BR102017024030A2 - Proteína recombinante imunogênica com antígenos de zika virus para vacina e seus usos - Google Patents

Abstract

com o advento dos projetos genoma e bioinformática novas estratégias de busca de antígenos para aplicações biotecnológicas como kits de diagnóstico, vacinas, produção de anticorpos monoclonais, etc, com maior sensibilidade e especificade vem sendo propostas. neste trabalho foram selecionados onze epítopos, provenientes da proteína de envelope de zika vírus, que foram selecionados através de análises de bioinformática com objetivo de identificar o potencial imunogênico de cada um desses epítopos. estes novos epítopos se mostraram ótimos candidatos para comporem uma vacina contra zika vírus, pois, segundo os programas utilizados nas análises in silico, se mostraram promissores na ligação com onze supertipos de alelos de hla classe i, com receptor de antígenos de células b e alguns deles também tiveram afinidade de ligação com alelos de hla classe ii,sendo considerados antigênicos, imunogênicos e não têm homologia com proteínas de humanos.

Description

PROTEÍNA RECOMBINANTE IMUNOGÊNICA COM ANTÍGENOS DE ZIKA VIRUS PARA VACINA E SEUS USOS [01] A presente invenção refere-se a uma quimera recombinante imunogênica construída a partir de onze epítopos selecionados provenientes de proteínas presentes na proteína do Envelope de Zika vírus com objetivo de compor kits vacinais para a doença provocada pelo vírus.

[02] O Zika vírus (ZIKV) pertencente à família Flaviviridae, do gênero Flavivírus (MAHFUZ, M. et al. Indian Journal of Pharmaceutical and Biological Research (JPBR ) In Silico Modeling and Immunoinformatics Probing Disclose the Epitope Based PeptideVaccine Against Zika Virus Envelope Glycoprotein. Indian Journal of Pharmaceutical Biological Research, v. 2, n. 4, p. 44-57, 2014) é transmitido por mosquitos, sendo filogeneticamente associado a outros Flavivírus como: o vírus da dengue (DNV), o vírus do Nilo Ocidental (VNO) e o vírus da febre amarela (YFV) (ALI, A. et al. Advances in research on Zika virus. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, v. 10, n. 4, p. 321-331, 2017; WAHID, B., et al. Zika: as an emergent epidemic. Asian Pac J Trop Med 2016; 9(8): 723-729).

[03] É um vírus emergente de artrópodes (arbovírus) que foi isolado primeiramente em 1947 em macacos rhesus sentinela febril na floresta Zika de Uganda (ZANLUCA, C. et al. First report of autochthonous transmission of Zika virus in Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 110, n. 4, p. 569-572, 2015; DICK, G.W.Aet al. Zika virus. I. Isolations and serological specificity. Trans R Soc Trop Med Hyg 46: 509-520,1952.). Assim como os demais Flavivírus, o genoma viral é uma molécula de ácido ribonucleico de cadeia simples de polaridade positiva, codificando um quadro de leitura aberto, três proteínas estruturais: capsídeo (C), a pré-membrana/membrana (PRM) e o Envelope (E) e sete proteínas não estruturais: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, 2K, NS4B e NS5 (ASHFAQ, U. A.; AHMED, B. De Novo Structural Modeling

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2/18 and Conserved Epitopes Prediction of Zika Virus Envelop Protein for Vaccine Development. Viral Immunology, v. 29, n. 7, p. 436-443, 2016; PINTO JUNIOR, V. L. et al. Virus zika: Revisão para clinicos. Acta Medica Portuguesa, v. 28, n. 6, p. 760-765, 2015; ZANLUCA, C. et al. First report of autochthonous transmission of Zika virus in Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 110, n. 4, p. 569-572, 2015; MAHFUZ, M. et al. Indian Journal of Pharmaceutical and Biological Research ( IJPBR ) In Silico Modeling and Immunoinformatics Probing Disclose the Epitope Based PeptideVaccine Against Zika Virus Envelope Glycoprotein. Indian Journal of Pharmaceutical Biological Research, v. 2, n. 4, p. 44-57, 2014).

[04] A estrutura do vírus por mais que não seja conhecida provavelmente deve ser limitado por um invólucro lipídico que restringe externamente núcleo capsídeo com estrutura e simetria ainda não definidas, composta pela proteína C e pelo genoma viral. O invólucro é proveniente do retículo endoplasmático das células onde estes vírus se replicam e deve conter as duas proteínas de superfície (denominadas M e E) (PINTO JUNIOR, V. L. et al. Virus zika: Revisão para clinicos. Acta Medica Portuguesa, v. 28, n. 6, p. 760-765, 2015).

[05] Dentre as proteínas ditas estruturais, tem-se a proteína Envelope envolvida na ligação, fusão e entrada de vírus nas células hospedeiras (LINDENBACH, B.D; RICE, C.M. Molecular biology of flaviviruses. Adv Virus Res. v. 59, p.23-62, 2003). Sendo assim, a proteína E pode agir como um alvo para bloquear ou parar a entrada do vírus nas células hospedeiras (ASHFAQ, U. A.; AHMED, B. De Novo Structural Modeling and Conserved Epitopes Prediction of Zika Virus Envelop Protein for Vaccine Development. Viral Immunology, v. 29, n. 7, p. 436-443, 2016). As proteínas ditas não-estruturais podem possuir atividade enzimática (NS3: helicase de RNA e protease e NS5: polimerase de RNA, dependente de RNA), ou exercer funções regulatórias (controle da replicação, transcrição, tradução e resposta imune) durante a

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3/18 replicação intracelular (PINTO JUNIOR, V. L. et al. Virus zika: Revisão para clínicos. Acta Medica Portuguesa, v. 28, n. 6, p. 760-765, 2015).

[06] Estudos filogenéticos demonstraram que possivelmente o vírus teria surgido por volta de 1920 na região de Uganda e duas linhagens africanas emergiram após a ocorrência de duas fases de migração para o Oeste Africano (PINTO JUNIOR, V. L. et al. Virus zika: Revisão para clinicos. Acta Medica Portuguesa, v. 28, n. 6, p. 760-765, 2015). Na década de 1940 originou-se a linhagem asiática com casos notificados na Indonésia e epidemia na Micronésia, sendo essa linhagem causadora da transmissão autóctone do vírus no Brasil recentemente (PINTO JUNIOR, V. L. et al. Virus zika: Revisão para clinicos. Acta Medica Portuguesa, v. 28, n. 6, p. 760-765, 2015; HADDOW, A.D et al. Genetic characterization of Zika virus strains: geographic expansion of the Asian lineage. PLoS Negl Trop Dis. 6:e1477, 2012; Faye, O et al. Molecular evolution of Zika virus during its emergence in the 20(th) century. PLoS Negl Trop Dis. v.8, p. e2636, 2014; ZANLUCA, C. et al. First report of autochthonous transmission of Zika virus in Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 110, n. 4, p. 569-572, 2015).

[07] Posteriormente, em 1948, o ZIKV foi isolado a partir de um grupo de mosquitos da espécie Aedes afrícanus na região da Floresta Zika (LANCIOTTI, R. S. et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap State, Micronésia, 2007. Emerging Infectious Diseases, v. 14, n. 8, p. 1232-1239, 2008). Ao longo dos 20 anos seguintes, diversos isolados foram obtidos de Aedes spp. na África, o Aedes afrícanus e na Malásia, o Aedes aegypti, associando essas espécies como possíveis vetores epidêmicos ou enzoóticos (WEINBREN, M.P, WILLIAMS, M.C. Zika virus: further isolations in the Zika area and some studies on the strains isolated. Trans R Soc Trop Med Hyg. V.52, p. 263-8, 1958. DOI: 10.1016/0035-9203(58)90085-3; MARCHETTE, N.J et al. Isolation of Zika virus from Aedes aegypti mosquitoes in Malaysia. Am J Trop Med Hyg. V.18, p.411-5, 1969; LANCIOTTI, R. S. et al. Genetic and serologic properties of Zika virus associated with an epidemic, Yap

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State, Micronesia, 2007. Emerging Infectious Diseases, v. 14, n. 8, p. 12321239, 2008).

[08] Os primeiros casos de infeção em seres humanos por ZIKV foram registrados em 1952 na Uganda e em 1953 na Nigéria, no entanto durante meio século, o vírus foi retratado esporadicamente como responsável por infeções humanas (PINTO JUNIOR, V. L. et al. Virus zika: Revisão para clinicos. Acta Medica Portuguesa, v. 28, n. 6, p. 760-765, 2015; DICK, G. W. Epidemiological notes on some viruses isolated in Uganda; Yellow fever, Rift Valley fever, Bwamba fever, West Nile, Mengo, Semliki forest, Bunyamwera, Ntaya, Uganda S and Zika viruses. Trans R Soc Trop Med Hyg. V. 47. P. 13-48, 1953; MACNAMARA, F. N. Zika virus: a report on three cases of human infection during an epidemic of jaundice in Nigéria. Trans R Soc Trop Med Hyg. v. 48, p. 139-45, 1954). Em 2007 foi registrada a primeira epidemia de febre ZIKV em Yap Island, Micronésia e outros surtos ocorreram nas Ilhas do Pacífico, incluindo Ilha de Páscoa, Ilha Cooks, Tahiti, Polinésia Francesa e Nova Caledônia (ZANLUCA, C. et al. First report of autochthonous transmission of Zika virus in Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 110, n. 4, p. 569572, 2015; DUFFY, M. R et al. Zika virus outbreak on Yap Island, Federated States of Micronesia. N Engl J Med. v. 360. p. 2536-2543, 2009).

[09] O segundo maior surto do vírus foi documentado em 2013 na Polinésia Francesa simultaneamente à epidemia de dengue causada pelos sorotipos 1 e 3 (ZANLUCA, C. et al. First report of autochthonous transmission of Zika virus in Brazil. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz, v. 110, n. 4, p. 569-572, 2015). Em 2015, o vírus se espalhou pela região do Pacífico, incluindo Ilha Oriental, Fiji, Ilhas Cook, Salomão, Vanuatu, Nova Caledônia e pelo Nordeste do Brasil. A partir da Tailândia à Polinésia Francesa, o ZIKV avançou para os países da América do Sul e da América Central em 2013, infectando mais de um milhão de indivíduos (ALI, A. et al. Advances in research on Zika virus. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, v. 10, n. 4, p. 321-331, 2017; MUSSO, D et al. Zika virus: following the path of dengue and chikungunya? Lancet. v. 386, n.

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9990, ρ. 243-244, 2015). Portanto, a Organização Mundial da Saúde declarou os surtos do ZIKV uma Emergência em Saúde Pública de Preocupação Internacional (ALI, A. et al. Advances in research on Zika virus. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, v. 10, n. 4, p. 321-331, 2017).

[010] Os sintomas clínicos em diversas pessoas podem permanecer assintomáticos enquanto em outras geralmente podem ser transitória e leve, durando alguns dias ou até uma semana com as manifestações clinicas variando de febre, erupção cutânea, dor nas articulações, conjuntivite, dor muscular e dor de cabeça, assemelhando-se a sintomas da Dengue e Chikungunya (JOOB, B.; WIWANITKIT, V. Zika Virus Infection. Pediatric Emergency Care. v.33, n.6, p.e6,2017). A infeção pode ser em alguns casos fortemente neurotrópica, ter complicações auto-imunes, causar sequelas teratogênicos em fetos. Diferentemente dos outros Flavivírus, o ZIKV utiliza o receptor de superfície celular AXL para invadir a corrente sanguínea fetal atingindo os tecidos fetais e assim provocando microcefalia em neonatos. (CUNHA, M.S et al. First complete genome sequence of Zika virus (Flaviviridae, Flavivírus) from an utochthonous transmission in Brazil. Gen Announc; v. 4, n.

2. p. e00032-16; ALI, A. et al. Advances in research on Zika virus. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, v. 10, n. 4, p. 321-331, 2017).

[011] No Brasil, há diversos registros de casos de Síndrome de Guillain-Barré que apareceram após o desenvolvimento do quadro clínico da infeção do ZIKV. Todavia essa associação ainda necessita de validação mediante estudos analíticos, pois ainda não se conhece o mecanismo que favorece essa condição, sendo provavelmente atribuído a um fenômeno de autoimunidade. (PINTO JUNIOR, V. L. et al. Virus zika: Revisão para dinicos. Acta Medica Portuguesa, v. 28, n. 6, p. 760-765, 2015; MUSSO, D, et al. Rapid spread of emerging Zika virus in the Pacifc area. Clin Microbiol Infect. V.20, p.0595-6, 2014; OEHLER, E, et al. Zika virus infection complicated by Guiliain-Barre

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6/18 syndrome—case report, French Polynesia, December 2013. Euro Surveill, 2014).

[012] A transmissão do vírus ocorre por dois ciclos: silvestre, que ocorre entre primatas não-humanos e mosquitos arbóreos, e urbano, que envolve a transmissão do vírus entre humanos e mosquitos presentes nas cidades. Em ciclo urbano, a transmissão de ZIKV ocorre pela picada de um mosquito fêmea da espécie Aedes aegypti (vetor primário) e A.albopictus (vetor secundário), que são os mesmos transmissores da Dengue e Chikungunya (ALAM, A. et al. Recent trends in ZikV research: A step away from cure. Biomedicine and Pharmacotherapy, v. 91, p. 1152-1159, 2017; SONG, B. H. et al. Zika virus: History, epidemiology, transmission, and clinicai presentation. Journal of Neuroimmunology, v. 308, p. 50-64, 2017).

[013] Outras formas de transmissão têm sido relatadas, tais como: (i) transmissão vertical, quando a infecção é transmitida da mãe para o feto. São evidencias deste tipo de transmissão a presença de ZIKV em amostras de líquido amniótico de mãe em que os fetos apresentavam anormalidades, em tecido cerebral e de placentas de crianças que nasceram com microcefalia que vieram a óbito, cordão umbilical, recém-nascidos e em mulheres grávidas (CALVET, G. et al. Detection and sequencing of Zika virus from amniotic fluid of fetuses with microcephaly in Brazil: a case study. The Lancet Infectious Diseases, v. 16, n. 6, p. 653-660, 2016; PETERSEN, L. R. et al. Zika Virus. New England Journal of Medicine, v. 374, n. 16, p. 1552-1563, 2016; DE ARAÚJO, T. V. B. et al. Association between Zika virus infection and microcephaly in Brazil, January to May, 2016: preliminary report of a casecontrol study. The Lancet Infectious Diseases, v. 16, n. 12, p. 1356-1363, dez. 2016; MLAKAR, J. et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. New England Journal of Medicine, v. 374, n. 10, p. 951-958, 10 mar. 2016); (ii) leite materno, uma vez que partículas de RNA de ZIKV foram detectadas no leite materno, portanto, sugere-se este fluido como via de infecção (DUPONT-ROUZEYROL, M. et al. Correspondence Infectious Zika viral particles in breastmilk. The

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Lancet, v. 387, n. 10023, p. 1051, 12 mar. 2015; COLT, S. et al. Transmission of Zika virus through breast milk and other breastfeeding-related bodily-fluids: A systematic review. PLoS Neglected Tropical Diseases, v. 11, n. 4, 2017; SONG, B. H. et al. Zika virus: History, epidemiology, transmission, and clinicai presentation. Journal of Neuroimmunology, v. 308, p. 50-64, 2017); (iii) transmissão sexual, ZIKV pode ser transmitido através de relações sexuais, mesmo que a pessoa infectada não apresente sintomas, durante a manifestação e fim dos sintomas. ZIKV foi identificado em sêmen humano e secreções vaginais (MUSSO, D. et al. Potenial sexual transmission of Zika virus. Emerging infectious diseases, v. 21, n. 2, p. 359-361, 2015; FRANK, C. et al. Sexual transmission of Zika virus in Germany, April 2016. Eurosurveillance, v. 21, n. 23, p. 2-5, 2016; MUSSO, D et al. Detection of Zika virus RNA in semen of asymptomatic blood donors. Clinicai Microbiology and Infection, 2017). A alta carga viral no sêmen, junto com a presença de vírus replicativo em uma fração móvel dos espermatozóides, podem levar à transmissão do vírus durante o contato sexual e procedimentos de reprodução assistida (PETERSEN, L. R. et al. Zika Virus. New England Journal of Medicine, v. 374, n. 16, p. 1552-1563, 2016; JOGUET, G. et al. Effect of acute Zika virus infection on sperm and virus clearance in body fluids: A prospective observational study. The Lancet Infectious Diseases, v. 3099, n. 17, p. 1-9, 2017); (iv) transmissão por doação sanguínea, quando o doador assintomático está infectado com ZIKV. Conforme demonstrado em estudos realizados na Polinésia Francesa, foram encontradas amostras positivas por PCR para ZIKV em sangue de doadores, o que serviu para alertar as autoridades quanto esta via de transmissão. Unidades de plaquetas doadas por aférese foram capazes de infectar dois pacientes no Brasil, levando a implementação de ensaios utilizando ácido nucleico para ZIKV em doadores de sangue (MUSSO, D. et al. Potential for Zika virus transmission through blood transfusion demonstrated during an outbreak in French Polynesia, November 2013 to February 2014. Eurosurveillance, v. 19, n. 14, 2014; ΜΟΤΤΑ, I. J. F. et al. Evidence for

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Transmission of Zika Virus by Platelet Transfusion. New England Journal of Medicine, v. 375, n. 11, p. 1101-1103, 15 set. 2016; GOODNOUGH, L. T.; MARQUES, Μ. B. Zika Virus and Patient Blood Management. Anesthesia and Analgesia, v. 124, n. 1, p. 282-289, 2017); (v) transmissão pela saliva, uma vez que, estudos anteriores demonstram que ZIKV foi isolado em cultura celular de amostra de saliva proveniente de indivíduo infectado (BARZON, L. et al. Isolation of infectious Zika virus from saliva and prolonged viral RNA shedding in a traveller returning from the Dominican Republic to Italy, January 2016. Euro surveillance: bulletin Europen sur les maladies transmissibles = European communicable disease bulletin, v. 21, n. 10, 2016; ALI, A. et al. Advances in research on Zika virus. Asian Pacific Journal of Tropical Medicine, v. 10, n. 4, p. 321-331, 2017); (vi) transmissão pela urina, em um estudo realizado no Rio de Janeiro em 2016, amostras de saliva e urina de pacientes em fase aguda de infecção por ZIKV foram cultivadas em cultura de células e a carga viral mostrou-se mais elevada nas amostras de urina. A detecção de partículas infecciosas na urina pode representar um fator crítico na propagação do vírus (BONALDO, M. C. et al. Isolation of Infective Zika Virus from Urine and Saliva of Patients in Brazil. PLoS neglected tropical diseases, v. 10, n. 6, p. e0004816, 24 jun. 2016).

[014] Atualmente, não existem vacinas e terapias clínicas aprovadas para ZIKV, sendo o tratamento concentrado apenas nos sintomas, embora não se conheça quais agentes seriam idéias para o tratamento da febre, coceira e artralgia (ASARAB, M. et al. Zika virus. BmJ, v. 1049, n. February, p. Ϊ1049, 2016.). Repouso, hidratação e monitoramento de sinais vitas devem ser adotado. Devido a semelhança dos sintomas de ZIKV com Dengue e Chikungunya, deve-se avaliar a possível infecção por estes vírus antes da confirmação do diagnóstico da infecção por ZIKV (SHUAIB, W. et al. ReEmergence of Zika Virus: A Review on Pathogenesis, Clinicai Manifestations

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9/18 , Diagnosis, Treatment, and Prevention. The American Journal of Medicine, v. 129, n. 8, p. 879.e7-879.e12, 2016).

[015] Diante disso, medidas de prevenção estão sendo adotas com o intuito de evitar picadas dos mosquitos, transmissão sexual e realizar o controle do vetor, com a eliminação de locais de reprodução de mosquitos, aplicação de larvicidas e inseticidas. Para mulheres grávidas, é recomendado evitar viagens em áreas de transmissão do vírus, contato sexual desprotegido e fazer uso de repelentes, redes/telas em casa (WEAVER, S. C. et al. Zika virus: History, emergence, biology, and prospects for control. Antiviral Research, v. 130, p. 69-80, 2016; PETERSEN, L. R. et al. Zika Virus. New England Journal of Medicine, v. 374, n. 16, p. 1552-1563, 2016).

[016] A indução e o desenvolvimento de uma resposta imunológica efetiva dependem de respostas específicas de células B ou CTL (linfócitos T citotóxico), bem como resposta de célula Th (células T auxiliares) (Zajac AJ and Harrington LJ: Encydopedia of Virology. Elsevier Ltd, Birmingham, Edition 3, VOL.3, 2008:70-77). Estratégias de imunobioinformática contam com o auxílio de softwares para encontrar um candidato vacinai que contenha epítopos antigênicos capazes de induzir tais respostas imunológicas. A resposta imune vai depender da apresentação do antígeno pelos alelos de classe I do Antígeno Leucocitário Humano (do inglês Human Leukocyte Antigen - HLA) aos CTLs e alelos de HLA classe II, estes por sua vez, apresentam o antígeno peptídico para os linfócitos T-CD4 (Th) e, finalmente, convergem para a resposta das células B (PULENDRAN, B.; AHMED, R. Immunological mechanisms of vaccination. Nature immunology, v. 12, n. 6, p. 509-17, jun. 2011).

[017] Em 1985, foi sintetizada a primeira vacina baseada em peptídeos. (JACOB, C. O. et al. Priming immunization against cholera toxin and E. coli heat-labile toxin by a cholera toxin short peptide-beta-galactosidase hybrid synthesized in E. coli. The EMBO journal, v. 4, n. 12, p. 3339-43, 1 dez. 1985). Posteriormente, viu-se que a incorporação de epítopos múltiplos na vacina é

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10/18 ainda mais desejável do que a produção de múltiplas cópias do epítopo único, mostrando eficácia e atingindo ensaios clínicos avançados (GROUP, T. F. I. S. Quadrivalent Vaccine against Human Papillomavirus to Prevent High-Grade Cervical Lesions. New England Journal of Medicine, v. 356, n. 19, p. 1915— 1927, 10 maio 2007).

[018] Até o presente momento, não há disponível vacinas e antivirais contra o ZIKV, tornando de extrema importância a necessidade de desenvolver uma vacina contra essa ameaça emergente. Ótimos candidatos para desenvolvimento de uma vacina seria as proteínas de superfície ou as proteínas do Envelope do vírus, visto que essas são potencialmente imunogênicas (CERDENO-TÁRRAGA, A. M. et al. The complete genome sequence and analysis of Corynebacterium diphtheriae NCTC13129. Nucleic acids research, v. 31, n. 22, p. 6516-23, 15 nov. 2003; TRENT, D. W.; QURESHI, A. A. Structural and nonstructural proteins of Saint Louis encephalitis virus. Journal of virology, v. 7, n. 3, p. 379-88, mar. 1971).

[019] O resultado do sequenciamento do genoma de ZIKV (KUNO, G.; CHANG, G.-J. J. Full-length sequencing and genomic characterization of Bagaza, Kedougou, and Zika viruses. Arch Virol, v. 152, p. 687-696, 2007) em conjunto com a disponibilidade de ferramentas de bioinformática cada vez mais sofisticadas , têm providenciado recursos potenciais para a investigação de epitopos de ZIKV para posterior rastreio de antígenos promissores para comporem uma vacina. A vacinologia reversa é um método que permite a identificação sistemática de antígenos promissores de um patógeno usando análise in silico de seu genoma, sem a necessidade de cultura do microorganismo (DOYTCHINOVA, I. A.; FLOWER, D. R. Bioinformatic Approach for Identifying Parasite and Fungai Candidate Subunit Vaccines. The Open Vaccine Journal, v. 1, n. 1, p. 22-26, 2008). Seguindo a mesma idéia da vacinologia reversa, é possível identificar e selecionar utilizando análises in silico, antígenos com potencial para comporem vacina contra o ZIKV.

[020] Dentre todos os possíveis canditatos para a busca de epitopos, a

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11/18 [021] proteína do Envelope foi escolhida para as análises de bioinformática e seleção de epítopos antigênicos para comporem vacina contra ZIKV. Ela está envolvida na ligação, fusão e entrada do vírus na célula hospedeira (LINDENBACH, B. D.; RICE, C. M. Molecular biology of flaviviruses. Adv Virus Res, 59:23-62, 2003), sendo considerada alvo primário do sistema imune (MAHFUZ, M. et al. Indian Journal of Pharmaceutical and Biological Research ( IJPBR) In Silico Modeling and Immunoinformatics Probing Disclose the Epitope Based PeptideVaccine Against Zika Virus Envelope Glycoprotein. Indian Journal of Pharmaceutical Biological Research, v. 2, n. 4, p. 44-57, 2014). Portanto, conclui-se ser uma ótima fonte de antígenos promissores para aplicações biotecnológicas.

[022] A presente invenção refere-se à identificação de novos epítopos imunogênicos presentes na proteína de Envelope de ZIKV, através de análises de bioinformática, e a construção de uma quimera imunogênica para a composição de vacina contra ZIKV. Foram selecionados onze epítopos provenientes de proteínas presentes na proteína do Envelope.

[023] Através das análises realizadas, entre todos os peptídeos analisados, estes são os peptídeos que mostraram serem os melhores candidatos a comporem futuras vacinas. Como são peptídeos provindos da proteína do Envelope, consequentemente estão em contato com o hospedeiro. Sendo assim, tiveram afinidade de ligação com onze supertipos de alelos de HLA classe I, com receptor de antígenos de células B e também alguns deles tiveram afinidade de ligação com sete alelos de HLA classe II, demonstrando uma ótima antigenicidade e imunogenicidade, levando a acreditar que a junção deles resultará em uma quimera que levará a uma ótima resposta imune e consequentemente, a proteção contra este vírus.

[024] A presente invenção fornece a descoberta de epítopos que podem ser utilizados como insumos biotecnológicos para a produção uma nova vacina contra ZIKV. Estes epítopos podem ser utilizados como novos insumos para

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12/18 originar uma vacina que vá levar a uma proteção contra um futuro contato com a doença.

[025] Metodologia [026] 1. Identificação da proteína e predição de epítopos [027] 1.1 Obtenção da sequência proteica [028] A sequência da Proteína do Envelope do Zika Virus foi retirada do GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) com número de acesso AIC06934.1.

[029] 1.2. Análises in silico da proteína [030] A sequência inteira da proteína foi analisada pelo programa de predição de epítopos com afinidade por alelos do sistema Humano Leucocitário de Antígenos (do inglês Human Leukocyte Antigen - HLA) de classe I pelo programa NetCTLpan (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetCTLDan-1.1/) (STRANZL, T. et al. NetCTLpan: Pan-specific MHC class I pathway epitope predictions. Immunogenetics, v. 62, n. 6, p. 357-368, 2010). O programa tem como limiar de afinidade pelos alelos de HLA classe I aqueles com score abaixo de 1.

[031] O programa VaxiJen (http://ddqpharmfac.net/VaxiJen/VaxiJen/VaxiJen.html) (DOYTCHINOVA, I. A.; FLOWER,

D. R. VaxiJen: a server for prediction of protective antigens, tumour antigens and subunit vaccines. BMC bioinformatics, v. 8, n. 1, p. 4, 2007) foi utilizado para fazer a predição de antigenicidade dos epítopos identificados pelo NetCTLpan. O resultado sai com a probabilidade de ser antigênico ou não antigênico, de acordo com um threshold predefinido.

[032] Para verificar a homologia dos epítopos selecionados com epítopos de proteínas humanas, foi utilizado o programa BLAST+ (http://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/ncbiblast/) (CAMACHO, C. et al. BLAST+: architecture and applications. BMC Bioinformatics, v. 10, n. 1, p. 421, 2009). O programa traça uma porcentagem de identidade que pode variar de 0 a 100. Aqueles cuja identidade foi acima que 60% foram descartados. Este programa

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13/18 foi utilizado, também, para verificar a homologias dos epítopos selecionados com organismos filogeneticamente relaciondas. Aqueles que apresentaram homologia significativa foram considerados para o estudo.

[033] Para verificar a possibilidade de existir epitopos que são reconhecidos ao mesmo tempo por HLA classe I, receptor de células B (BCR) e alelos de HLA classe II, a sequência inteira da proteína foi analisada, respectivamente, pelo programa ABCpred (http://www.imtech.res.in/raqhava/abcpred/) (SAHA,

S.; RAGHAVA, G. P. Prediction of Continuous B-cell Epitopes in an Antigen Using Recurrent Neural Network. Proteins, v. 65, n.1, p. 40-48, 2006) e também pelo programa Tepitool (httD://tools.iedb.orq/teDitool/) (PAUL, S. et al. TepiTool: A Pipeline for Computational Prediction of T Cell Epitope Candidates. In: Current Protocols in Immunology. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2016. v. 114p. 18.19.1-18.19.24.).

[034] 2. Resultados [035] 2.1 Identificação dos epítopos com afinidade por alelos de HLA classe II [036] A sequência total da proteína foi utilizada para busca de epítopos, uma vez que se trata da proteína do envelope do vírus. Considerando isto, as análises referentes à busca por sequência exposta não foi necessária. O programa NetCTLpan permite fazer a busca de epitopos com afinidade por 12 supertiposs de HLA classe I (HLA-A 01:01, HLA-A 02:01, HLA-A 03:01, HLA-A 24:02, HLA-A 26:01, HLA-B 07:02, HLA-B 08:01, HLA-B 27:05, HLA-B 39:01, HLA-B 40:01, HLA-B 58:01 e HLA-B 15:01) e integra a predição com três parâmetros: afinidade de ligação por alelos de HLA classe I, divagem do C terminal pelo proteassoma e eficiência de transporte pelo transportador associado ao processamento de antígenos ( do inglês - transporter associated with antigen processing - TAP). Além disso, o programa permite a busca por epítopos de 8, 9 e 11 aminoácidos, porém, como indicado pelo programa, a maioria das moléculas de HLA classe I têm uma forte preferência por ligação com epítopos de 9 aminoácidos, sendo o tamanho selecionado para a busca

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14/18 . Combinando o resultado dos três parâmetros, o programa libera os epítopos preditos, e somente aqueles abaixo do score de 1 foram considerados.

[037] 2.2 Seleção dos epítopos identificados pelo NetCTLpan [038] Utilizando o programa VaxiJen, foi possível descartar aqueles epítopos que foram preditos não-antigênicos e selecionar os epítopos ditos antigênicos pelo programa. O programa faz predição de antigenicidade baseado nas propriedades de aminoácidos principais, com valor de corte de 0.4 e acurácia de 70%. Epítopos abaixo do threshold são preditos não antigênicos e antígenos acima desse valor são preditos como antigênicos. Todos os epítopos identificados pelo NetCTLpan foram submetidos à análise pelo VaxiJen. O critério de seleção foi baseado na antigenicidade do epitopo: somente os epítopos preditos como antigênicos foram selecionados. Após esta análise, o supertipo HLA-B 39:01 foi descartado.

[039] 2.3 Análise de homologia [040] Utilizando o programa NCBI Blast +, foi possível excluir aqueles epítopos preditos com identidade acima de 60% com proteínas humanas. Essa análise foi de fundamental importância, uma vez que evita que o sistema imunológico reconheça a presença de antígenos e leve à produção de anticorpos contra o agente invasor. Adicional mente, foi possível selecionar epítopos com homologia significativa a epítopos de outros vírus. Isso permite a identificação de alvos com potenciais multivalentes, uma vez que podem levar ao estímulo do sistema imune contra várias virologias distintas.

[041] 2.4 Predição de epítopos com afinidade pelo BCR e HLA classe II [042] A sequência inteira da proteína foi novamente utilizada para fazer predição de epítopos com afinidade pelo BCR e por alelos de HLA classe II. O programa ABCpred faz a predição para BCR e tem como critério de identificação de epítopos um score de afinidade de 0.51, permitindo a busca de epítopos contendo 10, 12, 14, 16, 18 e 20 aminoácidos. Optou-se por epítopos

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15/18 contendo 16 aminoácidos, e aqueles acima do score de 0.51 foram considerados.

[043] O programa Tepitool foi utilizado para fazer a predição de epítopos com afinidade para sete alelos do sistema HLA classe II que são mais comuns na população caucasiana mundial: DRB1 0101, DRB1 0301, DRB1 0401, DRB1 0701, DRB1 1101, DRB1 1301 e DRB1 1501 (TEXIER, C. et al. HLA-DR restricted peptide candidates for bee venom immunotherapy. Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950), v. 164, n. 6, p. 3177-84, 2000). O programa Tepitool permite o ajuste de parâmetros para a predição de epítopos e, para a busca em questão, optou-se pela opção de porcentagem de ligação ao número de alelos totais selecionados. Foram preditos epítopos com sequência de quinze aminoácidos e todos eles têm afinidade pelos sete alelos de HLA classe II.

[044] 2.5 Seleção final dos melhores epítopos para comporem a proteína multiepitopo [045] Após a seleção dos epítopos antigênicos que têm afinidade de ligação por supertipos de HLA classe I e feita a predição de epítopos com afinidade por BCR e HLA classe II, os resultados foram comparados. O objetivo desta etapa foi selecionar aqueles epítopos que têm reconhecimento pelo maior número de moléculas do sistema imune: HLA classe I, BCR e HLA classe II, visando aumentar a resposta imune frente aos antígenos virais. Os epítopos antigênicos preditos com afinidade por alelos de HLA classe I foram a base para comparação e foram selecionados aqueles que eram reconhecidos pelo maior número de moléculas. Além disso, foram utilizadas as análises de homologia dos epítopos como critério de seleção, onde aqueles que apresentaram identidade considerável com proteínas humanas foram descartados, ao mesmo tempo que aqueles que apresentaram homologia com espécies filogeneticamente relacionadas foram considerados.

[046] Sendo assim, como resultado final, foram selecionados onze epítopos antigênicos correspondentes a 11 supertipos de HLA classe I, sendo que todos

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16/18 eles têm também afinidade de ligação pelo BCR e dentre os onze, quatro deles têm afinidade de ligação pelos sete alelos seleciondos de HLA classe II, como mostrado na Tabela 1.

Tabela 1. Epítopos selecionados da Proteína do Envelope para serem usados para a construção da proteína recombinante multiepitopo

Epítopo	Reconhecimento por Supertipos de MHC classe 1 Supertipos	Reconhecimen to por outras moléculas do sistema imune	Código da sequência de nucleotídeos	Código da sequência de aminoácidos
Ep1- SIQPENLEY	HLA-A 01:01	BCR	SEQ. ID. N°3	SEQ. ID. N°4
Ep2TMNNKHWLV	HLA-A 02:01	BCR; alelos de MHC classe II	SEQ. ID. N° 5	SEQ. ID. N°6
Ep3- KLRLKGVSY	HLA-A 03:01, HLA-B 15:01	BCR; alelos de MHC classe II	SEQ. ID. N° 7	SEQ. ID. N°8
Ep4- WFHDIPLPW	HLA-A 24:02	BCR	SEQ. ID. N°9	SEQ. ID. N° 10
Ep5DTAWDFGSV	HLA-A 26:01	BCR	SEQ. ID. N° 11	SEQ. ID. N° 12
Ep6VPAQMAVDM	HLA-B 07:02	BCR	SEQ. ID. N° 13	SEQ. ID. N° 14
Ep7- RLKGVSYSL	HLA-B 08:01	BCR; alelos de MHC classe II	SEQ. ID. N° 15	SEQ. ID. N° 16
Ep8- GRLSSGHLK	HLA-B 27:05	BCR	SEQ. ID. N° 17	SEQ. ID. N° 18
Ep9- LEHGGCVTV	HLA-B 40:01	BCR	SEQ. ID. N° 19	SEQ. ID. N° 20
Ep10KSLFGGMSW	HLA-B 58:01	BCR; alelos de MHC classe II	SEQ. ID. N°21	SEQ. ID. N° 22
Ep11MMLELDPPF	HLA-B 15:01	BCR	SEQ. ID. N° 23	SEQ. ID. N° 24

[047] 2.6 Desenho racional da quimera [048] Após a seleção dos cinco epítopos mais imunogênicos, citados na tabela acima, o passo seguinte foi a construção da melhor sequência para a quimera. Para o desenho racional da quimera, foram inseridos linkers flexíveis de glicina e serina (GSGSG) entre os epítopos e ao final da sequência, na porção C

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17/18 terminal, foram inseridos seis resíduos de histidina (H) para permitir a detecção e purificação da quimera.

[049] Todos os cinco epítopos selecionados pelas análises in silico foram utilizados para a construção da proteína recombinante. Com o objetivo de alcançar a melhor antigenicidade, foram testadas todas as possibilidades de posições dos epítopos dentro da sequência, mudando-se a ordem de cada um. Também como critério de seleção, a estrutura terciária de cada possível quimera proteica foi predita pelo programa SWISS-MODEL (https://swissmodel.exDasv.oro/interactive) (ARNOLD. K. et al. The SWISSMODEL workspace: a web-based environment for protein structure homology modelling. Bioinformatics, v. 22, n. 2, p. 195-201, 15 jan. 2006; BIASINI, M. et al. SWISS-MODEL: modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information. Nucleic Acids Research, v. 42, n. W1, p. W252-W258, 1 jul. 2014; BORDOLI, L. et al. Protein structure homology modeling using SWISS-MODEL workspace. Nature Protocols, v. 4, n. 1, p. 1-13, 11 dez.2008) que faz a predição baseada em modelos já existentes em banco de dados. A antigenicidade de cada tentativa de quimera foi conferida pelo VaxiJen e a quimera selecionada possui antigenicidade no valor de 0.8158. Aquelas sequências de quimera que tiveram as estruturas preditas a serem muito enoveladas foram descartadas, pois este enovelamento poderia ser um impedimento para o reconhecimento de anticorpos.

[050] Após a seleção da melhor sequência da quimera, foi conferido seu ponto isoelétrico (pl) e sua massa molecular pelo programa Compute pl/Mw (httD://web.exDasv.orq/comDute pi/) (GASTEIGER, E. et al. Protein Identification and Analysis Tools on the ExPASy Server. The Proteomics Protocols Handbook, p. 571-607, 2005) . O valor de pl é importante para a etapa de diálise da proteína, uma vez que durante o processo, o pH deve manter uma determinada distância do pl, caso contrário haverá a precipitação da proteína; e a massa molecular predita auxilia na comparação da massa em eletroforese do tipo SDS-PAGE. Para se obter uma massa molecular entre

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25kDa e 35kDa, a sequência com os cinco epítopos e os linkers foram repetidos três vezes, obtendo uma massa molecular final de 30.9 kDa e pl 6.92. A Figura 1 representa a sequência da quimera antigênica.

Claims (9)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. PROTEÍNA RECOMBINANTE IMUNOGÊNICA COM ANTÍGENOS DE ZIKA VIRUS caracterizada por compreender a sequência de aminoácidos representada pela SEQ ID NO. 01, composta pela união das porções imunogênicas Ep1, Ep2, Ep3, Ep4, Ep5, Ep6, Ep7, Ep8, E9, Ep10 e Ep11;
2. 2. PROTEÍNA RECOMBINANTE COM ANTÍGENOS DE ZIKA VÍRUS de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por ser imunogênica contra Zika vírus;
3. 3. PROTEÍNA RECOMBINANTE COM ANTÍGENOS DE ZIKA VÍRUS de acordo com as reivindicações 1 e 2, caracterizada por compreender variações na combinação dos epítopos selecionados e conter pelo menos duas das sequências de aminoácidos representadas por SEQ ID NO. 4; SEQ ID NO. 6; SEQ ID NO. 8; SEQ ID NO. 10, SEQ ID NO. 12, SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 16, SEQ ID NO. 18, SEQ ID NO. 20, SEQ ID NO. 22 e SEQ ID NO. 24.
4. 4. PROTEÍNA RECOMBINANTE COM ANTÍGENOS DE ZIKA VÍRUS de acordo com as reivindicações 1 a 3 caracterizada por compreender variantes biológicas de modificações em sua sequência primária, como adição, deleção ou substituição de aminoácidos ou outros grupos químicos, principal mente uma ou mais substituições, onde um aminoácido com determinada propriedade física e/ou química é trocado por outros aminoácidos com propriedade física e/ou química e funcionais ou semelhantes, ou ainda, modificações póstraducionais, resultando em resíduos de aminoácidos metilados, lipidizados, glicosilados, fosforilados, esterificados, carboxilados, ribosilados, hidroxilados, sulfatados, acetilados, amidados, polimerizados e/ou conjugados em qualquer parte;
5. 5. PROTEÍNA RECOMBINANTE COM ANTÍGENOS DE ZIKA VÍRUS de acordo com as reivindicações 1 a 4, caracterizada por ser codificada de nucleotídeos representada por SEQ ID NO. 02;

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6. 6. PROTEÍNA RECOMBINANTE de acordo com as reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelos epítopos serem unidos por um peptídeo conector, preferencialmente flexível, de 2 a 10 resíduos de aminoácidos;
7. 7. PROTEÍNA RECOMBINANTE de acordo com as reivindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato do peptídeo conector compreender preferencial mente os aminoácidos glicina e serina, e ser consistido pela sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 25;
8. 8. ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE caracterizado por compreender a sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO. 2, composta pela união das sequências de nucleotídeos das SEQ ID NO.3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 21 e SEQ ID NO. 23;
9. 9. ÁCIDO NUCLEICO RECOMBINANTE, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por compreender variações na combinação dos epitopos selecionados entre as sequências de nucleotídeos representadas por SEQ ID NO.3, SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 9, SEQ ID NO. 11, SEQ ID NO. 13, SEQ ID NO. 15, SEQ ID NO. 17, SEQ ID NO. 19, SEQ ID NO. 21 e SEQ ID NO. 23;