ES2472441T3 - Composición inmunog�nica para uso en vacunación contra estafilococos - Google Patents

Abstract

Una composición inmunogénica que comprende: - ClfA aislado o un fragmento inmunogénico del mismo; y - toxina alfa aislada, mutante H35L de la toxina alfa o mutante H35R de la toxina alfa o un fragmento inmunogénico de los mismos.

Description

Composici�n inmunog�nica para uso en vacunación contra estafilococos.

Campo de la técnica

La presente invención se refiere al campo de las composiciones inmunog�nicas y vacunas contra estafilococos, a su fabricación y al uso de dichas composiciones en medicina. Más particularmente, se refiere a composiciones de vacuna que comprenden una combinación de ant�genos para el tratamiento o prevención de la infección por estafilococos. También se proporcionan procedimientos de uso de dichas vacunas en medicina y procedimientos para su preparación.

Antecedentes

El número de infecciones adquiridas en la comunidad y adquiridas en el hospital ha aumentado en los últimos años con el creciente uso de dispositivos intravasculares. Las infecciones adquiridas en el hospital (nosocomiales) son una causa principal de morbididad y mortalidad, más particularmente en EE.UU., donde afecta a más de 2 millones de pacientes anualmente. Tras varios estudios, aproximadamente el 6 por ciento de los pacientes de EE.UU. adquirir� una infección durante su estancia en el hospital. La carga económica en EE.UU. se estim� en más de 4,5 billones de dólares americanos en 1992 (Emori and Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428). Las infecciones más frecuentes sin infecciones del tracto urinario (ITU, 33 % de las infecciones), seguidas de neumonía (15,5 %), infecciones en el área quirúrgica (14,8 %) e infecciones primarias en la circulación sanguínea (13 %) Emori y Gaynes, 1993, Clin. Microbiol. Rev. 6; 428).

Los pat�genos nosocomiales más importantes son Staphylococcus aureus, estafilococos negativos a la coagulasa (principalmente Staphylococcus epidermidis), enterococcus spp, Esherichia coli y Pseudomonas aeruginosa. Aunque dichos pat�genos cas producen el mismo número de infecciones, la gravedad de los trastornos que pueden producor junto con la frecuencia de los aislados resistentes a antibióticos equilibran esta clasificación hacia S. aureus y S. epidermidis como los pat�genos nosocomiales más significativos.

Staphylococcus aureus es la causa más frecuente de infecciones nosocomiales, con una morbididad y mortalidad significativa (Romero-Vivas et al 1995, Infect. Dis. 21; 1417). Es la causa de algunos casos de osteomielitis, endocarditis, artritis séptica, neumonía, abscesos y síndrome del shock tóxico.

S. epidermidis es un comensal normal de la piel que también es un pat�geno oportunista importrante para las infecciones de dispositivos m�dicos implantados y las infecciones en las zonas de cirugía. Los dispositivos m�dicos infectados por S. epidermidis inlcuyen marcamasos cardíacos, derivaciones de líquido cefalorraqu�deo, catéteres para di�lisis peritoneal ambulatoria continua, dispositivos ortopédicos y pr�tesos de v�lculas cardíacas.

Las infecciones producidas por S. aureus y S. epidermidis se tratan con antobi�ticos, siendo la penicilina el fármaco de elección, mientras que la vancomicina se usa para lis aislados resstentes a meticilina. El porcentaje de cepas de estafilococos que exhiben resistencia de amplio espectro a los antibióticos se ha convertido en cada vez más prevalente desde la década de 1980 (Panlilo et al 1992, Infect.Control. Hosp. Epidemiol. 13; 582), suponiendo una amenaza para la terapia antimicrobiana eficaz. Además, la reciente aparición de la cepa de S. aureus resistente a la vancomicina ha aumentado el miedo de aparición y avance de cepas de S. aureus resistentes a meticilina para las que no se dispone de un tratamiento eficaz.

Se ha investigado un enfoque alternativo del uso de antibióticos contra ant�genos de estafilococos en la inmunoterapia pasiva. Se esta desarrollando una terapia que implica la administración de antisueros policlonales (documento WO 00/15238, WO 00/12132) as� como el tratamiento con un anticuerpo monoclonal contra el ácido lipoteicoico (documento WO 98/57994).

Un enfoque alternativo sería el uso de la vacunación activa para generar una respuesta inmunitaria contra estafilococos. Se han identificado varios candidatos para incluir como componentes de la vacuna. Estos incluyen la proteína de unión a fibronectina (documento US5840846), análogo del MHC II (documento US5648240), la proteína de unión a fibrin�geno (documento US6008341), GehD (documento US 2002/0169288), la proteína de unión a col�geno (documento US6288214), SdrF, SdrG y SdrH (documento WO 00/12689), SEA mutante y exotoxinas de SEB (documento WO 00/02523) y la proteína de unión a vitronectina de 52kDa (documento WO 01/60852). También se han desarrollado vacunas de múltiples componentes que comprenden determinadas combinaciones de proteínas de unión bacterianas ("MSCRAMM"). Entre las realizaciones divulgadas en el documento US6703025 se encuentran las composiciones que comprenden el factor de agrupamiento A ("CIfA") o el factor de agrupamiento B ("CLfB").

Se ha secuenciado el genoma de S. aureus y se han identificado muchas de las secuencias de codificación (documentos EP786519, WO02/094868). Lo mismo es cierto para S. epidermidis (documento WO 01/34809). Como perfeccionamiento de este abordaje, otros han identificado proteínas que son reconocidas por suero hiperinmunitario de pacientes que han sufrido una infección por estafilococos (documentos WO01/98499, WO 02/059148).

La primera generación de vacunas dirigidas contra S. aureus o contra las exoprote�nas que produce han tenido un éxito limitado (Lee 1996 Trends Microbiol. 4; 162). Existe la necesidad de desarrollar vacunas eficaces contra infecciones producidas por estafilococos.

De acuerdo con lo anterior, la presente invención proporciona una composición inmunog�nica que comprende:

•

ClfA aislado o un fragmento inmunog�nico del mismo; y

•

toxina alfa aislada, mutante H35L de la toxina alfa o mutante H35R de la toxina alfa o un fragmento inmunog�nico de los mismos.

Descripci�n de las figuras

Figura 1 – Secuencias polipept�dicas de proteínas preferidas. La Tabla 1 proporciona información sobre qué proteína est� representada por cada SEC ID.

Figura 2 – Secuencias nucleot�dicas que codifican proteínas preferidas. La Tabla 1 proporciona información sobre qué proteína est� codificada por cada SEC ID.

Figura 3. Purificación de la toxina alfa en condiciones nativas. El panel A muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de las muestras preparadas durante la purificación de la toxina alfa. Calle 1- marcadores de peso molecular, calle 2 – fracción soluble que contiene la toxina alfa sobreexpresada, calle 3 – caudal que atraviesa la columna de Ni-NTA, calle 4 – fracciones eluidas con 10 % de tampón B, calle 5 – fracciones eluidas con 20 % de tampón B, calle 6 - fracciones eluidas con 30 % de tampón B, calle 7 - fracciones eluidas con 50 % de tampón B, calle 8 - fracciones eluidas con 75 % de tampón B, calle 9 y 10 fracciones eluidas con 100 % de tampón B, calle 11 bacterias a T= 0 antes de la inducción, calle 12 – bacterias a T= 4 horas tras la inducción, calle 13 – lisado celular, calle 14 – fracción soluble, calle 15 – fracción insoluble. El panel B muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de 10, 5, 2 y 1 de la toxina alfa purificada.

Figura 4. Purificación de SdrC en condiciones desnaturalizantes. El panel A muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de las muestras preparadas durante la purificación de la toxina alfa. Clle M- marcadores de peso molecular, calle Inicio- sobrenadante formado a partir de la fracción insoluble que contiene SdrC sobreexpresado, calle FT1- caudal a través de la columna de Ni-NTA, calle C- fracciones eluidas con tampón de lavado C, calle D- fracciones eluidas con tampón D, calle E – fracciones eluidas con tampón E. El panel B muestra un SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie de 1, 2, 5 y 10 él del SdrC purificado.

Figura 5 – Resultados de ELISA de antisueros contra proteínas de estafilococos en placas revestidas con proteínas purificadas.

Conjunto de ratones antes – resultado usando sueros combinados extraídos de ratones antes de la inoculación. Conjunto de ratones posterior III – resultado usando sueros de ratón combinados extraídos después de la inmunizaci�n. Conjunto de conejos antes – resultado usando sueros combinados extraídos de conejos antes de la inoculación. Conjunto de conejos posterior III – resultado usando sueros de conejo combinados extraídos después de la inmunizaci�n. Blc- Control negativo.

Figura 6 – Resultados de ELISA de antisueros de ratón producidos contra proteínas de estafilococos en placas revestidas con estafilococos muertos.

El panel A usa placas revestidas con células enteras muertas de S. aureus de serotipo 5. El panel B usa placas revestidas con células enteras muertas de S. aureus de serotipo 8. El panel C usa placas revestidas con células enteras muertas de S. epidermidis.

La línea marcada con signos cuadrados muestra el resultado de ELISA usando antisueros de ratones inmunizados tres veces con la proteína de estafilococos indicada. La línea marcada con los signos en rombo muestra el resultado de ELISA para los sueros de ratón antes de la inmunizaci�n.

Figura 7 – Resultados de ELISA de antisueros de conejo producidos contra proteínas de estafilococos en placas revestidas con estafilococos muertos.

El panel A usa placas revestidas con células enteras muertas de S. aureus de serotipo 5. El panel B usa placas revestidas con células enteras muertas de S. aureus de serotipo 8. El panel C usa placas revestidas con células enteras muertas de S. epidermidis.

La línea marcada con cuadrados muestra el resultado de ELISA usando antisueros de conejos inmunizados tres veces con la proteína de estafilococos indicada (a excepción de HarA, en los que solo se administr� una inmunizaci�n). La línea marcada con los signos en rombo muestra el resultado de ELISA para los sueros de conejo antes de la inmunizaci�n.

Descripci�n detallada

La presente invención divulga combinaciones concretas de ant�genos de estafilococos que cuando se combinan conducen a la producción de una composición inmunog�nica que es eficaz en el tratamiento o prevención de infecciones producidas por estafilococos. Las composiciones inmunog�nicas de la invención incorporan adecuadamente ant�genos que est�n implicados en diferentes funciones de los estafilococos. Dichas composiciones inmunog�nicas est�n dirigidas a la respuesta inmunitaria hacia diferentes aspectos de la función estafiloc�cica y, por tanto, pueden inducir una respuesta inmunitaria particularmente eficaz.

Las infecciones por estafilococos progresan por diferentes estadios. Por ejemplo, el ciclo de vida de los estafilococos implica colonización de comensales, inicio de infección mediante el acceso a los tejidos adyacentes o la circulación sanguínea, multiplicación anaerobia en la sangre, interacción entre los determinantes de la virulencia de S. aureus y los mecanismos de defensa del huésped e inducción de complicaciones, incluyendo endocarditis, formación de abscesos metast�sicos y síndrome séptico. Diferentes moléculas sobre la superficie de las bacterias estarán implicadas en diferentes etapas del ciclo de infección. Al dirigir la respuesta inmunitaria contra una cantidad eficaz de una combinación de ant�genos concretos implicados en diferentes procesos de infección por estafilococos, se puede lograr una composición inmunog�nica o vacuna con una mayor eficacia.

En particular, combinaciones de determinados ant�genos de diferentes clases, algunos de los cuales est�n implicados en la adhesión a células huésped, algunas de las cuales est�n implicadas en la adquisición de hierro u otras funciones de transporte, algunas de las cuales son toxinas o reguladores de la virulencia y ant�genos inmunodominantes pueden producir una respuesta inmunitaria que proteja contra múltiples estadios de infección. Más específicamente, las composiciones inmunog�nicas de la invención comprenden:

-

ClfA aislado (una proteína de unión al componente extracelular de estafilococos) o un fragmento inmunog�nico del mismo, y

-

toxina alfa aislada (una toxina estafiloc�cica), mutante H35L de la toxina alfa o mutante H35R de la toxina alfa

o un fragmento inmunog�nico de los mismos.

La eficacia de la respuesta inmunitaria se puede medir en ensayos de modelos animales como se ha descrito en los ejemplos y/o el uso de un ensayo opsonofagoc�tico como se describe en los ejemplos.

Una ventaja adicional de la invención es que al combinación de ant�genos de la invención de diferentes familias de proteínas en una composición inmunog�nica permitir� protección contra una gama más amplia de cepas.

Por tanto, la invención se refiere a composiciones inmunog�nicas que comprenden una pluralidad de proteínas seleccionadas de al menos dos categorías diferentes de proteínas que tienen diferentes funciones en los estafilococos. Ejemplos de dichas categorías de proteínas son las proteínas de unión extracelular, proteínas transportadoras tales como proteínas de adquisición de Fe, toxinas o reguladores de la virulencia y otras proteínas inmunodominantes. Las combinaciones de vacuna de la invención son eficaces contra cepas de estafilococos homólogas (cepas de las que derivan los ant�genos) y, preferentemente, también contra cepas heter�logas de estafilococos.

Una composición inmunog�nica de la invención puede comprender una serie de proteínas igual o más de 2, 3, 4, 5 o 6 seleccionadas de 2 o 3 de los grupos siguientes:

-

Grupo a) al menos una proteína de unión al componente extracelular de estafilococos o fragmento inmunog�nico del mismo, seleccionada del grupo que consiste en el receptor de laminina, la proteína de unión a SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteínas de unión a elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, autolisina, ClfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de unión a vitronectina, proteína de unión a fibrin�geno, coagulasa, Fig y MAP;

-

Grupo b) al menos una proteína transportadora de estafilococos o fragmento inmunog�nico del mismo seleccionada del grupo que consiste en el transportadores de ABC inmunodominante, IsdA, IsdB, transportador de Mg2+, SitC y transportador de Ni ABC; y

-

Grupo c) al menos un regulador estafiloc�cico de la virulencia, toxina o fragmento inmunog�nico del mismo seleccionado del grupo que consiste en la toxina alfa (Hia), mutante H35R de toxina alfa, proteína activadora de ARN III (RAP).

Por ejemplo, una primera proteína se selecciona de los grupos a), b) o c) y una segunda proteína se selecciona de un grupo seleccionado de los grupos a), b) y c) que no incluya la segunda proteína. En una realización preferida, la composición inmunog�nica de la invención contiene al menos una proteína seleccionada del grupo a) y una proteína adicional seleccionada del grupo b) y/o del grupo c). En una realización adicional, la composición inmunog�nica de la invención contiene al menos un ant�geno seleccionado del grupo b) y una proteína adicional seleccionada del grupo c) y/o del grupo a). En una realización adicional, la composición inmunog�nica de la invención contiene al menos un ant�geno seleccionado del grupo c) y una proteína adicional seleccionada del grupo a) y/o del grupo b). No obstante, las composiciones inmunog�nicas deben comprender:

-

ClfA aislado o un fragmento inmunog�nico del mismo; y

-

toxina alfa aislada, mutante H35L de la toxina alfa o mutante H35R de la toxina alfa o un fragmento 5 inmunog�nico de los mismos.

La composición inmunog�nica de la invención contiene adecuadamente proteínas de S. aureus, y/o S. epidermidis.

Prote�nas

Las composiciones inmunog�nicas de la invención comprenden una proteína aislada que comprende una secuencia de amino�cidos que tiene una identidad de al menos un 85 %, preferentemente identidad de al menos un 90 %, más

10 preferentemente una identidad de al menos un 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos un 97 - 99 % o exacta, con cualquier secuencia de la figura 1.

Cuando una proteína se menciona específicamente en el presente documento, preferentemente es una referencia a una proteína de longitud completa, nativa o recombinante, u, opcionalmente, una proteína madura en la que se ha eliminado toda secuencia señal. La proteína se puede aislar directamente de la cepa de estafilococos o producirse 15 mediante técnicas de ADN recombinante. Los fragmentos inmunog�nicos de la proteína se pueden incorporar en la composición inmunog�nica de la invención. Estos son fragmentos que comprenden al menos 10 amino�cidos, preferentemente 20 amino�cidos, más preferentemente 30 amino�cidos, más preferentemente 40 amino�cidos o 50 amino�cidos, lo más preferentemente 100 amino�cidos, tomados contiguos a la secuencia de amino�cidos de la proteína. Además, dichos fragmentos inmunog�nicos con inmunol�gicamente reactivos con los anticuerpos 20 generados contra las proteínas de estafilococos o con los anticuerpos generados mediante la infección de un huésped mamífero con estafilococos. Los fragmentos inmunog�nicos también incluyen fragmentos que, cuando se administran a una dosis eficaz (solos o como un hapteno unido a un vehículo), producen una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por estafilococos, más preferentemente es protectora contra la infección por S. aureus y/o S. epidermidis. Dicho fragmento inmun�geno puede incluir, por ejemplo, la proteína que carece de una

25 secuencia líder en N-terminal, y/o un dominio transmembrana y/o un dominio de anclaje en C-terminal. En un aspecto preferido, el fragmento inmunog�nico de acuerdo con la invención comprende sustancialmente todo el dominio extracelular de una proteína que tiene una identidad de al menos un 85 %, preferentemente una identidad de al menos un 95 %, lo más preferentemente una identidad de al menos un 97 – 99 % %, con la de una secuencia seleccionada de la Figura 1 sobre la longitud completa de la secuencia del fragmento.

30 En las composiciones inmunog�nicas de la invención también se incluyen proteínas de fusión compuestas por proteínas de estafilococos o fragmentos inmunog�nicos de proteínas de estafilococos. Dichas proteínas de fusión se pueden preparar de forma recombinante y pueden comprender una porción de al menos 2, 3, 4, 5 o 6 proteínas de estafilococos. Como alternativa, una proteína de fusión puede comprender múltiples porciones de al menos 2, 3, 4 o 5 proteínas de estafilococos. Estas pueden combinar diferentes proteínas de estafilococos o fragmentos

35 inmunog�nicos de las mismas en la misma proteína. Como alternativa, la invención también incluye proteínas de fusión individuales de proteínas de estafilococos o fragmentos inmunog�nicos de las mismas, como una proteína de fusión con secuencias heter�logas, tales como un proveedor de ep�topos de linfocitos T o marcadores de purificación, por ejemplo. β-galactosidasa, glutati�n-S-transferasa, proteínas fluorescentes verdes (GFP), marcadores de ep�topos tales como FLAG, myc tag, poli histidina o proteínas de la superficie viral, tales como la

40 hemaglutinina del virus de la gripe, o proteínas bacterianas, tales como el toxoide del tétanos, el toxoide dift�rico, CRM197.

Tabla 1

En la tabla siguiente se exponen los números de SEC ID de las secuencias proteicas preferidas y secuencias de ADN que se encuentra en la Figura 1 y la Figura 2, respectivamente. SA indica una secuencia de S. aureus y SE indica una secuencia de S. epidermidis.

Nombre

Secuencia de proteínas Secuencia de ADN

Transportador de ABC inmunodominante

SA

SEC ID 1 SEC ID 34

SE

SEC ID 2 SEC ID 35

Receptor de laminina

SEC ID 3

SEC ID 36

SA SE

SEC ID 4 SEC ID 37

Ant�geno secretor A SsaA SA 1 SA 2 SE

SEC ID 5

SEC ID 38

SEC ID 6

SEC ID 39

SEC ID 7

SEC ID 40

SitC SA SE

SEC ID 8

SEC ID 41

SEC ID 9

SEC ID 42

saA / PisA (IssA) SA SE

SEC ID 10

SEC ID 43

SEC ID 11

SEC ID 44

EbhA / B SA EbhA SA EbhB SE EbhA SE EbhB

SEC ID 12

SEC ID 45

SEC ID 13

SEC ID 46

SEC ID 14

SEC ID 47

SEC ID 15

SEC ID 48

Por Aap asociado con acumulación SA SE

SEC ID 16

SEC ID 49

SEC ID 17

SEC ID 50

Prote�na de activación de ARN III RAP SA SE

SEC ID 18

SEC ID 51

SEC ID 19

SEC ID 52

FIG / SdrG SA SE

SEC ID 20

SEC ID 53

SEC ID 21

SEC ID 54

Prote�na de unión a elastina EbpS SA SE

SEC ID 22

SEC ID 55

SEC ID 23

SEC ID 56

Prote�na extracelular EFB SA

SEC ID 24 SEC ID 57

Toxina alfa SA

SEC ID 25 SEC ID 58

SBI SA

SEC ID 26 SEC ID 59

IsdA SA

SEC ID 27 SEC ID 60

IsdB SA

SEC ID 28 SEC ID 61

SdrC SA

SEC ID 29 SEC ID 62

ClfA SA

SEC ID 30 SEC ID 63

FnbA SA

SEC ID 31 SEC ID 64

ClfB SA

SEC ID 32 SEC ID 65

Coagulasa SA

SEC ID 33 SEC ID 66

FnbB SA

SEC ID 67 SEC ID 71

MAP SA

SEC ID 68 SEC ID 72

SdrC SA

SEC ID 69 SEC ID 73

SdrG SA

SEC ID 70 SEC ID 74

Prote�nas de unión al componente extracelular

Las proteínas de unión al componente extracelular son proteínas que se unen a los componentes extracelulares del huésped. El término incluye, entre otros, adhesinas.

Ejemplos de proteínas de unión al componente extracelular incluyen el receptor de laminina (Naidu et al J. Med. Microbiol. 1992, 36; 177), la proteína de unión a SitC/MntC/saliva (documento US5801234, Wiltshire y Foster Infec. Immun. 2001, 69; 5198), EbhA (Williams et al Infect. Immun. 2002, 70; 6805), EbhB, proteína de unión a la elastina (EbpS) (Park et al 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845), EFB (FIB) (Wastfelt y Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347), SBI (Zhang et al FEMS Immun. Med. Microbiol. 2000, 28; 211), autolisina (Rupp et al 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), ClfA (documento US6008341, McDevitt et al Mol. Microbiol. 1994, 11; 237), SdrC, SdrG (McCrea et al Microbiology 2000, 146; 1535), SdrH (McCrea et al Microbiology 2000, 146; 1535), Lipasa GehD (documento US2002/0169288), SasA, FnbA (Flock et al Mol Microbiol. 1994, 12; 599, documento US6054572), FnbB (documento WO 97/14799, Booth et al 2001 Infec. Immun. 69; 345), proteína de unión al col�geno Cna (Visai et al 2000, J. Biol. Chem. 275; 39837), ClfB (WO 99/27109), FbpA (Phonimdaeng et al 1988 J. Gen Microbiol.134; 75), Npasa (Flock 2001 J. Bacteriol. 183; 3999), IsaA/PisA (Lonenz et al FEMS Immuno. Med. Microbiol. 2000, 29; 145), SsaA (Lang et al FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2000, 29; 213), EPB (Hussain y Hermann symposium on Staph Denmark 14 – 17� 2000), SSP-1 (Veenstra et al 1996, J. Bacteriol. 178; 537), SSP-2 (Veenstra et al 1996, J. Bacteriol. 178; 537), proteína de unión a la heparina de 17 kDa HBP (Fallgren et al 2001, J. Med. Microbiol. 50; 547), proteína de unión a la vitronectina (Li et al 2001, Curr. Microbiol. 42; 361), proteína de unión al fibrin�geno, coagulasa, Fig (documento WO 97/48727) y MAP (documento US5648240).

Prote�na de unión a Sitc/MntC/saliva

Esta es una proteína transportadora de ABC que es un homólogo de la adhesina PsaA en S. pneumoniae. Es una lipoprote�na de 32 kDa altamente inmunog�nica que est� distribuida por la pared celular bacteriana (Cockayne et al Infect. Immun. 1998 66; 3767). Se expresa en S. aureus y S. epidermidis como lipoprote�na de 32 kDa y est� presente un homólogo de 40 kDa en S. hominis. En S. epidermidis, es un componente de un oper�n regulado por hierro. Muestra una homología considerable con ambas adhesinas, incluyendo FimA de Streptococcus parasanguis, y con lipoprote�nas de una familia de transportadores de ABC con funciones de trannsporte de hierro met�lico probado o putativo. Por tanto, SitC est� incluido como una proteína de unión extracelular y como transportador de iones met�licos.

La proteína de unión a saliva divulgada en el documento US5.801.234 también es una forma de SitC y se puede incluir en una composición inmunog�nica de la invención.

ClfA y ClfB

Estas dos proteínas tienen actividad de unión a fibrin�geno y desencadena que S. aureus forme grumos en presencia de plasma. Contienen un motivo LPXTG a las proteínas asociadas con la pared.

ClfA se describe en el documento US6008341 y ClfB se describe en el documento WO 99/27109.

Coagulasa (FbpA)

Esta es una proteína de unión al fibrin�geno que desencadena que S. aureus forme grumos en presencia de plasma. Se describe en las referencias relacionadas con la coagulasa: Phonimdaeng et al (J. Gen. Microbio. 1988,

134:75 - 83), Phonimdaeng et al. (Mol Microbiol 1990; 4:393 - 404), Cheung et al. (Infect Immun 1995; 63:1914 1920) y Shopsin et al. (J. Clin. Microbiol. 2000; 38:3453 - 3456).

Fragmentos preferidos para la inclusión en la composición inmunog�nica de la invención incluyen la proteína madura en la que el p�ptido señal se ha eliminado (los amino�cidos 27 al extremo C).

La coagulasa tiene tres dominios distintos. Los amino�cidos 59 – 297, que es una región de hélice superenrollada, los amino�cidos 326 – 505, que es una ´regi�n rica en prolina y glicina, y el domino en el extremo C desde el amini�cido 506 al 645, que tiene una conformación en lámina beta. Cada uno de estos dominios es un fragmento preferido de la invención

SdrG- Fbe - EfB/FIG

Fbe es una proteína de unión a fibrin�geno que se encuentra en muchos aislados de S. epidermidis y tiene un peso molecular deducido de 119 kDa (Nilsson et al 1998. Infect. Immun. 66; 2666). Su secuencia est� relacionada con la del factor de agrupamiento de S. aureus (ClfA). Los anticuerpos contra Fbe pueden bloquear la unión de S. epidermidis a placas revestidas con fibrin�geno y a catéteres (Pei y Flock 2001, J. Infect. Dis. 184; 52). Esta proteína también se describe como SdrG en el documento WO 00/12689. SdrG se encuentra en los estafilococos negativos a la coagulasa y es una proteína asociada a la pared celular que contiene una secuencia LPXTG.

SdrG contiene un p�ptido señal (amino�cidos 1 - 51), una región que contiene sitios de unión a fibrin�geno y sitios de unión a col�geno (amino�cidos 627 - 698 y 738 - 809), una región de repetición SD (amino�cidos825 - 1000) y un 5 domInio de anclaje (amino�cidos 1009 - 1056).

Fbe tiene una secuencia señal putativa con un sitio de escisión entre los amino�cidos 51 y 52. Por tanto, un fragmento preferido de Fbe contiene la forma madura de Fbe que se extiende desde el amino�cido 52 al extremo C (amino�cido 1.092).

El dominio de Fbe desde el amino�cido 52 al amino�cido 825 es responsable de la unión al fibrin�geno. Por 10 consiguiente, un fragmento preferido de Fbe consiste en o contiene los amino�cidos52 - 825.

La región entre los amino�cidos 373 y 516 de Feb muestra la mayor conservación entre Fbe y ClfA. El fragmento preferido contendr�, por tanto, los amino�cidos 373 - 516 de Fbe.

Los amino�cidos 825 -1041 de Fbe contienen una región altamente repetitiva compuesta por residuos de ácido asp�rtico y serina repetidos en t�ndem.

15 Los fragmentos preferidos de SdrG incluyen los polip�ptidos en los que el p�ptido señal y/o las repeticiones SD y el dominio de anclaje se han eliminado. Estos incluyen polip�ptidos que comprenden o consisten en los amino�cidos 50 - 825, los amino�cidos 50 - 633, los amino�cidos 50 – 597 (SEC ID N� 2 del documento WO 03/76470), los amino�cidos 273 - 597 (SEC ID N� 4 del documento WO 03/76470), los amino�cidos 273 - 577 (SEC ID N� 6 del documento WO 03/76470), los amino�cidos 1 -549, los amino�cidos 219 - 549, los amino�cidos 225 - 549, los

20 amino�cidos 219 - 528, los amino�cidos 225 - 528 de SEC ID N� 70.

Preferentemente, un polip�ptido SdrG que tiene una secuencia con una homología de al menos el 80 %, 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % con la secuencia SEQ ID 70, 20 or 21 se incorpora en la composición inmunog�nica de la invención.

Las composiciones de la invención comprenden, opcionalmente, un fragmento de los polip�ptidos SdrG descritos 25 anteriormente.

Los fragmentos preferidos tienen el p�ptido señal y/o el dominio de repetición SD y/o el dominio de anclaje delecionado. Por ejemplo, las secuencias correspondientes a los amino�cidos 1 - 713 , 1 - 549, 225 - 549, 225 - 529, 24 - 717, 1 - 707, 1 - 690, 1 -680, 1 - 670, 1 - 660, 1 - 650, 1 - 640, 1 - 630, 1 -620, 1 - 610, 1 - 600, 34 - 707, 44 697, 36 - 689 de SEC ID 76 o secuencias que tienen una identidad del 85 %, 90 %, 92 %, 95 %, 97 %, 98 %, 99 % o

30 100 % con la SEC ID 70 o 20 o 21.

El fragmento preferido con el p�ptido señal delecionado tienen un residuo de metionina en el extremo N del fragmento para garantizar la traducción correcta.

Un fragmento más preferido tiene la fórmula siguiente:

EbhA y EbhB

EbhA y EbhB son proteínas que se expresan en S. aureus y S. epidermidis (Clarke y Foster Infect. Immun. 2002, 70;

6680 , Williams et al Infect. Immun. 2002, 20; 6805) y que se unen a la fibronectina. Dado que la fibronectina es un componente importante de la matriz extracelular, EbhA y EbhB tienen una función importante en la adhesión de los estafilococos a la matriz extracelular del huésped.

Las proteínas Ebh son grandes y tienen un peso molecular de 1,1 megadalton. Supone una ventaja usar un

5 fragmento de la proteína Ebh en lugar de la secuencia completa debido a la facilidad de producción y formulación. La región central de la proteína contiene repeticiones imperfectas que contienen sitios de unión a la fibronectina. Los fragmentos que contienen uno o más de los dominios de repetición descritos más adelante son fragmentos preferidos para incorporar en la composición inmunog�nica de la invención.

Las proteínas Ebh contienen unidades de repetición imperfectas de 127 amino�cidos de longitud que se caracterizan 10 porque contienen la secuencia consenso.

L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A

Preferentemente

.{19}L.G.{10}A.{13}Q.{26}L...M..L.{33}A.{12}

M�s preferentemente

15 .....I/V..A...I/V..AK.ALN/DG..NL..AK..A.{6}L..LN.AQK..L..QI/V..A..V.. V.{6}A..LN/D.AM..L...I/V.D/E...TK.S.NY/F.N/DAD..K..AY/F..AV..A..I/V.N /D.......

Donde '.' significa cualquier amino�cido y '.{10}' significa 10 amino�cidos cualesquiera y I/V indica elecciones alternativas de amino�cidos.

Mediante referencia a la secuencia divulgada en Kuroda et al (2001) Lancet 357; 1225 - 1240, y la Tabla 2, las 20 secuencias de repetición dentro de las proteínas Ebh se deducen fácilmente.

Los fragmentos preferidos a incluir en la composición inmunog�nica de la invención incluyen polip�ptidos que contienen uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez o más de 10 de las 127 unidades de repetición de amino�cidos. Dichos fragmentos pueden consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más repeticiones de la región de repetición de 127 amino�cidos o puede consistir en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más repeticiones con residuos de

25 amino�cidos adicionales presentes en cualquiera o ambos extremos del fragmentos. Un fragmento preferido adicional es el polip�ptido H2 de aproximadamente 44kDa que abarcan tres repeticiones (3202 – 3595 amino�cidos) como se describe en Clarke et al Infection and Immunity 70, 6680 - 6687, 2002. Dichos fragmentos podrán, preferentemente, unirse a fibronectina y/o provocar anticuerpos que son reactivos contra la proteína Ebh entera.

Los polip�ptidos Ebh son capaces de unirse a la fibronectina. Los fragmentos preferidos de estas secuencias

30 polipept�dicas conservan la capacidad para unirse a la fibronectina. La unión a la fibronectina se puede evaluar mediante ELISA, como describen Clarke et al (Infection and Immunity 70; 6680 - 6687 2002).

Otros fragmentos preferidos adicionales son aquellos que comprenden un ep�topo para linfocitos B o linfocitos T colaboradores, por ejemplo, los fragmentos/p�ptidos descritos en las Tablas 3 y 4.

TABLA 2. Secuencias de repetición en la secuencia de longitud completa de Ebh.

La secuencia completa de Ebh se divulga en Kuroda et al (2001) Lancet 357; 1225 - 1240. La siguiente tabla muestra los residuos de amino�cidos en los que las repeticiones de 127 amino�cidos comienzan y terminan dentro de la secuencia de longitud completa.

Comienzo Fin

1

3204 3330

2

3331 3457

3

3457 3583

4

3583 3709

5

3709 3835

6

3835 3961

7

3961 4087

8

4200 4326

9

4326 4452

La secuencia completa de Ebh se divulga en Kuroda et al (2001) Lancet 357; 1225 - 1240. La siguiente tabla muestra los residuos de amino�cidos en los que las repeticiones de 127 amino�cidos comienzan y terminan dentro de la secuencia de longitud completa.

Comienzo Fin

10

4452 4578

11

4578 4704

12

4704 4830

13

4830 4956

14

4956 5082

15

5082 5208

16

5208 5334

17

5334 5460

18

5460 5586

19

5585 5711

20

5711 5837

21

5837 5963

22

5963 6089

23

6089 6215

24

6215 6341

25

6341 6467

26

6467 6593

27

6593 6719

28

6719 6845

29

6845 6971

30

6971 7097

31

7097 7223

32

7223 7349

33

7349 7475

34

7475 7601

35

7601 7727

36

7727 7853

37

7852 7978

38

7978 8104

39

8104 8230

40

8230 8356

41

8356 8482

42

8482 8608

43

8604 8730

44

8858 8984

-

Las columnas “Comienzo" y "Fin" presentan la posición de los ep�tpos de linfocitos B predichos en la repetición de 127 amino�cidos

-

Las columnas “Inicio" y "Terminación" presentan la posición de los ep�topos de linfocitos B predichos en la repetición de 127 amino�cidos

-

La columnas “Posición de la repetición" presenta la posición de los ep�topos de linfocitos T predichos en la repetición

-

La columna “Posición de la secuencia" presenta la posición de los ep�topos de linfocitos T predichos en la secuencia de longitud completa de Ebh

10 Los fragmentos de los polip�ptidos de la invención se pueden emplear para producir el polip�ptido de longitud completa correspondiente mediante síntesis pept�dica; por tanto, estos fragmentos se pueden emplear como intermedios para la producción de los polip�ptidos de longitud completa de la invención.

Particularmente preferidas son las variantes en las que varios, 5 - 10, 1 - 5, 1 - 3, 1 - 2 o 1 amino�cidos se sustituyen, eliminan, o añaden en cualquier combinación

Prote�na de unión a elastina (EbpS)

EbpS es una proteína que contiene 486 amino�cidos con un peso molecular de 83 kDa. Se asocia con la membrana citopl�smica de S. aureus y tiene tres regiones hidrófobas que manitneen a la proteína en la membrana (Downer et al 2002, J. Biol. Chem. 277; 243; Park et al 1996, J. Biol. Chem. 271; 15803).

5 Dos regiones entre los amino�cidos 1 - 205 y 343 - 486 se exponen en la superficie en la cara externa de la membrana citoplasmática. El dominio de unión al ligando de EbpS se localiza entre los residuos 14 - 34 en el extremo N (Park et al 1999, J. Biol. Chem. 274; 2845).

Un fragmento preferido a incorporar en la composición inmunog�nica de la invención sería el fragmento expuesto en la membrana que contiene la región de unión a elastina (amino�cidos 1 - 205). Algunos ejemplos preferidos no

10 contienen el bucle entero expuesto pero deberían contener la región de unión a elastina (amino�cidos 14 - 34). Un fragmento alternativo que podría usarse consiste en amino�cidos que forman el segundo bucle expuesto en la superficie (amino�cidos 343 - 486). Los fragmentos alternativos que contienen hasta 1, 2, 5, 10, 20, 50 amino�cidos menos en uno o los dos extremos también son posibles.

Receptores de laminina

15 El receptor de laminina de S. aureus desempeña un importante papel en la patogeneicidad. Un rasgo característico de la infección es la invasión de la corriente sanguínea que permite la extendida formación de abscesos metast�sicos. La invasión de la corriente sanguínea requiere la capacidad para extravarse a través de la membrana basal vascular. Esto se consigue mediante la unión a la laminina a través del receptor de la laminina (Lopes et al Science 1985, 229; 275).

20 Los receptores de laminina se exponen en la superficie y est�n presentes en muchas cepas de estafilococos, incluidos S. aureus y S. epidermidis.

SBI

Sbi es una proteína que tiene una región de unión a IgG y un dominio de unión a la apolipoprote�na H y se expresa en la mayoría de las cepas de S.aureus (Zhang et al 1998, Microbiology 144; 985).

25 El extremo N de la secuencia de Sbi tiene una secuencia señal típica con un sitio de escisión tras el amino�cido 29. Por tanto, un fragmento preferido de Sbi a incorporar en una composición inmunog�nica de la invención comienza en el residuo de amino�cidos 30, 31, 32 o 33 y sigue al extremo C de Sbi, por ejemplo de SEC ID N� 26.

El dominio de unión a IgG de Sbi se ha identificado como una región hacia el extremo N de la proteína desde lis amino�cidos 41 - 92. Este dominio es homólogo a los dominios de unión a IgG de la proteína A.

30 El dominio de unión a IgG de Sbi contiene la secuencia siguiente:

* - indica los amino�cidos que son similares entre dominios de unión a IgG

El fragmento preferido de Sbi a incluir en la composición inmunog�nica de la invención contiene un dominio de unión

35 a IgG. Este fragmento contiene la secuencia consenso para un dominio de unión a IgG como se designa con *, como se muestra en la secuencia anterior. Preferentemente, el fragmento contiene o consiste en la secuencia completa mostrada anteriormente. Más preferentemente, el fragmento contiene o consiste en los amino�cidos 30 - 92, 33 -92, 30 - 94, 33 - 94, 30 - 146, 33 - 146, 30 - 150, 33 - 150, 30 - 160, 33 - 160, 33 - 170, 33 - 180, 33 - 190, 33 - 200, 33 205 or 33 - 210 de Sbi, por ejemplo de SEC ID N� 26.

40 El fragmento preferido puede contener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 sustituciones de amino�cidos de las secuencias indicadas.

Fragmentos preferidos pueden contener múltiples repeticiones (2, 3, 4, 5, 6, 7,8, 9 or 10) del dominio de unión a IgG.

EFB - FIB

Fib es una proteína de unión a fibrin�geno de 19kDa que S. aureus secreta al medio extracelular. Es producida por 45 todos los aislados de S. aureus analizados (Wastfelt y Flock 1995, J. Clin. Microbiol. 33; 2347).

S. aureus se agrupa en presencia de fibrin�geno y se une a las superficies recubiertas con fibrin�geno. Esta capacidad facilita la colonización por estafilococos de los catéteres y células endoteliales.

Fib contiene una secuencia señal en el extremo N de la proteína con un supuesto sitio de escisión aproximadamente en el amino�cido 30. Por tanto, un fragmento preferido que se va a introducir en la composición inmunog�nica de la invención contendría la secuencia de la proteína madura (desde aproximadamente el amino�cido 30 al extremo C de la proteína).

IsaA/PisA

IsaA es una proteína de 29 kDa, también conocida como PisA, que se ha demostrado que es una proteína estafiloc�icica inmunodominante durante la sepsis en pacientes hospitalizados (Lorenz et al 2000, FEMS Immunol. Med. Microb. 29; 145).

Se piensa que los primeros 29 amino�cidos de la secuencia de IsaA son una secuencia señal. Por tanto, un fragmento preferido de IsaA que se va a incluir en una composición inmunog�nica d ela invención contendría los residuos de amino�cidos desde el 30 hacia adelante, hasta el final de la secuencia codificada.

Prote�nas de unión a fibronectina

La proteína A de unión a fibronectina (FnbA) se describe en el documento US5320951 y Schennings et al (1993, Microb. Pathog. 15; 227). La proteína A de unión a fibronectina contiene varios dominios que est�n implicados en la unión a fibronectina (documento WO 94/18327). Estos se denominan D1, D2, D3 y D4. Fragmentos preferidos de la proteína A o B de unión a fibronectina comprenden o consisten en D1, D2, D3, D4, D1-D2, D2-D3, D3-D4, D1-D3, D2-D4 or D1-D4 (como se describe en el documento WO 94/18327).

La proteína de unión a fibronectina contiene una secuencia señal de 36 amino�cidos. Por ejemplo:

VKNNLRYGIRKHKLGAASVFLGTMIVVGMGQDKEAA

Opcionalmente, la proteína madura sin esta secuencia señal est� incluida en la composición inmunog�nica de la invención.

Prote�nas transportadoras

La pared celular de las bacterias grampositivas actúa como barrera que impide la difusión libre de metabolitos al interior de la bacteria. Una familia de proteínas orquesta el paso de nutrientes esenciales a la bacteria y, por tanto, son esenciales para la viabilidad de la bacteria. La expresión proteína transportadora cubre las proteínas implicadas en la etapa inicial de unión a metabolitos, tales como hierro, as� como los implicados en el transporte real del metabolito al interior de la bacteria.

El hierro molecular es un cofactor esencial para el crecimiento bacteriano. Se secretan sider�foros que se unen al hierro libre y después son capturados por receptores de la superficie bacteriana que liberan hierro para su transporte a través de la membrana citoplasmática. La adquisición de hierro es crítica para el establecimiento de infecciones humanas, de modo que la generación de una respuesta inmunitaria contra esta clase de proteínas conduce a una pérdida de la viabilidad de los estafilococos.

Ejemplos de proteínas transportadoras incluyen el transportador de ABC inmunodominante (Burnie et al 2000 Infect. Imun. 68; 3200), IsdA (Mazmanian et al 2002 PNAS 99; 2293), IsdB (Mazmanian et al 2002 PNAS 99; 2293), transportador de Mg2+, SitC (Wiltshire y Foster 2001 Infect. Immun. 69; 5198) y transportador de Ni ABC.

Transportador de ABC inmunodominante

El transportador de ABC inmunodominante es una proteína bien conservada que puede ser capaz de generar una respuesta inmunitaria que ofrece protección cruzada contra diferentes cepas de estafilococos (Mei et al 1997, Mol. Microbiol. 26; 399). Los anticuerpos contra esta proteína se han hallado en pacientes con septicemia (Burnie et al 2000, Infect. Immun. 68; 3200).

Los fragmentos preferidos del transportador de ABC inmunodominante incluirán los p�ptidos DRHFLN, GNYD, RRYPF, KTTLLK, GVTTSLS, VDWLR, RGFL, más preferentemente KIKVYVGNYDFWYQS, TVIVVSHDRHFLYNNV y/o TETFLRGFLGRMLFS, ya que estas secuencias contienen ep�topos que son reconocidos por el sistema inmunol�gico humano.

IsdA-IsdB

Los genes isd (determinante de la superficie regulado por hierro) de S. aureus codifican proteínas responsables de la unión a hemoglobina y el paso del hierro hemo al citoplasma, donde actúa como nutriente esencial. IsdA e IsdB se localizan en la pared celular de los estafilococos. Parece que IsdA est� expuesta sobre la superficie de la bacteria, ya que es susceptible a la digestión con proteinasa K. ISDb se digirió parcialmente, lo que sugiere que est� parcialmente expuesta sobre la superficie de la bacteria (Mazmanian et al 2003 Science 299; 906).

IsdA e IsdB son ambas proteínas de 29 kDa que se unen al grupo hemo. Su expresión est� regulada por la disponibilidad del hierro a través del represor Fur. Su expresión ser� alta durante la infección en un huésped n el que la concentración ser� baja.

Tambi�n se conocen como FrpA yFrpB (Morrissey et al 2002, Infect. Immun. 70; 2399). FrpA yFrpB son las proteínas de superficie principales con una carga elevada. Se ha demostrado que proporcionan una contribución fundamental a la adhesión a plástico.

En una realización, la composición inmunog�nica de la invención comprende un fragmento de IsdA y/o IsdB que se describe en el documento WO 01/98499 o el documento WO 03/11899.

Toxinas y reguladores de la virulencia

Los miembros de esta familia de proteínas incluyen toxinas, tales como la toxina alfa, hemolisina, enterotoxina B y TSST-1, as� como las proteínas que regulan la producción de toxinas, tales como RAP.

Toxina alfa (Hla)

La toxina alfa es un determinante importante de la virulencia producida por la mayoría de las cepas de S.aureus. Es una toxina formadora de poros con actividad hemol�tica. Se ha demostrado que los anticuerpos contra la toxina alfa neutralizan los efectos perjudiciales y letales de la toxina alfa en modelos animales (Adlam et al 1977 Infect. Immun. 17; 250). Las plaquetas humanas, las células endoteliales y las células mononucleares son susceptibles a los efectos de la toxina alfa.

La elevada toxicidad de la toxina alfa requiere que se destoxifique antes de usar como inmun�geno. Esto se puede conseguir mediante tratamiento químico, por ejemplo tratando con formaldeh�do, glutaraldeh�do de otros reactivos de reticulación o mediante conjugación química a los polisac�ridos bacterianos, como se describe más adelante.

Un modo adicional de eliminar la toxicidad es introducir mutaciones puntuales que eliminen la toxicidad al tiempo que conservan la antigeneicidad de la toxina. La introducción de una mutación puntual en el amino�cido 35 de la toxina alfa, en la que se sustituye un residuo de histidina por un residuo de leucina, tiene como resultado la eliminación de la toxicidad al tiempo que se conserva la inmunogeneicidad (Menzies and Kernodle 1996; Infect. Immun. 64; 1839). La histidina 35 parece ser crítica para la adecuada oligomerizaci�n requerida para la formación de poros y la mutación de este residuo conduce a pérdida de toxicidad.

La toxina alfa se destoxifica, preferentemente, mediante la mutación de His 35 sustituyendo His 35 con Leu o Arg. En una realización alternativa, la toxina alfa se destoxifica mediante conjugación con otros componentes de la composición inmunog�nica, preferentemente polisac�ridos capsulares, lo más preferentemente al polisac�rido de tipo V de S. aureus y/o al polisac�rido de tipo VIII de S. aureus y/o PNAG.

Prote�na de activación de ARN III (RAP)

La RAP no es en s� misma una toxina, sino un regulador de la expresión de factores de virulencia. La RAP es producida y secretada por estafilococos. Activa el sistema regulador de agr de otros estafilococos y activa la expresión y la posterior liberación de factores de virulencia, tales como hemolisina, enterotoxina B y TSST-1.

Una respuesta inmunitaria generada contra RAP no mataría la bacteria, pero interferiría en su patogeneicidad. Esto tiene la ventaja de proporcionar menos presión selectiva para que aparezcan las nuevas cepas resistentes.

Tendr�a una segunda ventaja, la de producir una respuesta inmunitaria que sería instrumental en la reducción de la morbididad de la infección.

Es particularmente ventajoso combinar RAP con otros ant�genos en una vacuna, en particular cuando el ant�geno adicional proporcionaría una respuesta inmunitaria que fuera capaz de matar la bacteria.

Otras proteínas

Prote�na asociada con la acumulación (Aap)

La Aap es una proteína de 140 kDa que es esencial para la acumulación de cepas de S. epidermidis sobre las superficies (Hussain et al Infect. Immun. 1997, 65; 519). Las cepas que expresan esta proteína produjeron cantidades significativamente más grandes de biopel�culas y la Aap parece estar implicada en la formación de biopel�culas. Los anticuerpos contra la Aap son capaces de inhibir la formación de biopel�culas y de inhibir la acumulación de S. epidermidis.

Un fragmento preferido de la Aap es un dominio conservado que comprende o que consiste en los amino�cidos 550

-

1069.

Ant�geno secretor estafiloc�cico SsaA

El SsaA es una proteína fuertemente inmunog�nica de 30 kDa hallada tanto en S. aureus como en S. epidermidis (Lang et al 2000 FEMS Immunol. Med. Microbiol. 29; 213). Su expresión durante la endocarditis sugirió un papel de virulencia específico de la patogenia de la enfermedad infecciosa.

SsaA contiene una secuencia líder en el extremo N y un sitio de escisión para la peptidasa señal. Al p�ptido líder le sigue una región hidrof�lica de aproximadamente 100 amino�cidos, desde el residuo 30 al residuo 130.

Un fragmento preferido de SsaA a incorporar en la composición inmunog�nica de la invención est� formado por la proteína madura (los amino�cidos 27 al extremo C o los amino�cidos 30 al extremo C).

Fragmentos preferidos adicionales contienen el área hidrof�lica de SsaA desde el amino�cido 30 al amino�cido 130.

Composiciones inmunog�nicas preferidas de la invención no incluyen las secuencias proteicas divulgadas en el documento WO02/094868.

Combinaciones de tres proteínas

Una composición inmunog�nica preferida de la invención contiene tres componentes proteicos en una combinación de toxina alfa, una proteína de unión al componente extracelular que es ClfA o un fragmento inmunog�nico del mismo y una proteína transportadora (preferentemente, una proteína de unión a hierro).

En dicha combinación, la toxina alfa puede destoxificarse qu�miciamente o destoxificarse genéricamente mediante la introducción de mutación(es) puntual(es), preferentemete la mutación puntual His35Leu. La toxina alfa est� presente como proteína libre o, como alternativa, est� conjugada a un polisac�rido o componente LTA de la composición inmunog�nica.

Combinaciones preferidas incluyen:

Una composición inmunog�nica que comprende la toxina alfa, IsdA y una proteína de unión al componente extracelular, que es ClfA.

Una composición inmunog�nica que comprende la toxina alfa, IsdB y una proteína de unión al componente extracelular, que es ClfA.

Una composición inmunog�nica que comprende toxina alfa, IsdA y ClfA.

Selecci�n de ant�genos expresados en diferentes linajes clonales

El análisis de la aparición de factores de virulencia en relación con la estructura de la población de Staphylococcus aureus mostr� una presencia variable de genes de virulencia en las poblaciones naturales de S. aureus

Entre los aislados cl�nicos de Staphylococcus aureus, se demostr� que al menos cinco linajes lconales eran altamente prevalentes (Booth et al., 2001 Infect Immun. 69(1):345 - 52). Se demostr� que alfa-hemolosina (hla), proteína A de unión a fibronectina (fnbA) y el factor de agrupamiento A (clfA) estaban presentes en los aislados, con independencia de la identidad del inaje, lo que sugiere un papel importante de estas proteínas en la supervivencia de S. aureus (Booth et al., 2001 Infect lmmun. 69(1):345 - 52). Además, de acuerdo con Peacock et al. 2002 las distrubiciones de fnbA, clfA, coagulasa, spa, map, pvl (leucocidina de Panton-Valentine), hlg (toxina gamma), toxina alfa e ica parecieron no estar relacionadas con la estructura clonal subyacente, lo que sugiere una transferencia horizontal considerable de estos genes.

Por el contrario, otros genes de virulencia, tal como la proteína B de unión a fibronectina ((fnbB), betahemolisina (hlb), proteína de unión al col�geno (cna), TSST-1 (tst) y gen de resistencia a meticilina (mecA) est�n fuertenente asociados con linajes específicos (Booth et al., 2001 Infect Immun 69(1):345 - 52). De un modo similar, Peacock et al 2002 (Infect Immun. 70(9):4987 - 96) mostraron que las distribuciones de las enterotoxinas, tst, las exfolatinas (eta and etb), las toxinas beta y delta, los genes sdr (sdrD, sdrE and bbp), cna, ebpS y efb en la población es�n alta y significativamente relacionados con los complejos clonales derivados de MLST.

Los datos de MLST no proporcionan pruebas de que las cepas responsables de enfermedad nosocomial representan una subpoblaci�n distinta de las cepas causantes de enfermedades adquiridas en la comunidad o cepas recuperadas de portadores asintom�ticos (Feil et al., 2003 J Bacteriol. 185(11):3307 - 16).

Las composiciones inmunog�nicas preferidas de la invención son eficacies contra estafilococos de diferentes linajes clonales.

En una realización, esto se consigue incluyendo 1, 2, 3, 4, preferentemente al menos 1, proteínas que se expresan en la mayoría de los aislados de estafilococos. Ejemplos de dichas proteínas incluyen alfa-hemolisina (hla), proteína A de unión a fibronectina (fnbA) t factir de agrupamiento A (clfA), coagulasa, spa, map, pvl (leucocidina de Panton-Valentine), hlg (toxina gamma) e ica. Los inventores también han identificado el transportador de ABC inmunodominante, RAP, autolisina (Rupp et al 2001, J. Infect. Dis. 183; 1038), receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA, SPOIIIE (), SsaA, EbpS, SasF (Roche et al 2003, Microbiology 149; 643), EFB(FIB), SBI, ClfB, IsdA, IsdB, FnbB, Npase, EBP, sialoprote�na II de unión al hueso, IsaB/PisB (Lorenz et al FEMS Immuno. Med. Microb. 2000, 29; 145), SasH (Roche et al 2003, Microbiology 149; 643), MRPI, SasD (Roche et al 2003, Microbiology 149; 643), SasH (Roche et al 2003, Microbiology 149; 643), precursor de aureolisina (AUR)/Sepp1 y nueva autolisina.

En una realización alternativa, 2 o más proteínas que se expresan en diferentes conjuntos de cepas clonales est�n incluidas en la composición inmunog�nica de la invención. Preferentemente, la combinación de ant�genos permitirán la generación de una respuesta inmunitaria que es eficaz contra múltiples cepas clonales, lo más preferentemente contra todas las cepas clonales. Combinaciones preferidas incluyen FnbB y betahemolisina, FnbB y Cna, FnbB y TSST-1, FnbB y mecA, FnbB y SdrD, FnbB y SdrF, FnbB y EbpS, FnbB y Efb, beta-hemolisina y Cna, betahemolisina y TSST-1, beta-hemolisina y mecA, beta-hemolisina y SdrD, beta-hemolisina y SdrF, beta-hemolisina y EbpS, beta-hemolisina y Efb, Cna y TSST-1, Cna y mecA, Cna y SdrD, Cna y SdrF, Cna y EbpS, Cna y Efb, TSST-1 y mecA, TSST-1 y SdrD, TSST-1 y SdrF, TSST-1 y EbpS, TssT-1 y Efb, MecA y SdrD, MecA y SdrF, MecA y EbpS, MecA y Efb, SdrD y SdrF, SdrD y EbpS, SdeD y Efb, SdrF y EbpS, SdrF y Efb, y, EbpS y Efb.

Las combinaciones preferidas descritas con anterioridad se pueden combinar con componentes adicionales descritos más adelante.

Selecci�n de ant�genos expresados durante diferentes fases de crecimiento

Los estafilococos atraviesan una fase de crecimiento exponencial durante la cual se expresarán un conjunto determinado de proteínas. Estas incluyen muchas de las proteínas de unión al componente extracelular y proteínas transporadoras. Después de un periodo de crecimiento exponencial, los estafilococos regresan a una fase postexponencial durante la cual el crecimiento es más lento y se modula la expresión de proteínas. Muchas de estas proteínas expresadas durante la fase de crecimiento exponencial est�n reguladas por disminución, mientras que otras proteínas, tales como enzimas y la mayoría de las toxinas, incluyendo la toxina alfa, se expresan a niveles más altos.

Las composiciones inmunog�nicas preferidas de la invención comprenden una prot�ina expresada a niveles más alto durante la fase de crecimiento exponencial y una proteína expresada a niveles más altos durante la fase de crecimiento postexponencial.

“Niveles más altos” hace referencia a que el nivel d expresión es más alto en una fase en comparación con la otra

fase.

En la invención, la composición inmunog�nica comprende la toxina alfa, y una proteína de unión al componente extracelular, que es ClfA o un fragmento inmunog�nico del mismo. La toxina alfa puede destoxificarse genéticamente o químicamente como se ha descrito anteriormente y puede estar no conjugada o conjugada con un polisac�rico, como se describe más adelante.

Polisac�ridos

Las composiciones inmunog�nicas de la invención comprenden, preferentemente, además, polisac�ridos capsulares, incluyendo uno o más de PIA (también conocido PNAG) y/o el polisac�rido capsular de tipo V y/o de tipo VIII de S. aureus y/o el polisac�rido capsular de tipo I y/o de tipo 11 y/o de tipo III de S. epidermidis.

PIA (PNAG)

Actualmente est� claro que las diversas formas de polisac�ridos de superficie de estafilococos identificados como PS/A, PIA y SAA son la misma entidad química, PNAG (Maira-Litran et al Vaccine 22; 872 - 879 (2004)). Por tanto, el término PIA o PNAG abarca todos estos polisac�ridos u oligosac�ridos derivados de ellos.

PIA es una adhesina polisac�rida intercelular y est� compuesta por un pol�mero de glucosamina unida por β-(1 →6) sustituida por constituyentes N-acetilo y O-succinilo. Este polisac�rido est� presente tanto en S.aureus como en S. epidermidis y se puede aislar de cualquier fuente (Joyce et al 2003, Carbohydrate Research 338; 903; Maira-Litran et al 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por ejemplo, PNAG se puede aislar de la cepa de S. aureus MN8m (documento WO 04/43407).

La PIA aislada de S. epidermidis es un constituyente integral de biopel�cula. Es responsable de la participación en la adhesión célula-célula y probablemente también funciona para proteger la colonia en crecimiento de la respuesta inmunitaria del huésped.

Recientemente se ha mostrado que el polisac�rido conocido anteriormente como poli-N-succinil-β-(1 → 6)glucosamina (PNSG) no tiene la estructura prevista, ya que la identificación de la N-succinilaci�n era incorrecta (Maira-Litran et al 2002, Infect. Imun. 70; 4433). Por tanto, el polisac�rido oficialmente conocido como PNSG y que actualmente se ha descubierto que es PNAG también entra dentro del término PIA.

PIA (o PNAG) puede tener diferents tamaños que varían desde más de 400 kDa a entre 75 y 400 kDa a entre 10 y 75 kDa a oligosac�ridos compuestos por hasta 30 unidades de repetición (de glucosamina unida por sustituida por constituyentes de N-acetilo o de O-succinilo). Cualquier tamaño de polisac�rido u oligosac�ridos PIA puede ser útil en una composición inmunog�nica de la invención, aunque se prefiere un tamaño de más de 40 kDa. El tamaño se puede alcanzar mediante cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo mediante microfluidificaci�n, irradiación ultrasónica o mediante escisión química (documentos WO 03/53462, EP497524, EP497525).

Los intervalos de tamaño preferidos de PIA (PNAG) son 40 – 400 kDa, 40 – 300 kDa, 50 – 350 kDa, 60 – 300 kDa, 50 – 250 kDa y 60 – 200 kDa.

PIA (PNAG) puede tener un grado de acetilaci�n diferente debido a la sustitución sobre los grupos de amino con acetato. PIA producida in vitro est� casi completamente sustituida en los grupos amino (95 -100 %). Como alternativa, se puede usar una PIA desacetilada (PNAG) que tenga menos del 60 %, preferentemente menos del 50 %, 40 %, 30 %, 20 %, 10 % de acetilaci�n. Se prefiere el uso de un PIA (PNAG) desacetilado, ya que los ep�topos no acetilados de PNAG son eficientes en la mediación de la muerte por opsonizaci�n de bacterias grampositivas, preferentemente S. aureus y/o S. epidermidis. Lo más preferentemente, el PIA (PNAG) tiene un tamaño entre 40 kDa y 300 kDa y est� desacetilado de modo que menos del 60 %, 50 %, 40 %, 30 % o 20 % de los grupos amino est�n acetilados.

El término PNAG desacetilado (dPNAG) hace referencia a un polisac�rido u oligosac�rido PNAG en el que menos del 60 %, 50 %, 40 %, 30 %, 20 % o 10 % de los grupos amino est�n acetilados.

En una realización, el PNAH se desacetila para formar dPNAG tratando químicamente el polisac�rido nativo. Por ejemplo, el PNAG nativo se trata con una solución básica de modo que el pH aumenta por encima de 10. Por ejemplo, el PNAH e trata con NaOH , KOH o NH4OH 0,1 -5M, 0,2 -4M, 0,3 -3M, 0,5 -2M, 0,7 5 - 1,5 M o 1 M. El tratamiento se realiza durante al menos 10 o 30 minutos o 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15 or 20 horas a una temperatura de 20 100, 25 - 80, 30 - 60 or 30 - 50 o 35 - 45 � C. El dPNAG se puede preparar como se ha descrito en el documento WO 04/43405.

El o los polisac�ridos incluidos en la composición inmunog�nica de la invención est�n, preferentemente, conjugados a una proteína transportadora como se describe más adelante o, como alternativa, no est�n conjugados.

Polisac�ridos de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus

La mayoría de las cepas de S.aureus que causan infección en el ser humano contienen polisac�ridos de tipo 5 o de tipo 8. Aproximadamente el 60 % de las cepas humanas son de tipo 8 y aproximadamente el 30 % son de tipo 5. Las estructuras de los ant�genos polisac�ridos capsulares de tipo 5 y de tipo 8 se describen en Moreau et al Carbohydrate Res. 201; 285 (1990) y Fournier et al Infect. Immun. 45; 87 (1984). Ambos tienen FucNAcp en su unidad de repetición, as� como ManNAcA, que se pueden usar para introducir un grupo sulfhidrilo. Las estructuras se notificaron como:

Tipo 5

→4)-β-D-ManNAcA(30Ac)-(1 →4)-α-L-FucNAc(1 →3)-β-D-FucNAc-(1 →

Tipo 8

→3)-β-D-ManNACA(4OAc)-(1 →3)-α-L-FucNAc(1 →3)-(3-D-FucNAc-(1 →

Recientemente (Jones Carbohydrate Research 340, 1097 - 1106 (2005)), la espectroscopia RMN revis� las estructuras a:

Tipo 5

→4)-β-D-ManNAcA-(1 →4)-α-L-FucNAc(3OAc)-(1 →3)-β-D-FucNAc-(1 →

Tipo 8

→3)-β-D-ManNACA(40Ac)-(1 →3)-α-L-FucNAc(1 →3)-(α-D-FucNAc(1 →

Los polisac�ridos se pueden extraer de la cepa adecuada de S. aureus usando un procedimiento bien conocido para el experto, por ejemplo como se describe en el documento US6294177. Por ejemplo, ATCC 12902 es una cepa de

S. aureus de tipo 5 y ATCC 12605 es una cepa de S. aureus de tipo 8.

Los polisac�ridos son del tamaño nativo o, como alternativa, pueden dimensionarse mediante, por ejemplo, microfluidificacion, irradiación ultrasónica o mediante tratamiento químico. La invención también cubre los oligosac�ridos derivados de los polisac�ridos de tipo 5 y de tipo 8 de S. aureus.

Los polisac�ridos de tipo 5 y de tipo 8 incluidos en la composición inmunog�nica de la invención est�n, preferentemente, conjugados a una proteína transportadora como se describe más adelante o, como alternativa, no est�n conjugados.

Las composiciones inmunog�nicas de la invención contiene, como alternativa, el polisac�rido de tipo 5 o de tipo 8.

Ant�geno 336 de S. aureus

En una realización, la composición inmunog�nica de la invención comprende el ant�geno 336 de S. aureus descrito en el documento US6294177.

El ant�geno 336 comprende hexosamina unida con β, no contiene grupos O-acetilo y específicamente se une a los anticuerpos a tipo 336 de S. aureus depositado en la ATCC con el número 55804.

En una realización, el ant�geno 336 es un polisac�rido que es de tamaño nativo o, como alternativa, pueden dimensionarse mediante, por ejemplo, microfluidificacion, irradiación ultrasónica o mediante tratamiento químico. La invención también cubre los oligosac�ridos derivados del ant�geno 336.

El ant�geno 336, cuando est� incluido en la composición inmunog�nica de la invención est�n, preferentemente, conjugados a una proteína transportadora como se describe más adelante o, como alternativa, no est�n conjugados.

Polisac�ridos de tipo I, II y III de S. epidermidis

Las cepas ATCC-31432, SE-360 y SE-10 de S. epidermidis son características de tres tipos capsulares diferentes, I, II y III, respectivamente (Ichiman y Yoshida 1981, J. Appl. Bacteriol. 51; 229). Los polisac�ridos capsulares extraídos de cada serotipo de S. epidermidis constituyen los polisac�ridos de tipo I, II y III. Los polisac�ridos se pueden extraer mediante varios procedimientos, incluyendo el procedimiento descrito en el documento US4197290 o como se describe en Ichiman et al 1991, J. Appl. Bacteriol. 71; 176.

En una realización de la invención, la composición inmunog�nica comprende polisac�ridos u oligosac�ridos de tipo I y/o II y/o III de S. epidermidis.

Los polisac�ridos son del tamaño nativo o, como alternativa, pueden dimensionarse mediante, por ejemplo, microfluidificacion, irradiación ultrasónica o mediante escisión química. La invención también cubre los oligosac�ridos extraídos de cepas de S. epidermidis.

Estos polisac�ridos no est�n conjugados o, preferentemente, est�n conjugados como se describe más adelante.

Conjugaci�n de polisac�ridos

Entre los problemas asociados con el uso de polisac�ridos en vacunación se encuentra el hecho de que los polisac�ridos per se son malos inmun�genos. Estrategias que se han diseñado para superar esta falta de inmunogeneicidad incluyen la unión del polisac�rido a vehículos proteicos grandes, que proporcionan ayuda por los linfocitos T inespec�ficos. Se prefiere que los polisac�ridos usados en la invención est�n ligados a un vehículo proteico que proporcione ayuda por los linfocitos T inespec�ficos. Ejemplos de tales vehículos que pueden estar conjugados con inmun�genos polisac�ridos incluyen los toxoides de difteria y tétanos (DT, DT CRM197 y TT, respectivamente), hemocianina de lapa californiana (KLH) y el derivado proteico purificado de la tuberculina (PPD), la exoprote�na A de Pseudomonas aeruginosa (rEPA), la proteína D de Haemophilus influenzae, neumolisina o fragmentos de cualquiera de los anteriores. Fragmentos adecuados para usar incluyen fragmentos que abarcan los ep�topos de linfocitos T colaboradores. En concreto, el fragmento de proteína D contiene, preferentemente, el 1/3 en el extremo N de la proteína. La proteína D es una proteína de unión a IgD de Haemophilus influenzae (documento EP 0 594 610 B1) y es un potencial inmun�geno.

Adem�s, las proteínas estafiloc�cicas se pueden usar como proteína vehículo en los conjugados de polisac�ridos de la invención. Las proteínas estafiloc�cidas descritas más adelante se pueden usar como proteína vehículo; por ejemplo el receptor de laminina, la proteína de unión a SitC/MntC/saliva, EbhA, EbhB, proteína de unión a elastina (EbpS), EFB (FIB), SBI, ClfA, SdrC, SdrG, SdrH, Lipasa GehD, SasA, FnbA, FnbB, Cna, ClfB, FbpA, Npasa, IsaA/PisA, SsaA, EPB, SSP-1, SSP-2, HBP, proteína de unión a vitronectina, proteína de unión a fibrin�geno, coagulasa, Fig, MAP; transportador de ABC inmunodominante, IsdA, IsdB, transportador de Mg2+, SitC, toxina alfa del transportador de Ni ABC (Hla), mutante H35R de la toxina alfa, proteína de activación de RNA III (RAP) o fragmentos de las mismas.

Una nueva proteína vehículo que sería particularmente ventajosa para usar en el contexto de una vacuna de estafilococos es el alfa toxoide de estafilococos. La forma nativa puede estar conjugada a un polisac�rido, ya que el proceso de conjugación reduce la toxicidad. Preferentemente, una toxina alfa genéticamente destoxificada tal como las variantes His35Leu o His 35 Arg se usan como vehículos, ya que la toxicidad residual es menor. Como alternativa, la toxina alfa se destoxifica químicamente mediante tratamiento con un reactivo de reticulación, formaldeh�do o glutaraldeh�do. Una toxina alfa se destoxifica genéticamente se destoxifica químicamente, preferentemente mediante tratamiento con un reactivo de reticulación, formaldeh�do o glutaraldeh�do, para reducir aún más la toxicidad.

Los polisac�ridos pueden unirse a la(s) proteína(s) vehículo por cualquier procedimiento conocido (por ejemplo, por Likhite, patente de EE.UU. 4.372.945 y por Armor y col., patente de EE.UU. 4.474.757 y Jennings et al., patente de EE.UU. 4.356.170). Preferentemente se lleva a cabo la química de conjugación CDAP (documento WO 95/08348).

En CDAP. el reactivo de cianilaci�n tetrafluoroborato de 1–ciano-dimetilaminopiridinio (CDAP) se usa, preferentemente, para la síntesis de conjugados de polisac�rido-proteína. La reacción de cianilaci�n puede realizarse bajo condiciones relativamente suaves, que evitan la hidrólisis de los polisac�ridos sensibles a la alcalinidad. Esta síntesis permite un acoplamiento directo con una proteína vehículo.

El polisac�rido se solubiliza en agua o una solución salina. CDAP se disuelve en acetonitrilo y se añade inmediatamente a la solución de polisac�ridos. El CDAP reacciona con los grupos hidroxilo del polisac�rido para formar un éster de cianato. Después de la etapa de activación se añade la proteína vehículo. Los grupos amino de la lisina reaccionan con el polisac�rido activado para formar un enlace covalente de isourea. Después de la reacción de acoplamiento, después se añade un gran exceso de glicina para inactivar los grupos funcionales activados residuales. Después, el producto se pasa a través de una columna de permeaci�n en gel para eliminar la proteína vhe�culo sin reaccionar y los reactivos residuales.

La conjugación implica, preferentemente, producir un enlace directo entre la proteína vehículo y los polisac�ridos. Opcionalmente se puede introducir un espaciador (tal como dihidruro ad�pico (ADH)) entre la proteína vehículo y el polisac�rido.

Protecci�n contra S.aureus y S. epidermidis

En una realización preferida d la invención, la composición inmunog�nica proporciona una respuesta inmunitaria eficaz contra más de una cepa de estafilococos, preferentemente contra cepas de S.aureus and S. epidermidis. Más preferentemente, se genera una respuesta inmunitaria protectora contra los serotipos 5 y 8 de S. aureus. Más preferentemente, se genera una respuesta inmunitaria protectora contra múltiples cepas de S. epidermidis, por ejemplo de cepas de al menos dos serotipos I, II y III de S. epidermidis.

Un uso de la composición inmunog�nica de la invención es prevenir las infecciones nosocomiales mediante la inoculación antes del tratamiento hospitalario. En esta etapa, es difícil predecir de forma precisa a qué cepas estafiloc�cicas estar� expuesto el paciente.Por tanto, es ventajoso inocular una vacuna que sea capaz de generar una respuesta inmunitaria protectora eficaz contra varias cepas de estafilococos.

Una respuesta inmunitaria eficaz se define como una respuesta inmunitaria que confiere una protección significativa en un modelo de exposición de ratones o ensayo de opsonofagocitosis como se describe en los ejemplos. Una protección significativa en un modelo de exposición de ratones, por ejemplo el del ejemplo 5, se define como un incremento de la DL50 en comparación con los ratones a los que se ha inoculado vehículo de al menos 10 %, 20 %, 50 %, 100 % o 200 %. Una protección significativa en un modelo de exposición de rata de algodón, por ejemplo el del ejemplo 8, se define como una disminución del log UFC medio observadi de al menos 10 %, 20 %, 50 %, 70 % o 90 %. Se sabe que la presencia de anticuerpos de opsonizacion se correlacionan con la protección, por tanto, una protección significativa viene indicada por una disminución del recuento bacteriano de al menos 10 %, 20 %, 50 %, 70 % o 90 % en un ensayo de opsonofagocitosis, por ejemplo el del ejemplo 7.

Varias de las proteínas, incluyendo el transportador de ABC inmunodominante, la proteína de activación de ARN III, los receptores de laminina, SitC, IsaA/PisA, SsaA, EbhA/EbhB, EbpS y Aap est�n bien conservados entre S.aureus y S. epidermidis y el ejemplo 8 muestra que IsaA, ClfA, IsdB, SdrG, HarA, FnbpA and Sbi pueden generar una respuesta inmunitaria de reacción cruzada (por ejemplo, reacción cruzada entre al menos una cepa de S. aureus y al menos una cepa de S. epidermidis). PIA también esta bien conservado entre S. aureus y S. epidermidis y es capaz de inducir una respuesta inmunitaria de protección cruzada.

Por tanto, en una realización preferida, la composición inmunog�nica de la invención comprender� dos, tres o cuatro de las proteínas anteriores, que comprenden, preferentemente, además, PIA (PNAG).

Vacunas de polinucle�tidos

Tambi�n se hace referencia al uso de los polinucle�tidos de la Figura 2 en el tratamiento, prevención o diagnóstico de infección por estafilococos. Dichos polinucle�tidos incluyen polinucle�tidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido que tiene una identidad de al menos un 70 %, preferentemente una identidad de al menos un 80 %, más preferentemente una identidad de al menos un 90 %, todavía más preferentemente una identidad de al menos un 95 % con la secuencia de amino�cidos de la figura 1, sobre la longitud completa de la secuencia. A este respecto, los polip�ptidos que tienen una identidad de al menos un 97 % son altamente preferidos, mientrs que aquellos con una identidad de al menos un 98 - 99 % son más altamente preferidos y aquellos con una identidad de al menos un 99 % son los más altamente preferidos.

Otros polinucle�tidos que encuentran utilidad incluyen polinucle�tidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido que tiene una identidad de al menos un 70 %, preferentemente una identidad de al menos un 80 %, más preferentemente una identidad de al menos un 90 %, todavía más preferentemente una identidad de al menos un 95 % con una secuencia de nucle�idos que codifica una proteína de la invención sobre la región de codificación completa. A este respecto, los polinucle�tidos que tienen una identidad de al menos un 97 % son altamente preferidos, mientrs que aquellos con una identidad de al menos un 98 - 99 % son más altamente preferidos y aquellos con una identidad de al menos un 99 % son los más altamente preferidos.

Otros polinucle�tidos incluyen polinucle�tidos aislados que comprenden una secuencia de nucleótidos que tiene una identidad de al menos un 70 %, preferentemente una identidad de al menos un 80 %, más preferentemente una identidad de al menos un 90 %, todavía más preferentemente una identidad de al menos un 95 %, con la secuencias de la figura 1. A este respecto, los polinucle�tidos que tienen una identidad de al menos un 97 % son altamente preferidos, mientras que aquéllos con una identidad de 98 -99 % son más altamente preferidos y aquéllos con una identidad de al menos un 99 % son los más altamente preferidos. Dicho polinucle�tido se puede insertar en un pl�smido o vector de microorganismo recombinante adecuado y usar para inmunizaci�n (véase, por ejemplo, Wolff et. al., Science 247:1465 - 1468 (1990); Corr et. al., J. Exp. Med. 184:1555 - 1560 (1996); Doe et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:8578 - 8583 (1996)).

Tambi�n se hace referencia a un ácido nucleico que codifica las proteínas mencionadas anteriormente y a su uso en medicina. En un caso preferido, los polinucle�tidos aislados pueden ser monocatenarios (de codificación o antisentido) o bicatenarios, y pueden ser moléculas de ADN (gen�mico, ADNc o sintético) o ARN. Las secuencias de codificación y no codificantes adicionales pueden estar presentes dentro de un polinucle�tido, aunque no es necesario. En otros casos relacionados, también se hace referencia a variantes polinucleotidicas que tienen una identidad sustancial con las secuencias divulgadas en el presente documento en la figura 2; los que comprenden una identidad de secuencia de al menos un 70 %, preferentemente de al menos 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, or 99 % o mayor, la identidad de secuencia comparada con una secuencia de polinucle�tidos en el presente documento usando los procedimientos descritos en el presente documento (p. ej., análisis BLAST usando parámetros convencionales). En un caso relacionado, el polinucle�tido aislado comprender� una secuencia de nucleótidos que codifica un polip�ptido que tiene una identidad de al menos un 90 %, preferentemente de un 9 % o superior, con la secuencia de amino�cidos de la figura 1, sobre la longitud completa de una secuencia de la Figura 1; o una secuencia de nucleótidos complementaria a dicho polinucle�tido aislado.

Tambi�n se hace referencia al uso de polinucle�tidos que son complementarios con todos los polinucle�tidos descritos anteriormente.

Tambi�n se hace referencia al uso de un fragmento de un polinucle�tido de la invención que cuando se administra a un sujeto tiene las mismas propiedades inmunog�nicas que un polinucle�tido de la Figura 1.

Tambi�n se hace referencia al uso de un polinucle�tido que codifica un fragmento inmunol�gico de una proteína de la Figura 1 como se ha definido anteriormente en el presente documento. También se contempla el uso de fragmentos que tienen un nivel de actividad inmunog�nico de al menos aproximadamente un 50 %, preferentemente de al menos aproximadamente un 70 % y, más preferentemente, de al menos aproximadamente un 90 % del nivel de actividad inmumog�nica de una secuencia polipept�dica codificada por una secuencia de polinucle�tidos expuesta en la Figura 2.

Los fragmentos polipept�dicos para dicho uso comprende, preferentemente, al menos aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 50, or 100 amino�cidos contiguos, o más, incluyendo todas las longitudes intermedias, de una composición polipept�dica expuesta en el presente documento, tales como las expuestas anteriormente.

Los polinucle�tidos para usar se pueden obtener usando técnicas de clonaci�n y detección selectiva estándar, de una biblioteca de ADNc derivada de ARNm e células de tejido tumoral o preneopl�sico humano (por ejemplo, pulmón), (por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2� Ed., Cold Spring harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N.Y. (1989)). Los polinucle�tidos también se pueden obtener de fuentes naturales, tales como bibliotecas de ADN gen�mico, o se pueden sintetizar usando técnicas bien conocidas y disponibles comercialmente.

Existen varios procedimientos disponibles y muy conocidos por los expertos en la técnica para obtener ADNc de longitud completa o extender ADN cortos, por ejemplo, los basados en los procedimientos de amplificación rápida de los extremos del ADNc (RACE) (véase, por ejemplo, Frohman, y col., PNAS USA 85, 8998 - 9002, 1988). Modificaciones recientes de la técnica, ejemplificadas por la tecnología Marathon™ (Clontech Laboratories Inc.), por ejemplo, han simplificado significativamente la búsqueda de ADNc más largos. En la tecnología MarathonTM, se preparan ADNc a partir de ARNm extraído de un tejido seleccionado y se liga en cada extremo una secuencia "adaptadora". A continuación se lleva a cabo la amplificación de los ácidos nucleicos (PCR) para amplificar el extremo 5' "que falta" del ADNc usando una combinación de cebadores de oligonucle�tidos específicos del gen y específicos del adaptador. Después se repite la reacción PCR usando cebadores "anidados", es decir, cebadores diseñados para hibridarse en el producto amplificado (normalmente un cebador específico del adaptador que se hibrida más all� de 3' en la secuencia adaptadora y un cebador específico del gen que se hibrida más all� de 5' en la secuencia del gen conocida). Después, los productos de esta reacción se pueden analizar mediante secuenciaci�n del ADN y se puede construir un ADNc de longitud completa uniendo directamente el producto al ADNc existente para dar una secuencia completa o llevando a cabo una PCR de longitud completa separada usando la nueva información de la secuencia para el diseño del cebador 5'.

El sistema de expresión también puede ser un microorganismo vivo recombinante, tal como un virus o una bacteria. El gen de interés se puede insertar en el genoma de un virus o bacteria vivo recombinante. La inoculación y la infección in vivo con este vector vivo darán lugar a la expresión in vivo del ant�geno y a la inducción de respuestas inmunitarias.

Por tanto, en ciertos casos, los polinucle�tidos que codifican polip�ptidos inmunog�nicos para usar como se ha tratado en el presente documento se introducen en células huésped de mamífero para expresar usando cualquiera de una serie de sistemas virales conocidos. En un caso ilustrativo, los retrovirus proporcionan una plataforma cómoda y eficaz para sistemas de liberación g�nica. Una secuencia de nucleótidos seleccionada que codifica un polip�ptido para uso como se ha descrito se puede insertar en un vector y empaquetar como partículas retrovirales usando técnicas conocidas en la materia. A continuación, se puede aislar el virus recombinante y liberar en un sujeto. Se ha descrito una serie de sistemas retrovirales ilustrativos (p. ej., la patente de EE.UU. N� 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BioTechniques 7:980 - 990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5 - 14; Scarpa et al. (1991) Virology 180:849 - 852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033 - 8037; y Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102 - 109.

Adem�s, también se han descrito numerosos sistemas ilustrativos basados en adenovirus. Al contrario que los retrovirus que se integran en el genoma huésped, los adenovirus persisten extracromos�micamente, de modo que se minimizan los riesgos asociados con mutag�nesis de inserción (Haj-Ahmad y Graham (1986) J. Virol. 57:267 274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911 - 5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5:717 - 729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933 - 940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1:51 - 58; Berkner, K. L. (1988) BioTechniques 6:616 629; y Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4:461 - 476).

Tambi�n se han desarrollado varios sistemas de vectores v�ricos adenoasociados (AAV) para liberación de polinucle�tidos. Los vectores AAV pueden construirse fácilmente usando técnicas bien conocidas en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. N� 5.173.414 y 5.139.941; las publicaciones internacionaesl N� WO 92/01070 y WO 93/03769; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8:3988 - 3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3:533 - 539; Muzyczka,

N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158:97 - 129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5:793 801; Shelling and Smith (1994) Gene Therapy 1:165 - 169; y Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179:1867 - 1875.

Los vectores virales adicionales útiles para liberar las moléculas de ácido nucleico que codifican polip�ptidos para usar mediante transferencia g�nica incluyen los derivados de la familia de poxv�ridos, tales como el virus variolovacunal y los poxvirus aviares. A modo de ejemplo, los recombinantes del virus variolovacunal que expresan las moléculas de interés se pueden construir del siguiente modo. El ADN que codifica un polip�pido se inserta primero en un vector adecuado de modo que est� adyacente a un promotor variolovacunal y que flanquee las secuencias de ADN variolovacunales, tal como la secuencia que codifica la timidina quinasa (TK). Después, este vector se usa para transfectar células que se infectan de forma simultánea con el virus variolovacunal. La recombinación homóloga sirve para insertar el promotor variolovacunal más el gen que codifica el polip�ptido de interés en el genoma viral. El recombinante TK.sup.(-) resultante se puede seleccionar mediante cultivo de las células en presencia de 5-bromodesoxiuridina y escogiendo las placas virales resistentes en el mismo.

Un sistema de infección/transfecci�n basado en el virus variolovacunal se puede usar de forma conveniente para proporcionar expresión o coexpresi�n inducible transitoria de uno o más polip�ptidos descritos en el presente documento en las células huésped de un organismo. En este sistema concreto, las células se infectaron primero in vitro con un virus variolovacunal recombinante que codifica la ARN polimerasa del bacteri�fago T7. Esta polimerasa exhibe una especificidad exquisita en cuanto a que sólo transcribe modes que llevan promotores de T7. Tras la infección, las células se transfectan el polinucle�tido o los polinucle�tidos de interés dirigido por un promotor de T7. La polimerasa expresada en el citoplasma del virus variolovacunal recombinante transcribe el ADN transfeccionado en ARN que después es traducido al polip�ptido por la maquinaria de traducción del huésped. El procedimiento proporciona una producción citopl�smica transitoria y de alto nivel de grandes cantidades de ARN y sus productos de traducción.Véase, por ejemplo, Elroy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:6743 - 6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83:8122 - 8126.

Como alternativa, los poxvirus aviares, tales como los virus de la viruela aviar y de la viruela de canario, también se pueden usar para liberar las secuencias de codificación de interés. Se sabe que los virus de la viruela aviar recombinantes, que expresan inmunogenes de pat�genos de mamífero, confieren inmunidad protectora cuando se administran a especies no aviares. El uso de un vector del virus de la viruela aviar es particularmente deseable en especies humanas y de otros mamíferos, ya que los miembros del género Avipox solo se replican de forma productiva en especies de aves susceptibles y, por tanto, no son ineficaces en células de mamífero. Los procedimientos para producir virus de la viruela aviar recombinante son conocidos en la técnica y emplean recombinación genética, como se ha descrito anteriormente con respecto a la producción de virus variolovacunales. Véase, por ejemplo, los documentos WO 91/12882, WO 89/03429 y WO 92/03545.

Tambi�n se pueden usar cualquiera de una serie de vectores alfavirus para liberar composiciones de polinucle�tidos para usar como se ha descrito en el presente documento, tales como los vectores descritos en las patentes de EE.UU. N� 5.843.723; 6.015.686; 6.008.035 y 6.015.694. Determinados vectores basados en la la encefalitis equina venezolana (EEV) también se pueden usar y ejemplos ilustrativos de los mismos se pueden encontrar en las patentes de EE.UU. N� 5.505.947 y 5.643.576.

Adem�s, también se pueden usar vectores conjugados moleculares, tales como los vectores quiméricos de adenovirus descritos en Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268:6866 - 6869 y Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89:6099 - 6103, para la liberación g�nica conforme a la invención.

Informaci�n ilustrativa adicional sobre estos y otros sistemas de liberación basados en virus conocidos se pueden encontrar en, por ejemplo, Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317 - 321, 1989; Flexner et al., Ann.

N.Y. Acad. Sci. 569:86 - 103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17 - 21, 1990; las patentes de EE.UU. N� 4.603.112, 4.769.330, y 5.017.487; el documento WO 89/01973; la patente de EE.UU. N� 4.777.127; el documento GB 2.200.651; el documento EP 0.345.242; el documento WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616 - 627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431 -434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215 - 219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498 - 11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838 - 2848, 1993; y Guzman et al., Cir. Res. 73:1202 - 1207, 1993.

Los microorganismos vivos recombinantes descritos anteriormente pueden ser virulentos o pueden atenuarse de diversos modos para obtener vacunas con microorganismos vivos. Dichas vacunas con microorganismos vivos también forman parte de la invención.

En determinado caso, un polinucle�tido se puede integrar en el genoma de una célula diana. Esta integración puede realizarse en una ubicación y orientación específicas mediante recombinación homóloga (sustitución g�nica) o puede integrarse en una ubicación inespec�fica aleatoria (aumento g�nico). En otros casos adicionales, el polinucle�tido puede mantenerse de forma estable en la célula como un segmento epis�mico separado de ADN.

Dichos segmentos polinucleot�dicos o “episomas" codifican secuencias suficientes para permitir el mantenimiento y

replicaci�n independiente o sincronizada con el ciclo de la célula huésped. El modo en que la construcción de la expresión se libera en una célula y donde permanece en la célula el polinucle�tido depende del tipo de construcción de expresión usada.

En otro caso de la invención se administra/libera un polinucle�tido como ADN “desnudo”, por ejemplo como se ha descrito en Ulmer et al., Science 259:1745 - 1749, 1993 y revisado por Cohen, Science 259:1691 - 1692, 1993. La captación de ADN desnudo puede aumentar recubriendo esferas biodegradables con ADN, que se transportan de forma eficiente en las células.

En otro caso más, se puede liberar una composición mediante un abordaje de bombardeo de partículas, muchas de las cuales se han descrito. En un ejemplo ilustrativo, se puede alcanzar aceleración de partículas dirigida por gas con dispositivos tales como los fabricados por Powderject Phanmaceuticals PLC (Oxford, UK) y Powderject Vaccines Inc. (Madison, WI), algunos ejemplos de los cuales se describen en las patentes de EE.UU. n� 5.846.796; 6.010.478; 5.865.796; 5.584.807; y la patente EP n� 0500 799. Esto enfoque ofrece un abordaje de liberación sin aguja en el que una formulación en polvo seco de partículas microscópicas, tal como un polinlucle�tido o partículas polipept�dicas, se acelera a alta velocidad en un chorro de gas helio generado por un dispositivo manual, que propulsa las partículas hacia un tejido diana de interés.

En una realización relacionada, otros dispositivos y procedimientos que pueden ser útiles para inyección dirigida por gas sin aguja de composiciones de la presente invención incluyen los proporcionados por Bioject, Inc. (Portland, OR), algunos ejemplos de los cuales se describen en las patentes de EE.UU. n� 4.790.824; 5.064.413; 5.312.335; 5.383.851; 5.399.163, 5.520.639 y 5.993.412.

Vacunas

En una realización preferida, la composición inmunog�nica de la invención se mezcla con un excipiente farmac�uticamente aceptable, más preferentemente con un adyuvante para formar una vacuna. Por tanto, la presente invención proporciona una vacuna que comprende una composición inmunog�nica de la invención y un excipiente farmac�uticamente aceptable.

Las vacunas de la presente invención est�n, preferentemente, adyuvadas. Adyuvantes adecuados incluyen una sal de aluminio, tal como gel de hidróxido de aluminio (alumbre) o fosfato de aluminio, pero también puede ser una sal de calcio, magnesio, hierro o cinc, o pueden ser una suspensión insoluble de tirosina acilada o azúcares acilados, polisac�ridos derivados cati�nica o ani�nicamente o polifosfacenos.

Se prefiere seleccionar el adyuvante de modo que sea un inductor preferente de una respuesta de tipo TH1 o TH2. Niveles elevados de citocinas de tipo TH1 tienden a favorecer la inducción de las respuestas inmunitarias celulares a un ant�geno dado, mientras que niveles elevados de citocinas de tipo TH2 tienden a favorecer la inducción de respuestas inmunitarias humorales al ant�geno.

Es importante recordar que la distinción entre las respuestas inmunitarias Th1 y Th2 no es absoluta. En realidad, un individuo soportar� una respuesta inmunitaria que se describe como predominantemente Th1 o predominantemente Th2. No obstante, a menudo es conveniente considerar las familias de citocinas en términos de lo descrito en los clones de linfocitos T CD4 +ve por Mosmann and Coffman (Mosmann, T.R. and Coffman, R.L. (1989) TH1 and TH2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annual Review of Immunology, 7, pág. 145 - 173). Tradicionalmente, las respuestas de tipo Th1 se asocian con la producción de las citocinas INF-γ e IL-2 por parte de los linfocitos T. Otras citocinas a menudo asociadas directamente con la inducción de respuestas inmunitarias de tipo TH1 no son producidas por los linfocitos T, tales como la IL-12. En contraste con ello, las respuestas de tipo TH2 se asocian con la secreción de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Sistemas adyuvantes adecuados que estimulan una respuesta predominantemente de tipo TH1 incluyen: Monofosforilo lípido A o un derivado del mismo, en particular el monofosforilo lípido A 3-des-O-acilado (3D-MPL) (para su preparación véase el documento GB 2220211 A); y una combinación de monofosforilo lípido A, preferentemente monofosforilo lípido A 3-des-O-acilado, junto con una sal de aluminio (por ejemplo, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio) o una emulsión de aceite en agua. En dichas combinaciones, el ant�geno y el 3D-MPL est�n contenidos en las mismas estructuras particuladas, lo que permite una liberación más eficiente de las señales antig�nicas e inmunoestimuladoras. En los estudios se ha demostrado que el 3D-MPL es capaz de potenciar adicionalmente la inmunogeneicidad de un ant�geno adsorbido sobre al�mina [Thoelen ef al. Vaccine (1998) 16:708 - 14; EP 689454-B1].

Un mejor sistema implica la combinación de un monofosforil lípido A y un derivado de saponina, en particular la combinación de QS21 y 3D-MPL, como se divulga en el documento WO 94/00153, o una composición menos reactog�nica en la que QS21 se inactiva con colesterol, como se divulga en el documento WO 96/33739. Una formulación de adyuvante particularmente potente que incluye QS21, 3D-MPL y tocoferol en una emulsión de aceite en agua se describe en el documento WO 95/17210 y es una formulación preferida. Preferentemente, la vacuna comprende adicionalmente una saponina, más preferentemente QS21. La formulación también puede comprender una emulsión de aceite en agua y tocoferol (documento WO 95/17210). Un procedimiento para producir una formulación de vacuna comprende mezclar una proteína descrita en el presente documento, junto con un excipiente farmac�uticamente aceptable, tal como 3D-MPL Los oligonucle�tidos que contienen CpG no metilada (documento WO 96/02555) también son inductores preferenciales de una respuesta TH1 y son adecuados para su uso en la presente invención.

Composiciones preferidas de la invención son las que forman una estructura de liposoma. Las composiciones en las que la fracción esterol/saponina inmunol�gicamente activa forma una estructura ISCOM también forman un aspecto de la invención.

La proporción QS21 : Esterol normalmente ser� del orden de 1 : 100 a 1: 1 en peso:peso. Preferentemente hay un exceso de esterol, la proporción de QS21 : esterol es de al menos 1: 2 en peso/peso. Normalmente para la administración a seres humanos QS21 y esterol estarán presentes en una vacuna en el intervalo de

aproximadamente 1 μg a aproximadamente 100 μg, preferentemente de aproximadamente 10 μg a

aproximadamente 10 �g por dosis.

Preferentemente, los liposomas contienen un lípido neutro, por ejemplo fosfatidilcolina, que es, preferentemente, no cristalino a temperatura ambiente, por ejemplo, fosfatidilcolina de yema de hueco, dioleoilfosfatidilcolina dilaurilfosfatidilcolina. Los liposomas pueden también contener un lípido cargado que aumenta la estabilidad de la estructura de liposoma-QS21 para liposomas compuestos por lípidos saturados. En estos casos, la cantidad de lípido cargado es, preferentemente, 1 - 20 % peso/peso, lo más preferentemente 5 - 10 %. La proporción entre esterol y fosfol�pidos es 1 - 50 % (mol/mol), lo más preferentemente 20 - 25 %.

Preferentemente, las composiciones de la invención contienen MPL (monofosforilo lípido A 3-desacilado, también conocido como 3D-MPL). El 3D-MPL se conoce a partir del documento GB 2 220 211 (Ribi) como una mezcla de 3 tipos de monofosforil lípido A Des-O-acilado con 4, 5, o 6 cadenas aciladas y est� fabricado por Ribi Immunocehm, Montana. Una forma preferida se divulga en la solicitud de patente internacional 92/116556.

Las composiciones adecuadas de la invención son aquéllas en las que los liposomas se preparan inicialmente son MPL y después se añade MPL, preferentemente como partículas de 100 nm. Por tanto, el MPL no est� contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocido como MPL externo). Las composiciones en las que el MPL est� contenido dentro de la membrana de la vesícula (conocido como MPL interno) también forman un aspecto de la invención. El ant�geno puede estar contenido dentro de la membrana de la vesícula o contenido fuera de la membrana de la vesícula. Preferentemente, los ant�genos solubles est�n fuera y los ant�genos hidrof�bicos o lipidados est�n contenidos dentro o fuera de la membrana.

Las preparaciones de vacunas de la presente invención se pueden usar para proteger o tratar a un mamífero susceptible a la infección administrando dicha vacuna por medio de una vía sist�mica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intrad�rmica o subcutánea; o mediante administración mucosa en los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario. Se prefiere la administración intranasal de las vacunas para el tratamiento de la neumonía o de la otitis media (ya que el transporte nasofaríngeo de los neumococos se puede prevenir con más eficacia y, de este modo, se aten�a la infección en su estadio más temprano). Aunque la vacuna de la invención se puede administrar como una dosis única, los componentes de la misma también se pueden coadministrar juntos al mismo tiempo o a tiempos diferentes (por ejemplo, los polisac�ridos neumoc�cicos se podrían administrar por separado, al mismo tiempo o 12 semanas después de la administración de cualquier componente de la proteína bacteriana de la vacuna para una coordinación óptima de las respuestas inmunitarias unas con respecto de otras). Para la administración conjunta, el adyuvante Th1 opcional puede estar presente en cualquiera o en todas las administraciones diferentes, aunque se prefiere que est� presente en combinación con el componente proteico bacteriano de la vacuna. Además de una única vía de administración se pueden usar 2 vías de administración diferentes. Por ejemplo, los polisac�ridos se pueden administrar por vía intramuscular (o intrad�rmica, i.d.) y las proteínas bacterianas se pueden administrar por vía intranasal (i.n.) o intrad�rmica (i.d.) Además, las vacunas de la invención se pueden administrar i.m. para las dosis primeras e i.n. para las dosis de refuerzo.

La cantidad de ant�geno conjugado en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que incluye una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en los vacunados t�picos. Tal cantidad variar� en función de qué inmun�genos específicos se emplean y de la manera en que se presenten. Generalmente cabe esperar que cada dosis comprenda 0,1-100 �g de cada polisac�rido, preferentemente 0,1 - 50 �g para los conjugados polisac�ridos, preferentemente 0,1 - 10 �g, más preferentemente 1 - 10 �g, de los cuales 1 a 5 �g es un intervalo más preferido.

El contenido de ant�genos proteicos en la vacuna normalmente estar� en el intervalo de 1 - 100 μg, preferentemente 5 -50 μg, lo más habitualmente en el intervalo de 5 – 25 μg. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente.

La preparación de las vacunas est� descrita en general en Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press Nueva York”). La encapsulaci�n en liposomas la describe Fullerton, en la patente de EE.UU. 4.235.877.

Las vacunas de la presente invención se pueden almacenar en solución o liofilizadas. Preferentemente, la solución est� liofilizada en presencia de un azúcar, tal como sacarosa, trehalosa o lactosa. Todavía es más preferible que est�n liofilizadas y se reconstituyan de forma extemporánea antes de usar. La liofilización puede tener como resultado una composición más estable (vacuna) y, posiblemente, puede conducir a títulos de anticuerpos más altos en presencia de 3D-MPL y en ausencia de un adyuvante a base de aluminio.

Anticuerpos e inmunizaci�n pasiva

Una inmunoglobulina para uso en la prevención o tratamiento de la infección por estafilococos se puede preparar mediante un procedimiento que comprende las etapas de inmunizar un receptor con la vacuna de la invención y aislar la inmunoglobulina del receptor. Una composición farmacéutica que comprende la inmunoglobulina y un vehículo farmac�uticamente aceptable se podrían usar en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de la enfermedad estafiloc�cica. Un procedimiento para el tratamiento o prevención de la enfermedad estafiloc�cica comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de la preparación farmacéutica.

Normalmente, los in�culos para la producción de anticuerpos policlonales se prepararn dispersando la composición antig�nica en un diluyente fisiológicamente tolerable, tal como solución salina u otros adyuvantes adecuados para uso humano con el fin de formar una composición acuosa. Una cantidad inmunoestmuladora del in�culo se administra a un mamífero y, después, el mamífero inoculado se mantiene durante un tiempo suficiente para que la composición antig�nica induzca anticuerpos protectores.

Los anticuerpos se pueden aislar en la medida deseada mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatograf�a de afinidad (Harlow and Lane Antibodies; a laboratory manual 1988).

Los anticuerpos pueden incluir preparaciones de antisuerpo a partir de diversos animales de uso habitual, por ejemplo cabras, primates, burros, cerdos, caballos, cobayas, ratas o seres humanos. Los animales se mezclan y se recupera el suero.

Una inmunoglbulina producida como se ha descrito en el presente documento puede incluir anticuerpos enteros, fragmentos o subfragmentos de anticuerpos. Los anticuerpos pueden ser inmunoglobulinas enteras de cualquier clase, por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especificidad doble por dos o más ant�genos descritos en el presente documento. También pueden ser fragmentos, por ejemplo F(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares, incluyendo fragmentos híbridos. Una inmunoglobulina también incluyen proteínas naturales, sintéticas o modificadas genéticamente que actúan como un anticuerpo mediante la unión a ant�genos específicos para formar un complejo.

Una vacuna de la presente invención se puede administrar a un receptor que después actúa como fuente de inmunoglobulina, producida en respuesta a la exposición de la vacuna específica. Un sujeto tratado de este modo donaría plasma del que se obtendría globulina hiperinmune mediante metodología de fraccionamiento en plasma. La globulina hiperinmune se administraría a otro sujeto con el fin de conferir resistencia contra una infección por estafilococos o tratar la misma. Las globulinas hiperinmunes son particularmente útiles para el tratamiento o prevención de la enfermedad estafiloc�cica en lactantes, individuos inmunocomprometidos o cuando se requiera tratamiento y no haya tiempo para que el individuo produzca anticuerpos en respuesta a la vacunación.

Una composición farmacéutica que comprende dos o más anticuerpos monoclonales (o fragmentos de los mismos; preferentemente humanos o humanizados) reactivos contra al menos dos constituyentes de la composición inmunog�nica de la invención podría usarse para tratar o prevenir la infección por bacterias grampositivas, preferentemente estafilococos, más preferentemente S. aureus o S. epidermidis.

Dichas composiciones farmacéuticas comprenden anticuerpos monoclonales que pueden ser inmunoglobulinas enteras de cualquier clase, por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgD o IgE, anticuerpos quiméricos o anticuerpos híbridos con especificidad por dos o más ant�genos a los que se ha hecho referencia. También pueden ser fragmentos, por ejemplo F(ab')2, Fab', Fab, Fv y similares, incluyendo fragmentos híbridos.

En la técnica se conocen bien los procedimientos para fabricar anticuerpos monoclonales y pueden incluir la fusión de esplenocitos con células de mieloma (Kohler and Milstein 1975 Nature 256; 495; Antibodies - a laboratory manual Harlow and Lane 1988). Como alternativa, los fragmentos Fv monoclonales se pueden obtener mediante detección selectiva de una biblioteca de expresión en fagos adecuada (Vaughan TJ et al 1998 Nature Biotechnology 16; 535). Los anticuerpos monoclonales pueden humanizarse o humanizarse parcialmente mediante procedimientos conocidos.

Procedimientos

La invención proporciona un procedimiento para preparar una vacuna que comprende las etapas de mezclar ant�genos para hacer la composición inmunog�nica de la invención y añadir un excipiente farmac�uticamente aceptable.

Tratamiento

La invención también proporciona el uso de la composición inmunog�nica de la invención en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o prevención de la infección por estafilococos. La infección por estafilococos es, particularmente, una infección nosocomial adquirida en el hospital.

Esta composición inmunog�nica o vacuna de la invención es particularmente ventajosa para usar en los casos de cirugía programada. Dichos pacientes conocerán la fecha de la cirugía con antelación y se les podr� inocular antes. Dado que no se sabe si el paciente estar� expuesto o no a la infección por S.aureus o S. epidermidis, se prefiere inocularles una vacuna de la invención que los proteja contra ambos, como se ha descrito anteriormente. Preferentemente, los adultos mayores de 16 años de edad en espera de una cirugía prorgramada son tratados con composiciones inmunog�nicas y vacunas de la invención.

Tambi�n es ventajoso inocular a los profesionales sanitarios la vacuna de la invención.

Las preparaciones de vacunas de la presente invención se pueden usar para proteger o tratar a un mamífero susceptible a la infección administrando dicha vacuna por medio de una vía sist�mica o mucosa. Estas administraciones pueden incluir inyección por vía intramuscular, intraperitoneal, intrad�rmica o subcutánea; o mediante administración mucosa en los tractos oral/alimentario, respiratorio o genitourinario.

La cantidad de ant�geno en cada dosis de vacuna se selecciona como una cantidad que incluye una respuesta inmunoprotectora sin efectos secundarios adversos significativos en los vacunados t�picos. Tal cantidad variar� en función de qué inmun�genos específicos se emplean y de la manera en que se presenten. El contenido de proteínas de la vacuna normalmente estar� en el intervalo de 1 - 100 μg, preferentemente 5 -50 μg, lo más habitualmente en el intervalo de 10 – 25 μg. Generalmente cabe esperar que cada dosis comprenda 0,1-100 �g del polisac�rido, cuando est� presente, preferentemente 0,1 - 50 �g, preferentemente 0,1 - 10 �g, de los cuales 1 a 5 �g es el intervalo más preferido. Una cantidad óptima para una vacuna concreta se puede determinar mediante estudios convencionales que implican observación de respuestas inmunitarias adecuadas en los sujetos. Tras una vacunación inicial, los sujetos pueden recibir una o varias inmunizaciones de refuerzo espaciadas adecuadamente.

Aunque las vacunas de la presente invención se pueden administrar por cualquier vía, la administración de las vacunas descritas en la piel (i.d.) forma un caso. La piel humana comprende una cutícula externa “espinosa”, denominada estrato c�rneo, encima de la epidermis. Debajo de esta epidermis hay una capa que se denomina dermis que, a su vez, est� encima de tejido subcutáneo. Los investigadores han demostrado que la inyección de una vacuna en la piel y, en particular, la dermis, estimula una respuesta inmunitaria, que también puede estar asociada con una serie de ventajas adicionales. La vacunación intrad�rmica con las vacunas descritas en el presente documento es, por tanto, una vía preferida.

La técnica convencional de inyección intrad�rmica, el "procedimiento de mantoux”, comprende las etapas de limpiar la piel y, después, estirando con una mano y con el bisel de una aguja de calibre estrecho (26 – 31 gauge) hacia arriba, se inserta la aguja en un ángulo de entre 10 - 15�. Una vez que el bisel de la aguja se ha insertado, se baja el émbolo y se hace avanzar proporcionando al mismo tiempo una ligera presión para elevarlo debajo de la piel. Después, el líquido se inyecta muy despacio formando una vesícula o bulto sobre la superficie de la piel, seguido de una lenta retirada de la aguja.

M�s recientemente se han descrito dispositivos específicamente diseñados para administrar agentes líquidos en o a través de la piel, por ejemplo los dispositivos descritos en los documentos WO 99/34850 and EP 1092444, también los dispositivos de inyección de chorro descritos en, por ejemplo, los documentos WO 01/13977; US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520 , 639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO 97/37705 y WO 97/13537. Procedimientos alternativos de administración intrad�rmica de las preparaciones de la vacuna pueden incluir jeringuillas y agujas convencionales diseñadas para administración balística de vacunas sólidas (documento WO 99/27961) o parches transd�rmicos (documentos WO 97/48440; WO 98/28037); o de aplicación a la superficie de la piel (liberación transd�rmcia o trasncut�nea, documentos WO 98/20734 ; WO 98/28037).

Cuando las vacunas de la presente invención se van a administrar a la piel o, más específicamente, en la dermis, la vacuna est� en un volumen de líquido bajo, en particular un volumen entre aproximadamente 0,05 ml y 0,2 ml.

El contenido de ant�genos en la piel o vacunas intrad�rmicas de la presente invención puede ser similar a las dosis convencionales como se encuentran en las vacunas intramusculares (véase anteriormente). No obstante, es una característica de las vacunas en la piel o intrad�rmicas que las formulaciones puedan ser de “dosis baja”. De acuerdo con lo anterior, los ant�genos proteicos en las vacunas de “dosis baja” est�n presentes, preferentenente, en

tan poco como de 0,1 a 10 10 �g, preferentemente de 0,1 a 5 �g por dosis; y los ant�genos polisac�ridos (preferentemente conjugados) pueden estar presentes en el intervalo de 0,0 1 - 1 �g, y, preferentemente, entre 0,0 1 a 0,5 �g de polisac�rido por dosis.

Como se usa en el presente documento, la expresión "liberación intrad�rmica” quiere decir la liberación de la vacuna en la región de la dermis en la piel. No obstante, la vacuna no necesariamente se localizar� exclusivamente en la dermis. La dermis es la capa de la piel localizada entre aproximadamente 1,0 y aproximadamente 2,0 mm de la superficie de la piel humana, pero existe una cierta cantidad de variación entre individuos y en diferentes partes del cuerpo. En general, se puede esperar alcanzar la dermis a 1,5 mm por debajo de la superficie de la piel. La dermis se localiza entre el estrato c�rneo y la epidermis, en la superficie y la capa subcutánea de debajo. Dependiendo del modo de administración, la vacuna puede localizarse en última instancia, única o principalmente, dentro de la dermis o, en última instancia, se puede distribuir en la epidermis y la dermis.

Una realización preferida de la invención es el uso de una composición inmunog�nica de la invención en la fabricación de una vacuna para prevenir o tratar la infección por estafilococos mediante un procedimiento que comprende la etapa de administrar la vacuna a un paciente que lo necesite.

En una forma de realización preferida, el paciente est� en espera de una cirugía programada.

Una realización preferida adicional de la invención es un uso de la composición inmunog�nica de la invención en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o prevención de la infección por estafilococos posquir�rgica.

La expresión “infección por estafilococos” abarca la infección causada por S.aureus y/o S. epidermidis y otras cepas de estafilococos capaces de producir infección en un mamífero, preferentemente un huésped humano.

Los inventores pretenden que los términos “que comprende”, “comprende” y “consiste”, puedan opcionalmente sustituirse con las expresiones que “consiste en”, “consiste en" “constituido por”, respectivamente, en cada caso. .

Con el fin de que la presente invención se entienda mejor, se exponen los ejemplos siguientes. Estos ejemplos son con fines ilustrativos únicamente y no deben interpretarse como limitantes del ámbito de la invención de ningún modo.

Ejemplos

Ejemplo 1 Construcción de pl�smido para expresar proteínas recombinantes

A: Clonaci�n

Los sitios de restricción adecuados introducidos mediante ingeniería en los oligonucle�tidos específicos del gen de estafilococos permitieron la clonaci�n direccional del producto de la PCR en el pl�smido de expresión en E.coli pET24d or pQE-30 de modo que se pudo expresar una proteína como proteína de fusión que contien�a un marcador de (His)6 para la cromatograf�a de afinidad en el extremo N o C.

Los cebadores usados fueron:

Toxina alfa -5'-CGCGGATCCGCAGATTCTGATATTAATATTAAAAC-3' y 5'CCCAAGCTTTTAATTTGTCATTTCTTCTTTTTC-3'

EbpS - 5'-CGCGGATCCGCTGGGTCTAATAATTTTAAAGATG-3' y 5'CCCAAGCTTTTATGGAATAACGATTTGTTG3'

ClfA - 5'-CGCGGATCCAGTGAAAATAGTGTTACGCAATC-3' y 5'CCCAAGCTTTTACTCTGGAATTGGTTCAATTTC3'

FnbA - 5'-CGCGGATCCACACAAACAACTGCAACTAACG-3' y 5'CCCAAGCTTTTATGCTTTGTGATTCTTTTTCAAAC3'

Sbi - 5'-CGCGGATCCAACACGCAACAAACTTC-3' and 5'GGAACTGCAGTTATTTCCAGAATGATAATAAATTAC-3'

SdrC - 5'-CGCGGATCCGCAGAACATACGAATGGAG-3' y 5'CCCAAGCTTTTATGTTTCTTCTTCGTAGTAGC-3'

SdrG - 5'-CGCGGATCCGAGGAGAATTCAGTACAAG-3' y 5'CCCAAGCTTTTATTCGTCATCATAGTATCCG-3'

Ebh - 5'-AAAAGTACTCACCACCACCACCACC-3' and 5'AAAAGTACTCACTTGATTCATCGCTTCAG-3'

Aaa -5'-GCGCGCCATGGCACAAGCTTCTACACAACATAC-3' y 5'GCGCGCTCGAGATGGATGAATGCATAGCTAGA-3'

IsaA -5'-GCATCCATGGCACCATCACCATCACCACGAAGTAAACGTTGATCAAGC-3' y 5'-AGCACTCGAGTTAGAATCCCCAAGCACCTAAACC-3'

HarA - 5'-GCACCCATGGCAGAAAATACAAATACTTC-3' and 5'TTTTCTCGAGCATTTTAGATTGACTAAGTTG-3'

Autolisina glucosaminidasa -5'-CAAGTCCCATGGCTGAGACGACACAAGATCAAC-3' y 5'-CAGTCTCGAGTTTTACAGCTGTTTTTGGTTG-3'

Autolisina amidasa -5'-AGCTCATATGGCTTATACTGTTACTAAACC-3' y 5'GCGCCTCGAGTTTATATTGTGGGATGTCG-3'

IsdA - 5'-CAAGTCCCATGGCAACAGAAGCTACGAACGCAAC-3' y 5'ACCAGTCTCGAGTAATTCTTTAGCTTTAGAGCTTG-3'

IsdB - 5'-TATTCTCGAGGCTTTGAGTGTGTCCATCATTTG-3' y 5' GAAGCCATGGCAGCAGCTGAAGAAACAGGTGG-3'

MRPII - 5'-GATTACACCATGGTTAAACCTCAAGCGAAA-3' and 5'AGGTGTCTCGAGTGCGATTGTAGCTTCATT-3'

Los productos de la PCR se introdujeron primero en el vector de clonaci�n pGEM-T (Novagen) usando células bacterianas Top10 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La construcción intermedia se realizó para facilitar la posterior clonaci�n en un vector de expresión. Los transformantes que contienen el inserto de ADN se seleccionaron mediante análisis con enzimas de restricción. Tras la digestión, un alícuota de ~20 él de la reacción se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa (0,8 % de agarosa en un tampón de Tris-acetato-EDTA (TAE). Los fragmentos de ADN se visualizaron mediante iluminación con UV después de la electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. En paralelo con las muestras problema se realizó electroforesis de un ADN de tamaño molecular estándar (marcador de 1 Kb, Life Technologies), que se us� para estimar el tamaño de los fragmentos de ADN, El pl�smido purificado de los transformantes seleccionados para cada clonaci�n se digirió después secuencialmente hasta finalizar con las enzimas de restricción adecuadas siguiendo las recomendaciones del fabricante (Life Technologies). Después, el fragmento de ADN digerido se purificó usando columnas giratorias gel de sílice antes de la unión en el pl�smido pET24d o pQE-30. La clonaci�n de Ebh (fragmento H2), AaA, IsdA, IsdB, HarA, Atl-amidasa, Atl-glucosamina, MRP, IsaA se llev� a cabo usando el pl�smido pET24d y la clonaci�n de ClfA, SdrC, SdrE, FnbpA, SdrG/Fbe, toxina alfa y Sbi se llevaron a cabo usando el pl�smido pQE-30.

B: Producción del vector de expresión

Para preparar el pl�smido de expresión pET24d o pQE-30 para la unión, se digirió de manera similar hasta finalización con las enzimas de restricción adecuadas. Se us� un exceso de aproximadamente 5 veces molar de los fragmentos digeridos para preparar el vector con el fin de programar la reacción de unión. Se realizó una reacción de unión estándar de ~ -20 μl (~ 16 �C, ~ 16 horas), usando procedimientos bien conocidos en la técnica y con la T4 ADN ligasa (~ 2,0 unidades/reacción, Life Technologies). Una alícuota de la unión (~5 μl) se us� para transformar células M15(pREP4) o BT21::DE3 electrocompetentes de acuerdo con procedimientos bien conocidos en al técnica. Después de un período de crecimiento de -2 - 3 horas a 37 �C en ~ 1,0 ml de caldo LB, las células transformadas se sembraron en placas de agar LB que contenían ampicilina (100 μg/ml) y/o kanamicina (30 μg/ml). En la selección se incluyeron antibióticos. Las placas se incubaron durante la noche a 37 �C durante ~16 horas. Se escogieron colonias

individuales ApR/KanRcon mondadientes estériles y se usaron para inocular “parches” en placas de ApR/KanR en

LB reciente as� como ApR/KanR 1,0 ml de caldo de cultivo LB Ap/Kan. Tanto las placas de parche como el caldo de cultivo se incubaron durante toda la noche a 37 �C en un incubador estándar (placas) o un baño de agua en agitaci�n. Se emple� un análisis de PCR basado en células enteras para verificar que los transformantes contenían el inserto de ADN. Aquí, ~ 1,0 ml de caldo de cultivo en LB de Kn/Ap durante toda la noche se transfirió a un tubo de polipropileno de 1,5 ml y las células se recogieron mediante centrifugaci�n en una microcentr�fuga Beckmann (- -3 minutos, temperatura ambiente, ~ 12.000 x g). El sedimento celular suspendió en ~ 200 μl de agua estéril y se us� un alícuota de ~ 10 μl para programar una reacción de PCR de ~ 50 μl de volumen final que contenía cebadores de amplificación tanto directos como inversos. La etapa de inicial de desnaturalización a 95�C se increment� hasta 3 minutos para asegurar la rotura térmica de las células bacterianas y la liberación del ADN del pl�smido. Un ciclador térmico modelo 9700 de ABI y un perfil de amplificación térmica de tres etapas y 32 ciclos, es decir 95 �C, 45 segundos, 55-58 �C, 45 segundos, 72�C 1 minuto, se usaron para amplificar el fragmento de PCR BASB201 a partir de las muestras transformantes lisadas. Tras la amplificación térmica, un alícuota de ~20 él de la reacción se analizó mediante electroforesis en gel de agarosa (0,8 % de agarosa en un tampón de Tris-acetato-EDTA (TAE). Los fragmentos de ADN se visualizaron mediante iluminación con UV después de la electroforesis en gel y tinción con bromuro de etidio. En paralelo con las muestras problema se realizó electroforesis de un ADN de tamaño molecular estándar (marcador de 1 Kb, Life Technologies), que se us� para estimar el tamaño de los productos de la PCR, Los transformantes que producían el producto de PCR del tamaño previsto se identificaron como cepas que contenían una construcción de expresión proteica. El pl�smido de expresión que contenía las cepas se analizó después para detectar expresión inducible de proteína recombinante.

C: Análisis de la expresión de los transformantes positivos en la PCR

Un alícuota del cultivo de siembra durante toda la noche (~ 1,0 ml) se inocul� en un matraz erlenmeyer de 125 ml que contenía ~ 125 ml de caldo LB de Ap/Kn y se cultiv� a 37�C con agitaci�n (~ 250 rpm) hasta que la turbidez del cultivo alcanzó una D. O. a 600 de ~ 0,5, es decir, fase semilogar�tmica (usualmente aproximadamente 1,5-2,0 horas). En este momento, aproximadamente la mitad del cultivo (~12,5 ml) se transfirii� a un segundo matraz de 125 ml y se indujo la expresión de proteína recombinante mediante la adición de IPTG (solución madre 1,0 M preparada en agua estéril, Sigma) hasta una concentración final de 1,0 mM. La incubaci�n de los cultivos tanto inducidos con IPTG como no inducidos continu� durante ~ 4 horas adicionales a 37�C con agitaci�n. Las muestras (~1,0 ml) de cultivos tanto inducidos como no inducidos se retiraron después del período de inducción y las células se recogieron mediante centrifugaci�n en una microcentr�fuga a temperatura ambiente durante ~ 3 minutos. Los

sedimentos celulares individuales se suspendieron en ~ 50 μl de agua estéril, después se mezclaron con un

volumen igual de 2 x de tampón de muestra SDS-PAGE de Lamelli que contenía 2-mercaptoetanol, y se introdujeron en un baño de agua en ebullición durante ~ 3 minutos para desnaturalizar la proteína. Volúmenes iguales (~ 15 él) de lisados celulares tanto inducidos por IPTG bruto como no inducidos por se cargaron por duplicado en gel de poliacrilamida Tris/glicina al 12 % (Minigeles de 1 mm de espesor, Novex). Las muestras de lisados inducidos y no inducidos se sometieron a electroforesis junto con marcadores de peso molecular prete�idos (SeeBlue, Novex) en condiciones convencionales usando un tampón de carrera SDS/Tris/glicina (Bio Rad). Tras la elextroforesis, un gel se ti�� con azul brillante de Coomassie R250 (BioRad) y después se decolor� para visualizar las nuevas proteínas inducibles mediante IPTG. El segundo gel se sometió a electrotransferencia sobre una membrana de PVDF (tamaño de poro 0,4 micrómetros, Novex) durante ~ 2 horas a 4�C usando un aparato de transferencia Mini-Protean II de BioRad y tampón de transferencia de metanol (20 %) de Towbin. El bloqueo de las incubaciones de membrana y de anticuerpos se realizó de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la técnica. Un anticuerpo monoclonal anti-RGS (His)3 seguido de un segundo anticuerpo anti-ratón de conejo conjugado con HPR (QiaGen) se us� para confirmar la expresión y la identidad de la proteína recombinante. La visualización del patrón reactivo del anticuerpo anti-His se logr� usando o bien un sustrato insoluble en ABT o usando Hyperfilm con el sistema de quimioluminiscencia ECL de Amersham.

Ejemplo 2: Producción de proteínas recombinantes

Cepa bacteriana

Para producir masa celular para la purificación de proteína recombinante se us� una cepa de expresión recombinante de E. coli M15(pREP4) que contenía un pl�smido (pQE60) o BL21::DE3 que contenía el pl�smido pET24d que codifiaba la proteína estafiloc�cica.

Medios

El medio de fermentación usado para la producción de proteína recombinante consistió en caldo 2X YT (Difco) que contenía 100 �g/ml de Ap y/o 30 �g/ml de Km. Se a�adi� antiespumante al medio para el fermentador a 0,25 ml/l (Antifoam 204, Sigma). Para inducir la expresión de la proteína recombinante se a�adi� al fermentador IPTG (isopropilo �-D-Tiogalactopiran�sido) (1 mM, final).

Producci�n de proteínas recombinantes

En condiciones nativas

El IPTG se a�adi� a una concentración final de 1mM y el cultivo se sembr� durante 4 horas adicionales. El cultivo se centrifug� después a 6.000 rpm durante 10 minutos y el sedimento se suspendió en tampón fosfato (K2HPO4, 50mM KH2PO4 pH 7) incluyendo un cóctel de inhibidores de la proteasa. Esta muestra se sometió a lisis con presión francesa usando una presión de 150 MPa (2 ciclos). Tras la centrifugaci�n durante 30 minutos a 15.000 rpm, el sobrenadante se reserv� para puificaci�n adicional y se a�adi� NaCl hasta 0,5M. A continuación se cargó la muestra en una resina de Ni-NTA (columna XK 16 Pharmacia, resina de Ni-NTA Qiagen) acondicionada en K2HPO4 50mM KH2PO4 pH 7. Después de cargar la muestra, la columna se lav� con tampón A (NaH2PO4 0,2 M pH 7, NaCl 0,3 M, 10 % de glicerol). Para eluir la proteína unida se us� un gradiente por etapas en el que al tampón A se añadieron diferentes proporciones de tampón B (NaH2PO4 0,2 M, pH7, NaCl 0,3 M, 10 % de glicerol e imidazol 200mM). La proporción del tampón B se aument� gradualmente del 10 % al 100 %. Después de purificar, la fracción eluida que contiene la proteína se combin�, se concentr� y se dializ� contra KH2PO4 0,002M /K2HPO4 pH7, NaCl 0,15M .

Este procedimiento se us� para purificar ClfA, SdrG, IsdA, IsaB, HarA, Atl-glucosamina y toxina alfa.

En condiciones desnaturalizantes

El IPTG se a�adi� a una concentración final de 1mM y el cultivo se sembr� durante 4 horas adicionales. El cultivo se centrifug� después a 6.000 rpm durante 10 minutos y el sedimento se suspendió en tampón fosfato (K2HPO4, 50mM KH2PO4 pH 7) incluyendo un cóctel de inhibidores de la proteasa. Esta muestra se sometió a lisis con presión francesa usando una presión de 150 MPa (2 ciclos). Tras la centrifugaci�n durante 30 minutos a 15.000 rpm, el sedimento se lav� con tampón fosfato, incluyendo urea 1M. La muestra se centrifug� durante 30 minutos a 15.000 rpm y el sedimento se resuspendi� en urea 8M, NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5 M, Tris-HCl 0,01 M a pH8 y se mantuvo durante la noche a temperatura ambiente. La muestra se centrifug� durante 20 minutos a 15000 rpm y el sobrenadante se recogió para su purificación adicional. Después se cargó la muestra en una resina de Ni-NTA (columna XK 16 Pharmacia, resina de Ni-NTA Qiagen) acondicionada en urea 8M, NaH2PO4, 0,1 M, NaCl, 0,5 M, Tris-HCl 0,01M pH8. Después del paso del caudal, la columna se lav� sucesivamente con tampón A (urea 8M, NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5M, Tris 0,01 M, pH 8,0 ), tampón C (Urea 8M , NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5 M, Tris 0,0 1 M, pH 6,3 ), tampón D (Urea 8M , NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5 M, Tris 0,01 M, pH 5,9 ) y tampón E (Urea 8M , NaH2PO4 0,1 M, NaCl 0,5 M, Tris 0,01 M, pH 4,5 ) La proteína recombinante se eluy� de la columna durante los lavados con tampón D y E. La proteína recombinante desnaturalizada se pudo solubilizar en una solución desprovista de urea. Para este fin, la proteína desnaturalizada contenida en urea 8M se dializ� sucesivamente contra urea 4M, Na2P04 0,1 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,1, urea 2M, NaH2PO4 0,1 M, Tris-HCl 0,01 M, pH 7,1, arginina 0,5 M y KH2PO4 0,002M/K2HP pH 7,1, NaCl 0,15M, arginina 0,5 M.

Este procedimiento se us� para purificar Ebh (fragmento H2), AaA, SdrC, FnbpA, Sbi, Atl-amidasa e IsaA.

Las proteínas purificadas se analizaron mediante SDS-PAGE. Los resultados para una proteína en condiciones nativas (toxina alfa) y una proteína purificada en condiciones desnaturalizantes (SdrC) se muestran en las Figuras 3 y 4.

Ejemplo 3 - Preparación de polisac�ridos

El PIA (PNAG) se prepara como se describe en Joyce et al 2003, Carbohydrate Research 338; 903 - 922.

Los polisac�ridos de tipo 5 y de tipo 8 se extraen de S. aureus como se describe en Infection and Immunity 58(7); 2367.

Qu�mica de activación y conjugación:

El polisac�rido nativo se disuelve en NaCl 2N o en agua. La concentración óptima del polisac�rido se evalúa para todos los serotipos y est� entre 2 mg/ml y 5 mg/ml.

De una solución madre de 100 mg/ml en acetonitrilo se añade CDAP (proporción CDAP/PS:0,7 5 mg/mg PS) se añade a la solución de polisac�rido, 1,5 minutos después se añade trietilamina 0,2M para obtener el pH de activación específico (pH 8,5 -10,0). La activación del polisac�rido se realiza a este pH durante 2 minutos a 25 �C. La proteína transportadora se añade al polisac�rido activado en una cantidad suficiente para dar una proporción molar de 1/1 y la reacción de acoplamiento se realiza al pH específico durante 1 hora.

Despu�s, la reacción se inactiva con glicina durante 30 minutos a 25�C y durante la noche a 4�C.

Los conjugados se purifican mediante filtración en gel usando una columna de filtración en gel Sephacryl 500HR equilibrada con NaCl 0,2M.

Se determina el contenido de hidratos de carbono y proteínas de las fracciones eluidas. Los conjugados se combinan y se filtran en esterilidad en una membrana de esterilización de 0,2 – 2 �m. Se determinan las proporciones PS/Proteína en las preparaciones del conjugado.

Caracterizaci�n;

Cada conjugado se caracteriza para determinar el contenido de proteínas y polisac�rido.

El contenido de polisac�rido se mide mediante la prueba del resorcinol y el contenido de proteínas mediante la

prueba de Lowry. La proporción final de PS/PD (peso/peso) se determina mediante la proporción de las

concentraciones.

Contenido residual de DMAP (ng/ �g de PS):

La activación del polisac�rido con CDAP introduce un grupo cianato en el polisac�rido y se libera DMAP (4dimetilaminopiridina). El contenido residual de DMAP se determina mediante un ensayo específico desarrollado y validado en GSK.

Contenido de polisac�rido libre (%):

El contenido de polisac�rido libre de los conjugados mantenidos a 4 �C o almacenados 7 días a 37 �C se determina en el sobrenadante obtenido tras la incubaci�n con anticuerpos α-vehículo y sulfato am�nico saturado, seguido de una centrifugaci�n.

Se usa un ELISA de α-PS/α-PS para la cuantificación del polisac�rido libre en el sobrenadante. La ausencia de conjugado también se controla mediante un ELISA de α-vehículo/α-PS.

Ejemplo 4 Formulación

Composiciones Adyuvantes

La proteína, individualmente o juntos, de los ejemplos anteriores se puede formular con la combinación de polisac�ridos de estafilococos y como adyuvante, la formulación puede comprender una mezcla de monofosforilo lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) e hidróxido de aluminio o de monofosforilo lípido A 3-O-desacilado (3D-MPL) y fosfato de aluminio, o 3D-MPL y/o QS21 opcionalmente en una emulsión de aceite/agua y formulado opcionalmente con colesterol, o sal de aluminio sola, preferentemente fosfato de aluminio.

3D-MPL: es una forma químicamente destoxificada del lipopolisac�rido (LPS) de la bacteria gramnegativa

Salmonella minnesota.

Los experimentos realizados en GSK Biologicals han demostrado que 3D-MPL combinado con varios vehículos potencia fuertemente la inmunidad humoral y la inmunidad celular de tipo Th1.

QS21: es una saponina purificada de un extracto bruto de la corteza del árbol Quillaja Saponaria Molina, que tiene una fuerte actividad adyuvante: induce la linfoproliferaci�n específica de ant�geno y los LTC frente a varios ant�genos.

La vacuna que contiene un ant�geno de la invención que contiene 3D-MPL y al�mina y se puede preparar de un modo análogo al descrito en los documentos WO93/19780 o 92/16231.

Los experimentos realizados en GSK Biologicals han demostrado un claro efecto sin�rgico de las combinaciones de 3D-MPL y QS21 1 en la inducción de las respuestas inmunitarias tanto humoral como celular de tipo Th1. Las vacunas que contienen un ant�geno, dichos ant�genos se describen en el documento US 5750110.

Una emulsión de aceite/agua puede estar compuesta por 2 aceites (un tocoferol y un escualeno) y por PBS que contiene Tween 80 como emulsionante. La emulsión comprendía 5 % de escualeno, 5 % de tocoferol, 0,4 % de Tween 80, y tenía un tamaño medio de partícula de 180 nm y se conoce como SB62 (véase el documento WO 95/17210).

En los experimentos realizados en GSK Biologicals se ha demostrado que la unión de esta emulsión de Ac/A con MPL/QS21 incrementa de forma adicional sus propiedades de inmunoestimulaci�n.

Preparaci�n de la emulsión SB62 (concentrado por 2)

El Tween 80 se disuelve en solución salina tamponada con fosfato (PBS), para dar una solución al 2 % en PBS. Para proporcionar 100 ml, una emulsión concentrada multiplicada por dos, 5 g de DL alfa tocoferol y 5 ml de escualeno se agitan en v�rtex para mezclar íntimamente. Se añaden 90 ml de la solución PBS/Tween y se mezclan completamente. La emulsión resultante se pasa después por una jeringuilla y, por último, se microfluidiza usando una máquina M110S Microfluidics. Las gotas de aceite resultantes tienen un tamaño de aproximadamente 180 nm.

Ejemplo 5

Experimentos con animales.

Ratones CD-1 hembra de 8 a 10 semanas de edad se obtienen de Charles River Laboratories, Kingston, Mass. Para estudios de letalidad, cinco grupos de 9 a 11 ratones CD-1 se expusieron por vía intraperitoneal (i.p.) a diluciones en serie de S. aureus cultivados en placas de CSA. Los tamaños del in�culo varía de ~1010 to 108 UFC/ratón. La mortalidad se evalúa a diario durante 3 días. Las dosis letales al 50 % (DL50) se estiman usando un modelo de probabilidad de la relación dosis-respuesta. La hipótesis nula de las DL50 comunes se analizó mediante la prueba del cociente de verosimilitudes. La bateriemia subletal se inicia exponiendo grupos de 8 a 20 ratones por vía intrabemosa (i.v.) a ~ 2 x 106 UFC/ratón o por vía i.p. a ~ 2 x 107 UFC/ratón. Después de la inoculación, se extrae sangre en grupos separados de animales de la cola a tiempos especificados y se estiman los niveles de bateriemia mediante recuentos cuantitativos de las placas por duplicado en placas de agar de soja tr�ptica con 5 % de sangre bovina (Becton Dickinson Microbiology Systems). La significación estadística se determina con la modificación de Welch de la prueba t de Student no apareada.

Ejemplo 6

Metodolog�a general de la determinación de respuestas de anticuerpos en varios mamíferos

Se analizaron los sueros para determinar los anticuerpos IgG frente a los polisac�ridos de estafilococos mediante un ELISA. Brevemente, los polisac�ridos capsulares purificados de la ATCC (Rockville, Md, 20852) se recubren en 25 �g/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulaci�n de unión alta (Nunc Maxisorp) durante la noche a 4 �C. Las placas se bloquean con 10 % de suero bovino fetal (FCS), 1 hora a 37�C. Las muestras de suero se preincuban con 20 �g/ml del polisac�rido de la pared celular (Statens Serum Institute, Copenhagen) y 10 % de FCS a temperatura ambiente durante 30 minutos para neutralizar los anticuerpos frente a este ant�geno. Después, las muestras se diluyen dos veces en la microplaca en 10 % de FCS en PBS y se equilibran a temperatura ambiente durante 1 hora con agitaci�n. Después de lavar, las microplacas se equilibran con el anticuerpo monoclonal Fc IgG anti-humano marcado con peroxidasa (HP6043-HRP, Stratech Scientific Ltd) diluido a 1:4000 en 10 % de FCS en PBS durante 1 hora temperatura ambiente con agitaci�n. El ELISA se realiza para medir la IgG de rata usando IgG anti-rata de cabra AffiniPure conjugada con peroxidasa (H+L) (código 112 - 035 - 003) a 1:5000. Las curvas de titulación se relacionan con los sueros estándar para cada serotipo usando comparación log logística mediante SoftMax Pro. Las concentraciones del polisac�rido usadas para revestir la placa de ELISA son 10 -20 �g/ml. El color se desarrolla usando 4 mg de OPD (Sigma) por 10 ml a pH 4,5, tampón citrato 0,1,1M con 14 él de H2O2 durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detiene con 50 él de HCl y la densidad óptica se lee a 490 nm relativa a 650 nm. Las concentraciones de IgG se determinan mediante referencia de los puntos de titulación a la curva de calibración modelada usando una ecuación log logística de 4 parámetros calculada mediante el software SoftMax Pro.

El ELISA para medir la IgG murina y de rata a los polisac�ridos de estafilococos es similar con las excepciones siguientes. IgG (H+L) anti-ratón de cabra affiniPure conjugada con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. e IgG anti-rata de cabra AffiniPure (H+L) se usaron para detectar la IgG unida.

HP6043-HRP reaccciona igual con IgG purificada de ser humano y de Rhesus, por lo que este reactivo se usa para el antisuero de Rhesus.

El ELISA de proteínas se realiza de un modo similar al ELISA del polisac�rido con las modificaciones siguientes. La prot�ina se reviste durante la noche a 2,0 �g/ml en PBS. Las muestras de suero se diluten en PBS que contiene 10 % de suero bovino fetal y 0,1 % de alcohol polivin�lico. El anticuerpo humano unido se detecta usando anticuerpo purificado por afinidad de cabra conjugado con proxidasa de Sigma frente a la Fc de IgG humana (referencia A2290).

Ejemplo 7

Ensayo de opsonofagocitosis.

La muerte por opsonofagocitosis in vitro de S. aureus mediante leucocitos polimorgonucleares (PMN) humanos se realiza como se describe en Xu et al 1992 Infect. Immun. 60; 1358. Los PMN humanos se preparan a partir de sangre heparinizada mediante sedimentación en 3 % de dextrano T-250. La mezcla de reacción ops�nica (1 ml) contiene 106 PMN en medio RPMI 1640 suplementado con 10 % de suero bovino fetal inactivado con calor, 108 UFC de S. aureus y 0,1 ml del suero de ensayo o preparación de IgG. El suero hiperinmunizado de conejo se usa como control positivo y se usaron 0m1 ml de suero de conejo no inmune como una fuente completa para las muestras de IgG. Las mezclas de reacción se incuban a 37 �C y las muestras bacterianas se transfieren a 0, 60 y 120 min en agua y después se diluyeron, se extendieron sobre placas de agar de soja tr�ptica y se incuban a 37�C para el recuento bacterian tras la incubaci�n durante la noche.

Ejemplo 8

Inmunogeneicidad de las proteínas estafiloc�cicas en ratones y conejos

Se inmuniz� a los animales con proteínas estafiloc�cicas purificadas con el fin de generar sueros hiperinmunes. Se inmuniz� a los ratones tres veces (días 0, 14 y 28) con 10 �g de cada proteína adyuvada en Specol. Se inmuniz� a los conejos tres veces (días 0, 21 y 42) con 20 �g de cada proteína adyuvada en Specol. Los sueros inmunes se recogieron y se evaluaron en ELISA de células enteras anti-proteínas y anti-muertas.

ELISA antiprote�na:

La proteína purificada se recubri� a 1 �g/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtitulaci�n de unión alta (Nunc MAXISORP), durante la noche a 4� C. Las placas se bloquearon con PBS-BSA 1 % durante 30 min a temperatura ambiente con agitaci�n. Después, las muestras de ensayo se diluyeron a 1/1000 y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora con agitaci�n. Después de lavar, el anticuerpo unido murino o de conejo se detect� usando IgG anti-ratón de cabra (H+L) affiniPure conjugada con peroxidasa de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref: 115 - 035 - 003) o IgG anti-conejo de cabra (H+L) AffiniPure (ref: 11-035-003) diluida a 1:5000 en PBS-tween al 0,05 %. Los anticuerpos de detección se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitaci�n. El color se desarroll� usando 4 mg de OPD (Sigma) + 5 él de H2O2 por 10 ml a pH 4,5, tampón citrato 0,1M durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 él de HCl y la densidad óptica se leyó a 490 nm relativa a 650 nm.

La DO para una dilución a 1/1000 de Post III se compar� con la DO obtenida con la misma dilución del suero preinmune.

Los resultados generados con sueros de ratón y de conejo se presentan en la Figura 5. Se observ� una buena seroconversi�n contra cada ant�geno. La evaluación de los sueros dirigidos contra SBI se alter� debido a la actividad de unión a Ig de esta proteína.

ELISA anti-células enteras muertas:

Las células enteras muertas (inactivadas con calor o con formaldeh�do) de S. aureus de tupo 5 u 8 o de la cepa Hay de S. epidermidis se recibieron a 20 �g/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) en placas de microtiutulaci�n de unión alta (Nunc Maxisorp) durante la noche a 4 �C co evaporación. Las placas se bloquearon con PBS-BSA 1 % durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitaci�n. La proteína A se neutralizó mediante la adición de 10 �g/ml de anti-proteína A de pollo purificada por afinidad (ICL ref: CPA-65A-2) diluida en PBS-tween al 0,05 %, seguido de incubaci�n durante 1 hora a temperatura ambiente. Después, las muestras de ensayo se diluyeron dos veces en la microplaca en PBS al 0,05 % a partir de una dilución de partida a 1/10 y se incubaron durante 1 hora y a a temperatura ambiente con agitaci�n. Después de lavar, el anticuerpo unido murino o de conejo se detect� usando IgG anti-ratón de cabra (H+L) affiniPure conjugada con peroxidadas de Jackson ImmunoLaboratories Inc. (ref: 115 - 035 - 003) o IgG anti-conejo de cabra (H+L) AffiniPure (ref: 11-035-003) diluida a 1:5000 en PBS-tween al 0,05 %. Estos anticuerpos de detección se incubaron durante 30 minutos a temperatura ambiente con agitaci�n. El color se desarroll� usando 4 mg de OPD (Sigma) + 5 él de H2O2 por 10 ml a pH 4,5, tampón citrato 0,1M durante 15 minutos en oscuridad a temperatura ambiente. La reacción se detuvo con 50 él de HCl y la densidad óptica se leyó a 490 nm relativa a 650 nm.

Cabe destacar que los niveles de expresión de las proteínas en estafilococos variarán en función de las condiciones de cultivo. Por tanto, un resultado negativo puede reflejar la elección de condiciones de cultivo incorrectas en lugar de una falta de inmunogeneicidad.

Los resultados usando sueros de ratón se muestran en la Tabla 5 y algunos de los gráficos se muestran en la Figura

6. Se observa un débil reconocimiento de la cepa 5 de S. aureus con los sueros dirigidos contra SdrC, FnbpA, Ebh, Sbi e IsaA. El reconocimiento de la cepa 8 de S. aureus solo se observa con el suero ditigido contra Sbi. El débil reconocimiento de S. epidermidis Hay se observa con los sueros dirigidos contra Atl amidasa, MRP, IsdA, IsaA, Ebh, Aaa y Sbi.

Una selección de los resultados generados usando sueros de conejo se muestra en la Figura 7 y se resumen en la Tabla 6. Se observ� un reconocimiento muy bueno de las tres cepas con IsaA e IsdB. Un débil reconocimiento de las tres cepas se observ� con HarA, aunque los animales solo recibieron una inyección en lugar de las tres inyecciones usadas para las otras proteínas.

Tabla 5

Nombre de la proteína

Reacción en SA5 Reacción en SA8 Reacción en SE Hay

IsaA

(+) (+) (+)

ClfA

- (+) (+)

Atl amidasa

- - ++

SdrG

- - -

Glucosamidasa

- - -

IsdA

- - ++

Toxina alfa

- - -

SrdC

++ (+) -

Ebh

+ - +

AaA

- - ++

MRP

- - ++

Sbi

++ ++ +++

FnbpA

+ + (+)

Tabla 6

Nombre de la proteína

Reacción en SA5 Reacción en SA8 Reacción en SE Hay

IsaA

+++ +++ +++

ClfA

+ ++ ++

Atl amidasa

- ++ +

IsdB

+++ +++ +++

SdrG

+ + +

Glucosamidasa

- - -

HarA (1 inyección)

+ + +

IsdA

- - -

Toxina alfa

- - +

SrdC

- - -

Ebh

- + -

AaA

- - -

MRP

- - ++

Sbi

- +++ -

Nombre proteína

de la Reacción en SA5 Reacción en SA8 Reacción en SE Hay

FnbpA

- ++ ++

Ejemplo 9

Eficacia de las combinaciones de proteínas estafiloc�cicas en un modelo de colonización nasal

En quince grupos de tres ratas algodoneras se inocularon combinaciones de ocho ant�genos de estafilococos y cinco ratas algodoneras que actuaron como controles se trataron sin ant�geno. Estos dieciséis grupos son los siguientes: Grupo 1 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, AAA, toxina alfa, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi Grupo 2 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, IsdA, IsdB, ClfA, SdrC, Ebh, FnbpA Grupo 3 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, HarA, IsdA, MRP, IsdB, AAA, toxina alfa Grupo 4 - Atl-glucosamina, HarA, IsdA, AAA, ClfA, IsaA, Ebh, Sbi Grupo 5 - HarA, MRP, AAA, toxina alfa, ClfA, SdrC, Ebh, FnbpA Grupo 6 - IsdA, IsdB, AAA, toxina alfa, ClfA, SdrG, Sbi, FnbpA Grupo 7 - Atl-aminidasa, IsdA, MRP, AAA, IsaA, SdrG, Ebh, FnbpA Grupo 8 - Control Grupo 9 - Atl-glucosamina, IsdA, MRP, toxina alfa, IsaA, SdrC, Sbi, FnbpA Grupo 10 - Atl-glucosamina, MRP, IsdB, AAA, ClfA, IsaA, SdrC, SdrG Grupo 11 - Atl-amindasa, MRP, IsdB, toxina alfa, ClfA, IsaA, Ebh, Sbi Grupo 12 - Atl-glucosamina, HarA, IsdB, toxina alfa, IsaA, SdrG, Ebh, FnbpA Grupo 13 - Atl-aminidasa, HarA, IsdB, AAA, IsaA, SdrC, Sbi, FnbpA Grupo 14 - Atl-glucosamina, Atl-amidasa, HarA, MRP, ClfA, SdrG, Sbi, FnbpA Grupo 15 - Atl-amindasa, HarA, IsdA, toxina alfa, ClfA, IsaA, SdfC, SdrG Grupo 16 - HarA, IsdA, MRP, IsdB, SdrC, SdrG, Ebh, Sbi Cada mezcla de ant�genos contenía 3 �g de cada ant�geno mezclados con un adyuvante formado por liposomas que

cntienen MPL y QS21. Se inocul� a las ratas algodoneras tres veces los días 1, 14 y 28 del experimento. Dos semanas después de la inoculación se evalu� la eficacia de las inmunizaciones usando un ensayo de colonización nasal como se describe en Kokai-Kun et al (2003) Antimicrob.Agents.Chemother. 47; 1589 - 1597.

Se llev� a cabo un análisis de regresión lineal múltiple clásico con los datos usando el software "Design Expert 6". La presencia de una nt�geno se codificó como +1 y la ausencia de un ant�geno por -1. Usando la ecuación del modelo, fue posible determinar qué ant�genos eran los ant�geenos fundamentales que produjeron una gran disminución del número de colonias por nariz.

Resultados Los resultados del ensayo de colonización nasal se muestran en la Tabla 7. El grupo control tenía un log medio de UFC/nariz de 3,51335 y una disminución de la colonización nasal se pudo veer para todos los grupos de ratas algodoneras a las que se habían inoculado proteínas de estafilococos. Los grupos 4, 9 y 13 mostraron la mayor disminución en la colonización nasal con una disminución de más de 2 log en las UFC/nariz. Los grupos 12 y 16 también dieron buenos resultados, lo que muestra una disminución de aproximadamente 2 log en las UFC/nariz.

Tabla 7

Grupo

Log medio observado de UFC/nariz Log medio predicho de UFC/nariz

1

1,77527 2,03560

2

2,90435 2,52684

3

1,96556 2,23033

4

1,27748 1,21872

5

1,67304 1,93128

6

2,79745 2,98193

7

2,21481 2,30705

8

3,51355 3,47317

9

1,22480 1,44080

10

2,03085 1,93204

11

2,02522 1,81581

12

1,53402 1,70996

13

1,36063 1,49100

14

2,31201 1,73909

15

2,22979 1,98223

16

1,58109 1,44004

La contribución de los ant�genos específicos dentro de la mezcla antig�nica se calcul� usando un análisis de regresión múltiple de los datos de colonización nasal. El modelo final contiene los siete mejores ant�genos. Los resultados para estos ant�genos se muestran en la Tabla 8. Dentro del contexto de la mezcla de proteínas, la inclusic�n de HarA dio la mayor disminución de la colonización nasal, seguido de IsaA, Sbi, SdrC, autolisinaglucosamina, MRP y Ebh.

Tabla 8. Efectos en la diferencia del log de UFC/nariz y proporción de UFC/nariz para los siete mejoresant�genos en el modelo y los correspondientes valores p

Ant�geno

prob >F Estimación del efecto Proporción de la reducción Efecto acumulativo Proporciona acumulativa

HarA

0,033 -0,596 3,9 -0,596 3,9

IsaA

0,046 -0,558 3,6 -1,154 14,3

Sbi

0,077 -0,491 3,1 -1,645 44,2

SdrC

0,22 -0,337 2,2 -1,982 96,0

Atl-glucos

0,238 -0,324 2,1 -2,306 202,2

MRP

0,239 -0,323 2,1 -2,629 425,3

Ebh

0,297 -0,286 1,9 -2,914 821,0

LISTADO DE SECUENCIAS

<110> GlaxoSmithKline Biologicals S.A.

<120> Composición inmunog�nica para uso en vacunación contra estafilococos

<130> N.1018371

<150> GB 0421082,9

<151> 2004 - 09 - 22

<150> GB 0421078,7

<151> 2004 - 09 - 22

<150> GB 0421081,1

<151> 2004 - 09 - 22

<150> GB 0421079,5

<151> 2004 - 09 - 22

<150> GB 0503143,0

<151> 2005 - 02 - 15

<160> 151

<170> FastSEQ for Windows Versión 4,0

<210> 1

<211> 533

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 1

<210> 2

<211> 535

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 2

<210> 3 <211>434

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 3

<210> 4 <211>434

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 4

<210> 5

<211> 255

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 5

<210> 6

<211> 267

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 6

<210> 7 10 <211> 257

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 7 15

<210> 8

<211> 309

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 8

<210> 9

<211> 309 15 <212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 9

5 <210> 10

<211> 233

<212> PRT

<213> Staphylococcus

10 <400> 10 <210> 11

<211> 235 5 <212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 11

<210> 12

<211> 3890

<212>

PRT 15 <213> Staphylococcus

<400> 12

<210> 13

<211> 6713

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 13

<210> 14

<211> 701

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 14

<210> 15

<211> 9439

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 15

<210> 16

<211> 1115

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 16

<210> 17

<211> 1469

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 17

<210> 18

<211> 167

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 18

<210> 19

<211> 167

<212>

PRT 15 <213> Staphylococcus

<400> 19

5 <210> 20

<211> 1141

<212> PRT

<213> Staphylococcus

10 <400> 20

<210> 21

<211> 1056

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 21

<210> 22

<211> 486

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 22

<210> 23

<211> 472

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 23

<210> 24

<211> 165

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 24

<210> 25

<211> 319

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 25

<210> 26

<211> 428

<212> PRT 15 <213> Staphylococcus

<400> 26

<210> 27

<211> 350

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 27

<210> 28

<211> 645

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 28

<210> 29

<211> 953

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 29

<210> 30

<211> 935

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 30

<210> 31

<211> 1038

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 31

<210> 32

<211> 877

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 32

<210> 33

<211> 658

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 33

<210> 34

<211> 1602

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 34

<210> 35

<211> 1608 5 <212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 35

<210> 36

<211> 1305

<212>

ADN 15 <213> Staphylococcus

<400> 36

<210> 37

<211> 1305

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 37

<210> 38

<211> 768

<212>

ADN 15 <213> Staphylococcus

<400> 38

<210> 39

<211> 804

<212> ADN

<213> Staphylococcus 25

<400> 39

<210> 40 5 <211> 774

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 40 10

<210> 41

<211> 930 15 <212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 41

<210> 42

<211> 930

<212>

ADN 25 <213> Staphylococcus

<400> 42

<210> 43

<211> 702

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 43

<210> 44

<211> 708

<212>

ADN 15 <213> Staphylococcus

<400> 44

<210> 45

<211> 11670

<212> ADN

<213> Staphylococcus 25

<400> 45

<210> 46

<211> 20139

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 46

<210> 47

<211> 2103

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 47

<210> 48

<211> 28317

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 48

<210> 49

<211> 3348

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 49

<210> 50

<211> 4410

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 50

<210> 51

<211> 504

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 51

<210> 52

<211> 504

<212> ADN 15 <213> Staphylococcus

<400> 52

<210> 53

<211> 3426

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 53

<210> 54

<211> 3171

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 54

<210> 55

<211> 1461

<212> ADN

<213> Staphylococcus 15

<400> 55 <210> 56

<211> 1419 5 <212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 56

<210> 57

<211> 498

<212>

ADN 15 <213> Staphylococcus

<400> 57

<210> 58

<211> 960

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 58

<210> 59

<211> 1287

<212>

ADN 15 <213> Staphylococcus

<400> 59

<210> 60

<211> 1053

<212> ADN

<213> Staphylococcus 25

<400> 60 <210> 61

<211> 1938 5 <212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 61

<210> 62

<211> 2862

<212> ADN 15 <213> Staphylococcus

<400> 62

<210> 63

<211> 2808

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 63

<210> 64

<211> 3117

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 64

<210> 65

<211> 2634

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 65

<210> 66

<211> 1977

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 66

<210> 67

<211> 961

<212> PRT

<213> Staphylococcus 15

<400> 67

<210> 68

<211> 578

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 68

<210> 69

<211> 995

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 69

<210> 70

<211> 773

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 70

<210> 71

<211> 2886

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 71

<210> 72

<211> 1737 5 <212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 72

<210> 73

<211> 2988

<212> ADN 15 <213> Staphylococcus

<400> 73

<210> 74

<211> 2319

<212> ADN

<213> Staphylococcus

<400> 74

<210> 75

<211> 774

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 75

<210> 76

<211> 128

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 76

<210> 77

<211> 6

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 77

<210> 78

<211> 6

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 78

<210> 79

<211> 13

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 79

<210> 80

<211> 10

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 80

<210> 81

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 81

<210> 82

<211> 13

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 82

<210> 83

<211> 7

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 83

<210> 84

<211> 128

<212> PRT

<213> Staphylococcus 10

<400> 84

15

<210> 85 <211> 9 <212> PRT <213> Staphylococcus

20

<400> 85

25

<210> 86 <211> 9 <212> PRT <213> Staphylococcus

30

<400> 86

35

<210> 87 <211> 9 <212> PRT <213> Staphylococcus

<400> 87

40

45

<210> 88 <211> 9 <212> PRT <213> Staphylococcus

<400> 88

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 89

<210> 90

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 90

<210> 91

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 91

<210> 92

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 92

<210> 93

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 93

<210> 94

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 94

<210> 95

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 95

<210> 96

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 96

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 97

<210> 98

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 98

<210> 99

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 99

<210> 100

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 100

<210> 101

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 101

<210> 102

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 102

<210> 103

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 103

<210> 104

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 104

<210> 105

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 105

<210> 106

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 106

<210> 107

<211> 9

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 107

<210> 108

<211> 52

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 108

<210> 109

<211> 36

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 109

<210> 110 15 <211> 6

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 110

<210> 111

<211> 4 25 <212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 111

<210> 112

<211> 5

<212> PRT 35 <213> Staphylococcus

<400> 112

<210> 113

<211> 6

<212> PRT

<213> Staphylococcus 45

<400> 113

<210> 114

<211> 7

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 114

<210> 115

<211> 5

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 115

<210> 116

<211> 4

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 116

<210> 117

<211> 15

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 117

<210> 118

<211> 16

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 118

<210> 119

<211> 15

<212> PRT

<213> Staphylococcus

<400> 119

<210> 120

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<400> 120

cgcggatccg cagattctga tattaatatt aaaac 35

<210> 121

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 121

cccaagcttt taatttgtca tttcttcttt ttc 33

<210> 122

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 122

cgcggatccg ctgggtctaa taattttaaa gatg 34

<210> 123

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 123

cccaagcttt tatggaataa cgatttgttg 30

<210> 124

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 124

cgcggatcca gtgaaaatag tgttacgcaa tc 32

<210> 125

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 125

cccaagcttt tactctggaa ttggttcaat ttc 33

<210> 126

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos <400> 126

cgcggatcca cacaaacaac tgcaactaac g 31

<210> 127

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 127

cccaagcttt tatgctttgt gattcttttt caaac 35

<210> 128

<211> 26

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 128

cgcggatcca acacgcaaca aacttc 26

<210> 129

<211> 36

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 129

ggaactgcag ttatttccag aatgataata aattac 36

<210> 130

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 130

cgcggatccg cagaacatac gaatggag 28

<210> 131

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 131

cccaagcttt tatgtttctt cttcgtagta gc 32

<210> 132

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 132

cgcggatccg aggagaattc agtacaag

28

<210> 133 <211> 31 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador de estafilococos

<400> 133

cccaagcttt tattcgtcat catagtatcc g

31

<210> 134 <211> 25 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador de estafilococos

<400> 134

aaaagtactc accaccacca ccacc

25

<210> 135 <211> 29 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador de estafilococos

<400> 135

aaaagtactc acttgattca tcgcttcag

29

<210> 136 <211> 33 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador de estafilococos

<400> 136

gcgcgccatg gcacaagctt ctacacaaca tac 33

<210> 137 <211> 32 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador de estafilococos

<400> 137

gcgcgctcga gatggatgaa tgcatagcta ga

32

<210> 138 <211> 48 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 138

gcatccatgg caccatcacc atcaccacga agtaaacgtt gatcaagc

<210> 139

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 139

agcactcgag ttagaatccc caagcaccta aacc 34

<210> 140

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400>140 gcacccatgg cagaaaatac aaatacttc 29

<210> 141

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 141

ttttctcgag cattttagat tgactaagtt g 31

<210> 142

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 142

caagtcccat ggctgagacg acacaagatc aac 33

<210> 143

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 143

cagtctcgag ttttacagct gtttttggtt g 31

<210> 144

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 144

agctcatatg gcttatactg ttactaaacc 30

<210> 145

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 145

gcgcctcgag tttatattgt gggatgtcg 29

<210> 146

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 146

caagtcccat ggcaacagaa gctacgaacg caac 34

<210> 147

<211> 35

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 147

accagtctcg agtaattctt tagctttaga gcttg 35

<210> 148

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 148

tattctcgag gctttgagtg tgtccatcat ttg 33

<210> 149

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Cebador de estafilococos

<400> 149

gaagccatgg cagcagctga agaaacaggt gg 32

5

<210> 150 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador de estafilococos

<400> 150

10

gattacacca tggttaaacc tcaagcgaaa 30

15

<210> 151 <211> 30 <212> ADN <213> Secuencia artificial <220> <223> Cebador de estafilococos

20

<400> 151 aggtgtctcg agtgcgattg tagcttcatt 30

Claims (11)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composición inmunog�nica que comprende:

   -

   ClfA aislado o un fragmento inmunog�nico del mismo; y

   -

   toxina alfa aislada, mutante H35L de la toxina alfa o mutante H35R de la toxina alfa o un fragmento inmunog�nico de los mismos.

2. 2.

   La composición inmunog�nica de la reivindicación 1, que comprende al menos una proteína de S. aureus.

3. 3.

   La composición inmunog�nica de las reivindicaciones 1 o 2, que comprende al menos una proteína de S. epidermidis.

4. 4.

   La composición inmunog�nica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un polisac�rido o un oligosac�rido PIA y/o polisac�rido u oligosac�rido capsulares de tipo V y/o de tipo VIII de S. aureus.

5. 5.

   La composición inmunog�nica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además polisac�rido u oligosac�rido capsulares de tipo I y/o de tipo II y/o de tipo II de S. epidermidis.

6. 6.

   La composición inmunog�nica de las reivindicaciones 4 o 5, en la que el polisac�rido capsular est� conjugado con un vehículo proteico.

7. 7.

   La composición inmunog�nica de la reivindicación 6, en la que el vehículo proteico se selecciona de toxoide del tétanos, toxoide dift�rico, CRM197, proteína D de Haemophilus influenzae, neumolisina y toxoide alfa.

8. 8.

   La composición inmunog�nica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es capaz de generar una respuesta inmunitaria eficaz tanto contra S. aureus como contra S. epidermidis.

9. 9.

   Una vacuna que comprende la composición inmunog�nica de una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un excipiente farmac�uticamente aceptable.

10. 10.

    Un procedimiento de preparación de una vacuna, que comprende las etapas de mezclar ant�genos para preparar la composición inmunog�nica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y añadir un excipiente farmac�uticamente aceptable.

11. 11.

    Uso de la composición inmunog�nica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en la fabricación de una vacuna para el tratamiento o la prevención de infección por estafilococos.

    Anti-Isa A

    Anti-Isa A

    Anti-Isa A