JP7443232B2 - ジカウイルスを不活化するため、及び不活化の完全性を決定するための方法 - Google Patents
ジカウイルスを不活化するため、及び不活化の完全性を決定するための方法 Download PDFInfo
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Description
本発明は、保健医療福祉省、準備および対応担当秘書室、生物医学先端研究開発局(Department of Health and Human Services,Office of the Assistant Secretary for Preparedness and Response,Biomedical Advanced Research and Development Authority)との契約番号HHSO100201600015Cの下で政府の支援を受けてなされた。本発明は、保健社会福祉省の機関(Agency of the Department of Health and Human Services)である疾病管理予防センター(Centers for Disease Control and Prevention)との共同研究開発契約(Cooperative Research and Development Agreement)の履行で作成された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
本開示は、ワクチンおよび免疫原性組成物に使用され得る、ジカウイルスを不活化する方法に関する。本開示はまた、アルボウイルス調製物の不活化の完全性を決定するための方法にも関する。
したがって、遺伝子的に安定なジカウイルスを利用するジカウイルス感染を治療および/または予防するためのワクチンおよび免疫原性組成物を開発する必要がある。ワクチン開発のオプションの1つは、ホールウイルスを不活化し、この不活化ホールウイルスを対象のワクチン接種に使用することである。しかし、不活化ウイルスワクチンの開発中の重要な安全性保証は、製剤または原薬に感染性ウイルスが残っていないことを確認することである。感染性ビリオンが残っているか否かを測定および決定するための効果的な不活化プロセス及び高感度分析の開発は、野生型ウイルスに由来するが、胎児の異常を引き起こす可能性のある病原性/脳炎ウイルスも確実に含む、精製不活化ウイルスの開発にとっては重要な安全面である。
(a)インビトロで培養された1つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、ここで、細胞がウイルス調製物を産生するために使用されること;及び
(b)ジカウイルス調製物を0.005%~0.02%w/vのホルムアルデヒドで処理すること。
(i)0.005%~0.02%w/vのホルムアルデヒドで処理したジカウイルス調製物を培養昆虫細胞に接種し、その昆虫細胞を第1の期間インキュベートし、それによって昆虫細胞上清を生成すること;
(ii)(i)で生産された昆虫細胞上清を培養哺乳動物細胞に接種し、この哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)ジカウイルス調製物が、この哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを判断すること。
(a)ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む薬学的組成物を提供すること;
(b)(a)の薬学的組成物をリン酸及び2,4-ジニトロフェニルヒドラジン(DNPH)と混合し、それにより混合物を提供すること;
(c)適切な条件下で(b)の混合物をインキュベートすること;及び
(d)残留ホルマリンの存在について混合物を分析すること。
(i)培養昆虫細胞に不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第1の期間インキュベートして、それによって昆虫細胞上清を生成すること;
(ii)培養哺乳動物細胞に(i)で生産されたこの昆虫細胞上清を接種し、その哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;ならびに;
(iii)このアルボウイルス調製物が哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること。
本明細書に記載または参照される技術及び手順は、一般によく理解されており、例えば、Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3d edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.;Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel,et al.eds.,(2003));the series Methods in Enzymology(Academic Press,Inc.):PCR 2:A Practical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995)),Harlow and Lane,eds.(1988)Antibodies,A Laboratory Manual,and Animal Cell Culture(R.I.Freshney,ed.(1987));Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait,ed.,1984);Methods in Molecular Biology,Humana Press;Cell Biology:A Laboratory Notebook(J.E.Cellis,ed.,1998)Academic Press;Animal Cell Culture(R.I.Freshney),ed.,1987);Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather and P.E.Roberts,1998)Plenum Press;Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths,and D.G.Newell,eds.,1993-8)J.Wiley and Sons;Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir and C.C.Blackwell,eds.);Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller and M.P.Calos,eds.,1987);PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis et al.,eds.,1994);Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan et al.,eds.,1991);Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999);Immunobiology(C.A.Janeway and P.Travers,1997);Antibodies(P.Finch,1997);Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.,ed.,IRL Press,1988-1989);Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd and C.Dean,eds.,Oxford University Press,2000);Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow and D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999);及び The Antibodies(M.Zanetti and J.D.Capra,eds.,Harwood Academic Publishers,1995)に記載の広範に利用される方法論など、当業者による従来の方法論を用いて、通常使用される。
本開示の特定の態様は、ワクチン及び/または免疫原性組成物に有用であり得る精製不活化ホールジカウイルスに関する。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置で、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの精製不活化ホールウイルスを含む、ジカウイルスワクチン、及び免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態では、このワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置に、Trp98Gly変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、このジカウイルスは、PRVABC59株由来である。いくつかの実施形態では、このワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置にTrp98Gly変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、ここでこのジカウイルスは、配列番号2によるゲノム配列を含むPRVABC59株由来である。一実施形態では、このワクチン及び免疫原性組成物は、プラーク精製されたクローンジカウイルス単離物を含む。そのようなワクチン及び免疫原性組成物は、例えば、それを必要とする対象のジカウイルス感染を治療もしくは予防するか、及び/またはそれを必要とする対象のジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導するのに有用であり得る。
ジカウイルスは、当技術分野で公知である任意の適切な方法によって生成及び/もしくは精製またはそうでなければ単離され得る。一実施形態では、本開示の抗原は、精製された不活化ホールジカウイルスである。
本開示の特定の実施形態は、ジカウイルスワクチン及び/または精製された不活化ジカウイルスを含む免疫原性組成物に関する。本明細書で使用される「不活化ジカウイルス」という用語は、有効量のホルマリンでの処理などの不活化方法で処理されたジカウイルスを含むことを意図している。特に、不活化ジカウイルスは、20℃~24℃の温度で10日間、約0.01%w/vの量のホルムアルデヒドを用いてジカウイルスを処理する方法から取得可能/取得される。不活化されたジカウイルスは、不活化されていないジカウイルスであれば感染し得る宿主細胞に、もはや感染し得ない。一実施形態では、不活化ジカウイルスはもはやVERO細胞に感染できず、VERO細胞に細胞変性効果を及ぼすことができない。
本開示の他の態様は、2つの異なる細胞型の連続感染を使用することにより、アルボウイルス調製物の不活化の完全性を決定する方法に関する。この方法は、1つの細胞タイプのみを使用するアッセイ、またTCID50方法などの他の方法と比較しても、驚くほど低い検出限界(LOD)を有する。さらに、この方法では、動物を使用して不活化ウイルスの感染性を判定する必要がない。
(i)培養昆虫細胞に不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第1の期間インキュベートして、それによって昆虫細胞上清を生成すること;
(ii)(i)で生成された昆虫細胞上清を培養哺乳動物細胞に接種し、この哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
(i)C6/36細胞に、不活化ステップを施したアルボウイルス製剤を接種し、昆虫細胞を第1の期間インキュベートして、それによってC6/36細胞上清を生成すること;
(ii)培養哺乳動物細胞に、(i)で生成されたC6/36細胞上清を接種し、この哺乳動物細胞を第2期間インキュベートすること;及び
(iii)ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
(i)培養昆虫細胞に不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第1の期間インキュベートして、それによって昆虫細胞上清を生成すること;
(ii)(i)で生成された昆虫細胞上清をVero細胞に接種し、哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
(i)不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、C6/36細胞に接種し、昆虫細胞を第1の期間インキュベートして、それによってC6/36細胞上清を生成すること;
(ii)Vero細胞に、(i)で生成されたC6/36細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
(i)不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、C6/36細胞に接種し、昆虫細胞を第1の期間インキュベートして、それによってC6/36細胞上清を生成すること;
(ii)Vero細胞に、(i)で生成されたC6/36細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
(i)不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、C6/36細胞に接種し、昆虫細胞を3~7日間インキュベートして、それによってC6/36細胞上清を生成すること;
(ii)Vero細胞に、(i)で生成されたC6/36細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
(i)不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、C6/36細胞に接種し、昆虫細胞を第1の期間インキュベートして、それによってC6/36細胞上清を生成すること;
(ii)Vero細胞に、(i)で生成されたC6/36細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を3~14日間インキュベートすること;及び
(iii)ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
(i)不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、C6/36細胞に接種し、昆虫細胞を3~7日間インキュベートして、それによってC6/36細胞上清を生成すること;
(ii)Vero細胞に、(i)で生成されたC6/36細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を3~14日間インキュベートすること;及び
(iii)ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
(i)不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、C6/36細胞に接種し、昆虫細胞を6日間インキュベートして、それによってC6/36細胞上清を生成すること;
(ii)Vero細胞に、(i)で生成されたC6/36細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を8日間インキュベートすること;及び
(iii)ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
(a)インビトロで培養された1つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞がアルボウイルス調製物を生成するために使用されること;
(b)アルボウイルス調製物を0.005%~0.02%w/vのホルムアルデヒドで処理すること;
(c)不活化の完全性を、以下によって決定すること:
(i)培養昆虫細胞にステップ(b)に従って処理されたウイルス調製物を接種し、この昆虫細胞を第1の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること;
(ii)培養哺乳動物細胞に(i)で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること。
(a)インビトロで培養された1つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞がアルボウイルス調製物を生成するために使用されること;
(b)20~30℃の温度で5~120分間、0.1~3%の過酸化水素でアルボウイルス製剤を処理すること;
(c)不活化の完全性を、以下によって決定すること:
(i)培養昆虫細胞にステップ(b)に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第1の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること;
(ii)培養哺乳動物細胞に(i)で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)このアルボウイルス調製物が哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること。
(a)インビトロで培養された1つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞がアルボウイルス調製物を生成するために使用されること;
(b)20~30℃の温度で60分間、0.01%の過酸化水素でアルボウイルス調製物を処理すること;
(c)不活化の完全性を、以下によって決定すること:
(i)培養昆虫細胞にステップ(b)に従って処理されたウイルス調製物を接種し、この昆虫細胞を第1の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること;
(ii)培養哺乳動物細胞に(i)で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)このアルボウイルス調製物が哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること。
(a)インビトロで培養された1つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞がジカウイルス調製物を産生するために使用されること;
(b)ジカウイルス調製物を0.005%~0.02%w/vのホルムアルデヒドで処理すること;
(c)不活化の完全性を、以下によって決定すること:
(i)培養昆虫細胞にステップ(b)に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、この昆虫細胞を第1の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること;
(ii)培養哺乳動物細胞に(i)で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)ジカウイルス調製物に、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスが含まれているか否かを判断すること。
(a)インビトロで培養された1つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞はジカウイルス調製物を産生するために使用されること;
(b)20~30℃の温度で5~120分間、0.1~3%の過酸化水素でジカウイルス調製物を処理すること;
(c)不活化の完全性を、以下によって決定すること:
(i)培養昆虫細胞にステップ(b)に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、この昆虫細胞を第1の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること;
(ii)培養哺乳動物細胞に(i)で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを判断すること。
(a)インビトロで培養された1つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞はジカウイルス調製物を産生するために使用されること;
(b)20℃~30℃の温度で60分間、0.01%の過酸化水素でジカウイルス調製物を処理すること;
(c)不活化の完全性を、以下によって決定すること:
(i)ステップ(b)に従って処理されたジカウイルス調製物を昆虫細胞に接種し、この昆虫細胞を第1の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること;
(ii)哺乳動物細胞に(i)で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスが、ジカウイルス調製物に含まれているか否かを判断すること。
(a)インビトロで培養された1つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞がジカウイルス調製物を産生するために使用されること;
(b)ジカウイルス調製物を、20℃~30℃の温度で、例えば、22℃で7日間、0.05%ホルマリンで処理すること;
(c)不活化の完全性を、以下によって決定すること:
(i)培養昆虫細胞にステップ(b)に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、この昆虫細胞を第1の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること;
(ii)培養哺乳動物細胞に(i)で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
本開示の他の態様は、本明細書に記載の少なくとも1つのジカウイルス由来の1つ以上の抗原を、1つ以上のアジュバントと組み合わせて含むジカウイルスワクチン及び/または免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態では、ワクチン及び/または免疫原性組成物は、1つ以上のアジュバントと組み合わせて、本明細書に記載されるように、配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置に、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの精製不活化ホールジカウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置にTrp98Gly変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、ここで、このジカウイルスは、1つ以上のアジュバントと組み合わせた株PRVABC59に由来する。いくつかの実施形態では、このワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置にTrp98Gly変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、このジカウイルスは1つ以上のアジュバントと組み合わせて配列番号2のゲノム配列を含むPRVABC59株に由来する。一実施形態では、ワクチン及び免疫原性組成物は、1つ以上のアジュバントと組み合わせて、プラーク精製クローンジカウイルス単離物を含む。本開示のそのようなアジュバント化ワクチン及び/または免疫原性組成物は、それを必要とする対象のジカウイルス感染を治療または予防するか、及び/またはそれを必要とする対象のジカウイルスに対する免疫応答、例えば防御免疫応答を誘導するのに有用であり得る。
本開示のさらなる態様はジカウイルスを精製する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、ジカウイルスの集団を含有する接種材料を複数の細胞に接種すること、及び接種した細胞の1つ以上から、プラーク精製によって、ジカウイルスクローン単離物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、この細胞は非ヒト細胞(例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞)である。いくつかの実施形態では、この細胞は昆虫細胞(例えば、本明細書に記載の蚊細胞/細胞株のいずれか)である。いくつかの実施形態では、この細胞は哺乳動物細胞(例えば、本明細書に記載の哺乳動物細胞/細胞株のいずれか)である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はサル細胞である。
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載のジカウイルス由来の1つ以上の抗原を含む本開示のワクチン及び/または免疫原性組成物の製剤に関する。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、精製された不活化ホールジカウイルスである。いくつかの実施形態では、精製不活化ホールジカウイルスは、配列番号1の位置98、または配列番号1の位置98に相当する位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、精製不活化ホールジカウイルスは、配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置にTrp98Gly変異を含む。いくつかの実施形態では、精製不活化ホールジカウイルスは、配列番号1の位置98、または配列番号1の98位に対応する位置にTrp98Gly変異を含み、ここでジカウイルスはPRVABC59株に由来する。いくつかの実施形態では、精製された不活化ホールジカウイルスは、配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置にTrp98Gly変異を含み、ここでこのジカウイルスは配列番号2によるゲノム配列を含むPRVABC59株に由来する。
本開示のさらなる態様は、それを必要とする対象においてジカウイルスを治療もしくは予防するか、及び/またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに対する免疫応答を誘導するために、本明細書に記載のような配列番号1の位置98または本明細書に記載の配列番号1の位置98に相当する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である、変異を有するジカウイルスなどの精製不活化ホールジカウイルスを含む、本明細書に記載のワクチン及び/または免疫原性組成物の使用方法に関する。本開示のさらなる態様は、それを必要とする対象においてジカウイルスを治療もしくは予防するか、及び/またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに対する免疫応答を誘導するために、配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置に、トリプトファンからグリシンへの置換である、変異を有する精製不活化ホールジカウイルスを含む、本明細書に記載のワクチン及び/または免疫原性組成物の使用方法に関する。本開示のさらなる態様は、配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置に、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製不活化ホールジカウイルスを含む、本明細書に記載のワクチン及び/または免疫原性組成物の使用方法に関し、このジカウイルスは、それを必要とする対象においてジカウイルスを治療もしくは予防するため、及び/またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに対する免疫応答を誘導するために、PRVABC59株に由来する。本開示のさらなる態様は、配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置でトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製不活化ホールジカウイルスを含む、本明細書に記載のワクチン及び/または免疫原性組成物の使用方法に関し、このジカウイルスは、それを必要とする対象においてジカウイルスを治療もしくは予防するため、及び/またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに対する免疫応答を誘導するために、配列番号2に記載のゲノム配列を含むPRVABC59株に由来する。
本実施例では、研究歴が知られているジカウイルス(ZIKAV)株の生成が記載されている。
Vero細胞の維持
WHO Vero 10-87細胞の1つのバイアルを水浴で急速に解凍し、36℃+/2℃、5%CO2のT-75cm2フラスコ中にペニシリン-ストレプトマイシン、L-グルタミン40mM、及び10%FBSを含む19mLの予熱DMEM(ダルベッコの改変最小必須培地)に直接接種した。細胞をコンフルエンシーになるまで増殖させ、TryplEを使用して継代培養した。このフラスコを2つのT-185cm2フラスコに拡大し、コンフルエンシーになるまで成長させ、31xT-185cm2フラスコに継代培養し、細胞が100%コンフルエンシーに達するまで増殖させた。細胞をトリプシン処理により回収し、800×gで10分間遠心分離し、10%FBS及び10%DMSOを含むDMEMに、濃度1.9×107細胞/mLの濃度で再懸濁した。Vero細胞の1つのバイアルを急速に解凍し、上記のようにT-75cm2フラスコ中に蘇生させた。これらを2回継代し、13×T-185cm2フラスコに細胞バンクを作成した。トリプシン処理後、細胞を800×gで遠心分離し、4.68x105細胞/mLの濃度で凍結培地(10%FBS及び10%DMSOを含むDMEM)に再懸濁した。この細胞バンクを、クリオバイアルにアリコートした。
ウイルス力価は、6ウェルプレートで増殖させたVero細胞の新鮮にコンフルエントな単層でのプラーク滴定により決定した。凍結したアリコートを解凍し、96ウェルプレートのcDMEM-0%-FBSでそのアリコートの10倍希釈系列を作成した。希釈したウイルスは、Vero細胞単層の接種前、氷上で維持した。アッセイ時に、増殖培地を6ウェルプレートから吸引し、各ウイルス希釈液100μLをウェルに加えた。ウイルスを、細胞シートの乾燥を防ぐためにプレートを頻繁に(10分ごとに)揺らしながら、36℃±2℃で、5%CO2で60分間吸着させた。ウイルス吸着後、40~41℃に維持された4mLの最初のアガロース積層(1X cDMEM-2%-FBS+0.8%アガロース)を各ウェルに加えた。アガロースを、室温で30分間固化させた後、そのプレートを上下逆さまにして、36℃+/2℃、5%CO2で4~6日間インキュベートした。4日目に160μg/mLのニュートラルレッドバイタル染料を含む2mLの第2のアガロース積層を追加した。5日目と6日目にプラークを視覚化した。
ウイルス力価はまた、96ウェルプレートで増殖したVero細胞の新鮮にコンフルエントな単層での滴定により決定した。凍結したアリコートを解凍し、96ウェルプレートのcDMEM-2%-FBS希釈液で10倍連続希釈したアリコートを作成した。希釈したウイルスは、Vero細胞単層の接種前、氷上で維持した。アッセイの時点で、増殖培地を96ウェルプレートから吸引し、各ウイルス希釈液100μLをウェルに加えた。プレートを、5%CO2で、36℃+/2℃で5日間インキュベートした。Reed/Muench計算機を使用して、50%組織培養感染量(Tissue Culture Infective Dose)(TCID50)の力価を計算した。
ジカウイルス株PRVABC59(ドライアイス上の1つの0.5mLバイアル)を疾病管理予防センター(CDC)から受け取り、ジカウイルスの同定は、RT-PCRにより確認した。この株を試験したところ、PCRによってアルファウイルス及びマイコプラズマの混入が陰性であった。この情報を表1に要約する。
QIAampViral RNA Mini Spinキットを使用して、製造業者のプロトコールに従って各単離物の安定化されたウイルス収穫物からRNAを抽出した。各分離株から抽出したRNAを使用して、ジカウイルスゲノム全体を含む6つのcDNA断片を作成及び増幅した。増幅されたcDNA断片のサイズ及び純度を1%アガロース/TBEゲルで分析し、その後Qiagen Quick Gel Extraction Kitを使用してゲル精製した。ABI 3130XL Genetic Analyzerシーケンサーを使用して、自動配列決定反応を実施した。Lasergene SeqManソフトウェアを使用して、配列決定データを分析した。
アメリカにおける現在のZIKAVの激増に関連する研究歴が既知であるZIKAV株を求めた。この理由のため、ZIKAV株PRVABC59を選択した。Vero細胞での増殖に適した十分に特徴づけられたウイルスを生成するために、ZIKAV PRVABC59を、最初にVero細胞で増幅した(P1)。
以下の実施例は、P6b及びP6e株に由来する不活化ジカウイルスワクチン(PIZV)のCD1及びAG129マウスにおける、前臨床免疫原性及び効力を記載する。実施例1に記載されているように、6つのクローンが伝染病関連PRVABC59株から生成され、2つ(P6b及びP6e)を、さらなる前臨床免疫原性及び有効性研究のために選択した。
ジカウイルスワクチンの精製、不活化および製剤
前臨床免疫原性及び有効性の研究での使用に適した多くの不活化ZIKAVワクチンを生成し、特徴付けた。0.01というMOIでコンフルエントなVero細胞のフラスコに感染させることにより、P6b及びP6e株からウイルスを増幅した。ウイルスは、36℃±2℃/5%CO2で1時間吸着させた。吸着後、20mLのcDMEM-0%-FBSを各フラスコに加え、36℃±2℃/5%CO2で5日間インキュベートした。感染後3日目及び5日目に細胞上清を回収し、細胞破片を遠心分離により清澄化した。
免疫原性研究のために、6週齢の雄性及び雌性のSwiss-ICR(CD-1)マウスを6つの群に分けた(n=10/群)。0日目に、群1~5のマウスに筋肉内(i.m.)経路(2×0.05mL注射)で0.1mLのワクチンを接種した。第6群のマウスには、プラセボ対照としてPBSを接種した。マウスは、0日目と同じ用量及びワクチンタイプを使用して28日目と56日目に追加免疫した。血液試料は、-1日目(免疫前)、27日目(初回免疫(プライム))、42日目(追加免疫(ブースト)1)、70日目(追加免疫2)に採取した。
血清を、PIZVワクチン接種及びチャレンジしたAG129マウスから収集し、プール後に凍結した(表6の群1、2、4、及び5)。血清プールを解凍し、PBSで血清プールを3倍希釈することにより、試験品を作成した。PBS中のAG129正常マウス血清の3倍希釈を使用して、プラセボを生成した。
中和抗体力価は、前述のプラーク減少中和試験(PRNT)により決定された(例えば、Osorio et al.Lancet Infect Dis.2014 Sep;14(9):830-8を参照のこと)。
中和抗体力価は、96ウェルプレートで増殖したVero細胞における一定量のジカRVPによる血清試料の滴定により分析した。RVPには、Zika(SPH2012株)のprMEタンパク質及びデング熱ベースのウミシイタケル(Renilla)シフェラーゼレポーターが含まれていた。要するに、血清を56℃で30分間熱失活させ、希釈した後、RVPと37℃でインキュベートした。次に、血清/RVP混合物を、Vero細胞と混合し、37℃±2℃/5%CO2で72時間インキュベートした後に、ルシフェラーゼ基質で検出した。JMP11非線形4パラメータ分析を使用してデータを分析し、ポジティブトラッキング対照に正規化し、有効50%用量(EC50)を報告した。
6週齢の雄性及び雌性のCD-1マウスにおけるPIZV候補の免疫原性を評価するために、CD-1マウスの群(N=10/群)を、i.m.経路によって、ZIKAV PRVABC69 P6bまたはP6eウイルス株由来のワクチンを0.1μg(+アラム)、1.0μg(+アラム)のいずれかの用量で用いて免疫した。アジュバントの必要性を評価するために、P6e由来であり、アラムアジュバントを含まない0.1μgのワクチンを用いて動物群にワクチン接種した。0、28、及び56日にワクチン接種を行い、第6群にはプラセボ対照としてPBSを投与した(図12A及び表5)。
材料及び方法
AG129マウス(インターフェロンα/β及びγ受容体を欠く)は、脳内の重篤な病状を含むZIKV感染及び疾患の影響を受けやすい。14週齢のAG129マウスに104及び103pfuのZIKVの継代6のクローンa及びeを腹腔内感染させた。
preMVS P6eによる感染は100%の死亡率(生存期間中央値=12.5日)をもたらしたが、preMVS P6aの感染では死亡率(生存期間中央値=未定)は33%に過ぎなかった(図22)。これと一致して、preMVS P6e感染マウスは、PRVABC59 P6a感染マウスと比較してより大きな体重減少を示した(3)。PRVABC59 P6aまたはP6eに感染したマウスの群間で、群の平均ウイルス血症レベルに統計的な差は見られなかった(図24)。これらのデータによって、増殖動態だけが重要な決定要因ではないかもしれないこと(両方の株がインビトロで同様のウイルス血症、及び同様のピーク力価を生じたため)、ならびにエンベロープタンパク質の特性が毒性(野生型株の)及び免疫原性(不活化された候補の)にとって重要であり得ることが示唆される。
不活化の完全性(COI)アッセイとも呼ばれる二重感染性アッセイは、ホルマリン不活化(0.01%ホルムアルデヒド)の有効性、及び精製不活化ジカウイルス(PIZV)バルク原薬(BDS)の潜在的な残留感染性ウイルス活性を決定するために開発された。
ウイルス力価対照試験:既知の力価の対照ウイルス(PRVABC59)の2つの独立した複製を、2%FBSを含む培地で10倍連続希釈にかけ、各希釈液100μLを、Vero細胞を含む96ウェルプレートの4ウェルに添加した。プレートを5日間インキュベートした後、CPEを含むウェルを記録し、Reed-Meunch計算機を使用してウイルス力価を計算した。
ウイルス逆滴定対照試験:既知の力価の対照ウイルスを200 TCID50まで連続希釈した。200 TCID50対照ウイルスの2つの独立した複製を、2%FBSを含む培地で2倍希釈系列にかけ、各希釈液100μLを、Vero細胞を含む96ウェルプレートの4つのウェルに加えた。細胞を5日間インキュベートした後、CPEを含むウェルを記録し、Reed-Meunch計算機を使用してウイルス力価を計算した。
1.アッセイの第1部分:Vero(1.4E+05細胞/mL)及びAedes aegypti mosquito C6/36(4E+05細胞/mL)細胞を、試料の添加の2日前に96ウェルプレートに播種した。Vero細胞は、DMEM+10%最終FBS+2%L-グルタミン+1%ペニシリン/ストレプトマイシンで、37℃で培養した。C6/36細胞は、28℃で、DMEM+10%FBS+2%L-グルタミン+1%ペニシリン/ストレプトマイシン+1%非必須アミノ酸中で培養した。
2.200 TCID50対照ウイルス(ウイルス逆滴定対照試験で調製)またはDS試料の3つの独立した複製物を、2%FBSを含む培地に希釈した(5倍及び10倍希釈)。
3.96ウェルプレートの細胞に試料を接種した。96ウェルプレートの細胞単層に感染する前に、試料をボルテックスして、潜在的な凝集を破壊した。各希釈液100μLを5つのウェルのそれぞれに適用し、それぞれVero及びC6/36細胞を含む2つの独立した96ウェルプレートに入れた。
4.陰性CPE対照として、培地単独を各細胞型のために別のウェルに含めた。
5.プレートは、細胞株のための適切な温度で6日間インキュベートした。
6.アッセイの第2部分:許容細胞株でCPEにより、生ウイルスをさらに増幅及び可視化できるように、Vero及びC6/36細胞の両方由来の各96ウェル上清の全容積をVero細胞の6ウェルプレートの個々のウェルに移した。接種は、15分間隔で揺り動かしながら、90分間進行された。
7.2%FBSを含む培地をウェルに加え、CPEの関数として増幅試料を検出引き続き検出するために、プレートをさらに8日間インキュベートした。8日目の終わりにDSの複製のいずれかがCPEを示した場合、不活化は不完全であると見なされた。
7.生/複製ビリオンの存在は、6ウェルプレートに移し、ウイルス複製を可能にするために8日間インキュベートした後、感受性細胞単層上のプラークまたはCPEの形成によって可視化された。アッセイ終了時の6ウェルプレートのCPEスコア%は、以下のように計算された。
-Vero細胞の各6ウェルプレートは、比色変化の視覚化によりCPEを検査し、その後、倒立光学顕微鏡下での検査によりCPEを確認した。
-各6ウェルプレートは、上記の5倍及び10倍希釈で調製したDS希釈の複製の1つに相当した(5ウェルに加えて培地のみを含む1ウェル)。
したがって、各複製のCPE%は、1試料あたり合計5つのウェルのうちCPEを含むウェルの数を反映した(1アッセイごとに合計120のウェルを使用する)。平均CPE%及び標準偏差は、各希釈の3回の繰り返しに基づいて計算された。
1.材料及び方法
1.1 材料
ホルムアルデヒド標準溶液(メタノール中)(982μg/mL)、DNPH、HPLCグレードのアセトニトリル、及びリン酸は、和光純薬株式会社(東京、日本)から購入した。リン酸の希釈に使用する蒸留水は、大塚製薬(徳島、日本)から入手した。水酸化アルミニウムゲルとして使用されるAlhydrogel(登録商標)2%(10mg/mLアルミニウムに相当)は、Brenntag(Frederikssund、Denmark)から入手した。PBSは社内で調製し、水酸化アルミニウムゲルを含むジカワクチン製剤は以下に説明するように製造した。ジカウイルスは、収穫後にさまざまな手法で精製した。ホルムアルデヒドで不活化した後、ウイルスを濃縮し、ろ過により緩衝液をPBSと交換した。バルク原薬をPBSで希釈し、水酸化アルミニウムゲル(0.4mg/mLアルミニウム)で製剤化して、最終製剤を形成した。
UV検出器(Milford、USA)及び逆相カラム(YMC-Pack ODS-A、4.6mm×250mm、5μm(京都、日本))を装備したWaters HPLCアライアンスシステムを使用した。水とアセトニトリルの混合物(1:1、v/v)を、移動相として使用し、検出波長を360nmに設定し、その流速は1.0mL/分であった。カラム温度及び注入量は、それぞれ25℃及び50μLであった。
ワクチン製剤(1.2mL)を、15000rpmで10分間遠心分離し、上清(1mL)を、Waters(Milford、USA)から購入した2mL HPLCガラスバイアルに移した。次に、20μLの20(v/v)%リン酸、及びアセトニトリル中50μLの1.0mg/mLのDNPH溶液を加え、その混合物を攪拌し、注入前に室温で20分間放置した。
ICH Q2ガイドラインによれば、この方法を、試料の特異性、直線性、精度、再現性、中間精度、堅牢性、及び安定性に関して検証した。精度の研究では、ジカ(Zika)ワクチン製剤と水酸化アルミニウムゲル溶液に、特定量のホルムアルデヒドをスパイクし、試料をボルテックスでよく混合した後、セクション2.3で説明した手順に従った。
2.1 直線性及び特異性
ホルムアルデヒドの6つの標準溶液(0.049、0.098、0.196、0.491、0.982、及び1.964μg/mL)を、PBSで希釈することにより調製した。次に、20(v/v)%リン酸及びアセトニトリル中の1mg/mL DNPH溶液を、各溶液に添加し、対応するクロマトグラムを図28に示す。明らかに、10.4分のピーク面積は、以下の回帰方程式で直線性を示した:y=1075730x+11731(ここでyは10.4分のピークの面積であり、xはμg/mL単位のホルムアルデヒドの濃度である)(相関係数:0.9998)、これによって、HCHO-DNPH(すなわち、DNPHで誘導体化されたホルムアルデヒド)に起因するものであることが示された。さらに、5.8分でのピークはDNPHを添加した全ての試料で検出されたため、DNPHに起因していた。したがって、HCHO-DNPHピーク面積を、PBSのバックグラウンドピーク面積を差し引いた後の直線性と精度の評価に使用した。
水酸化アルミニウムアジュバントの効果を回収研究により評価し、これは、ワクチン原薬の非存在下で0.05μg/mLのホルムアルデヒドを含むPBS中の水酸化アルミニウムの3つの試料(0.1、0.4、及び1.0mg/mLアルミニウム)をスパイクすることにより行った。平均回収率は、それぞれ102%(n=3)、100%(n=3)、及び100%(n=3)であり、相対標準偏差(RSD)の値は低かった(表13)。再現性を評価するために精度データのRSDを計算し、1.0%であることがわかり、これによって、最大1.0mg/mLのアルミニウム量がホルムアルデヒドの回収を妨げないことが示されている。
この方法のロバスト性を評価して、試料調製中の実験パラメータの変動が試料中のホルムアルデヒド濃度にどのように影響するかを決定した。誘導体化の有効性への影響を考慮して、DNPHとリン酸の濃度を、この研究においてモニターされたパラメータとして選択した。DNPH及びリン酸の濃度をそれぞれ±0.1mg/mL及び±5%変化させることにより、効果を調べた。ホルムアルデヒドは、各条件下で2つの開発医薬品製品ロットで決定され、表15に示す結果により、DNPH及びリン酸濃度の変動が、ホルムアルデヒドの決定に有意な影響を及ぼさないことが示唆されている。
本発明において考えられる好適な態様を、さらに以下の項目1~36に示す。
(項目1)
ジカウイルス調製物を不活化する方法であって:
(a)インビトロで培養された1つ以上の細胞から前記ジカウイルス調製物を単離することであって、前記細胞が前記ジカウイルス調製物を産生するために使用される前記単離すること;及び
(b)前記ジカウイルス調製物を0.005%~0.02%w/vのホルムアルデヒドで処理すること、を含む前記方法。
(項目2)
前記細胞が非ヒト細胞である、項目1に記載の方法。
(項目3)
前記ジカウイルス調製物が、0.01%ホルムアルデヒドで処理される、項目1または2に記載の方法。
(項目4)
前記ジカウイルス調製物が8~12日間処理される、項目1~3のいずれか1つに記載の方法。
(項目5)
前記ジカウイルス調製物が10日間処理される、項目4に記載の方法。
(項目6)
前記ジカウイルス調製物が15℃~30℃の温度で処理される、先行項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目7)
前記ジカウイルス調製物が22℃の温度で処理される、項目6に記載の方法。
(項目8)
不活化の完全性を判定するステップ(c)をさらに含む、先行項目いずれか1つに記載の方法。
(項目9)
項目8に記載の方法であって、ステップ(c)が以下:
(i)培養昆虫細胞にステップ(b)に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を第1の期間インキュベートし、それによって昆虫細胞上清を生成すること;
(ii)培養哺乳動物細胞に、(i)で生成された昆虫細胞上清を接種し、前記哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;及び
(iii)前記ジカウイルス調製物に、前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスが含まれているか否かを判断すること、を含む、前記方法。
(項目10)
項目9に記載の方法であって、前記昆虫細胞が、CCL-125細胞、Aag-2細胞、RML-12細胞、C6/36細胞、C7-10細胞、AP-61細胞、A.t.GRIP-1細胞、A.t.GRIP-2細胞、A.t.GRIP-3細胞、UM-AVE1細胞、Mos.55細胞、Sua1B細胞、4a-3B細胞、Mos.42細胞、MSQ43細胞、LSB-AA695BB細胞、NIID-CTR細胞、及びTRA-171細胞、例えば、C6/36細胞から選択される、前記方法。
(項目11)
前記第1の期間が3~7日である、項目9または10に記載の方法。
(項目12)
前記哺乳動物細胞が、VERO細胞、LLC-MK2細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、ATCC CCL34 MDCK(NBL2)細胞、MDCK33016(WO97/37001に記載されている寄託番号DSM ACC 2219)細胞、BHK21-F細胞、HKCC細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、例えば、VERO細胞から選択される、項目9~11のいずれか1つに記載の方法。
(項目13)
前記第2の期間が3~14日である、項目9~12のいずれか1つに記載の方法。
(項目14)
ホルムアルデヒド処理ジカウイルス調製物をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ(d)をさらに含む、先行項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目15)
前記ホルムアルデヒド処理ジカウイルス調製物が、ホルムアルデヒド処理後少なくとも5日、少なくとも7日、少なくとも9日、少なくとも11日、または少なくとも14日で中和される、項目14に記載の方法。
(項目16)
前記不活化ジカウイルス調製物を含む薬学的組成物を調製するステップ(e)をさらに含む、先行項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目17)
前記ジカウイルス調製物がアジュバントと混合される、項目16に記載の方法。
(項目18)
前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体(TLR)アゴニスト、モノホスホリルリピドA(MLA)、合成リピドA、リピドA模倣物または類似体、MLA誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド(MDP)誘導体、CpGオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖(LPS)、ポリホスファゼン、エマルジョン、ヴィロソーム、渦巻状物、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLG)微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、フロイント完全アジュバント(CFA)、及びフロイント不完全アジュバント(IFA)からなる群より選択される、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びAlhydrogel 85などのアルミニウム塩である、項目17に記載の方法。
(項目20)
前記ジカウイルス調製物中の1つ以上の抗原の少なくとも75%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、または100%が前記アジュバントに吸着されている、項目17~19のいずれか1つに記載の方法。
(項目21)
前記ジカウイルスが、配列番号1の位置98または配列番号1の位置98に相当する位置に変異を含む、先行項目のいずれか1つに記載の方法。
(項目22)
前記変異が配列番号1のTrp98Gly変異である、項目21に記載の方法。
(項目23)
前記ジカウイルスがエンベロープタンパク質(E)に変異を含まない、項目21または22記載の方法。
(項目24)
前記エンベロープタンパク質をコードする配列が、配列番号2の対応する配列と同じである、項目23に記載の方法。
(項目25)
項目1~24のいずれか1つに記載の方法により取得可能な不活化ジカウイルスを含む薬学的組成物。
(項目26)
不活化ジカウイルスを含み、かつ0.5μg/ml未満の残留ホルマリン含量を有する薬学的組成物。
(項目27)
項目1~24のいずれか1つに記載の方法により取得可能である、項目26に記載の薬学的組成物。
(項目28)
アルボウイルス調製物の不活化の完全性を決定する方法であって、以下のステップ:
(i)培養昆虫細胞に不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を第1の期間インキュベートして、それによって昆虫細胞上清を生成すること;
(ii)(i)で生産された前記昆虫細胞上清を培養哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;
(iii)前記アルボウイルス調製物が前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること、を含む、前記方法。
(項目29)
前記アルボウイルスがフラビウイルスまたはアルファウイルスである、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記アルボウイルスが、ジカウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、オニョンニョンウイルスまたはマヤロウイルスである、項目28または29に記載の方法。
(項目31)
前記アルボウイルス調製物が、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、ベータプロピオラクトン(BPL)、バイナリーエチルアミン(BEI)、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、またはソラレンでの処理を受けた、項目28~30のいずれか1つに記載の方法。
(項目32)
前記昆虫細胞が、CCL-125細胞、Aag-2細胞、RML-12細胞、C6/36細胞、C7-10細胞、AP-61細胞、A.t.GRIP-1細胞、A.t.GRIP-2細胞、A.t.GRIP-3細胞、UM-AVE1細胞、Mos.55細胞、Sua1B細胞、4a-3B細胞、Mos.42細胞、MSQ43細胞、LSB-AA695BB細胞、NIID-CTR細胞、及びTRA-171細胞、例えば、C6/36細胞から選択される、項目28~31のいずれか1つに記載の方法。
(項目33)
前記第1の期間が3から7日である、項目28~32のいずれか1つに記載の方法。
(項目34)
前記哺乳動物細胞が、VERO細胞、LLC-MK2細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、ATCC CCL34 MDCK(NBL2)細胞、MDCK33016(WO97/37001に記載されている寄託番号DSM ACC 2219)細胞、BHK21-F細胞、HKCC細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)、例えば、VERO細胞から選択される、項目28~33のいずれか1つに記載の方法。
(項目35)
前記第2の期間が3~14日である、項目28~34のいずれか1つに記載の方法。
(項目36)
前記方法が、1.0TCID 50 未満の前記アルボウイルスを検出し得る、項目28~35のいずれか1つに記載の方法。
Claims (19)
- ジカウイルス調製物の不活化の完全性を決定する方法であって、以下のステップ:
(i)培養昆虫細胞に不活化ステップを施したジカウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を第1の期間インキュベートして、それによって昆虫細胞上清を生成すること;
(ii)(i)で生産された前記昆虫細胞上清を培養哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第2の期間インキュベートすること;
(iii)前記ジカウイルス調製物が前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること、を含み、
その際、前記方法は、1.0 log10TCID50未満の前記ジカウイルスを検出し得る、前記方法。 - 前記昆虫細胞が、CCL-125細胞、Aag-2細胞、RML-12細胞、C6/36細胞、C7-10細胞、AP-61細胞、A.t.GRIP-1細胞、A.t.GRIP-2細胞、A.t.GRIP-3細胞、UM-AVE1細胞、Mos.55細胞、Sua1B細胞、4a-3B細胞、Mos.42細胞、MSQ43細胞、LSB-AA695BB細胞、NIID-CTR細胞、及びTRA-171細胞から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞が、VERO細胞、LLC-MK2細胞、MDBK細胞、MDCK細胞、ATCC CCL34 MDCK(NBL2)細胞、MDCK33016(WO97/37001に記載されている寄託番号DSM ACC 2219)細胞、BHK21-F細胞、HKCC細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO細胞)から選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 前記ジカウイルス調製物が、界面活性剤、ホルムアルデヒド、過酸化水素、ベータプロピオラクトン(BPL)、バイナリーエチルアミン(BEI)、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、またはソラレンでの処理を受けたものである、請求項1から3までのいずれか1項に記載の方法。
- 以下のステップ:
(i)C6/36細胞に、不活性化ステップを施したジカウイルス調製物を接種し、前記C6/36細胞を第1の期間インキュベートして、それによってC6/36細胞上清を生成すること;
(ii)(i)で生産された前記C6/36細胞上清をVero細胞に接種し、前記Vero細胞を第2の期間インキュベートすること;
(iii)前記ジカウイルス調製物が前記Vero細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること、を含む、請求項1から4までのいずれか1項に記載の方法。 - 前記第1の期間が3~7日間である、請求項1から5までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記第2の期間が3~14日間である、請求項1から6までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記方法が、0.8 log10TCID50未満、0.5 log10TCID50未満、0.2 log10TCID50未満、または0.1 log10TCID50未満の前記ジカウイルスを検出し得る、請求項1から7までのいずれか1項に記載の方法。
- ジカウイルス調製物を不活化する方法であって:
(a)インビトロで培養された1つ以上の細胞から前記ジカウイルス調製物を単離することであって、前記細胞が前記ジカウイルス調製物を産生するために使用される、前記単離をすること;
(b)前記ジカウイルス調製物を0.005%~0.02%w/vのホルムアルデヒドで処理すること;及び
残留する未反応ホルムアルデヒドを除去し、かつ、請求項1から8までのいずれか1項に記載の方法による不活性化の完全性を決定すること;をさらに含み、その際、前記ジカウイルス調製物は、工程(b)で処理されたジカウイルス調製物である、前記方法。 - 工程(a)中の細胞が非ヒト細胞である、請求項9に記載の方法。
- 前記ジカウイルス調製物が8~12日間処理される、請求項9または10に記載の方法。
- 前記ジカウイルス調製物が15℃~30℃の温度で処理される、請求項9から11までのいずれか1項に記載の方法。
- ホルムアルデヒドで処理されたジカウイルス調製物を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和することによって、透析によって、バッファー交換によって、あるいはクロスフロー濾過(TFF)によって、残存する未反応ホルムアルデヒドを除去する、請求項9から12までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記不活化ジカウイルス調製物を含む薬学的組成物を調製するステップ(c)をさらに含む、請求項9から13までのいずれか1項に記載の方法。
- 前記ジカウイルス調製物をアジュバントと混合する、請求項14に記載の方法。
- 前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体(TLR)アゴニスト、モノホスホリルリピドA(MLA)、合成リピドA、リピドA模倣物または類似体、MLA誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド(MDP)誘導体、CpGオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖(LPS)、ポリホスファゼン、エマルジョン、ヴィロソーム、渦巻状物、ポリ(ラクチド-コ-グリコリド)(PLG)微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、フロイント完全アジュバント(CFA)、及びフロイント不完全アジュバント(IFA)からなる群より選択される、請求項15に記載の方法。
- 前記アジュバントが、アルミニウム塩である、請求項16に記載の方法。
- 前記アルミニウム塩が、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、またはAlhydrogel 85である、請求項17に記載の方法。
- 前記ジカウイルス調製物中の1つ以上の抗原の少なくとも75%が前記アジュバントに吸着されている、請求項15から18までのいずれか1項に記載の方法。
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