ES2252785T3 - Composiciones proteinicas fijadoras de colageno y metodos de utilizacion. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL GEN CNA Y A SEGMENTOS DE ACIDO NUCLEICO DERIVADOS DE CNA A PARTIR DE STAPHYLOCCOCCUS AUREUS, SEGMENTOS DE ADN QUE CODIFICAN CNA A PARTIR DE BACTERIAS ASOCIADAS. ESTA INVENCION SE REFIERE TAMBIEN A UNAS COMPOSICIONES DE PROTEINA DE ENLACE COL (PLC) Y PROCEDIMIENTOS DE USO. LA PROTEINA PLC Y LOS DETERMINANTES ANTIGENICOS DERIVADOS DE ESTA SE CONSIDERAN PARA SU USO EN EL TRATAMIENTO DE LAS INFECCIONES PATOLOGICAS, Y EN PARTICULAR PARA LA PROFILAXIS DE LA ADHESION BACTERIANA A COL. UNOS SEGMENTOS DE ADN QUE CODIFICAN ESTAS PROTEINAS Y ANTICUERPOS ANTI - (PROTEINA DE ENLACE COL) SON UTILES TAMBIEN EN VARIAS APLICACIONES DE BUSQUEDA, DIAGNOSTICO Y TERAPIA QUE INCLUYEN LA INMUNIZACION ACTIVA Y PASIVA Y PROCEDIMIENTOS PARA LA PREVENCION DE COLONIZACION BACTERIANA EN EL ANIMAL Y EN EL HOMBRE. ESTOS SEGMENTOS DE ADN Y LOS PEPTIDOS DERIVADOS DE ESTOS SE CONSIDERAN PARA SU USO EN LA PREPARACION DE VACUNAS Y, TAMBIEN, PARA SU USO COMO PROTEINAS VECTORES EN FORMULACIONES DE VACUNAS, ASI COMO EN LA FORMULACION DE COMPOSICIONES DESTINADAS A SU USO EN LA PREVENCION DE LA INFECCION DE S. AUREUS.

Description

Composiciones proteínicas fijadoras de colágeno y métodos de utilización.

1.1. Ámbito de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular. Más particularmente, ciertas realizaciones se refieren a métodos y composiciones que comprenden segmentos de ADN y proteínas derivadas de especies bacterianas. Más particularmente, la invención presenta composiciones de cna y de ácido nucléico derivado de cna, que comprenden una proteína (CBP) fijadora de colágeno (Col) de Staphylococcus aureus y los epítopos de péptido correspondientes y secuencias proteínicas que comprenden dominios de sitios de fijación de Col nativos y sintéticamente modificados. Se describen diversos métodos para realizar y utilizar estos segmentos de ADN, segmentos de ADN que codifican dominios de zona de fijación de ligando sintéticamente modificados y proteínas nativas y sintéticas, tales como por ejemplo la utilización de segmentos de ADN como sondas diagnósticas y plantillas para la producción de proteínas, y la utilización de proteínas, vehículos de proteínas de fusión y péptidos en diversas aplicaciones farmacológicas e inmunológicas.

1.2. Descripción del estado de la técnica afín 1.2.1. Colonización por Staphylococcus aureus

Las células de S. aureus pueden colonizar varios tejidos huéspedes diferentes y causar diversos tipos de infecciones, tales como endocarditis, neumonía, infecciones de heridas, osteomielitis y artritis séptica. La adherencia de los staphylococci a tejidos huéspedes supone una familia de adhesiones que reconocen componentes de matriz extracelular y que han recibido el nombre de MSCRAMMs (Microbial Surface Components Recognizing Adhesive Matrix Molecules) (Moléculas de Matriz Adhesiva de Reconocimiento de Componentes Superficiales Microbianos) (Patti et al., 1994a).

La expresión de MSCRAMMs específicos parece ser necesaria para la colonización de tipos diferentes de tejidos. Por ejemplo, las cepas de estafilococos recuperadas de las articulaciones de pacientes con diagnóstico de artritis séptica, o de osteomielitis expresan casi invariablemente una CBP, mientras que muchos menos aislados obtenidos de infecciones de heridas expresan esta adhesina (Switalski et al., 1993a). De forma similar, las cepas de S. aureus aisladas de los huesos de pacientes con osteomielitis suelen tener MSCRAMM que reconoce la proteína específica del hueso, sialoproteína ósea (BSP) (Rydén et al., 1989).

La clonación, secuenciación y expresión de un gen cna que codifica una CBP de S. aureus ha sido documentada con anterioridad (Patti et al., 1992). El gen cna codifica una adhesina 133-kDa, que contiene rasgos estructurales característicos de proteínas superficiales aisladas de bacterias Gram-positivas. Se ha demostrado que la CBP se necesita y es suficiente para la adherencia de S. aureus a sustratos artificiales recubiertos con Col así como a cartílago, un tejido rico en Col de tipo II (Switalski et al., 1993a). Todas las cepas que expresan la CBP podían adherirse a cartílago, mientras que las cepas que carecían de los MSCRAMMs no lo hacían. La pre-incubación de S. aureus con anticuerpos policlonales producidos con la adhesina purificada o la saturación de sustratos de cartílago con CBP recombinante soluble dieron como resultado una inhibición completa de la fijación bacteriana (Switalski et al., 1993a).

La colonización por S. aureus del cartílago articular dentro del espacio articular parece ser un factor importante que contribuye al desarrollo de la artritis séptica. La importancia de la CBP en la patogénesis de la artritis séptica se examinó comparando la virulencia de dos conjuntos de mutantes isogénicos de S. aureus en un modelo animal (Patti et al., 1994b). Más del 70% de los ratones inyectados con cepas CNA^{+} (es decir un aislado clínico que expresa la CBP o una cepa negativa en la que se ha introducido el gen cna) desarrollaron síntomas clínicos de artritis, mientras que el 27% de los animales mostró síntomas de enfermedad cuando se les inyectó con cepas CNA^{-} (es decir, una cepa que carece del gen cna o una cepa en la que el gen cna ha sido inactivado por recombinación homóloga). Tomados juntos, estos resultados demuestran que la CBP desempeña una función importante en la patogénesis de la artritis séptica inducida por S. aureus.

Recientemente se ha localizado la zona de fijación del ligando dentro de la mitad N-terminal de la CBP (Patti et al., 1993). Analizando la actividad de fijación de Col de proteínas recombinantes correspondientes a segmentos diferentes del MSCRAMM, se identificó un fragmento proteínico de 168 aminoácidos de longitud (que corresponde a los residuos de aminoácidos 151-318) que tenían una actividad apreciable de fijación de Col. Unas truncaciones cortas de esta proteína en el término N o C dieron como resultado una pérdida de actividad fijadora de ligando, aunque también unos cambios en la conformación de la proteína, tal como indica la espectroscopia de dicroísmo circular. Estos resultados mostraron la posibilidad de una pérdida de la actividad de fijación de ligando aunque mostraron también unos cambios en la conformación de la proteína, tal como lo indica la espectroscopia de dicroísmo circular. Estos resultados sugirieron la posibilidad de que la zona de fijación de ligando del MSCRAMM está contenida dentro de un segmento corto de aminoácidos y que se necesitan secuencias flanqueadoras para el plegado adecuado de estos residuos en la zona de fijación de ligando.

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El documento WO-A1-85/05553 describe proteínas de superficie celular bacteriana con capacidad para fijar fibronectina, fibrinógeno, colágeno y/o laminina. Se muestra en el mismo que diversas bacterias tienen aptitud para adherirse a fibronectina, fibrinógeno, colágeno y/o laminina.

Existen varios estudios relativos a la fijación de colágeno a S. aureus (Carret et al., 1985; Holderbaum et al. 1985; Holderbaum, D., Hall, G.S. y Ehrhart, L.A. 1986, lnfect Immun. 54:359-364; Vercellotti, G.M., McCarthy, J.B. Lindholm, P., Peterson, P.K. Jacob, K.S. y Furcht, L.T.; 1985, Am. J. Pathol. 120:13-21; Speziale, P.G. Ruacci, L. Switalski, L.M. Timpl. R. Y Höök, M. 1986, J. Bact. 167:77-81; Switalski, L.M. Seziale, P. and Höök, M. 1989, J. Biol. Chem. 264:21080-21086).

Switalski et al., 1989 informaron del aislamiento y la caracterización de la proteína de superficie de S. aureus, que identificaron como receptor de colágeno. Utilizando lisostafina para liberar la proteína de la pared celular, seguido de cromatografía por cambio iónico, precipitación de sulfato de amonio y filtración de gel, fue posible purificar una proteína con un peso molecular aparente de 135 kDa. También se mostró que los anticuerpos producidos con la proteína 135 kDa inhibieron la fijación de colágeno a células Cowan 1 de S. aureus.

El documento WO 92/07002 se refiere a una nueva molécula de ADN híbrido recombinante que comprende una secuencia de nucleotídos de S. aureus que codifica una proteína, o un polipéptido con propiedades de fijación de colágeno.

1.2.2. Función de la CBP de S. aureus en la patología humana

La artritis bacteriana adquirida hematógenamente sigue siendo un problema médico grave. Esta patología de las articulaciones de progresión rápida y altamente destructiva resulta difícil de erradicar y menos del 50% de los pacientes infectados consiguen recuperarse sin serios daños articulares. El S. aureus es el patógeno predominante aislado de pacientes adultos con osteomielitis hematógena (primaria) y secundaria (Walvogel and Vasey 1980), y es el causante también de hasta el 90% de los casos de osteomielitis hematógena aguda en niños, por otra parte sanos (Cole 1982). Los estudios de escaneado por microscopia electrónica han mostrado que S. aureus está íntimamente asociado con cartílago y tejido óseo recuperado de la zona de infección. Otras pruebas microscópicas sugieren la fijación predominante y colonización subsiguiente de superficies cartilaginosas en lugar de sinoviales (Voytek et al 1988). Un análisis de cepas de S. aureus aisladas de pacientes diagnosticados con osteomielitis y artritis séptica reveló que casi la totalidad de los aislados contenían una adhesina Col. En cambio, solamente un tercio de las cepas de S. aureus aisladas de pacientes con infecciones del tejido blando expresaron la adhesina Col. (Switalski, Patti et al., 1993). Estas observaciones sugieren que la expresión en superficie celular de la adhesina Col es un factor de virulencia importante en la osteomielitis y la artritis séptica por estafilococos. Además, se ha observado que la degradación del cartílagos tras la infección articular por estafilococos se puede atribuir a una interacción directa entre la bacteria y el cartílago (Smith et al., 1982), además de la respuesta inflamatoria al huésped (Smith et al., 1987). Las personas que necesitan más de 6 días para que el fluido sinovial esté libre de microorganismos suelen tener un desenlace clínico pobre (Ho and Su 1982). Como resultados pobres se pueden citar una discapacidad permanente con movimiento limitado o un dolor persistente en la articulación afectada. Por consiguiente, al inhibir la fijación inicial de la bacteria al cartílago, puede disminuirse la probabilidad de una destrucción ulterior de la articulación.

1.3. Deficiencias en el estado de la técnica

Es evidente que si bien diversos métodos en el tratamiento de patologías bacterianas han tenido algún éxito, siguen existiendo muchos problemas, inclusive la resistencia antibiótica, la variabilidad de antígenos entre especies y la variación de especies por mutación de antígenos, así como la necesidad de proteger grupos susceptibles como niños jóvenes, personas mayores y otros pacientes inmunodeficientes. Existe por lo tanto la necesidad inmediata de un tratamiento eficaz para la infección por S. aureus y de vacunas contra este patógeno.

En un primer aspecto de la presente invención, se presenta una composición que comprende un péptido CBP, donde dicho péptido tiene la secuencia de aminoácidos contigua de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4; o SEQ ID NO: 6 e inhibe la adhesión bacteriana al colágeno, que se utiliza en terapia.

También se presenta una composición farmacéutica que comprende un péptido CBP, en el que dicho péptido tiene la secuencia de aminoácidos contigua de SEQ ID NO: 6 e inhibe la adhesión bacteriana al colágeno.

En otro aspecto, se presenta la utilización de una composición que comprende un péptido CBP, donde dicho péptido tiene la secuencia de aminoácidos contigua de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6 e inhibe la adhesión bacteriana al colágeno, para la fabricación de un medicamento profiláctico para inhibir o evitar la colonización bacteriana, la infección bacteriana, la sepsis bacteriana, la infección por estafilococos o la sepsis en un animal.

En otro aspecto, se presenta también una composición que comprende un segmento de ácido nucléico aislado que codifica un péptido CBP, donde el péptido CBP tiene la secuencia de aminoácidos contigua de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6 e inhibe la adhesión bacteriana a colágeno, que se utiliza en terapia.

En otro aspecto, se presenta también la utilización de una composición que comprende un segmento de ácido nucléico aislado, que codifica un péptido CBP, donde el péptido CBP tiene la secuencia de aminoácidos contigua de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6 e inhibe la adhesión bacteriana a colágeno para la fabricación de un medicamento profiláctico para inhibir o evitar la colonización bacteriana, la infección bacteriana, la sepsis bacteriana, la infección por estafilococos o la sepsis en un animal.

En otro aspecto, se presenta una composición que comprende un anticuerpo que interacciona con un péptido CBP, donde el péptido CBP tiene una secuencia de aminoácidos reflejada en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, y donde dicho anticuerpo inhibe la adhesión bacteriana a colágeno, que se utiliza en terapia.

Se presenta también la utilización de una composición que comprende un anticuerpo que interacciona con un péptido CBP, péptido CBP que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, donde dicho anticuerpo inhibe la adhesión bacteriana a colágeno, para la fabricación de un medicamento que se utiliza para inhibir o evitar la colonización bacteriana, la infección bacteriana, la sepsis bacteriana, la infección por estafilococo o la sepsis en un animal.

En otro aspecto, se presenta un kit que comprende una composición según la presente invención.

Se presenta también la utilización de una composición que comprende un anticuerpo que interactúa con un péptido CBP, péptido CBP que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 para la fabricación de un medicamento profiláctico para inhibir o evitar la colonización bacteriana la infección bacteriana o la sepsis bacteriana, en un animal.

En otro aspecto, se presenta la utilización de una composición que comprende un anticuerpo que interacciona con un péptido CBP, péptido CBP que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la infección por estafilococos o la sepsis en un animal.

En otro aspecto, se ofrece un kit que comprende una composición que tiene un anticuerpo que interactúa con un péptido CBP, péptido CBP que tiene una secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2, que se utiliza en terapia.

La presente invención supera uno o varios de estos u otros inconvenientes inherentes al estado de la técnica, al presentar composiciones nuevas y métodos para su utilización en el tratamiento de infección por S. aureus utilizando estrategias no antibióticas. Se describen métodos para la utilización de composiciones de péptido y anticuerpo nuevas en el tratamiento de infección por S. aureus, producida por la inhibición de la fijación bacteriana al componente ECM de la célula huésped, Col. También se describen unos métodos para la inmunización activa y pasiva contra S. aureus y especies afines utilizando unas composiciones de CBP nativas y alteradas específicamente según zona, y péptidos epitópicos derivados de CBP de especies bacterianas. Unos aspectos particulares de la invención se refieren a nuevos segmentos de ácidos nucléicos que codifican estos péptidos y epítopos, y métodos para la utilización de dichos segmentos de ácidos nucléicos en una variedad de diagnósticos y regímenes terapéuticos. También se obtienen composiciones de péptidos derivadas de CBP, que comprenden el dominio de fijación de Col. Utilizando el análisis de estructura de cristal, los inventores han desarrollado mutaciones específicas de zona en segmentos de ADN que codifican CBP, que dan lugar a dominios de fijación de Col alterados. En unas realizaciones importantes, se obtiene métodos y composiciones para inhibir la fijación de S. aureus a Col. Estas composiciones resultan útiles para evitar la adhesión bacteriana a componentes de matriz extracelular como Col y la inhibición de la colonización bacteriana a sustratos de colágeno. Además, la invención comprende la utilización de CBP o secuencias de gen cna para producir anticuerpos que protegen contra infecciones por estafilococos.

En otra realización, la invención describe un método para evitar la enfermedad en un animal debida a S. aureus. El método suele comprender la identificación de un animal sospechoso de infección por S. aureus y la administración al animal de una proteína de fijación de colágeno, o una composición de anticuerpo eficaz para evitar la enfermedad en el animal.

En otra realización, la invención describe un método para aumentar la fagocitosis de una célula de S. aureus por una célula macrófaga. En general, el método consiste en proporcionar a la célula de macrofago una proteína de fijación de colágeno o composición de anticuerpos farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para aumentar la fagocitosis de la bacteria por temacrófago.

De preferencia, la composición proteínica de fijación de colágeno comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, o el anticuerpo interactúa específicamente con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.

En una realización afín, la invención describe un método para potenciar la muerte intracelular de una célula de S. aureus en una célula macrófaga. Este método consiste en proporcionar a una célula macrófaga una proteína de fijación de colágeno o composición de anticuerpos farmacéuticamente aceptable en una cantidad eficaz para potenciar la muerte intracelular de la célula de S. aureus en el macrófago.

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2.1. Composiciones de ácido nucléico de CNA

La invención presenta secuencias de ácido nucléico de codificación de CBP. Tal como se utiliza aquí, un gen codificador de CBP significa una secuencia de ácidos nucléicos codificadora de proteína de fijación de Col. Una secuencia de ácidos nucléicos codificadora de un gen CBP es la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1, o una variante de cepa o un fragmento activo de la misma. Se espera que el gen codificador de CBP variará en la secuencia de ácidos nucléicos de una cepa a la otra, pero que la variación en la secuencia de ácidos nucléicos no excluirá la hibridación entre secuencias codificadoras de CBP de cada cepa en condiciones estrictas de hibridación.

Tal como se utiliza aquí, una variante de cepa de CBP significa un polipéptido codificado, total o parcialmente por una secuencia de nucleácidos que híbrida en estrictas condiciones de hibridación a una secuencia de ácidos nucléicos de cualquiera de las SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5 codificadoras de los epitopos M55, M31 y M17 de una CBP de S. aureus respectivamente. La secuencia de aminoácidos de péptidos M55, M31 y M17 se da en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 6 respectivamente. Todo experto en la materia entenderá que las variantes de cepa de CBP incluyen aquellas proteínas codificadas por secuencias de ácido nucléicos que se pueden amplificar utilizando una secuencia de ácidos nucléicos de cualquiera de las siguientes SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5.

En unas realizaciones afines, la descripción también comprende variantes de cepas de CBP y los genes cna codificadores de CBP. Las variantes de cepas son aquellas composiciones de ácidos nucléicos y composiciones de polipéptidos aisladas de cepas de S. aureus y bacterias gran positivas afines que expresan CBP y que se adhieren a sustratos de Col.

Algunos aspectos de la descripción se refieren a la identificación de estas variantes de cepa utilizando métodos diagnósticos y unos kits que se describen aquí. En particular, los métodos que utilizan secuencias de gen cna como sondas de hibridación de ácido nucléico y/o anticuerpos anti-CBP en transferencias western o análisis afines resultan útiles para la identificación de estas variantes de cepas. La identidad de variantes potenciales de cepas de CBP se puede confirmar mediante ensayos de fijación de Col, por ejemplo por análisis de transferencia con Col rotulado o, alternativamente, demostrando la aptitud de la variante de cepa CBP para reducir o evitar la adherencia de S. aureus y bacterias afines Col.

Tal como se utiliza aquí, una CBP es una proteína que confiere protección contra infección por estafilococo o estreptococo. Una CBP o fragmentos de la misma puede evitar o reducir la adhesión de S. aureus a Col o evitar o reducir la gravedad de algunos de los trastornos asociados a infección por S. aureus, inclusive sepsis, lesiones cutáneas, artritis séptica, endocarditis, mastitis, neumonía, trastornos neurológicos y otras patologías que resultan de la colonización de S. aureus u organismos afines en sustratos que contienen Col. Un aspecto importante de la presente invención se refiere a segmentos aislados de ADN y vectores recombinantes codificadores de CBP, y la creación y utilización de células huéspedes recombinantes mediante la aplicación de tecnología ADN, que expresan genes CBP y productos génicos derivados de CBP. Como tal, la invención se refiere a un segmento de ADN que comprende un gen aislado que codifica una proteína o péptido que incluye una secuencia de aminoácidos prácticamente como la mostrada en una secuencia contigua de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6. Estos segmentos de ADN se ejemplifican en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5, respectivamente. La invención también comprende composiciones que incluyen una proteína purificada que tiene una secuencia de aminoácidos prácticamente como la de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6.

En lo que respecta los nuevos epítopos de proteína CBP, la presente invención se refiere a segmentos de ADN que se pueden aislar virtualmente desde cualquier fuente bacteriana, libres de ADN genómico total y que codifican proteínas o péptidos que tienen actividad similar a CBP. Los segmentos de ADN que codifican especies similares a CBP pueden codificar proteínas, polipéptidos, subunidades, dominios funcionales y similares.

Tal como se utiliza aquí el término "segmento de ADN" se refiere a una molécula de ADN que ha sido aislada libre de ADN genómico total de una especie particular. Por consiguiente, un segmento de ADN que codifica CBP se refiere a un segmento de ADN que contiene secuencias de codificación de CBP aislada o purificada y libre de ADN genómico total de las especies a partir de las cuales se obtiene el segmento de ADN. El término "segmento de ADN" incluye segmentos de ADN y fragmentos más pequeños de dichos segmentos y también vectores recombinantes, inclusive por ejemplo, plasmidos, cósmidos, fagémidos, fago, virus y similares.

De modo similar, el segmento ADN que comprende un gen CBP aislado o purificado se refiere a un segmento de ADN que incluye secuencias de codificación de CBP y, en ciertos aspectos, secuencias de regulación, aislado prácticamente y separado de otros genes de producción natural o secuencias de codificación de proteína. En este sentido, el término "gen" se utiliza para simplificar, para referirse a una proteína funcional, polipéptido o unidad codificadora de péptido. Los expertos en la materia entenderán bien que el término funcional incluye secuencias genómicas, secuencias codificadoras de plásmido y extra - genómicas y segmentos de gen más pequeños que expresan o pueden adaptarse para expresar proteínas, polipéptidos o péptidos. Estos segmentos se pueden aislar naturalmente o modificar sintéticamente de forma manual.

El término "prácticamente aislado de otras secuencias de codificación" significa que el gen en cuestión, en este caso, un gen codificador de CBP constituye la parte importante de la región codificadora del segmento de ADN, y que el segmento de ADN no contiene porciones grandes de ADN codificador de producción natural, como grandes fragmentos cromosómicos u otros genes funcionales o regiones codificadoras de polipéptido. Por supuesto, se refiere al segmento ADN originalmente aislado, y no excluye genes o regiones codificadoras añadidas posteriormente al segmento.

En realizaciones particulares, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que codifican una especie CBP que incluye dentro de su secuencia de aminoácidos una secuencia de aminoácidos prácticamente como la que aparece en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6. En otras realizaciones particulares, la invención se refiere a segmentos de ADN aislados y vectores recombinantes que incorporan secuencias de ADN que incluyen dentro de su secuencia una secuencia nucleótida prácticamente como la que aparece en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5.

El término "una secuencia prácticamente como la que aparece en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6" significa que la secuencia corresponde prácticamente a una parte de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6 y tiene relativamente pocos aminoácidos que no son idénticos o equivalentes funcionales biológicos de los aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6. El término "equivalente biológicamente funcional" es algo bien conocido en el estado de la técnica y se define además aquí de modo detallado (por ejemplo, véase Realizaciones Ilustrativas). Por consiguiente, las secuencias que tienen entre aproximadamente 70% y 80%, o de preferencia entre aproximadamente 81% y 90% o incluso mejor entre aproximadamente 91% y 99% de aminoácidos que son idénticos o funcionalmente equivalentes a los aminoácidos de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6 serán secuencias "prácticamente como las que aparecen en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6".

En algunas otras realizaciones, la invención se refiere a segmentos aislados de ADN y vectores recombinantes que incluyen dentro de su secuencia una secuencia de ácido nucléico prácticamente como la que aparece en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5. El término "prácticamente como aparece en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5" se utiliza en el mismo sentido descrito anteriormente y significa que la secuencia de ácido nucléico corresponde prácticamente a una parte de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5 y tiene relativamente pocos codones que no son idénticos o equivalentes funcionales de los codones de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5. Por lo general, se preferirán los segmentos de ADN que codifican proteínas que presentan actividad similar a CBP.

Se entenderá también que las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucléicos pueden incluir residuos adicionales, tales como aminoácidos terminales N o C adicionales o secuencias 5' ó 3' y sin embargo ser prácticamente como las que aparecen en una de las secuencias aquí descritas, siempre que la secuencia cumpla los criterios indicados anteriormente, inclusive el mantenimiento de actividad proteínica biológica cuando se trata de expresión proteínica. La adición de secuencias finales se aplica particularmente a secuencias de ácidos nucléicos que pueden incluir por ejemplo varias secuencias no codificadoras que flanquean partes 5' ó 3' de la región codificadora o pueden incluir diversos genes estructurales o regulatorios, corriente arriba o abajo.

Como es natural, la presente invención también comprende segmentos de ADN complementarios o prácticamente complementarios de la secuencia que aparece en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5. Las secuencias de ácidos nucléicos que son "complementarias" son aquellas que pueden presentar apareamiento de bases según las reglas de complementariedad standard de Watson-Crick. Tal como se utiliza aquí, el término "secuencias complementarias" se refiere a secuencias de ácidos nucléicos que son prácticamente complementarias, según se puede evaluar con la misma comparación de nucleotídos expuesta anteriormente, o que se definen como capaces de hibridar al segmento de ácido nucléico de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5 en condiciones relativamente rigurosas como las aquí descritas.

Los segmentos de ácido nucléico de la presente invención, independientemente de la longitud de la secuencia de codificación en sí, pueden combinarse con otras secuencias de ADN, tales como promotores, señales de poli adenilación, zonas de enzima de restricción adicional, zonas de clonación múltiple, otros segmentos de codificación y similares, de forma que su longitud global puede variar considerablemente. Se contempla por lo tanto la posibilidad de utilizar un fragmento de ácido nucléico de casi cualquier longitud, quedando la longitud total limitada de preferencia por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante previsto. Por ejemplo, se pueden preparar fragmentos de ácidos nucléicos que incluyen un tramo contiguo corto idéntico o complementario a SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5, de aproximadamente 14 nucleótidos, y con una longitud aproximada de 10.000 0 5.000 pares de bases, con segmentos de aproximadamente 3.000, de preferencia en ciertos casos. También se consideran útiles segmentos de ADN con longitudes totales de aproximadamente 2.000, aproximadamente 1.000, aproximadamente 500, aproximadamente 200, aproximadamente 100 y aproximadamente 50 pares de bases de longitud (inclusive todas las longitudes intermedias).

Se entenderá fácilmente que el término "longitudes intermedias" en estos contextos se refiere a cualquier longitud comprendida entre los límites mencionados, tal como 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, etc, 21, 22, 23, etc; 30, 31, 32, etc; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 103, etc; 150, 151, 152, 153, etc.; inclusive todos los enteros dentro de los límites de 200-500; 500-1.000; 1.000-2.000; 2.000-3.000; 3.000-5.000; 5.000-10.000 hasta secuencias, inclusive, de aproximadamente 12.001, 12.002, 13.001, 13.002 y similares.

Se tiene que entender también que la presente descripción no se limita a las secuencias de ácidos nucléicos particulares descritas en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5, o a las secuencias de aminoácidos descritas en SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6. Unos vectores recombinantes y fragmentos aislados de ADN pueden por lo tanto incluir de forma variable las regiones mismas de codificación de epitopos CBP, regiones de codificación que llevan alteraciones o modificaciones seleccionadas en la región de codificación básica, o pueden codificar polipéptidos mayores que incluyen no obstante regiones de codificación derivadas de CBP o pueden codificar proteínas equivalentes biológicamente funcionales o péptidos que tienen secuencias de aminoácidos variantes.

Los segmentos de ADN de la presente invención comprenden péptidos y proteínas derivados de CBP equivalente biológicamente funcionales, en particular aquellas CBP y proteínas afines aisladas de fuentes procarióticas y particularmente bacterias. Los segmentos de ADN aislados de especies de estafilococos y estreptococos y bacterias afines, que, según se ve, fijan Col resultan particularmente preferidos para su utilización en los métodos aquí descritos. Dichas secuencias pueden surgir como consecuencia de redundancia de codón y equivalencia funcional que, según se sabe, se producen de forma natural dentro de las secuencias de ácidos nucléicos y las proteínas así codificadas. Alternativamente, se pueden crear péptidos o proteínas funcionalmente equivalentes mediante la aplicación de tecnología de ADN recombinante, en la cual se pueden diseñar cambios en la estructura proteínica, basados en consideraciones de las propiedades de los aminoácidos que se intercambian. Los cambios diseñados se pueden introducir mediante la aplicación de técnicas de mutagénesis dirigida a la zona, por ejemplo para introducir mejoras en la antigenicidad de la proteína o comprobar mutantes con el objeto de examinar la actividad a nivel molecular.

Si se desea, se pueden preparar también proteínas de fusión y péptidos por ejemplo cuando las regiones de codificación de CBP o derivadas de CBP están alineadas dentro de la misma unidad de expresión con otras proteínas o péptidos que tienen funciones deseadas, como para fines de purificación o inmunodetección (por ejemplo proteínas que se pueden purificar por cromatografía de afinidad y regiones de codificación de rótulo enzimático, respectivamente).

2.2. Expresión recombinante de epitopos de CBP y derivados de CBP

La presente descripción se refiere también a células huéspedes recombinantes para la expresión de un gen cna aislado, o para una secuencia de ADN que codifica uno o más péptidos epitópicos derivados de una proteína de codificación de cna. Se contempla la posibilidad de emplear virtualmente cualquier célula anfitrión para este fin, aunque puede presentar ciertas ventajas la utilización de una célula anfitrión bacteriana como E. coli, S. typhimurium, B. subtilis, o S. aureus, S. dysgalactiae, S. pyogenes u otras especies grampositivas. Se contempla también la expresión en células eucarióticas como las derivadas de levadura, líneas celulares de insecto o mamífero. Estas células huéspedes recombinantes se pueden utilizar en conexión con proteínas CBP "de sobre - expresión", es decir que incrementan el nivel de expresión por encima del que se encuentra naturalmente en S. aureus.

Se espera que las proteínas de secuencias de aminoácidos derivadas de CBP o similar a la misma tengan afinidad por Col y se puedan purificar a partir de otros constituyentes de S. aureus o células huéspedes recombinantes por cromatografía sobre matrices que contienen Col, denominada "cromatografía por afinidad". Las CBP se pueden purificar también utilizando metodologías que no se basan en la afinidad por Col como la cromatografía por intercambio iónico, cromatografía de exclusión de tamaño, cromatografía de quelación metálica o similares. El tampón, el detergente y otras condiciones pueden no ser iguales a los que resultan óptimos para la "cromatografía por afinidad". En una realización preferida, se puede utilizar una matriz de afinidad que comprende Col de tipo II o un tipo de Col afín (por ejemplo Tipo, I, Tipo III, Tipo V, Tipo IX, etc.) para el aislamiento de CBP de la solución, o alternativamente, el aislamiento de bacterias intactas que expresan CBP o incluso fragmentos de membranas de bacterias que expresan CBP.

Un aspecto particular de la presente invención ofrece nuevas vías, en las que se utilizan péptidos de CBP recombinante o derivados de CBP segmentos de ácido nucléico que codifican estos péptidos, vectores recombinantes y células huéspedes transformadas que comprenden segmentos de ADN de cna o derivados de cna, vectores recombinante y células huéspedes transformadas que comprenden segmentos de ADN de cna o derivados de cna, y vectores recombinantes y células huéspedes transformadas que comprenden segmentos de ADN derivados de cna de S. aureus. En realizaciones particulares, se obtienen segmentos de ácido nucléico diseñados genéticamente y proteínas de CBP que tienen dominios de zona de fijación de Col alteradas. Utilizando los métodos aquí descritos, los inventores han desarrollado unas CBPs específicamente alteradas por zona que han reducido la afinidad por Col. Como saben los expertos en la materia, muchos de estos vectores y células huéspedes se pueden obtener fácilmente; un ejemplo particular detallado de vector adecuado para la expresión en células de mamíferos es el descrito en la patente US 5.168.050. No obstante, no se requiere la utilización de un vector altamente purificado, mientras el segmento de codificación empleado codifique una proteína o péptido de interés (por ejemplo una CBP, y particularmente una CBP de S. aureus o bacteria afín, y no incluye ninguna secuencia de codificación o regulatoria que pudiera tener un efecto negativo sobre la célula).

Por consiguiente, se entenderá también que las secuencias de ácidos nucléicos útiles pueden incluir residuos adicionales, tales como secuencias no codificadoras adicionales que flanquean las partes 5' ó 3' de la región de codificación o pueden incluir varias secuencias regulatorias.

Tras la identificación de una molécula de ácido nucléico adecuada codificadora de epítopo, puede insertarse en cualquiera de los muchos vectores actualmente conocidos en el estado de la técnica, de forma que dirija la expresión en la producción de la epítopo peptídico de interés (por ejemplo una CBP de S. aureus) cuando se incorpora en una célula huésped. En un vector de expresión recombinante, la parte de codificación del segmento de ADN se pone bajo el control de un promotor. El promotor puede tener la forma del promotor que se asocia naturalmente con un segmento de ácido nucléico codificador de CBP, como el que se puede obtener aislando las secuencias no codificadas 5' situadas corriente arriba del segmento de codificación, por ejemplo, utilizando la clonación recombinante y/o tecnología PCR™, en conexión con las composiciones aquí descritas. Se considera particularmente útil en dicha metodología la amplificación directa de ácidos nucléicos utilizando la tecnología PCR™ de las patentes US 4.683.195 y 4.683.202.

En ciertas realizaciones, se contempla la posibilidad de obtener ventajas particulares poniendo el segmento de ADN codificador de CBP bajo el control de un promotor recombinante o heterólogo. Tal como se utiliza aquí, el término promotor recombinante o heterólogo se refiere a un promotor no asociado normalmente con un segmento génico de cna o similar a cna en el entorno natural. Dichos promotores pueden incluir los normalmente asociados con otros genes de codificación de MSCRAMM, y/o promotores aislados de cualquier otra célula bacteriana, viral, eucariótica o de mamífero. Como es natural, será importante utilizar un promotor que dirija eficazmente la expresión del segmento de ADN en la célula particular que contiene el vector que incluye el segmento de ácido nucléico codificador de
CBP.

La utilización de combinaciones de promotor y tipo de célula para la expresión proteínica es generalmente conocida por los expertos en la materia, en este caso en biología molecular, por ejemplo, véase Sambrook et al., 1989. Los promotores empleados pueden ser constitutivos o inducibles y se pueden utilizar en condiciones adecuadas para dirigir la expresión de alto nivel del segmento de ADN introducido, tal como resulta ventajoso en la producción a gran escala de proteínas o péptidos recombinantes.

La expresión procariótica de segmentos de ácido nucléico de la presente invención se puede realizar utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia, que comprenderán probablemente vectores de expresión y secuencias de promotor como las obtenidas por tac, trp, tac, lacUV5 o T7. Si se desea la expresión de las proteínas CBP recombinantes en células eucarióticas se dispone de cierto número de sistemas de expresión conocidos por los expertos en la materia. Un sistema promotor eucariótico ejemplar que se utiliza en la expresión de alto nivel es el sistema de nivel de expresión Pichia (Pharmacia LKB Biotechnology).

En conexión con realizaciones de expresión para preparar CBP recombinante y péptidos, se considera que se utilizarán con más frecuencia segmentos de ADN más largos, prefiriéndose los segmentos de ADN que codifican toda la CBP o dominios funcionales, epitopos, dominios de fijación de ligando, subunidades, etc. No obstante, se apreciará que la utilización de segmentos de ADN más cortos para dirigir la expresión de péptidos de CBP o regiones centrales epitópicas, como las que se pueden utilizar para generar anticuerpos anti-CBP, también cae dentro del ámbito de la invención. Se consideran particularmente útiles los segmentos de ADN que codifican antígenos peptídicos de aproximadamente 15 a 100 aminoácidos de longitud, o de preferencia de aproximadamente 15 a 50 aminoácidos de longitud. Como ejemplos de segmentos de ADN que codifican epitopos peptídicos de la proteína de fijación de Col, cuya utilidad en evitar la fijación a Col ha sido mostrada por lo inventores, se encuentran los polinucleótidos descritos en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5.

Los segmentos de ADN del gen cna y derivados del cna se pueden utilizar también en conexión con la expresión somática en un animal o en la creación de un animal transgénico. Nuevamente, en estas realizaciones se contempla particularmente la utilización de un vector recombinante que dirige la expresión del epítopo de longitud normal o de uno o varios epítopos de CBP activos. Se considera particularmente útil la expresión de transgénicos cna en animales en la producción de anticuerpos anti-CBP que se utilizan en métodos de inmunización pasiva para evitar la adhesión de estafilococos y estreptococos al Col.

La utilización de promotores recombinantes para lograr la expresión proteínica es algo generalmente conocido por los expertos en la materia (biología molecular); véase por ejemplo Sambrook et al., (1989). Los promotores utilizados pueden ser constitutivos o inducibles y se pueden utilizar en condiciones adecuadas para dirigir la expresión regulada o de alto nivel del segmento de ADN introducido. Para la expresión eucariótica, los promotores actualmente preferidos son: CMV, RSV, LTR, el promotor SV40 solo y el promotor SV40 en combinación con el potenciador (enhancer) SV40. En unas realizaciones preferidas, la expresión de CBP recombinante se realiza utilizando sistemas de expresión procariótica, y en particular sistemas bacterianos como E. coli. Esta expresión procariótica de segmentos de ácido nucléico de la presente invención se puede realizar utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia, y comprenderá probablemente vectores de expresión y secuencias de promotor como las obtenidas por promotores tac, trp, lac, lacUV5 o T7.

Para la expresión de epítopos de CBP y derivados de CBP, una vez que se ha obtenido un clon o unos clones adecuados, ya sean secuencias nativas o genéricamente modificadas, se puede proceder a preparar un sistema de expresión para la preparación recombinante de CBP o péptidos derivados de CBP. El diseño de segmento(s) de ADN para la expresión en un sistema procariótico o eucariótico puede realizarse mediante técnicas generalmente conocidas por los expertos en expresión recombinante. Se cree que es posible emplear virtualmente cualquier sistema de expresión en la expresión de epítopos de CBP o derivados de CBP.

Alternativamente, puede ser deseable, en ciertas realizaciones, expresar epítopos de CBP o derivados de CBP en sistemas de expresión eucariótica. Las secuencias de ADN que codifican los epítopos de CBP o derivados de CBP deseados (ya sean nativos o mutagenizados) se pueden expresar por separado en sistemas bacterianos, expresándose las proteínas codificadas como fusiones con b-galactosidasa, ubiquitina, glutationa S-transferasa Schistosoma japonicum, proteína A de S. aureus, proteína de fijación de maltosa y similares. Se cree que la expresión bacteriana tendrá en última instancia ventajas con respecto a la expresión eucariótica en términos de facilidad de uso y cantidad de materiales obtenidos.

La propuesta es que la transformación de células huéspedes con segmentos de ADN que codifican dichos epítopos proporcionará unos medios convenientes para obtener CBP o péptidos derivados de CBP. Las secuencias genómicas resultan adecuadas para la expresión eucariótica, ya que la célula huésped procesará, por supuesto, los transcriptos genómicos para producir mARN funcional para su traducción en proteína.

Se cree, de forma similar, que casi cualquier sistema de expresión eucariótica se puede utilizar para la expresión de CBP y epítopos derivados de CBP, por ejemplo sistemas basados en baculovirus, en glutamina sintasa o dihidrofolato reductasa. En unas realizaciones preferidas, se considera que será de mayor utilidad los vectores plásmidos que incorporan un origen de replicación y un promotor eucariótico eficiente, tal como lo ejemplifican los vectores eucarióticos de las series pCMV como pCMV5.

Para la expresión de esta forma, habría que colocar las secuencias de codificación adyacentes al promotor y bajo el control del mismo. Se sabe en el estado de la técnica que para llevar una secuencia de codificación bajo el control de este tipo de promotor, se posiciona el extremo 5' de la zona de iniciación de transcripción del marco de lectura transcripcional de la proteína entre aproximadamente 1 y aproximadamente 50 nucleótidos "corriente abajo" (es decir 3' del) promotor elegido.

Si se contempla la expresión eucariótica, se deseará por lo general también incorporar en la unidad de transcripción que incluye secuencias de ácido nucléico que codifican CBP o péptidos derivados de CBP, una zona de poliadenilación adecuada (por ejemplo 5'-AATAAA-3') si una no estaba contenida dentro del segmento clonado original. Por lo general, la zona de adición poli-A está situada aproximadamente 30 a 2000 nucleótidos "corriente abajo" de la zona de terminación de la proteína en una posición anterior a la terminación de transcripción.

Se contempla la posibilidad de utilizar virtualmente cualquiera de las células huéspedes habitualmente empleadas en conexión con la expresión de CBP y los epítopos derivados de CBP de acuerdo con lo anterior. Como ejemplos se puede citar líneas celulares que se suelen utilizar para la expresión eucariótica como por ejemplo: líneas celulares 239, AtT-20, HepG2, VERO, HeLa, CHO, WI 38, BHK, COS-7, RIN y MDCK.

También se contempla la posibilidad de "sobre - expresar" la CBP o péptidos epitópicos derivados de CBPs nativos o recombinantes, expresar en niveles incrementados con respecto a su expresión natural en células humanas, o incluso respecto de la expresión de otras proteínas en una célula huésped recombinante que contiene segmentos de ADN que codifican CBP. Esta sobreexpresion se puede evaluar mediante varios métodos que incluyen la radio rotulación y/o purificación proteínica. Sin embargo, se prefieren los métodos sencillos y directos como por ejemplo los que utilizan SDS/PAGE y la tinción proteínica o transferencia western, seguido de análisis cuantitativos tales como escaneado densitométrico del gel resultante o "blot". Un incremento específico en el nivel de la proteína o péptido recombinante en comparación con el nivel en células que producen CBP natural es indicativo de sobre - expresión, al igual que una abundancia relativa de la proteína específica en relación con las demás proteínas producidas por la célula huésped, y por ejemplo visible en un gel.

Tal como se utiliza aquí, el término de célula "diseñada" o "recombinante" se refiere a una célula en la que se ha introducido un gen recombinante, tal como un gen que codifica una CBP o un epítopo derivado de CBP. Por consiguiente, las células diseñadas se pueden distinguir de las células que se producen naturalmente, que no contienen un gen introducido de modo recombinante. Las células diseñadas son por lo tanto células que tienen uno o varios genes introducidos por la mano del hombre. Los genes introducidos de forma recombinante tendrán la forma de un gen estructural sencillo, un clon genómico completo que comprende un gen estructural o ADN flanqueador, o un operon u otro segmento de ácido nucléico funcional que puede incluir también genes situados corriente arriba y/o corriente abajo del promotor, elementos de regulación o el mismo gen estructural, o incluso genes no asociados naturalmente con el gen estructural particular en cuestión.

Si se requiere la introducción de una versión recombinante de uno o más de los genes anteriores, será importante introducir el gen de forma que se encuentre bajo el control de un promotor que dirija eficazmente la expresión del gen en el tipo celular elegido para el diseño. En general, uno deseará utilizar un promotor que permita una expresión constitutiva (constante) del gen en cuestión. Como promotores eucarióticos constitutivos utilizados habitualmente se pueden citar los promotores virales tales como el promotor de cito megalo virus (CMV), la secuencia de repetición terminal larga de sarcoma Rous (LTR), o el promotor de gen trempano SV40. La utilización de estos promotores constitutivos garantizará un elevado nivel constante de expresión de los genes introducidos. Los inventores han observado que el nivel de expresión de los genes introducidos en cuestión puede variar en diferentes clones o genes aislados de cepas o bacterias diferentes. Por consiguiente, el nivel de expresión de un gen recombinante particular se puede elegir evaluando clones diferentes derivados de cada estudio de transfección; una vez elegida dicha línea, el promotor constitutivo asegura que el nivel deseado de expresión se mantiene de forma permanente. También puede ser posible utilizar promotores específicos del tipo celular utilizado para el diseño, como el promotor de insulina en las líneas celulares de insulinoma, o la prolactina o promotores de hormona de crecimiento en líneas celulares de pituitaria anterior.

2.3. Detección inmunológica de CBP y bacterias que expresan CBPs

Otro aspecto de la invención es la preparación de composiciones inmunológicas, y en particular, anticuerpos anti-CBP para métodos diagnósticos y terapéuticos relativos a la detección y tratamiento de infecciones causadas por S. aureus y especies gram-positivas afines. En unas realizaciones preferidas, se describen composiciones de anticuerpos que interactúan con las CBPs recombinantes alteradas específicamente según zona, descritas en la presente invención. También se describen anticuerpos que reconocen dentro de las CBPs epítopos de dominio de fijación de Col sintéticamente mutados y nativos específicos. Los inventores consideran que estos anticuerpos resultan útiles en los ensayos de reconocimiento diagnóstico, procesos de purificación de Col, detección de anticuerpos anti-CBP, así como su utilización en la inmunización pasiva de un animal para prevenir la sepsis bacteriana, colonización o interacción con el Col componente de ECM.

2.4. Métodos para producir una respuesta inmunológica

También se describe un método para generar una respuesta inmunológica en un animal. El método suele comprender la administración a un animal de una composición farmacéutica que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición peptídica aquí descrita. Como composiciones peptídicas se pueden citar el péptido descrito en cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6.

La invención también comprende composiciones de antígeno peptídico de CBP o derivados de CBP junto con excipientes farmacéuticamente aceptables, vehículos, diluyentes, adyuvantes y otros componentes tales como péptidos adicionales, antígenos o preparaciones de membranas exterior como las que se pueden utilizar en la formulación de vacunas particulares.

Las secuencias de ácido nucléico de la presente invención codifican CBP y resultan útiles para generar CBP recombinante puro para su administración a un huésped. Dicha administración resulta útil como vacuna para inducir anticuerpos terapéuticos que evitan la adherencia de S. aureus a los tejidos del huésped.

Se muestra que el antisuero cultivado y reactivo con CBP inhibe la fijación, promueve la fagocitosis y potencia la muerte intracelular por parte de los macrófagos. Por consiguiente, se considera que la administración de anticuerpos reactivos con CBP a pacientes de riesgo será eficaz para la profilaxis y, en caso de pacientes infectados, para la terapia de infecciones bacterianas.

Los anticuerpos pueden ser de varios tipos, inclusive los producidos en animales donantes heterólogos o voluntarios humanos inmunizados con CBPs, anticuerpos monoclonales (mAbs) resultantes de hibridomas derivados de fusiones de células B de animales CBP-inmunizados o seres humanos con líneas celulares de miolema compatible, denominadas mAbs "inmunizadas" resultantes de la expresión de fusiones génicas de regiones determinantes combinatoriales de genes que codifican mAb a partir de especies heterólogas con genes que codifican anticuerpos humanos, o fracciones de plasma de donantes humanos que contienen anticuerpo CBP-reactivo. Se considera que se puede utilizar cualquiera de las técnicas descritas anteriormente para la vacunación de pacientes con vistas a la producción de anticuerpos. La dosificación óptima de dichos anticuerpos depende en gran medida de la fármaco - cinética de la población de anticuerpos específicos en las especies particulares que se van a tratar. Se considera que la duración de dosificación que mantiene niveles anti-CBP, en estas concentraciones de anticuerpos inhibitorios, será por lo menos de 4 a 8 semanas tras la presunta exposición a S. aureus o mientras duren los síntomas de la enfermedad y durante por lo menos 4 a 8 semanas después de que cesen estos síntomas.

Utilizando los antígenos peptídicos descritos aquí, la presente invención también proporciona métodos para generar una respuesta inmunológica, métodos que suelen comprender la administración a un animal, de una composición farmacéuticamente aceptable, que contiene una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición peptídica de CBP. Los animales preferidos son los mamíferos y en particular los seres humanos. Otros animales preferidos pueden ser murinos, bovinos, equinos, porcinos, caninos y felinos. La composición puede incluir epítopos peptídicos CBP, parcial o notablemente purificados, obtenidos de fuentes naturales o recombinantes, proteínas o péptidos que se pueden obtener naturalmente o sintetizar químicamente o producirse alternativamente in vitro a partir de células huéspedes recombinantes que expresan segmentos de ADN que codifican dichos epítopos. Se suelen preferir péptidos más pequeños que incluyen epítopos reactivos, tales como los que tienen de aproximadamente 10 a 50, e incluso de 50 a 100 aminoácidos de longitud aproximadamente. Las proteínas o péptidos antigénicos pueden combinarse también con otros agentes como composiciones de ácido nucléico o péptido, si se desea.

El término "cantidad inmunológicamente eficaz" significa una cantidad de composición peptídica capaz de generar una respuesta inmunológica en el animal receptor. Esto incluye la generación de una respuesta de anticuerpo (respuesta de célula B) y/o la estimulación de una respuesta inmunológica citotóxica (respuesta célula T). La generación de una respuesta inmunológica de este tipo tendrá utilidad tanto en la producción de biorreactivos útiles, por ejemplo CTLs y, más particularmente anticuerpos reactivos que se utilizan en realizaciones diagnósticas, como en diversas realizaciones profilácticas o terapéuticas. Por consiguiente, aunque estos métodos para la estimulación de una respuesta inmunológica comprenden regímenes de vacunación diseñados para evitar o reducir infecciones notables causadas por bacterias que expresan una CBP, y regímenes de tratamiento que pueden reducir la gravedad o la duración de una infección, se entenderá que el lograr cualquiera de estos objetivos no es necesario para practicar estos aspectos de la invención. Dichos métodos de tratamiento se pueden utilizar en particular para el tratamiento de infecciones causadas por patógenos como S. aureus, especies afines y otras bacterias que expresan CBPs y se adhieren a Col.

Otros medios contemplados por los inventores para generar una respuesta inmunológica en un animal son la administración al animal o al paciente humano, de una composición farmacéuticamente aceptable que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de una composición de ácido nucléico que codifica un epítopo de CBP, o una cantidad inmunológicamente eficaz de un organismo vivo atenuado que incluye y expresa dicha composición de ácido nucléico. Las "cantidades inmunológicamente eficaces" son aquellas cantidades capaces de estimular una respuesta de célula B y/o célula T.

Las inmuno - formulaciones de esta invención, ya sea para la vacunación, el tratamiento o para la generación de anticuerpos útiles en la detección de S. aureus y bacterias relacionadas, la prevención de la adhesión bacteriana o en el caso de colonización bacteriana, la promoción de la adhesión bacteriana a componentes ECM tales como Col, pueden comprender fragmentos peptídicos antigénicos nativos o sintéticamente derivados de estas proteínas. Como tales, los equivalentes antigénicos funcionales de las proteínas y péptidos aquí descritos también caen dentro del ámbito de la presente invención. Una proteína o péptido "equivalente antigénicamente funcional" es una que incorpora un epítopo con reacción cruzada inmonológicamente con uno o más epítopos derivados de cualquiera de las proteínas MSCRAMM particulares descritas (por ejemplo CBPs) y particularmente la CBP de S. aureus. Los equivalentes antigénicamente funcionales o secuencias epitópicas pueden diseñarse primero o predecirse y luego comprobarse o se puede comprobar simplemente y de forma directa la reactividad cruzada.

En otras realizaciones, la presente invención se refiere a métodos de inmunodetección y kits asociados. Se contempla la posibilidad de utilizar las proteínas o péptidos de la invención para detectar anticuerpos que tienen reactividad con los mismos, o alternativamente, se pueden utilizar anticuerpos preparados de acuerdo con la presente invención para detectar CBP o péptidos. Se puede utilizar cualquier tipo de kit en la inmunodetección de compuestos, presentes dentro de muestras clínicas, indicativas de infecciones causadas por bacterias gram positivas que expresan una CBP, y en particular S. aureus. Los kits también se pueden utilizar en purificación antigénica o de anticuerpo, según convenga.

En general, los métodos de inmunodetección preferidos incluirán primero la obtención de una muestra sospechosa de contener un anticuerpo CBP- reactivo, como una muestra biológica de un paciente, y poner en contacto la muestra con una primera CBP o péptido en condiciones eficaces para permitir la formación de un inmunocomplejo (complejo inmunológico primario). Se detecta entonces la presencia de los posibles inmunocomplejos primarios que se han formado.

El poner en contacto la muestra elegida con la CBP o el péptido en condiciones eficaces para permitir la formación de inmunocomplejos (primario) suele ser cuestión de añadir simplemente a la muestra la composición de proteína o péptido. Se incuba entonces la mezcla durante un período de tiempo suficiente para permitir que los antígenos añadidos formen inmunocomplejos con, es decir que interactúen con cualquier anticuerpo presente dentro de la muestra. Después de este tiempo, la composición de la muestra, como una sección de tejido, placa ELISA, hibridación puntual o transferencia western, se lavará por lo general para eliminar cualquier especie antígena no específicamente ligada, permitiendo detectar únicamente aquellas especies específicamente ligadas dentro de los inmunocomplejos.

La detección de la formación de inmunocomplejos es bien conocida en el estado de la técnica y se puede lograr aplicando varios métodos conocidos por el experto en la materia y descritos en diversas publicaciones, tales como por ejemplo Nakamura et al., (1987), que se incorporan aquí a modo de referencia. La detección de inmunocomplejos primarios se basa por lo general en la detección de un rótulo o marcador, como un rótulo radioactivo, fluorescente, biológico o enzimático, con etiquetas enzimáticas tales como fosfatasa alcalina, ureasa, peroxidasa de rábano picante y glucosa oxidasa. El antígeno particular empleado puede estar a su vez vinculado con un rótulo detectable, en el que se pueda detectar sencillamente este rótulo, permitiendo de este modo determinar la cantidad de antígeno ligado presente en la composición.

Alternativamente, se pueden detectar los inmunocomplejos primarios por medio de un segundo ligando de fijación acoplado a un rótulo detectable y que tiene afinidad de fijación para la primera proteína o péptido. El segundo ligando de fijación suele ser él mismo un anticuerpo, que se puede denominar por lo tanto anticuerpo "secundario". Los inmunocomplejos primarios se ponen en contacto con el ligando de fijación secundario rotulado, o anticuerpo, en condiciones eficaces y durante un período de tiempo suficiente para permitir la formación de inmunocomplejos secundarios. Los inmunocomplejos secundarios se suelen lavar entonces para eliminar cualquier anticuerpo secundario rotulado no específicamente ligado, detectándose entonces el rótulo ligado restante.

Para fines diagnósticos, se propone la posibilidad de utilizar virtualmente cualquier muestra sospechosa de contener los anticuerpos en cuestión. Como ejemplos de muestras se pueden citar muestras clínicas obtenidas de un paciente como muestras de sangre o de suero, fluido bronco alveolar, algodones de oído, muestras de esputo, fluido del oído medio o incluso quizás muestras de orina. Esto permite el diagnóstico de infecciones causadas por la bacteria gram positiva y en particular S. aureus. Además, se piensa que dichas realizaciones pueden utilizarse en muestras no clínicas, como en la valoración de muestras de anticuerpos, en la selección de hibridomas, la detección de anticuerpos anti-CBP, en una muestra, la purificación de CBPs y el evitar que la bacteria se adhiera a Col y similares. Alternativamente, las muestras clínicas pueden ser de fuentes veterinarias y pueden incluir animales domésticos como ganado, ovejas y cabras. También se pueden utilizar muestras procedentes de felinos, caninos y equinos de acuerdo con los métodos aquí descritos.

En realizaciones afines, la presente invención contempla la preparación de kits que se pueden utilizar para detectar la presencia de anticuerpos CBP- específicos en una muestra. Hablando en general, los kits según la presente invención incluirán una proteína o péptido adecuado junto con un reactivo de inmunodetección y un medio para contener la proteína o péptido y el reactivo.

El reactivo de inmunodetección comprenderá por lo general un rótulo asociado con una CBP o péptido, o asociado con un ligando de fijación secundario. Como ejemplos de ligandos se puede citar un anticuerpo secundario dirigido contra la primera CBP o péptido o anticuerpo, o un ligando de biotina o avidina (o estreptavidina) que tiene un rótulo asociado. También se contemplan rótulos detectables ligados anticuerpos que tienen afinidad de fijación para un anticuerpo humano, por ejemplo para protocolos en los que el primer reactivo es un péptido CBP que se utiliza para fijar a un anticuerpo reactivo de una muestra humana. Por supuesto, según se ha indicado anteriormente, se conoce en el estado de la técnica cierto número de ejemplos de rótulos, y se pueden emplear todos estos rótulos en conexión con la presente invención. Los kits pueden contener conjugados de rótulo antígeno o anticuerpo en forma enteramente conjugada, en forma de intermedios o como mitades separadas a conjugar por el usuario del kit.

El dispositivo contenedor comprenderá por lo general por lo menos un vial, un tubo de prueba, un frasco, una botella, jeringa o cualquier otro contenedor en el que se puede colocar el antígeno, y de preferencia asignar adecuadamente. Cuando se obtenga un segundo ligando de fijación, el kit también contendrá por lo general un segundo vial u otro contenedor en el que se puede colocar este ligando o anticuerpo. Los kits de la presente invención incluirán también por lo general un dispositivo para contener los viales herméticamente cerrados para la venta comercial como por ejemplo contenedores de plástico de inyección o de moldeado por soplado en los cuales se retienen los viales deseados.

2.5. Métodos para inhibir la adhesión bacteriana al col

Además, la CBP resulta útil como agente para bloquear la adherencia de S. aureus al Col. En una realización preferida de la invención, se administra una dosis terapéuticamente eficaz de un epítopo derivado de CBP a un paciente para evitar bloquear la adhesión de S. aureus a los tejidos del huésped, utilizando métodos convencionales. La composición de CBP se administra de preferencia de forma sistemática (es decir por vía oral, intravenosa, y/o parenteral, aunque también puede aplicarse de forma tópica, por ejemplo en una zona localizada del tejido, herida, lesión o cualquier otro lugar en el que se desea evitar la adhesión de S. aureus. El término "dosis terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de composición de CBP que resulta suficiente para disminuir o evitar la adherencia de S. aureus a un sujeto o neutralizar los efectos negativos conocidos de la infección por S. aureus. Esta dosis se puede determinar fácilmente utilizando métodos clínicos, diagnósticos y farmacológicos conocidos. Si la bacteria no se adhiere a los tejidos, se suprimen los efectos inductores de la enfermedad producidos por el microorganismo y por consiguiente la CBP de la invención resulta útil como agente terapéutico para evitar la adhesión de S. aureus y por lo tanto disminuir o evitar la patología inducida por este microorganismo.

2.6. Métodos para identificar los inhibidores de la fijación de col a CBPs

En una realización preferida, los polipéptidos recombinantes nuevos de la presente descripción se utilizan en métodos para aislar, identificar y caracterizar composiciones que inhiben la fijación de Col a CBPs. Estos inhibidores resultan útiles para evitar la adhesión bacteriana a matrices extracelulares que contienen Col. Estos inhibidores ofrecen una estrategia no-antibiótica para evitar la infección bacteriana en un animal, particularmente mediante la inhibición de la fijación de Col a proteínas situadas en la superficie de una célula bacteriana. En particular, los inventores contemplan la utilización de CBP y péptidos derivados de CBP para definir e investigar inhibidores de moléculas pequeñas. Una utilidad particular de estos inhibidores es el hecho de que evitan la adhesión bacteriana a tejidos colágenos expuestos o a Col que se acumula en articulaciones artificiales, implantes médicos y otros dispositivos quirúrgicos que pueden ser susceptibles de revestimiento por Col y ulterior adherencia bacteriana a las superficies revestidas con Col. Asimismo, la disponibilidad de la estructura cristalina de la CBP también permite ahora por vez primera diseñar péptidos miméticos que pueden servir también para inhibir la fijación de CBP a Col.

2.7. Realizaciones de hibridación

Además de su utilización para dirigir la expresión de CBP y péptidos epitópicos derivados de CBP, las secuencias de ácido nucléico aquí descritas también tienen toda una serie de usos diferentes. Por ejemplo, resultan también útiles como sondas o iniciadores en realizaciones de hibridación de ácido nucléico. Como tales, se consideran que tendrán una utilidad particular los segmentos de ácido nucléico que comprenden una región de la secuencia que consiste en por lo menos una secuencia contigua de 14 nucleótidos de longitud, que tiene la misma secuencia que, o es complementaria a, una secuencia contigua larga de 14 nucleótidos de cualquiera de las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5. También resultarán útiles en ciertas realizaciones, secuencias complementarias o idénticas contiguas más largas, por ejemplo las que tienen aproximadamente 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 (inclusive todas las longitudes intermedias) e incluso hasta secuencias de longitud completa.

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La aptitud de estas sondas de ácido nucléico para hibridar específicamente a secuencias codificadoras de CBP les permitirá ser útiles en la detección de la presencia de secuencias complementarias en una muestra dada. No obstante, se preven otros usos, inclusive la utilización de la información de la secuencia para la preparación de iniciadores de especies mutantes, o iniciadores que se utilizan en la preparación de otras construcciones genéticas.

Se consideran particularmente como sondas de hibridación que se utilizan por ejemplo en la transferencia Southern o Northern las moléculas de ácido nucléico que tienen regiones de secuencias que consisten en tramos de nucleotídos contiguos de 10-14, 15-20, 30-50 o incluso de 100-200 nucleótidos más o menos, idénticos, complementarios a las secuencias SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5. Esto permitiría también analizar los genes regulatorios o estructurales de CBP en diversos tipos celulares así como también en diversas células bacterianas. El tamaño total del fragmento, así como el tamaño del o de los tramos complementarios dependerá en última instancia del uso previsto o de la aplicación del segmento de ácido nucléico particular. Se utilizarán en general fragmentos más pequeños en realizaciones de hibridación, en las cuales la longitud de la región complementaria contigua puede variar, por ejemplo entre aproximadamente 14 y 100 nucleótidos, aunque se pueden utilizar tramos complementarios más grandes, según la longitud de las secuencias complementarias de longitud que se desea detectar.

La utilización de una sonda de hibridación de aproximadamente 14-25 nucleótidos de longitud permite la formación de una molécula dúplex que es estable y selectiva. Las moléculas que tienen secuencias complementarias contiguas en tramos superiores a 14 bases de longitud son las que se suelen preferir con el objeto de aumentar la estabilidad y la selectividad del híbrido y de este modo mejorar la calidad y grado de las moléculas híbridas específicas obtenidas. Se preferirá por lo general diseñar moléculas de ácido nucléico que tienen tramos gen-complementarios de 15 a 25 nucleótidos contiguos, o incluso más si se desea.

Se pueden elegir sondas de hibridación de una parte de alguna de las secuencias aquí descritas. Todo lo que se necesita es revisar la secuencia que aparece en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5 y elegir cualquier parte continua de la secuencia, desde aproximadamente 14-25 nucleótidos de longitud hasta la secuencia de longitud completa inclusive, que se desea utilizar como sonda o iniciador. La elección de las secuencias de sonda e iniciador puede depender de varios factores, como, a modo de ejemplo solamente, el que se desee utilizar iniciadores hacia los términos de la secuencia total.

El proceso de selección y preparación de un segmento de ácido nucléico que incluye una secuencia contigua de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5, se puede describir alternativamente como la preparación de un fragmento de ácido nucléico. Se pueden obtener también fragmentos, por supuesto, utilizando otras técnicas, como por ejemplo cizallamiento técnico o por digestión de enzima de restricción. Se pueden preparar fácilmente pequeños segmentos o fragmentos de ácido nucléico sintetizando por ejemplo directamente el fragmento por medios químicos, tal como se suele practicar utilizando un sintetizador de oligonucleótido automatizado. También se pueden obtener fragmentos mediante la aplicación de una tecnología de reproducción de ácido nucléico, como la tecnología PCR™ de la patente US 4.683.202 (que se incorpora aquí a modo de referencia), introduciendo secuencias seleccionadas en vectores recombinantes para la producción de recombinante y mediante otras técnicas de ADN recombinante que suelen conocer bien los expertos en biología molecular.

Por consiguiente, las secuencias de nucleotídos de la descripción se pueden utilizar por su aptitud para formar selectivamente moléculas dúplex con tramos complementarios de todo el gen cna o de fragmentos de gen. Según la aplicación prevista, se deseará utilizar condiciones variables de hibridación para lograr grados variables de selectividad de sonda respecto de la secuencia - blanco. Para las aplicaciones que requieren alta selectividad, se deseará utilizar por lo general condiciones relativamente rigurosas para formar los híbridos, se elegirá por ejemplo condiciones de temperatura relativamente elevadas y/o de sal relativamente bajas como las que se obtienen con aproximadamente 0,02 M a 0,15 M NaCl a temperaturas de 50ºC a 70ºC. Estas condiciones selectivas toleran poco desequilibrio, si acaso, entre la sonda y la plantilla o la cadena blanco y resultarían particularmente adecuadas para aislar genes de CBP.

Por supuesto, en algunas aplicaciones por ejemplo, si se desea preparar mutantes utilizando la cadena de iniciador mutante hibridada a una plantilla subyacente o si se intenta aislar secuencias de codificación de CBP de especies afines, equivalentes funcionales o similares, se necesitarán por lo general condiciones de hibridación menos rigurosas para permitir la formación del heteroduplex. En estas circunstancias, se puede desear utilizar condiciones como aproximadamente 0,15 M a 0,9 M de sal, a temperaturas que oscilan entre 20ºC y 55ºC. De este modo, se pueden identificar fácilmente especies de hibridación cruzada como señales de hibridación positiva con respecto a las hibridaciones de control. En cualquier caso, se aprecia por lo general el hecho de que se pueda hacer que las condiciones sean más rigurosas añadiendo cantidades crecientes de formamida, que sirven para desestabilizar el dúplex híbrido de la misma forma que el aumento de temperatura. Por consiguiente, se pueden manipular fácilmente las condiciones de hibridación y ese será por lo general el método que se utilice según el resultado deseado.

En ciertas realizaciones, resultará ventajoso utilizar secuencias de ácido nucléico de la presente descripción en combinación con un medio adecuado, como un rótulo, para determinar la hibridación. Se conoce en el estado de la técnica una amplia variedad de medios indicadores adecuados, como medios fluorescentes, radiactivos, enzimáticos u otros ligandos como avidina/biotina que pueden emitir una señal detectable. En realizaciones preferidas, se deseará posiblemente utilizar una etiqueta fluorescente o un rótulo enzimático como ureasa, fosfatasa alcalina o peroxidasa, en lugar de reactivos radiactivos u otros reactivos no deseables por razones de medio ambiente. En el caso de rótulos enzimáticos, se conocen sustratos indicadores colorimétricos que se pueden utilizar para proporcionar un medio visible al ojo humano o espectrofotométricamente para identificar la hibridación específica con muestras que contienen ácido nucléico complementarias.

En general, se pretende que las sondas de hibridación aquí descritas resulten útiles como reactivos en hibridación de solución así como en realizaciones que utilizan una fase sólida. En realizaciones en las que interviene una fase sólida, el ADN de prueba (o ARN) es absorbido o adherido de alguna otra forma a una matriz o superficie elegida. Este ácido nucléico fijado, de una sola cadena, se somete entonces a hibridación específica con sondas seleccionadas en condiciones deseadas. Las condiciones seleccionadas dependerán de las circunstancias particulares según los criterios particulares requeridos (según por ejemplo el contenido de G+C, el tipo de ácido nucléico blanco, la fuente de ácido nucléico, el tamaño de la sonda de hibridación, etc). Después de lavar la superficie hibridada para eliminar las moléculas de la sonda específicamente ligadas, se detecta la hibridación específica o incluso se cuantifica, mediante la etiqueta.

2.8. Composiciones de anticuerpo

En una realización preferida, la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de CBP a un sujeto induce en el mismo anticuerpos que fijan y neutralizan el S. aureus presente en el sujeto, evitando de este modo los efectos negativos de este microorganismo. Alternativamente, los anticuerpos del epítopo anti - CBP generados en un primer animal huésped proporcionan anticuerpos que se pueden administrar a un segundo sujeto para la inmunización pasiva o el tratamiento contra infección por S. aureus. Estos anticuerpos resultan también útiles como cribado diagnóstico de la presencia de S. aureus en una muestra de prueba, utilizando técnicas de inmuno ensayo convencionales.

En la presente invención, se describen nuevas secuencias de ácido nucléico que codifican CBPs de S. aureus modificadas específicamente según zona. Estas variantes sintéticas se preparan con los métodos aquí descritos, y codifican CBPs que tienen dominios de fijación Col modificados.

En ciertos aspectos, la presente invención se refiere a composiciones de anticuerpos nuevas que inhiben la fijación de Col a la bacteria. En particular, se han desarrollado anticuerpos a epítopos nativos y sintéticamente modificados de CBPs que inhiben la fijación de Col a CBPs tanto in vitro como in vivo. En particular, se han producido proteínas, péptidos y epítopos peptídicos para proporcionar composiciones de vacuna útiles en la prevención de infección bacteriana y composiciones de anticuerpos útiles en la prevención de la fijación de Col a dichos organismos.

En otras realizaciones, la presente invención comprende composiciones de anticuerpos que potencian la fijación de Col a células bacterianas. Estos aspectos ofrecen métodos y composiciones para producir colonización bacteriana de un huésped animal con cepas bacterianas atenuadas o avirulentas que expresan epítopos de CBP de la superficie celular.

En un aspecto, la invención describe un anticuerpo que interactúa con un dominio de CBP de un producto génico bacteriano de cna y particularmente un dominio CBP de un producto génico cna S. aureus. Dicho anticuerpo puede ser monoclonal o, de preferencia, policlonal. En otro aspecto, la invención describe un anticuerpo que inhibe la adhesión bacteriana y la fijación del producto génico al Col.

También se describe un método para detectar una bacteria que expresa una CBP en una muestra. El método comprende por lo general la obtención de una muestra sospechosa de contener una bacteria que expresa dicho tipo de proteína, la puesta en contacto posterior de la muestra con una composición de anticuerpo aquí descrita y la detección de la formación de complejos inmunológicos. En unas realizaciones preferidas, la bacteria es S. aureus, S. dysgalactiae, S. pyogenes, sobre una especie afín de bacteria gram-positiva. Otros aspectos de la descripción comprenden métodos para inhibir la colonización bacteriana y, particularmente la colonización por S. aureus, S. dysgalactiae, S. pyogenes, sobre una especie afín de bacteria gram-positiva en un animal, administrando al mismo un anticuerpo de la presente invención que evita o reduce de forma significativa la fijación de Col a la CBP expresada por la bacteria. La administración de la composición de anticuerpos puede ser profiláctica, antes y/o después del diagnóstico de infección u otros trastornos multisistémicos causados por infección bacteriana, que pueden afectar a la piel, las articulaciones, el corazón y el sistema nervioso central. La administración también se puede realizar en protocolos de inmunización pasiva diseñados para prevenir y/o mejorar las infecciones sistémicas por patógenos susceptibles, y en particular, para mejorar los efectos de infecciones por estreptococos, estafilococos patógenos y bacterias gram - positivas afines.

2.9. Segmentos y vectores de ácido nucléico

La presente descripción comprende proteínas expresadas a partir de genes que codifican una CBP, como la proteína expresada a partir del inserto de ADN de clones recombinantes que comprende CBPs modificadas específicamente según zona de S. aureus. También se incluyen variantes de cepas del gen cna derivadas de S. aureus, que también codifican proteínas capaces de fijar Col, que pueden hibridar a ADN de cna en condiciones de rigurosidad moderada o elevada, o que pueden servir de plantillas para amplificación génica por PCR™ utilizando iniciadores oligonucleótidos derivados de secuencias de ácido nucléico de cna o derivado de cna. Se entenderá que estas variantes pueden comprender genes que contienen codones no idénticos en secuencia nucleótida a los del gen cna de S. aureus que codifican el mismo aminoácido u otro funcionalmente equivalente, como pueden esperar los expertos en la materia, que comprenden la degeneración del código genético. Estas variantes pueden incluir también aquellos genes similares al gen de cna de S. aureus, pero que tienen codones que especifican relativamente pocos aminoácidos diferentes de aquellos de la/las proteínas codificada(s) por S. aureus, o que tienen en cierto modo números mayores o menores de estos codones. Por consiguiente, dichas secuencias incluyen aquellos que tienen entre aproximadamente 60% y 80%, o de preferencia entre 81% y 90% o incluso mejor entre aproximadamente 91% y 99% de aminoácidos idénticos o funcionalmente equivalentes a los de la/las proteínas codificada(s) por cna S. aureus.

También se entiende que las secuencias de aminoácidos y de ácidos nucléicos pueden comprender residuos adicionales, tales como aminoácidos N- o C-terminales adicionales, o secuencias de ácidos nucléicos 5' ó 3', y seguir siendo como las aquí indicadas, siempre que la secuencia cumpla los criterios indicados anteriormente, inclusive la expresión de una proteína de CBP. Estas secuencias adicionales pueden incluir por ejemplo varios promotores transcripcionales, potenciadores o terminadores, diversos péptidos lideres que dirigen la secreción, varias secuencias de aminoácidos que dirigen las modificaciones post - translacionales, aminoácidos o péptidos que pueden facilitar el aislamiento y la purificación de CBP(s) y similares. Como es natural se realizarán alternaciones y adiciones a estas secuencias teniendo en cuenta el tipo de célula, organismo o animal que se elija para la expresión de CBP(s).

2.10. Formulación de vacuna

Se espera que para lograr una "formulación inmunológicamente eficaz" puede ser deseable administrar CBPs al sujeto humano o animal en una composición farmacéuticamente aceptable, que comprende una cantidad inmunológicamente eficaz de CBPs, mezclada con otros excipientes, vehículos o diluyentes que pueden mejorar o alterar de algún otro modo la estimulación de las respuestas de la célula B y/o célula T o sales inmunológicamente inertes, ácidos orgánicos y bases, carbohidratos y similares, que promueven la estabilidad de dichas mezclas. Los excipientes inmuno estimulantes, que reciben frecuentemente el nombre de adyuvantes, pueden comprender sales de aluminio (denominadas en general Alums) ácidos grasos simples o compuestos y compuestos de esterol, aceites fisiológicamente aceptables, carbohidratos poliméricos, toxinas de proteína química o genéticamente modificada y diversas combinaciones en partículas o emulsiones de las mismas. Se espera que las CBPs o péptidos dentro de estas mezclas o cada variante si hay más de una presente, comprendan aproximadamente 0,0001 a 1,0 miligramos, o mejor aproximadamente 0,001 a 0,1 miligramos o incluso mejor menos de 0,1 miligramo por dosis.

También se contempla la posibilidad de diseñar organismos atenuados para expresar productos génicos CBP recombinantes que sean ellos mismos vehículos de administración para la invención. Particularmente preferidas son las especies bacterianas atenuadas como la Mycobacterium, y en particular M. bovis, M. smegmatis o BCG. Alternativamente, también se pueden utilizar virus de la viruela, la polio, adenovirus y otros virus y bacterias, como especies como Salmonella, Shigella, Listeria, Streptococcus conjuntamente con los métodos y composiciones aquí descritos.

La tecnología ADN desnuda, denominada por lo general inmunización genética, ha resultado ser adecuada para la protección contra organismos infecciosos. Se podrían utilizar dichos segmentos de ADN en una variedad de formas, inclusive ADN desnudo y ADN plásmido, y administrarse al sujeto en una variedad de vías, inclusive la parenteral, mucosal y la denominada inoculación a base de microproyectil "gene-gun" (pistola génica). La utilización de composiciones de ácido nucléico cna de la presente invención en estas técnicas de inmunización se propone por lo tanto por considerarla útil como estrategia de vacunación contra infección por estreptococo y estafilococo.

Los expertos en la materia reconocen que un programa óptimo de dosificación de un régimen de vacunación puede incluir de 5 a 6, aunque de preferencia de 3 a 5, o incluso todavía mejor de una a tres administraciones de la entidad de inmunización a intervalos de 2 a 4 semanas hasta 5-10 años, o también incluso a intervalos más largos.

2.11. Vectores y células huéspedes recombinantes

Ciertos aspectos particulares de la descripción se refieren a la utilización de vectores plásmidos para la clonación y expresión de péptidos recombinantes y epítopos peptídicos particulares que comprenden epítopos de zona de fijación de Col CBP nativos o mutados específicamente según zona. La generación de vectores recombinantes, transformación de células huéspedes y la expresión de proteínas recombinantes es algo bien conocido por los expertos en la materia. Se prefieren los huéspedes procarióticos para la expresión de las composiciones peptídicas de la presente invención. Un ejemplo de huésped procariótico preferido es el E. coli y en particular, cepas de E. coli ATCC 69791, BL21(DE3), JM101, XL1-BIue™, RR1, LE392, B, \chi^{1776} (ATCC 31537), y W3110 (F^{-}, \lambda^{-} prototrófico, ATCC 273325). Alternativamente se pueden utilizar otras especies de Enterobacteriaceae tales como Salmonella typhimurium y Serratia marcescens, o incluso otros huéspedes gram - negativos que incluyen diversas especies de pseudomonas en la expresión recombinante de los constructos genéticos aquí descritos.

Se pueden utilizar alternativamente especies de estreptococos y estafilococos para expresar estos constructos, y en particular S. aureus, S. dysgalactiae, y S. pyogenes.

En general, se utilizan en conexión con estos huéspedes vectores plásmidos que contienen secuencias de control y replicación derivadas de especies compatibles con la célula huésped. El vector suele llevar una zona de replicación, así como secuencias de marcación capaces de proporcionar selección fenotípica en células transformadas. Por ejemplo, E. coli se puede transformar generalmente utilizando vectores como pBR322 o cualquiera de sus derivados (Bolivar et al., 1977). pBR322 contiene genes para la resistencia a la ampicilina y la tetraciclina y proporciona por lo tanto un medio fácil para identificar células transformadas. pBR322, sus derivados u otros plásmidos microbianos o bacteriófagos pueden también contener o ser modificados para contener promotores que pueden ser utilizados por el organismo microbiano para la expresión de proteínas endógenas.

Además, se pueden utilizar vectores fagos que contienen secuencias de control y replicon compatibles con el microorganismo huésped como vectores de transformación en conexión con estos huéspedes. Por ejemplo, se puede utilizar un bacteriófago como \lambdaGEM™-11 en la fabricación de un vector recombinante que se puede utilizar para transformar células huéspedes susceptibles tales como E. coli LE392.

Estos promotores que se suelen utilizar por lo general en construcción de ADN recombinante incluyen los sistemas de promotor de \beta-lactamasa (penicilinasa) y lactosa (Chang et al., 1980; Itakura et al., 1977; Goeddel et al., 1979) o el sistema promotor triptófano (trp) (Goeddel et al., 1980). La utilización de promotores microbianos nativos y recombinantes es bien conocida por los expertos en la materia y los detalles relativos a sus secuencias de nucleotídos y metodologías específicas son de dominio publico, lo cual permite a un trabajador especialista construir vectores recombinantes particulares y sistemas de expresión con el objeto de producir composiciones de la presente invención.

Además de la expresión en procariotas, se pueden utilizar también microbios eucarióticos tales como cultivos de levadura junto con los métodos aquí descritos. El Saccharomyces cerevisiae o levadura común de panadero es el microorganismo eucariótico más habitualmente utilizado aunque también se puede emplear otras especies para dichos sistemas de expresión eucariótica. Para la expresión en Saccharomyces, el plásmido YRp7, por ejemplo, se utiliza habitualmente (Stinchcomb et al, 1979; Kingsman et al., 1979, Tschemper et al., 1980). Este plásmido ya contiene el gen trpL que proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de aptitud para crecer en triptófano, por ejemplo ATCC 44076 o PEP4-1 (Jones 1977). La presencia de lesión trpL como característica del genoma de célula huésped de la levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación por crecimiento en ausencia de triptófano.

Como secuencias promotoras adecuadas en vectores de levadura, se pueden citar los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., 1980) u otras enzimas glucolíticas (Hess et al., 1968, Holland et al., 1978), tales como enolasa, gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfo fructo quinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfo glucosa isomerasa y glucoquinasa. En la construcción de plásmidos de expresión adecuados, las secuencias de terminación asociadas con estos genes también son ligadas en el vector de expresión 3' de la secuencia que se desea expresar para proporcionar la poliadenilación del mARN y la terminación. Otros promotores, que tienen la ventaja adicional de transcripción controlada en condiciones de crecimiento, son la región promotora para alcohol dehidrogenasa 2, isocitocromo C, ácido fosfatasa, enzimas degradativas asociadas con metabolismo del nitrógeno y la antes citada gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenasa así como enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Resulta adecuado cualquier vector plásmido que contenga un promotor compatible con la levadura, un origen de replicación y secuencias de terminación.

Además de microorganismos, también se pueden utilizar cultivos de células derivados de organismos multicelulares como huéspedes en la práctica de rutina de los métodos descritos. En principio, cualquiera de estos cultivos celulares se puede trabajar, ya sea cultivo vertebrado o invertebrado. No obstante, existe gran interés por células de vertebrado, y la propagación de células de vertebrados en cultivos (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento de rutina en los últimos años. Como ejemplos de estas líneas de células huéspedes útiles se pueden citar la células VERO y HeLa, líneas celulares de ovario de hámster chino (CHO) y líneas celulares W138, BHK, COS-7, 293 y MDCK. Los vectores de expresión para dichas células suelen incluir (si es necesario) un origen de replicación, un promotor situado frente al gen que se va a expresar, junto con zonas de fijación de ribosoma necesarias, zonas de empalme de ARN, zonas de poliadenilación y secuencias de terminador transcripcional.

Para su utilización en células de mamíferos, las funciones de control sobre los vectores de expresión se suelen obtener por material viral. Por ejemplo, los promotores habitualmente utilizados se derivan de polioma, adenovirus 2 y por lo general Simian virus 40 (SV40). Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 resultan particularmente útiles, ya que ambos se obtienen fácilmente del virus en forma de fragmento que contiene también el origen viral de replicación de SV40 (Fiers et al., 1978). También se pueden utilizar fragmentos de SV40 más pequeños o más grandes, siempre que incluyan la secuencia de aproximadamente 250 bp que se extiende desde la zona Hindlll hacia la zona Bglll situada en el origen viral de replicación. Además, es también posible y a menudo deseable utilizar secuencias de control o promotor normalmente asociadas con la secuencia génica deseada, siempre que dichas secuencias de control sea compatibles con los sistemas de célula huésped.

El origen de replicación se puede obtener ya sea por construcción del vector que incluya un origen exógeno tal como el derivado de SV40 o de otra fuente viral (por ejemplo polioma, adeno, VSV, BPV), o se puede obtener por el mecanismo de replicación cromosonal de la célula huésped. Si el vector está integrado en el cromosoma de la célula huésped, este último resulta muchas veces suficiente.

Se entiende además que algunos de los polipéptidos pueden estar presentes en cantidades por debajo de los límites de detección del procedimiento de tinción de azul brillante Coomassie habitualmente utilizado en el análisis de geles SDS/PAGE, o su presencia puede estar enmascarada por un polipéptido inactivo de Mt similar. Aunque no es necesario para la práctica de rutina de la presente invención, se contempla la posibilidad de utilizar otras técnicas de detección ventajosamente en la visualización de polipéptidos particulares de interés. Las técnicas de base inmunológicas como la transferencia western que utiliza cuerpos rotulados enzimáticamente, radio rotulados o por fluorescencia se consideran como una utilización particular en este sentido. Alternativamente, los péptidos de la presente invención se pueden detectar utilizando anticuerpos de la presente invención en combinación con anticuerpos secundarios que tienen afinidad por dichos anticuerpos primarios. Este anticuerpo secundario puede haberse rotulado enzimáticamente, radiorotulado o alternativamente por fluorescencia u oro coloidal. Los expertos en la materia conocen muy bien los medios utilizados para la rotulación y detección de estas técnicas de anticuerpos secundarios de dos etapas.

3. Breve descripción de las figuras

Las figuras forman parte de la presente especificación y se incluyen para mostrar además ciertos aspectos de la presente invención. La invención se podrá entender mejor con referencia a una o más de estas figuras, en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas que aquí se da.

Figura 1. Diagrama de plegado de CBD (169-318). Las flechas representan cadenas de hojas \beta, los cilindros representan hélices \alpha. Las cadenas A, B, H, D y E forman la hoja \beta I. Las cadenas F, G, C, I y J forman la hoja \beta II. Figura 2. Dos vistas del dominio CBD (169-318) de fijación de Col representado por un diagrama de cinta de estructura secundaria. Las cadenas de las hojas \beta son verdes, las hélices azules, los lazos y tiras doradas. Las cadenas A, B, H, D y E forman la hoja \beta I, las cadenas F, G, C, I y J forman la hoja \beta II. N indica término amino, C indica término carboxi.

Figura 3A. La superficie molecular de Connolly del dominio de fijación de Col, con vista de la hendidura en la hoja \beta I. Los residuos que delimitan la hendidura y forman sus "paredes" están rotulados en amarillo. Otros residuos relevantes están rotulados en magenta. La textura pone de relieve la superficie de residuos de hasta 6\ring{A} de las sondas de Col.

Figura 3B. Un modelo de Col ligado basado en la búsqueda de acoplamiento. Misma vista que la figura 12A con la triple hélice de Col en dorado; únicamente se muestran las cadenas principales.

Figura 4. Una vista estéreo de la zona de fijación de Col sobre la hoja \beta I. Los residuos con elevado efecto mutacional en la fijación de Col están en magenta. Los residuos con un efecto moderado o ninguno están en amarillo. La mayor claridad se muestra en algunos otros residuos en azul verdoso.

4. Descripción de realizaciones ilustrativas

La tecnología aquí descrita se utiliza para desarrollar métodos y composiciones que interfieren específicamente con la adhesión bacteriana y los subsiguientes tejidos huéspedes de colonización, con el resultado de evitar la infección y las enfermedades causadas por bacterias que expresan CBPs sobre la superficie celular. La tecnología de amplia aplicación tiene el potencial de incrementar la eficacia de la terapia antibiótica en muchas situaciones y sustituir la terapia antibiótica en otras muchas aplicaciones. Se espera que la tecnología sea especialmente eficaz en el tratamiento de regímenes de infecciones por estafilococo y estreptococo y como profilaxis rentable, en lo que a costes se refiere, para evitar enfermedades afines. La elucidación de la estructura cristalina de la CBP por parte de los inventores representa un avance monumental en la ciencia médica y particularmente en el sector del diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas al proporcionar información critica necesaria para identificar composiciones que interfieren o bloquean completamente la fijación de Col a las CBPs. Este tipo de inhibidores resulta por lo tanto útil para evitar la adhesión bacteriana a matrices que contienen Col. Los inventores han identificado la zona de fijación del ligando en la CBPs de S. aureus y se ha caracterizado un péptido de 25 aminoácidos que inhibe directamente la fijación de S. aureus al Col de tipo II rotulado ^{125}I. Además, la mutagénesis dirigida a la zona de la CBP ha revelado dos residuos específicos críticos para la actividad de fijación del ligando. La invención ha obtenido por vez primera composiciones nuevas que se utilizan en métodos para identificar inhibidores de la interacción entre Col y la CBP tanto in vitro como in vivo.

4.1. La función de CBP como factor de virulencia

Para determinar la importancia de la adhesina Col como factor de virulencia en artritis séptica inducida por estafilococo, se han construido dos clases de mutantes. En la primera clase de mutantes, el gen de adhesina Col aislado cna, se inactivo en un aislado clínico de S. aureus obtenido de un paciente con osteomielitis. En el segundo tipo de mutante, el gen activo cna se introdujo en una cepa de S. aureus que carecía del gen.

La virulencia de las dos clases de mutantes de S. aureus se compararon con sus cepas madres respectivas utilizando un modelo de murino recientemente desarrollado y caracterizado de artritis séptica (Bremell et al., 1991). En este modelo los ratones presentan signos histopatológicos de artritis que alcanzan su máximo aproximadamente 2-3 semanas después de la inyección, tanto en lo que a intensidad como a extensión de la artritis se refiere, estabilizándose posteriormente. Los signos de artritis clínicamente estimados se correlacionan estrechamente con la evaluación histopatológica (Bremell et al., 1992). Dentro de las cuatro semanas siguientes a la inoculación se producen en aproximadamente el 50% de los ratones lesiones caudales con células inflamatorias que invaden y destruyen tejido óseo o intervertebral. Además, los ratones artríticos suelen presentar una tremenda activación de la célula B policlonal por IL-6 (Bremell et al., 1992).

Los resultados mostraron que los ratones inyectados por vía intravenosa con cepas de S. aureus que expresan la adhesina Col tenían muchas más probabilidades de desarrollar la artritis que los ratones inyectados con las cepas mutantes de S. aureus. Además, los niveles de suero de IgGl e IL-6 se elevaron espectacularmente en ratones inyectados con el aislado clínico CNA^{+} comparado con los ratones inyectados con el mutante salino CNA (Patti et al., 1994). Tomados juntos, estos datos demuestran que la adhesina Col es un factor de virulencia importante en la artritis séptica inducida por estafilococos.

4.2. MSCRAMMs

La adherencia bacteriana a tejido huésped supone la intervención de adhesinas microbianas específicas de superficie, una de cuyas subfamilias se denomina MSCRAMMs (Patti et al., 1994; Patti and Höök, 1994), reconocen específicamente componentes ECM. Muchas bacterias patógenas reconocen específicamente, según se ha podido comprobar, e interactúan con diversos componentes de ECM en una interacción que parece representar un mecanismo de colonización de tejido huésped.

Los MSCRAMMs (en la superficie celular bacteriana) y los ligandos (dentro del tejido huésped) son las moléculas que interactúan a modo de cierre y llave produciéndose la adherencia de la bacteria al huésped. No se requiere un bloqueo completo de la adhesión microbiana para evitar la infección. Sólo es necesario mantener el inoculum bacteriano por debajo de una masa crítica. Se han desarrollado diversas estrategias, que resultan particularmente útiles para combatir las infecciones bacterianas, como la infección por especies de estreptococo y estafilococo, evitando la adhesión bacteriana al sustrato Col, que incluye el ECM de células huéspedes susceptibles. Dichas estrategias resultan ser útiles en el diagnóstico, tratamiento y profilaxis de dichas infecciones.

4.3. Matriz extracelular

La ECM contiene numerosas glucoproteínas y proteoglicanos que, por medio de interacciones intra e Intermoleculares, forman matrices insolubles. La ECM tiene una función estructural en los tejidos, aunque afecta también la fisiología celular del organismo. Quizás las mejores funciones biológicas caracterizadas de la ECM estén relacionadas con su aptitud para servir de sustrato para la adhesión de células de tejido huésped. Este proceso supone la intervención de las integrinas, una familia de receptores de superficie celular heterodiméricos (\alpha/\beta) que reconocen estructuras específicas en muchas de las proteínas de ECM. Es evidente que muchas bacterias también han utilizado la ECM como sustrato para la adhesión. Al igual que muchas células de tejido eucariótico, muchas bacterias han desarrollado diversos mecanismos de adhesión paralelos y esta aparente redundancia puede reflejar la importancia de la adherencia del tejido huésped para la prosperidad de la bacteria.

La adherencia de microbios a diversos componentes de ECM y de la superficie celular ha sido objeto de amplios informes (Abraham et al., 1983; Coburn et al., 1993; Fröman et al., 1984; Isaacs 1994; Maxe et al., Van Nhieu and Isber, 1993). La presente invención ha identificado una nueva MSCRAMM bacteriana que promueve la adhesión bacteriana a Col y otros proteoglicanos estructuralmente similares al Col que se encuentran junto con componentes de ECM como Col.

4.4. Colágeno

Las proteínas colagenosas son el constituyente principal de la ECM (Bornstein and Sage, 1980). La mayoría de los Cols se sintetizan intracelularmente como moléculas precursoras y experimentan amplios procesos post-translacionales antes de la secreción y la incorporación en la ECM u otros tejidos ricos en Col como el cartílago (Ramachandran and Reddi, 1976). Hasta la fecha se han definido más de 18 tipos diferentes de Cols que se categorizan aproximadamente en 5 grupos (Vanderrest and Garrone, 1991). Estos grupos son los siguientes:

1)

Col tipos 1, II, 111, V y XI que participan en fibrillas cuarto - escalonadas;

2)

Col tipos XII, XIV y IX asociados a fibrillas con hélices triples interrumpidas;

3)

Col tipos IV, VIII y X que forman hojas;

4)

Col tipo VI que forma filamentos nudosos, y

5)

Col tipo VII, que forma fibrillas de anclaje.

La red de Col en la piel está compuesta predominantemente por Cols de tipo 1 y III. El Col puede inhibir la transformación de la actividad beta del factor de crecimiento (TGF-\beta) (Yamaguchi et al., 1990) e inactivar el componente complemento Clq (Krumdieck et al., 1992) y ha sido propuesto como agente antiinflamatorio debido a estas interacciones.

4.5. Segmentos de ácido nucléico que codifican CNA

Tal como se utiliza aquí, el término "gen CBP" se usa para referirse a un gen cna o región codificadora de ADN que codifica una proteína, polipéptido o péptido capaz de fijar Col o un componente ECM afín.

La definición de "gen CBP" tal como se utiliza aquí, es la de un gen que híbrida, en condiciones de hibridación relativamente rigurosas (véase por ejemplo Maniatis et al., 1982) a secuencias ADN actualmente conocidas por incluir secuencias génicas que codifican CBP. Se entenderá por supuesto que se puede utilizar uno o más de un gen codificador de CBPs o péptidos en los métodos y composiciones de la invención. Las composiciones de ácido nucléico y los métodos aquí descritos pueden incluir la administración de uno, dos, tres o más genes o segmentos génicos. El número máximo de genes que se puede utilizar queda limitado únicamente por consideraciones prácticas, como el esfuerzo que supone la preparación simultánea de un gran número de constructos génicos o incluso la posibilidad de producir un efecto citotóxico negativo importante.

Cuando se utilizan genes múltiples, se pueden combinar sobre un solo constructor genético bajo el control de uno o más promotores o se pueden preparar como constructos separados de tipo igual o diferente. Por consiguiente, se puede utilizar una combinación casi infinita de genes diferentes y constructos genéticos. Ciertas combinaciones génicas pueden diseñarse o su utilización puede de alguna otra forma tener como resultado, la consecución de efectos sinérgicos en la formación de una respuesta inmunitaria o el desarrollo de anticuerpos a productos génicos codificados por dichos segmentos de ácido nucléico, o la producción de protocolos diagnósticos y de tratamiento para infección por estreptococo o estafilococo, y en particular, infección por S. aureus, S. dysgalactiae, y S. pyogenes. Todas y cada una de estas combinaciones caen dentro del ámbito de la presente invención. Se han descrito por supuesto muchos efectos sinergéticos en la literatura científica, de forma que toda persona experta en la materia podrá identificar fácilmente combinaciones génicas posiblemente sinergéticas o incluso combinaciones de gen-proteína.

Se entenderá también que, si se desea, el segmento nucléico o gen se podría administrar en combinación con otros agentes, como por ejemplo proteínas o polipéptidos o diversos agentes farmacéuticamente activos. Mientras haya material genético que forme parte de la composición, no existe virtualmente ningún límite para otros componentes que se puedan incluir también, debido a que los agentes adicionales no producen un efecto negativo importante al entrar en contacto con las células o tejidos blanco.

4.6. Kits terapéuticos y diagnósticos que comprenden composiciones de CBP

Los kits terapéuticos que comprenden, en contenedores adecuados, una composición de CBP de la presente invención en una formulación farmacéuticamente aceptable representan otro aspecto de la invención. La composición de CBP puede ser CBP nativa, CBP truncada, CBP mutada específicamente según la zona, o epítopos peptídicos codificados de CBP, o, alternativamente anticuerpos que fijan CBP nativa, CBP truncada, CBP mutada específicamente según zona, o epítopos peptídicos codificados de CBP. En otras realizaciones, la composición de CBP puede ser segmentos de ácido nucléico que codifican CBP nativa, CBP truncada, CBP mutada específicamente según zona o epítopos peptídicos codificados de CBP. Estos segmentos de ácido nucléico pueden ser ADN o ARN o pueden ser segmentos de ácido nucléico nativos, recombinantes o mutagenizados.

Los kits pueden comprender un solo contenedor, en el que se encuentra la composición de CBP. El contenedor puede tener en su interior, si se desea, un excipiente estéril farmacéuticamente asociado con la composición de CBP asociada con el mismo y, opcionalmente, una etiqueta detectable o agente formador de imagen. El contenedor puede ser una jeringa, una pipeta o cualquier otro aparato similar con el que se pueda aplicar la composición de CBP a una zona del tejido, lesión cutánea, área de una herida o cualquier otra zona de infección bacteriana. No obstante, el contenedor único puede tener una mezcla seca o liofilizada de composición de CBP que puede necesitar o no humidificación antes de utilizarla.

Alternativamente, los kits de la invención pueden comprender contenedores distintos para cada componente. En estos casos, un contenedor contendrá la composición de CBP ya sea como proteína estéril, solución de ARN o ADN o en forma liofilizada y el otro contenedor incluirá el vehículo, que puede ser o no, a su vez, sólido o en solución estéril o presentarse en forma gelatinosa, líquida o de cualquier otra forma.

Los kits pueden comprender también un segundo o tercer contenedor para un tampón estéril, farmacéutica-
mente aceptable, diluyente o disolvente. Esta solución puede ser necesaria para formular el componente de CBP en una forma más adecuada para su aplicación al cuerpo, por ejemplo como preparación tópica o, alternativa, en forma oral, parenteral o intravenosa. Hay que señalar sin embargo que todos los componentes de un kit se pueden suministrar en forma seca (liofilizada), lo cual permitiría su "humectación" al ponerse en contacto con fluidos corporales. Por lo tanto, la presencia de algún tipo de tampón o disolvente farmacéuticamente aceptable no es un requisito indispensable para los kits de la invención. Los kits pueden comprender también un segundo o tercer contenedor que incluya un agente o composición formadora de imagen detectable, farmacéuticamente acepta-
ble.

El contenedor será por lo general un contenedor de tipo vial, tubo de ensayo, frasco, botella, jeringa u otro contenedor en el que se pongan los componentes del kit. Los componentes pueden también subdividirse en contenedores más pequeños, si se desea. Los kits de la presente invención pueden incluir también un dispositivo para los contenedores individuales cerrado herméticamente para su venta en el comercio, como por ejemplo contenedores de plástico, moldeados por soplado o inyección, en los que se encuentran los viales o jeringas deseadas.

Independientemente del número de contenedores, los kits de la invención pueden comprender también o estar envasados con, un instrumento para ayudar a la colocación de la composición de CBP dentro del cuerpo de un animal. Este tipo de instrumento puede ser una jeringa, pipeta, fórceps o cualquier otro vehículo de administración autorizado par uso médico.

4.7. Cromatografía por afinidad

La cromatografía por afinidad se basa por lo general en el reconocimiento de una proteína por un sustrato, como un ligando o un anticuerpo. El material de la columna se puede sintetizar mediante acoplamiento covalente de una molécula de fijación, como un tinte activado, por ejemplo a una matriz insoluble. Se deja entonces que el material de la columna absorba la sustancia deseada de la solución. A continuación, se modifican las condiciones a otras en las que dicha fijación no se produce y se eluye el sustrato. Los requisitos para una cromatografía por afinidad realizada con éxito son los siguientes:

1)

que la matriz debe absorber específicamente las moléculas que interesan;

2)

que otros contaminantes permanezcan inadsorbidos;

3)

que el ligando debe acoplarse sin alterar su actividad de fijación;

4)

que el ligando debe fijarse de forma suficientemente sólida a la matriz; y

5)

que debe ser posible eluir las moléculas de interés sin destruirlas.

Una realización preferida de la presente invención es un método de cromatografía por afinidad para purificar anticuerpos de soluciones, donde la matriz contiene CBPs o epítopos peptídicos derivados de CBPs, acoplados de forma covalente a una Sepharose CL6B o CL4B. Esta matriz fija directamente los anticuerpos de la presente invención y permite su separación por elusión con un gradiente adecuado como una sal, GuHCl, pH o urea. Otra realización preferida de la presente invención es un método de cromatografía por afinidad para la purificación de CBPs y epítopos peptídicos de solución. En este caso, la matriz puede ser un anticuerpo específico de CBP o alternativamente una composición que tenga afinidad por CBPs. Las composiciones de aminoácidos de la presente invención se ligan por lo tanto directamente, y esto permite su purificación ulterior por elución de la columna con un tampón adecuado según lo descrito anteriormente.

4.8. Métodos de administración de ácido nucleico y transfección de ADN

En ciertas realizaciones, se contempla la posibilidad de utilizar los segmentos de ácido nucléico aquí descritos para transfectar células huéspedes adecuadas. Los expertos en la materia conocen también la tecnología para introducir ADN en las células. Se han descrito 4 métodos generales para administrar un segmento nucléico al interior de unas células:

(1)

métodos químicos (Graham and VanDerEb, 1973);

(2)

métodos físicos como la microinyección (Capecchi, 1980), electroporación (Wong and Neumann, 1982; Fromm et al., 1985) y la pistola génica (Yang et al., 1990);

(3)

vectores virales (Clapp, 1993; Eglitis and Anderson, 1988); y

(4)

mecanismos por medio de receptor (Curiel et al, 1991; Wagner et al., 1992).

4.9. Liposomas y nanocapsulas

También se describe la utilización de liposomas y/o nanocápsulas para la introducción de péptidos particulares o segmentos de ácido nucléico en el interior de células huéspedes. En particular, los péptidos malonil tirosilo y fosfo tirosilo de la presente invención se pueden formular para la administración en solución con DMSO o encapsulado en liposomas.

Dichas formulaciones pueden resultar preferidas para la introducción de formulaciones farmacéuticamente aceptables de los ácidos nucléicos, péptidos y/o anticuerpos aquí descritos. La formación y uso de liposomas es generalmente conocida por los expertos en la materia (por ejemplo véase, Couvreur et al., 1977; 1988 que describe la utilización de liposomas y nanocápsulas en la terapia antibiótica dirigida de infecciones y patologías bacterianas intracelulares). Recientemente se han desarrollado liposomas con estabilidad de suero mejorada y circulación de mitad de tiempo (Gabizon y Papahadjopoulos, 1988; Allen and Choun, 1987).

Se ha utilizado con éxito liposomas con cierto número de tipos de células que son normalmente resistentes a la transfección por otros procedimientos, inclusive las suspensiones de célula T, cultivos hepatocito primario y células PC 12 (Muller et al., 1990). Además, los liposomas quedan libres de las limitaciones de longitud de ADN típicas de los sistemas de administración de base viral. Los liposomas se han utilizado eficazmente para introducir genes, fármacos (Heath and Martín, 1986; Heath et al., 1986; Balazsovits et al., 1989), agentes terapéuticos (Pikul et al., 1987), enzimas (Imaizumi et al., 1990a; 1990b), virus (Faller and Baltimore, 1984) factores de transcripción y efectores alostéricos (Nicolau and Gersonde, 1979) en una variedad de líneas celulares cultivadas y animales. Además, se ha realizado varios "trails" clínicos con éxito para examinar la eficacia de la administración de fármacos mediante liposoma (López-Berestein et la., 1985a, 1985b; Coune, 1988; Sculier et al., 1988). Además, diversos estudios sugieren que la utilización de liposomas no está asociada con respuestas autoinmunes, toxicidad o localización gonadal tras la administración sistémica (Mori and Fukatsu, 1992).

Los liposomas se forman a partir de fosfolípidos que se dispersan en un medio acuoso y forman espontáneamente vesículas bi-capas concéntricas multilaminares (también denominadas vesículas multilaminares (MLVs). Las MLVs suelen tener diámetros de 25 mm a 4 \mum. El tratamiento con ultrasonido de MLVs da como resultado la formación de pequeñas vesículas unilaminares (SUVs) con diámetros que oscilan entre 200 y 500 \ring{A}, que contienen una solución acuosa en el núcleo.

Los liposomas se parecen mucho a membranas celulares y se contempla su utilización en conexión con la presente invención, como vehículos para las composiciones peptídicas. Resultan ampliamente adecuadas ya que tanto las sustancias solubles en agua como en lípido se pueden comprimir, es decir en los espacios acuosos y dentro de la bi-capa misma, respectivamente. Es posible que los liposomas que llevan fármacos se puedan utilizar incluso para la administración específica de zona de agentes activos, modificando selectivamente la formulación liposomal.

Además, de las enseñanzas de Couvreur et al., (1977; 1988), se puede utilizar la información siguiente para generar formulaciones liposomales. Los fosfolípidos pueden formar una variedad de estructuras que no sean liposomas si se dispersan en agua, según la relación molar de lípido/agua. Con relaciones bajas, el liposoma es la estructura preferida. Las características físicas de los liposomas depende del pH, de la resistencia iónica y de la presencia de cationes divalentes. Los liposomas pueden presentar una permeabilidad baja a sustancias iónicas y polares, pero a temperaturas elevadas experimentan una transición de fase que altera notablemente su permeabilidad. La transición de fase supone un cambio de una estructura ordenada, estrechamente comprimida, conocida como estado de gel, hasta una estructura menos ordenada y menos comprimida, conocida como estado fluido. Esto ocurre a una temperatura de transición de fase característica y tiene como resultado un incremento de la permeabilidad a iones, azucares y fármacos.

Además de la temperatura, la exposición a proteínas puede alterar la permeabilidad de las liposomas. Algunas proteínas solubles tales como citocroma c ligan, deforman y penetran en la bi-capa, produciendo de este modo cambios de permeabilidad. El colesterol inhibe esta penetración de proteínas, aparentemente empaquetando los fosfolípidos de forma más comprimida. Se contempla la posibilidad de que las formaciones de liposoma más útiles para administración de antibiótico e inhibidor contengan colesterol. La aptitud de atrapar/bloquear solutos varia según los tipos de liposomas. Por ejemplo, los MLVs resultan moderadamente eficaces para atrapar solutos, pero los SUVs son extremadamente ineficaces. Los SUVs ofrecen sin embargo la ventaja de la homogeneidad y la reproducibilidad en distribución de tamaño y se ofrece una solución intermedia entre tamaño y eficacia de bloqueo mediante grandes vesículas unilaminares (LUVs). Estas se preparan evaporando éter y resultan de tres a cuatro veces más eficaces par bloquear solutos que los MLVs.

Además de las características del liposoma, un determinante importante para el atrapado de compuestos lo constituyen las propiedades físico-químicas del compuesto mismo. Los compuestos polares se atrapan en espacios acuosos y los compuestos no polares interactúan con la bicapa lípida de la vesícula. Los compuestos polares se liberan por permeación o si se rompe la bi-capa pero los compuestos no polares permanecen afiliados con la bicapa, a no ser que disgreguen por temperatura o exposición a lipoproteínas. Ambos tipos muestran unas tasas de salida máxima a la temperatura de transición de fase. Los liposomas interactúan con células por medio de cuatro mecanismos diferentes: endocitosis por células fagocíticas del sistema retículo endotelial como macrófagos y neutrófilos; adsorción a la superficie celular, ya sea por fuerzas hidrófobas o electrostáticas débiles no específicas o por interacciones específicas con componentes de la superficie celular; fusión con la membrana celular de plasma por inserción de la bi-capa lípida del liposoma dentro de la membrana del plasma, con liberación simultánea de contenido liposomal en el citoplasma; y por transferencia de lípidos liposomales a membranas celulares o subcelulares, o viceversa, sin ninguna asociación de los contenidos de liposoma. Suele resultan difícil determinar qué mecanismo es el que está funcionando y más de uno puede estar actuando al mismo tiempo.

El destino y la disposición de liposomas inyectados por vía intravenosa depende de sus propiedades físicas, como tamaño, fluidez y carga superficial. Pueden persistir en tejidos durante horas o días, dependiendo de su composición, y las semi vidas en la sangre oscilan entre algunos minutos y varias horas. Los liposomas mayores, como MLVs y LUVs son absorbidos rápidamente por células fagocíticas del sistema retículo endotelial, pero la fisiología del sistema circulatorio refrena la salida de estas especies grandes en la mayoría de las zonas. Sólo pueden salir en lugares en los que existen grandes aberturas o poros en el endotelio capilar, como las sinusoides del hígado o del bazo. Por consiguiente, estos órganos son la zona predominante de absorción. Por otra parte, los SUVs muestran una distribución de tejido más amplia pero siguen estando secuestrados en gran medida en el hígado y el bazo. Por lo general, este comportamiento in vivo limita el "targeting" potencial de los liposomas únicamente a aquellos órganos y tejidos accesibles a su gran tamaño. Estos órganos pueden ser la sangre, el hígado, el bazo, la médula ósea y los órganos linfoides.

El "targeting" no es por lo general una limitación en los términos de la presente invención. No obstante, si se desea un "targeting" específico, se dispone de métodos para realizarlo. Se pueden utilizar anticuerpos para interactuar con la superficie del liposoma y para dirigir el anticuerpo y su contenido de fármaco a receptores antigénicos específicos situados en una superficie particular de tipo celular. También se pueden utilizar determinantes de carbohidrato (componentes de superficie celular de glicoproteína o glicolípido que desempeñan una función en el reconocimiento célula - célula, interacción y adhesión) como zonas de reconocimiento, ya que tienen potencial para dirigir los liposomas a ciertos tipos particulares de células. Por lo general, se contempla la posibilidad de utilizar inyección intravenosa de preparaciones liposomales aunque también se puede pensar en otras vías de administración. Alternativamente, la invención proporciona formulaciones de nanocápsulas farmacéuticamente aceptables de los péptidos de la presente invención. Las nanocápsulas pueden bloquear por lo general los compuestos de forma estable y reproducible (Henry-Michelland et al., 1987). Para evitar efectos secundarios debido a la sobrecarga polimérica intracelular, estas partículas ultrafinas (de un tamaño aproximado de 0,1 \mum) deberán diseñarse utilizando polímeros que se pueden degradar in vivo. Se contempla la utilización en la presente invención de nanopartículas biodegradables de poli alquil - ciano acrilato que cumplan estos requisitos, y dichas partículas se pueden fabricar fácilmente según lo descrito (Couvreur et al., 1984; 1988).

4.10. Métodos para la preparación de composiciones de anticuerpos

En otro aspecto, la presente invención contempla un anticuerpo inmuno reactivo con un polipéptido de la invención. Según se ha indicado anteriormente, una de las utilizaciones de la CBPs y péptidos epitópicos derivados de CBP según la presente invención es la generación de anticuerpos. Toda referencia a anticuerpos a lo largo de la especificación incluye anticuerpos monoclonales y policlonales completos (mAbs) y partes de los mismos, ya sea solos o conjugados con otras mitades. Las partes de anticuerpo incluyen fragmentos de Fab y F(ab)_{2} y anticuerpos de cadena simple. Los anticuerpos pueden realizarse in vivo en animales de laboratorio adecuados, inmunizando donantes (de preferencia humanos), o in vitro utilizando técnicas de ADN recombinante. En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo policlonal. En el estado de la técnica se conocen bien los dispositivos para preparar y caracterizar anticuerpos (véase por ejemplo Harlow and Lane, 1988).

En suma, un anticuerpo policlonal se prepara inmunizando un animal con un inmunógeno que comprende un polipéptido de la presente invención y recogiendo antisuero de dicho animal inmunizado. Se puede utilizar una amplia gama de especies animales para la producción de antisueros. Por lo general, el animal utilizado para la producción de antisuero es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, una cabra, o un conejillo de indias. Debido al volumen de sangre relativamente elevado de los conejos, se prefiere elegir un conejo para la producción de anticuerpos policlonales.

Los anticuerpos, tanto policlonales como monoclonales, específicos de CBP y epítopos derivados de CBP se pueden preparar utilizando técnicas de inmunización convencionales, que suelen conocer bien los expertos en la materia. Se puede utilizar una composición que contiene epítopos antigénicos de CBPs particulares para inmunizar uno o varios animales experimentales tales como un conejo o un ratón, que procederá entonces a producir anticuerpos específicos contra péptido de CBP. Los antisueros policlonales se pueden obtener, después de dejar tiempo para la generación de anticuerpo, simplemente sangrando al animal y preparando muestras de suero a partir de la sangre completa.

La cantidad de composición inmunógena utilizado en la producción de anticuerpos policlonales varia según la naturaleza del inmunógeno, así como el animal utilizado para la inmunización. Se puede utilizar toda una serie de vías para administrar el inmunógeno (subcutánea, intramuscular, intradérmica, intravenosa e intraperitoneal). La producción de anticuerpos policlonales se puede seguir y controlar recogiendo muestras de sangre del animal inmunizado en diversos puntos tras la inmunización. También se puede dar una segunda inyección de refuerzo. El proceso de refuerzo y valoración se repite hasta obtener un título/valor adecuado. Si se obtiene un nivel deseado de inmunogenicidad, el animal inmunizado se puede sangrar y aislarse el suero y almacenarse y/o el animal se puede utilizar para generar mAbs (más abajo). Una de las características importantes obtenidas por la presente invención es un suero policlonal relativamente homogéneo con respecto a la especificidad de los anticuerpos aquí mencionados.

Por lo general, el antisuero policlonal se deriva de toda una serie de "clones" diferentes, es decir células B de linaje diferente. Los mAbs, en cambio se definen como procedentes de células productoras de anticuerpos con un antecesor de célula B común, de ahí su "mono" clonalidad.

Si se utilizan péptidos como antígenos para producir suero policlonal, se esperaría una variación considerablemente inferior en la naturaleza clonal del suero que si se utilizara un antígeno completo. Lamentablemente, si se presentan fragmentos incompletos de un epítopo, el péptido puede asumir muy bien múltiples conformaciones (y probablemente no nativas). Como resultado de ello, incluso péptidos cortos pueden producir antisuero policlonal con especificidades relativamente plurales, y, lamentablemente, un antisuero que no reacciona o reacciona pobremente con la molécula nativa.

El antisuero policlonal según la presente invención se produce contra péptidos que se ha previsto contienen epítopos intactos, completos. Se cree que estos epítopos son por lo tanto más estables en sentido inmunológico y que expresan un objetivo inmunológico más consistente para el sistema inmunológico. En este modelo, el número de clones potenciales de célula B que responden a este péptido será considerablemente más pequeño y por lo tanto la homogeneidad del suero resultante será más elevada. En diversas realizaciones, la presente invención ofrece antisueros policlonales en los que la clonalidad, es decir el porcentaje de clon que reacciona con el mismo determinante molecular es como mínimo de 80%. Se contempla incluso una clonalidad superior - 90%, 95% o más.

Para obtener mAbs, habrá que inmunizar inicialmente también un animal experimental, de preferencia por lo general un ratón, con una composición que contiene CBP. Tras un período de tiempo suficiente para permitir la generación de anticuerpos, habrá que obtener entonces una población de células de bazo o linfáticas del animal. El bazo o células linfáticas se pueden condensar con líneas celulares, tales como cepas de mieloma humano o de ratón, para producir hibridomas que secretan anticuerpos. Estos hibridomas se pueden aislar para obtener clones individuales que se pueden examinar entonces para averiguar la producción de anticuerpo al péptido deseado.

Tras la inmunización, se quitan y condensan las células del bazo, utilizando un protocolo de fusión standard con células de plasmacitoma para producir hibridomas que secretan mAbs contra CBP. Se identifican hibridomas que producen mAbs para los antígenos elegidos utilizando técnicas standard tales como ELISA y métodos de transferencia western. Se pueden cultivar entonces clones de hibridoma en medio líquido y purificar el sobrenadante del cultivo para proporcionar el mAbs específico de CBP.

Se propone que el mAbs de la presente invención tenga también una aplicación útil en procedimientos inmunoquímicos, tales como los métodos ELISA y de transferencia western, así como otros procedimientos como la inmuno precipitación, métodos inmuno citológicos, etc. que pueden utilizar anticuerpos específicos de CBPs. En particular, se pueden utilizar anticuerpos de CBP en protocolos inmuno absorbentes para purificar CBPs o especies peptídicas derivadas de CBP recombinante o nativo o variantes sintéticas o naturales de los mismos.

Los anticuerpos aquí descritos se pueden utilizar en protocolos de clonación de anticuerpos para obtener cADNs o genes codificadores de CBPs de otras especies u organismos, o para identificar proteínas que tienen una notable homología con CBP. Se pueden utilizar también en estudios de inhibición para analizar los efectos de CBP en células, tejidos o animales completos. Los anticuerpos anti-CBP también serán útiles en estudios de inmuno localización para analizar la distribución de bacterias que expresan CBPs durante la infección celular, por ejemplo, para determinar la distribución celular o específica del tejido de estreptococos y estafilococos en condiciones fisiológicas diferentes. Una aplicación particularmente útil de estos anticuerpos es la purificación de CBPs nativo o recombinante, por ejemplo utilizando una columna de afinidad de anticuerpo. Los expertos en la materia conocerán el funcionamiento de estas técnicas inmunológicas a la vista de la presente descripción.

4.11. Expresión recombinante de CBP

Los clones recombinantes que expresan los segmentos de ácido nucléico cna se pueden utilizar para preparar CBP recombinante purificado (rCBP), antígenos peptídicos derivados de rCBP purificado así como especies de proteína recombinante mutante o variante en cantidades notables. Los antígenos seleccionados y las variantes de los mismos se proponen por tener una notable utilidad en el diagnóstico y el tratamiento de infecciones causadas por S. aureus, S. pyogenes y S. dysgalactiae. Por ejemplo, se propone la posibilidad de utilizar también rCBPs, variantes peptídicos de los mismos y/o anticuerpos contra dichos rCBPs en inmuno ensayos para detectar células de S. aureus, S. pyogenes y S. dysgalactiae o como vacunas o inmuno terapéutica para tratar infecciones por S. aureus, S. pyogenes y S. dysgalactiae, y para evitar la adhesión bacteriana a componentes de ECM tales como Col, de la misma forma que composiciones CBP nativas.

Además, aplicando técnicas como mutagénesis de ADN, la presente invención permite la preparación fácil de las denominas moléculas de "segunda generación" que tienen estructuras proteinicas modificadas o simplificadas. Las proteínas de segunda generación compartirán por lo general una o más propiedades en común con el antígeno de longitud completa, como una secuencia de núcleo epitópico antigénico/inmunogénico particular. Se pueden obtener secuencias epitópicas sobre moléculas relativamente cortas preparadas a partir del conocimiento del péptido, o codificando información de secuencia de ADN, Estas moléculas variantes no solamente derivar de regiones inmunogénicas/antigénicas de la estructura proteínica, sino que adicional o alternativamente pueden incluir uno o más aminoácidos funcionalmente equivalentes elegidos sobre la base de semejanzas o incluso diferencias con respecto a la secuencia natural. Esta es una particularidad deseable en la preparación de anticuerpos de bloqueo que evitan la adhesión bacteriana a Col, según lo aquí descrito.

4.12. Composiciones de anticuerpos y formulaciones de las mismas

En el estado de la técnica se conocen bien los medios utilizados para preparar y caracterizar anticuerpos (véase por ejemplo Harlow and Lane (1988), que se incorpora aquí a modo de referencia). Los métodos para generar mAbs comienzan por lo general en la misma línea que los utilizados para preparar anticuerpos policlonales. En suma, un anticuerpo policlonal se prepara inmunizando un animal con una composición inmunogénica según la presente invención y recogiendo antisuero del animal inmunizado. Se puede utilizar una amplia gama de especies animales para la producción de antisuero. Por lo general el animal utilizado para la producción de antisuero es un conejo, un ratón, una rata, un hámster, un conejillo de indias o una cabra. Debido al volumen de sangre relativamente grande los conejos, se prefiere un conejo para producir anticuerpos policlonales.

Como es bien sabido en el estado de la técnica, una composición determinada puede variar en cuanto a su inmunogenicidad. Por lo general, es necesario por lo tanto reforzar el sistema inmunológico del huésped, lo cual se puede realizar acoplando un inmunógeno peptídico o polipeptídico a un vehículo. Los vehículos preferidos, que constituyen un ejemplo son ``Keyhole limpet hemocyanin (KLH) y albúmina de suero bovino (BSA). También se pueden utilizar como vehículos otras albúminas como ovalbúmina, albúmina de suero de ratón o albúmina de suero de conejo. En el estado de la técnica se conocen bien los medios existentes para conjugar un polipéptido con una proteína portadora, que pueden ser: glutar aldehído, m-maleimido benzoil -N-hidroxi succinimida éster, carbodiimida y bencidina bis-biazoada.

Los mAbs se pueden preparar fácilmente utilizando técnicas bien conocidas tales como las que se ejemplifican en la patente US 4.196.265, que se incorpora aquí a modo de referencia. Por lo general, esta técnica comprende la inmunización de un animal adecuado con una composición inmunógena elegida, por ejemplo una proteína, polipéptido o péptido purificado o parcialmente purificado. La composición de inmunización se administra de forma eficaz para estimular las células que producen anticuerpo. Los roedores como los ratones y las ratas son los animales preferidos, aunque también es posible utilizar células de conejo, oveja o rana. La utilización de ratas puede presentar ciertas ventajas (Goding, 1986) aunque se prefieren los ratones, siendo el preferido el ratón BALB/c que se utiliza con más frecuencia de forma rutinaria y suele dar un porcentaje mayor de fusiones estables.

Tras la inmunización, se seleccionan células somáticas con potencial para producir anticuerpos, especialmente linfocito-B (células B) que se utilizan en el protocolo de generación de mAb. Estas células se pueden obtener de la biopsia de bazo, amígdalas, ganglios linfáticos o de una muestra de sangre periférica. Se prefieren las células de bazo y de sangre periférica, las primeras porque constituyen una fuente rica de células productoras de anticuerpo que se encuentran en el estadio de división de plasmablasto y las ultimas porque la sangre periférica se puede obtener fácilmente. Por lo general, se inmuniza un panel de animales y el bazo del animal con el mayor valor de anticuerpo se quitará, obteniéndose linfocitos de bazo homogenizando el bazo con una jeringa. Por lo general, un bazo de un ratón inmunizado contiene aproximadamente de 5 x 10^{7} a 2 x 10^{8} linfocitos aproximadamente.

Los linfocitos B que producen anticuerpos del animal inmunizado se condensan entonces con células de una célula de mieloma inmortal, generalmente una de la misma especie que el animal que se inmunizó. Las líneas celulares de mieloma adecuadas para utilizar en los procedimientos de fusión de producción de hibridoma son generalmente las que producen no-anticuerpos, tienen una eficacia de fusión elevada y deficiencias enzimáticas que las hace incapaces de crecer en ciertos medios selectivos que soportan el crecimiento únicamente de las células condensadas deseadas (hibridomas).

Se puede utilizar cualquier otro número de células de mieloma, como sabrán los expertos en la materia (Goding, 1986; Campbell, 1984). Por ejemplo, si el animal inmunizado es un ratón, se puede utilizar P3-X63/Ag8, X63-Ag8.653, NS1/1.Ag 4 1, Sp210-Ag14, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 y S194/5XX0 Bul; para las ratas, se puede utilizar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3,, IR983F y 4B210; Y U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 y UC729-6 resultan útiles en conexión con fusiones celulares humanas.

Una célula de mieloma de murino preferida es la línea celular de mieloma NS-1 (también denominada P3-NS-1-Ag4-1), de la que se puede disponer fácilmente en el NIGMS Human Genetic Mutant Cell Repository, solicitando el número de línea celular GM3573. Otra línea celular de mieloma de ratón que se puede utilizar es la línea celular no productora de SP2/0 de mieloma de murino ratón resistente a 8-azaguanina.

Los métodos para generar híbridos de células de ganglio linfático o bazo productor de anticuerpo y células de mieloma suelen comprender la mezcla de células somáticas con células de mieloma en una relación de 2:1, aunque la relación puede variar de 20:1 a 1:1 aproximadamente, respectivamente, en presencia de uno o varios agentes (químico o eléctrico) que promueve la fusión de membranas celulares. Se han descrito métodos de fusión que utilizan virus Sendai (Kohler and Milstein, 1975; 1976) y los que utilizan poli etilen glicol (PEG), como 37% (v/v) PEG de Gefter et al., (1977). También resulta adecuada la utilización de métodos de fusión inducidos eléctricamente (Goding, 1986).

Los procedimientos de fusión suelen producir híbridos viables a frecuencias bajas, de aproximadamente 1 x 10^{-6} a aproximadamente 1 x 10^{-8}. No obstante, esto no plantea ningún problema ya que los híbridos condensados, viables, se diferencian de las células no condensadas, parentales (particularmente las células de mieloma no condensadas que seguirían normalmente dividiéndose de forma indefinida) cultivándolas en un medio selectivo.

El medio selectivo es generalmente el que contiene un agente que bloquea la síntesis de novo de nucleotídos en el medio de cultivo de tejido. Como ejemplos de agentes preferidos se pueden citar la aminopterina, metotrexato y azaserina. La aminopterina y metotrexato bloquean la síntesis de novo tanto de las purinas como de las pirimidinas, mientras que la azaserina solo bloquea la síntesis de la purina. Si se utiliza aminopterina o metotrexato, el medio se suplementa con hipoxantina y timidina como fuente de nucleotídos (medio HAT). Si se utiliza azaserina, el medio se suplementa con hipoxantina.

El medio de selección preferido es HAT. Únicamente las células capaces de realizar senderos de salvamento de nucleótido pueden sobrevivir en medio HAT. Las células de mieloma tienen pocas enzimas claves del sendero de salvamento, por ejemplo hipoxantina fosforibosil transferasa (HPRT) y no pueden sobrevivir. Las células B pueden realizar este sendero, pero tienen una vida limitada en cultivo y por lo general mueren dentro de las dos semanas aproximadamente. Por consiguiente, las únicas células que pueden sobrevivir en el medio selectivo son los híbridos formados por mieloma y células B.

Este cultivo proporciona una población de hibridomas a partir de los cuales se seleccionan hibridomas específicos. Por lo general, la selección de hibridomas se realiza cultivando las células por dilución de clon simple en placas de microvaloración, seguido de test de los sobrenadantes clonales individuales (después de aproximadamente 2 a 3 semanas) para comprobar la reactividad deseada. El ensayo debe ser sencillo y rápido como los radioinmunoensayos, inmunoensayos enzimáticos, ensayos de citotoxicidad, ensayos de placa, ensayos de inmunofijación dot y similares.

Los hibridomas elegidos se diluirán entonces serialmente y se clonarán en líneas celulares productoras de anticuerpo, clones que se pueden propagar entonces indefinidamente para proporcionar mAb. Las líneas celulares se pueden explotar para la producción de mAb de dos formas básicas. Se puede inyectar una muestra del hibridoma (por lo general en la cavidad peritoneal) en un animal histocompatible del tipo que se utilizó para proporcionar las células somáticas y de mieloma para la fusión original. El animal inyectado desarrolla tumores que se secretan el mAb específico producido por el híbrido celular condensado. Los fluidos corporales de animal tales como el suero o fluido ascitis se pueden puncionar (tapped) para proporcionar mAbs en concentración elevada. Las líneas celulares individuales también podían cultivarse in vitro, si los mAbs se secretan naturalmente en el medio de cultivo del cual se pueden obtener fácilmente en concentraciones elevadas. Los mAbs producidos por cualquiera de estos medios se pueden seguir purificando, si se desea, utilizando métodos de filtración, centrifugación y diversos métodos cromatográficos tales como HPLC o cromatografía por afinidad.

4.13 Inmunoensayos

Tal como se ha indicado, se propone la utilización de epítopos peptídicos y péptidos derivados sintéticamente y nativos, de la invención, como inmunógenos, por ejemplo en relación con el desarrollo de vacunas, o como antígenos en inmunoensayos para la detección de anticuerpos reactivos. Con referencia en primer lugar a los inmunoensayos, en su sentido más sencillo y directo, los inmunoensayos preferidos de la invención comprenden los diversos tipos de ensayos de inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISAs), como conocen los expertos en la materia. No obstante, se apreciará fácilmente que la utilidad de péptidos y proteínas derivadas de CBP no se limita a dichos ensayos y que otras realizaciones útiles comprenden RIAs y otros ensayos y procedimientos de fijación de anticuerpos ligados a no enzimas.

En unos ensayos preferidos ELISA, se inmovilizan proteínas o péptidos que incorporan CBP, rCBP o secuencias de antígenos proteínicos derivados de CBP sobre una superficie elegida, de preferencia una superficie que muestra afinidad proteínica, como los pocillos de una placa de microvaloración de poliestireno. Después de lavar para eliminar de forma incompleta el material absorbido, lo que se desea por lo general es fijar o revestir una proteína no específica conocida como antigénicamente neutra con respecto al antisuero de prueba, como la albúmina de suero de bovino (BSA) o la caseína, sobre el pocillo. Esto permite bloquear zonas de adsorción no específicas sobre la superficie de inmovilización y reduce por lo tanto el fondo (background) causado por la fijación no específica de antisuero sobre la superficie.

Después de fijar material antigénico al pocillo, de revestir con un material no reactivo para reducir el fondo, y de lavar para eliminar el material no fijado, la superficie de inmovilización se pone en contacto con el antisuero o extracto clínico o biológico que se va a probar con el objeto de obtener la formación de complejos inmunes (antígeno/anticuerpo). Estas condiciones comprenden de preferencia la dilución del antisuero con diluyentes tales como BSA, gamma globulina bovina (BGG) y salino con tampón de fosfato (PBS)/Tween™. Estos agentes añadidos tienden también a contribuir a la reducción de fondo no específico. Se deja entonces incubar el antisuero aplicado en capa durante por ejemplo dos a cuatro horas, a temperaturas comprendidas de preferencia entre aproximadamente 25º y 27ºC. Tras la incubación, la superficie en contacto con el antisuero se lava con el fin de eliminar el material no inmunocomplejado. Un procedimiento de lavado preferido comprende el lavado con una solución como PBS/Tween™, o tampón de borato.

Tras la formación de inmunocomplejos específicos entre la muestra de prueba y el antígeno fijado, y después de lavar, la ocurrencia y la cantidad de formación de inmunocomplejo se puede determinar sometiendo el complejo a un segundo anticuerpo que tiene especificidad por el primero. Por supuesto, como la muestra de prueba será normalmente de origen humano, el segundo anticuerpo será de preferencia un anticuerpo que tiene especificidad por anticuerpos humanos. Para proporcionar un medio de detección, el segundo anticuerpo tendrá de preferencia un rótulo detectable asociado como un rótulo enzimático, que generará una señal, como coloración tras incubar con un sustrato cromogénico adecuado. Por consiguiente se deseará por ejemplo poner en contacto e incubar la superficie fijada a antisuero con una ureasa o IgG antihumano peroxidasa-conjugado durante un período de tiempo y en condiciones que favorezcan el desarrollo de la formación de inmunocomplejo (por ejemplo incubación durante dos horas a temperatura ambiente en una solución que contiene PBS como PBS-Tween™)

Tras la incubación con el segundo anticuerpo marcado enzimáticamente, y después de lavar para eliminar el material no fijado, se cuantifica la cantidad de rótulo por incubación con un sustrato cromogénico como urea o púrpura de bromocresol o ácido 2,2'-azino-di-(3-etil-benztiazolina)-6-sulfónico (ABTS) y H_{2}O_{2}, en el caso de la peroxidasa como rótulo enzimático. La cuantificación se realiza entonces midiendo el grado de generación de color, por ejemplo utilizando un espectrómetro de espectro visible.

Se puede utilizar ELISA junto con la invención. En uno de estos ensayos ELISA, se inmovilizan proteínas o péptidos que incorporan secuencias antigénicas de la presente invención sobre una superficie elegida, de preferencia una superficie que presenta afinidad proteínica como los pocillos de una placa de microvaloración de poliestireno. Después de lavar para eliminar el material completamente absorbido, es deseable fijar o revestir los pocillos de la placa de ensayo con una proteína no específica conocida como antigénicamente neutra con respecto al antisuero de prueba como albúmina de suero bovino (BSA), caseína o soluciones de leche en polvo. Esto permite bloquear las zonas de adsorción no específicas sobre la superficie de inmovilización y por lo tanto reducir el fondo causado por la fijación no específica de antisuero sobre la superficie.

4.14 Inmunoprecipitación

Los anticuerpos anti-CBP de la presente invención resultan particularmente útiles para aislar antígenos CBP por inmunoprecipitación. La inmunoprecipitación supone la separación del componente antígeno blanco de una mezcla de complejos y se utiliza para discriminar o aislar cantidades min punto de proteína. Para aislar proteínas localizadas en la superficie celular como CBP, deben solubilizarse péptidos de la pared celular bacteriana tratando con enzimas como lisozima, lisostafina o mutanolisina, o alternativamente en micelas detergentes. Se prefieren las sales no iónicas, ya que otros agentes como sales biliares precipitan con pH ácido o en presencia de cationes bivalentes.

En una realización alternativa, los anticuerpos de la presente invención resultan útiles para la estrecha yuxtaposición de dos antígenos. Esto resulta particularmente útil para aumentar la concentración localizada de antígenos, por ejemplo pares substrato - enzima.

En una realización afín, resultan útiles los anticuerpos de la presente invención para promover la fijación de Col a productos génicos cna. Dicha fijación se mide fácilmente controlando y siguiendo la fijación de ligando utilizando procedimientos bien conocidos. La detección de la fijación se puede realizar utilizando anticuerpos rotulados radiactivamente o alternativamente Col rotulado radiactivamente. Alternativamente los expertos en la materia conocen bien los ensayos que utilizan anticuerpos rotulados con biotina (según lo descrito por Bayer and Wilchek, 1980).

4.15. Transferencias western

Las composiciones de la presente invención hallarán una gran utilización en el análisis de transferencia western o inmunotransferencia. Los anticuerpos anti-CBP se pueden utilizar como reactivos primarios de gran afinidad para la identificación de proteínas inmovilizadas sobre una matriz de soporte sólida, como nitrocelulosa, nylon o combinaciones de los mismos. Junto con la inmunoprecipitación, seguida de electrofóresis de gel, se pueden utilizar como reactivo de una sola etapa para la detección de antígenos contra los cuales los reactivos secundarios utilizados en la detección del antígeno causan un fondo (background) adverso. Esto resulta particularmente útil cuando los antígenos estudiados son inmunoglobulinas (excluyendo la utilización de inmunoglobulinas que fijan componentes de la pared celular bacteriana), los antígenos estudiados interaccionan con el agente detector o migran con el mismo peso molecular relativo como señal interactuante. Los métodos de detección con base inmunológica unidos a los de transferencia western (inclusive anticuerpos secundarios marcados enzimáticamente, con radiorótulo o fluorescencia contra la mitad toxina) se consideran de particular utilidad en este sentido.

4.16. Vacunas

La presente invención contempla unas vacunas que se utilizan en realizaciones de inmunización tanto activas como pasivas. Las composiciones inmunogénicas propuestas como adecuados para utilizar como vacuna se pueden preparar muy fácilmente directamente a partir de las proteínas inmunogénicas nuevas y/o los epítopos peptídicos aquí descritos. De preferencia, el material antigénico se dializa ampliamente para eliminar las moléculas de pequeño peso molecular no deseadas y/o se liofiliza para una formulación más fácil en el vehículo deseado.

La preparación de vacunas que contienen secuencias peptídicas como ingredientes activos es algo generalmente bien comprendido en el estado de la técnica, pudiéndose citar a modo de ejemplo las patentes US 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792 y 4.578.770. Por lo general, estas vacunas se preparan como inyectables ya sea como soluciones o suspensiones líquidas, y también se pueden utilizar formas sólidas adecuadas para solución, o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar. El ingrediente inmunogénico activo se suele mezclar con excipientes farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Como excipientes adecuados se pueden citar por ejemplo el agua, salino, dextrosa, glicerol, etanol o similares o combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancia auxiliares como agentes humectantes o emulsionantes, agentes tampón de pH o adyuvantes que potencian la eficacia de las vacunas.

También se puede tomar como base para vacunas humanas una composición que comprenda CBP o proteínas derivadas de CBP y/o péptidos epitópicos nativos o modificados de las mismas. La preparación de dichas composiciones, prácticamente libres de endotoxina, se puede realizar siguiendo la metodología publicada, por ejemplo en la patente US 4.271.147 (que se incorpora aquí a modo de referencia) que describe métodos para la preparación de proteínas de membrana de Neisseria meningitidis que se utiliza en vacunas.

Las vacunas de CBP y a base de epítopos derivados de CBP se pueden administrar convencionalmente de forma parenteral, por inyección, por ejemplo subcutánea o intramuscular. Otras formulaciones que resultan adecuadas para otros modos de administración son los supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. En el caso de supositorios, los ligantes y vehículos tradicionales pueden incluir por ejemplo polialcalen glicoles o triglicéridos. Estos supositorios pueden estar formados a base de mezclas que contienen el ingrediente activo del orden de 0,5% a 10%, de preferencia 1-2%. Las formulaciones orales comprenden los excipientes normalmente utilizados como por ejemplo calidades farmacéuticas de mannitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio y similares. Estas composiciones adoptan la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, cápsulas, formulaciones de liberación sostenida o polvos y contienen 10-95% de ingrediente activo, de preferencia 25-70%.

Las proteínas se pueden formular en la vacuna como formas neutrales o salinas. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres del péptido) y las formadas con ácidos inorgánicos tales como por ejemplo ácido clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos como ácido acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libre pueden derivarse también de bases inorgánicas tales como por ejemplo sodio, potasio, amino, calcio o hidróxidos férricos y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína y similares.

Las vacunas se pueden administrar de forma compatible con la formulación de dosificación y en cantidades terapéuticamente eficaces e inmunogénicas. La cantidad a administrar depende del paciente a tratar, e incluye por ejemplo la capacidad del sistema inmunológico del individuo para sintetizar anticuerpos y el grado de protección deseado. Los expertos en la materia podrán determinar fácilmente las cantidades precisas de ingrediente activo que se tiene que administrar. No obstante, las dosificaciones adecuadas son del orden de varios centenares de microgramos de ingrediente activo por vacunación. Los regímenes adecuados para la administración inicial y la revacunación son también variables aunque se tipifican por medio de una administración inicial seguida de inoculaciones subsiguientes u otras administraciones.

La forma de aplicación puede variar ampliamente. Se puede aplicar cualquiera de los métodos convencionales de administración de vacunas. Se creen que comprenden la aplicación oral sobre una base sólida fisiológicamente aceptable o en una dispersión fisiológicamente aceptable, de forma parenteral, por inyección o similar. La dosificación de la vacuna dependerá de la vía de administración y variará según el tamaño del huésped.

Entre los diversos métodos para lograr el efecto adyuvante para la vacuna se encuentra la utilización de agentes como hidróxido o fosfato de aluminio (alum) que se utilizan habitualmente como solución al 0,05 - 0,1% en salino con tampón de fosfato, mezclado con polímeros sintéticos de azúcar (Carbopol®) utilizados como solución al 0,25%, adición de la proteína en la vacuna por tratamiento térmico con temperaturas que oscilan entre aproximadamente 70ºC y 101ºC durante períodos de 30 segundos a 2 minutos respectivamente. También puede utilizarse la agregación por reactivación con anticuerpos tratados con pepsina F(ab) albúmina, mezcla con células bacterianas tales como C. parvum o endotoxinas o componentes de lipopolisacáridos de bacterias gram-negativas, emulsión en vehículos de aceite fisiológicamente aceptables como monooleato mannido (Aracel-A™) o emulsión con 20% de solución de un perfluorcarbono (Fluosol-DA™) utilizado como sustituto de bloque.

En muchos casos, será deseable tener múltiples administraciones de la vacuna, por lo general no más de seis vacunas, todavía no más general no más de cuatro vacunas y de preferencia una o más, por lo general por lo menos unas tres vacunas. Las vacunas se harán por lo general a intervalos de 2 a 12 semanas, todavía mejor de 3 a 4 semanas. Serán deseables revacunaciones periódicas a intervalos de 1-5 años, por lo general 3 años, para mantener niveles protectores de los anticuerpos. El curso de la inmunización se puede seguir mediante ensayos de anticuerpos para los antígenos sobrenadantes. Los ensayos se pueden realizar rotulando con etiquetas convencionales tales como radionúclidos, enzimas, fluorescentes y similares. Estas técnicas son bien conocidas y se pueden encontrar en una gran variedad de patentes como las patentes US 3.791932; 4.174.384 y 3.949.064 (cada una de las cuales se incorpora aquí específicamente a modo de referencia, como ilustración de estos tipos de ensayos).

Se entenderá, por supuesto, a la luz de la nueva tecnología de vacunación ADN, que virtualmente todos estos regímenes de vacunación resultarán adecuados para ser utilizados con vectores y constructos ADN según lo descrito (Ulmer et al., 1993; Tang et al., 1992; Cox et al., 1993; Fynan et al., 1993; Wang et al., 1993; Whitton et al., 1993, que se incorporan aquí a modo de referencia). Además de las vías parenterales de inoculación de ADN, inclusive inyecciones intramusculares e intravenosas, se contempla también la posibilidad de vacunación mucosal que se puede realizar administrando gotas de composiciones de ADN a las fosas nasales o la traquea. Se contempla particularmente la posibilidad de utilizar una pistola génica para administrar una cantidad eficazmente inmunizadora de ADN a la epidermis (Fynan et al., 1993). La presente invención contempla vacunas que se utilizan tanto en las realizaciones de inmunización activa como pasiva. Las composiciones inmunogénicas propuestas por considerarlas adecuadas para utilizar como vacunas se pueden preparar muy fácilmente directamente a partir de péptidos inmunogénicos preparados en la forma aquí descrita. De preferencia, el material antigénico se dializa a fondo para eliminar las moléculas de pequeño peso molecular no deseadas y/o se liofilizan para facilitar la formulación en un vehículo deseado. La preparación de vacunas que contienen secuencias peptídicas como ingredientes activos se conoce bien en el estado de la técnica, según lo muestran los ejemplos de las patentes US 4.608,251; 4.601.903; 4.599.231; 4.599.230; 4.596.792 y 4.578.770, todas las cuales se incorporan aquí a modo de referencia. Por lo general, estas vacunas se prepararan como inyectables. Ya sea como soluciones líquidas o suspensiones: también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación también puede emulsionarse. El ingrediente inmunogénico activo se suele mezclar con excipientes farmacéuticamente aceptables y compatibles con el ingrediente activo. Estos excipientes son, por ejemplo, agua, salino, dextrosa, glicerol, etanol o similares y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la vacuna puede contener cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes de tampón de pH o adyuvantes que potencian la eficacia de las vacunas.

4.17. Formulación farmacéutica

Las composiciones farmacéuticas aquí descritas se pueden administrar oralmente, como por ejemplo, con un diluyente inerte o con un vehículo comestible asimilable o se pueden introducir en cápsulas de gelatina de piel dura o blanda, o se pueden comprimir para obtener comprimidos o incorporarse directamente al alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, los compuestos activos se pueden incorporar con excipientes y utilizarse en la forma de comprimidos ingeribles, comprimidos sublinguales, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, bleas y similares. Estas composiciones y preparaciones deberán contener por lo menos 0,1% de componente activo. El porcentaje de las composiciones y preparaciones puede variarse, por su puesto, y oscilar convenientemente entre aproximadamente 2 y 60% del peso de la unidad. La cantidad de componentes activos en este tipo de composiciones terapéuticamente útiles tiene que ser la que permita obtener una dosificación adecuada.

Los comprimidos, píldoras, cápsulas y similares pueden contener también lo siguiente: aglutinante como goma tragacanto, acacia, almidón o gelatina; excipientes como fosfato dicálcico; agente desintegrante como almidón, fécula, ácido algínico y similares; un lubricante como estearato de magnesio; y se puede añadir un agente edulcorante, como la suprosa, la lactosa o la sacarina o un agente de condimento, como menta, aceite de gaulteria o condimento de cereza. Cuando la forma de la unidad de dosificación es una cápsula, puede contener además de materiales del tipo antes citado, un vehículo líquido. Pueden estar presentes otros materiales diversos como revestimientos o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo los comprimidos, píldoras o cápsulas se pueden revestir con goma, azúcar o ambos. Un jarabe de elixir puede contener los componentes activos sucrosa, como agente edulcorante metilo y propilparabens como conservantes y un tinte y condimento como sabor a cereza o a naranja. Por supuesto, todo material utilizado en la preparación de una unidad de dosificación deberá ser farmacéuticamente puro y prácticamente no toxico en las cantidades utilizadas. Además, los compuestos activos pueden incorporarse en preparaciones y formulaciones de liberación sostenida.

Los compuestos activos también se pueden administrar de forma parenteral o intraperitoneal. Las soluciones de los compuestos activos como base libre o sales farmacológicamente aceptables se pueden preparar en agua debidamente mezclada con un surfactante como hidroxi propil celulosa. Se pueden preparar también dispersiones en glicerol, polietilen glicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones normales de almacenamiento y uso, estas preparaciones contienen un conservante para evitar el crecimiento de microorganismos.

Las formas farmacéuticas adecuadas para la utilización inyectable comprenden soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones inyectables e estériles o dispersiones. En todos los casos, la forma debe ser estéril y fluida en la medida en que permita una utilización fácil de jeringas. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenaje y protegerse contra la acción contaminante de microorganismos como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o una dispersión que contiene por ejemplo agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilen glicol y polietilen glicol líquido, y similares), mezclas adecuadas de los mismos y aceites vegetales. La fluidez adecuada se puede mantener por ejemplo utilizando un revestimiento como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y utilizando surfactantes. El hecho de evitar la acción de los microorganismos se puede conseguir por medio de agentes antibacterianos y antifúngicos varios, por ejemplo, parabens, clorubutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo azucares, o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede conseguir utilizando en las composiciones agentes retardadores de la absorción, como por ejemplo monoesterato de aluminio y gelatina.

Las soluciones estériles inyectables se preparan incorporando los compuestos activos en la cantidad requerida en el disolvente adecuado con varios de los demás ingredientes mencionados anteriormente, en la forma requerida, seguido de esterilización filtrada. Por lo general, las dispersiones se preparan incorporando los diversos ingredientes activos esterilizados en un vehículo estéril que contiene el medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos, elegidos entre los mencionados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones estériles inyectables, los métodos preferidos de preparación son las técnicas de secado en vacío y secado con congelación que dan como resultado un polvo del ingrediente activo más algún ingrediente adicional deseado de una solución previamente filtrada-estéril del mismo.

Tal como se utiliza aquí, el término "vehículo farmacéuticamente aceptable" comprende cualquier disolvente, medio de dispersión, revestimiento, agente antibacteriano y antifúngico, agentes isotónicos y retardadores de la absorción y similares. La utilización de estos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es muy conocida en el estado de la técnica. A no ser que alguno de estos medios o agentes convencionales resulte incompatible con el ingrediente activo, se contempla su utilización en las composiciones terapéuticas. También se pueden incorporar ingredientes activos suplementarios en las composiciones. Para la profilaxis oral el polipéptido puede incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de elixires bucales y dentífricos no ingeribles. Un elixir bucal debe prepararse incorporando el ingrediente activo en la cantidad requerida y en un disolvente adecuado como una solución de borato sódico (solución de Dobell). Alternativamente, el ingrediente activo se puede incorporar en un elixir bucal antiséptico que contiene borato sódico, glicerina y bicarbonato potásico. El ingrediente activo también se puede dispersar en dentífricos, como por ejemplo: geles, pastas, polvos y líquidos. El ingrediente activo se puede añadir en una cantidad terapéuticamente eficaz a pasta dentífrica que puede comprender agua, aglutinantes, abrasivos, agentes condimentadores, agentes espumantes y humectantes.

El término "farmacéuticamente aceptable" se refiere a entidades moleculares u composiciones que no producen una reacción alérgica o similar adversa cuando se administra a un ser humano. La preparación de una composición acuosa que contiene una proteína como ingrediente activo también es conocida en el estado de la técnica. Por lo general, estas composiciones se preparan como inyectables, ya sea como soluciones líquidas o suspensiones; también se pueden preparar formas sólidas adecuadas para solución o suspensión en líquido antes de la inyección. La preparación también se puede emulsionar. La composición se puede formular en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables comprenden las sales de adición ácida (formadas con los grupos amino libres de la proteína) y que se forman con ácido orgánico tales como ácidos orgánicos tales como por ejemplo ácido clorhídrico o fosfórico o ácidos orgánicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carboxilo libres también pueden derivarse de bases inorgánicas como por ejemplo sodio, potasio, amonio, calcio o hidróxidos férricos y bases orgánicas como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína y similares. Tras la formulación, se administrarán las soluciones de forma compatible con la formulación de dosificación y en cantidades terapéuticamente eficaces. Las formulaciones se administran fácilmente en toda una serie de formas de dosificación como soluciones inyectables, cápsulas de liberación de fármaco y similares.

Para la administración parenteral en solución acuosa, por ejemplo, la solución deberá amortiguarse adecuadamente si es necesario y el diluyente líquido se tendrá que hacer primero isotónico con suficiente salino o glucosa. Estas soluciones acuosas particulares resultan particularmente adecuadas para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal. En este sentido, los medios acuosos estériles que se pueden utilizar serán bien conocidos por los expertos en la materia a la vista de la presente descripción. Por ejemplo una dosificación se puede disolver en 1 ml de solución de NaCl isotónica y añadirse a 1000 ml de fluido de hipodermoclisis o inyectarse en la zona propuesta de infusión (véase por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15 th Edition, páginas 1035-1038 y 1570-1580). Se producirá necesariamente alguna variación en la dosificación según el estado del paciente que se va a tratar. La persona responsable de la administración determinará en cada caso la dosis adecuada para el paciente individual. Además, para la administración humana, las preparaciones deberán cumplir las normas de esterilidad, pirogenicidad, seguridad general y pureza exigida por FDA Office of Biologics standards.

4.18 Ensayos de exploración

Se pueden utilizar células huéspedes que han sido transformadas en la exploración de compuestos o mezclas naturales o derivados artificialmente para elegir aquellos que pueden formar complejos con CBP y las proteínas derivadas de CBP de la presente invención. Esto podría resultar útil en la búsqueda de compuestos que inhiben o interrumpen de alguna otra forma o incluso potencian la aptitud del microorganismo para fijar Col. Se contempla la posibilidad de desarrollar agentes farmacéuticos eficaces identificando compuestos que forman complejos con los epítopos particulares de CBP, inclusive por ejemplo, compuestos aislados de fuentes naturales tales como fuentes vegetales, animales o marinos, y diversos compuestos sintéticos. Los compuestos naturales o artificiales que se pueden comprobar de esta forma pueden incluir también diversos minerales y proteínas, péptidos o anticuerpos.

4.19 Secuencias nucleares epitópicas

La presente invención se dirige también a composiciones proteinicas o peptídicas, libres de células totales y otros péptidos, que comprenden una proteína o péptido purificado que incorpora un epítopo inmunológicamente interactivo con uno o más de los anticuerpos de la presente invención.

Tal como se utiliza aquí, el término "que comprota un epítopo inmunológicamente interactivo con uno o más anticuerpos anti-CBP" se entiende como un antígeno peptídico o proteínico que incluye una estructura primaria, secundaria o terciaria similar a un epítopo situado dentro de un polipéptido CBP. El nivel de semejanza será por lo general de tal índole que los anticuerpos monoclonales o policlonales dirigidos contra el polipéptido CBP también interaccionarán, reaccionarán o reconocerán de alguna otra forma el antígeno peptídico o proteínico interreactivo. Se pueden utilizar diversos métodos de inmunoensayo junto con aquellos anticuerpos como por ejemplo transferencia western, ELISA, RIA y similares, todos los cuales son conocidos de los expertos en la materia.

La identificación de epítopos CBP tales como los derivados de cna o de productos génicos similares a cna y/o sus equivalentes funcionales, que se pueden utilizar en vacunas, es algo relativamente sencillo. Por ejemplo, se pueden utilizar los métodos de Hopp, tal como se indica en la patente US 4.554.101, que se incorpora aquí a modo de referencia, que muestra la identificación y la preparación de epítopos de secuencias de aminoácidos sobre la base de la hidrofilicidad. Los métodos descritos en otros documentos varios y programas de software basados en los mismos también se pueden utilizar para identificar secuencias nucleares epitópicas (véase por ejemplo, Jameson and Wolf, 1988; Wolf et al., 1988; patente US 4.554.101). La secuencia de aminoácidos de estas "secuencias nucleares epitópicas" se pueden incorporar entonces fácilmente a los péptidos, ya sea mediante la aplicación de síntesis peptídica o tecnología recombinante.

Los péptidos preferidos que se utilizan según la presente invención será por lo general los que tienen una longitud aproximada de 5 a 25 aminoácidos, y todavía mejor de 8 a 20 aminoácidos aproximadamente de longitud. Se propone que las secuencias peptídicas antigénicas más cortas proporcionarán ventajas en ciertas circunstancias, por ejemplo en la preparación de vacunas o en ensayos de detección inmunológica. Como ejemplos de las ventajas se pueden citar la facilidad de preparación y purificación, el coste relativamente bajo y la mejora en la reproducibilidad de producción y biodistribución ventajosa.

Se indica que se pueden obtener ventajas particulares de la presente invención mediante la preparación de péptidos sintéticos que comprenden secuencias nucleares epitópicas/inmunogénicas modificadas y/o ampliadas que dan como resultado un péptido epitópico "universal" dirigido a secuencias CBP y relacionadas con CBP, u otros dominios que ligan Col o proteoglicanos afines. Se propone que estas regiones representan aquellas que tienen más probabilidades de promover estimulación de célula T o célula B en un animal y por lo tanto inducir la producción de anticuerpos específicos en dicho animal. Una secuencia nuclear epitópica, tal como se utiliza aquí, es un tramo relativamente corto de aminoácidos "complementario" que por lo tanto fijará zonas de fijación de antígenos sobre anticuerpos específicos de epítopo de CBP. Además o de forma alternativa, una secuencia nuclear epitópica es una que suscitará los anticuerpos que interreaccionan con anticuerpos dirigidos contra las composiciones peptídicas de la presente invención. Se entenderá que en el contexto de la presente descripción el término "complementario" se refiere a aminoácidos o péptidos que presentan una fuerza de atracción entre si. Por lo tanto, algunas secuencias nucleares epitópicas de la presente invención se pueden definir operativamente en términos de su aptitud para competir o quizás desplazar la fijación del antígeno proteínico deseado por el antisuero correspondiente dirigido a la proteína.

Por lo general no se cree que el tamaño del antígeno polipeptídico sea particularmente crucial, siempre que sea por lo menos lo suficientemente grande para llevar la o las secuencias nucleares identificadas. La secuencia nuclear más pequeña y útil que se espera en la presente descripción sería por lo general del orden de aproximadamente 5 aminoácidos de longitud, prefiriéndose secuencias del orden de 8 ó 25. Por consiguiente este tamaño corresponderá por lo general a los antígenos peptídicos más pequeños preparados según la invención. Sin embargo el tamaño del antígeno puede ser mayor si se desea, siempre que contenga una secuencia nuclear epitópica básica.

Los expertos en la materia conocerán la identificación de secuencias nucleares epitópicas como la descrita por ejemplo en la patente US 4.554.101, que se incorpora aquí a modo de referencia, que muestra la identificación y la preparación de epítopos a partir de secuencias de aminoácidos sobre la base de la hidrofilicidad. Además, se dispone de varios programas informáticos que se utilizan en la predicción de porciones antigénicas de proteínas (véase por ejemplo Jameson and Wolf, 1988; Wolf et al., 1988). También pueden resultar útiles programas de análisis informático de secuencia peptídica (por ejemplo DNAStar® software, DNAStar, Inc., Madison, Wl) para diseñar péptidos sintéticos de CBP y análogos peptídicos según la presente descripción.

Los péptidos obtenidos en la presente invención son blancos ideales para utilizar como vacunas o inmunoagentes para el tratamiento de diversas enfermedades relacionadas con estafilococos o estreptococos y en particular las causadas por especies que contienen CBP y genes que codifican CBP y por lo tanto aquellos que expresan cna o productos génicos similares a cna sobre la superficie celular y que interaccionan a su vez con componentes ECM tales como Col para promover la adhesión bacteriana a células huéspedes. En este sentido, se pueden obtener ventajas particulares mediante la preparación de péptidos sintéticos que comprenden secuencias nucleares epitópicas/inmunogénicas. Estas secuencias nucleares epitópicas se pueden identificar como regiones hidrófilas y/o móviles de los polipéptidos o como aquellas que comprenden un motivo de célula T. En el estado de la técnica es bien conocido que estas regiones representan aquellas con más probabilidades de promover estimulación de célula B o célula T y por lo tanto de suscitar una producción específica de anticuerpos.

En el caso de desear evitar la adhesión bacteriana, la preparación de epítopos que produce anticuerpos que inhiben la interacción de un producto génico específico de Col y Col o proteoglicanos, estructuralmente similares a Col resulta particularmente deseable.

También resulta fácil confirmar que una proteína o un péptido es inmunológicamente interreactivo con, o es un equivalente biológico equivalente de, uno o más epítopos de los péptidos descritos. Esto se puede determinar fácilmente utilizando ensayos específicos, por ejemplo de una sola secuencia epitópica propuesta, o utilizando exploraciones más generales por ejemplo de un grupo de fragmentos proteínicos o péptidos sintéticos generados aleatoriamente. Los ensayos de exploración se pueden utilizar para identificar antígenos equivalentes o anticuerpos interreactivos. En cualquier caso, el principio es el mismo, es decir se basa en la competición por zonas de fijación entre anticuerpos y antígenos.

Entre los ensayos de competición adecuados que se pueden utilizar se encuentran los protocolos basados en ensayos inmuno-histoquímicos, ELISAs, RIAs, transferencia western dot y similares. En cualquiera de los ensayos competitivos, uno de los componentes de fijación, generalmente el elemento conocido, como el péptido derivado de CBP, o un anticuerpo conocido, se rotulará con una etiqueta detectable y se comprobará la aptitud de los componentes de la prueba que permanece por lo general sin rotular, para reducir la cantidad de rótulo que interactúa con el antígeno o anticuerpo reactivo correspondiente.

Como ejemplo de realización de un estudio de competencia entre CBP y cualquier antígeno de prueba, habría que rotular primero CBP con una etiqueta detectable como por ejemplo biotina o una etiqueta enzimática, radiactiva o fluorgénica, para permitir la identificación subsiguiente. Habría que incubar entonces el antígeno rotulado con el otro antígeno de prueba a examinar, en proporciones diferentes (por ejemplo 1:1, 1:10 y 1:100) y, después de mezclar habría que añadir entonces la mezcla a un anticuerpo de la presente invención. De preferencia, el anticuerpo conocido se inmovilizaría, por ejemplo fijándolo a una placa ELISA. La aptitud de la mezcla para interactuar con el anticuerpo se determinaría detectando la presencia del rótulo específicamente ligado. Este valor se compararía entonces con un valor de control en el que no se incluyera en la incubación ningún antígeno (de prueba) potencialmente competidor.

El ensayo puede ser cualquiera de los diversos ensayos inmunológicos basados en la hibridación, y los antígenos reactivos se detectarían, detectando su rótulo, por ejemplo utilizando estreptavidina en el caso de antígenos biotinilados o utilizando un sustrato cromogénico en conexión con un rótulo enzimático o simplemente detectando un rótulo radioactivo o fluorescente. Todo antígeno que interactúa con el mismo anticuerpo como CBP, como por ejemplo, podrá competir eficazmente interactuar y por consiguiente reducirá notablemente la fijación de CBP, tal como lo muestra la reducción en la cantidad de rótulo detectada.

La reactividad del antígeno rotulado, como por ejemplo una composición de CBP, en ausencia de un antígeno de prueba sería el valor elevado de control. El valor bajo de control se obtendría incubando el antígeno rotulado con un exceso de antígeno CBP no rotulado, cuando se produjera la competición y se redujera la fijación. Una reducción significativa de reactividad del antígeno rotulado en presencia de un antígeno de prueba es indicativa de un antígeno de prueba "Ínter-reactivo", es decir que tiene afinidad de fijación por el mismo anticuerpo. El término "reducción significativa" utilizado en la presente aplicación se puede definir como reducción reproducible de la fijación (por ejemplo observada de forma coherente).

Además de los compuestos peptidílicos descritos aquí, los inventores también contemplan la posibilidad de formular otros compuestos estéricamente similares para mimetizar las partes claves de la estructura peptídica. Estos compuestos, que se pueden denominar péptido miméticos, se pueden utilizar del mismo modo que los péptidos de la invención y por lo tanto son también equivalentes funcionales. La generación de un equivalente funcional estructural se puede lograr mediante técnicas de modelado y diseño químico conocidos por los expertos en la materia. Queda claro que todos estos constructos estéricamente similares caen dentro del ámbito de la presente invención.

Las síntesis de secuencias epitópicas o péptidos que incluyen un epítopo antigénico dentro de su secuencia, se pueden realizar fácilmente utilizando técnicas sintéticas convencionales tales como el método de fase sólida (utilizando por ejemplo un sintetizador peptídico que se encuentra en el comercio como el Sintetizador Peptídico Modelo 430A de Applied Biosystems). Los antígenos peptídicos sintetizados de esta forma se pueden separar en cantidades predeterminadas y almacenarse de forma convencional como en soluciones acuosas o incluso todavía mejor en polvo o en estado liofilizado a espera de su utilización.

Por lo general, debido a la estabilidad relativa de los péptidos, se pueden almacenar fácilmente en soluciones acuosas durante períodos de tiempo bastante largos si se desea, por ejemplo hasta 6 meses o más, en casi cualquier solución acuosa sin degradación apreciable o pérdida de la actividad antigénica. No obstante, en caso de almacenamiento acuoso prolongado será por lo general deseable incluir agentes como tampones, como tris o tampones de fosfato para mantener un pH de aproximadamente 7,0 a 7,5. Además, puede ser deseable incluir agentes que inhiban el crecimiento microbiano, tales como azida sádica o mertiolato. En el caso de almacenamiento prolongado en estado acuoso será deseable almacenar las soluciones a 4ºC o de preferencia congelarlas. Es evidente que cuando los péptidos se almacenan en estado liofilizado o en polvo, se pueden almacenar prácticamente de forma indefinida, es decir en porciones determinadas que se pueden rehidratar con una cantidad predeterminada de agua (de preferencia destilada) o de tampón antes de su utilización.

4.20 Mutagénesis específica de la zona

La mutagénesis específica de la zona es una técnica útil en la preparación de péptidos individuales, o péptidos o proteínas equivalentes funcionales biológicos, mediante mutagénesis específica del ADN subyacente. La técnica, bien conocida por los expertos en la materia, ofrece además la posibilidad de preparar y comprobar variantes de secuencia, por ejemplo incorporando una o más de las consideraciones anteriores, introduciendo uno o más cambios de la secuencia de nucleótidos en el ADN. La mutagénesis específica de la zona permite la producción de mutantes, mediante el uso de secuencias de oligonucleótidos específicos que codifican la secuencia de ADN de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia iniciadora de tamaño suficiente y complejidad de secuencia para formar un dúplex estable a ambos lados de la unión de delación que se atraviesa. Por lo general se prefiere un iniciador de aproximadamente 14 a 25 nucleótidos, con unos 5 a 10 residuos a ambos lados de la unión de la secuencia que se altera.

Por lo general, la técnica de mutagénesis específica de la zona es bien conocida en el estado de la técnica, como lo muestran varias publicaciones.

Según se podrá apreciar, la técnica suele utilizar un vector fago que existe tanto en forma de cadena simple como de cadena doble. Como vectores habitualmente útiles en la mutagénesis según zona se pueden citar los vectores tales como el fago M13. Estos fagos se pueden obtener fácilmente en el comercio y su utilización es generalmente bien conocida de los expertos en la materia. Se utilizan también de forma rutinaria plásmidos de doble cadena en mutagénesis según zona, lo cual elimina la etapa de transferencia del gen en cuestión de un plásmido a un fago.

En general, la mutagénesis según zona de acuerdo con la presente se realiza obteniendo en primer lugar un vector de una sola cadena o separando por fusión dos cadenas de un vector de doble cadena que comprende dentro de su secuencia una secuencia de ADN que codifica el péptido deseado. Se prepara un iniciador oligonucleótido que lleva la secuencia mutada deseada, por lo general de forma sintética. Este iniciador se híbrida entonces con el vector de una sola cadena y se somete a enzimas de polimerización de ADN como fragmento 1 Klenow de polimerasa E. coli, con el objeto de completar la síntesis de la cadena que lleva la mutación. Se forma por consiguiente un heteroduplex en el que una cadena codifica una secuencia no mutada original y la segunda cadena lleva la mutación deseada. Este vector heteroduplex se utiliza entonces para transformar células adecuadas, tales como células de E.coli y se eligen clones que incluyen vectores recombinantes que llevan la disposición de secuencia mutada.

La preparación de variantes de secuencia de los segmentos de ADN elegidos que codifican péptido utilizando mutagénesis según zona se obtiene como un medio para producir especies potencialmente útiles y no se considera limitador ya que existen otros medios en los cuales se pueden obtener variantes de secuencia de péptidos y las secuencias de ADN que las codifican. Por ejemplo, se puede tratar vectores recombinantes que codifican la secuencia peptídica deseada con agentes mutagénicos tales como hidroxilamina, para obtener variantes de secuencia. Para más detalles específicos relativos a estos métodos y protocolos véase las descripciones de Maloy, 1990;: Maloy et al., 1994, Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991 Kuby, 1994; y Maniatis et al., 1982, que se incorporan aquí a modo de referencia, a tal efecto.

La extensión de solapamiento de cadena basado en PCR^{TM} (SOE) (Ho et al., 1989) para mutagénesis según zona se prefiere particularmente para la mutagénesis según zona de las composiciones de ácido nucléico de la presente invención. Las técnicas de PCR^{TM} son bien conocidos por los expertos en la materia, tal como se han descrito anteriormente. El procedimiento SOE supone un protocolo PCR^{TM} de dos etapas en el cual se utiliza un par complementario de iniciadores internos (B y C) para introducir los cambios nucleótidos adecuados en la secuencia de tipo natural. En dos reacciones separadas se utiliza iniciador A PCR^{TM} de flanqueo (zona de restricción incorporada en el oligo) e iniciador D (zona de restricción incorporada en el oligo, junto con iniciadores B y C, respectivamente, para generar productos PCR^{TM} AB y CD. Los productos PCR^{TM} se purifican por electrólisis de gel agarosa y los dos fragmentos sobrepuestos PCR^{TM} AB y CD se combinan con iniciadores de flanqueo A y D y se utilizan en una segunda reacción PCR^{TM}. El producto amplificado PCR^{TM} se purifica con gel agarosa, se digiere con las enzimas adecuadas, se liga en un vector de expresión y se transforma en MJ101 E. coli, XL1-BIue™ y las mutaciones se confirman secuenciando los plásmidos aislados.

4.21. Equivalentes funcionales biológicos

Se pueden realizar modificaciones y cambios en la estructura de los péptidos de la presente invención y segmentos de ADN que los codifican y seguir obteniendo una molécula funcional que codifica una proteína o péptido con características deseables. Lo que sigue es una discusión basada en el cambio de aminoácidos de una proteína para crear un equivalente o incluso una molécula de segunda generación mejorada. Los cambios del aminoácido se pueden realizar cambiando los codones de la secuencia de ADN, según el siguiente cuadro de codones:

CUADRO 1

Aminoácidos	Codones
Alanina	Ala	A	GCA	GCC	GCG	GCU
Cisteína	Cys	C	UGC	UGU
Ácido aspártico	Asp	D	GAC	GAU
Ácido glutámico	Glu	E	GAA	GAG
Fenilalanina	Phe	F	UUC	UUU
Glicina	Gly	G	GGA	GGC	GGG	GGU
Histidina	His	H	CAC	CAU
Isoleucina	IIe	I	AUA	AUC	AUU
Lisina	Lys	K	AAA	AAG
Leucina	Leu	L	UUA	UUG	CUA	CUC	CUG	CUU
Metionina	Met	M	AUG
Asparagina	Asn	N	AAC	AAU
Prolina	Pro	P	CCA	CCC	CCG	CCU
Glutamina	Gln	Q	CAA	CAG
Arginina	Arf	R	AGA	AGG	CGA	CGC	CGG	CGU
Serina	Ser	S	AGC	AGU	UCA	UCC	UCG	UCU
Treonina	Thr	T	ACA	ACC	ACG	ACU
Valina	Val	V	GUA	GUC	GUC	GUU
Triptófano	Trp	W	UGG
Tirosina	Tyr	Y	UAC	UAU

Por ejemplo, ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos en una estructura proteinica sin pérdida apreciable de capacidad de fijación interactiva con estructuras tales como por ejemplo regiones de fijación de antígeno de anticuerpos o zonas de fijación en moléculas sustrato. Como es la capacidad interactiva y la proteína la que define la actividad funcional biológica de la proteína, se pueden realizar ciertas sustituciones de secuencias de aminoácidos en una secuencia proteinica y, por supuesto, su secuencia de codificación de ADN subyacente, y obtener sin embargo una proteína con propiedades similares. Los inventores contemplan por lo tanto la posibilidad de realizar varios cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones descritas o la secuencias de ADN correspondientes que codifican dichos péptidos sin pérdida apreciable de su utilidad o actividad biológica.

En la realización de dichos cambios, se puede considerar el índice hidropático de los aminoácidos. La importancia del índice hidropático de aminoácidos para conferir función biológica interactiva a una proteína es algo que se entiende bien en el estado de la técnica (Kyte and Doolittle, 1982, que se incorpora aquí a modo de referencia). Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que define a su vez la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo enzimas, sustratos, receptores ADN, anticuerpos, antígenos y similares. A cada aminoácido se la asignado un índice hidropático sobre la base de su hidrofobicidad y características de cambio (Kyte and Doolittle, 1982) y estas son: isoleucina (+4,5); valina (+4,2); leucina (+3,8), fenilalanina (+2,8); cisteina/cistina (+2,5); metionina (+1,9); alanina (+12,8), glicina (-0,4); treonina (-0,7); serina (-0,8); triptófano (-0,9); tirosina (-1,3), prolina (-1,6); histidina (-3,2); glutamato (-3,5); glutamina (-3,5); aspartato (-3,5); asparagina (-3,5); lisina (-3,9) y arginina (-4,5).

En el estado de la técnica se sabe que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tienen un índice hidropático similar y pese a ello sigue dándose como resultado una proteína con actividad biológica similar, es decir que se sigue obteniendo una proteína funcionalmente equivalente biológica. Cuando se realizan estos cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos están comprendidos dentro de los límites \pm2, todavía más los comprendidos dentro de los límites \pm1 y mucho más los comprendidos entre los límites \pm0,5. También se sabe en el estado de la técnica que la sustitución de aminoácidos similares puede realizarse de forma eficaz sobre la base de la hidrofilicidad. La patente US 4.554.101, que se incorpora aquí a modo de referencia, indica que la hidrofilicidad local media máxima de una proteína, que se rige por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes) se corresponde con una propiedad biológica de la proteína.

Según se detallada en la patente US 4.554.101 se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a residuos de aminoácidos: arginina (+3,0), lisina (+3,0), aspartato (+3,0\pm1); glutamato (+3,0\pm1); serina (+0,3); asparagina (+0,2); glutamina (+0,2); glicina (0), treonina (-04,); prolina (-0,5 \pm 1), alanina (-0,5); histina (-0,5); cisteína (-1,0), metionina (-1,3), valina (-1,5), leucina (-1,8), isoleucina (-1,8), tirosina (-2,3), fenillalanina (-2,5), triptófano (-3,4). Se entiende que un aminoácido puede ser sustituido por otro que tiene un valor de hidrofilicidad similar y seguir obteniendo un equivalente biológico, y en particular una proteína inmunológicamente equivalente. En dichos cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están comprendidos entre \pm 2 es la preferida, prefiriéndose todavía más los comprendidos entre \pm 1 y todavía más en particular los valores comprendidos entre \pm 0,5.

Según lo indicado anteriormente, las sustituciones de aminoácidos se basan generalmente por lo tanto en la semejanza relativa de los sustituyentes de cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño y similares. Los expertos en la materia conocen bien los ejemplos de sustitución que toman varias de las características anteriores como por ejemplo: arginina y lisina, glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina.

4.22. MSCRAMMs bacterianas (adhesinas) como candidatos de vacunas

Históricamente, los estudios sobre adherencia bacteriana se han centrado principalmente en bacterias gram-negativas, que expresan una amplia variedad de proteínas adhesivas fimbriales (designadas adhesivas) sobre su superficie celular (Falkow et al., 1992). Estas adhesinas reconocen glicoconjugados específicos expuestos sobre la superficie de células huéspedes (particularmente capas epiteliales). Empleando las estructurales similares a la lectina en la fijación se permite que el microorganismo colonice eficazmente las superficies epiteliales; esto proporciona a la bacteria un lugar excelente para la replicación y también la oportunidad de diseminar a tejidos huéspedes vecinos. En muchos casos se ha demostrado que la inmunización con adhesinas pilus puede suscitar la protección contra la exposición bacteriana, como en la otitis media inducida por Hemophilus influenza en un modelo de chinchilla (Sirakova et al. 1994), Moraxella Bovis en queratoconjuntivitis bovina infecciosa inducida experimentalmente (Lepper et al.,1995) y diarrea inducida por E. coli en conejos (McQueen et al., 1993). En la mayoría de los casos la inmunización con adhesinas conduce a la producción de anticuerpos inmunológicos que evitan la infección por fijación bacteriana inhibidora y colonización, así como potenciación de opsonofagocitosis bacteriana y parte mediada por complemento dependiente de anticuerpo.

La utilización de moléculas mediadoras en la adhesión de microbios patógenos a componentes de tejido huéspedes como componentes de vacunas está emergiendo como una etapa critica en el desarrollo de futuras vacunas. Debido a que la adherencia bacteriana es la primera etapa critica en el desarrollo de la mayoría de las infecciones, constituye un objetivo atractivo para el desarrollo de vacunas nuevas. Una creciente comprensión de las interacciones entre MSCRAMMs y los componentes de tejido huésped a nivel molecular acoplado con nuevas técnicas en tecnología de ADN recombinante han sentado los cimientos para una nueva generación de vacunas de subunidad. Se pueden producir ahora dominios específicos o enteros de MSCRAMMs ya sea en sus formas nativas o alteradas según la zona. Además, la aptitud para mezclar y emparejar MSCRAMMs de microorganismos diferentes crea la posibilidad de diseñar una sola vacuna que protegerá contra múltiples bacterias.

\newpage

Los recientes ensayos clínicos con una nueva vacuna subunidad contra tos ferina que consisten en la hemaglutinina y pertactina filamentosa de MSCRAMMs Bordatella pertussis purificada además de una toxina de pertussis inacabada constituyen un ejemplo principal del éxito de este tipo de enfoque. Varias versiones de la nueva vacuna acelular resultaron ser seguridad y más eficaces que la vacuna antigua que contenía células bacterianas completas (Greco et al., 1996; Gustafson et al., 1996).

4.23. Componentes actual de vacuna de S. aureus

El desarrollo de la penicilina para combatir S. aureus constituyó un avance considerable en el control y el tratamiento de la infección. Lamentablemente, emergieron rápidamente organismos resistentes a la penicilina y se tuvo una necesidad primordial de nuevos antibióticos. Con la introducción de cada nuevo antibiótico, S. aureus ha sido capaz de contrarrestar con beta-lactamasas, proteínas de fijación de penicilina alteradas y proteínas de membrana celular mutada que permiten que la bacteria persista. Por consiguiente, han ido surgiendo organismos resistentes a múltiples fármacos y S. aureus resistentes a la meticilina (MRSA) que han logrado establecerse de forma importante en los hospitales y clínicas de todo el mundo.

Sigue siendo deficiente la compresión de la inmunidad a infecciones por S. aureus. Por lo general, los seres humanos y los animales sanos muestran un alto grado de resistencia innata a las infecciones por S. aureus. La protección se atribuye a barreras mucosales y epiteliales intactas y a respuestas humorales y celulares normales. Los valores de anticuerpos de componentes de S. aureus son elevados después de infecciones graves (Ryding et al. 1995), no obstante, no existe hasta la fecha ninguna evidencia serológica de correlación entre valores de anticuerpos e inmunidad humana.

A lo largo de las ultimas décadas se han probado como vacunas preparaciones de células de S. aureus fijadas en formalina, matadas térmicamente, vivas, para prevenir infecciones por estafilococos. Se diseñó una prueba clínica multicentro para estudiar los efectos de una vacuna comercial, que consiste en toxoide de estafilococo y estafilococos completos muertos sobre la incidencia de la peritonitis, infección de zona de salida y "carriage" nasal S. aureus entre pacientes de diálisis peritoneal continua (Poole-Warren et al., 1991). Aunque la inmunización con la vacuna suscitó un incremento del nivel de anticuerpos específicos de S. aureus, esto no afectó a la incidencia de la peritonitis. De forma similar, la inmunización de conejos con células completas de S. aureus no pudo evitar o modificar ninguna etapa en el desarrollo de endocarditis experimental, reducir la incidencia de absceso renal o disminuir la carga bacteriana en riñones infectados (Greenberg et al., 1987).

En la actualidad no existe ninguna vacuna aprobada por FDA para la prevención de infecciones por S. aureus (Foster 1991). No obstante NABI (North American Biologicals Inc.) está desarrollando en la actualidad una vacuna de S. aureus (StaphVAX) basada en el polisacárido capsular. Esta vacuna consiste en polisacáridos capsulares de tipo 5 ú 8 conjugados con exotoxina A de pseudomonas aeruginosa (rEPA). La vacuna está pensada para inducir anticuerpos opsónicos específicos al tipo y potenciar la opsonofagocitosis (Karakawa et al., 1988). Utilizando un modelo de ratón de exposición letal refinada (Fatton et al., 1996) se ha mostrado que la infusión intraperitoneal de IgG específico de tipo 5 reduce la mortalidad de los ratones inoculados intraperitonealmente con S. aureus. Se ha utilizado también la vacuna polisacárido-rEPA capsular de tipo 5 para vacunar a 17 pacientes con patología renal en etapa terminal (Welch et al., 1996). La media geométrica (GM) de niveles de anticuerpo IgG al conjugado tipo 5 aumentó de 13 a 17 veces tras la primera inmunización aunque no se pudo detectar ningún incremento adicional tras inyecciones adicionales. Lo que es interesante es que los niveles GM IgG de los pacientes vacunados fueron notablemente inferiores a los de los individuos de control. Con el soporte de los estudios de animales, la vacuna ha finalizado recientemente una prueba de Fase II en pacientes de diálisis peritoneal ambulatoria continua. La prueba clínica mostró que la vacuna era segura pero ineficaz para evitar infecciones por estafilococos (NABI SE FOR 10-K405, 12/31/95). Dos posibles explicaciones de la incapacidad de StaphVAX para prevenir infecciones relacionadas con diálisis peritoneal en pacientes vacunados son que la
inmunogenicidad de la vacuna era demasiado baja debido a la dosificación subóptima de la vacuna o que los anticuerpos en la corriente sanguínea eran incapaces de afectar una infección en ciertas área anatómicas con el peritoneo.

4.24. Utilización de la CBP de S. aureus como componente de vacuna 4.24.1. Sepsis

Está aumentando la sepsis relacionada con bacterias gram-positivas. De hecho, entre un tercio y la mitad de todos los casos de sepsis son causados por bacterias gram-positivas, particularmente S. aureus y S. epidermidis. en los Estados Unidos se puede estimar que más de 200.000 pacientes desarrollaran este año una sepsis relacionada con gram-positivo. Utilizando un modelo de ratón (Bremell et al., 1991), los inventores han demostrado claramente que la inmunización activa con dominio M55 (SEQ ID NO: 2) del MSCRAMM de fijación de Col puede proteger a los ratones contra la muerte inducida por sepsis. Se inmunizó subcutáneamente a unos ratones con M55 o un antígeno de control (albúmina de suero bovino) y luego se provocaron intravenosamente con S. aureus. El 83% (35/42) de los ratones inmunizados con M55 sobrevivió comparado con solamente el 27% de los ratones inmunizados con BSA (12/45). Esta es una compilación de 3 estudios separados.

4.25. Producción de una vacuna prototipo basada en MSCRAMM multivalente

Se sobrexpresaron en E. coli una serie de proteínas recombinantes, que representan dominios del Col, Fn y MS
CRAMMs de fijación de Fbg y se purificó por afinidad mediante cromatografía de quelato metálico tal se ha descrito anteriormente (Joh et al., 1994; McDevitt et al., 1994; Patti et al., 1995): (1) aminoácidos contenidos en CBP M 17 recombinante; SEQ ID NO: 6); (2) aminoácidos contenidos en MSCRAMM de fijación de Fib recombinante (pCF33), y (3) aminoácidos contenidos en MSCRAMM de fijación de fibronectina recombinante (pQD).

5. Ejemplos

Se incluyen los siguientes ejemplos para mostrar las realizaciones preferidas de la invención. Los expertos en la materia apreciarán que las técnicas descritas en los ejemplos que siguen representan técnicas descubiertas por los inventores que funcionan bien en la práctica de la invención y que se pueden considerar por lo tanto que constituyen modos preferidos de su práctica. No obstante, los expertos en la materia apreciaran, a la luz de la presente descripción que se pueden realizar muchos cambios en las realizaciones específicas que se describen y seguir obteniendo un resultado igual o similar sin apartarse del espíritu ni del ámbito de la invención.

Ejemplo 1

5.1. Residuos críticos en la zona de fijación de ligando de la CBP de S. aureus

Se ha identificado una zona de fijación de Col discreta dentro de la adhesina Col de S. aureus situada en una región entre los aminoácidos Asp^{209} y Tyr^{233}. Los anticuerpos policlonales obtenidos con una forma recombinante de la adhesina de Col inhibieron la fijación de Col de tipo II a S. aureus. Al comprobar la aptitud de los segmentos minetizadores de péptidos sintéticos superpuestos de fragmento de adhesina para neutralizar la actividad inhibitoria del anticuerpo solamente se comprobó que había un péptido activo, CBD4. CBD4 interactuaba directamente con Col y a grandes concentraciones inhibía la fijación de Col a S. aureus. Un derivado peptídico sintético de CBD4 que carecía de dos residuos terminales carboxilo (Asn^{232}, Tyr^{233}) tenía una actividad inhibitoria mínima. La importancia de estos residuos para la fijación de Col se confirmó mediante análisis de interacción bioespecífica. Las proteínas de adhesinas mutantes N^{232} \rightarrow A e Y^{233} \rightarrow A mostraron cambios importantes en la actividad de fijación de Col. La tasa de disociación dominante para la fijación de proteína adhesina mutante N^{232} \rightarrow A a Col II inmovilizado se redujo casi 10 veces, mientras que Y^{233} \rightarrow A y el doble mutante presentaron reducciones todavía más significativas en la afinidad y la relación de fijación aparente comparado con la proteína de tipo natural.

5.1.1. El IgG policlonal contra fragmentos de MSCRAMM inhibe la fijación de col a S. aureus

Se realizaron estudios para identificar la zona de fijación de ligando de CBP S. aureus examinando la actividad de fijación de fragmentos recombinantes de MSCRAMM de tamaño progresivamente decreciente. Las truncaciones más allá de un segmento de 168 aminoácidos de largo, CBD (151-318), dieron como resultado una pérdida de la actividad de fijación de Col aunque también afectaron el plegado de las proteínas resultantes tal como se indica por espectroscopia CD. Es por lo tanto posible que la zona de fijación de ligando esté contenida dentro de un segmento corto de CBD (151-318), pero debido al plegado inadecuado de la proteína la zona de fijación de Col no se encuentra en forma activa. Para explotar esta posibilidad se desarrolló un método de neutralización de inhibición de anticuerpo. Se utilizó una estrategia similar con éxito para controlar y seguir la purificación de CBP nativo de células de S. aureus (Switalski et al., 1989). Para generar un anticuerpo inhibidor, CBD (151-297) se utilizó como antígeno una versión recombinante del segmento mayor que no ligaba Col y presentaba una conformación alterada. De este modo se reduciría al mínimo la generación de anticuerpos inhibidores que reconocen epítopos dependientes de la conformación. Un anticuerpo monoclonal inhibidor generado contra una CBP biológicamente activa reconoció un epítopo dependiente de conformación y resultó de uso limitado para la identificación de la zona de fija-
ción.

Se inmunizaron, según lo descrito unos conejos con CBD (157-297). Se recogieron también sueros antes de la inmunización y se comprobó la reactividad a CBD (151-297). Se comprobó la reactividad del antisuero con segmentos diferentes de CBD (151-297) en un ELISA utilizando una serie de 8 péptidos sintéticos de 25 aminoácidos de largo con secuencias parcialmente sobrepuestas como blancos. El IgG purificado reaccionó fuertemente con péptidos 2, 3, 5, 6 y 7 y de forma débil con péptidos 1, 4 y 8. Cuando se comprobó IgG preinmune con los péptidos CBD, solo se pudo detectar una reacción reducida. La reactividad inmunológica relativa de los distintos péptidos se correlacionó estrechamente con su índice antigénico utilizando el algoritmo de Jameson and Wolf (1988).

IgG purificado \alphaCBD (151-297) inhibió la fijación de S. aureus a Col rotulado ^{125}I de una forma que dependía de la dosis. La cantidad de Col I^{125} ligada por 10^{8} células bacterianas se redujo en más de 50% con 5 \mug y se inhibió prácticamente de forma completa con 100 \mug de IgG inmune purificado. Por el contrario, los anticuerpos purificados de sueros preinmunes no poseían una actividad inhibitoria significante. Estos resultados sugieren que los anticuerpos \alphaCBD (151-297) reconocen epítopos en la zona activa o cerca de la misma, de MSCRAMM, inhibiendo de este modo o interfiriendo estéricamente con la fijación de Col.

5.1.2. Los péptidos sintéticos neutralizan la actividad inhibitoria de IgG \alphaCBD (151-297)

Los distintos péptidos sintéticos CBD descritos anteriormente que reaccionan, según se ha visto con el IgG. \alphaCBD (151-297) se sometieron a ensayo para comprobar su potencial para neutralizar la actividad inhibitoria del anticuerpo. El IgG \alphaCBD (151-297) (12 \mug) se preincubó con una sola dosis (100 \mug) de cada péptido en la etapa 1. Las células de S. aureus se añadieron luego y se prosiguió la pre-incubación. Finalmente se añadió el Col de tipo 2 rotulado I^{125}. El péptido CBD4 neutralizó el 68% de la actividad inhibitoria de IgG \alphaCBD (151-297) mientras que los demás péptidos comprobado surtían poco o ningún efecto. Estos resultados sugirieron que únicamente anticuerpos que reconocen epítopos presentes en CBD4 eran capaces de inhibir la fijación de Col a las bacterias. Aunque otras secuencias peptídicas era más inmunógenas que CBD4, los anticuerpos que reconocían los epitopos correspondientes no eran inhibitorios. Estos datos sugieren que la zona de fijación de ligando de MSCRAMM está situada cerca de la secuencia, o dentro de la misma cubierta por péptido CBD4.

Para seguir investigando la interacción entre péptido CBD4 y \alphaCBD (151-297) IgG y su efecto sobre la fijación de Col se incubó una concentración fija del anticuerpo con una actividad creciente de CBD4. Para que el ensayo fuera más sensible se eligió una concentración de \alphaCBD (151-297) IgG (12 \mug/ml) que dio como resultado una reducción del 50% en la fijación de Col a 10^{8} células de S. aureus. Por consiguiente se pudo detectar fácilmente una reducción relativamente pequeña de la inhibición. A concentraciones reducidas, el péptido parece neutralizar la actividad inhibitoria y en este estudio 100 \mug de péptido CBD4 restauraron el nivel de fijación de Col a S. aureus observado en ausencia de \alphaCBD (151-297) IgG. De forma en cierto modo sorprendente, la adición de más péptido CBD4 dio como resultado una disminución en función de la dosis de la fijación de Col a S. aureus.

5.1.3. El péptido CBD4 inhibe directamente la fijación de Col a S. aureus

Para evaluar la función de aminoácidos 209-233 en la fijación de Col, se comprobó la aptitud del péptido CBD4 para inhibir directamente la fijación de Col I^{125} a S. aureus. Se probó también péptido CBD7 que reaccionó fuertemente con \alphaCBD (151-297) IgG en el ensayo ELISA. Al incubar cantidades crecientes de péptido CBD4 con Col I^{125} antes de añadir S. aureus, se inhibió la fijación a Col en función de la dosis. Cinco \mum de CBD4 inhibieron la fijación en más de un 50%. El péptido CBD7 no tenía ningún efecto inhibitorio cuando se preincubó con ^{125}I-Col. Estos datos sugieren que el péptido CBD4 puede fijar ^{125}I-col soluble y que CBD4 contiene los residuos que representa una zona de fijación de col dentro de la proteína MSCRAMM.

5.1.4. Residuos críticos de CBD4 necesarios para la actividad de fijación de Col

Para identificar residuos dentro de CBD4 necesarios para la fijación de Col se sintetizaron diversos péptidos sobre puestos más pequeños. Se realizó una serie de péptidos que contenía residuos amino terminales 2 y un péptido que contenía una deleción de aminoácido 2 en el término carboxilo. Se comprobó la aptitud de los péptidos (10 \muM) para inhibir la fijación de Col rotulado ^{125}I a S. aureus. El péptido CBD4 inhibió la fijación de Col en un 76%, mientras que todos los péptidos que contenían truncaciones amino-terminales tenían poca actividad en la concentración ensayada. Estos datos indican que cuando se elimina una cantidad tan pequeña como 5 residuos del péptido de la zona activa, se pierde la capacidad para fijar Col. Además, la deleción de solamente los dos aminoácidos carboxil-terminales causa una pérdida completa de la actividad biológica. Esto sugiere que son miembros integrales de la zona activa de
CBP.

5.1.5. Actividad de fijación de Col de mutantes definidos de MSCRAMM

Se examinó la importancia de residuos aminoácidos Asn^{232} y Tyr^{233} en el MSCRAMM para la fijación de Col, creando mutantes específicos de CBD (30-529) y caracterizando las interacciones de estos mutantes con Col tipo II inmovilizado utilizando el BIAcore. En las mutaciones realizadas, los residuos aminoácidos identificados se sustituyeron individualmente (N^{232} \rightarrow A, Y^{233} \rightarrow A) o como un par (N^{232} \rightarrow A: Y^{233} \rightarrow A) con alanina un residuo que no se espera interfiera con la estructura secundaria existente. Se hicieron los cambios de base correspondientes utilizando PCR^{TM} de extensión de sobreposición tal como se describe y se confirmaron experimentalmente los cambios de secuencia. Las proteínas recombinantes que contienen las mutaciones se purificaron hasta homogeneidad por cromatografía de quelato de ion metálico. Los análisis estructurales de las proteínas aisladas por espectroscopia cercana y lejana UV CD sugirieron que no se había producido ningún cambio significativo en la estructura secundaria o terciaria como resultado de las mutaciones.

En las condiciones descritas, CBD (30-529) presenta interacciones multifásicas complejas cuando se analizan utilizando el BIAcore. No se obtuvo un equilibrio verdadero durante el período de tiempo de inyección debido a la reducida tasa de disociación (k_{off}). La fase de asociación presenta fijación multifásica con una interacción caracterizada por un k_{off} rápido aparente al comienzo de la inyección seguido de una segunda fase caracterizada por un k_{off} más lento. La fase de disociación ofrece información sobre el k_{off} y esta tasa es independiente del número de zonas de fijación, concentración de análitos y caudal. El análisis de estos datos indica por lo menos una disociación de 3 componentes con las dos tasas más rápidas superior a 10^{-2} s^{-1} y el k_{off} más lento a 5 x 10^{-4} S^{-1}. La fase de asociación contiene la información para determinar la tasa de asociación k_{off}, la interacción, pero también es influida por la tasa de disociación, el número de zonas de fijación para cada interacción y la concentración del análito. Debido a la complejidad de esta interacción y a la ausencia de datos de equilibrio medibles, no fue posible determinar la constante de fijación (K_{D}), relación de fijación aparente (BR_{app}) y k_{on}.

En una comparación de las tres proteínas mutantes con CBD (30-529) de tipo natural, se puede ver fácilmente que cada una de las mutaciones introducidas afectó las propiedades de fijación de Col de las proteínas generadas. Mientras la forma del sensorgrama de fijación permanece prácticamente igual para el mutante N^{232} \rightarrow A, el análisis de la fase de disociación indica que la tasa de disociación más lenta se ha incrementado casi 10 veces. Aunque no se puede determinar una constante de desasociación (K_{D}), parece ser que la afinidad de este mutante por Col de tipo II se ha visto también influida por esta mutación. Tanto el Y^{233} \rightarrow A como el doble mutante ligan inmovilizado de tipo II. El análisis de los datos obtenidos con el doble mutante produce una constante de fijación monofásica cuando se evalúa mediante el análisis Scatchard o la ecuación 1. Además, el BR_{app} ha disminuido aproximadamente a 2 a 3 zonas de afinidad elevada.

De los resultados del biosensor se puede ver que los residuos Asn^{232} y Tyr^{233} son importantes tanto para la afinidad como para la especificidad de la fijación de CBD (30-529) a col de tipo II. No parece sin embargo existir un efecto aditivo de la doble mutación si se compara con las mutaciones sencillas.

Ejemplo 2 5.2. Estructura del dominio de fijación de Col de CBP de S. aureus

La base estructural para el targeting del tejido huésped mediante S. aureus aquí presentada revela que el dominio de fijación de Col CBD (151-318) está bien diseñado para interactuar con estructuras de Col de triple hélice. El interface de fijación del dominio se construye a lo largo de una garganta sobre una hoja beta cóncava y tiene una complementariedad geométrica y química considerable con el segmento helicoidal de Col que contiene cuatro repeticiones de Gly-Pro-Hyp o Gly-Pro-Pro por cadena. El análisis mutacional ha confirmado la zona de fijación putativa de Col y sugiere que el modelo de docking simple puede tener una importancia más general. En este modelo, la triple hélice de Col misma es un elemento de reconocimiento importante para la adhesina bacteriana que contiene zona de fijación complementaria. Esto proporciona una explicación estructural a las primeras observaciones de la especificidad de
MSCRAMMs por estructura de triple hélice (Speziale et al., 1986). Además la zona de fijación sugerida sobre la adhesina parece ser versátil por el hecho de que permite una diversidad adecuada pero restringida por complementariedad estructural. La generalidad de este modelo debe esperar el análisis estructural de otras proteínas que interactúan con la triple hélice de Col.

5.2.1. Métodos 5.2.1.1. Cristalización y recogida de datos

El polipéptido recombinante CBD (151-318) se cristalizó con el método de difusión de vapor "hanging drop" utilizando PEG4000 como precipitante, 50 mM tampón HEPES entre pH 6,2 y 6,9 y el detergente n-octil-\beta-D-glucopiranosida. Los cristales pertenecen al grupo espacial trigonal P3_{2}21 y al enantiomorfo P3_{1}21. Los parámetros de la célula unidad son a=74,0 \ring{A}, b=74,0 \ring{A}, c=56,7 \ring{A}, \alpha=90º, \beta=90º, \gamma=120º. Hay una molécula por unidad asimétrica con contenido de disolvente estimado en 44%. Se recogieron los datos de la difracción a temperatura ambiente en un detector de área Siemens Histar y se procesaron con X-GEN de Molecular Simulations Inc. Se recogió cierto número de conjuntos de datos potenciales derivados de átomo pesado aunque solo resultaron útiles para el phasing MIR los derivados de HgCl_{2} y K_{2}PtCl_{4}.

5.2.1.2. Solución estructural y refinación

La solución de ajuste de fase con el manejo del ratón derecho (right handedness) era coherente con el grupo espacial P3_{2}21 y proporcionó un mapa interpretable. El mapa MIR aplanado de disolvente a una resolución de 3 \ring{A} reveló característica importantes de la estructura y resultó adecuado para el rastreo de cadena como la alineación de secuencia. De la secuencia deducida de 168 aminoácidos se alinearon con el mapa 150 residuos entre 169-318. El modelo inicial se refinó a una resolución de 2,4 \ring{A} con X-PLOR (Brunger, 1992) utilizando minimización de gradiente conjuntado, restricciones de fases MIR y F>2\sigma_{F}. En esa etapa, el factor R y el libre R eran de 34,3% y 41,4% respectivamente. El modelo se siguió mejorando con varios ciclos de refinación de hibridación simulada y construcción de modelo manual. Antes de añadir moléculas de agua, se refinaron los factores isotrópicos de temperatura de átomos individuales que no fueran hidrógeno y el factor R y el libre R disminuyeron a 25,3% y 31,3% respectivamente, para el entorno de resolución de 10,0-2,0 \ring{A}. Se acoplaron moléculas de agua a los mapas FO-FC en el nivel 3a. Varias rodas finales de minimización de gradiente conjugado y construcción de modelo manual dieron como resultado un factor R de 20% y libre R de 24,9%. Las coordenadas atómicas de la estructura cristalina se depositarán en el Banco de Datos de Proteínas.

5.2.1.3. Búsqueda del anclaje

En suma, se calcularon superficies de puntos (Connolly, 1993) con vectores normales para el blanco y la sonda respectivamente y se dividieron en cubos de superficie y cubos interiores. El átomo más cercano a cada punto determina la propiedad química representada por un código sencillo de 6 colores. El espacio de rotación de la sonda "cubada" se muestrea y por cada etapa de rotación se calculan todas las traslaciones enteras de los cubos de sonda a cubos blancos estacionarios. Cada traslación de la sonda se registra según la equivalencia de vectores normales, la compatibilidad de códigos de color y la sobreposición de cubos de colores. Se toma la media de las soluciones agrupadas con las mejores puntuaciones y se aplican las rotaciones y traslaciones correspondientes a coordenadas atómicas de la sonda.

\newpage

5.2.1.4. Espectros CD

Todos los espectros CD se recogieron utilizando un espectropolarímetro Jasco J720 calibrado con una solución d de ácido 10-camforsulfónico al 0,1% (peso/volumen). Los espectros se midieron a 25ºC y se tomó la media de 5 exploraciones. Se utilizó una célula de 0,05 cm de longitud de recorrido para UV cercana (250-320 nm) CD y una célula de 1 cm de longitud de recorrido para UV lejana (190-250 nm) CD.

5.2.2. Determinación de la estructura

La estructura cristalina de CBD (151-318) se determino utilizando métodos de sustitución isomorfa (MIR) múltiple/de átomo pesado convencionales y se refinó hasta un factor R cristalográfico de 20% (R_{free}= 24,9%) utilizando datos de difracción entre 10,0 y 2,0 \ring{A} de resolución (cuadro 2). El modelo refinado comprende 150 aminoácidos entre residuos 169-318 y 74 moléculas de agua. La desviación cuadrática media (RMS) de las longitudes de enlace ideal es de 0,012 \ring{A}, y la desviación RMS de los ángulos ideales es de 1,625º. El modelo tiene una alta puntuación en el análisis PROCHECK (Laskowski et al., 1993), y el gráfico Ramachandran de los ángulos de conformación \phi\Psi no presenta ningún valor atípico. La densidad electrónica era de buena calidad en toda la estructura y había 8 cadenas laterales exteriores desordenadas en el modelo final. No se observó densidad electrónica para los residuos terminales N 151-168.

5.2.3. Descripción de la estructura

La estructura molecular del dominio de fijación Col recombinante es muy compacta con dimensiones aproximadas de 55 x 35 x 25 \ring{A}. La cadena de polipéptidos e CBD (169-318) está plegada en un modelo topológico "jelly-roll" (rollo gelatinoso) (figura 1) (Richardson, 1981). La estructura secundaria del dominio consiste en 53% hoja \beta, 39% arrollamiento y 8% hélice. No hay ningún puente disulfuro o cisteína s libres. Todo el dominio está compuesto prácticamente por dos hojas \beta, paralelas entre sí y dos hélices \alpha pequeñas (figura 2). Las hojas \beta I y II forman un sándwich con un interior en gran medida hidrofóbico. El lado descubierto de la hoja \beta I tiene tendencia cóncava mientras que la hoja \beta II tiene una cara convexa. Hay cinco cadenas antiparalelas en cada hoja \beta las cadenas D y J tienen roturas con estructura secundaria menos definida. Una pequeña hélice \alpha de dos vuelta está presente en el entrecruzamiento entre cadenas E y F sobre el lado más ancho del sándwich. Se aprecia una sola vuelta helicoidal \alpha en la conexión entre las cadenas G y H. Otras conexiones adoptan diversas formas de estructura en espiral. Tres residuos cargados K176, D209 y E301 se encuentran enterrados en el interior de la molécula y todos ellos se definen bien en mapas de densidad electrónica. K176 y D209 son puenteados por N293 por enlaces de hidrógeno y el residuo E301 es un hidrógeno unido a S199. El empaquetamiento cristalino tiene como resultado unas canales de disolvente grandes, de aproximadamente 35 \ring{A} de diámetro, a lo largo de los 3 ejes helicoidales. Los dominios están empaquetados entorno a los ejes helicoidales exponiendo la mayor parte de la hoja \beta II a los canales disolventes.

La superficie molecular de Connolly (Connolly, 1983) de la estructura cristalina de CBD (169-318) muestra una garganta aparente sobre la hoja \beta I (figura 3A) que indica una región de fijación de Col putativa. Esta garganta tiene aproximadamente 10 \ring{A} de ancho y se extiende diagonalmente por las cadenas D, H y B en la dirección aproximada T221 - N196. Con la excepción de los residuos de terminal N desordenados 169 y 170 de una molécula de simetría afín, no hay ningún contacto intermolecular corto significativo para los residuos y entorno a la misma. Los residuos exteriores en la hoja \beta I, específicamente K280,. R189, F191, Y175, E197, S235, Y233, N225, T227 y K198 (figura 3A) delimitan y forman las paredes de la garganta. Los residuos N193, N223, S274 y N278 con superficie accesible inferior a 20 \ring{A}^{2} están sepultados en la garganta; N196 y S276 están también en el interior de la garganta pero relativamente más expuestos (figura 3A). Los únicos resultados hidrofóbico en la región de fijación putativa de Col son V172, L181 y
F191. Los residuos cargados D179, E197, K198, D218 y K280 están situados en torno a los bordes de la garganta junto con Y175 e Y233, cuyos anillos fenólicos están orientados hacia el interior de la garganta. Las conformaciones de algunas cadenas laterales son estabilizadas por enlaces de hidrógeno, como por ejemplo R189 están enlazado por medio
de hidrógeno a D179 y K198 a S274. No se encuentra ninguna molécula de agua con enlace fuerte en la hoja \beta I.

La secuencia peptídica D209-Y233 era, según ya se indicó, esencial para la actividad de fijación de Col (Patti et al., 1995). En estructura cristalina, esta secuencia abarca la cadena D y parte de las cadenas C y E con residuos exteriores T221, N223, N225, T227 e Y233 en la región de fijación putativa de Col. Además, la mutación de un residuos 233Y \rightarrow A en el dominio 55 kDa A del MSCRAMM ha visto su actividad de fijación de Col fuertemente reducida (Patti et al., 1995).

5.2.4. Anclaje de Col

Unos estudios anteriores han mostrado que el MSCRAMM de fijación de Col sobre S. aureus interactúa en varias zonas en tipos diferentes de Col (Patti et al., 1993) pero reconoce colágenos de forma de triple hélice (Speziale et al., 1986); por consiguiente la zona de fijación de Col dentro del MSCRAMM deberá terne provisiones para la interacción directa con un motivo de triple hélice. Los colágenos son glucosilados en varios grados según el tejido. La posibilidad de fijación de Col se comprobó mediante el carbohidrato por cocristalización y empapado de CBD (151-318) con glucosa, galactosa, lactosa, respectivamente. Aunque se obtuvieron cristales isomorfos de gran calidad, los mapas de diferencia de Fourier no indicaron ninguna fijación apreciable de los carbohidratos. La conformación básica de triple hélice, de diámetro aproximado de 15\ring{A}, consiste en tres hélices de poliprolina II enrolladas que requieren la presencia de residuos de glicina en cada tercera posición de la secuencia. Esto da como resultado un modelo repetitivo (GLY-X-Y)_{n}, donde las posiciones X e Y son ocupadas frecuentemente por prolina y residuos de 4-hidroxiprolina (Hyp), respectivamente. Los hidroxilos de residuos Hyp, esenciales para la estructuración de redes de agua en torno a las triples hélices desempeñan una función fundamental en la estabilización de Col (Bella et al., 1994). Otros aminoácidos en las posiciones X e Y no siguen un modelo claro. El MSCRAMM de fijación de Col de S. aureus reconoce péptidos sintéticos (Gly-Pro-Pro)_{n} y (Gly-Pro-Hyp)_{10} (Speziale et al., 1986) que según se sabe forman una triple hélice similar a Col en solución (Sakakibara et al., 1973; Heidemann and Roth, 1982). Por el contrario, el receptor no reconoce la poliprolina que no puede formar la triple hélice Col, o (Gly-Ala-Pro)_{n}, que está enrollada en solución (Segal and Traub, 1969). Los análisis anteriores de biosensor de la fijación de MSCRAMM a Col de tipo II indicaron múltiples zonas de fijación de afinidades diferentes por Col. En particular, CBD (151-318) parece reconocer dos clases de zonas de fijación con constantes de disociación aparente de 3 x 10^{-6} M y 3 x 10^{-5} M, respectivamente (Patti et al., 1993). Es probable que el MSCRAMM interactúe con mayor afinidad con secuencias específicas de Col pero la estructura de triple hélice de Gly-Pro-Pro/Hyp repetidos parece representar un motivo general de fijación.

El carácter compacto y el tamaño relativamente pequeño del dominio CBD (169-318), la asociación aparentemente estrecha de sus hojas \beta y la información adicional sobre la especificidad de la adhesina por las estructuras de triple hélice (Speziale et al., 1986) proporcionaron una oportunidad única para realizar estudios de anclaje sistemáticos. Se utilizaron sondas con repeticiones de Gly-Pro-Pro/Hyp en la búsqueda de la superficie molecular total del dominio de fijación de Col para regiones con compatibilidad geométrica y química. Un anclaje manual preliminar del modelo Col a CBD (169-318) indicó que la superficie de las hojas \beta I puede alojar un fragmento de hasta cuatro repeticiones de Gly-Pro-Hyp o Gly-Pro-Pro por cadena. Se derivaron cuatro sondas Col del Banco de Datos de Proteínas para los cálculos del anclaje: 1BBE (Nemethy et al., 1992), un modelo teórico de [(Gly-Pro-Pro)_{4}]_{3} donde se procedió a la deleción de grupos terminales de acetilo y metilamina; 2CLG (Chen et al., 1991) un modelo teórico [(GIy-Pro-Hyp)_{12}]_{3}
que se acortó a [(Gly-Pro-Hyp)_{4}]_{3} y a [(Gly-Pro-Hyp)_{6}]_{3} e 1CAG (Bella et al., 1994), la estructura cristalina de un péptido similar a Col [(-Pro-Hyp-Gly)_{4} Pro-Hyp-Ala (Pro-Hyp-Gly)_{5}]_{3} se acortó al terminal C [(Gly-Pro-Hyp)_{4}]_{3}.
El blanco de anclaje era la estructura cristalina refinada de CBD (172-318) con los residuos desordenados de N terminal 169-171 excluidos. El anclaje se realizó como búsqueda completa de seis dimensiones utilizando el algoritmo de cubos "matching" (Jiang and Kim, 1991) aplicado en el programa SoftDock. Se evaluaron las 16 soluciones principales en cada búsqueda y se encontraron coherentemente soluciones con los mejores resultados a lo largo de la garganta en el hoja \beta I en la dirección T221-N196. Las hélices de Col estaban siempre orientadas en esta dirección del término N al término C. El resultado de anclaje fue empeorando drásticamente cuando se forzó en el sentido opuesto. Aparentemente, la hélice Col se empareja a la "nut" de la adhesina en esta zona (figura 3B). Las variaciones de las longitudes de la zona, parámetros helicoidales y conformaciones anulares de la proteína así como el intercambio de Pro y Hyp en la posición Y de la sonda tuvieron efectos mínimos en las posiciones finales "ancladas". Los análisis visuales y computacionales no indicaron ningún conflicto serio en predisposiciones químicas y distancias atómicas entre la zona de fijación y las sondas Col. Todos los complejos anclados con éxito son energía - minimizables en X-PLOR (Brunger, 1992) con una pequeña pérdida del carácter helicoidal regular y sutiles cambios conformacionales en las cadenas laterales del receptor.

5.2.5. Análisis mutacional

Se utilizó el análisis mutacional para evaluar la zona de fijación putativa definida por la búsqueda de anclaje. Se tomaron como blanco los residuos de superficie que mostraban una reducción en su área accesible disolvente (Cuadro 3 y figura 4). La superficie cubierta por el Col anclado es de aproximadamente 1630 \ring{A}^{2}, lo cual supone el 22% de la superficie total accesible al disolvente de CBD (172-318). Hay 19 residuos sobre la interface que mostraba una reducción de zona accesible al disolvente de más de 10 \ring{A}^{2}. Nueve de estos residuos se mutaron así como dos residuos adicionales fuera de la región de fijación putativa. Las mutaciones de lisina y alanina de una sola zona fueron diseñadas para interrumpir la superficie de la garganta de fijación putativa de Col de tipo natural CBD (151-318). Las proteínas mutantes no mostraron ningún cambio significativo en los espectros de dicroísmo circular UV cercano o UV lejano al compararlos con el tipo natural recombinante; lo cual pone de relieve que las diversas mutaciones no tienen un efecto medible sobre la conformación global. El MSCRAMM reconoce estructuras genéricas de triple hélice (Speziale et al., 1986; Sakakibara et al., 1973; Heidemann and Roth, 1982), por consiguiente se utilizaron cambios en las constantes de disociación de baja afinidad para evaluar alteraciones en la fijación de las proteínas mutantes (House-Pompeo et al., 1994).

Para los mutantes 212Q \rightarrow A, 232N \rightarrow A, 221T \rightarrow K, Y 225N \rightarrow K (Cuadro 3) la actividad de fijación de Col, expresada como constante de disociación aparente K_{D}, no difiere notablemente de la de CBD (151-318) de tipo natural. El residuo Q212 está situado en la hoja \beta II, lejos de la zona de fijación sugerida y fue mutado como residuo de control. No mostró ningún cambio significativo en afinidad por Col. La cadena lateral de N232 no forma parte de la garganta de fijación (Figura 3A y figura 4) y no presenta ninguna reducción de accesibilidad del disolvente en el anclaje del Col. De acuerdo con esto, la mutación 232N \rightarrow A en CBD (151-318) tuvo un efecto muy pequeño sobre al fijación de Col. Los residuos T221 y N225 son residuos marginales de la garganta de fijación con cadenas laterales relativamente pequeñas. Los estudios de modelación muestra que las cadenas laterales de lisina en las posiciones 221 y 225 pueden adoptar conformaciones que no interfieren con sondas Col y apuntan hacia la región disolvente.

Las alteraciones específicas de zona de residuos en N193, N223 y N278 a residuos de lisina dieron como resultado proteína recombinantes con una afinidad notablemente reducida por Col. Estas zonas se encuentran en el interior de la garganta de fijación y, según el modelo de anclaje, están prácticamente sepultadas por el Col fijado. Por consiguiente, las cadenas laterales de lisina tienen menos libertad conformacional en estas zonas y pueden evitar estéricamente que la adhesina adopte la posición adecuada a lo largo de la hélice Col. Es significativo que la constante de disociación más elevada para 193N \rightarrow K comparada con las otras dos mutaciones se pudo atribuir a su proximidad a la "pared" de la garganta de fijación putativa de Col y residuos críticos Y175 y F191.

Las mutaciones en posiciones Y233, F191, R189 e Y175 dieron como resultado proteínas con afinidad extremadamente baja por Col comparado con CBD (151-318) de tipo natural, lo cual sugiere que estos son algunos de los determinantes principales para la fijación de Col. Las cuatro zonas de mutación involucran residuos grandes, relativamente expuestos, que forman las paredes laterales de la garganta de fijación putativa. La mayor disminución de área accesible al disolvente en anclaje Col. Es para Y233 y unos estudios de modelado sugieren un número de contactos con sondas Col para este residuo. Aunque los residuos 189 e Y175 mostraron contactos relativamente menores con sondas Col ancladas, la mutación de estos residuos destruye esencialmente la fijación Col con valores K_{D} cercanos al entorno milimolar. Los resultados para estos dos residuos pueden reflejar la sencillez de la sonda utilizada en el modelado y las posibles optimizaciones para "anclarla". Es importante señalar que aunque se utilizaron péptidos genéricos en los estudios de anclaje, el análisis biosensor de los mutantes específicos de zona mostraron un grado elevado de correlación con Col nativo de tipo II.

El análisis mutacional muestra dos tendencias generales. La mutación Lys/Ala de residuos grandes que forman las paredes de la garganta de fijación afecta drásticamente la afinidad de la adhesina a Col. La mutación de residuos más pequeños hallados en el interior de la garganta o cerca de sus paredes muestra efectos moderados e incluso ninguno sobre la fijación. Globalmente, los resultados del análisis mutacional concuerdan bien con las interacciones que se han visto en el modelo de fijación de Col derivado de anclaje sistemático de sondas genéricas de Col. La fijación de Col nativo involucra algunos residuos no-prolina en posiciones X/Y. Otros estudios de modelación indican que además de reconocer los tripletes genéricos, la zona de fijación de CBD (151-318) también puede alojar otros residuos pequeños no-prolina. La distribución predominante de residuos polares pequeños (Thr, Asn y Ser) en la garganta de fijación puede imitar posiblemente la hidración esencial en la estabilización de hidroxiprolinas. Además, pueden facilitar estéricamente la fijación de diversos residuos sugeridos en secuencia Col. Por lo tanto es posible que unas secuencias específicas de Col puedan fijar mejor que los tripletes genéricos utilizados en estudios de anclaje y pueden dar cuenta de las zonas de fijación de mayor afinidad observadas sobre Col II (Patti et al., 1993).

CUADRO 2

Recogida de datos y estadística de fasaje (phasing) DE CBD (151-318)

	NATIVO	HgCl_{2} (I)	HgCl_{2} (II)	K_{2}PtCl_{4}
Gradación interna
Nº. de cristales	3	1	1	1
Reflexiones observadas	104150	6505	10133	9040
Reflexiones únicas	13094	3495	5588	3208
Completitud (%)	97,2	92,6	85,0	85,0
Resolución (A)	2,0	3,0	2,5	3,0
R_{sym}^{1} (%)	7,8	7,0	5,8	3,2
Gradación derivada
Resolución (A)		3,0	3,0	3,0
R_{merge}^{2}(%)		19,1	43,0	16,0
Nº. de zonas		4	5	2
Poder de fase (phasing)^{3}		2,09	2,73	1,83
R_{CULLIS}^{4} (%)		51,1	39,1	58,1
R_{KRAAUT}^{5} (%)		7,6	18,4	6,5
Coeficiente de calidad^{6}		0,442	0,390	0,423
^{1}R_{SYM} = \sum_{h} \sum_{t} |I(h)-I_{i}|/ \sum h\sum_{i}I (h) donde I_{i} (h) e I(h) son las medidas i-th y media de la intensidad de reflexión h.
^{2}R_{MERGE} = \sum_{h}|F_{P}(h) – F_{PH}(h)|/ \sumF_{P} (h), donde F_{p}(h) y F_{PH} son factores de estructura derivada y gradada observados de la refle-
\hskip0,2cmxión h.
^{3}Poder de fase es la relación entre la desviación cuadrática media (RMS) de las amplitudes de estructura de átomo pesado y la
\hskip0,2cmfalta de cierre RMS.
^{4}R_{CULLIS} = \sum |||F_{PH}|_{OBS}+|F_{P}|_{OBS} +| F_{H}|_{CALC}|/\sum|F_{PH}|_{OBS}+|F_{P}|_{OBS}|, donde F_{PH} Y F_{P} son las amplitudes de factor de estructura
\hskip0,2cmobservado para el conjunto de datos nativos y derivados de átomo pesado, con la suma de todas las reflexiones céntricas y F_{H}
\hskip0,2cmes el factor estructural de átomo pesado.
^{5}R_{KRAUT} = \sum||F_{PH}|_{OBS} -\sum|F_{PH}|_{CALC}|/\sum|F_{PH}|_{OBS} con la suma tomada de todas las reflexiones céntricas.
^{6}El coeficiente global de calidad es 0,662

CUADRO 3

CBD	K_{P}(mM)	BR
CBD (151-318)	31	10
212Q \rightarrow A	34	10
221R \rightarrow K	34	9
225N \rightarrow K	30	10
232N \rightarrow A	38	12
278N \rightarrow K	50	9
223N \rightarrow K	53	10
193N \rightarrow K	140	12
233Y \rightarrow A	195	11
191F \rightarrow A	199	10
189R \rightarrow A	>350	>13
175Y \rightarrow K	>460	>20

Constantes de disociación aparente (K_{D}) y relaciones de fijación aproximadas (BR) para la fijación de CBD (151-318) y mutantes correspondientes a Col tipo II según lo determinado por análisis de biosensor. Las diluciones seriales de cada proteína, tipo natural y mutantes respectivamente, se hicieron pasar sobre Col tipo II inmovilizado covalentemente [Sigma]. La respuesta de fijación de equilibrio a los 10 segundos de la inyección se utilizó para calcular las constantes (Patti et al., 1995; House-Pompeo et al., 1994).

Ejemplo 3 5.3. Inmunización pasiva utilizando epítopos de MSCRAMMs

Los aminoácidos subrayados están codificados en el vector pQe^{TM}- 30 (Qiagen Inc., Chastworth, CA).

5.3.1. Derivado M17 de MSCRAMM de fijación col de S. aureus (SEQ ID NO: 2)

\vskip1.000000\baselineskip

1

\hskip0,7cm (El número de acceso GenBank de gen cna completo es M81736).

\vskip1.000000\baselineskip

5.3.2. Epitopo M17 ADN CBP S. aureus (SEQ ID NO: 1)

\vskip1.000000\baselineskip

2

5.3.3. M31 Derivado de MSCRAMM de fijación col S. aureus (SEQ ID NO: 4)

3

\hskip12mm (El número de acceso GenBank de gen cna completo es M81736).

5.3.4. ADN M31 Epitopo CBP S. aureus (SEQ ID NO: 3)

4

5.3.5. M55 Derivado MSCRAMM Fijación Col S. aureus (SEQ ID NO: 6)

5

\hskip11mm (El número de acceso GenBank de gen cna completo es M81736).

5.3.6. ADN M55 Epitopo M55 S. aureus (SEQ ID NO: 5)

6

5.3.7. pCF33 Derivado MSCRAMM de fijación fib S. aureus (SEQ ID NO: 7)

7

\hskip0,1cm (El número de acceso GenBank de gen clfA completo es Z18852).

5.3.8. Derivado MSCRAMM fijación fibronectina S. aureus pQD (SEQ. ID NO: 8)

8

\hskip0,1cm (El número de acceso GenBank de gen fnbA completo es I128324)

5.3.9. Utilización de IgG anti MSCRAMM de conejo policlonal hiperinmune purificado en la inmunización pasiva. 5.3.9.1 Mastitis bovina

Diversos estudios han sugerido que el daño celular epitelial y la exposición de moléculas ECM dentro del orificio del canal de la tetilla y la glándula mamaria son factores críticos que conducen al desarrollo de la mastitis (Gudding et al., 1984; Olmsted and Norcross 1992; Cifrian et al., 1995). La adhesión de S. aureus al tejido de la glándula mamaria se considera como la primera etapa en el desarrollo de la mastitis. Por consiguiente, las adhesinas que median la fijación de S. aureus en tejidos de glándula mamaria bovina son los blancos típicos para el desarrollo de anticuerpos de bloqueo. Los anticuerpos policlonales hiperinmunes generados contra varios MSCRAMMs han sido analizados para conocer su aptitud para inhibir la fijación de la cepa M60 de S. aureus en células epiteliales secretoras mamarias de bovino cultivadas. Una reducción, dependiente de la dosis, en la adherencia de S. aureus se demostró con el IgG anti-MSCRAMM policlonal de conejo a las CBPs de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8.

5.3.9.2. Detalles experimentales

En suma, se añadieron 5 x 10^{4} células epiteliales secretoras, en 100 \mul de medio de cultivo, a placas de 96 pocillos de fondo plano revestidas con Col y se cultivaron a confluencia a 37ºC. Las cepas de S. aureus se cultivaron durante la noche en caldo de soja tripticasa (TSB) a 37ºC. El cultivo de la noche se diluyó en TSB fresco y se desarrollo hasta que el cultivo alcanzó la fase exponencial, se cosecharon los organismos y se resuspendieron en 3 ml de medio de cultivo fresco. Las bacterias (3,1 x 10^{8}) se incubaron con cantidades crecientes de IgG anti-MSCRAMM durante 30 minutos a 37ºC. Se añadieron entonces las bacterias pre-tratadas a las capas celulares (4,1 x 10^{6} células epiteliales) y se incubaron durante 3 horas a 37ºC. Las monocapas se lavaron entonces 5 veces con salino tampón de fosfato. Las monocapas se fijaron con metanol y se tiñeron con Giemsa. Se examinaron 20 campos (100X objetivos) en cada monocapa para comprobar la presencia de bacterias adherentes.

5.3.10. Peritonitis

Los pacientes sometidos a diálisis (diálisis peritoneal ambulatoria continua, hemodiálisis) presentan un riesgo creciente de que se desarrollen infecciones debidas a estafilococo. Utilizando modelo animal de peritonitis (Menzies and Kernodle 1996) hemos demostrado que la inmunización pasiva con una sola dosis subcutánea de IgG anti-
MSCRAMM puede proteger a los ratones contra la exposición intraperitoneal a S. aureus. Al exponer ratones a la acción de S. aureus, únicamente se infectaron el 27% (10/37) de los ratones inmunizados pasivamente con IgG anti-
MSCRAMM. Por el contrario, el 76% de los ratones inmunizados pasivamente con suero de conejo normal resultaron infectados.

* Compilación de tres estudios separados

Se utilizaron ratones machos NIH Swiss, de 6-8 semanas de edad y de 18-22 g de peso (Harlab Sprague Dawley, Indianápolis, IN). Se administró IgG anti-MSCRAMM en forma de infección subcutánea (s.c.) de 0,25 ml en el muslo de los ratones. Los ratones de control recibieron una cantidad equivalente de IgG normal de ratón (Sigma Chemical Co. St. Louis, MO). Cuarenta y ocho horas después de la inmunización, se expusieron los ratones intraperitonealmente (i.p.) a la acción de S. aureus. La cepa bacteriana se preparó desarrollando durante la noche en caldo de infusión de corazón cerebro (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, MD), lavando dos veces en PBS y volviendo a suspender en PBS, ajustando por transmisión de luz a una concentración de 6 x 10^{8} cfu/ml. Se inocularon los ratones con 0,5 ml de la suspension bacteriana. Una parte de la suspension bacteriana se cultivó en placas de Petri sobre agar de sangre de oveja para determinar el cfu/ml exacto. Se sacrificaron los ratones 48 horas después de la inoculación bacteriana. Se extirparon asépticamente ambos riñones de cada uno de los ratones, se colocaron en una bolsa estéril que contenía 0,5 ml de PBS, y se homogenizaron durante 30 segundos utilizando un Tekmar Tissumizer (Tekmar, Cincinnati, OH). El homogenado se diluyó serialmente en agua estéril y se cultivo en placas de Petri con agar de sangre de oveja y se incubó a 37ºC. Se contaron las placas 18-24 horas después. Se consideraron negativos los homogenados de riñones de ratones que contenía <100 cfu/ml. Los resultados se muestran en el cuatro 4.

CUADRO 4

Total	IgG de conejo anti-MSCRAMM	IgG de conejo normal nº.
Dosis IgG (mg/ratón)	nº. de ratones infectados/ratones	de ratones infectados/
	totales (%)	ratones totales (%)
0,3	5/6 (83%)	4/5 (80%)
0,6	1/6 (17%)	4/6 (67%)
1,63	8/23(35%)^{a}	16/21 (76%)
3,50	1/8/(13%)^{b}	8/10 (80%)
^{a}P = 0,006
^{b}P = 0,005

5.3.11. Demostración de la eficacia terapéutica en el modelo de neumonía

El Staphylococcus aureus es un agente, peligroso para la vida, de la neumonía nosocomial en pacientes inmunocomprometidos. Muchas veces el S. aureus aislado de estos pacientes muestra una resistencia de amplio espectro a los antibióticos, particularmente a la meticilina. Se utilizó un modelo de ratón experimental de neumonía por estafilococo (Ramisse et al., 1993) para evaluar la aptitud de IgG anti-MSCRAMM para proteger los ratones neutropénicos contra la neumonía mediada por S. aureus. Los ratones que habían sido tratados intranasalmente con IgG anti-MSCRAMM 3 horas después de la inoculación bacteriana tenían una reducción de más de 1000 veces en la cantidad de bacterias recuperadas de sus pulmones (p<0,01) comparado con los animales de control tratados con PBS.

5.3.11.1. Detalles experimentales

Se trataron intravenosamente ratones hembra BALB/c de cuatro semanas de edad con ciclo fosfamida a ratón de 150 mg/kg el día 4 y 75 mg/kg el día 1 antes de la exposición bacteriana. La ciclo fosfamida induce una neutropenia transitoria en los ratones. El S. aureus se cultivó en caldo de soja tripticasa (TSB) durante la noche a 37ºC. Los cultivos se lavaron y ajustaron a \ring{A} 6,3 x 10^{6} cfu/ml en PBS. Se cultivó en placas de Petri una parte de la suspension bacteriana sobre agar de sangre de oveja para determinar el cfu/ml exacto. Los ratones fueron anestesiados y se les inoculó 50 \mul de suspensión bacteriana. Tres horas después de la exposición bacteriana, cada ratón recibió 75 \mug de IgG de anti-MSCRAMM, 75 \mug de IgG anti-MSCRAMM, o PBS por vía intranasal. Para comprobar la colonización de los pulmones por la bacteria, se sacrificaron 5 ratones por período de tiempo. Los recuentos bacterianos se determinan a partir de homogenatos pulmonares (los pulmones son diseccionados cuidadosamente de los bronquios principales) diluios serialmente en PBS cultivando en placa Petri partes de 100 \mul sobre agar de soja tripticasa y recontando el cfu tras la incubación durante 24 horas a 37ºC. Los recuentos bacterianos se expresaron como la media (\pm SE). La importancia estadística se determinó mediante el test de Student. Los resultados se muestran en el cuadro 5.

CUADRO 5

Tratamiento	Cinética de la infección pulmonar (cfu/ml)
	3 horas	24 horas	48 horas
Estudio 1
Control PBS	4,80\pm0,09	6,40\pm0,30	7,93\pm0,20
7,5 \mug de IgG anti-MSCRAMM/ratón	4,94\pm0,14	6,33\pm0,38	7,04\pm0,12
75 \mug de IgG anti-MSCRAMM/ratón	5,20\pm0,08	6,03\pm0,70	5,53\pm0,80^{a}
Estudio 2
Control PBS	5,30\pm0,03	7,15\pm0,08	7,98\pm0,11
7,5 \mug de IgG anti-MSCRAMM/ratón	no realizado	5,50\pm0,54	5,52\pm0,40
^{a}p < 0,01
ND = no realizado

5.3.12. Inmunización pasiva utilizando epítopos de CBP

En estudios separados se inmunizaron unas ratas con M55 o BSA como control, según lo aquí descrito. Se sangraron y la fracción de IgG obtuvo por precipitación de sulfato de amonio. La fracción IgG (16 mg) se administró a ratones un día antes de la exposición IV con S. aureus. Estos datos de inmunización pasiva confirman la eficacia de la inmunización activa. Es decir, los anticuerpos dirigidos contra M55 de CBP protegen contra dosis letales de S. aureus (figura 8).

Ejemplo 4 5.4. Estudios animales en los que interviene la CBP de S. aureus

La infección corneal es una causa que conduce a la pérdida visual y constituye un problema muy importante de la sanidad en los Estados Unidos. La queratitis se produce cuando los factores de virulencia microbiana superan los mecanismos de defensa del huésped. El patógeno cornea) exitoso se fija a la superficie corneal, evitando los mecanismos de aclaramiento de la película lacrimal. Unas proteínas específicas de la superficie bacteriana se adhieren a componentes específicos de la cornea, como la fibronectina, fibrinógeno, y Col. Las adhesinas microbianas específicas median esta adherencia mediante una interacción sofisticada con moléculas huésped.

Se han utilizado MSCRAMMs de S. aureus utilizando diversos modelos animales. Estos MSCRAMMs están localizados en la superficie de S. aureus e interaccionan con componentes ECM de elevada afinidad y especificidad. Los MSCRAMMS que reconocen la fibronectina, el fibrinógeno y el Col ya han sido descritos anteriormente con respecto a la organización estructural, los dominios de fijación de ligando, la importancia en la colonización e invasión de huésped, y las funciones biológicas como factores de virulencia.

Los inventores han utilizado estudios in vitro e in vivo para determinar el papel de la CBP en la patofisiologia de la queratitis infecciosa.

5.4.1. Fijación de Col por aislados oculares

Se eligieron aleatoriamente 20 aislados clínicos de S. aureus del Cullen Eye Institute del Baylor College of Medicine (Houston, TX). Cada uno de ellos se aisló de un caso anterior de queratitis bacteriana con técnicas clínicas standard. El Col de tipo II se rotuló con ^{125}I utilizando el método de cloramina-T. Se desarrolló durante la noche un cultivo de 5 ml de cada cepa en caldo de infusión de corazón-cerebro. Las células se centrifugaron y se volvieron a suspender en 1 ml de PBS. Para cada ensayo, se incubaron 50 \mul de células bacterianas (aproximadamente 5 x 10^{8} cfu/ml) con 400 \mul de PBS con 0,1% BSA y 0,1% Tween 80® y 4 x 10^{4} cpm del Col de tipo II rotulado ^{125}I. Se incubaron unos tubos a una temperatura ambiente durante 1 hora haciéndose girar totalmente. La reacción se detuvo al añadir 3 ml de PBS muy frío que contenía 0,1% de Tween® y los tubos se centrifugaron inmediatamente a 1500 x g durante 20 minutos. Después de aspirar el sobrenadante, se analizó el nódulo que contenía células bacterianas para comprobar su radiactividad en un contador gamma. Se analizaron muestras triplicadas y se restaron los valores de base que representan la radiactividad recuperada en los tubos incubados en ausencia de
bacterias.

El análisis de los aislados clínicos sugirió que la fijación a Col es un fenómeno "todo o nada". El 30% (6/20) de los aislados de S. aureus interactuaron con Col rotulado. También se analizó la actividad de fijación de Col en 18 cepas adicionales de S. aureus aisladas del vítreo de pacientes con queratitis bacteriana. Lo que es interesante que el 72% (13/18) de estas cepas fijadas Col. Tomados juntos estos datos sugieren que la fijación de Col es un determinante de virulencia importante en la patogénesis de infecciones oculares por S. aureus.

5.4.2. Estudios animales en los que interviene la queratitis por S. aureus

En estudios ulteriores, los inventores han examinado si la aptitud para fijar Col era importante en la producción de queratitis microbiana en el conejo. Unos modelos animales previos de queratitis por S. aureus necesitaron una inyección intraestromal directa para inducir la infección. La adhesión bacteriana al tejido cornea) dañado es muy probablemente el evento iniciador en el desarrollo de la queratitis, y por lo tanto para imitar de forma más estrecha el curso natural de la enfermedad se desarrolló un modelo animal que no implica inyección intraestromal. Para determinar si el MSCRAMM de Col S. aureus puede ser considerado un factor de virulencia en la queratitis se desarrolló un modelo de conejo para este estudio. Se colocaron lentes de contacto blandas en un medio de cultivo de una cepa de S. aureus Phillips (CBP^{+}) y su derivado mutante isogénico PH100 (CBO^{-}). Las lentes de contacto se incubaron durante 24 horas en el medio de cultivo que contenía aproximadamente 10^{8} bacterias. El resultado fue 1 x 10^{6} bacterias fijada a la lente de contacto para PH100 y 2 x 10^{5} organismos fijados a la lente para la cepa Phillips. Esta diferencia no era estadísticamente importante. Las lentes de contacto suaves se lavaron en PBS para eliminar cualquier organismo fijado no demasiado fuertemente y se colocaron entonces sobre las corneas des-epitelializadas de conejos blancos de Nueva Zelanda. La membrana nictitante de los conejos se eliminó para prevenir la dislocación de la lente de contacto y los párpados se cerraron y suturaron con 7-0 Vicry®. En un ensayo ciego se utilizó un total de 16 conejos, 8 en cada grupo. Se abrieron los ojos 48 horas después de la colocación de lente de contacto. Se realizaron raspados de cornea que se colocaron sobre agar de sangre para confirmar la presencia de infección y eliminaron las corneas para proceder al examen histológico. Uno de los conejos asignados al grupo CBP^{-} desarrolló una dehiscencia espontánea del cierre de la tarsorrafia y pérdida de la lente de contacto de forma que se eliminó el animal del estudio. El 75% (6/8) de los conejos con lentes de contacto incubadas con la cepa Phillips (CBP^{+}) desarrollaron queratitis microbiana clínica, según se puedo comprobar por la queratitis estromal supurativa central densa. Los cultivos confirmaron la presencia de S. aureus en todos los casos infectados. Por el contrario, 0/7 conejos con lentes de contacto incubada con el pH100 desarrollaron queratitis supurativa, aunque en todos los casos permaneció el defecto epitelial. Esta diferencia en el porcentaje de queratitis era estadísticamente importante (prueba exacta de Fisher
p=0,006).

La eficacia de un inhibidor de molécula pequeña basado en la estructura tridimensional de CBD (151-318) se puede comprobar utilizando el modelo de queratitis bacteriana. Una vez incubada la lente de contacto con S. aureus y lavada para eliminar cualquier organismo fijado no fuertemente, el contacto contaminado se colocó en una solución que contiene el inhibidor. El inhibidor interactuará con la zona activa saturando el MSCRAMM Col y evitando que la bacteria se adhiera a las fibras de Col expuestas/desnudas en la cornea dañada. Además de evitar la queratitis bacteriana por S. aureus, el inhibidor se tendría que añadir a soluciones utilizadas habitualmente por bancos de ojos para evitar infecciones en recipientes de lentes de donantes.

Ejemplo 5 5.5. Modelo de artritis séptica en ratón

Utilizando el modelo de ratón de artritis séptica (Bremell et al., 1992), los inventores han estudiado la utilización de dominios recombinantes, CBD (151-297) y CBD (61-343), de MSCRAMM Col de S. aureus, como componentes de vacunas. Se vacunaron 18 ratones con 100 \mug de proteína (GST-61-343) en adyuvante completo de Freund (FCA) los días 34, 21, 9. Se inyectó a 25 ratones de control PBS-FCA los mismos días. Los ratones recibieron una inyección intravenosa de cepa de S. aureus Phillips el día 0. Los ratones inmunizados con GST-61-343 tenían un 50% de reducción en la artritis comparado con los ratones de control. También se han realizado estudios adicionales que utilizan dominios diferentes del MSCRAMM de Col de S. aureus.

Ejemplo 6 5.6. Evidencia de que únicamente ciertos epítopos Particulares de CBP Confieren protección contra infección por S. aureus

El siguiente ejemplo muestra el uso eficaz de epítopos de CBP como componentes de vacuna, y composiciones útiles para conferir protección a un animal contra infección por S. aureus.

5.6.1. Modelo de sepsis de ratón - epítopos CBP utilizados

M17 contiene aminoácidos 151-297 de CBP de longitud completa (SEQ ID NO. 2)

M31 contiene aminoácidos 61-343 de CBP de longitud completa (SEQ ID NO. 4)

M55 contiene aminoácidos 30-531 de CBP de longitud completa (SEQ ID NO. 6)

Los segmentos de ADN que codifican epítopos M17, M31 y M55 se describen en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 5 respectivamente.

5.6.2. Programa de inmunización

Día -31: 100 \mug/ratón de un epítopo de CBP (es decir M17, M31 o M55) o BSA emulsionado. Con adyuvante completo de Freund (Difco Laboratories) como control.

Día -18: 100 \mug/ratón de un epítopo de CBP (es decir M17, M31 o M55) o BSA disuelto en salino de tampón fosfato estéril (PBS)

Día -7: 100 \mug/ratón de un epítopo de CBP (es decir M17, M31 o M55) o BSA disuelto PBS.

Día 0: inoculación intravenosa cepa S. aureus Phillips (que expresa CBP) (dosis: 2,8 x 10^{7} cfu/ratón)

Día 14: Final del estudio; todos los ratones supervivientes se sometieron a eutanasia

5.6.2. Resultados

10/15 ratones murieron en el grupo MSCRAMM de fijación de Col M17

12/14 ratones murieron en el grupo MSCRAMM de fijación de Col M31

4/11 ratones murieron en el grupo MSCRAMM de fijación de Col M55

La totalidad de los 15 ratones murieron en el grupo de control BSA

En un estudio de control, se expusieron ratones inmunizados con M55 BSA a una cepa de S. aureus que no expresa el MSCRAMM de fijación de Col. La mortalidad en el grupo M55 fue de 50% comparado con 30% en el grupo BSA. Lo que es importante es que estos datos indican la protección está directamente relacionada con los anticuerpos generados contra la parte de M55 del MSCRAMM de fijación de Col.

El fuerte contraste con la secuencia de longitud completa previamente identificada que no confiere protección contra la sepsis en un modelo animal in vivo, estos datos muestran claramente que M55 (que sólo contiene el demonio A) resultó altamente eficaz en la protección contra la sepsis.

Sorprendentemente, mientras todos los fragmentos de CBP (M17 y M31) están contenidos dentro de la secuencia proteinica M55, únicamente M55 es altamente protector.

Ejemplo 7 5.7. Opsonización, fagocitosis y muerte intracelular de bacterias

La prueba de fagocitosis se realizó modificando el método previamente descrito (Lissner et al., 1983). En suma, se recogieron macrófagos peritoneales de la cavidad peritoneal inyectando 3 ml de medio refrigerado (medio Iscovés que contiene 10% de suero de ternera fetal y 100 \mug/ml de gentamicina) i.p. después de un minuto de masaje del abdomen se aspiró el macrófago que contenía el medio. Los macrófagos se lavaron y se ajustaron a 2 x 10^{6} células/ml, se sembraron en volúmenes de 200 \mul en placas de 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) y se dejaron a temperatura ambiente durante 90 minutos. Se añadieron 500 \mul de medio de cultivo celular a cada pocillo y se incubaron las células durante 24 horas a 37ºC. El medio se eliminó posteriormente y se sustituyó por 500 \mul de un medio libre de antibióticos y las células se incubaron entonces durante la noche a 37ºC. Al día siguiente se opsonizaron los estafilococos durante 30 minutos a 4ºC con: a) 50% de suero térmicamente inactivado de ratones que han sido hiperinmunizados con M55 o b) con sueros de BSA ratones inmunizados o alternativamente c) con sueros de ratones que habían sido infectados con cepa Phillips sin inmunización previa. Se añadieron 500 \mul de estafilococos opsonizados a los pocillos en una concentración de 1,4 x 10^{7} bacterias/ml. A los 50 minutos de incubación, se lavaron los macrófagos 3 veces en Iscovés con el objeto de eliminar las bacterias no ingeridas. Posteriormente se analizaron los macrófagos directamente después de la incubación bacteriana o cuatro horas después. A estos cultivos que se incubaron durante 4 horas se añadió medio Iscovés con la concentración inhibitoria mínima de gentamicina adecuada para la cepa Phillips de S. aureus (5 \mug/ml) para evitar la replicación extracelular de bacterias. Los macrófagos se lisaron con agua destilada durante 20 minutos, y el lisato se diluyó 1/1, 1/10, 1/100 y se cultivó 1/1000 sobre placas de agar sangre de caballo 5%. Las placas se incubaron durante la noche y se recontó el número de bacterias.

5.7.1. Ensayos in vitro

Se realizaron ensayos in vitro para evaluar el impacto de anticuerpos específicos en la adhesión de colágeno sobre la fagocitosis y la capacidad de muerte intracelular. La adhesión de colágeno que expresa la cepa Phillips se opsonizó con suero que contenía anticuerpos específicos M55 o suero que contenía anticuerpos BSA, o alternativamente suero de ratones nativos que habían sido infectados con Phillips.

Los resultados (figura 5A) muestran claramente que la muerte intracelular de cepa Phillips de S. aureus se ve potenciada moderadamente por una infección previa con la misma cepa (p=0,037). En contraste, la opsonización de estafilococos con suero de ratones inmunizados con M55 (pero no infectados) mostró una capacidad de muerte intracelular notablemente potenciada si se compara con el suero de control (p=0,009) La capacidad fagocítica únicamente se ve afectada de forma modesta por la opsonización de bacterias con suero que contenía anticuerpos M55 y se vio notablemente afectada cuando las bacterias fueron opzonizadas con suero de ratones infectados con cepa Phillips (figura 5B).

Ejemplo 8 5.8. Detección de anticuerpo CBP en ratones infectados con S. aureus

En este estudio, se infectaron experimentalmente 15 ratones con una dosis subletal de S. aureus que expresa el MSCRAMM de fijación de Col. No se pudo detectar IgG (MSCRAMM Col) anti-M55 en el suero de animales infectados. Por el contrario, los animales inmunizados con M55 e infectados con una dosis subletal de S. aureus tenían valores de IgG anti-M55 (MSCRAMM) de 32 x 10^{9} unidades/ml.

Estos datos indican que durante el curso normal de la infección, la CBP está protegida de reconocimiento inmunológico. La inducción de la activación policlonal de célula B, como consecuencia de infección con S. aureus realizará una reacción reductora en las respuestas inmunes específicas a muchos componentes de pared de célula bacteriana, inclusive la CBP nativa.

5.8.1. Detalles experimentales

Se midió el nivel de suero de anticuerpos específicos contra el M55 peptídico de adhesión de colágeno en un ensayo inmunosorbente vinculado a enzima (ELISA). Se revistieron durante la noche microplacas de 96 pocillos (Nunc) a 4ºC con 2 \mug/ml de péptido M55. Se realizó el bloqueo con 0,5% de ovalbúmina (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) disuelta en 0,05 M Tris (pH 7,7). Se diluyeron el suero, los anticuerpos biotinilados y la ExtrAvidin-peroxidasa (Sigma) en 0,05 M Tris (pH 7,4)-0,0015 M NaCl. Las placas se incubaron durante la noche a 4ºC con suero, se lavaron e incubaron por etapas con anticuerpo IgG anti ratón cabra biotinilado (Jackson Immuno Research Laboratories, Inc, West Grove, PA), ExtrAvidin-peroxidasa (0,5 \mug/ml; Sigma) y sustrato ABTS. Se midió el A405 en un fotómetro Titertec Multiscan (Flow Laboratories, McLean, VA). Un procedimiento ELISA similar al descrito anteriormente se utilizó para detectar anticuerpos a M19, M31, así como al dominio B1 de la adhesión de colágeno. Se utilizó OVA como antígeno sólido de control.

Además, se pre-recubrieron placas de 96 pocillos con poli-L-lisina (Sigma) y luego se recubrieron con 1,5 x 10^{7} cepas de S. aureus Phillips o L.S-1. Después del procedimiento de bloqueo se incubaron sueros de ratones inmunizados y ratones no inmunizados pero infectados así como de suero de ratón nativo. Las etapas de desarrollo se realizaron en la forma descrita anteriormente. Los datos se muestran en la figura 6.

Ejemplo 9 5.9. Detección de anticuerpos a MSCRAMMs de fijación de Col en humanos infectados por S. aureus

Este ejemplo describe los resultados de estudios para detectar anticuerpos al MSCRAMM de fijación de Col.

Se examinaron por ELISA sueros de 34 pacientes que fueron diagnosticados clínicamente como pacientes que presentaban infección por S. aureus. Se pudo detectar IgG que reconocía el M55 inmovilizado (Col MSCRAMM) únicamente cuando se utilizaron niveles excesivamente elevados de antígeno en el ensayo. Por consiguiente, pese a estos pacientes habían sido diagnosticados clínicamente como pacientes de infecciones S. aureus, únicamente se pudo detectar un incremento mínimo en los valores de \alpha-CBP. Estos datos (figura 7A y figura 7B) sugieren que la infección por S. aureus puede inducir una activación de célula B policlonal que regula de forma reductora la respuesta inmunológica humana a ciertos componentes de la pared celular microbiana, inclusive la CBP.

Referencias

Las siguientes citaciones procedentes de la literatura así como las mencionadas anteriormente se incorporan en la parte pertinente a modo de referencia por las razones mencionadas en el texto anterior:

Patente US 3.791.932

Patente US 3.949.064

Patente US 4.174.384

Patente US 4.196.265

Patente US 4.271.147

Patente US 4.554.101

Patente US 4.578.770

Patente US 4.596.792

Patente US 4.599.230

Patente US 4.599.231

Patente US 4.601.903

Patente US 4.608.251

Patente US 4.683.195

Patente US 4.683.202

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Todas las composiciones y métodos aquí descritos y reivindicados se pueden realizar y ejecutar sin experimentación excesiva a luz de la presente descripción. Si bien las composiciones y métodos de la presente invención han sido descritos en términos de realizaciones preferidas, será evidente para los expertos en la materia que se pueden realizar variaciones en la composición, en los métodos y en las etapas o en la secuencia de etapas del método descrito aquí sin apartarse del concepto, espíritu y ámbito de la invención. Más específicamente, se podrá apreciar claramente que se pueden sustituir los agentes aquí descritos por ciertos agentes química y fisiológicamente afines obteniéndose resultados iguales o similares. Todos estos sustitutos y modificaciones similares evidentes para los expertos en la materia se consideran comprendidos dentro del espíritu, el ámbito y el concepto de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. Por lo tanto, los derechos exclusivos que se quieren patentar se describen en las reivindicaciones.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: The Texas A&M University System

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(B)

CALLE: 310 Wisenbaker

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(C)

LOCALIDAD: College Station

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(D)

ESTADO: Texas

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(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 77843-3369

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\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: UAB Research Foundation

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 701 South 20th Street, Suite 1120G

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(C)

LOCALIDAD: Birmingham

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(D)

ESTADO: Alabama

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 35294-0111

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: COMPOSICIONES DE PROTEÍNAS QUE FIJAN COLÁGENO Y MÉTODOS DE UTILIZACIÓN

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(iii)

NUMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A)

TIPO MEDIO: DISQUETE

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(B)

ORDENADOR: IBM PC Compatible

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: Patentln Release 1.0, Versión 1,30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 441 PARES DE BASE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

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(C)

CADENAS: ÚNICA

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 1

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9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 2

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 159 AMINOACIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOACIDOS

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(C)

CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2

\vskip1.000000\baselineskip

10

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 3

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 849 PARES DE BASE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: ÚNICA

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 3

\vskip1.000000\baselineskip

11

12

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 283 AMINOACIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOACIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 4

\vskip1.000000\baselineskip

13

130

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1500 PARES DE BASE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ÁCIDO NUCLÉICO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS: ÚNICA

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 5

14

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 512 AMINOACIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOACIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 6

15

16

\newpage

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(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 345 AMINOACIDOS

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(B)

TIPO: AMINOACIDOS

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(C)

CADENAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 7

\vskip1.000000\baselineskip

17

18

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(2) INFORMACION PARA SEQ ID NO: 8

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA

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(A)

LONGITUD: 139 AMINOACIDOS

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(B)

TIPO: AMINOACIDOS

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(C)

CADENAS:

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(D)

TOPOLOGÍA: LINEAL

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(xi)

DESCRIPCION DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 8

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19

Claims (22)

1. Composición farmacéutica que comprende un péptido CBP, donde dicho péptido tiene la secuencia de aminoácidos contigua de SEQ ID NO: 6 e inhibe la adhesión bacteriana a colágeno.

2. Composición que comprende un péptido CBP, donde dicho péptido tiene la secuencia de aminoácidos contigua de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6 e inhibe la adhesión bacteria a colágeno, para uso en terapia.

3. La composición de la reivindicación 2 que se utiliza para inhibir la colonización bacteriana, la infección bacteriana, la sepsis bacteriana, la infección por estafilococo o la sepsis en un animal.

4. La utilización de una composición que comprende un péptido CBP, donde dicho péptido tiene la secuencia de aminoácidos contigua de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4, o SEQ ID NO: 6 e inhibe la adhesión bacteriana a colágeno, para la fabricación de un medicamento profiláctico para inhibir o prevenir la colonización bacteriana, la infección bacteriana, la sepsis bacteriana, la infección por estafilococo o la sepsis en un animal.

5. La composición de la reivindicación 2 o 3, o el uso de la reivindicación 4, donde el péptido tiene la secuencia de aminoácidos contigua de SEQ ID NO: 6.

6. La composición o uso de cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, donde dicho péptido inhibe la adhesión de estafilococo a colágeno.

7. Una composición que comprende un segmento de ácido nucléico aislado que codifica un péptido CBP, donde el péptido CBP tiene la secuencia de aminoácidos contigua de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6 e inhibe la adhesión bacteriana a colágeno, para utilizar en terapia.

8. La composición de la reivindicación 7, que se utiliza en la inhibición de la colonización bacteriana, la infección bacteriana, la sepsis bacteriana, la infección por estafilococo o la sepsis en un animal.

9. El uso de una composición que comprende un segmento de ácido nucléico aislado que codifica un péptido CBP, donde el péptido CBP tiene la secuencia de aminoácidos contigua de SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6 e inhibe la adhesión bacteriana a colágeno para la fabricación de un medicamento profiláctico para inhibir o prevenir la colonización bacteriana, la infección bacteriana, la septis bacteriana, la infección por estafilococo o la sepsis en un animal.

10. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 o la utilización de la reivindicación 9, donde dicho segmento de ácido nucléico tiene la secuencia de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 3 o SEQ ID NO: 5

11. Una composición que comprende un anticuerpo que interactúa con un péptido CBP, teniendo el péptido CBP una secuencia de aminoácidos reflejada en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, donde dicho anticuerpo inhibe la adhesión bacteriana a colágeno, para su uso en terapia.

12. La composición de la reivindicación 11 que se utiliza en la inhibición de la colonización bacteriana, la infección bacteriana, la sepsis bacteriana, la infección por estafilococo o la sepsis en un animal.

13. La utilización de una composición que comprende un anticuerpo que interactúa con un péptido CBP, donde el péptido CBP tiene una secuencia de aminoácidos reflejada en SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 6, donde dicho anticuerpo inhibe la adhesión bacteriana a colágeno, para la fabricación de un medicamento que se utiliza en la inhibición o prevención de la colonización bacteriana, la infección bacteriana, la sepsis bacteriana, la infección por estafilococo o la sepsis en un animal.

14. La composición de la reivindicación 11 o 12 o el uso de la reivindicación 13, donde dicho anticuerpo inhibe la adhesión de estafilococo a colágeno.

15. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 11, 12, o 14 o el uso de la reivindicación 13 o 14, donde dicho anticuerpo inhibe o previene la infección por estafilococo tras la administración a un animal.

16. La composición de cualquiera de las reivindicaciones 11, 12, 14 o 16, o el uso de cualquiera de las reivindicaciones 13, 14 o 15, donde dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal.

17. Un kit que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

18. El kit de la reivindicación 17, donde dicha composición se formula para administración parenteral, oral, intranasal, subcutánea o intravenosa.

19. La utilización de una composición que comprende un anticuerpo que interactúa con un péptido CBP, donde el péptido CBP tiene una secuencia de aminoácidos reflejada en SEQ ID NO 2 para la fabricación de un medicamento profiláctico para inhibir o prevenir la colonización bacteriana, la infección bacteriana o la sepsis bacteriana en un animal.

20. La utilización de una composición que comprende un anticuerpo que interactúa con un péptido CBP, péptido CBP que tiene una secuencia de aminoácidos reflejada en SEQ ID NO: 2 para la fabricación de un medicamento para tratar la infección por estafilococo o la sepsis en un animal.

21. Kit que comprende un composición que tiene un anticuerpo que interactúa con un péptido CBP, péptido CBP que tiene una secuencia de aminoácidos reflejada en SEQ ID NO: 2 que se utiliza en terapia.

22. El kit de la reivindicación 2, donde dicha composición se fórmula para la administración parenteral, oral, intranasal, subcutánea o intravenosa.