Muut kohteet ilmenevät seuraavasta selityksestä.
WO-A1-85/05553:ssa kuvataan bakteerisolun pintaproteiineja, joilla on fibronektiiniä, fibrinogeeniä, kollageenia ja/tai laminiinia sitovaa kykyä. Täten on osoitettu, että erilai- 35 2 105333 silla bakteereilla on kyky sitoutua fibronektiiniin, fib-rinogeeniin, kollageeniin ja/tai laminiiniin.
Kollageenin sitoutuminen S. aureukseen on raportoitu lukui-5 sissa tutkimuksissa (Carret et ai 1985, Holderbaum et ai 1985, Holderbaum et ai 1986, Vercellotti et ai 1985, Spe-ziale et ai 1986, Switalski et ai 1989).
Switalski et ai 1989 raportoivat S. aureuksen pintaprote-10 iinin eristämisen ja karakterisoinnin, jonka he identifioivat kollageenireseptoriksi. Käyttämällä lysostafiinia proteiinin vapauttamiseen solun seinästä, mitä seurasi ionin-vaihtokromatografia, ammoniumsulfaattipresipitaatio ja gee-lisuodatus, oli mahdollista puhdistaa proteiini, jonka 15 näennäis-Mr on 135 kDA. Osoitettiin myös, että 135 kDa:n proteiinia vastaan herätetyt vasta-aineet inhiboivat kollageenin sitoutumista S. aureus Cowan 1 -soluihin.
Nyt on yllättäen havaittu mahdolliseksi saada hybridi-DNA-20 molekyyli, joka käsittää sekvenssin, joka koodaa proteiinia tai polypeptidiä, jolla on kollageenia sitovia ominaisuuksia. Kuten jäljempänä ilmenee, seuraava nukleotidisek-venssi on läsnä sanottua proteiinia koodaavassa geenissä.
GCA
25 CGAGATATTT CATCAACGAA TGTTACAGAT TTAACTGTAT CACCGTCTAA
GATAGAAGAT GGTGGTAAAA CGACAGTAAA AATGACGTTC GACGATAAAA
ATGGAAAAAT ACAAAATGGT GACATGATTA AAGTGGCATG GCCGACAAGC
GGTACAGTAA AGATAGAGGG TTATAGTAAA ACAGTACCAT TAACTGTTAA
AGGTGAACAG GTGGGTCAAG CAGTTATTAC ACCAGACGGT GCAACAATTA
30 CATTCAATGA TAAAGTAGAA AAATTAAGTG ATGTTTCGGG ATTTGCAGAA
TTTGAAGTAC AAGGAAGAAA TTTAACGCAA ACAAATACTT TAGATGACAA
. AGTAGCTACG ATAACATCTG GGAATAAATC AACGAATGTT ATCGGTTGGA
TAAAAGTGAA GCGGGAACCA GTAGTGTTTC TAATTAATAA AAGCGGGAAG
ATATGCTACC AAGAAGATAC GACACATGTA CGATGGTTTT TAAATATTAA
35 CAATGAAAAA AGTTATGTAT CGAAAGATAT TACTATAAAG GATCAGATTC
AAGGTGGACA GCAGTTAGAT TTAAGCACAT TAAACATTAA TGTGACAGGT
ACACATAGCA ATTATTATAG TGGACAAAGT GCAATTACTG ATTTTGAAAA
AGCCTTTCCA GGTTCTAAAA TAACTGTTGA TAATACGAAG AACACAATTG
ATGTAACAAT TCCACAAGGC TATGGGTCAT ATAATAGTTT TTCAATTAAC
3 105333
TACAAAACCA AAATTACGAA TGAACAGCAA AAAGAGTTTG TTAATAATTC ACAAGCTTGG TATCAAGAGC ATGGTAAGGA AGAAGTGAAC GGGAAATCAT TTAATCATAC TGTGCACAAT ATTAATGCTA ATGCCGGTAT TGAAGGTACT 5 GTAAAAGGTG AATTAAAAGT TTTAAAACAG GATAAAGATA CCAAGGCTCC TATAGCTAAT GTAAAATTTA AACTTTCTAA AAAAGATGGA TCAGTTGTAA AGGACAATCA AAAAGAAATT GAGATTATAA CAGATGCAAA CGGTATTGCT AATATTAAAG CGTTGCCTAG TGGAGACTAT ATTTTAAAAG AAATAGAGGC GCCACGACCG TATACATTTG ATAAGGATAA AGAATATCCG TTTACTATGA 10 AAGATACAGA TAATCAGGGA TATTTTACGA CTATTGAAAA TGCAAAAGCG ATAGAAAAAA CAAAAGATGT TTCTGCTCAA AAGGTTTGGG AAGGCACTCA AAAAGTGAAA CCAACGATTT ATTTCAAGTT GTACAAACAA GATGACAATC AAAATACAAC ACCAGTAGAC AAAGCAGAGA TTAAAAAATT AGAAGATGGA ACGACAAAAG TGACATGGTC TAATCTTCCG GAAAATGACA AAAATGGCAA 1 5 GGCTATTAAA TATTTAGTTA AAGAAGTAAA TGCTCAAGGT GAAGATACAA CACCAGAAGG ATATACTAAA AAAGAAAATG GTTTAGTGGT TACTAATACT GAAAAACCAA TCGAAACAAC ATCAATTAGT GGTGAAAAAG TATGGGACGA CAAAGACAAT CAAGATGGTA AGAGACCAGA AAAAGTCAGT GTGAATTTAT TGGCTAACGG GGAGAAAGTA AAAACGTTAG ACGTGACATC TGAAACAAAC 20 TGGAAGTACG AATTTAAAGA CTTACCGAAG TATGATGAAG GAAAGAAAAT AGAATATACA GTGACCGAAG ATCACGTAAA AGACTACACA ACAGACATCA ACGGTACGAC AATAACGAAC AAGTATACAC CAGGAGAGAC ATCGGCAACA GTAACAAAAA ATTGGGATGA CAATAATAAC CAAGACGGAA AACGACCAAC TGAAATCAAA GTTGAGTTAT ATCAAGACGG AAAAGCAACA GGAAAAACGG 25 CAACATTAAA TGAATCTAAT AACTGGACCC ATACGTGGAC AGGATTAGAT GAAAAAGCAA AAGGACAACA AGTAAAATAC ACAGTCGAGG AATTAACAAA : GGTCAAAGGT TATACAACAC ATGTGGATAA CAATGATATG GGTAACTTGA
TTGTGACGAA TAAATATACG C CAGAAACAA CATCAATTAG TGGTGAAAAA GTATGGGACG ACAAAGACAA TCAAGATGGT AAGAGACCAG AAAAAGTCAG 30 TGTGAATTTA TTGGCTGATG GAGAGAAAGT AAAAACGTTA GACGTGACAT CTGAAACAAA CTGGAAGTAC GAATTTAAAG ACTTACCGAA GTATGATGAA GGAAAGAAAA TAGAATATAC AGTGACCGAA GATCACGTAA AAGACTACAC AACAGACATC AACGGTACGA CAATAACGAA CAAGTATACA CCAGGAGAGA CATCGGCAAC AGTAACAAAA AATTGGGATG ACAATAATAA CCAAGACGGA 35 AAACGACCAA CTGAAATCAA AGTTGAGTTA TATCAAGACG GAAAAGCAAC AGGAAAAACG GCAACATTAA ATGAATCTAA TAACTGGACC CATACGTGGA CAGGATTAGA TGAAAAAGCA AAAGGACAAC AAGTAAAATA CACAGTCGAG
105333 4
GAATTAACAA AGGTCAAAGG TTATACAACA CATGTGGATA ACAATGATAT GGGCAACTTG ATTGTGACGA ATAAATATAC GCCAGAAACA ACATCAATTA GCGGTGAAAA AGTATGGGAC GACAAAGACA ATCAAGATGG TAAGAGACCA GAAAAAGTCA GTGTAAATTT ATTGGCTAAC GGAGAGAAAG TAAAAACGTT 5 AGACGTGACA TCTGAAACAA ACTGGAAGTA CGAATTTAAA GACTTACCGA AGTATGATGA AGGAAAGAAA ATAGAATATA CAGTGACCGA AGATCACGTA AAAGACTACA CAACAGACAT CAACGGTACG ACAATAACGA ACAAGTATAC ACCAGGAGAG ACATCGGCAA CAGTAACAAA AAATTGGGAT GACAATAATA ACCAAGACGG AAAACGACCA ACTGAAATCA AAGTTGAGTT ATATCAAGAT 10 GGAAAAGCAA CAGGAAAAAC GGCAATATTA AATGAATCTA ATAACTGGAC ACATACGTGG ACAGGATTAG ATGAAAAAGC AAAAGGACAA CAAGTAAAAT ACACAGTCGA TGAATTAACA AAAGTTAATG GCTATACAAC GCATGTGGAT AACAATGATA TGGGTAACTT GATTGTGACA AATAAATATA CGCCGAAAAA ACCGAATAAA CCAATCTATC CTGAAAAACC AAAAGACAAA ACACCACCAA 15 CTAAACCTGA TCATTCTAAT AAAGTTAAAC CAACTCCCCC AGATAAGCCA TCAAAAGTGG ATAAGGATGA TCAACCTAAA GATAATAAAA CCAAACCTGA AAATCCTCTA AAAGAATTAC CAAAAACTGG TATGAAGATT ATAACTTCAT GGATTACATG GGTATTTATA GGTATATTGG GACTGTATTT AATTTTAAGA AAAAGATTTA ACTCA
20 jolloin tämä nukleotidisekvenssi koodaa seuraavaa proteiinia, joka alkaa nukleotidista no 1 edellä olevassa lukujärjestyksessä, jolloin kuviossa 2 esitetyt esiläsnäolevat nukleotidit ovat signaalijärjestelmän osa:
Ala 25 ArgAspIleSerSerThrAsnValThrAspLeuThrValSerProSerLysIleGluAsp GlyGlyLysThrThrValLysMetThrPheAspAspLysAsnGlyLysIleGlnAsnGly AspMetlleLysValAlaTrpProThrSerGlyThrValLysIleGluGlyTyrSerLys ThrValProLeuThrValLysGlyGluGlnValGlyGlnAlaVallleThrProAspGly AlaThrlleThrPheAsnAspLysValGluLysLeuSerAspValSerGlyPheAlaGlu 30 PheGluValGlnGlyArgAsnLeuThrGlnThrAsnThrLeuAspAspLysValAlaThr IleThrSerGlyAsnLysSerThrAsnVallleGlyTrpIleLysValLysArgGluPro ValValPheLeuIleAsnLysSerGlyLysIleCysTyrGlnGluAspThrThrHisVal ArgTrpPheLeuAsnlleAsnAsnGluLysSerTyrValSerLysAspIleThrlleLys AspGlnlleGlnGlyGlyGlnGlnLeuAspLeuSerThrLeuAsnlleAsnValThrGly 35 ThrHisSerAsnTyrTyrSerGlyGlnSerAlalleThrAspPheGluLysAlaPhePro GlySerLysIleThrValAspAsnThrLysAsnThrlleAspValThrlleProGlnGly 5 105333
TyrGlySerTyrAsnSerPheSerlleAsnTyrLysThrLysIleThrAsnGluGlnGln LysGluPheValAsnAsnSerGlnAlaTrpTyrGlnGluHisGlyLysGluGluValAsn GlyLysSerPheAsnHisThrValHisAsnlleAsnAlaAsrtAlaGlylleGluGlyThr 5 ValLysGlyGluLeuLysValLeuLysGlnAspLysAspThrLysAlaProIleAlaAsn ValLysPheLysLeuSerLysLysAspGlySerValValLysAspAsnGlnLysGluIle GluIlelleThrAspAlaAsnGlylleAlaAsnlleLysAlaLeuProSerGlyAspTyr IleLeuLysGluIleGluAlaProArgProTyrThrPheAspLysAspLysGluTyrPro PheThrMetLysAspThrAspAsnGlnGlyTyrPheThrThrlleGluAsnAlaLysAla 1o IleGluLysThrLysAspValSerAlaGlnLysValTrpGluGlyThrGlnLysValLys ProThrlleTyrPheLysLeuTyrLysGlnAspAspAsnGlnAsnThrThrProValAsp LysAlaGluIleLysLysLeuGluAspGlyThrThrLysValThrTrpSerAsnLeuPro GluAsnAspLysAsnGlyLysAlalleLysTyrLeuValLysGluValAsnAlaGlnGly GluAspThrThrProGluGlyTyrThrLysLysGluAsnGlyLeuValValThrAsnThr 15 GluLysProIleGluThrThrSerlleSerGlyGluLysValTrpAspAspLysAspAsn GlnAspGlyLysArgProGluLysValSerValAsnLeuLeuAlaAsnGlyGluLysVal LysThrLeuAspValThrSerGluThrAsnTrpLysTyrGluPheLysAspLeuProLys TyrAspGluGlyLysLysIleGluTyrThrValThrGluAspHisValLysAspTyrThr ThrAspIleAsnGlyThrThrlleThrAsnLysTyrThrProGlyGluThrSerAlaThr 20 ValThrLysAsnTrpAspAspAsnAsnAsnGlnAspGlyLysArgProThrGluIleLys ValGluLeuTyrGlnAspGlyLysAlaThrGlyLysThrAlaThrLeuAsnGluSerAsn AsnTrpThrHisThrTrpThrGlyLeuAspGluLysAlaLysGlyGlnGlnValLysTyr ThrValGluGluLeuThrLysValLysGlyTyrThrThrHisValAspAsnAsnAspMet GlyAsnLeuIleValThrAsnLysTyrThrProGluThrThrSerIleSerGlyGluLys 25 ValTrpAspAspLysAspAsnGlnAspGlyLysArgProGluLysValSerValAsnLeu LeuAlaAspGlyGluLysValLysThrLeuAspValThrSerGluThrAsnTrpLysTyr GluPheLysAspLeuProLysTyrAspGluGlyLysLysIleGluTyrThrValThrGlu AspHisValLysAspTyrThrThrAspIleAsnGlyThrThrlleThrAsnLysTyrThr ProGlyGluThrSerAlaThrValThrLysAsnTrpAspAspAsaAsnAsnGlnAspGly 30 LysArgProThrGluIleLysValGluLeuTyrGlnAspGlyLysAlaThrGlyLysThr AlaThrLeuAsnGluSerAsnAsnTrpThrHisThrTrpThrGlyLeuAspGluLysAla , LysGlyGlnGlnValLysTyrThrValGluGluLeuThrLysValLysGlyTyrThrThr
HisValAspAsnAsnAspMetGlyAsnLeuIleValThrAsnLysTyrThrProGluThr ThrSerlleSerGlyGluLysValTrpAspAspLysAspAsnGlnAspGlyLysArgPro 3 5 GluLysValSerValAsnLeuLeuAlaAsnGlyGluLysValLysThrLeuAspValThr SerGluThrAsnTrpLysTyrGluPheLysAspLeuProLysTyrAspGluGlyLysLys IleGluTyrThrValThrGluAspHisValLysAspTyrThrThrAspIleAsnGlyThr « 105333
ThrlleThrAsnLysTyrThrProGlyGluThrSerAlaThrValThrLysAsnTrpAsp AspAsnAsnAsnGlnAspGlyLysArgProThrGluIleLysValGluLeuTyrGlnAsp GlyLysAlaThrGlyLysThrAlalleLeuAsnGluSerAsnAsnTrpThrHisThrTrp ThrGlyLeuAspGluLysAlaLysGlyGlnGlnValLysTyrThrValAspGluLeuThr 5 LysValAsnGlyTyrThrThrHisValAspAsnAsnAspMetGlyAsnLeuIleValThr As nLys TyrThrProLysLys ProAs nLysP ro11eTyrProG1uLys ProLysAs pLys ThrProProThrLysProAspHisSerAsnLysValLysProThrProProAspLysPro SerLysValAspLysAspAspGlnProLysAspAsnLysThrLysProGluAsnProLeu LysGluLeuProLysThrGlyMetLysIleileThrSerTrpIleThrTrpValPhelle 10 GlylleLeuGlyLeuTyrLeuIleLeuArgLysArgPheAsnSer
Edellä olevassa yksikirjaimisessa aminohapposekvenssissä on käytetty seuraavia lyhenteitä: A Ala, alaniini 15 R Arg, arginiini N Asn, asparagiini D Asp, aspartaamihappo C Cys, kysteiini C Cys, kystiini 20 G Gly, glysiini E Glu, glutaamihappo Q Gin, glutamiini H His, histidiini I Ile, isoleusiini 25 L Leu, leusiini K Lys, lysiini M Met, metioniini F Phe, fenyylialaniini P Pro, proliini 30 s Ser, seriini T Thr, treoniini W Trp, tryptofaani ♦ Y Tyr, tyrosiini V Vai, väliini
Lisäksi keksintö käsittää plasmidin tai faagin, joka käsittää sanottua kollageenia sitovaa proteiinia koodaavan nukleotidi sekvenssin.
35 7 105333
Lisäksi keksintö käsittää mikro-organismin, joka sisältää vähintään yhden edellä olevan mukaisen hybridi-DNA-molekyylin. E. coli -lajissa TG1 oleva plasmidi pSAC104 on talletettu Deutsche Sammlung von Mikroorganismeniin (DSM), ja sille on 5 siten annettu talletusnumero DSM 6199. Esillä oleva keksintö saa aikaan kloonatun geenin, joka koodaa CBP:tä, jolla on parantuneet CBP-ominaisuudet verrattuna luonnolliseen CBP:hen, joka on vapautettu ja puhdistettu S. aureus -soluista. Geeni on johdettu S. aureus -lajista ja liitetty kloonausvektoriin. 10 Selostetaan prokaryoottiorganismin soluja, jotka on transformoitu yhdistelmävektoreilla.
Keksintö saa lisäksi aikaan geenin nukleotidisekvenssin identifioinnin, joka geeni koodaa CBP:tä, jota kutsutaan tässä 15 cbp-geeniksi. Dedukoitu aminohapposekvenssi paljastaa molekyylin, jolla on useita erilaisia piirteitä muistuttaen sta-fylokokkisolupintaproteiinej a.
Keksintö saa myös aikaan menetelmän yhdistelmä-CBP:n valmis-20 tamiseksi ja puhdistamiseksi. Se tehdään siten, että molekyyli säilyttää kollageenia sitovat ominaisuudet ja täten tämä yhdistelmä-CBP on samankaltainen luonnollisen vapautumattoman S. aureus -CBP:n kanssa.
25 Lisäksi keksintö saa aikaan cbp-geenin käytön diagnostisiin tarkoituksiin. On käytetty geenikoettimia, jotka on valittu erityisesti tunnistamaan cbp-geenin läsnäolon kliinisissä S. aureus -isolaateissa. Esimerkiksi CBP:n läsnäolon S. aureus -lajien pinnalla, jotka on eristetty potilaasta, jolla on 30 tarttuva niveltulehdus, välinen korrelaatio voidaan vahvistaa ' · cbp-geenin läsnäololla kaikissa testatuissa lajeissa.
Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.
Sopivat kantajaproteiinit voidaan kytkeä aminohapposekvenssiin samoin kuin esimerkiksi proteiinin IgG:tä sitovat alueet.
35 8 105333
Keksintöä kuvataan seuraavassa viitaten annettuihin esimerkkeihin kuitenkaan niihin rajoittumatta.
Kuvioiden lyhyt selostus 5 Kuvio 1: (A), p 16:ssa ja cCOLR6A:ssa olevan liitteen yk sinkertaistettu restriktiokartta, joka osoittaa homologia-alueen, MCS on monikloonauspaikan lyhennys. (B), Erilaisia alueita koodaavan cbp-geenin kaaviomainen piirros. S on ehdotettu signaalisekvenssi, jota seuraa alue A ja toistuvat 10 B-alueet, W on solun seinämää jännittävä alue ja M on kalvoa ankkuroiva alue.
Kuvio 2: p 16:ssa ja cCOLR6A:ssa olevasta liitteestä peräisin olevan kootun sekvenssin nukleotidisekvenssi ja dedu-15 koitu aminohapposekvenssi. Erilaiset alueet on merkitty nuolin ja sekvenssit, jotka ovat muistuttavat ribosomaali-siä sitomispaikkoja (RBS). p 16 olevan liitteen 5'-pää ja 31-pää sekä cCOLR6A:ssa olevan liitteen 5'-pää on osoitettu .
20
Kuvioiden selitykset
Kuvio 3: Antikollageeniadhesiinivasta-aineilla testatun S. aureksen kliinisten isolaattien lysaattien Westerna-blot-taus. Lajien lysostafiinilysaatit erotettiin geelielektro-25 foreesilla, sähköblotattiin Immunobilon-P-kalvoon. Kaista a: Cowan, b:#7, c:#12, d:#13, e:#14, f:#15, g:#16, h: Phil-lips ja i:#9.
Kuvio 4: S. aureuksen kollageeniadhesiinipositiivisten ja 30 -negatiivisten lajien ajasta riippuva kiinnittyminen kollageeniin (laatikko A) ja rustoon (laatikko D). Tämän kiinnittymisen inhibointi antiadhesiinivasta-aineilla (laatikot B ja D, kollageeni ja rusto vastaavasti). Kahden kollagee-niadhesiinipositiivisen lajin S. aureus Phillips (Λ) j a #14 35 (O) ja yhden adhesiininegatiivisen lajin #9 (·) ^25j_mer_ kittyjä soluja inkuboitiin kollageenilla päällystetyillä koloilla tai ilman ruston kappaleita osoitettuja aikoja. Kollageeniadhesiinipositiivisen S. aureus -lajin Phillips rustoon kiinnittymisen (laatikko C) ja tämän kiinnittymisen 9 105333 inhiboinnin antiadhesiinivasta-aineilla (laatikko F) elektronimikroskopia .
Kuvio 5: 125i_merkityn kollageenin sitoutuminen tai adhee-5 sio kalvoon polystyreenipalloilla, jotka on päällystetty joko kollageeniadhesiinilla (O) tai S. aureus fibronektii-nireseptorin rekombinanttimuodolla (#, ZZFR). Laatikko A-1 25j_]<oiiageenin sitoutuminen proteiinilla päällystettyihin palloihin ajan funktiona. Laatikko B - 125i_merkittyjen 10 pallojen sitoutuminen rustoon ajan funktiona (laatikko C) ja 125i_merkittyjen pallojen kiinnittymisen rustoon inhi-bointi vasta-aineilla (laatikko D). Tässä kokeessa 1 μg adhesiiniproteiinia kytkettiin 108 polystyreenipalloseen. Verrokkipalloset päällystettiin samalla moolikonsentraati-15 olla fibronektiinireseptoria. Palloissa olevat reagoimattomat kohdat kyllästettiin naudan seerumin albumiinilla. Kollageeniadhesiinilla päällystettyjen pallojen (laatikko E) tai rustoon kiinnittyneen fibronektiinireseptoriproteii-nin (laatikko F) skannauselektronimikroskopia.
20
Kuvio 6: S. aureus kollageeniadhesiinissa olevan kollageenia sitovan domeenin paikallistamiseen käytetyt ilmennys-rakenteet .
25 Esimerkki 1: . cbp-qeenin kloonaus ja identifiointi E. colissa S. aureus CBP:tä koodaavan geenin eristämiseksi testattiin kaksi kaupallisesti saatavissa olevaa (Clontech laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA) S. aureus -lajia (laji FDA 30 574 ja FDA 485) sen osalta, sitoivatko ne radioaktiivisesti merkittyä kollageenia. Tämä tehtiin Switalski et al:n, * 1989, mukaisesti. Lajin 574 havaittiin sitoutuvan kollagee niin ja siksi saman lajin geenikirjasto (joka saatiin samasta yhtiöstä, kat. #XL 150'6) seulottiin CBP-aktiivisuu-35 den ilmentämistä varten. Käyttäen välittäjän protokollaa (tämän protokollan lisäksi käytettiin yleistä työtä, joka sisältää molekyyliset geneettiset sopivat protokollat, jotka on löydettävissä Current Protocoils in Molecular Biology, Voi 1 ja 2 (toim. Ausubel, F. M., R. Brenti, R.E.
ίο 105333
Kingston, D.D, Moore, I.G. Seidman, J.A. Smith, U. Struhl, Greene, Wiley Interscience) ja Molecular Cloning, A laboratory manual, (Maniatis, T., Fritsch, E.F. ja Sambrook (1982) Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York), 5 päällystettiin rekombinantti-lambda gt 11 -faagit E. coli -lajille Y1090. Valittiin agarlevyt, joissa on 10000-100000 PFU 90 mm levyä kohti. Kultakin levyltä siirrettiin plakit replikoimalla nitroselluloosa(NC)suodattimiin (Schleicher & Schull). Plakkien, joissa on CBP-aktiivisuutta, havait-10 semiseksi käytettiin kahta erilaista menetelmää. Ensimmäisessä menetelmässä suodattimet esi-inkuboitiin liuoksessa, joka sisälsi 150 mM NaCl, 10 mM Tris, pH 7,5, 1,36 % maitojauhetta (rasva poistettu) 1 h ajan 37 °C:ssa (tai yön yli huoneenlämpötilassa). Inkuboinnin jälkeen suodattimet siir-15 rettiin samantyyppiseen liuokseen kuin edellä, mutta sitä oli täydennetty 125i-merkityllä naudan tyypin II kollageenillä ja suodattimia inkuboitiin yön yli huoneenlämpötilassa. Seuraavana päivänä suodattimia pestiin 3x10 min liuoksessa, joka sisälsi 150 mM NaCl, 0,05 % Tween 20 37 °C:s-20 sa, ne kuivattiin huoneenlämpötilassa ja autoradiografoltiin useita päiviä kloonien, joissa on kollageenia sitovaa aktiivisuutta, havaitsemiseksi.
Vaihtoehtoisessa seulontamenetelmässä polyklonaalisesta 25 kanin IgGcstä peräisin olevia Fab-fragmentteja, jotka tunnistavat luonnollisen koi1ageenireseptorin, käytettiin kloonien, joissa on CBP-aktiivisuutta, havaitsemiseen. Swi-talski et ai 1989 ovat käyttäneet tämäntyyppistä Fab-frag-mentin valmistusta kollageenireseptorin identifioimiseen 30 ja karakterisoimiseen. Tässä vaihtoehtoisessa menetelmässä NC-filtereille päällystettyjä replikoita esi-inkuboitiin liuoksessa, joka sisältää 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,5, 3 % (paino/til.) naudan seerumin albumiinia (BSA), 45 min 37 °C:ssa ei-spesifisen sitoutumisen ehkäisemiseksi. Ehkäi-35 semisen jälkeen suodattimet siirrettiin liuokseen, joka sisälsi fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta, jota oli täydennetty Tween 20:llä lopulliseen konsentraatioon 0,05 % (PBS-T), joka myös sisälsi kanin antikollageenireseptori-fragmentteja laimennoksena 1:400. 2,5 h kuluttua huoneen- n 105333 lämmössä inkuboimisen jälkeen suodattimia pestiin 3x10 min PBS-T:ssä, mitä seurasi sekundaarisen vuohen antikani-igG-alkalinen fosfataasi-konjugaatin (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA, Kat. #170-6518) lisääminen laimennettuna 5 1:3000 PBS-T:hen sitoutuneiden primaaristen Fab-fragment- tien havaitsemiseksi. 1 h huoneenlämpötilassa inkuboinnin jälkeen suodattimia pestiin 3 x 10 min PBS-T:ssä. Sitoutuneet merkityt sekundaariset vasta-aineet havaittiin väri-reaktiolla valmistajan ohjeiden mukaisesti (Bio-Rad, In-10 structions for preparing the BCIP/NBT color development solution for use in the immun-blot alkalinn phosphatase assay kit).
Käyttämällä edellä kuvattuja menetelmiä voitiin identifioi-15 da ja eristää useita rekombinantti-lambda-faageja, jotka ilmentävät CBP-aktiivisuutta.
Kaksi niistä valittiin lisätutkimuksiin. Ne nimettiin lambda coll 1:ksi ja lambda cCOLR6A:ksi vastaavasti.
20
Lambda coll 1:n subkloonaus: Puhdistettu lambda coll 1 -DNA pilkottiin EcoRI:lllä ja tahmaiset päät täytettiin käyttämällä Klenowin fragmentteja yhdessä dNTP:iden kanssa. S. aureus -kromosomista peräisin olevat tylppäpäiset DNA-frag-25 mentit ligatoitiin Sma 1:llä pilkottuun pUC 18:aan (Phar-. macia-LKB Biotechnology, Uppsala, Ruotsi). Jäätyneisiin kompetentteihin E. coli TG1 -soluihin transformoinnin jälkeen rekombinanttisolut testattiin CBP:n ilmentämisen osalta. Havaittiin, että kaikki kloonit, jotka ilmentävät 30 CBP:tä, sisälsivät rekombinanttiplasmidin, jossa on noin 4 kb:n insertti. Tällainen klooni, joka nimettiin p 16:ksi, . valittiin lisätutkimuksiin ja tässä kloonissa olevan inser- • tin kaaviomainen kartta on esitetty kuviossa 1A.
35 Samalla tavalla kuin lambda coll 1 generoitiin kaksi muuta lambda-kloonia genomisen kirjaston seulomisesta. Puhtaiden positiivien laajan skaalan viljelmät saatiin ja DNA eristettiin. Kloonien EcoRI-hajottaminen tuotti kahta eri kokoa olevia inserttejä. Kloonissa 1A oli 3,2 kb:n insertti ja 12 105333 3B:ssä oli 4,5 kb:n insertti. Suurempaa näistä kahdesta käytettiin lisäkarakterisointiin. Puhdistettu insertti-DNA (1,5 kb), joka oli peräisin lambda GT11 -kloonista 3B, li-gatoitiin EcoRI:llä hajotettuun pUC18:aan ja transformoi-5 tiin E. coli TB-1 -soluun luoden subklooni cCOLR6A. Se sub-kloonattiin myös M1 3mp1 8/JM101:een sekvennointia varten.
Subkloonista cCOLRöA peräisin oleva CsCl2-puhdistettu plas-midi-DNA kartoitettiin sitten käyttämällä erilaisia re-10 striktioendonukleaaseja. Pst1 -hajotus tuotti kaksi fragmenttia 2,9 kb ja 1,7 kb. Kummatkin frqagmentit sekvennoi-tiin. 2,9 kb EcoRI-Pst1-fragmentti limittyy osittain lambda COLLl:n kanssa. Subklooni CCOLR6A sisältää kaikki kolme toistoa, solunseinädomeenin sekä kalvoa jännittävän alueen. 15 Tässä kloonissa olevan insertin kaaviomainen kartta on esitetty kuviossa 1A.
Vertailevat restriktioentsyymihajotukset yhdessä hybridoin-tikokeiden kanssa osoittivat, että p 16 ja CC0LR6A peittä-20 vät limittäin osittain toisensa (kuvio 1A).
Esimerkki 2 DNA- ja aminohapposekvenssitiedot cbp-geenin nukleotidisekvenssin määrittämiseksi noudatet-25 tiin Sequenase-vä 1 inesar j aan (United States Biochemical . Corporationista, USA) sisällytettyä protokollaa p 16:ssa ja cCOLR6A:ssa olevan insertin analysoimiseksi. Vertaamalla inserteistä peräisin olevaa nukleotidisekvenssiä vahvistettiin, että kaksi inserttiä olivat osittain homologiset (ku-30 νίο 1A ja kuvio 2). Koostamalla nämä sekvenssit yhteen ja etsimällä avoimet lukujärjestykset päätettiin, että 3555 nt:n avointa lukujärjestystä käytettiin, joka vastaa 1885 • aminohapon dedukoitua aminohapposekvenssiä (kuvio 2).
35 Dedukoidussa aminohapposekvenssissä on useita toistuvia ja homologisia alueita. Tämä on esitetty kaaviomaisesti kuviossa 1B. Alkaen N-terminaalista paljastuu rakenne, joka muistuttaa signaalisekvenssiä. Tämä on sovussa sen kanssa, mitä odotetaan, koska CBP on solun pintaproteiini S. au- 13 105333
reuksessa. Tämän alueen jälkeen löytyy alue A, jota seuraa 187 aminohapon toistuva alue, jota kutsutaan B 1, B 2 ja B
3. Näitä alueita seuraa suoraan alue, jota kutsutaan W, joka koostuu toistuvasta, hydrofiilisestä rakenteesta, joka 5 sisältää useita proliinitähteitä. Tämä alue muistuttaa samanlaista rakennetta, joka on löydetty stafylokokkiproteii-nista A (Guss et ai 1 984) ja FnBP A (Signäs et ai 1986) samoin streptokokkiproteiinista G (Guss et ai 1986) ja M proteiinista (Hollingsheadd et ai 1986). Tämän alueen on 10 ajateltu välittävän proteiinin sitoutumista solunseinään. Lähimpänä C-terminaalista päätä oleva aminohapposekvenssi koostuu pitkästä hydrofobisten tähteiden alueesta, jota seuraa joitakain varautuneita aminohappoja. Tämä M:ksi kutsuttu alue on samanlainen rakenteeltaan kuin proteiinin A, 15 FnBP A:n, proteiinin G ja M proteiinin C-terminaalinen pää.
Dedukoidun CBP:n ennustettu moolipaino on suunnilleen 133 kD (mukaan lukien postuloitu signaalisekvenssi S), joka on hyvin lähellä luonnollisen vapautuneen reseptorin raportoi-20 tua 135 kd:n molekyylipainoa (Switalski et ai 1989).
Täydellista cbp-geeniä koodaavan plasmidin konstruoimiseksi S. aureus FDA 574 kromosomaalinen DNA puhdistettiin ja kak-soispilkottiin Hind ΙΙΙ/Pst 1 :llä. Southern Transfer-kokei-25 den, joissa käytetään 32-P-merkittyä oligonukleotidikoetin-ta (5’-ATTAAAGCGTTGCCTAGTGG-31) opastuksen avulla, oli tunnettua, että näillä entsyymeillä pilkonta generoi suunnilleen 3,2 kb fragmentin, joka vastaa cbp-geenin 3'-päätä. Näillä entsyymeillä pilkonnan jälkeen kromosomaalinen DNA 30 erotettiin elektroforeettisesti agaroosigeelissä. Geelipa-la, joka vastasi punostetusti oikeaa kokoa, leikattiin pois = ja DNA-fragmentti eluoitiin ja puhdistettiin. Puhdistetut fragmentit ligatoitiin pUC 18:aan, joka oli ennalta kak-soispilkottu Hind ΙΙΙ/Pst 1:llä. Ligaatiota seurasi trans-35 formointi E. coli TG1reen ja saadut rekombinanttikloonit seulottiin oikean fragmentin saamiseksi käyttämällä pesä-kehybridointia samalla koettimella. Yksi positiivinen klooni, joka hydridoitui radioaktiivisella koettimella, valittiin lisätutkimuksiin. Tämä E. coli pSAC lOOrksi nimitetty ,4 105333 klooni pilkottiin Hind 111:11a ja puhdistettu suunnilleen 1,8 kb Hind III-fragmentti, joka on peräisin p 16:sta (koo-daa cbp-geenin 5'-fragmenttia, kuvio 1A) ligatoitiin pSAC 100:aan. E. coli TG1reen transformoinnin jälkeen rekombi-5 nanttikloonit, joissa oli suunnilleen 1,8 kb fragmentti oikeassa orientaatiossa, identifioitiin ja eristettiin. Yksi tällainen E. coli pSAC 104:ksi nimetty klooni valittiin lisätutkimuksiin. Tässä kloonissa olevan insertin tulee edustaa täydellistä cbp-geeniä. Klooni oli myös posi-10 tiivinen, kun se testattiin CBP:n ilmentämisen osalta (katso esimerkki 3). Tämä klooni on tallennettu Deutsche Sam-mlung von Mikroorganismeniin, tallennenumero 6199.
Esimerkki 3 15 CBP;n ilmentäminen E. colissa Käyttämälllä Switalski et al:n, 1989, kuvaamaa 1251-kolla-geenin sitoutumistestiä testattiin E. coli -kloonit, jotka sisältävät cbp-geenin tai sen osia, sen osalta, voivatko näistä klooneista (sisältävät CBP-aktiivisuutta) peräisin 20 olevat lysaatit inhiboida 1251-kollageeniä sitoutumasta S. aureus Cowan I -soluihin. Asianomaista E. coli -kloonia viljeltiin yön yli Luria-liemessä, jota oli täydennetty ampisilliinilla, lopullinen konsentraatio 50 mikrogram-maa/ml. Bakteerit lingottiin alas ja supernatantti hylät-25 tiin (koska enin CBP-aktiivisuudesta havaittiin solunsisäi-seksi). Bakteeripelletti suspendoitiin uudelleen 1/10 osana alkuperäisestä tilavuudesta liuokseen, joka sisälsi 50 mM Tris pH 8,0, 50 mM EDTA ja lysotsyymiä 1 mg/ml, mitä seurasi inkubointi 37 °C:ssa täydelliseen liukenemiseen. Liu-30 enneet bakteerit sentrifugoitiin solujätteen poistamiseksi ja supernatantista huolehdittiin. Tämä supernatantin (tavanomainen käytetty tilavuus oli 100-200 mikrolitraa) kyky inhiboida 1251-kollageeniä sitoutumasta Cowan I -soluihin mitattiin. Verrokkina käytettiin E. coli TG1 pCJC 18:aa, 35 joka oli käsitelty samalla tavalla. CBP-aktiivisuuden läsnäolo voitiin mitata niinkin merkittävänä (joissakin tapauksissa 66 % saakka) Cowan 1 -soluihin sitoutuneen radioaktiivisen kollageenin vähentymisenä, kun mitattiin gamma-laskijalla. Tällä tavalla mitatuissa klooneissa E. coli TG1 is 105333 p 16, E. coli TG1 pSAC 104 ja E. coli TG1 pCA 1 oli suuri inhibitorinen aktiivisuus verrattuna verrokki-E. coli TG1 pUC 18;een, jossa ei esiintynyt mitään merkittävää inhiboivaa aktiivisuutta. Tämä tulos eroaa jyrkästi Switalski et 5 al:n 1989 raportoimista tuloksista, joissa havaittiin, että puhdistettu tai osittain puhdistettu luonnollinen kollagee-nireseptori ei voi inhiboida kollageenin sitoutumista S. aureus Cowan 1 -soluihin. Tästä on johtopäätöksenä, että ilmennetty rekombinantti-CBP on pysyttänyt enemmän alkupe-10 räisistM piirteistään kuin stafylokokeista vapautettu proteiini .
Vaikkakin oli mahdollista havaita CBP-aktiivisuutta rekom-binantti-E. coli-lysaatissa, ei ollut mahdollista affini-15 teettipuhdistaa CBP:tä käyttämällä immobilisoitua kollageenia tai gelatiinia. "Western transfer" -kokeissa edellä mainituista rekombinanttiklooneista peräisin olevista klooneista peräisin olevilla lysaateilla käyttäen esimerkissä 1 kuvattuja Fab-fragmentteja oli kuitenkin mahdollista ha-20 väitä kaistoja, jotka vastaavat suuren molekyylipainon fragmentteja. Nämä olivat samankokoisia kuin mitä oletettiin laskelmista dedukoitua aminohapposekvenssiä käyttämällä.
25 Esimerkki 4 CBP-fuusioproteiinin, joka säilyttää kollageeniin sitoutu-misominaisuudet puhdistuksen jälkeen, ilmentäminen Koska rekombinanttituotetun CBP:n affinitettipuhdistaminen käyttämällä immobilisoitua kollageenia ei onnistunut, käy-30 tettiin toista lähestymistapaa. Tämä lähestymistapa oli cbp-geenin tai geenin osien fuusioiminen toiseen geeniin, joka koodaa niin sanottua affiniteettihäntää (Methods in enzymology, Part 185). Testattava affiniteettihäntä on osa proteiini A -geenistä, joka koodaa IgG:tä sitovia domeenei-35 ta (Uhle'n et ai 1984). Siten käytettiin vektoria, joka koodaa edellä mainittuja domeeneja proteiinista A. Tämä pNSEQI:ksi nimitetty vektori, joka on tri M. Uhle'nin lahja, sisältää IgG:tä sitovien domeenien (E, D, A, B ja C) lisäksi kaksi multikloonauskontaa (MCS), jotka sivuavat '6 105333
IgG:ta sitovia alueita. Tämä tekee mahdolliseksi valita restriktioentsyymi, jossa on tunnistuskohta kummassakin MCS:ssä, mikä saa aikaan pilkonnassa igGrtä sitovia domee-neja koodaavan DNA-fragmentin vapautumisen (edellyttäen 5 että IgG:tä sitovissa domeeneissa ei ole restriktiopaik-kaa), joka voidaan puhdistaa ja liittää muihin vektoreihin. Koska cbp-geenin nukleotidisekvenssi on ollut määritetty, tiedettiin, että p 16 koodasi cbp-geenin N-terminaalista osaa ja päätettiin tehdä C-terminaalinen fuusio. Se tehtiin 10 seuraavalla tavalla: p 16 pilkottiin EcoRI:llä (kuvio 1A) ja puhdistettu pNSQlistä oleva EcoRI DNA fragmentti, joka koodaa proteiinin A IgG:tä sitovaa osaa ligatoitiin plas-midiin. Transformoinnin jälkeen rekombinanttikloonit, joissa oli insertoidun proteiini A:n oikea orientaatio, iden-15 tifioitiin ja eristettiin. Eräs näistä klooneista, jota nimitetään E. coli pCA 1:ksi, valittiin lisätutkimuksiin. Havaittiin, että tämän kloonin lysaatissa on sen lisäksi, että se inhiboi kollageenin sitoutumista mitattuna siten kuin esimerkissä 3, proteiini A -IgG:tä sitovaa aktiivi-20 suutta. Seuraava vaihe oli yrittää affiniteettipuhdistaa oletettu fuusioproteiini IgG-Sepharose FF:llä (Pharmacia LKB Biotechnology, Uppsala, Ruotsi). Käyttämällä saman valmistajan Protein A -käsikirjaa oli mahdollista affiniteet-tipuhdistaa fuusioproteiini solulysaatista. Käyttämällä 25 SDS-PAGEa puhdistetun proteiinin analysoimiseen osoitettiin, että useita erilaisia moolipainoja vastaavia kaistoja esiintyi, kun geeli värjättiin Coomassie 3rilliant Bluella. Kuitenkin pääkaistalla oli moolipaino, joka vastaa täysi-pituisen fuusioproteiinin moolipainoa laskettuna dedukoi-30 dusta aminohapposekvenssistä. Mitattaessa CBP-aktiivisuu-den osalta tämä puhdistettu proteiinivalmiste pystyi inhiboimaan radioaktiivisen kollageenin sitoutumista S. aureus Cowan 1 -soluihin niin tehokkaana kuin vastaava solulysaat-ti. Tämä on myös parannus verrattuna Switalski et al:n 1989 35 esittämään tulokseen. Johtopäätös on, että toteuttamalla esillä olevaa keksintöä on nyt mahdollista sekä valmistaa että puhdistaa S. aureus CBP, jossa säilyy sen biologiset ominaisuudet paremmalla tavalla verrattuna aiemmin raportoituihin menetelmiin.
17 105333
Esimerkki 5 CBP-geenin käyttö diagnostisena välineenä
Konstruoitiin kaksi oligonukleotidia (JP-1,5'-AGT-GGT-TAC-TAA-TAC-TG-3' ja JP-2,5'-CAG-GAT-AGA.TIG.GTT.TA-31), jotka 5 ovat komplementaarisia CBP:n alueille, jotka sivusivat toistoja B1, B2 ja B3 (Oligot etc). 6 erilaisesta Staphylococcus aureus -lajista peräisin olevat genomiset DNA:t, joiden tiedettiin sitovan 25i_kollageenia (taulukko 1) eristettiin, kuten Lindberg on kuvannut aiemmin. Polymeraa-10 siket j ureaktio (PCR) suoritettiin Cetus/Perkin-Elmer DNA Thermocylerillä. Reaktioseokset (100 μΐ) sisälsivät 1 mM kutakin aloittajaa, 200 mM kutakin dNTP, 1 mM Tris-HCl (pH 8,3), 5 mM KC1, 15 mM MgCl2, 0,001 % gelatiinia, 3 yg tem-plaatti-DNA:ta ja 2,5 U Amplitaq DNA-polymeraasia. Reaktio-15 seokset päällystettiin 100 yl:lla mineraaliöljyä ja niitä vahvistettiin 30 jaksoa, jotka koostuivat 2 minuutin dena-turoinnista 94 °C:ssa, 2 minuutin lämpöliittämisjaksosta 55 °C:ssa ja 3 minuutin laajennusajasta 72 °C:ssa. Vahvistuksen jälkeen 15 μΐ PCR-tuotteista analysoitiin 1 % aga-20 roosigeelillä (SeaKem GTG, FMC Inc., Rockland, Maine).
Erilaisista S. aureus -isolaateista peräisin olevan genomi-sen DNA:n PCR-analyysi paljasti kaksi distinktiivisesti erikokoista tuotetta. FDA 574, Cowan ja #13, kaikilla oli 25 1677 bp:n geenituotteet, kun taas Phillipsillä, #7:llä ja #14391:llä oli 1118 bp:n geenituotteet. S. aureus Newmanil-la, tunnetulla ei-kollageenisitojalla, ei ollut havaittavaa PCR-tuotetta. Testatuista erilaisista S. aureus -lajeista peräisin olevan puhdistetun luonnollisen kollageeniresep-30 torin toistokoon ja arvioidun molekyylipainon välillä on suora korrelaatio. Lisäsekvenssianalyysissä ilmenee, että 1677 bp:n PCR-tuote vastaa 3 toistoyksikköä, kukin 560 bp pitkä. 1118 bp:n PCR-tuote vastaa siten 2 toistoa, kukin 560 bp pitkä. Nämä tiedot korreloivat hyvin 135 kd:n ja 35 vastaavasti 115 kd:n puhdistettujen luonnollisten kollagee-nireseptorien arvioidun molekyylipainon kanssa hyvin.
Lisä-PCR-analyysi suoritettiin käyttämällä aloittajia JP-3(5'-ATA-TGA-ATT-CGA-GTA-TAA-GGA-GGG-GTT-3 ' ) ja JP-4(5 ' - 105333 1 8 ATT-CTG-CAG-AGA-ACT-AAG-AAT-AGC-CTT-3 ' ) . Nämä aloittajat sivuavat intaktia CBP-geeniä 5'- ja vastaavasti 3'-päissä. Käyttämällä erilaisia PCR-parametrejä voidaan intakti geeni eristää menestyksellä S. aureuksen genomisesta DNA:sta.
5 Jälleen otettiin talteen kaksi distinktiivisestä erilaista geenituotetta. S. aureus -isolaateilla, joissa on 3 toistoa, on kiintoisasti CBP-geeni, joka vastaa 3,5 kb. S. aureus -lajeissa, joissa on vain kaksi toistoa, oli 3,0 kb:n CBP-geeni. Tämä työ todistaa suorasti, että erilaisista S. 10 aureus -isolaateista peräisin olevan CBP-geenin koko on suoraan verrannollinen toistuvien yksikköjen lukumäärän kanssa.
Intaktin CBP-geenin ilmentäminen. 3,5 kb PCR-tuotteen il-15 mentäminen. 3,5 kb PCR-tuote, joka käsittää intaktin geenin aloittajat (JP-3, JP-4), kloonattiin prokaryoottiseen il-mentämisvektori in pKK223-3, Pharmacia-LKB. Tämä vektori sisältää IPTG:llä indusoitavan tac-promoottorin, joka panee liikkeelle kloonatun geenin ilmentymisen. Induktiossa 5-15 20 % SDS-PAGE-geelin Coomassie-värjäys paljastaa 135 kd pro teiinin. Tämä on luonnollisen kollageenireseptorin molekyy-lipainon vertainen 4. Tämä proteiini vahvistetaan pian Wes-tern-blottauksella ja funktionaalisella biologisella testillä.
25
Erilaisista kliinisistä isolaateista peräisin olevan kol-lageeniadhesiinin immunologinen suhde
Edelliset tulokset osoittivat, että vasta-aineet, jotka herätettiin kollageeniadhesiinipositiivisen (CA+) -lajin 30 S. aureus Cowan kokonaisia soluja ja sen puhdistettua kol-lageeniadhesiinia vastaan inhiboivat tehokkaasti ^25j_mer_ kitynä kollageenin sitoutumista homologiseen lajiin (Swi-talski et ai., 1989). Nämä vasta-aineet inhiboivat tehokkaasti myös 1 25i_mer]^^-yn kollageenin sitoutumista kaikkiin 35 kollageeniä sitoviin lajeihin, mikä osoittaa kollageenin sitoutumiskohdan immunologista ristireaktiivisuutta. Näiden vasta-aineiden tunnistamien solunpintaproteiinien tutkimiseksi, niitä käytettiin erilaisesta S. aureus -isolaateista valmistettujen lysostafiinilysaattien Western-blottien tes- 19 105333 taamiseen (kuvio 3). Lysostafiinihajotus vapauttaa S. au-reuksen solunpinnasta lukuisia proteiineja, noin 30 kaistaa voidaan tehdä näkyviksi lysaateissa geelin Coomassie Brilliant Blue -värjäyksellä (Switalski et ai., 1989). Antiad-5 hesiinivasta-aineet tunnistivat Mr 135 kd:n komponentin lajin Cowan lysaatissa (kuvio 3, kaista a), mikä on sopusoinnussa aikaisempien havaintojemme kanssa (Switalski et ai., 1989). Muiden kollageeniadhesiinipositiivisten lajien (CA+) lysaateissa havaitun pääimmunoreaktiivisen proteiinin 10 molekyylipaino vaihteli ja sitä oli läsnä joko 110 kd:nä tai 135 kd:nä (kuvio 3, kaistat b-h). Immunoreaktiivisen proteiinin näennäispainon ja lajin tai sen alkuperän (luu, nivelvoideneste) välillä ei havaittu mitään korrelaatiota. Mikään yhdeksästä testatusta ei-sitoutumattomasta kollagee-15 ni S. aureus -lajista ei ilmentänyt immunoreaktiivista proteiinia (kuvio 3, kaista i).
Stafylokokin kollageeniadhesiinivälitteinen kiinnittyminen kollageenisiin substraatteihin 20 Kyvyn ilmentää kollageeniadhesiinia ja kollageenirikkaissa kudoksissa olevan infektion havaitun sijainnin välinen suhde innoitti meidät analysoimaan solunpinta-adhesiinin roolia bakteerien kiinnittymisessä kollageenia sisältäviin substraatteihin. Aluksi tutkimme bakteerien kiinnittymistä 25 tyypin II kollageenilla päällystettyyn pintaan. Tulokset osoittivat, että kollageenilla päällystetty pinta oli sei-laisten lajien erinomainen kiinnittymissubstraatti, jotka ilmentävät pintapaikallistettua kollageeniadhesiinia. Kiinnittyminen on ajasta riippuvainen ja kyllästyvä ja saavut-30 taa tasapainon 3 tuntia inkuboinnin jälkeen (kuvio 4A). Kiinnittyvien bakteerien lukumäärään ei vaikuta adhesiinin koko, koska lajit #14 ja Phillis, jotka ilmentävät joko 135 kd tai 110 kd adhesiinia vastaavasti, kiinnittyivät samoina . lukumäärinä kollageenilla päällystetylle substraatille. Kun 35 bakteereita esi-inkuboitiin antiadhesiini vasta-aineilla S. aureus -lajista Cowan peräisin olevaa kollageeniadhesiinia vastaan, kiinnittyminen inhiboitui konsentraatiosta riippuvalla tavalla (kuvio 4B). Tämä vahvisti aikaisemmat havainnot kollageeniadhesiinissa olevan kollageenia sito- 20 105333 van kohdan immunologisesta ristireaktiivisuudesta. Adhesii-ninegatiivisten lajien (CA-) kiinnityrnistä ei saatu esi-inkuboimalla antiadhesiinivasta-aineiden kanssa.
5 A. aureuksen kiinnittyminen rustoon
Seuraavaksi tutkittiin bakteerien kiinnittymistä rustoon mallissa, joka matkii tarttuvan niveltulehduksen kehityksen alkutapahtumia. Tässä mallissa ruston yhtäläisiä paloja inkuboitiin 125i_pinnoj_tetulla merkityllä S. aureuksella. 10 Tässä tutkimuksessa käytettiin naudan nenärustoa, joka on histologissti identtinen luuruston kanssa. Rustokudoksella saadut tiedot muistuttivat läheisesti niitä tuloksia, joita saatiin kollageenipäällystetyillä pinnoilla. Vain CA+-lajit kiinnittyivät rustoon (kuvio 4D) ollen kineettisesti ana-15 logisia niiden kanssa, jotka havaittiin CA+-lajeissa, jotka kiinnittyvät kollageenillä päällystettyihin substraattei-hin. Tämä kiinnittyminen voidaan inhiboida täydellisesti esi-inkuboimalla antiadhesiinivasta-ainei1la (kuvio 4E). Nämä tiedot osoittavat, että kudoskollageenin tunnistaminen 20 voi olla riittävää bakteereille, jotta ne muodostavat pesäkkeitä rustoon. Elektronimikroskopia vahvisti edellä esitetyt kvantitatiiviset havainnot. S. aureus -lajit, jotka sitovat 1 25i_j^0iiageenin ja joissa on immunoreaktiivinen proteiini Western-blotissa, kiinnittyvät suurina määrinä 25 rustokudokseen ja niiden voidaan havaita mieluusti kiinnittyvän kollageenikuituihin (kuvio 4C). Kiinnittyvien bakteerien lukumäärä vähenee drastisesti antiadhesiinivasta-aineiden läsnäollessa (kuvio 4F). Elektronimikroskooppiha-vainnot osoittavat, että bakteerien luukudokseen kiinnit-30 tyminen liittyy kykyyn ilmentää biologisesti funktionaalista kollageeniadhesiinia.
Keinotekoisten bakteerien luominen "Keinotekoiset bakteerit" valmistettiin päällystämällä ko-35 valenttisesti päällystetyt polystyreenipalloset (1,2 pm vs. stafylokokit 0,8-1,0 pm halkaisijaltaan) kollageeniadhesii-niproteiinilla. Sitten nämä palloset testattiin koesarjoissa, jotka ovat analogisia niiden kanssa, jotka suoritettiin intakteilla bakteereilla. Kollageeniadhesiinilla (CA) pääl- 21 105333 lystetyt pallot, mutteivät muun stafylokkisolupintakompo-nentin, fibronektiinireseptori (Flock et ai., 1987), rekom-binanttimuodolla päällystetyt palloset, sitoivat 125ι_]ς0ι_ lageenin (kuvio 5A) samalla tavalla kuin S. aureuksen CA+-5 lajit (Speziale et ai., 1986). Tämän sitoutumisen lakkauttivat anti-CA-vasta-aineet, kun taas esi-immuunivasta-ai-neet eivät inhiboineet tehokkaasti sitomista (kuvio 5B). Kun "keinotekoiset bakteerit" testattiin kyvyltään kiinnittyä kollageeniin (tietoja ei esitetty) tai rustoon, havait-10 tiin, että CA-palloset tarttuivat substraatteihin ajasta riippuvalla tavalla, joka on identtinen S. aureuksen CA + -lajien tavan kanssa, kun taas palloset, jotka oli päällystetty fibronektiinireseptorilla, eivät tarttuneet merkittävinä tasoina (kuvio 5C). Anti-CA-vasta-aine inhiboi CA-15 pallosten adheesiota rustoon annoksesta riippuvalla tavalla, kun taas esi-immuunivasta-aineilla ei ollut vaikutusta (kuvio 5D). Jälleen vahvistettiin kvantitatiiviset sitou-tumistiedot elektronimikroskopiahavainnoilla. CA:lla päällystetyt palloset tarkertuivat suurina määrinä kollageeni-20 kuituihin (kuvio 5E), kun taas palloset, jotka oli päällystetty fibronektiinireseptorilla, eivät (kuvio 5F).
Kollageenia sitovan domeenin sijainti kollageeniadhesiinis-sä 25 E. colissa luotiin useita erilaisia konstruktioita kolla-. geeniä sitovan domeenin paikallistamiseksi spesifisesti.
Näissä kokeissa käytettiin kahta erityyppistä ilmentämis-vektoria, pKK223-3 ja pGEX-2T, joista toinen saa aikaan kollageeniadhesiinin fuusioituneena glutationi-S-transfe-30 raasiin. Tähän mennessä adhesiinin pienin alue, jossa on osoitettavissa olevaa sitomisaktiivisuutta, on sisällytetty rakenteeseen pGEX-1.1. Tämä fuusioproteiini on suunnilleen 68 kDA, josta 41 kDa on kollageeniadhesiiniä. Kuten kuviossa 6 esitetään, kollageenia sitova aktiivisuus sijaitsee 35 cna-geenin A-domeenissa.
Esillä olevaa kollageenia sitovaa proteiinia voidaan käyttää immunointiin, jolloin proteiini, edullisesti yhdistettynä f uusioproteiiniin suuren antigeenin luomiseksi vas- 22 1 0 5 3 3 3 teeksi, injektoidaan annoksina, jotka aiheuttavat immunologisen reaktion isäntänisäkkäässä. Täten kollageeniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää märehtijöiden rokottamiseen stafylokokki-infektioiden aiheuttamaa utaretulehdusta vas-5 taan.
Kollageeniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää avoimen iho-haavan infektoitumisen estämiseen käsittelemällä haava käyttäen kollageenia sitovaa proteiinia suspensiona. Täten 10 kollageeniä sitovaa proteiinia voidaan käyttää haavojen hoitoon, esim. proteiinireseptorien estämiseen, tai immu-nointiin (rokottamiseen). Jälkimmäisessä tapauksessa isän-täkeho tuottaa spesifisiä vasta-aineita, jotka voivat suojata bakteerilajien tunkeutumista vastaan, jotka käsittävät 15 tällaisen kollageeniä sitovan proteiinin. Täten vasta-aineet estävät bakteerilajien tarkertumisen vahingoittuneeseen kudokseen. Septisen niveltulehduksen käsitteleminen kuuluu myös mukaan.
20 Esimerkkejä kudosvaurioiden pesäkkeistymisestä ovat: a) ihon ja sidekudosten haavojen pesäkkeistyminen, jotka haavat aiheutuvat mekaanisesta vauriosta, kemiallisesta vauriosta ja/tai lämpövauriosta; b) limakalvojen haavojen, kuten suuontelossa tai rintarau-25 hasissa, virtsaputkessa tai vaginassa olevien haavojen, . pesäkkeistyminen, c) sidekudosproteiinien, jotka ovat altistuneet minimaaliselle kudosvauriolle (mikroleesio) endoteelissä tai epiteelissä (mastitiitti, sydänläppätulehdus, lonkkakirurgia), 30 pesäkkeistyminen.
Käytettäessä esillä olevaa CBP:tä tai polypeptidiä nisäkkäiden mukaan lukien ihmisen immunointi- (rokotus-) tarkoituksiin proteiini tai polypeptidi dispergoidaan steriiliin, 35 isotoniseen suolaliuokseen, optionaalisesti lisätään samalla farmaseuttiseuttisesti hyväksyttävää dispergointiainet-ta. Lisäksi voidaan käyttää erityyppisiä apuaineita kudokseen vapautumisen ylläpitämiseksi ja siten proteiinin tai 23 1 0 5 3 3 3 peptidin altistamiseksi pidemmäksi ajaksi kehon immuunipuo-lustusjärjestelmälle.
Sopiva annos immunoinnin aikaansaamiseksi on 0,5-5 pg 5 CBP:tä tai polypeptidiä ruumiin painokiloa ja immunointi-injektiota kohti. Kestävän immunoinnin saavuttamiseksi tulee rokottaminen suorittaa useammassa kuin yhdessä toisiaan seuraavassa tilaisuudessa 1-3 viikon välein, edullisesti kolmessa tilaisuudessa.
1 0
Kun esillä olevaa CBP:tä tai polypeptidiä käytetään toop-piseen, paikalliseen antamiseen, proteiini dispergoidaan isotoniseen suolaliuokseen konsentraatioon 25-250 pl ml:aa kohti. Sitten haavoja käsitellään sellaisella määrällä, 15 jolla saavutetaan vain haavan pinnan täydellinen kostuminen. Täten keskimääräiseen haavaan käytetään vain muutama millilitra liuosta tällä tavoin. Sen jälkeen kun haavat on käsitelty käyttäen proteiiniliuosta, ne pestään sopivasti isotonisella suolaliuoksella tai toisella sopivalla haavan-20 hoitoliuoksella.
Lisäksi keksinnön mukaista kollageeniä sitovaa proteiinia samoin kuin minimaalisen kollageenin sitomiskohdan polypeptidiä voidaan käyttää stafylokokkilajien aiheuttamien bak-25 teeri-infektioiden diagnostisoimiseen, jolloin keksinnön mukainen kollageeniä sitova proteiini immobilisoidaan kiinteään kantoaineeseen, kuten pienniin lateksi- tai Sepharo-seR-pallosiin, minkä jälkeen seerumien, jotka sisältävät vasta-aineita, annetaan ohittaa ja reagoida täten immobili-30 soidun CBP:n kanssa. Sitten agglutinaatio mitataan tunnetuilla menetelmillä.
CBP:tä tai polypeptidiä voidaan lisäksi käyttää ELISA-tes-tissä (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay, E. Engvall, Med.
35 Biol. 55, 193, (1977). Tällöin polystyreenimikrotiitteri-levyssä olevat kolot päällystetään CBPrllä ja niitä inku-boidaan 4 °C:ssa yön yli. Sitten levyt pestään kauttaaltaan käyttämällä PBS:ää, joka sisältää 0,05 X TWEEN 20 ja kuivataan. Potilaan seerumin sarjalaimennokset tehdään PBS- 24 1 0 5 3 3 3
Tweeniin, ne lisätään koloihin ja inkuboidaan 3Ö °C:ssa 1,5 tuntia. Huuhtelemisen jälkeen antihumaani-IgG:tä konjugoi-tuna entsyymiin tai antinaudan-IgG:tä konjugoituma entsyymiin vastaavasti, piparjuuriperoksidaasia tai alkalista 5 fosfataasia lisättiin koloihin ja niitä inkuboitiin 30 °C:ssa 1,5 h, minkä jälkeen kun IgG oli sitoutunut siihen ja huuhtelemisen jälkeen, lisätään entsyymisubstraatti, p-nitrofosfaatti alkalisen fosfataasin tapauksessa tai orto-fenyleenidiamiinisubstraatti (OPD) siinä tapauksessa, kun 10 käytettiin peroksidaasia vastaavasti. Levyt, jotka käsittävät kolot, huuhdeltiin sitten käyttämällä sitraattipusku-ria, joka sisältää 0,055 % OPD ja 0,002 % H2O2, ja niitä inkuboitiin 30 °C;ssa 10 min. Entsyymireaktio pysäytettiin lisäämällä H2SO4 4N liuosta jokaiseen koloon. Värin kehitys 15 mitattiin käyttämällä spektrofotometriä.
Käytetyn entsyymisubstraatin tyypistä riippuen voidaan myös yhtä hyvin käyttää fluoresenssimittausta.
20 Toinen menetelmä stafylokokki-infektioiden mittaamiseksi on DNA-geenikoettinmenetelmän käyttäminen, joka menetelmä perustuu CBP-nukleotidisekvenssiin tai polypeptidisekvens-siin. Tapuksessa, jossa diagnostisoidaan mastitis, maito-näyte ajetaan kalvon läpi, joka kerää läsnäolevat baktee-25 rit. Bakteereiden autolyysi alkalissa sitoo vapautuneen yksijuosteisen DNA:n kalvoon. DNA-geenikoetin, joka on op-tionaalisesti merkitty entsymaattisesti tai radioaktiisella isotoopilla, lisätään sitten kalvoon, joka käsittää DNA-sekvenssin, jolloin DNA-geenikoetin kiinnittyy DNA-sekvens-30 siin siellä, missä se esiintyy. Entsyymi tai radioaktiinen isotooppi voidaan sitten määrittää helposti tunnetuilla menetelmillä.
Edellä oleva termi kollageeniä sitova proteiini käsittää 35 myöskin polypeptidisekvenssin, joka polypeptidisekvenssi muodostaa kokonaisen proteiinin minimaalisen kollageenia sitovan kohdan.
25 105333
Viitteet
Carret, G., H. Emonard, G. Fardel, M. Druguet, D. Herbage, and J. P. Flandrois. 1985. Ann. Inst Pasteur (Paris) 5 136A:241-245.
Guss, B., K. Uhle'n, B. Nilsson, M. Lindberg, J. Sjöquist and J. Sjödahl. 1981. J. Biochem., 138, 413-420.
Guss, B., M. Eliasson, A. Olsson, M. Uhle'n, A.-K. Frej, H. Jörnvall, J.-I. Flock and M. Lindberg. 1986. EMBO J., 10 5, 1567-1575.
Holderbaum, D., R.A. Spech and L. A. Ehrhart. 1985. Collagen Reiät. Res. 5:261-271.
Holderbaum, D., G. S. Hall and L. A. Ehrhart. 1986. Infect. Immun. 54:359-364.
15 Hollingshead, S. K., V. A. Fischetti and J. R. Scott. 1?86. J. Biol. Chem. 261:1677-1686.
Signäs, S., G. Raucci, K. Jönsson, P.-E. Lindgren, G. K. Anantharamaiah, M. Höök and M. Lindberg. 1989. Proc. Nuti. Acad. Sei. USA. 86:699-703.
20 Speziale, P. G. Raucci, L. Visal, L. M. Switalski, R. Timpl and M. Höök. 1986. J. Bact. 167:77-81.
Switalski, L. M., P. Speziale and H. Höök. 19S9.
J. Biol. Chem. 264:21080-21086.
Uhle'n, K., 3. Guss, B. Nilsson, S. Gatenbeck, L. Philipsson 25 and M. Lindberg. 1984. J. Biol. Chem. 259:1695-1702.
Verceilotti, G. M., J. B. .McCarthy, P. Lindholm, ?. K. Peterson, H.S. Jacob and L. T. Furcht. 1985. Am. J. Pathol. 120:13-21.
30 35
Claims (10)
1. Plasmidi pSAC104, joka on sisällytetty E. coli TGlreen, jonka talletusnumero on DSM 6199. 5
2. CAACATTAAA TGAATCTAAT AACTGGACCC ATACGTGGAC AGGATTAGAT . GAAAAAGCAA AAGGACAACA AGTAAAATAC ACAGTCGAGG AATTAACAAA GGTCAAAGGT TATACAACAC ATGTGGATAA CAATGATATG GGTAACTTGA TTGTGACGAA TAAATATAC G CCAGAAACAA CATCAATTAG TGGTGAAAAA GTATGGGACG ACAAAGACAA TCAA. . TGGT AAGAGACCAG AAAAAGTCAG
30 TGTGAATTTA TTGGCTGATG GAGAGAAAGT AAAAACGTTA GACGTGACAT CTGAAACAAA CTGGAAGTAC GAATTTAAAG ACTTACCGAA GTATGATGAA . GGAAAGAAAA TAGAATATAC AGTGACCGAA GATCACGTAA AAGACTACAC AACAGACATC AACGGTACGA CAATAACGAA CAAGTATACA CCAGGAGAGA CATCGGCAAC AGTAACAAAA AATTGGGATG ACAATAATAA CCAAGACGGA
2. E. coli -kanta, joka ilmentää patenttivaatimuksen l mukaisen plasmidin koodaamaa kollageeniä sitovaa proteiinia.
3. AAACGACCAA CTGAAATCAA AGTTGAGTTA TATCAAGACG GAAAAGCAAC AGGAAAAACG GCAACATTAA ATGAATCTAA TAACTGGACC CATACGTGGA CAGGATTAGA TGAAAAAGCA AAAGGACAAC AAGTAAAATA CACAGTCGAG 2β 105333 GAATTAACAA AGGTCAAAGG TTATACAACA CATGTGGATA ACAATGATAT GGGCAACTTG ATTGTGACGA ATAAATATAC GCCAGAAACA ACATCAATTA GCGGTGAAAA AGTATGGGAC GACAAAGACA ATCAAGATGG TAAGAGACCA GAAAAAGTCA GTGTAAATTT ATTGGCTAAC GGAGAGAAAG TAAAAACGTT 5 AGACGTGACA TCTGAAACAA ACTGGAAGTA CGAATTTAAA GACTTACCGA AGTATGATGA AGGAAAGAAA ATAGAATATA CAGTGACCGA AGATCACGTA AAAGACTACA CAACAGACAT CAACGGTACG ACAATAACGA ACAAGTATAC ACCAGGAGAG ACATCGGCAA CAGTAACAAA AAATTGGGAT GACAATAATA ACCAAGACGG AAAACGACCA ACTGAAATCA AAGTTGAGTT ATATCAAGAT 10 GGAAAAGCAA CAGGAAAAAC GGCAATATTA AATGAATCTA ATAACTGGAC ACATACGTGG ACAGGATTAG ATGAAAAAGC AAAAGGACAA CAAGTAAAAT ACACAGTCGA TGAATTAACA AAAGTTAATG GCTATACAAC GCATGTGGAT AACAATGATA TGGGTAACTT GATTGTGACA AATAAATATA CGCCGAAAAA ACCGAATAAA CCAATCTATC CTGAAAAACC AAAAGACAAA ACACCACCAA 15 CTAAACCTGA TCATTCTAAT AAAGTTAAAC CAACTCCCCC AGATAAGCCA TCAAAAGTGG ATAAGGATGA TCAACCTAAA GATAATAAAA CCAAACCTGA AAATCCTCTA AAAGAATTAC CAAAAACTGG TATGAAGATT ATAACTTCAT GGATTACATG GGTATTTATA GGTATATTGG GACTGTATTT AATTTTAAGA AAAAGATTTA ACTCA 20
3. Mikro-organismi, tunnettu siitä, että se on transformoitu 10 patenttivaatimuksen 1 mukaisen plasmidin sisältämällä rekom- : binantti-DNA-molekyylillä.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukaisen plasmidin sisältämä hybridi -DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se käsittää seuraavan 15 nukleotidisekvenssin: GCA CGAGATATTT CATCAACGAA TGTTACAGAT TTAACTGTAT CACCGTCTAA GATAGAAGAT GGTGGTAAAA CGACÄGTAAA AATGACGTTC GACGATAAAA
20 ATGGAAAAAT ACAAAATGGT GACATGATTA AAGTGGCATG GCCGACAAGC GGTACAGTAA AGATAGAGGG TTATAGTAAA ACAGTACCAT TAACTGTTAA AGGTGAACAG GTGGGTCAAG CAGTTATTAC ACCAGACGGT GCAACAATTA CATTCAATGA TAAAGTAGAA AAATTAAGTG ATGTTTCGGG ATTTGCAGAA TTTGAAGTAC AAGGAAGAAA TTTAACGCAA ACAAATACTT TAGATGACAA
25 AGTAGCTACG ATAACATCTG GGAATAAATC AACGAATGTT ATCGGTTGGA TAAAAGTGAA GCGGGAACCA GTAGTGTTTC TAATTAATAA AAGCGGGAAG ATATGCTACC AAGAAGATAC GACACATGTA CGATGGTTTT TAAATATTAA CAATGAAAAA AGTTATGTAT CGAAAGATAT TACTATAAAG GATCAGATTC AAGGTGGACA GCAGTTAGAT TTAAGCACAT TAAACATTAA TGTGACAGGT
30 ACACATAGCA ATTATTATAG TGGACAAAGT GCAATTACTG ATTTTGAAAA AGCCTTTCCA GGTTCTAAAA TAACTGTTGA TAATACGAAG AACACAATTG ATGTAACAAT TCCACAAGGC TATGGGTCAT ATAATAGTTT TTCAATTAAC 27 105333 TACAAAACCA AAATTACGAA TGAACAGCAA AAAGAGTTTG TTAATAATTC ACAAGCTTGG TATCAAGAGC ATGGTAAGGA AGAAGTGAAC GGGAAATCAT TTAATCATAC TGTGCACAAT ATTAATGCTA ATGCCGGTAT TGAAGGTACT
5. Plasmidi tai faagi, tunnettu siitä, että se käsittää patenttivaatimuksen 4 mukaisen nukleotidisekvenssin.
5 GTAAAAGGTG AATTAAAAGT TTTAAAACAG GATAAAGATA CCAAGGCTCC TATAGCTAAT GTAAAATTTA AACTTTCTAA AAAAGATGGA TCAGTTGTAA AGGACAATCA AAAAGAAATT GAGATTATAA CAGATGCAAA CGGTATTGCT AATATTAAAG CGTTGCCTAG TGGAGACTAT ATTTTAAAAG AAATAGAGGC GCCACGACCG TATACATTTG ATAAGGATAA AGAATATCCG TTTACTATGA
10 AAGATACAGA TAATCAGGGA TATTTTACGA CTATTGAAAA TGCAAAAGCG ATAGAAAAAA CAAAAGATGT TTCTGCTCAA AAGGTTTGGG AAGGCACTCA AAAAGTGAAA CCAACGATTT ATTTCAAGTT GTACAAACAA GATGACAATC AAAATACAAC ACCAGTAGAC AAAGCAGAGA TTAAAAAATT AGAAGATGGA ACGACAAAAG TGACATGGTC TAATCTTCCG GAAAATGACA AAAATGGCAA
15 GGCTATTAAA TATTTAGTTA AAGAAGTAAA TGCTCAAGGT GAAGATACAA CACCAGAAGG ATATACTAAA AAAGAAAATG GTTTAGTGGT TACTAATACT GAAAAACCAA TCGAAACAAC ATCAATTAGT GGTGAAAAAG TATGGGACGA CAAAGACAAT CAAGATGGTA AGAGACCAGA AAAAGTCAGT GTGAATTTAT TGGCTAACGG GGAGAAAGTA AAAACGTTAG ACGTGACATC TGAAACAAAC
20 TGGAAGTACG AATTTAAAGA CTTACCGAAG TATGATGAAG GAAAGAAAAT AGAATATACA GTGACCGAAG ATCACGTAAA AGACTACACA ACAGACATCA ACGGTACGAC AATAACGAAC AAGTATACAC CAGGAGAGAC ATCGGCAACA GTAACAAAAA ATTGGGATGA CAATAATAAC CAAGACGGAA AACGACCAAC TGAAATCAAA GTTGAGTTAT ATCAAGACGG AAAAGCAACA GGAAAAACGG
6. Mikro-organismi, tunnettu siitä, että se sisältää vähin-25 tään yhden patenttivaatimuksen 5 mukaisen plasmidin tai faa- gin.
7. Menetelmä kollageeniä sitovan proteiinin tai polypeptidin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) vähintään yksi pa- 30 tenttivaatimuksen 4 mukainen hybridi-DNA-molekyyli viedään mikro-organismiin, b) sanottua mikro-organismia viljellään kasvua edistävässä väliaineessa, ja c) täten muodostunut proteiini eristetään ioninvaihtokromatografiällä, ammoniumsul-faattipresipitaatiolla ja geelisuodatuksella. 35
8. Kemiallinen synteesimenetelmä patenttivaatimuksen 7 mu- * kaisen kollageeniä sitovan proteiinin tai polypeptidin val mistamiseksi, tunnettu siitä, että rakennetaan aminohappotäh- 105333 de, joka perustuu patenttivaatimuksessa 4 esitettyyn nukleo-tidisekvenssiin, joka koodaa sanottua proteiinia tai polypep-tidiä alkaen C-terminaalisesta seriinistä, joka reagoitetaan vaiheittain sopivan aminohapon kanssa, ja että se lopuksi 5 reagoitetaan N-terminaalissa alaniinin kanssa kollageeniä sitovan proteiinin tai polypeptidin muodostamiseksi.
9. Kollageeniä sitovaa proteiinia koodaava DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että proteiini käsittää aminohapposekvenssin
10 Ala ArgAspIleSerSerThrAsnValThrAspLeuThrValSerProSerLysIleGluAsp GlyGlyLysThrThrValLysMetThrPheAspAspLysAsnGlyLysIleGlnAsnGly AspMetlleLysValAlaTrpProThrSerGlyThrValLysIleGluGlyTyrSerLys 15 ThrValProLeuThrValLysGlyGluGlnValGlyGlnAlaVallleThrProAspGly AlaThrlleThrPheAsnAspLysValGluLysLeuSerAspValSerGlyPheAlaGlu PheGluValGlnGlyArgAsnLeuThrGlnThrAsnThrLeuAspAspLysValAlaThr IleThrSerGlyAsnLysSerThrAsnVallleGlyTrpIleLysValLysArgGluPro ValValPheLeuIleAsnLysSerGlyLysIleCysTyrGlnGluAspThrThrHisVal 20 ArgTrpPheLeuAsnlleAsnAsnGluLysSerTyrValSerLysAspIleThrlleLys AspGlnlleGlnGlyGlyGlnGlnLeuAspLeuSerThrLeuAsnlleAsnValThrGly ThrHisSerAsnTyrTyxSerGlyGlnSerAlalleThrAspPheGluLysAlaPhePro GlySerLysIleThrValAspAsnThrLysAsnThrlleAspValThrlleProGlnGly TyrGlySerTyrAsnSerPheSerlleAsnTyrLysThrLysIleThrAsnGluGlnGln ; 2 5 LysGluPheValAsnAsnSerGlnAlaTrpTyrGlnGluHisGlyLysGluGluValAsn GlyLysSerPheAsnHisThrValHisTisnlleAsnAlaAsnAlaGlylleGluGlyThr ValLysGlyGluLeuLysValLeuLysGlnAspLysAspThrLysAlaProI leAlaAsn ValLysPheLysLeuSerLysLysAspGlySerValValLysAspAsnGlnLysGluIle GluIlelleThrAspAlaAsnGlylleAlaAsnlleLysAlaLeuProSerGlyAspTyr 3 0 IleLeuLysGluIleGluAlaProArgProTyrThrPheAspLysAspLysGluTyrPro PheThrMetLysAspThxAspAsnGlnGlyTyrPheThrThrlleGluAsnAlaLysAla IleGluLysThrLysAspValSerAlaGlnLysValTrpGluGlyThrGlhLysValLys ProThrlleTyrPheLysLeuTyrLysGlnAspAspAsnGlnAsnThrThrProValAsp LysAlaGluIleLysLysLeuGluAspGlyThrThrLysValThrTrpSerAsnLeuPro 35 GluAsnAspLysAsnGlyLysAlalleLysTyrLeuValLysGluValAsnAlaGlnGly 30 1 0 5 3 3 3 GluAspThrThrProGluGlyTyrThrLysLysGluAsnGlyLeuValValThrAsnThr GluLysProIleGluThrThrSerlleSerGlyGluLysValTrpAspAspLysAspAsn GlnAspGlyLysArgProGluLysValSerValAsnLeuLeuAlaAsnGlyGluLysVal 5 LysThrLeuAspValThrSerGluThrAsnTrpLysTyrGluPheLysAspLeuProLys TyrAspGluGlyLysLysIleGluTyrThrValThrGluAspHisValLysAspTyrThr ThrAspIleAsnGlyThrThrlleThrAsnLysTyrThrProGlyGluThrSerAlaThr ValThrLysAsnTrpAspAspAsnAsnAsnGlnAspGlyLysArgProThrGluIleLys ValGluLeuTyrGlnAspGlyLysAlaThrGlyLysThrAlaThrLeuAsnGluSerAsn 10 AsnTrpThrHisThrTrpThrGlyLeuAspGluLysAlaLysGlyGlnGlnValLysTyr ThrValGluGluLeuThrLysValLysGlyTyrThrThrHisValAspAsnAsnAspMet GlyAsnLeuIleValThrAsnLysTyrThrProGluThrThrSerlleSerGlyGluLys ValTrpAspAspLysAspAsnGlnAspGlyLysArgProGluLysValSerValAsnLeu LeuAlaAspGlyGluLysValLysThrLeuAspValThrSerGluThrAsnTrpLysTyr 15 GluPheLysAspLeuProLysTyrAspGluGlyLysLysIleGluTyrThrValThrGlu AspHisValLysAspTyrThrThrAspIleAsnGlyThrThrlleThrAsnLysTyrThr ProGlyGluThrSerAlaThrValThrLysAsnTrpAspAspAsnAsnAsnGlnAspGly LysArgProThrGluIleLysValGluLeuTyrGlnAspGlyLysAlaThrGlyLysThr AlaThrLeuAsnGluSerAsnAsnTrpThrHisThrTrpThrGlyLeuAspGluLysAla 20 LysGlyGlnGlnValLysTyrThrValGluGluLeuThrLysValLysGlyTyrThrThr HisValAspAsnAsnAspMetGlyAsnLeuIleValThxAsnLysTyrThrProGluThr ThrSerlleSerGlyGluLysValTrpAspAspLysAspAsnGlnAspGlyLysArgPro GluLysValSerValAsnLeuLeuAlaAsnGlyGluLysValLysThrLeuAspValThr SerGluThrAsnTrpLysTyrGluPheLysAspLeuProLysTyrAspGluGlyLysLys 25 IleGluTyrThrValThrGluAspHisValLysAspTyrThrThrAspIleAsnGlyThr ThrlleThrAsnLysTyrThrProGlyGluThrSerAlaThrValThrLysAsnTrpAsp AspAsnAsnAsnGlnAspGlyLysArgProThrGluIleLysValGluLeuTyrGlnAsp GlyLysAlaThrGlyLysThrAlalleLeuAsnGluSerAsnAsnTrpThrHisThrTrp Th-rGlyLeuAspGluLysAlaLysGlyGlnGlnValLysTyrThrValAspGluLeuThr 30 LysValAsnGlyTyrThrThrHisValAspAsnAsnAspMetGlyAsnLeulleValThr AsnLysTyrThrProLysLysProAsnLysProIleTyrProGluLysProLysAspLys ThrProProThrLysProAspHisSerAsnLysValLysProThrProProAspLysPro SerLysValAspLysAspAspGlnProLysAspAsnLysThrLysProGluAsnProLeu ’ LysGluLeuProLysThrGlyMetLysIlelleThrSerTrpIleThrTrpValPhelle 35 GlylleLeuGlyLeuTyrLeuIleLeuArgLysArgPheAsnSer 31 105333
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9003374A SE9003374D0 (sv) | 1990-10-22 | 1990-10-22 | A collagen binding protein as well as its preparation |
| SE9003374 | 1990-10-22 | ||
| SE9100707 | 1991-10-22 | ||
| PCT/SE1991/000707 WO1992007002A1 (en) | 1990-10-22 | 1991-10-22 | A collagen binding protein as well as its preparation |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI922865A FI922865A (fi) | 1992-06-18 |
| FI922865A0 FI922865A0 (fi) | 1992-06-18 |
| FI105333B true FI105333B (fi) | 2000-07-31 |
Family
ID=20380713
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI922865A FI105333B (fi) | 1990-10-22 | 1992-06-18 | Kollageeniä sitova proteiini tai polypeptidi sekä sen valmistaminen |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0506923B1 (fi) |
| JP (1) | JPH05505943A (fi) |
| AT (1) | ATE139541T1 (fi) |
| AU (1) | AU652587B2 (fi) |
| CA (1) | CA2071950C (fi) |
| DE (1) | DE69120390T2 (fi) |
| DK (1) | DK0506923T3 (fi) |
| ES (1) | ES2090357T3 (fi) |
| FI (1) | FI105333B (fi) |
| GR (1) | GR3020997T3 (fi) |
| HU (1) | HU219679B (fi) |
| IE (1) | IE76292B1 (fi) |
| NO (2) | NO922421L (fi) |
| SE (1) | SE9003374D0 (fi) |
| WO (1) | WO1992007002A1 (fi) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5648240A (en) * | 1994-05-24 | 1997-07-15 | Texas A&M University | MHC II analog from Staphylococcus aureus |
| US6013482A (en) * | 1996-10-15 | 2000-01-11 | Smithkline Beecham Plc | Cell surface protein compounds |
| JPH11505130A (ja) * | 1995-10-16 | 1999-05-18 | スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー | 新規な細胞表面タンパク質化合物 |
| JPH11514870A (ja) * | 1995-10-16 | 1999-12-21 | スミスクライン・ビーチャム・パブリック・リミテッド・カンパニー | 新規な唾液結合タンパク質 |
| ATE309271T1 (de) | 1996-05-16 | 2005-11-15 | Texas A & M Univ Sys | Zusammensetzungen von kollagenbindungsprotein und verfahren zur deren verwendungen |
| US5882871A (en) * | 1996-09-24 | 1999-03-16 | Smithkline Beecham Corporation | Saliva binding protein |
| US6692739B1 (en) | 1998-08-31 | 2004-02-17 | Inhibitex, Inc. | Staphylococcal immunotherapeutics via donor selection and donor stimulation |
| US6908994B1 (en) | 1999-05-10 | 2005-06-21 | The Texas A&M University System | Collagen-binding proteins from enterococcal bacteria |
| CA2501621C (en) | 2002-10-11 | 2012-01-24 | Bengt Guss | Immunization of non-human mammals against streptococcus equi |
| US20110020403A1 (en) | 2007-12-13 | 2011-01-27 | Bengt Guss | immunizing composition |
| CN112225820B (zh) * | 2020-10-21 | 2023-01-17 | 中美福源生物技术(北京)股份有限公司 | 肿瘤特异靶向性基质的重组人血清白蛋白-胶原结合域融合蛋白和应用 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE454403B (sv) * | 1984-05-30 | 1988-05-02 | Alfa Laval Agri Int | Anvendning av ett cellyteprotein med fibronektin-, fibrinogen-, kollagen-, och/eller lamininbindande egenskaper vid framstellning av sarbehandlingsmedel |
-
1990
- 1990-10-22 SE SE9003374A patent/SE9003374D0/xx unknown
-
1991
- 1991-10-22 AU AU87518/91A patent/AU652587B2/en not_active Expired
- 1991-10-22 ES ES91918842T patent/ES2090357T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-22 JP JP91517169A patent/JPH05505943A/ja active Pending
- 1991-10-22 DE DE69120390T patent/DE69120390T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-22 IE IE369491A patent/IE76292B1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-22 WO PCT/SE1991/000707 patent/WO1992007002A1/en active IP Right Grant
- 1991-10-22 AT AT91918842T patent/ATE139541T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-22 DK DK91918842.5T patent/DK0506923T3/da active
- 1991-10-22 HU HU9202074A patent/HU219679B/hu unknown
- 1991-10-22 CA CA002071950A patent/CA2071950C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-22 EP EP91918842A patent/EP0506923B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-06-18 FI FI922865A patent/FI105333B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-06-19 NO NO92922421A patent/NO922421L/no unknown
-
1996
- 1996-09-12 GR GR960402347T patent/GR3020997T3/el unknown
-
1997
- 1997-01-10 NO NO970113A patent/NO970113D0/no unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO970113L (no) | 1997-01-10 |
| FI922865A (fi) | 1992-06-18 |
| EP0506923B1 (en) | 1996-06-19 |
| NO922421L (no) | 1992-08-20 |
| HUT64369A (en) | 1993-12-28 |
| IE913694A1 (en) | 1992-11-18 |
| DE69120390D1 (de) | 1996-07-25 |
| AU652587B2 (en) | 1994-09-01 |
| NO922421D0 (no) | 1992-06-19 |
| AU8751891A (en) | 1992-05-20 |
| HU219679B (hu) | 2001-06-28 |
| CA2071950C (en) | 2007-08-21 |
| CA2071950A1 (en) | 1992-04-23 |
| FI922865A0 (fi) | 1992-06-18 |
| ATE139541T1 (de) | 1996-07-15 |
| HU9202074D0 (en) | 1992-10-28 |
| NO970113D0 (no) | 1997-01-10 |
| IE76292B1 (en) | 1997-10-08 |
| DK0506923T3 (da) | 1996-10-28 |
| SE9003374D0 (sv) | 1990-10-22 |
| JPH05505943A (ja) | 1993-09-02 |
| ES2090357T3 (es) | 1996-10-16 |
| GR3020997T3 (en) | 1996-12-31 |
| WO1992007002A1 (en) | 1992-04-30 |
| DE69120390T2 (de) | 1997-01-16 |
| EP0506923A1 (en) | 1992-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI102768B (fi) | Hybridi-DNA-molekyyli ja menetelmä fibronektiiniä sitovan proteiinin v almistamiseksi | |
| JP4714342B2 (ja) | コアグラーゼ陰性スタフィロコカス菌に由来のポリペプチド及びポリヌクレオチド | |
| JP4486748B2 (ja) | 黄色ブドウ球菌由来の細胞外マトリックス結合タンパク質 | |
| US5851794A (en) | Collagen binding protein as well as its preparation | |
| FI105333B (fi) | Kollageeniä sitova proteiini tai polypeptidi sekä sen valmistaminen | |
| JP4173549B2 (ja) | コアグラーゼ陰性ブドウ球菌に由来する、新規フィブリノーゲン結合たん白質 | |
| FI101542B (fi) | Kemiallinen syntetointimenetelmä fibronektiiniä sitovan proteiinin tai polypeptidin valmistamiseksi | |
| AU632001B2 (en) | A fibronectin binding peptide | |
| US5789549A (en) | Fibronectin binding protein | |
| AU618803B2 (en) | Pharmaceutical composition containing fibronectin binding protein | |
| CA2309559A1 (en) | Hp90: host membrane receptor for pathogenic bacteria, encoded by the bacterial tir gene | |
| US6030805A (en) | Fibronectin binding protein as well as its preparation | |
| AU692140B2 (en) | Fibronectin binding protein as well as its preparation | |
| WO1998038312A1 (en) | Bacterial elastin binding protein, nucleic acid sequence encoding same and diagnostic and therapeutic methods of use thereof | |
| WO1994010330A9 (en) | Fibronectin binding protein as well as its preparation | |
| CA2507163C (en) | Streptococcus uberis adhesion molecule | |
| US20020173462A1 (en) | Fibrinogen binding protein | |
| US20040096965A9 (en) | Activator of fibronectin binding protein and method of its preparation | |
| IE83742B1 (en) | Fibronectin binding protein | |
| JP2001314185A (ja) | ブドウ球菌表層蛋白質の輸送を阻害する薬剤をスクリーニングする方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MA | Patent expired |