BRPI0011369B1

BRPI0011369B1 - Método de detecção precoce de uma infecção flaviviral, kit de diagnóstico precoce, processo de purificação da protéina ns1 de um flavivírus composição imunogese, utilização da proteína ns1, de pelo menos um anticorpo monoclonal anti-ns1, e, processo de expressão de um polinucleotídeo codificado para a proteína ns1 de um vírus da dengue

Info

Publication number: BRPI0011369B1
Application number: BRPI0011369-7A
Authority: BR
Inventors: Marie Flamand; Françoise Megret; Sophie Alcon; Antoine Talarmin; Philippe Despres; Vicente Deubel
Original assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1999-06-09
Filing date: 2000-06-09
Publication date: 2019-03-19
Also published as: MXPA01012662A; US20090226478A1; US20120009216A1; FR2794865B1; US7670766B2; US20090068213A1; HK1045729A1; CN1360678B; DE60013287D1; CN1360678A; US6870032B1; HK1045729B; US8709427B2; WO2000075665A1; EP1190257B1; BR0011369A; BRPI0011369B8; ATE274701T1; AU6447400A; ES2226894T3

Abstract

"método de detecção precoce de uma infecção flaviviral, kit de diagnóstico precoce, processo de purificação da proteína ns1 de um flavivírus, composição imunogene, utilização da proteína ns1, de pelo menos um anticorpo monoclonal anti-ns1, e, processo de expressão de um polinucleotídeo codificando para a proteína ns1 de um vírus da dengue". método de detecção precoce de uma infecção flaviviral compreendendo a detecção da glicoproteína não estrutural ns1 de um flavivírus em uma amostra biológica, durante a fase clínica da infecção, por um método imunológico empregando pelo menos dois anticorpos idênticos ou diferentes, o primeiro anticorpo sendo constituído por anticorpos policlonais ou monoclonais previamente selecionados para sua afinidade elevada para a referida proteína ns1 de forma hexamérica.

Description

UMA INFECÇÃO FLAVIVIRAL, PROCESSO DE

DA PROTEÍNA NS1 DE UM FLAVIVÍRUS,

MÉTODO DE DETECÇÃO PRECOCE E KIT DE DIAGNÓSTÍQ PRECOCE DE PURIFICAÇÃO

COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, UTILIZAÇÃO DA PROTEÍNA NS1, DE

PELO MENOS UM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-NS1 E DA

PROTEÍNA NS1 DE FORMA HEXAMÉRICA, E, PROCESSO DE EXPRESSÃO DE UM POLINUCLEOTÍDEO CODIFICANDO PARA A

PROTEÍNA NS 1 DE UM VÍRUS DA DENGUE

A presente invenção refere-se a um método de detecção 10 precoce dos flavivírus, notadamente vírus da dengue e em suas aplicações.

A dengue é uma doença tropical aguda febril cujo vírus causador é um arbovírus, transmitido pelos mosquitos. Os vetores da doença são os mosquito do gênero Aedes, notadamente Aedes aegypti cujas larvas são com maior freqüência domésticas e peridomésticas. O vírus responsável, 15 isolado em 1951, foi classificado em quatro tipos antigênicos diferentes (DEN1, DNE2, DEN3 e DEN4). Ele pertence à família de Flaviviridae, gênero flavivírus.

Mais de dois bilhões de habitantes vivem nas zonas endêmicas e o número de indivíduos infectados pelo vírus se eleva a mais de 100 20 milhões por ano. A dengue é notadamente responsável por 500 000 hospitalizações e de várias dezenas de milhares de mortes anuais, de crianças principalmente.

Após uma incubação de cinco a oito dias, o começo dos sinais clínicos é geralmente súbito e consiste no aparecimento de febre não 25 diferenciada (DF dengue fever), acompanhada por cefaléias severas, lombalgias, dores musculares e articulares assim como calafrios. Do terceiro ao quinto dia de fase febril, pode aparecer uma erupção maculo-papulosa congestiva durante três a quatro dias (dengue clássica).

Na sua forma severa, a infecção pode chegar ao aparecimento de uma síndrome hemorrágica (DHF ou Dengue haemorrhagic fever),

• · caracterizada por uma permeabilidade vascular aumentada e uma desregulagem da hemostase. Apear de que na maior parte dos casos, a evolução é geralmente favorável em uma semana, o agravamento da doença pode ser fatal em caso de choque hipovolêmico (DSS ou dengue shock syndrome). Estas complicações poderíam ser devido à presença de uma imunidade pré-existente, adquirida notadamente quando de uma primoinfecção por um vírus heterólogo da dengue (sorotipo diferente). Com efeito, dois tipos diferentes de resposta sorológica são identificados junto aos indivíduos infectados pela dengue: os indivíduos que não tiveram uma

infecção ao flavivírus e não foram vacinados contra um outro flavivírus (vírus da febre amarela, vírus da encefalite japonesa, por exemplo) irão apresentar uma resposta primária, caracterizada por um aparecimento lento dos anticorpos específicos do vírus responsável pela infecção; os indivíduo que já tinham tido uma infecção ao flavivírus (outro sorotipo da dengue, por exemplo), ou que foram vacinados contra um outro flavivírus irão apresentar uma resposta secundária, caracterizada por um aparecimento rápido dos anticorpos.

O agente infeccioso é o vírus da dengue pertencendo à família

dos Flaviviridae, à qual pertencem igualmente o vírus da febre amarela e o da encefalite japonesa (T.P. Monath et al, (1996), Flaviviruses in B.N. Fields,

D.M. Knipe, P.M. Howly et al, (ed). Fields Virology, Philadelphia: Lippincott Raven Press Publishers). Estes vírus possuem um RNA monocatenário de polaridade positiva que compreende 11 000 nucleotídeos e que codifica para uma poliproteína de cerca de 3400 aminoácidos. Ela se individualiza em três proteínas de estrutura e sete proteínas não estruturais

NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B5, durante as clivagens co- e pós traducionais pelas proteases virais e celulares. A proteína não estrutural NS1 foi identificada pela primeira vez em 1970 por P.K. Russel et al (J. Immunol.

(1970), 105, 838-845), e caracterizada em 1985 por G.W. Smith et al, {J. Gen.

Virol. (1985), 66, 559- 571). Esta glico-proteína altamente conservada no

gênero de flavivírus (T.P. Monath já citado), nota nos quatro sorotipos de vírus da dengue, existe sob uma forma intracelular, e sob uma forma extracelular. A forma intracelular interviria nas fases precoces da replicação do vírus (Hall

R.A. et al. J. Virol. (1999) 73, 10272- 10280; Rice C.M. et al, J. Virol. 71, 291298, Rice C.M. et al, J. Virol. (1996), 222, 159- 168; Rice C.M. et al, J. Virol. (1997), 71, 9608- 9617). Antes de ser transportada para a membrana plásmica, a proteína NS1 sofre uma dimerização. Nas células de mamíferos, mas não nas células de insetos, uma parte da proteína NS1 é liberada no meio extracelular 10 seja majoritariamente, sob forma de uma proteína solúvel, seja acessoriamente sob forma de micro-partículas. Quando está sob forma solúvel, a proteína existe sob forma de um oligômero, notadamente de um pentâmero ou um hexâmero (Crooks A. J. et al, J. Chrom. (1990), 502, 59-68 e J. Gen. Virol. (1994), 75, 3453- 3460). Atualmente, a função biológica da proteína NS1 não é conhecida.

Vários estudos sugerem um caráter imunodominante da proteína NS1 na resposta imune protetora contra as infeções por flavivírus. Experiências realizadas com um certo número de flavivírus, como os vírus da

febre amarela, da dengue, da encefalite japonesa, e da encefalite provocada por carrapato mostraram uma proteção parcial ou total contra uma dose mortal de vírus homólogo junto aos animais vacinados com a ajuda da proteína NS1 subunitária ou produzida pelos vírus vetores, tipo vacina ou adenovírus (Schlesinger et al, J. Virol. (1986), 60, 1153- 1155; J. Gen. Virol. (1987), 68, 853- 857, Falgout et al, J. Virol. (1990), 64, 4356-4363; Jacobs et al, J. Virol.

(1992), 66, 2086-2095; Hall et al, J. Gen. Virol. (1996), 77, 1287- 1294;

Konishi et al, Virology, (1991), 185,401-410).

A imunização passiva dos camundongos pelos anticorpos monoclonais anti-NSl permitiu igualmente obter um certo grau de proteção (Schlesinger et al, J. Immunol. (1985), 135, 2805- 2809; Gould et al, J. Gen.

Virol. (1986), 67, 591- 595; Henchal et al, J. Gen. Virol. (1988), 69, 21012107). Não se conhece totalmente o papel dos anticorpos anti-NSl na proteção. Podería ser que as proteínas NS1 na superfície das células infectadas seriam reconhecidas pelos anticorpos fixando o complemento conduzindo à lise das 5 células infectadas (Schlesinger et al, Virology, (1993), 192, 132- 141.

Não existe tratamento específico e os cuidados supridos ao paciente são unicamente sintomáticos. No caso da dengue clássica, o tratamento repousa sobre a administração de antálgicos e antipiréticos. No caso de DHF, o tratamento consiste em uma perfusão para compensar a fuga

plasmática, associada à correção de males hidroelétricos e a diminuição da diurese.

Não existe vacina comercializada contra o vírus da dengue. Ao contrário, os ensaios de proteção pelas cepas atenuadas dos 4 sorotipos do vírus da dengue foram efetuados por N. Bhamarapravati et al (Dengue and 15 Dengue haemorrhagic fever (1997), 367- 377), como resultados não satisfatórios. A prevenção portanto repousa unicamente na luta contra o vetor. Esta luta associa uma destruição larvar e pulverizações adulticidas.

Na ausência de vacina, é necessário cuidar das epidemias e evitar as complicações acima citadas; para isto, programas de controle ativo foram notadamente elaborados pela Organização Mundial da Saúde e compreendendo essencialmente o controle dos casos de febre e dos insetos vetores e do estudo sorológico e virológico das pessoas apresentando uma febre e suspeitas de serem infectadas pelo vírus da dengue.

A etiologia da dengue é às vezes delicada de afirmar quando um doente apresenta uma síndrome febril indiferenciada do tipo semelhante a dengue, que pode ter como origem um outro arbovírus, vírus provocando febre eruptivas como a gripe ou patógenos não virais agentes de doentes como a leptospirose e mesmo o paludismo. Somente um exame no laboratório pode dar o diagnóstico.

« ···· * · · • · · ♦ · * · · · • · · ♦ · ··♦ ♦♦ • ♦ • «·

Existe atualmente vários testes de diagnóstico da dengue.

Todavia, para chegar a um resultado interpretável, é necessário combinar vários métodos:

- o isolamento do vírus, por técnicas de virologia clássica, notadamente por infecção de culturas de células ou propagação no cérebro de ratinhos ou amplificação por inoculação aos mosquitos e exame, por exemplo, por imunofluorescência. Estes métodos tem o inconveniente de serem difíceis de realizar e de depender da precocidade da retirada e das boas condições de conservação; além disso, os primeiros resultados só podem ser obtidos em menos de uma semana; para remediar estes inconvenientes, pode-se ter recurso * a um teste para RT/PCR (V. Deubel, L^feurobiologiste, (1997), tomo XXXI, 37155); todavia, este meio não é sempre confiável, e não pode ser usado em rotina em países afetadas pela infecção pelo vírus da dengue por razoes de custo e de equipamento;

- testes sorológicos; o diagnóstico sorológico o mais precoce consiste em pesquisar IgM específicos dos antígenos virais pela técnica MACELISA {Immunoglobulin M Antibody Capture Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Sua detecção vários dias após o início dos sintomas permite estabelecer um diagnóstico de probabilidade de infecção por um flavivírus. Os anticorpos lo de tipo IgG aparecem mais tardiamente que os anticorpos de tipo IgM. Em todos os casos, a pesquisa por anticorpos precisa de duas retiradas: uma no início dos sinais clínicos, outra 10 a 28 dias após, de modo a evidenciar uma conversão sorológica por reação de inibição de hemaglutinação (IHA) ou por ELISA.

Foram igualmente propostos testes imunológicos simples e baratos, utilizáveis nos países em risco, que empregam, como reativo imunológico específico, peptídeos derivados da proteína não estrutural NS1 característica dos flavivírus. Assim, a patente US 5 824 506 descreve um método usando os peptídeos derivados da proteína não estrutural NS1, que permite detectar anticorpos induzidos pela presença do vírus da dengue; todavia, os peptídeos selecionados reconhecem essencialmente as amostras obtidas a partir de indivíduos convalescentes e reconhecem igualmente melhor os pacientes infectados pela segunda vez que os infectados pela primeira vez;

estes resultados enganadores poderíam ser explicados pelo fato de que os peptídeos usados não são representativos das características antigênicas da proteína nativa e, portanto, conduzem a um má reconhecimento dos anticorpos procurados.

Em todos os casos, somente a confirmação tardia de uma o

GLo infecção por um flavivírus pode ser dada.

Um relatório proveniente do Sir Albert Sakzewski Virus Research Centre Royal Children's Hospital, (A. Falconar, 1991) descreve a pesquisa da glicoproteína não estrutural NS1 no soro de pacientes infectados pelo vírus DEN2. Os autores deste relatório elaboraram um teste ELISA de tipo duplo sanduíche, no qual um soro de coelho contendo anticorpos policlonais anti-NSl, usado como anticorpo de captura, é imobilizado sobre uma placa de microtitulação. O antígeno capturado é detectado com a ajuda de anticorpos monoclonais de camundongos dirigidos contra a proteína NS1 seja do vírus da dengue do tipo DEN2, seja específico do complexo sorológico da dengue; a revelação da formação do complexo antígeno/ anticorpo é efetuada com a ajuda de IgG de cabra anti-camundongo conjugados a peroxidase. Por este método, os autores demonstraram que utilizando a proteína NS1 dimérica purificada ou degradada como padrão, a sensibilidade de detecção do teste é de cerca de 4 ng/ml com os anticorpos monoclonais DEN2, como sonda de revelação e de cerca de 60 ng/ml com os anticorpos monoclonais do grupo.

Todavia, este teste não permite detectar a proteína NS1 nem no caso de infeções primárias em fase aguda ou convalescente, nem nas infeções secundárias em fase convalescente nas quais existe um título elevado em anticorpos anti-NSl, os autores concluíram que a proteína NS1 deveria estar • · ♦ ··· ♦ •4·· ·*

4· • 4

4« ♦· ··

4444 presente em quantidades importantes unicamente no caso de infeções secundárias e, de modo transitório, durante a infecção.

Ora, os inventores elaboraram um processo de purificação da •4 •

•44 •

•4

1Μ proteína NS1 de um flavivírus sob forma hexamérica, o que permitiu selecionar os anticorpos específicos desta proteína sob forma hexamérica e para demonstrar, de modo surpreendente, que estes anticorpos são ferramentas de escolha para o evidenciamento de diferentes formas da proteína NS1 circulante no quadro da uma infecção por um flavivírus, particularmente nas fases precoces onde a resposta em anticorpos específicos não é detectável,

notadamente quando das infeções primárias pelo vírus da dengue.

Consequentemente, os inventores conseguiram chegar a um método de detecção precoce de uma infecção flaviviral que responde melhor às necessidades da prática que os processos da arte anterior da técnica, isto é, um processo que seja confiável, rápido, pouco oneroso, e que permite adaptar a tempo os cuidados médicos.

A presente invenção tem, conseqüentemente, por objeto um método de detecção precoce da uma infecção flaviviral caracterizado pelo fato de que compreende a detecção da glicoproteína não estrutural NS1 de um

flavivírus em uma amostra biológica, durante toda a duração da fase clínica de infecção, por um método imunológico empregando pelo menos dois anticorpos idênticos ou diferentes,

- o primeiro anticorpo ou anticorpos de captura da glicoproteína

NS1 sendo constituído por anticorpos escolhidos no grupo constituído por:

- anticorpos policlonais previamente selecionados por imunocaptura sobre a proteína NS1 do referido flavivírus, de forma hexamérica, e

- misturas de anticorpos monoclonais anti-NSl previamente selecionados para sua afinidade elevada para a proteína NS1 do referido flavivírus, de forma hexamérica, os referidos anticorpos monoclonais sendo em seguida purificados,

- o segundo anticorpo ou anticorpo de revelação sendo selecionado dentre o grupo consistindo de :

- anticorpos policlonais dirigidos contra a proteína NS1 de forma hexamérica, e

- uma mistura de anticorpos monoclonais dirigidos contra uma proteína NS1 de forma hexamérica.

No sentido da presente invenção, entende-se por forma hexamérica da proteína NS1 de um flavivírus, a proteína nativa obtida a partir

do sobrenadante de cultura de células de mamíferos infectadas pelo referido flavivírus ou então transformadas por um sistema de expressão compreendendo o gene da proteína NS1 do referido flavivírus e purificada de acordo com o processo da invenção como descrito abaixo. Esta forma hexamérica da referida proteína NS1 que se distingue de outras formas como as da forma monomérica 15 ou da forma dimérica da referida proteína, é evidenciada pelas técnicas de eletroforese ou de cromatografia, como descritas na figura 1.

No sentido da presente invenção, entende-se por anticorpos monoclonais e policlonais dirigidos contra a proteína NS1 de um flavivírus, os

anticorpos obtidos por imunização de um mamífero não humano,

- seja por uma proteína NS1 de forma hexamérica,

- seja um flavivírus vivo ou inativado, os referidos anticorpos policlonais sendo selecionados por sua afinidade para a proteína NS1 sob forma hexamérica e purificados em uma única etapa e os referidos anticorpos monoclonais sendo previamente 25 selecionados por sua afinidade elevada para a proteína NS1 sob forma hexamérica depois purificados por técnicas clássicas, notadamente por cromatografia de afinidade ou de troca de íons.

No sentido da presente invenção, entende-se por afinidade de um anticorpo monoclonal para a proteína NS1 sob forma hexamérica a concentração na referida proteína necessária para saturar 50% dos sítios de

anticorpos, este é medido pela constante de afinidade do referido anticorpo de acordo com o protocolo descrito no Exemplo 5.

No sentido da presente invenção, entende-se por afinidade g elevada uma afinidade cuja constante é inferior a 10’ M.

De modo surpreendente, a utilização, para a detecção da proteína NS1 em uma amostra biológica, de anticorpos policlonais selecionado e purificados por imunocaptura sobre a proteína NS1 de forma hexamérica, ou

de anticorpos monoclonais apresentando uma afinidade elevada para proteína NS 1 de forma hexamérica e purificados, em vez e em lugar de um soro total de coelho hiperimunizado, permite melhorar, de modo significativo, a sensibilidade do método e colocar em evidência a proteína NS 1 circulando no sangue dos doentes, desde o estágio precoce da infecção, e tão bem em uma infecção primária como em uma infecção secundária.

O método de acordo com a presente invenção possui várias vantagens:

- ele pode ser empregado de modo precoce: a presença da glicoproteína NS1 é revelada quando da fase clínica, antes que a resposta em

anticorpos seja detectável,

- ele é sensível: pode-se detectar até menos de 1 ng de proteína/ ml de soro, o que permite detectar a proteína NS1 circulante na fase precoce das infeções primárias,

- ele é rápido: pode-se obter uma resposta em um dia,

- ele é relativamente pouco oneroso e pode ser utilizados nos países em risco,

- ele permite distinguir as pessoas vacinadas das pessoas infectadas recentemente por um flavivírus porque a proteína NS1 estará ausente junto às pessoas vacinadas nas quais os anticorpos poderíam ser ainda reveláveis.

De acordo com uma forma de realização vantajosa do referido

1Ύ método a infecção fiaviviral é uma infecção pelo vírus da dengue.

De acordo com outra forma de realização vantajosa do referido método, o primeiro anticorpo é preferivelmente fixado sobre um suporte sólido 5 conveniente e o segundo anticorpo é eventualmente conjugado a um marcador apropriado.

De acordo com uma outra forma de realização vantajosa do referido método, quando o segundo anticorpo não é conjugado a um marcador, sua ligação à proteína NS1 fixada sobre o suporte sólido é então detectada por

um terceiro anticorpo conjugado a um marcador conveniente, o referido terceiro anticorpo sendo um anticorpo classicamente usado, como por exemplo um IgG dirigido contra o segundo anticorpo e produzido notadamente junto à cabra, porco ou jumento.

Dentre os marcadores usados, pode-se citar a título de 15 Exemplos dos marcadores fluorescentes, o sistema biotina/ estreptavidina, os marcadores não isotópicos, ou enzimas, como por exemplo a peroxidase de raiz forte, ou a fosfatase alcalina.

De acordo com uma outra forma de realização vantajosa do

referido método, o referido terceiro anticorpo é conjugado a uma enzima.

De acordo com outra forma de realização vantajosa do referido método,

- o primeiro anticorpo ou anticorpos de captura é constituído por anticorpos policlonais de camundongo, selecionados por imunocaptura sobre a proteína NS1 do vírus da dengue, a referida proteína estando sob forma hexamérica, e

- o segundo anticorpo ou anticorpo de detecção da presença de NS1 na amostra biológica a analisar, é constituído por anticorpos policlonais de coelho imunizado pela proteína NS1 do vírus da dengue de sorotipo 1, a referida proteína estando sob forma hexamérica, a fixação do referido segundo ·'«*··· * · ♦ ··· · ♦ «* ····« « · · · · «»· anticorpo sendo revelada por um terceiro anticorpo constituído por anticorpos, conjugados à peroxidase e dirigidos contra o segundo anticorpo.

De acordo com outra forma de realização ainda mais vantajosa do referido método, os anticorpos policlonais de camundongos são purificados por imunocaptura sobre a proteína NS1 hexamérica de dengue de sorotipo 1.

A presente invenção tem igualmente por objeto um kit de

diagnóstico de uma infecção flaviviral caracterizado em que compreende:

- pelo menos um anticorpo de captura e pelo menos um anticorpo de revelação, como definidos previamente.

- pelo menos um controle positivo constituído pela proteína NS1 de um flavivírus e/ou diferentes sorotipos de acordo com o flavivírus, a referida proteína estando sob forma hexamérica, e

- pelo menos um controle negativo constituído por um soro humano normal.

De acordo com uma forma de realização vantajosa do kit de diagnóstico de acordo com a invenção, a referida proteína NS1, sob forma hexamérica, é obtida a partir de um sobrenadante de cultura, seja de células de mamíferos infectadas, seja de células de mamíferos transfectadas por um

plasmídeo recombinado, compreendendo o gene da proteína NS1 ou um fragmento do referido gene ou um fragmento do genoma flaviviral, os referidos fragmentos sendo aptos a expressar toda ou parte da proteína NS1

De acordo com uma forma de realização vantajosa do kit de diagnóstico de acordo com a invenção, a referida proteína NS1 é a do vírus da dengue.

De acordo com uma forma de realização ainda mais vantajosa do referido kit de diagnóstico, o plasmídeo é o plasmídeo pCIneo-NSl.FGA que foi depositado junto à Coleção Nacional de Culturas e de microorganismos mantida pelo Instituto Pasteur, sob o número 1-2220, na data de 7 de junho de 1999.

A presente invenção tem igualmente por objeto um processo de purificação da proteína NS1 de um flavivírus, sob forma hexamérica, a partir de um sobrenadante de cultura, seja de células de mamíferos infectadas, seja de células de mamíferos transfectadas por um plasmídeo recombinado, compreendendo o gene da proteína NS1 ou um fragmento do referido gene ou um fragmento do genoma flaviviral, os referidos fragmentos sendo aptos a expressar a proteína NS1 sob forma hexamérica, caracterizado pelo fato de que, previamente à purificação da proteína NS1 pelas técnicas clássicas, como a cromatografia de afinidade, separa-se a forma solúvel da proteína NS1 de

forma em micro-partículas da referida proteína, por tratamento por um agente precipitando depois por centrifugação.

Por exemplo, a centrifugação foi reafizada a uma velocidade superior ou igual a 10.000 g.

No sentido da presente invenção, entende-se por agente precipitante, um agente que precipita especificamente as proteínas em micropartículas ou resíduos celulares, como por exemplo o polietileno glicol, o referido agente sendo usado nas condições clássicas que permitem separar as proteínas solúveis e as proteínas em micro-partículas ou resíduos celulares.

Em uma forma de realização preferida do referido processo de purificação , a proteína NS1 hexamérica é a do vírus da dengue, notadamente o vírus da dengue de sorotipo 1.

A presente invenção tem igualmente por objeto uma composição imunogene, caracterizada pelo fato de que ela compreende, a título de princípio ativo da proteína NS1 de um flavivírus, de forma hexamérica, eventualmente associada a outras proteínas, em associação com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

Em uma forma de realização preferida da composição imunogene de acordo com a presente invenção, a composição imunogene compreende pelo menos uma mistura de proteínas NS1 de forma hexamérica ·· · ·· *♦ ·* correspondendo aos diferentes sorotipos do vírus da dengue.

A presente invenção tem igualmente por objeto uma composição imunogene, caracterizada em que ela compreende um princípio ativo selecionado dentre o grupo consistindo de

- um polinucleotídeo capaz de expressar toda ou parte da proteína NS1 do vírus da dengue qualquer que seja seu sorotipo e

- um sistema de expressão compreendendo pelo menos um promotor capaz de fazer expressar, junto ao hospedeiro, onde foi injetado, o DNA codificando para a proteína NS1 do vírus da dengue qualquer que seja

seu sorotipo, o referido DNA expressando a referida proteína, em associação com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

Protocolos de vacinação usando os ácidos nucleicos são notadamente descritos no pedido internacional WO 90/ 11092.

A presente invenção tem igualmente por objeto a utilização de uma proteína NS1 de forma hexamérica de um flavivírus ou de um de seus sistemas de expressão, para a preparação de uma composição imunogene capaz de induzir a produção de anticorpos in vivo.

Em uma forma de realização preferida da referida utilização, a proteína NS1 é a do vírus da dengue, notadamente sorotipo 1.

A presente invenção tem igualmente por objeto a utilização de pelo menos um anticorpo monoclonal anti-NSl apresentando uma afinidade elevada para a proteína NS1 de forma hexamérica, os referidos anticorpos monoclonais sendo em seguida purificados e modificados para a fabricação de 25 um medicamento apto a induzir uma imunização passiva.

De modo vantajoso, as modificações dos anticorpo s são notadamente a seleção de fragmentos Fab ou a humanização dos anticorpos.

A presente invenção tem igualmente por objeto a utilização da proteína NS1 de forma hexamérica, para selecionar in vitro anticorpos específicos da referida proteína NS1 aptos ao diagnóstico precoce de uma infecção por um flavivírus.

Em uma forma de realização vantajosa da referida utilização, os anticorpos são anticorpos policlonais.

Em uma outra forma de realização vantajosa da referida utilização, os anticorpos são anticorpos monoclonais.

Em uma outra forma de realização vantajosa da referida utilização, a proteína é a proteína NS1, do vírus da dengue, notadamente sorotipo 1.

Os anticorpos monoclonais anti-NSl são com vantagem obtidos

I por fusão de células esplênicas de camundongos imunizados pela proteína NS1 de forma hexamérica com células mielomatosas apropriadas.

A presente invenção tem igualmente por objeto um processo de expressão de um polinucleotídeo codificando para a proteína NS1 de um vírus 15 da dengue, caracterizado em que compreende a expressão de um polinucleotídeo como definido na SEQ ID NO: 1, associado a um promotor do referido polinucleotídeo nas células eucarióticas convenientes.

Outras características e vantagens da invenção aparecerão na

seqüência da descrição e dos Exemplos ilustrados nas figuras nas quais:

- a figura 1 representa a proteína NS1 extracelular hexamérica purificada obtida após cromatografia de exclusão (a) após cromatografia de exclusão, a proteína é concentrada a 0,5 mg/ml por ultrafiltragem e tratada por suberimidato de dimetila (DMS), a 0, 0,5,5 e 50 mM. Os produtos obtidos são colocados em um tampão não rédutor de Laemmli, separados por um gel acrilamida de gradiente 4 a 20% e marcados com azul Brilhante Coomassie .

Uma amostra tratada por DMS 50 mM é aquecida durante 3 min a 95 °C antes da eletroforese para dissociar os oligômeros não covalentes. (b) A proteína

NS1 purificada é tratada durante uma noite a 37 °C por 0,5% ou 1% de n-octil glucosídeo (nOG) e eventualmente tratada por 25 mM de DMS durante 1 h. As • · · • · ·♦ proteínas são separadas sem desnaturação a quente em um gel acrilamida de gradiente 4 a 20% e detectado por immunoblotting com um anticorpo monoclonal anti-NSI da literatura, ou como definido previamente .

- A figura 2 representa a seqüência de proteína NS1 do vírus da dengue de sorotipo 1 obtido pelo clone 4C do Exemplo 2 abaixo, assim como a seqüência de codificação correspondente.

- a figura 3 ilustra os resultados obtidos por dosagem da

proteína NS1 circulante pelo método de detecção ELISA-captura junto aos pacientes infectados previamente por um vírus da dengue cujos soros foram retirados quando das fases agudas e convalescentes, assim como a comparação com os resultados obtidos pelas técnicas da arte anterior IHA (inibição de hemaglutinação dos sorotipos 1, 2, 3 ou 4, do vírus da dengue), e MAC ELISA (immunoglobulin MAntibody Capture Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay); Dl corresponde ao sorotipo 1 da dengue; D2 corresponde ao sorotipo 2 da dengue; D3 corresponde ao sorotipo 3 da dengue e D4 corresponde ao sorotipo da dengue; ID = identidade do doente; 1 corresponde à primeira retirada em fase aguda da doença 2 corresponde à segunda retirada em fase convalescente (efetuada 2 a 4 semanas após a primeira); no teste ELISA captura, os valores

são expressos em densidade ótica obtidos por um mesmo soro diluído 10, 30 ou 90 vezes.

- A figura 4 ilustra a detecção da proteína NS1 pelo teste ELISA captura, nos soros de pacientes infectados pelo vírus da dengue de sorotipo 1 da Guiana Francesa. Os números indicados representam o número de pacientes dividido pela categoria (positividade ou negatividade em ELISA- captura e positividade e negatividade em IgM);

- a figura 5 ilustra os resultados obtidos em 4 pacientes da Guiana Francesa infectados pelo vírus da dengue 1 que foram retirados diariamente durante a fase clínica da doença de dia 1 a dia 5. Cada gráfico corresponde a um paciente com para cada dia de retirada, tanto os resultados da

detecção da proteína NS1 com o teste ELISA- captura revelado, os resultados de RT-PCR e os resultados obtidos pela Técnica MAC-ELISA. Os valores de

D.O. registrados foram corrigidos em uma vez o valor do bruto de fundo. Os limiares de positividade são indicados pelos traços em pontilhado.

- A figura 6 indica as características de anticorpos monoclonais anti NSlF22eG18,

- a figura 7 ilustra a detecção da proteína NS1 pelo teste

ELISA- captura usando a abordagem monoclonal em comparação com o teste ELISA- captura usando a abordagem policlonal como no Exemplo 3. Os resultados obtidos são registrados sob a forma de valores de densidade ótica medidos para cada diluição de soro analisada (10a., 30a, ou 90a.), e divididos pelo valor médio dos testemunhos negativos.

- a figura 8 ilustra a evidência da proteína NS1 nos soros de pacientes infectados com o vírus da febre amarela, por um teste ELISA15 captura específico para febre amarela. Para cada soro testado é registrado o valor de densidade ótica medida pelo teste desenvolvido dividido pelo valor médio dos testemunhos negativos, o valor da densidade ótica medido pelo teste MAC-ELISA específico dos IgM de febre amarela, e os resultados do

isolamento viral quando eles são disponíveis.

Exemplo 1 - purificação da proteína NS1 do vírus da dengue, sorotipo 1

1. Material e métodos

A proteína é produzida pela células Vero infectadas pelo vírus da dengue, sorotipo 1, cepa FGA/ 89 (P. Després et al, Virol. (1993), 196, 209219), nas condições adaptadas do método descrito por A.K. I. Falconar et al (J.

Virol. Meth. (1990), 30, 323- 332).

O meio de cultura é coletado 5 dias após a infecção e centrifugado a 1500 g para eliminar os resíduos celulares. O sobrenadante de centrifugação é levado a 20 mM Tris-HCl, 1 mM azida de sódio, concentrado 6 vezes por ultrafiltragem a frio e as partículas virais são eliminadas por uma « * ····« · · · ··· · · ··* ····· · ♦ · · · **2 precipitação de 2 h a 4 °C, a uma concentração de 7,5% de polietileno glicol (PEG), seguida por uma centrifugação de 30 min a 10.000 g. O sobrenadante clarificado, contendo 7,5% de PEG é tratado com 0,05% de Tween 30 e 1 mg/ml de aprotinina, depois passado em uma coluna de imunoafinidade sobre a 5 qual é fixado um anticorpo monoclonal anti-NSl. A proteína é eluída de acordo com a técnica da dietilamina, como descrito em Falconar et al, (acima mencionado) concentrado por ultra-filtragem e a solução de eluição trocada sobre um tampão 10 mM Tris-HCl pH 7,5 contendo 1 mM de azida de sódio.

2. Resultados

Os resultados são ilustrados na figura 1.

A figura la mostra que a proteína NS1 está bem sob a forma hexamérica. A proporção de forma hexamérica aumenta com uma concentração crescente em DMS (figura la).

A proteína de forma hexamérica extracelular NS1 pode ser transformada em subunidades diméricas em presença do detergente não iônico, n-octilglucosídeo (nOG) (figura lb). Após uma noite a 37 °C em ausência ou presença de n-octilglucosídeo (nOG) e tratamento por DMS 25 mM, observase em ausência de nOG, a presença de bandas correspondendo ao dímero, ao

tetrâmero e ao hexâmero e em presença de nOG, uma dissolução parcial ou completa do hexâmero em função da concentração emnOG (figura lb).

Exemplo 2 - expressão da proteína NS1 do vírus da dengue sorotipo 1 por células Vero

1. Material e processos

O plasmídeo pCIneo-NS 1 .FGA depositado junto ao depositado junto à Coleção Nacional de Culturas e de microorganismos mantida pelo Instituto Pasteur, sob o número 1-2220, na data de 7 de junho de 1999) contendo o gene da proteína NS1 compreendendo o gene codificando para seu peptídeo sinal, precedido por um códon de iniciação da tradução e seguido por um códon de terminação da tradução é introduzido na bactéria competente • * • ·♦♦ • · • ♦ · ♦· • « · * · · « φ«· · · > ♦ · « · · ♦ · ♦ • ··« ·♦ ♦·

Escherichia coli (Epicurian SURE de Stratagene). Este plasmídeo é *· ·· amplificado em cultura bacteriana e purificado de acordo com a técnica clássica de preparação de DNA plasmídico. O DNA purificado é usado pelo seqüenciamento de diferentes clones (a seqüência do clone 4C é ilustrada na 5 figura 2) para transfectar as células Vero com a ajuda seja de uma mistura adequada com os lipossomas catiônicos, como DOTAP (Boehringer Manheim), ou com um agente não lipossômico, como FuGENE (Boehringer Manheim), O FuGENE e o DNA são pré- incubados no meio sem soro durante 15 min, depois a mistura é colocada em contato com uma esteira celular de

células Vero durante 24 h. As células são em seguida enxaguadas com a ajuda de PBS (solução salina tamponada com fosfato), fixadas 20 min em temperatura ambiente com uma solução de PBS contendo 3% de paraformaldeído, permeabilizadas 5 min com PBS contendo 0,5% Triton X100. A presença de antígeno NS1 é então revelada com a ajuda de anticorpos 15 específicos, reconhecidos por um anticorpo conjugado marcado com fluoresceína.

2. Resultados

É possível colocar assim em evidência por um sinal

fluorescente elevado, específico do antígeno viral NS1, em cerca de 20% de células transfectadas.

A expressão de NS1 é assim demonstrada e as linhagens estáveis poderão ser estabelecidas em presença de neomicina, marcador de seleção das células transfectadas.

A figura 2 ilustra a seqüência da proteína NS1 do vírus da 25 dengue de sorotipo 1 assim obtido, assim como a seqüência de codificação correspondente.

Exemplo 3 - Emprego da técnica ELISA- captura de acordo com a invenção no quadro de uma infecção pelo vírus da dengue de sorotipo 1 e comparação com os métodos da arte anterior da técnica ♦ « ♦···♦<

· · · * · ♦·· φ 4 · · ♦ V « · · *

1. Princípio da técnica ELISA- captura o2£>

O antígeno viral NS1 é capturado pelos anticorpos policlonais de camundongos monoespecíficos previamente purificados por imunocaptura sobre a proteína NS1 hexamérica purificada de dengue, sorotipo 1.

A presença de NS1 é revelada pelos anticorpos de coelho imunizados pela proteína NS1 hexamérica purificada, eles mesmos reconhecidos pelos anticorpos conjugados à peroxidase de raiz forte.

2. Materiais e métodos

a- Purificação de anticorpos policlonais de camundongos dirigidos contra a proteína NS 1 ai - Fixação da proteína NS1 sobre membrana

A proteína NS1 purificada é fixada por adsorção em uma membrana de náilon anfotérica (Nytran, Schleicher & Schuell). A superfície da membrana é então saturada pela albumina bovina presente a uma concentração de 3% em uma solução salina tamponada com fosfato (PBS, phosphate buffer saline: 10 mM fosfato; pH 7,2; 150 mM NaCl). Após 2 enxágües em PBS, a membrana é tratada por PBS contendo 0,25% de glutaraldeído, durante 15 min em temperatura ambiente. Após 3 enxágües em PBS, a membrana é neutralizada em um tampão de 100 mM glicina, 3% albumina bovina, enxaguada 2 vezes em PBS depois conservada a 4 °C em PBS com azida de sódio 1 mM.

a2 - purificação de anticorpos policlonais monoespecíficos de camundongos (anticorpos de captura).

- Produção de ascitos policlonais .· os cérebros de ratinhos Swiss infectados 25 pelos vírus da dengue e moribundos são triturados em 9 ml de tampão PBS. O produto é centrifugado 10 min a 10.000 g a 4 °C.

A suspensão viral é injetada em camundongos Swiss, de acordo com o seguinte esquema:

Dia 0: 0,5 ml de antígeno subcutaneamente na coxa;

Dia 3 - 0,4 ml de antígeno e 0,1 ml de adjuvante completo de

Freund por via intraperitoneal,

Dia 25 - 0,5 ml de antígeno por via intraperitoneal,

Dia 26 - 0,5 ml de ascito de camundongo TG180, e

Dia 28 : 0,5 ml de antígeno por via intraperitoneal.

Os ascitos são coletados no dia 42.

Após coletar os ascitos, deixa-se o coágulo se formar durante 1 h em temperatura ambiente depois realiza-se uma centrifugação durante pelo menos 30 min a 1500 g. O sobrenadante é deixado uma noite a 4 °C. O pH do sobrenadante é ajustado a 4,8 com ácido acético 2 M, depois o sobrenadante é centrifugado novamente nas mesmas condições. O pH do sobrenadante é então levado a 7,0 - 7,2 por adição de uma solução de soda 2N. O sobrenadante pode ser conservado a - 20 °C.

- Purificação de anticorpos de camundongos específicos do vírus da dengue de sorotipo 1

A membrana é incubada durante 1 h em temperatura ambiente em uma mistura de ascitos policlonais dirigidos contra os 4 sorotipos do vírus da dengue preparados como acima. Após 3 enxágües da membrana em PBS, os anticorpos fixados na proteína NS1 são eluídos com uma solução de dietilamina pH 11,4 (meio de Dulbecco modificado por Iscove (Gibco) contendo 10 mM dietilamina). Os anticorpos são concentrados por ultrafiltragem e substituídos em um tampão PBS contendo azida de sódio 1 mM.

b. Preparação de anticorpos policlonais de coelho dirigidos contra a proteína NS1 (anticorpos de revelação).

A imunização de coelhos foi realizada por 3 ou 4 injeções sucessivas de 30 pg de proteína NS1 hexamérica purificada de acordo com o método do Exemplo 1, realizados em dia 0, dia 7, dia 21 e eventualmente dia 49 e seguidos por uma sangria em branco no dia 83. O soro é empobrecido em • i· • 4 • · • 4« t

• 4 •

• 44 t ··♦· ··· ·* · · · · « 4 ·»< ·· • · · ··· 4 · · ♦· ··« ·«♦ «e sinal não específicos por incubação com esferas de Sepharose contendo um FL anticorpo monoclonal descrito na literatura ou preparados como previamente .

c- Processo de ELISA- captura

Ci - Curva de patamar

Para cada placa ELISA- captura destinada a testar soros humanos, uma gama de patamar é realizada a partir de uma solução de proteína NS1 purificada de acordo com o método descrito no ponto 1, cuja concentração inicial é de 0,5 pg/ml e diluída de 3 em 3.

C2 - Detecção da proteína NS1 circulante quando da fase aguda:

Os anticorpos policlonais de camundongos purificados obtidos de acordo com o método descrito previamente (anticorpos de captura) são fixados em uma placa, diluídos em uma solução de PBS e levados a incubar durante uma noite a 4 °C. Após 3 enxágües de 5 min com uma solução de PBS/ Tween, 0,05% , a placa é saturada com uma mistura de PBS, Tween, 0,05% e leite 3%, durante 30 min em temperatura ambiente. Após três enxágües com uma solução de PBS/ Tween 0,05%, deposita-se os soros a testar, diluídos ou não, e deixa-se reagir durante uma hora, sempre na temperatura ambiente. As diluições em 1/10, 1/30 e 1/90 são realizadas em uma solução de PBS/ Tween

0,05%. Após 3 enxágües, adiciona-se o segundo anticorpo específico de NS1 (anticorpo de revelação obtido no ponto 3 acima), após ter diluído em uma mistura de PBS/ Tween 0,05% e leite 3%, e deixa-se incubar durante 45 min a °C. Após 3 enxágües, o anticorpo anti-IgG dirigido contra um segundo anticorpo e marcado com peroxidase, o referido anticorpo sendo preparado nas condições clássicas conhecidas dos versados na arte, é adicionado e a 25 incubação realizada durante 45 min a 37 °C. Após 3 enxágües, revela-se durante 10 min por uma solução de TMB (3,3', 5,5'- tetrametilbenzidina, Kierkegaard & Perry Lab). A reação colorimétrica é parada com ácido sulfurico.

3. Resultados

Eles são ilustrados na figura 3.

A técnica ELISA- captura de acordo com a invenção permite

detectar a presença da proteína NS1 na fase aguda da doença e isto independentemente do fato de que os doentes tenham tido uma infecção primária ou secundária.

Os resultados confirmam que a presença da proteína NS1 é transitória, porque nas amostras retiradas realizadas em fase de convalescência, não se detecta esta proteína (figura 3).

93% das retiradas em fase aguda da doença, revelam ser

negativas pelo teste MAC ELISA, enquanto que 100% das amostradas realizadas em fase convalescente se revelam positivas neste mesmo teste (figura 3).

Do mesmo modo, o teste de inibição de hemaglutinação (IHA) não permite detectar a infecção pelo vírus da dengue do sorotipo 1 em 80% dos casos em fase aguda da doença, mas este teste se revela positivo em 100% das retiradas realizadas em fase convalescente (figura 3). De acordo com critérios

OMS, uma taxa de IHA inferior a 1280 no soro retirado em fase convalescente permite diagnosticar uma infecção de dengue primária e uma taxa superior a

1280 de uma infecção de dengue secundária. A metade dos soros positivos deste estudo corresponde portanto aos casos de dengue primária e a outra metade aos casos de dengue secundária. A técnica ELISA- captura de acordo com a invenção permite assim detectar proteína NS1 no caso de dengue primária e secundária.

Exemplo 4 - Determinação da janela de detecção

1. Materiais e métodos a- Estudo realizado em um grupo coorte de pacientes da Guiana Francesa infectados pelo vírus da dengue 1

As retiradas são realizadas junto aos pacientes infectados pelo vírus da dengue de sorotipo 1, entre dia 0, marcando o aparecimento dos sinais ♦ · · « · *

• * « · · ·· • · ·· • · ·« • · ·· • ♦ ·· • · • · • · • Λ Á — ^w ® clínicos (inicialmente uma febre indiferenciada), e dia 06 correspondendo’ ao’ final da fase convalescente.

Nos soros destes pacientes, procura-se a presença de NS1 circulante de acordo com o método ELISA- captura descrito no Exemplo 3, e compara-se o resultado obtido com a positividade em IgM específica medida em MAC_ELISA, quando os dados são disponíveis.

b- Acompanhamento cotidiano de 4 pacientes infectados pelo vírus da dengue

1.

Quatro pacientes foram amostrados quotidíanamente durante a

fase clínica de dia 1 ao dia 5. Uma reação de RT-PCR para evidenciar o RNA viral, um teste MAC-ELISA para a detecção de IgM específicos do vírus da dengue e uma busca do antígeno NS1 dengue de acordo com o método ELISAcaptura descrito previamente , foram realizados em cada retirada sanguínea.

2. Resultados a- Determinação da janela de detecção

Os resultados são reunidos na figura 4.

Entre dia 1 e dia 6, a possibilidade de detectar a proteína NS1 circulante oscila entre 64% (em dia 2) e 100% (em dia 5), dos pacientes infectados. Além do dia 10, a proteína NS1 circulante não é mais detectada, ^20 enquanto que a resposta em anticorpo se toma predominante.

A detecção da proteína NS1 circulante não parece dependente da presença de IgM totais (específicos dos antígenos virais) que aparecem em alguns casos em dia 3 e culminam a partir de dia 5, nem mesmo, para alguns pacientes da presença de IgG totais que podem aparecer desde o dia 2. Em 25 revanche, a ausência de detecção de antígeno NS1 nos soros da fase clínica podería ser explicada pela presença de IgG especificamente dirigidos contra NS1.

Assim, a janela de detecção de antígeno sérico NS1 pela técnica

ELISA - captura, de acordo com a presente invenção , se situa preferivelmente

entre dia 1 e dia 6, após o aparecimento dos sinais clínicos...............

b- Acompanhamento cotidiano de 4 pacientes infectados com o vírus da dengue

Os resultados são reunidos na figura 5.

Junto aos 4 pacientes estudados, a proteína NS1 é detectada de modo contínuo até dia 5, e isto, qualquer que seja o dia de retirada em relação ao começo dos sintomas. Para alguns pacientes, a janela de detecção da proteína é maior do que o período de viremia, detectado por RT-PCR.

Exemplo 5 - Emprego da técnica ELISA- captura com as ferramentas monoclonais no quadro de uma infecção pelo vírus da dengue de sorotipo 1 e comparação com a técnica ELISA- captura previamente descrita

1. Materiais e métodos a- Produção e caracterização de anticorpos monoclonais de camundongos dirigidos contra a proteína NS1 do vírus da dengue sorotipo 1

ü] - produção de anticorpos monoclonais de camundongos dirigidos contra a proteína NS1

A imunização de camundongos Balb/C fêmeas foi realizada por 7 injeções de 10 pg de proteína NS1 do vírus da dengue sorotipo 1, hexamérico, purificado de acordo com o método do Exemplo 1. A primeira injeção em adjuvante completo de Freund e as cinco seguintes em adjuvante incompleto de Freund foram realizadas subcutaneamente em 15 dias de intervalo. A última injeção, em adjuvante incompleto de Freund, pratada três dias antes do sacrifício do animal, é efetuada por via intraperitoneal.

As células das vísceras dos camundongos imunizados são fundidas com mieloma de murinos e colocadas em cultura até aparecimento de clones de acordo com o protocolo padrão.

a2 - identificação de hibridomas secretando anticorpos anti-NSl

A detecção de anticorpos específicos da proteína NS1 foi realizada seja por uma técnica ELISA clássica, seja por uma técnica ELISA25 captura.

- Técnica ELISA clássica

A proteína NS1 hexamérica purificada de acordo com o método do Exemplo 1 é fixada por adsorção em uma placa de concentração de 1 pg/ml em solução de PBS durante uma noite a 4 °C. Após 3 lavagens com uma solução de PBS/ Tween 0,1% (PT) a proteína é incubada com os sobrenadantes de diferentes hibridomas diluídos em 1/2 com uma solução de PT contendo 0,5% de gelatina (PTG) durante 1 h a 37 °C. Após 3 lavagens com PT, o anticorpo anti-IgG de camundongos marcado com peroxidase diluído em PTG 10 é adicionado e incubado durante 1 h a 37 °C. Após 3 lavagens, revela-se por uma solução de água oxigenada em presença de ortofenilenodiamina.

- Técnica ELISA- captura

A técnica usada é descrita no Exemplo 3 (cf. detecção da proteína NS1 circulante na fase aguda) mas substituindo as diluições de soros a 15 testar por uma diluição em 1/10 na solução PTG de sobrenadante d e cultura de células Vero não infectadas ou infectadas durante 5 dias pelo vírus da dengue sorotipo 1 e precipitada com 7% de polietileno glicol (cf Exemplo 1, purificação da proteína NS1 do vírus da dengue sorotipo 1). A reatividade dos

sobrenadantes dos diferentes hibridomas frente ao sobrenadante de cultura de células Vero não infectadas serve de testemunho de sinal não específico.

a3 - reatividade dos anticorpos monoclonais anti-NSl por imunofluorescência indireta sobre células Vero infectadas por um dos 4 sorotipos do vírus da dengue

As células Vero são infectadas 40 h após um dos 4 sorotipos do 25 vírus da dengue

Sorotipo 1: cepa FGA/89

Sorotipo 2: cepa NG

Sorotipo 3: cepa H87

Sorotipo 4: cepa H241 • · · ♦ • · · ·♦· · · · · • ····'. , _ Após 1 lavagem com uma solução‘de *PBS, ás células são' • ··« · « ♦ · · ♦·· fixadas por uma solução de paraformaldeído a 3% em PBS durante 30 min em temperatura do laboratório. As células enxaguadas em PBS são em seguida permeabilizadas por uma solução de Triton X-100 a 0,5% em PBS durante 10 5 min. Após enxague em PBS, as células são incubadas durante 1 h com os sobrenadantes de diferentes hibridomas tendo reagido positivamente em

ELISA. Após 3 lavagens com PBS, o anticorpo anti-IgG de camundongos marcado com fluoresceína é adicionado e incubado durante 1 h. Após 3 lavagens em PBS, as lâminas são recobertas com uma lamela e observadas sob 10 microscópio com fluorescência.

a₄ — preparação de ascitos monoclonais de camundongos

Os ascitos monoclonais são produzidos junto aos camundongos

Balb/C. Os camundongos recebem uma injeção intraperitoneal de 0,5 ml de pristano (2,6,10,14-tetrametil pentadecano Sigma), uma semana antes da injeção intraperitoneal do clone de hibridoma secretando o anticorpo monoclonal. Os ascitos são retirados na medida de sua formação, centrifugados a 1500 rpm durante 20 min e conservados a -20 °C.

a₅ — determinação do isotipo de anticorpos monoclonais anti-NSl

A determinação do isotipo de anticorpos anti-NSl é efetuada por ELISA com a ajuda dos anticorpos dirigidos contra as diferentes subclasses de imunoglobulinas de murinos: IgGl, IgG2a, IgG2b, IgG3. A determinação da cadeia leve da imunoglobulina é realizada de acordo com a metodologia idêntica.

a6 - determinação da constante de afinidade dos anticorpos monoclonais anti25 NS1 (B. Friguet et al, J. Immunol. (1985), 77, 305-319).

A afinidade de um anticorpo corresponde à concentração em antígeno necessária para saturar 50% dos sítios do anticorpo. Uma incubação é realizada em meio líquido entre o anticorpo em concentração constante e o antígeno em concentração decrescente durante 1 noite a 4 °C a fim de atingir o

3'4 • « ··

-- ♦ ♦ equilíbrio da reação. A concentração em anticorpo livre,* ápós*‘eqüílíbrio*,’ é determinado por teste ELISA, a mistura é depositada em uma placa previamente incubada com o antígeno. Após uma incubação de 20 min a 4 °C ·«« (para evitar um deslocamento do equilíbrio), a revelação de ELISA é feita com um anti- IgG de camundongo copulado a B galactosidase seguido pela reação enzimática. A constante de dissolução KD é em seguida determinada.

αγ - reação de competição de diferentes anticorpos monoclonais anti-NSl

Esta reação permite determinar a especificidade dos anticorpos monoclonais frente a um mesmo epítopo ou epítopos diferentes. A 10 determinação epitópica emprega a reatividade por um antígeno, de um > anticorpo monoclonal não marcado e um segundo anticorpo monoclonal copulado a biotina.

O primeiro anticorpo monoclonal não marcado é colocado na concentração saturante (previamente determinada por ELISA), em uma placa 15 sobre a qual foi previamente fixado o antígeno e incubado 2 h a 37 °C. Após 4 lavagens em solução PT a 4 °C, o segundo anticorpo monoclonal copulado à biotina é adicionado e incubado 20 min a 4 °C. Após 4 lavagens em solução PT a 4 °C, a solução de conjugado estreptavidina marcado com peroxidase é ajustada e incubada 1 h a 37 °C. Após 4 lavagens em solução PT, revela-se por Io uma solução de água oxigenada em presença de ortofenilenodiamina. A obtenção de um sinal após leitura em espectrofotômero indica que os epítopos reconhecidos pelos 2 anticorpos são diferentes. No caso inverso, os 2 anticorpos monoclonais são dirigidos contra o mesmo epítopo do antígeno.

b. Purificação dos anticorpos monoclonais G18 e F22

Os anticorpos G18 e F22 são purificados por imunoafinidade como descrito no Exemplo 3.

c- Detecção da proteína NS1 circulante por um teste ELISA- captura usando os anticorpos monoclonais

Os anticorpos monoclonais purificados G18 e F22 são <** H · · · ·· ·· • ♦ ·<··· · ··*·· ··* »· · 4 «4 · • 4 · . * 4 tr » 44 misturados em uma solução de PBS a uma diluição dádá* e ^colocados 'èm incubar uma noite a 4 °C. As etapas seguintes deste teste ELISA são semelhantes às do Exemplo precedente.

d- Comparação do teste ELISA- captura usando a abordagem monoclonal com a usando a abordagem policlonal

Um painel de soro da Guiana Francesa foi testado no mesmo dia com o teste ELISA- captura usando a abordagem monoclonal e a usando a abordagem policlonal. Os soros foram testados com diferentes diluições 10a, * · ··♦

30a, e 90a.

2. Resultados ►

a- Características de anticorpos monoclonais

Os resultados são reagrupados na figura 6.

Os anticorpos G18 e F22 foram selecionados por sua capacidade de se fixar, com uma forte afinidade, sobre epítopos diferentes da 15 proteína NS1. O anticorpo F22 é específico do sorotipo 1, G18 dos sorotipos 1 e 3 do vírus da dengue.

b- Utilização dos anticorpos monoclonais sobre a captura do antígeno NS1

Os resultados são reagrupados na figura 7.

Os anticorpos monoclonais selecionados não somente reproduzem os resultados obtidos com a abordagem policlonal mas eles apresentam reatividades mais marcadas que os anticorpos policlonais. A ferramenta monoclonal desenvolvida parece portanto particularmente adaptada à utilização diagnostica que deve ser feita.

Exemplo 6 - Emprego da técnica ELISA- captura de acordo com a invenção no quadro da infecção por um outro sorotipo do vírus da dengue ou um outro flavivírus

1. Material e métodos a- Preparação dos sobrenadante de cultura

As células Vero são infectadas seja pelo vírus da dengue 2, seja »4* • 4·4 *

··· ··« * * 9 9 · » • 44 · · 9 9 *> · ’ · ·’ i · * * * ^ · * · pelo vírus da encefalite japonesa ou o vírus da febre amarelà. Os sobrenadantes’* ··>· de cultura são em seguida preparados de acordo com o método descrito no

Exemplo 1.

b- Purificação de anticorpos monoclonais dirigidos contra a proteína NS1 do 5 vírus da febre amarela e da encefalite japonesa.

Os ascitos monoclonais dos anticorpos 8G4, 1A5, e 2D10 (J.J.

Schlesinger et al, Virology, (1983), 125, 8-17) dirigidos contra a proteína NS1 do vírus da febre amarela e dos anticorpos 171- 2-2 e 70-14-20 dirigidas contra a proteína NS1 do vírus da encefalite japonesa, são purificados sobre esferas de 10 proteína A Sepharose CL-4B (Pharmacia Biotech). Os ascitos monoclonais são I colocadas para incubar uma noite a 4 °C sobre esferas de proteína A. Após 3 enxágües de esferas em PBS/Tween 0,05%, os anticorpos fixados sobre as esferas de proteína A são eluídos com uma solução de tampão glicina pH = 3. Eles são em seguida concentrados por ultrafiltragem e substituídos em um 15 tampão PBS contendo azida de sódio 1 mM.

c- Detecção de proteína NS1 sobre os sobrenadantes da cultura do vírus da dengue 2

Ci - Anticorpos usados

A etapa de captura é feita com uma mis de ascitos de anticorpos monoclonais 3D1.4 e 1A12 (A.K.1. Falconar et al, Arch. Virology, (1994), 137,

315-326). Q reconhecimento da proteína é feito em seguida com uma mistura de dois anticorpos de coelho: o soro obtido após imunização com uma proteína purificada do Exemplo 3 e um soro de coelho obtido após imunização com os vírus de quatro sorotipos de dengue.

C2 - Processo ELISA- captura

A técnica usada é a mesma que descrita no Exemplo 3 - d Detecção da proteína NS1 nos sobrenadantes de cultura de vírus de encefalite japonesa di - anticorpos usados

Os anticorpos monoclonais 171-2-2 e 70-14-20 purificados são usados para a etapa de captura. O reconhecimento da proteína é feita em seguida com uma mistura de dois soros de coelhos que foram imunizados previamente com as proteínas recombinadas da proteína NS1 da encefalite 5 japonesa.

d? - Processo ELISA- captura

A técnica usada é a mesma que descrita no Exemplo 3 e- Detecção da proteína NS1 nos sobrenadantes da cultura do vírus da febre amarela e os soros de pacientes infectados por estes vírus

ej - anticorpos usados

Os anticorpos monoclonais 8G4, 1A5, e 2D10 purificados são misturados a uma diluição dada em uma solução de PBS e usados como anticorpos de captura. O segundo anticorpo específico de NS1 febre amarela usado provém de um soro de coelho imunizado previamente contra a proteína 15 NS1 do vírus 17D da febre amarela (J.J. Shlesinger et al, J. Immunol. (1985), 135, 2805-2809).

e₂ - processo ELISA- captura

A técnica usada é a mesma que descrito no Exemplo 3.

2. Resultados

Èo A secreção da proteína NS1 foi previamente registada das culturas celulares in vitro infectadas por diferentes flavivírus, o vírus da DEN2 (Winkler et al, Virology, (1988), 162, 187- 196, Pryor et al, Virology, (1993), 194, 769- 780), encefalite por carrapato (Lee et al, J. Gen. Virol. (1989), 70, 335- 343, Crooks et al, j. Chrom (1990), 502, 59-68, Crooks et al, J. Gen.

Virol. (1994), 75, 3453- 3460), da encefalite japonesa (Mason, Virology, (1989), 169, 354- 364, Fan et al, Virology, (1990), 177,470- 476), da encefalite do Vale de Murray (Hall et al, J. Virol. Meth. (1991), 32, 11-20), e da febre amarela (Post et al, Vir. Res. (1990), 18, 291- 302). Como estes resultados foram obtidos pelas técnicas diferentes de ELISA, os requerentes irão procurar • · *«*··· * · t • · · ♦ * « · « · · · ,Μ • · ♦ · · · · ♦ · · · · ··· ♦· ·♦ «·* «·» ♦· ·· ·· ò^b evidenciar a proteína, pela técnica de ELISA- captura da presente invenção , nos sobrenadantes da células de mamíferos infectadas.

A proteína NS1 é detectável nos sobrenadantes de cultura de células Vero infectadas seja pelo vírus DEN2, seja pelo vírus da encefalite japonesa, seja pelo vírus da febre amarela.

A proteína também pode ser evidenciada por esta técnica nos soros dos pacientes infectados pelo vírus da febre amarela como demonstra os resultados reunidos na figura 8. Dentre os 18 soros generosamente fornecidos por Ch. Matbiot (Institut Pasteur de Dakar), 7 são positivos em antigenemia 10 NS1 e como pelo vírus DEN1, a detecção da proteína NS1 circulante parece I indiferente à presença de IgM específicos da febre amarela.

A técnica ELISA- captura de acordo com a presente invenção permite detectar a proteína NS1 nos sobrenadantes de cultura de células infectadas pelos diferentes flavivírus e nos soros dos pacientes infectados pelos 15 vírus da febre amarela. Ela podería ter deste fato uma aplicação diagnostica para revelar uma infecção pelo outro flavivírus que o vírus DEN1.

Claims

1. Método de detecção precoce de uma infecção flaviviral, caracterizado pelo fato de que ele compreende a detecção da glicoproteína não estrutural NS1 de um flavivírus em uma amostra biológica, durante _toda_a 5 duração da fase clínica de infecção, por um método imunológico empregando pelo menos dois anticorpos idênticos ou diferentes,

- o primeiro anticorpo ou anticorpos de captura da glicoproteína

NS1 sendo constituído por anticorpos escolhidos no grupo constituído por :

- anticorpos policlonais previamente selecionados por

10 imunocaptura sobre a proteína NS1 do referido flavivírus, de forma hexamérica, e

- misturas de anticorpos monoclonais anti-NSl previamente selecionados para sua afinidade elevada para a proteína NS1 do referido flavivírus, de forma hexamérica, os referidos anticorpos monoclonais sendo em

15 seguida purificados,

20 - uma mistura de anticorpos monoclonais dirigidos contra uma proteína NS1 de forma hexamérica.

2. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a infecção flaviviral é uma infecção pelo vírus da dengue.

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3. Método de detecção de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o primeiro anticorpo é fixado sobre um suporte sólido conveniente e o segundo anticorpo é eventualmente conjugado a um marcador apropriado.

4. Método de detecção de acordo com a reivindicação 3, • 20

-> Fls-% caracterizado pelo fato de que quando o segundo anticorpo não é conjugado^/S^rO -'^v‘ um marcador, sua ligação à proteína NS1 fixada sobre o suporte sólido, é então detectada por um terceiro anticorpo conjugado a um marcador conveniente.

5. Método de detecção de acordo com a reivindicação—4,— caracterizado pelo fato de que o terceiro anticorpo é conjugado a uma enzima.

6. Método de detecção de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que

- o segundo anticorpo ou anticorpo de detecção da presença de NS1 na amostra biológica a analisar, é constituído por anticorpos policlonais de coelho imunizado pela proteína NS1 do vírus da dengue de sorotipo 1, a referida proteína estando sob forma hexamérica, a fixação do referido segundo anticorpo sendo revelada por um terceiro anticorpo constituído por anticorpos, conjugados à peroxidase e dirigidos contra o segundo anticorpo.

7. Kit de diagnóstico precoce de uma infecção flaviviral, caracterizado pelo fato de compreender

- pelo menos um anticorpo de captura e pelo menos um anticorpo de revelação, como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 6,

- pelo menos um controle negativo constituído por um soro humano normal.

8. Kit de diagnóstico de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que pelo menos um anticorpo de captura e/ou pelo menos um anticorpo de revelação é um anticorpo monoclonal direcíonàd^ contra uma proteína NS1 na forma hexamérica.

9. Kit de diagnóstico de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a referida proteína NS 1 é obtida a partir de um sobrenadante de cultura, seja de células de mamíferos infectadas, seja de células de mamíferos transfectadas por um plasmídeo recombinado, compreendendo o gene da proteína NSÍ de um flavivírus ou um fragmento do referido gene ou um fragmento do genoma flaviviral, os referidos fragmentos sendo aptos a expressar toda ou parte da proteína NS1.

10 10. Kit de diagnóstico precoce de uma infecção flaviviral de acordo com qualquer uma das reivindicações 7 a 9, caracterizado pelo fato de que a proteína NS 1 é a do vírus da dengue.

11. Kit de diagnóstico precoce de uma infecção flaviviral de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o referido

15 plasmídeo foi depositado junto à Coleção Nacional de Culturas e de microorganismos mantida pelo Instituto Pasteur, sob o número 1-2220, na data de 7 de junho de 1999.

12. Processo de purificação da proteína NS1 de um flavivírus, sob forma hexamérica, a partir de um sobrenadante de cultura, seja de células

20 de mamíferos infectadas, seja de células de mamíferos transfectadas por um plasmídeo recombinado, compreendendo o gene da proteína NS1 ou um fragmento do referido gene ou um fragmento do genoma flaviviral, os referidos fragmentos sendo aptos a expressar a proteína NS1, caracterizado pelo fato de que, previamente à purificação da proteína NS1 pelas técnicas clássicas, ele 25 compreende uma etapa de separação da forma solúvel da proteína NS1 de forma em micro-partículas da referida proteína, por tratamento por um agente precipitando depois por centrifugação.

13. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que ela compreende, como princípio ativo, a proteína NS1 de um flavivírus, de • 20 forma hexamérica, eventualmente associada a outras proteínas, em assoeiaçW?jc< com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

14. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação

13. caracterizada pelo fato de que ela compreende pelo menos uma mistura de proteínas NS1 de forma hexamérica correspondendo aos diferentes sorotipos do vírus da dengue.

15. Utilização da proteína NS1, de forma hexamérica, ou de um de seus sistemas de expressão, caracterizada pelo fato de ser para a preparação de uma composição imunogênica, apta a induzir a produção de anticorpos in vivo.

16. Utilização de pelo menos um anticorpo monoclonal antiNS1 apresentando uma afinidade elevada para a proteína NS1 de forma hexamérica, a referida forma sendo não degradada, os referidos anticorpos monoclonais sendo em seguida purificados, e modificados caracterizada pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento apto a induzir uma imunização passiva.

17. Utilização da proteína NS1 de forma hexamérica, a referida forma sendo não degradada, caracterizada pelo fato de ser para selecionar in vitro anticorpos específicos anti-NSl aptos ao diagnóstico precoce de uma infecção por um flavivírus.

18. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que ela compreende um princípio ativo selecionado dentre o grupo consistindo de

- um sistema de expressão compreendendo pelo menos um promotor capaz de fazer expressar, junto ao hospedeiro, onde foi injetado, o DNA codificando para a proteína NS1 do vírus da dengue qualquer que seja seu sorotipo, o referido gene expressando a referida proteína, em associação com pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável.

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19. Processo de expressão de um polinucleotídeo codificando para a proteína NS1 de um vírus da dengue, caracterizado pelo fato de que ele compreende a expressão de um polinucleotídeo como definido na seqüência_ 5 SEQ ID NO: 1, associado a um promotor do referido polinucleotídeo nas células eucarióticas convenientes.

20. Processo de purificação da proteína NS1 de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o flavivírus é um vírus da dengue qualquer que seja seu sorotipo.

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21. Processo de purificação da proteína NS1 de acordo com as reivindicações 12 ou 20, caracterizado pelo fato de que o flavivírus é um vírus da dengue de sorotipo 1.

22. Utilização de pelo menos um anticorpo monoclonal antiNS1 tendo uma alta afinidade pela proteína NS1 na forma hexamérica, a

15 referida forma sendo não degradada, o referido anticorpo monoclonal sendo então purificado e modificado, caracterizado pelo fato de ser para a detecção in vitro precoce de uma infecção flaviviral. 3^

23. Utilização de pelo menos um anticorpo monoclonal antiNS1 tendo uma alta afinidade pela proteína NS1 na forma hexamérica, a

20 referida forma sendo não degradada, o referido anticorpo monoclonal sendo então purificado e_modificado, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de umí^t de diagnóstico/)—?