ES2226894T3 - Deteccion precoz de los flavivirus utilizando la glicoproteina ns1. - Google Patents
Deteccion precoz de los flavivirus utilizando la glicoproteina ns1.Info
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Abstract
Método de detección precoz de una infección flaviviral, caracterizada porque incluye la detección de la glicoproteína no estructural NS1 de un flavivirus en una muestra biológica, durante toda la duración de la fase clínica de la infección, mediante un método inmunológico que emplea, por lo menos, dos anticuerpos idénticos o distintos, - formándose el primer anticuerpo o anticuerpo de captura de la glicoproteína NS1 por anticuerpos elegidos en el grupo constituido por: u anticuerpos policlonales previamente seleccionados mediante inmunocaptura sobre la proteína NS1 de dicho flavivirus, en forma hexamérica, y u mezclas de anticuerpos monoclonales anti-NS1 previamente seleccionados por su elevada afinidad con la proteína NS1 de dicho flavivirus, en forma hexamérica, purificándose a continuación dichos anticuerpos monoclonales, - eligiéndose el segundo anticuerpo o anticuerpo de revelación en el grupo constituido por: u anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína NS1 en forma hexamérica, y u una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos contra una proteína NS1 en forma hexamérica.
Description
Detección precoz de los flavivirus utilizando la
glicoproteína NS1.
La presente invención se refiere a un método de
detección precoz de los flavivirus, especialmente del virus del
dengue, y a sus aplicaciones.
El dengue es una enfermedad tropical aguda
febril, cuyo virus causal es un arbovirus transmitido por mosquitos
del tipo Aedes, especialmente Aedes Aegypti, cuyas
moradas larvarias son habitualmente domésticas y peridomésticas. El
virus responsable, aislado en 1951, fue clasificado en cuatro tipos
antigénicos distintos (DEN1, DEN2, DEN3 y DEN4). Pertenece a la
familia de los Flaviviridae, género flavivirus.
Más de dos mil millones de habitantes viven en
las zonas endémicas, y el número de individuos infectados por el
virus podría elevarse a más de 100 millones anuales. El dengue es
especialmente responsable de 500.000 hospitalizaciones y varias
decenas de miles de fallecimientos anuales, en su mayoría niños.
Tras una incubación de entre cinco y ocho días,
el comienzo de los signos clínicos es generalmente repentino y
consiste en la aparición de fiebre no diferenciada (DF dengue
fever), acompañada por cefaleas severas, lumbalgias, dolores
musculares y articulares, así como escalofríos. Entre el tercero y
el quinto día de fase febril, puede aparecer una erupción
maculo-papulosa congestiva, durante tres a cuatro
días. (dengue clásico).
En su forma severa, la infección puede desembocar
en la aparición de un síndrome hemorrágico (DHF o dengue
haemorrhagic fever), caracterizado por un incremento de la
permeabilidad vascular y un desajuste de la hemostasia. Mientras
que, en la mayoría de los casos, la evolución es generalmente
favorable en una semana, el resultado de la enfermedad puede ser
fatal en caso de choque hipovolémico (DSS o dengue shock
syndrome). Estas complicaciones podrían deberse a la presencia
de una inmunidad preexistente, adquirida especialmente durante una
primoinfección mediante un virus heterólogo del dengue (serotipo
distinto). En efecto, se identifican dos tipos distintos de
respuesta serológica en los sujetos infectados por el dengue: los
individuos que nunca han sufrido una infección por flavivirus y no
han sido vacunados contra otro flavivirus (por ejemplo, virus de la
fiebre amarilla, virus de la encefalitis japonesa) presentan una
respuesta primaria, caracterizada por la aparición lenta de
anticuerpos específicos del virus responsable de la infección; los
individuos que ya han sufrido una infección por flavivirus (por
ejemplo, otro serotipo del dengue) o han sido vacunados contra otro
flavivirus presentan una respuesta secundaria, caracterizada por la
rápida aparición de anticuerpos.
El agente infeccioso es el virus del dengue
perteneciente a la familia de los Flaviviridae, a la que
pertenecen asimismo el virus de la fiebre amarilla y y el de la
encefalitis japonesa (T.P. Monath y otros, (1996) Flaviviruses in
B.N. Fields, D:M: Knipe, P.M. Hpowly y otros (eds.) "Fields
Virology" Philadelphia: Lippincott Raven Press Publishers).
Estos virus poseen un ARN monocatenario de polaridad positiva, que
incluye 10.000 nucleótidos y codifica para una poliproteína de
alrededor de 3.400 aminoácidos. Ésta se individualiza en tres
proteínas de estructura y siete proteínas no estructurales NS1,
NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5, en el transcurso de la separación co y
post-traduccionales mediante proteasas virales y
celulares. La proteína no estructural NS1 fue identificada por
primera vez en 1970 por P.K. Russel y otros (J. immunol.,
105, 838-845) y caracterizada en 1985 por G.W. Smith
y otros (J. Gen Virol., (1985), 66,
559-571). Esta glicoproteína altamente conservada en
el género de los flavivirus (T.P. Monath ya citado), especialmente
en los cuatro serotipos del virus del dengue, existe en una forma
intracelular y en una forma extracelular. La forma intracelular
podría intervenir en las fases precoces de la replicación del virus
(Hall R.A. y otros, J. Virol. (1999), 73,
10272-10280; Rice C.M y otros, J. Virol,
(1997), 71, 291-298; Rice C.M. y otros, J.
Virol, (1996), 222, 159-168; Rice C.M. y otros,
J. Virol, (1997), 71, 9608-9617). Antes de ser
transportada hacia la membrana plásmica, la proteína NS1 sufre una
dimerización. En las células de mamíferos, pero no en las células
de insectos, una parte de la proteína NS1 es liberada en el medio
extracelular, bien mayoritariamente en forma de una proteína
soluble, bien accesoriamente en forma microparticular. Cuando está
en forma soluble, la proteína existe en forma de un oligómero,
especialmente un pentámero o un hexámero (Crooks A.J. y otros, J
Chrom, (1990), 502, 59-68 y J. Gen
Virol. (1994), 75, 3453-3460). Actualmente, no
se conoce la función biológica de la proteína NS1.
Varios estudios sugieren un carácter
inmunodominante de la proteína NS1 en la respuesta inmunitaria
protectora contra las infecciones con flavivirus. Experimentos
realizados con cierto número de flavivirus, tales como el virus de
la fiebre amarilla, el dengue, la encefalitis japonesa y la
encefalitis por garrapata, han demostrado una protección parcial o
total contra una dosis mortal de virus homólogo en los animales
vacunados mediante la proteína NS1 subunitaria o producida por virus
vectores, del tipo vaccina o adenovirus (Schlessinger y otros,
J. Virol (1986), 60, 1153-1135; J. Gen.
Virol., (1987), 68, 853-857; Falgout y otros,
J. Virol., (1990), 64, 4356-4363; Jacobs y
otros, J. Virol., (1992), 66, 2086-2095; may
y otros, J. Gen Virol, (1996), 77, 1287-1294;
Konishi y otros, Virology, (1991), 185,
401-410).
La inmunización pasiva de ratones mediante
anticuerpos monoclonales anti-NS1 permitió asimismo
obtener cierto grado de protección (Schlessinger y otros, J.
Immunol, (1985), 135, 2805-2809; Gould y otros,
J. Gen. Virol, (1986), 57, 591-595; Henchal
y otros, J. Gen. Virol, (1988), 69,
2101-2107). No se conoce del todo el papel de los
anticuerpos anti-NS1 en la protección. Podría ser
que las proteína NS1 de la superficie de las células infectadas
sean reconocida por los anticuerpos que fijan el complemento que
conduce a la lisis de las células infectadas, (Schlessinger y otros,
Virology, (1993), 192, 132-141).
No existe tratamiento específico, y los cuidados
aportados al paciente son únicamente sintomáticos. En el caso del
dengue clásico, el tratamiento se basa en la administración de
antálgicos y antipiréticos. En el caso de DHF, el tratamiento
consiste en una perfusión, para compensar la pérdida plasmática,
asociada a la corrección de los trastornos hidroeléctricos y el
reinicio de la diuresis.
No existe vacuna comercial contra el virus del
dengue. Por el contrario, N. Bhamarapravati y otros ha realizado
pruebas de protección mediante cepas atenuadas de los 4 serotipos de
virus del dengue (Dengue and Dengue haemorrhagic fever
(1997), 367-377), con resultados no satisfactorios.
La prevención se basa pues únicamente en la lucha contra el vector.
Esta lucha asocia una destrucción larvaria y pulverizaciones
"adulticidas".
En la ausencia de vacuna, es necesario vigilar
las epidemias y prevenir las complicaciones mencionadas; para ello,
la Organización Mundial de la Salud ha implantado programas de
vigilancia activa, que incluyen especialmente la vigilancia de los
casos de fiebre y de los insectos vectores, así como la detección
sexológica y virológica de las personas que presentan una fiebre y
sospechosas de estar infectadas por el virus del dengue.
La etiología del dengue es, a veces, difícil de
afirmar cuando un enfermo presenta un síndrome febril
indiferenciado del tipo "dengue-like", que
puede tener por origen otro arbovirus, virus que provocan fiebres
eruptivas tales como la gripe o patógenos no virales, agentes de
enfermedades tales como la leptospirosis e incluso el paludismo.
Sólo un examen de laboratorio puede aportar un diagnóstico.
Actualmente, existen varios tests de diagnóstico
del dengue. Sin embargo, para alcanzar un resultado interpretable,
es preciso combinar varios métodos:
- -
- el aislamiento del virus, mediante técnicas de virología clásica, especialmente mediante infección de cultivos de células o propagación en cerebro de ratoncillos o amplificación mediante inoculación por mosquitos, y examen, por ejemplo, por medio de inmunofluorescencia. Estos métodos tienen el inconveniente de ser difíciles de poner en práctica y de depender de la precocidad del muestreo y las buenas condiciones de conservación; además, los primeros resultados no pueden obtenerse en menos de una semana; para paliar estos inconvenientes, se puede recurrir a un test mediante RT/PCR (V. Deubel, L'eurobiologiste (1997), tomo XXI, 37-1555); sin embargo, este medio no es siempre fiable, y no puede utilizarse como rutina en los países afectados por la infección con el virus del dengue, por motivos de coste y equipamiento;
- -
- los tests serológicos; el diagnóstico serológico más precoz consiste en investigar IgM específicos de los antígenos virales mediante la técnica MAC-ELISA (inmunoglobulin M Antibody Capture Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). Su detección, varios días después del inicio de los síntomas, permite establecer un diagnóstico de probabilidad de infección por un flavivirus. En cualquier caso, la búsqueda de los anticuerpos requiere dos muestreos: uno al comienzo de los signos clínicos, y el otro entre 10 y 28 días después, de manera a poner en evidencia una conversión sexológica mediante reacción de inhibición de la hemoaglutinación (IHA) o mediante ELISA.
Asimismo, se han propuesto tests inmunológicos
sencillos y poco caros, utilizables en los países de riesgo, que
ponen en práctica, como reactivo inmunológico específico, unos
péptidos derivados de la proteína no estructural NS1 característica
de los flavivirus. De este modo, la patente US 5 824 506 describe un
método que utiliza péptidos derivados de la proteína no estructural
NS1, que permite detectar los anticuerpos inducidos por la presencia
del virus del dengue; sin embargo, los péptidos seleccionados
reconocen esencialmente las muestras obtenidas a partir de sujetos
convalecientes, y reconocen asimismo mejor los pacientes infectados
por segunda vez que aquellos infectados por primera vez; estos
resultados decepcionantes podrían explicarse por el hecho de que los
péptidos utilizados no son representativos de las características
antigénicas de la proteína nativa, por lo que conducen a un
reconocimiento defectuoso de los anticuerpos buscados.
En cualquier caso, sólo se puede aportar la
confirmación tardía de una infección por un flavivirus.
Un informe procedente del Sir Albert Sakzewski
Virus Research Centre Royal Children's Hospital (A. Falconar,
1991) describe la investigación de la glicoproteína NS1 en el suero
de pacientes infectados por el virus DEN2. Los autores de dicho
informe han puesto a punto un test ELISA del tipo doble sándwich, en
el que un suero de conejo con anticuerpos policlonales
anti-NS1, utilizado como anticuerpo de captura, es
inmovilizado en una placa de microtitulación. El antígeno capturado
es detectado mediante anticuerpos monoclonales de ratón, dirigidos
contra la proteína NS1 bien del virus del dengue del tipo DEN2, bien
específicos del complejo sexológico del dengue; la revelación de la
formación del complejo antígeno/anticuerpos se efectúa por medio de
IgG de cabra anti-ratón conjugadas con la
peroxidasa. Mediante este método, los Autores han demostrado que,
utilizando la proteína NS1 dimérica purificada o degradada como
estándar, la sensibilidad de detección del tests es de alrededor de
4 ng/ml con los anticuerpos monoclonales DEN2 como sonda de
revelación, y de alrededor de 60 ng/ml con los anticuerpos
monoclonales de grupo.
Sin embargo, este test no permite detectar la
proteína NS1 ni en el caso de infecciones primarias en fase aguda o
convaleciente, ni en las infecciones secundarias en fase
convaleciente en las que existe un título elevado de anticuerpos
anti-NS1; los Autores han concluido que la proteína
NS1 debía estar presente en cantidades importantes únicamente en el
caso de infecciones secundarias, de forma transitoria, durante la
infección.
Sin embargo, los Inventores han puesto a punto un
procedimiento de purificación de la proteína NS1 de un flavivirus,
en forma hexamérica, los que les ha permitido seleccionar
anticuerpos específicos de dicha proteína en forma hexamérica, y
demostrar de forma sorprendente que estos anticuerpos son
herramientas destacadas para la puesta en evidencia de las distintas
formas de la proteína NS1 circulante en el marco de una infección
por flavivirus, especialmente durante las infecciones primarias por
el virus del dengue.
En consecuencia, los inventores se han fijado por
objetivo proporcionar un método de detección precoz de una
infección flaviviral, que responde mejor a las necesidades de la
práctica que los procedimientos del estado anterior de la técnica,
es decir, un procedimiento que sea fiable, rápido, poco costoso y
permita adaptar a tiempo los cuidados médicos.
En consecuencia, la presente invención tiene por
objeto un método de detección precoz de un infección flaviviral,
caracterizado porque incluye la detección de la glicoproteína no
estructural NS1 de un flavivirus, en una muestra biológica, durante
toda la fase clínica de la infección, mediante un método
inmunológico que aplica, por lo menos, dos anticuerpos idénticos o
distintos,
- -
- dado que el primer anticuerpo o anticuerpo de captura de la glicoproteína NS1 está formado por anticuerpos elegidos en el grupo constituido por:
- \bullet
- anticuerpos policlonales previamente seleccionados mediante inmunocaptura en la proteína NS1 de dicho flavivirus, de forma hexamérica, y
- \bullet
- mezclas de anticuerpos monoclonales anti-NS1 previamente seleccionados por su elevada afinidad para la proteína NS1 de dicho flavivirus, de forma hexamérica, purificándose a continuación dichos anticuerpos monoclonales,
- -
- el segundo anticuerpo o anticuerpo de revelación se elige en el grupo formado por:
- \bullet
- anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína NS1 de forma hexamérica, y
- \bullet
- una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos contra la proteína NS1 de forma hexamérica.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por forma hexamérica de la proteína NS1 de un flavivirus,
la proteína nativa obtenida a partir de lo que sobrenada en el
cultivo de células de mamíferos infectadas por dicho flavivirus, o
transformadas mediante un sistema de expresión que incluye el gen de
la proteína NS1 de dicho flavivirus, y purificadas según el
procedimiento de la invención, como se describe a continuación. Esta
forma hexamérica de dicha proteína NS1, que se distingue de otras
formas tales como la forma monomérica o la forma dimérica de dicha
proteína, se pone en evidencia mediante técnicas de electroforesis o
cromatografía, tales como las descritas en la figura 1.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por anticuerpos policlonales y monoclonales dirigidos
contra la proteína NS1 de un flavivirus, los anticuerpos obtenidos
mediante inmunización de un mamífero no humano,
- -
- bien mediante una proteína NS1 de forma hexamérica,
- -
- bien mediante un flavivirus vivo o inactivado,
seleccionándose dichos anticuerpos
policlonales por su afinidad con la proteína NS1 en forma
hexamérica, y purificados en una única etapa, y siendo dichos
anticuerpos monoclonales previamente seleccionados por su elevada
afinidad con la proteína NS1 en forma hexamérica y purificados
mediante técnicas clásicas, especialmente mediante cromatograma de
afinidad o intercambio de
iones.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por afinidad de un anticuerpo monoclonal con la proteína
NS1 en forma hexamérica la concentración de dicha proteína necesaria
para saturar el 50% de las localizaciones del anticuerpo, midiéndose
ésta mediante la constante de afinidad de dicho anticuerpo, según el
protocolo descrito en el ejemplo 5.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por afinidad elevada una afinidad cuya constante es
inferior a 10^{-8} M.
De forma sorprendente, el uso, para la detección
de la proteína NS1 en una muestra biológica, de anticuerpos
policlonales seleccionados y purificados mediante inmunocaptura en
la proteína NS1 de forma hexamérica, o de anticuerpos monoclonales
que presentan una elevada afinidad con la proteína NS1 de forma
hexamérica y purificada, en lugar de un suero total de conejo
hiperinmunizado, permite de mejorar de forma significativa la
sensibilidad del método y poner en evidencia la proteína NS1 que
circula en la sangre de los enfermos, desde la fase precoz de la
infección, tanto durante una infección primaria, como de una
infección secundaria.
El método de la presente invención tiene cierto
número de ventajas:
- -
- puede emplearse de forma precoz: la presencia de la glicoproteína NS1 queda revelada durante la fase clínica, antes de que pueda detectarse la respuesta de anticuerpos,
- -
- es sensible: se puede detectar hasta menos de 1 ng de proteína/ml de suero, lo que permite detectar la proteína NS1 circulante en la fase precoz de las infecciones primarias,
- -
- es rápido: se puede obtener una respuesta en el día,
- -
- es relativamente poco costoso, por lo que puede utilizarse en los países de riesgo,
- -
- permite distinguir a las personas vacunadas de las personas infectadas recientemente por un flavivirus, ya que la proteína NS1 estará ausente en las personas vacunadas, en las que los anticuerpos podrían aún detectarse.
Según un modo de empleo ventajoso de dicho
método, la infección flaviviral es una infección por el virus del
dengue.
Según otro modo de empleo ventajoso de dicho
método, el primer anticuerpo está preferiblemente fijado sobre un
soporte sólido conveniente, y el segundo anticuerpo está
eventualmente conjugado a un marcador apropiado.
Según otro modo de empleo ventajoso de dicho
método, cuando el segundo anticuerpo no está conjugado a un
marcador, su unión a la proteína NS1 fijada en el soporte sólido
queda entonces detectada por un tercer anticuerpo conjugado a un
marcador conveniente, siendo dicho tercer anticuerpo un anticuerpo
clásicamente utilizado, tal como por ejemplo, una IgG dirigida
contra el segundo anticuerpo y producida, especialmente, en la
cabra, el cerdo o el
asno.
asno.
Entre los marcadores utilizados, se pueden
mencionar a título de ejemplo, los marcadores fluorescentes, el
sistema biotina/estreptavidina, los marcadores no isotópicos o
enzimas, como por ejemplo, la peroxidasa de rábano o la fosfatasa
alcalina.
Según otro modo de empleo ventajoso de dicho
método, dicho tercer anticuerpo está conjugado a una enzima.
Según otro modo de empleo ventajoso de dicho
método:
- -
- el primer anticuerpo o anticuerpo de captura está constituido por anticuerpos policlonales de ratón, seleccionados mediante inmunocaptura en la proteína NS1 del virus del dengue, siendo dicha proteína en forma hexamérica, y
- -
- el segundo anticuerpo o anticuerpo de detección de la presencia de NS1 en la muestra biológica a analizar está formado por anticuerpos policlonales de conejo inmunizado mediante proteína NS1 del virus del dengue, siendo dicha proteína en forma hexamérica, y siendo la fijación de dicho segundo anticuerpo revelada por un tercer anticuerpo constituido por anticuerpos conjugados con la peroxidasa y dirigidos contra el segundo anticuerpo.
Según otro modo de empleo aún más ventajoso de
dicho método, los anticuerpos policlonales de ratón son purificados
mediante inmunocaptura en proteína NS1 hexamérica de dengue de
serotipo 1.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un kit o kit de diagnóstico de una infección flaviviral,
caracterizado porque incluye:
- -
- por lo menos un anticuerpo de captura y por lo menos un anticuerpo de revelación, tal como se han definido anteriormente,
- -
- por lo menos un control positivo formado por la proteína NS1 de un flavivirus y/o de distintos serotipos según el flavivirus, siendo dicha proteína en forma hexamérica, y
- -
- por lo menos un control negativo formado por un suero humano normal.
Según un modo de realización ventajoso del kit de
diagnóstico de la invención, dicha proteína NS1 en forma hexamérica
se obtiene a partir de lo que sobrenada en un cultivo, bien de
células de mamíferos infectadas, bien de células de mamíferos
transfectadas por un plásmido recombinado, incluyendo el gen de la
proteína NS1 o un fragmento de dicho gen, o un fragmento del genoma
flaviviral, SINDO dichos fragmentos capaces de expresar todo o parte
de la proteína NS1.
Según otro modo de realización ventajoso del kit
de diagnóstico de la invención, la proteína NS1 es la del virus del
dengue.
Según otro modo de realización aún más ventajoso
de dicho kit de diagnóstico, el plásmido es el plásmido
pClneo-NS1.FGA que se ha depositado en la Colección
Nacional de Cultivos y de Microorganismos gestionada por el
Instituto Pasteur con el número I-2220, con fecha 7
de junio de 1999.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un procedimiento de purificación de la proteína NS1 de un
flavivirus, en forma hexamérica, a partir de lo que sobrenada en un
cultivo, bien de células de mamíferos infectadas, bien de células
de mamíferos transfectadas por un plásmido recombinado, incluyendo
el gen de la proteína NS1 de un flavivirus o un fragmento de dicho
gen, o un fragmento del genoma flaviviral, siendo dichos fragmentos
capaces de expresar la proteína NS1 en forma hexamérica,
caracterizado porque, previamente a la purificación de la proteína
NS1 mediante las técnicas clásicas tales como la cromatografía de
afinidad, se separa la forma soluble de la proteína NS1 de la forma
microparticular de dicha proteína, mediante tratamiento con un
agente precipitante, y mediante centrifugación.
Por ejemplo, la centrifugación se realiza a una
velocidad superior o igual a 10.000 g.
En el sentido de la presente invención, se
entiende por agente precipitante un agente que precipita
específicamente las proteínas microparticulares o restos celulares,
como por ejemplo, el polietilenglicol, utilizándose dicho agente en
condiciones clásicas que permiten separar proteínas solubles y
proteínas microparticulares o restos celulares.
En un modo preferido de empleo de dicho
procedimiento de purificación, la proteína hexamérica NS1 es la del
virus del dengue, especialmente el virus del dengue de serotipo
1.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un compuesto inmunógeno caracterizado porque incluye, a título de
principio activo, la proteína NS1 de un flavivirus, en forma
hexamérica, eventualmente asociada a otras proteínas, en asociación
con, por lo menos, un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En un modo preferido de realización del compuesto
inmunógeno de la presente invención, el compuesto inmunógeno
incluye, por lo menos, una mezcla de proteínas NS1 de forma
hexamérica correspondiente a distintos serotipos de virus del
dengue.
La presente invención tiene asimismo por objeto
un compuesto inmunógeno, caracterizado porque incluye un principio
activo seleccionado del grupo formado por:
- -
- un polinucleótido capaz de expresar todo o parte de la proteína NS1 del virus del dengue, cualquiera que sea su serotipo,
- -
- un sistema de expresión que incluye, por lo menos, un promotor capaz de hacer expresar, en el huésped en que se inyecta, un ADN codificador para la proteína NS1 del virus del dengue, cualquiera que sea su serotipo, expresando dicho ADN dicha proteína.,
en asociación con, por lo menos, un
vehículo farmacéuticamente
aceptable.
La solicitud internacional WO 90/11092 describe
protocolos de vacunación que utilizan ácidos nucléicos.
La presente invención también tiene por objeto la
utilización de una proteína NS1 en forma hexamérica de un flavivirus
o uno de sus sistemas de expresión, para la preparación de un
compuesto inmunógeno capaz de inducir la producción de anticuerpos
in vivo.
En un modo preferido de dicha utilización, la
proteína NS1 es la del virus del dengue, especialmente del serotipo
1.
La presente invención también tiene por objeto la
utilización de, por lo menos, un anticuerpo monoclonal
anti-NS1, que presente una elevada afinidad con la
proteína NS1 en forma hexamérica, siendo, a continuación, dichos
anticuerpo purificados y modificados para la fabricación de un
medicamento capaz de inducir una inmunización pasiva.
Ventajosamente, las modificaciones de los
anticuerpos son, especialmente, la selección de fragmentos Fab o la
humanización de los anticuerpos.
La presente invención también tiene por objeto la
utilización de la proteína NS1 en forma hexamérica, para seleccionar
in vitro anticuerpos específicos de dicha proteína NS1,
capaces de diagnosticar precozmente una infección por un
flavivirus.
En un modo de realización ventajoso de dicha
utilización, los anticuerpos son anticuerpos policlonales.
En otro modo de realización ventajoso de dicha
utilización, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales.
En otro modo ventajoso de dicha utilización, la
proteína es la proteína NS1 del virus del dengue, especialmente del
serotipo 1.
Los anticuerpos monoclonales
anti-NS1 se obtienen ventajosamente mediante fusión
de células esplénicas de ratón inmunizado con la proteína NS1 en
forma hexamérica, con células mielomatosas apropiadas.
La presente invención también tiene por objeto un
procedimiento de expresión de un polinucleótido codificador para la
proteína NS1 de un virus del dengue, caracterizado porque incluye la
expresión de un polinucleótido tal como se define en la secuencia
SEQ ID Nº 1, asociado a un promotor de dicho polinucleótido en
células eucariotas convenientes.
Otras características y ventajas de la invención
aparecen en el resto de la descripción y en los ejemplos ilustrados
mediante las figuras, en las cuales:
- la figura 1 representa la proteína NS1
extracelular hexamérica purificada, obtenida tras cromatografía de
exclusión (a) tras cromatografía de exclusión, se concentra la
proteína a 0,5 mg/ml mediante ultrafiltración, y se trata con
dimetilsuberimidato (DMS) a 0, 0,5, 5 y 50 mM. Los productos
obtenidos se colocan en un tampón no reductor de Laemmii, separados
sobre un gel de acrilamida de gradiente 4 al 20% y marcados con azul
de Coomassie. Se calienta una muestra tratada mediante DMS 50 mM
durante 3 min a 95ºC, antes de la electroforesis para disociar los
oligómeros no covalentes. (b) La proteína NS1 purificada se trata
durante una noche a 37ºC mediante 0,5% o 1% de
n-octilglucosido (nOG) y, eventualmente, se trata con 25 mM
de DMS durante 1 hora. Las proteínas se separan sin
desnaturalización en caliente sobre un gel de acrilamida de
gradiente 4 al 20%, y se detecta mediante inmunotransferencia con un
anticuerpo monoclonal anti-NS1 de la literatura, o
como se ha definido anteriormente,
- la figura 2 representa la secuencia de la
proteína NS1 del virus del dengue de serotipo 1, obtenido mediante
el clon 4C del ejemplo 2, así como la secuencia codificadora
correspondiente,
- la figura 3 ilustra los resultados obtenidos
mediante dosificación de la proteína NS1 circulante mediante el
método de detección con ELISA-captura en pacientes
previamente infectados por un virus del dengue, cuyo suero se ha
extraído durante las fases agudas y de convalecencia, así como la
comparación con los resultados obtenidos mediante los métodos de la
técnica anterior IHA (inhibición de hemoaglutinación de los
serotipos 1, 2, 3 ó 4 del virus del dengue) y MAC ELISA
(Immunoglobulin M Antibody Capture Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay); D1 corresponde al serotipo 1 del dengue;
D2 corresponde al serotipo 2 del dengue; D3 corresponde al serotipo
3 del dengue y D4 corresponde al serotipo 4 del dengue; ID =
identidad del enfermo; 1 corresponde a la primera extracción en fase
aguda de la enfermedad; 2 corresponde a la segunda extracción en
fase de convalecencia (efectuada de 2 a 4 semanas después de la
primera); en el test ELISA-captura, los valores se
expresan en densidad óptica, obtenidos para un mismo suero diluido
10, 30 ó 90 veces,
- la figura 4 ilustra la detección de la proteína
NS1 mediante el test ELISA-captura en sueros de
pacientes infectados por el virus del dengue del serotipo 1 de
Guayana francesa. Las cifras indicadas representan el número de
pacientes repartidos por categorías (positividad o negatividad en
ELISA-captura y positividad o negatividad en
IgM),
- la figura 5 ilustra los resultados obtenidos
para 4 pacientes de Guyana francesa infectados por el virus del
dengue 1, con extracción diaria durante la fase clínica de la
enfermedad, entre D1 y D5. Cada gráfico corresponde a un paciente
con, para cada día de extracción, al mismo tiempo, los resultados de
la detección de la proteína NS1 con el test
ELISA-captura desarrollado, los resultados de
RT-PCR y los resultados obtenidos mediante la
técnica MAC-ELISA. Los valores de D.O. mostrados se
han corregido en una vez el valor del ruido de fondo. Los umbrales
de positividad se indican mediante los trazos discontinuos.
- La figura 6 indica las características de los
anticuerpos monoclonales anti-NS1 F22 y G18,
- La figura 7 ilustra la detección de la proteína
NS1 mediante el test ELISA-captura que utiliza el
enfoque monoclonal, en comparación con el test
ELISA-captura que utiliza el enfoque policlonal,
como se describe en el ejemplo 3. Los resultados obtenidos se
muestran en forma de valores de densidad óptica medida para cada
dilución de suero analizado (10, 30 ó 90), restados del valor medio
de los testigos negativos.
- La figura 8 ilustra la puesta en evidencia de
la proteína NS1 en los sueros de pacientes infectados por el virus
de la fiebre amarilla, mediante un test
ELISA-captura específico de la fiebre amarilla. Para
cada suero testado, se indica el valor de densidad óptica medido por
el test desarrollado, restado del valor medio de los testigos
negativos, el valor de densidad óptica medido por el test
MAC-ELISA específico de los IgM de la fiebre
amarilla, y los resultados del aislamiento viral, si están
disponibles.
La proteína se produce en células Vero infectadas
por el virus del dengue, serotipo 1, cepa FGA/89 (P. Después y
otros, Virol, (1993), 196, 209-219), en las
condiciones adaptadas del método descrito por A.K.I. Falconar y
otros, (J. Virol. Meth., (1990), 30,
323-332).
Se recolecta el medio de cultivo 5 días después
de la infección, y se centrifuga a 1.500 g, para eliminar los restos
celulares. El sobrenadante de la centrifugación se rebaja a 20 mM
Tris-HCl, 1 mM azida de sodio, concentrado 6 veces
mediante ultrafiltración en frío, y se eliminan las partículas
virales mediante precipitación de 2 h a 4ºC, en una concentración
del 7,5% de polietilenglicol (PEG), seguida de un centrifugado de 30
min a 10.000 g. El sobrenadante enjuagado, con 7,5% de PEG, se trata
con 0,05% de Tween 20 y 1 mg/ml de aprotinina, y se pasa a una
columna de inmunoafinidad en la que está fijado un anticuerpo
monoclonal anti-NS1. La proteína es eluida según la
técnica con dietilamina, tal como se describe en Falconar y otros,
(ya mencionado), concentrada mediante ultrafiltración y la solución
de elusión es intercambiada por un tampón 10 nM
Tris-HCl pH 7,5 que contiene 1 nM de azida de
sodio.
Los resultados se ilustran en la figura 1.
La figura 1a muestra que la proteína NS1 está en
forma hexamérica. La proporción de forma hexamérica aumenta con una
concentración creciente de DMS (Figura 1a).
La proteína en forma hexamérica extracelular NSI
puede transformarse en subunidades diméricas, en presencia del
detergente no iónico n-octilglucósido (nOG) (figura 1b).
Tras una noche a 37ºC en la ausencia o la presencia de
n-octilglucósido (nOG) y tratamiento con DMS 25 mM,
se observa, en la ausencia de nOG, la presencia de bandas
correspondientes al dímero, al tetrámero y al hexámero y, en
presencia de nOG, una disociación parcial o completa del hexámero,
en función de la concentración de nOG (figura 1b).
El plásmido
pClneo-NS1-FGA depositado en la
Colección Nacional de Cultivos y Microorganismos (CNCM) del
Instituto Pasteur, con el nº 1-2220, con fecha 7 de
junio de 1999, que contiene el gen de la proteína NS1 que incluye, a
su vez, el gen codificador para su péptido señal, precedido de un
codón de inicio de la traducción y seguido por un codón de
terminación de la traducción, se introduce en la bacteria adecuada
Escherichia coli (Epicurian SURE de Stratagène). Este
plásmido se amplia en un cultivo bacteriano y se purifica según la
técnica clásica de preparación de ADN plasmídico. Se utiliza el ADN
purificado para la secuenciación de distintos clones (la secuencia
del clon 4C se ilustra en la figura 2) y para transfectar células
Vero, bien mediante una mezcla adecuada con liposomas catiónicos,
como el DOTAP (Boehringer-Mannheim), bien mediante
un agente no liposomal, como el FuGENE
(Boehringer-Mannheim). El FuGENE y el ADN se
preincuban en un medio sin suero durante 15 min, y se pone la mezcla
en contacto con un tapiz celular de células Vero durante 24 h. A
continuación, se enjuagan las células mediante PBS (phosphate
saline buffer), se fijan durante 20 min a temperatura ambiente
con una solución de PBS con un 3% de paraformaldehido, y se
permeabilizan durante 5 min con PBS con un 0,5% de Triton
X-100. La presencia de antígeno NS1 queda entonces
revelada mediante anticuerpos específicos, reconocidos por un
anticuerpo conjugado marcado con fluoresceína.
De este modo, es posible poner en evidencia
mediante una señal fluorescente elevada, específica del antígeno
viral NS1, alrededor del 20% de las células transfectadas.
La expresión de NS1 queda así demostrada,
pudiéndose establecer linajes estables en presencia de neomicina,
marcador de selección de las células transfectadas.
La figura 2 ilustra la secuencia de la proteína
NS1 del virus del dengue del serotipo 1 así obtenido, así como la
secuencia codificadora correspondiente.
El antígeno viral NS1 es capturado por
anticuerpos policlonales de ratón monoespecíficos, previamente
purificados mediante inmunocaptura en la proteína NS1 hexamérica
purificada de dengue, serotipo 1.
La presencia de NS1 es revelada por anticuerpos
de conejo inmunizados mediante la proteína NS1 hexamérica
purificada, a su vez reconocidos por anticuerpos conjugados a la
peroxidasa de rábano.
Se purifica la proteína NS1 y se fija mediante
absorción sobre una membrana de nailon amfotérico (Nutran,
Schleicher & Schuell). Se satura entonces la superficie de la
membrana mediante albúmina bovina presente en una concentración del
3% en una solución salina tamponada con fosfato (PBS: phosphate
buffer saline; 10 mM fosfato; pH 7,2; 150 mM NaCl). Tras 2
enjuagues con PBS, se trata la membrana con PBS con un 0,25% de
glutaraldehído durante 15 min, a temperatura ambiente. Tras 3
enjuagues con PBS, se neutraliza la membrana con un tampón de 100 mM
glicina, 3% albúmina bovina, se enjuaga 2 veces en PBS y se conserva
a 4ºC en PBS con azida de sodio 1 mM.
- -
- producción de los ascites poligonales: se trituran los cerebros de ratoncillos Swiss infectados por el virus del dengue y moribundos, en 9 ml de tampón PBS. El producto se centrifuga durante 10 min a 10.000 g y a 4ºC.
Se inyecta la suspensión viral a ratones Swiss,
según el siguiente calendario:
- -
- D0: 0,5 ml de antígeno en subcutáneo en el muslo,
- -
- D3: 0,4 ml de antígeno y 0,1 ml de adyuvante completo de Freund por vía intraperitoneal,
- -
- D25: 0,5 ml de antígeno por vía intraperitoneal,
- -
- D26: 0,5 ml de ascite de ratón TG180, y
- -
- D28: 0,5 ml de antígeno por vía intraperitoneal.
Se recolectan los ascites en D42.
Tras la recogida de ascites, se deja formar el
coágulo durante 1 hora a temperatura ambiente, y se realiza una
centrifugación durante, por lo menos, 30 minutos a 1.500 g.Se deja
el sobrenadante durante una noche a 4ºC. Se ajusta el pH del
sobrenadante a 4,8 mediante ácido acético 2M, y se centrifuga de
nuevo el sobrenadante en las mismas condiciones. Se eleva el pH del
sobrenadante a 7,0-7,2 mediante adición de una
solución de sosa 2N. El sobrenadante puede conservarse a -20ºC.
- -
- purificación de los anticuerpos de ratón específicos del virus del dengue del serotipo 1:
Se incuba la membrana durante una hora a
temperatura ambiente, en una mezcla de ascites poligonales dirigidos
contra los 4 serotipos del virus del dengue, preparadas como se ha
descrito anteriormente.
Tras 3 enjuagues de la membrana en PBS, se eluyen
los anticuerpos fijados a la proteína NS1 mediante una solución de
dietilaminapH 11,4 (medio Dubelco modificado por Iscove (Gibco) con
100 mM de dietilamina). Se concentran los anticuerpos mediante
ultrafiltración y se colocan en un tampón PBS con azida de sodio 1
mM.
La inmunización de los conejos se ha realizado
mediante 3 ó 4 inyecciones sucesivas de 30 \mug de proteína NS1
hexamérica purificada según el método del ejemplo 1, efectuadas en
D0, D7, D21 y, eventualmente, D49, seguidas de un desangrado en D83.
El suero está empobrecido en señales no específicas por incubación
con microesferas de Sépharose portando un anticuerpo monoclonal,
descrito en la literatura o preparado como se ha descrito
anteriormente.
Para cada placa ELISA-captura
destinada a testar sueros humanos, se realiza una gama patrón a
partir de una solución de proteína NS1 purificada según el método
descrito en el punto 1, cuya concentración inicial es de 0,5
\mug/ml y diluida de 3 en 3.
Los anticuerpos policlonales de ratón
purificados, obtenidos según el método descrito anteriormente
(anticuerpos de captura) son fijados a una placa, diluidos en una
solución de PBS y puestos a incubar durante una noche a 4ºC. Tras 3
enjuagues de 5 minutos con una solución de PBS/Tween 0,05%, se
satura la placa con una mezcla de PBS/Tween 0,05% y leche 3%,
durante 30 minutos a temperatura ambiente. Tras 3 enjuagues con una
solución de PBS/Tween 0,05%, se depositan los sueros a testar,
diluidos o no, y se deja reaccionar durante una hora, simpre a
temperatura ambiente. Las diluciones a 1/10, 1/30 y 1/90 se realizan
en una solución de PBS/Tween 0,05%. Tras 3 enjuagues, se añade el
segundo anticuerpo específico de NS1 (anticuerpo de revelación
obtenido en el punto 3 anterior), tras haberlo diluido en una mezcla
de PBS/Tween 0,05% y leche 3%, y se dejan incubar durante 45 minutos
a 37ºC. Tras 3 enjuagues, se añade el anticuerpo
anti-IgG dirigido contra el segundo anticuerpo y
marcado con peroxidasa, habiéndose preparado dicho anticuerpo en
condiciones clásicas conocidas del especialista, a la incubación
realizada durante 45 minutos a 37ºC. Tras 3 enjuagues, se revela
durante 10 minutos mediante una solución de TMB (3,3',
5,5'-tetrametilbencidina, Kierkegaard & Perry
Lab.). Se detiene la reacción colorimétrica mediante ácido
sulfúrico.
Se ilustran en la figura 3.
La técnica ELISA-captura de la
invención permite detectar la presencia de la proteína NS1 en la
fase aguda de la enfermedad, con independencia del hecho de que los
enfermos tengan una infección primaria o secundaria.
Los resultados confirman que la presencia de la
proteína NS1 es transitoria, ya que en las extracciones realizadas
en fase de convalecencia no se detecta esta proteína (figura
3).
El 93% de las extracciones en la fase aguda de la
enfermedad se revelan negativas mediante el test
MAC-ELISA, mientras que el 100% de las extracciones
realizadas en la fase de convalecencia se revela positivo en este
mismo test (figura 3).
Del mismo modo, el test de inhibición de
hemoaglutinación (IHA) no permite detectar la infección por el virus
del dengue del serotipo 1 en el 80% de los casos en fase aguda de
la enfermedad, pero este test se revela positivo en el 100% de las
extracciones realizadas en fase de convalecencia (figura 3). Según
los criterios de la OMS, una tasa de IHA inferior a 1280 en el suero
extraído en fase de convalecencia permite diagnosticar una infección
de dengue primaria y una tasa superior a 1280 una infección de
dengue secundaria. La mitad de los sueros positivos de este estudio
corresponden pues a casos de dengue primario, y la otra mitad a
casos de dengue secundario. La técnica ELISA-captura
de la invención permite así detectar proteína NS1 en los casos de
dengue primario y secundario.
Las extracciones se realizan en pacientes
infectados por el virus del dengue del serotipo 1, entre D0, que
marca la aparición de los signos clínicos (inicialmente una fiebre
indiferenciada), y D66, correspondiente al final de la fase de
convalecencia.
En los sueros de dichos pacientes, se busca la
presencia de NS1 circulante, según el método
ELISA-captura descrito en el ejemplo 3, y se compara
el resultado obtenido con la positividad de IgM específicos medida
en MAC-ELISA, si los datos están disponibles.
Se ha extraído sangre a cuatro pacientes
diariamente, durante la fase clínica de D1 a D5. En cada extracción
sanguínea, se ha realizado una reacción de RT-PCR
para poner en evidencia el ARN viral, un test
MAC-ELISA para la detección de IgM específicos del
virus del dengue, y una búsqueda del antígeno NS1 dengue, según el
método ELISA-captura descrito anteriormente.
Los resultados están recogidos en la figura
4.
Entre D1 y D6, la posibilidad de detectar la
proteína NS1 circulante oscila entre el 64% (en D2) y el 100% (en
D6) de los pacientes infectados. Pasado D10, no se detecta la
proteína NS1 circulante, mientras que la respuesta en anticuerpos se
vuelve predominante.
La detección de la proteína NS1 circulante no
parece depender de la presencia de IgM totales (específicos de los
antígenos virales) que aparecen en algunos casos en D3 y culminan a
partir de D5, ni siquiera, en algunos pacientes, de la presencia de
IgG totales que pueden aparecer desde D2. Por el contrario, la
ausencia de detección del antígeno NS1 en sueros de la fase clínica
podría explicarse por la presencia de IgG específicamente dirigidas
contra NS1.
De este modo, la ventana de detección del
antígeno sérico NS1 mediante la técnica
ELISA-captura de la presente invención se sitúa
preferiblemente entre D1 y D6, tras la aparición de los signos
clínicos.
Los resultados están recogidos en la figura
5.
En los 4 pacientes estudiados, se detecta la
proteína NS1 de manera continua hasta D5, cualquiera que sea el día
de extracción con relación al inicio de los síntomas. Para algunos
pacientes, la ventana de detección de la proteína es más amplia que
el período de viremia, detectado mediante
RT-PCR.
La inmunización de ratones Balb/C hembras se ha
realizado mediante 7 inyecciones de 10 \mug de proteína NS1 del
virus del dengue serotipo 1, hexamérica, purificada según el método
del ejemplo 1. La primera inyección de adyuvante completo de Freund
y las cinco siguientes de adyuvante incompleto de Freund se realizan
por vía subcutánea, con 15 días de intervalo. La última inyección de
adyuvante incompleto de Freund, practicada tres días antes del
sacrificio del animal, se efectúa por vía intraperitoneal.
Las células del bazo del ratón inmunizadas son
fusionadas con el mieloma murino y se ponen en cultivo hasta la
aparición de los clones, según el protocolo estándar.
La detección de los anticuerpos específicos de la
proteína NS1 se ha realizado, bien mediante una técnica ELISA
clásica, bien mediante una técnica
ELISA-captura.
La proteína NS1 hexamérica purificada según el
método del ejemplo 1 se fija por absorción sobre una placa, con una
concentración de 1 \mug/ml en solución de PBS, durante una noche,
a 4ºC. Tras 3 lavados con una solución de PBS/Tween 0,1% (PT), se
incuba la proteína con los sobrenadantes de los distintos hibridomas
diluidos al ½ con una solución de PT con el 0,5% de gelatina (PTG),
durante 1 h a 37ºC. Tras 3 lavados con PT, se añade y se incuba el
anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con peroxidasa
y diluido en PTG, durante 1 h a 37ºC. Tras 3 lavados, se revela
mediante una solución de agua oxigenada, en presencia de
ortofenilendiamina.
La técnica utilizada se describe en el ejemplo 3
(véase Detección de la proteína NS1 circulante en la fase aguda),
pero sustituyendo las diluciones de sueros a testar por una dilución
a 1/10 en la solución PTG de sobrenadante de cultivo de células Vero
no infectadas o infectadas durante 5 días por el virus del dengue
serotipo 1, y precipitado con un 7% de polietilenglicol (véase
ejemplo 1: purificación de la proteína NS1 del virus del dengue
serotipo 1). La reactividad de los sobrenadantes de los distintos
hibridomas frente al sobrenadante de cultivo de células Vero no
infectadas sirve de testigo de señal no específica.
Se infectan las células Vero durante 40 h, con
uno de los 4 serotipos del virus del dengue:
serotipo 1: cepa FGA/89
serotipo 2: cepa NG
serotipo 3: cepa H87
serotipo 4: cepa H241
Tras 1 lavado con una solución de PBS, se fijan
las células mediante una solución de paraformaldehído al 3% de PBS,
durante 30 minutos a la temperatura del laboratorio. Las células
enjuagadas en PBS se permeabilizan mediante una solución de Triton
X-100 al 0,5% de PBS, durante 10 minutos. Tras un
enjuague con PBS, se incuban las células durante 1 h con los
sobrenadantes de los distintos hibridomas que han reaccionado
positivamente en ELISA. Tras 3 lavados con PBS, se añade y se incuba
el anticuerpo anti-IgG de ratón marcado con
fluoresceína, durante 1 h. Tras 3 lavados con PBS, se cubren los
portaobjetos con láminas y se observan con un microscopio de
fluorescencia.
Los ascites monoclonales se producen en ratones
Balb/C. Los ratones reciben una inyección intraperitoneal de 0,5 ml
de pristane
(2,6,10,14-tetrametil-pentadecane
Sigma), una semana antes de la inyección intraperitoneal del clon
hibridoma que segrega el anticuerpo monoclonal. Se extraen los
ascites a medida que se forman, se centrifugan a 1.500 rpm, durante
20 mn y se conservan a -20ºC.
La determinación del isotipo del anticuerpo
anti-nSI se efectúa mediante ELISA, por medio de
anticuerpos dirigidos contra las distintas subclases de
inmunoglobulinas murinas: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3. La determinación
de la cadena ligera de la inmunoglobulina se realiza mediante una
metodología idéntica.
La afinidad de un anticuerpo corresponde a la
concentración de antígeno necesaria para saturar el 50% de los
sitios del anticuerpo. Se realiza una incubación en medio líquido,
entre el anticuerpo de concentración constante y el antígeno de
concentración decreciente, durante 1 noche, a 4ºC, con el fin de
alcanzar el equilibrio de la reacción. La concentración de
anticuerpos libre, tras el equilibrio, se determina mediante un
test ELISA; se deposita la mezcla en una placa previamente incubada
con el antígeno. Tras una incubación de 20 minutos a 4ºC (para
evitar un desplazamiento del equilibrio), el revelado de ELISA se
efectúa con un anti-IgG de ratón acoplado a la B
galactosidasa, seguido de la reacción encimática. A continuación, se
determina la constante de disociación KD.
Esta versión permite determinar la especificidad
de los anticuerpos monoclonales frente a un mismo epitope o epitopes
distintos. La determinación epitópica pone en juego la reactividad
para un antígeno, un anticuerpo monoclonal no marcado y un segundo
anticuerpo monoclonal acoplado a la biotina.
El primer anticuerpo monoclonal no marcado se
coloca en concentración saturante (previamente determinada por
ELISA) en un placa en la que se ha fijado previamente el antígeno, y
se ha incubado durante 2 h a 37ºC. Tras 4 lavados en una solución PT
a 4ºC, se añade el segundo anticuerpo monoclonal acoplado a la
biotina, y se incuba durante 20 minutos a 4ºC: Tras 4 lavados en una
solución PT a 4ºC, se añade la solución de conjugado estreptavidina
marcada con peroxidasa, y se incuba durante 1 h a 37ºC. Tras 4
lavados en una solución PT, se revela mediante una solución de agua
oxigenada, en presencia de ortofenildiamina. La obtención de una
señal tras lectura mediante espectrofotómetro indica que los
epitopes reconocidos por los 2 anticuerpos son distintos. En el caso
inverso, los 2 anticuerpos monoclonales son dirigidos contra el
mismo epitope del antígeno.
Los anticuerpos G18 y F22 se purifican mediante
inmunoafinidad, como se describe en el ejemplo 3.
Los anticuerpos monoclonales purificados G18 y
F22 se mezclan en una solución de PBS a una dilución dada, y se
ponen a incubar una noche a 4ºC. Las etapas siguientes de este test
ELISA se parecen a las del ejemplo anterior.
El mismo día, se ha testado un panel de suero de
Guayana francesa mediante el test ELISA-captura,
utilizando el enfoque monoclonal, y el que utiliza el enfoque
policlonal. Los sueros son testados en distintas diluciones: 1/10,
1/30 y 1/90.
Los resultados están recogidos en la figura
6.
Se han seleccionado los anticuerpos G18 y F22 por
su capacidad para fijarse, con una gran afinidad, a epitopes
distintos de 1a proteína NS1. El anticuerpo F22 es específico del
serotipo 1, y G18 de los serotipos 1 y 3 del virus del dengue.
Los resultados están recogidos en la figura
7.
Los anticuerpos monoclonales seleccionados no
sólo reproducen los resultados obtenidos con el enfoque policlonal,
si no que presentan reactividades más marcadas que los anticuerpos
policlonales. La herramienta monoclonal desarrollada parece pues
estar especialmente adaptada al uso diagnóstico que debe
efectuarse.
Se infectan las células Vero bien con el virus
dengue 2, bien por el virus de la encefalitis japonesa o el virus
de la fiebre amarilla. Los sobrenadantes de cultivo se preparan, a
continuación, según el método descrito en el ejemplo 1.
Los ascites monoclonales de los anticuerpos 8G4,
1A5 y 2D10 (J.J. Schlessinger y otros, Virology, (1983), 125,
8-17) dirigidos contra la proteína NS1 del virus de
la fiebre amarilla, y anticuerpos
171-2-2 y
70-14-20 dirigidos contra la
proteína NS1 del virus de la encefalitis japonesa se purifican en
microesferas de proteína A Sepharose CL-4B
(Pharmacia Biotech). Estos ascites monoclonales se ponen a incubar
durante una noche a 4ºC en las microesferas de proteína A. Tras 3
lavados de las microesferas en PBS/Tween 0,05%, los anticuerpos
fijados en las microesferas de proteína A se eluyen con una solución
de tampón glicina pH=3. A continuación, se concentran mediante
ultrafiltración y se colocan de nuevo en un tampón PBS con azida de
sodio 1 mM.
La etapa de captura se realiza con una mezcla de
los ascites de los anticuerpos monoclonales 3D1.4 y 1A12 (A.K.I.
Falconar y otros, Arch. Virology, (1994), 137,
315-326). El reconocimiento de la proteína se
efectúa, a continuación, con una mezcla de dos anticuerpos de
conejo: el suero obtenido tras inmunización mediante la proteína
purificada descrita en el ejemplo 3, y un suero de conejo obtenido
tras inmunización mediante el virus de los cuatro serotipos de
dengue.
La técnica utilizada es la misma que la descrita
en el ejemplo 3.
Los anticuerpos monoclonales
171-2-2 y
70-14-20 purificados se utilizan
para la etapa de captura. El reconocimiento de la proteína se
efectúa, a continuación, mediante una mezcla de dos sueros de conejo
previamente inmunizados con proteínas recombinadas de la proteína
NS1 de la encefalitis japonesa.
La técnica utilizada es la misma que la descrita
en el ejemplo 3.
Los anticuerpos monoclonales 8G4, 1A5 y 2D10
purificados son mezclados con una dilución dada en una solución de
PBS, y utilizados como anticuerpos de captura. El segundo anticuerpo
específico de NS1 fiebre amarilla utilizado procede de un suero de
conejo previamente inmunizado contra la proteína NS1 del virus 17D
de la fiebre amarilla (J.J. Schlessinger y otros, J. immunol.,
(1985), 135, 2805-2809).
La técnica utilizada es la misma que la descrita
en el ejemplo 3.
La secreción de la proteína NS1 ha sido
previamente aportada en cultivos celulares in vitro
infectados por distintos flavivirus, el virus del DEN2 (Winkler y
otros, Virology (1988), 162, 187-196, Prior y
otros, Virology (1993), 194, 769-780), de la
encefalitis por garrapata (Lee y otros, J. Gen. Virol.
(1989), 70, 335-343, Crooks y otros, J.
Chrom, (1990), 502, 59-68, Crooks y otros,
J. Gen. Virol. (1994), 75,
3453-3460), de la encefalitis japonesa (Mason,
Virology, (1989), 169, 354-364, Fan y otros,
Virology (1990), 177, 470-478), de la
encefalitis del valle de Murria (may y otros, J. Virol.
Meth. (1991), 32, 11-20) y de la fiebre amarilla
(Post y otros, Vir. Res. (1990), 18,
291-302). Dado que estos resultados han sido
obtenidos mediante técnicas distintas de ELISA, hemos intentado
poner en evidencia la proteína mediante la técnica
ELISA-captura de la presente invención, en
sobrenadantes de células de mamíferos infectados.
La proteína NS1 es detectable en los
sobrenadantes de cultivo de células Vero infectadas, bien por el
virus DEN2, bien por el virus de la encefalitis japonesa o el virus
de la fiebre amarilla.
Asimismo, se ha podido poner en evidencia la
proteína mediante esta técnica en sueros de pacientes infectados por
el virus de la fiebre amarilla, como lo muestran los resultados
recogidos en la figura 8. Entre los 18 sueros generosamente
suministrados por Ch. Mathiot (Instituto Pasteur de Dakar), 7 son
positivos en antigenemia NS1 y, como para el virus DEN1, la
detección de la proteína NS1 circulante parece indiferente a la
presencia de IgM específicas de la fiebre amarilla.
La técnica ELISA-captura de la
presente invención permite detectar proteína NS1 en los
sobrenadantes de cultivo de células infectadas por distintos
flavivirus y en los sueros de los pacientes infectados por el virus
de la fiebre amarilla. Por ello, podría tener una aplicación
diagnóstica para detectar una infección por otros flavivirus
distintos del virus DEN1.
<110> INSTITUTO PASTEUR
FLAMAND Marie
MEGRET Françoise
A Sophie
TALARMIN Antoine
DESPRES Philippe
DEUBEL Vincent
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODO DE DETECCIÓN PRECOZ DE LOS
FLAVIVIRUS Y SUS APLICACIONES
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> S228FR78B
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> FR9907290
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-06-09
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1137
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína NS1 tipo 1 del virus del
Dengue
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 378
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Proteína NS1 tipo 1 del virus del
Dengue
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
Claims (20)
1. Método de detección precoz de una infección
flaviviral, caracterizada porque incluye la detección de la
glicoproteína no estructural NS1 de un flavivirus en una muestra
biológica, durante toda la duración de la fase clínica de la
infección, mediante un método inmunológico que emplea, por lo menos,
dos anticuerpos idénticos o distintos,
- -
- formándose el primer anticuerpo o anticuerpo de captura de la glicoproteína NS1 por anticuerpos elegidos en el grupo constituido por:
- \bullet
- anticuerpos policlonales previamente seleccionados mediante inmunocaptura sobre la proteína NS1 de dicho flavivirus, en forma hexamérica, y
- \bullet
- mezclas de anticuerpos monoclonales anti-NS1 previamente seleccionados por su elevada afinidad con la proteína NS1 de dicho flavivirus, en forma hexamérica, purificándose a continuación dichos anticuerpos monoclonales,
- -
- eligiéndose el segundo anticuerpo o anticuerpo de revelación en el grupo constituido por:
- \bullet
- anticuerpos policlonales dirigidos contra la proteína NS1 en forma hexamérica, y
- \bullet
- una mezcla de anticuerpos monoclonales dirigidos contra una proteína NS1 en forma hexamérica.
2. Método de detección, según la reivindicación
1, caracterizado porque la infección flaviviral es una
infección por el virus del dengue.
3. Método de detección, según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque el primer
anticuerpo está fijado a un soporte sólido adecuado y el segundo
anticuerpo está eventualmente conjugado a un marcador adecuado.
4. Método de detección, según la reivindicación
3, caracterizado porque cuando el segundo anticuerpo no está
conjugado a un marcador, su unión a la proteína NS1 fijada al
soporte sólido es detectada por un tercer anticuerpo conjugado a un
marcador adecuado.
5. Método de detección, según la reivindicación
4, caracterizado porque el tercer anticuerpo está conjugado a
una enzima.
6. Método de detección, según la reivindicación
5, caracterizado porque:
- -
- el primer anticuerpo o anticuerpo de captura está formado por anticuerpos policlonales de ratón, seleccionados mediante inmunocaptura en la proteína NS1 del virus del dengue, encontrándose dicha proteína en forma hexamérica, y
- -
- el segundo anticuerpo o anticuerpo de detección de la presencia de NS1 en la muestra biológica a analizar está formado por anticuerpos policlonales de conejo inmunizado mediante la proteína NS1 del virus del dengue del serotipo 1, encontrándose dicha proteína en forma hexamérica, revelándose la fijación de dicho segundo anticuerpo por un tercer anticuerpo constituido por anticuerpos conjugados a la peroxidasa y dirigidos contra el segundo anticuerpo.
7. Kit de diagnóstico precoz de una infección
flaviviral, caracterizado porque incluye:
- -
- por lo menos un anticuerpo de captura y por lo menos un anticuerpo de revelación tal como se definen en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,
- -
- por lo menos un control positivo constituido por la proteína de un flavivirus y/o de distintos serotipos, según el flavivirus, encontrándose dicha proteína en forma hexamérica, y
- -
- por lo menos un control negativo constituido por un suero humano normal.
8. Kit de diagnóstico, según la reivindicación 7,
caracterizado porque dicha proteína NS1 se obtiene a partir
de un sobrenadante de cultivo, bien de células de mamíferos
infectadas, bien de células de mamíferos transfectadas por un
plásmido recombinado, que incluye el gen de la proteína NS1 de un
flavivirus o un fragmento de dicho gen o un fragmento del genoma
flaviviral, siendo capaces dichos fragmentos de expresar todo o
parte de la proteína NS1.
9. Kit de diagnóstico precoz de una infección
flaviviral, según una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8,
caracterizado porque la proteína NS1 es la del virus del
dengue.
10. Kit de diagnóstico precoz de una infección
flaviviral, según una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9,
caracterizado porque se ha depositado dicho plásmido en la
Colección Nacional de Cultivos y Microorganismos gestionada por el
Instituto Pasteur, con el número 1-2220, con fecha
7 de junio de 1999.
11. Procedimiento de purificación de la proteína
NS1 de un flavivirus, en forma hexamérica, a partir de un
sobrenadante de cultivo, bien de células de mamíferos infectadas,
bien de células de mamíferos transfectadas por un plásmido
recombinado, que incluye el gen de la proteína NS1 o un fragmento de
dicho gen o un fragmento del genoma flaviviral, siendo dichos
fragmentos capaces de expresar la proteína NS1,
caracterizado porque, previamente a la purificación de la
proteína NS1 mediante las técnicas clásicas, incluye una etapa de
separación de la forma soluble de la proteína NS1 de la forma
microparticular de dicha proteína, mediante tratamiento con un
agente precipitante y mediante centrifugación.
12. Compuesto inmunógeno caracterizado
porque incluye, a título de principio activo, la proteína NS1 de un
flavivirus, en forma hexamérica, eventualmente asociada a otras
proteína, en asociación con, por lo menos, un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
13. Compuesto inmunógeno, según la reivindicación
12, caracterizado porque incluye por lo menos una mezcla de
las proteínas NS1, en forma hexamérica, correspondiente a los
distintos serotipos del virus del dengue.
14. Utilización de la proteína NS1, en forma
hexamérica, o uno de sus sistemas de expresión, para la preparación
de un compuesto inmunogénico capaz de inducir la producción de
anticuerpos in vivo.
15. Utilización de, por lo menos, un anticuerpo
monoclonal anti-NS1, que presenta una elevada
afinidad con la proteína NS1 en forma hexamérica, siendo dicha
forma no degradada, purificándose a continuación dichos anticuerpos
monoclonales, y modificándose para la fabricación de un medicamento
capaz de inducir una inmunización pasiva.
16. Utilización de la proteína NS1 en forma
hexamérica, siendo dicha forma no degradada, para seleccionar in
vitro anticuerpos específicos anti-NS1 aptos
para el diagnóstico precoz de una infección por un flavivirus.
17. Compuesto inmunógeno caracterizado
porque incluye un principio activo seleccionado en el grupo
constituido por:
- -
- un polinucleótido capaz de expresar todo o parte de la proteína NS1 del virus del dengue, cualquiera que sea su serotipo, y
- -
- un sistema de expresión que incluye, por lo menos, un promotor capaz de hacer expresar en el huésped en el que se inyecta, el ADN codificador para la proteína NS1 del virus del dengue, cualquiera que sea su serotipo, expresando dicho gen dicha proteína,
en asociación con, por lo menos, un
vehículo farmacéuticamente
aceptable.
18. Procedimiento de expresión de un
polinucleótido codificador para la proteína NS1 de un virus del
dengue caracterizado porque incluye la expresión de un
polinucleótido, tal como se define en la secuencia SEQ ID Nº 1,
asociado a un promotor de dicho polinucleótido en células
eucariotas adecuadas.
19. Procedimiento de purificación de la proteína
NS1, según la reivindicación 11, caracterizado porque el
flavivirus es un virus del dengue, cualquiera que sea su
serotipo.
20. Procedimiento de purificación de la proteína
NS1, según las reivindicaciones 11 y 19, caracterizado
porque el flavivirus es un virus del dengue del serotipo 1.
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