CN111526885A - 寨卡疫苗和免疫原性组合物及其使用方法 - Google Patents

寨卡疫苗和免疫原性组合物及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本公开涉及具有来自寨卡病毒(例如寨卡病毒克隆分离株、非人类细胞适应性寨卡病毒等)的一种或多种抗原的寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物，及其治疗方法和用途。

Description

寨卡疫苗和免疫原性组合物及其使用方法
关于联邦资助研究的声明
本发明是根据合同号HHSO100201600015C在政府支持下与卫生和公共服务部、备灾和应对助理部长办公室、生物医学高级研究与发展管理局一起作出的。本发明是在执行与卫生和公共服务部机构疾病控制与预防中心的合作研究与开发协议的过程中创造的。美国政府享有本发明的某些权利。
发明领域
本公开涉及具有来自寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株、非人类细胞适应性寨卡病毒等)的一种或多种抗原的寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物，及其治疗方法和用途。
背景技术
寨卡病毒是一种黄病毒，与其它蚊媒病毒(例如黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗河病毒和日本脑炎病毒)一起归类于黄病毒科(Flaviviridae)内，该病毒自2013年传入巴西以来，已在半球范围的流行中迅速蔓延。该病毒已经传播到中美洲和北美洲，包括美国领土，因此现在正威胁着美国大陆。实际上，寨卡病毒株PRVABC59是在2015年从前往波多黎各旅行的人的血清中分离出来的。该毒株的基因组已进行了至少三次测序(参见Lanciotti等人,Emerg.Infect.Dis.2016年5月；22(5):933-5和GenBank登录号KU501215.1；GenBank登录号KX087101.3；以及Yun等人,Genome Announc.2016年8月18日；4(4)和GenBank登录号ANK57897.1)。
该病毒最初于1947年在乌干达被分离，于1952年首次与人类疾病相关联，并在非洲和东南亚被零星地识别为轻度自限性发热疾病的原因(Weaver等人,(2016)AntiviralRes.130:69-80；Faria等人,(2016)Science.352(6283):345-349)。但是，在2007年，北太平洋的雅浦岛暴发了一次疫情，然后在整个太平洋的岛屿之间蔓延开来，导致法属波利尼西亚于2013-2014年暴发了广泛的疫情，然后蔓延至新喀里多尼亚、库克群岛并最终至复活节岛。随后亚洲谱系病毒通过尚未确定的途径转移到西半球(Faria等人,(2016)Science.352(6283):345-349)。该病毒可由埃及伊蚊(Aedes aegypti)、白纹伊蚊(A.albopictus)以及可能由赫斯里伊蚊(A.hensilli)和波利尼西亚伊蚊(A.polynieseinsis)进行人畜共患性传播(Weaver等人,(2016)Antiviral Res.130:69-80)。另外，认为可能存在其它传播病毒的载体，并且该病毒可通过输血、经胎盘和/或经由性传播进行传播。
2015年末，寨卡病毒广泛感染地区的胎儿异常(例如小头畸形)和格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)显著增加，使人们警惕寨卡病毒可能比原先认为的毒力大得多，这促使世界卫生组织(WHO)宣布为国际关注的突发公共卫生事件(PublicHealth Emergency of International Concern，PHEIC)(Heymann等人,(2016)Lancet387(10020):719-21)。尽管WHO此后宣布终止PHEIC，但寨卡病毒继续对孕妇及其未出生婴儿构成特别严重的威胁。
尽管寨卡病毒对公众健康构成重大威胁，但目前尚无FDA批准的疫苗或治疗方法，并且控制寨卡病毒的唯一预防措施涉及管理蚊子群体。
在表征重组寨卡病毒以开发潜在疫苗的最新努力中，鉴定了一种非人类细胞适应性寨卡病毒，该病毒在病毒包膜蛋白的第330位带有突变(Weger-Lucarelli等人,(2017)Journal of Virology 91(1):1-10)。该研究的作者发现，寨卡病毒株PRVABC59的全长传染性cDNA克隆当在克隆过程中扩增时在遗传上不稳定，并选择分裂病毒基因组以解决所观测到的不稳定性，开发并应用了两个质粒系统。然而，用于寨卡疫苗开发的两个质粒系统不太理想。
发明内容
因此，需要开发用于治疗和/或预防寨卡病毒的疫苗和免疫原性组合物。因此，本公开的某些方面涉及一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的来自寨卡病毒的一种抗原，其中所述抗原是灭活的全病毒。
因此，本公开的某些方面涉及一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的来自寨卡病毒的一种抗原，其中所述寨卡病毒包含至少一个非人类细胞适应突变。
因此，本公开的某些方面涉及一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的来自寨卡病毒的一种抗原，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有突变。
为了满足上述和其它需求，本公开至少部分涉及在非结构蛋白1(具有野生型包膜蛋白)中具有适应的遗传稳定的非人类细胞适应性寨卡病毒，允许将单个病毒/病毒基因组系统用于疫苗生产。本公开还至少部分涉及遗传上同质的和/或已经从一种或多种外来因子(adventitious agent)纯化出来的寨卡病毒克隆分离株。因此，本公开提供了可用于治疗和/或预防寨卡病毒感染(例如，在人类中)的疫苗和免疫原性组合物，所述疫苗和免疫原性组合物包含来自带有至少一个非人类细胞适应突变(例如，寨卡病毒非结构蛋白1中的突变)的寨卡病毒和/或寨卡病毒克隆分离株的一种或多种寨卡病毒抗原(例如，来自灭活全寨卡病毒的一种或多种抗原)。
本公开至少部分地基于以下令人惊讶的发现，即包含来自非人类细胞适应性寨卡病毒的单独衍生的克隆病毒群体的一种或多种抗原的高剂量和低剂量疫苗均能够诱导强力免疫应答并提供免于寨卡病毒感染的显著保护(参见下面的实施例2和实施例4)。寨卡病毒株的克隆分离还允许：1)从污染因子(例如，可与亲本毒株共同纯化的外来因子)中成功纯化病毒，以及2)产生遗传上同质的病毒群体。而且，本公开至少部分地基于以下发现：在蛋白NS1中带有适应突变的克隆的分离的寨卡病毒在Vero细胞中生长良好并且可预测地达到高滴度，并且令人惊讶地，是遗传上稳定的/遗传上同质的，在病毒包膜蛋白中没有任何可检测到的突变(参见下面的实施例1和2)。尽管在寨卡病毒株PRVABC59的3个已公开序列中的1个的基因组测序分析中可能已经观察到寨卡病毒非结构蛋白1的类似突变(Yun等人,Genome Announc.2016年8月18日；4(4))，该参考文献没有教导或暗示NS1中的突变可改善病毒的稳定性；没有教导或暗示带有该突变的病毒可用于开发针对寨卡病毒的有效疫苗；并且没有教导或暗示这种疫苗当在低剂量和高剂量下使用时都可有效诱导强烈的免疫应答并提供针对寨卡病毒感染的显著保护。因此，不希望受理论束缚，本公开的发明人已经确定蛋白NS1中的适应突变似乎增强了寨卡病毒内的遗传稳定性，导致增加/增强的复制效率。此外，在蛋白NS1中带有适应突变的寨卡病毒株能够传代多次而不产生进一步的突变。这样的稳定的寨卡病毒株作为主病毒种子(MVS)或源自MVS的后续种子，对于疫苗的生产和制造而言是有利的，因为降低了主病毒种子发生不希望的突变的风险。而且，不希望受理论束缚，本公开的寨卡病毒株的蛋白NS1中的适应突变也可减少或以其它方式抑制不希望的突变如寨卡病毒株的包膜蛋白E(Env)内的突变的发生。
因此，本公开的某些方面涉及一种疫苗或免疫原性组合物，其含有来自寨卡病毒的一种或多种抗原，其中所述寨卡病毒含有至少一个非人类细胞适应突变。在一些实施方案中，所述至少一个非人类细胞适应突变是在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中。在一些实施方案中，所述至少一个适应突变发生在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置。在一些实施方案中，所述至少一个适应突变是Trp98Gly突变。
因此，本公开的某些方面涉及一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的来自寨卡病毒的一种抗原，其中所述寨卡病毒包含至少一个非人类细胞适应突变。
因此，本公开的某些方面涉及一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的来自寨卡病毒的一种抗原，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有突变。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，至少一个适应突变与缺乏所述至少一个适应突变的寨卡病毒相比增强遗传稳定性。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，至少一个适应突变与缺乏所述至少一个适应突变的寨卡病毒相比增强病毒复制。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒在包膜蛋白E(Env)中不包含突变。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，非人类细胞是哺乳动物细胞。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，非人类细胞是猴细胞。在一些实施方案中，所述猴细胞来自Vero细胞系。在一些实施方案中，所述Vero细胞系是WHO Vero 10-87细胞系。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒是非洲谱系病毒或亚洲谱系病毒。在一些实施方案中，寨卡病毒是亚洲谱系病毒。在一些实施方案中，寨卡病毒来自毒株PRVABC59。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是纯化的抗原疫苗或免疫原性组合物，亚单位疫苗或免疫原性组合物，灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物，或减毒的病毒疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含纯化的灭活的全寨卡病毒。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含突变。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ IDNO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒与毒株PRVABC59的区别在于在SEQ ID NO:1的第98位的Trp98Gly突变。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，病毒是化学灭活的。在一些实施方案中，病毒用去污剂、福尔马林、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰基乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种化学灭活。在一些实施方案中，病毒用福尔马林化学灭活。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物还含有佐剂。在一些实施方案中，所述佐剂选自铝盐，toll样受体(TLR)激动剂，单磷酰基脂质A(MLA)，合成脂质A，脂质A模拟物或类似物，MLA衍生物，细胞因子，皂苷，胞壁酰二肽(MDP)衍生物，CpG寡核苷酸，革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)，聚磷腈，乳剂，病毒体(virosome)，蜗形体(cochleate)，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒，泊洛沙姆颗粒，微粒，脂质体，完全弗氏佐剂(CFA)和/或不完全弗氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，佐剂是铝盐。在一些实施方案中，佐剂选自由明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和Alhydrogel 85组成的组。在一些实施方案中，一种或多种抗原的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到佐剂上。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是低剂量或中等剂量的疫苗或免疫原性组合物(例如，含有约1μg至约5μg抗原或5μg或抗原2μg抗原或5μg抗原)。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是高剂量疫苗或免疫原性组合物(例如，含有约10μg抗原)。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物含有约1μg至约25μg的一种或多种抗原，特别是2μg、5μg或10μg，或特别是10μg的一种或多种抗原。在某些这样的实施方案中，抗原是纯化的灭活全病毒，例如如本文所述在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有色氨酸至甘氨酸取代的突变的寨卡病毒。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。在某些这样的实施方案中，寨卡病毒是蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物含有约0.1μg至约100μg的寨卡病毒抗原或Env。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是无佐剂的。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒是克隆分离株。在一些实施方案中，克隆分离株基本上不含一种或多种外来因子(例如，不含可与亲本毒株共同纯化的一种或多种外来因子)。
本公开的其它方面涉及一种疫苗，所述疫苗包含在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有突变的寨卡病毒。在一些实施方案中，疫苗包含纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，疫苗包含纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。在某些这样的实施方案中，寨卡病毒是蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。
本公开的其它方面涉及一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物含有：a)铝盐佐剂；和b)纯化的灭活的全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒含有非人类细胞适应突变，并且其中所述非人类细胞适应突变是在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处的Trp98Gly突变。
本公开的其它方面涉及一种在有需要的受试者中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的任何本文所述的疫苗或免疫原性组合物。
本公开的其它方面涉及一种在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用免疫原性量的任何本文所述的疫苗或免疫原性组合物。
在一个方面，本公开涉及一种在有需要的受试者中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用疫苗或免疫原性组合物。
在一个方面，本公开涉及一种在有需要的受试者中诱导针对寨卡病毒抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用疫苗或免疫原性组合物。
在一个方面，本公开涉及一种在有需要的受试者中预防寨卡病毒疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用疫苗或免疫原性组合物。在这种情况下，所述疾病与轻度发热、斑丘疹、结膜炎和关节痛有关。此外，寨卡病毒是一种神经营养性黄病毒，其可能引起中枢神经系统内的疾病和格林-巴利综合征(GBS)。
在一个方面，本公开涉及一种在有需要的胎儿或新生儿中预防寨卡病毒疾病的方法，所述方法包括向怀孕的受试者或打算怀孕的受试者或有生育能力的妇女施用疫苗或免疫原性组合物。在这种情况下，寨卡疾病与胎儿和新生儿的严重后果有关。与寨卡病毒感染相关的一系列先天异常，称为先天性寨卡综合征(CZS)，包括具有颅骨部分塌陷的严重小头畸形，具有皮质下钙化的大脑皮层，黄斑瘢痕和局灶性色素性视网膜色斑，先天性挛缩和具有锥体外系受累症状的明显早期肌张力增高。
在一个方面，本公开涉及一种疫苗或免疫原性组合物，其用于在有需要的受试者中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，用于在有需要的受试者中诱导针对寨卡病毒抗原的免疫应答的方法，以及在有需要的受试者、胎儿或新生儿中预防寨卡病毒疾病的方法。
在一个方面，本公开涉及疫苗或免疫原性组合物在制造药物中的用途，所述药物用于在有需要的受试者中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，用于在有需要的受试者中诱导免疫应答的方法，以及用于在有需要的受试者胎儿或新生儿中预防寨卡病毒疾病的方法。
因此，本公开的某些方面涉及一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含寨卡抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于300，大于500，或大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于3000，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
因此，本公开的某些方面涉及一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度是在所述初免施用后28天诱导的几何平均中和抗体滴度的至少10倍，或至少15倍，或至少20倍，或至少25倍，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。因此，加强施用提供非常高的几何平均中和抗体滴度，从而产生长期保护。
因此，本公开的某些方面涉及一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以单剂或初免施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述单剂或初免施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于10，或大于50，或大于100，或大于200，或大于250，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。较高的几何平均中和抗体滴度表明保护作用的早期开始，这在疫情暴发情况下或旅行者在施用疫苗或免疫原性组合物后的短时间内访问流行地区时是有益的。
在本公开的含义内，PRNT是指通过如先前所述的蚀斑减少中和试验(PRNT)确定的寨卡病毒中和抗体滴度(参见Sun,W.等人,Protection of Rhesus monkeys againstdengue virus challenge after tetravalent live attenuated dengue virusvaccination.J.Infect.Dis.193,1658-1665(2006)；Muthumani K,Griffin BD,Agarwal S等人,In vivo protection against ZIKV infection and pathogenesis throughpassive antibody transfer and active immunisation with a prMEnv DNAvaccine.NPJ Vaccines 2016；1:16021)。用于PRNT测定开发的寨卡病毒株是PRVABC59。
在本公开的含义内，血清阳性定义为如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)确定的滴度≥10；如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)确定的寨卡病毒血清阴性受试者(滴度<10)，血清转换定义为：寨卡病毒血清阴性受试者(滴度<10)在接种后的滴度≥10，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定；如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定的结果<10被指定为5的滴度；如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)确定的滴度≥10(检测限)且<26(定量下限)被指定为13的值。
本公开的未感染黄病毒的受试者定义为如通过基于反应性抗体的测定法(Luminex)所测量不具有针对一组黄病毒的可检测血清抗体的受试者。黄病毒筛查测定法是基于luminex平台以同时检测同一样品中的多个靶抗原。这种基于珠的测定法是灵敏的、特异性的和可重现的。对于ZIK101，靶向的抗原是寨卡、登革热、黄热病、JEV、USUV、SLEV和WNV。由于黄病毒之间的交叉反应性，当前的抗原集合将有助于检测任何先前的黄病毒暴露。luminex概念的参考文献是：Dias D,Van Doren J,Schlottmann S,Kelly S,PuchalskiD,Ruiz W,Boerckel P,Kessler J,Antonello JM,Green T,Brown M,Smith J,ChirmuleN,Barr E,Jansen KU,Esser MT.2005.Optimization and validation of a multiplexedLuminex assay to quantify antibodies to neutralizing epitopes on humanpapillomaviruses 6,11,16,and 18.Clin.Diagn.Lab.Immunol.12:959-969[PMC freearticle][PubMed].Ayouba A等人,Development of a Sensitive and SpecificSerological Assay Based on Luminex Technology for Detection of Antibodies toZaire Ebola Virus.J Clin Microbiol.2017年12月28日；55(1):165-176.doi:10.1128/JCM.01979-16。
在本公开的含义内，流行地区被定义为如由疾病控制与预防中心定义的具有感染风险的地区，例如截至2018年3月，即：亚洲：孟加拉国、缅甸(Burma/Myanmar)、柬埔寨、印度、印度尼西亚、老挝、马来西亚、马尔代夫、巴基斯坦、菲律宾、新加坡、泰国、东帝汶(Timor-Leste/East Timor)、越南。太平洋岛屿：斐济、马绍尔群岛、巴布亚新几内亚、萨摩亚、所罗门群岛、汤加。加勒比：安圭拉；安提瓜和巴布达；阿鲁巴岛；巴巴多斯；博奈尔岛；英属维尔京群岛；古巴；库拉索；多米尼加；多明尼加共和国；格林纳达；海地；牙买加；蒙特塞拉特；美国领土波多黎各联邦；萨巴；圣基茨和尼维斯；圣卢西亚；圣马丁；圣文森特和格林纳丁斯；圣尤斯特歇斯；圣马丁；特立尼达和多巴哥；特克斯和凯科斯群岛；美属维尔京群岛。北美：墨西哥。中美洲：伯利兹、哥斯达黎加、萨尔瓦多、危地马拉、洪都拉斯、尼加拉瓜、巴拿马。南美洲：阿根廷、玻利维亚、巴西、哥伦比亚、厄瓜多尔、法属圭亚那、圭亚那、巴拉圭、秘鲁、苏里南、委内瑞拉。非洲：安哥拉、贝宁、布基纳法索、布隆迪、喀麦隆、佛得角、中非共和国、乍得、刚果(刚果-布拉柴维尔)、科特迪瓦、刚果民主共和国(刚果-金沙萨)、赤道几内亚、加蓬、冈比亚、加纳、几内亚、几内亚比绍、肯尼亚、利比里亚、马里、尼日尔、尼日利亚、卢旺达、塞内加尔、塞拉利昂、南苏丹、苏丹、坦桑尼亚、多哥、乌干达。这个地区可能会改变。
因此，本公开的某些方面涉及一种在有需要的受试者群体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含寨卡抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的受试者群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于300，或大于500，或大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于3000，或大于5000，或大于10,000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
因此，本公开的某些方面涉及一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以单剂或初免施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述单剂或初免施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于300，或大于500，大于1000，或大于2000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。高的几何平均中和抗体滴度表明保护作用的早期开始，这在疫情暴发情况下或旅行者在施用疫苗或免疫原性组合物后的短时间内访问流行地区时是有益的。
在本公开的含义内，报告病毒颗粒(RVP)中和测定法是指通过在96孔板中生长的Vero细胞中用恒定量的寨卡RVP滴定血清样品来分析寨卡中和抗体滴度。RVP含有寨卡(毒株SPH2012)的prME蛋白和基于登革热的海肾荧光素酶报告基因。简言之，将血清在56℃加热灭活30分钟，稀释，然后在37℃与RVP一起温育。然后将血清/RVP混合物与Vero细胞混合，并在37℃±2℃/5％CO2下温育72小时，然后用萤光素酶底物进行检测。使用JMP11非线性4参数分析对数据进行分析，将其归一化为阳性追踪对照，并报告50％有效剂量(EC50)。
因此，本公开的某些方面涉及一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含寨卡抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名血清阴性受试者的群体中诱导的血清转换率为100％。
因此，本公开的某些方面涉及一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以单剂或初免施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述单剂或初免施用后14和/或28天在至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的血清转换率为60％、70％、80％或90％。高的血清转换率表明保护作用的早期开始，这在疫情暴发情况下或旅行者在施用疫苗或免疫原性组合物后的短时间内访问流行地区时是有益的。
上述方法应理解为还涉及如本文所公开的包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物用于制造用于治疗或预防寨卡病毒感染的药物的相应用途。
上述方法应理解为还涉及如本文所公开的包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于治疗或预防寨卡病毒感染。
在一些实施方案中，施用是肌内或皮下的。在一些实施方案中，施用包括施用两剂如本文所述的疫苗或免疫原性组合物(例如10μg纯化的灭活全病毒，例如如本文所述在SEQID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有色氨酸至甘氨酸取代的突变的寨卡病毒)，间隔约1至约16周给与(第一次(初免)和第二次(加强)施用)。在某些这样的实施方案中，寨卡病毒是蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。
本公开的其它方面涉及如本文所述的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者中治疗或预防寨卡病毒感染，用于在有需要的受试者中诱导免疫应答，以及用于在有需要的受试者、胎儿或新生儿中预防寨卡病毒疾病。在一些实施方案中，施用是肌内或皮下的。在一些实施方案中，施用包括施用两剂如本文所述的疫苗或免疫原性组合物(例如10μg纯化的灭活全病毒，例如如本文所述在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有色氨酸至甘氨酸取代的突变的寨卡病毒)，间隔约1至约16周给与(第一次(初免)和第二次(加强)施用)。在某些这样的实施方案中，寨卡病毒是蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。
本公开的其它方面涉及如本文所述的疫苗或免疫原性组合物用于制造药物的用途，所述药物用于在有需要的受试者中治疗或预防寨卡病毒感染以在有需要的受试者中诱导免疫应答以及在有需要的受试者、胎儿或新生儿中预防寨卡病毒疾病。在一些实施方案中，施用是肌内或皮下的。在一些实施方案中，施用包括施用两剂如本文所述的疫苗或免疫原性组合物(例如10μg纯化的灭活全病毒，例如如本文所述在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有色氨酸至甘氨酸取代的突变的寨卡病毒)，间隔约1至约16周给与(第一次(初免)和第二次(加强)施用)。在某些这样的实施方案中，寨卡病毒是蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，受试者是怀孕的或打算怀孕的或有生育能力的妇女。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物的施用在受试者中诱导保护性免疫应答。在一些实施方案中，在受试者中诱导的保护性免疫应答大于在被施用含有来自缺乏至少一个非人类细胞适应突变的寨卡病毒的一种或多种抗原的疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的保护性免疫应答。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物的施用在受试者中诱导针对寨卡病毒的中和抗体的产生。在一些实施方案中，在受试者中产生的中和抗体的浓度高于在被施用包含来自缺乏至少一个非人类细胞适应突变的寨卡病毒的一种或多种抗原的疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中产生的中和抗体的浓度。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是通过选自以下的途径来施用的：皮下施用、经皮施用、真皮内施用、真皮下施用、肌内施用、经口施用、鼻内施用、经颊施用、腹膜内施用、阴道内施用、肛门施用和/或颅内施用。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物被施用一次或多次。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物以第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用。在一些实施方案中，在第一次(初免)施用后至少28天施用第二次(加强)施用。在一些实施方案中，施用包括施用两剂如本文所述的疫苗或免疫原性组合物(例如10μg纯化的灭活全病毒，例如如本文所述在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有色氨酸至甘氨酸取代的突变的寨卡病毒)，间隔约1至约16周给与(第一次(初免)和第二次(加强)施用)。在某些这样的实施方案中，寨卡病毒是蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，将病毒制剂与佐剂混合。在一些实施方案中，佐剂选自铝盐，toll样受体(TLR)激动剂，单磷酰基脂质A(MLA)，合成脂质A，脂质A模拟物或类似物，MLA衍生物，细胞因子，皂苷，胞壁酰二肽(MDP)衍生物，CpG寡核苷酸，革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)，聚磷腈，乳剂，病毒体，蜗形体，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒，泊洛沙姆颗粒，微粒，脂质体，完全弗氏佐剂(CFA)和/或不完全弗氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，佐剂是铝盐。在一些实施方案中，佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和/或Alhydrogel 85。在一些实施方案中，病毒制剂中一种或多种抗原的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到佐剂上。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，至少一种非人类细胞适应突变是在寨卡病毒NS1中。在一些实施方案中，至少一个适应突变发生在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置。在一些实施方案中，至少一个适应突变是Trp98Gly突变。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，至少一个适应突变与缺乏所述至少一个适应突变的寨卡病毒相比增强遗传稳定性。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，至少一个适应突变与缺乏所述至少一个适应突变的寨卡病毒相比增强病毒复制。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒在包膜蛋白E(Env)中不包含突变。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒群体是异质的。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒群体包含寨卡病毒临床分离株。在一些实施方案中，寨卡病毒临床分离株来自毒株PRVABC59。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒群体包含先前在细胞培养中传代一次或多次的寨卡病毒。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，接种物包含人类血清。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，接种物包含一种或多种外来因子。在一些实施方案中，寨卡病毒克隆分离株基本上不含一种或多种外来因子。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述方法还包括寨卡病毒克隆分离株的一次或多次另外的蚀斑纯化。在一些实施方案中，将寨卡病毒克隆分离株进一步蚀斑纯化两次或更多次。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述方法还包括将寨卡病毒克隆分离株在细胞培养物中传代一次或多次。在一些实施方案中，将寨卡病毒克隆分离株传代两次或更多次。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述方法还包括配制包含来自寨卡病毒克隆分离株的一种或多种抗原的疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是纯化的抗原疫苗或免疫原性组合物，亚单位疫苗或免疫原性组合物，灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物，或减毒的病毒疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是纯化的灭活全病毒疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，寨卡病毒克隆分离株是化学灭活的。在一些实施方案中，寨卡病毒克隆分离株用去污剂、福尔马林、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰基乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种化学灭活。在一些实施方案中，寨卡病毒克隆分离株用福尔马林化学灭活。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，所述方法还包括将疫苗或免疫原性组合物与佐剂混合。在一些实施方案中，佐剂选自铝盐，toll样受体(TLR)激动剂，单磷酰基脂质A(MLA)，合成脂质A，脂质A模拟物或类似物，MLA衍生物，细胞因子，皂苷，胞壁酰二肽(MDP)衍生物，CpG寡核苷酸，革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)，聚磷腈，乳剂，病毒体，蜗形体，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒，泊洛沙姆颗粒，微粒，脂质体，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，佐剂是铝盐。在一些实施方案中，佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和Alhydrogel 85。在一些实施方案中，一种或多种抗原的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到佐剂上。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含1μg至约40μg的纯化的灭活全病毒，或1μg至约30μg的纯化的灭活全病毒，或1μg至约20μg的纯化的灭活全病毒，特别是2μg、或5μg、或10μg、或15μg或20μg或特别是10μg的纯化的灭活全病毒，例如如本文所述在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有色氨酸至甘氨酸取代的突变的寨卡病毒。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含1μg至约30μg的纯化的灭活全病毒，特别是2μg、5μg或10μg，或特别是10μg的在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒是源自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含1μg至约30μg的纯化的灭活全病毒，特别是2μg、5μg或10μg，或特别是10μg的在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变的纯化的灭活全寨卡病毒，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含约0.1μg Env至约100μg Env。在某些这样的实施方案中，寨卡病毒是蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是无佐剂的。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒克隆分离株是同质遗传群体。在一些实施方案中，寨卡病毒克隆分离株在包膜蛋白E(Env)中不含突变。在一些实施方案中，寨卡病毒克隆分离株含有至少一个突变。在一些实施方案中，至少一个突变是在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中。在一些实施方案中，至少一个突变发生在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置。在一些实施方案中，至少一个突变是Trp98Gly突变。在一些实施方案中，至少一个突变不在包膜蛋白E(Env)中。在一些实施方案中，至少一个突变与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比增强遗传稳定性。在一些实施方案中，至少一个突变与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比增强病毒复制。
本公开的其它方面涉及一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物含有来自蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株的一种或多种抗原。在一些实施方案中，蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是从与包含寨卡病毒群体的接种物接触的细胞中蚀斑纯化的。在一些实施方案中，细胞是非人类细胞。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞。在一些实施方案中，昆虫细胞是蚊子细胞。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是猴细胞。在一些实施方案中，猴细胞来自Vero细胞系。在一些实施方案中，Vero细胞系是WHO Vero 10-87细胞系。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒群体是异质的。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒群体包含寨卡病毒临床分离株。在一些实施方案中，寨卡病毒临床分离株是来自毒株PRVABC59。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，寨卡病毒群体包含先前在细胞培养中传代一次或多次的寨卡病毒。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，接种物包含人类血清。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，接种物包含一种或多种外来因子。在一些实施方案中，蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株基本上不含一种或多种外来因子。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，与野生型寨卡病毒相比，蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株被修饰。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是同质遗传群体。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株不包括包膜蛋白E(Env)中的突变。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株包含至少一个突变。在一些实施方案中，至少一个突变是在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中。在一些实施方案中，至少一个突变发生在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置。在一些实施方案中，至少一个突变是Trp98Gly突变。在一些实施方案中，至少一个突变不在寨卡病毒包膜蛋白E(Env)中。在一些实施方案中，至少一个突变与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比增强遗传稳定性。在一些实施方案中，至少一个突变与缺乏所述至少一个突变的寨卡病毒相比增强病毒复制。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是非洲谱系病毒或亚洲谱系病毒。在一些实施方案中，蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是亚洲谱系病毒。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是纯化的抗原疫苗或免疫原性组合物，亚单位疫苗或免疫原性组合物，灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物，或减毒的病毒疫苗或免疫原性组合物。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，将蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株化学灭活。在一些实施方案中，蚀斑纯化的寨卡病毒用去污剂、福尔马林、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰基乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种化学灭活。在一些实施方案中，蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株用福尔马林化学灭活。
在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物还包含佐剂。在一些实施方案中，佐剂选自铝盐，toll样受体(TLR)激动剂，单磷酰基脂质A(MLA)，合成脂质A，脂质A模拟物或类似物，MLA衍生物，细胞因子，皂苷，胞壁酰二肽(MDP)衍生物，CpG寡核苷酸，革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)，聚磷腈，乳剂，病毒体，蜗形体，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒，泊洛沙姆颗粒，微粒，脂质体，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，佐剂是铝盐。在一些实施方案中，佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和Alhydrogel 85。在一些实施方案中，一种或多种抗原的至少75％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％被吸附到佐剂上。在可与任何前述实施方案组合的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物含有0.1μg至约25μg的纯化的灭活全病毒，例如如本文所述在SEQ ID NO:1的第98位具有色氨酸至甘氨酸取代的突变的寨卡病毒，特别是2μg、5μg或10μg，或特别是10μg纯化的灭活全病毒或约0.1μg Env至约100μg Env。在某些这样的实施方案中，寨卡病毒是蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物是无佐剂的。
应当理解，上文和本文所述的各个实施方案的一个、一些或全部性质可组合以形成本公开的其它实施方案。本公开的这些和其它方面对于本领域技术人员将变得显而易见。通过下面的详细描述进一步描述本公开的这些和其它实施方案。
附图说明
图1显示了模拟感染(顶部)或感染ZIKAV毒株PRVABC59(底部)的Vero细胞单层的明场显微镜图像。
图2显示了如通过TCID50确定的ZIKAV PRVABC59 P1在Vero细胞单层上的生长动力学。
图3显示了寨卡病毒PRVABC59 P5克隆a-f的效力测定测试(TCID50)。
图4显示了描绘寨卡病毒PRVABC59 P6克隆a-f在Vero细胞单层上的生长的细胞病变效应(CPE)的明场显微镜图像。
图5显示了寨卡病毒PRVABC59 P6克隆a-f的效力测定测试(TCID50)。
图6显示了氨基酸序列比对，比较了寨卡病毒株PRVABC59 P6e(SEQ ID NO:8)和PRVABC59(SEQ ID NO:9)的330号残基附近的寨卡病毒的包膜糖蛋白序列与其它几种黄病毒(WNV(SEQ ID NO:10)；JEV(SEQ ID NO:11)；SLEV(SEQ ID NO:12)；YFV(SEQ ID NO:13)；DENV 1 16007(SEQ ID NO:14)；DENV 2 16681(SEQ ID NO:15)；DENV 3 16562(SEQ IDNO:16)；和DENV 4 1036(SEQ ID NO:17))。
图7显示了氨基酸序列比对，比较了寨卡病毒株PRVABC59 P6e(SEQ ID NO:18)和PRVABC59(SEQ ID NO:19)的98号残基附近的寨卡病毒的NS1蛋白序列与其它几种黄病毒(WNV(SEQ ID NO:20)；JEV(SEQ ID NO:21)；SLEV(SEQ ID NO:22)；YFV(SEQ ID NO:23)；DENV 1 16007(SEQ ID NO:24)；DENV 2 16681(SEQ ID NO:25)；DENV 3 16562(SEQ IDNO:26)；和DENV 4 1036(SEQ ID NO:27))。
图8显示了ZIKAV PRVABC59 P6病毒克隆a-f与ZIKAV PRVABC59 P1病毒相比的蚀斑表型。
图9显示了ZIKAV PRVABC59 P6病毒克隆与ZIKAV PRVABC59 P1病毒相比的平均蚀斑大小。
图10显示了ZIKAV PRVABC59 P6克隆a-f在Vero细胞中在无血清生长条件下的生长动力学。
图11显示了制备用于免疫实验的PRVABC59 P6b和P6e配制药物产品所采取的步骤的示意图。
图12A显示了用源自ZIKAV PRVABC59 P6b和P6e克隆的疫苗制剂向CD-1小鼠给药的时间表。PBS用作安慰剂。
图12B显示了使用源自ZIKAV PRVABC59 P6b和P6e克隆的疫苗制剂如图12A所述免疫的CD-1小鼠的血清ZIKAV中和抗体滴度。ZIKAV中和抗体滴度通过报告病毒颗粒(RVP)中和测定法来确定。实线表示一组的几何平均值。检测限(1.93log10)由虚线表示。
图13A显示了用源自ZIKAV PRVABC59 P6b和P6e克隆的疫苗制剂向AG129小鼠给药的时间表。PBS用作安慰剂。
图13B显示了使用源自ZIKAV PRVABC59 P6b和P6e克隆的疫苗制剂如图13A所述免疫的AG129小鼠的血清ZIKAV中和抗体滴度。实线表示一组的几何平均值。检测限(1.30log10)由虚线表示。不具有可检测滴度(<1.30)的动物指定滴度为0.5。
图14显示了攻毒后AG129测试组的平均体重，以起始体重的百分比表示。误差条表示标准偏差。
图15显示了攻毒后两天的个体AG129小鼠的血清病毒血，报告为PFU/mL。实线表示一组的平均值。检测限(2.0log10)由虚线表示。
图16显示了攻毒后AG129测试组的存活分析。
图17显示了从接种和攻毒的AG129小鼠被动转移合并血清后的攻毒前血清循环ZIKAV中和抗体(Nab)滴度。
图18显示了用寨卡病毒攻毒的被动转移和对照小鼠的平均体重。
图19显示了攻毒后三天的个体AG129小鼠的血清病毒血，报告为PFU/mL。
图20显示了用寨卡病毒攻毒的被动转移和对照小鼠的存活分析。
图21显示了在被动转移小鼠中观察到的ZIKAV中和抗体滴度与病毒血之间的相关性。
图22显示了使用Kaplan Meier存活曲线对用P6a和P6e的preMVS储备液攻毒后的AG129小鼠的存活分析。
图23显示了用P6a和P6e的preMVS储备液攻毒后以发明时的起始体重的百分比表示的平均体重。虚线表示起始重量的100％供参考。
图24显示了用P6a和P6e的preMVS储备液攻毒三天后个别AG129小鼠的血清病毒血，报告为PFU/mL。虚线表示测定法的检测限。
图25显示了实施例4的临床研究设计概要。
图26显示了实施例4中使用受试者的PRNT确定的几何平均滴度(GMT)。
图27显示了在实施例4中描述的研究的第29天(初免剂量后第28天)和第57天(加强剂量后第28天)使用PRNT确定的达到血清转换的受试者的百分比。
图28显示了在实施例4中描述的研究的第29天(初免剂量后第28天)达到特定几何平均滴度(使用PRNT确定)的受试者的百分比的图。
图29显示了在实施例4中描述的研究的第57天(初免剂量后第56天)达到特定几何平均滴度(使用PRNT确定)的受试者的百分比的图。
具体实施方式
一般技术
本文描述或参考的技术和程序一般为本领域技术人员所容易理解并通常使用常规方法来利用，例如，以下文献中所述的广泛利用的方法：Sambrook等人,MolecularCloning:A Laboratory Manual第3版(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.；Current Protocols in Molecular Biology(F.M.Ausubel等人编辑,(2003))；Methods in Enzymology系列(Academic Press,Inc.):PCR 2:APractical Approach(M.J.MacPherson,B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995)),Antibodies,A Laboratory Manual(Harlow和Lane编辑(1988),和Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑,1984)；Methodsin Molecular Biology(J.M.Walker编辑Humana Press(1983))；Cell Biology:ALaboratory Notebook(J.E.Celis编辑,Academic Press(1998))Academic Press；AnimalCell Culture(R.I.Freshney)编辑,1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts编辑Plenum Press(1998))；Cell and Tissue Culture:Laboratory Procedures(A.Doyle,J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑,J.Wiley and Sons(1993-8))；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑,ColdSpring Harbor Laboratory(1987))；PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis等人编辑,Springer(1994))；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等人编辑,Wiley(1991))；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers,(1997))；Antibodies(P.Finch,1997)；Antibodies:A Practical Approach(D.Catty.编辑,IRL Press,(1988-1989))；Monoclonal Antibodies:A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编辑,OxfordUniversity Press,(2000))；Using Antibodies:A Laboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring Harbor Laboratory Press,(1999))；以及The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑,Harwood Academic Publishers,(1995))。
寨卡病毒
本公开的某些方面涉及至少一种寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株，通过本文所述的方法纯化的寨卡病毒，包含一种或多种非人类细胞适应突变的寨卡病毒等)，所述病毒可用于疫苗和/或免疫原性组合物，包括但不限于纯化病毒、灭活病毒、减毒病毒、重组病毒、或用于亚单位疫苗的纯化和/或重组病毒蛋白。
寨卡病毒(ZIKV)是一种蚊媒黄病毒，最早于1947年从乌干达寨卡森林(ZikaForest)的哨兵恒河猴中分离出来。自那时以来，已经在非洲和亚洲以及最近在美洲从人类中进行了分离。ZIKV存在于两个(可能是三个)谱系中：一个非洲谱系(可能是分开的东非和西非谱系)和一个亚洲谱系。因此，本公开的合适的寨卡病毒的实例包括但不限于来自非洲和/或亚洲谱系的病毒。在一些实施方案中，寨卡病毒是非洲谱系病毒。在一些实施方案中，寨卡病毒是亚洲谱系病毒。另外，先前已经鉴定出非洲和亚洲谱系寨卡病毒中的多种毒株。本领域已知的任何一种或多种合适的寨卡病毒株都可用于本公开中，包括例如毒株Mr766、ArD 41519、IbH 30656、P6-740、EC Yap、FSS13025、ArD 7117、ArD 9957、ArD 30101、ArD 30156、ArD 30332、HD 78788、ArD 127707、ArD 127710、ArD 127984、ArD 127988、ArD127994、ArD 128000、ArD 132912、132915、ArD 141170、ArD 142623、ArD149917、ArD149810、ArD 149938、ArD 157995、ArD 158084、ArD165522、ArD 165531、ArA 1465、ArA27101、ArA 27290、ArA 27106、ArA 27096、ArA 27407、ArA 27433、ArA 506/96、ArA 975-99、Ara982-99、ArA 986-99、ArA 2718、ArB 1362、尼日利亚68、马来西亚66、凯杜古84、苏里南、MR1429、PRVABC59、ECMN2007、DakAr41524、H/PF/2013、R103451、103344、8375、JMB-185、ZIKV/H、智人/巴西/纳塔尔/2015、SPH2015、ZIKV/Hu/千叶/S36/2016和/或古巴2017。在一些实施方案中，在本公开中使用毒株PRVABC59。
在一些实施方案中，寨卡病毒基因组序列的一个实例在下面以SEQ ID NO:2示出：
Figure BDA0002475462310000281
Figure BDA0002475462310000291
Figure BDA0002475462310000301
Figure BDA0002475462310000311
Figure BDA0002475462310000321
在一些实施方案中，寨卡病毒可包含GenBank登录号KU501215.1的基因组序列。在一些实施方案中，寨卡病毒来自毒株PRVABC59。在一些实施方案中，GenBank登录号KU501215.1的基因组序列包含SEQ ID NO:2的序列。在一些实施方案中，寨卡病毒可包含与SEQ ID NO:2的序列具有至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的基因组序列。
在一些实施方案中，寨卡病毒可包含至少一个由SEQ ID NO:2的序列编码的多肽。在一些实施方案中，寨卡病毒可包含至少一个多肽，所述多肽的氨基酸序列与由SEQ IDNO:2的序列编码的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。
因此，在一些实施方案中，本公开的寨卡病毒可用于任何本文公开的疫苗和/或免疫原性组合物中。例如，本公开的寨卡病毒可用于提供一种或多种抗原，所述抗原可用于在有需要的受试者中治疗或预防寨卡病毒感染和/或在有需要的受试者中诱导针对寨卡病毒的免疫应答，例如保护性免疫应答。
病毒抗原
在一些实施方案中，本公开涉及可用于疫苗和/或免疫原性组合物中的来自本文所述的任何寨卡病毒的一种或多种抗原，包括但不限于纯化病毒、灭活病毒、减毒病毒、重组病毒、或用于亚单位疫苗的纯化和/或重组的病毒蛋白。在一些实施方案中，疫苗和/或免疫原性组合物包含灭活的全病毒。
本公开的抗原可以是任何能够引发免疫应答的物质。合适抗原的实例包括但不限于全病毒，减毒病毒，灭活病毒，蛋白质，多肽(包括活性蛋白质和蛋白质内的各个多肽表位)，糖多肽，脂多肽，肽，多糖，多糖结合物，多糖和其它分子的肽和非肽模拟物，小分子，脂质，糖脂和碳水化合物。
本公开的抗原可来自由细胞培养物中的一个或多个细胞(例如，经由蚀斑纯化)产生的任何寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。可使用本领域已知的用于产生寨卡病毒的任何合适的细胞，包括例如昆虫细胞(例如，蚊子细胞如CCL-125细胞、Aag-2细胞、RML-12细胞、C6/36细胞、C7-10细胞、AP-61细胞、A.t.GRIP-1细胞、A.t.GRIP-2细胞、A.t.GRIP-3细胞、UM-AVE1细胞、Mos.55细胞、Sua1B细胞、4a-3B细胞、Mos.42细胞、MSQ43细胞、LSB-AA695BB细胞、NIID-CTR细胞、TRA-171细胞，以及来自蚊子物种如埃及伊蚊、白纹伊蚊(Aedes albopictus)、假鳞斑伊蚊(Aedes pseudoscutellaris)、三叶伊蚊(Aedestriseriatus)、刺扰伊蚊(Aedes vexans)、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)、斯氏按蚊(Anopheles stephensi)、白点按蚊(Anopheles albimus)、致倦库蚊(Culexquinquefasciatus)、纹腿库蚊(Culex theileri)、三带喙库蚊(Culextritaeniorhynchus)、二带喙库蚊(Culex bitaeniorhynchus)和/或安汶巨蚊(Toxorhynchites amboinensis)的另外的细胞或细胞系)，和哺乳动物细胞(例如，VERO细胞(来自猴肾)，LLC-MK2细胞(来自猴肾)，MDBK细胞，MDCK细胞，ATCC CCL34MDCK(NBL2)细胞，MDCK 33016(如WO97/37001中所述的保藏号DSM ACC 2219)细胞，BHK21-F细胞，HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在一些实施方案中，本公开的抗原来自由非人类细胞(例如，经由蚀斑纯化)产生的寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。在一些实施方案中，本公开的抗原来自由昆虫细胞(例如，经由蚀斑纯化)产生的寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。在一些实施方案中，本公开的抗原来自由蚊子细胞(例如，经由蚀斑纯化)产生的寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。在一些实施方案中，本公开的抗原来自由哺乳动物细胞(例如，经由蚀斑纯化)产生的寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。在一些实施方案中，本公开的抗原来自由VERO细胞(例如，经由蚀斑纯化)产生的寨卡病毒(例如，寨卡病毒克隆分离株)。通过进行蚀斑纯化来纯化病毒的方法是本领域普通技术人员已知的(参见例如下面的实施例1)。
本公开的抗原可包括至少一个非人类细胞适应突变。可通过使病毒适应特定细胞系中的生长来产生适应突变。例如，细胞可用病毒、从病毒(例如，传染性病毒或传染性克隆)转录的RNA和/或从全病毒中纯化的RNA进行转染或电穿孔，并传代以使得病毒和/或病毒RNA复制并且其核酸发生突变。核酸突变可以是点突变、插入突变或缺失突变。核酸突变可导致病毒蛋白内的氨基酸变化，从而促进病毒在非人类细胞中的生长。适应突变可促进病毒的表型变化，包括改变的蚀斑大小、生长动力学、温度敏感性、耐药性、毒力和细胞培养中的病毒产量。这些适应性突变可通过提高细胞系中培养的病毒的速度、产量和一致性来用于疫苗制造。适应性突变可通过改变免疫原性表位的结构来改变(例如，增强或降低)病毒抗原的免疫原性。另外，适应性突变还可通过多次(例如，至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次、至少10次、至少11次、至少12次、至少13次、至少14次、至少15次、至少16次、至少17次、至少18次、至少19次、至少20次或更多次)传代来增加病毒的遗传稳定性和/或减少或以其它方式抑制病毒中不希望的突变的发展。
因此，在某些实施方案中，本公开的抗原包括至少一个非人类细胞适应突变。在某些实施方案中，适应突变是病毒抗原针对非人类细胞的突变。在一些实施方案中，非人类细胞是哺乳动物细胞。可使用本领域已知的任何合适的哺乳动物细胞，包括但不限于VERO细胞(来自猴肾)、LLC-MK2细胞(来自猴肾)、MDBK细胞、MDCK细胞、ATCC CCL34 MDCK(NBL2)细胞、MDCK 33016(如WO97/37001中所述的保藏号DSM ACC 2219)细胞、BHK21-F细胞、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)。在一些实施方案中，非人类细胞是猴细胞。在一些实施方案中，猴细胞来自Vero细胞系。可使用本领域已知的任何合适的Vero细胞系，包括但不限于WHO Vero 10-87、ATCC CCL-81、Vero 76(ATCC登录号CRL-1587)或Vero C1008(ATCC登录号CRL-1586)。在一些实施方案中，Vero细胞系是WHO Vero 10-87。
寨卡病毒具有编码结构和非结构多肽的正义单链RNA基因组。所述基因组在5'和3'末端区域也含有非编码序列，这些序列在病毒复制中起作用。这些病毒编码的结构多肽包括但不限于衣壳(C)、前体膜(prM)和包膜(E)。这些病毒编码的非结构(NS)多肽包括但不限于NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。
在某些实施方案中，本公开的抗原可在一个或多个(例如一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、六个或更多个、七个或更多个、八个或更多个、九个或更多个或所有十个)病毒抗原/多肽(包括但不限于C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)内含有至少一个(例如，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个、至少15个、至少16个、至少17个、至少18个、至少19个、至少20个等)非人类细胞适应突变。在一些实施方案中，本公开的抗原包括寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中的至少一个非人类细胞适应突变。在一些实施方案中，本公开的抗原包括灭活全病毒，所述病毒可含有至少一个(例如，至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少10个等)非人类细胞适应突变。在一些实施方案中，本公开的抗原包括灭活全病毒，所述病毒可在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中含有至少一个非人类细胞适应突变。
在一些实施方案中，至少一个非人类细胞适应突变在NS1多肽内。来自示例性寨卡病毒株的野生型非细胞适应性NS1多肽的氨基酸序列示为：
DVGCSVDFSKKETRCGTGVFVYNDVEAWRDRYKYHPDSPRRLAAAVKQAWEDGICGISSVSRMENIMWRSVEGELNAILEENGVQLTVVVGSVKNPMWRGPQRLPVPVNELPHGWKAWGKSYFVRAAKTNNSFVVDGDTLKECPLKHRAWNSFLVEDHGFGVFHTSVWLKVREDYSLECDPAVIGTAVKGKEAVHSDLGYWIESEKNDTWRLKRAHLIEMKTCEWPKSHTLWTDGIEESDLIIPKSLAGPLSHHNTREGYRTQMKGPWHSEELEIRFEECPGTKVHVEETCGTRGPSLRSTTASGRVIEEWCCRECTMPPLSFRAKDGCWYGMEIRPRKEPESNLVRSMVT(SEQ ID NO:1)。
在一些实施方案中，NS1多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性。在一些实施方案中，NS1多肽的氨基酸序列可来自由GenBank登录号KU501215.1的序列(SEQ ID NO:2)编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，NS1多肽的氨基酸序列可以是由GenBank登录号KU501215.1的序列编码的氨基酸序列的第795至1145位氨基酸。在一些实施方案中，NS1多肽的氨基酸序列可来自寨卡病毒株PRVABC59。
“序列同一性”、“序列同一性％”、“同一性％”、“同一％”或“序列比对”是指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的比较，或第一核酸序列与第二核酸序列的比较，并且基于所述比较以百分比计算。该计算结果可描述为“同一性百分比”或“ID百分比”。
通常，序列比对可用于通过两种不同方法之一来计算序列同一性。在第一种方法中，在最终序列同一性计算中，将单个位置处的不匹配和单个位置处的空位都计为不相同的位置。在第二种方法中，在最终序列同一性计算中，将单个位置处的不匹配计为不相同的位置；然而，在最终序列同一性计算中，单个位置处的空位不计为(忽略)不相同的位置。换句话说，在第二种方法中，在最终序列同一性计算中忽略了空位。这两种方法之间的差异(即，在单个位置，将空位计为不相同的位置相对于忽略空位)可能会导致两个序列之间的序列同一性值的可变性。
序列同一性由程序确定，该程序产生比对，并计算同一性，在最终序列同一性计算中将单个位置处的错配和单个位置处的空位都计为不相同的位置。例如程序Needle(EMBOS)，该程序已实现Needleman和Wunsch的算法(Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)，并且其计算根据默认设置的序列同一性，通过首先产生第一序列与第二序列之间的比对，然后计算比对长度上相同位置的数目，然后将相同残基的数目除以比对长度，然后将该数目乘以100以产生序列同一性％[序列同一性％＝(相同残基数/比对长度)×100)]。
可从逐对比对计算序列同一性，所述逐对比对显示全长上的两个序列，因此以全长显示第一序列和第二序列(“全局序列同一性”)。例如，程序Needle(EMBOSS)产生这样的比对；序列同一性％＝(相同残基数/比对长度)×100)]。
可从仅显示第一序列或第二序列的局部区域的逐对比对来计算序列同一性(“局部同一性”)。例如，程序Blast(NCBI)产生这样的比对；序列同一性％＝(相同残基数/比对长度)×100)]。
序列比对优选通过使用Needleman和Wunsch的算法(J.Mol.Biol.(1979)48,第443-453页)产生。优选地，将程序“NEEDLE”(欧洲分子生物学开放软件套件(EuropeanMolecular Biology Open Software Suite，EMBOSS))与程序默认参数(对于蛋白质，空位开放＝10.0，空位延伸＝0.5，并且矩阵＝EBLOSUM62，而对于核苷酸，矩阵＝EDNAFULL)一起使用。然后，可以从显示全长的两个序列的比对中计算序列同一性，因此以全长显示第一序列和第二序列(“全局序列同一性”)。例如：序列同一性％＝(相同残基数/比对长度)×100)]。
在一些实施方案中，至少一个非人类细胞适应突变发生在NS1多肽内的一个或多个氨基酸位置。在一些实施方案中，当使用逐对比对算法与SEQ ID NO:1进行比对时，突变发生在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置。在一些实施方案中，第98位的突变是色氨酸至甘氨酸的取代。
在一些实施方案中，寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含突变。可通过使用逐对比对算法将NS-1蛋白的氨基酸序列与SEQ IDNO:1比对来确定对应于SEQ ID NO:1的第98位的位置。在本申请的图7中显示了除寨卡病毒以外的病毒中与SEQ ID NO:1的第98位色氨酸残基相对应的氨基酸残基，其中这些残基用方框标出。在一些实施方案中，第98位的突变是色氨酸至甘氨酸的取代。在一些实施方案中，第98位的突变是在SEQ ID NO:1的第98位的色氨酸至甘氨酸的取代。
在一些实施方案中，本公开的抗原在NS1蛋白内含有至少一个非人类细胞适应突变，并且在C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5病毒蛋白的一个或多个内含有至少一个突变(例如，至少一个适应突变)。在一些实施方案中，本公开的抗原在NS1蛋白内含有一个或多个非人类细胞适应突变，并且在C、prM、E、NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5病毒蛋白的一个或多个内不含至少一个突变(例如，至少一个非人类细胞适应突变)。在一些实施方案中，本公开的抗原在NS1蛋白内含有至少一个非人类细胞适应突变，并且在包膜蛋白E内不含至少一个突变(例如，至少一个非人类细胞适应突变)。在一些实施方案中，本公开的抗原包括灭活全病毒，该病毒在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中含有至少一个非人类细胞适应突变，并且在寨卡病毒包膜蛋白E(Env)中不包括突变。在一些实施方案中，本公开的抗原在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处含有突变，并且在包膜蛋白E内不含任何突变。在一些实施方案中，本公开的抗原包括灭活全病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处含有突变，并且在寨卡病毒包膜蛋白E(Env)中不包括突变。在一些实施方案中，灭活全病毒在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中含有至少一个突变，并且编码包膜蛋白的序列与SEQ ID No.2中的相应序列相同。在一些实施方案中，寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处含有突变，并且编码包膜蛋白的序列与SEQ ID No.2中的相应序列相同。在一些实施方案中，灭活全寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处含有突变，并且编码包膜蛋白的序列与SEQ ID No.2中的相应序列相同。
在一些实施方案中，本公开的抗原如寨卡病毒含有至少一个非人类细胞适应突变，与缺乏所述至少一个适应突变的寨卡病毒相比，该突变增强遗传稳定性。在一些实施方案中，本公开的抗原如寨卡病毒含有至少一个非人类细胞适应突变，与缺乏所述至少一个适应突变的寨卡病毒相比，该突变增强病毒复制。在一些实施方案中，本公开的抗原如寨卡病毒含有至少一个非人类细胞适应突变，该突变减少或以其它方式抑制不希望的突变的发生，例如在寨卡病毒的包膜蛋白E(Env)内。
在本公开的上述实施方案中，示例性的逐对比对算法是使用默认参数(例如，空位开放罚分＝10.0，并且空位延伸罚分＝0.5，使用EBLOSUM62评分矩阵)的Needleman-Wunsch全局比对算法。该算法在EMBOSS程序包的needle工具中方便地实现。
在一些实施方案中，来自寨卡病毒的本公开的抗原可用于任何本公开的疫苗和免疫原性组合物中。例如，本公开的抗原可用于在有需要的受试者中治疗或预防寨卡病毒感染和/或在有需要的受试者中诱导针对寨卡病毒的免疫应答，例如保护性免疫应答。
疫苗和免疫原性组合物的生产
本公开的其它方面涉及寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物，所述疫苗和免疫原性组合物含有来自至少一种寨卡病毒的本公开的一种或多种抗原。这样的疫苗和免疫原性组合物可用于例如在有需要的受试者中治疗或预防寨卡病毒感染和/或在有需要的受试者中诱导针对寨卡病毒的免疫应答，例如保护性免疫应答。本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可包括但不限于纯化病毒、灭活病毒、减毒病毒、重组病毒、用于亚单位疫苗的纯化和/或重组病毒蛋白。本公开的疫苗和/或免疫原性组合物还可包括纯化的抗原疫苗或免疫原性组合物，亚单位疫苗或免疫原性组合物，灭活的全病毒疫苗或免疫原性组合物，或纯化的灭活全病毒疫苗或免疫原性组合物，或减毒的病毒疫苗或免疫原性组合物。
本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的生产包括寨卡病毒的生长，其中抗原是从生长的病毒制备的。细胞培养中的生长是用于制备本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的方法。用于病毒生长的细胞可以悬浮或贴壁条件培养。
适合于本公开的至少一种病毒的生长的细胞系优选地是哺乳动物来源的，并且包括但不限于：昆虫细胞(例如，如本文所述的蚊子细胞，VERO细胞(来自猴肾)，马，牛(例如MDBK细胞)，绵羊，狗(例如来自狗肾的MDCK细胞，ATCC CCL34 MDCK(NBL2)或MDCK 33016，如WO97/37001中所述的保藏号DSM ACC 2219)，猫，和啮齿动物(例如仓鼠细胞如BHK21-F、HKCC细胞或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并且可从多种发育阶段获得，包括例如成年、新生儿、胎儿和胚胎。在某些实施方案中，细胞被永生化(例如，如WO 01/38362和WO 02/40665中所述并以ECACC保藏号96022940保藏的PERC.6细胞)。在优选的实施方案中，利用哺乳动物细胞，并且所述细胞可选自和/或源自以下非限制性细胞类型中的一种或多种：成纤维细胞(例如真皮、肺)，内皮细胞(例如主动脉、冠状动脉、肺、血管、真皮微血管、脐带)，肝细胞，角质形成细胞，免疫细胞(例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK、树突状细胞)，乳腺细胞(例如上皮细胞)，平滑肌细胞(例如血管、主动脉、冠状动脉、动脉、子宫、支气管、宫颈、视网膜周细胞)，黑素细胞，神经细胞(例如星形细胞)，前列腺细胞(例如上皮、平滑肌)，肾细胞(例如上皮、肾小球系膜、近端小管)，骨骼细胞(例如软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)，肌肉细胞(例如成肌细胞、骨骼肌、平滑肌、支气管)，肝细胞，成视网膜细胞和基质细胞。WO97/37000和WO97/37001描述了能够在悬浮液和无血清培养基中生长并且可用于病毒的产生和复制的动物细胞和细胞系的生产。
上述细胞类型的培养条件是已知的，并在各种出版物中有所描述。或者，培养基、补充剂和条件可商购，例如在Cambrex Bioproducts(East Rutherford,N.J.)的目录和其它文献中描述。
在某些实施方案中，本文所述方法中使用的细胞在无血清和/或无蛋白质的培养基中培养。在本公开的上下文中，培养基被称为无血清培养基，其中不存在来自人类或动物来源的血清的添加剂。无蛋白质应理解为是指这样的培养物，其中细胞增殖发生在排除蛋白质、生长因子、其它蛋白质添加剂和非血清蛋白质的情况下，但是可任选地包括诸如胰蛋白酶的蛋白质或病毒生长所必需的其它蛋白酶。在这样的培养物中生长的细胞自然地含有蛋白质本身。
已知的无血清培养基包括Iscove培养基、Ultra-CHO培养基(BioWhittaker)或EX-CELL(JRH Bioscience)。含血清的普通培养基包括Eagle基础培养基(BME)或最低必需培养基(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))或Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM或EDM)，通常使用至多10％胎牛血清或类似添加剂。任选地，可使用最低必需培养基(MEM)(Eagle,Science,130,432(1959))或Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM或EDM)，而无任何含血清的补充剂。无蛋白质培养基如PF-CHO(JHR Bioscience)，化学成分确定的培养基如ProCHO4CDM(BioWhittaker)或SMIF 7(Gibco/BRL Life Technologies)和有丝分裂肽如Primactone、Pepticase或HyPep.TM.(全部来自Quest International)或乳清蛋白水解产物(Gibco和其他制造商)在现有技术中也是充分已知的。基于植物水解产物的培养基添加剂具有特殊优势，即可排除病毒、支原体或未知传染性病原体的污染。
由于根据本公开使用的细胞系的适合性，细胞培养条件(温度、细胞密度、pH值等)在非常宽的范围内可变，并且可适应特定病毒株的要求。
在培养的细胞中繁殖病毒的方法通常包括以下步骤：用待培养的毒株接种培养的细胞，将感染的细胞培养所需的一段时间以进行病毒繁殖，例如通过病毒滴度或抗原表达(例如在接种后24至168小时之间)所确定，以及收集繁殖的病毒。在一些实施方案中，病毒是经由蚀斑纯化收集的。将培养的细胞用病毒(通过PFU或TCID50测量)接种至细胞比率为1:500至1:1，优选1:100至1:5。将病毒加入到细胞悬浮液中或施加于细胞单层，并且在25℃至40℃、优选28℃至38℃下使病毒在细胞上吸收至少10分钟、至少20分钟、至少30分钟、至少40分钟、至少50分钟、至少60分钟，但通常少于300分钟。感染的细胞培养物(例如单层)可通过冻融或通过酶促作用去除，以增加收获的培养物上清液的病毒含量。然后将收获的流体灭活或冷冻储存。培养的细胞可以约0.0001至10、优选0.002至5、更优选0.001至2的感染复数(“MOI”)感染。更优选地，以约0.01的MOI感染细胞。可在感染后30至60小时或感染后3至10天收获感染的细胞。在某些优选的实施方案中，在感染后3至7天收获细胞。更优选地，在感染后3至5天收获细胞。在一些实施方案中，可在细胞培养期间加入蛋白酶(例如胰蛋白酶)以允许病毒释放，并且可在培养期间的任何合适阶段加入蛋白酶。或者，在某些实施方案中，可收获感染细胞培养物的上清液，并且可从上清液中分离或以其它方式纯化病毒。
病毒接种物和病毒培养物优选不含(即将经过测试并给出阴性污染结果)单纯疱疹病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒3、SARS冠状病毒、腺病毒、鼻病毒、呼肠孤病毒、多瘤病毒、鼻病毒、圆环病毒和/或细小病毒[WO2006/027698]。
如果病毒已经在细胞系上生长，则标准做法是使最终疫苗中残留的细胞系DNA的量最小化，以便使宿主细胞DNA的任何致癌活性最小化。可在疫苗制备过程中使用标准纯化程序例如色谱法等去除污染的DNA。可通过核酸酶处理，例如通过使用DNA酶来增强残留宿主细胞DNA的去除。在参考文献(Lundblad(2001)Biotechnology and AppliedBiochemistry 34:195-197,Guidance for Industry:Bioanalytical MethodValidation.U.S.Department of Health and Human Services Food and DrugAdministration Center for Drug Evaluation and Research(CDER)Center forVeterinary Medicine(CVM).2001年5月)中公开了一种减少宿主细胞DNA污染的适宜方法，所述方法涉及两步处理，首先使用可在病毒生长期间使用的DNA酶(例如Benzonase)，然后可在病毒粒子破坏期间使用阳离子去污剂(例如CTAB)。也可使用通过β-丙内酯处理去除。在一个实施方案中，通过对培养物上清液进行benzonase处理去除污染性DNA。
抗原的产生
用于疫苗和/或免疫原性组合物中的本公开的抗原，包括但不限于用于治疗和/或预防寨卡病毒感染和/或诱导针对寨卡病毒的免疫应答如保护性免疫应答的纯化病毒、灭活病毒、灭活全病毒、减毒病毒、重组病毒、或用于亚单位疫苗的纯化和/或重组的病毒蛋白，可通过本领域已知的任何合适的方法来产生和/或纯化或以其它方式分离。本公开的抗原可包括但不限于从寨卡病毒产生、衍生、纯化和/或以其它方式分离的全病毒、减毒病毒、灭活病毒、灭活全病毒、蛋白质、多肽(包括活性蛋白质和蛋白质内的各个多肽表位)、糖多肽、脂多肽、肽、多糖、多糖结合物、多糖和其它分子的肽和非肽模拟物、小分子、脂质、糖脂和碳水化合物。例如，合适的抗原可包括但不限于来自寨卡病毒的结构多肽如C、prM和/或E，和非结构多肽如NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和/或NS5。
在一个实施方案中，本公开的抗原是纯化的灭活的全寨卡病毒。
本公开的抗原可以化学方式或酶促方式合成，重组产生，从天然来源分离或前述的组合。在某些实施方案中，本公开的抗原是从本公开的至少一种寨卡病毒产生、纯化、分离和/或衍生的。本公开的抗原可以是纯化的，部分纯化的或粗提取物。在一些实施方案中，本公开的抗原是病毒，例如灭活病毒，如上文在题为“疫苗和免疫原性组合物的生产”的部分中所述生产。
在某些实施方案中，可通过培养非人类细胞来产生本公开的一种或多种抗原。适合产生本公开的一种或多种抗原的细胞系可包括昆虫细胞(例如，本文所述的任何蚊子细胞)。适合产生本公开的一种或多种抗原的细胞系也可以是哺乳动物来源的细胞，并且包括但不限于：VERO细胞(来自猴肾)，马，牛(例如MDBK细胞)，绵羊，狗(例如来自狗肾的MDCK细胞，ATCC CCL34 MDCK(NBL2)或MDCK 33016，如WO97/37001中所述的保藏号DSM ACC 2219)，猫和啮齿动物(例如仓鼠细胞如BHK21-F、HKCC细胞，或中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞))，并且可从多种发育阶段获得，包括例如成年、新生儿、胎儿和胚胎。在某些实施方案中，细胞被永生化(例如，如WO01/38362和WO02/40665中所述并以ECACC保藏号96022940保藏的PERC.6细胞)。在优选的实施方案中，利用哺乳动物细胞，并且所述细胞可选自和/或源自以下非限制性细胞类型中的一种或多种：成纤维细胞(例如真皮、肺)，内皮细胞(例如主动脉、冠状动脉、肺、血管、真皮微血管、脐带)，肝细胞，角质形成细胞，免疫细胞(例如T细胞、B细胞、巨噬细胞、NK、树突状细胞)，乳腺细胞(例如上皮细胞)，平滑肌细胞(例如血管、主动脉、冠状动脉、动脉、子宫、支气管、宫颈、视网膜周细胞)，黑素细胞，神经细胞(例如星形细胞)，前列腺细胞(例如上皮、平滑肌)，肾细胞(例如上皮、肾小球系膜、近端小管)，骨骼细胞(例如软骨细胞、破骨细胞、成骨细胞)，肌肉细胞(例如成肌细胞、骨骼肌、平滑肌、支气管)，肝细胞，成视网膜细胞和基质细胞。WO97/37000和WO97/37001描述了能够在悬浮液和无血清培养基中生长并且可用于生产病毒抗原的动物细胞和细胞系的生产。在某些实施方案中，非人类细胞在无血清培养基中培养。
多肽抗原可使用本领域已知的标准蛋白质纯化方法从天然来源分离，所述方法包括但不限于液相色谱法(例如，高效液相色谱法、快速蛋白质液相色谱法等)，尺寸排阻色谱法，凝胶电泳(包括一维凝胶电泳、二维凝胶电泳)，亲和色谱法或其它纯化技术。在许多实施方案中，抗原是纯化的抗原，例如，约50％至约75％的纯度，约75％至约85％的纯度，约85％至约90％的纯度，约90％至约95％的纯度，约95％至约98％的纯度，约98％至约99％的纯度，或大于99％的纯度。纯化抗原的纯度可通过尺寸排阻色谱法确定，并且纯度％对应于主峰占曲线下总面积的百分比。在尺寸排阻色谱法中纯化抗原的主峰可占尺寸排阻色谱法中曲线下总面积的85％以上，或尺寸排阻色谱法中曲线下总面积的90％以上，或尺寸排阻色谱法中曲线下总面积的95％以上或98％以上或99％以上。这样的结果被认为是本发明含义内的“纯化的”抗原。
根据上述有关纯度的公开内容，术语“纯化的寨卡病毒”是指在尺寸排阻色谱法中纯化的寨卡病毒的主峰占尺寸排阻色谱法中曲线下总面积的85％以上，或尺寸排阻色谱法中曲线下总面积的90％以上，或尺寸排阻色谱法中曲线下总面积的95％以上、98％以上或99％以上。
根据上文关于纯度的公开内容，术语“纯化的灭活的全寨卡病毒”是指在尺寸排阻色谱法中纯化的灭活的全寨卡病毒的主峰占尺寸排阻色谱法中曲线下总面积的85％以上，或尺寸排阻色谱法中曲线下总面积的90％以上，或尺寸排阻色谱法中曲线下总面积的95％以上、98％以上或99％以上。
可采用固相肽合成技术，其中这类技术是本领域技术人员已知的。参见Jones,TheChemical Synthesis of Peptides(Clarendon Press,Oxford)(1994)。通常，在这样的方法中，通过将活化的单体单元依序加入到固相结合的生长的肽链中来生产肽。
可使用公认的重组DNA技术来生产多肽，其中，例如，将包含编码多肽的核苷酸序列的表达构建体引入到适当的宿主细胞(例如，在体外细胞培养中作为单细胞实体生长的真核宿主细胞，例如酵母细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等)或原核细胞(例如，在体外细胞培养中生长)，产生遗传修饰的宿主细胞；在适当的培养条件下，蛋白质是由遗传修饰的宿主细胞产生的。
除了杀死和减毒的病毒免疫原性组合物之外，还可使用亚单位免疫原性组合物或其它类型的免疫原性组合物，其向动物提供寨卡病毒的抗原组分。抗原组分可以是蛋白质、糖蛋白、脂质结合蛋白或糖蛋白，修饰的脂质部分或其它病毒组分，当注射到人体内时，所述抗原组分刺激人体内的免疫应答，使得人类产生针对寨卡病毒的保护性免疫力。对于亚单位免疫原性组合物，如上所述，病毒可在哺乳动物细胞上培养。可将细胞培养物匀浆化，并且可利用使细胞培养物匀浆通过适当的柱或通过适当孔径的过滤器或经由细胞培养物匀浆的离心来分离免疫原性组合物。
如果抗原组分是蛋白质，则可分离编码该蛋白质的核酸并产生含有该分离核酸的免疫原性组合物。可将编码抗原组分的核酸置于真核启动子信号序列下游的质粒上。该质粒可含有一种或多种选择标志物，并被转染到减毒的原核生物如沙门氏菌属(Salmonellaspp.)、志贺氏菌属(Shigella spp.)或其它合适的细菌中。然后可将细菌施用于人类，使得人类可产生针对抗原组分的保护性免疫应答。或者，可将编码抗原组分的核酸置于原核启动子的下游，具有一个或多个选择标志物，并被转染到减毒的原核生物如沙门氏菌属、志贺氏菌属或其它合适的细菌中。然后可将细菌施用于需要针对所关注抗原的免疫应答的真核生物受试者。参见例如美国专利第6,500,419号。
对于亚单位免疫原性组合物，可将编码寨卡病毒的蛋白质抗原组分的核酸克隆到质粒中，例如国际专利申请公开号WO 00/32047(Galen)和国际专利申请公开号WO 02/083890(Galen)中所述的那些。然后可将质粒转染到细菌中，并且细菌可产生所需的抗原蛋白。可通过两个专利申请中描述的多种方法分离和纯化所需的抗原蛋白。
病毒灭活
本公开的某些方面涉及含有来自寨卡病毒的一种或多种抗原的寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物。本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可包括纯化病毒、全病毒、重组病毒、活的减毒全病毒，或者优选灭活全病毒、或来自灭活病毒的亚单位、多肽和/或抗原。因此，本公开的某些实施方案涉及寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自至少一个灭活的寨卡病毒的一种或多种抗原。
灭活或杀死病毒以破坏其感染哺乳动物细胞的能力但不破坏病毒结构的方法是本领域已知的。这些方法包括化学和物理手段。灭活病毒的合适手段包括但不限于用有效量的一种或多种试剂进行处理，所述试剂选自去污剂，福尔马林(本文也称为“甲醛”)，β-丙内酯(BPL)，二元乙胺(BEI)，乙酰基乙烯亚胺，加热，电磁辐射，x射线辐射，γ辐射，紫外线辐射(UV辐射)，UV-A辐射，UV-B辐射，UV-C辐射，亚甲基蓝，补骨脂素，羧基富勒烯(C60)及其中任何一个的任意组合。
在本公开的某些实施方案中，至少一个病毒是化学灭活的。用于化学灭活的试剂和化学灭活的方法在本领域中是众所周知的并且在本文中进行描述。在一些实施方案中，至少一个病毒被BPL、福尔马林或BEI中的一种或多种化学灭活。在其中至少一个病毒被BPL化学灭活的某些实施方案中，所述病毒可含有一个或多个修饰。在一些实施方案中，一个或多个修饰可包括修饰的核酸。在一些实施方案中，修饰的核酸是烷基化的核酸。在其它实施方案中，一个或多个修饰可包括修饰的多肽。在一些实施方案中，修饰的多肽含有修饰的氨基酸残基，包括修饰的半胱氨酸、甲硫氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、酪氨酸、赖氨酸、丝氨酸和苏氨酸中的一种或多种。
在用福尔马林化学灭活至少一个病毒的某些实施方案中，灭活的病毒可含有一个或多个修饰。在一些实施方案中，一个或多个修饰可包括修饰的多肽。在一些实施方案中，一个或多个修饰可包括交联的多肽。在用福尔马林化学灭活至少一个病毒的一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物还包括福尔马林。在至少一个病毒被BEI化学灭活的某些实施方案中，所述病毒可含有一个或多个修饰。在一些实施方案中，一个或多个修饰可包括修饰的核酸。在一些实施方案中，修饰的核酸是烷基化的核酸。
在用福尔马林化学灭活至少一个病毒的一些实施方案中，可用焦亚硫酸钠中和任何残留的未反应的福尔马林，可将其透析，和/或可进行缓冲液交换以除去残留的未反应的福尔马林。在一些实施方案中，过量加入焦亚硫酸钠。在一些实施方案中，可使用混合器，例如在线静态混合器，将溶液混合，随后过滤或进一步纯化(例如，使用错流过滤系统)。
本公开的某些实施方案涉及一种用于灭活寨卡病毒制剂的方法。在一些实施方案中，所述方法涉及(a)从一个或多个用于生产病毒制剂的非人类细胞中分离并接着纯化寨卡病毒制剂；以及(b)用有效量的福尔马林处理所述病毒制剂。在某些实施方案中，用有效量的福尔马林处理包括但不限于用范围为约0.001％v/v至约3.0％v/v的量的福尔马林处理。例如，用有效量的福尔马林处理可包括以范围为约0.001％至约3.0％v/v、约0.005％至约2.0％v/v、或约0.01％至约1.0％v/v的量，或约0.001％、约0.0025％、约0.005％、约0.0075％、约0.01％、约0.02％、约0.03％、约0.04％、约0.05％、约0.06％、约0.07％、约0.08％、约0.09％、约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1.0％、约1.25％、约1.5％、约1.75％、约2.0％、约2.25％、约2.5％、约2.75％或约3.0％v/v的量的福尔马林处理。
在所述方法的某些实施方案中，在约2℃至约42℃的范围的温度下用福尔马林处理寨卡病毒制剂。例如，可在约2℃至约42℃、约2℃至约8℃、约15℃至约37℃、约17℃至约27℃、约20℃至约25℃范围的温度下，或在约2℃、约4℃、约8℃、约10℃、约15℃、约17℃、约18℃、约19℃、约20℃、约21℃、约22℃、约23℃、约24℃、约25℃、约26℃、约27℃、约28℃、约29℃、约30℃、约37℃或约42℃的温度下用福尔马林处理寨卡病毒制剂。在一些实施方案中，在室温下用福尔马林处理寨卡病毒制剂。
在一些实施方案中，寨卡病毒制剂用福尔马林处理至少约1天。例如，寨卡病毒制剂可用福尔马林处理至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天，以及例如不超过15天，例如5至15天。例如，寨卡病毒制剂可用福尔马林处理至少约7天、至少约8天、至少约9天、至少约10天、至少约11天、至少约12天、至少约13天、至少约14天、至少约15天、至少约16天、至少约17天、至少约18天、至少约19天、至少约20天、至少约21天、至少约22天、至少约23天、至少约24天、至少约25天、至少约26天、至少约27天、至少约28天、至少约29天、至少约30天或更多天。在一些实施方案中，寨卡病毒制剂用福尔马林处理至少约9天。在一些实施方案中，寨卡病毒制剂用福尔马林处理至少约11天。在一些实施方案中，寨卡病毒制剂用福尔马林处理至少约14天。在一些实施方案中，寨卡病毒制剂用福尔马林处理至少约20天。在一些实施方案中，寨卡病毒制剂用福尔马林处理至少约30天。
在一些实施方案中，所述方法还包括用有效量的焦亚硫酸钠中和未反应的福尔马林。在一些实施方案中，焦亚硫酸钠的有效量范围为约0.01mM至约100mM。例如，可以约0.01mM至约100mM、约0.1mM至约50mM、约0.5mM至约20mM、或约1mM至约10mM的有效浓度，或以约0.01mM、约0.05mM、约0.1mM、约0.25mM、约0.5mM、约0.75mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约20mM、约30mM、约40mM、约50mM、约75mM或约100mM的浓度加入焦亚硫酸钠。在一些实施方案中，用约2mM焦亚硫酸钠中和福尔马林。
在一些实施方案中，所述方法包括(a)从一个或多个用于生产病毒制剂的非人类细胞中分离并接着纯化寨卡病毒制剂；(b)用有效量的福尔马林处理病毒制剂；(c)用有效量的焦亚硫酸钠中和病毒制剂；以及(d)纯化中和的病毒制剂。可采用本领域已知的任何纯化病毒制剂的方法，包括但不限于使用错流过滤(CFF)、多峰色谱法、尺寸排阻色谱法、阳离子交换色谱法和/或阴离子交换色谱法。在一些实施方案中，中和的病毒制剂通过错流过滤(CFF)进行纯化。在一些实施方案中，将病毒制剂纯化至约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高的量的高程度。
因此，本公开的某些实施方案涉及含有纯化的灭活的全寨卡病毒的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物。如本文所用，术语“灭活的全寨卡病毒”旨在包括已经用灭活方法如用有效量的福尔马林处理的寨卡病毒。认为这样的处理不会破坏病毒的结构，即不破坏病毒的二级、三级或四级结构和免疫原性表位，但是灭活的寨卡病毒不再能够感染可被尚未灭活的寨卡病毒感染的宿主细胞。在一个实施方案中，灭活的寨卡病毒不再能够感染VERO细胞并且对VERO细胞发挥细胞病变作用。
确定虫媒病毒制剂灭活的完全性的方法包括以下步骤：
(i)用经过灭活步骤的虫媒病毒制品接种昆虫细胞，并将昆虫细胞温育第一时段，从而产生昆虫细胞上清液；
(ii)用(i)中产生的昆虫细胞上清液接种哺乳动物细胞，并将哺乳动物细胞温育第二时段；以及
(iii)确定病毒制剂是否含有对哺乳动物细胞产生细胞病变作用的残留复制病毒。
如果无法通过蚀斑检测到残留的复制病毒，则认为灭活完全。
对于本公开内容，术语“灭活的全寨卡病毒”因此是指可通过如下方法获得的寨卡病毒，其中在约15℃至约37℃范围的温度下用约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量的福尔马林处理寨卡病毒5至15天，特别是在22℃下用0.02％v/v甲醛处理10天，或特别是在22℃下用0.01％v/v甲醛处理10天。该定义意在涵盖从如下方法获得的寨卡病毒，其中在约15℃至约37℃范围的温度下用约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量的福尔马林处理寨卡病毒5至15天，特别是在22℃下用0.02％v/v甲醛处理10天，或特别是在22℃下用0.01％v/v甲醛处理10天，但不应理解为限于这些，因为其它方法可能导致相同的灭活的全寨卡病毒。然而，在某些这样的实施方案中，寨卡病毒是从如下方法获得的，其中在约15℃至约37℃范围的温度下用约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量的福尔马林处理寨卡病毒5至15天，特别是在22℃下用0.02％v/v甲醛处理10天，或特别是在22℃下用0.01％v/v甲醛处理10天。
或者，在本公开内，“灭活的全寨卡病毒”因此是指已经通过包括步骤(i)至(iii)的方法测试的寨卡病毒，并且在步骤(iii)中未显示出任何蚀斑形成：
(i)用经过灭活步骤的虫媒病毒制剂接种昆虫细胞，并将昆虫细胞温育第一时段，从而产生昆虫细胞上清液；
(ii)用(i)中产生的昆虫细胞上清液接种哺乳动物细胞，并将哺乳动物细胞温育第二时段；以及
(iii)确定病毒制剂是否含有对哺乳动物细胞产生细胞病变作用的残留复制病毒。
因此，术语“纯化的灭活的全寨卡病毒”是指从如下方法可获得或获得的寨卡病毒，其中在约15℃至约37℃范围的温度下用约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量的福尔马林处理寨卡病毒5至15天，特别是在22℃下用0.02％v/v甲醛处理10天，或特别是在22℃下用0.01％v/v甲醛处理10天，或者通过上述用于确定灭活完全性的方法，并且如果需要，已经进行了纯化过程。因此，与未纯化的寨卡病毒相比，纯化的寨卡病毒具有较低含量的宿主细胞蛋白如Vero细胞蛋白和宿主细胞DNA如Vero细胞DNA。因此，术语“纯化的灭活的全寨卡病毒”是指从如下方法可获得或获得的寨卡病毒，其中在约15℃至约37℃范围的温度下用约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量的福尔马林处理寨卡病毒5至15天，特别是在22℃下用0.02％v/v甲醛处理10天，或特别是在22℃下用0.01％v/v甲醛处理10天，或者通过上述用于确定灭活完全性的方法，并且提供在尺寸排阻色谱法中占曲线下总面积的至少85％的主峰。
在某些这样的实施方案中，纯化的灭活的全寨卡病毒此外是通过蚀斑纯化获得或可获得的克隆分离株。
在某些这样的实施方案中，纯化的灭活的全寨卡病毒(其此外任选地是通过蚀斑纯化获得或可获得的克隆分离株)在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处含有突变，并且在包膜蛋白E内不含任何突变。在某些这样的实施方案中，所述突变是在SEQ ID NO:1的第98位或与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处的Trp98Gly突变。在某些这样的实施方案中，寨卡病毒是源自毒株PRVABC59。在某些这样的实施方案中，寨卡病毒是源自毒株PRVABC59，其包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列。
含有来自至少一个灭活的寨卡病毒的一种或多种抗原的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可用于在有需要的受试者中治疗或预防寨卡病毒感染和/或在有需要的受试者中诱导针对寨卡病毒的免疫应答，例如保护性免疫应答。
佐剂
本公开的其它方面涉及寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自本文所述的至少一种寨卡病毒的一种或多种抗原与一种或多种佐剂的组合。本公开的此类含佐剂的疫苗和/或免疫原性组合物可用于在有需要的受试者中治疗或预防寨卡病毒感染和/或在有需要的受试者中诱导针对寨卡病毒的免疫应答，例如保护性免疫应答。
实现疫苗佐剂效应的各种方法是已知的，并且可与本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物结合使用。一般原理和方法详述于"The Theory and PracticalApplication of Adjuvants",1995,Duncan E.S.Stewart-Tull(编辑),John Wiley&SonsLtd,ISBN 0-471-95170-6；以及"Vaccines:New Generation Immunological Adjuvants",1995,Gregoriadis G等人,(编辑),Plenum Press,New York,ISBN0-306-45283-9。
在一些实施方案中，寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物包括抗原和佐剂。抗原可与至少一种佐剂混合，基于重量的比率为约10:1至约1010:1抗原:佐剂，例如，约10:1至约100:1、约100:1至约103:1、约103:1至约104:1、约104:1至约105:1、约105:1至约106:1、约106:1至约107:1、约107:1至约108:1、约108:1至约109:1、或约109:1至约1010:1抗原:佐剂。本领域技术人员可通过有关佐剂和常规实验的信息容易地确定适当的比率，以确定最佳比率。
示例性佐剂可包括但不限于铝盐，磷酸钙，toll样受体(TLR)激动剂，单磷酰脂质A(MLA)，MLA衍生物，合成脂质A，脂质A模拟物或类似物，细胞因子，皂苷，胞壁酰二肽(MDP)衍生物，CpG寡核苷酸，革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)，聚磷腈，乳剂(油乳剂)，壳聚糖，维生素D，硬脂基或十八烷基酪氨酸，病毒体，蜗形体，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒，泊洛沙姆颗粒，微粒，脂质体，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。在一些实施方案中，佐剂是铝盐。
在一些实施方案中，佐剂包括明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和Alhydrogel 85中的至少一种。在一些实施方案中，已发现本公开的铝盐佐剂可增加本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的抗原的吸附。因此，在一些实施方案中，至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的抗原被吸附至铝盐佐剂。
在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包括约100μg至约600μg、约100μg至约500μg、约125μg至约500μg、约150μg至约500μg、约175μg至约500μg、约100μg至约450μg、约125μg至约450μg、约150μg至约450μg、约175μg至约450μg、约100μg至约400μg、约125μg至约400μg、约150μg至约400μg、约175μg至约400μg、约100μg至约350μg、约125μg至约350μg、约150μg至约350μg、约175μg至约350μg、约100μg至约300μg、约125μg至约300μg、约150μg至约300μg、约175μg至约300μg、约100μg至约250μg、约125μg至约250μg、约150μg至约250μg、约175μg至约250μg、约100μg至约225μg、约125μg至约225μg、约150μg至约225μg、约175μg至约225μg、或约200μg的铝盐佐剂(例如明矾)。在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包括约100μg至约600μg、约100μg至约300μg或约150μg至约250μg或约200μg的铝盐佐剂(例如明矾，如氢氧化铝)。
在一些实施方案中，疫苗和/或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、5μg或10μg的纯化的灭活全寨卡病毒，例如如本文所述在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ IDNO:1的第98位相对应的位置处具有色氨酸至甘氨酸取代的突变的寨卡病毒；以及一种或多种佐剂，例如100μg至约600μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、5μg或10μg的纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自毒株PRVABC59；以及一种或多种佐剂，例如100μg至约600μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、5μg或10μg的纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59；以及一种或多种佐剂，例如100μg至约600μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、5μg或10μg的纯化的灭活全蚀斑纯化的寨卡病毒分离株，所述寨卡病毒分离株在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59；以及一种或多种佐剂，例如100μg至约600μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
本公开的某些实施方案包括制备含佐剂的寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物的方法，所述方法包括(a)将具有铝盐佐剂的疫苗或免疫原性组合物与包括来自本文所述的至少一种寨卡病毒的一种或多种抗原的疫苗或免疫原性组合物混合，以及(b)在合适的条件下将混合物温育约1小时至约24小时(例如，约16小时至约24小时)范围的时段，其中至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％的抗原被吸附到铝盐佐剂。在所述方法的某些实施方案中，至少一种寨卡病毒是包含非人类细胞适应突变(例如，蛋白NS1中的非人类细胞适应突变，如Trp98Gly突变)的寨卡病毒。
在所述方法的一些实施方案中，将混合物在约2℃至约8℃范围的温度下温育。在所述方法的一些实施方案中，使用本领域已知的任何合适的混合器在恒定混合下温育混合物。在所述方法的一些实施方案中，将混合物在约6.5至约8.5、约6.5至约8、约6.8至约7.8、约6.9至约7.6、约7至约7.5、约6.8至约8.5、约6.9至约8.5、或约7至约8.5数值范围的pH下温育。在某些优选的实施方案中，将混合物在中性pH下温育。在所述方法的一些实施方案中，铝盐佐剂选自明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和Alhydrogel 85。
单磷酰脂质A(MLA)是来自沙门氏菌的脂质A的无毒衍生物，是一种有效的TLR-4激动剂，已被开发为疫苗佐剂(Evans等人,(2003)Expert Rev.Vaccines 2(2):219-229)。在临床前鼠类研究中，鼻内MLA已显示可增强分泌性以及全身性体液反应(Baldridge等人,(2000)Vaccine 18(22):2416-2425；Yang等人,(2002)Infect.Immun.70(7):3557-3565)。在超过120,000例患者的临床研究中，它也被证明是安全有效的疫苗佐剂(Baldrick等人,(2002)Regul.Toxicol.Pharmacol.35(3):398-413；Baldrick等人,(2004)J.Appl.Toxicol.24(4):261-268)。MLA通过TLR-4受体刺激先天免疫的诱导，因此能够引发针对多种传染性病原体的非特异性免疫应答，所述传染性病原体包括革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌、病毒和寄生虫(Baldrick等人,(2004)J.Appl.Toxicol.24(4):261-268；Persing等人,(2002)Trends Microbiol.10(10增刊):S32-37)。鼻内制剂中包含MLA应提供对先天应答的快速诱导，从病毒攻毒中引发非特异性免疫应答，同时增强疫苗抗原组分产生的特异性应答。
因此，在一个实施方案中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含单磷酰基脂质A(MLA)、3去-O-酰化的单磷酰基脂质A(3D-MLA)或其衍生物作为适应性和先天性免疫的增强剂。化学上3D-MLA是具有4、5或6个酰化链的3去-O-酰化单磷酰基脂质A的混合物。欧洲专利0 689 454B1(SmithKline Beecham Biologicals SA)公开了3去-O-酰化的单磷酰基脂质A的优选形式。在另一个实施方案中，本公开提供了一种组合物，所述组合物包含合成脂质A，脂质A模拟物或类似物，例如BioMira的PET脂质A，或设计为起TLR-4激动剂作用的合成衍生物。
另外的示例性佐剂包括但不限于多肽佐剂，所述多肽佐剂可通过与多肽组分共表达或与多肽组分融合以产生嵌合多肽而容易地添加至本文所述的抗原。细菌鞭毛蛋白是鞭毛的主要蛋白质成分，它是一种佐剂，由于其通过先天性免疫系统被toll样受体TLR5识别，因此作为佐剂蛋白受到越来越多的关注。通过TLR5进行的鞭毛蛋白信号传导可通过诱导DC成熟和迁移以及巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肠上皮细胞的活化，导致促炎性介体的产生，从而对先天性和适应性免疫功能产生影响。
TLR5识别鞭毛蛋白单体内的保守结构，该结构是这种蛋白所特有的并且是鞭毛功能所必需的，从而阻止了其响应于免疫压力的突变。所述受体对100fM浓度敏感，但不识别完整的细丝。鞭毛分解成单体对于结合和刺激是必需的。
作为佐剂，鞭毛蛋白具有强大的活性，可诱导肠胃外或鼻内施用的异源抗原的保护性应答，并且也已报道了DNA疫苗的佐剂效应。当使用鞭毛蛋白时，观察到Th2偏倚，这适合于呼吸道病毒如流感，但没有观察到在小鼠或猴子中诱导IgE的证据。另外，在猴子中鼻内或全身施用后，没有局部或全身炎症反应的报道。使用鞭毛蛋白后引起的反应的Th2特性有些令人惊讶，因为鞭毛蛋白以MyD88依赖性方式通过TLR5进行信号传导，并且已显示通过TLR传递的所有其它MyD88依赖性信号均导致Th1偏倚。重要的是，预先存在的鞭毛蛋白抗体对佐剂功效没有明显的作用，使其作为多用途佐剂具有吸引力。
在许多近期的鼻内疫苗试验中，一个共同的主题是使用佐剂和/或递送系统来提高疫苗功效。在一项此类研究中，一种含有遗传解毒的大肠杆菌热不稳定肠毒素佐剂(LTR192G)的H3流感疫苗可导致针对H5攻毒的异亚型保护，但仅在鼻内传递后产生。保护作用是基于交叉中和抗体的诱导，并证明了开发新疫苗用于鼻内途径的重要意义。
细胞因子，集落刺激因子(例如GM-CSF、CSF等)；肿瘤坏死因子；白介素-2、-7、-12、干扰素和其它类似的生长因子也可用作佐剂，因为它们可容易地通过与多肽组分混合或融合而包含在寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物中。
在一些实施方案中，本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物可包括其它通过Toll样受体起作用的佐剂，例如包含5'-TCG-3'序列的核酸TLR9配体；咪唑并喹啉TLR7配体；取代的鸟嘌呤TLR7/8配体；其它TLR7配体，例如洛索比滨(Loxoribine)、7-脱氮脱氧鸟苷、7-硫杂-8-氧代脱氧鸟苷、咪喹莫特(R-837)和瑞西莫德(R-848)。
某些佐剂促进APC如树突状细胞对疫苗分子的吸收并激活这些分子。非限制性实例选自由以下组成的组：免疫靶向佐剂；免疫调节佐剂，例如毒素、细胞因子和分枝杆菌衍生物；油制剂；聚合物；胶束形成佐剂；皂苷；免疫刺激复合物基质(ISCOM基质)；颗粒；DDA；铝佐剂；DNA佐剂；MLA；和封装佐剂。
佐剂的其它实例包括如下试剂，例如铝盐如氢氧化物或磷酸盐(明矾)，通常以0.05％至0.1％的缓冲盐水溶液形式使用(参见例如Nicklas(1992)Res.Immunol.143:489-493)，与糖的合成聚合物(例如
Figure BDA0002475462310000591
)的混合物(以0.25％溶液使用)，通过在70℃至101℃范围的温度下分别进行30秒至2分钟时期的热处理使疫苗中的蛋白质聚集以及通过交联剂聚集也是可能的。也可使用以下方法聚集：通过白蛋白的胃蛋白酶处理的抗体(Fab片段)再激活，与细菌细胞如小球藻(C.parvum)或内毒素或革兰氏阴性细菌的脂多糖组分混合，在生理学上可接受的油媒介物如二缩甘露醇单油酸酯(Aracel A)中乳化或以用作嵌段替代物的20％全氟化碳(Fluosol-DA)溶液乳化。也可使用与油如角鲨烯和IFA的混合物。
DDA(二甲基双十八烷基溴化铵)是佐剂的有趣候选物，但弗氏完全和不完全佐剂以及皂皮树皂苷如QuilA和QS21也很有趣。其它可能性包括脂多糖的聚[二(羧酸基苯氧基)磷腈(PCPP)衍生物，例如单磷酰基脂质A(MLA)、胞壁酰二肽(MDP)和苏氨酰胞壁酰二肽(tMDP)。基于脂多糖的佐剂还可用于产生主要Th1型应答，包括例如单磷酰基脂质A如3-去-O-酰化的单磷酰基脂质A与铝盐的组合。
还已知脂质体制剂赋予佐剂效应，因此脂质体佐剂可与寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物结合使用。
免疫刺激复合物基质类型
Figure BDA0002475462310000592
基质)佐剂也可与寨卡病毒疫苗抗原和免疫原性组合物一起使用，尤其是因为已证实这种类型的佐剂能够通过APC上调MHC II类表达。ISCOM基质由(任选地分馏的)来自皂树(Quillaja saponaria)的皂苷(三萜类化合物)、胆固醇和磷脂组成。当与免疫原性蛋白如寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物抗原混合时，所得微粒制剂就是所谓的ISCOM颗粒，其中皂苷可占60-70％w/w，胆固醇和磷脂占10-15％w/w，以及蛋白质占10-15％w/w。与免疫刺激复合物的组成和使用有关的细节可例如见于上述涉及佐剂的教科书，但Morein B等人,(1995)Clin.Immunother.3:461-475以及Barr I G和Mitchell G F(1996)Immunol.and Cell Biol.74:8-25也提供了用于制备完整的免疫刺激复合物的有用说明。
可用于本文公开的寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物的佐剂组合的皂苷，无论是否为iscom形式，都包括源自南美洲皂皮树(Quillaja Saponaria Molina)的树皮的皂苷，被称为Quil A及其级分，描述于美国专利第5,057,540号和"Saponins as vaccineadjuvants",Kensil,C.R.(1996)Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 12(1-2):1-55；以及EP 0 362 279B1。Quil A的示例性级分是QS21、QS7和QS17。
β-七叶皂苷(escin)是另一种溶血性皂苷，用于寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的佐剂组合物中。七叶皂苷在默克索引(第12版：条目3737)中被描述为七叶树(拉丁文：Aesculus hippocastanum)的种子中存在的皂苷混合物。通过色谱法和纯化(Fiedler,Arzneimittel-Forsch.4,213(1953))以及通过离子交换树脂(Erbring等人,美国专利第3,238,190号)描述了其分离。七叶皂苷的级分已被纯化并显示出生物活性(Yoshikawa M等人,(Chem Pharm Bull(Tokyo)1996年8月；44(8):1454-1464))。β-七叶皂苷也被称为七叶皂素(aescin)。
用于寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物中的另一种溶血性皂苷是地高辛(Digitonin)。地高辛在默克索引(第12版，条目3204)中被描述为一种皂苷，其源自洋地黄(Digitalis purpurea)的种子并根据以下中所述的程序纯化：Gisvold等人,(1934)J.Am.Pharm.Assoc.23:664；以及Ruhenstroth-Bauer(1955)Physiol.Chem.,301,621。其用途被描述为用于胆固醇测定的临床试剂。
实现佐剂效应的另一个有趣的可能性是采用Gosselin等人,1992中描述的技术。简言之，相关抗原如本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物中的抗原的呈递可通过将抗原与针对单核细胞/巨噬细胞上的FC受体的抗体(或抗原结合抗体片段)结合而增强。尤其是，已证实抗原与抗-FCRI之间的结合物可提高用于疫苗接种目的的免疫原性。所述抗体可在产生或作为所述产生的一部分之后与寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物抗原结合，包括通过作为与寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物抗原的任何一种多肽组分的融合物表达。其它可能性包括使用靶向和免疫调节物质(例如细胞因子)。另外，也可使用细胞因子的合成诱导物，例如poly I:C。
合适的分枝杆菌衍生物可选自由以下组成的组：胞壁酰二肽，完全弗氏佐剂，RIBI(Ribi ImmunoChem Research Inc.,Hamilton,Mont.)和海藻糖二酯如TDM和TDE。
合适的免疫靶向佐剂的实例包括CD40配体和CD40抗体或其特异性结合片段(参见上述讨论)、甘露糖、Fab片段和CTLA-4。
合适的聚合物佐剂的实例包括碳水化合物如葡聚糖、PEG、淀粉、甘露聚糖和甘露糖；塑料聚合物；和乳胶如乳胶珠。
调节免疫应答的另一种有趣的方式是将免疫原(任选地与佐剂和药学上可接受的载体和媒介物一起)包含在“虚拟淋巴结”(VLN)(由ImmunoTherapy,Inc.(360LexingtonAvenue,New York,N.Y.10017-6501)开发的专有医疗装置)。VLN(细管状装置)模拟淋巴结的结构和功能。VLN插入皮肤下会产生无菌炎症位点，并伴有细胞因子和趋化因子激增。T细胞和B细胞以及APC对危险信号(发炎部位的所在地)迅速做出响应并积聚在VLN的多孔基质内部。已经表明，当使用VLN时，针对抗原产生免疫应答所需的必要抗原剂量降低，并且通过使用VLN进行疫苗接种所赋予的免疫保护作用超过了使用Ribi作为佐剂的常规免疫。该技术简述于Gelber C等人,1998,"Elicitation of Robust Cellular and Humoral ImmuneResponses to Small Amounts of Immunogens Using a Novel Medical DeviceDesignated the Virtual Lymph Node",在"From the Laboratory to the Clinic,Bookof Abstracts,1998年10月12-15日,Seascape Resort,Aptos,Calif."中。
寡核苷酸可作为佐剂与寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物抗原结合使用，并且可含有被至少三个或更多个或甚至至少六个或更多个核苷酸隔开的两个或更多个二核苷酸CpG基序。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)诱导主要Th1反应。这样的寡核苷酸是众所周知的，并且描述于例如WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利第6,008,200号和第5,856,462号中。
这样的寡核苷酸佐剂可以是脱氧核苷酸。在某些实施方案中，寡核苷酸中的核苷酸骨架是二硫代磷酸酯或硫代磷酸酯键，但也可使用磷酸二酯和其它核苷酸骨架如PNA，包括具有混合骨架连接的寡核苷酸。生产硫代磷酸酯寡核苷酸或二硫代磷酸酯的方法描述于美国专利第5,666,153号、美国专利第5,278,302号和WO 95/26204中。
示例性的寡核苷酸具有以下序列。所述序列可含有硫代磷酸酯修饰的核苷酸骨架：
(SEQ ID NO:3)OLIGO 1:TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT(CpG 1826)；
(SEQ ID NO:4)OLIGO 2:TCT CCC AGC GTG CGC CAT(CpG 1758)；
(SEQ ID NO:5)OLIGO 3:ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG；
(SEQ ID NO:6)OLIGO 4:TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT(CpG 2006)；和
(SEQ ID NO:7)OLIGO 5:TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT(CpG 1668)
替代的CpG寡核苷酸包括上述序列，其具有不连贯的缺失或添加。可通过本领域已知的任何方法(例如，EP 468520)合成作为佐剂的CpG寡核苷酸。例如，可利用自动化合成仪合成此类寡核苷酸。这样的寡核苷酸佐剂的长度可在10-50个碱基之间。另一种佐剂体系涉及含CpG的寡核苷酸和皂苷衍生物的组合，特别是WO 00/09159中公开了CpG和QS21的组合。
已经描述了许多单相或多相乳剂体系。本领域技术人员可容易地使这些乳剂体系适用于寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物抗原，使得乳剂不会破坏抗原的结构。已经提出水包油乳剂佐剂本身可用作佐剂组合物(EP 399 843B)，也已经描述了水包油乳剂和其它活性剂的组合作为疫苗佐剂(WO 95/17210；WO 98/56414；WO 99/12565；WO 99/11241)。已经描述了其它油乳剂佐剂，例如油包水乳剂(美国专利第5,422,109号；EP 0 480 982B2)和水包油包水乳剂(美国专利第5,424,067号；EP 0 480 981B)。
用于本文所述的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的油乳剂佐剂可以是天然的或合成的，并且可以是无机的或有机的。矿物油和有机油的实例对于本领域技术人员将是显而易见的。
为了使任何水包油组合物适合于人类施用，乳剂体系的油相可包含可代谢油。术语可代谢油的含义是本领域众所周知的。可代谢的可定义为“能够被代谢转化”(Dorland'sIllustrated Medical Dictionary,W.B.Sanders Company,第25版(1974))。油可以是任何植物油、鱼油、动物油或合成油，其对接受者无毒并且能够通过新陈代谢转化。坚果(例如花生油)、种子和谷物是植物油的常见来源。也可使用合成油，并且可包括可商购的油如
Figure BDA0002475462310000631
等。角鲨烯(2,6,10,15,19,23-六甲基-2,6,10,14,18,22-二十四碳六烯)是一种不饱和油，其在鲨鱼肝油中大量存在，在橄榄油、小麦胚芽油、米糠油和酵母中以较低量存在，并且可与寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物一起使用。角鲨烯是可代谢的油，因为它是胆固醇生物合成中的中间体(默克索引，第10版，条目号8619)。
示例性的油乳剂是水包油乳剂，特别是水包角鲨烯乳剂。
另外，用于寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的油乳剂佐剂可包括抗氧化剂，例如油α-生育酚(维生素E，EP 0 382 271 B1)。
WO 95/17210和WO 99/11241公开了基于角鲨烯、α-生育酚和TWEEN 80(TM)的乳剂佐剂，任选地与免疫刺激剂QS21和/或3D-MLA一起配制。WO 99/12565公开了通过向油相中添加固醇来对这些角鲨烯乳剂进行改进。另外，可将甘油三酸酯如甘油三辛酸酯(C27H50O6)加入油相中以稳定乳剂(WO 98/56414)。
在稳定的水包油乳剂中发现的油滴尺寸可小于1微米，可在基本上30-600nm、直径基本上约30-500nm或直径基本上150-500nm的范围内，并且特别是直径约150nm，如通过光子相关光谱法所测量。就此而言，以数量计80％的油滴可在这些范围内，以数量计90％以上或95％以上的油滴在限定的尺寸范围内。油乳剂中存在的组分的量通常在以下范围内：2％至10％的油，例如角鲨烯；以及可能存在的2％至10％的α-生育酚；以及0.3％至3％的表面活性剂，例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯。油:α生育酚的比率可等于或小于1，因为这提供了更稳定的乳剂。SPAN 85(TM)也可以约1％的水平存在。在一些情况下，可能有利的是，本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物将进一步含有稳定剂。
生产水包油乳剂的方法是本领域技术人员众所周知的。通常，所述方法包括以下步骤：将油相与表面活性剂如
Figure BDA0002475462310000641
溶液混合，接着使用匀浆器匀浆化，本领域技术人员将清楚的是，包括使混合物通过注射器针头两次的方法将适合于匀浆化少量液体。同样地，本领域技术人员可采用微流化器(M110S微流控机器，最多50次，在最大压力输入为6巴(输出压力为约850巴)下持续2分钟的时期)的乳化过程来生产较小或较大体积的乳剂。这种适应性可通过常规实验来实现，所述常规实验包括测量所得乳剂，直到用所需直径的油滴来完成制备。
或者，寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物可与由以下组成的疫苗媒介物组合：壳聚糖(如上所述)或其它聚阳离子聚合物，聚丙交酯和聚丙交酯-共-乙交酯颗粒，基于聚N-乙酰葡糖胺的聚合物基质，由多糖或化学改性的多糖组成的颗粒，脂质体和脂质基颗粒，由甘油单酯组成的颗粒等。皂苷也可在胆固醇存在下配制以形成微粒结构，例如脂质体或ISCOM。此外，皂苷可与聚氧乙烯醚或酯一起配制成非微粒溶液或悬浮液，或微粒结构如薄层(paucilamelar)脂质体或ISCOM。
用于本文所述的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物中的另外的说明性佐剂包括SAF(Chiron,Calif.,United States)，MF-59(Chiron，参见例如Granoff等人,(1997)Infect Immun.65(5):1710-1715)，SBAS系列佐剂(例如SB-AS2(含有MLA和QS21的水包油乳剂)；SBAS-4(含有明矾和MLA的佐剂体系，可从SmithKline Beecham,Rixensart,Belgium获得)，Detox
Figure BDA0002475462310000651
(GlaxoSmithKline)，RC-512、RC-522、RC-527、RC-529、RC-544和RC-560(GlaxoSmithKline)和其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸酯(AGP)，例如未决的美国专利申请序列号08/853,826和09/074,720中所述的那些。
佐剂的其它实例包括但不限于：Hunter的TiterMax佐剂(CytRx Corp.,Norcross,Ga.)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH,Gaiberg,Germany)；硝化纤维(Nilsson和Larsson(1992)Res.Immunol.143:553-557)；基于明矾(例如氢氧化铝、磷酸铝)乳剂的制剂，包括矿物油、非矿物油、油包水或水包油乳剂，例如Seppic ISA系列的Montamide佐剂(例如ISA-51、ISA-57、ISA-720、ISA-151等；Seppic,Paris,France)；和
Figure BDA0002475462310000661
(IDECPharmaceuticals)；OM-174(与脂质A有关的葡糖胺二糖)；利什曼原虫伸长因子；形成胶束的非离子嵌段共聚物，例如CRL 1005；和Syntex佐剂制剂。参见例如O'Hagan等人,(2001)Biomol Eng.18(3):69-85；以及"Vaccine Adjuvants:Preparation Methods andResearch Protocols"D.O'Hagan编辑(2000)Humana Press。
其它示例性佐剂包括通式(I)HO(CH2CH2O)n-A-R的佐剂分子，其中n为1-50，A为键或--C(O)--，R为C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
一个实施方案由疫苗制剂组成，所述疫苗制剂包含通式(I)的聚氧乙烯醚，其中n为1至50、4-24或9；R组分为C1-50、C4-C20烷基或C12烷基，并且A为键。聚氧乙烯醚的浓度应在0.1-20％、0.1-10％或0.1-1％的范围内。示例性的聚氧乙烯醚选自以下组：聚氧乙烯-9-月桂基醚，聚氧乙烯-9-硬脂基醚，聚氧乙烯-8-硬脂基醚，聚氧乙烯-4-月桂基醚，聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。聚氧乙烯醚如聚氧乙烯月桂基醚描述于默克索引(第12版：条目7717)。这些佐剂分子描述于WO 99/52549中。
如果需要，可将根据上述通式(I)的聚氧乙烯醚与另一种佐剂组合。例如，佐剂组合可包括如上所述的CpG。
用于本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的合适的药学上可接受的赋形剂的其它实例包括水、磷酸盐缓冲盐水、等渗缓冲溶液。
病毒纯化
本公开的其它方面涉及纯化寨卡病毒的方法。在一些实施方案中，所述方法包括用含有寨卡病毒群体的接种物接种多个细胞，并通过蚀斑纯化从一个或多个接种的细胞中获得寨卡病毒克隆分离株。在一些实施方案中，细胞是非人类细胞(例如昆虫细胞、哺乳动物细胞等)。在一些实施方案中，细胞是昆虫细胞(例如本文所述的任何蚊子细胞/细胞系)。在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞(例如本文所述的任何哺乳动物细胞/细胞系)。在一些实施方案中，哺乳动物细胞是猴细胞。
在一些实施方案中，寨卡病毒群体是异质的(例如，包含两个或更多个基因型)。在一些实施方案中，寨卡病毒群体包含寨卡病毒克隆分离株(例如，来自毒株PRVABC59)和/或一种或多种先前在细胞培养中传代的寨卡病毒。在一些实施方案中，蚀斑纯化(例如，如本文所述)允许从异质病毒群体中基本上和/或完全分离(遗传上同质的)克隆分离株。在一些实施方案中，猴细胞来自VERO细胞系(例如VERO 10-87细胞)。在一些实施方案中，接种物包含人类血清。在一些实施方案中，接种物包含一种或多种外来因子(例如一种或多种污染病毒)。在一些实施方案中，蚀斑纯化(例如，如本文所述)允许从一种或多种外来因子中基本上和/或完全纯化(遗传上同质的)克隆分离株。
在一些实施方案中，所述用于分离和/或纯化寨卡病毒克隆的方法包括一个或多个(例如一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个等)另外的寨卡病毒克隆分离株的蚀斑纯化。在一些实施方案中，所述用于分离和/或纯化寨卡病毒克隆分离株的方法包括将寨卡病毒克隆分离株在细胞培养物中(例如在昆虫细胞如蚊子细胞系中和/或在哺乳动物细胞如VERO细胞系中)传代一次或多次(例如，一次或多次、两次或更多次、三次或更多次、四次或更多次、五次或更多次等)。
本公开的其它方面涉及纯化寨卡病毒以制备疫苗或免疫原性组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法包括一个或多个(例如，一个或多个、两个或更多个、三个或更多个、四个或更多个、五个或更多个、或六个)步骤(以任何顺序，包括以下顺序)：对含有寨卡病毒的样品或制剂进行深度过滤；缓冲液交换和/或稀释含有寨卡病毒的样品(例如通过错流过滤(CFF))以产生保留液；将包含寨卡病毒的样品与离子交换膜(例如，阴离子交换膜、阳离子交换膜)结合以产生结合级分，其中所述结合级分包含寨卡病毒，并从离子交换膜上洗脱结合级分；用有效量的本文所述的任何化学灭活剂处理含有寨卡病毒的样品；用焦亚硫酸钠中和含有化学灭活的寨卡病毒的样品；和/或纯化包含化学灭活的寨卡病毒的中和样品(例如，通过错流过滤(CFF))。在一些实施方案中，所述方法包括以下步骤：(a)使含有寨卡病毒的样品通过第一深度过滤器以产生第一洗脱液，其中所述第一洗脱液含有寨卡病毒；(b)通过错流过滤(CFF)缓冲液交换和/或稀释第一洗脱液以产生第一保留液，其中所述第一保留液含有寨卡病毒；(c)将第一保留液结合到离子交换膜上以产生第一结合级分，其中所述第一结合级分含有寨卡病毒，并从离子交换膜上洗脱第一结合级分以产生第二洗脱液，其中所述第二洗脱液含有寨卡病毒；(d)使所述第二洗脱液通过第二深度过滤器以产生第二保留液，其中所述第二保留液含有寨卡病毒；(e)用有效量的化学灭活剂处理所述第二保留液；(f)用焦亚硫酸钠中和处理过的第二保留液；以及(g)通过错流过滤(CFF)纯化中和的第二保留液。
深度过滤器可以药筒或胶囊的形式应用，例如使用Bio 20
Figure BDA0002475462310000681
深度过滤片的SUPRACAPTM系列深度过滤器胶囊(Pall Corporation)。其它合适的深度过滤技术和设备是本领域已知的，并且包括Sartorius PP3过滤器。在一些实施方案中，深度过滤器的孔径在约0.2μm至约3μm之间。在一些实施方案中，深度过滤器的孔径小于大约任何以下孔径(以μm为单位)：3、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6和0.4。在一些实施方案中，深度过滤器的孔径大于大约任何以下孔径(以μm为单位)：0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6或2.8。也就是说，深度过滤器的孔径可以是任何以下孔径(以μm为单位)范围，该范围具有上限3、2.8、2.6、2.4、2.2、2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6和0.4以及独立选择的下限0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6或2.8；其中下限小于上限。
如本文所述，阳离子交换和阴离子交换色谱法可用于本公开的方法中以纯化从本公开的细胞收获的寨卡病毒。例如，可将澄清的病毒收获物碱化，加载到阴离子交换膜上，通过盐或pH洗脱，过滤并灭活。这仅是示例性方案，并且本领域技术人员可容易地设想其具有取代、删除、插入或重新排序的步骤的变化形式。
阴离子和阳离子交换色谱法都依赖于流动相中所关注的带电大分子(例如病毒)对具有相反电荷的基质的吸引。在阳离子交换色谱中，带负电的基质或膜会吸引带正电的大分子。在阴离子交换色谱中，带正电的基质或膜会吸引带负电的大分子。一旦将大分子结合或装载到基质上，就可根据大分子的特性以线性或逐步方式从基质上洗脱大分子，从而制定带不同电荷的分子的分离。该原理可用于从其它大分子中纯化病毒。洗脱可通过改变流动相缓冲液的pH或盐含量来实现。洗脱可以是梯度的或逐步的。如本文所述，可通过使用流动相的pH变化或通过使用流动相的离子强度变化(例如，通过添加盐)来实现洗脱。各种盐用于洗脱，包括但不限于氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸铵、乙酸钠、磷酸钾、氯化钙和氯化镁。在某些实施方案中，盐是NaCl。多种合适的缓冲液是本领域已知的并且在本文中描述。使用离子交换色谱的病毒纯化方法也是众所周知的。参见例如可在www.pall.com/pdfs/Biopharmaceuticals/MustangQXT_AcroPrep_USD2916.pdf在线获得的流感病毒的纯化。
本领域中已知的多种装置适用于阳离子交换色谱法(任选地包括过滤)，例如
Figure BDA0002475462310000691
系统(Pall Corporation)，该系统使用孔径为0.65μm的阳离子交换膜。各种官能团用于阳离子交换膜，包括但不限于在交联的聚合物涂层中的磺酸侧基官能团。可使用多种缓冲液将含有本公开的寨卡病毒的洗脱液结合至阳离子交换膜。示例性缓冲液包括但不限于柠檬酸盐和磷酸盐缓冲液(下文描述了其它缓冲液)。在一些实施方案中，用于阳离子交换色谱法(例如上样和/或洗脱)的缓冲液含有聚山梨酯(例如0.05％、0.1％、0.25％或0.5％的
Figure BDA0002475462310000701
)。
本领域已知的多种装置适用于阴离子交换色谱法(任选地包括过滤)，例如
Figure BDA0002475462310000702
Q系统(Pall Corporation)，该系统使用孔径为0.8μm的阴离子交换膜。另一种合适的阴离子交换膜是SartobindQ IEXNano。多种官能团用于阴离子交换膜，包括但不限于交联的聚合物涂层中的季胺侧基官能团。可使用多种缓冲液将含有本公开的寨卡病毒的洗脱液结合至阴离子交换膜。示例性的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液(下文描述了其它缓冲液)。在一些实施方案中，用于阴离子交换色谱法(例如上样和/或洗脱)的缓冲液含有聚山梨酯(例如0.05％、0.1％、0.25％或0.5％的
Figure BDA0002475462310000703
)。在一些实施方案中，病毒是通过分步洗脱来洗脱，例如使用250mM NaCl、500mM NaCl和750mM NaCl。
疫苗和/或免疫原性组合物的制剂和剂量
本公开的其它方面涉及含有来自本文所述的寨卡病毒的一种或多种抗原的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的制剂。
含有来自本文所述的寨卡病毒的一种或多种抗原的本公开的此类疫苗和/或免疫原性组合物可用于在有需要的受试者中治疗或预防寨卡病毒感染和/或在有需要的受试者中诱导针对寨卡病毒的免疫应答，例如保护性免疫应答。
通常，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物被制备成可注射的液体溶液或悬浮液形式；还可制备适合于在注射之前溶解或悬浮在液体中的固体形式。这样的制剂也可被乳化或制成干粉。活性免疫原性成分通常与药学上可接受并与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂是例如水、盐水、右旋糖、蔗糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。另外，如果需要，疫苗或免疫原性组合物可含有辅助物质，例如湿润或乳化剂、pH缓冲剂或佐剂，它们可增强疫苗或免疫原性组合物的有效性。
疫苗或免疫原性组合物可常规地通过注射进行肠胃外施用，例如皮下、经皮、真皮内、真皮下或肌内注射。在某些实施方案中，所述组合物经肌内或皮下施用。适合于其它施用模式的其它制剂包括栓剂，并且在某些情况下还包括口服、经口、鼻内、经颊、舌下、腹膜内、阴道内、肛门和颅内制剂。对于栓剂，传统的粘合剂和载体可包括例如聚亚烷基二醇或甘油三酸酯；这样的栓剂可由含有0.5％至10％或甚至1-2％的范围的活性成分的混合物形成。在某些实施方案中，首先将低熔点蜡如脂肪酸甘油酯或可可脂的混合物熔融，并且本文所述的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物例如通过搅拌均匀分散。然后将熔融的均匀混合物倒入适宜尺寸的模具中，使其冷却并固化。
适用于鼻内递送的制剂包括液体(例如，以气雾剂或滴鼻剂形式施用的水溶液)和干粉(例如用于在鼻道内快速沉积)。制剂包括通常使用的赋形剂，例如，药用级的甘露糖醇、乳糖、蔗糖、海藻糖、木糖醇和壳聚糖。粘膜粘附剂如壳聚糖可用于液体或粉末制剂中，以延迟鼻内施用制剂的粘膜纤毛清除。糖如甘露糖醇、山梨糖醇、海藻糖和/或蔗糖可用作液体制剂中的稳定剂，以及用作干粉制剂中的稳定剂、增量剂或粉末流动剂和上浆剂。另外，佐剂如单磷酰基脂质A(MLA)或其衍生物或CpG寡核苷酸可在液体和干粉制剂中用作免疫刺激佐剂。
适于口服递送的制剂包括液体、固体、半固体、凝胶、片剂、胶囊、锭剂等。适于口服递送的制剂包括片剂、锭剂、胶囊、凝胶、液体、食品、饮料、保健食品等。制剂包括通常使用的赋形剂，例如，药用级的甘露糖醇，山梨糖醇，海藻糖，多元醇如糖如蔗糖、乳糖、淀粉、硬脂酸镁，糖精钠，纤维素，碳酸镁等。其它寨卡病毒疫苗和免疫原性组合物可采用溶液、悬浮液、丸剂、缓释制剂或散剂的形式，并含有10-95％的活性成分或25-70％的活性成分。对于口服制剂，霍乱毒素是有趣的配制搭配物(以及可能的结合搭配物)。
当寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物配制成用于阴道施用时，其可以是子宫托、棉塞、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫或喷雾剂的形式。除寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物外，任何前述制剂都可含有本领域已知适当的试剂，例如载体。
在一些实施方案中，本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物可配制用于全身或局部递送。这样的制剂是本领域众所周知的。肠胃外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格氏溶液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(例如基于林格氏右旋糖的那些)等。全身和局部施用途径包括例如真皮内、局部施用、静脉内、肌内等。
本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可以与剂量制剂相容的方式施用，并且以治疗有效和免疫原性的量施用。抗原的剂量可特别地在约1μg至约100μg、约1μg至约40μg、约1μg至约30μg、约1μg至约20μg、约1μg至约15μg、或约2μg至约15μg、或约5μg至约15μg、或约10μg至约15μg的范围内。剂量可特别地为约2μg、约5μg、约10μg、约15μg或约20μg，特别是约10μg。抗原即纯化的灭活寨卡病毒的量可通过Bradford测定法(Bradford等人,(1976)Anal.Biochem.72:248-254)使用限定量的重组寨卡包膜蛋白以建立标准曲线来确定。因此，抗原的剂量也可称为寨卡包膜蛋白E(μg Env)的微克(μg)数。因此，在本公开的含义内，μg抗原和μg Env是相同含义。在一些实施方案中，疫苗和/或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、5μg或10μg的抗原，所述抗原的形式为纯化的灭活的全寨卡病毒，例如如本文所述在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有色氨酸至甘氨酸取代的突变的寨卡病毒。
在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、5μg或10μg的抗原，所述抗原的形式为纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自毒株PRVABC59。
在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg，5μg或10μg的抗原，所述抗原的形式为纯化的灭活的全寨卡病毒，该病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。
在一些实施方案中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、5μg或10μg的抗原，所述抗原的形式为纯化的灭活的蚀斑纯化的全寨卡病毒分离株，该病毒分离株在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59。
在某些这样的实施方案中，疫苗或免疫原性组合物包含
剂量为约10μg的纯化的灭活全病毒，
约200μg氢氧化铝，
缓冲剂；以及任选地
糖，如蔗糖。
适用于初始施用和加强注射的方案也是可变的，但通常是初始施用并接着后续接种或其它施用。
应用方式可广泛地变化。疫苗或免疫原性组合物的任何常规施用方法都是适用的。这些包括在生理学上可接受的固体基质上或生理学上可接受的分散液中口服应用，经胃肠外，通过注射等用于例如肌内或皮下施用。疫苗或免疫原性组合物的剂量将取决于施用途径，并且可根据要接种的人的年龄和抗原的制剂而变化。如本文所述，疫苗或免疫原性组合物的单位剂量体积可大于0.5mL，等于0.5mL或小于0.5mL。例如，其可以0.25mL的体积施用。0.5mL的体积适用于肌内或皮下施用。
改善粘膜粘附的递送剂也可用于改善递送和免疫原性，尤其是对于鼻内、口服或肺基递送制剂而言。一种这样的化合物壳聚糖(几丁质的N-去乙酰化形式)被用于许多药物制剂中。它是鼻内疫苗递送的有吸引力的粘膜粘附剂，因为它能够延迟粘膜纤毛清除并为粘膜抗原摄取和加工留出更多时间。另外，它可暂时打开紧密连接，这可增强抗原向NALT的跨上皮运输。在一项最新的人体试验中，鼻内施用具有壳聚糖但不具有任何额外佐剂的三价灭活流感疫苗产生的血清转换和HI滴度仅略低于肌内接种后获得的血清转换和HI滴度。
壳聚糖还可与在鼻内起作用的佐剂一起配制，例如遗传解毒的大肠杆菌热不稳定肠毒素突变体LTK63。这除壳聚糖所赋予的递送和粘附益处外还增加了免疫刺激作用，导致粘膜和全身反应增强。
最后，应该指出的是，壳聚糖制剂还可以干粉形式制备，与液体制剂相比，干粉形式已经显示出可改善疫苗稳定性并且导致粘膜纤毛清除的进一步延迟。这在最近的一项人类临床试验中得到了证实，该临床试验涉及用壳聚糖配制的鼻内干粉白喉类毒素疫苗，其中鼻内途径与传统肌内途径一样有效，并具有分泌性IgA反应的额外益处。疫苗的耐受性也很好。含壳聚糖和MLA或其衍生物的鼻内干粉炭疽疫苗在兔中诱导的反应比肌内接种更强，并且对气溶胶孢子攻毒也具有保护作用。
鼻内疫苗代表了一种示例性制剂，因为与更擅长影响下呼吸道的肠胃外施用疫苗相比，鼻内疫苗可影响上呼吸道和下呼吸道。这对于诱导对基于变应原的疫苗的耐受性和诱导对基于病原体的疫苗的免疫力可能是有益的。
除了在上呼吸道和下呼吸道提供保护外，鼻内疫苗还避免了针头接种的并发症，并提供了经由微粒和/或可溶性抗原与鼻咽相关淋巴组织(NALT)相互作用来诱导粘膜和全身性体液和细胞反应的手段。
本公开的疫苗和/或免疫原性组合物是药学上可接受的。它们可包括除抗原和佐剂之外的组分，例如它们通常将包括一种或多种药物载体和/或赋形剂。此类成分的详尽讨论可见于Gennaro(2000)Remington:The Science and Practice of Pharmacy.第20版,ISBN:0683306472。
为了控制张力，优选包括生理盐，例如钠盐。优选氯化钠(NaCl)，其可以1至20mg/ml存在。可能存在的其它盐包括氯化钾、磷酸二氢钾、脱水磷酸二钠、氯化镁、氯化钙等。
本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可包含一种或多种缓冲剂。典型的缓冲剂包括：磷酸盐缓冲剂；Tris缓冲剂；硼酸盐缓冲剂；琥珀酸盐缓冲剂；组氨酸缓冲剂(特别是氢氧化铝佐剂)；或柠檬酸盐缓冲剂。缓冲剂通常以5-20mM范围包含。
疫苗或免疫原性组合物的pH通常将在5.0至8.5或5.0至8.1之间，并且更通常在6.0至8.5之间，例如6.0至8.0之间，6.5至8.0之间，6.5至7.5之间，7.0至8.5之间，7.0至8.0之间，或7.0至7.8之间。因此，本公开的制造方法可包括在包装之前调节散装疫苗的pH的步骤。
疫苗或免疫原性组合物优选是无菌的。其优选地是无热原的，例如每剂含<1EU(内毒素单位，标准量度)，并且优选每剂<0.1EU。它优选不含麸质。
在某些实施方案中，本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可包含有效浓度的去污剂。在一些实施方案中，去污剂的有效量可包括但不限于约0.00005％v/v至约5％v/v或约0.0001％v/v至约1％v/v。在某些实施方案中，去污剂的有效量为约0.001％v/v、约0.002％v/v、约0.003％v/v、约0.004％v/v、约0.005％v/v、约0.006％v/v、约0.007％v/v、约0.008％v/v、约0.009％v/v或约0.01％v/v。不希望受理论束缚，去污剂有助于将本公开的疫苗和/或免疫原性组合物保持在溶液中，并有助于防止疫苗和/或免疫原性组合物聚集。
合适的去污剂包括例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇酯表面活性剂(称为‘Tween’)，辛苯聚醇(例如辛苯聚醇-9(Triton X 100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，十六烷基三甲基溴化铵(‘CTAB’)和脱氧胆酸钠，特别是对于裂解或表面抗原疫苗。去污剂只能以痕量存在。痕量的其它残留组分可能是抗生素(例如新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。在一些实施方案中，去污剂含有聚山梨酯。在一些实施方案中，去污剂的有效浓度包括约0.00005％v/v至约5％v/v的范围。
疫苗和/或免疫原性组合物优选储存在2℃至8℃之间。在理想情况下，它们应避免直射光。抗原和乳剂通常将是混合物形式，但它们最初可能以用于临时混合的独立组分的试剂盒的形式呈现。当施用于受试者时，疫苗和/或免疫原性组合物通常将为水性形式。
本公开的方法
本发明尤其还涉及在有需要的受试者中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染和/或预防寨卡病毒疾病的方法，所述方法包括向受试者或受试者群体施用治疗有效量的如本文所述的疫苗或免疫原性组合物。
该疾病通常是轻度的且持续时间短。一些临床表现包括但不限于轻度发热、斑丘疹、结膜炎和关节痛。尽管孕妇有轻度的临床症状，但在怀孕期间寨卡病毒感染与胎儿和新生儿的严重后果相关。该疾病的严重程度与怀孕期间感染寨卡病毒的妇女对胎儿和新生婴儿的后果有关。与寨卡病毒感染相关的一系列先天畸形，称为先天性寨卡综合征(CZS)，包括具有颅骨部分塌陷的严重小头畸形，具有皮质下钙化的大脑皮层，黄斑瘢痕和局灶性色素性视网膜色斑，先天性挛缩和具有锥体外系受累症状的明显早期肌张力增高。此外，寨卡病毒是一种神经营养性黄病毒，其可能引起中枢神经系统内的疾病。另外，寨卡病毒引起格林-巴利综合征(GBS)也引起了全世界的关注。
因此，寨卡病毒疾病的预防不仅涉及所治疗的受试者，而且在所治疗的受试者已经或将要怀孕的情况下延伸至胎儿和新生儿。因此，根据本发明的方法包括通过对受试者施用疫苗或免疫原性组合物来治疗受试者，以及通过对怀孕的受试者或打算怀孕的受试者或具有生育能力的妇女施用疫苗或免疫原性组合物来治疗胎儿和新生儿。特别地，受试者是人类。
本公开的其它方面涉及使用本文所述的疫苗和/或免疫原性组合物的方法，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自至少一种寨卡病毒(例如，克隆寨卡病毒分离株，包含非人类细胞适应突变如蛋白NS1中的非人类细胞适应突变的寨卡病毒)以在有需要的受试者中治疗或预防寨卡病毒和/或在有需要的受试者中诱导针对寨卡病毒的免疫应答。
在某些这样的方法中，疫苗和/或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、或5μg、或10μg的纯化的灭活的全寨卡病毒，例如如本文所述在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有色氨酸至甘氨酸取代的突变的寨卡病毒，任选地以及一种或多种佐剂，例如100μg至约300μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
在某些此类方法中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、或5μg或10μg的纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自毒株PRVABC59，任选地以及一种或多种佐剂，例如100μg至约600μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
在某些此类方法中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、或5μg或10μg的纯化的灭活的全寨卡病毒，所述病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQ IDNO:2的基因组序列的毒株PRVABC59，任选地以及一种或多种佐剂，例如100μg至约600μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
在某些此类方法中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、或5μg或10μg的纯化的灭活的蚀斑纯化的全寨卡病毒分离株，所述病毒分离株在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59，任选地以及一种或多种佐剂，例如100μg至约600μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
在一些实施方案中，本公开涉及一种在有需要的受试者中治疗或预防寨卡病毒感染的方法，所述方法通过向所述受试者施用治疗有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自至少一种寨卡病毒(例如，克隆寨卡病毒分离株，包含非人类细胞适应突变如蛋白NS1中的非人类细胞适应突变的寨卡病毒)的一种或多种抗原。在一些实施方案中，本公开涉及在有需要的受试者中诱导针对寨卡病毒的免疫应答的方法，所述方法通过向所述受试者施用治疗有效量的本公开的疫苗和/或免疫原性组合物，所述疫苗和/或免疫原性组合物含有来自至少一种寨卡病毒(例如，克隆寨卡病毒分离株，包含非人类细胞适应突变如蛋白NS1中的非人类细胞适应突变的寨卡病毒)的一种或多种抗原。在一些实施方案中，施用步骤在受试者中诱导针对寨卡病毒的保护性免疫应答。在一些实施方案中，受试者是人类。在一些实施方案中，受试者是怀孕的或打算怀孕的或有生育能力的妇女。
本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物可用于通过利用鼻内、经口、口服、经颊、舌下、肌内、腹膜内、真皮内、透皮、真皮下、阴道内、肛门、颅内、静脉内、经皮或皮下施用，特别是肌内施用来施用疫苗以保护或治疗易受病毒感染或患有病毒感染的受试者(例如哺乳动物如人类)。本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的全身施用方法可包括常规注射器和针头，或设计用于弹道递送固体疫苗的装置(WO 99/27961)，或无针压力液体喷射装置(美国专利第4,596,556号；美国专利第5,993,412号)；或透皮贴剂(WO 97/48440；WO98/28037)。本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物也可应用于皮肤(透皮或经皮递送WO 98/20734；WO 98/28037)。因此，本发明的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物可包括预先填充有寨卡病毒疫苗或免疫原性组合物的用于全身施用的递送装置。因此，提供了在受试者(例如哺乳动物如人类)中治疗或预防寨卡病毒感染和/或诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的疫苗或免疫原性组合物和任选地包括佐剂和/或载体的步骤，其中所述疫苗或免疫原性组合物是经由肠胃外或全身性途径施用的。
本公开的疫苗和/或免疫原性组合物可用于保护或治疗易受病毒感染或患有病毒感染的受试者(例如哺乳动物如人类)，其通过经由粘膜途径如口服/消化道或鼻途径施用疫苗或免疫原性组合物。替代的粘膜途径是阴道内和直肠内。粘膜施用途径可经由鼻途径，称为鼻内疫苗接种。鼻内疫苗接种方法在本领域中是众所周知的，包括将液滴、喷雾剂或干粉形式的疫苗施用于待免疫个体的鼻咽。雾化或气雾化疫苗制剂是本文公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物的潜在形式。肠溶制剂，例如用于口服施用的抗胃酸胶囊和颗粒剂、用于直肠或阴道施用的栓剂，也是本公开的疫苗和/或免疫原性组合物的制剂。
本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物也可经由口服途径施用。在这样的情况下，药学上可接受的赋形剂还可包括碱性缓冲剂、或肠溶胶囊或微粒。本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物也可通过阴道途径施用。在这样的情况下，药学上可接受的赋形剂还可包括乳化剂，聚合物如
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和其它已知的阴道乳膏和栓剂的稳定剂。寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物也可通过直肠途径施用。在这样的情况下，赋形剂还可包括蜡和本领域已知的用于形成直肠栓剂的聚合物。
在一些实施方案中，施用步骤包括一次或多次施用。施用可以是单剂方案或多剂(初免-加强)方案。在多剂方案中，多个剂可通过相同或不同的途径给与，例如肠胃外初免和粘膜加强，粘膜初免和肠胃外加强等。通常，它们将通过相同的途径给与，例如肌内或皮下施用。多个剂通常将间隔至少1周(例如约1周、约2周、约3周、约4周、约5周、约6周、约7周、约8周、约9周、约10周、约11周、约12周、约16周等，例如间隔1至16周)施用。间隔25-30天(例如28天、4周)提供两剂特别有用。在某些这样的实施方案中，施用模式是肌内或皮下施用。
本公开的方法包括施用治疗有效量或免疫原性量的本公开的寨卡病毒疫苗和/或免疫原性组合物。治疗有效量或免疫原性量可以是本公开的疫苗和/或免疫原性组合物将在其所施用的未感染、感染或未暴露的受试者中诱导保护性免疫应答的量。这样的应答通常将导致受试者中对疫苗的分泌性、细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。通常，这种应答包括但不限于以下作用中的一种或多种：从任何免疫学类别产生抗体，例如免疫球蛋白A、D、E、G或M；B和T淋巴细胞的增殖；向免疫细胞提供激活、生长和分化信号；辅助性T细胞、抑制性T细胞和/或细胞毒性T细胞的扩增。
在某些这样的方法中，疫苗和/或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、5μg或10μg的纯化的灭活的全寨卡病毒，例如如本文所述在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQID NO:1的第98位相对应的位置处具有色氨酸至甘氨酸取代的突变的寨卡病毒，任选地组合一种或多种佐剂，例如100μg至约600μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
在某些这样的方法中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、5μg或10μg的纯化的灭活的全寨卡病毒，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ IDNO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自毒株PRVABC59，任选地组合一种或多种佐剂，例如100μg至约600μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
在某些这样的方法中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、5μg或10μg的纯化的灭活的全寨卡病毒，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ IDNO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59，任选地组合一种或多种佐剂，例如100μg至约600μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
在某些这样的方法中，疫苗或免疫原性组合物含有剂量为1μg至15μg、或2μg、5μg或10μg的纯化的灭活的蚀斑纯化的全寨卡病毒分离株，所述寨卡病毒分离株在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处包含Trp98Gly突变，其中所述寨卡病毒是源自包含根据SEQ ID NO:2的基因组序列的毒株PRVABC59，任选地组合一种或多种佐剂，例如100μg至约600μg或约150μg至约250μg或约200μg明矾如氢氧化铝。
在某些这样的方法中，疫苗或免疫原性组合物的施用在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于10，或大于50，或大于100，或大于200，或大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于2000，或大于3000，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
在某些这样的方法中，疫苗或免疫原性组合物的施用在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于300或大于500，或大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于2000，或大于3000，或大于5000，或大于10,000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
在某些这样的方法中，在施用后14和/或28天达到上述中和抗体滴度。
在某些这样的方法中，在施用疫苗或免疫原性组合物后14和/或28天，在受试者中产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于250，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
在某些这样的方法中，在施用疫苗或免疫原性组合物后14和/或28天，在受试者中产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于1000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
在某些这样的方法中，在施用后14和/或28天达到这种滴度。这样的中和抗体产生在寨卡病毒血清阴性的至少20名受试者群体中提供了高的血清转换率。在某些这样的实施方案中，血清转换率是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。
在某些这样的方法中，在施用后14和/或28天达到这种滴度。这样的中和抗体产生在至少20名受试者的群体中，特别是寨卡病毒血清阴性群体中提供了高的血清阳性率。在某些这样的实施方案中，血清阳性率是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。
在某些这样的方法中，在施用后14和/或28天达到所述血清转换率和/或血清阳性率。
在某些这样的方法中，严重的不良事件同时被最小化或避免。在某些这样的方法中，避免了39℃以上的发热。
根据本发明的方法，疫苗或免疫原性组合物以单剂或多剂如例如以第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式进行施用。
在某些这样的方法中，在单剂或初免施用疫苗或免疫原性组合物后14和/或28天，受试者、特别是未感染黄病毒的受试者中寨卡病毒中和抗体滴度大于200，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
在某些这样的方法中，在单剂或初免施用疫苗或免疫原性组合物后14和/或28天，特别是在未感染黄病毒的至少20名受试者的群体中，几何平均寨卡病毒中和抗体滴度大于200，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
在某些这样的方法中，在单剂或初免施用疫苗或免疫原性组合物后14和/或28天，受试者、特别是未感染黄病毒的受试者中寨卡病毒中和抗体滴度大于1000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
在某些这样的方法中，在单剂或初免施用疫苗或免疫原性组合物后14和/或28天，特别是在未感染黄病毒的至少20名受试者的群体中，几何平均寨卡病毒中和抗体滴度大于1000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
在单剂或初免施用后，在未感染黄病毒的至少20名受试者的群体中，这样的中和抗体产生提供高的血清转换率。在某些这样的实施方案中，血清转换率是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。
在单剂或初免施用后，在至少20名受试者的群体中，特别是未感染黄病毒的群体中，这样的中和抗体产生提供高的血清阳性率。在某些这样的实施方案中，血清阳性率是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。
在某些方法中，施用包括初免和加强施用，其中初免和加强施用间隔约1至约16周进行。在某些这样的方法中，第二次(加强)施用在第一次(初免)施用后至少28天施用。
在某些这样的方法中，在疫苗或免疫原性组合物的加强施用后14和/或28天，在受试者、特别是未感染黄病毒的受试者中，寨卡病毒中和抗体滴度大于1000，或大于1500，或大于3000，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
在某些这样的方法中，在疫苗或免疫原性组合物的加强施用后14和/或28天，特别是在未感染黄病毒的至少20名受试者的群体中，几何平均寨卡病毒中和抗体滴度大于1000，或大于1500，或大于3000，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
在某些这样的方法中，在疫苗或免疫原性组合物的加强施用后14和/或28天，在受试者、特别是未感染黄病毒的受试者中，寨卡病毒中和抗体滴度大于3000，或大于5000，或大于10000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
在某些这样的方法中，在疫苗或免疫原性组合物的加强施用后14和/或28天，特别是在未感染黄病毒的至少20名受试者的群体中，几何平均寨卡病毒中和抗体滴度大于3000，或大于5000，或大于10000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
在加强施用后，在未感染黄病毒的至少20名受试者的群体中，这样的中和抗体产生提供高的血清转换率。在某些这样的实施方案中，血清转换率是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。
在加强施用后，在至少20名受试者的群体中，特别是在未感染黄病毒的群体中，这样的中和抗体产生提供高的血清阳性率。在某些这样的实施方案中，血清阳性率是至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或
根据某种方法，受试者或受试者群体来自寨卡病毒流行地区。根据某种这样的方法，受试者或受试者群体来自遭受疫情暴发的寨卡病毒流行地区。根据某种这样的方法，受试者或受试者群体是未感染黄病毒的。
根据某种方法，受试者或受试者群体来自寨卡病毒非流行地区。根据某种这样的方法，受试者或受试者群体是来自前往流行地区旅行的寨卡病毒非流行地区。根据某种这样的方法，受试者或受试者群体是未感染黄病毒的。
根据某种方法，受试者或受试者群体是西班牙裔、拉丁裔、美洲印第安人、阿拉斯加原住民、亚洲裔、黑人或非裔美国人、夏威夷原住民或白人或其混血儿。
根据某种方法，受试者或受试者群体的年龄是18至29岁。
根据某种方法，受试者或受试者群体的年龄是30至49岁。
还公开了如本文所公开的疫苗或免疫原性组合物用于如本文所公开的方法中。
本文还公开了如本文所公开的疫苗或免疫原性组合物用于制造如本文所公开的方法的药物的用途。
在一些实施方案中，在施用本公开的含有非人类细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物后的受试者中诱导的保护性免疫应答大于在施用含有不适应非人类细胞生长和/或包含不同的非人类细胞适应突变的寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的免疫应答。在一些实施方案中，在施用本公开的含有非人类细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物后的受试者中诱导的保护性免疫应答相比于在施用含有不适应非人类细胞生长和/或包含不同的非人类细胞适应突变的寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的免疫应答大至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。测量保护性免疫应答的方法是本领域普通技术人员通常已知的。
在一些实施方案中，施用本公开的含有非人类细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物可诱导受试者中针对寨卡病毒的中和抗体的产生。在一些实施方案中，施用本公开的含有非人类细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体量大于在施用含有不适应非人类细胞生长和/或包含不同的非人类细胞适应突变的寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的中和抗体量。在一些实施方案中，施用本公开的含有非人类细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体量相比于在施用含有不适应非人类细胞生长和/或包含不同的非人类细胞适应突变的寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的中和抗体量大至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％。在一些实施方案中，施用本公开的含有非人类细胞适应性寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体量是在施用含有不适应非人类细胞生长和/或包含不同的非人类细胞适应突变的寨卡病毒的疫苗和/或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的中和抗体量的至少约1倍、至少约2倍、至少约3倍、至少约4倍、至少约5倍、至少约6倍、至少约7倍、至少约8倍、至少约9倍、至少约10倍、至少约100倍或至少约1000倍。测量受试者中的中和抗体的方法是本领域普通技术人员通常已知的。
优选地，治疗有效量或免疫原性量足以引起疾病症状的治疗或预防。合适剂量为约2μg、约5μg或约10μg，特别是约10μg。
参考以下实施例将更充分地理解本公开。然而，它们不应被解释为以任何方式限制本公开的任何方面或范围。
实施例
实施例1：克隆寨卡病毒株的产生
本实施例描述了具有已知研究历史的寨卡病毒(ZIKAV)株的产生。
材料和方法
Vero细胞维持
将一小瓶的WHO Vero 10-87细胞在水浴中快速解冻并且在36℃+/2℃下在5％CO2下直接接种到T-75cm2烧瓶中19mL预热的含有青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺40mM和10％FBS的DMEM(Dulbecco改良的基本必需培养基)中。使细胞生长至汇合并使用TryplE继代培养。将该烧瓶扩展至两个T-185cm2烧瓶，生长至汇合，并继代培养至31xT-185cm2烧瓶，并生长直至细胞达到100％汇合。通过胰蛋白酶消化收获细胞，以800x g离心10分钟，并以1.9x107个细胞/毫升的浓度重悬于含有10％FBS和10％DMSO的DMEM中。将一小瓶Vero细胞快速解冻并如上所述复苏到T-75cm2烧瓶中。将这些细胞继代培养两次，以在13x T-185cm2烧瓶中产生细胞库。胰蛋白酶消化后，将细胞以800x g离心，并以4.68x105个细胞/毫升的浓度重悬于冷冻培养基(含10％FBS和10％DMSO的DMEM)中。将该细胞库等分到冷冻小瓶中。
Vero细胞生长并维持在含有青霉素-链霉素、L-谷氨酰胺和10％FBS(cDMEM-10％-FBS)的DMEM中。TryplExpress用于维持和胰蛋白酶消化细胞。病毒吸附前两天，将6孔板以4-5x 105个细胞/孔接种在3mL cDMEM-10％-FBS中或以7x 105个细胞接种在T-25cm2烧瓶中的5mL cDMEM-10％-FBS中，或以1x 104个细胞/孔接种在96孔板中的0.1mL cDMEM-10％-FBS中。每天监测培育箱以维持指示的温度。将Vero细胞系储存在液氮中。
蚀斑测定
通过在6孔板中生长的新鲜汇合的Vero细胞单层中的蚀斑滴定来确定病毒滴度。将冷冻的等分试样解冻，并在96孔板中的cDMEM-0％-FBS中制备等分试样的十倍稀释系列。在接种Vero细胞单层之前，将稀释的病毒维持在冰上。在测定时，从6孔板中吸出生长培养基，并将100μL的每种病毒稀释液加入到孔中。病毒在36℃±2℃、5％CO2下吸附60分钟，并频繁(每10分钟)摇动板以防止细胞片干燥。病毒吸附后，将维持在40-41℃的4mL第一琼脂糖覆盖层(1X cDMEM-2％-FBS+0.8％琼脂糖)加入到每个孔中。使琼脂糖在室温下固化30分钟，然后将板在5％CO2下于36℃+/2℃上下颠倒温育4-6天。在第4天，加入2mL含有160μg/mL中性红色生命染料的第二琼脂糖覆盖层。蚀斑在第5天和第6天显现。
通过TCID50测定进行病毒定量
还通过在96孔板中生长的新鲜汇合的Vero细胞单层中滴定来确定病毒滴度。将冷冻的等分试样解冻，并在96孔板的cDMEM-2％-FBS稀释剂中制成等分试样的十倍稀释系列。在接种Vero细胞单层之前，将稀释的病毒维持在冰上。在测定时，从96孔板中吸出生长培养基，并将100μL的每种病毒稀释液加入到孔中。将板在5％CO2下于36℃+/2℃温育5天。使用Reed/Muench计算器计算50％组织培养感染剂量(TCID50)滴度。
测试物品
从疾病控制与预防中心(CDC)收到寨卡病毒株PRVABC59(在干冰上一个0.5mL小瓶)。通过RT-PCR确认了寨卡病毒的鉴定。该毒株通过PCR检测为甲病毒和支原体污染呈阴性。此信息汇总于表1。
表1：PRVABC59毒株信息
Figure BDA0002475462310000891
测序
根据制造商的方案，使用QIAampViral RNA Mini Spin试剂盒从每个分离株的稳定病毒收获物中提取RNA。从每个分离株中提取的RNA用于创建和扩增涵盖整个寨卡病毒基因组的6个cDNA片段。在1％琼脂糖/TBE凝胶上分析扩增的cDNA片段的大小和纯度，随后使用Qiagen快速凝胶提取试剂盒进行凝胶纯化。使用ABI 3130XL遗传分析仪测序仪进行自动测序反应。Lasergene SeqMan软件用于分析测序数据。
结果
寻找一种具有已知研究历史的ZIKAV毒株，该毒株与美国当前的ZIKAV疫情暴发有关。为此，选择了ZIKAV毒株PRVABC59。为了生成适应在Vero细胞中生长的良好表征的病毒，首先在Vero细胞中扩增ZIKAV PRVABC59(P1)。
在4mL cDMEM-0％-FBS中以0.01的MOI感染100％汇合的Vero细胞烧瓶(T-175cm2)。病毒在5％CO2下于36℃±2℃吸附到单层持续60分钟，然后在5％CO2下于36℃±2℃施加20mL cDMEM-0％-FBS进行病毒扩增。接种后每天监测细胞层的细胞病变效应(CPE)(图1)。96小时后，通过收集培养基并通过离心(600x g，4℃，10分钟)进行澄清，收获上清液。通过添加海藻糖至最终浓度为18％w/v来稳定收获物。将整体等分到0.5mL冷冻小瓶中并储存在-80℃。
通过TCID50测定法分析稳定化P1收获物中在Vero细胞单层上是否存在传染性病毒。通过从第0小时开始每天取等分试样来监测生长动力学。到第72小时达到峰值滴度(图2)。
通过在6孔Vero细胞单层上从第3天起滴定收获物，对P1材料进行蚀斑纯化。蚀斑在第6天显现，并通过在塑料板底部的独特和分开的蚀斑周围画一个圆圈，鉴定出10个要分离的蚀斑。通过使用无菌大口径移液管提取琼脂糖塞，同时刮擦孔底并用cDMEM-10％-FBS冲洗，以挑取蚀斑。将琼脂糖塞加入到0.5mL cDMEM-10％-FBS中，涡旋，标记为PRVABC59P2a-j，并在5％CO2下于36℃±2℃置于培育箱中过夜。
携带三个蚀斑(PRVABC59 P2a-c)进行另外的纯化。将每个分离株一式两份地纯净地平板接种在新鲜的6孔Vero细胞单层上。对该P2/P3过渡进行蚀斑纯化，并标记为PRVABC59 P3a-j。
携带六块蚀斑(PRVABC59 P3a-f)进行最后一轮纯化。将每个分离株一式两份地纯净地平板接种在新鲜的6孔Vero细胞单层上。对该P3/P4过渡进行蚀斑纯化，并标记为PRVABC59 P4a-j。
将来自P4蚀斑纯化的六个蚀斑(PRVABC59 P4a-f)在T-25cm2烧瓶中的Vero细胞单层上盲传。将每个蚀斑挑取物稀释在2mL cDMEM-0％-FBS中，其中1mL在5％CO2下于36℃±2℃吸附1小时；另外1mL用海藻糖稳定(最终浓度为18％v/v)，并储存在<-60℃。病毒吸附后，将cDMEM-0％-FBS加入到每个烧瓶中，并使其在36℃±2℃下在5％CO2下生长4天。收获病毒上清液，通过离心(600x g，4C，10分钟)澄清，在18％海藻糖中稳定化并等分并储存在<-60℃。通过TCID50测试该P5种子的寨卡病毒效力(图3)。
用六个PRVABC59克隆(P5a-f)中的每一个在4mL cDMEM-0％-FBS中以0.01的MOI感染Vero细胞的T-175cm2烧瓶的汇合单层。将病毒在5％CO2下于36℃+/2℃吸附60分钟，然后将20mL cDMEM-0％-FBS加入到每个烧瓶中，并在5％CO2下于36℃+/2℃生长。每天监测Vero细胞单层健康和CPE。如所示(图4)，在第3天和第5天收获病毒。将第3天和第5天的P6毒株收获物合并，用18％海藻糖稳定化，等分并储存在<-60℃。
测试了六个PRVABC59克隆(P6a-f)中的每一个的寨卡病毒体外效力(图5)。通过两种不同的方法TCID50和蚀斑滴定来确定效力。通过目测CPE(显微镜)并通过测量显示CPE的孔(黄色)与红色(无CPE)的吸光度差(A560-A420)来计算TCID50。在读板器上读取板，并将其应用于与显微镜读取板相同的计算器(吸光度)。两种评分技术之间的TCID50值非常相似，而通过蚀斑滴定获得的值较低。
下表2显示了P6病毒的产生和表征的汇总。
表2：产生克隆ZIKAV毒株的病毒传代和表征的汇总
Figure BDA0002475462310000911
Figure BDA0002475462310000921
由于黄病毒的包膜蛋白是病毒的主要免疫原性部分，因此寻求一种与原始分离株的包膜糖蛋白序列极为相似的分离的寨卡病毒克隆。PRVABC59克隆P6a、P6c、P6d和P6f在包膜区域(G990T)中的核苷酸990处含有G→T突变，导致在包膜残基330处出现Val→Leu的氨基酸突变，而PRVABC59克隆P6b和P6e的包膜基因与参考毒株(GenBank参考KU501215.1)相同(表3和图6)。
表3：PRVABC59 P6克隆的测序
Figure BDA0002475462310000922
Figure BDA0002475462310000931
然后对包膜序列中缺乏突变的两个克隆进行全基因组测序。测序结果汇总在上表3中。序列分析显示，两个克隆在NS1区的292位核苷酸处都有T→G取代，导致NS1残基98处出现Trp→Gly突变。该突变后来也通过深度测序得到证实。NS1 W98G突变位于ZIKAV NS1侧翼结构域的缠绕环中，这与膜缔合、与包膜蛋白的相互作用以及潜在的六聚体NS1形成有关。尽管其它色氨酸残基(W115、W118)在黄病毒中高度保守，但W98并非如此(图7)。然而，有趣的是，在11种不同的ZIKAV毒株中观察到W98残基的100％保守，包括来自非洲和亚洲谱系的那些。表4汇总了每个毒株中鉴定出的突变。
表4：PRVABC59 P6克隆中鉴定的突变的汇总
Figure BDA0002475462310000932
对ZIKAV PRVABC59 P6储备液进行表型分析，以表征ZIKAV克隆。如图8所示并在图9中定量，与具有大小蚀斑的混合群体的P1病毒相比，每个克隆分离株均由相对均一的大尺寸蚀斑群体组成。这些数据表明成功分离了单个ZIKAV克隆。
接下来，分析了ZIKAV PRVABC59 P6克隆的Vero细胞中的生长动力学分析。在无血清生长培养基中，每个ZIKAV P6克隆的细胞以0.01TCID50感染Vero细胞。每天获取病毒上清液样品，并同时通过TCID50测定来测定感染滴度。对于所有P6克隆，峰值滴度出现在第3天和第4天之间(约9.0log10 TCID50/mL)。各种P6克隆的生长动力学没有显著差异(图10)。
总而言之，结果表明成功产生了寨卡病毒种子。这种种子选择需要了解病毒的生长史、动力学、产量、基因型和表型。重要的是，寨卡病毒株的克隆分离允许成功地从污染剂(例如，可能在亲本人类分离株中的外来因子)中纯化出病毒。有趣的是，三个连续的蚀斑纯化成功地快速选择了适应Vero细胞的病毒(毒株P6a-f)，其中这些毒株能够在无血清Vero细胞培养物中良好复制，其中毒株P6a、c、d和f在病毒包膜蛋白中带有突变，而毒株p6b和p6e在病毒NS1蛋白中获得突变(对病毒包膜没有修饰)。此外，适应Vero的毒株能够高效且可重现地生长和制造从这些毒株繁殖的后续病毒传代。不希望受理论束缚，在病毒株P6a、c、d和f中观察到的Env-V330L突变可能是体外适应的结果，因为在Vero细胞传代时也观察到Env 330的突变(Weger-Lucarelli等人,2017.Journal of Virology)。由于包膜蛋白是寨卡病毒的主要免疫原性表位，因此在Env中含有Vero适应性突变的毒株可能会对疫苗免疫原性产生不利影响。不希望受理论束缚，蛋白NS1中的适应突变似乎不仅增强病毒复制，而且还可减少或以其它方式抑制不希望的突变的发生，例如在寨卡病毒的包膜蛋白E(Env)中。此外，在病毒的生命周期中，已知NS1可与包膜蛋白结合。该突变(NS1W98G)可能与改变NS1在下游加工过程中与病毒缔合并可能与病毒共纯化的能力有关。还已知NS1具有免疫原性，并且可能与疫苗的免疫应答有关。
实施例2：源自P6b和P6e毒株的纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)的临床前免疫原性和功效
以下实施例描述了源自P6b和P6e毒株的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)在CD1和AG129小鼠中的临床前免疫原性和功效。如实施例1中所述，从流行病相关的PRVABC59毒株产生六个克隆，并选择其中两个(P6b和P6e)用于进一步的临床前免疫原性和功效研究。
材料和方法
寨卡病毒疫苗的纯化、灭活和配制
产生并表征了许多适用于临床前免疫原性和功效研究的灭活ZIKAV疫苗。通过以MOI为0.01感染汇合Vero细胞的烧瓶，从P6b和P6e毒株扩增病毒。病毒在36℃±2℃/5％CO2下吸附1小时。吸附后，向每个烧瓶中加入20mL cDMEM-0％-FBS，并在36℃±2℃/5％CO2下温育五天。感染后第3天和第5天收获细胞上清液，并通过离心来澄清细胞碎片。
对于每个分离株，将澄清的上清液合并，在含有18％海藻糖的DMEM中稳定化并储存在<-60℃。将合并的澄清的病毒上清液在37℃水浴中解冻，并在4℃下用benzonase处理过夜。进行benzonase处理后，将每个样品施加到Sartorius PP3深度过滤器。深度过滤后，将每个样品施加到Centricon Plus-70切向流过滤(TFF)装置。将保留液进行缓冲液交换，稀释，并施加到Sartorius SartobindQ IEXNano。将每个样品施加到第二个SartoriusSartobindQ IEXNano上，并使用250mM、500mM和750mM NaCl的3步洗脱工艺洗脱。在进行MonoQ色谱法和稀释后，将每个250mM洗脱液施加到Centricon Plus-70错流过滤(CFF)装置上以进行缓冲液交换，用PBS稀释至35mL，并储存在2-8℃。
对于福尔马林灭活，将新鲜制备的1％甲醛滴加到每个纯化的样品中，并轻轻摇动，获得最终甲醛浓度为0.02％。在每日倒置下，将样品在室温(约22℃)温育14天。甲醛在室温下用焦亚硫酸钠中和15'，然后再施加到Centricon Plus-70切向流过滤(TFF)装置。通过加入50mL原料药缓冲液(10mM NaH2PO4，50mM NaCl，6％蔗糖，pH 7.4)进行四次缓冲液交换。然后将每个样品用原料药缓冲液稀释至15mL，使用0.2m注射器过滤器灭菌，等分至带瓶塞的无菌玻璃小瓶(每小瓶0.5mL)中，并于<-60℃冷冻。
通过TCID50测定和双重感染测定来确认病毒灭活。简言之，将原料药样品施加到C6/36细胞，并使其扩增6天。将来自C6/36细胞的上清液施加到Vero细胞上，并监测CPE持续8天。对于药物产品制剂，将PIZV原料药小瓶解冻，根据样品类型合并，并在存在或不存在Alhydrogel(Brenntag；最终0.5mg/mL，0.050mg/剂量)的PBS中稀释至1μg/mL或10μg/mL，并且在2-8℃温和搅拌下温育过夜。然后将所得药物产品批次等分到带瓶塞的无菌玻璃小瓶中，并储存在2-8℃直至使用。图11提供了用于制备药物产品的步骤的汇总。
小鼠免疫和攻毒
为了进行免疫原性研究，将六周龄的雄性和雌性Swiss-ICR(CD-1)小鼠分为6组(n＝10/组)。在第0天，通过肌内(i.m.)途径(2x0.05mL注射)向第1至5组的小鼠接种0.1mL疫苗。用PBS作为安慰剂对照接种第6组的小鼠。在第28天和第56天使用与第0天相同的剂量和疫苗类型对小鼠进行加强免疫。在第-1天(免疫前)、第27天(初免)、第42天(加强1)和第70天(加强2)采集血液样品。
为了进行免疫原性和功效研究，将四周龄的雄性和雌性AG129小鼠分为7组(n＝5/组)。在第0天，通过肌内(i.m.)途径(2x 0.05mL注射)向第1至6组的小鼠接种0.1mL疫苗。用PBS作为安慰剂对照接种第7组的小鼠。在第28天使用与第0天相同的剂量和疫苗类型对小鼠进行加强免疫。在第-1天(免疫前)、第27天(初免)和第55天(加强)从尾静脉采集血液样品。在实施安乐死时，在用异氟烷深层麻醉下经由心脏穿刺对小鼠采血(末期)。在第56天，用104个蚀斑形成单位(PFU)的ZIKAV PRVABC59经腹膜内对小鼠攻毒。
血清转移
从接种PIZV并攻毒的AG129小鼠中收集血清，并且在合并后冷冻(表6的第1、2、4和5组)。将血清库解冻，并通过将血清库在PBS中稀释三倍来生成测试物品。使用PBS中的AG129正常小鼠血清的3倍稀释液产生安慰剂。
将测试物品以0.1mL腹膜内注射的形式施用于AG129小鼠(施用相等体积的安慰剂物品至对照小鼠)。然后用100μL的104个蚀斑形成单位的寨卡病毒株PRVABC59经腹膜内对动物攻毒。
在第-11天(免疫前)通过十只小鼠的尾部采血以全血形式收集以重量计允许的血液体积。通过尾部采血在第1天(原代，循环Nab)和第4天(病毒血)从每只小鼠收集全血。致死性攻毒后的末期采血是通过在深层麻醉下心脏穿刺来进行以获得更大体积，然后通过颈脱位进行安乐死。将血液样品收集在微容器SST血清分离凝胶管中，并使其凝结至少30分钟，然后通过离心(10,000x g，2分钟)分离血清，并于-80℃冷冻。
蚀斑减少中和试验
如前所述通过蚀斑减少中和试验(PRNT)确定中和抗体滴度(参见例如Osorio等人,Lancet Infect Dis.2014年9月；14(9):830-8)。
报告病毒颗粒(RVP)中和测定
通过在96孔板中生长的Vero细胞中用恒定量的寨卡RVP滴定血清样品来分析中和抗体滴度。RVP含有寨卡(毒株SPH2012)的prME蛋白和基于登革热的海肾荧光素酶报告基因。简言之，将血清在56℃加热灭活30分钟，稀释，然后在37℃与RVP一起温育。然后将血清/RVP混合物与Vero细胞混合，并在37℃±2℃/5％CO2下温育72小时，然后用萤光素酶底物进行检测。使用JMP11非线性4参数分析对数据进行分析，将其归一化为阳性追踪对照，并报告50％有效剂量(EC50)。
除非有相反指示，否则所有另外的实验方法都如上文实施例1中所述进行。
结果
为了评估PIZV候选物在6周龄的雄性和雌性CD-1小鼠中的免疫原性，通过i.m.途径用0.1μg(+明矾)、1.0μg(+明矾)剂量的源自ZIKAV PRVABC69 P6b或P6e病毒株的疫苗使CD-1小鼠组(N＝10/组)免疫。为了评估对佐剂的需求，对一组动物接种0.1μg源自P6e且缺乏明矾佐剂的疫苗。疫苗接种在第0天、第28天和第56天进行，其中第6组接受PBS作为安慰剂对照(图12A和表5)。
表5：PIZV制剂和CD-1小鼠中的攻毒
组 毒株 剂量(μg) 明矾(μg) N
1 P6b 0.1 0.50 10
2 P6b 1.0 0.50 10
3 P6e 0.1 0.50 10
4 P6e 1.0 0.50 10
5 P6e 0.1 - 10
6 安慰剂(PBS) - - 10
接种疫苗后，通过RVP中和测定法对初次(第27天)、二次(第40天)和三次(第70天)免疫后收集的血清样品进行ZIKAV特异性中和抗体测试(图12B)。与PBS安慰剂对照组相比，在接受第一剂后27天，在接种有源自任一含明矾克隆的PIZV的小鼠中，观察到轻微的中和抗体应答。重要的是，该应答在第二次免疫(第40天)后显著增加，但在用第三剂免疫(第70天)后没有另外增强。在接种有非佐剂疫苗的小鼠中未观察到中和抗体应答(图12B)。
为了评估PIZV候选物的免疫原性和保护功效，在第1天和第28天通过i.m.途径用0.1μg剂量(+明矾)、1.0μg剂量(+明矾)或0.1μg剂量(-明矾)的源自ZIKAV PRVABC59 P6b或P6e储备液的疫苗使4周龄AG129小鼠组(n＝5/组)免疫(图13A和表6)。
表6：PIZV制剂和AG129小鼠中的攻毒
组 性别 病毒株 剂量(μg) 明矾(μg) N
1 F P6b 0.1 0.50 5
2 F P6b 1.0 0.50 5
3 F P6b 0.1 - 5
4 M P6e 0.1 0.50 5
5 M P6e 1.0 0.50 5
6 M P6e 0.1 - 5
7 M 安慰剂(PBS) - - 5
接种疫苗后，在第56天用104PFU的ZIKAV PRVABC59(低传代)经腹膜内对接种疫苗的小鼠和对照小鼠攻毒。对初次(D27)和二次(D55)免疫后收集的血清样品进行了ZIKAV特异性中和抗体应答的测试(图13B和表7)。仅接受高剂量明矾佐剂疫苗的组(第2组和第5组)在单次免疫后引起中和抗体应答，其在加强免疫后急剧增加。相反，接受低剂量或高剂量明矾佐剂疫苗的组在第二剂后产生高的中和抗体应答。接受两剂疫苗后，接受明矾佐剂疫苗的小鼠组之间无统计学差异，无论其剂量如何或是否源自P6克隆。
表7：ZIKAV特异性中和抗体应答
Figure BDA0002475462310000991
Figure BDA0002475462310001001
攻毒后21天，还监测所有组的死亡率、发病率和体重减轻。检测攻毒后的病毒血，并通过蚀斑滴定进行定量。用明矾配制的低剂量或高剂量PIZV候选物疫苗接种的小鼠(第1、2、4和5组)可完全免受致命ZIKAV攻毒，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)测定以及类似的二次中和测定所评估(表8)。在疫苗接种的小鼠中未观察到体重减轻或疾病的临床体征，在攻毒后三天都没有可检测到的感染性病毒血，并且所有用低剂量或高剂量抗原+明矾佐剂接种的小鼠都存活到攻毒后21天(图14-16)。相反，所有未感染小鼠的攻毒都在攻毒后第2天都导致高病毒血，并且在攻毒后第10天至第18天之间发病/死亡(中位存活期＝D13)。此外，用源自毒株P6b的无明矾佐剂的低剂量疫苗接种的小鼠进行攻毒后，在攻毒后第2天和中位存活日均与安慰剂对照组相似，导致高病毒血，而用源自克隆e的低剂量无明矾佐剂疫苗接种的小鼠仍受到部分保护，中位存活期为19天。这些结果表明，用明矾进行免疫更有效，可能需要二次免疫，并且低剂量与高剂量同样有效。
表8：血清中和抗体滴度
Figure BDA0002475462310001002
另外，测试了由完全灭活的P7b和P7e病毒(分别从P6b和P6e毒株进行的另一次传代)产生的疫苗原料药(DS)中NS1的存在。使用预先涂有对亚洲和非洲谱系的寨卡病毒NS1都具有反应性但对登革热NS1无交叉反应性的单克隆抗体的板，进行夹心ELISA。一式两份地制备DS的2倍、4倍、8倍、16倍和32倍稀释液，并与在0-8ng/mL的浓度下一式两份地使用重组纯化的NS1的标准曲线进行比较。一式两份地制备仅DS缓冲液的稀释液作为阴性对照。用抗NS1 HRP结合物检测结合的NS1，并从含有匹配DS样品的孔中测得的吸光度中减去仅使用DS缓冲液的孔的吸光度(A450-A630)。夹心ELISA的结果显示在下表9中。有趣的是，观察到NS1与疫苗原料药制剂共纯化，这表明病毒NS1可能是整个灭活病毒疫苗的免疫原性组分。
表9：NS1 ELISA
Figure BDA0002475462310001011
接下来测试了抗体被动转移后赋予免受野生型寨卡病毒攻毒的保护作用所需的中和抗体(Nab)的阈值。(表10A和B)。
表10A：AG129小鼠中被动转移研究的设计
Figure BDA0002475462310001012
表10B：AG129小鼠中被动转移研究的时间安排
Figure BDA0002475462310001013
Figure BDA0002475462310001021
将来自疫苗接种并攻毒的AG129小鼠的合并血清在PBS中3倍连续稀释，并经腹膜内注射到7组(N＝5/组)的5-6周龄的AG129小鼠中。免疫前的AG129小鼠血清用作安慰剂对照(第8组)。被动转移后(约16-19小时后)，在进行病毒攻毒之前，从每只小鼠收集全血并通过离心分离血清，以测定循环中和抗体滴度(图17)。在即将病毒攻毒之前，各组小鼠(指定的第1、2、3、4、5、6、7、8组)的平均log10中和抗体滴度分别为2.69、2.26、1.72、1.30、<1.30、<1.30、<1.30、<1.30。
ZIKV nAb被动转移后24小时，用104pfu的ZIKV PRVABC59经腹膜内对小鼠攻毒。攻毒后，将动物每天称重并且每天1-3次监测疾病体征，持续28天。基于症状对每只动物给出临床评分(表11)。垂死和/或表现出明显神经系统体征(临床评分≥2)的动物被人道地安乐死并计为非存活者。
表11：监测发病率和死亡率时给出的临床评分的描述
Figure BDA0002475462310001022
在对照组(第8组)和第5-7组中，攻毒后9天开始出现疾病体征，并且体重相应减轻(图18)。攻毒后三天，收集全血并通过离心从每只动物分离血清。使用蚀斑滴定测定分析血清样品中是否存在传染性ZIKV(图19)。第1-8组小鼠的平均感染滴度(log10 pfu/mL)分别为：1.66、2.74、4.70、4.92、7.24、7.54、7.54和7.46。重要的是，第1-4组中可检测到ZIKV中和抗体水平(≥1.30log10)的小鼠的病毒血水平相比于对照小鼠在统计学上显著较低(滴度低102.5至106.0倍)(p＝0.0001、0.0003、0.0007和0.0374)。这些结果表明，可检测水平的ZIKV中和抗体(≥1.30log10)以剂量依赖性方式降低病毒血。
在第1-8组中，小鼠的中位存活天数分别为：未确定、第17天、第17天、第13天、第11天、第11天、第11天和第10天(图20)。重要的是，具有可检测的ZIKV中和抗体滴度的小鼠组(1至4组)的存活曲线与对照组(第8组)相比在统计学上不同(分别为p＝0.0019、0.0019、0.0019、0.0153)。这些结果表明，ZIKV中和抗体的可检测水平(≥1.30log10)以剂量依赖性方式延迟了疾病的发作。
最后，将每只动物的ZIKV中和抗体滴度相对于其相应的病毒血滴度作图，并进行线性回归分析。攻毒后第3天，观察到ZIKV中和抗体滴度与病毒血水平呈高度负相关关系(图21)。被动转移研究的结果汇总如下表12所示。
表12：被动转移结果的汇总
Figure BDA0002475462310001031
尽管在该实验中接受ZIKAV中和抗体的小鼠组没有完全保护免于致命ZIKAV攻毒，但在具有可检测水平的循环ZIKAV中和抗体滴度的小鼠组中，显示呈剂量依赖性方式的病毒血水平降低和疾病发作延迟。
总而言之，来自CD-1和AG129小鼠研究的临床前数据表明，源自独立且良好表征的病毒克隆的PIZV具有免疫原性，并且能够提供针对野生型ZIKAV攻毒的保护作用。重要的是，低剂量和高剂量的疫苗在两剂后引起相似的中和抗体应答，并提供了相似的针对致命ZIKAV攻毒的保护水平。有趣的是，接种有无佐剂的PIZV候选物的小鼠也显示出免于ZIKAV攻毒的部分保护作用。疫苗抗血清显著减少了被动免疫的AG129小鼠中的病毒血，并延长了针对致命ZIKAV攻毒的存活。这些结果还表明，在非常容易感染ZIKAV的AG129小鼠模型中，良好表征的PIZV候选物可高效抵抗ZIKAV感染。
另外，发现在第7代的PRVABC59(来自PRVABC59 P6e)的序列在遗传上与第6代的序列相同。这是令人惊讶的，因为黄病毒通常被认为在遗传上不稳定。PRVABC59 P6e被选为主要病毒种子，这部分是由于其7代以上的遗传稳定性。不希望受理论束缚，据信这种增强的遗传稳定性可能是由于NS1侧翼结构域中的单个氨基酸取代(W98G)所致，因为这是在适应Vero细胞的PRVABC59 P6基因组中观察到的唯一突变。另外，遗传稳定性和同质性是有利的，因为它减少了变异性并增加了可用于疫苗制剂的后续毒株的可重现生产。
实施例3：P6a和P6e毒株表型的临床前评估
材料和方法
AG129小鼠(缺乏干扰素α/β和γ受体)易受ZIKV感染和疾病侵袭，包括脑部严重病变。用104和103pfu的ZIKV第6代克隆a(P6a)和e(P6e)经腹膜内感染14周龄的AG129小鼠。
每天对小鼠称重并监测(长达28天)是否有疾病的临床体征(体重减轻、皮毛褶皱、驼背姿势、嗜睡、四肢无力、部分/完全瘫痪)。另外，如实施例1所述，通过对攻毒后三天收集的血清样品进行蚀斑滴定来进行病毒血分析。
结果
P6e感染导致100％的死亡率(中位存活时间＝12.5天)，而P6a感染导致仅33％的死亡率(中位存活时间＝未确定)(图22)。与此相符的是，与PRVABC59 P6a感染的小鼠相比，preMVS P6e感染的小鼠表现出更大的体重减轻(3)。PRVABC59 P6a或P6e感染的小鼠组之间的平均组病毒血水平无统计学差异(图24)。这些数据表明，仅生长动力学可能不是关键的决定因素(因为两个毒株在体外都产生相似的病毒血和相似的峰值滴度)，并且包膜蛋白的特性对于(野生型毒株)的毒力和(灭活候选物的)免疫原性可能很重要。
实施例4：源自P6e毒株的纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)的临床免疫原性和功效
样品制备：
如上所述，通过在Vero细胞中生长来制造四个纯化的灭活寨卡疫苗(PIZV)批次(Tox批次1-4)。通过过滤和色谱法纯化来自4个每日收获物的上清液(每个每日收获物每天1000mL，总计约4000mL)，浓缩并通过加入福尔马林至最终浓度0.01％将其灭活。使灭活在22℃下进行10天，然后将样品缓冲液交换到原料药缓冲液(10mM NaH2PO4、50mM NaCl、6％蔗糖，pH 7.4)中。
灭活的寨卡病毒活性剂不再能够感染宿主细胞，而宿主细胞可被尚未灭活的寨卡病毒感染。灭活取决于以下测试方案。如果未检测到蚀斑，则确认灭活。
详细的COI(灭活完全)方案：
1.测定法的第一部分：在添加样品之前两天，将Vero(1.4E+05个细胞/毫升)和埃及伊蚊C6/36(4E+05个细胞/毫升)细胞接种到96孔板中。将Vero细胞在37℃下在DMEM+10％最终FBS+2％L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素中培养。C636细胞在28℃下在DMEM+10％FBS+2％L-谷氨酰胺+1％青霉素/链霉素+1％非必需氨基酸中培养。
2.将200TCID50对照病毒(在病毒反滴定对照测试中制备)或DS样品的三个独立重复样品稀释(5倍和10倍稀释)到含有2％FBS的培养基中。
3.将96孔板中的细胞接种样品。在感染96孔板中的细胞单层之前，将样品涡旋以破坏任何可能的聚集。将100μL每种稀释液分别施加到两个分开的含有Vero和C636细胞的96孔板中的各5个孔中。
4.对于每种细胞类型，另一孔中仅包括培养基作为阴性CPE对照。
5.将板在对于细胞系的适当温度下温育6天。
6.测定法的第二部分：为了使活病毒在允许的细胞系上进一步扩增并通过CPE可视化，将来自Vero和C636细胞的每个96孔上清液的全部体积转移到6孔板的各个孔的Vero细胞。接种持续90分钟，以15分钟间隔摇动。
7.将含有2％FBS的培养基加入到孔中，并将板再温育8天，以随后检测扩增的样品与CPE的关系。如果DS的任何重复实验在第8天结束时显示CPE，则认为灭活是不完全的。
7.通过转移至6孔板后在易感细胞单层上形成蚀斑或CPE，并温育8天以允许病毒复制，来可视化活/复制病毒粒子的存在。在测定法结束时在6孔板中的CPE评分％计算如下：
-通过比色变化的可视化检查每个6孔板的Vero细胞的CPE，接着通过在倒置光学显微镜下检查来确认CPE。
-每个6孔板代表以上述5倍和10倍稀释制备的DS稀释液的重复样品之一(5个孔，加上一个仅包含培养基的孔)。
因此，每个重复物的CPE％反映了每个样品的总共5个孔中具有CPE的孔数(每个测定使用总共120个孔)。基于每种稀释液的三个重复物计算平均CPE％和标准偏差。
纯化的灭活寨卡病毒的量可通过Bradford测定法(Bradford等人,(1976)Anal.Biochem.72:248-254)使用限定量的重组寨卡包膜蛋白以建立标准曲线来确定。
纯化的寨卡病毒的纯度可通过尺寸排阻色谱法确定。在本实施例中，在尺寸排阻色谱法中的纯化寨卡病毒的主峰占尺寸排阻色谱法中的曲线下总面积的85％以上。
研究疫苗(PIZV)是指纯化的福尔马林灭活寨卡病毒，其用200μg氢氧化铝Al(OH)3作为佐剂在磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中配制。将最终的液体配制产品装入一次性使用小瓶中，并用防启封口密封。研究疫苗以0.5mL的2剂方案(每剂2、5或10μg抗原，间隔28天)以IM(肌内)方式施用。
注射用氯化钠(NaCl)0.9％溶液用作安慰剂。它以一次性使用的小瓶形式提供。它是无菌、透明、无色的氯化钠液体溶液，不含防腐剂，仅设计用于肠胃外使用。安慰剂以2剂方案(每剂0.5mL，间隔28天)IM施用。
测试方法
PRNT测定：如先前所述通过蚀斑减少中和试验(PRNT)确定中和抗体滴度(参见Protection of Rhesus monkeys against dengue virus challenge after tetravalentlive attenuated dengue virus vaccination.J.Infect.Dis.193,1658-1665(2006).Muthumani K,Griffin BD,Agarwal S等人,In vivo protection against ZIKVinfection and pathogenesis through passive antibody transfer and activeimmunisation with a prMEnv DNA vaccine.NPJ Vaccines 2016；1:16021)。用于PRNT测定开发的寨卡病毒株是PRVABC59。
免疫结果量度：
定义：
血清阳性(PRNT)：滴度≥LOD(检测限)
血清阴性(PRNT)：滴度<LOD(检测限)
血清转换(PRNT)：最初血清阴性受试者中的接种后滴度≥LOD
LOD(PRNT)＝10
低于LOD的指定值＝5
LLoQ(定量下限，PRNT)＝26
低于LLoQ(定量下限)的指定值＝13
报告病毒颗粒(RVP)中和测定：通过在96孔板中生长的Vero细胞中用恒定量的寨卡RVP滴定血清样品来分析中和抗体滴度。RVP含有寨卡(毒株SPH2012)的prME蛋白和基于登革热的海肾荧光素酶报告基因。简言之，将血清在56℃加热灭活30分钟，稀释，然后在37℃与RVP一起温育。然后将血清/RVP混合物与Vero细胞混合，并在37℃±2℃/5％CO2下温育72小时，然后用萤光素酶底物检测。使用JMP11非线性4参数分析对数据进行分析，将其归一化为阳性追踪对照，并报告50％有效剂量(EC50)。
研究说明
纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)在年龄为18至49岁的未感染黄病毒和初免的健康成年人中的1期、随机、观察者盲、安慰剂对照的安全性、免疫原性和剂量范围研究
研究设计如图25所示。该研究被设计为依序招募年龄介于18至49岁之间的未感染黄病毒和黄病毒初免的健康成年人。这两个连续组各自由120名受试者(计划中)组成，这些受试者被随机分配给4组之一，每组30名受试者，以接受三种剂量之一的PIZV疫苗或盐水安慰剂。疫苗接种方案由间隔28天施用的2剂组成。此实施例中的数据仅与未感染黄病毒的受试者(n＝124)有关，预计将有黄病毒初免受试者的进一步数据。该实施例提供了来自“黄病毒未感染组”的第57天(第2剂后的第28天)之后的首次中期分析的数据。来自黄病毒初免组的数据不是该中期分析的一部分，因为在首次中期分析时该组的招募仍在进行中。
总之，将受试者随机分为四个研究组，分别接受两剂安慰剂(盐水)或浓度为2μg、5μg和10μg的纯化的灭活寨卡疫苗(PIZV)。该研究涉及在第1天和第29天肌内注射疫苗(或安慰剂)，其中在研究的第-15、1、8、29、36、57、211、393、767天采集血液样品。在第-15天的血液样品用于确定黄病毒血清状况筛查和资格筛查。第1、29、57天的样品用于免疫原性评估。在第8天和第36天进行安全实验室测试。将在第211、393和767天评估免疫持久性。
基于第2剂后第28天的数据，纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)在年龄介于18至49岁之间的未感染黄病毒的成年人中是安全的且具有免疫原性。
主要目标
该研究的主要目的是描述间隔28天给与的两剂PIZV的安全性，并从三种不同的抗原浓度(2、5或10μg)中选择一种剂量水平以用于后续临床研究。主要终点是：施用每种剂量的PIZV或安慰剂后7天时期内经历征集性局部和全身不良事件(AE)的受试者的百分比，以及在接种后28天时期内经历不严重的非征集性AE和严重不良事件(SAE)的受试者的百分比。
次要目标
次要目标是描述未感染黄病毒的成年人在第1剂后28天和第2剂后28天对纯化的灭活寨卡病毒疫苗(PIZV)的免疫应答。与这些目标有关的次要终点是所考虑的时间点的中和抗ZIKV抗体的几何平均滴度(GMT)、血清阳性率(SPR)和血清转换率(SCR)。
数据分析由另一组独立的非盲统计学家和程序员进行，他们能够访问各个治疗任务。所有参与试验进行的人员都看不到个体受试者治疗任务。研究小组只能访问小组级别的非盲结果。
研究群体：
总共124名受试者被招募到未感染黄病毒组并被纳入安全性集合(SS)，其中包括已接受至少一剂PIZV或安慰剂的所有随机受试者。其中，118例(SS的95.2％)被纳入已接受至少一剂研究疫苗(PIZV)/安慰剂的随机受试者的全面分析集合(FAS)中，提供在基线时和至少一次疫苗接种后的有效血清学结果。FAS中的受试者的符合方案集合(PPS)中包括113名受试者(SS的91.1％)，这些受试者没有与免疫原性分析相关的重大方案违规。分析集合呈现于表14。
表14：分析集合
Figure BDA0002475462310001101
Figure BDA0002475462310001111
安全性集合＝所有接受至少1剂PIZV或安慰剂的随机受试者
全面分析集合＝所有接受至少一剂PIZV/安慰剂并提供有效基线和至少一次疫苗接种后血清学结果的随机受试者
符合方案集合＝FAS中所有无重大方案违规的受试者
SS中的受试者年龄为35.3±8.91岁(平均值±标准偏差)，并且在18-29岁年龄段中分布为28.2％和在30-49岁年龄段中分布为71.8％。女性占组中的54.8％。在人种和种族方面，研究参与者为白人(81.5％)、黑人(14.5％)和“非西班牙裔”(93.5％)。SS中的平均BMI为27.5±4.05(平均值±标准偏差)。四个研究组的人口统计学特征(年龄、性别、身高、体重、BMI和种族)总体相似。在安慰剂组中，女性更具代表性，其中她们占研究参与者的66％，而在其它组中，其中性别分布更为均衡。表15呈现了人口统计学和基线特征。
在研究开始时检查安全性实验室参数和生命体征，作为纳入标准的一部分。这些规定了生命体征必须在正常范围内(即低于FDA毒性分级量表中指示的第1级)，并且安全性实验室测试必须在正常范围内或不超过FDA毒性分级量表中所定义的第1级。
表15：人口统计学和基线特征(安全性集合)
Figure BDA0002475462310001112
Figure BDA0002475462310001121
Figure BDA0002475462310001131
BMI＝体重(kg)/身高2(m2)。
备注1：使用知情同意日期计算年龄。
备注2：仅当选择了多人种类别时，受试者才包括在多人种类别中。
安全性/反应原性
接受疫苗(PIZV)的组中征集性局部不良事件(AE)的总体报告发生率高于安慰剂组。疼痛是最常报告的征集性注射部位AE。第1剂后，PIZV组中受试者的疼痛发生率为30.0％至38.7％，而安慰剂组为13.8％。第2剂后，PIZV组中的疼痛发生率与第1剂后的那些相似：29.6％至40％，而在安慰剂组中为14.3％。在第1剂后疼痛的强度报告为轻度并且在第2剂后为轻度至中度，其中5μg PIZV组中的2名受试者(6.7％)和10μg PIZV组中的1名受试者(3.3％)报告中度疼痛。不超过9.7％的受试者报告其它征集性局部AE(红斑、肿胀和硬结)。
疼痛发作发生在第1天(对于90％的受试者)或第2天(对于3名受试者)。安慰剂组或PIZV组中的任何受试者直到第5天仍未报告疼痛。
第1剂后，PIZV组中30％至48.4％的受试者报告任何性质的征集性全身AE，而安慰剂组中则有41.4％的受试者。第2剂后，PIZV组中发生率为10％至33.3％，而安慰剂组中则为27.6％。总体上81.3％(第1剂)和75％(第2剂)的征集性全身AE被判断为与研究疫苗接种有关。两次给药后，报告最多的全身事件是头痛、疲劳和肌痛。
大多数全身AE报告为轻度，即不干扰日常活动。少数事件强度中等：
在第1剂后，PIZV组中6.7-12.9％的受试者和安慰剂接受者中的17.2％；
在第2剂后，PIZV组中0-3.3％的受试者和安慰剂组中的10.3％。
曾有一份关于严重AE的报告：安慰剂组中的一名受试者经历发热。该研究参与者在接受第二次研究疫苗接种后第4天，经口测得的温度为39.4℃。研究人员没有将这次发热判断为与研究有关。
在四个组中，在整个7天时期内均不同地报告了征集性全身AE。发热、疲劳、关节痛和肌痛事件的发作主要在接种疫苗后的2天内，并且因头痛和不适而有所不同。除了在第4天在安慰剂组中有受试者报告严重发热外，在疫苗接种后的2天内报告发热。
疫苗接种后7天的征集性局部和全身不良事件的发生率如表16所示。
表16：疫苗接种后7天的征集性局部和全身不良事件的发生率(安全性集合)
Figure BDA0002475462310001141
Figure BDA0002475462310001151
N＝具有可用信息的受试者数目；n(％)＝报告特定AE的受试者数目(百分比)。
总共30.6％的受试者在以下任何给药后的28天内报告了非征集性AE(不包括长期征集性AE)：PIZV组中21.9-38.7％并且安慰剂组中36.7％。这些AE主要是感染，侵染(13.7％)和神经系统病症(3.2％：头痛、偏头痛、头晕)。强度均为轻度至中度。
非征集性AE被认为与三名受试者(2.4％)的研究疫苗接种有关。
所报告的事件是：
在第1剂后，5μg PIZV组中的一名受试者头晕，而2μg PIZV组中的一名受试者有潮红。
在第2剂后，10μg PIZV组中一名受试者的眼部瘙痒和流泪增加。
这些事件的强度为轻度至中度，从接种疫苗后的第1天或第2天开始，持续时间为1至3天，并且都已解决。
一名受试者由于第1剂后的头痛而中止了研究疫苗接种。该受试者接受了PIZV，并在疫苗接种后第1天出现头痛。头痛发作36天后消退。从第1剂至第2剂后28天的时期内，未报告严重不良事件(SAE)。
疫苗接种后7天内血液安全性实验室参数相比于基线所观察到的变化很小，例如从正常至轻度或从轻度至中度AE，在四组中受试者百分比相当。尿液分析参数在所有时间点均正常，或者各组和访视的分级类别相似。
免疫原性
表17呈现了如通过PRNT所测量的寨卡病毒中和抗体(EC50)的几何抗体滴度以及每次疫苗给药后的血清阳性率和血清转换率。
PIZV疫苗在未感染黄病毒的成年人中具有免疫原性。所有受试者在基线时均为血清阴性。在任何剂量的PIZV疫苗的两次给药后，最初对寨卡病毒抗体呈血清阴性的受试者的疫苗接种在所有受试者中均引起血清阳性：第1剂后血清转换率范围为69.23％至96.43％，并且第2剂后为100％。安慰剂组中的所有受试者在整个考虑期间保持血清阴性。
在第1剂后对于血清阳性率和在每次给药后对于GMT均观察到剂量范围效应。首次给药后，几乎所有已接受10μg PIZV剂量的受试者(96.4％)都产生寨卡病毒中和抗体。在三个PIZV组中，第二剂相比于第1剂导致GMT增加10倍以上。
表17：施用每剂PIZV之前和之后28天的寨卡病毒中和抗体(EC50)(PRNT)的血清阳性率、血清转换率和GMT(符合方案集合)
Figure BDA0002475462310001161
Figure BDA0002475462310001171
N＝具有可用PRNT数据的PPS中的受试者数目；
血清阳性定义为滴度≥10；血清转换定义为：在基线时的血清阴性受试者(滴度<10)在疫苗接种后滴度≥10；结果<10指定为5的滴度；滴度≥10(检测限)和<26(定量下限)指定为13的值。
根据表17，使用PRNT确定的几何平均滴度以图形显示在图26中。根据表17，使用PRNT确定达到血清转换的受试者的百分比以图形显示在图27中。
第1剂后和第2剂后中和滴度的分布分别以反向累积分布曲线显示在图28和图29中。
除了使用PRNT测定来测量免疫应答外，还利用RVP中和测定法测试样品。表18呈现了如通过RVP测定所测量的寨卡病毒中和抗体(EC50)的几何抗体滴度。RVP测定结果显示PRNT数据的相似剂量范围效应，随着PIZV剂量增加，GMT逐渐升高。
表18：疫苗接种之前和之后28天的寨卡病毒中和抗体(EC50)(RVP)的GMT(符合方案集合)
Figure BDA0002475462310001181
N＝具有可用RVP数据的PPS中的受试者数目。
结论
对于在未感染黄病毒组中评估的所有抗原剂量，PIZV疫苗都是良好耐受且安全的。在所有组中均报告了征集性全身AE，它们随着剂量强度增大而无明显增加并且强度为轻度至中度。在各组中所报告的局部征集性AE的强度也是轻度至中度。在四个研究组中，非征集性症状以相似频率报告。总体而言，所述疫苗在未感染黄病毒的受试者中具有免疫原性，并且观察到阳性剂量范围反应。
本发明的其它条目：
1.一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的来自寨卡病毒的一种抗原。
2.如条目1中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒包含至少一种非人类细胞适应突变。
3.如条目1的疫苗或免疫原性组合物，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有突变。
4.如条目1或2的疫苗或免疫原性组合物，其中所述抗原是纯化的灭活全病毒。
5.如条目4的疫苗或免疫原性组合物，其中在尺寸排阻色谱法中的纯化抗原的主峰占所述尺寸排阻色谱法中的曲线下总面积的85％以上。
6.如条目5的疫苗或免疫原性组合物，其中所述抗原是可从如下方法获得的灭活全病毒，其中在约15℃至约37℃范围的温度下用约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量的福尔马林处理所述寨卡病毒5至15天。
7.如条目5或6的疫苗或免疫原性组合物，其中所述灭活全病毒是化学灭活的。
8.如条目7的疫苗或免疫原性组合物，其中所述灭活全病毒用去污剂、福尔马林、β-丙内酯(BPL)、二元乙胺(BEI)、乙酰基乙烯亚胺、亚甲基蓝和补骨脂素中的一种或多种化学灭活。
9.如条目8的疫苗或免疫原性组合物，其中所述灭活全病毒在如下方法中用福尔马林化学灭活，其中在约15℃至约37℃范围的温度下用约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量的福尔马林处理所述寨卡病毒5至15天。
10.如条目1至9中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为约2μg的纯化的灭活全病毒。
11.如条目1至9中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为约5μg的纯化的灭活全病毒。
12.如条目1至9中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为约10μg的纯化的灭活全病毒。
13.如条目1的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个非人类细胞适应突变是在寨卡病毒非结构蛋白1(NS1)中。
14.如条目1的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个适应突变发生在SEQ IDNO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置。
15.如条目1至14中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个适应突变或突变是Trp98Gly突变。
16.如条目1至15中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个适应突变或突变与缺乏所述至少一个适应突变的寨卡病毒相比增强遗传稳定性。
17.如条目1至16中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个适应突变或突变与缺乏所述至少一个适应突变的寨卡病毒相比增强病毒复制。
18.如条目1至17中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒不包含包膜蛋白E(Env)中的突变。
19.如条目1的疫苗或免疫原性组合物，其中所述非人类细胞是哺乳动物细胞。
20.如条目1的疫苗或免疫原性组合物，其中所述非人类细胞是猴细胞。
21.如条目20的疫苗或免疫原性组合物，其中所述猴细胞来自Vero细胞系。
22.如条目21的疫苗或免疫原性组合物，其中所述Vero细胞系是WHO Vero 10-87细胞系。
23.如条目1至22中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒是非洲谱系病毒或亚洲谱系病毒。
24.如条目1至22中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒是亚洲谱系病毒。
25.如条目1至24的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒来自毒株PRVABC59。
26.如条目1至25中任一项的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物还包含佐剂。
27.如条目26的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂选自由以下组成的组：铝盐，toll样受体(TLR)激动剂，单磷酰脂质A(MLA)，合成脂质A，脂质A模拟物或类似物，MLA衍生物，细胞因子，皂苷，胞壁酰二肽(MDP)衍生物，CpG寡核苷酸，革兰氏阴性细菌的脂多糖(LPS)，聚磷腈，乳剂，病毒体，蜗形体，聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)微粒，泊洛沙姆颗粒，微粒，脂质体，完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(IFA)。
28.如条目27的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂是铝盐。
29.如条目28的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂选自由明矾、磷酸铝、氢氧化铝、硫酸铝钾和Alhydrogel 85组成的组。
30.如条目29的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝。
31.如条目30的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含100μg至600μg氢氧化铝，或100μg至300μg氢氧化铝，或150μg至250μg氢氧化铝，或约200μg氢氧化铝。
32.如条目1至31中任一项的疫苗，其中所述寨卡病毒是克隆分离株，特别是来自蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。
33.如条目1至32中任一项的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物还包含磷酸盐缓冲剂和多元醇，例如糖，如蔗糖。
34.如条目1至33中任一项的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物包含
-剂量为约10μg的纯化的灭活全病毒
-约200μg氢氧化铝，
-缓冲剂；以及任选地
-糖如蔗糖。
35.如条目1至34中任一项的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物为干燥物质或水性组合物的形式。
36.如条目1至34中任一项的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物为水性组合物的形式，体积为0.1至0.8ml，或约0.5ml。
37.一种在有需要的受试者中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用条目1至36中任一项的疫苗或免疫原性组合物。
38.一种在有需要的受试者中诱导针对寨卡抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用条目1至36中任一项的疫苗或免疫原性组合物。
39.一种在有需要的胎儿或新生儿中预防寨卡病毒疾病的方法，所述方法包括向怀孕的受试者或打算怀孕的受试者或有生育能力的妇女施用条目1至36中任一项的疫苗。
40.一种在有需要的受试者中预防寨卡病毒疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用条目1至36中任一项的疫苗。
41.如条目37至40中任一项的方法，其中所述受试者是怀孕的或打算怀孕的或是有生育能力的妇女。
42.如条目37至41中任一项的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述受试者中诱导保护性免疫应答。
43.如条目42的方法，其中在所述受试者中诱导的保护性免疫应答大于在施用包含来自缺乏至少一种非人类细胞适应突变的寨卡病毒的一种或多种抗原的疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中诱导的保护性免疫应答。
44.如条目37至43中任一项的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述受试者中诱导寨卡病毒中和抗体的产生。
45.如条目37至44中任一项的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于10，或大于50，或大于100，或大于200，或大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于2000，或大于3000，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
46.如条目37至46中任一项的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于300，或大于500，或大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于3000，或大于5000，或大于10,000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
47.如条目45和46中任一项的方法，其中在所述施用后28天达到这样的滴度。
48.如条目37至47中任一项的方法，其中避免了严重的不良事件。
49.如条目37至48中任一项的方法，其中避免了39℃以上的发热。
50.如条目37至49中任一项的方法，其中在所述受试者中产生的中和抗体浓度高于在施用包含来自缺乏至少一种非人类细胞适应突变的寨卡病毒的一种或多种抗原的疫苗或免疫原性组合物的相应受试者中产生的中和抗体浓度。
51.如条目37至50中任一项的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物是通过选自由以下组成的组的途径施用的：皮下施用、经皮施用、真皮内施用、真皮下施用、肌内施用、经口施用、鼻内施用、经颊施用、腹膜内施用、阴道内施用、肛门施用和颅内施用。
52.如条目37至51中任一项的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物是通过肌内或皮下施用来施用的。
53.如条目37至52中任一项的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物被施用一次或多次。
54.如条目37至53中任一项的方法，其中包含10μg剂量的所述疫苗或免疫原性组合物被施用一次。
55.如条目54的方法，其中在施用所述疫苗或免疫原性组合物后14和/或28天，在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于200或大于250，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
56.如条目54的方法，其中在施用所述疫苗或免疫原性组合物后14和/或28天，在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于1000或大于2000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
57.如条目37至53中任一项的方法，其中包含10μg剂量的所述疫苗或免疫原性组合物以第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用。
58.如条目57的方法，其中所述初免和加强施用间隔约1至约16周进行。
59.如条目57和58的方法，其中所述第二次(加强)施用在所述第一次(初免)施用后至少28天施用。
60.如条目57至59中任一项的方法，其中在所述疫苗或免疫原性组合物的加强施用后14和/或28天，在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于3000，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
61.如条目57至59中任一项的方法，其中在所述疫苗或免疫原性组合物的加强施用后14和/或28天，在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于3000，或大于5000，或大于10000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
62.如条目37至61中任一项的方法，其中所述受试者来自寨卡病毒流行地区。
63.如条目37至62中任一项的方法，其中所述受试者来自遭受疫情暴发的寨卡病毒流行地区。
64.如条目37至61中任一项的方法，其中所述受试者来自寨卡病毒非流行地区。
65.如条目37至61中任一项的方法，其中所述受试者来自前往流行地区旅行的寨卡病毒非流行地区。
66.如条目37至65中任一项的方法，其中所述受试者是未感染黄病毒的。
67.如条目37至65中任一项的方法，其中所述受试者是西班牙裔。
68.如条目37至65中任一项的方法，其中所述受试者是拉丁裔。
69.如条目37至65中任一项的方法，其中所述受试者是美洲印第安人。
70.如条目37至65中任一项的方法，其中所述受试者是阿拉斯加原住民。
71.如条目37至65中任一项的方法，其中所述受试者是亚洲人。
72.如条目37至65中任一项的方法，其中所述受试者是黑人或非裔美国人。
73.如条目37至65中任一项的方法，其中所述受试者是夏威夷原住民。
74.如条目37至65中任一项的方法，其中所述受试者是白人。
75.如条目37至74中任一项的方法，其中所述受试者的年龄是18至29岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
76.如条目37至74中任一项的方法，其中所述受试者的年龄是30至49岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
77.如条目1至36中任一项的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于如条目37至76中任一项的方法中。
78.如条目1至36中任一项的疫苗或免疫原性组合物在制造用于如条目37至76中任一项的方法的药物中的用途。
79.如条目32的疫苗或免疫原性组合物，其中所述蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是从与包含寨卡病毒群体的接种物接触的细胞进行蚀斑纯化的。
80.如条目79的疫苗或免疫原性组合物，其中所述细胞是非人类细胞。
81.如条目79或条目80的疫苗或免疫原性组合物，其中所述细胞是昆虫细胞。
82.如条目81的疫苗或免疫原性组合物，其中所述昆虫细胞是蚊子细胞。
83.如条目79或条目80的疫苗或免疫原性组合物，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
84.如条目83的疫苗或免疫原性组合物，其中所述哺乳动物细胞是猴细胞。
85.如条目84的疫苗或免疫原性组合物，其中所述猴细胞是来自Vero细胞系。
86.如条目85的疫苗或免疫原性组合物，其中所述Vero细胞系是WHO Vero 10-87细胞系。
87.如条目79至85中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒群体是异质的。
88.如条目79至86中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒群体包含寨卡病毒临床分离株。
89.如条目88的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒临床分离株是来自毒株PRVABC59。
90.如条目79至86中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒群体包含先前在细胞培养中传代一次或多次的寨卡病毒。
91.如条目79至89中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述接种物包含人类血清。
92.如条目79至90中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述接种物包含一种或多种外来因子。
93.如条目91的疫苗或免疫原性组合物，其中所述蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株基本上不含所述一种或多种外来因子。
94.如条目79至92中任一项的疫苗或免疫原性组合物，其中所述蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株是同质遗传群体。
95.一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于300，或大于500，或大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于3000，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
96.一种在有需要的受试者群体中诱导免疫应答的方法，所述方法包括对所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的受试者群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于300，或大于500，或大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于3000，或大于5000，或大于10,000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
97.一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的血清转换率为100％。
98.一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以单剂或初免施用的形式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述单剂或初免施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于10，或大于50，或大于100，或大于200，或大于250，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
99.一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以单剂或初免施用的形式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述单剂或初免施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于300，或大于500，或大于1000，或大于2000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
100.一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以单剂或初免施用的形式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述单剂或初免施用后14和/或28天在至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的血清转换率为60％、70％、80％或90％。
101.如条目95至100中任一项的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的抗原，其中所述抗原是灭活全病毒。
102.如条目100或101的方法，其中所述寨卡病毒包含至少一个非人类细胞适应突变。
103.如条目101或102的方法，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQID NO:1的第98位相对应的位置处具有突变。
104.如条目101至103中任一项的方法，其中所述抗原是纯化的。
105.如条目104的方法，其中在尺寸排阻色谱法中的纯化抗原的主峰占所述尺寸排阻色谱法中的曲线下总面积的85％以上。
106.如条目101至105的方法，其中所述抗原是可从如下方法获得的灭活全病毒，其中在约15℃至约37℃范围的温度下用约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量的福尔马林处理所述寨卡病毒5至15天。
107.如条目100至106中任一项的方法，其中所述受试者来自寨卡病毒流行地区。
108.如条目107所述的方法，其中所述受试者来自遭受疫情暴发的寨卡病毒流行地区。
109.如条目100至106中任一项的方法，其中所述受试者来自寨卡病毒非流行地区。
110.如条目109的方法，其中所述受试者来自前往流行地区旅行的寨卡病毒非流行地区。
111.如条目100至110中任一项的方法，其中所述受试者是未感染黄病毒的。
112.如条目100至111中任一项的方法，其中所述受试者的年龄是18至29岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
113.如条目100至111中任一项的方法，其中所述受试者的年龄是30至49岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
114.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于300，或大于500，或大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于3000，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
115.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中诱导免疫应答的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的受试者群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于300，或大于500，或大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于3000，或大于5000，或大于10,000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
116.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的血清转换率为100％。
117.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以单剂或初免施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述单剂或初免施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于10，或大于50，或大于100，或大于200，或大于250，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
118.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以单剂或初免施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述单剂或初免施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于300，或大于500，或大于1000，或大于2000，如通过报告病毒颗粒中和测定(RVP)所确定。
119.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以单剂或初免施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述单剂或初免施用后14和/或28天在至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的血清转换率为60％、70％、80％或90％。
120.如条目114至119中任一项使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的抗原，其中所述抗原是灭活全病毒。
121.如条目120使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒包含至少一个非人类细胞适应突变。
122.如条目120或121使用的疫苗或免疫原性组合物，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有突变。
123.如条目120至122使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述抗原是纯化的。
124.如条目123使用的疫苗或免疫原性组合物，其中尺寸排阻色谱法中的纯化抗原的主峰占所述尺寸排阻色谱法中的曲线下总面积的85％以上。
125.如条目120至124使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述抗原是可从如下方法获得的灭活全病毒，其中在约15℃至约37℃范围的温度下用约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量的福尔马林处理所述寨卡病毒5至15天。
126.如条目114至125中任一项使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自寨卡病毒流行地区。
127.如条目126使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自遭受疫情暴发的寨卡病毒流行地区。
128.如条目114至125中任一项使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自寨卡病毒非流行地区。
129.如条目128使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自前往流行地区旅行的寨卡病毒非流行地区。
130.如条目114至129中任一项使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者是未感染黄病毒的和/或寨卡病毒血清阴性的。
131.如条目114至130中任一项使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者的年龄是18至29岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
132.如条目114至130中任一项使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者的年龄是30至49岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
133.一种在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度是在所述初免施用后28天诱导的几何平均中和抗体滴度的至少10倍，或至少15倍，或至少20倍，或至少25倍，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
134.如条目133的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的抗原，其中所述抗原是灭活全病毒。
135.如条目133或134的方法，其中所述寨卡病毒包含至少一个非人类细胞适应突变。
136.如条目133或134的方法，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQID NO:1的第98位相对应的位置处具有突变。
137.如条目133至136中任一项的方法，其中所述抗原是纯化的。
138.如条目137的方法，其中尺寸排阻色谱法中的纯化抗原的主峰占所述尺寸排阻色谱法中的曲线下总面积的85％以上。
139.如条目133至138的方法，其中所述抗原是可从如下方法获得的灭活全病毒，其中在约15℃至约37℃范围的温度下用约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量的福尔马林处理所述寨卡病毒5至15天。
140.如条目134至139中任一项的方法，其中所述受试者来自寨卡病毒流行地区。
141.如条目140的方法，其中所述受试者来自遭受疫情暴发的寨卡病毒流行地区。
142.如条目133至139中任一项的方法，其中所述受试者来自寨卡病毒非流行地区。
143.如条目142的方法，其中所述受试者来自前往流行地区旅行的寨卡病毒非流行地区。
144.如条目133至143中任一项的方法，其中所述受试者是未感染黄病毒的。
145.如条目133至144中任一项的方法，其中所述受试者的年龄是18至29岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
146.如条目133至144中任一项的方法，其中所述受试者的年龄是30至49岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
147.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度是在所述初免施用28天诱导的几何平均中和抗体滴度的至少10倍，或至少15倍，或至少20倍，或至少25倍，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
148.如条目147使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的抗原，其中所述抗原是灭活全病毒。
149.如条目147或148使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒包含至少一个非人类细胞适应突变。
150.如条目147或148使用的疫苗或免疫原性组合物，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有突变。
151.如条目147至150使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述抗原是纯化的。
152.如条目151使用的疫苗或免疫原性组合物，其中尺寸排阻色谱法中的纯化抗原的主峰占所述尺寸排阻色谱法中的曲线下总面积的85％以上。
153.如条目148至152使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述抗原是可从如下方法获得的灭活全病毒，其中在约15℃至约37℃范围的温度下用约0.001％v/v至约3.0％v/v范围的量的福尔马林处理所述寨卡病毒5至15天。
154.如条目147至153中任一项使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自寨卡病毒流行地区。
155.如条目154使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自遭受疫情暴发的寨卡病毒流行地区。
156.如条目147至153中任一项使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自寨卡病毒非流行地区。
157.如条目156使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自前往流行地区旅行的寨卡病毒非流行地区。
158.如条目147至157中任一项使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者是未感染黄病毒的和/或寨卡病毒血清阴性的。
159.如条目147至157中任一项使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者的年龄是18至29岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
160.如条目147至157中任一项使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者的年龄是30至49岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
序列表
<110> 武田疫苗股份有限公司
美利坚合众国, 由健康及人类服务 部部长代表
<120> 寨卡疫苗和免疫原性组合物及其使用方法
<130> T08289WO3
<150> US 62/581500
<151> 2017-11-03
<150> US 62/592995
<151> 2017-11-30
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 351
<212> PRT
<213> 寨卡病毒(Zika virus)
<400> 1
Asp Val Gly Cys Ser Val Asp Phe Ser Lys Lys Glu Thr Arg Cys Gly
1 5 10 15
Thr Gly Val Phe Val Tyr Asn Asp Val Glu Ala Trp Arg Asp Arg Tyr
20 25 30
Lys Tyr His Pro Asp Ser Pro Arg Arg Leu Ala Ala Ala Val Lys Gln
35 40 45
Ala Trp Glu Asp Gly Ile Cys Gly Ile Ser Ser Val Ser Arg Met Glu
50 55 60
Asn Ile Met Trp Arg Ser Val Glu Gly Glu Leu Asn Ala Ile Leu Glu
65 70 75 80
Glu Asn Gly Val Gln Leu Thr Val Val Val Gly Ser Val Lys Asn Pro
85 90 95
Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro Val Asn Glu Leu Pro
100 105 110
His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys Ser Tyr Phe Val Arg Ala Ala Lys
115 120 125
Thr Asn Asn Ser Phe Val Val Asp Gly Asp Thr Leu Lys Glu Cys Pro
130 135 140
Leu Lys His Arg Ala Trp Asn Ser Phe Leu Val Glu Asp His Gly Phe
145 150 155 160
Gly Val Phe His Thr Ser Val Trp Leu Lys Val Arg Glu Asp Tyr Ser
165 170 175
Leu Glu Cys Asp Pro Ala Val Ile Gly Thr Ala Val Lys Gly Lys Glu
180 185 190
Ala Val His Ser Asp Leu Gly Tyr Trp Ile Glu Ser Glu Lys Asn Asp
195 200 205
Thr Trp Arg Leu Lys Arg Ala His Leu Ile Glu Met Lys Thr Cys Glu
210 215 220
Trp Pro Lys Ser His Thr Leu Trp Thr Asp Gly Ile Glu Glu Ser Asp
225 230 235 240
Leu Ile Ile Pro Lys Ser Leu Ala Gly Pro Leu Ser His His Asn Thr
245 250 255
Arg Glu Gly Tyr Arg Thr Gln Met Lys Gly Pro Trp His Ser Glu Glu
260 265 270
Leu Glu Ile Arg Phe Glu Glu Cys Pro Gly Thr Lys Val His Val Glu
275 280 285
Glu Thr Cys Gly Thr Arg Gly Pro Ser Leu Arg Ser Thr Thr Ala Ser
290 295 300
Gly Arg Val Ile Glu Glu Trp Cys Cys Arg Glu Cys Thr Met Pro Pro
305 310 315 320
Leu Ser Phe Arg Ala Lys Asp Gly Cys Trp Tyr Gly Met Glu Ile Arg
325 330 335
Pro Arg Lys Glu Pro Glu Ser Asn Leu Val Arg Ser Met Val Thr
340 345 350
<210> 2
<211> 10675
<212> DNA
<213> 寨卡病毒(Zika virus)
<400> 2
gttgttgatc tgtgtgaatc agactgcgac agttcgagtt tgaagcgaaa gctagcaaca 60
gtatcaacag gttttatttt ggatttggaa acgagagttt ctggtcatga aaaacccaaa 120
aaagaaatcc ggaggattcc ggattgtcaa tatgctaaaa cgcggagtag cccgtgtgag 180
cccctttggg ggcttgaaga ggctgccagc cggacttctg ctgggtcatg ggcccatcag 240
gatggtcttg gcgattctag cctttttgag attcacggca atcaagccat cactgggtct 300
catcaataga tggggttcag tggggaaaaa agaggctatg gaaacaataa agaagttcaa 360
gaaagatctg gctgccatgc tgagaataat caatgctagg aaggagaaga agagacgagg 420
cgcagatact agtgtcggaa ttgttggcct cctgctgacc acagctatgg cagcggaggt 480
cactagacgt gggagtgcat actatatgta cttggacaga aacgatgctg gggaggccat 540
atcttttcca accacattgg ggatgaataa gtgttatata cagatcatgg atcttggaca 600
catgtgtgat gccaccatga gctatgaatg ccctatgctg gatgaggggg tggaaccaga 660
tgacgtcgat tgttggtgca acacgacgtc aacttgggtt gtgtacggaa cctgccatca 720
caaaaaaggt gaagcacgga gatctagaag agctgtgacg ctcccctccc attccaccag 780
gaagctgcaa acgcggtcgc aaacctggtt ggaatcaaga gaatacacaa agcacttgat 840
tagagtcgaa aattggatat tcaggaaccc tggcttcgcg ttagcagcag ctgccatcgc 900
ttggcttttg ggaagctcaa cgagccaaaa agtcatatac ttggtcatga tactgctgat 960
tgccccggca tacagcatca ggtgcatagg agtcagcaat agggactttg tggaaggtat 1020
gtcaggtggg acttgggttg atgttgtctt ggaacatgga ggttgtgtca ccgtaatggc 1080
acaggacaaa ccgactgtcg acatagagct ggttacaaca acagtcagca acatggcgga 1140
ggtaagatcc tactgctatg aggcatcaat atcagacatg gcttctgaca gccgctgccc 1200
aacacaaggt gaagcctacc ttgacaagca atcagacact caatatgtct gcaaaagaac 1260
gttagtggac agaggctggg gaaatggatg tggacttttt ggcaaaggga gcctggtgac 1320
atgcgctaag tttgcatgct ccaagaaaat gaccgggaag agcatccagc cagagaatct 1380
ggagtaccgg ataatgctgt cagttcatgg ctcccagcac agtgggatga tcgttaatga 1440
cacaggacat gaaactgatg agaatagagc gaaagttgag ataacgccca attcaccgag 1500
agccgaagcc accctggggg gttttggaag cctaggactt gattgtgaac cgaggacagg 1560
ccttgacttt tcagatttgt attacttgac tatgaataac aagcactggt tggttcacaa 1620
ggagtggttc cacgacattc cattaccttg gcacgctggg gcagacaccg gaactccaca 1680
ctggaacaac aaagaagcac tggtagagtt caaggacgca catgccaaaa ggcaaactgt 1740
cgtggttcta gggagtcaag aaggagcagt tcacacggcc cttgctggag ctctggaggc 1800
tgagatggat ggtgcaaagg gaaggctgtc ctctggccac ttgaaatgtc gcctgaaaat 1860
ggataaactt agattgaagg gcgtgtcata ctccttgtgt actgcagcgt tcacattcac 1920
caagatcccg gctgaaacac tgcacgggac agtcacagtg gaggtacagt acgcagggac 1980
agatggacct tgcaaggttc cagctcagat ggcggtggac atgcaaactc tgaccccagt 2040
tgggaggttg ataaccgcta accccgtaat cactgaaagc actgagaact ctaagatgat 2100
gctggaactt gatccaccat ttggggactc ttacattgtc ataggagtcg gggagaagaa 2160
gatcacccac cactggcaca ggagtggcag caccattgga aaagcatttg aagccactgt 2220
gagaggtgcc aagagaatgg cagtcttggg agacacagcc tgggactttg gatcagttgg 2280
aggcgctctc aactcattgg gcaagggcat ccatcaaatt tttggagcag ctttcaaatc 2340
attgtttgga ggaatgtcct ggttctcaca aattctcatt ggaacgttgc tgatgtggtt 2400
gggtctgaac acaaagaatg gatctatttc ccttatgtgc ttggccttag ggggagtgtt 2460
gatcttctta tccacagccg tctctgctga tgtggggtgc tcggtggact tctcaaagaa 2520
ggagacgaga tgcggtacag gggtgttcgt ctataacgac gttgaagcct ggagggacag 2580
gtacaagtac catcctgact ccccccgtag attggcagca gcagtcaagc aagcctggga 2640
agatggtatc tgcgggatct cctctgtttc aagaatggaa aacatcatgt ggagatcagt 2700
agaaggggag ctcaacgcaa tcctggaaga gaatggagtt caactgacgg tcgttgtggg 2760
atctgtaaaa aaccccatgt ggagaggtcc acagagattg cccgtgcctg tgaacgagct 2820
gccccacggc tggaaggctt gggggaaatc gtatttcgtc agagcagcaa agacaaataa 2880
cagctttgtc gtggatggtg acacactgaa ggaatgccca ctcaaacata gagcatggaa 2940
cagctttctt gtggaggatc atgggttcgg ggtatttcac actagtgtct ggctcaaggt 3000
tagagaagat tattcattag agtgtgatcc agccgttatt ggaacagctg ttaagggaaa 3060
ggaggctgta cacagtgatc taggctactg gattgagagt gagaagaatg acacatggag 3120
gctgaagagg gcccatctga tcgagatgaa aacatgtgaa tggccaaagt cccacacatt 3180
gtggacagat ggaatagaag agagtgatct gatcataccc aagtctttag ctgggccact 3240
cagccatcac aataccagag agggctacag gacccaaatg aaagggccat ggcacagtga 3300
agagcttgaa attcggtttg aggaatgccc aggcactaag gtccacgtgg aggaaacatg 3360
tggaacaaga ggaccatctc tgagatcaac cactgcaagc ggaagggtga tcgaggaatg 3420
gtgctgcagg gagtgcacaa tgcccccact gtcgttccgg gctaaagatg gctgttggta 3480
tggaatggag ataaggccca ggaaagaacc agaaagcaac ttagtaaggt caatggtgac 3540
tgcaggatca actgatcaca tggaccactt ctcccttgga gtgcttgtga tcctgctcat 3600
ggtgcaggaa gggctgaaga agagaatgac cacaaagatc atcataagca catcaatggc 3660
agtgctggta gctatgatcc tgggaggatt ttcaatgagt gacctggcta agcttgcaat 3720
tttgatgggt gccaccttcg cggaaatgaa cactggagga gatgtagctc atctggcgct 3780
gatagcggca ttcaaagtca gaccagcgtt gctggtatct ttcatcttca gagctaattg 3840
gacaccccgt gaaagcatgc tgctggcctt ggcctcgtgt cttttgcaaa ctgcgatctc 3900
cgccttggaa ggcgacctga tggttctcat caatggtttt gctttggcct ggttggcaat 3960
acgagcgatg gttgttccac gcactgataa catcaccttg gcaatcctgg ctgctctgac 4020
accactggcc cggggcacac tgcttgtggc gtggagagca ggccttgcta cttgcggggg 4080
gtttatgctc ctctctctga agggaaaagg cagtgtgaag aagaacttac catttgtcat 4140
ggccctggga ctaaccgctg tgaggctggt cgaccccatc aacgtggtgg gactgctgtt 4200
gctcacaagg agtgggaagc ggagctggcc ccctagcgaa gtactcacag ctgttggcct 4260
gatatgcgca ttggctggag ggttcgccaa ggcagatata gagatggctg ggcccatggc 4320
cgcggtcggt ctgctaattg tcagttacgt ggtctcagga aagagtgtgg acatgtacat 4380
tgaaagagca ggtgacatca catgggaaaa agatgcggaa gtcactggaa acagtccccg 4440
gctcgatgtg gcgctagatg agagtggtga tttctccctg gtggaggatg acggtccccc 4500
catgagagag atcatactca aggtggtcct gatgaccatc tgtggcatga acccaatagc 4560
catacccttt gcagctggag cgtggtacgt atacgtgaag actggaaaaa ggagtggtgc 4620
tctatgggat gtgcctgctc ccaaggaagt aaaaaagggg gagaccacag atggagtgta 4680
cagagtaatg actcgtagac tgctaggttc aacacaagtt ggagtgggag ttatgcaaga 4740
gggggtcttt cacactatgt ggcacgtcac aaaaggatcc gcgctgagaa gcggtgaagg 4800
gagacttgat ccatactggg gagatgtcaa gcaggatctg gtgtcatact gtggtccatg 4860
gaagctagat gccgcctggg atgggcacag cgaggtgcag ctcttggccg tgccccccgg 4920
agagagagcg aggaacatcc agactctgcc cggaatattt aagacaaagg atggggacat 4980
tggagcggtt gcgctggatt acccagcagg aacttcagga tctccaatcc tagacaagtg 5040
tgggagagtg ataggacttt atggcaatgg ggtcgtgatc aaaaacggga gttatgttag 5100
tgccatcacc caagggagga gggaggaaga gactcctgtt gagtgcttcg agccctcgat 5160
gctgaagaag aagcagctaa ctgtcttaga cttgcatcct ggagctggga aaaccaggag 5220
agttcttcct gaaatagtcc gtgaagccat aaaaacaaga ctccgtactg tgatcttagc 5280
tccaaccagg gttgtcgctg ctgaaatgga ggaggccctt agagggcttc cagtgcgtta 5340
tatgacaaca gcagtcaatg tcacccactc tggaacagaa atcgtcgact taatgtgcca 5400
tgccaccttc acttcacgtc tactacagcc aatcagagtc cccaactata atctgtatat 5460
tatggatgag gcccacttca cagatccctc aagtatagca gcaagaggat acatttcaac 5520
aagggttgag atgggcgagg cggctgccat cttcatgacc gccacgccac caggaacccg 5580
tgacgcattt ccggactcca actcaccaat tatggacacc gaagtggaag tcccagagag 5640
agcctggagc tcaggctttg attgggtgac ggatcattct ggaaaaacag tttggtttgt 5700
tccaagcgtg aggaacggca atgagatcgc agcttgtctg acaaaggctg gaaaacgggt 5760
catacagctc agcagaaaga cttttgagac agagttccag aaaacaaaac atcaagagtg 5820
ggactttgtc gtgacaactg acatttcaga gatgggcgcc aactttaaag ctgaccgtgt 5880
catagattcc aggagatgcc taaagccggt catacttgat ggcgagagag tcattctggc 5940
tggacccatg cctgtcacac atgccagcgc tgcccagagg agggggcgca taggcaggaa 6000
tcccaacaaa cctggagatg agtatctgta tggaggtggg tgcgcagaga ctgacgaaga 6060
ccatgcacac tggcttgaag caagaatgct ccttgacaat atttacctcc aagatggcct 6120
catagcctcg ctctatcgac ctgaggccga caaagtagca gccattgagg gagagttcaa 6180
gcttaggacg gagcaaagga agacctttgt ggaactcatg aaaagaggag atcttcctgt 6240
ttggctggcc tatcaggttg catctgccgg aataacctac acagatagaa gatggtgctt 6300
tgatggcacg accaacaaca ccataatgga agacagtgtg ccggcagagg tgtggaccag 6360
acacggagag aaaagagtgc tcaaaccgag gtggatggac gccagagttt gttcagatca 6420
tgcggccctg aagtcattca aggagtttgc cgctgggaaa agaggagcgg cttttggagt 6480
gatggaagcc ctgggaacac tgccaggaca catgacagag agattccagg aagccattga 6540
caacctcgct gtgctcatgc gggcagagac tggaagcagg ccttacaaag ccgcggcggc 6600
ccaattgccg gagaccctag agaccataat gcttttgggg ttgctgggaa cagtctcgct 6660
gggaatcttc ttcgtcttga tgaggaacaa gggcataggg aagatgggct ttggaatggt 6720
gactcttggg gccagcgcat ggctcatgtg gctctcggaa attgagccag ccagaattgc 6780
atgtgtcctc attgttgtgt tcctattgct ggtggtgctc atacctgagc cagaaaagca 6840
aagatctccc caggacaacc aaatggcaat catcatcatg gtagcagtag gtcttctggg 6900
cttgattacc gccaatgaac tcggatggtt ggagagaaca aagagtgacc taagccatct 6960
aatgggaagg agagaggagg gggcaaccat aggattctca atggacattg acctgcggcc 7020
agcctcagct tgggccatct atgctgcctt gacaactttc attaccccag ccgtccaaca 7080
tgcagtgacc acctcataca acaactactc cttaatggcg atggccacgc aagctggagt 7140
gttgtttggc atgggcaaag ggatgccatt ctacgcatgg gactttggag tcccgctgct 7200
aatgataggt tgctactcac aattaacacc cctgacccta atagtggcca tcattttgct 7260
cgtggcgcac tacatgtact tgatcccagg gctgcaggca gcagctgcgc gtgctgccca 7320
gaagagaacg gcagctggca tcatgaagaa ccctgttgtg gatggaatag tggtgactga 7380
cattgacaca atgacaattg acccccaagt ggagaaaaag atgggacagg tgctactcat 7440
agcagtagcc gtctccagcg ccatactgtc gcggaccgcc tgggggtggg gggaggctgg 7500
ggctctgatc acagccgcaa cttccacttt gtgggaaggc tctccgaaca agtactggaa 7560
ctcctctaca gccacttcac tgtgtaacat ttttagggga agttacttgg ctggagcttc 7620
tctaatctac acagtaacaa gaaacgctgg cttggtcaag agacgtgggg gtggaacagg 7680
agagaccctg ggagagaaat ggaaggcccg cttgaaccag atgtcggccc tggagttcta 7740
ctcctacaaa aagtcaggca tcaccgaggt gtgcagagaa gaggcccgcc gcgccctcaa 7800
ggacggtgtg gcaacgggag gccatgctgt gtcccgagga agtgcaaagc tgagatggtt 7860
ggtggagcgg ggatacctgc agccctatgg aaaggtcatt gatcttggat gtggcagagg 7920
gggctggagt tactacgtcg ccaccatccg caaagttcaa gaagtgaaag gatacacaaa 7980
aggaggccct ggtcatgaag aacccgtgtt ggtgcaaagc tatgggtgga acatagtccg 8040
tcttaagagt ggggtggacg tctttcatat ggcggctgag ccgtgtgaca cgttgctgtg 8100
tgacataggt gagtcatcat ctagtcctga agtggaagaa gcacggacgc tcagagtcct 8160
ctccatggtg ggggattggc ttgaaaaaag accaggagcc ttttgtataa aagtgttgtg 8220
cccatacacc agcactatga tggaaaccct ggagcgactg cagcgtaggt atgggggagg 8280
actggtcaga gtgccactct cccgcaactc tacacatgag atgtactggg tctctggagc 8340
gaaaagcaac accataaaaa gtgtgtccac cacgagccag ctcctcttgg ggcgcatgga 8400
cgggcctagg aggccagtga aatatgagga ggatgtgaat ctcggctctg gcacgcgggc 8460
tgtggtaagc tgcgctgaag ctcccaacat gaagatcatt ggtaaccgca ttgaaaggat 8520
ccgcagtgag cacgcggaaa cgtggttctt tgacgagaac cacccatata ggacatgggc 8580
ttaccatgga agctatgagg cccccacaca agggtcagcg tcctctctaa taaacggggt 8640
tgtcaggctc ctgtcaaaac cctgggatgt ggtgactgga gtcacaggaa tagccatgac 8700
cgacaccaca ccgtatggtc agcaaagagt tttcaaggaa aaagtggaca ctagggtgcc 8760
agacccccaa gaaggcactc gtcaggttat gagcatggtc tcttcctggt tgtggaaaga 8820
gctaggcaaa cacaaacggc cacgagtctg caccaaagaa gagttcatca acaaggttcg 8880
tagcaatgca gcattagggg caatatttga agaggaaaaa gagtggaaga ctgcagtgga 8940
agctgtgaac gatccaaggt tctgggctct agtggacaag gaaagagagc accacctgag 9000
aggagagtgc cagagctgtg tgtacaacat gatgggaaaa agagaaaaga aacaagggga 9060
atttggaaag gccaagggca gccgcgccat ctggtatatg tggctagggg ctagatttct 9120
agagttcgaa gcccttggat tcttgaacga ggatcactgg atggggagag agaactcagg 9180
aggtggtgtt gaagggctgg gattacaaag actcggatat gtcctagaag agatgagtcg 9240
tataccagga ggaaggatgt atgcagatga cactgctggc tgggacaccc gcattagcag 9300
gtttgatctg gagaatgaag ctctaatcac caaccaaatg gagaaagggc acagggcctt 9360
ggcattggcc ataatcaagt acacatacca aaacaaagtg gtaaaggtcc ttagaccagc 9420
tgaaaaaggg aaaacagtta tggacattat ttcgagacaa gaccaaaggg ggagcggaca 9480
agttgtcact tacgctctta acacatttac caacctagtg gtgcaactca ttcggaatat 9540
ggaggctgag gaagttctag agatgcaaga cttgtggctg ctgcggaggt cagagaaagt 9600
gaccaactgg ttgcagagca acggatggga taggctcaaa cgaatggcag tcagtggaga 9660
tgattgcgtt gtgaagccaa ttgatgatag gtttgcacat gccctcaggt tcttgaatga 9720
tatgggaaaa gttaggaagg acacacaaga gtggaaaccc tcaactggat gggacaactg 9780
ggaagaagtt ccgttttgct cccaccactt caacaagctc catctcaagg acgggaggtc 9840
cattgtggtt ccctgccgcc accaagatga actgattggc cgggcccgcg tctctccagg 9900
ggcgggatgg agcatccggg agactgcttg cctagcaaaa tcatatgcgc aaatgtggca 9960
gctcctttat ttccacagaa gggacctccg actgatggcc aatgccattt gttcatctgt 10020
gccagttgac tgggttccaa ctgggagaac tacctggtca atccatggaa agggagaatg 10080
gatgaccact gaagacatgc ttgtggtgtg gaacagagtg tggattgagg agaacgacca 10140
catggaagac aagaccccag ttacgaaatg gacagacatt ccctatttgg gaaaaaggga 10200
agacttgtgg tgtggatctc tcatagggca cagaccgcgc accacctggg ctgagaacat 10260
taaaaacaca gtcaacatgg tgcgcaggat cataggtgat gaagaaaagt acatggacta 10320
cctatccacc caagttcgct acttgggtga agaagggtct acacctggag tgctgtaagc 10380
accaatctta atgttgtcag gcctgctagt cagccacagc ttggggaaag ctgtgcagcc 10440
tgtgaccccc ccaggagaag ctgggaaacc aagcctatag tcaggccgag aacgccatgg 10500
cacggaagaa gccatgctgc ctgtgagccc ctcagaggac actgagtcaa aaaaccccac 10560
gcgcttggag gcgcaggatg ggaaaagaag gtggcgacct tccccaccct tcaatctggg 10620
gcctgaactg gagatcagct gtggatctcc agaagaggga ctagtggtta gagga 10675
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> 寡核苷酸1 (CpG 1826)
<400> 3
tccatgacgt tcctgacgtt 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> 寡核苷酸2 (CpG 1758)
<400> 4
tctcccagcg tgcgccat 18
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> 寡核苷酸3
<400> 5
accgatgacg tcgccggtga cggcaccacg 30
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> 寡核苷酸4 (CpG 2006)
<400> 6
tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工(artificial)
<220>
<223> 寡核苷酸5 (CpG 1668)
<400> 7
tccatgacgt tcctgatgct 20
<210> 8
<211> 31
<212> PRT
<213> 寨卡病毒(Zika virus)
<400> 8
Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu
1 5 10 15
Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln
20 25 30
<210> 9
<211> 31
<212> PRT
<213> 寨卡病毒(Zika virus)
<400> 9
Phe Thr Lys Ile Pro Ala Glu Thr Leu His Gly Thr Val Thr Val Glu
1 5 10 15
Val Gln Tyr Ala Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ala Gln
20 25 30
<210> 10
<211> 31
<212> PRT
<213> 西尼罗病毒(West Nile Virus)
<400> 10
Phe Leu Gly Thr Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Leu Glu
1 5 10 15
Leu Gln Tyr Thr Gly Thr Asp Gly Pro Cys Lys Val Pro Ile Ser
20 25 30
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> 日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)
<400> 11
Phe Ala Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Ile Glu
1 5 10 15
Leu Thr Tyr Ser Gly Ser Asp Gly Pro Cys Lys Ile Pro Ile Val
20 25 30
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> 圣路易斯脑炎病毒(Saint Louis Encephalitis Virus)
<400> 12
Phe Ser Lys Asn Pro Ala Asp Thr Gly His Gly Thr Val Ile Val Glu
1 5 10 15
Leu Gln Tyr Thr Gly Ser Asn Gly Pro Cys Arg Val Pro Ile Ser
20 25 30
<210> 13
<211> 30
<212> PRT
<213> 黄热病病毒(Yellow Fever Virus)
<400> 13
Phe Val Lys Asn Pro Thr Asp Thr Gly His Gly Thr Val Val Met Gln
1 5 10 15
Val Lys Val Ser Lys Gly Ala Pro Cys Arg Ile Pro Val Ile
20 25 30
<210> 14
<211> 31
<212> PRT
<213> 登革热病毒(Dengue virus)
<400> 14
Leu Glu Lys Glu Val Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Val Leu Val Gln
1 5 10 15
Val Lys Tyr Glu Gly Thr Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser
20 25 30
<210> 15
<211> 31
<212> PRT
<213> 登革热病毒(Dengue virus)
<400> 15
Val Val Lys Glu Ile Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Val Ile Arg
1 5 10 15
Val Gln Tyr Glu Gly Asp Gly Ser Pro Cys Lys Ile Pro Phe Glu
20 25 30
<210> 16
<211> 31
<212> PRT
<213> 登革热病毒(Dengue virus)
<400> 16
Leu Lys Lys Glu Val Ser Glu Thr Gln His Gly Thr Ile Leu Ile Lys
1 5 10 15
Val Glu Tyr Lys Gly Glu Asp Ala Pro Cys Lys Ile Pro Phe Ser
20 25 30
<210> 17
<211> 31
<212> PRT
<213> 登革热病毒(Dengue virus)
<400> 17
Ile Asp Lys Glu Met Ala Glu Thr Gln His Gly Thr Thr Val Val Lys
1 5 10 15
Val Lys Tyr Glu Gly Ala Gly Ala Pro Cys Lys Val Pro Ile Glu
20 25 30
<210> 18
<211> 29
<212> PRT
<213> 寨卡病毒(Zika virus)
<400> 18
Ser Val Lys Asn Pro Met Gly Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro
1 5 10 15
Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys
20 25
<210> 19
<211> 29
<212> PRT
<213> 寨卡病毒(Zika virus)
<400> 19
Ser Val Lys Asn Pro Met Trp Arg Gly Pro Gln Arg Leu Pro Val Pro
1 5 10 15
Val Asn Glu Leu Pro His Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys
20 25
<210> 20
<211> 29
<212> PRT
<213> 西尼罗病毒(West Nile Virus)
<400> 20
Lys Gln Glu Gly Met Tyr Lys Ser Ala Pro Lys Arg Leu Thr Ala Thr
1 5 10 15
Thr Glu Lys Leu Glu Ile Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys
20 25
<210> 21
<211> 29
<212> PRT
<213> 日本脑炎病毒(Japanese Encephalitis Virus)
<400> 21
Lys Pro Val Gly Arg Tyr Arg Ser Ala Pro Lys Arg Leu Ser Met Thr
1 5 10 15
Gln Glu Lys Phe Glu Met Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys
20 25
<210> 22
<211> 29
<212> PRT
<213> 圣路易斯脑炎病毒(Saint Louis Encephalitis Virus)
<400> 22
Glu Asp Pro Lys Tyr Tyr Lys Arg Ala Pro Arg Arg Leu Lys Lys Leu
1 5 10 15
Glu Asp Glu Leu Asn Tyr Gly Trp Lys Ala Trp Gly Lys
20 25
<210> 23
<211> 29
<212> PRT
<213> 黄热病病毒(Yellow Fever Virus)
<400> 23
Asp Pro Lys Asn Val Tyr Gln Arg Gly Thr His Pro Phe Ser Arg Ile
1 5 10 15
Arg Asp Gly Leu Gln Tyr Gly Trp Lys Thr Trp Gly Lys
20 25
<210> 24
<211> 29
<212> PRT
<213> 登革热病毒(Dengue virus)
<400> 24
Asp Val Ser Gly Ile Leu Ala Gln Gly Lys Lys Met Ile Arg Pro Gln
1 5 10 15
Pro Met Glu His Lys Tyr Ser Trp Lys Ser Trp Gly Lys
20 25
<210> 25
<211> 29
<212> PRT
<213> 登革热病毒(Dengue virus)
<400> 25
Asp Ile Lys Gly Ile Met Gln Ala Gly Lys Arg Ser Leu Arg Pro Gln
1 5 10 15
Pro Thr Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys
20 25
<210> 26
<211> 29
<212> PRT
<213> 登革热病毒(Dengue virus)
<400> 26
Asp Ile Thr Gly Val Leu Glu Gln Gly Lys Arg Thr Leu Thr Pro Gln
1 5 10 15
Pro Met Glu Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys
20 25
<210> 27
<211> 29
<212> PRT
<213> 登革热病毒(Dengue virus)
<400> 27
Asp Val Lys Gly Val Leu Thr Lys Gly Lys Arg Ala Leu Thr Pro Pro
1 5 10 15
Val Asn Asp Leu Lys Tyr Ser Trp Lys Thr Trp Gly Lys
20 25

Claims (54)

1.一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的来自寨卡病毒的一种抗原，其中所述抗原是灭活全病毒。
2.如权利要求1所述的疫苗或免疫原性组合物，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有突变。
3.如权利要求1或2所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述抗原是纯化的。
4.如权利要求3所述的疫苗或免疫原性组合物，其中在尺寸排阻色谱法中的所述纯化抗原的主峰占所述尺寸排阻色谱法中的曲线下总面积的85％以上。
5.如权利要求1至5中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为约2μg的纯化的灭活全病毒。
6.如权利要求1至5中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为约5μg的纯化的灭活全病毒。
7.如权利要求1至5中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为约10μg的纯化的灭活全病毒。
8.如权利要求1至7中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述至少一个适应突变或突变是Trp98Gly突变。
9.如权利要求1至8所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述寨卡病毒是来自病毒株PRVABC59。
10.如权利要求1至9中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物还包含佐剂。
11.如权利要求10所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝。
12.如权利要求11所述的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含100μg至600μg氢氧化铝，或100μg至300μg氢氧化铝，或150μg至250μg氢氧化铝，或约200μg氢氧化铝。
13.如权利要求1至12中任一项所述的疫苗，其中所述寨卡病毒是克隆分离株，特别是来自蚀斑纯化的克隆寨卡病毒分离株。
14.如权利要求1至13中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物包含
-剂量为约10μg的纯化的灭活全病毒
-约200μg氢氧化铝，
-缓冲剂；以及任选地
-糖如蔗糖。
15.一种在有需要的受试者中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至14中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物。
16.一种在有需要的受试者中诱导针对寨卡抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至14中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物。
17.一种在有需要的胎儿或新生儿中预防寨卡病毒疾病的方法，所述方法包括向怀孕的受试者或打算怀孕的受试者或有生育能力的妇女施用如权利要求1至14中任一项所述的疫苗。
18.一种在有需要的受试者中预防寨卡病毒疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1至14中任一项所述的疫苗。
19.如权利要求15至18中任一项所述的方法，其中所述受试者是怀孕的或打算怀孕的或有生育能力的妇女。
20.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中避免了严重的不良事件。
21.如权利要求15至19中任一项所述的方法，其中避免了39℃以上的发热。
22.如权利要求15至21中任一项所述的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物是通过肌内或皮下施用来施用的。
23.如权利要求15至22中任一项所述的方法，其中所述疫苗或免疫原性组合物被施用一次或多次。
24.如权利要求15至23中任一项所述的方法，其中包含10μg剂量的所述疫苗或免疫原性组合物被施用一次。
25.如权利要求23至24所述的方法，其中在所述疫苗或免疫原性组合物的第一次施用后14和/或28天，在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于200或大于250，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
26.如权利要求15至22中任一项所述的方法，其中包含10μg剂量的所述疫苗或免疫原性组合物是以第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式来施用的。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述初免和加强施用间隔约1至约16周进行。
28.如权利要求26和27所述的方法，其中所述第二次(加强)施用是在所述第一次(初免)施用后至少28天施用的。
29.如权利要求26至28中任一项所述的方法，其中在所述疫苗或免疫原性组合物的所述加强施用后14和/或28天，在受试者中诱导产生的寨卡病毒中和抗体滴度大于1000，或大于1500，或大于2000，或大于3000，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
30.如权利要求15至29中任一项所述的方法，其中所述受试者来自寨卡病毒流行地区，任选地遭受疫情暴发。
31.如权利要求15至29中任一项所述的方法，其中所述受试者来自前往流行地区旅行的寨卡病毒非流行地区。
32.如权利要求15至31中任一项所述的方法，其中所述受试者的年龄是18至29岁，特别是其中所述受试者是女性受试者。
33.如权利要求15至31中任一项所述的方法，其中所述受试者的年龄是30至49岁，特别是其中所述受试者是女性受试者。
34.如权利要求1至14中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于如权利要求15至33中任一项所述的方法中。
35.如权利要求1至14中任一项所述的疫苗或免疫原性组合物用于制造用于如权利要求15至33中任一项所述的方法中的药物的用途。
36.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于1500，或大于2000，或大于3000，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
37.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的血清转换率为100％。
38.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以单剂或初免施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述单剂或初免施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度大于200，或大于250，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
39.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以单剂或初免施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述单剂或初免施用后14和/或28天在至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的血清转换率为60％、70％、80％或90％。
40.如权利要求36至39中任一项所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的所述抗原，其中所述抗原是灭活全病毒。
41.如权利要求40所述使用的疫苗或免疫原性组合物，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有突变。
42.如权利要求40至41所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述抗原是纯化的，并且其中在尺寸排阻色谱法中的所述纯化抗原的主峰占所述尺寸排阻色谱法中的曲线下总面积的85％以上。
43.如权利要求36至42中任一项所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自寨卡病毒流行地区，任选地遭受疫情暴发。
44.如权利要求36至42中任一项所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自前往流行地区旅行的寨卡病毒非流行地区。
45.如权利要求36至44中任一项所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者的年龄是18至29岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
46.如权利要求36至44中任一项所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者的年龄是30至49岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
47.包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗或免疫原性组合物用于在有需要的受试者群体中治疗或预防，特别是预防寨卡病毒感染的方法中，所述方法包括向所述受试者群体的个体受试者施用包含来自寨卡病毒的一种抗原的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物以间隔约1至约16周的第一次(初免)和第二次(加强)施用的方式施用，并且其中所述疫苗或免疫原性组合物的施用在所述加强施用后14和/或28天在至少20名未感染黄病毒的受试者和/或至少20名寨卡病毒血清阴性受试者的群体中诱导的几何平均中和抗体滴度是在所述初免施用后28天诱导的几何平均中和抗体滴度的至少10倍，或至少15倍，或至少20倍，或至少25倍，如通过蚀斑减少中和试验(PRNT)所确定。
48.如权利要求47所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述疫苗或免疫原性组合物包含剂量为1μg至40μg的所述抗原，其中所述抗原是灭活全病毒。
49.如权利要求48所述使用的疫苗或免疫原性组合物，所述寨卡病毒在SEQ ID NO:1的第98位或在与SEQ ID NO:1的第98位相对应的位置处具有突变。
50.如权利要求47至49所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述抗原是纯化的，并且其中在尺寸排阻色谱法中的所述纯化抗原的主峰占所述尺寸排阻色谱法中的曲线下总面积的85％以上。
51.如权利要求47至50中任一项所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自寨卡病毒流行地区，任选地遭受疫情暴发。
52.如权利要求47至50中任一项所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者来自前往流行地区旅行的寨卡病毒非流行地区。
53.如权利要求47至52中任一项所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者的年龄是18至29岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
54.如权利要求47至52中任一项所述使用的疫苗或免疫原性组合物，其中所述受试者的年龄是30至49岁，特别是其中所述受试者是有生育能力的妇女。
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