CN111615397A - 寨卡疫苗和免疫原性组合物及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本公开涉及具有来自寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株、非人细胞适应性寨卡病毒等)的一种或多种抗原的寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物，及其制造、配制、测试和使用方法。

Description

寨卡疫苗和免疫原性组合物及其使用方法

关于联邦资助研究的声明

本发明是受政府支持，根据卫生与公众服务部(Department of Health andHuman Services)、防备和应对助理部长办公室(Office of the Assistant Secretaryfor Preparedness and Response)、生物医学高级研究与发展管理局(BiomedicalAdvanced Research and Development Authority)的合同号HHSO100201600015C进行的。本发明是在履行与疾病控制和预防中心，即卫生与公众服务部代理的合作研究与开发协议中而产生的。美国政府拥有本发明的某些权利。

发明领域

本公开涉及具有来自寨卡病毒(Zika virus)(例如，寨卡病毒克隆分离株、非人细胞适应性寨卡病毒等)的一种或多种抗原的寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物，及其制造、配制、测试和使用方法。

背景技术

寨卡病毒，是一种与其他蚊媒病毒(例如，黄热病病毒、登革病毒、西尼罗病毒和日本脑炎病毒)一起分类为黄病毒科的黄病毒，自该病毒于2013年引入巴西以来已在半球范围的流行病中迅速蔓延。该病毒已到达中美洲和北美洲，包括美国领土，因此现在威胁到美国大陆。实际上，寨卡病毒株PRVABC59是从2015年曾前往波多黎各旅行的人的血清中分离出来的。该毒株的基因组已进行至少三次测序(参见Lanciotti等人Emerg.Infect.Dis.2016年5月；22(5):933-5和GenBank登录号KU501215.1；GenBank登录号KX087101.3；以及Yun等人Genome Announc.2016年8月18日；4(4)和GenBank登录号ANK57897.1)。

该病毒最初于1947年在乌干达分离，于1952年首次将其与人类疾病联系起来，并在非洲和东南亚已被偶发性地认为是轻度、自限性发热病的原因(Weaver等人(2016)Antiviral Res.130:69-80；Faria等人(2016)Science.352(6283):345-349)。然而，在2007年，北太平洋雅浦岛出现爆发，然后在整个太平洋的岛屿之间传播，2013-2014年在法属波利尼西亚导致广泛爆发，然后蔓延到新喀里多尼亚、库克群岛，最终蔓延到复活节岛。随后，亚洲谱系病毒通过仍未确定的途径转移到西半球(Faria等人(2016)Science.352(6283):345-349)。该病毒可以通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(A.albopictus)并且可能通过赫斯里伊蚊(A.hensilli)和波里尼西亚伊蚊(A.polynieseinsis)在动物中传播(Weaver等人(2016)Antiviral Res.130:69-80)。另外，认为可能存在用于传播该病毒的其他载体，并且该病毒可以通过输血、经胎盘和/或通过性传播而传播。

2015年末，寨卡病毒广泛感染地区的胎儿异常(例如小头畸形)和格林-巴利综合征(GBS)显著增加，使人们警惕寨卡病毒的毒性可能比原来以为的要强得多，这促使世界卫生组织(WHO)宣布国际关注的突发公共卫生事件(PHEIC)(Heymann等人(2016)Lancet 387(10020)：719-21)。虽然寨卡病毒对公众健康构成重大威胁，但目前尚无FDA批准的疫苗或治疗方法，并且控制寨卡病毒的唯一预防措施涉及管理蚊虫种群。

在最近表征重组寨卡病毒以开发潜在疫苗的努力中，鉴定出一种非人细胞适应性寨卡病毒，该病毒在病毒包膜蛋白中的位置330带有突变(Weger-Lucarelli等人(2017)Journal of Virology 91(1)：1-10)。该研究的作者发现寨卡病毒株PRVABC59的全长感染性cDNA克隆物在克隆期间扩增时在遗传上不稳定，并选择分裂病毒基因组以解决观察到的不稳定性，开发并应用双质粒系统。然而，用于开发寨卡疫苗的双质粒系统不太理想。

发明内容

因此，需要开发利用不需要双载体系统的遗传稳定的寨卡病毒的用于治疗和/或预防寨卡病毒感染的疫苗和免疫原性组合物。为了满足上述和其他需要，本公开至少部分涉及在非结构蛋白1(具有野生型包膜蛋白)中带有适应作用的遗传稳定的非人细胞适应性寨卡病毒，允许使用单个病毒/病毒基因组系统进行疫苗生产。本公开还至少部分涉及遗传上同种的和/或已经从一种或多种外源因子纯化的寨卡病毒克隆分离株。因此，本公开提供了可用于治疗和/或预防寨卡病毒感染(例如，在人中)的疫苗和免疫原性组合物，其包括来自带有至少一个非人细胞适应性突变(例如，寨卡病毒非结构蛋白1中的突变)和/或来自寨卡病毒克隆分离株的一种或多种寨卡病毒抗原(例如，来自全灭活寨卡病毒的一种或多种抗原)。

本公开至少部分基于以下的惊人发现，即包含来自非人细胞适应性寨卡病毒的单独来源的克隆病毒群体的一种或多种抗原的高剂量和低剂量疫苗均能够诱导强力免疫反应并提供对寨卡病毒感染的显著保护作用(参见下面的实施例2)。寨卡病毒株的克隆分离还允许：1)从污染因子(例如可以与亲本毒株共同纯化的外源因子)中成功纯化病毒，并且2)产生遗传上同种的病毒群体。而且，本公开至少部分基于以下发现：在蛋白NS1中带有适应性突变的克隆分离寨卡病毒在Vero细胞中生长良好并且可预测地达到高滴度，并且令人惊讶地，该病毒是遗传稳定/遗传上同种的，在病毒包膜蛋白中没有任何可检测到的突变(参见下文实施例1和2)。虽然可能已经在3个公开的寨卡病毒株PRVABC59序列中的1个序列的基因组测序分析中观察到寨卡病毒非结构蛋白1的类似突变(Yun等人GenomeAnnounc.2016Aug 18；4(4))，但是该参考文献无法教导或暗示NS1中的突变可以改善病毒的稳定性；无法教导或暗示带有该突变的病毒可用于开发抗寨卡病毒的有效疫苗；并且无法教导或暗示此类疫苗在低剂量和高剂量下使用时都可以有效诱导强力免疫反应并提供对寨卡病毒感染的显著保护作用。因此，不希望受理论束缚，本公开的发明人已经确定蛋白NS1中的适应性突变似乎会增强寨卡病毒内的遗传稳定性，从而产生增加/增强的复制效率。此外，在蛋白NS1中带有适应性突变的寨卡毒株能够传代多次，而不会发展其他突变。此类稳定的寨卡病毒株作为原始毒种(MVS)或源自MVS的后续种子，对于疫苗生产和制造而言是有利的，因为降低了原始毒种发展不良突变的风险。而且，不希望受理论束缚，本公开的寨卡毒株的蛋白NS1中的适应性突变也可以减少或以其他方式抑制不良突变，诸如寨卡病毒株的包膜蛋白E(Env)内的突变的发生。

因此，本公开的某些方面涉及一种含有来自寨卡病毒的一种或多种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒含有至少一个非人细胞适应性突变。在一些实施方案中，所述至少一个非人细胞适应性突变是在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中。在一些实施方案中，所述至少一个适应性突变发生在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置。在一些实施方案中，所述至少一个适应性突变是Trp98Gly突变。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，与缺乏所述至少一个适应性突变的寨卡病毒相比，所述至少一个适应性突变增强了遗传稳定性。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，与缺乏所述至少一个适应性突变的寨卡病毒相比，所述至少一个适应性突变增强了病毒复制。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒在包膜蛋白E(Env)中不含突变。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述非人细胞是哺乳动物细胞。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述非人细胞是猴细胞。在一些实施方案中，所述猴细胞来自Vero细胞系。在一些实施方案中，所述Vero细胞系是WHO Vero10-87细胞系。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述寨卡病毒是非洲谱系病毒或亚洲谱系病毒。在一些实施方案中，所述寨卡病毒是亚洲谱系病毒。在一些实施方案中，所述寨卡病毒来自毒株PRVABC59。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物是纯化的抗原疫苗或免疫原性组合物、亚单位疫苗或免疫原性组合物、灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物是灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含纯化的灭活全寨卡病毒。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含突变的纯化的灭活全寨卡病毒。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ IDNO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含与毒株PRVABC59的不同之处在于SEQ IDNO：1的位置98的Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述病毒是化学灭活的。在一些实施方案中，所述病毒用洗涤剂、福尔马林、过氧化氢、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(binary ethylamine,BEI)、乙酰乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种化学灭活。在一些实施方案中，所述病毒用福尔马林化学灭活。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物还含有佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂选自铝盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和/或不完全弗氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，所述佐剂是铝盐。在一些实施方案中，所述佐剂选自由明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和铝胶85(Alhydrogel 85)组成的组。在一些实施方案中，所述一种或多种抗原中的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到所述佐剂上。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物是低剂量的疫苗或免疫原性组合物(例如，含有约1μg至约5μg抗原)。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物是高剂量的疫苗或免疫原性组合物(例如，含有约10μg抗原)。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物含有约0.1μg至约25μg的所述一种或多种抗原。在某些此类实施方案中，抗原是纯化的灭活全病毒，诸如具有突变的寨卡病毒，所述突变是如本文所述，在SEQID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置，色氨酸取代为甘氨酸。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。在某些此类实施方案中，寨卡病毒是空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物含有约0.1μg寨卡病毒或Env至约100μg寨卡病毒或Env。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物是无佐剂的。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述寨卡病毒是克隆分离株。在一些实施方案中，所述克隆分离株基本上不含一种或多种外源因子(例如，不含可以与亲本毒株共同纯化的一种或多种外源因子)。

本公开的其他方面涉及一种疫苗，其包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ IDNO：1的位置98相对应的位置具有突变的寨卡病毒。在一些实施方案中，所述疫苗包含在SEQID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，所述疫苗包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。在某些此类实施方案中，寨卡病毒是空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。

本公开的其他方面涉及一种疫苗或免疫原性组合物，其包含：a)铝盐佐剂；b)纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒含有非人细胞适应性突变，并且其中所述非人细胞适应性突变是在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的Trp98Gly突变。

本公开的其他方面涉及一种治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染的方法，其包括向受试者施用治疗有效量的本文所述的任何疫苗或免疫原性组合物。

本公开的其他方面涉及一种诱导有需要的受试者的免疫反应的方法，其包括向受试者施用免疫原性量的本文所述的任何疫苗或免疫原性组合物。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者已妊娠或准备妊娠。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物的施用在受试者中诱导保护性免疫反应。在一些实施方案中，在所述受试者中诱导的所述保护性免疫反应强于在施用了下述疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的保护性免疫反应，所述疫苗或免疫原性组合物含有来自缺乏所述至少一个非人细胞适应性突变的寨卡病毒的一种或多种抗原。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述受试者中诱导产生针对寨卡病毒的中和抗体。在一些实施方案中，在所述受试者中产生的中和抗体的浓度高于在施用了下述疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中产生的中和抗体的浓度，所述疫苗或免疫原性组合物包含来自缺乏所述至少一个非人细胞适应性突变的寨卡病毒的一种或多种抗原。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物通过选自以下的途径施用：皮下施用、经皮施用、真皮内施用、真皮下施用、肌内施用、经口施用、鼻内施用、经颊施用、腹膜内施用、阴道内施用、肛门施用和/或颅内施用。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物施用一次或多次。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物以第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用。在一些实施方案中，所述第二次(加强)施用在所述第一次(初免)施用后至少28天施用。

本公开的其他方面涉及一种灭活寨卡病毒制剂的方法，其包括(a)从一种或多种非人细胞中分离出所述寨卡病毒制剂，其中所述细胞用于产生所述病毒制剂，并且其中所述寨卡病毒含有至少一个非人细胞适应性突变；以及(b)用有效量的福尔马林处理所述病毒制剂。在一些实施方案中，所述方法还包括(c)用焦亚硫酸钠中和所述福尔马林处理过的病毒制剂。在一些实施方案中，在福尔马林处理后至少五天、至少七天、至少九天、至少11天或至少14天中和所述病毒制剂。在一些实施方案中，所述方法还包括(d)纯化经中和的病毒制剂。在一些实施方案中，所述经中和的病毒制剂通过选自错流过滤(CFF)、多元层析、尺寸排阻色谱法、阳离子交换色谱法和/或阴离子交换色谱法的工艺纯化。

本公开的其他方面涉及一种灭活寨卡病毒制剂的方法，其包括(a)从一种或多种非人细胞中分离出所述寨卡病毒制剂，其中所述细胞用于产生所述病毒制剂，并且其中所述寨卡病毒在SEQ ID NO：1的位置98或在与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含突变；以及(b)用有效量的福尔马林处理所述病毒制剂。在一些实施方案中，所述方法还包括(c)用焦亚硫酸钠中和所述福尔马林处理过的病毒制剂。在一些实施方案中，在福尔马林处理后至少五天、至少七天、至少九天、至少11天或至少14天中和所述病毒制剂。在一些实施方案中，所述方法还包括(d)纯化经中和的病毒制剂。在一些实施方案中，所述经中和的病毒制剂通过选自错流过滤(CFF)、多元层析、尺寸排阻色谱法、阳离子交换色谱法和/或阴离子交换色谱法的工艺纯化。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，将所述病毒制剂与佐剂混合。在一些实施方案中，所述佐剂选自铝盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和/或不完全弗氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，所述佐剂是铝盐。在一些实施方案中，所述佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和/或铝胶85。在一些实施方案中，所述病毒制剂中一种或多种抗原中的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到所述佐剂上。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述至少一个非人细胞适应性突变是在寨卡病毒NS1中。在一些实施方案中，所述至少一个适应性突变发生在SEQ IDNO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置。在一些实施方案中，所述至少一个适应性突变是Trp98Gly突变。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，与缺乏所述至少一个适应性突变的寨卡病毒相比，所述至少一个适应性突变增强了遗传稳定性。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，与缺乏所述至少一个适应性突变的寨卡病毒相比，所述至少一个适应性突变增强了病毒复制。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒在包膜蛋白E(Env)中不含突变。

本公开的其他方面涉及一种纯化寨卡病毒的方法，其包括以下步骤：(a)为多个细胞接种含有寨卡病毒群的接种物，并且(b)通过空斑纯化从所述经接种的细胞中的一个或多个获得寨卡病毒克隆分离株。在一些实施方案中，所述细胞是非人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，所述细胞是蚊细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是猴细胞。在一些实施方案中，所述猴细胞来自Vero细胞系。在一些实施方案中，所述Vero细胞系是WHO Vero 10-87细胞系。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述寨卡病毒群是异种的。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述寨卡病毒群包含寨卡病毒临床分离株。在一些实施方案中，所述寨卡病毒临床分离株来自毒株PRVABC59。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述寨卡病毒群包括先前已经在细胞培养物中传代一次或多次的寨卡病毒。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述接种物包含人血清。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述接种物包含一种或多种外源因子。在一些实施方案中，所述寨卡病毒克隆分离株基本上不含所述一种或多种外源因子。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述方法还包括对寨卡病毒克隆分离株的一次或多次另外的空斑纯化。在一些实施方案中，所述寨卡病毒克隆分离株进一步经空斑纯化两次或更多次。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述方法还包括使寨卡病毒克隆分离株在细胞培养物中传代一次或多次。在一些实施方案中，使寨卡病毒克隆分离株传代两次或更多次。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述方法还包括配制包含来自寨卡病毒克隆分离株的一种或多种抗原的疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物是纯化的抗原疫苗或免疫原性组合物、亚单位疫苗或免疫原性组合物、灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物是纯化的灭活全病毒疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述寨卡病毒克隆分离株是化学灭活的。在一些实施方案中，所述寨卡病毒克隆分离株用洗涤剂、福尔马林、过氧化氢、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种化学灭活。在一些实施方案中，所述寨卡病毒克隆分离株用福尔马林化学灭活。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述方法还包括将所述疫苗或免疫原性组合物与佐剂混合。在一些实施方案中，所述佐剂选自铝盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，所述佐剂是铝盐。在一些实施方案中，所述佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和铝胶85。在一些实施方案中，所述一种或多种抗原中的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到所述佐剂上。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含约0.1μg Env至约100μg Env。在某些此类实施方案中，寨卡病毒是空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物是无佐剂的。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述寨卡病毒克隆分离株是同种遗传群体。在一些实施方案中，所述寨卡病毒克隆分离株在包膜蛋白E(Env)中不含突变。在一些实施方案中，所述寨卡病毒克隆分离株含有至少一个突变。在一些实施方案中，所述至少一个突变是在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中。在一些实施方案中，所述至少一个突变发生在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置。在一些实施方案中，所述至少一个突变是Trp98Gly突变。在一些实施方案中，所述至少一个突变不是在包膜蛋白E(Env)中。在一些实施方案中，与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比，所述至少一个突变增强了遗传稳定性。在一些实施方案中，与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比，所述至少一个突变增强了病毒复制。

本公开的其他方面涉及一种纯化寨卡病毒以制备疫苗或免疫原性组合物的方法，其包括选自以下的一个或多个(例如，一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或全部六个)步骤：(a)使含有寨卡病毒的样品通过深层过滤器，以产生洗脱液，其中所述洗脱液含有所述寨卡病毒；(b)通过错流过滤(CFF)对含有寨卡病毒的样品进行缓冲液交换和/或稀释以产生渗余物，其中所述渗余物含有所述寨卡病毒；(c)使含有寨卡病毒的样品与离子交换膜结合以产生被结合的级分，其中所述被结合的级分含有所述寨卡病毒，并将所述被结合的级分从所述离子交换膜上洗脱；(d)用有效量的化学灭活剂处理含有寨卡病毒的样品；(e)用焦亚硫酸钠中和含有化学灭活的寨卡病毒的样品；和/或(f)通过错流过滤(CFF)纯化经中和的含有化学灭活的寨卡病毒的样品。在一些实施方案中，所述方法包括所有步骤：(a)使含有寨卡病毒的样品通过深层过滤器，以产生洗脱液，其中所述洗脱液含有所述寨卡病毒；(b)通过错流过滤(CFF)对含有寨卡病毒的样品进行缓冲液交换和/或稀释以产生渗余物，其中所述渗余物含有所述寨卡病毒；(c)使含有寨卡病毒的样品与离子交换膜结合以产生被结合的级分，其中所述被结合的级分含有所述寨卡病毒，并将所述被结合的级分从所述离子交换膜上洗脱；(d)用有效量的化学灭活剂处理含有寨卡病毒的样品；(e)用焦亚硫酸钠中和含有化学灭活的寨卡病毒的样品；和/或(f)通过错流过滤(CFF)纯化经中和的含有化学灭活的寨卡病毒的样品，这些步骤为任何顺序。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)使含有寨卡病毒的样品通过第一深层过滤器，以产生第一洗脱液，其中所述第一洗脱液含有所述寨卡病毒；(b)通过错流过滤(CFF)对所述第一洗脱液进行缓冲液交换和/或稀释以产生第一渗余物，其中所述第一渗余物含有所述寨卡病毒；(c)使所述第一渗余物与离子交换膜结合以产生第一被结合的级分，其中所述第一被结合的级分含有所述寨卡病毒，并将所述第一被结合的级分从所述离子交换膜上洗脱以产生第二洗脱液，其中所述第二洗脱液含有所述寨卡病毒；(d)使所述第二洗脱液通过第二深层过滤器以产生第二渗余物，其中所述第二渗余物含有所述寨卡病毒；(e)用有效量的化学灭活剂处理所述第二渗余物；(f)用焦亚硫酸钠中和所述处理过的第二渗余物；以及(g)通过错流过滤(CFF)纯化所述经中和的第二渗余物。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述离子交换膜是阴离子交换膜。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述阴离子交换膜包含季铵配体。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，步骤(c)的被结合的级分以多个步骤洗脱，其中每个步骤包括递增的盐浓度。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述盐是氯化钠。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，盐浓度从250mM增加至750mM。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述化学灭活剂是洗涤剂、福尔马林、过氧化氢、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述化学灭活剂是福尔马林。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述中和进行至少五天、至少七天、至少九天、至少11天或至少14天。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述寨卡病毒是通过本文所述的任何方法产生的寨卡病毒克隆分离株。

本公开的其他方面涉及一种疫苗或免疫原性组合物，其含有来自空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株的一种或多种抗原。在一些实施方案中，所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是从与包含寨卡病毒群的接种物接触的细胞中纯化的空斑。在一些实施方案中，所述细胞是非人细胞。在一些实施方案中，所述细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，所述昆虫细胞是蚊细胞。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是猴细胞。在一些实施方案中，所述猴细胞来自Vero细胞系。在一些实施方案中，所述Vero细胞系是WHO Vero 10-87细胞系。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述寨卡病毒群是异种的。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述寨卡病毒群包含寨卡病毒临床分离株。在一些实施方案中，所述寨卡病毒临床分离株来自毒株PRVABC59。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述寨卡病毒群包括先前已经在细胞培养物中传代一次或多次的寨卡病毒。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述接种物包含人血清。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述接种物包含一种或多种外源因子。在一些实施方案中，所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株基本上不含所述一种或多种外源因子。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株与野生型寨卡病毒相比是经改良的。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是同种遗传群体。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株在包膜蛋白E(Env)中不含突变。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株包含至少一个突变。在一些实施方案中，所述至少一个突变是在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中。在一些实施方案中，所述至少一个突变发生在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQID NO：1的位置98相对应的位置。在一些实施方案中，所述至少一个突变是Trp98Gly突变。在一些实施方案中，所述至少一个突变不是在寨卡病毒包膜蛋白E(Env)中。在一些实施方案中，与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比，所述至少一个突变增强了遗传稳定性。在一些实施方案中，与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比，所述至少一个突变增强了病毒复制。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是非洲谱系病毒或亚洲谱系病毒。在一些实施方案中，所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是亚洲谱系病毒。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物是纯化的抗原疫苗或免疫原性组合物、亚单位疫苗或免疫原性组合物、灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物是灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是化学灭活的。在一些实施方案中，所述空斑纯化的寨卡病毒用洗涤剂、福尔马林、过氧化氢、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种化学灭活。在一些实施方案中，所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株用福尔马林化学灭活。

在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物还包含佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂选自铝盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，所述佐剂是铝盐。在一些实施方案中，所述佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和铝胶85。在一些实施方案中，所述一种或多种抗原中的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到所述佐剂上。在可以与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物含有约0.1μg Env至约100μg Env。在某些此类实施方案中，寨卡病毒是空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物是无佐剂的。

应当理解，以上和本文所述的各个实施方案的一种、一些或全部特性可以组合形成本公开的其他实施方案。本公开的这些和其他方面对于本领域技术人员将变得显而易见。通过下面的详细描述来进一步描述本公开的这些和其他实施方法。

附图说明

图1示出了模拟感染(顶部)或用ZIKAV毒株PRVABC59感染(底部)的Vero细胞单层的亮场显微图像。

图2示出了通过TCID₅₀测定的Vero细胞单层上ZIKAV PRVABC59 P1的生长动力学。

图3示出了寨卡病毒PRVABC59 P5克隆物a-f的效力测定试验(TCID₅₀)。

图4示出了亮场显微镜图像，描绘了在Vero细胞单层上寨卡病毒PRVABC59 P6克隆物a-f生长的细胞病变效应(CPE)。

图5示出了寨卡病毒PRVABC59 P6克隆物a-f的效力测定试验(TCID₅₀)。

图6示出了氨基酸序列比对，比较了寨卡病毒株PRVABC59 P6e(SEQ ID NO：8)和PRVABC59(SEQ ID NO：9)的残基330附近的寨卡病毒包膜糖蛋白序列与其他几种黄病毒(WNV(SEQ ID NO：10)、JEV(SEQ ID NO：11)、SLEV(SEQ ID NO：12)、YFV(SEQ ID NO：13)、DENV 1 16007(SEQ ID NO：14)、DENV 2 16681(SEQ ID NO：15)、DENV 3 16562(SEQ IDNO：16)和DENV 4 1036(SEQ ID NO：17))的包膜糖蛋白序列。

图7示出了氨基酸序列比对，比较了寨卡病毒株PRVABC59 P6e(SEQ ID NO：18)和PRVABC59(SEQ ID NO：19)的残基98附近的寨卡病毒NS1蛋白序列与其他几种黄病毒(WNV(SEQ ID NO：20)、JEV(SEQ ID NO：21)、SLEV(SEQ ID NO：22)、YFV(SEQ ID NO：23)、DENV 116007(SEQ ID NO：24)、DENV 2 16681(SEQ ID NO：25)、DENV 3 16562(SEQ IDNO：26)和DENV 4 1036(SEQ ID NO：27))的NS1蛋白序列。

图8示出了与ZIKAV PRVABC59 P1病毒相比，ZIKAV PRVABC59 P6病毒克隆物a-f的空斑表型。

图9示出了与ZIKAV PRVABC59 P1病毒相比，ZIKAV PRVABC59 P6病毒克隆物的平均空斑大小。

图10示出了ZIKAV PRVABC59 P6克隆物a-f在Vero细胞中于无血清生长条件下的生长动力学。

图11示出了制备用于免疫实验的PRVABC59 P6b和P6e配制药物产品所采取的步骤的示意图。

图12A示出了用源自ZIKAV PRVABC59 P6b和P6e克隆物的疫苗配制品对CD-1小鼠给药的时间表。PBS用作安慰剂。

图12B示出了如图12A所述，使用源自ZIKAV PRVABC59 P6b和P6e克隆物的疫苗配制品免疫的CD-1小鼠的血清ZIKAV中和抗体滴度。ZIKAV中和抗体滴度通过报告病毒颗粒(RVP)中和测定法测定。实线表示一组的几何平均值。检测限(1.93log₁₀)用虚线表示。

图13A示出了用源自ZIKAV PRVABC59 P6b和P6e克隆物的疫苗配制品对AG129小鼠给药的时间表。PBS用作安慰剂。

图13B示出了如图13A所述，使用源自ZIKAV PRVABC59 P6b和P6e克隆物的疫苗配制品免疫的AG129小鼠的血清ZIKAV中和抗体滴度。实线表示一组的几何平均值。检测限(1.30log₁₀)用虚线表示。为没有可检测滴度(<1.30)的动物分配滴度为0.5。

图14示出了攻击后AG129试验组的平均重量，以起始重量的百分比表示。误差棒表示标准偏差。

图15示出了攻击后两天单个AG129小鼠的血清病毒血症，以PFU/mL报告。实线表示一组的平均值。检测限(2.0log₁₀)用虚线表示。

图16示出了攻击后AG129试验组的存活率分析。

图17示出了从接种疫苗并受到攻击的AG129小鼠被动转移混合血清后的攻击前血清循环ZIKAV中和抗体(Nab)滴度。

图18示出了受寨卡病毒攻击的被动转移和对照小鼠的平均体重。

图19示出了攻击后三天单个AG129小鼠的血清病毒血症，以PFU/mL报告。

图20示出了受寨卡病毒攻击的被动转移和对照小鼠的存活率分析。

图21示出了在被动转移小鼠中观察到的ZIKAV中和抗体滴度与病毒血症之间的相关性。

图22示出了在用P6a和P6e寨卡病毒preMVS原液感染后使用Kaplan Meier存活曲线对AG129小鼠的存活率分析。

图23示出了发明时在用P6a和P6e寨卡病毒preMVS原液感染后的平均体重，以起始重量的百分比表示。虚线表示起始重量的100％供参考。

图24示出了在用P6a和P6e寨卡病毒preMVS原液感染三天后单个AG129小鼠的血清病毒血症，以PFU/mL报告。虚线表示该测定法的检测限。

图25示出了实施例4的临床研究设计的概要。

图26示出了实施例4中使用受试者的PRNT测定的几何平均滴度(GMT)

图27示出了在实施例4中描述的研究的第29天(初免剂量后第28天)和第57天(加强剂量后28天)使用PRNT测定的达到血清转化的受试者的百分比。

图28示出了在实施例4中描述的研究的第29天(初免剂量后第28天)达到特定几何平均滴度(使用PRNT测定)的受试者的百分比的图表。

图29示出了在实施例4中描述的研究的第57天(初免剂量后第56天)达到特定几何平均滴度(使用PRNT测定)的受试者的百分比的图表。

具体实施方式

一般技术

本领域技术人员通常很了解并且通常使用常规方法来采用本文描述或引用的技术和程序，所述常规方法例如，以下参考文献中描述的广泛利用的方法：Sambrook等人,Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编(2003))；the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.)：PCR 2：A Practical Approach(M.J.MacPherson、B.D.Hames和G.R.Taylor编(1995)),Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow and Lane编(1988)，和Animal CellCulture(R.I.Freshney编(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Methods in Molecular Biology(J.M.Walker编，Humana Press(1983))；Cell Biology：ALaboratory Notebook(J.E.Celis编，Academic Press(1998))Academic Press；AnimalCell Culture(R.I.Freshney)编，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts编，Plenum Press(1998))；Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures(A.Doyle、J.B.Griffiths和D.G.Newell编，J.Wiley and Sons(1993-8))；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编，Cold SpringHarbor Laboratory(1987))；PCR：The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编，Springer(1994))；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编，Wiley(1991))；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,(1997))；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty编，IRL Press,(1988-1989))；MonoclonalAntibodies：A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编，Oxford University Press,(2000))；Using Antibodies：A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(ColdSpringHarbor Laboratory Press,(1999))；以及The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编，Harwood Academic Publishers,(1995))。

寨卡病毒

本公开的某些方面涉及至少一种可用于疫苗和/或免疫原性组合物中的寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株，通过本文所述方法纯化的寨卡病毒，包含一个或多个非人细胞适应性突变的寨卡病毒，等等)，包括但不限于用于亚单位疫苗的纯化病毒、灭活病毒、减毒病毒、重组病毒或纯化和/或重组病毒蛋白。

寨卡病毒(ZIKV)是1947年首次从乌干达寨卡森林(Zika Forest)的前哨恒河猴中分离的一种蚊媒黄病毒。从那以后，在非洲和亚洲以及最近在美洲从人类中进行了分离。ZIKV存在于两个(可能是三个)谱系中：非洲谱系(可能是单独的东非和西非谱系)和亚洲谱系。因此，本公开的合适的寨卡病毒的实例包括但不限于来自非洲和/或亚洲谱系的病毒。在一些实施方案中，所述寨卡病毒是非洲谱系病毒。在一些实施方案中，所述寨卡病毒是亚洲谱系病毒。另外，先前已经鉴定出非洲和亚洲寨卡病毒谱系中的多种毒株。本领域已知的任何一种或多种合适的寨卡病毒株都可以用于本公开中，包括例如，毒株Mr 766、ArD41519、IbH 30656、P6-740、EC Yap、FSS13025、ArD 7117、ArD 9957、ArD 30101、ArD 30156、ArD 30332、HD 78788、ArD 127707、ArD 127710、ArD 127984、ArD 127988、ArD 127994、ArD128000、ArD 132912、132915、ArD 141170、ArD 142623、ArD 149917、ArD 149810、ArD149938、ArD 157995、ArD 158084、ArD 165522、ArD 165531、ArA 1465、ArA 27101、ArA27290、ArA 27106、ArA 27096、ArA 27407、ArA 27433、ArA 506/96、ArA 975-99、Ara 982-99、ArA 986-99、ArA 2718、ArB 1362、尼日利亚68、马来西亚66、凯杜古84、苏里南、MR1429、PRVABC59、ECMN2007、DakAr41524、H/PF/2013、R103451、103344、8375、JMB-185、ZIKV/H、智人/巴西/纳塔耳/2015、SPH2015、ZIKV/Hu/千叶/S36/2016和/或古巴2017。在一些实施方案中，在本公开中使用毒株PRVABC59。

在一些实施方案中，寨卡病毒基因组序列的实例在下面表示为SEQ ID NO：2：

在一些实施方案中，寨卡病毒可包含GenBank登录号KU501215.1的基因组序列。在一些实施方案中，所述寨卡病毒来自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，GenBank登录号KU501215.1的基因组序列包含SEQ ID NO：2的序列。在一些实施方案中，寨卡病毒可以包含与SEQ ID NO：2的序列具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性的基因组序列。

在一些实施方案中，寨卡病毒可包含至少一个由SEQ ID NO：2的序列编码的多肽。在一些实施方案中，寨卡病毒可包含具有与SEQ ID NO：2的序列编码的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的至少一个多肽。

因此，在一些实施方案中，本公开的寨卡病毒可用于本文公开的任何疫苗和/或免疫原性组合物中。例如，本公开的寨卡病毒可用于提供一种或多种抗原，所述抗原可用于治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染和/或诱导有需要的受试者的针对寨卡的免疫反应，诸如保护性免疫反应。

病毒抗原

在一些实施方案中，本公开涉及来自可用于疫苗和/或免疫原性组合物中的本文所述的任何寨卡病毒的一种或多种抗原，所述病毒包括但不限于用于亚单位疫苗的纯化病毒、灭活病毒、减毒病毒、重组病毒或纯化和/或重组病毒蛋白。在一些实施方案中，所述疫苗和/或免疫原性组合物包含纯化的灭活全病毒。在一些实施方案中，所述病毒是空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。

本公开的抗原可以是能够引发免疫反应的任何物质。合适的抗原实例包括但不限于全病毒、减毒病毒、灭活病毒、蛋白、多肽(包括活性蛋白及蛋白内的各个多肽表位)、糖多肽、脂多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其他分子的肽和非肽模拟物、小分子、脂质、糖脂和碳水化合物。

本公开的抗原可以来自由细胞培养物中的一个或多个细胞(例如，通过空斑纯化)产生的任何寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。可以使用本领域已知的用于产生寨卡病毒的任何合适的细胞，包括例如昆虫细胞(例如蚊细胞，诸如CCL-125细胞、Aag-2细胞、RML-12细胞、C6/36细胞、C7-10细胞、AP-61细胞、A.t.GRIP-1细胞、A.t.GRIP-2细胞、A.t.GRIP-3细胞、UM-AVE1细胞、Mos.55细胞、Sua1B细胞、4a-3B细胞、Mos.42细胞、MSQ43细胞、LSB-AA695BB细胞、NIID-CTR细胞、TRA-171细胞和来自蚊虫种类的其他细胞或细胞系，所述蚊虫种类诸如埃及伊蚊、白纹伊蚊、伪盾纹伊蚊(Aedes pseudoscutellaris)、三列伊蚊(Aedes triseriatus)、刺扰伊蚊(Aedes vexans)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、斯氏按蚊(Anopheles stephensi)、Anopheles albimus、致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)、希氏库蚊(Culex theileri)、三带喙库蚊(Culextritaeniorhynchus)、二带喙库蚊(Culex bitaeniorhynchus)和/或安波那巨蚊(Toxorhynchites amboinensis))，和哺乳动物细胞(例如，VERO细胞(来自猴肾)、LLC-MK2细胞(来自猴肾)、MDBK细胞、MDCK细胞、ATCC CCL34 MDCK(NBL2)细胞、MDCK 33016(保藏号DSM ACC 2219，如WO97/37001中所述)细胞、BHK21-F细胞、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在一些实施方案中，本公开的抗原来自由非人细胞(例如，通过空斑纯化)产生的寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。在一些实施方案中，本公开的抗原来自由昆虫细胞(例如，通过空斑纯化)产生的寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。在一些实施方案中，本公开的抗原来自由蚊细胞(例如，通过空斑纯化)产生的寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。在一些实施方案中，本公开的抗原来自由哺乳动物细胞(例如，通过空斑纯化)产生的寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。在一些实施方案中，本公开的抗原来自由VERO细胞(例如，通过空斑纯化)产生的寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。通过进行空斑纯化来纯化病毒的方法是本领域普通技术人员已知的(参见例如以下实施例1)。

本公开的抗原可包括至少一个非人细胞适应性突变。可以通过使病毒适应在特定细胞系中的生长来产生适应性突变。例如，细胞可以用病毒，由病毒(例如，感染性病毒或感染性克隆物)转录的RNA和/或从全病毒中纯化的RNA进行转染或电穿孔，并且进行传代使得病毒和/或病毒RNA复制且其核酸发生突变。核酸突变可以是点突变、插入突变或缺失突变。核酸突变可在病毒蛋白内产生促进病毒在非人细胞中的生长的氨基酸变化。适应性突变可以促进病毒的表型变化，包括改变空斑大小、生长动力学、温度敏感性、耐药性、毒力和细胞培养物中的病毒产量。这些适应性突变因提高细胞系中培养的病毒的速度、产量和一致性而可用于疫苗制造。适应性突变可以通过改变免疫原性表位的结构来改变(例如，增强或降低)病毒抗原的免疫原性。另外，适应性突变还可以通过多次(例如，至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次、至少15次、至少16次、至少17次、至少18次、至少19次、至少20次或更多次)传代来增加病毒的遗传稳定性和/或减少或以其他方式抑制病毒中不良突变的发展。

因此，在某些实施方案中，本公开的抗原包括至少一个非人细胞适应性突变。在某些实施方案中，适应性突变是病毒抗原向非人细胞的突变。在一些实施方案中，非人细胞是哺乳动物细胞。可以使用本领域已知的任何合适的哺乳动物细胞，包括但不限于VERO细胞(来自猴肾)、LLC-MK2细胞(来自猴肾)、MDBK细胞、MDCK细胞、ATCC CCL34 MDCK(NBL2)细胞、MDCK 33016(保藏号DSM ACC 2219，如WO97/37001中所述)细胞、BHK21-F细胞、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在一些实施方案中，非人细胞是猴细胞。在一些实施方案中，所述猴细胞来自Vero细胞系。可以使用本领域已知的任何合适的Vero细胞系，包括但不限于WHO Vero 10-87、ATCC CCL-81、Vero 76(ATCC登录号CRL-1587)或Vero C1008(ATCC登录号CRL-1586)。在一些实施方案中，Vero细胞系是

寨卡病毒具有编码结构和非结构多肽的正义、单链RNA基因组。该基因组在5'-和3'-末端区域还含有在病毒复制中起作用的非编码序列。这些病毒编码的结构多肽包括但不限于衣壳(C)、前体膜(prM)和包膜(E)。这些病毒编码的非结构(NS)多肽包括但不限于NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。

在某些实施方案中，本公开的抗原可在一个或多个(例如，一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个更多个、或全部十个)病毒抗原/多肽(包括但不限于C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)中含有至少一个(例如，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个等)非人细胞适应性突变。在一些实施方案中，本公开的抗原在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中包括至少一个非人细胞适应性突变。在一些实施方案中，本公开的抗原包括全灭活病毒，其可以含有至少一个(例如，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个等)非人细胞适应性突变。在一些实施方案中，本公开的抗原包括全灭活病毒，其可以在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中含有至少一个非人细胞适应性突变。在一些实施方案中，本公开的抗原包括全灭活病毒，其可以在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置含有Trp98Gly突变。

在一些实施方案中，所述至少一个非人细胞适应性突变是在NS1多肽内。来自示例性寨卡病毒株的野生型、非细胞适应性NS1多肽的氨基酸序列如下所示：

DVGCSVDFSKKETRCGTGVFVYNDVEAWRDRYKYHPDSPRRLAAAVKQAWEDGICGISSVSRMENIMWRSVEGELNAILEENGVQLTVVVGSVKNPMWRGPQRLPVPVNELPHGWKAWGKSYFVRAAKTNNSFVVDGDTLKECPLKHRAWNSFLVEDHGFGVFHTSVWLKVREDYSLECDPAVIGTAVKGKEAVHSDLGYWIESEKNDTWRLKRAHLIEMKTCEWPKSHTLWTDGIEESDLIIPKSLAGPLSHHNTREGYRTQMKGPWHSEELEIRFEECPGTKVHVEETCGTRGPSLRSTTASGRVIEEWCCRECTMPPLSFRAKDGCWYGMEIRPRKEPESNLVRSMVT(SEQ ID NO：1)。

在一些实施方案中，NS1多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1的序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，NS1多肽的氨基酸序列可以来自由GenBank登录号KU501215.1的序列(SEQ ID NO：2)编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，NS1多肽的氨基酸序列可以是由GenBank登录号KU501215.1的序列编码的氨基酸序列的氨基酸位置795至1145。在一些实施方案中，NS1多肽的氨基酸序列可以来自寨卡病毒株PRVABC59。

“序列同一性”、“％序列同一性”、“％同一性”、“％相同”或“序列比对”意指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的比较，或第一核酸序列与第二核酸序列的比较并且是基于该比较按百分比计算的。该计算结果可以描述为“相同百分比”或“ID百分比”。

通常，序列比对可用于通过两种不同方法之一来计算序列同一性。在第一种方法中，在最终序列同一性计算中，将单个位置的错配和单个位置的空位都计为不相同的位置。在第二种方法中，在最终序列同一性计算中，将单个位置的错配计为不相同的位置；然而，在最终序列同一性计算中，不将单个位置的空位(忽略)计为不相同的位置。换句话说，在第二种方法中，在最终序列同一性计算中忽略了空位。这两种方法之间的差异(即，在单个位置，将空位计为不相同的位置与忽略空位)可在两个序列之间的序列同一性值上产生可变性。

序列同一性是通过产生比对并计算同一性的程序测定的，在最终序列同一性计算中将单个位置的错配和单个位置的空位都计为不相同的位置。例如程序Needle(EMBOS)，该程序已实现Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48：443-453)，并根据默认设置通过以下方式计算序列同一性：首先在第一序列和第二序列之间产生比对，然后对比对长度上相同位置的数目进行计数，然后将相同残基的数目除以比对长度，然后将该数字乘以100产生％序列同一性[％序列同一性＝((相同残基数/比对长度)x100)]。

可以由成对比对计算出序列同一性，所述成对比对显示全长上的两个序列，因此显示全长的第一序列和第二序列(“全局序列同一性”)。例如，程序Needle(EMBOSS)产生此类比对；％序列同一性＝(相同残基数/比对长度)x100)]。

可以由仅显示第一序列或第二序列的局部区域的成对比对计算出序列同一性(“局部同一性”)。例如，程序Blast(NCBI)产生此类比对；％序列同一性＝(相同残基数/比对长度)x100)]。

序列比对优选通过使用Needleman和Wunsch的算法产生(J.Mol.Biol.(1979)48,第443-453页)。优选地，将程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EMBOSS))与程序默认参数一起使用(对于蛋白而言，空位开放罚分＝10.0，空位延伸罚分＝0.5并且矩阵＝EBLOSUM62，而对于核苷酸而言，矩阵＝EDNAFULL)。然后，可以由显示全长上的两个序列，因此显示全长的第一序列和第二序列的比对计算出序列同一性(“全局序列同一性”)。例如：％序列同一性＝(相同残基数/比对长度)x100)]。

在一些实施方案中，所述至少一个非人细胞适应性突变发生在NS1多肽内的一个或多个氨基酸位置。在一些实施方案中，当使用成对比对算法与SEQ ID NO：1比对时，所述突变发生在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置。在一些实施方案中，位置98的突变是色氨酸取代为甘氨酸。

在一些实施方案中，寨卡病毒在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含突变。可以通过使用成对比对算法将NS-1蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNO：1比对来确定与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置。在本申请的图7中示出了除寨卡病毒以外的病毒中与SEQ ID NO：1的位置98的色氨酸残基相对应的氨基酸残基，其中这些残基用带有方框。在一些实施方案中，位置98的突变是色氨酸取代为甘氨酸。在一些实施方案中，位置98的突变是在SEQ ID NO：1的位置98的色氨酸取代为甘氨酸。

在一些实施方案中，本公开的抗原在NS1蛋白内含有至少一个非人细胞适应性突变，并且在C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5病毒蛋白中的一种或多种内含有至少一个突变(例如，至少一个适应性突变)。在一些实施方案中，本公开的抗原在NS1蛋白内含有一个或多个非人细胞适应性突变，而在C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5病毒蛋白中的一种或多种内不含至少一个突变(例如，至少一个非人细胞适应性突变)。在一些实施方案中，本公开的抗原在NS1蛋白内含有至少一个非人细胞适应性突变，而在包膜蛋白内不含至少一个突变(例如，至少一个非人细胞适应性突变)。在一些实施方案中，本公开的抗原包括全灭活病毒，其在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中含有至少一个非人细胞适应性突变，而在寨卡病毒包膜蛋白E(Env)中不包括突变。在一些实施方案中，本公开的抗原在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置含有突变，而在包膜蛋白E内不含任何突变。在一些实施方案中，本公开的抗原包括全灭活病毒，其在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置含有突变，而在寨卡病毒包膜蛋白质E(Env)中不包括突变。在一些实施方案中，全灭活病毒在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中含有至少一个突变，并且编码包膜蛋白的序列与SEQ ID No.2中的相应序列相同。在一些实施方案中，寨卡病毒在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置含有突变，并且编码包膜蛋白的序列与SEQ ID No.2中的相应序列相同。在一些实施方案中，灭活的全寨卡病毒在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置含有突变，并且编码包膜蛋白的序列与SEQ ID No.2中的相应序列相同。

在一些实施方案中，本公开的抗原，诸如寨卡病毒，含有至少一个非人细胞适应性突变，与缺乏所述至少一个适应性突变的寨卡病毒相比，该适应性突变增强了遗传稳定性。在一些实施方案中，本公开的抗原，诸如寨卡病毒，含有至少一个非人细胞适应性突变，与缺乏所述至少一个适应性突变的寨卡病毒相比，该适应性突变增强了病毒复制。在一些实施方案中，本公开的抗原，诸如寨卡病毒，含有至少一个非人细胞适应性突变，其减少或以其他方式抑制不良突变的发生，诸如在寨卡病毒的包膜蛋白E(Env)内。

在本公开的上述实施方案中，示例性的成对比对算法是使用默认参数(例如，空位开放罚分＝10.0，并且空位延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)的Needleman-Wunsch全局比对算法。该算法在EMBOSS软件包的needle工具中得以方便地实现。

在一些实施方案中，来自寨卡病毒的本公开的抗原可以用于本公开的任何疫苗和免疫原性组合物中。例如，本公开的抗原可用于治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染和/或诱导有需要的受试者的针对寨卡的免疫反应，诸如保护性免疫反应。

疫苗和免疫原性组合物的生产

本公开的其他方面涉及寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物，其包含来自至少一种寨卡病毒的本公开的一种或多种抗原，所述寨卡病毒尤其是纯化的灭活全病毒形式，诸如具有突变的寨卡病毒的形式，所述突变是如本文所述，在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ IDNO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。在一个实施方案中，所述疫苗和免疫原性组合物含有空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。此类疫苗和免疫原性组合物可用于例如治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染和/或诱导有需要的受试者的针对寨卡病毒的免疫反应，诸如保护性免疫反应。本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可包括但不限于用于亚单位疫苗的纯化病毒、灭活病毒、减毒病毒、重组病毒、纯化和/或重组病毒蛋白。本公开的疫苗和/或免疫原性组合物还可包括纯化的抗原疫苗或免疫原性组合物、亚单位疫苗或免疫原性组合物、灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。

本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的生产包括寨卡病毒的生长，其中抗原是由生长的病毒制备的。在细胞培养中生长是用于制备本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的方法。用于病毒生长的细胞可以悬浮培养或在贴壁条件下培养。

适于本公开的所述至少一种病毒生长的细胞系优选是哺乳动物来源的，并且包括但不限于：昆虫细胞(例如，本文所述的蚊细胞、VERO细胞(来自猴肾)、马细胞、牛细胞(例如MDBK细胞)、绵羊细胞、狗细胞(例如来自狗肾的MDCK细胞，ATCC CCL34 MDCK(NBL2)或MDCK33016，保藏号DSM ACC 2219，如WO97/37001中所述)、猫和啮齿动物细胞(例如仓鼠细胞，诸如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并且可以从多个发育阶段(包括例如成人、新生儿、胎儿和胚胎)获得。在某些实施方案中，细胞是永生化的(例如，PERC.6细胞，如WO 01/38362和WO 02/40665中所述，并且以ECACC保藏号96022940保藏)。在优选的实施方案中，利用哺乳动物细胞，并且其可以选自和/或源自以下的一种或多种非限制性细胞类型：成纤维细胞(例如真皮细胞、肺细胞)、内皮细胞(例如主动脉细胞、冠状动脉细胞、肺部细胞、血管细胞、真皮微血管细胞、脐带细胞)、肝细胞、角化细胞、免疫细胞(例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突细胞)、乳腺细胞(例如上皮细胞)、平滑肌细胞(例如，血管细胞、主动脉细胞、冠状动脉细胞、动脉细胞、子宫细胞、支气管细胞、宫颈细胞、视网膜周细胞)、黑素细胞、神经细胞(例如星形胶质细胞)、前列腺细胞(例如上皮细胞、平滑肌细胞)、肾细胞(例如上皮细胞、系膜细胞、近端小管细胞)、骨骼细胞(例如软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)、肌细胞(例如成肌细胞、骨骼细胞、平滑肌细胞、支气管细胞)、肝脏细胞、成视网膜细胞和基质细胞。WO97/37000和WO97/37001描述了能够在悬浮液和无血清培养基中生长并且可用于病毒的产生和复制的动物细胞和细胞系的产生。

上述细胞类型的培养条件是已知的，并在各种出版物中有所描述。可替代地，培养基、补充剂和条件可以商业购买，例如在Cambrex Bioproducts(East Rutherford,N.J.)的目录和其他文献中有描述。

在某些实施方案中，本文所述方法中使用的细胞在无血清和/或无蛋白的培养基中培养。培养基在本公开的上下文中称为无血清培养基，其中不存在来自人或动物来源的血清的添加剂。无蛋白应理解为意指其中发生细胞倍增，不包括蛋白、生长因子、其他蛋白添加剂和非血清蛋白，但可以任选地包括蛋白质诸如胰蛋白酶或病毒生长可能必需的其他蛋白酶的培养物。在此类培养物中生长的细胞本身含有蛋白质。

已知的无血清培养基包括Iscove培养基、Ultra-CHO培养基(BioWhittaker)或EX-CELL(JRH Bioscience)。含血清的普通培养基包括伊格尔基础培养基(BME)或最小必需培养基(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))或杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM或EDM)，通常最多使用10％的胎牛血清或类似添加剂。任选地，可以使用最小必需培养基(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))或杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM或EDM)，无需任何含血清的补充剂。无蛋白培养基如PF-CHO(JHR Bioscience)，化学成分明确的培养基如ProCHO4CDM(BioWhittaker)或SMIF 7(Gibco/BRL Life Technologies)和有丝分裂肽如Primactone、Pepticase或HyPep.TM.(全部来自Quest International)或乳清蛋白水解产物(Gibco和其他制造商)在现有技术中也是充分已知的。基于植物水解产物的培养基添加剂具有特殊优势，可以排除病毒、支原体或未知感染源的污染。

由于根据本公开采用的细胞系的适合性，细胞培养条件(温度、细胞密度、pH值等)在非常宽的范围内可变，并且可以适应特定病毒株的需求。

在培养的细胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步骤：为培养的细胞接种待培养的毒株，将感染的细胞培育所需时间以进行病毒繁殖，例如通过病毒滴度或抗原表达来确定(例如在接种后24至168小时之间)并收集繁殖的病毒。在一些实施方案中，通过空斑纯化收集病毒。以1:500至1:1，优选1:100至1:5的病毒:细胞比率(通过PFU或TCID50测量)接种培养的细胞。将病毒添加到细胞悬浮液中或施加到细胞单层上，并且在25℃至40℃，优选28℃至38℃下使病毒吸附在细胞上至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少60分钟，但通常少于300分钟。感染的细胞培养物(例如单层)可以通过冻融或酶促作用移除，以增加收获的培养物上清液的病毒含量。然后将收获的液体灭活或冷冻储存。培养的细胞可以约0.0001至10，优选0.002至5，更优选至0.001至2的感染复数(“MOI”)感染。还更优选地，以约0.01的MOI感染细胞。感染后30至60小时或感染后3至10天可收获感染细胞的上清液。在某些优选的实施方案中，在感染后3至7天收获感染细胞的上清液。更优选地，在感染后3至5天收获感染细胞的上清液。在一些实施方案中，可以在细胞培养期间添加蛋白酶(例如，胰蛋白酶)以允许病毒释放，并且可以在培养期间的任何合适阶段添加蛋白酶。可替代地，在某些实施方案中，可以收获感染细胞培养物的上清液，并且可以从上清液中分离或以其他方式纯化病毒。

病毒接种物和病毒培养物优选不含以下病毒(即，针对以下病毒进行了测试并针对以下病毒的污染给出了阴性结果)：单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、双RNA病毒、环状病毒和/或细小病毒[WO2006/027698]。

如果病毒已经在细胞系中生长，则标准的做法是使最终疫苗中残留的细胞系DNA的量最小化，以便使宿主细胞DNA的任何致癌活性最小化。可以在疫苗制备期间使用标准的纯化程序例如色谱法等去除污染性DNA。可以通过核酸酶处理例如使用DNA酶来增强残留宿主细胞DNA的去除。在参考文献(Lundblad(2001)Biotechnology and AppliedBiochemistry 34:195-197,Guidance for Industry：Bioanalytical MethodValidation.美国卫生与公众服务部食品和药物监督管理局药物评估与研究中心(CDER)兽医医学中心(CVM)(U.S.Department of Health and Human Services Food and DrugAdministration Center for Drug Evaluation and Research(CDER)Center forVeterinary Medicine(CVM)).2001年5月)中公开的减少宿主细胞DNA污染的简便方法涉及两步处理，首先使用可在病毒生长期间使用的DNA酶(例如全能核酸酶(Benzonase))处理，然后使用可在病毒体破坏期间使用的阳离子洗涤剂(例如CTAB)处理。也可以使用通过β-丙内酯处理来去除。在一个实施方案中，通过全能核酸酶处理培养物上清液来去除污染性DNA。

抗原的产生

用于疫苗和/或免疫原性组合物中的本公开的抗原，包括但不限于用于治疗和/或预防寨卡病毒感染和/或诱导针对寨卡病毒的免疫反应，诸如保护性免疫反应的亚单位疫苗的纯化病毒、灭活病毒、减毒病毒、重组病毒或纯化和/或重组病毒蛋白，可以通过本领域已知的任何合适的方法产生和/或纯化或以其他方式分离。本公开的抗原可包括但不限于从寨卡病毒产生、得到、纯化和/或以其他方式分离的全病毒、减毒病毒、灭活病毒、蛋白、多肽(包括活性蛋白及蛋白内的各个多肽表位)、糖多肽、脂多肽、肽、多糖、多糖缀合物、多糖和其他分子的肽和非肽模拟物、小分子、脂质、糖脂和碳水化合物。例如，合适的抗原可以包括但不限于来自寨卡病毒的结构多肽诸如C、prM和/或E，和非结构多肽诸如NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和/或NS5。在一个实施方案中，本公开的抗原是纯化的灭活全寨卡病毒。

本公开的抗原可以化学或酶促合成、重组产生、从天然来源分离或前述的组合。在某些实施方案中，本公开的抗原是从本公开的至少一种寨卡病毒产生、纯化、分离和/或得到的。本公开的抗原可以是纯化的、部分纯化的或粗提取物。在一些实施方案中，本公开的抗原是如以上标题为“疫苗和免疫原性组合物的产生”的部分所述产生的病毒，诸如灭活病毒。

在某些实施方案中，可以通过培养非人细胞来产生本公开的一种或多种抗原。适于产生本公开的所述一种或多种抗原的细胞系可以包括昆虫细胞(例如，本文所述的任何蚊细胞)。适于产生本公开的所述一种或多种抗原的细胞系也可以是哺乳动物来源的细胞，并且包括但不限于：VERO细胞(来自猴肾)、马细胞、牛细胞(例如MDBK细胞)、绵羊细胞、狗细胞(例如来自狗肾的MDCK细胞，ATCC CCL34 MDCK(NBL2)或MDCK 33016，保藏号DSM ACC2219，如WO97/37001中所述)、猫和啮齿动物细胞(例如仓鼠细胞，诸如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并且可以从多个发育阶段(包括例如成人、新生儿、胎儿和胚胎)获得。在某些实施方案中，细胞是永生化的(例如，PERC.6细胞，如WO01/38362和WO02/40665中所述，并且以ECACC保藏号96022940保藏)。在优选的实施方案中，利用哺乳动物细胞，并且其可以选自和/或源自以下的一种或多种非限制性细胞类型：成纤维细胞(例如真皮细胞、肺细胞)、内皮细胞(例如主动脉细胞、冠状动脉细胞、肺部细胞、血管细胞、真皮微血管细胞、脐带细胞)、肝细胞、角化细胞、免疫细胞(例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK细胞、树突细胞)、乳腺细胞(例如上皮细胞)、平滑肌细胞(例如，血管细胞、主动脉细胞、冠状动脉细胞、动脉细胞、子宫细胞、支气管细胞、宫颈细胞、视网膜周细胞)、黑素细胞、神经细胞(例如星形胶质细胞)、前列腺细胞(例如上皮细胞、平滑肌细胞)、肾细胞(例如上皮细胞、系膜细胞、近端小管细胞)、骨骼细胞(例如软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)、肌细胞(例如成肌细胞、骨骼细胞、平滑肌细胞、支气管细胞)、肝脏细胞、成视网膜细胞和基质细胞。WO97/37000和WO97/37001描述了能够在悬浮液和无血清培养基中生长并且可用于产生病毒抗原的动物细胞和细胞系的产生。在某些实施方案中，在无血清培养基中培养非人细胞。

可以使用本领域已知的标准蛋白纯化方法从天然来源中分离多肽抗原，这些方法包括但不限于液相色谱法(例如，高效液相色谱法、快速蛋白液相色谱法等)、尺寸排阻色谱法、凝胶电泳(包括一维凝胶电泳、二维凝胶电泳)、亲和色谱法或其他纯化技术。在许多实施方案中，抗原是纯化抗原，例如，纯度为约50％至约75％，纯度为约75％至约85％，纯度为约85％至约90％，纯度为约90％至约95％，纯度为约95％至约98％，纯度为约98％至约99％，或纯度高于99％。

可以采用固相肽合成技术，其中此类技术是本领域技术人员已知的。参见Jones,The Chemical Synthesis of Peptides(Clarendon Press,Oxford)(1994)。通常，在此类方法中，通过将活化的单体单元依序添加到固相结合的增长肽链中来产生肽。

可以采用得到确认的重组DNA技术来产生多肽，其中例如，将包含编码多肽的核苷酸序列的表达构建体引入适当的宿主细胞(例如，作为单细胞实体在体外细胞培养物中生长的真核宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等)或原核细胞(例如，在体外细胞培养物中生长的原核细胞)，从而产生基因修饰的宿主细胞；在适当的培养条件下，由基因修饰的宿主细胞产生蛋白质。

除了杀伤和减毒的病毒免疫原性组合物之外，还可以使用亚单位免疫原性组合物或其他类型的免疫原性组合物，其向动物提供寨卡病毒的抗原组分。抗原组分可以是蛋白、糖蛋白、脂质缀合的蛋白或糖蛋白、经修饰的脂质部分或其他病毒组分，当注入人体内时，所述抗原组分刺激人体内的免疫反应，使得人发展出针对寨卡病毒的保护性免疫力。对于亚单位免疫原性组合物，如上所述，可以在哺乳动物细胞上培养病毒。可以使细胞培养物匀化，并且可以通过使细胞培养物匀浆经过适当的柱或通过适当孔径的过滤器或经由细胞培养物匀浆离心来分离免疫原性组合物。

如果抗原组分是蛋白，则可以分离编码该蛋白的核酸，并产生含有分离的核酸的免疫原性组合物。编码抗原组分的核酸可以置于真核启动子信号序列下游的质粒上。该质粒可以含有一种或多种选择标记，将其转染到减毒的原核生物，诸如沙门氏菌属(Salmonella spp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)或其他合适的细菌中。然后可以将细菌施用于人，使得人可以对抗原组分产生保护性免疫反应。可替代地，编码抗原组分的核酸可以置于原核启动子的下游，具有一个或多个选择标记，并且可以转染到减毒的原核生物诸如沙门氏菌、志贺氏菌或其他合适的细菌中。然后可以将细菌施用于需要针对目标抗原的免疫反应的真核生物受试者。参见，例如，美国专利第6,500,419号。

对于亚单位免疫原性组合物，可以将编码寨卡病毒的蛋白质抗原组分的核酸克隆到质粒中，诸如国际专利申请公开号WO 00/32047(Galen)和国际专利申请公开号WO 02/083890(Galen)中描述的那些质粒。然后可以将质粒转染到细菌中，并且细菌可以产生所需的抗原蛋白。可以通过两个专利申请中描述的多种方法来分离和纯化所需的抗原蛋白。

病毒灭活

本公开的某些方面涉及含有来自寨卡病毒的一种或多种抗原的寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物。本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可包括纯化的病毒、全病毒、重组病毒、活的减毒全病毒或优选灭活的全病毒，或来自灭活病毒的亚单位、多肽和/或抗原。因而，本公开的某些实施方案涉及含有来自至少一种灭活寨卡病毒的一种或多种抗原的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物。本公开的某些实施方案涉及含有纯化的灭活寨卡病毒的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物。如本文所用，术语“灭活寨卡病毒”旨在包括已经用灭活方法(诸如用有效量的福尔马林处理)处理的寨卡病毒。具体而言，灭活寨卡病毒通过以下方法可获得/获得：其中在22℃的温度下，以约0.02％w/v的量用甲醛处理寨卡病毒14天。灭活寨卡病毒不再能够感染可以被尚未灭活的寨卡病毒感染的宿主细胞。在一个实施方案中，灭活寨卡病毒不再能够感染VERO细胞和对VERO细胞产生细胞病变效应。术语“纯化的寨卡病毒”意指寨卡病毒已经过如下所述的纯化工艺。与未纯化的寨卡病毒相比，纯化的寨卡病毒具有较低含量的宿主细胞蛋白(诸如Vero细胞蛋白)和宿主细胞DNA(诸如Vero细胞DNA)。纯化的寨卡病毒的纯度可以通过尺寸排阻色谱法测定。在尺寸排阻色谱法中纯化的寨卡病毒的主峰可为尺寸排阻色谱法曲线下总面积的85％以上，或尺寸排阻色谱法曲线下总面积的90％以上，或尺寸排阻色谱法曲线下总面积的95％以上。此类结果被认为是“纯化的”寨卡病毒。因此，术语“纯化的灭活全寨卡病毒”是指从以下方法可获得/获得并且提供尺寸排阻色谱法曲线下总面积至少85％的主峰的寨卡病毒，其中在22℃的温度下以约0.02％w/v的量用福尔马林处理了寨卡病毒几天。在某些实施方案中，纯化的灭活全寨卡病毒是通过空斑纯化获得/可获得的克隆分离株。

灭活或杀伤病毒以破坏其感染哺乳动物细胞的能力，但不破坏病毒的二级、三级或四级结构和免疫原性表位的方法是本领域已知的。此类方法包括化学和物理手段。灭活病毒的合适手段包括但不限于用有效量的一种或多种选自以下的药剂处理：洗涤剂、福尔马林(本文也称为“甲醛”)、过氧化氢、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰乙烯亚胺、热、电磁辐射、x射线辐射、γ辐射、紫外线(UV辐射)、UV-A辐射、UV-B辐射、UV-C辐射、亚甲基蓝、补骨脂素、羧酸富勒烯(C60)、过氧化氢及其任何组合。

在本公开的某些实施方案中，所述至少一种病毒是化学灭活的。用于化学灭活的药剂和化学灭活的方法是本领域中众所周知的，并且在本文中有描述。在一些实施方案中，所述至少一种病毒用BPL、过氧化氢、福尔马林或BEI中的一种或多种化学灭活。在所述至少一种病毒用BPL化学灭活的某些实施方案中，该病毒可含有一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰可以包括经修饰的核酸。在一些实施方案中，经修饰的核酸是烷基化的核酸。在其他实施方案中，所述一个或多个修饰可以包括经修饰的多肽。在一些实施方案中，经修饰的多肽含有经修饰的氨基酸残基，包括经修饰的半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸中的一种或多种。

在所述至少一种病毒用福尔马林化学灭活的某些实施方案中，该灭活病毒可含有一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰可以包括经修饰的多肽。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰可以包括交联多肽。在所述至少一种病毒用福尔马林化学灭活的一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物还包括福尔马林。在所述至少一种病毒用BEI化学灭活的某些实施方案中，该病毒可含有一个或多个修饰。在一些实施方案中，所述一个或多个修饰可以包括经修饰的核酸。在一些实施方案中，经修饰的核酸是烷基化的核酸。

在所述至少一种病毒用福尔马林化学灭活的一些实施方案中，任何残留的未反应的福尔马林均可以用焦亚硫酸钠中和，可以透析出来，和/或可以进行缓冲液交换以去除残留的未反应的福尔马林。在一些实施方案中，添加过量的焦亚硫酸钠。在一些实施方案中，可以使用混合器，诸如在线静态混合器，将溶液混合，随后过滤或进一步纯化(例如，使用错流过滤系统)。

本公开的某些实施方案涉及用于灭活寨卡病毒制剂的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及(a)从一种或多种用于产生病毒制剂的非人细胞中分离寨卡病毒制剂，并且(b)用有效量的福尔马林处理该病毒制剂。在某些实施方案中，用有效量的福尔马林处理包括但不限于以约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量，用福尔马林处理。例如，用有效量的福尔马林处理可以包括以约0.001％至约3.0％v/v、约0.005％至约2.0％v/v或约0.01％至约1.0％v/v的量，或以约0.001％、约0.0025％、约0.005％、约0.0075％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.25％、约1.5％、约1.75％、约2.0％、约2.25％、约2.5％、约2.75％或约3.0％v/v范围的量，用福尔马林处理。

在该方法的某些实施方案中，在约2℃至约42℃范围的温度下用福尔马林处理寨卡病毒制剂。例如，可以在约2℃至约42℃、约2℃至约8℃、约15℃至约37℃、约17℃至约27℃、约20℃至约25℃范围的温度下，或在约2℃、约4℃、约8℃、约10℃、约15℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约37℃或约42℃的温度下，用福尔马林处理寨卡病毒制剂。在一些实施方案中，在室温下用福尔马林处理寨卡病毒制剂。

在一些实施方案中，用福尔马林处理寨卡病毒制剂至少约1天。例如，寨卡病毒制剂可以用福尔马林处理至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、至少约30天或更多天数。在一些实施方案中，用福尔马林处理寨卡病毒制剂至少约9天。在一些实施方案中，用福尔马林处理寨卡病毒制剂至少约11天。在一些实施方案中，用福尔马林处理寨卡病毒制剂至少约14天。在一些实施方案中，用福尔马林处理寨卡病毒制剂至少约20天。在一些实施方案中，用福尔马林处理寨卡病毒制剂至少约30天。

认为灭活的全寨卡病毒制剂通过以下方法可获得/获得：其中在22℃的温度下，以约0.02％w/v的量用甲醛处理寨卡病毒14天。

在一些实施方案中，该方法还涉及用有效量的焦亚硫酸钠中和未反应的福尔马林。在一些实施方案中，焦亚硫酸钠的有效量范围为约0.01mM至约100mM。例如，可以以约0.01mM至约100mM、约0.1mM至约50mM、约0.5mM至约20mM或约1mM至约10mM的有效浓度，或以约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.25mM、约0.5mM、约0.75mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约75mM或约100mM的浓度添加焦亚硫酸钠。在一些实施方案中，用约2mM焦亚硫酸钠中和福尔马林。

在一些实施方案中，用过氧化氢处理寨卡病毒制剂。在一些实施方案中，在20℃至30℃的任意温度下用浓度范围为0.1至3％，优选0.1至1％的过氧化氢处理寨卡病毒制剂5至120分钟。在一些实施方案中，用最终浓度为0.01％的过氧化氢处理寨卡病毒制剂60分钟或更短时间。

在一些实施方案中，所述方法涉及(a)从一种或多种用于产生病毒制剂的非人细胞中分离寨卡病毒制剂；(b)用有效量的福尔马林处理病毒制剂；(c)用有效量的焦亚硫酸钠中和病毒制剂；以及(d)纯化经中和的病毒制剂。可以采用本领域已知的纯化病毒制剂的任何方法，包括但不限于使用错流过滤(CFF)、多元层析、尺寸排阻色谱法、阳离子交换色谱法和/或阴离子交换色谱法。在一些实施方案中，通过错流过滤(CFF)纯化经中和的病毒制剂。在一些实施方案中，以约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更多的量，高度纯化病毒制剂。

含有来自至少一种灭活寨卡病毒的一种或多种抗原的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可用于治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染和/或诱导有需要的受试者的针对寨卡病毒的免疫反应，诸如保护性免疫反应。

佐剂

本公开的其他方面涉及含有来自本文所述的至少一种寨卡病毒的一种或多种抗原联合一种或多种佐剂的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物。在一些实施方案中，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有纯化的灭活全寨卡病毒，诸如在SEQ ID NO:1的位置98或与SEQ ID NO:1的位置98相对应的位置具有色氨酸取代为甘氨酸的突变的寨卡病毒，联合一种或多种佐剂。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒联合一种或多种佐剂，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒联合一种或多种佐剂，其中所述寨卡病毒源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。在一个实施方案中，所述疫苗和免疫原性组合物含有空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株联合一种或多种佐剂。本公开的此类含佐剂的疫苗和/或免疫原性组合物可用于治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染和/或诱导有需要的受试者的针对寨卡病毒的免疫反应，诸如保护性免疫反应。

实现疫苗佐剂效应的各种方法是已知的，并且可以连同本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物一起使用。一般原理和方法在"The Theory and PracticalApplication of Adjuvants",1995,Duncan E.S.Stewart-Tull(编),John Wiley&SonsLtd,ISBN 0-471-95170-6中，还有在"Vaccines：New Generation ImmunologicalAdjuvants",1995,Gregoriadis G等人(编),Plenum Press,New York,ISBN 0-306-45283-9中进行了详述。

在一些实施方案中，寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物包括抗原和佐剂。抗原可以与至少一种佐剂混合，基于重量的比率为约10:1至约10¹⁰:1的抗原:佐剂，例如约10:1至约100:1，约100:1至约10³:1，约10³:1至约10⁴:1，约10⁴:1至约10⁵:1，约10⁵:1至约10⁶:1，约10⁶:1至约10⁷:1，约10⁷:1至约10⁸:1，约10⁸:1至约10⁹:1，或约10⁹:1至约10¹⁰:1的抗原:佐剂。本领域技术人员可以通过有关佐剂和常规实验的信息容易地确定适当比率，以确定最佳比率。

示例性佐剂可包括但不限于铝盐、磷酸钙、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、MLA衍生物、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂(油乳剂)、壳聚糖、维生素D、硬脂基或十八烷基酪氨酸、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，所述佐剂是铝盐。

在一些实施方案中，佐剂包括明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和铝胶85中的至少一种。在一些实施方案中，已经发现本公开的铝盐佐剂会增加本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的抗原的吸附。因此，在一些实施方案中，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的抗原被吸附到铝盐佐剂上。

在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物每剂包含约1μg至约500μg、约5μg至约500μg、约10μg至约500μg、约15μg至约500μg、约25μg至约500μg、约50μg至约500μg、约75μg至约500μg、约100μg至约500μg、约125μg至约500μg、约150μg至约500μg、约175μg至约500μg、约200μg至约500μg、约225μg至约500μg、约250μg至约500μg、约275μg至约500μg、约300μg至约500μg、约325μg至约500μg、约350μg至约500μg、约375μg至约500μg、约400μg至约500μg、约425μg至约500μg、约450μg至约500μg、约475μg至约500μg、约1μg至约475μg、约5μg至约475μg、约10μg至约475μg、约15μg至约475μg、约25μg至约475μg、约50μg至约475μg、约75μg至约475μg、约100μg至约475μg、约125μg至约475μg、约150μg至约475μg、约175μg至约475μg、约200μg至约475μg、约225μg至约475μg、约250μg至约475μg、约275μg至约475μg、约300μg至约475μg、约325μg至约475μg、约350μg至约475μg、约375μg至约475μg、约400μg至约475μg、约425μg至约475μg、约450μg至约475μg、约1μg至约450μg、约5μg至约450μg、约10μg至约450μg、约15μg至约450μg、约25μg至约450μg、约50μg至约450μg、约75μg至约450μg、约100μg至约450μg、约125μg至约450μg、约150μg至约450μg、约175μg至约450μg、约200μg至约450μg、约225μg至约450μg、约250μg至约450μg、约275μg至约450μg、约300μg至约450μg、约325μg至约450μg、约350μg至约450μg、约375μg至约450μg、约400μg至约450μg、约425μg至约450μg、约1μg至约425μg、约5μg至约425μg、约10μg至约425μg、约15μg至约425μg、约25μg至约425μg、约50μg至约425μg、约75μg至约425μg、约100μg至约425μg、约125μg至约425μg、约150μg至约425μg、约175μg至约425μg、约200μg至约425μg、约225μg至约425μg、约250μg至约425μg、约275μg至约425μg、约300μg至约425μg、约325μg至约425μg、约350μg至约425μg、约375μg至约425μg、约400μg至约425μg、约1μg至约400μg、约5μg至约400μg、约10μg至约400μg、约15μg至约400μg、约25μg至约400μg、约50μg至约400μg、约75μg至约400μg、约100μg至约400μg、约125μg至约400μg、约150μg至约400μg、约175μg至约400μg、约200μg至约400μg、约225μg至约400μg、约250μg至约400μg、约275μg至约400μg、约300μg至约400μg、约325μg至约400μg、约350μg至约400μg、约375μg至约400μg、约1μg至约375μg、约5μg至约375μg、约10μg至约375μg、约15μg至约375μg、约25μg至约375μg、约50μg至约375μg、约75μg至约375μg、约100μg至约375μg、约125μg至约375μg、约150μg至约375μg、约175μg至约375μg、约200μg至约375μg、约225μg至约375μg、约250μg至约375μg、约275μg至约375μg、约300μg至约375μg、约325μg至约375μg、约350μg至约375μg、约1μg至约350μg、约5μg至约350μg、约10μg至约350μg、约15μg至约350μg、约25μg至约350μg、约50μg至约350μg、约75μg至约350μg、约100μg至约350μg、约125μg至约350μg、约150μg至约350μg、约175μg至约350μg、约200μg至约350μg、约225μg至约350μg、约250μg至约350μg、约275μg至约350μg、约300μg至约350μg、约325μg至约350μg、约1μg至约325μg、约5μg至约325μg、约10μg至约325μg、约15μg至约325μg、约25μg至约325μg、约50μg至约325μg、约75μg至约325μg、约100μg至约325μg、约125μg至约325μg、约150μg至约325μg、约175μg至约325μg、约200μg至约325μg、约225μg至约325μg、约250μg至约325μg、约275μg至约325μg、约300μg至约325μg、约1μg至约300μg、约5μg至约300μg、约10μg至约300μg、约15μg至约300μg、约25μg至约300μg、约50μg至约300μg、约75μg至约300μg、约100μg至约300μg、约125μg至约300μg、约150μg至约300μg、约175μg至约300μg、约200μg至约300μg、约225μg至约300μg、约250μg至约300μg、约275μg至约300μg、约1μg至约275μg、约5μg至约275μg、约10μg至约275μg、约15μg至约275μg、约25μg至约275μg、约50μg至约275μg、约75μg至约275μg、约100μg至约275μg、约125μg至约275μg、约150μg至约275μg、约175μg至约275μg、约200μg至约275μg、约225μg至约275μg、约250μg至约275μg、约1μg至约250μg、约5μg至约250μg、约10μg至约250μg、约15μg至约250μg、约25μg至约250μg、约50μg至约250μg、约75μg至约250μg、约100μg至约250μg、约125μg至约250μg、约150μg至约250μg、约175μg至约250μg、约200μg至约250μg、约225μg至约250μg、约1μg至约225μg、约5μg至约225μg、约10μg至约225μg、约15μg至约225μg、约25μg至约225μg、约50μg至约225μg、约75μg至约225μg、约100μg至约225μg、约125μg至约225μg、约150μg至约225μg、约175μg至约225μg、约200μg至约225μg、约1μg至约200μg、约5μg至约200μg、约10μg至约200μg、约15μg至约200μg、约25μg至约200μg、约50μg至约200μg、约75μg至约200μg、约100μg至约200μg、约125μg至约200μg、约150μg至约200μg、约175μg至约200μg、约1μg至约175μg、约5μg至约175μg、约10μg至约175μg、约15μg至约175μg、约25μg至约175μg、约50μg至约175μg、约75μg至约175μg、约100μg至约175μg、约125μg至约175μg、约150μg至约175μg、约1μg至约150μg、约5μg至约150μg、约10μg至约150μg、约15μg至约150μg、约25μg至约150μg、约50μg至约150μg、约75μg至约150μg、约100μg至约150μg、约125μg至约150μg、约1μg至约125μg、约5μg至约125μg、约10μg至约125μg、约15μg至约125μg、约25μg至约125μg、约50μg至约125μg、约75μg至约125μg、约100μg至约125μg、约1μg至约100μg、约5μg至约100μg、约10μg至约100μg、约15μg至约100μg、约25μg至约100μg、约50μg至约100μg、约75μg至约100μg、约1μg至约75μg、约5μg至约75μg、约10μg至约75μg、约15μg至约75μg、约25μg至约75μg、约50μg至约75μg、约1μg至约50μg、约5μg至约50μg、约10μg至约50μg、约15μg至约50μg、约25μg至约50μg、约1μg至约25μg、约5μg至约25μg、约10μg至约25μg、约15μg至约25μg、约1μg至约15μg、约5μg至约15μg、约10μg至约15μg、约1μg至约10μg、约5μg至约10μg或约1μg至约5μg的铝盐佐剂(例如，明矾)。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物每剂包含约1μg、约5μg、约10μg、约15μg、约25μg、约50μg、约75μg、约100μg、约125μg、约150μg、约175μg、约200μg、约225μg、约250μg、约275μg、约300μg、约325μg、约350μg、约375μg、约400μg、约425μg、约450μg、约475μg或约500μg的铝盐佐剂(例如明矾)。

本公开的某些实施方案包括用于制备含佐剂的寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物的方法，该方法涉及(a)将疫苗或免疫原性组合物与铝盐佐剂混合，所述疫苗或免疫原性组合物包含来自本文所述的至少一种寨卡病毒的一种或多种抗原，并且(b)在合适的条件下将混合物孵育一段时间，该时间段范围为约1小时至约24小时(例如，约16小时至约24小时)，其中至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的抗原被吸附到铝盐佐剂上。在该方法的某些实施方案中，所述至少一种寨卡病毒是包含非人细胞适应性突变(例如，蛋白NS1中的非人细胞适应性突变，诸如Trp98Gly突变)的寨卡病毒。在一些实施方案中，所述至少一种寨卡病毒是在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，所述寨卡病毒是在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。

在所述方法的一些实施方案中，将混合物在约2℃至约8℃范围的温度下孵育。在所述方法的一些实施方案中，使用本领域已知的任何合适的混合器在恒定混合下孵育混合物。在所述方法的一些实施方案中，在值的范围为约6.5至约8.5、约6.5至约8、约6.8至约7.8、约6.9至约7.6、约7至约7.5、约6.8至约8.5、约6.9至约8.5或约7至约8.5的pH下孵育混合物。在某些优选的实施方案中，在中性pH下孵育混合物。在所述方法的一些实施方案中，所述铝盐佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和铝胶85。

单磷酰脂质A(MLA)，是来自沙门氏菌的脂质A的无毒衍生物，是一种已被开发为疫苗佐剂的有效TLR-4激动剂(Evans等人(2003)Expert Rev.Vaccines 2(2)：219-229)。在临床前的鼠类研究中，已证明鼻内MLA可增强分泌以及全身性体液反应(Baldridge等人(2000)Vaccine 18(22)：2416-2425；Yang等人(2002)Infect.Immun.70(7)：3557-3565)。还已在超过120,000名患者的临床研究中，证明它是安全有效的疫苗佐剂(Baldrick等人(2002)Regul.Toxicol.Pharmacol.35(3)：398-413；Baldrick等人(2004)J.Appl.Toxicol.24(4)：261-268)。MLA通过TLR-4受体刺激先天免疫的诱导，因此能够引发针对多种感染性病原体的非特异性免疫反应，包括革兰氏阴性细和革兰氏阳性细菌、病毒和寄生虫(Baldrick等人(2004)J.Appl.Toxicol.24(4)：261-268；Persing等人(2002)Trends Microbiol.10(10增刊)：S32-37)。鼻内配制品中包含MLA应提供对先天反应的快速诱导，从病毒攻击开始引发非特异性免疫反应，同时增强疫苗抗原组分所产生的特异性反应。

因此，在一个实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含单磷酰脂质A(MLA)、3脱氧-酰化单磷酰脂质A(3D-MLA)或其衍生物作为适应性和先天性免疫的增强剂。化学上3D-MLA是3脱氧-酰化单磷酰脂质A与4、5或6条酰化链的混合物。欧洲专利0 689 454 B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)中公开了3脱氧-酰化单磷酰脂质A的优选形式。在另一个实施方案中，本公开提供了一种组合物，其包含合成脂质A、脂质A模拟物或类似物(诸如BioMira PET脂质A)，或设计为功能类似于TLR-4激动剂的合成衍生物。

其他示例性佐剂包括但不限于多肽佐剂，可通过与多肽组分共表达或与多肽组分融合产生嵌合多肽而容易地将多肽佐剂添加到本文所述的抗原中。细菌鞭毛蛋白，即鞭毛的主要蛋白组成成分，是一种佐剂，其作为佐剂蛋白受到越来越多的关注，因为它被先天免疫系统的toll样受体TLR5识别。通过TLR5进行的鞭毛蛋白信号传导通过诱导DC成熟和迁移以及巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肠上皮细胞的活化而影响先天和适应性免疫功能，从而导致促炎介质的产生。

TLR5识别鞭毛蛋白单体内的保守结构，从而阻止其响应于免疫压力而突变，该保守结构是这种蛋白独有的，并且是鞭毛功能所需的。该受体对100fM浓度敏感，但不识别完整细丝。鞭毛分解成单体是结合和刺激所需的。

作为佐剂，鞭毛蛋白具有诱导针对胃肠外或鼻内施用的异源抗原的保护性反应的有效活性，并且还报道了DNA疫苗的佐剂作用。当采用适于呼吸道病毒(诸如流感)的鞭毛蛋白时，观察到Th2偏倚，但在小鼠或猴子中没有观察到IgE诱导的证据。另外，在猴子鼻内或全身施用后，尚未报道有局部或全身炎症反应。使用鞭毛蛋白后引发的反应的Th2特性有些令人惊讶，因为已经证实以MyD88依赖性方式通过TLR5传导的鞭毛蛋白信号，以及通过TLR传导的所有其他MyD88依赖性信号均会导致Th1偏倚。重要的是，预先存在的鞭毛蛋白抗体对佐剂功效没有明显影响，使其作为多用途佐剂具有吸引力。

在许多新近鼻内疫苗试验中，共同的主题是使用佐剂和/或递送系统来提高疫苗功效。在一项此类研究中，一种含有经基因解毒的大肠杆菌不耐热肠毒素佐剂(LT R192G)的H3流感疫苗产生针对H5攻击的异型保护作用，但仅在鼻内递送后才产生。该保护作用是基于对交叉中和抗体的诱导，并展示出在新疫苗开发对于鼻腔途径的重要意义。

细胞因子，集落刺激因子(例如GM-CSF、CSF等)；肿瘤坏死因子；白介素-2、-7、-12，干扰素和其他类似的生长因子，也可以用作佐剂，因为它们容易通过与多肽成分混合或融合而包含在寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物中。

在一些实施方案中，本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物可包括通过Toll样受体起作用的其他佐剂，诸如包含5'-TCG-3'序列的核酸TLR9配体；咪唑喹啉TLR7配体；经取代的鸟嘌呤TLR7/8配体；其他TLR7配体，诸如洛索立宾(Loxoribine)、7-脱氮脱氧鸟苷、7-硫杂-8-氧代脱氧鸟苷、咪喹莫特(Imiquimod)(R-837)和雷西莫特(Resiquimod)(R-848)。

某些佐剂促进APC诸如树突状细胞对疫苗分子的吸收并将这些细胞激活。非限制性实例选自由以下组成的组：免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂，诸如毒素、细胞因子和分枝杆菌衍生物；油配制品；聚合物；胶束形成佐剂；皂苷；免疫刺激复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；MLA；和包封佐剂。

佐剂的其他实例包括诸如铝盐等药剂(诸如氢氧化铝或磷酸铝(明矾))，通常以0.05％至0.1％的缓冲盐水溶液使用(参见，例如Nicklas(1992)Res.Immunol.143:489-493)，与以0.25％溶液形式使用的糖的合成聚合物(例如

)混合，通过以在70°至101℃的温度分别热处理30秒至2分钟来使疫苗中的蛋白质聚集，以及通过交联剂的方式聚集是可能的。也可以采用通过胃蛋白酶处理的针对白蛋白的抗体(Fab片段)再活化来聚集，与细菌细胞(诸如小隐胞子虫)或内毒素或革兰氏阴性细菌的脂多糖组分混合，在生理上可接受的油媒介物(诸如甘露糖单油酸酯(Aracel A)中乳化或用作为嵌段替代物使用的20％全氟化碳(Fluosol-DA)溶液乳化。也可以使用与诸如角鲨烯和IFA等油的混合物。

DDA(溴化二甲基双十八烷基铵)是令人感兴趣的佐剂候选物，但弗氏完全和不完全佐剂以及皂皮树皂苷(诸如QuilA和QS21)也令人感兴趣。进一步的可能性包括脂多糖的聚[二(羧基苯氧基)磷腈(PCPP)衍生物，诸如单磷酰脂质A(MLA)、胞壁酰二肽(MDP)和苏氨酰基胞壁酰二肽(tMDP)。基于脂多糖的佐剂也可用于产生主要为Th1型的反应，包括例如单磷酰脂质A诸如3-脱氧-酰化单磷酰脂质A与铝盐的组合。

还已知脂质体制剂赋予佐剂作用，因此脂质体佐剂可连同寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物一起使用。

免疫刺激复合物基质类型(

基质)佐剂也可与寨卡病毒疫苗抗原和免疫原性组合物一起使用，特别是因为已证实这种类型的佐剂能够上调APC的MHC II类表达。ISCOM基质由(任选分级分离的)来自皂皮树的皂苷(三萜类化合物)、胆固醇和磷脂组成。与免疫原性蛋白诸如寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物抗原混合时，所得颗粒配制品就是称为ISCOM颗粒的配制品，其中皂苷可占60-70％w/w，胆固醇和磷脂占10-15％w/w，蛋白占10-15％w/w。关于免疫刺激复合物的组成和用途的详情可以例如在以上提到的关于佐剂的教科书中找到，但Morein B等人(1995)Clin.Immunother.3：461-475以及Barr I G和Mitchell G F(1996)Immunol.and Cell Biol.74：8-25也提供了制备完全免疫刺激复合物的有用说明。

可以在本文所述的寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物的佐剂组合中使用的皂苷，无论是否为免疫刺激复合物(iscom)形式，包括源自莫利纳皂皮树(Saponaria Molina)的树皮的皂苷(称为Quil A)及其级分，在美国专利第5,057,540号和"Saponins as vaccineadjuvants",Kensil,C.R.(1996)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 12(1-2):1-55；以及EP 0 362279 B1中有描述。Quil A的示例性级分为QS21、QS7和QS17。

β-七叶皂苷是用于寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的佐剂组合物中的另一种溶血性皂苷。在默克索引(第12版：条目3737)中将七叶皂苷描述为七叶树种子(拉丁名：Aesculus hippocastanum)的种子中存在的皂苷混合物。描述其分离是通过色谱法和纯化(Fiedler,Arzneimittel-Forsch.4,213(1953))，以及通过离子交换树脂(Erbring等人，美国专利第3,238,190号)进行。七叶皂苷的级分已被纯化，并且证实具有生物活性(Yoshikawa M等人(Chem Pharm Bull(Tokyo)1996年8月；44(8):1454-1464))。β-七叶皂苷也称为七叶素。

用于寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物中的另一种溶血性皂苷是毛地黄皂苷(Digitonin)。在默克索引(第12版，条目3204)中将毛地黄皂苷描述为源自紫花毛地黄(Digitalis purpurea)的种子并根据Gisvold等人(1934)J.Am.Pharm.Assoc.23：664；以及Ruhenstroth-Bauer(1955)Physiol.Chem.,301,621的程序纯化的一种皂苷。将其用途描述为用于胆固醇测定的临床试剂。

另一获得佐剂作用的令人感兴趣的可能性是采用Gosselin等人，1992描述的技术。简言之，相关抗原诸如本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物中的抗原的呈递可以通过使抗原与针对单核细胞/巨噬细胞上的FC受体的抗体(或抗原结合抗体片段)缀合来增强。特别是，已经证明抗原与抗-FCRI之间的缀合物会增强免疫原性，以用于疫苗接种目的。抗体可以在产生后或作为产生的一部分与寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物抗原缀合，包括通过作为与寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物抗原的任一多肽组分的融合物表达。其他可能性涉及使用靶向和免疫调节物质(例如细胞因子)。另外，也可以使用细胞因子的合成诱导物，诸如聚I:C。

合适的分枝杆菌衍生物可以选自由以下各项组成的组：胞壁酰二肽、完全弗氏佐剂、RIBI(Ribi ImmunoChem Research Inc.,Hamilton,Mont.)和海藻糖二酯(诸如TDM和TDE)。

合适的免疫靶向佐剂的实例包括CD40配体和CD40抗体或其特异性结合片段(参见上述讨论)、甘露糖、Fab片段和CTLA-4。

合适的聚合物佐剂的实例包括碳水化合物，诸如葡聚糖、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖；塑料聚合物；和乳胶，诸如乳胶珠粒。

另一种令人感兴趣的调节免疫反应的方式是将免疫原(任选地与佐剂及药学上可接受的载体和媒介物一起)包含在“虚拟淋巴结”(VLN)(由ImmunoTherapy,Inc.,360Lexington Avenue,New York,N.Y.10017-6501开发的专利医疗设备)内。VLN(一种细管状设备)模拟淋巴结的结构和功能。VLN插入皮肤下会产生无菌炎症部位，并伴有细胞因子和趋化因子激增。T细胞和B细胞以及APC对危险信号迅速做出反应，归巢到发炎部位，并在VLN的多孔基质中积聚。已经证实，当使用VLN时，对抗原产生免疫反应所需的必需抗原剂量降低，并且通过使用VLN进行疫苗接种所赋予的免疫保护作用超过了使用Ribi作为佐剂的常规免疫作用。在Gelber C等人，1998,"Elicitation of Robust Cellular and HumoralImmune Responses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical DeviceDesignated the Virtual Lymph Node",在："From the Laboratory to the Clinic,Bookof Abstracts中,1998年10月12-15日,Seascape Resort,Aptos,Calif"中简单描述了该技术。

寡核苷酸可以作为佐剂连同寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物抗原一起使用，并且可以含有两个或多个被至少三个或更多或甚至至少六个或更多核苷酸隔开的二核苷酸CpG基序。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)诱导主要的Th1反应。此类寡核苷酸是众所周知的，并且在例如WO 96/02555、WO 99/33488及美国专利第6,008,200和5,856,462号中有描述。

此类寡核苷酸佐剂可以是脱氧核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸主链是二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键，但也可以使用磷酸二酯和其他核苷酸主链诸如PNA，包括具有混合主链连接的寡核苷酸。产生硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法在美国专利第5,666,153号、美国专利第5,278,302号和WO 95/26204中有描述。

示例性的寡核苷酸具有以下序列。这些序列可含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸主链：

(SEQ ID NO：3)寡核苷酸1：TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)；

(SEQ ID NO：4)寡核苷酸2：TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG1758)；

(SEQ ID NO：5)寡核苷酸3：ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG；

(SEQ ID NO：6)寡核苷酸4：TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)；和

(SEQ ID NO：7)寡核苷酸5：TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)

替代性的CpG寡核苷酸包括上述序列，其具有无关紧要的缺失或添加。可以通过本领域已知的任何方法(例如，EP 468520)合成作为佐剂的CpG寡核苷酸。例如，可以利用自动化合成仪合成此类寡核苷酸。此类寡核苷酸佐剂的长度可以在10-50个碱基之间。另一种佐剂体系涉及含CpG的寡核苷酸和皂苷衍生物的组合，尤其是WO 00/09159中公开了CpG和QS21的组合。

已经描述了许多单相或多相乳剂体系。本领域技术人员可以很容易地使此类乳剂体系适于和寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物抗原一起使用，使得乳剂不会破坏抗原的结构。已经提出水包油乳化佐剂本身可用作佐剂组合物(EP 399 843B)，还已描述了水包油乳剂与其他活性剂的组合作为疫苗佐剂(WO 95/17210、WO 98/56414、WO 99/12565、WO 99/11241)。已经描述了其他油乳化佐剂，诸如油包水乳剂(美国专利第5,422,109号；EP 0 480982B2)和水包油包水乳剂(美国专利第5,424,067号；EP 0 480 981B)。

用于本文所述的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的油乳化佐剂可以是天然的或合成的，并且可以是矿物的或有机的。矿物油和有机油的实例对于本领域技术人员将是显而易见的。

为了使任何水包油组合物均适于人类施用，乳剂体系的油相可以包含可代谢的油。术语可代谢的油的含义是本领域众所周知的。可代谢可以定义为“能够通过代谢转化”(Dorland's Illustrated Medical Dictionary,W.B.Sanders Company，第25版(1974))。油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，其对受者无毒并且能够通过代谢转化。坚果(诸如花生油)、种子和谷物是植物油的常见来源。也可以使用合成油，并且可以包括可商购的油，诸如

等。角鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-三十六碳六烯)是一种不饱和油，在鲨鱼肝油中大量存在，而在橄榄油、小麦胚芽油、米糠油和酵母中少量存在，并且可以与寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物一起使用。角鲨烯是可代谢的油，这是因为它是胆固醇生物合成的中间体(默克索引，第10版，条目号8619)。

示例性的油乳剂是水包油乳剂，尤其是水包角鲨烯乳剂。

另外，用于寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的油乳化佐剂可包括抗氧化剂，诸如油α-生育酚(维生素E，EP 0 382 271 B1)。

WO 95/17210和WO 99/11241公开了基于角鲨烯、α-生育酚和吐温80(TM)的乳化佐剂，任选地与免疫刺激剂QS21和/或3D-MLA配制。WO 99/12565公开了通过向油相中添加固醇对这些角鲨烯乳剂进行改善。另外，可以将甘油三酯诸如三辛酸甘油酯(C27H50O6)添加至油相中以稳定乳剂(WO 98/56414)。

通过光子相关光谱法测量，在稳定的水包油乳剂中发现的油滴大小可以小于1微米，可以在大致30-600nm的范围内，直径大致为30-500nm左右或直径大致为150-500nm，尤其直径为约150nm。就这一点而言，按数量计80％的油滴可以在这些范围内，按数量计90％以上或95％以上的油滴在限定的大小范围内。油乳剂中存在的组分的量通常在以下范围内：2％至10％的油，诸如角鲨烯；以及当存在时，2％至10％的α-生育酚；和0.3至3％的表面活性剂，诸如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。油:α-生育酚的比率可以等于或小于1，因为这提供更稳定的乳剂。SPAN 85(TM)也可以约1％的水平存在。在一些情况下，本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物将进一步含稳定剂可能是有利的。

产生水包油乳剂的方法是本领域技术人员众所周知的。通常，该方法包括以下步骤：将油相与表面活性剂诸如

溶液混合，接着使用匀化器匀化，本领域技术人员将清楚的是，包括使混合物两次通过注射器针头的方法将适于匀化少量液体。同样地，本领域技术人员可以修改微流化器(M110S微流控机，在最大压力输入为6巴(输出压力为约850巴)时最多通过50次，持续2分钟)的乳化工艺来生产更小或更大体积的乳剂。这种修改可以通过常规实验而实现，该常规实验包括测量所得乳剂，直至获得具有所需直径的油滴的制剂。

可替代地，寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物可以与由以下物质组成的疫苗媒介物组合：壳聚糖(如上所述)或其他聚阳离子聚合物，聚丙交酯和聚丙交酯-乙交酯颗粒，基于聚N-乙酰葡糖胺的聚合物基质，多糖或化学改性的多糖组成的颗粒，基于脂质体和脂质的颗粒，由甘油单酯组成的颗粒等。皂苷也可以在胆固醇的存在下配制以形成微粒结构，诸如脂质体或ISCOM。此外，皂苷可以与聚氧乙烯醚或酯一起以非微粒溶液或悬浮液形式，或以微粒结构(诸如paucilamelar脂质体或ISCOM)配制。

用于本文所述的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物中的其他示例性佐剂包括SAF(Chiron,Calif.,United States)、MF-59(Chiron，参见例如Granoff等人(1997)InfectImmun.65(5):1710-1715)、SBAS系列佐剂(例如SB-AS2(含有MLA和QS21的水包油乳剂)；SBAS-4(含明矾和MLA的佐剂体系)，可从SmithKline Beecham,Rixensart,Belgium获得)、Detox

(GlaxoSmithKline)、RC-512、RC-522、RC-527、RC-529、RC-544和RC-560(GlaxoSmithKline)和其他氨基烷基氨基葡萄糖苷4-磷酸酯(AGP)，诸如在未决的美国专利申请序列号08/853,826和09/074,720中描述的那些。

佐剂的其他实例包括但不限于：Hunter

佐剂(CytRx Corp.,Norcross,Ga.)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH,Gaiberg,Germany)；硝化纤维(Nilsson和Larsson(1992)Res.Immunol.143:553-557)；基于明矾(例如氢氧化铝、磷酸铝)乳剂的配制品，包括矿物油、非矿物油、油包水或水包油乳剂，诸如Seppic ISA系列的Montamide佐剂(例如ISA-51、ISA-57、ISA-720、ISA-151等；Seppic,Paris,France)；和

(IDEC Pharmaceuticals)；OM-174(一种与脂质A有关的葡萄糖胺二糖)；利什曼原虫延伸因子；形成胶束的非离子嵌段共聚物，诸CRL 1005；和Syntex佐剂配制品。参见，例如，O'Hagan等人(2001)Biomol Eng.18(3):69-85；以及"Vaccine Adjuvants：Preparation Methods and Research Protocols"D.O'Hagan编，(2000)Humana Press。

其他示例性佐剂包括以下通式的佐剂分子：

HO(CH ₂CH₂O)n-A-R，(I)

其中，n为1-50，A为键或--C(O)--，R为C1-50烷基或苯基C1-50烷基。

一个实施方案由疫苗配制品组成，所述疫苗配制品包含通式(I)的聚氧乙烯醚，其中n为1至50、4-24或9；R组分为C1-50、C4-C20烷基或C12烷基，并且A为键。聚氧乙烯醚的浓度应在0.1-20％、0.1-10％的范围内，或在0.1-1％的范围内。示例性的聚氧乙烯醚选自具有以下的组：聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-9-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。在默克索引(第12版：条目7717)中描述了聚氧乙烯醚，诸如聚氧乙烯月桂基醚。这些佐剂分子在WO 99/52549中有描述。

如果需要，可以将根据以上通式(I)的聚氧乙烯醚与另一种助剂组合。例如，佐剂组合可包括如上所述的CpG。

用于本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的合适的药学上可接受的赋形剂的其他实例包括水、磷酸盐缓冲盐水、等渗缓冲溶液。

病毒纯化

本公开的其他方面涉及纯化寨卡病毒的方法。在一些实施方案中，所述方法包括为多个细胞接种含有寨卡病毒群的接种物，并通过空斑纯化从一个或多个经接种的细胞中获得寨卡病毒克隆分离株。在一些实施方案中，所述细胞是非人细胞(例如昆虫细胞、哺乳动物细胞等)。在一些实施方案中，所述细胞是昆虫细胞(诸如本文所述的任何蚊细胞/细胞系)。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞(诸如本文所述的任何哺乳动物细胞/细胞系)。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是猴细胞。

在一些实施方案中，寨卡病毒群是异种的(例如，包含两种或更多种基因型)。在一些实施方案中，寨卡病毒群包含寨卡病毒临床分离株(例如，来自毒株PRVABC59)和/或一种或多种先前已经在细胞培养物中传代的寨卡病毒。在一些实施方案中，空斑纯化(例如，如本文所述)允许从异种病毒群中基本上和/或完全分离(遗传上同种的)克隆分离株。在一些实施方案中，猴细胞来自VERO细胞系(例如VERO 10-87细胞)。在一些实施方案中，接种物包含人血清。在一些实施方案中，接种物包含一种或多种外源因子(例如，一种或多种污染病毒)。在一些实施方案中，空斑纯化(例如，如本文所述)允许从一种或多种外源因子中基本上和/或完全纯化(遗传上同种的)克隆分离株。

在一些实施方案中，描述的用于分离和/或纯化寨卡病毒克隆物的方法包括对寨卡病毒克隆分离株的一次或多次(例如，一次或多次、两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、五次或更多次，等等)另外的空斑纯化。在一些实施方案中，描述的用于分离和/或纯化寨卡病毒克隆分离株的方法包括使寨卡病毒克隆分离株在细胞培养物中(例如，在诸如蚊细胞系的昆虫细胞中和/或在诸如VERO细胞系的哺乳动物细胞中)传代一次或多次(例如，一次或多次、两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、五次或更多次，等等)。

本公开的其他方面涉及纯化寨卡病毒以制备疫苗或免疫原性组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括以下的一个或多个(例如，一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个或六个)步骤(以任何顺序，包括以下顺序)：对含有寨卡病毒的样品或制剂进行深层过滤；对含有寨卡病毒的样品进行缓冲液交换和/或稀释(例如，通过错流过滤(CFF))以产生渗余物；使包含寨卡病毒的样品与离子交换膜(例如，阴离子交换膜、阳离子交换膜)结合以产生被结合的级分，其中所述被结合的级分包含寨卡病毒，并将所述被结合的级分从离子交换膜上洗脱；用有效量的本文所述的任何化学灭活剂处理含有寨卡病毒的样品；用焦亚硫酸钠中和含有化学灭活的寨卡病毒的样品；和/或纯化经中和的包含化学灭活的寨卡病毒的样品(例如，通过错流过滤(CFF))。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)使含有寨卡病毒的样品通过第一深层过滤器，以产生第一洗脱液，其中所述第一洗脱液含有所述寨卡病毒；(b)通过错流过滤(CFF)对所述第一洗脱液进行缓冲液交换和/或稀释以产生第一渗余物，其中所述第一渗余物含有所述寨卡病毒；(c)使所述第一渗余物与离子交换膜结合以产生第一被结合的级分，其中所述第一被结合的级分含有所述寨卡病毒，并将所述第一被结合的级分从所述离子交换膜上洗脱以产生第二洗脱液，其中所述第二洗脱液含有所述寨卡病毒；(d)使所述第二洗脱液通过第二深层过滤器以产生第二渗余物，其中所述第二渗余物含有所述寨卡病毒；(e)用有效量的化学灭活剂处理所述第二渗余物；(f)用焦亚硫酸钠中和所述处理过的第二渗余物；以及(g)通过错流过滤(CFF)纯化所述经中和的第二渗余物。

深层过滤器可以以药筒或胶囊的形式应用，诸如使用Bio 20

深层过滤片的SUPRACAP^TM系列的深层过滤器胶囊(Pall Corporation)。其他合适的深层过滤技术和装置是本领域已知的，并且包括Sartorius PP3过滤器。在一些实施方案中，深层过滤器的孔径在约0.2μm至约3μm之间。在一些实施方案中，深层过滤器的孔径小于以下几乎任何孔径(以μm为单位)：3、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6和0.4。在一些实施方案中，深层过滤器的孔径大于以下几乎任何孔径(以μm为单位)：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6或2.8。也就是说，深层过滤器的孔径可以是上限为3、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6和0.4且独立选择的下限为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6或2.8的任何孔径范围(以μm为单位)；其中下限低于上限。

如本文所述，阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法可用于本公开的方法中以纯化从本公开的细胞上清液收获的寨卡病毒。例如，可以将澄清的病毒收获物碱化，上样到阴离子交换膜上，用盐或pH洗脱，过滤并灭活。这仅是示例性方案，并且本领域技术人员可以容易地设想其具有取代、删除、插入或重新排序的步骤的变型。

阴离子和阳离子交换色谱法都依赖于流动相中带电荷的目标大分子(例如病毒)吸引到具有相反电荷的基质上。在阳离子交换色谱法中，带负电荷的基质或膜会吸引带正电荷的大分子。在阴离子交换色谱法中，带正电荷的基质或膜会吸引带负电荷的大分子。一旦大分子结合或上样到基质上，就可以根据其特性以线性或逐步方式从基质上洗脱大分子，从而实现带不同电荷的分子的分离。这种原理可用于从其他大分子中纯化病毒。洗脱可以通过改变流动相缓冲液的pH或盐含量来实现。洗脱可以是梯度的或逐步的。如本文所述，可以通过改变流动相的pH或通过改变流动相的离子强度(例如，通过添加盐)来实现洗脱。使用各种盐进行洗脱，包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、乙酸钠、磷酸钾、氯化钙和氯化镁。在某些实施方案中，盐是NaCl。多种合适的缓冲液是本领域已知的并且在本文中有描述。使用离子交换色谱法的病毒纯化方法也是众所周知的；参见例如流感病毒的纯化，在www.pall.com/pdfs/Biopharmaceuticals/MustangQXT_AcroPrep_USD2916.pdf可在线获得。

本领域中已知的多种设备适于阳离子交换色谱法(任选地包括过滤)，诸如

S系统(Pall Corporation)，该系统使用孔径为0.65μm的阳离子交换膜。各种官能团用于阳离子交换膜，包括但不限于交联聚合物涂层中的侧接磺酸官能团。可以使用多种缓冲液使含有本公开的寨卡病毒的洗脱液与阳离子交换膜结合。示例性缓冲液包括但不限于柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液(下文描述了其他缓冲液)。在一些实施方案中，在阳离子交换色谱法(例如，在上样和/或洗脱中)使用的缓冲液含有聚山梨酸酯(例如，0.05％、0.1％、0.25％或0.5％的

-80)。

本领域中已知的多种设备适于阴离子交换色谱法(任选地包括过滤)，诸如

Q系统(Pall Corporation)，该系统使用孔径为0.8μm的阴离子交换膜。另一种合适的阴离子交换膜是SartobindQ IEXNano。各种官能团用于阴离子交换膜，包括但不限于交联聚合物涂层中的侧接季胺官能团。可以使用多种缓冲液使含有本公开的寨卡病毒的洗脱液与阴离子交换膜结合。示例性缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液(下文描述了其他缓冲液)。在一些实施方案中，在阴离子交换色谱法(例如，在上样和/或洗脱中)使用的缓冲液含有聚山梨酸酯(例如，0.05％、0.1％、0.25％或0.5％的

-80)。在一些实施方案中，病毒通过分步洗脱，例如使用250mM NaCl、500mM NaCl和750mM NaCl洗脱病毒。

疫苗和/或免疫原性组合物的配制品

本公开的其他方面涉及含有一种或多种来自本文所述的寨卡病毒的抗原的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的配制品。在一些实施方案中，寨卡病毒是纯化的灭活全寨卡病毒。在一些实施方案中，纯化的灭活全寨卡病毒在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ IDNO：1的位置98相对应的位置包含突变。在一些实施方案中，纯化的灭活全寨卡病毒在SEQID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变。在一些实施方案中，纯化的灭活全寨卡病毒在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，纯化的灭活全寨卡病毒在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。

含有来自本文所述的寨卡病毒的一种或多种抗原的本公开的此类疫苗和/或免疫原性组合物可用于治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染和/或诱导有需要的受试者的针对寨卡病毒的免疫反应，诸如保护性免疫反应。

通常，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物制备成可注射的液体溶液或悬浮液形式；还可以制备适于在注射之前溶解或悬浮在液体中的固体形式。此类制剂也可以乳化或制成干粉。活性免疫原性组合物常常与药学上可接受的并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是例如水、盐水、葡萄糖、蔗糖、甘油、乙醇等及其组合。另外，如果需要，疫苗或免疫原性组合物可以含有辅助物质，诸如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂，或增强疫苗或免疫原性组合物有效性的佐剂。

疫苗或免疫原性组合物可以常规地通过注射，例如皮下、经皮、真皮内、真皮下或肌内注射进行胃肠外施用。适于其他施用模式的其他配制品包括栓剂，并且在一些情况下还包括口服、经口、鼻内、经颊、舌下、腹膜内、阴道内、肛门和颅内配制品。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括，例如，聚亚烷基二醇或甘油三酯；此类栓剂可以由含有0.5％至10％，或甚至1-2％范围的活性成分的混合物形成。在某些实施方案中，首先使低熔点蜡，诸如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物融化，然后例如通过搅拌，将本文所述的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物均匀分散。然后将熔融均匀混合物倒入尺寸合适的模具中，使其冷却并固化。

适于鼻内递送的配制品包括液体(例如，以气雾剂或滴鼻剂形式施用的水溶液)和干粉(例如，用于在鼻腔通道内快速沉积)。配制品包括诸如药用级的甘露醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇和壳聚糖等通常采用的赋形剂。粘膜粘附剂诸如壳聚糖可用于液体或粉末配制品中，以延迟鼻内施用的配制品的粘膜纤毛清除。诸如甘露醇、山梨醇、海藻糖和/或蔗糖之类的糖可用作液体配制品中的稳定剂，以及用作干粉配制品中的稳定剂、填充剂或粉末流动剂和施胶剂。另外，佐剂诸如单磷酰脂质A(MLA)或其衍生物或CpG寡核苷酸可在液体和干粉配制品中用作免疫刺激佐剂。

适于口服递送的配制品包括液体、固体、半固体、凝胶、片剂、胶囊、锭剂等。适于口服递送的配制品包括片剂、锭剂、胶囊、凝胶、液体、食品、饮料、保健品等。配制品包括诸如药用级的甘露醇、山梨醇、海藻糖、蔗糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等通常采用的赋形剂。其他寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物可以呈溶液、混悬液、丸剂、缓释配制品或粉剂的形式，并且含有10-95％的活性成分或25-70％的活性成分。对于口服配制品，霍乱毒素是令人感兴趣的配制伴侣(以及可能的缀合伴侣)。

当寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物配制成用于阴道施用时，其可以是子宫托、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂的形式。除寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物外，任何前述配制品都可以含有本领域已知适当的药剂，诸如载体。

在一些实施方案中，本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物可配制用于全身或局部递送。此类配制品是本领域众所周知的。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏油或不挥发性油。静脉内媒介物包括液体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格氏葡萄糖的那些补充剂)等。全身和局部施用途径包括例如真皮内、局部施加、静脉内、肌内等。

本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可以与剂量配制相容的方式，并且以治疗有效和具有免疫原性的量施用。疫苗可以包含纯化的灭活全寨卡病毒，其是从空斑纯化可获得/获得的克隆分离株的形式，诸如具有突变的寨卡病毒，所述突变是如本文所述，在SEQID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置，色氨酸取代为甘氨酸。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，所述疫苗或免疫原性组合物包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。施用量取决于待治疗的受试者，包括例如个体免疫系统产生免疫反应的能力以及所需的保护程度。合适的剂量范围可以每剂包括例如约0.1μg至约100μg、约1μg至约100μg、约2μg至约100μg、约5μg至约100μg、约10μg至约100μg、约15μg至约100μg、约20μg至约100μg、约25μg至约100μg、约30μg至约100μg、约35μg至约100μg、约40μg至约100μg、约45μg至约100μg、约50μg至约100μg、约55μg至约100μg、约60μg至约100μg、约65μg至约100μg,70μg至约100μg、约75μg至约100μg、约80μg至约100μg、约85μg至约100μg、约90μg至约100μg、约95μg至约100μg、约0.1μg至约95μg、约1μg至约95μg、约2μg至约95μg、约5μg至约95μg、约10μg至约95μg、约15μg至约95μg、约20μg至约95μg、约25μg至约95μg、约30μg至约95μg、约35μg至约95μg、约40μg至约95μg、约45μg至约95μg、约50μg至约95μg、约55μg至约95μg、约60μg至约95μg、约65μg至约95μg,70μg至约95μg、约75μg至约95μg、约80μg至约95μg、约85μg至约95μg、约90μg至约95μg、约0.1μg至约90μg、约1μg至约90μg、约2μg至约90μg、约5μg至约90μg、约10μg至约90μg、约15μg至约90μg、约20μg至约90μg、约25μg至约90μg、约30μg至约90μg、约35μg至约90μg、约40μg至约90μg、约45μg至约90μg、约50μg至约90μg、约55μg至约90μg、约60μg至约90μg、约65μg至约90μg,70μg至约90μg、约75μg至约90μg、约80μg至约90μg、约85μg至约90μg、约0.1μg至约85μg、约1μg至约85μg、约2μg至约85μg、约5μg至约85μg、约10μg至约85μg、约15μg至约85μg、约20μg至约85μg、约25μg至约85μg、约30μg至约85μg、约35μg至约85μg、约40μg至约85μg、约45μg至约85μg、约50μg至约85μg、约55μg至约85μg、约60μg至约85μg、约65μg至约85μg,70μg至约85μg、约75μg至约85μg、约80μg至约85μg、约0.1μg至约80μg、约1μg至约80μg、约2μg至约80μg、约5μg至约80μg、约10μg至约80μg、约15μg至约80μg、约20μg至约80μg、约25μg至约80μg、约30μg至约80μg、约35μg至约80μg、约40μg至约80μg、约45μg至约80μg、约50μg至约80μg、约55μg至约80μg、约60μg至约80μg、约65μg至约80μg,70μg至约80μg、约75μg至约80μg、约0.1μg至约75μg、约1μg至约75μg、约2μg至约75μg、约5μg至约75μg、约10μg至约75μg、约15μg至约75μg、约20μg至约75μg、约25μg至约75μg、约30μg至约75μg、约35μg至约75μg、约40μg至约75μg、约45μg至约75μg、约50μg至约75μg、约55μg至约75μg、约60μg至约75μg、约65μg至约75μg,70μg至约75μg、约0.1μg至约70μg、约1μg至约70μg、约2μg至约70μg、约5μg至约70μg、约10μg至约70μg、约15μg至约70μg、约20μg至约70μg、约25μg至约70μg、约30μg至约70μg、约35μg至约70μg、约40μg至约70μg、约45μg至约70μg、约50μg至约70μg、约55μg至约70μg、约60μg至约70μg、约65μg至约70μg、约0.1μg至约65μg、约1μg至约65μg、约2μg至约65μg、约5μg至约65μg、约10μg至约65μg、约15μg至约65μg、约20μg至约65μg、约25μg至约65μg、约30μg至约65μg、约35μg至约65μg、约40μg至约65μg、约45μg至约65μg、约50μg至约65μg、约55μg至约65μg、约60μg至约65μg、约0.1μg至约60μg、约1μg至约60μg、约2μg至约60μg、约5μg至约60μg、约10μg至约60μg、约15μg至约60μg、约20μg至约60μg、约25μg至约60μg、约30μg至约60μg、约35μg至约60μg、约40μg至约60μg、约45μg至约60μg、约50μg至约60μg、约55μg至约60μg、约0.1μg至约55μg、约1μg至约55μg、约2μg至约55μg、约5μg至约55μg、约10μg至约55μg、约15μg至约55μg、约20μg至约55μg、约25μg至约55μg、约30μg至约55μg、约35μg至约55μg、约40μg至约55μg、约45μg至约55μg、约50μg至约55μg、约0.1μg至约50μg、约1μg至约50μg、约2μg至约50μg、约5μg至约50μg、约10μg至约50μg、约15μg至约50μg、约20μg至约50μg、约25μg至约50μg、约30μg至约50μg、约35μg至约50μg、约40μg至约50μg、约45μg至约50μg、约0.1μg至约45μg、约1μg至约45μg、约2μg至约45μg、约5μg至约45μg、约10μg至约45μg、约15μg至约45μg、约20μg至约45μg、约25μg至约45μg、约30μg至约45μg、约35μg至约45μg、约40μg至约45μg、约0.1μg至约40μg、约1μg至约40μg、约2μg至约40μg、约5μg至约40μg、约10μg至约40μg、约15μg至约40μg、约20μg至约40μg、约25μg至约40μg、约30μg至约40μg、约35μg至约40μg、约0.1μg至约35μg、约1μg至约35μg、约2μg至约35μg、约5μg至约35μg、约10μg至约35μg、约15μg至约35μg、约20μg至约35μg、约25μg至约35μg、约30μg至约35μg、约0.1μg至约30μg、约1μg至约30μg、约2μg至约30μg、约5μg至约30μg、约10μg至约30μg、约15μg至约30μg、约20μg至约30μg、约25μg至约30μg、约0.1μg至约25μg、约1μg至约25μg、约2μg至约25μg、约5μg至约25μg、约10μg至约25μg、约15μg至约25μg、约20μg至约25μg、约0.1μg至约20μg、约1μg至约20μg、约2μg至约20μg、约5μg至约20μg、约10μg至约20μg、约15μg至约20μg、约0.1μg至约15μg、约1μg至约15μg、约2μg至约15μg、约5μg至约15μg、约10μg至约15μg、约0.1μg至约10μg、约1μg至约10μg、约2μg至约10μg、约5μg至约10μg、约0.1μg至约5μg、约1μg至约5μg、约2μg至约5μg、约0.1μg至约2μg、约1μg至约2μg或约0.1μg至约1μg。在某些实施方案中，剂量可以是每剂量约0.1μg、约0.2μg、约0.3μg、约0.4μg、约0.5μg、约0.6μg、约0.7μg、约0.8μg、约0.9μg、约1μg、约1.1μg、约1.2μg、约1.3μg、约1.4μg、约1.5μg、约1.6μg、约1.7μg、约1.8μg、约1.9μg、约2μg、约2.1μg、约2.2μg、约2.3μg、约2.4μg、约2.5μg、约2.6μg、约2.7μg、约2.8μg、约2.9μg、约3μg、约4μg、约5μg、约6μg、约7μg、约8μg、约9μg、约10μg、约11μg、约12μg、约13μg、约14μg、约15μg、约16μg、约17μg、约18μg、约19μg、约20μg、约21μg、约22μg、约23μg、约24μg、约25μg、约26μg、约27μg、约28μg、约29μg、约30μg、约31μg、约32μg、约33μg、约34μg、约35μg、约36μg、约37μg、约38μg、约39μg、约40μg、约41μg、约42μg、约43μg、约44μg、约45μg、约46μg、约47μg、约48μg、约49μg、约50μg、约51μg、约52μg、约53μg、约54μg、约55μg、约56μg、约57μg、约58μg、约59μg、约60μg、约61μg、约62μg、约63μg、约64μg、约65μg、约66μg、约67μg、约68μg、约69μg、约70μg、约71μg、约72μg、约73μg、约74μg、约75μg、约76μg、约77μg、约78μg、约79μg、约80μg、约81μg、约82μg、约83μg、约84μg、约85μg、约86μg、约87μg、约88μg、约89μg、约90μg、约91μg、约92μg、约93μg、约94μg、约95μg、约96μg、约97μg、约98μg、约99μg或约100μg。可以通过Bradford测定法(Bradford等人(1976)Anal.Biochem.72：248-254)，使用限定量的重组寨卡包膜蛋白建立标准曲线，测定纯化的灭活寨卡病毒的量。因此，抗原的剂量也可以表示为寨卡包膜蛋白E的微克数(μg)(μg Env)。因此，如本段上文提到的μg抗原和下一段中提到的μg Env在本公开的含义内意思是相同的。

在一些实施方案中，可以以寨卡包膜蛋白E(Env)的微克数(μg)来测量剂量。因此，在一些实施方案中，剂量范围可包括例如每剂约0.1μg Env至约100μg Env、约1μg Env至约100μg Env、约2μg Env至约100μg Env、约5μg Env至约100μg Env、约10μg Env至约100μgEnv、约15μg Env至约100μg Env、约20μg Env至约100μg Env、约25μg Env至约100μg Env、约30μg Env至约100μg Env、约35μg Env至约100μg Env、约40μg Env至约100μg Env、约45μg Env至约100μg Env、约50μg Env至约100μg Env、约55μg Env至约100μg Env、约60μg Env至约100μg Env、约65μg Env至约100μg Env,70μg Env至约100μg Env、约75μg Env至约100μg Env、约80μg Env至约100μg Env、约85μg Env至约100μg Env、约90μg Env至约100μgEnv、约95μg Env至约100μg Env、约0.1μg Env至约95μg Env、约1μg Env至约95μg Env、约2μg Env至约95μg Env、约5μg Env至约95μg Env、约10μg Env至约95μg Env、约15μg Env至约95μg Env、约20μg Env至约95μg Env、约25μg Env至约95μg Env、约30μg Env至约95μgEnv、约35μg Env至约95μg Env、约40μg Env至约95μg Env、约45μg Env至约95μg Env、约50μg Env至约95μg Env、约55μg Env至约95μg Env、约60μg Env至约95μg Env、约65μg Env至约95μg Env,70μg Env至约95μg Env、约75μg Env至约95μg Env、约80μg Env至约95μgEnv、约85μg Env至约95μg Env、约90μg Env至约95μg Env、约0.1μg Env至约90μg Env、约1μg Env至约90μg Env、约2μg Env至约90μg Env、约5μg 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Env、约2μg Env至约5μg Env、约0.1μg Env至约2μg Env、约1μg Env至约2μg Env或约0.1μg Env至约1μg Env。在某些实施方案中，剂量可以是每剂约0.1μg Env、约0.2μg Env、约0.3μg Env、约0.4μg Env、约0.5μg Env、约0.6μg Env、约0.7μg Env、约0.8μg Env、约0.9μg Env、约1μg Env、约1.1μg Env、约1.2μg Env、约1.3μg Env、约1.4μg Env、约1.5μg Env、约1.6μg Env、约1.7μg Env、约1.8μg Env、约1.9μg Env、约2μg Env、约2.1μgEnv、约2.2μg Env、约2.3μg Env、约2.4μg Env、约2.5μg Env、约2.6μg Env、约2.7μg Env、约2.8μg Env、约2.9μg Env、约3μg Env、约4μg Env、约5μg Env、约6μg Env、约7μg Env、约8μg Env、约9μg Env、约10μg Env、约11μg Env、约12μg Env、约13μg Env、约14μg Env、约15μg Env、约16μg Env、约17μg Env、约18μg Env、约19μg Env、约20μg Env、约21μg Env、约22μg Env、约23μg Env、约24μg Env、约25μg Env、约26μg Env、约27μg Env、约28μg Env、约29μg Env、约30μg Env、约31μg Env、约32μg Env、约33μg Env、约34μg Env、约35μg Env、约36μg Env、约37μg Env、约38μg Env、约39μg Env、约40μg Env、约41μg Env、约42μg Env、约43μg Env、约44μg Env、约45μg Env、约46μg Env、约47μg Env、约48μg Env、约49μg Env、约50μg Env、约51μg Env、约52μg Env、约53μg Env、约54μg Env、约55μg Env、约56μg Env、约57μg Env、约58μg Env、约59μg Env、约60μg Env、约61μg Env、约62μg 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初次施用和加强注射的合适方案也是可变的，但以初次施用，随后接种或其他施用为代表。施加方式可以广泛地变化。施用疫苗或免疫原性组合物的任何常规方法都是适用的。这些包括在生理上可接受的固体基质或生理上可接受的分散体中，通过注射等适应性方式口服施加。疫苗或免疫原性组合物的剂量将取决于施用途径，并且可以根据要接种的人的年龄和抗原的配方而改变。如本文所述，疫苗或免疫原性组合物可具有大于0.5mL、0.5mL或小于0.5mL的单位剂量体积。例如，可以0.25mL的体积施用。

改善粘膜粘附的递送剂也可用于改善递送和免疫原性，尤其是对于鼻内、口服或基于肺部的递送配制品而言。一种此类化合物，即壳聚糖，几丁质的N-去乙酰化形式，用于许多药物制剂中。它是有吸引力的用于鼻内疫苗递送的粘膜粘附剂，这是因为它具有延迟粘膜纤毛清除并为粘膜抗原摄取和加工留出更多时间的能力。另外，它可以暂时打开紧密连接，从而可以增强抗原向NALT的经上皮运输。在最近的人类试验中，随壳聚糖一起鼻内施用但未添加任何佐剂的三价灭活流感疫苗产生的血清转化和HI滴度仅略低于肌内接种后获得的血清转化和HI滴度。

壳聚糖还可以与在鼻内作用良好的佐剂一起配制，诸如经基因解毒的大肠杆菌不耐热肠毒素突变体LTK63。这在壳聚糖赋予的递送和粘附益处之上增加了免疫刺激作用，产生增强的粘膜和全身反应。

最后，应该指出的是，壳聚糖配制品还可以制备成干粉形式，已经证实干粉形式可以改善疫苗稳定性，并且与液体配制品相比，引起粘膜纤毛清除的进一步延迟。在最近的人类临床试验中看到了这一点，该临床试验涉及用壳聚糖配制的鼻内干粉白喉类毒素疫苗，其中鼻内途径与传统肌内途径一样有效，并具有分泌性IgA反应的额外益处。疫苗的耐受性也非常良好。含壳聚糖和MLA或其衍生物的鼻内干粉状炭疽疫苗在兔中诱导的反应比肌内接种更强，并且对气溶胶孢子攻击也具有保护作用。

鼻内疫苗代表一种示例性配制品，因为与更善于影响下呼吸道的胃肠外施用的疫苗大不相同，它们可以影响上呼吸道和下呼吸道。这对于诱导对基于变应原的疫苗的耐受性和诱导对基于病原体的疫苗的免疫力可能是有益的。

鼻内疫苗除了在上呼吸道和下呼吸道提供保护作用外，还避免了针头接种的并发症，并提供了一种通过微粒和/或可溶性抗原与鼻咽相关淋巴组织(NALT)相互作用来诱导粘膜和全身性体液和细胞反应的手段。

本公开的疫苗和/或免疫原性组合物是药学上可接受的。它们可以包括除抗原和佐剂以外的组分，例如，它们通常将包括一种或多种药物载体和/或赋形剂。对此类组分的深入讨论在Gennaro(2000)Remington：The Science and Practice of Pharmacy.第20版，ISBN：0683306472中可用。

为了控制张力，优选包括生理盐，诸如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以1至20mg/ml存在。可能存在的其他盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。

本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可包含一种或多种缓冲液。典型的缓冲液包括：磷酸盐缓冲液；Tris缓冲液；硼酸盐缓冲液；琥珀酸盐缓冲液；组氨酸缓冲液(特别是氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲液。通常包含在5-20mM范围内的缓冲液

疫苗或免疫原性组合物的pH通常将在5.0至8.5或5.0至8.1之间，更通常在6.0至8.5之间，例如在6.0至8.0之间，在6.5至8.0，在6.5至7.5之间，在7.0至8.5之间，在7.0至8.0之间，或在7.0至7.8之间。因此，本公开的制造工艺可以包括在包装之前调节散装疫苗的pH的步骤。

疫苗或免疫原性组合物优选是无菌的。优选是无热原的，例如每剂含<1EU(内毒素单位，标准量度)，优选每剂<0.1EU。它优选不含谷蛋白。

在某些实施方案中，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可以包含有效浓度的洗涤剂。在一些实施方案中，洗涤剂的有效量可包括但不限于约0.00005％v/v至约5％v/v或约0.0001％v/v至约1％v/v。在某些实施方案中，洗涤剂的有效量为约0.001％v/v、约0.002％v/v、约0.003％v/v、约0.004％v/v、约0.005％v/v、约0.006％v/v、约0.007％v/v、约0.008％v/v、约0.009％v/v或约0.01％v/v。不希望受到理论的束缚，洗涤剂有助于将本公开的疫苗和/或免疫原性组合物保持呈溶液，并且有助于防止疫苗和/或免疫原性组合物聚集。

合适的洗涤剂包括，例如，聚氧乙烯山梨醇酐酯表面活性剂(称为“吐温”)、辛苯聚醇(例如辛苯聚醇-9(Triton X 100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)、十六烷基三甲基溴化铵(‘CTAB’)和脱氧胆酸钠，尤其适于分裂或表面抗原疫苗。洗涤剂可以仅以痕量存在。痕量的其他残留组分可以是抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。在一些实施方案中，洗涤剂含有聚山梨醇酯。在一些实施方案中，洗涤剂的有效浓度包括约0.00005％v/v至约5％v/v的范围。

疫苗和/或免疫原性组合物优选储存在2℃至8℃之间。理想情况下，应将其避开直射光。抗原和乳剂通常是混合的，但它们最初可以呈用于临时混合的独立组分的试剂盒的形式呈现。当施用于受试者时，疫苗和/或免疫原性组合物通常将为水性形式。

本公开的方法

本公开的其他方面涉及使用本文所述的疫苗和/或免疫原性组合物治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒和/或诱导有需要的受试者的对寨卡病毒的免疫反应的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自至少一种寨卡病毒(例如，克隆寨卡病毒分离株、包含非人细胞适应性突变(诸如蛋白NS1中的非人细胞适应性突变)的寨卡病毒，诸如呈通过空斑纯化获得/可获得的克隆分离株形式的纯化的灭活全寨卡病毒，诸如具有突变的寨卡病毒，所述突变是如本文所述在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸)的一种或多种抗原。本公开的其他方面涉及使用本文所述的疫苗和/或免疫原性组合物治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒和/或诱导有需要的受试者的对寨卡病毒的免疫反应的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有具有突变的纯化的灭活全寨卡病毒，所述突变是在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸。本公开的其他方面涉及使用本文所述的疫苗和/或免疫原性组合物治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒和/或诱导有需要的受试者的对寨卡病毒的免疫反应的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有具有突变的纯化的灭活全寨卡病毒，所述突变是在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。本公开的其他方面涉及使用本文所述的疫苗和/或免疫原性组合物治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒和/或诱导有需要的受试者的对寨卡病毒的免疫反应的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有具有突变的纯化的灭活全寨卡病毒，所述突变是在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸，其中所述寨卡病毒源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物来治疗或预防该受试者的寨卡病毒感染的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自至少一种寨卡病毒(例如，克隆寨卡病毒分离株、包含非人细胞适应性突变(诸如蛋白NS1中的非人细胞适应性突变)的寨卡病毒，诸如呈通过空斑纯化获得/可获得的克隆分离株形式的纯化的灭活全寨卡病毒，诸如具有突变的寨卡病毒，所述突变是如本文所述在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸)的一种或多种抗原。

本公开涉及通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物来治疗或预防该受试者的寨卡病毒感染的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有具有突变的纯化的灭活全寨卡病毒，所述突变是在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ IDNO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸。本公开涉及通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物来治疗或预防该受试者的寨卡病毒感染的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有具有突变的纯化的灭活全寨卡病毒，所述突变是在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。本公开涉及通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物来治疗或预防该受试者的寨卡病毒感染的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有具有突变的纯化的灭活全寨卡病毒，所述突变是在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸，其中所述寨卡病毒源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。

在一些实施方案中，本公开涉及通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物来诱导该受试者针对寨卡病毒的免疫反应的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自至少一种寨卡病毒(例如，克隆寨卡病毒分离株、包含非人细胞适应性突变(诸如蛋白NS1中的非人细胞适应性突变)的寨卡病毒，诸如呈通过空斑纯化获得/可获得的克隆分离株形式的纯化的灭活全寨卡病毒，诸如具有突变的寨卡病毒，所述突变是如本文所述在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸)的一种或多种抗原。本公开涉及通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物来诱导该受试者针对寨卡病毒的免疫反应的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有具有突变的纯化的灭活全寨卡病毒，所述突变是在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。本公开涉及通过向有需要的受试者施用治疗有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物来诱导该受试者针对寨卡病毒的免疫反应的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有具有突变的纯化的灭活全寨卡病毒，所述突变是在SEQID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的色氨酸取代为甘氨酸，其中所述寨卡病毒源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。

在一些实施方案中，所述施用步骤在受试者中诱导针对寨卡病毒的保护性免疫反应。在一些实施方案中，所述受试者是人。在一些实施方案中，所述受试者已妊娠或准备妊娠。

本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物可通过鼻内、经口、口服、经颊、舌下、肌内、腹膜内、真皮内、透皮、真皮下、阴道内、肛门、颅内、静脉内、经皮或皮下施用疫苗的手段用于保护或治疗对病毒感染敏感或遭受病毒感染的受试者(例如哺乳动物，诸如人)。本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的全身施用方法可包括常规注射器和针头，或设计用于弹道递送固体疫苗的设备(WO 99/27961)，或无针压力液体喷射设备(美国专利第4,596,556号；美国专利第5,993,412号)或透皮贴剂(WO 97/48440；WO 98/28037)。本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物也可以应用于皮肤(透皮或经皮递送WO 98/20734；WO98/28037)。因此，本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物可以包括预先填充有寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物的用于全身性施用的递送设备。因此，提供了在受试者(例如，哺乳动物，诸如人)中治疗或预防寨卡病毒感染和/或诱导免疫反应的方法，其包括向受试者施用本公开的疫苗或免疫原性组合物的步骤并且任选地包括施用佐剂和/或载体，其中所述疫苗或免疫原性组合物是通过胃肠外或全身途径施用的。

本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可通过经由粘膜途径，诸如口服/饮食或鼻腔途径，施用疫苗或免疫原性组合物的手段，用于保护或治疗对病毒感染敏感或遭受病毒感染的受试者(例如哺乳动物，诸如人)。替代的粘膜途径是阴道内和直肠内。粘膜施用途径可以是通过鼻腔途径，称为鼻内疫苗接种。鼻内疫苗接种的方法在本领域中是众所周知的，包括将疫苗的液滴、喷雾剂或干粉形式施用至待免疫个体的鼻咽内。雾化或雾状疫苗配制品是本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的潜在形式。肠溶配制品，诸如用于口服施用的胃抗性胶囊和粒剂，用于直肠或阴道施用的栓剂，也是本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的配制品。

本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物也可以通过口服途径施用。在此类情况下，药学上可接受的赋形剂还可以包括碱性缓冲液、肠溶胶囊或微粒。本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物也可以通过阴道途径施用。在此类情况下，药学上可接受的赋形剂还可以包括乳化剂、聚合物(诸如

)和其他已知的阴道乳膏和栓剂的稳定剂。寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物也可以通过直肠途径施用。在此类情况下，赋形剂还可包括本领域已知的用于形成直肠栓剂的蜡和聚合物。

在一些实施方案中，施用步骤包括一次或多次施用。施用可以是单剂量方案或多剂量(初免-加强)方案。在多剂量方案中，各种剂量可以通过相同或不同的途径给予，例如胃肠外初免和粘膜加强，粘膜初免和胃肠外加强等。通常，它们将通过相同的途径给予。多个剂量通常将间隔至少1周(例如，约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约16周等)施用。间隔25-30天(例如28天)给予两剂特别有用。

本公开的方法包括施用治疗有效量或免疫原性量的本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物。治疗有效量或免疫原性量可以是将在施用其的未感染、已感染或未暴露的受试者中诱导保护性免疫反应的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的量。此类反应通常将导致受试者对疫苗的分泌、细胞和/或抗体介导的免疫反应的发展。通常，此类反应包括但不限于以下一种或多种效应；产生任何免疫学类别的抗体，诸如免疫球蛋白A、D、E、G或M；B和T淋巴细胞增殖；向免疫细胞提供激活、生长和分化信号；辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞扩增。

在一些实施方案中，在施用含有本公开的非人细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物后，在受试者中诱导的保护性免疫反应强于在施用含有不适于非人细胞生长的和/或包含不同的非人细胞适应性突变的寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的免疫反应。在一些实施方案中，在施用含有本公开的非人细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物后，在受试者中诱导的保护性免疫反应比在施用含有不适于非人细胞生长的和/或包含不同的非人细胞适应性突变的寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的免疫反应强至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。测量保护性免疫反应的方法是本领域普通技术人员通常已知的。

在一些实施方案中，施用含有本公开的非人细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物在受试者中诱导产生针对寨卡病毒的中和抗体。在一些实施方案中，施用含有本公开的非人细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物在受试者中诱导产生的针对寨卡病毒的中和抗体的量高于在施用含有不适于非人细胞生长的和/或包含不同的非人细胞适应性突变的寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的中和抗体的量。在一些实施方案中，施用含有本公开的非人细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物在受试者中诱导产生的针对寨卡病毒的中和抗体的量比在施用含有不适于非人细胞生长的和/或包含不同的非人细胞适应性突变的寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的中和抗体的量高至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些实施方案中，施用含有本公开的非人细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物在受试者中诱导产生的针对寨卡病毒的中和抗体的量是在施用含有不适于非人细胞生长的和/或包含不同的非人细胞适应性突变的寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的中和抗体的量的至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍或至少约1000倍。测量受试者体内的中和抗体的方法是本领域普通技术人员通常已知的。

优选地，治疗有效量或免疫原性量足以引起疾病症状的治疗或预防。除其他因素外，所需的确切量还将根据以下因素而改变：所治疗的受试者；待治受试者的年龄和总体状况；受试者免疫系统合成抗体的能力；所需的保护程度；所治病状的严重程度；选择的特定寨卡病毒抗原及其施用模式。适当的治疗有效量或免疫原性量可以由本领域技术人员容易地确定。治疗有效量或免疫原性量将落在可以通过常规试验测定的相对较宽的范围内。

参考以下实施例将更充分地理解本公开。然而，不应将以下实施例解释为以任何方式限制本公开的任何方面或范围。

实施例

实施例1：寨卡病毒克隆株的产生

本实施例描述了具有已知研究历史的寨卡病毒(ZIKAV)毒株的产生。

材料和方法

Vero细胞维持

将一小瓶WHO Vero 10-87细胞在水浴中快速解冻，然后在36℃+/2℃、5％CO2下直接接种到T-75cm2烧瓶中19mL预先温热的DMEM(杜尔贝科改良的最小必需培养基)中，该培养基含有青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺40mM和10％FBS。使细胞生长至融合并使用TryplE传代培养。将该烧瓶扩展至两个T-185cm2烧瓶，使细胞生长至融合并传代培养至31xT-185cm2烧瓶中，并生长直至细胞达到100％融合。通过胰蛋白酶消化收集细胞，以800x g离心10分钟，并使其以1.9x107个细胞/mL的浓度重悬于含有10％FBS和10％DMSO的DMEM中。如上所述将一小瓶Vero细胞快速解冻并使其复苏，转移到T-75cm2烧瓶中。这些传代培养两次，在13个T-185cm2烧瓶中产生细胞库。胰蛋白酶消化后，将细胞以800x g离心，并以4.68x105个细胞/mL的浓度重悬于冷冻培养基(含10％FBS和10％DMSO的DMEM)中。将该细胞库等分到冷冻管中。

使Vero细胞在含有青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺和10％FBS(cDMEM-10％-FBS)的DMEM中生长并维持。使用TryplExpress维持细胞并进行胰蛋白酶消化。病毒吸附前两天，为6孔板接种，在3mL cDMEM-10％-FBS中具有4-5x 105个细胞/孔或在T-25cm2烧瓶中的5mLcDMEM-10％-FBS中具有7x 105个细胞，或在96孔板的0.1mL cDMEM-10％-FBS中具有1x 104个细胞/孔。每天监测培养箱以维持指示温度。将Vero细胞系储存在液氮中。

空斑测定

通过在6孔板中生长的Vero细胞新鲜融合单层中的空斑滴定来测定病毒滴度。将冷冻的等分试样解冻，并在96孔板的cDMEM-0％-FBS中制备等分试样的十倍稀释系列。在接种Vero细胞单层膜之前，将稀释的病毒维持在冰上。在测定时，从6孔板中吸出生长培养基，并将各100μL的病毒稀释液添加至孔中。病毒在36℃±2℃、5％CO2下吸附60分钟，同时频繁(每10分钟)摇动板以防止细胞层干燥。病毒吸附后，将4mL维持在40-41℃的第一琼脂糖覆盖层(1X cDMEM-2％-FBS+0.8％琼脂糖)添加到每个孔中。使琼脂糖在室温下固化30分钟，然后将板在36℃+/2℃、5％CO2下倒置孵育4-6天。第4天添加2mL含160μg/mL中性红活性染料的第二琼脂糖覆盖层。第5天和第6天空斑显现。

通过TCID50测定进行病毒定量

也通过在96孔板中生长的Vero细胞新鲜融合单层中的滴定来测定病毒滴度。将冷冻的等分试样解冻，并在96孔板的cDMEM-2％-FBS稀释剂中制备等分试样的十倍稀释系列。在接种Vero细胞单层膜之前，将稀释的病毒维持在冰上。在测定时，从96孔板中吸出生长培养基，并将各100μL的病毒稀释液添加至孔中。将板在36℃+/2℃、5％CO2下孵育5天。使用Reed/Muench计算器计算50％组织培养感染剂量(TCID50)滴度。

试验品

从疾病控制和预防中心(CDC)收到寨卡病毒株PRVABC59(于干冰上的一个0.5mL小瓶)。通过RT-PCR确认寨卡病毒的鉴定。该毒株通过PCR检验为甲病毒属(Alphavirus)和支原体(mycoplasma)污染阴性。表1汇总了该信息。

表1：PRVABC59毒株信息

测序

根据制造商的方案，使用QIAampViral RNA Mini Spin试剂盒从每个分离株的稳定病毒收获物中提取RNA。使用从每个分离株中提取的RNA创建和扩增涵盖整个寨卡病毒基因组的6个cDNA片段。在1％琼脂糖/TBE凝胶上分析扩增的cDNA片段的大小和纯度，随后使用Qiagen快速凝胶提取试剂盒进行凝胶纯化。使用ABI 3130XL遗传分析仪测序仪进行自动测序反应。使用Lasergene SeqMan软件分析测序数据。

结果

寻找一种具有已知研究历史的ZIKAV毒株，该毒株与美国当前的ZIKAV爆发有关。为此，选择了ZIKAV毒株PRVABC59。为了生成适于在Vero细胞中生长的特征明确的病毒，首先使ZIKAV PRVABC59在Vero细胞中扩增(P1)。

在4mL的cDMEM-0％-FBS中以0.01的MOI感染多个烧瓶的100％融合的Vero细胞(T-175cm2)。使病毒在36℃±2℃、5％CO2下吸附到单层上60分钟，然后施加20mL的cDMEM-0％-FBS以在36℃±2℃、5％CO2下进行病毒扩增。接种后每天监测细胞层的细胞病变效应(CPE)(图1)。96小时后，通过收集培养基并通过离心(600x g，4℃，10分钟)进行澄清，收集上清液。通过添加海藻糖至最终浓度为18％w/v而使收获物稳定。将散装物等分到0.5mL冷冻管中并储存在-80℃下。

在Vero细胞单层上通过TCID50测定法分析稳定的P1收获物是否存在感染性病毒。从第0小时开始每天取等分试样，监测生长动力学。到第72小时达到峰值滴度(图2)。

从第3天开始在6孔Vero细胞单层上对收获物进行滴定来空斑纯化P1材料。第6天空斑显现，并通过在塑料板底部的不同且分开的空斑周围画一个圆圈，标识出10个待分离的空斑。使用无菌大口径移液管对琼脂糖塞进行提取，同时刮擦孔底并用cDMEM-10％-FBS冲洗，挑取空斑。将琼脂糖塞添加到0.5mL的cDMEM-10％-FBS中，涡旋并标记为PRVABC59P2a-j，并且放置在培养箱中于36℃±2℃、5％CO2下过夜。

将三个空斑(PRVABC59 P2a-c)进行进一步纯化。将每种分离株纯净地一式两份地平板接种到新鲜的6孔Vero细胞单层上。将该P2/P3过渡物进行空斑纯化，并标记PRVABC59P3a-j。

将六个空斑(PRVABC59 P3a-f)进行最后一轮纯化。将每种分离株纯净地一式两份地平板接种到新鲜的6孔Vero细胞单层上。将该P3/P4过渡物进行空斑纯化，并标记PRVABC59 P4a-j。

将来自P4空斑纯化的六个空斑(PRVABC59 P4a-f)在T-25cm2烧瓶中的Vero细胞单层上进行盲传。将每种空斑挑取物稀释在2mL cDMEM-0％-FBS中-使1mL在36℃±2℃、5％CO2下吸附1小时；另1mL用海藻糖稳定(最终浓度为18％v/v)，并储存在<-60℃下。病毒吸附后，将cDMEM-0％-FBS添加到每个烧瓶中，并使其在36℃±2℃、5％CO2下生长4天。收获病毒上清液，通过离心(600x g，4C，10分钟)进行澄清，在18％海藻糖中稳定并等分并且储存在<-60℃下。通过TCID50测试该P5种子的寨卡病毒效力(图3)。

用6种PRVABC59克隆物(P5a-f)中的每一种在4mL cDMEM-0％-FBS中以0.01的MOI感染T-175cm2烧瓶的Vero细胞融合单层。使病毒在36℃+/2℃、5％CO2下吸附60分钟，之后向每个烧瓶添加20mL的cDMEM-0％-FBS，并使其在36℃+/2℃、5％CO2下生长。每天监测Vero细胞单层的健康状况和CPE。如图所示，在第3天和第5天收获病毒(图4)。合并第3天和第5天的P6毒株收获物，用18％海藻糖稳定，等分并储存在<-60℃下。

测试6种PRVABC59克隆物(P6a-f)中的每一种的寨卡病毒体外效力(图5)。通过两种不同的方法(TCID50和空斑滴定)测定滴度。TCID50是通过目测CPE(显微镜)并测量显示CPE(黄色)的孔与红色(无CPE)的孔的吸光度差(A560-A420)来计算的。在酶标仪上读板，并将其应用于与显微镜读取的板相同的计算器(吸光度)。两种评分技术之间的TCID50值非常相似，而通过空斑滴定获得的值较低。

P6病毒的产生和表征的概要示于下面的表2中。

表2：产生克隆ZIKAV毒株的病毒传代和表征概要

由于黄病毒的包膜蛋白是该病毒的主要免疫原性部分，因此寻求一种与原始分离株的包膜糖蛋白序列极为相似的分离的寨卡病毒克隆物。PRVABC59克隆物P6a、P6c、P6d和P6f在包膜区中的核苷酸990处含有G→T突变(G990T)，在包膜残基330处产生Val→Leu的氨基酸突变，而PRVABC59克隆物P6b和P6e的包膜基因相对于参考毒株(GenBank参考KU501215.1)是相同的(表3和图6)。

表3：PRVABC59 P6克隆物的测序

然后对寨卡包膜序列中缺乏突变的两种克隆物进行全基因组测序。测序结果汇总在上面的表3中。序列分析揭示，两种克隆物在NS1区中的核苷酸292处发生T→G取代，从而在NS1残基98处产生Trp→Gly突变。稍后还通过深度测序证实了该突变。NS1 W98G突变位于ZIKAV NS1翼结构域的缠绕环中，这已与膜缔合、与包膜蛋白的相互作用以及潜在六聚体NS1的形成有关。虽然在黄病毒中其他色氨酸残基(W115、W118)是高度保守的，但W98不保守(图7)。然而，有趣的是，在11种不同的ZIKAV毒株中，包括来自非洲和亚洲谱系的那些毒株，观察到W98残基100％保守。表4中汇总了每种毒株中鉴定出的突变。

表4：PRVABC59 P6克隆物中鉴定出的突变汇总

对ZIKAV PRVABC59 P6原液进行表型分析，以表征ZIKAV克隆物。如图8所示以及如图9中量化的，与具有大小空斑混合群体的P1病毒相比，每个克隆分离株由相对均一的大空斑组成。这些数据表明成功分离了单个ZIKAV克隆物。

接下来，分析ZIKAV PRVABC59 P6克隆物在Vero细胞中的生长动力学。在无血清生长培养基中，用0.01TCID50/个细胞的每种ZIKAV P6克隆物感染Vero细胞。每天取病毒上清液样品，同时通过TCID50测定法测定感染滴度。对于所有P6克隆物，峰值滴度出现在第3天和第4天之间(～9.0log10 TCID50/mL)。各种P6克隆物的生长动力学没有显著差异(图10)。

综上所述，结果表明成功产生了寨卡病毒种子。这种种子选择需要了解病毒的生长史、动力学、产量、基因型和表型。重要的是，寨卡病毒株的克隆分离允许从污染因子(例如可以是在人亲本分离株中的外源因子)中成功纯化病毒。有趣的是，三次连续的空斑纯化成功地快速选择了Vero细胞适应性病毒(毒株P6a-f)，其中这些毒株能够在无血清Vero细胞培养物中良好地复制，毒株P6a、c、d和f在病毒包膜蛋白中带有突变，而毒株p6b和p6e在病毒NS1蛋白中获得突变(对病毒包膜没有修饰)。另外，Vero适应性毒株能够实现从这些毒株繁殖的后续病毒传代的高效且可再现的生长和制造。不希望受理论的束缚，在毒株P6a、c、d和f中观察到的Env-V330L突变可能是体外适应的结果，因为在Vero细胞中传代时也观察到Env 330的突变(Weger-Lucarelli等人2017.Journal of Virology)。由于包膜蛋白是寨卡病毒的主要免疫原性表位，因此在Env中含有Vero适应性突变的毒株可能对疫苗免疫原性产生负面影响。不希望受理论束缚，蛋白NS1中的适应性突变似乎不但会增强病毒复制，而且可以减少或以其他方式抑制不良突变，诸如寨卡病毒株的包膜蛋白E(Env)内的突变的发生。另外，已知NS1可以在病毒的生命周期中与包膜蛋白结合。该突变(NS1 W98G)可能与改变NS1在下游加工期间与病毒缔合并且可能与病毒共纯化的能力有关。还已知NS1具有免疫原性，并且可与疫苗的免疫反应有关。

实施例2：源自P6b和P6e毒株的纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)的临床前免疫原性和功效

以下实施例描述了源自P6b和P6e毒株的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)在CD1和AG129小鼠中的临床前免疫原性和功效。如实施例1中所述，从流行性相关的PRVABC59毒株产生六种克隆物，并选择两种(P6b和P6e)用于进一步的临床前免疫原性和功效研究。

材料和方法

寨卡病毒疫苗的纯化、灭活和配制

产生并表征了许多适合用于临床前免疫原性和功效研究的灭活ZIKAV疫苗。通过以0.01的MOI感染多个烧瓶的融合Vero细胞，从P6b和P6e毒株中扩增出病毒。病毒在36℃±2℃/5％CO2下吸附1小时。吸附后，向每个烧瓶中添加20mL的cDMEM-0％-FBS，并在36℃±2℃/5％CO2下孵育5天。感染后第3和5天收集细胞上清液，并通过离心澄清细胞碎片。

对于每种分离株，合并澄清的上清液，在含有18％海藻糖的DMEM中稳定化并保存在<-60℃下。将合并的澄清病毒上清液在37℃水浴中解冻，并在4℃下用全能核酸酶处理过夜。进行全能核酸酶处理后，将每份样品施加于Sartorius PP3深层过滤器。深层过滤后，将每份样品施加到Centricon Plus-70切向流过滤(TFF)设备上。将渗余物进行缓冲液交换，稀释并施加到Sartorius SartobindQ IEXNano上。将每份样品施加到第二SartoriusSartobindQ IEXNano上，并用250mM、500mM和750mM NaCl，使用3步洗脱工艺洗脱。在进行MonoQ色谱法和稀释后，将每份250mM洗脱液施加到Centricon Plus-70错流过滤(CFF)设备上进行缓冲液交换，用PBS稀释至35mL，并保存在2-8℃下。

对于福尔马林灭活，向每份纯化的样品中滴加新鲜制备的1％甲醛，并轻轻旋动，以获得0.02％的最终甲醛浓度。在室温(～22℃)下孵育样品14天，每天倒置一次。在室温下用焦亚硫酸钠中和甲醛15秒，然后施加到Centricon Plus-70切向流过滤(TFF)设备上。通过添加50mL原料药缓冲液(10mM NaH2PO4、50mM NaCl，6％蔗糖，pH 7.4)进行四次缓冲液交换。然后将每份样品用原料药缓冲液稀释至15mL，使用0.2m注射器式滤器灭菌，等分至无菌带塞玻璃小瓶(每瓶0.5mL)中，并于<-60℃冷冻。

通过TCID50测定法和双重感染测定法确认病毒灭活。简要地，将原料药样品施加到C6/36细胞中并使其扩增6天。将来自C6/36细胞的上清液施加到Vero细胞上，并监测CPE8天。对于药物产品配制，将小瓶的PIZV药物解冻，根据样品类型合并，并在有或无铝胶的PBS中稀释至1μg/mL或10μg/mL(Brenntag；最终浓度为0.5mg/mL，0.050mg/剂)，并且在2-8℃下边轻轻搅拌边孵育过夜。然后将所得药物产品批次等分到无菌带塞玻璃小瓶中，并保存在2-8℃下直至使用。图11提供了用于制备药物产品的步骤的概要。

小鼠免疫接种和攻击

对于免疫原性研究，将六周龄的雄性和雌性Swiss-ICR(CD-1)小鼠分为6组(n＝10只/组)。第0天，通过肌内(i.m.)途径(2x 0.05mL注射)向第1-5组的小鼠接种0.1mL疫苗。向第6组的小鼠接种PBS作为安慰剂对照。第28天和第56天使用与第0天相同的剂量和疫苗类型对小鼠进行加强免疫。在第-1天(免疫前)、第27天(初免)、第42天(加强1)和第70天(加强2)收集血样。

对于免疫原性和功效研究，将四周龄的雄性和雌性AG129小鼠分为7组(n＝5只/组)。第0天，通过肌内(i.m.)途径(2x 0.05mL注射)向第1-6组的小鼠接种0.1mL疫苗。向第7组的小鼠接种PBS作为安慰剂对照。第28天使用与第0天相同的剂量和疫苗类型对小鼠进行加强免疫。在第-1天(免疫前)、第27天(初免)和第55天(加强)从尾静脉采集血样。安乐死时，在用异氟烷进行深麻醉下(末期)通过心脏穿刺使小鼠出血。第56天，用104个空斑形成单位(PFU)的ZIKAV PRVABC59对小鼠进行腹膜内攻击。

血清转移

从接种PIZV且受到攻击的AG129小鼠中收集血清，并且在合并后冷冻(表6的第1、2、4和5组)。解冻混合血清，并通过将混合血清在PBS中稀释三倍来产生试验品。使用AG129正常小鼠血清在PBS中的3倍稀释液产生安慰剂。

将试验品以0.1mL腹膜内注射的形式施用给AG129小鼠(向对照小鼠施用相等体积的安慰剂制品)。然后用104个空斑形成单位的寨卡病毒株PRVABC59(100μL)对动物进行腹膜内攻击。

在第-11天(免疫接种前)从十只小鼠通过尾部放血收集允许的血量(按重量计)作为全血。第1天(初次，循环Nab)和第4天(病毒血症)通过尾部放血从每只小鼠收集全血。致死性攻击后的末期放血是通过在深麻醉下进行大体积心脏穿刺进行的，然后通过颈脱位法实施安乐死。将血样收集在微容器SST血清分离凝胶管中，使其凝结至少30分钟，然后通过离心(10,000x g，2分钟)分离血清，并于-80℃冷冻。

空斑减少中和试验

如先前所述，通过空斑减少中和试验(PRNT)测定中和抗体的滴度(参见例如，Osorio等人Lancet Infect Dis.2014Sep；14(9):830-8)。

报告病毒颗粒(RVP)中和测定

通过在96孔板中生长的Vero细胞中用恒定量的寨卡RVP滴定血清样品来分析中和抗体的滴度。RVP含有寨卡(毒株SPH2012)的prME蛋白和基于登革病毒的海肾荧光素酶报道基因。简言之，将血清在56℃热灭活30分钟，稀释，然后在37℃下与RVP一起孵育。然后将血清/RVP混合物与Vero细胞混合，并在37℃±2℃/5％CO2下孵育72小时，然后用荧光素酶底物进行检测。使用JMP11非线性4参数分析对数据进行分析，将其归一化为阳性跟踪对照，并报告50％有效剂量(EC50)。

除非指出相反，否则所有其他实验方法均如以上实施例1中所述进行。

结果

为了评估PIZV候选物在6周龄的雄性和雌性CD-1小鼠中的免疫原性，通过肌内途径用0.1μg(+明矾)、1.0μg(+明矾)剂量的源自ZIKAV PRVABC69 P6b或P6e病毒株的疫苗对多组CD-1小鼠(N＝10只/组)进行免疫接种。为了评估对佐剂的需要，为一组动物接种0.1μg源自P6e且缺乏明矾佐剂的疫苗。在第0、28和56天进行疫苗接种，第6组接受PBS作为安慰剂对照(图12A和表5)。

表5：PIZV配方和在CD-1小鼠中的攻击

分组	毒株	剂量(μg)	明矾(μg)	N
					1	P6b	0.1	0.50	10
2	P6b	1.0	0.50	10
					3	P6e	0.1	0.50	10
4	P6e	1.0	0.50	10
					5	P6e	0.1	-	10
6	安慰剂(PBS)	-	-	10

疫苗接种后，通过RVP中和测定法测试初次(第27天)、二次(第40天)和三次(第70天)免疫接种后收集的血清样品的ZIKAV特异性中和抗体(图12B)。与PBS安慰剂对照组相比，在接受第一剂量后二十七天，在接种了源自任一含明矾的克隆物的PIZV的小鼠中，观察到轻微的中和抗体反应。重要的是，这种反应在第二次免疫接种后(第40天)显著增加，但在第三次免疫接种后(第70天)没有另外增强。在接种无佐剂的疫苗的小鼠中未观察到中和抗体反应(图12B)。

为了评估PIZV候选物的免疫原性和保护功效，在第1天和第28天通过肌内途径用0.1μg剂量(+明矾)、1.0μg剂量(+明矾)或0.1μg剂量(-明矾)的源自ZIKAV PRVABC59 P6b或P6e原液的疫苗对4周龄的AG129小鼠组(n＝5只/组)进行免疫接种(图13A和表6)。

表6：PIZV配方和在AG129小鼠中的攻击

接种疫苗后，在第56天用104PFU的ZIKAV PRVABC59(低传代)对接种疫苗的小鼠和对照小鼠进行腹膜内攻击。测试在初次(D27)和二次(D55)免疫接种后收集的血清样品的ZIKAV特异性中和抗体反应(图13B和表7)。只有接受高剂量的含明矾佐剂的疫苗的组(第2组和第5组)在单次免疫接种后引起中和抗体反应，中和抗体反应加强后急剧增加。相反，接受低剂量或高剂量的含明矾佐剂的疫苗的组在第二剂量后产生高中和抗体反应。接受两剂疫苗后，无论其剂量或源自P6克隆物，接受含明矾佐剂的疫苗的多组小鼠之间无统计学差异。

表7：ZIKAV特异性中和抗体反应

攻击后21天，还监测了所有组的死亡率、发病率和体重减轻。攻击后检测病毒血症，并通过空斑滴定进行定量。如通过空斑减少中和试验(PRNT)测定法，以及同等二次中和测定法所评估的那样，接种用明矾配制的低剂量或高剂量PIZV候选物的小鼠(第1、2、4和5组)受到完全保护免受致死性ZIKAV攻击(表8)。在接种疫苗的小鼠中未观察到体重减轻或疾病的临床体征，在攻击后三天都没有可检测到的感染性病毒血症，并且用低剂量或高剂量抗原+明矾佐剂疫苗接种的所有小鼠存活到攻击后21天(图14-16)。相反，对所有原初小鼠的攻击在攻击后第2天导致高病毒血症，并且在攻击后第10至18天导致发病率/死亡率(中位存活期＝D13)。另外，对接种了源自毒株P6b的无明矾佐剂的低剂量疫苗的小鼠的攻击，在攻击后第2天导致高病毒血症，并且中位存活天数与安慰剂对照组相似，而接种了源自克隆物e的无明矾佐剂的低剂量疫苗的小鼠仍受到部分保护，中位存活期为19天。这些结果表明用明矾进行免疫接种更有效，可能需要二次免疫接种，并且低剂量与高剂量同样有效。

表8：血清中和抗体滴度

另外，测试了由全灭活的P7b和P7e病毒(分别从P6b和P6e毒株再一次传代)产生的疫苗原料药(DS)中NS1的存在。使用预先涂有对亚洲和非洲谱系的寨卡病毒NS1都具有反应性但对登革NS1无交叉反应性的单克隆抗体的板，进行夹心ELISA。制备DS的双份的2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀释液，并使用重组纯化的NS1，一式两份以0-8ng/mL的浓度与标准曲线进行比较。制备单独的DS缓冲液的双份稀释液作为阴性对照。用抗NS1 HRP缀合物检测结合的NS1，并从含有匹配DS样品的孔中测得的吸光度中减去仅含DS缓冲液的孔的吸光度(A450-A630)。夹心ELISA的结果示于下面表9中。有趣的是，观察到NS1与疫苗原料药制剂共纯化，这表明病毒NS1可能是全灭活病毒疫苗的免疫原性组分。

表9：NS1 ELISA

接下来测试了抗体被动转移后赋予免受野生型寨卡病毒攻击的保护作用所需的中和抗体(Nab)的阈值。(表10A和B)。

表10A：AG129小鼠的被动转移研究设计

分组	试验品	血清稀释	IP前预测的Nab滴度
				1	100μL	1/3	6827/3.83
2	100μL	1/9	2276/3.36
				3	100μL	1/27	759/2.88
4	100μL	1/81	253/2.40
				5	100μL	1/243	84/1.93
6	100μL	1/729	28/1.45
				7	100μL	1/2187	9/0.97
8	100μL	PBS	-

表10B：AG129小鼠的被动转移研究的时间

描述	研究天数
		被动转移	第0天
初次放血(上午)	第1天
		攻击(下午)	第1天
病毒血症放血	第4天
		末期放血	存活者第29天

将来自接种疫苗并受到攻击的AG129小鼠的混合血清在PBS中连续稀释3倍，并向7组(N＝5只/组)的5-6周龄的AG129小鼠腹膜内注射。免疫前的AG129小鼠血清用作安慰剂对照(第8组)。被动转移后(～16-19小时后)，在进行病毒攻击之前，从每只小鼠收集全血并通过离心分离血清，用于测定循环中和抗体的滴度(图17)。就在病毒攻击之前，各组小鼠(指定的第1、2、3、4、5、6、7、8组)的平均log10中和抗体滴度分别为2.69、2.26、1.72、1.30、<1.30、<1.30、<1.30、<1.30。

ZIKV nAb被动转移后二十四小时，用104pfu的ZIKV PRVABC59对小鼠进行腹膜内攻击。攻击后，每天对动物称重并且每天监测1-3次疾病体征，持续28天。根据症状给予每只动物临床评分(表11)。垂死和/或表现出明显的神经病学体征(临床评分≥2)的动物实施人道安乐死并计为非存活者。

表11：监测发病率和死亡率时给出的临床评分的说明

在对照组(第8组)和第5-7组中，攻击后9天开始出现疾病体征，相应地体重减轻(图18)。攻击后三天，从每只动物收集全血并通过离心分离血清。使用空斑滴定测定法分析血清样品中是否存在感染性ZIKV(图19)。第1-8组小鼠的平均感染滴度(log10 pfu/mL)分别为：1.66、2.74、4.70、4.92、7.24、7.54、7.54和7.46。重要的是，第1-4组中具有可检测水平的ZIKV中和抗体(≥1.30log10)的小鼠的病毒血症水平显著低于对照小鼠(滴度低102.5-106.0倍)(p＝0.0001、0.0003、0.0007和0.0374)。这些结果表明，可检测水平的ZIKV中和抗体(≥1.30log10)以剂量依赖性方式减轻病毒血症。

第1-8组小鼠的中位存活天数分别是：未确定、第17天、第17天、第13天、第11天、第11天、第11天和第10天(图20)。重要的是，具有可检测的ZIKV中和抗体滴度的各组小鼠(第1-4组)的存活曲线与对照组(第8组)相比在统计学上不同(分别地，p＝0.0019、0.0019、0.0019、0.0153)。这些结果表明，可检测水平(≥1.30log10)的ZIKV中和抗体以剂量依赖性方式延迟疾病发作。

最后，将每只动物的ZIKV中和抗体滴度相对于其相应的病毒血症滴度作图，并进行线性回归分析。观察到攻击后第3天ZIKV中和抗体滴度与病毒血症水平之间高度负相关的关系(图21)。被动转移研究的结果汇总示于下表12中。

表12：被动转移结果的汇总

虽然在该实验中接受ZIKAV中和抗体的各组小鼠未受到完全保护免于致死性ZIKAV攻击，但证明在具有可检测水平的循环ZIKAV中和抗体滴度的各组小鼠中，呈剂量依赖性方式病毒血症水平降低和疾病发作延迟。

总的来说，来自CD-1和AG129小鼠研究的临床前数据表明，源自单独且特征明确的病毒克隆物的PIZV具有免疫原性并且能够提供针对野生型ZIKAV攻击的保护作用。重要的是，低剂量和高剂量在两剂之后都引起相似的中和抗体反应，并针对致死性ZIKAV攻击提供了相似水平的保护作用。有趣的是，接种了无佐剂的PIZV候选物的小鼠也显示出部分保护作用免受ZIKAV攻击。疫苗抗血清显著减低了被动免疫的AG129小鼠的病毒血症，并延长了对致死性ZIKAV攻击的存活期。这些结果还证明，在ZIKAV高度易感的AG129小鼠模型中，特征明确的PIZV候选物对ZIKAV感染高度有效。

另外，发现第7代的PRVABC59(来自PRVABC59 P6e)的序列在遗传上与第6代相同。鉴于黄病毒通常被认为在遗传上不稳定，这令人惊讶。选择PRVABC59 P6e作为原始毒种前体，这部分是由于其7代以上的遗传稳定性。不希望受到理论的束缚，据信这种增强的遗传稳定性可能是由于NS1翼结构域中的单个氨基酸取代(W98G)所致，因为这是在Vero细胞适应性PRVABC59 P6基因组中观察到的唯一突变。另外，遗传稳定性和同种性是有利的，因为它降低了变异性而增加了可用于疫苗配制的后续毒株的重现性生产。

实施例3：P6a和P6e毒株表型的临床前评估

材料和方法

AG129小鼠(缺乏干扰素α/β和γ受体)对ZIKV感染和疾病(包括脑部严重病变)敏感。用104和103pfu的ZIKV第6代克隆物a(P6a)和e(P6e)对14周龄的AG129小鼠进行腹膜内感染。

每天对小鼠称重并监测(最多28天)是否有疾病的临床体征(体重减轻、皮毛起皱、姿势驼背、嗜睡、四肢无力、部分/完全麻痹)。另外，如实施例1所述，通过对攻击后三天收集的血清样品的空斑滴定进行病毒血症分析。

结果

P6e感染导致100％的死亡率(中位存活时间＝12.5天)，而P6a感染仅导致33％的死亡率(中位存活时间＝未确定)(图22)。与此相符的是，与PRVABC59 P6a感染的小鼠相比，preMVS P6e感染的小鼠显示出更大的体重减轻(3)。在PRVABC59 P6a或P6e感染的各组小鼠之间发现组平均病毒血症水平无统计学差异(图24)。这些数据表明，单独的生长动力学可能不是关键的决定因素(因为两个毒株在体外产生相似的病毒血症和相似的峰值滴度)，并且包膜蛋白的特征对于(野生型毒株的)毒力和(灭活候选物的)免疫原性可能很重要。

实施例4：源自P6e毒株的纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)的临床免疫原性和功效

以下实施例描述了纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)在黄病毒未感染的患者中的临床免疫原性和功效研究。

产生并表征了许多适合用于临床免疫原性和功效研究的纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)。

灭活的寨卡病毒活性剂不再能够感染可以被尚未灭活的寨卡病毒感染的宿主细胞。例如，灭活寨卡病毒不再能够感染Vero细胞和对Vero细胞产生细胞病变效应。

可以通过Bradford测定法(Bradford等人(1976)Anal.Biochem.72：248-254)，使用限定量的重组寨卡包膜蛋白建立标准曲线，测定纯化的灭活寨卡病毒的量。

纯化的寨卡病毒的纯度可以通过尺寸排阻色谱法测定。在当前实施例中，在尺寸排阻色谱法中纯化的寨卡病毒的主峰可为尺寸排阻色谱法曲线下总面积的85％以上。

研究疫苗(PIZV)是指在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中用200μg氢氧化铝Al(OH)3作为佐剂配制的纯化的福尔马林灭活的寨卡病毒。将最终的液体配制产品装入一次性小瓶中，并用防拆密封件密封。研究疫苗以0.5mL的2剂量方案(每剂2、5或10μg抗原)以IM方式(肌内)注射(间隔28天)。

注射用氯化钠(NaCl)0.9％溶液用作安慰剂。它以一次性小瓶的形式提供。它是无菌、透明的无色氯化钠液体溶液，不含仅设计用于胃肠外使用的防腐剂。安慰剂以0.5mL的2剂量方案以IM方式注射(间隔28天)。

测试方法

PRNT测定法：如先前所述，通过空斑减少中和试验(PRNT)测定中和抗体的滴度(参见Protection of Rhesus monkeys against dengue virus challenge aftertetravalent live attenuated dengue virus vaccination.J.Infect.Dis.193,1658–1665(2006).Muthumani K,Griffin BD,Agarwal S等人In vivo protection againstZIKV infection and pathogenesis through passive antibody transfer and activeimmunisation with a prMEnv DNA vaccine.NPJ Vaccines 2016；1：16021)。用于PRNT测定开发的寨卡毒株是PRVABC59。

免疫结果测量：

定义：

血清阳性(PRNT)：滴度≥LOD(检测限)

血清阴性(PRNT)：滴度<LOD(检测限)

血清转化(PRNT)：在最初血清阴性的受试者中疫苗接种后的滴度≥LOD

LOD(PRNT)＝10

低于LOD的分配值＝5

LLoQ(资格下限，PRNT)＝26

低于LLoQ(资格下限)的分配值＝13

报告病毒颗粒(RVP)中和测定：通过在96孔板中生长的Vero细胞中用恒定量的寨卡RVP滴定血清样品来分析中和抗体的滴度。RVP含有寨卡(毒株SPH2012)的prME蛋白和基于登革病毒的海肾荧光素酶报道基因。简言之，将血清在56℃热灭活30分钟，稀释，然后在37℃下与RVP一起孵育。然后将血清/RVP混合物与Vero细胞混合，并在37℃±2℃/5％CO2下孵育72小时，然后用荧光素酶底物进行检测。使用JMP11非线性4参数分析对数据进行分析，将其归一化为阳性跟踪对照，并报告50％有效剂量(EC50)。

研究说明

纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)在18至49岁的黄病毒未感染的和初免的健康成人中的1期、随机、观察者设盲、安慰剂对照的安全性、免疫原性和剂量范围研究

研究设计示于图25中。设计这项研究以依序入组18至49岁之间黄病毒未感染的和黄病毒初免的健康成人。这两个连续群组各由120名受试者(计划)组成，这些受试者随机分配为4组，每组30名受试者，以接受PIZV疫苗三种剂量中的一种或盐水安慰剂。疫苗接种方案由间隔28天施用的2个剂量组成。该实施例中的数据仅与黄病毒未感染的受试者有关(n＝124)，预计将有黄病毒初免的受试者的进一步数据。该实施例提供了来自“黄病毒未感染的群组”在第57天后(第2剂后28天)的首次期中分析的数据。来自黄病毒初免群组的数据不属于该期中分析，因为在首次期中分析时对该组的招募仍在进行。

总之，将受试者随机分为四个研究组，分别接受两剂安慰剂(盐水)或浓度为2μg、5μg和10μg的纯化的灭活寨卡疫苗(PIZV)。该研究涉及在第1天和第29天肌内注射疫苗(或安慰剂)，并在研究的第-15、1、8、29、36、57、211、393、767天采集血样。使用第-15天的血样确定黄病毒的血清状态筛查和资格筛查。第1、29、57天的样品用于进行免疫原性评估。在第8天和第36天进行安全性实验室试验。将在第211、393和767天评估免疫力的持久性。

根据第2剂后28天的数据，纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)在18-49岁之间黄病毒未感染的成人中是安全且具有免疫原性的。

主要目的

该研究的主要目的是描述间隔28天给予的两剂PIZV的安全性，并从三种不同的抗原浓度(2、5或10μg)中选择一个剂量水平用于后续临床研究。主要终点是：在施用每种剂量的PIZV或安慰剂后的7天内经历了诱发性局部和全身不良事件(AE)的受试者的百分比，以及在疫苗接种后的28天内经历非严重的非诱发性AE和严重不良事件(SAE)的受试者的百分比。

次要目的

次要目的是描述黄病毒未感染的成人在第1剂后28天和第2剂后28天对纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)的免疫反应。与这些目的有关的次要终点是在所考虑的时间点中和抗ZIKV抗体的几何平均滴度(GMT)、血清阳性率(SPR)和血清转化率(SCR)。

数据分析由一组独立的非盲统计学家和程序员进行，他们可以访问个体治疗任务。所有参与进行试验的人员对个体受试者治疗任务设盲。研究小组只能访问小组级别的非盲结果。

研究群体：

总共124名受试者入组黄病毒未感染的研究群组，并且纳入安全集(SS)，其由接受了至少一剂PIZV或安慰剂的所有随机受试者组成。其中，118名(占SS的95.2％)纳入随机受试者的完全分析集(FAS)，这些随机受试者接受了至少一剂研究疫苗(PIZV)/安慰剂，在基线时以及在疫苗接种后至少一次提供有效血清学结果。一百一十三(113)名受试者(占SS的91.1％)纳入FAS中没有与免疫原性分析相关的重大方案违背的受试者的符合方案集(PPS)中。分析集呈现于表14。

表14：分析集

安全集＝所有接受至少一(1)剂PIZV或安慰剂的随机受试者

完全分析集＝所有接受至少一剂PIZV或安慰剂并提供有效基线和至少一项疫苗接种后血清学结果的随机受试者

符合方案集＝FAS中没有重大方案违背的所有受试者

SS中的受试者是35.3±8.91岁(平均值±标准差)，并且分布为18-29岁年龄段28.2％且30-49岁年龄段71.8％。妇女占群组的54.8％。关于人种和种族方面，研究参与者为白人(81.5％)、黑人(14.5％)和“非西班牙裔”(93.5％)。SS中的平均BMI为27.5±4.05(平均值±标准差)。四个研究组中人口统计特征(年龄、性别、身高、体重、BMI和种族)总体相似。在安慰剂组中女性占比更高，她们占研究参与者的66％，而在其他两组中，性别分布更为均衡。表15中呈现了人口统计和基线特征。

在研究开始时检查安全性实验室参数和生命体征，作为纳入标准的一部分。这些规定生命体征必须在正常限值范围内(即低于FDA毒性分级量表中指示的1级)，并且安全性实验室试验必须在正常限值范围内或不高于FDA毒性分级量表中所定义的1级。

表15：人口统计和基线特征(安全集)

BMI＝重量(kg)/身高²(m²)。

注1：年龄是使用知情同意日期计算的。

注2：只有在选择多个人种类别时，多人种类别中所包括的受试者。

安全性/反应原性

在接受疫苗(PIZV)的群体中诱发性局部不良事件(AE)的总体报告发生率高于安慰剂组。疼痛是最常报告的注射部位诱发性AE。在第1剂后，PIZV组30.0％至38.7％的受试者经历疼痛，相比之下安慰剂组为13.8％。在第2剂后，疼痛发生率与第1剂后相似：在PIZV组中为29.6％至40％，在安慰剂组中为14.3％。第1剂后疼痛的强度报告为轻度，在第2剂后报告为轻度至中度，其中5μg PIZV组中的2名受试者(6.7％)和10μg PIZV组中的1名受试者(3.3％)报告中度疼痛。不超过9.7％的受试者报告了其他诱发性局部AE(红斑、肿胀和硬结)。

疼痛的发作发生在第1天(对于90％的受试者而言)或第2天(对于3名受试者而言)。安慰剂组或PIZV组中的任何受试者在第5天后均未报告疼痛。

在第1剂后，PIZV组中30％至48.4％的受试者和安慰剂组中41.4％的受试者报告了任何性质的诱发性全身AE。在第2剂后，发生率在PIZV组中为10％至33.3％，在安慰剂组中为27.6％。总体上81.3％(第1剂)和75％(第2剂)的诱发性全身AE被判定为与研究疫苗相关。两剂后，报告最多的全身性事件是头痛、疲劳和肌痛。

大多数全身性AE报告为轻度，即不干扰日常活动。中等强度较少发生的：

第1剂后，PIZV组6.7-12.9％的受试者和17.2％的安慰剂接受者；

第2剂后，PIZV组0-3.3％的受试者和安慰剂组中的10.3％。

曾有一份关于严重AE的报告：安慰剂组的一名受试者经历发热。该研究参与者在接受第二次研究疫苗接种后4天，经口测得的温度为39.4℃。研究人员未将这种发热判定为与研究有关。

7天中四个组内诱发性全身AE均有不同的报告。发热、疲劳、关节痛和肌痛事件的发作主要在疫苗接种后的2天期间，并且因头痛和不适而有所不同。除了安慰剂组中受试者在第4天报告严重发热外，在疫苗接种后的2天期间报告发热。

表16中示出了疫苗接种后7天的诱发性局部和全身不良事件的发生率。

表16：疫苗接种后7天的诱发性局部和全身不良事件的发生率(安全集)

N＝具有可用信息的受试者数量；n(％)＝报告特定AE的受试者的数量(百分比)。

总共30.6％的受试者在任何剂量后的28天内报告了非诱发性AE(不包括长期的诱发性AE)：PIZV组为21.9-38.7％，安慰剂组为36.7％。这些AE主要是感染、侵染(13.7％)和神经系统病症(3.2％：头痛、偏头痛、眩晕)。全部强度均为轻度至中度。

非诱发性AE被认为与三名受试者(2.4％)接种研究疫苗有关。报告的事件是：

在第1剂后，5μg PIZV组中的一名受试者出现眩晕，而2μg PIZV组中的一名受试者出现潮红。

在第2剂后，10μg PIZV组中一名受试者出现眼睛瘙痒和流泪增加。

这些的强度为轻度至中度，从疫苗接种后的第1天或第2天开始，持续1至3天，并且都已消退。

一名受试者由于第1剂后出现头痛而中止了接种研究疫苗。该受试者接受PIZV并且在疫苗接种后1天经历头痛。头痛发作36天后消退。在从第1剂开始到第2剂后28天的时期内，未报告严重不良事件(SAE)。

疫苗接种后7天内观察到的血液安全性实验室参数相对于基线的变化很小，例如从正常到轻度或从轻度到中度AE，在四组受试者中所占百分比相当。尿液分析参数在所有时间点均正常，或各组和访视的分级类别相似。

免疫原性

表17呈现了通过PRNT测量的寨卡病毒中和抗体的几何抗体滴度(EC50)以及每个疫苗剂量后的血清阳性率和血清转化率。

PIZV疫苗在黄病毒未感染的成人中具有免疫原性。所有受试者在基线时均为血清阴性。对最初寨卡病毒抗体呈血清阴性的受试者的疫苗接种在两剂任何剂量的PIZV疫苗后，在所有受试者中引起血清阳性：第1剂后血清转化率范围为69.23％至96.43％，第2剂后为100％。在考虑的整个期间，安慰剂组的所有受试者均保持血清阴性。

在第1剂后对血清阳性率和每次施用后对GMT均观察到剂量范围效应。在第一剂后，几乎所有接受10μg PIZV剂量的受试者(96.4％)均已产生针对寨卡病毒的中和抗体。在三个PIZV组中，第二剂导致GMT比第1剂增加10倍以上。

表17：施用每剂PIZV之前和之后28天的寨卡病毒中和抗体(EC₅₀)(PRNT)的血清阳性率、血清转化率和GMT

N＝PPS中具有可用PRNT数据的受试者数量；

血清阳性定义为滴度≥10；血清转化定义为：基线时的血清阴性受试者(滴度<10)在疫苗接种后滴度≥10；结果<10分配的滴度为5；滴度≥10(检测限)和<26(定量下限)分配的值为13。

根据表17使用PRNT确定的几何平均滴度在图26中以图形方式示出。根据表17使用PRNT确定的实现血清转化的受试者的百分比在图27中以图形方式示出。

第1剂和第2剂之后中和滴度的分布分别在图28和29中以反向累积分布曲线示出。

除了用PRNT测定法测量免疫反应外，还用RVP中和测定法测试样品。表18呈现了通过RVP测定法测量的寨卡病毒中和抗体(EC50)的几何抗体滴度。RVP测定结果显示PRNT数据的相似剂量范围效应，随着PIZV剂量的增加，GMT逐渐升高。

表18：疫苗接种之前和之后28天的寨卡病毒中和抗体(EC₅₀)(RVP)的GMT(符合方案集)

N＝PPS中具有可用RVP数据的受试者数量；

结论

对于在黄病毒未感染的群组中评价的所有抗原剂量而言，PIZV疫苗耐受良好且安全。在所有组中均报告诱发性全身AE，并没有随着剂量强度的增加而明显增加，并且强度为轻度至中度。报告的局部诱发性AE在各组中的强度也为轻度至中度。在四个研究组中，非诱发症状的报告频率相似。总体而言，该疫苗在黄病毒未感染的受试者中具有免疫原性，并且观察到阳性剂量范围反应。

序列表

<110> 武田疫苗股份有限公司

美利坚合众国, 由健康及人类服务 部部长代表

<120> 寨卡疫苗和免疫原性组合物及其使用方法

<130> T08289WO

<150> US 62/581500

<151> 2017-11-03

<150> US 62/592995

<151> 2017-11-30

<160> 27

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 351

<212> PRT

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 1

Asp Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly

1 5 10 15

Thr Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr

20 25 30

Lys Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln

35 40 45

Ala Trp Glu Asp Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu

50 55 60

Asn Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu

65 70 75 80

Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro

85 90 95

Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro

100 105 110

His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys

115 120 125

Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro

130 135 140

Leu Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe

145 150 155 160

Gly Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser

165 170 175

Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu

180 185 190

Ala Val His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp

195 200 205

Thr Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu

210 215 220

Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp Gly Ile Glu Glu Ser Asp

225 230 235 240

Leu Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr

245 250 255

Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Met Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu

260 265 270

Leu Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu

275 280 285

Glu Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser

290 295 300

Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro Pro

305 310 315 320

Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg

325 330 335

Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met Val Thr

340 345 350

<210> 2

<211> 10675

<212> DNA

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 2

gttgttgatc tgtgtgaatc agactgcgac agttcgagtt tgaagcgaaa gctagcaaca 60

gtatcaacag gttttatttt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 120

aaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtgag 180

cccctttggg ggcttgaaga ggctgccagc cggacttctg ctgggtcatg ggcccatcag 240

gatggtcttg gcgattctag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct 300

catcaataga tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaacaataa agaagttcaa 360

gaaagatctg gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaaga agagacgagg 420

cgcagatact agtgtcggaa ttgttggcct cctgctgacc acagctatgg cagcggaggt 480

cactagacgt gggagtgcat actatatgta cttggacaga aacgatgctg gggaggccat 540

atcttttcca accacattgg ggatgaataa gtgttatata cagatcatgg atcttggaca 600

catgtgtgat gccaccatga gctatgaatg ccctatgctg gatgaggggg tggaaccaga 660

tgacgtcgat tgttggtgca acacgacgtc aacttgggtt gtgtacggaa cctgccatca 720

caaaaaaggt gaagcacgga gatctagaag agctgtgacg ctcccctccc attccaccag 780

gaagctgcaa acgcggtcgc aaacctggtt ggaatcaaga gaatacacaa agcacttgat 840

tagagtcgaa aattggatat tcaggaaccc tggcttcgcg ttagcagcag ctgccatcgc 900

ttggcttttg ggaagctcaa cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat 960

tgccccggca tacagcatca ggtgcatagg agtcagcaat agggactttg tggaaggtat 1020

gtcaggtggg acttgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggttgtgtca ccgtaatggc 1080

acaggacaaa ccgactgtcg acatagagct ggttacaaca acagtcagca acatggcgga 1140

ggtaagatcc tactgctatg aggcatcaat atcagacatg gcttctgaca gccgctgccc 1200

aacacaaggt gaagcctacc ttgacaagca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac 1260

gttagtggac agaggctggg gaaatggatg tggacttttt ggcaaaggga gcctggtgac 1320

atgcgctaag tttgcatgct ccaagaaaat gaccgggaag agcatccagc cagagaatct 1380

ggagtaccgg ataatgctgt cagttcatgg ctcccagcac agtgggatga tcgttaatga 1440

cacaggacat gaaactgatg agaatagagc gaaagttgag ataacgccca attcaccgag 1500

agccgaagcc accctggggg gttttggaag cctaggactt gattgtgaac cgaggacagg 1560

ccttgacttt tcagatttgt attacttgac tatgaataac aagcactggt tggttcacaa 1620

ggagtggttc cacgacattc cattaccttg gcacgctggg gcagacaccg gaactccaca 1680

ctggaacaac aaagaagcac tggtagagtt caaggacgca catgccaaaa ggcaaactgt 1740

cgtggttcta gggagtcaag aaggagcagt tcacacggcc cttgctggag ctctggaggc 1800

tgagatggat ggtgcaaagg gaaggctgtc ctctggccac ttgaaatgtc gcctgaaaat 1860

ggataaactt agattgaagg gcgtgtcata ctccttgtgt actgcagcgt tcacattcac 1920

caagatcccg gctgaaacac tgcacgggac agtcacagtg gaggtacagt acgcagggac 1980

agatggacct tgcaaggttc cagctcagat ggcggtggac atgcaaactc tgaccccagt 2040

tgggaggttg ataaccgcta accccgtaat cactgaaagc actgagaact ctaagatgat 2100

gctggaactt gatccaccat ttggggactc ttacattgtc ataggagtcg gggagaagaa 2160

gatcacccac cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcatttg aagccactgt 2220

gagaggtgcc aagagaatgg cagtcttggg agacacagcc tgggactttg gatcagttgg 2280

aggcgctctc aactcattgg gcaagggcat ccatcaaatt tttggagcag ctttcaaatc 2340

attgtttgga ggaatgtcct ggttctcaca aattctcatt ggaacgttgc tgatgtggtt 2400

gggtctgaac acaaagaatg gatctatttc ccttatgtgc ttggccttag ggggagtgtt 2460

gatcttctta tccacagccg tctctgctga tgtggggtgc tcggtggact tctcaaagaa 2520

ggagacgaga tgcggtacag gggtgttcgt ctataacgac gttgaagcct ggagggacag 2580

gtacaagtac catcctgact ccccccgtag attggcagca gcagtcaagc aagcctggga 2640

agatggtatc tgcgggatct cctctgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggagatcagt 2700

agaaggggag ctcaacgcaa tcctggaaga gaatggagtt caactgacgg tcgttgtggg 2760

atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acagagattg cccgtgcctg tgaacgagct 2820

gccccacggc tggaaggctt gggggaaatc gtatttcgtc agagcagcaa agacaaataa 2880

cagctttgtc gtggatggtg acacactgaa ggaatgccca ctcaaacata gagcatggaa 2940

cagctttctt gtggaggatc atgggttcgg ggtatttcac actagtgtct ggctcaaggt 3000

tagagaagat tattcattag agtgtgatcc agccgttatt ggaacagctg ttaagggaaa 3060

ggaggctgta cacagtgatc taggctactg gattgagagt gagaagaatg acacatggag 3120

gctgaagagg gcccatctga tcgagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt cccacacatt 3180

gtggacagat ggaatagaag agagtgatct gatcataccc aagtctttag ctgggccact 3240

cagccatcac aataccagag agggctacag gacccaaatg aaagggccat ggcacagtga 3300

agagcttgaa attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaacatg 3360

tggaacaaga ggaccatctc tgagatcaac cactgcaagc ggaagggtga tcgaggaatg 3420

gtgctgcagg gagtgcacaa tgcccccact gtcgttccgg gctaaagatg gctgttggta 3480

tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agaaagcaac ttagtaaggt caatggtgac 3540

tgcaggatca actgatcaca tggaccactt ctcccttgga gtgcttgtga tcctgctcat 3600

ggtgcaggaa gggctgaaga agagaatgac cacaaagatc atcataagca catcaatggc 3660

agtgctggta gctatgatcc tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcta agcttgcaat 3720

tttgatgggt gccaccttcg cggaaatgaa cactggagga gatgtagctc atctggcgct 3780

gatagcggca ttcaaagtca gaccagcgtt gctggtatct ttcatcttca gagctaattg 3840

gacaccccgt gaaagcatgc tgctggcctt ggcctcgtgt cttttgcaaa ctgcgatctc 3900

cgccttggaa ggcgacctga tggttctcat caatggtttt gctttggcct ggttggcaat 3960

acgagcgatg gttgttccac gcactgataa catcaccttg gcaatcctgg ctgctctgac 4020

accactggcc cggggcacac tgcttgtggc gtggagagca ggccttgcta cttgcggggg 4080

gtttatgctc ctctctctga agggaaaagg cagtgtgaag aagaacttac catttgtcat 4140

ggccctggga ctaaccgctg tgaggctggt cgaccccatc aacgtggtgg gactgctgtt 4200

gctcacaagg agtgggaagc ggagctggcc ccctagcgaa gtactcacag ctgttggcct 4260

gatatgcgca ttggctggag ggttcgccaa ggcagatata gagatggctg ggcccatggc 4320

cgcggtcggt ctgctaattg tcagttacgt ggtctcagga aagagtgtgg acatgtacat 4380

tgaaagagca ggtgacatca catgggaaaa agatgcggaa gtcactggaa acagtccccg 4440

gctcgatgtg gcgctagatg agagtggtga tttctccctg gtggaggatg acggtccccc 4500

catgagagag atcatactca aggtggtcct gatgaccatc tgtggcatga acccaatagc 4560

catacccttt gcagctggag cgtggtacgt atacgtgaag actggaaaaa ggagtggtgc 4620

tctatgggat gtgcctgctc ccaaggaagt aaaaaagggg gagaccacag atggagtgta 4680

cagagtaatg actcgtagac tgctaggttc aacacaagtt ggagtgggag ttatgcaaga 4740

gggggtcttt cacactatgt ggcacgtcac aaaaggatcc gcgctgagaa gcggtgaagg 4800

gagacttgat ccatactggg gagatgtcaa gcaggatctg gtgtcatact gtggtccatg 4860

gaagctagat gccgcctggg atgggcacag cgaggtgcag ctcttggccg tgccccccgg 4920

agagagagcg aggaacatcc agactctgcc cggaatattt aagacaaagg atggggacat 4980

tggagcggtt gcgctggatt acccagcagg aacttcagga tctccaatcc tagacaagtg 5040

tgggagagtg ataggacttt atggcaatgg ggtcgtgatc aaaaacggga gttatgttag 5100

tgccatcacc caagggagga gggaggaaga gactcctgtt gagtgcttcg agccctcgat 5160

gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttaga cttgcatcct ggagctggga aaaccaggag 5220

agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaacaaga ctccgtactg tgatcttagc 5280

tccaaccagg gttgtcgctg ctgaaatgga ggaggccctt agagggcttc cagtgcgtta 5340

tatgacaaca gcagtcaatg tcacccactc tggaacagaa atcgtcgact taatgtgcca 5400

tgccaccttc acttcacgtc tactacagcc aatcagagtc cccaactata atctgtatat 5460

tatggatgag gcccacttca cagatccctc aagtatagca gcaagaggat acatttcaac 5520

aagggttgag atgggcgagg cggctgccat cttcatgacc gccacgccac caggaacccg 5580

tgacgcattt ccggactcca actcaccaat tatggacacc gaagtggaag tcccagagag 5640

agcctggagc tcaggctttg attgggtgac ggatcattct ggaaaaacag tttggtttgt 5700

tccaagcgtg aggaacggca atgagatcgc agcttgtctg acaaaggctg gaaaacgggt 5760

catacagctc agcagaaaga cttttgagac agagttccag aaaacaaaac atcaagagtg 5820

ggactttgtc gtgacaactg acatttcaga gatgggcgcc aactttaaag ctgaccgtgt 5880

catagattcc aggagatgcc taaagccggt catacttgat ggcgagagag tcattctggc 5940

tggacccatg cctgtcacac atgccagcgc tgcccagagg agggggcgca taggcaggaa 6000

tcccaacaaa cctggagatg agtatctgta tggaggtggg tgcgcagaga ctgacgaaga 6060

ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct ccttgacaat atttacctcc aagatggcct 6120

catagcctcg ctctatcgac ctgaggccga caaagtagca gccattgagg gagagttcaa 6180

gcttaggacg gagcaaagga agacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atcttcctgt 6240

ttggctggcc tatcaggttg catctgccgg aataacctac acagatagaa gatggtgctt 6300

tgatggcacg accaacaaca ccataatgga agacagtgtg ccggcagagg tgtggaccag 6360

acacggagag aaaagagtgc tcaaaccgag gtggatggac gccagagttt gttcagatca 6420

tgcggccctg aagtcattca aggagtttgc cgctgggaaa agaggagcgg cttttggagt 6480

gatggaagcc ctgggaacac tgccaggaca catgacagag agattccagg aagccattga 6540

caacctcgct gtgctcatgc gggcagagac tggaagcagg ccttacaaag ccgcggcggc 6600

ccaattgccg gagaccctag agaccataat gcttttgggg ttgctgggaa cagtctcgct 6660

gggaatcttc ttcgtcttga tgaggaacaa gggcataggg aagatgggct ttggaatggt 6720

gactcttggg gccagcgcat ggctcatgtg gctctcggaa attgagccag ccagaattgc 6780

atgtgtcctc attgttgtgt tcctattgct ggtggtgctc atacctgagc cagaaaagca 6840

aagatctccc caggacaacc aaatggcaat catcatcatg gtagcagtag gtcttctggg 6900

cttgattacc gccaatgaac tcggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatct 6960

aatgggaagg agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgcggcc 7020

agcctcagct tgggccatct atgctgcctt gacaactttc attaccccag ccgtccaaca 7080

tgcagtgacc acctcataca acaactactc cttaatggcg atggccacgc aagctggagt 7140

gttgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct 7200

aatgataggt tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct 7260

cgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca 7320

gaagagaacg gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga 7380

cattgacaca atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat 7440

agcagtagcc gtctccagcg ccatactgtc gcggaccgcc tgggggtggg gggaggctgg 7500

ggctctgatc acagccgcaa cttccacttt gtgggaaggc tctccgaaca agtactggaa 7560

ctcctctaca gccacttcac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagcttc 7620

tctaatctac acagtaacaa gaaacgctgg cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagg 7680

agagaccctg ggagagaaat ggaaggcccg cttgaaccag atgtcggccc tggagttcta 7740

ctcctacaaa aagtcaggca tcaccgaggt gtgcagagaa gaggcccgcc gcgccctcaa 7800

ggacggtgtg gcaacgggag gccatgctgt gtcccgagga agtgcaaagc tgagatggtt 7860

ggtggagcgg ggatacctgc agccctatgg aaaggtcatt gatcttggat gtggcagagg 7920

gggctggagt tactacgtcg ccaccatccg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa 7980

aggaggccct ggtcatgaag aacccgtgtt ggtgcaaagc tatgggtgga acatagtccg 8040

tcttaagagt ggggtggacg tctttcatat ggcggctgag ccgtgtgaca cgttgctgtg 8100

tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtcct 8160

ctccatggtg ggggattggc ttgaaaaaag accaggagcc ttttgtataa aagtgttgtg 8220

cccatacacc agcactatga tggaaaccct ggagcgactg cagcgtaggt atgggggagg 8280

actggtcaga gtgccactct cccgcaactc tacacatgag atgtactggg tctctggagc 8340

gaaaagcaac accataaaaa gtgtgtccac cacgagccag ctcctcttgg ggcgcatgga 8400

cgggcctagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat ctcggctctg gcacgcgggc 8460

tgtggtaagc tgcgctgaag ctcccaacat gaagatcatt ggtaaccgca ttgaaaggat 8520

ccgcagtgag cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc 8580

ttaccatgga agctatgagg cccccacaca agggtcagcg tcctctctaa taaacggggt 8640

tgtcaggctc ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac 8700

cgacaccaca ccgtatggtc agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgcc 8760

agacccccaa gaaggcactc gtcaggttat gagcatggtc tcttcctggt tgtggaaaga 8820

gctaggcaaa cacaaacggc cacgagtctg caccaaagaa gagttcatca acaaggttcg 8880

tagcaatgca gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga 8940

agctgtgaac gatccaaggt tctgggctct agtggacaag gaaagagagc accacctgag 9000

aggagagtgc cagagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga 9060

atttggaaag gccaagggca gccgcgccat ctggtatatg tggctagggg ctagatttct 9120

agagttcgaa gcccttggat tcttgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg 9180

aggtggtgtt gaagggctgg gattacaaag actcggatat gtcctagaag agatgagtcg 9240

tataccagga ggaaggatgt atgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagcag 9300

gtttgatctg gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg gagaaagggc acagggcctt 9360

ggcattggcc ataatcaagt acacatacca aaacaaagtg gtaaaggtcc ttagaccagc 9420

tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttcgagacaa gaccaaaggg ggagcggaca 9480

agttgtcact tacgctctta acacatttac caacctagtg gtgcaactca ttcggaatat 9540

ggaggctgag gaagttctag agatgcaaga cttgtggctg ctgcggaggt cagagaaagt 9600

gaccaactgg ttgcagagca acggatggga taggctcaaa cgaatggcag tcagtggaga 9660

tgattgcgtt gtgaagccaa ttgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga 9720

tatgggaaaa gttaggaagg acacacaaga gtggaaaccc tcaactggat gggacaactg 9780

ggaagaagtt ccgttttgct cccaccactt caacaagctc catctcaagg acgggaggtc 9840

cattgtggtt ccctgccgcc accaagatga actgattggc cgggcccgcg tctctccagg 9900

ggcgggatgg agcatccggg agactgcttg cctagcaaaa tcatatgcgc aaatgtggca 9960

gctcctttat ttccacagaa gggacctccg actgatggcc aatgccattt gttcatctgt 10020

gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac tacctggtca atccatggaa agggagaatg 10080

gatgaccact gaagacatgc ttgtggtgtg gaacagagtg tggattgagg agaacgacca 10140

catggaagac aagaccccag ttacgaaatg gacagacatt ccctatttgg gaaaaaggga 10200

agacttgtgg tgtggatctc tcatagggca cagaccgcgc accacctggg ctgagaacat 10260

taaaaacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10320

cctatccacc caagttcgct acttgggtga agaagggtct acacctggag tgctgtaagc 10380

accaatctta atgttgtcag gcctgctagt cagccacagc ttggggaaag ctgtgcagcc 10440

tgtgaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagcctatag tcaggccgag aacgccatgg 10500

cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10560

gcgcttggag gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg 10620

gcctgaactg gagatcagct gtggatctcc agaagaggga ctagtggtta gagga 10675

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(artificial)

<220>

<223> 寡核苷酸1 (CpG 1826)

<400> 3

tccatgacgt tcctgacgtt 20

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工(artificial)

<220>

<223> 寡核苷酸2 (CpG 1758)

<400> 4

tctcccagcg tgcgccat 18

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工(artificial)

<220>

<223> 寡核苷酸3

<400> 5

accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工(artificial)

<220>

<223> 寡核苷酸4 (CpG 2006)

<400> 6

tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工(artificial)

<220>

<223> 寡核苷酸5 (CpG 1668)

<400> 7

tccatgacgt tcctgatgct 20

<210> 8

<211> 31

<212> PRT

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 8

Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu

1 5 10 15

Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln

20 25 30

<210> 9

<211> 31

<212> PRT

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 9

Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu

1 5 10 15

Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln

20 25 30

<210> 10

<211> 31

<212> PRT

<213> 西尼罗病毒(West Nile Virus)

<400> 10

Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu

1 5 10 15

Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser

20 25 30

<210> 11

<211> 31

<212> PRT

<213> 日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)

<400> 11

Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu

1 5 10 15

Leu Thr Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val

20 25 30

<210> 12

<211> 31

<212> PRT

<213> 圣路易斯脑炎病毒(Saint Louis Encephalitis Virus)

<400> 12

Phe Ser Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Ile Val Glu

1 5 10 15

Leu Gln Tyr Thr Gly Ser Asn Gly Pro Cys Arg Val Pro Ile Ser

20 25 30

<210> 13

<211> 30

<212> PRT

<213> 黄热病病毒(Yellow Fever Virus)

<400> 13

Phe Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met Gln

1 5 10 15

Val Lys Val Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile

20 25 30

<210> 14

<211> 31

<212> PRT

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 14

Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln

1 5 10 15

Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser

20 25 30

<210> 15

<211> 31

<212> PRT

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 15

Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg

1 5 10 15

Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu

20 25 30

<210> 16

<211> 31

<212> PRT

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 16

Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys

1 5 10 15

Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser

20 25 30

<210> 17

<211> 31

<212> PRT

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 17

Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys

1 5 10 15

Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu

20 25 30

<210> 18

<211> 29

<212> PRT

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 18

Ser Val Lys Asn Pro Met Gly Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro

1 5 10 15

Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys

20 25

<210> 19

<211> 29

<212> PRT

<213> 寨卡病毒(Zika virus)

<400> 19

Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro

1 5 10 15

Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys

20 25

<210> 20

<211> 29

<212> PRT

<213> 西尼罗病毒(West Nile Virus)

<400> 20

Lys Gln Glu Gly Met Tyr Lys Ser Ala Pro Lys Arg Leu Thr Ala Thr

1 5 10 15

Thr Glu Lys Leu Glu Ile Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys

20 25

<210> 21

<211> 29

<212> PRT

<213> 日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)

<400> 21

Lys Pro Val Gly Arg Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr

1 5 10 15

Gln Glu Lys Phe Glu Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys

20 25

<210> 22

<211> 29

<212> PRT

<213> 圣路易斯脑炎病毒(Saint Louis Encephalitis Virus)

<400> 22

Glu Asp Pro Lys Tyr Tyr Lys Arg Ala Pro Arg Arg Leu Lys Lys Leu

1 5 10 15

Glu Asp Glu Leu Asn Tyr Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys

20 25

<210> 23

<211> 29

<212> PRT

<213> 黄热病病毒(Yellow Fever Virus)

<400> 23

Asp Pro Lys Asn Val Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro Phe Ser Arg Ile

1 5 10 15

Arg Asp Gly Leu Gln Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly Lys

20 25

<210> 24

<211> 29

<212> PRT

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 24

Asp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg Pro Gln

1 5 10 15

Pro Met Glu His Lys Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys

20 25

<210> 25

<211> 29

<212> PRT

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 25

Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg Pro Gln

1 5 10 15

Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys

20 25

<210> 26

<211> 29

<212> PRT

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 26

Asp Ile Thr Gly Val Leu Glu Gln Gly Lys Arg Thr Leu Thr Pro Gln

1 5 10 15

Pro Met Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys

20 25

<210> 27

<211> 29

<212> PRT

<213> 登革病毒(Dengue virus)

<400> 27

Asp Val Lys Gly Val Leu Thr Lys Gly Lys Arg Ala Leu Thr Pro Pro

1 5 10 15

Val Asn Asp Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys

20 25

Claims (195)

1.一种包含来自寨卡病毒的一种或多种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒包含至少一个非人细胞适应性突变。

2.如权利要求1所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个非人细胞适应性突变是在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中。

3.如权利要求2所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个适应性突变发生在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置。

4.如权利要求3所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个适应性突变是Trp98Gly突变。

5.如权利要求1-4中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中与缺乏所述至少一个适应性突变的寨卡病毒相比，所述至少一个适应性突变增强了遗传稳定性。

6.如权利要求1-5中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中与缺乏所述至少一个适应性突变的寨卡病毒相比，所述至少一个适应性突变增强了病毒复制。

7.如权利要求1-6中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒在包膜蛋白E(Env)中不含突变。

8.如权利要求1-7中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述非人细胞是哺乳动物细胞。

9.如权利要求1-8中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述非人细胞是猴细胞。

10.如权利要求9所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述猴细胞来自Vero细胞系。

11.如权利要求10所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述Vero细胞系是WHO Vero10-87细胞系。

12.如权利要求1-11中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒是非洲谱系病毒或亚洲谱系病毒。

13.如权利要求1-11中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒是亚洲谱系病毒。

14.如权利要求13所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒来自毒株PRVABC59。

15.如权利要求1-14中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物是纯化的抗原疫苗或免疫原性组合物、亚单位疫苗或免疫原性组合物、灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。

16.如权利要求1-15中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物是灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物。

17.如权利要求1-16中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述病毒是化学灭活的。

18.如权利要求17所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述病毒用洗涤剂、福尔马林、过氧化氢、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种化学灭活。

19.如权利要求17所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述病毒用福尔马林化学灭活。

20.如权利要求1-19中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其还包含佐剂。

21.如权利要求20所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂选自由以下各项组成的组：铝盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

22.如权利要求20或权利要求21所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂是铝盐。

23.如权利要求22所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂选自由明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和铝胶85组成的组。

24.如权利要求20-23中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述一种或多种抗原中的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到所述佐剂上。

25.如权利要求1-24中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其包含约0.1μg寨卡病毒或Env至约100μg寨卡病毒或Env。

26.如权利要求25所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物是无佐剂的。

27.如权利要求1-26中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒是克隆分离株。

28.如权利要求27所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述克隆分离株基本上不含一种或多种外源因子。

29.一种疫苗，其包含在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置具有突变的寨卡病毒。

30.如权利要求29所述的疫苗，其中所述突变是SEQ ID NO：1中的Trp98Gly突变。

31.如权利要求29或权利要求30所述的疫苗，其中所述寨卡病毒在所述包膜蛋白(Env)中不含突变。

32.如权利要求31所述的疫苗，其中编码所述包膜蛋白的序列与SEQ ID No.2中的相应序列相同。

33.如权利要求29至权利要求32中任一项所述的疫苗，其中所述寨卡病毒源自毒株PRVABC59。

34.如权利要求33所述的疫苗，其中毒株PRVABC59包含根据SEQ ID NO：2的基因组序列。

35.如权利要求29至权利要求34中任一项所述的疫苗，其中所述寨卡病毒是灭活的。

36.如权利要求29至权利要求35中任一项所述的疫苗，其还包含佐剂。

37.如权利要求36所述的疫苗，其中所述佐剂选自由以下各项组成的组：铝盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

38.如权利要求36或权利要求37所述的疫苗，其中所述佐剂是铝盐。

39.如权利要求36至权利要求38中任一项所述的疫苗，其中所述佐剂选自由明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和铝胶85组成的组。

40.一种疫苗或免疫原性组合物，其包含：a)铝盐佐剂；b)全灭活寨卡病毒，其中所述寨卡病毒包含非人细胞适应性突变，并且其中所述非人细胞适应性突变是在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置的Trp98Gly突变。

41.一种治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1-40中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物。

42.一种诱导有需要的受试者的免疫反应的方法，其包括向所述受试者施用致免疫量的如权利要求1-40中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物。

43.如权利要求41或权利要求42所述的方法，其中所述受试者是人。

44.如权利要求41-43中任一项所述的方法，其中所述受试者已妊娠或准备妊娠。

45.如权利要求41-44中任一项所述的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述受试者中诱导保护性免疫反应。

46.如权利要求45所述的方法，其中在所述受试者中诱导的所述保护性免疫反应强于在施用了下述疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的保护性免疫反应，所述疫苗或免疫原性组合物包含来自缺乏所述至少一个非人细胞适应性突变的寨卡病毒的一种或多种抗原。

47.如权利要求41-46中任一项所述的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述受试者中诱导产生针对寨卡病毒的中和抗体。

48.如权利要求47所述的方法，其中在所述受试者中产生的中和抗体的浓度高于在施用了下述疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中产生的中和抗体的浓度，所述疫苗或免疫原性组合物包含来自缺乏所述至少一个非人细胞适应性突变的寨卡病毒的一种或多种抗原。

49.如权利要求41-48中任一项所述的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物通过选自由以下各项组成的组的途径施用：皮下施用、经皮施用、真皮内施用、真皮下施用、肌内施用、经口施用、鼻内施用、经颊施用、腹膜内施用、阴道内施用、肛门施用和颅内施用。

50.如权利要求41-49所述的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物以第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述第二次(加强)施用在所述第一次(初免)施用后28天施用。

52.如权利要求1-40中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其用于治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染。

53.如权利要求1-40中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其用于诱导有需要的受试者的免疫反应。

54.如权利要求52或权利要求53所述的使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者是人。

55.如权利要求52-54中任一项所述的使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者已妊娠或准备妊娠。

56.如权利要求52-55中任一项所述的使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述受试者中诱导保护性免疫反应。

57.如权利要求56所述的使用的疫苗或免疫原性组合物，其中在所述受试者中诱导的所述保护性免疫反应强于在施用了下述疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的保护性免疫反应，所述疫苗或免疫原性组合物包含来自缺乏所述至少一个非人细胞适应性突变的寨卡病毒的一种或多种抗原。

58.如权利要求52-57中任一项所述的使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述受试者中诱导产生针对寨卡病毒的中和抗体。

59.如权利要求58所述的使用的疫苗或免疫原性组合物，其中在所述受试者中产生的中和抗体的浓度高于在施用了下述疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中产生的中和抗体的浓度，所述疫苗或免疫原性组合物包含来自缺乏所述至少一个非人细胞适应性突变的寨卡病毒的一种或多种抗原。

60.如权利要求52-59中任一项所述的使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物通过选自由以下各项组成的组的途径施用：皮下施用、经皮施用、真皮内施用、真皮下施用、肌内施用、经口施用、鼻内施用、经颊施用、腹膜内施用、阴道内施用、肛门施用和颅内施用。

61.如权利要求52-60中任一项所述的使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用。

62.如权利要求61所述的使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述第二次(加强)施用在所述第一次(初免)施用后28天施用。

63.如权利要求1-40中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物在制造用于治疗或预防有需要的受试者的寨卡病毒感染的药物中的用途。

64.如权利要求1-40中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物在制造用于诱导有需要的受试者的免疫反应的药物中的用途。

65.如权利要求63或权利要求64所述的用途，其中所述受试者是人。

66.如权利要求63-65中任一项所述的用途，其中所述受试者已妊娠或准备妊娠。

67.如权利要求63-66中任一项所述的用途，其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述受试者中诱导保护性免疫反应。

68.如权利要求67所述的用途，其中在所述受试者中诱导的所述保护性免疫反应强于在施用了下述疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的保护性免疫反应，所述疫苗或免疫原性组合物包含来自缺乏所述至少一个非人细胞适应性突变的寨卡病毒的一种或多种抗原。

69.如权利要求63-66中任一项所述的用途，其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述受试者中诱导产生针对寨卡病毒的中和抗体。

70.如权利要求69所述的用途，其中在所述受试者中产生的中和抗体的浓度高于在施用了下述疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中产生的中和抗体的浓度，所述疫苗或免疫原性组合物包含来自缺乏所述至少一个非人细胞适应性突变的寨卡病毒的一种或多种抗原。

71.如权利要求63-70中任一项所述的用途，其中所述疫苗或免疫原性组合物通过选自由以下各项组成的组的途径施用：皮下施用、经皮施用、真皮内施用、真皮下施用、肌内施用、经口施用、鼻内施用、经颊施用、腹膜内施用、阴道内施用、肛门施用和颅内施用。

72.如权利要求63-71中任一项所述的用途，其中所述疫苗或免疫原性组合物以第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用。

73.如权利要求72所述的用途，其中所述第二次(加强)施用在所述第一次(初免)施用后28天施用。

74.一种灭活寨卡病毒制剂的方法，其包括：

(a)从一种或多种非人细胞中分离出所述寨卡病毒制剂，其中所述细胞用于产生所述病毒制剂，并且其中所述寨卡病毒包含至少一个非人细胞适应性突变；以及

(b)用有效量的福尔马林处理所述病毒制剂。

75.如权利要求74所述的方法，其还包括(c)用焦亚硫酸钠中和所述福尔马林处理过的病毒制剂。

76.如权利要求75所述的方法，其中在福尔马林处理后至少五天、至少七天、至少九天、至少11天或至少14天中和所述病毒制剂。

77.如权利要求74-76中任一项所述的方法，其还包括(d)纯化所述经中和的病毒制剂。

78.如权利要求77所述的方法，其中所述经中和的病毒制剂通过选自由错流过滤(CFF)、多元层析、尺寸排阻色谱法、阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法组成的组的工艺纯化。

79.如权利要求74-78中任一项所述的方法，其中将所述病毒制剂与佐剂混合。

80.如权利要求79所述的方法，其中所述佐剂选自由以下各项组成的组：铝盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

81.如权利要求79和权利要求80所述的方法，其中所述佐剂是铝盐。

82.如权利要求81所述的方法，其中所述佐剂选自由明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和铝胶85组成的组。

83.如权利要求79-82中任一项所述的方法，其中所述病毒制剂中一种或多种抗原中的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到所述佐剂上。

84.如权利要求74-83中任一项所述的方法，其中所述至少一种非人细胞适应性突变是在寨卡病毒NS1中。

85.如权利要求84所述的方法，其中所述至少一个适应性突变发生在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置。

86.如权利要求85所述的方法，其中所述至少一个适应性突变是Trp98Gly突变。

87.如权利要求74-86中任一项所述的方法，其中与缺乏所述至少一个适应性突变的寨卡病毒相比，所述至少一个适应性突变增强了遗传稳定性。

88.如权利要求74-86中任一项所述的方法，其中与缺乏所述至少一个适应性突变的寨卡病毒相比，所述至少一个适应性突变增强了病毒复制。

89.如权利要求74-88中任一项所述的方法，其中所述寨卡病毒在包膜蛋白E(Env)中不含突变。

90.一种灭活寨卡病毒制剂的方法，其包括：

(a)从一种或多种非人细胞中分离出所述寨卡病毒制剂，其中所述细胞用于产生所述病毒制剂，并且其中所述寨卡病毒在SEQ ID NO：1的位置98或在与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置包含突变；以及

(b)用有效量的福尔马林处理所述病毒制剂。

91.如权利要求90所述的方法，其中所述突变是SEQ ID NO：1中的Trp98Gly突变。

92.如权利要求90或权利要求91所述的方法，其中所述寨卡病毒在所述包膜蛋白(E)中不含突变。

93.如权利要求92所述的方法，其中编码所述包膜蛋白的所述序列与SEQ ID No.2中的相应序列相同。

94.如权利要求90-93中任一项所述的方法，其还包括(c)用焦亚硫酸钠中和所述福尔马林处理过的病毒制剂。

95.如权利要求94所述的方法，其中在福尔马林处理后至少五天、至少七天、至少九天、至少11天或至少14天中和所述病毒制剂。

96.如权利要求90-95中任一项所述的方法，其还包括(d)纯化所述经中和的病毒制剂。

97.如权利要求96所述的方法，其中所述经中和的病毒制剂通过选自由错流过滤(CFF)、多元层析、尺寸排阻色谱法、阳离子交换色谱法和阴离子交换色谱法组成的组的工艺纯化。

98.如权利要求90-97中任一项所述的方法，其中将所述病毒制剂与佐剂混合。

99.如权利要求98所述的方法，其中所述佐剂选自由以下各项组成的组：铝盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

100.如权利要求99所述的方法，其中所述佐剂是铝盐。

101.如权利要求100所述的方法，其中所述佐剂选自由明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和铝胶85组成的组。

102.如权利要求98-101中任一项所述的方法，其中所述病毒制剂中一种或多种抗原中的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到所述佐剂上。

103.一种纯化寨卡病毒的方法，其包括：

(a)为多个细胞接种包含寨卡病毒群的接种物；以及

(b)通过空斑纯化从所述经接种的细胞中的一个或多个获得寨卡病毒克隆分离株。

104.如权利要求103所述的方法，其中所述细胞是非人细胞。

105.如权利要求103或权利要求104所述的方法，其中所述细胞是昆虫细胞。

106.如权利要求105所述的方法，其中所述昆虫细胞是蚊细胞。

107.如权利要求103或权利要求104所述的方法，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

108.如权利要求107所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是猴细胞。

109.如权利要求108所述的方法，其中所述猴细胞来自Vero细胞系。

110.如权利要求109所述的方法，其中所述Vero细胞系是WHO Vero 10-87细胞系。

111.如权利要求103-110中任一项所述的方法，其中所述寨卡病毒群是异种的。

112.如权利要求103-111中任一项所述的方法，其中所述寨卡病毒群包括寨卡病毒临床分离株。

113.如权利要求112所述的方法，其中所述寨卡病毒临床分离株来自毒株PRVABC59。

114.如权利要求103-113中任一项所述的方法，其中所述寨卡病毒群包括先前已经在细胞培养物中传代一次或多次的寨卡病毒。

115.如权利要求103-114中任一项所述的方法，其中所述接种物包含人血清。

116.如权利要求103-115中任一项所述的方法，其中所述接种物包含一种或多种外源因子。

117.如权利要求116所述的方法，其中所述寨卡病毒克隆分离株基本上不含所述一种或多种外源因子。

118.如权利要求103-117中任一项所述的方法，其还包括对所述寨卡病毒克隆分离株的一次或多次另外的空斑纯化。

119.如权利要求118所述的方法，其中所述寨卡病毒克隆分离株进一步经空斑纯化两次或更多次。

120.如权利要求103-119中任一项所述的方法，其还包括使所述寨卡病毒克隆分离株在细胞培养物中传代一次或多次。

121.如权利要求120所述的方法，其中使所述寨卡病毒克隆分离株传代两次或更多次。

122.如权利要求103-121中任一项所述的方法，其还包括配制包含来自所述寨卡病毒克隆分离株的一种或多种抗原的疫苗或免疫原性组合物。

123.如权利要求122所述的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物是纯化的抗原疫苗或免疫原性组合物、亚单位疫苗或免疫原性组合物、灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。

124.如权利要求122所述的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物是灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物。

125.如权利要求103-124中任一项所述的方法，其中所述寨卡病毒克隆分离株是化学灭活的。

126.如权利要求125所述的方法，其中所述寨卡病毒克隆分离株用洗涤剂、福尔马林、过氧化氢、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种化学灭活。

127.如权利要求125所述的方法，其中所述寨卡病毒克隆分离株用福尔马林化学灭活。

128.如权利要求122-127中任一项所述的方法，其还包括将所述疫苗或免疫原性组合物与佐剂混合。

129.如权利要求128所述的方法，其中所述佐剂选自由以下各项组成的组：铝盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

130.如权利要求128所述的方法，其中所述佐剂是铝盐。

131.如权利要求128所述的方法，其中所述佐剂选自由明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和铝胶85组成的组。

132.如权利要求128-131中任一项所述的方法，其中所述一种或多种抗原中的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到所述佐剂上。

133.如权利要求122-128中任一项所述的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含约0.1μg寨卡病毒或Env至约100μg寨卡病毒或Env。

134.如权利要求133所述的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物是无佐剂的。

135.如权利要求103-134中任一项所述的方法，其中所述寨卡病毒克隆分离株是同种遗传群体。

136.如权利要求103-135中任一项所述的方法，其中所述寨卡病毒克隆分离株在包膜蛋白E(Env)中不含突变。

137.如权利要求103-135中任一项所述的方法，其中所述寨卡病毒克隆分离株包含至少一个突变。

138.如权利要求137所述的方法，其中所述至少一个突变是在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中。

139.如权利要求138所述的方法，其中所述至少一个突变发生在SEQ ID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置。

140.如权利要求139所述的方法，其中所述至少一个突变是Trp98Gly突变。

141.如权利要求137-140中任一项所述的方法，其中所述至少一个突变不是在包膜蛋白E(Env)中。

142.如权利要求137-141中任一项所述的方法，其中与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比，所述至少一个突变增强了遗传稳定性。

143.如权利要求137-142中任一项所述的方法，其中与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比，所述至少一个突变增强了病毒复制。

144.一种纯化寨卡病毒以制备疫苗或免疫原性组合物的方法，所述方法包括一个或多个选自具有以下的组的步骤：

(a)使包含寨卡病毒的样品通过深层过滤器，以产生洗脱液，其中所述洗脱液包含所述寨卡病毒；

(b)通过错流过滤(CFF)对包含寨卡病毒的样品进行缓冲液交换和/或稀释以产生渗余物，其中所述渗余物包含所述寨卡病毒；

(c)使包含寨卡病毒的样品与离子交换膜结合以产生被结合的级分，其中所述被结合的级分包含所述寨卡病毒，并将所述被结合的级分从所述离子交换膜上洗脱；

(d)用有效量的化学灭活剂处理包含寨卡病毒的样品；

(e)用焦亚硫酸钠中和包含化学灭活的寨卡病毒的样品；以及

(f)通过错流过滤(CFF)纯化经中和的包含化学灭活的寨卡病毒的样品。

145.如权利要求144所述的方法，其包括以下步骤：

(a)使包含寨卡病毒的样品通过深层过滤器，以产生洗脱液，其中所述洗脱液包含所述寨卡病毒；

(b)通过错流过滤(CFF)对包含寨卡病毒的样品进行缓冲液交换和/或稀释以产生渗余物，其中所述渗余物包含所述寨卡病毒；

(c)使包含寨卡病毒的样品与离子交换膜结合以产生被结合的级分，其中所述被结合的级分包含所述寨卡病毒；并将所述被结合的级分从所述离子交换膜上洗脱；

(d)用有效量的化学灭活剂处理包含寨卡病毒的样品；

(e)用焦亚硫酸钠中和包含化学灭活的寨卡病毒的样品；以及

(f)通过错流过滤(CFF)纯化经中和的包含化学灭活的寨卡病毒的样品。

146.如权利要求144或权利要求145所述的方法，其包括以下步骤：

(a)使包含寨卡病毒的样品通过第一深层过滤器，以产生第一洗脱液，其中所述第一洗脱液包含所述寨卡病毒；

(b)通过错流过滤(CFF)对所述第一洗脱液进行缓冲液交换和/或稀释以产生第一渗余物，其中所述第一渗余物包含所述寨卡病毒；

(c)使所述第一渗余物与离子交换膜结合以产生第一被结合的级分，其中所述第一被结合的级分包含所述寨卡病毒；并将所述第一被结合的级分从所述离子交换膜上洗脱以产生第二洗脱液，其中所述第二洗脱液包含所述寨卡病毒；

(d)使所述第二洗脱液通过第二深层过滤器以产生第二渗余物，其中所述第二渗余物包含所述寨卡病毒；

(e)用有效量的化学灭活剂处理所述第二渗余物；

(f)用焦亚硫酸钠中和所述处理过的第二渗余物；以及

(g)通过错流过滤(CFF)纯化所述经中和的第二渗余物。

147.如权利要求145-146中任一项所述的方法，其中所述离子交换膜是阴离子交换膜。

148.如权利要求147所述的方法，其中所述阴离子交换膜包含季铵配体。

149.如权利要求145-148中任一项所述的方法，其中步骤(c)的所述被结合的级分以多个步骤洗脱，其中每个步骤包括递增的盐浓度。

150.如权利要求149所述的方法，其中所述盐是氯化钠。

151.如权利要求150所述的方法，其中所述盐浓度从250mM增加至750mM。

152.如权利要求145-151中任一项所述的方法，其中所述化学灭活剂是洗涤剂、福尔马林、过氧化氢、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种。

153.如权利要求145-151中任一项所述的方法，其中所述化学灭活剂是福尔马林。

154.如权利要求145-153中任一项所述的方法，其中所述中和进行至少五天、至少七天、至少九天、至少11天或至少14天。

155.如权利要求145-154中任一项所述的方法，其中所述寨卡病毒是由权利要求103-143中任一项产生的寨卡病毒克隆分离株。

156.一种疫苗或免疫原性组合物，其包含来自空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株的一种或多种抗原。

157.如权利要求156所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是从与包含寨卡病毒群的接种物接触的细胞中纯化的空斑。

158.如权利要求157所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述细胞是非人细胞。

159.如权利要求157或权利要求158所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述细胞是昆虫细胞。

160.如权利要求159所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述昆虫细胞是蚊细胞。

161.如权利要求157或权利要求158所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述细胞是哺乳动物细胞。

162.如权利要求161所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述哺乳动物细胞是猴细胞。

163.如权利要求162所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述猴细胞来自Vero细胞系。

164.如权利要求163所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述Vero细胞系是WHO Vero10-87细胞系。

165.如权利要求157-164中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒群是异种的。

166.如权利要求157-165中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒群包含寨卡病毒临床分离株。

167.如权利要求166所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒临床分离株来自毒株PRVABC59。

168.如权利要求157-165中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒群包括先前已经在细胞培养物中传代一次或多次的寨卡病毒。

169.如权利要求157-168中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述接种物包含人血清。

170.如权利要求157-169中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述接种物包含一种或多种外源因子。

171.如权利要求170所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株基本上不含所述一种或多种外源因子。

172.如权利要求157-171中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株与野生型寨卡病毒相比是经改良的。

173.如权利要求157-172中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是同种遗传群体。

174.如权利要求157-173中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株在包膜蛋白E(Env)中不含突变。

175.如权利要求157-173中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株包含至少一个突变。

176.如权利要求175所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个突变是在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中。

177.如权利要求176所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个突变发生在SEQID NO：1的位置98或与SEQ ID NO：1的位置98相对应的位置。

178.如权利要求177所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个突变是Trp98Gly突变。

179.如权利要求175-178中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个突变不是在寨卡病毒包膜蛋白E(Env)中。

180.如权利要求174-178中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比，所述至少一个突变增强了遗传稳定性。

181.如权利要求174-180中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比，所述至少一个突变增强了病毒复制。

182.如权利要求157-181中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是非洲谱系病毒或亚洲谱系病毒。

183.如权利要求157-182中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是亚洲谱系病毒。

184.如权利要求157-183中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物是纯化的抗原疫苗或免疫原性组合物、亚单位疫苗或免疫原性组合物、灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物，或减毒病毒疫苗或免疫原性组合物。

185.如权利要求157-183中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物是灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物。

186.如权利要求157-185中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是化学灭活的。

187.如权利要求186所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述空斑纯化的寨卡病毒用洗涤剂、福尔马林、过氧化氢、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种化学灭活。

188.如权利要求186所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述空斑纯化的克隆寨卡病毒分离株用福尔马林化学灭活。

189.如权利要求157-188中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其还包含佐剂。

190.如权利要求189所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂选自由以下各项组成的组：铝盐、toll样受体(TLR)激动剂、单磷酰脂质A(MLA)、合成脂质A、脂质A模拟物或类似物、MLA衍生物、细胞因子、皂苷、胞壁酰二肽(MDP)衍生物、CpG寡聚物、革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)、聚磷腈、乳剂、病毒体、脂质卷、聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒、泊洛沙姆颗粒、微粒、脂质体、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。

191.如权利要求189所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂是铝盐。

192.如权利要求189所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂选自由明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和铝胶85组成的组。

193.如权利要求189-192中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述一种或多种抗原中的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到所述佐剂上。

194.如权利要求157-188中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其包含约0.1μg寨卡病毒或Env至约100μg寨卡病毒或Env。

195.如权利要求194所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物是无佐剂的。

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