DE69405551T3

DE69405551T3 - 3-0-deazylierte monophosphoryl lipid a enthaltende impfstoff-zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69405551T3
Application number: DE69405551T
Authority: DE
Inventors: Pierre Smithkline Beecham Bio. Hauser (S.A.); Pierre Smithkline Beecham Bio. Voet (S.A.); Moncef Smithkline Beecham Bio. Slaoui (S.A.); Nathalie Marie-Josephe Claude Garcon-Johnson; Pierre Smithkline Beecham Bio. Desmons (S.A.)
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA; SmithKline Beecham Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 1993-03-23
Filing date: 1994-03-14
Publication date: 2005-10-20
Anticipated expiration: 2014-03-15
Also published as: HK1045935A1; DE69405551T2; DE69405551D1; NO20054701L; JP4028593B2; HK1023499A1; IL109056A; SK117395A3; IL109056A0; DK0812593T3; JP2005015487A; DZ1763A1; NO322578B1; SG48309A1; ES2109685T3; PL178578B1; SA94140762B1; FI954514A0; DK0689454T4; HU9501979D0

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Impfstoff-Zubereitungen, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung in der Therapie.
3-O-deacyliertes Monophosphoryl-Lipid A (oder 3 De-O-acyliertes Monophosphoryl-Lipid A) wurde früher als 3D-MPL oder d3-MPL bezeichnet, um, darauf hinzuweisen, daß Position 3 des Glucosamins am reduzierenden Ende de-O-acyliert ist. Zur Herstellung s. GB 2 220 211 A. Chemisch handelt es sich um ein Gemisch aus 3-deacyliertem Monophosphoryl-Lipid A mit 4, 5 oder 6 acylierten Ketten Hier wird die Bezeichnung 3D-MPL (oder d3-MPL) abgekürzt mit MPL, da es sich bei "MPL" um ein eingetragenes Warenzeichen von Ribi Immunochem., Montana handelt, das von Ribi verwendet wird, um eindeutig deren 3-O-deacyliertes Monophosphoryl-Lipid A Produkt zu kennzeichnen.
GB 2 220 211 A erwähnt, daß die Endotoxizität der zuvor verwendeten enterobakteriellen Lipopolysaccharide (LPS) vermindert wird, während die immunogenen Eigenschaften erhalten bleiben. Jedoch führt GB 2 220 211 A dieses Ergebnis lediglich in Verbindung mit bakteriellen (Gram-negativen) Systemen an. Die Teilchengröße des MPL wurde nicht erwähnt. Tatsächlich weist das bekannte 3-deacylierte Monophosphoryl-Lipid A Teilchen mit einer Teilchengröße über 500 nm auf.
In WO 92/06113 wurde eine Impfstoff-Zubereitung offenbart, die ein Herpes-simplex-Virus-Glykoprotein gD bzw. immunologische Fragmente davon in Verbindung mit 3-deacyliertem Monophosphoryl-Lipid A umfaßt. Wieder wurde die Teilchengröße des 3-deacylierten Monophosphoryl-Lipids A nicht erwähnt.
In WO 92/06113 wurde eine Impfstoff-Zubereitung offenbart, die HIV gp 160 bzw. einen Abkömmling davon, wie gp120, in Verbindung mit 3-deacyliertem Monophosphoryl-Lipid A umfaßt. Die Teilchengröße des MPL wurde nicht erwähnt.
Die vorliegende Erfindung liefert eine Impfstoff-Zusammensetzung, die ein Antigen in Verbindung mit 3-O-deacyliertem Monophosphoryl-Lipid A (hier mit MPL abgekürzt) sowie einen geeigneten Träger umfaßt, in der die Teilchengröße des MPL "klein" ist und bei der Herstellung 120 nm nicht übersteigt.
Eine derartige Zubereitung eignet sich für ein breites Spektrum monovalenter oder polyvalenter Impfstoffe.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß erfindungsgemäße Impfstoff-Zusammensetzungen besonders vorteilhafte Eigenschaften besitzen, wie hier beschrieben.
Insbesondere sind solche Zubereitungen äußerst immunogen. Zusätzlich kann die Sterilität der Adjuvans-Zubereitung gewährleistet werden, da das Produkt einer Sterilfiltration zugänglich ist. Ein weiterer Vorteil von "kleinem" MPL zeigt sich bei der Zubereitung mit Aluminiumhydroxid, da das MPL mit dem Aluminiumhydroxid und dem Antigen unter Bildung eines einheitlichen Produkts interagiert.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Antigen ein virales Antigen, beispielsweise ein Antigen gegen Hepatitis-Infektion (Hepatitis A, B, C, D oder E) oder Herpes-Infektion (HSV1 oder HSV2) wie nachstehend beschrieben. Eine Übersicht über moderne Hepatitis-Impfstoffe, einschließlich einer Anzahl wichtiger Literaturstellen, ist bei Prof. A. L. W. F. Eddleston, Lancet 12. Mai 1990, 1142 ff. zu finden. S. auch "Viral Hepatits and Liver Disease" (Hrsg. Vyas, B. N., Dienstag, J. L. and Hoofnagle, J. H., Grune and Stratton, Inc. (1984) und "Viral Hepatitis and Liver Disease" (Proceedings of the 1990 International Symposium, Hrsg. F. B. Hollinger, S. M. Lemon and H. Margolis, publiziert von Williams and Wilkins). Verweise auf HSV1 und HSV2 finden sich in WO 92/16231.
Die Infektion mit dem Hepatitis A-Virus (HAV) ist ein weitverbreitetes Problem, es stehen jedoch Impfstoffe zur Verfügung, die für die Massenimmunisierung verwendet werden können, beispielsweise das Produkt "Havrix" (Smith Kline Beecham Biologicals), das ein abgetöteter abgeschwächter Impfstoff ist, den man aus dem HM-175-Stamm des HAV erhält [s. "Inactivated Candidate Vaccines for Hepatitis A von F. E. Andre, A. Hepburn and E. D'Hondt, Prog. Med. Virol. 37 (1990), 72–95 und die Produktbeschreibung "Havrix", publiziert von Smith Kline Beecham Biologicals (1991)].
Flehmig et al. (ibid., 56–71) haben eine Übersicht zusammengestellt über klinische Aspekte und Virologie, Immunologie und Epidemiologie von Hepatitis A sowie Ansätze für die Entwicklung von Impfstoffen gegen diese verbreitete Virusinfektion diskutiert.
Der hier verwendete Begriff "HAV-Antigen" betrifft jedes Antigen, das in der Lage ist, HAV-neutralisierende Antikörper im Menschen zu stimulieren. Das HAV-Antigen kann lebend abgeschwächte Virus-Teilchen oder inaktivierte abgeschwächte Virus-Teilchen umfassen oder es kann beispielsweise ein HAV-Capsid- oder HAV-Virusprotein sein, das man auf einfache Weise mit Hilfe rekombinanter DNA-Technologie erhalten kann.
Die Infektion mit dem Hepatitis B-Virus (HBV) ist ein weitverbreitetes Problem, es stehen nun jedoch Impfstoffe für die Massenimmunisierung zur Verfügung, beispielsweise das Produkt "Engerix-B" (Smith Kline Beecham plc), das man mit Hilfe gentechnologischer Techniken erhält.
Die Herstellung des Hepatitis B-Oberflächenantigens (HBsAg) ist gut dokumentiert. S. beispielsweise Harford et al. in Develop. Biol. Standard 54 (1983), 125, Gregg et al. in Biotechnology 5 (1987), 479, EP-A-O 226 846, EP-A-O 299 108 und dortige Verweise.
Der Begriff "Hepatitis B-Oberflächenantigen" oder "HBsAg", wie er hier verwendet wird, schließt jedes HBsAg Antigen oder Fragment davon ein, das die Antigenität des HBV- Oberflächenantigens zeigt. Es ist selbstverständlich, daß HBsAg wie hier beschrieben zusätzlich zur Sequenz der 226 Aminosäuren des HBsAg-S-Antigens (s. Tiollais et al., Nature 317 (1985), 489 und dortige Verweise), gegebenenfalls die gesamte prä-S-Sequenz oder einen Teil davon enthalten kann, wie in den vorstehend zitierten Dokumenten und in EP-A- 0 278 940 beschrieben. Insbesondere kann das HBsAg ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz umfassend die Reste 12–52 gefolgt von den Resten 133–145 gefolgt von den Resten 175–400 des L-Proteins von HBsAg, bezogen auf den offenen Leserahmen eines Hepatitis B-Virus des ad-Serotyps sein (dieses Polypeptid wird als L* bezeichnet; s. EP 0 414 374 ). HBsAg im Schutzbereich dieser Erfindung kann ebenso das präS1-präS2-S-Polypeptid beinhalten, das in EP 0 198 474 (Endotronics) beschrieben wird oder Analoga davon, wie diejenigen, die in EP 0 304 578 (Mc Cormick and Jones) beschrieben werden. HBsAg, wie es hier beschrieben wird, kann sich ebenso auf Mutanten beziehen, beispielsweise die in WO 91/14703 oder der EP-A 0 511 855 beschriebene "Escape-Mutante", insbesondere HBsAg, in dem die Aminosäure-Substitution an Postition 145 Arginin anstelle von Glycin einführt.
Im Normalfall wird HBsAg in Teilchenform vorliegen. Die Teilchen können beispielsweise S-Protein allein umfassen oder sie können zusammengesetzte Teilchen sein, beispielsweise (L*, S), wobei für L* die obige Definition gilt und S das S-Protein von HBsAg bedeutet. Das Teilchen ist vorteilhafterweise in der Form, in der es in Hefe exprimiert wird.
Herpes-simplex-Virus-Glykoprotein D ist in der Virushülle lokalisiert und läßt sich auch im Cytoplasma infizierter Zellen finden (Eisenberg, R. J. et al., J. Virol. 35 (1990), 428–435. Es umfaßt 393 Aminosäuren einschließlich eines Signalpeptids und hat ein Molekulargewicht von annähernd 60 kD. Von allen HSV-Hüll-Glykoproteinen ist dieses wahrscheinlich das bestcharakterisierte (Cohen et al., J. Virol: 60, 157–166). Es ist bekannt, daß es in vivo eine zentrale Rolle bei der viralen Adhäsion an Zellmembranen spielt. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß Glykoprotein D in vivo neutralisierende Antikörper hervorrufen kann (Eing et al., J. Med. Virol. 127, 59–65). Jedoch kann latentes HSV2-Virus immer noch reaktiviert werden und einen Krankheitsrückfall auslösen, ungeachtet eines hohen Titers an neutralisierenden Antikörpern in den Patienten-Seren. Es ist also offensichtlich, daß die Fähigkeit zur Induktion neutralisierender Antikörper allein nicht ausreicht, um die Krankheit in geeigneter Weise unter Kontrolle zu halten.
Das reife, rekombinante, verkürzte Glykoprotein D (rgD₂t) oder äquivalente, von Säugerzellen sezernierte Proteine, werden in der hier genannten Erfindung bevorzugt für die Impfstoff-Zubereitung eingesetzt. Äquivalente Proteine schließen das Glykoprotein gD aus HSV1 ein.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei dem rgD₂t um das HSV2-Glykoprotein mit 308 Aminosäuren, das die Aminosäuren 1 bis 306 des natürlich vorkommenden Glykoproteins unter Zusatz von Asparagin und Glutamin am C-terminalen Ende des verkürzten Proteins umfaßt. Diese Form des Proteins schließt das Signalpeptid ein, das abgespalten wird, wodurch sich ein reifes Protein von 283 Aminosäuren ergibt. Die Produktion eines derartigen Proteins in Ovarzellen des Chinesischen Hamsters wurde beschrieben in Genentech's Europäischem Patent EP-B-139 417 und in Science 222. 524 sowie in Biotechnology, Juni 1984, 527. Ein solcher Impfstoff besitzt, wenn er erfindungsgemäß mit kleinem MPL zubereitet wird, verglichen mit herkömmlichen rgD₂t-Zubereitungen ein stärkeres therapeutisches Potential.
Während gewisse in der Erprobung stehende sowie im Handel erhältliche Impfstoffe ausgezeichnete Ergebnisse liefern, ist es eine anerkannte Tatsache, daß ein optimaler Impfstoff nicht nur neutralisierende Antikörper stimulieren, sondern auch so wirksam wie möglich die durch T-Zellen vermittelte zelluläre Immunität stimulieren muß.
Ein besonderer Vorteil ist, daß die erfindungsgemäßen Impfstoff-Zubereitungen sehr wirksam sind hinsichtlich der Induktion schützender Immunität, sogar in Verbindung mit sehr niedrigen Antigen-Dosen.
Sie bieten einen ausgezeichneten Schutz gegen Primär- und Rückfall-Infektion und stimulieren vorteilhaft sowohl die spezifische humorale (neutralisierende Antikörper) als auch die durch Effektorzellen vermittelte (DTH) Immunantwort.
Um 3-deacyliertes Monophosphoryl-Lipid A mit einer kleinen Teilchengröße herzustellen, die 120 nm nicht übersteigt, kann man der in GB 2 220 211 beschriebenen Vorgehensweise folgen, wodurch man bekanntes 3D-MPL erhält (oder man kann kommerzielles MP1 mit einer größeren Teilchengröße von Ribi Immunochem. erwerben), und das Produkt dann mit Ultraschall behandeln, bis die Suspension klar ist. Die Größe der Teilchen kann man mit Hilfe des dynamischen Lichtstreu-Verfahrens abschätzen, wie nachstehend beschrieben. Um nach der Zubereitung mit Aluminiumhydroxid eine MPL-Größe im 100 nm-Bereich aufrecht zu erhalten, können das Antigen und der Puffer, Tween 80 oder Sorbit, hinzugefügt werden. Es wurde festgestellt, daß unter diesen Bedingungen MPL in Gegenwart von Phosphatpuffer nicht aggregiert, wie es bei Zubereitung ohne die Zugaben der Fall sein kann. Dadurch wird die endgültige Zubereitung weiter definiert und charakterisiert. Es wurde ebenfalls nachgewiesen, daß unter diesen Bedingungen MPL mit Aluminiumhydroxid und dem Antigen weiterhin unter Bildung eines einheitlichen Produkts interagiert.
Eine klare Lösung von MPL kann sterilisiert werden, indem sie durch ein Filter gedrückt wird. Vorzugsweise liegt die Größe der Teilchen im Bereich von 60–120 nm.
Besonders vorteilhafterweise liegt die Teilchengröße unter 100 nm.
Das wie vorstehend definierte MPL wird im Normalfall in einem Bereich von 10–200 μg vorliegen, vorzugsweise 25–50 μg pro Dosis, worin das Antigen typischerweise in einer Menge von 2–50 μg pro Dosis oder mehr enthalten sein wird. Die Impfstoff-Zubereitung der vorliegenden Erfindung kann zusätzlich weitere Immunstimulanzien enthalten, in einer bevorzugten Ausführungsform kann der Impfstoff der vorliegenden Erfindung QS21 enthalten (in manchen Fällen als QA21 bezeichnet). Dabei handelt es sich um eine HPLC-Fraktion eines Saponin-Extrakts, welcher aus der Rinde eines Baumes, Quillaja Saponaria Molina, gewonnen wird. Ein Verfahren zu dessen Herstellung wird in US Patent 5,057,540 offenbart.
Die Trägersubstanz kann gegebenenfalls eine Öl-in-Wasser-Emulsion, ein Lipid-Vehikel oder Aluminiumhydroxid (Aluminiumhydroxid-Salz) sein.
Ungiftige Öl-in-Wasser-Emulsionen enthalten vorzugsweise ungiftiges Öl, z.B. Squalen, und einen Emulgator wie Tween 80, in einem wässrigen Träger. Dieser wässrige Träger kann beispielsweise phosphatgepufferte Kochsalzlösung sein.
Vorzugsweise werden die Impfstoff-Zubereitungen ein Antigen oder eine antigene Zusammensetzung enthalten, das/die in der Lage ist, eine Immunantwort auf ein menschliches oder tierisches Pathogen hervorzurufen, wobei das Antigen oder die antigene Zusammensetzung abgeleitet ist von HIV-1 (wie gp120 oder gp160; s. WO 92/06113 und dortige Verweise), Herpes-Virus wie gD oder Derivaten davon oder sehr frühem Protein wie ICP27 von HSV1 oder HSV2, gB (oder Derivaten davon) von menschlichem Cytomegalievirus, oder gpI, II oder III vom Varicella-Zoster-Virus, oder von einem Hepatitis-Virus wie dem Hepatitis B-Virus oder von anderen viralen Pathogenen wie dem Respiratory-Syncytial-Virus, dem menschlichen Papillom-Virus oder dem Influenza-Virus, oder gerichtet ist gegen bakterielle Pathogene wie Salmonella, Neisseria, Borrelia (beispielsweise OspA oder OspB oder Derivaten davon), oder Chlamydia, oder Bordetella, beispielsweise P.69, PT und FHA, oder gegen Parasiten wie Plasmodium oder Toxoplasma. Die Impfstoff-Zubereitungen der hier genannten Erfindung können ein Tumor-Antigen enthalten und als Impfstoff gegen Krebs verwendbar sein.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist das HAV-Antigen (wie beispielsweise in Havrix) unter Beimischung von MPL und Aluminiumhydroxid wie nachstehend beschrieben. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist das HB-Virus-Oberflächenartigen (HBsAg) (wie beispielsweise in Engerix-B) unter Beimischung von MPL und Aluminiumhydroxid.
Eine weitere spezifische Ausführungsform der Erfindung ist das HBsAg-Antigen in Form von (L*, S)-Teilchen, wie vorstehend beschrieben, unter Beimischung. von MPL und Aluminiumhydroxid.
Hepatitis A/Hepatitis B-Kombinationsimpfstoffe können gemäß der Erfindung ebenfalls hergestellt werden.
Eine weitere Ausführungsform ist eine erfidungsgemäße Zubereitung, die reifes verkürztes Glykoprotein D (rgD₂t) oder äquivalente Proteine umfaßt, wie vorstehend beschrieben. Noch eine weitere Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Zubereitung, die ein OspA-Antigen, oder Derivate davon, aus Borrelia burgdorferi umfaßt. Beispielsweise können Antigene, insbesondere OspA-Antigene, der ZS7- oder B31-Stämme verwendet werden. Noch eine weitere Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Zubereitung, die ein Grippevirus-Antigen umfaßt. Dies liefert einen verbesserten Influenza-Impfstoff, insbesondere, wenn ein "gespaltenes" Virus verwendet wird.
Die Zubereitung kann auch für die Nutzung mit leichten Herpes-Teilchen verwendbar sein, wie in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB92/00824 (WO92/19748) und in der Internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/GB92/00179 (WO92/13943) beschrieben.
Vorteilhafterweise enthält die erfindungsgemäße Impfstoff-Zusammensetzung weitere Antigene, so daß sie bei der Behandlung oder Prophylaxe einer oder mehrerer weiterer Bakterien-, Virus- oder Pilzinfektionen wirksam ist.
Beispielsweise enthalten erfindungsgemäße Hepatitis-Impfstoff-Zubereitungen vorzugsweise wenigstens einen weiteren Bestandteil aus der Gruppe der Non-Hepatitis-Antigene, von denen auf dem Fachgebiet bekannt ist, daß sie Schutz bieten vor einer(m) oder mehreren der folgenden Krankheiten oder Krankheitserreger: Diphtherie, Tetanus, Keuchhusten, Haemophilus influenzae b (Hib) und Polio.
Vorzugsweise enthält der erfindungsgemäße Impfstoff HBsAg wie vorstehend definiert.
Spezielle Kombinationsimpfstoffe im Schutzbereich der Erfindung umfassen eine DTP (Diphtherie-Tetanus-Keuchhusten)-Hepatitis B-Kombinationsimpfstoff-Zubereitung, eine Hib-Hepatitis B-Impfstoff-Zubereitung, eine DTP-Hib-Hepatitis B-Impfstoff-Zubereitung und eine IPV (inaktivierter Polioimpfstoff)-DTP-Hib-Hepatitis B-Impfstoff-Zubereitung.
Die vorstehend genannten Kombinationen können vorteilhafterweise einen Bestandteil umfassen, der gegen Hepatitis A schützt, insbesondere den aus dem HM-175-Stamm abgeleiteten, abgetöteten abgeschwächten Stamm, wie er in Havrix enthalten ist.
Für die Verwendung in solchen Impfstoffen geeignete Bestandteile sind bereits im Handel erhältlich. Einzelheiten kann man bei der Weltgesundheitsorganisation erhalten. Beispielsweise kann der IVP-Bestandteil der Salk-inaktivierte-Polio-Impfstoff sein. Der Keuchhusten-Impfstoff kann ein Produkt aus ganzen Zellen oder aus nichtzellulären Bestandteilen umfassen.
Vorteilhafterweise ist der erfindungsgemäße Hepatitis- oder Kombinationsimpfstoff ein in der Kinderheilkunde verwendbarer Impfstoff.
Die Erfindung liefert in weiterer Hinsicht eine erfindungsgemäße Impfstoff-Zusammensetzung für die Verwendung in der medizinischen Therapie, insbesondere für die Verwendung bei Behandlung und Prophylaxe von Infektionen, einschließlich bakterieller und viraler Infektionen, oder für die immuntherapeutische Behandlung von Krebs.
In einem bevorzugten Aspekt ist der erfindungsgemäße Impfstoff ein therapeutischer Impfstoff, der verwendbar ist für die Behandlung bestehender (ongoing) Infektionen, beispielsweise Hepatitis B- oder Herpes-Infektionen bei Menschen, die daran leiden.
Die Impfstoff-Herstellung ist allgemein beschrieben in New Trends and Developments in Vaccines, Hrsg. Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland U.S.A., 1978. Der Einschluß in Liposomen wird beispielsweise beschrieben von Fullerton, US Patent 4,235,877. Die Konjugation von Proteinen mit Makromolekülen wird beispielsweise offenbart von Likhite, US Patent 3,372,945 und von Armor et al., US Patent 4,474,757.
Die Antigenmenge in jeder Impfstoff-Dosis wird gewählt als die Menge, die in typischen Impflingen eine Immunschutzreaktion ohne signifikante ungünstige Nebenwirkungen auslöst. Diese Menge wird variieren in Abhängigkeit davon, welche spezifischen Immunogene man einsetzt. Im allgemeinen rechnet man damit, daß jede Dosis 1–1000 μg Gesamtimmunogen umfaßt, vorzugsweise 2–100 μg, am meisten bevorzugt 4–40 μg. Die optimale Menge für einen bestimmten Impfstoff kann durch Standard-Studien ermittelt werden, die eine Kontrolle des Antikörpertiters und anderer Reaktionen in Testpersonen beinhaltet. Im Anschluß an eine Erstimpfung können Testpersonen nach etwa 4 Wochen eine Auffrischungsimpfung erhalten.
In weiterer Hinsicht liefert die vorliegende Erfindung ein Herstellungsverfahren für einen Impfstoff, der bei Infektionsvorbeugung oder -behandlung wirksam ist, wobei das Verfahren das Mischen des Antigens mit einem Träger und MPL umfaßt, wobei die Teilchengröße des MPL nicht größer als 120 nm ist, im Normalfall 60–120 nm, vorzugsweise etwa 100 nm oder weniger.
Die folgenden Beispiele verdeutlichen die Erfindung und ihre Vorteile.
Beispiel 1: Herstellung von MPL mit einer Teilchengröße von 60–120 nm
Wasser für Injektion wird unter Verwendung einer Spritze in Glasfläschchen mit lyophilisiertem 3-de-O-acyliertem Monophophoryl-Lipid A (MPL) von Ribi Immunochem., Montana, injiziert, so daß eine Konzentration von 1 bis 2 mg pro ml erreicht wird. Eine vorläufige Suspension erhält man durch Mischen unter Verwendung eines Vortex-Gerätes. Der Inhalt der Glasfläschchen wird dann in 25 ml-Corex-Röhrchen mit rundem Boden überführt (10 ml Suspension pro Röhrchen) und die Suspension wird unter Verwendung eines Wasserbad-Ultraschallgerätes beschallt. Sobald die Suspension klar geworden ist, wird unter Verwendung des dynamischen Lichtstreu-Verfahrens (Malvern Zetasizer Typ 3) die Größe der Teilchen bestimmt. Die Behandlung wird fortgeführt, bis die Größe der Teilchen im Bereich von 60–120 nm liegt.
In manchen Fällen können die Suspensionen bei 4°C bis zu 5 Monate ohne signifikante Aggregation aufbewahrt werden. Isotonische NaCl-Lösung (0.15 M) oder isotonische NaCl-Lösung mit 10 mM Phosphat lösen eine rasche Aggregation aus (Größe > 3–5 μm).
Beispiel 2: Herstellung von sterilem löslichem MPLVIPL mit einer Teilchengröße von unter 100 nm in großem Maßstab
Lyophilisiertes 3-de-O-acyliertes Monophophoryl-Lipid A würde bei Ribi Immunochem. erworben und in Wasser für Injektion (WFI) suspendiert. Die Suspension wurde kontinuierlich durch eine Ultraschall-Flußzelle gepumpt. Die Flußzelle besteht typischerweise aus Glas oder rostfreiem Stahl mit PTFE-Verschlüssen, um den GMP-Regeln zu entsprechen. Zur Erzeugung von Ultraschall werden ein Ultraschall-Generator und eine Titan-Beschallungsspitze (Sonotrode) benutzt, die bei Undatim Ultrasonics (Louvain-La-Neuve, Belgien) erworben wurden. Ein Wärmeaustauscher wird in den Kreislauf eingebaut, um den Abbau des Produkts durch Wärme zu vermeiden. Die Temperatur des MPL zwischen dem Zulauf und dem Ablauf der Flußzelle wird zwischen +4°C und 30°C gehalten und die Differenz der Temperatur zwischen dem Zulauf und dem Ablauf wird unter 20°C gehalten. Wärme kann auch entzogen werden, wenn das Material die Apparatur durchfließt.
Die verwendete Apparatur ist schematisch in 1 dargestellt.
2.1. Beschallung
Das MPL-Pulver (50 bis 500 mg) wird in WFI zu einer Konzentration zwischen 1 und 2 mg pro ml suspendiert.
Die MPL-Suspension wird (unter Rühren) kontinuierlich durch einen Beschallungskreislauf gepumpt (s. 1), mit einer Flußrate zwischen 50 und 100 ml pro Minute, um die Gleichgewichtstemperatur des Systems zu erreichen, die zwischen +4 und +15°C liegt.
Das Eigenfrequenz-Spektrum der Beschallungsspitze wird bei der Konfiguration des Systems (Leistung, Flußzelle, Flüssigkeits-Flußrate, T°) gemäß den Anweisungen des Herstellers für die Anlage eingestellt. Zuvor ermittelte Grenzwerte werden zwischen 19000 Hertz und 21000 Hertz für den 20,000 Hertz-Überträger festgesetzt.
Der Generator ermöglicht die Steuerung des optimalen Wirkungsgrades der Beschallung (mehr Energieübertragung bei weniger Wärme) in einem bestimmten Zeitabstand.
Die Temperatur wird während des Vorgangs unter 30°C gehalten, um den MPL-Abbau zu vermeiden.
Der Vorgang ist beendet, sobald die Teilchengröße auf unter 100 nm verringert wurde und die Lösung optisch klar ist. Während des Beschallungsvorgangs werden Proben entnommen für die Beurteilung der Teilchengröße mit Hilfe der der Photonkorrelationsspektroskopie (dynamisches Lichtstreu-Verfahren) unter Verwendung eines Malvern Zetasizer Typ 3 ebenso wie in Beispiel 1. Die Gesamtverweildauer der Flüssigkeit in der Beschallungsflußzelle wird so berechnet, daß sie 2.5–3.5 Minuten beträgt (s. Tab. 1), unter Verwendung einer Flußzelle mit 20 ml Kapazität und einer Rezirkulationsflußrate von 50 ml/min. Diese Flußrate ergibt eine mittlere Verweildauer von 25 Sekunden pro Zyklus, wobei im Normalfall weniger als 10 Zyklen benötigt werden, um die gewünschte Wirkung, MPL als kleine Teilchen, zu erzielen.
2.2. Sterilisationsvorgang
Das so erhaltene "solubilisierte" MPL wird durch Einweg-Filtration über eine hydrophile PVDF 0.22 mcm-Membran sterilisiert. Der beobachtete Druck liegt gewöhnlich unter 1 bar. Mühelos lassen sich mindestens 25 mg des "solubilisierten" MPL pro Quadratzentimeter mit einer Ausbeute von über 85% verarbeiten.
2.3. Lagerung/Stabilität
Steriles "solubilisiertes" MPL wird bei +2 bis +8°C aufbewahrt. Stabilitätsdaten (Malvern) zeigten keine signifikante Änderung der Teilchengröße nach 6-monatiger Lagerung (s. Tab. 2).
Beispiel 3: Hepatitis B-Impfstoff Zubereitung
MPL (Teilchengröße unter 100 nm) erhielt man wie in Beispiel 1 beschrieben. Aluminiumhydroxid wurde bei Superfos (Alhydrogel) erworben.
Das MPL wurde in Wasser für Injektion durch Beschallung in einem Wasserbad zu einer von 0.2 bis 1 mg/ml variierenden Konzentration resuspendiert, bis eine Teilchengröße zwischen 80 und 500 nm erreicht war, wie mit Hilfe des Photokorrelationslichtstreuverfahrens gemessen wurde.
1 bis 20 μg HBsAg (S-Antigen wie in Engerix B), in einer Konzentration von 1 mg/ml in Phosphatpufferlösung, wird 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter Schütteln an 30 bis 100 μg Aluminiumhydroxid (Lösung von 10.38 mg/ml Al⁺⁺⁺) adsorbiert. Zu dieser Lösung werden dann 30 bis 50 μg MPL (Lösung 1 mg/ml) gegeben. Volumen und Osmolarität werden mit Wasser für Injektion und 5× konzentriertem Phosphatpuffer auf 600 μl eingestellt. Die Lösung wird bei Raumtemperatur 1 Stunde lang inkubiert und bis zur Verwendung bei 4°C gehalten. Die Reifung der Zubereitung findet während der Lagerung statt. Dies stellt 10 Injektionsdosen für Testversuche an Mäusen dar.
Beispiel 4: Hepatitis A-Impfstoff-Zubereitung
MPL (Teilchengröße unter 100 nm) erhielt man wie in Beispiel 1 beschrieben. Aluminiumhydroxid wurde bei Supervos (Alhydrogel) erworben.
HAV (360 bis 22 EU pro Dosis) wird an 10% der Aluminiumhydroxid-Endkonzentration (0.5 mg/ml) präadsorbiert. Das MPL (12.5 bis 100 μg pro Dosis) wird der Lösung hinzugefügt.
Das verbleibende Aluminiumhydroxid wird der Lösung hinzugefügt und diese 1 Stunde lang bei Raumtemperatur belassen. Die Volumina werden mit Phosphatpuffer (10 mM Phosphat, 150 mM NaCl) eingestellt und die fertige Zubereitung wird dann bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 5: Vergleich der Adjuvans-Wirksamkeit eines rekombinanten Herpes-simplex-Glykoprotein D-Untereinheit-Impfstoffs
5.1. In dieser Studie wurde an prophylaktischen und therapeutischen Meerschweinchen-Modellen die Fähigkeit verschiedener Al(OH)₃-MPL-Zubereitungen zur Verbesserung des Immunschutzes durch ein verkürztes Glykoprotein D (rgD₂t) des Herpes-simplex-Virus-Typ2 (HSV2) beurteilt. Immunogenitätsstudien wurden ebenfalls an Primaten durchgeführt. Ziel dieser Experimente war es, den Einfluß der Größe von 3-de-O-acylierten Monophosphoryl-Lipid A-(MPL)-Teilchen auf die Immunogenität und die schützende Wirksamkeit von rgD₂t-Al(OH)₃-MPL-Zubereitungen in Nagern und Primaten zu untersuchen. Drei unterschiedliche Al(OH)₃-MPL-Zubereitungen mit MPL geringer Größe wurden untersucht:
Al(OH)₃-MPL, 100 nm (wie zuvor beschrieben)
Al(OH)₃-MPL, 100 nm, mit Sorbit
Al(OH)₃-MPL, 100 nm, mit Tween.
5.2. Antigen-Adjuvans-Herstellungen und Immunisierungszeitpläne
5.2.1. Antigen-Zubereitungen
Aluminiumhydroxid (Al(OH)₃) wurde bei Superfos (Alhydrogel Superfos, Dänemark) erworben. MPL wurde bei Ribi Immunochem Research Inc. erworben.
5.2.1.1. rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-TEA
MPL wurde durch Beschallung in einem Wasserbad resuspendiert, so daß sich Größen ergaben, die 200 bis 600 nm umfaßten. Die Präparation wurde gemäß der Patentanmeldung WO92/16231 hergestellt und wurde bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Eine Dosis enthielt 5 μg rgD₂t, 0.5 mg Al(OH)₃ und 50 μg MPL.
5.2.1.2. rgD₂t/Al(OH)₃/MPL, 100 nm
MPL (Teilchengröße unter 100 nm) erhielt man wie in Beispiel 1 beschrieben. rgD₂t wurde an Aluminiumhydroxid adsorbiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. MPL wurde der Lösung in der erforderlichen Konzentration hinzugefügt und weiter 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Präparation wurde mit PBS vervollständigt, so daß eine Endkonzentration von 10 mM PO₄, 150 mM NaCl erreicht würde. Die fertige Zubereitung wurde weitere 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Eine Dosis enthielt 5 μg rgD₂t, 0.5 mg Al(OH)₃ und 50 μg MPL.
5.2.1.3. rgD₂t/Al(OH)₃/MPL, 100 nm; Sorbit
MPL wurde hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben. rgD₂t wurde an Aluminiumhydroxid adsorbiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde eine 50%ige Sorbit-Lösung hinzugefügt, so daß eine Endkonzentration von 5% erreicht wurde. Dann wurde eine 10 mM Tris-Lösung hinzugefügt, um das gewünschte Endvolumen herzustellen, und die Lösung dann unter Schütteln 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert.
Die Zubereitung wurde bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Eine Dosis enthielt 5 μg rgD₂t, 0.5 mg Al(OH)₃ und 50 μg MPL.
5.2.1.4. rgD₂t/Al(OH)₃/MPL, 100 nm; Tween
MPL wurde hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben. Um die MPL-Größe von 100 nm aufrecht zu erhalten, wurde der Lösung Tween 80 in einer Konzentration hinzugefügt, die in der fertigen Zubereitung 0.01% ergab. Die Zubereitung wird dann hergestellt wie vorstehend in Zubereitung 5.2.1.3 beschrieben.
Eine Dosis enthielt 5 μg rgD₂t, 0.5 mg Al(OH)₃ und 50 μg MPL.
5.3. Meerschweinchen-Prophylaxe-Experiment
In diesen Experimenten wurden Gruppen von Meerschweinchen an den Tagen 0 und 28 mit 5 μg rgD₂t in zwei unterschiedlichen Aluminiumhydroxid-MPL-Zubereitungen geimpft.
Die Immunisierung erfolgte in einer 0.5 ml Dosis subkutan. Einen Monat nach der zweiten Impfung wurden die Meerschweinchen intravaginal 10⁵ pfu des HSV2-Stamms MS ausgesetzt. Sie wurden täglich auf die Entwicklung einer Primär- und Rückfall-HSV2-Erkrankung kontrolliert (Tage 4 bis 39 nach der Exposition).
5.3.1. Meerschweinchen-Therapie-Experimente
In diesen Experimenten wurden Meerschweinchen am Tag 0 10⁵ pfu des HSV2-Stamms MS exponiert. Nach der Genesung von der Primär-Infektion wurden sie täglich hinsichtlich einer Rückfall-Herpes-Erkrankung beurteilt (Tage 13 bis 21). Die Meerschweinchen wurden an den Tagen 21 und 42 mit rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-Impfstoff geimpft. Die Impfstoffe wurden in 0.5 ml Dosen subkutan verabreicht. Die Tiere wurden bis zum Tag ±60 oder ±84 täglich auf Herpes-Läsionen kontrolliert.
5.3.2. Primaten-Immunogenitätsstudien
Die Immunogenität von rgD₂t/Al(OH)₃ kombiniert mit MPL in Sorbit wurde an Afrikanischen Meerkatzen beurteilt. Gruppen von Affen wurden an den Tagen 0 und 28 mit 20 μg rgD₂t und 0.5 mg Al(OH)₃ kombiniert mit 50, 20 oder 5 μg MPL in Sorbit geimpft. Spezifische humorale (ELISA und neutralisierende Titer) und durch Effektorzellen vermittelte (verzögerte Hypersensitivitätsreaktion, delayed type hypersensitivity response: DTH) Immunreaktionen wurden beurteilt. Jede Affengruppe bestand aus 5 Tieren. Die Zubereitungen wurden intramuskulär als 1 ml Dosis verabreicht. Die Herstellung der Zubereitungen wurde durchgeführt wie vorstehend beschrieben. Den Tieren wurde ± alle zwei Wochen zur Antikörperbestimmung Blut abgenommen.
Die DTH-Reaktion wurde 14 Tage nach der zweiten Impfung untersucht. Der Hauttest wird nachstehend beschrieben.
5.4. Meßangaben
Es wurden Tests konzipiert, um die spezifische Antikörperreaktion zu beurteilen, die durch die Impfung mit rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-Zubereitungen ausgelöst wurde (Bestimmung von Anti-rgD₂t-ELISA-Titern und neutralisierenden Anti-HSV2-Titern). Die schützende Wirksamkeit dieser gD₂-Zubereitungen wurde in prophylaktischen und therapeutischen Meerschweinchen-Modellen bewertet. Immunogenitätsstudien wurden ebenfalls an Affen durchgeführt. Spezifische humorale und DTH-Reaktionen wurden beurteilt.
5.4.1. ELISA und neutralisierende Titer
Anti-rgD₂t Antikörpertiter und die neutralisierende Aktivität von Anti-HSV2 wurden gemäß den Methoden bestimmt, die in der Patentanmeldung Nr. WO92/16231 beschrieben sind.
5.4.2. Verzögerte Hypersensitivität (DTH)
Die rgD₂t-Zubereitungen wurden ebenfalls auf ihre Fähigkeit zur Induktion einer T-Zell-spezifischen Immunreaktion in Affen untersucht, was anhand der Induktion verzögerter Hypersensitivitätsreaktionen gemessen wurde.
Afrikanische Meerkatzen wurden an den Tagen 0 und 28 mit 20 μg intramuskulär verabreichter gD₂-Impfstoff-Zubereitung geimpft. Sie wurden 14 Tage nach der zweiten Impfung anhand einer intradermalen Injektion von 15 oder 5 μg rgD₂t in Kochsalzlösung am Bauch einem Hauttest unterzogen. Die Injektionsstelle wurde 24 und 48 Stunden später im Hinblick auf Erythem und Verhärtung untersucht und die Größe dieser lokalen Reaktionen gemessen.
5.4.3. Meerschweinchen-Intravaginal-Expositionsmodell
Das Meerschweinchen-Modell für genitale HSV-Infektion wurde von L. Stanberry et al. beschrieben (J. of Infectious Diseases (1982), 146: 397–403, Intervirology (1985), 24: 226–231). In Kürze: Bei prophylaktischen Experimenten wurden die Meerschweinchen einen Monat nach der letzten Impfung intravaginal 10⁵ pfu des HSV2-Stamms MS ausgesetzt. Der klinische Verlauf der Primär-Erkrankung wurde durch tägliche Beobachtung von Auftreten und Schwere genitaler Hautläsionen während des Zeitraums von Tag 4 bis 12 nach der Exposition kontrolliert. Die Tiere wurden dann von Tag 13 bis 39 täglich auf Anzeichen von Rückfall-Herpes-Läsionen hin überprüft. Bei therapeutischen Experimenten wurden die Meerschweinchen an Tag 0 10⁵ pfu des HSV2-Stamms MS ausgesetzt. Nach der Genesung von der Primär-Erkrankung wurden sie täglich hinsichtlich einer Rückfall-Herpes-Erkrankung beurteilt (Tag 13 bis 21) und dann gemäß ihrer Primär- und Rückfall-Werte zufallsverteilt (was eine vergleichbare Verteilung der Tiere mit milder bis schwerer Infektion in jeder Gruppe lieferte), die dann entweder keine Behandlung oder eine Impfung erhielten. Die Impfstoffe wurden an den Tagen 20 und 41 nach der Exposition verabreicht. Der Verlauf der Rückfall-Erkrankung wurde im allgemeinen bis zum ±70. Tag nach der Exposition beobachtet.
Die Herpes-Läsionen wurden anhand einer Läsionswertskala von 0 bis 32 quantifiziert.
Bewertungssystem
Klinische Meßangaben
Primärinfektion

– Schwere der Läsion = Summe der täglichen Bewertungszahlen für die Tage 4 bis 12 nach der Infektion. Die Schwere der Läsion wird ausgedrückt als arithmetisches Mittel ±SD und ebenso als Median (eher geeignet für einen nicht-parametrischen Test)
– Primärinfektionsvorkommnisse = % der Tiere, die eine maximale Läsionsbewertungszahl von 0, 0.5, 1, 2, 4, 8 oder 16 (selten 32) erhielten.

Primärinfektionsindex = Σi(max.Punktzahl i) × (Vorkommnis%) mit i = 0, 0.5, 2, 4, 8 oder 16.
Rückfall-Erkrankung

– Rückfalltageszahl = Anzahl der Rückfalltage für die Tage 13 bis 39 nach der Infektion. Einem Rückfall geht ein Tag ohne Läsionen voraus und folgt ein Tag ohne Läsionen, der Rückfall ist charakterisiert durch mindestens zwei Tage mit Erythem und einen Tag mit einem oder mehreren Bläschen. Rückfalltageszahlen werden ausgedrückt als arithmetisches Mittel ±SD und Mittelwerte.
– Schwere des Rückfalls = Summe der täglichen Werte für die Tage 13 bis 39 nach der Infektion. Ergebnisse werden ausgedrückt als arithmetische Mittel ±SD und Mittelwerte.

5.5. Ergebnisse
Die schützende Wirksamkeit unterschiedlicher rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-Zubereitungen wurde in prophylaktischen und therapeutischen Experimenten an Meerschweinchen verglichen.
Immunogenitätsstudien wurden ebenso an Primaten durchgeführt. Ziel dieser Experimente war es, die Immunogenität und schützende Wirksamkeit von rgD₂t/Al(OH)₃ kombiniert mit unterschiedlichen MPL-Teilchengrößen zu vergleichen.
5.5.1. Prophylaktische Experimente
Es wurden zwei Experimente durchgeführt, um das Potential unterschiedlicher rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-Impfstoffe zu beurteilen, vor einer Primär- und Rückfall-HSV2-Erkrankung Schutz zu bieten, wenn sie Meerschweinchen vor intravaginaler viraler Impfung verabreicht wurden.
Experiment 1: MPL, 100 nm; Sorbit im Vergleich mit MPL-TEA
Eine Gruppe weiblicher Hartley-Meerschweinchen (200–250 g) wurde an den Tagen 0 und 28 immunisiert mit 5 μg rgD₂t/Al(OH)₃ kombiniert mit kleinen MPL-Teilchen (100 nm; MPL in Sorbit) oder mit größeren MPL-Teilchen (MPL in TEA). Kontrolltieren wurde nach dem gleichen Protokoll Adjuvans allein injiziert oder sie blieben unbehandelt. Den Tieren wurde 14 und 28 Tage nach der zweiten Impfung zur Antikörper-Bestimmung mit Hilfe von ELISA und Neutralisierungstestreaktionen Blut abgenommen. Sie wurden 29 Tage nach der zweiten Impfung intravaginal 10⁵ pfu des HSV2-Stamms MS ausgesetzt. Nach der Exposition wurden die Meerschweinchen täglich auf klinische Symptome einer akuten Infektion (Tage 4 bis 12 nach der Exposition) und auf Anzeichen für eine Rückfall-Herpes-Erkrankung (Tage 13 bis 39 nach der Exposition) überprüft.
a) Induktion der humoralen Immunität
Wie in Tabelle 3 gezeigt, wurden höhere ELISA- und Neutralisierungstiter induziert, wenn in der rgD₂t/Al(OH)₃-Zubereitung kleine MPL-Teilchen verwendet wurden.
b) Auswirkung der Impfung auf die Primär-HSV2-Infektion (Tabelle 3)
Im Vergleich zur Kontrollgruppe, die infiziert wurde und eine akute Primärinfektion erlitt, zeigten beide geimpften Gruppen eine signifikant verminderte Schwere der Läsion (p < 0.00005). Eine signifikant niedrigere Hautläsionswahrscheinlichkeit wurde in der mit rgD₂t/Al(OH)₃/MPL, 100 nm geimpften Gruppe beobachtet (p < 0.06).
c) Auswirkung der Impfung auf eine Rückfall-Herpes-Erkrankung
Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargestellt. Im Vergleich zu den Kontrollen waren beide Impfstoffe in der Lage, die Entwicklung einer Rückfall-Herpes-Erkrankung zu ändern, wie anhand der Verringerung der Anzahl von Rückfällen gemessen wurde (p < 0.02 für rgD₂t/Al(OH)₃/MPL, 100 nm).
d) Schlußfolgerungen
Beide Zubereitungen waren in der Lage, signifikanten Schutz vor Primärinfektion zu bieten und Krankheitsrückfälle zu verringern. Diese Ergebnisse zeigen, daß die rgD₂t/Al(OH)₃-Zubereitung mit den kleinen MPL-Teilchen eine sehr starke prophylaktische Wirksamkeit hat.
Experiment 2: Wirksamkeit von Al(OH)₃/MPL, 100 nm
Hartley-Meerschweinchen (200–250 g) wurden an den Tagen 0 und 28 mit 5 μg gD₂, das mit Al(OH)₃/MPL, 100 nm zubereitet wurde, immunisiert. Die Immunisierungen wurden subkutan in einer 0.5 ml Dosis verabreicht. In der Al(OH)₃/MPL-Zubereitung wurde eine Dosis von 50 μg MPL verwendet. Kontrolltieren wurde nach dem gleichen Protokoll Adjuvans allein injiziert oder sie blieben unbehandelt. Den Tieren wurde 14 und 28 Tage nach der zweiten Impfung zur Antikörper-Bestimmung mit Hilfe von ELISA und Neutralisierungstestreaktionen Blut abgenommen. Die Meerschweinchen wurden 29 Tage nach der zweiten Impfung intravaginal 10⁵ pfu des HSV2-Stamms MS ausgesetzt.
a) Induktion humoraler Immunität
Wie in Tabelle 3 gezeigt, produzierte die geimpfte Gruppe gute ELISA- und Neutralisierungstiter. Die Kontrollgruppe entwickelte keine nachweisbare Antikörperreaktion.
b) Auswirkung der Impfung auf die Primär-HSV2-Infektion (Tabelle 3)
Im Vergleich zur Kontrollgruppe, die infiziert wurde und eine akute Primärinfektion erlitt, zeigte die geimpfte Gruppe eine signifikant verminderte Läsionsschwere (p < 0.00005) und -wahrscheinlichkeit (p < 0.002). Es gab bei keinem der geimpften Meerschweinchen Anzeichen für externe Hautläsionen.
e) Auswirkung der Impfung auf die Rückfall-HSV2-Erkrankung (Tabelle 4)
Im Vergleich zur Kontrollgruppe war der rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-Impfstoff in der Lage, die Entwicklung einer Rückfall-Herpes-Erkrankung zu ändern, was man anhand _Signifikanter Verringerung der Schwere von Rückfall-Ereignissen (p < 0.00005) und des Auftretens von Rückfall-Ereignissen (p < 0.01) messen konnte.
d) Schlußfolgerungen
rgD₂t/Al(OH)₃ kombiniert mit kleinen MPL-Teilchen bietet einen sehr wirkungsvollen Schutz gegen Primär- und Rückfall-HSV2-Infektion in Meerschweinchen.
Aus den obigen Experimenten konnte man schließen, daß Zubereitungen mit kleinem. MPL und Al(OH)₃, die man nach zwei unterschiedlichen Strategien erhielt, eine mindestens so starke prophylaktische Reaktion auslösen wie Zubereitungen mit großem MPL und Al(OH)₃. Zusätzlich hat kleines MPL den Vorteil, daß es vor der Verwendung mühelos sterilisiert werden kann.
5.5.2. Therapeutische Experimente
Ziel dieser Experimente war es, das therapeutische Potential unterschiedlicher rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-Zubereitungen im Zusammenhang mit dem Verlauf von Rückfall-HSV2-Erkrankungen in Meerschweinchen mit bestehender HSV2-Infektion zu vergleichen.
Die Meerschweinchen wurden an Tag 0 intravaginal mit 10⁵ pfu des HSV2-Stamms MS infiziert. Sie wurden täglich hinsichtlich klinischer Symptome einer akuten Infektion (Tage 4 bis 12) sowie auf Anzeichen einer Rückfall-Herpes-Erkrankung (Tage 13 bis 20) kontrolliert. Die Tiere wurden entsprechend ihrer Primär- und Rückfallwerte auf verschiedene experimentelle Gruppen zufallsverteilt, so daß eine vergleichbare Verteilung von Tieren mit milder bis schwerer Infektion in jeder Gruppe geschaffen wurde. Meerschweinchen ohne Anzeichen klinischer Infektionssymptome wurden nicht in die Versuchsreihe aufgenommen. Die Impfstoffe wurden an den Tagen 21 und 42 nach der Exposition subkutan verabreicht.
Die therapeutische Wirksamkeit von rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-Zubereitungen wurde in drei unterschiedlichen Experimenten beurteilt.
Experiment 1: Wirksamkeit von rgD₂t/Al(OH)₃ kombiniert mit großen MPL-Teilchen (MPL in TEA)
Meerschweinchen, die gerade einen Rückfall erlitten, wurden zufallsverteilt, und erhielten dann entweder 20 μg rgD₂t/Al(OH)₃ kombiniert mit großen MPL-Teilchen (MPL-TEA) oder Adjuvans allein. Die Impfstoffe wurden an den Tagen 21 und 42 nach der Exposition verabreicht. Der Verlauf der Rückfallerkrankungen wurde bis zum Tag 84 beobachtet.
Wie in Tabelle 3 gezeigt, war die rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-TEA-Zubereitung beim Zurückdrängen einer bestehenden (ongoing) Rückfallerkrankung nicht wirksam.
Experiment 2: Wirksamkeit von rgD₂t/Al(OH)₃/MPL, 100 nm
Zwei Gruppen von Meerschweinchen wurden entweder mit 20 μg rgD₂t/Al(OH)₃ kombiniert mit kleinen MPL-Teilchen (MPL, 100 nm) geimpft oder blieben unbehandelt.
Die Impfungen wurden an den Tagen 20 und 41 nach der Exposition verabreicht. Die Rückfallerkrankung wurde bis zum Tag 69 verfolgt.
Wie in Tabelle 5 gezeigt, änderte die Impfung mit rgD₂t/Al(OH)₃/MPL, 100 nm-Impfstoff Rückfälle bei einer bestehenden HSV2-Erkrankung im Vergleich zur Kontrollgruppe, indem sie signifikant die Schwere des Rückfalls (–39%, p < 0.05) und die Rückfalltageszahl (–28%, p < 0.1) herabsetzte, was im Gegensatz zu den Daten in Experiment 1 steht, wo große MPL-Teilchen verwendet wurden.
Experiment 3: Relative Wirksamkeit von Al(OH)₃ kombiniert mit kleinen MPL-Teilchen
In diesem Experiment wurde eine dritte Strategie verwendet, um kleines MPL zu erhalten: Zusatz von Tween, z. B. Tween 80.
Die experimentellen Gruppen waren wie folgt:
Gruppe 1 (n = 15): 20 μg rgD₂t/Al(OH)₃/MPL, 100 nm, mit Tween
Gruppe 2 (n = 15): 20 μg rgD₂t/Al(OH)₃/MPL, 100 nm, mit Sorbit
Gruppe 3 (n = 16): Kontrollen
Die Kontrollen wurden entweder nicht behandelt oder mit Al(OH)₃/MPL allein geimpft.
Die Impfstoffe wurden an den Tagen 21 und 42 nach der Exposition verabreicht. Der Verlauf der Rückfallerkrankungen wurde bis zum Tag 60 nach der Exposition beobachtet.
Die Ergebnisse werden in Tabelle 5 gezeigt. Eine klare signifikante therapeutische Wirkung wurde bei Tieren beobachtet, die mit den beiden rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-Zubereitungen geimpft worden waren.
Beide Zubereitungen verminderten signifikant die Schwere des Rückfalls, die Rückfalltageszahl und die Anzahl der Rückfallereignisse.
Schlußfolgerungen
Eine sehr starke therapeutische Wirkung bei einer bestehenden genitalen HSV2-Erkrankung wurde für rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-Zubereitungen beobachtet, die kleine MPL-Teilchen (ca. 100 nm) enthielten. Im Gegensatz dazu wurde diese therapeutische Wirkung nicht beobachtet, wenn dem rgD₂t/Al(OH)₃-Impfstoff große MPL-Teilchen (MPL in TEA) hinzugefügt wurden.
Schließlich zeigen die Ergebnisse an Meerschweinchen klar die prophylaktische Wirksamkeit von rgD₂t/Al(OH)₃/MPL-Zubereitungen, die mit kleinen MPL-Teilchen hergestellt wurden. Diese Zubereitungen haben im Vergleich zu rgD₂t/Al(OH)₃, das mit großen MPL-Teilchen kombiniert ist, ein verbessertes therapeutisches Potential.
5.5.3. Immunogenitätsstudien an Primaten mit rgD₂t/Al(OH)₃ an Kombination mit kleinen MPL-Teilchen
Die Immunogenität von rgD₂t/Al(OH)₃ in Kombination mit kleinen MPL-Teilchen (MPL, 100 nm; Sorbit) wurde an Primaten (Afrikanischen Meerkatzen) beurteilt.
Dosen von 50, 20 oder 5 μg MPL, 100 nm wurden kombiniert mit 20 μg rgD₂t und Al(OH)₃ (0.5 mg). Zum Zeitpunkt 0 und nach einem Monat wurden zwei Impfungen verabreicht. Spezifische humorale (ELISA und neutralisierende Titer) und effektorzellvermittelte (DTH) Immunreaktionen wurden gemessen.
a) Experimentelle Vorgehensweise
Drei Gruppen zu je 5 Afrikanischen Meerkatzen wurden an den Tagen 0 und 28 mit 20 μg gD₂t-Aluminiumhydroxid-Zubereitung geimpft, die 50, 20 oder 5 μg MPL enthielt.
Die Immunisierungen wurden in 1 ml-Dosenintramuskulär verabreicht. Den Tieren wurde alle zwei Wochen zur Antikörperbestimmung mit Hilfe von ELISA (Anti-gD₂t-Titer) und Neutralisierungstestreaktionen Blut abgenommen. Ebenso wurden die drei Impfstoff-Zubereitungen verglichen hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Auslösung einer T-Zell-vermittelten Immunität in vivo, was anhand der Induktion einer spezifischen verzögerten Hypersensitivitäts(DTH)reaktion gemessen wurde. 14 Tage nach der zweiten Impfung wurden aus jeder Gruppe 3 Affen einem Hauttest unterzogen, der mit 15 oder 5 μg gD₂t in Kochsalzlösung am Bauch durchgeführt wurde. Sie wurden zur Kontrolle ebenfalls einem Hauttest mit Kochsalzlösung allein unterzogen. Erythem und Verhärtung an der intradermalen Impfstelle wurden 24 und 48 Stunden später kontrolliert.
b) Ergebnisse
Die serologischen und DTH-Reaktionen sind in Tabelle 6 gezeigt. Die Affengruppen, die mit gD₂t/Al(OH)₃-Zubereitungen mit entweder 50 oder 20 μg MPL geimpft worden waren, produzierten signifikant mehr neutralisierende Antikörper als die Gruppe, die eine 5 μg-Dosis MPL erhalten hatte (p < 0.003 bzw. p < 0.008). Die ELISA- oder Neutralisierungstiter, die in der 50 oder 20 μg MPL-Gruppe gemessen wurden, zeigten keinen signifikanten Unterschied. Ein Zusammenhang zwischen der MPL-Dosis und der Wirkung auf effektorzellvermittelte Immunantwort wurde beobachtet. Eine starke DTH-Reaktion wurde bei der Mehrzahl der Affen (3/4) registriert, die mit 50 oder 20 μg MPL-Zubereitung geimpft worden waren. Im Gegensatz dazu entwickelte nur ein Affe aus der 5 μg MPL-Gruppe eine Hauttest-Reaktion.
c) Schlußfolgerungen
Die vorstehend beschriebenen Daten zeigen, daß die Adjuvans-Wirkung von Al(OH)₃ in Kombination mit kleinen MPL-Teilchen auch in Primaten auftritt und nicht begrenzt ist auf kleine Tierarten. Ein Zusammenhang zwischen MPL-Dosis und der Immunogenität der rgD₂t/Aluminiumhydroxid/MPL-Zubereitung konnte an Affen beobachtet werden, wobei 20 und 50 μg die besten serologischen Reaktionen und DTH-Reaktionen ergeben.
Beispiel 6: Klinische Studien mit Lyme- und Hepatitis B-Impfstoffen und kleinem MPL
6.1. Impfstoff gegen die Lyme-Erkrankung, der ein Fusionsprotein aus NS1(1–81) des Influenza-Virus und OspA, abgeleitet von B. burgdorferi ZS7, umfaßt.
Herstellung der Zubereitungen
6.1.1. NS1-OspA/Aluminiumhydrozid
Nach den in WO93/04175 beschriebenen Vorgehensweisen hergestelltes NS1-OspA wurde an Aluminiumhydroxid adsorbiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Endvolumen wurde mit Phosphatpuffer (PO₄ 10 mM, NaCl 150 mM) eingestellt. Die Zubereitung wurde bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Eine Dosis enthält 10 μg NS1-OspA/500 μg Aluminiumhydroxid.
6.1.2. NS1-OspA/Aluminiumhydroxid/MPL
NS1-OspA wurde an Aluminiumhydroxid adsorbiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. MPL, hergestellt wie zuvor beschrieben, wurde dann der Zubereitung hinzugefügt und wieder 1 Stunde bei Raumtemperatur, inkubiert. Die Zubereitung wurde dann mit Phosphatpuffer (10 mM PO₄, 150 mM NaCl) auf das Endvolumen eingestellt. Die Zubereitung wurde bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Eine Dosis enthält 10 μg NS1-OspA/500 μg Al(OH)₃/50 μg MPL.
6.1.3. Immunisierungszeitplan
Freiwilligen Testpersonen wurde dreimal je 1 ml einer bestimmten Zubereitung an den Tagen 0, 31 und 62 intramuskulär verabreicht. Seren wurden 30 Tage nach I, II und III erhalten.
Sie wurden dann mit Hilfe von ELISA auf Gesamt-IgG, Anti-OspA sowie in einen Hemmtest auf eine LA-2-ähnliche Antikörper-Reaktion untersucht (für LA-2-Mab wurde an Mäusen gezeigt, daß er ein gegen Infektion schützender Antikörper ist).
6.2. HBsAg/MPL-Zubereitungen am Menschen
6.2.1. Herstellung der Zubereitungen
HBsAg 20 μg/Aluminiumhydroxid 500 μg
HBsAg wurde an die gesamte Aluminiumhydroxid-Endmenge adsorbiert und das Endvolumen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PO₄ 10 mM, NaCl 150 mM) auf 1 ml pro Dosis eingestellt. Die Zubereitung wurde bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
6.2.2. HBsAg 20 μg/Aluminiumhydroxid 100 μg
HBsAg wurde zubereitet wie zuvor beschrieben, jedoch nur an 100 μg Al(OH)₃ adsorbiert. Das Endvolumen pro Dosis war 1 ml.
6.2.3. HBsAg 20 μg/Aluminiumhydroxid 100 μg/MPL 50 μg
HBsAg wurde an 100 μg Aluminiumhydroxid adsorbiert und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurde MPL in der entsprechenden Konzentration hinzugefügt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Die Zubereitung wurde dann mit dem geeigneten Puffer auf das Endvolumen eingestellt (1 ml pro Dosis) und bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
6.2.4. Immunisierungszeitplan
Freiwilligen Testpersonen (20 pro Gruppe) wurde 1 ml von je einer der Zubereitungen I. M. injiziert. Seren wurden im Monat 0, 1, 3 und 6 gesammelt. Sie wurden mit Hilfe des im Handel erhältlichen Abbot-Tests auf neutralisierende Antikörper untersucht.
6.3. Ergebnisse
Tabelle 8 zeigt, daß MPL, wenn es in Kombination mit Aluminiumhydroxid und NS1-OspA in Form von 100 nm-Teilchen verwendet wird, höhere Antikörper-Titer hemmender Natur produzieren kann als das Antigen an Aluminiumhydroxid und daß die Kinetik der Serokonversion schneller ist.
Dies zeigt, daß MPL, als kleines Teilchen zubereitet, beim Menschen für ein lösliches Antigen wie NS1-OspA die Adjuvans-Eigenschaften beibehält, die es bei Tieren mit anderen löslichen Antigenen bereits an den Tag legte.
Tabelle 7 zeigt, daß die infolge einer Verringerung der Aluminiumhydroxid-Zubereitungsmenge in Hepatitis B-Zubereitungen verlorengegangene Adjuvans-Wirkung durch Zusatz von MPL in der Form, wie sie in diesem Patent beschrieben wird, wiedergewonnen wird. Das MPL verbessert ebenfalls die Serokonversionsrate.
Beispiel 7: Kombinationsimpfstoff-Zubereitung-Hepatitis A + Hepatitis B
HBsAg wird an 90% der Aluminiumhydroxid-Endmenge (0.5 mg/ml) adsorbiert und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Der pH-Wert wird auf 6.2 eingestellt und die Präparation wird zur Reifung 14 Tage bei Raumtemperatur belassen.
Hepatitis A-Antigen in Form eines inaktivierten Abkömmlings des Stamms HM-175 (wie in Havrix) wird zu 360 bis 22 EU pro Dosis an 10% der Aluminiumhydroxid-Endkonzentration (0.5 mg/ml) adsorbiert. Das verbleibende Aluminiumhydroxid wird dann der Lösung hinzugefügt und 1 Stunde lang unter Rühren bei Raumtemperatur belassen.
Das an Aluminiumhydroxid adsorbierte HAV wird dann der HBsAg-Zubereitung hinzugefügt.
MPL (Teilchengröße weniger als 100 nm) wird der HAV/HsAg-Lösung in einer Endkonzentration von 12.5 bis 100 μg per ml Dosis hinzugefügt, das Volumen wird auf das Dosis-Endvolumen eingestellt und die Zubereitung wird bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 8: Kombinationsimpfstoffe mit zusätzlichen Antigenen
Kombinationsimpfstoffe können hergestellt werden durch Zusatz eines oder mehrerer der gewünschten Antigene zu den Zubereitungen, die vorstehend in Beispiel 2 oder Beispiel 3 oder Beispiel 4 beschrieben wurden.
Beispiel 9: Anstieg der humoralen Immunität und Induktion der Zell-vermittelten Immunität durch Immunisierung von Mäusen mit HBsAg, das mit Aluminiumhydroxid und MPL zubereitet wurde
9.1. Auswirkung von Al(OH)₃ + MPL, auf die Induktion von Anti-HBs-Antikörpern
Balb/c Mäuse wurden auf subkutanem oder intradermalem Weg mit rekombinantem HBsAg immunisiert, das an Al(OH)₃ adsorbiert war, mit MPL als Adjuvans. Die Mäuse wurden zweimal mit HBsAg/Al/MPL-Zubereitungen immunisiert und die Antikörper-Reaktion wurde nach der ersten und zweiten Dosis gemessen. Gesamt-IgG wurde mit Hilfe von ELISA oder dem AUSAB-Kit (Abbott Lab., Ill.) gemessen, wobei der Induktion von Antikörpern des IgG2a-Isotyps besondere Aufmerksamkeit gewidmet wurde, da dieser Isotyp hauptsächlich auf γ-Interferon-Sekretion hin induziert wird. Die Induktion dieses Isotyps spiegelt auf diese Weise indirekt die Aktivierung der zellvermittelten Immunität wider, nämlich der Aktivierung von Th1.
Das Verhältnis HBsAg/MPL wurde ebenso untersucht wie die Größe der MPL-Teilchen.
9.1.1. Experiment I – Auswirkung der MPL (> 500 nm)-Dosis auf die Immunogenität von an Al(OH)₃ adsorbiertem recHBsAg
Gruppen von weiblichen Balb/c-Mäusen wurden auf dem subkutanen Weg 2.5 mcg recHBsAg, das an 50 mcg Al⁺⁺⁺ (als Al(OH)₃) adsorbiert war, sowie steigende Mengen an MPL (3.1 bis 50 mcg) mit einer Teilchengröße von > 500 nm, injiziert. Im Abstand von 2 Wochen wurde den Mäusen zweimal ein Volumen von 100 mcl injiziert. 2 Wochen nach der ersten Injektion wurde ihnen Blut abgenommen (partielle Blutabnahme), ebenso eine Woche nach der Auffrischungsinjektion. Gesamt-Anti-HBs-IgG und spezifisches IgG2a wurden mit Hilfe von ELISA gemessen, wobei recHBsAg als Sondenantigen verwendet wurde. Die Titer wurden als reziproke Werte derjenigen Verdünnung ausgedrückt, die 50% des Maximalwerts entsprach ("mid-point dilution"). Die Ergebnisse zeigen für steigende MPL-Dosen einen Anstieg sowohl des spezifischen IgG als auch des spezifischen IgG2a, besonders für Dosen von 12.5 bis 50 mcg. Die Wirkung ist sowohl bei der Primär- als auch bei der Sekundärreaktion zu sehen und ist besonders deutlich bei IgG2a (bis zu 20-facher Anstieg), was indirekt auf eine Sekretion von γ-Interferon hinweist, die durch die Immunisierung mit MPL ausgelöst wurde.
9.1.2. Experiment II – Vergleich klinischer Chargen von adsorbiertem recHBsAg mit oder ohne MPL (> 500 nm)
3 klinische Chargen von an Al(OH)₃ adsorbiertem recHBsAg wurden hergestellt: Charge DSAH16 enthielt kein MPL und diente als Kontrolle. Die Chargen DSAR501 und 502 wurden in ähnlicher Weise hergestellt (20 mcg von an Al⁺⁺⁺ (als Al(OH)₃)-adsorbiertem recHBsAg, jedoch mit 50 mcg MPL (> 500 nm)).
Die 3 Chargen wurden Gruppen von je 10 Mäusen zweimal im Abstand von 2 Wochen subkutan injiziert (200 mcl mit 2.5 mcg HBsAg, 100 mcg Al⁺⁺⁺ und 6.25 mcg MPL). Den Mäusen wurde an Tag 14 sowie 1 Woche nach der Auffrischungsinjektion Blut abgenommen. Anti-HBs-Antikörper wurden unter Verwendung eines AUSAB-Kits oder eines betriebsinternen ELISAs entweder für IgG oder für IgG2a bestimmt ((!)gemessen). Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Sie zeigen, daß die beiden Chargen mit MPL 2 Wochen nach der ersten Injektion eine sehr signifikante Anti-HBs-Reaktion (12.3 und 41.9 mlU/ml) auslösen, während die Charge ohne MPL nur eine geringfügige Reaktion (0.75 mlU/ml) auslöst. Ebenso ist die Anzahl der reagierenden Testtiere mit MPL höher (9/10 und 9/10 gegenüber 1/10 ohne MPL). Die Wirkung von MPL läßt sich nach der Auffrischungsinjektion bestätigen, da die Titer, die man für die Chargen DSAR501 und 502 erhält, etwa 6-fach höher sind als diejenigen, die man ohne MPL beobachtet.
Dies zeigt, daß, zumindest bei Mäusen, MPL (> 500 nm) sowohl die Kinetik der Anti-HBs-Reaktion verbessern kann als auch das Ausmaß der Anti-HBs-Reaktion.
Diese Ergebnisse wurden bestätigt, wenn nach der Immunisierung mit den Chargen DSAH16 (ohne MPL) und DSAR502 (mit MPL) spezifisches IgG und IgG2a gemessen wurde: Der Anti-HBs-IgG-Titer ist mit MPL 5-fach (Primär-Reaktion) bzw. 3-fach (Sekundär-Reaktion) höher.
Hinsichtlich der IgG2a-Reaktion ist die MPL-Wirkung sogar noch überzeugender, zumindest nach der zweiten Dosis, und zwar insofern, als sie auf eine bevorzugte Induktion von IgG2a hinweist. Dies spiegelt indirekt eine Aktivierung der zellvermittelten Immunität (Sekretion von γ-Interferon) durch die Präparation mit MPL wider.
9.1.3. Experiment III: Auswirkung der MPL(< 100 nm)-Dosis auf die Immunogenität von an Al(OH)₃ adsorbiertem rekombinantem HBsAg
Gruppen von je 10 Mäusen (Balb/c, weiblich, 7 Wochen alt) wurde 1 mcg von an 50 mcg Al⁺⁺⁺ (als Al(OH)₃) adsorbiertem HBsAg in Gegenwart steigender (3.1 bis 25 mcg) MPL (< 100 nm)-Mengen subkutan injiziert. Den Mäusen wurde im Abstand von 2 Wochen zweimal ein Volumen von 200 mcl injiziert. Ihnen wurde 2 Wochen nach der ersten Injektion und 1 Woche nach der Auffrischungsinjektion Blut abgenommen. Die Anti-HBs-Reaktion wurde an gesammelten Seren im ELISA (Gesamt-IgG, IgG und IgG2a) beurteilt. Die Titer wurden ausgedrückt als "mid-point dilution" (reziproker Wert derjenigen Verdünnung, die 50% des höchsten Wertes angibt). Die Ergebnisse zeigen, daß eine so geringe Menge wie 3.1 mcg MPL einen starken Anstieg der Antikörper-Reaktion (sowohl hinsichtlich der Primär- als auch der Sekundär-Reaktion) auslösen kann. Die Reaktion erreicht ein Maximum für 6.25 mcg und fällt danach ab, so daß sie sich, wenn hohe Dosen an MPL (25 mcg) verwendet werden, derjenigen ohne MPL annähert. Der Verlauf der Antikörper-Reaktion ist ähnlich für IgG, IgG2a und Gesamt-Ig. Es steht im Gegensatz zu den Ergebnissen, die man für größeres MPL (> 500 nm) erhielt, und zeigt, daß kleine MPL-Teilchen (< 100 nm) wirksamer sind als größere (> 500 nm) Teilchen (zumindest für die humorale Immunität), da weniger MPL für die maximale Wirkung benötigt wird. Die höchste Aktivität von kleinem MPL wurde in mehreren Experimenten bestätigt.
Wie für größeres MPL (> 500 nm) gezeigt, ist die Adjuvans-Wirkung von MPL für IgG2a stärker als für Gesamt-IgG oder Ig. Beim Maximalwert der Sekundär-Reaktion (6.25 mcg MPL) gibt es einen 25-fachen Anstieg von IgG2a, während der Anstieg von IgG oder Gesamt-Ig 7.6 bzw. 4.3 betrug.
9.2. Induktion zellvermittelter Immunität durch an Al(OH₃) adsorbiertes recHBsAg – Auswirkung von MPL
Wenn die humorale Immunität ausreicht, um vor Hepatitis B zu schützen, so könnte die Induktion zellvermittelter Immunität (CTL, Th1) von besonderer Bedeutung für die Behandlung der Krankheit sein.
Für therapeutische Impfstoffe sind jedoch neue Zubereitungen erforderlich, da Al(OH)₃ zwar in der Lage ist, die humorale Immunität zu verbessern, nicht aber die zellvermittelte Immunität.
Wir haben die Auswirkung von MPL auf die Induktion von Th1-Zellen untersucht, die in der Lage sind, bei Balb/c-Mäusen, die mit an Al(OH)₃ adsorbiertem recHBsAg immunisiert wurden, IL-2 und γ (i. e. gamma)-Interferon zu sezernieren.
9.2.1. Experiment I – Auswirkung von MPL (> 500 nm) auf die Induktion von Th1-Zellen nach der Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit an Al(OH)₃ adsorbiertem recHBsAg
Eine Gruppe von 10 Balb/c-Mäusen (weiblich, 5 Wochen alt) wurde durch Injektion von 30 mcl (10 mcg HBsAg, 15 mcg Al⁺⁺⁺ (als Al(OH)₃) und 15 mcg MPL) in jede Pfote immunisiert.
Ähnlich wurde Kontroll-Mäusen dieselbe Menge an recHBsAg injiziert, entweder gemischt mit FCA (Positivkontrolle) oder adsorbiert an Al(OH)₃ ohne MPL (Negativkontrolle).
Sechs Tage nach der Immunisierung wurden die Mäuse getötet und die poplitealen Lymphknoten entnommen. Die Lymphknoten-Zellen (LNC 2.105/ml) wurden für unterschiedliche Zeiträume in RPMI-Medium mit 5 mcg/ml rec HBsAg, ergänzt durch 1% negatives Mausserum, kultiviert (24 Stunden bis 72 Stunden). Nach Beendigung der Kultur wurde die Menge des ins Medium sezerniertem IL-2, INF-γ und IL-4 bestimmt. IL-2 wurde abgeschätzt anhand seiner Fähigkeit, die Proliferation (beurteilt anhand des Einbaus von ³H-Thymidin) einer IL-2 abhängigen CTL-Linie (VDA2-Zellen) zu stimulieren, wobei der Titer ausgedrückt wurde als Stimulationsindex (SI = eingebaute ³H-Thymidin-Menge in stimulierten Zellen/eingebaute ³H-Thymidin-Menge in unstimulierten Zellen). Die IL-4- und INF-γ-Menge wurde bestimmt unter Verwendung von im Handel erhältlichen ELISA-Kits (Holland Biotechnology für INF-γ und Endogen für IL-4). Die Titer wurden ausgedrückt in pg INF-γ/ml.
Die Ergebnisse zeigen, daß von LNC aus Mäusen, die mit an Al(OH)₃ adsorbiertem HBsAg geimpft worden waren, keine signifikante Menge an IL-2, IL-4 oder INF-γ sezerniert wird. Im Gegenteil, hohe Spiegel von IL-2 (IS = 38 nach 48 Stunden) und eine signifikante Menge an INF-γ werden von LNC aus Mäusen sezerniert, die mit an Al(OH)₃ + MPL adsorbiertem HBsAG immunisiert worden waren. Diese Sekretion ist ähnlich (INF-γ) oder stärker (IL-2) als diejenige, die bei Mäusen beobachtet wird, die mit HBsAg + FCA immunisiert worden waren, auch tritt die in vitro-Sekretion früher auf.
IL-4 ließ sich nach einer Immunisierung mit an Al(OH)₃ adsorbiertem HBsAg auch mit MPL nicht nachweisen.
Dieses Sekretionsprofil zeigt, daß spezifische Th1-Zellen (IL-2, INF-γ) durch die Immunisierung mit an Al(OH)₃ adsorbiertem HBsAg mit MPL, nicht aber ohne MPL, induziert worden waren. Jedoch ließen sich unter diesen Immunisierungsbedingungen keine Th2-Zellen (IL-4) nachweisen.
9.2.2. Experiment II – Auswirkung der MPL(< 100 nm)-Dosis auf die Induktion von Th1-Zellen nach Immunisierung von Balb/c-Mäusen mit an Al(OH)₃ adsorbiertem recHBsAg
Gruppen von 5 Balb/c-Mäusen wurden durch Injektion von 30 mcl (15 mcg von an Al⁺⁺⁺ (als Al(OH)₃) adsorbiertem recHBsAg mit steigenden Mengen an MPL (100 nm, 0 bis 15 mcg) in jede der beiden Pfoten immunisiert.
Sechs Tage nach der Injektion wurden die Mäuse getötet und die poplitealen Lymphknoten-Zellen (LNC) wurden zu 2.106 Zellen/ml in mit 1% negativem Mausserum ergänztem RPMI für verschiedene Zeiträume (24 Stunden bis 96/25) in Gegenwart von 5 mcg/ml recHBsAg kultiviert.
Die IL-2-Sekretion wurde gemessen anhand der Proliferationsstimulation von VDA2-Zellen, wobei die Konzentration an IL-2 als Stimulationsindex (SI) ausgedrückt wird; die Sekretion von INF-γ wurde unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits gemesssen und in pg/ml ausgedrückt.
Es ergab sich, daß die Sekretion von IL-2 dramatisch erhöht wird durch die niedrigere MPL-Dosis (7.5 mcg) und daß man die maximale Wirkung mit 15 mcg MPL erhält.
Die Sekretion von IL-2 ist im allgemeinen nach 24 Stunden von größerer Bedeutung als nach 48 oder 72 Stunden.
Die Sekretion von INF-γ findet nicht statt, wenn HBsAg ohne MPL an Al(OH)₃ adsorbiert wurde. Eine kleine Dosis (7.5 mcg) von MPL induziert eine Sekretion von INF-γ, wobei man die maximale Wirkung wiederum mit 15 mcg MPL erhält. Im Gegensatz zu dem, was bei IL-2 beobachtet wird, ist die Sekretion von INF-γ in der Kultur verzögert und erhöht sich mit der Zeit, bis zu 96 Stunden lang.
Zusammengenommen zeigen diese Daten, daß MPL (weniger als 100 nm) in Kombination mit an Al(OH)₃ adsorbiertem HBsAg ein starker Induktor von Th1 ist. Die Wirksamkeit einer Zubereitung, die an Al(OH)₃ adsorbiertes HBsAg und MPL enthält, auf die Induktion sowohl der humoralen als auch der zellvermittelten Immunität würde an Balb/c-Mäusen untersucht. Die Ergebnisse zeigen, daß MPL die Kinetik der Anti-HBs-Reaktion deutlich verbessert, da sowohl nach der Primär- als auch nach der Sekundär-Immunisierung wesentlich mehr Anti-HBs-Antikörper festgestellt werden. Die Qualität des Anti-HBs wird ebenso verändert und es wurde eine bevorzugte Induktion von IgG2a beobachtet, was indirekt eine Sekretion von INF-γ und auf diese Weise die Induktion einer zellvermittelten Immunität widerspiegelt.
Eine unmittelbare Beurteilung der Induktion von Th1-Zellen durch Zubereitungen mit HBsAg, Al(OH)₃ und MPL zeigt deutlich, daß MPL ein starker Induktor von Th1-Zellen ist, die sowohl IL-2 als auch INF-γ sezernieren. Diese Art von Zubereitung ist demnach bedeutend für die Entwicklung therapeutischer Impfstoffe.
Die besten Ergebnisse wurden bei der Verwendung von MPL mit weniger als 100 nm Teilchengröße erzielt.
Die nachstehenden Tabellen 9–14 sind Tabellen, die die vorstehend beschriebenen Experimente zeigen.
13. Schlußfolgerungen
Die Gesamtheit der Daten legt nahe, daß kleines MPL gegenüber großem MPL in Primaten einschließlich dem Menschen ein verbessertes Immunstimulanz darstellt. Diese Tatsache zusammen mit der Möglichkeit, sterile Chargen in großem Maßstab herzustellen, macht kleines MPL zu einem geeigneten Immunstimulanz für ein Spektrum menschlicher oder tierischer Impfstoffe. Tabelle 1 MPL-Teilchen und Filtrationsausbeute bei Verwendung verschiedener Beschallungsparameter
Tabelle 2 Stabilität der Teilchengröße in einer sterilen MPL-Lösung gemäß Photon-Korrelationsspektroskopie (Malvern) bei einer Konzentration von 1 mg/ml

Tabelle 6 Immunogenität von gD₂t/Aluminiumhydroxid/MPL, 100 nm (Sorbit) bei Primaten Serologische Ergebnisse und DTH Ergebnisse

Tabelle 8 Immunogenität klinischer OspA-Chargen beim Menschen Anti-OspA im LA-2-Hemmtest (ng equiv LA-2/ml) (GMT)

N = 80
10 μg/Dosis
i.m.-Weg

Tabelle 9 Auswirkung steigender Dosen an MPL (> 500 nm) auf die Immunogenität von an Al(OH)₃ adsorbiertem recHBsAg
Tabelle 10 Vergleich von 3 klinischen Chargen mit und ohne MPL AUSAB-Reaktion
Tabelle 11 Vergleich von 2 klinischen Chargen mit und ohne MPL (> 500 nm) Anti-HBs-IgG- und IgG2a-Reaktion

Claims

Impfstoffzusammensetzung, die ein Antigen in Verbindung mit 3-O-deacyliertem Monophosphoryl-Lipid A (3D MPL) und einen geeigneten Träger umfasst, in der die Teilchengröße des 3D-MPL 120 nm nicht übersteigt.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, in der die Teilchengröße des 3-O-deacylierten Monophosphoryl-Lipid A im Bereich von 60 bis 120 nm ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 1, in der die Teilchengröße des 3-O-deacyliertem Monophosphoryl-Lipid A kleiner als 100 nm ist.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in der der Träger Aluminiumhydroxid ist.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in der der Träger eine Öl-in-Wasser-Emulsion oder ein anderes Vehikel auf Lipidbasis ist.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in der das Antigen ein virales Antigen ist.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, in der das Antigen ein Antigen gegen Hepatitis A ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 7, in der das Hepatitis A-Antigen eine Zusammensetzung aus inaktivierten ganzen Zellen ist, die sich vom Stamm HM-175 ableiten.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, in der das Antigen ein Antigen gegen Hepatitis B ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 9, in der das Antigen das Oberflächenantigen von Hepatitis B (HBsAg) oder eine Variante davon umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 10, in der das HBsAg das S-Antigen von HBsAg (226 Aminosäuren) umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 11, in der das HBsAg zusätzlich eine Prä-S-Sequenz umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 9 oder 10, in der das HBsAg ein zusammengesetztes Teilchen der Formel (L*, S) ist, wobei L* ein modifiziertes L-Protein des Hepatitis B-Virus bedeutet, das eine Aminosäuresequenz mit den Resten 12 bis 52, gefolgt von den Resten 133–145, gefolgt von den Resten 175–400 des L-Proteins umfasst, und S das S-Protein von HBsAg bedeutet.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 9 bis 11, die zusätzlich ein Hepatitis A-Antigen umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, die ein oder mehrere Hepatitis-Antigene und mindestens einen weiteren Nicht-Hepatitis-Antigenbestandteil umfasst, der gegen eine(n) oder mehrere der folgenden Krankheiten oder Krankheitserreger Schutz verleiht: Diphtherie, Tetanus, Pertussis, Haemophilus influenzae b (Hib) und Polio.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 15, ausgewählt aus einer DTP (Diphtherie-Tetanus-Pertussis)-HBsAg-Kombination, einer Hib-HBsAg-Kombination, einer DTP-Hib-HbsAg-Kombination und einer IPV (inaktivierter Polioimpfstoff)-DTP-Hib-HBsAg-Kombination.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 15, die zusätzlich ein Hepatitis A-Antigen umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die ein HSV-Glycoprotein D oder ein immunologisches Fragment davon umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 18, wobei das Glycoprotein D ein verkürztes Protein ist.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 19, wobei das verkürzte Protein HSVgD2 ist, dem der C-terminale Verankerungsbereich fehlt.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die HIV gp160 oder ein Derivat davon umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 21, wobei das Derivat von gp160 gp120 ist.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das 3-O-deacylierte Monophosphoryl-Lipid A im Bereich von 10 μg bis 100 μg pro Dosis vorliegt.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23, die zusätzlich entweder Tween 80 oder Sorbit umfasst.
Impfstoffzusammensetzung nach einem der vorhergehenden Ansprüche zur Verwendung in der Medizin.
3-O-deacyliertes Monophosphoryl-Lipid A, wobei die Partikelgröße kleiner als 120 nm ist.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes nach einem der vorhergehenden Ansprüche, das das Mischen des Produkts nach Anspruch 26 mit einem Antigen und einem Träger umfasst.
Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes umfassend deacyliertes Monophosphoryl-Lipid A, umfassend das Suspendieren von 3-O-deacyliertem Monophosphoryl-Lipid A in Wasser und das Beschallen der erhaltenen Suspension bis die Partikelgröße 120 nm nicht überschreitet, das Adsorbieren der 3-O-deacylierten Monophosphoryl-Lipid A-Lösung an Aluminiumhydroxid und das Hinzufügen von Antigen.