JP2003501661A - Ｎｓ１糖タンパク質を用いるフラビウイルスの早期検出 - Google Patents
Ｎｓ１糖タンパク質を用いるフラビウイルスの早期検出Info
- Publication number
- JP2003501661A JP2003501661A JP2001501889A JP2001501889A JP2003501661A JP 2003501661 A JP2003501661 A JP 2003501661A JP 2001501889 A JP2001501889 A JP 2001501889A JP 2001501889 A JP2001501889 A JP 2001501889A JP 2003501661 A JP2003501661 A JP 2003501661A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protein
- antibody
- flavivirus
- dengue virus
- antibodies
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 title claims abstract description 35
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 title claims description 6
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 title claims description 6
- 101710158312 DNA-binding protein HU-beta Proteins 0.000 claims abstract description 162
- 101710128560 Initiator protein NS1 Proteins 0.000 claims abstract description 162
- 101710144127 Non-structural protein 1 Proteins 0.000 claims abstract description 162
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 79
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 27
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 62
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 58
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 52
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 claims description 33
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 claims description 31
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 24
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 24
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 20
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 claims description 16
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 claims description 11
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 10
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 8
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 7
- 238000003312 immunocapture Methods 0.000 claims description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 6
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 6
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 claims description 5
- 108700004715 Flavivirus NS1 Proteins 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 claims 3
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 claims 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 claims 1
- 101710195254 Non-structural glycoprotein Proteins 0.000 abstract description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 37
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 30
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 30
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 30
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 21
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 21
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 18
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 description 12
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 description 12
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 11
- HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N octyl beta-D-glucopyranoside Chemical compound CCCCCCCCO[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HEGSGKPQLMEBJL-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 11
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 11
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 10
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 description 10
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 10
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N dimethyl octanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCCCC(=N)OC FRTGEIHSCHXMTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 8
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 description 8
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 8
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 7
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 6
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 5
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 5
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000710827 Dengue virus 1 Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000708009 Homo sapiens Sentrin-specific protease 8 Proteins 0.000 description 3
- 102100031407 Sentrin-specific protease 8 Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 3
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 3
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 3
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 3
- 201000002950 dengue hemorrhagic fever Diseases 0.000 description 3
- HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N diethylamine Chemical compound CCNCC HPNMFZURTQLUMO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 3
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 2
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 2
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101001028244 Onchocerca volvulus Fatty-acid and retinol-binding protein 1 Proteins 0.000 description 2
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 208000009714 Severe Dengue Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000710771 Tick-borne encephalitis virus Species 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000256111 Aedes <genus> Species 0.000 description 1
- 241000256118 Aedes aegypti Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241001566735 Archon Species 0.000 description 1
- 208000008035 Back Pain Diseases 0.000 description 1
- 101100298998 Caenorhabditis elegans pbs-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100032566 Carbonic anhydrase-related protein 10 Human genes 0.000 description 1
- 241000710815 Dengue virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000867836 Homo sapiens Carbonic anhydrase-related protein 10 Proteins 0.000 description 1
- 101000879758 Homo sapiens Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010021137 Hypovolaemia Diseases 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000013463 Immunoglobulin Light Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010065825 Immunoglobulin Light Chains Proteins 0.000 description 1
- 206010024238 Leptospirosis Diseases 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- -1 NS2B Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 101800001030 Non-structural protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 1
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 208000002193 Pain Diseases 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 208000004880 Polyuria Diseases 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 206010037868 Rash maculo-papular Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 102100037330 Sjoegren syndrome nuclear autoantigen 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 206010058874 Viraemia Diseases 0.000 description 1
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002506 adulticidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001754 anti-pyretic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002221 antipyretic Substances 0.000 description 1
- 229940125716 antipyretic agent Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 201000009892 dengue shock syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000003831 deregulation Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 230000035619 diuresis Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000010211 hemagglutination inhibition (HI) assay Methods 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 231100000636 lethal dose Toxicity 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000012965 maculopapular rash Diseases 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 1
- 235000020030 perry Nutrition 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 208000018316 severe headache Diseases 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 208000037972 tropical disease Diseases 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/10—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from RNA viruses
- C07K16/1081—Togaviridae, e.g. flavivirus, rubella virus, hog cholera virus
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
- G01N33/56983—Viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/005—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from viruses
- G01N2333/08—RNA viruses
- G01N2333/18—Togaviridae; Flaviviridae
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2469/00—Immunoassays for the detection of microorganisms
- G01N2469/10—Detection of antigens from microorganism in sample from host
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】
この発明は、少なくとも2つの同一又は異なる抗体(第一抗体は形状がヘキサマーのNS1タンパク質に対する高度な親和性について予備選択されたポリクローナルもしくはモノクローナル抗体からなる)を用いる免疫学的方法によって、感染の臨床段階中の生物試料におけるフラビウイルスの非構造糖タンパク質NS1を検出することからなる、フラビウイルス誘発性感染を早期に検出する方法に関する。
Description
【０００１】
この発明は、フラビウイルス、特にデング熱ウイルスの早期検出方法及びその
応用に関する。
応用に関する。
【０００２】
デング熱は、急性熱病性の熱帯性疾患であり、これを引き起こすウイルスは、
蚊によって媒介されるアルボウイルスである。疾患の媒介物はヤブカ属の蚊、特
にネッタイシマカであり、多くは一般にその幼虫を家屋及び家屋周辺の領域に残
す。1951年に単離された原因ウイルスは、4つの異なる抗原型に分類された(DEN1
、DEN2、DEN3 及びDEN4)。それはフラビウイルス科、フラビウイルス属に属して
いる。 20億人以上の住民が風土病域で生活しており、ウイルスによって感染した個体
数は1年当たり1億人以上であると考えられる。デング熱は、特に50万件の入院及
び一年当たり数万件の死亡件数(大部分は子供である)の原因である。
蚊によって媒介されるアルボウイルスである。疾患の媒介物はヤブカ属の蚊、特
にネッタイシマカであり、多くは一般にその幼虫を家屋及び家屋周辺の領域に残
す。1951年に単離された原因ウイルスは、4つの異なる抗原型に分類された(DEN1
、DEN2、DEN3 及びDEN4)。それはフラビウイルス科、フラビウイルス属に属して
いる。 20億人以上の住民が風土病域で生活しており、ウイルスによって感染した個体
数は1年当たり1億人以上であると考えられる。デング熱は、特に50万件の入院及
び一年当たり数万件の死亡件数(大部分は子供である)の原因である。
【０００３】
臨床的な徴候は、5〜8日の潜伏期間後、一般に突然始まり、重い頭痛、腰痛、
筋肉と関節の痛み、また悪寒を伴う画一的な発熱(DFデング熱)の現象からなる。
熱病段階の3日目〜5日目には、うっ血性の斑丘発疹が3〜4日間現れる可能性があ
る(従来のデング熱)。 深刻な場合には、感染は、血管透過性の増大及びうっ血の規制解除によって特
徴付けられる出血症候群(DHFつまりデング出血熱)を生じる可能性がある。大多
数の場合には、疾患は一般に好都合には1週間以内で進展するが、循環血液量減
少に関連したショック事象(DSSつまりデング熱ショック症候群)において致命的
であることが分かっている。これらの合併症は、特に異種デング熱ウイルス(異
なる血清型)での一次感染中に獲得される、予め存在する免疫の存在に起因して
いる可能性がある。詳細には、血清学的応答について異なる2つのタイプが、デ
ング熱に感染した個体で同定される:フラビウイルス感染に罹患したことがなく
、別のフラビウイルス(例えば黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス)に対して予防
接種を受けたことのない個体は、感染の原因となるウイルスに特異的な抗体がゆ
っくりと現れることによって特徴付けられる一次応答を示すであろう;既にフラ
ビウイルス感染(例えば他のデング熱血清型)に罹患しているか、又は別のフラビ
ウイルスに対して予防接種を受けている個体は、抗体の迅速な出現によって特徴
付けられる二次応答を示すであろう。
筋肉と関節の痛み、また悪寒を伴う画一的な発熱(DFデング熱)の現象からなる。
熱病段階の3日目〜5日目には、うっ血性の斑丘発疹が3〜4日間現れる可能性があ
る(従来のデング熱)。 深刻な場合には、感染は、血管透過性の増大及びうっ血の規制解除によって特
徴付けられる出血症候群(DHFつまりデング出血熱)を生じる可能性がある。大多
数の場合には、疾患は一般に好都合には1週間以内で進展するが、循環血液量減
少に関連したショック事象(DSSつまりデング熱ショック症候群)において致命的
であることが分かっている。これらの合併症は、特に異種デング熱ウイルス(異
なる血清型)での一次感染中に獲得される、予め存在する免疫の存在に起因して
いる可能性がある。詳細には、血清学的応答について異なる2つのタイプが、デ
ング熱に感染した個体で同定される:フラビウイルス感染に罹患したことがなく
、別のフラビウイルス(例えば黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス)に対して予防
接種を受けたことのない個体は、感染の原因となるウイルスに特異的な抗体がゆ
っくりと現れることによって特徴付けられる一次応答を示すであろう;既にフラ
ビウイルス感染(例えば他のデング熱血清型)に罹患しているか、又は別のフラビ
ウイルスに対して予防接種を受けている個体は、抗体の迅速な出現によって特徴
付けられる二次応答を示すであろう。
【０００４】
感染因子はフラビウイルス科に属するデング熱ウイルスであり、この科には、
黄熱病ウイルス及び日本脳炎ウイルスも属している(T.P. Monathら、(1996) Fla
viviruses in B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howlyら(編集) "Fields Virolog
y" Philadelphia: Lippincott Raven Press Publishers)。これらのウイルスは
、11 000ヌクレオチドからなり、約 3400アミノ酸のポリタンパク質をエンコー
ドする正極性の一本鎖RNAを有する。それは、ウイルスや細胞のプロテアーゼに
よる翻訳と同時の切断ならびに翻訳後の切断中に、3つの構造タンパク質と7つの
非構造タンパク質NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及びNS5に分離される。NS1
非構造タンパク質は、初めて1970年にP.K. Russelら(J. Immunol., (1970), 105
, 838-845)によって同定され、1985年にG.W. Smithら(J. Gen Virol., (1985),
66, 559-571)によって特徴付けられた。この糖タンパク質は、フラビウイルス属
(上記のT.P. Monath)、特に4つのデング熱ウイルス血清型で高度に保存されてお
り、細胞内形態及び細胞外形態で存在する。細胞内形態は、ウイルス複製の初期
段階に関わっていると考えられる(Hall R.A.ら、J. Virol. (1999), 73, 10272-
10280; Rice C.M.ら、J. Virol., (1997), 71, 291-298; Rice C.M.ら、J. Viro
l., (1996), 222, 159-168; Rice C.M.ら、 J. Virol., (1997), 71, 9608-9617
)。原形質膜に輸送される前に、NS1タンパク質はダイマー化を受ける。昆虫細胞
ではなく、哺乳動物細胞では、NS1タンパク質の一部は、主として可溶性タンパ
ク質の形態で、又は二次的には微粒子形態のいずれかで、細胞外媒体に放出され
る。タンパク質が可溶性形態である場合、タンパク質はオリゴマー、特にペンタ
マー又はヘキサマーの形態で存在する(Crooks A.J.ら、J. Chrom. (1990), 502,
59-68 及び J. Gen. Virol. (1994), 75, 3453-3460)。現時点で、NS1タンパク
質の生物学的機能は未知である。
黄熱病ウイルス及び日本脳炎ウイルスも属している(T.P. Monathら、(1996) Fla
viviruses in B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howlyら(編集) "Fields Virolog
y" Philadelphia: Lippincott Raven Press Publishers)。これらのウイルスは
、11 000ヌクレオチドからなり、約 3400アミノ酸のポリタンパク質をエンコー
ドする正極性の一本鎖RNAを有する。それは、ウイルスや細胞のプロテアーゼに
よる翻訳と同時の切断ならびに翻訳後の切断中に、3つの構造タンパク質と7つの
非構造タンパク質NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B及びNS5に分離される。NS1
非構造タンパク質は、初めて1970年にP.K. Russelら(J. Immunol., (1970), 105
, 838-845)によって同定され、1985年にG.W. Smithら(J. Gen Virol., (1985),
66, 559-571)によって特徴付けられた。この糖タンパク質は、フラビウイルス属
(上記のT.P. Monath)、特に4つのデング熱ウイルス血清型で高度に保存されてお
り、細胞内形態及び細胞外形態で存在する。細胞内形態は、ウイルス複製の初期
段階に関わっていると考えられる(Hall R.A.ら、J. Virol. (1999), 73, 10272-
10280; Rice C.M.ら、J. Virol., (1997), 71, 291-298; Rice C.M.ら、J. Viro
l., (1996), 222, 159-168; Rice C.M.ら、 J. Virol., (1997), 71, 9608-9617
)。原形質膜に輸送される前に、NS1タンパク質はダイマー化を受ける。昆虫細胞
ではなく、哺乳動物細胞では、NS1タンパク質の一部は、主として可溶性タンパ
ク質の形態で、又は二次的には微粒子形態のいずれかで、細胞外媒体に放出され
る。タンパク質が可溶性形態である場合、タンパク質はオリゴマー、特にペンタ
マー又はヘキサマーの形態で存在する(Crooks A.J.ら、J. Chrom. (1990), 502,
59-68 及び J. Gen. Virol. (1994), 75, 3453-3460)。現時点で、NS1タンパク
質の生物学的機能は未知である。
【０００５】
幾つかの研究は、NS1タンパク質がフラビウイルス感染に対して現存する保護
免疫応答において免疫優勢であることを示唆している。幾つかのフラビウイルス
、例えば黄熱病、デング熱、日本脳炎及びダニ媒介脳炎ウイルスを用いて行われ
た実験は、NS1タンパク質サブユニット又はワクシニアもしくはアデノウイルス
型のウイルスベクターによって産生されるNS1タンパク質を用いて予防接種した
動物での同種ウイルスの致死用量に対し部分的又は全体的な保護を示している(S
chlesingerら、J. Virol (1986), 60, 1153-1155; J. Gen. Virol., (1987), 68
, 853-857; Falgoutら、J. Virol., (1990), 64, 4356-4363; Jacobsら、J. Vir
ol., (1992), 66, 2086-2095; Hallら、J. Gen. Virol., (1996), 77, 1287-129
4; Konishiら、Virology, (1991), 185, 401-410)。 モノクローナル抗-NS1抗体でのマウスの受動免疫によっても、ある程度の保護
を得ることができる(Schlesingerら、J. Immunol. (1985), 135, 2805-2809; Go
uldら、J. Gen. Virol., (1986), 67, 591-595; Henchalら、J. Gen. Virol., (
1988), 69, 2101-2107)。保護における抗-NS1抗体の役割は、完全には知られて
いない。感染細胞表面の NS1タンパク質は、補体-固定抗体によって認識され、
感染細胞の溶解をもたらしている可能性がある(Schlesingerら、 Virology, (19
93), 192, 132-141)。
免疫応答において免疫優勢であることを示唆している。幾つかのフラビウイルス
、例えば黄熱病、デング熱、日本脳炎及びダニ媒介脳炎ウイルスを用いて行われ
た実験は、NS1タンパク質サブユニット又はワクシニアもしくはアデノウイルス
型のウイルスベクターによって産生されるNS1タンパク質を用いて予防接種した
動物での同種ウイルスの致死用量に対し部分的又は全体的な保護を示している(S
chlesingerら、J. Virol (1986), 60, 1153-1155; J. Gen. Virol., (1987), 68
, 853-857; Falgoutら、J. Virol., (1990), 64, 4356-4363; Jacobsら、J. Vir
ol., (1992), 66, 2086-2095; Hallら、J. Gen. Virol., (1996), 77, 1287-129
4; Konishiら、Virology, (1991), 185, 401-410)。 モノクローナル抗-NS1抗体でのマウスの受動免疫によっても、ある程度の保護
を得ることができる(Schlesingerら、J. Immunol. (1985), 135, 2805-2809; Go
uldら、J. Gen. Virol., (1986), 67, 591-595; Henchalら、J. Gen. Virol., (
1988), 69, 2101-2107)。保護における抗-NS1抗体の役割は、完全には知られて
いない。感染細胞表面の NS1タンパク質は、補体-固定抗体によって認識され、
感染細胞の溶解をもたらしている可能性がある(Schlesingerら、 Virology, (19
93), 192, 132-141)。
【０００６】
特別な治療法は存在せず、患者に払われる介護は独特の対症的なものである。
従来のデング熱の場合、治療は鎮痛薬と解熱薬の投与に基づいている。DHFの場
合、治療は、水力電気問題(hydroelectric problem)の矯正及び利尿の再開と組
合わさった、血漿漏出を補償するための注入からなる。 デング熱ウイルスに対して市場で入手可能なワクチンは、ない。他方、4つの
デング熱ウイルス血清型の弱毒化株での保護アッセイがN. Bhamarapravatiら (D
engue and Dengue haemorrhagic fever (1997), 367-377)によって行われている
が、不満足な結果となっている。したがって、予防は媒介物と争うことにのみ基
づいている。この争いは、幼虫の駆除と"成体殺性剤(adulticide)"の噴霧を組合
わせている。
従来のデング熱の場合、治療は鎮痛薬と解熱薬の投与に基づいている。DHFの場
合、治療は、水力電気問題(hydroelectric problem)の矯正及び利尿の再開と組
合わさった、血漿漏出を補償するための注入からなる。 デング熱ウイルスに対して市場で入手可能なワクチンは、ない。他方、4つの
デング熱ウイルス血清型の弱毒化株での保護アッセイがN. Bhamarapravatiら (D
engue and Dengue haemorrhagic fever (1997), 367-377)によって行われている
が、不満足な結果となっている。したがって、予防は媒介物と争うことにのみ基
づいている。この争いは、幼虫の駆除と"成体殺性剤(adulticide)"の噴霧を組合
わせている。
【０００７】
ワクチン不在下では、流行病をモニターし、上記の合併症を予防する必要があ
る;このため、積極的なモニタープログラムが、特に世界保健機構によって開設
された。これは、本質的に発熱と媒介昆虫の症例をモニターすること、及び発熱
し、デング熱ウイルスに感染している疑いのある個体について血清学的かつウイ
ルス学的なスクリーニングを行うことからなる。 デング熱の病因は、患者が、原因が別のアルボウイルス、インフルエンザのよ
うな発疹性の発熱を引き起こすウイルス、又は疾患、例えばレプトスピラ症及び
マラリアすらもの因子である非ウイルス性病原体あり得るデング熱-様の画一的
な熱病症候群を示す際には時として確認しづらい。研究室試験は、診断を提供す
ることができるにすぎない。
る;このため、積極的なモニタープログラムが、特に世界保健機構によって開設
された。これは、本質的に発熱と媒介昆虫の症例をモニターすること、及び発熱
し、デング熱ウイルスに感染している疑いのある個体について血清学的かつウイ
ルス学的なスクリーニングを行うことからなる。 デング熱の病因は、患者が、原因が別のアルボウイルス、インフルエンザのよ
うな発疹性の発熱を引き起こすウイルス、又は疾患、例えばレプトスピラ症及び
マラリアすらもの因子である非ウイルス性病原体あり得るデング熱-様の画一的
な熱病症候群を示す際には時として確認しづらい。研究室試験は、診断を提供す
ることができるにすぎない。
【０００８】
現時点で、デング熱の診断には幾つかの試験が存在する。しかし、解釈し得る
結果を得るためには、幾つかの方法を組合わせる必要がある: - 従来のウイルス学的な技術、特に細胞培養物の感染又は若いマウスの脳での
増殖又は蚊への接種による増幅、及び例えば免疫蛍光での調査によるウイルスの
単離。これらの方法には、実行しにくく、試料が早期に採取されることと保存状
態が良好であることに依存しているという欠点がある;さらに、最初の結果は、1
週間以内では得られない;これらの欠点を克服するために、RT/PCR試験(V. Deube
l, L'eurobiologiste (1997), volume XXXI, 37-155)を利用することができる;
しかし、この手法は必ずしも信頼できるものではなく、費用と装置の点でデング
熱ウイルスが関わる国々で常套的に使用することができない; - 血清学的試験; 最も早期の血清学的診断は、MAC-ELISA (免疫グロブリンM 抗
体捕捉酵素-結合イムノソルベントアッセイ)技術を用いて、ウイルス抗原に特異
的なIgMを検索することにある。症状が現れてから数日後にこれらのIgMを検出す
ることにより、フラビウイルス感染の可能性についての診断を確立することがで
きる。IgG型抗体は、IgM型抗体より遅く現れる。全ての場合に、抗体の研究には
2つの試料が必要である: 1つは臨床的な徴候の開始時、他方は、赤血球凝集反応
阻止(IHA)を介した血清学的な変換又はELISAを決定するため10〜28日後である。
結果を得るためには、幾つかの方法を組合わせる必要がある: - 従来のウイルス学的な技術、特に細胞培養物の感染又は若いマウスの脳での
増殖又は蚊への接種による増幅、及び例えば免疫蛍光での調査によるウイルスの
単離。これらの方法には、実行しにくく、試料が早期に採取されることと保存状
態が良好であることに依存しているという欠点がある;さらに、最初の結果は、1
週間以内では得られない;これらの欠点を克服するために、RT/PCR試験(V. Deube
l, L'eurobiologiste (1997), volume XXXI, 37-155)を利用することができる;
しかし、この手法は必ずしも信頼できるものではなく、費用と装置の点でデング
熱ウイルスが関わる国々で常套的に使用することができない; - 血清学的試験; 最も早期の血清学的診断は、MAC-ELISA (免疫グロブリンM 抗
体捕捉酵素-結合イムノソルベントアッセイ)技術を用いて、ウイルス抗原に特異
的なIgMを検索することにある。症状が現れてから数日後にこれらのIgMを検出す
ることにより、フラビウイルス感染の可能性についての診断を確立することがで
きる。IgG型抗体は、IgM型抗体より遅く現れる。全ての場合に、抗体の研究には
2つの試料が必要である: 1つは臨床的な徴候の開始時、他方は、赤血球凝集反応
阻止(IHA)を介した血清学的な変換又はELISAを決定するため10〜28日後である。
【０００９】
単純で安価な免疫学的試験も提案されている。これは危険な状態の国々で使用
でき、特異的な免疫試薬として、フラビウイルスに特有のNS1非構造タンパク質
から誘導されるペプチドを使用している。つまり、米国特許第5 824 506号は、N
S1非構造タンパク質から誘導されるペプチドを用いる方法を記載しており、これ
により、デング熱ウイルスの存在によって誘発される抗体を検出することができ
る;しかし、選択されるペプチドは、本質的に回復期の個体から得られる試料を
認識し、初めて感染した患者よりも二度感染した患者をより良く認識する;これ
らの取るに足らない結果は、使用されるペプチドが天然のタンパク質の抗原特性
を表さず、それ故に探索される抗体をあまり認識しないという事実によって説明
できるかもしれない。 全ての場合に、フラビウイルス感染について末期の確認がなされるにすぎない
。
でき、特異的な免疫試薬として、フラビウイルスに特有のNS1非構造タンパク質
から誘導されるペプチドを使用している。つまり、米国特許第5 824 506号は、N
S1非構造タンパク質から誘導されるペプチドを用いる方法を記載しており、これ
により、デング熱ウイルスの存在によって誘発される抗体を検出することができ
る;しかし、選択されるペプチドは、本質的に回復期の個体から得られる試料を
認識し、初めて感染した患者よりも二度感染した患者をより良く認識する;これ
らの取るに足らない結果は、使用されるペプチドが天然のタンパク質の抗原特性
を表さず、それ故に探索される抗体をあまり認識しないという事実によって説明
できるかもしれない。 全ての場合に、フラビウイルス感染について末期の確認がなされるにすぎない
。
【００１０】
Sir Albert Sakzewski Virus Research Center, Royal Children's Hospital
のレポート(A. Falconar, 1991)は、DEN2ウイルス感染患者の血清におけるNS1非
構造糖タンパク質についての研究を記載している。このレポートの著者らは、捕
捉抗体として用いられるポリクローナル抗-NS1抗体を含むウサギの血清をマイク
ロタイタープレートに固定化するダブル-サンドウィッチELISAアッセイを開発し
ている。捕捉された抗原は、DEN2型のデング熱ウイルスのマウスモノクローナル
抗体、又はデング熱の血清学的な複合体に特異的なNS1タンパク質に対するマウ
スモノクローナル抗体を用いて検出される;抗原/抗体複合体の形成は、ペルオキ
シダーゼ-複合ヤギ抗-マウスIgGを用いて認められる。この方法で、著者らは、
分解又は精製したダイマーNS1タンパク質をスタンダードとして用いることによ
り、アッセイの検出感度は関連プローブとしてのDEN2モノクローナル抗体で約4
ng/ml、モノクローナル抗体群で約60 ng/mlであることを示した。
のレポート(A. Falconar, 1991)は、DEN2ウイルス感染患者の血清におけるNS1非
構造糖タンパク質についての研究を記載している。このレポートの著者らは、捕
捉抗体として用いられるポリクローナル抗-NS1抗体を含むウサギの血清をマイク
ロタイタープレートに固定化するダブル-サンドウィッチELISAアッセイを開発し
ている。捕捉された抗原は、DEN2型のデング熱ウイルスのマウスモノクローナル
抗体、又はデング熱の血清学的な複合体に特異的なNS1タンパク質に対するマウ
スモノクローナル抗体を用いて検出される;抗原/抗体複合体の形成は、ペルオキ
シダーゼ-複合ヤギ抗-マウスIgGを用いて認められる。この方法で、著者らは、
分解又は精製したダイマーNS1タンパク質をスタンダードとして用いることによ
り、アッセイの検出感度は関連プローブとしてのDEN2モノクローナル抗体で約4
ng/ml、モノクローナル抗体群で約60 ng/mlであることを示した。
【００１１】
しかし、このアッセイでは、急性もしくは回復段階での一次感染の場合、又は
抗-NS1抗体の力価が高い回復段階での二次感染のどちらでも、NS1タンパク質を
検出することができない;このことから、著者らは、二次感染は一過性であるの
で、二次感染の場合のみ、NS1タンパク質が感染中に大量に存在しなければなら
ないと結論付けた。 ここで、発明者らは、ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質を精
製する方法を開発した。これにより、ヘキサマー形態のこのタンパク質に特異的
な抗体を選択することができ、驚くべきことに、フラビウイルスに感染した状況
、特に特異的な抗体反応が認められない早期段階、特にデング熱ウイルスでの一
次感染中に、これらの抗体が、循環しているNS1タンパク質に関する種々の問題
を決定するための選択手段であることが示された。
抗-NS1抗体の力価が高い回復段階での二次感染のどちらでも、NS1タンパク質を
検出することができない;このことから、著者らは、二次感染は一過性であるの
で、二次感染の場合のみ、NS1タンパク質が感染中に大量に存在しなければなら
ないと結論付けた。 ここで、発明者らは、ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質を精
製する方法を開発した。これにより、ヘキサマー形態のこのタンパク質に特異的
な抗体を選択することができ、驚くべきことに、フラビウイルスに感染した状況
、特に特異的な抗体反応が認められない早期段階、特にデング熱ウイルスでの一
次感染中に、これらの抗体が、循環しているNS1タンパク質に関する種々の問題
を決定するための選択手段であることが示された。
【００１２】
この結果、発明者らは、当該分野の従来法より良好な実際的な必要性に対応す
る、フラビウイルス感染の早期検出方法、つまり信頼性があり、迅速かつ安価で
、そのうちに医療保護に適用できる方法を提供することを目的とした。 したがって、この発明の対象は、同じか異なっていてもよい少なくとも2つの
抗体 - 第一抗体つまり - ヘキサマー形態の、フラビウイルスのNS1タンパク質の免疫捕捉によって
予備選択されたポリクローナル抗体、及び - ヘキサマー形態の、フラビウイルスのNS1タンパク質に対する高い親和性
について予備選択された抗-NS1モノクローナル抗体混合物(モノクローナル抗体
は次いで精製される) からなる群から選択される抗体からなるNS1糖タンパク質を捕捉するための抗体
、 - 第二抗体つまり - ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するポリクローナル抗体、及び - ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体混合物 からなる群から選択される関連抗体 を用いる免疫学的方法により、感染の臨床段階期間にわたって生物試料における
フラビウイルスのNS1非構造糖タンパク質を検出することからなることを特徴と
する、フラビウイルス感染の早期検出方法である。
る、フラビウイルス感染の早期検出方法、つまり信頼性があり、迅速かつ安価で
、そのうちに医療保護に適用できる方法を提供することを目的とした。 したがって、この発明の対象は、同じか異なっていてもよい少なくとも2つの
抗体 - 第一抗体つまり - ヘキサマー形態の、フラビウイルスのNS1タンパク質の免疫捕捉によって
予備選択されたポリクローナル抗体、及び - ヘキサマー形態の、フラビウイルスのNS1タンパク質に対する高い親和性
について予備選択された抗-NS1モノクローナル抗体混合物(モノクローナル抗体
は次いで精製される) からなる群から選択される抗体からなるNS1糖タンパク質を捕捉するための抗体
、 - 第二抗体つまり - ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するポリクローナル抗体、及び - ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体混合物 からなる群から選択される関連抗体 を用いる免疫学的方法により、感染の臨床段階期間にわたって生物試料における
フラビウイルスのNS1非構造糖タンパク質を検出することからなることを特徴と
する、フラビウイルス感染の早期検出方法である。
【００１３】
この発明の目的のため、表現"フラビウイルスのヘキサマー形態のNS1タンパク
質"は、フラビウイルスに感染するか、又はフラビウイルスのNS1タンパク質遺伝
子からなる発現系を用いて形質転換され、後述のこの発明の方法にしたがって精
製される哺乳動物細胞の培養上清から得られる天然タンパク質を意味することを
意図する。このヘキサマー形態のNS1タンパク質は、当該タンパク質のモノマー
形態又はダイマー形態のような他の形態とは異なり、図1に記載するような電気
泳動法又はクロマトグラフィー技術を用いて決定される。 この発明の目的のため、表現"フラビウイルスのNS1タンパク質に対するポリク
ローナル及びモノクローナル抗体"は、 - ヘキサマー形態のNS1タンパク質で、 - 又は、生のもしくは不活化したフラビウイルスで 非哺乳動物を免疫化して得られる抗体を意味することを意図する。ポリクローナ
ル抗体は、ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対する親和性について選択され、1
回の工程で精製される。モノクローナル抗体は、ヘキサマー形態のNS1タンパク
質に対する高い親和性について予備選択され、次いで従来技術、特にイオン交換
もしくはアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。
質"は、フラビウイルスに感染するか、又はフラビウイルスのNS1タンパク質遺伝
子からなる発現系を用いて形質転換され、後述のこの発明の方法にしたがって精
製される哺乳動物細胞の培養上清から得られる天然タンパク質を意味することを
意図する。このヘキサマー形態のNS1タンパク質は、当該タンパク質のモノマー
形態又はダイマー形態のような他の形態とは異なり、図1に記載するような電気
泳動法又はクロマトグラフィー技術を用いて決定される。 この発明の目的のため、表現"フラビウイルスのNS1タンパク質に対するポリク
ローナル及びモノクローナル抗体"は、 - ヘキサマー形態のNS1タンパク質で、 - 又は、生のもしくは不活化したフラビウイルスで 非哺乳動物を免疫化して得られる抗体を意味することを意図する。ポリクローナ
ル抗体は、ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対する親和性について選択され、1
回の工程で精製される。モノクローナル抗体は、ヘキサマー形態のNS1タンパク
質に対する高い親和性について予備選択され、次いで従来技術、特にイオン交換
もしくはアフィニティクロマトグラフィーによって精製される。
【００１４】
この発明の目的のため、表現"ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノク
ローナル抗体の親和性"は、抗体部位の50%飽和に必要なタンパク質濃度を意味す
ることを意図する;これは、実施例5に記載するプロトコルにしたがって、抗体の
親和定数(affinity constant)によって測定される。 この発明の目的のため、用語"高い親和性"は、定数が10-8 M未満の親和性を意
味することを意図する。
ローナル抗体の親和性"は、抗体部位の50%飽和に必要なタンパク質濃度を意味す
ることを意図する;これは、実施例5に記載するプロトコルにしたがって、抗体の
親和定数(affinity constant)によって測定される。 この発明の目的のため、用語"高い親和性"は、定数が10-8 M未満の親和性を意
味することを意図する。
【００１５】
驚くべきことに、生物試料中のNS1タンパク質を検出するために、完全に過度
に免疫化したウサギの血清の代わりに、ヘキサマー形態のNS1タンパク質での免
疫捕捉により選択され精製されるポリクローナル抗体、又はヘキサマー形態のNS
1タンパク質に対する親和性が高く、精製されるモノクローナル抗体を使用する
ことによって、方法の感度を著しく改善し、一次感染及び二次感染双方の患者の
血液に循環するNS1タンパク質を早期の感染段階から検出することができる。 この発明による方法には、幾つかの利点がある: - 方法は早期に行うことができる:NS1糖タンパク質の存在は、抗体反応が検出
される以前の臨床段階中に認められる、 - 方法は感受性である:1 ng タンパク質/ml未満のごくわずかな血清を検出する
ことができ、一次感染の早期段階で循環しているNS1タンパク質を検出すること
ができる、 - 方法は迅速である:結果が一日以内に得られる、 - 方法は比較的安価であり、それ故に危険な状態にある国々で使用することが
できる、 - 方法は、フラビウイルスに最近感染した個体から予防接種した個体を区別す
ることができる。なぜなら、NS1タンパク質は予防接種した個体には存在せず、
その個体では抗体が依然として検出可能であろうからである。
に免疫化したウサギの血清の代わりに、ヘキサマー形態のNS1タンパク質での免
疫捕捉により選択され精製されるポリクローナル抗体、又はヘキサマー形態のNS
1タンパク質に対する親和性が高く、精製されるモノクローナル抗体を使用する
ことによって、方法の感度を著しく改善し、一次感染及び二次感染双方の患者の
血液に循環するNS1タンパク質を早期の感染段階から検出することができる。 この発明による方法には、幾つかの利点がある: - 方法は早期に行うことができる:NS1糖タンパク質の存在は、抗体反応が検出
される以前の臨床段階中に認められる、 - 方法は感受性である:1 ng タンパク質/ml未満のごくわずかな血清を検出する
ことができ、一次感染の早期段階で循環しているNS1タンパク質を検出すること
ができる、 - 方法は迅速である:結果が一日以内に得られる、 - 方法は比較的安価であり、それ故に危険な状態にある国々で使用することが
できる、 - 方法は、フラビウイルスに最近感染した個体から予防接種した個体を区別す
ることができる。なぜなら、NS1タンパク質は予防接種した個体には存在せず、
その個体では抗体が依然として検出可能であろうからである。
【００１６】
この方法の有利な具体例によれば、フラビウイルス感染は、デング熱ウイルス
での感染である。 この方法の別の有利な具体例によれば、第一抗体は、適当な固体支持体に付着
していることが好ましく、第二抗体は適当な標識に任意に複合している。 この方法の別の有利な具体例によれば、第二抗体が標識に複合していない場合
、固体支持体に付着したNS1タンパク質に対するその結合は、次いで第三抗体で
検出され、適当な標識に複合する。第三抗体は、従来使用される抗体、例えば第
二抗体に相対し、特にヤギ、ブタ又はロバで産生されるIgGである。
での感染である。 この方法の別の有利な具体例によれば、第一抗体は、適当な固体支持体に付着
していることが好ましく、第二抗体は適当な標識に任意に複合している。 この方法の別の有利な具体例によれば、第二抗体が標識に複合していない場合
、固体支持体に付着したNS1タンパク質に対するその結合は、次いで第三抗体で
検出され、適当な標識に複合する。第三抗体は、従来使用される抗体、例えば第
二抗体に相対し、特にヤギ、ブタ又はロバで産生されるIgGである。
【００１７】
用いられる標識には、例として、蛍光標識、ビオチン/ストレプトアビジン系
、非同位体標識又は酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ
ホスファターゼが挙げられる。 この方法の別の有利な具体例によれば、第三抗体は酵素に複合している。 この方法の別の有利な具体例によれば、 - 第一抗体、つまり捕捉抗体は、デング熱ウイルスのNS1タンパク質(タンパク
質はヘキサマー形態である)での免疫捕捉によって選択されるマウスのポリクロ
ーナル抗体からなり、かつ - 第二抗体、つまり分析される生物試料でNS1の存在を検出するための抗体は、
デング熱ウイルスのNS1タンパク質(タンパク質はヘキサマー形態である)で免疫
化したウサギ由来のポリクローナル抗体からなる。第二抗体の付着は、ペルオキ
シダーゼに複合した、第二抗体に対する抗体からなる第三抗体を用いて認められ
る。
、非同位体標識又は酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ又はアルカリ
ホスファターゼが挙げられる。 この方法の別の有利な具体例によれば、第三抗体は酵素に複合している。 この方法の別の有利な具体例によれば、 - 第一抗体、つまり捕捉抗体は、デング熱ウイルスのNS1タンパク質(タンパク
質はヘキサマー形態である)での免疫捕捉によって選択されるマウスのポリクロ
ーナル抗体からなり、かつ - 第二抗体、つまり分析される生物試料でNS1の存在を検出するための抗体は、
デング熱ウイルスのNS1タンパク質(タンパク質はヘキサマー形態である)で免疫
化したウサギ由来のポリクローナル抗体からなる。第二抗体の付着は、ペルオキ
シダーゼに複合した、第二抗体に対する抗体からなる第三抗体を用いて認められ
る。
【００１８】
この方法の別のより有利な具体例によれば、マウスのポリクローナル抗体は、
デング熱血清型1のヘキサマーNS1タンパク質での免疫捕捉によって精製される。 また、この発明の対象は、 - 上記のような少なくとも1つの捕捉抗体及び少なくとも1つの関連抗体、 - フラビウイルス及び/又はフラビウイルスに応じた種々の血清型のNS1タンパ
ク質(タンパク質はヘキサマー形態である)からなる少なくとも1つの正の対照、
及び - 正常なヒト血清からなる少なくとも1つの負の対照 からなることを特徴とする、フラビウイルス感染を診断するためのキット又は箱
入りのセットである。
デング熱血清型1のヘキサマーNS1タンパク質での免疫捕捉によって精製される。 また、この発明の対象は、 - 上記のような少なくとも1つの捕捉抗体及び少なくとも1つの関連抗体、 - フラビウイルス及び/又はフラビウイルスに応じた種々の血清型のNS1タンパ
ク質(タンパク質はヘキサマー形態である)からなる少なくとも1つの正の対照、
及び - 正常なヒト血清からなる少なくとも1つの負の対照 からなることを特徴とする、フラビウイルス感染を診断するためのキット又は箱
入りのセットである。
【００１９】
この発明による診断のための箱入りセットの有利な具体例によれば、ヘキサマ
ー形態のNS1タンパク質は、感染した哺乳動物細胞、又はNS1タンパク質遺伝子か
らなる組換えプラスミドもしくは該遺伝子のフラグメントもしくはフラビウイル
スゲノムのフラグメント(フラグメントはNS1タンパク質を全て又は一部発現でき
る)でトランスフェクトされた哺乳動物細胞のいずれかからの培養上清から得ら
れる。 この発明による診断のための箱入りセットの別の有利な具体例によれば、 NS1タンパク質はデング熱ウイルスのタンパク質である。
ー形態のNS1タンパク質は、感染した哺乳動物細胞、又はNS1タンパク質遺伝子か
らなる組換えプラスミドもしくは該遺伝子のフラグメントもしくはフラビウイル
スゲノムのフラグメント(フラグメントはNS1タンパク質を全て又は一部発現でき
る)でトランスフェクトされた哺乳動物細胞のいずれかからの培養上清から得ら
れる。 この発明による診断のための箱入りセットの別の有利な具体例によれば、 NS1タンパク質はデング熱ウイルスのタンパク質である。
【００２０】
診断のための箱入りセットのさらに有利な具体例によれば、プラスミドはpCIn
eo-NS1.FGAプラスミドであり、これは1999年6月7日付けで番号I-2220でInstitut
Pasteurによって開設されているCollection Nationale de Cultures et de Mic
roorganismes [National collection of cultures and microorganisms]に寄託
された。 また、この発明の対象は、アフィニティクロマトグラフィーのような従来技術
を用いるNS1タンパク質の精製前に、沈降剤での処理、続く遠心分離によって、N
S1タンパク質の可溶型が該タンパク質の微粒子形態から分離されることを特徴と
する、感染した哺乳動物細胞、又はフラビウイルスのNS1タンパク質遺伝子から
なる組換えプラスミドもしくは該遺伝子のフラグメントもしくはフラビウイルス
ゲノムのフラグメント(フラグメントはヘキサマー形態でNS1タンパク質を発現し
得る)でトランスフェクトした哺乳動物細胞のいずれかからの培養上清から、ヘ
キサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質を精製する方法である。
eo-NS1.FGAプラスミドであり、これは1999年6月7日付けで番号I-2220でInstitut
Pasteurによって開設されているCollection Nationale de Cultures et de Mic
roorganismes [National collection of cultures and microorganisms]に寄託
された。 また、この発明の対象は、アフィニティクロマトグラフィーのような従来技術
を用いるNS1タンパク質の精製前に、沈降剤での処理、続く遠心分離によって、N
S1タンパク質の可溶型が該タンパク質の微粒子形態から分離されることを特徴と
する、感染した哺乳動物細胞、又はフラビウイルスのNS1タンパク質遺伝子から
なる組換えプラスミドもしくは該遺伝子のフラグメントもしくはフラビウイルス
ゲノムのフラグメント(フラグメントはヘキサマー形態でNS1タンパク質を発現し
得る)でトランスフェクトした哺乳動物細胞のいずれかからの培養上清から、ヘ
キサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質を精製する方法である。
【００２１】
例えば、遠心分離は、10 000 gより大きいか、それに等しい速度で行われる。
この発明の目的のため、用語"沈降剤"は、具体的には例えばポリエチレングリ
コールのような微粒子タンパク質又は細胞残がいを沈澱させる剤を意味すること
を意図する。剤は、可溶性タンパク質と微粒子タンパク質又は細胞残がいを分離
できる従来条件下で用いられる。 この精製方法の好ましい具体例では、ヘキサマーNS1タンパク質は、デング熱
ウイルス、特にデング熱ウイルス血清型1のタンパク質である。
コールのような微粒子タンパク質又は細胞残がいを沈澱させる剤を意味すること
を意図する。剤は、可溶性タンパク質と微粒子タンパク質又は細胞残がいを分離
できる従来条件下で用いられる。 この精製方法の好ましい具体例では、ヘキサマーNS1タンパク質は、デング熱
ウイルス、特にデング熱ウイルス血清型1のタンパク質である。
【００２２】
また、この発明の対象は、任意に他のタンパク質と会合し、少なくとも1つの
医薬的に許容される賦形剤と組合わさった、ヘキサマー形態のフラビウイルスの
NS1タンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、免疫原性組成物である
。 この発明による免疫原性組成物の好ましい具体例で、免疫原性組成物は、種々
のデング熱ウイルス血清型に相当するヘキサマー形態のNS1タンパク質の少なく
とも1つの混合物からなる。
医薬的に許容される賦形剤と組合わさった、ヘキサマー形態のフラビウイルスの
NS1タンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、免疫原性組成物である
。 この発明による免疫原性組成物の好ましい具体例で、免疫原性組成物は、種々
のデング熱ウイルス血清型に相当するヘキサマー形態のNS1タンパク質の少なく
とも1つの混合物からなる。
【００２３】
また、この発明の対象は、少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤と組み
あわさった、 - あらゆる血清型のデング熱ウイルスのNS1タンパク質の全て又は一部を発現し
得るポリヌクレオチド、 - 宿主に注入されており、あらゆる血清型のデング熱ウイルスのNS1タンパク質
をエンコードするDNA(このDNAは該タンパク質を発現する)を発現できるプロモー
ターを少なくとも1つ含む発現系 からなる群から選択される有効成分を含むことを特徴とする免疫原性組成物であ
る。 核酸を用いる予防接種のプロトコルは、特に国際出願WO 90/11092に記載され
ている。
あわさった、 - あらゆる血清型のデング熱ウイルスのNS1タンパク質の全て又は一部を発現し
得るポリヌクレオチド、 - 宿主に注入されており、あらゆる血清型のデング熱ウイルスのNS1タンパク質
をエンコードするDNA(このDNAは該タンパク質を発現する)を発現できるプロモー
ターを少なくとも1つ含む発現系 からなる群から選択される有効成分を含むことを特徴とする免疫原性組成物であ
る。 核酸を用いる予防接種のプロトコルは、特に国際出願WO 90/11092に記載され
ている。
【００２４】
この発明の対象は、インビボで抗体の産生を誘発し得る免疫原性組成物を製造
するための、ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質、又はその発現
系の使用である。 この使用の好ましい方法では、NS1タンパク質は、デング熱ウイルス、特にデ
ング熱ウイルス血清型1のタンパク質である。 また、この発明の対象は、ヘキサマー形態のNS1タンパク質に高い親和性を有
する少なくとも1つのモノクローナル抗-NS1抗体の使用である。このモノクロー
ナル抗体は、受動免疫を誘発し得る医薬品の製造のため、次いで精製され、修飾
される。 有利には、抗体に対する修飾は、特にFabフラグメントの選択又は抗体のヒト
化である。
するための、ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質、又はその発現
系の使用である。 この使用の好ましい方法では、NS1タンパク質は、デング熱ウイルス、特にデ
ング熱ウイルス血清型1のタンパク質である。 また、この発明の対象は、ヘキサマー形態のNS1タンパク質に高い親和性を有
する少なくとも1つのモノクローナル抗-NS1抗体の使用である。このモノクロー
ナル抗体は、受動免疫を誘発し得る医薬品の製造のため、次いで精製され、修飾
される。 有利には、抗体に対する修飾は、特にFabフラグメントの選択又は抗体のヒト
化である。
【００２５】
また、この発明の対象は、早期段階でのフラビウイルスの感染を診断できる、
NS1タンパク質に特異的な抗体をインビトロで選択するためのヘキサマーのNS1タ
ンパク質の使用である。 この使用の有利な具体例で、抗体はポリクローナル抗体である。 この使用の別の有利な具体例で、抗体はモノクローナル抗体である。 この使用の別の有利な具体例で、タンパク質は、デング熱ウイルス、特にデン
グ熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質である。 抗-NS1モノクローナル抗体は、ヘキサマー形態のNS1タンパク質で免疫化した
マウス由来の脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合して有利に得られる。 また、この発明の対象は、プロモーターと結合した配列SEQ ID No. 1で定義さ
れるポリヌクレオチドを適当な真核細胞で発現させることからなることを特徴と
する、デング熱ウイルスのNS1タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドの
発現方法である。
NS1タンパク質に特異的な抗体をインビトロで選択するためのヘキサマーのNS1タ
ンパク質の使用である。 この使用の有利な具体例で、抗体はポリクローナル抗体である。 この使用の別の有利な具体例で、抗体はモノクローナル抗体である。 この使用の別の有利な具体例で、タンパク質は、デング熱ウイルス、特にデン
グ熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質である。 抗-NS1モノクローナル抗体は、ヘキサマー形態のNS1タンパク質で免疫化した
マウス由来の脾臓細胞を適当な骨髄腫細胞と融合して有利に得られる。 また、この発明の対象は、プロモーターと結合した配列SEQ ID No. 1で定義さ
れるポリヌクレオチドを適当な真核細胞で発現させることからなることを特徴と
する、デング熱ウイルスのNS1タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドの
発現方法である。
【００２６】
この発明の他の特徴及び利点は、残りの記載及び図面によって例示される実施
例において明らかである: - 図1は、排除クロマトグラフィー後に得られる、精製されたヘキサマー細胞外
NS1タンパク質を示す。(a) 排除クロマトグラフィー後、タンパク質を限外ろ過
で0.5 mg/mlに濃縮し、ジメチルスベリミデート(DMS)を用いて0、0.5、5 及び50
mMで処理する。得られた生成物を非還元Laemmli緩衝液に入れ、4〜20%勾配のア
クリルアミドゲルで分離し、クマシーブルーで染色する。50 mM DMSで処理した
試料を電気泳動前に3分95℃で加熱し、非共有オリゴマーを分離する。(b) 精製N
S1タンパク質を37℃で0.5% 又は1% のn-オクチルグルコシド(nOG)を用いて一晩
処理し、任意に25 mMのDMSを用いて1時間処理する。タンパク質を、4〜20%勾配
のアクリルアミドゲルで熱変性せずに分離し、文献からの又は上記のようなモノ
クローナル抗-NS1抗体を用いるイムノブロッティングにより検出する。
例において明らかである: - 図1は、排除クロマトグラフィー後に得られる、精製されたヘキサマー細胞外
NS1タンパク質を示す。(a) 排除クロマトグラフィー後、タンパク質を限外ろ過
で0.5 mg/mlに濃縮し、ジメチルスベリミデート(DMS)を用いて0、0.5、5 及び50
mMで処理する。得られた生成物を非還元Laemmli緩衝液に入れ、4〜20%勾配のア
クリルアミドゲルで分離し、クマシーブルーで染色する。50 mM DMSで処理した
試料を電気泳動前に3分95℃で加熱し、非共有オリゴマーを分離する。(b) 精製N
S1タンパク質を37℃で0.5% 又は1% のn-オクチルグルコシド(nOG)を用いて一晩
処理し、任意に25 mMのDMSを用いて1時間処理する。タンパク質を、4〜20%勾配
のアクリルアミドゲルで熱変性せずに分離し、文献からの又は上記のようなモノ
クローナル抗-NS1抗体を用いるイムノブロッティングにより検出する。
【００２７】
- 図2は、後述の実施例2のクローン4Cを用いて得られるデング熱ウイルス血清
型1のNS1タンパク質の配列、及びその相当するコード化配列を示す。 - 図3は、デング熱ウイルスに予め感染した患者(その血清を急性段階と回復期
段階中に採取した)における捕捉-ELISAによる検出方法を用いて循環しているNS1
タンパク質をアッセイして得られる結果、また従来技術IHA (デング熱ウイルス
血清型1、2、3又は4の赤血球凝集阻止) 及び MAC ELISA (免疫グロブリンM抗体
捕捉酵素-結合イムノソルベントアッセイ)を用いて得られる結果との比較を示し
ている; D1はデング熱血清型1に相当し; D2はデング熱血清型2に相当し;D3はデ
ング熱血清型3に相当し、かつD4はデング熱血清型4に相当する; ID = 患者の身
元; 1は疾患の急性段階での第一試料に相当し、2は回復期段階(第一の2〜4週間
後に採取)での第二試料に相当する;捕捉-ELISAアッセイで、値は、10、30又は90
倍に希釈した同一の血清について得られる光学密度として示す。
型1のNS1タンパク質の配列、及びその相当するコード化配列を示す。 - 図3は、デング熱ウイルスに予め感染した患者(その血清を急性段階と回復期
段階中に採取した)における捕捉-ELISAによる検出方法を用いて循環しているNS1
タンパク質をアッセイして得られる結果、また従来技術IHA (デング熱ウイルス
血清型1、2、3又は4の赤血球凝集阻止) 及び MAC ELISA (免疫グロブリンM抗体
捕捉酵素-結合イムノソルベントアッセイ)を用いて得られる結果との比較を示し
ている; D1はデング熱血清型1に相当し; D2はデング熱血清型2に相当し;D3はデ
ング熱血清型3に相当し、かつD4はデング熱血清型4に相当する; ID = 患者の身
元; 1は疾患の急性段階での第一試料に相当し、2は回復期段階(第一の2〜4週間
後に採取)での第二試料に相当する;捕捉-ELISAアッセイで、値は、10、30又は90
倍に希釈した同一の血清について得られる光学密度として示す。
【００２８】
- 図4は、フランス領ギアナのデングウイルス血清型1に感染した患者由来の血
清について捕捉-ELISAアッセイを用いるNS1タンパク質の検出を示す。 示した数
は、カテゴリー当たりに分けられた患者数を示す(捕捉-ELISAによる正又は負な
らびにIgMに対する正又は負)。 - 図5は、デング熱ウイルス1に感染したフランス領ギアナ出身の4人の患者につ
いて得られた結果を示す。試料は、患者からD1〜D5の疾患の臨床段階中に毎日採
取した。グラフはそれぞれ患者に対応しており、そのそれぞれの日に試料を採取
した。グラフは、開発した捕捉-ELISAアッセイでのNS1タンパク質の検出結果、R
T-PCRの結果及びMAC-ELISA技術を用いて得られた結果と併せている。報告された
O.D.値は、バックグランドのノイズ値に対して1回較正した。正の閾値を破線で
示す。 - 図6は、抗-NS1モノクローナル抗体F22及びG18の特徴を示す。
清について捕捉-ELISAアッセイを用いるNS1タンパク質の検出を示す。 示した数
は、カテゴリー当たりに分けられた患者数を示す(捕捉-ELISAによる正又は負な
らびにIgMに対する正又は負)。 - 図5は、デング熱ウイルス1に感染したフランス領ギアナ出身の4人の患者につ
いて得られた結果を示す。試料は、患者からD1〜D5の疾患の臨床段階中に毎日採
取した。グラフはそれぞれ患者に対応しており、そのそれぞれの日に試料を採取
した。グラフは、開発した捕捉-ELISAアッセイでのNS1タンパク質の検出結果、R
T-PCRの結果及びMAC-ELISA技術を用いて得られた結果と併せている。報告された
O.D.値は、バックグランドのノイズ値に対して1回較正した。正の閾値を破線で
示す。 - 図6は、抗-NS1モノクローナル抗体F22及びG18の特徴を示す。
【００２９】
- 図7は、実施例3に記載されるポリクローナル手法を用いる捕捉-ELISAアッセ
イと比較した、モノクローナル手法を用いる捕捉-ELISAアッセイでのNS1タンパ
ク質の検出を示す。得られた結果は、分析した血清の各希釈(10回、30回又は90
回)について測定される光学密度値の形態で示しており、負の対照の平均値より
小さい。 - 図8は、黄熱病に特異的な捕捉-ELISAアッセイを用いて黄熱病ウイルスに感染
した患者由来の血清におけるNS1タンパク質の証明を示している。試験した各血
清について、負の対照の平均値より小さい、開発されたアッセイを用いて測定さ
れる光学密度値、黄熱病IgMに特異的なMAC-ELISAアッセイを用いて測定される光
学密度値及びウイルスの単離結果を、入手できた際に示している。
イと比較した、モノクローナル手法を用いる捕捉-ELISAアッセイでのNS1タンパ
ク質の検出を示す。得られた結果は、分析した血清の各希釈(10回、30回又は90
回)について測定される光学密度値の形態で示しており、負の対照の平均値より
小さい。 - 図8は、黄熱病に特異的な捕捉-ELISAアッセイを用いて黄熱病ウイルスに感染
した患者由来の血清におけるNS1タンパク質の証明を示している。試験した各血
清について、負の対照の平均値より小さい、開発されたアッセイを用いて測定さ
れる光学密度値、黄熱病IgMに特異的なMAC-ELISAアッセイを用いて測定される光
学密度値及びウイルスの単離結果を、入手できた際に示している。
【００３０】実施例1
: デング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質の精製
1. 材料と方法
タンパク質を、A.K.I. Falconarら(J. Virol. Meth, (1990), 30, 323-332)に
よって記載される方法に適用される条件下、デング熱ウイルス血清型1、FGA/89
株(P. Despresら、Virol, (1993), 196, 209-219)に感染したVero細胞で産生さ
せる。 細胞培養物を感染から5日後に回収し、1500 gで遠心分離し、細胞残がいを除
く。遠心分離分離の上清を20 mM Tris-HCl、1 mMアジ化ナトリウムに入れ、冷限
外ろ過で6倍に濃縮し、7.5％のポリエチレングリコール(PEG)濃縮物を用いて2時
間4℃で沈澱させ、次いで30分10 000 gで遠心分離し、ウイルス粒子を除く。7.5
% PEG含有の浄化した上清を0.05% Tween 20と1 mg/ml のアプロチニンで処置し
、次いで抗-NS1モノクローナル抗体を付着させた免疫親和性カラムに通す。Falc
onarら(上記)に記載されるように、ジエチルアミンの技術にしたがってタンパク
質を溶出し、限外ろ過で濃縮し、溶出液を、1 mMアジ化ナトリウム含有10 mM Tr
is-HCl 緩衝液pH 7.5で交換する。
よって記載される方法に適用される条件下、デング熱ウイルス血清型1、FGA/89
株(P. Despresら、Virol, (1993), 196, 209-219)に感染したVero細胞で産生さ
せる。 細胞培養物を感染から5日後に回収し、1500 gで遠心分離し、細胞残がいを除
く。遠心分離分離の上清を20 mM Tris-HCl、1 mMアジ化ナトリウムに入れ、冷限
外ろ過で6倍に濃縮し、7.5％のポリエチレングリコール(PEG)濃縮物を用いて2時
間4℃で沈澱させ、次いで30分10 000 gで遠心分離し、ウイルス粒子を除く。7.5
% PEG含有の浄化した上清を0.05% Tween 20と1 mg/ml のアプロチニンで処置し
、次いで抗-NS1モノクローナル抗体を付着させた免疫親和性カラムに通す。Falc
onarら(上記)に記載されるように、ジエチルアミンの技術にしたがってタンパク
質を溶出し、限外ろ過で濃縮し、溶出液を、1 mMアジ化ナトリウム含有10 mM Tr
is-HCl 緩衝液pH 7.5で交換する。
【００３１】
2. 結果
結果を図1に示す。
図1aは、NS1タンパク質が実際にヘキサマー形態であることを示している。ヘ
キサマー形態の比率は、DMS濃度の増加に伴って増加する(図1a)。 ヘキサマー形態の細胞外NS1タンパク質は、ノニオン性洗浄剤n-オクチルグル
コシド(nOG)の存在下、ダイマーサブユニットに変換されてもよい(図1b)。n-オ
クチルグルコシド(nOG)の存在下又は不在下37℃で一晩インキュベートし、25 mM
DMSで処理した後、nOG不在下でダイマー、テトラマー及びヘキサマーに相当す
るバンドが存在すること、及びnOG存在下で、nOG濃度に応じたヘキサマーの部分
的又は完全な分離があることが認められる(図1b)。
キサマー形態の比率は、DMS濃度の増加に伴って増加する(図1a)。 ヘキサマー形態の細胞外NS1タンパク質は、ノニオン性洗浄剤n-オクチルグル
コシド(nOG)の存在下、ダイマーサブユニットに変換されてもよい(図1b)。n-オ
クチルグルコシド(nOG)の存在下又は不在下37℃で一晩インキュベートし、25 mM
DMSで処理した後、nOG不在下でダイマー、テトラマー及びヘキサマーに相当す
るバンドが存在すること、及びnOG存在下で、nOG濃度に応じたヘキサマーの部分
的又は完全な分離があることが認められる(図1b)。
【００３２】実施例2
: デング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質のVero細胞による発現
1. 材料と方法
そのシグナルペプチドをエンコードする遺伝子、次いで翻訳開始コドン、さら
に翻訳終結コドンからなるNS1タンパク質遺伝子を含むpCIneo-NS1.FGAプラスミ
ド(1999年6月7日付けでNo. I-2220でInstitut Pasteur のCollection Nationale
de Cultures et de Microorganismes [National collection of cultures and
microorganisms] (CNCM)に寄託)を、受容性細菌の大腸菌(Stratagene のepicuri
an SURE)に導入する。このプラスミドを細菌培養物中で増幅し、プラスミドDNA
の調製についての従来技術にしたがって精製する。精製DNAを用いて種々のクロ
ーンをシークエンスし(クローン4Cの配列を図2に示す)、DOTAP (Boehringer Man
nheim)のようなカチオン性リポソーム、又はFuGENE (Boehringer Mannheim)のよ
うな非リポソーム剤とのいずれかの適当な混合物を用いてVero細胞をトランスフ
ェクトする。FuGENEと DNAは、無血清培地で15分プレインキュベートし、次いで
混合物をVero細胞層と24時間接触させる。次に、細胞をPBS (リン酸緩衝食塩水)
で洗浄し、3%パラホルムアルデヒド含有PBS溶液を用いて室温で20分固定し、0.5
% Triton X-100含有PBSを用いて5分浸透させる。NS1抗原の存在は、次いでフル
オロセイン(fluoroscein)-標識した複合抗体によって認識される特異的な抗体を
用いて認められる。
に翻訳終結コドンからなるNS1タンパク質遺伝子を含むpCIneo-NS1.FGAプラスミ
ド(1999年6月7日付けでNo. I-2220でInstitut Pasteur のCollection Nationale
de Cultures et de Microorganismes [National collection of cultures and
microorganisms] (CNCM)に寄託)を、受容性細菌の大腸菌(Stratagene のepicuri
an SURE)に導入する。このプラスミドを細菌培養物中で増幅し、プラスミドDNA
の調製についての従来技術にしたがって精製する。精製DNAを用いて種々のクロ
ーンをシークエンスし(クローン4Cの配列を図2に示す)、DOTAP (Boehringer Man
nheim)のようなカチオン性リポソーム、又はFuGENE (Boehringer Mannheim)のよ
うな非リポソーム剤とのいずれかの適当な混合物を用いてVero細胞をトランスフ
ェクトする。FuGENEと DNAは、無血清培地で15分プレインキュベートし、次いで
混合物をVero細胞層と24時間接触させる。次に、細胞をPBS (リン酸緩衝食塩水)
で洗浄し、3%パラホルムアルデヒド含有PBS溶液を用いて室温で20分固定し、0.5
% Triton X-100含有PBSを用いて5分浸透させる。NS1抗原の存在は、次いでフル
オロセイン(fluoroscein)-標識した複合抗体によって認識される特異的な抗体を
用いて認められる。
【００３３】
2. 結果
このようにして、トランスフェクト細胞の約20%に、NS1ウイルス抗原に特異的
な強力な蛍光シグナルを測定することができる。 つまり、NS1の発現が立証され、安定な系は、トランスフェクト細胞に選択的
なマーカーであるネオマイシンの存在下で確立され得る。 図2は、こうして得られるデング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質の配列、
また相当するコード化配列を示す。
な強力な蛍光シグナルを測定することができる。 つまり、NS1の発現が立証され、安定な系は、トランスフェクト細胞に選択的
なマーカーであるネオマイシンの存在下で確立され得る。 図2は、こうして得られるデング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質の配列、
また相当するコード化配列を示す。
【００３４】実施例3
: デング熱ウイルス血清型1での感染に関連したこの発明による捕捉-ELI
SA技術の実施及び従来技術法との比較 1. 捕捉-ELISA技術の原則 NS1ウイルス抗原は、デング熱血清型1の精製されたヘキサマーNS1タンパク質
についての免疫捕捉で予め精製された単一特異的なマウスポリクローナル抗体を
用いて捕捉される。 NS1の存在は、セイヨウワサビペルオキシダーゼに複合した抗体で認識される
、精製したヘキサマーNS1タンパク質で免疫化したウサギ由来抗体を用いて認め
られる。
SA技術の実施及び従来技術法との比較 1. 捕捉-ELISA技術の原則 NS1ウイルス抗原は、デング熱血清型1の精製されたヘキサマーNS1タンパク質
についての免疫捕捉で予め精製された単一特異的なマウスポリクローナル抗体を
用いて捕捉される。 NS1の存在は、セイヨウワサビペルオキシダーゼに複合した抗体で認識される
、精製したヘキサマーNS1タンパク質で免疫化したウサギ由来抗体を用いて認め
られる。
【００３５】
2. 材料と方法
a- NS1タンパク質に対するマウスのポリクローナル抗体の精製
a1- NS1タンパク質の膜への付着
精製NS1タンパク質は、両性ナイロン膜(Nytran, Schleicher & Schuell)への
吸着によって付着する。膜表面を、次いでリン酸緩衝食塩溶液(PBS; 10 mM リン
酸エステル; pH 7.2; 150 mM NaCl)に3%濃度で存在するウシアルブミンで浸す。 PBSで2回洗浄後、0.25%のグルタルアルデヒドを含有するPBSを用いて15分室温
で膜を処理する。PBSで3回洗浄後、3%ウシアルブミン含有100 mMグリシン緩衝液
で膜を中和し、PBSで2回洗浄し、次いで1 mM アジ化ナトリウムを有する PBSに4
℃で保存する。
吸着によって付着する。膜表面を、次いでリン酸緩衝食塩溶液(PBS; 10 mM リン
酸エステル; pH 7.2; 150 mM NaCl)に3%濃度で存在するウシアルブミンで浸す。 PBSで2回洗浄後、0.25%のグルタルアルデヒドを含有するPBSを用いて15分室温
で膜を処理する。PBSで3回洗浄後、3%ウシアルブミン含有100 mMグリシン緩衝液
で膜を中和し、PBSで2回洗浄し、次いで1 mM アジ化ナトリウムを有する PBSに4
℃で保存する。
【００３６】
a2- マウスの単一特異的なポリクローナル抗体(捕捉抗体)の精製
- ポリクローナル腹水の生産: デング熱ウイルスに感染し、死にかかっている
若いスイスマウスの脳を9 mlのPBS緩衝液中ですりつぶす。生成物を10分 10 000
gで4℃で遠心分離する。 ウイルス懸濁液を、以下の項目日程にしたがってスイスマウスに注射する: - D0: 腿に皮下で0.5 mlの抗原 - D3: 腹膜内に0.4 mlの抗原及び0.1 mlの完全フロイントアジュバント、 - D25: 腹膜内に0.5 mlの抗原、 - D26: 0.5 mlのTG180マウスの腹水、及び - D28: 腹膜内に0.5 mlの抗原。 腹水をD42で回収する。 腹水を回収後、クロットを室温で1時間形成させ、次いで少なくとも30分1500
gで遠心分離する。上清を4℃で一晩放置する。上清のpHを2M酢酸を用いて4.8に
調整し、上清を同条件下で再度遠心分離する。2N水酸化ナトリウム溶液を加えて
、上清のpHを次いで7.0-7.2に調整する。上清は、-20℃に保存してもよい。
若いスイスマウスの脳を9 mlのPBS緩衝液中ですりつぶす。生成物を10分 10 000
gで4℃で遠心分離する。 ウイルス懸濁液を、以下の項目日程にしたがってスイスマウスに注射する: - D0: 腿に皮下で0.5 mlの抗原 - D3: 腹膜内に0.4 mlの抗原及び0.1 mlの完全フロイントアジュバント、 - D25: 腹膜内に0.5 mlの抗原、 - D26: 0.5 mlのTG180マウスの腹水、及び - D28: 腹膜内に0.5 mlの抗原。 腹水をD42で回収する。 腹水を回収後、クロットを室温で1時間形成させ、次いで少なくとも30分1500
gで遠心分離する。上清を4℃で一晩放置する。上清のpHを2M酢酸を用いて4.8に
調整し、上清を同条件下で再度遠心分離する。2N水酸化ナトリウム溶液を加えて
、上清のpHを次いで7.0-7.2に調整する。上清は、-20℃に保存してもよい。
【００３７】
- デング熱ウイルス血清型1に特異的なマウス抗体の精製:
上記のようにして調製した4つのデング熱ウイルス血清型に対するポリクロー
ナル腹水の混合物中で、膜を室温で1時間インキュベートする。 膜を3回PBSで洗浄後、NS1タンパク質に付着した抗体を、 ジエチルアミン溶液
pH 11.4 (100 mMジエチルアミンを含有するIscove (Gibco)で改質したダルベッ
コ培地)で溶出する。抗体を限外ろ過で濃縮し、1 mMアジ化ナトリウムを含むPBS
緩衝液に戻す。 b- NS1タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体(関連抗体)の調製: ウサギは、D0、D7、D21及び任意にD49で、実施例1の方法にしたがって精製し
たヘキサマーNS1タンパク質30μgを3回又は4回連続的に注射して免疫化し、次い
でD83で出血させた。文献に記載されるか、又は上記のように製造されるモノク
ローナル抗体を有するSepharoseビーズでのインキュベーションによって、血清
から非特異的なシグナルを奪う。
ナル腹水の混合物中で、膜を室温で1時間インキュベートする。 膜を3回PBSで洗浄後、NS1タンパク質に付着した抗体を、 ジエチルアミン溶液
pH 11.4 (100 mMジエチルアミンを含有するIscove (Gibco)で改質したダルベッ
コ培地)で溶出する。抗体を限外ろ過で濃縮し、1 mMアジ化ナトリウムを含むPBS
緩衝液に戻す。 b- NS1タンパク質に対するウサギポリクローナル抗体(関連抗体)の調製: ウサギは、D0、D7、D21及び任意にD49で、実施例1の方法にしたがって精製し
たヘキサマーNS1タンパク質30μgを3回又は4回連続的に注射して免疫化し、次い
でD83で出血させた。文献に記載されるか、又は上記のように製造されるモノク
ローナル抗体を有するSepharoseビーズでのインキュベーションによって、血清
から非特異的なシグナルを奪う。
【００３８】
c- 捕捉-ELISA法
c1- 標準的な曲線
ヒト血清の試験用の各捕捉-ELISAプレートについて、標準的な範囲を、ポイン
ト1に記載される方法にしたがって精製したNS1タンパク質の溶液から調製する。
その初期濃度は0.5 μg/mlであり、それを3-倍連続希釈で希釈する。 C2- 急性段階中の循環しているNS1タンパク質の検出: 上記方法にしたがって得られる精製したマウスポリクローナル抗体(捕捉抗体)
をプレートに付着させ、PBS溶液に希釈し、4℃で一晩インキュベートさせる。 P
BS/0.05% Tween 溶液で5分3回洗浄した後、プレートを室温で30分PBS、0.05% Tw
een 及び3% ミルクの混合物で浸す。PBS/0.05% Tween溶液で3回洗浄後、試験さ
れ、希釈されるか又は希釈されない血清を置き、さらに室温で1時間反応させる
。1/10、1/30及び1/90の希釈物を、PBS/0.05% Tween溶液中で調製する。3回洗浄
した後、NS1に特異的な第二抗体(上記のポイント3で得られる関連抗体)を加え、
PBS/0.05% Tweenと3%ミルクの混合物に希釈した後、45分37℃でインキュベート
する。3回洗浄後、抗-IgG抗体を第二抗体に相対させ、ペルオキシダーゼで標識
する。当業者に公知の従来条件下で調製したこの抗体を加え、45分37℃でインキ
ュベーションを行う。3回洗浄後、TMB溶液(3,3', 5,5'-テトラメチルベンジジン
、Kierkegaard & Perry Lab)を用いて10分暴露を行う。比色反応は、硫酸を用い
て止める。
ト1に記載される方法にしたがって精製したNS1タンパク質の溶液から調製する。
その初期濃度は0.5 μg/mlであり、それを3-倍連続希釈で希釈する。 C2- 急性段階中の循環しているNS1タンパク質の検出: 上記方法にしたがって得られる精製したマウスポリクローナル抗体(捕捉抗体)
をプレートに付着させ、PBS溶液に希釈し、4℃で一晩インキュベートさせる。 P
BS/0.05% Tween 溶液で5分3回洗浄した後、プレートを室温で30分PBS、0.05% Tw
een 及び3% ミルクの混合物で浸す。PBS/0.05% Tween溶液で3回洗浄後、試験さ
れ、希釈されるか又は希釈されない血清を置き、さらに室温で1時間反応させる
。1/10、1/30及び1/90の希釈物を、PBS/0.05% Tween溶液中で調製する。3回洗浄
した後、NS1に特異的な第二抗体(上記のポイント3で得られる関連抗体)を加え、
PBS/0.05% Tweenと3%ミルクの混合物に希釈した後、45分37℃でインキュベート
する。3回洗浄後、抗-IgG抗体を第二抗体に相対させ、ペルオキシダーゼで標識
する。当業者に公知の従来条件下で調製したこの抗体を加え、45分37℃でインキ
ュベーションを行う。3回洗浄後、TMB溶液(3,3', 5,5'-テトラメチルベンジジン
、Kierkegaard & Perry Lab)を用いて10分暴露を行う。比色反応は、硫酸を用い
て止める。
【００３９】
3. 結果
結果を図3に示す。
この発明による捕捉-ELISA技術により、疾患の急性段階におけるNS1タンパク
質の存在を検出することができる。この検出は、患者が一次感染であるか二次感
染であるかどうかとは無関係である。 結果から、NS1タンパク質が回復期段階に採取された試料では検出されないた
め、該タンパク質の存在は一過性のものであることが分かる(図3)。 疾患の急性段階に採取された試料の93%はMAC ELISAアッセイを用いて陰性であ
ることが明らかになったが、回復期段階に採取した試料の100%が、この同じアッ
セイで陽性であることが分かった(図3).
質の存在を検出することができる。この検出は、患者が一次感染であるか二次感
染であるかどうかとは無関係である。 結果から、NS1タンパク質が回復期段階に採取された試料では検出されないた
め、該タンパク質の存在は一過性のものであることが分かる(図3)。 疾患の急性段階に採取された試料の93%はMAC ELISAアッセイを用いて陰性であ
ることが明らかになったが、回復期段階に採取した試料の100%が、この同じアッ
セイで陽性であることが分かった(図3).
【００４０】
同様に、赤血球凝集阻止アッセイ(IHA)では、疾患の急性段階にある80%の症例
でデング熱ウイルス血清型1の感染を検出することができないが、この試験は回
復段階に採取された試料については100%陽性であることが分かった(図3)。 WHO
の基準によれば、回復期段階に採取された血清において1280未満のIHAレベルは
、デング熱の一次感染を診断でき、1280以上のレベルはデング熱の二次感染を診
断できる。したがって、この研究における陽性血清の半分は、一次デング熱の症
例に相当し、他の半分は二次デング熱の症例に相当する。つまり、この発明によ
る捕捉-ELISA技術は、一次及び二次感染の症例でNS1タンパク質を検出すること
ができる。
でデング熱ウイルス血清型1の感染を検出することができないが、この試験は回
復段階に採取された試料については100%陽性であることが分かった(図3)。 WHO
の基準によれば、回復期段階に採取された血清において1280未満のIHAレベルは
、デング熱の一次感染を診断でき、1280以上のレベルはデング熱の二次感染を診
断できる。したがって、この研究における陽性血清の半分は、一次デング熱の症
例に相当し、他の半分は二次デング熱の症例に相当する。つまり、この発明によ
る捕捉-ELISA技術は、一次及び二次感染の症例でNS1タンパク質を検出すること
ができる。
【００４１】実施例4
: 検出領域の決定
1. 材料と方法
a- デング熱ウイルス1に感染したフランス領ギニア出身患者群について行った研
究 試料は、臨床的な徴候(当初の画一的な発熱)の現象を示すD0から回復期段階の
最後に相当するD66のあいだ、デング熱ウイルス血清型1に感染した患者から採取
する。 循環しているNS1の存在を、実施例3に記載される捕捉-ELISA法にしたがってこ
れらの患者の血清で研究する。得られた結果を、データが利用可能である際に、
MAC-ELISAによって測定される特異的なIgMに対する陽性と比較する。 b- デング熱ウイルス1に感染した4人の患者の毎日のモニター 試料は、D1〜D5の臨床段階中の4人の患者から毎日採取した。各血液試料につ
いて、ウイルスRNAを明らかにするためのRT-PCR反応、デング熱ウイルスに特異
的なIgMを検出するためのMAC-ELISAアッセイ及び上記の捕捉-ELISA法に従ったデ
ング熱NS1抗原についての研究を行った。
究 試料は、臨床的な徴候(当初の画一的な発熱)の現象を示すD0から回復期段階の
最後に相当するD66のあいだ、デング熱ウイルス血清型1に感染した患者から採取
する。 循環しているNS1の存在を、実施例3に記載される捕捉-ELISA法にしたがってこ
れらの患者の血清で研究する。得られた結果を、データが利用可能である際に、
MAC-ELISAによって測定される特異的なIgMに対する陽性と比較する。 b- デング熱ウイルス1に感染した4人の患者の毎日のモニター 試料は、D1〜D5の臨床段階中の4人の患者から毎日採取した。各血液試料につ
いて、ウイルスRNAを明らかにするためのRT-PCR反応、デング熱ウイルスに特異
的なIgMを検出するためのMAC-ELISAアッセイ及び上記の捕捉-ELISA法に従ったデ
ング熱NS1抗原についての研究を行った。
【００４２】
2. 結果
a- 検出領域の決定
結果を図4に示す。
D1〜D6のあいだ、循環しているNS1タンパク質の検出の可能性は、感染患者の6
4% (D2で)〜100% (D5で)のあいだで変動する。D10以降、循環しているNS1タンパ
ク質はもはや検出されないが、抗体反応が優勢になる。 循環しているNS1タンパク質の検出は、ある症例ではD3に現れてD5から最高潮
に達する全IgM(ウイルス抗原に特異的)の存在や、ある症例ではD2に現れる可能
性がある全IgGの存在にすら依存しているものとは考えられない。他方、臨床段
階でNS1抗原が検出されないことは、具体的にはNS1に相対しているIgGの存在に
よって説明できるかもしれない。 つまり、この発明による捕捉-ELISA技術を用いる血清中のNS1抗原についての
検出領域は、臨床的な徴候が現れた後のD1〜D6であることが好ましい。
4% (D2で)〜100% (D5で)のあいだで変動する。D10以降、循環しているNS1タンパ
ク質はもはや検出されないが、抗体反応が優勢になる。 循環しているNS1タンパク質の検出は、ある症例ではD3に現れてD5から最高潮
に達する全IgM(ウイルス抗原に特異的)の存在や、ある症例ではD2に現れる可能
性がある全IgGの存在にすら依存しているものとは考えられない。他方、臨床段
階でNS1抗原が検出されないことは、具体的にはNS1に相対しているIgGの存在に
よって説明できるかもしれない。 つまり、この発明による捕捉-ELISA技術を用いる血清中のNS1抗原についての
検出領域は、臨床的な徴候が現れた後のD1〜D6であることが好ましい。
【００４３】
b- デング熱ウイルスに感染した4人の患者の毎日のモニター
結果を図5に示す。
研究した4人の患者で、NS1タンパク質は、症状の始まりに対して試料を採取し
た日に関わらず、D5まで連続的に検出される。ある患者の場合、タンパク質の検
出領域は、RT-PCRによって検出されるウイルス血症期間より幅広い。
た日に関わらず、D5まで連続的に検出される。ある患者の場合、タンパク質の検
出領域は、RT-PCRによって検出されるウイルス血症期間より幅広い。
【００４４】実施例5
: デング熱ウイルス血清型1での感染に関連したモノクローナル手段での
捕捉-ELISA技術の実施、及び上記捕捉-ELISA技術との比較 1. 材料と方法 a- デング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質に対するマウスのモノクローナル
抗体の産生及び特徴づけ a1- NS1タンパク質に対するマウスのモノクローナル抗体の産生 実施例1の方法にしたがって精製した、デング熱ウイルス血清型1のヘキサマー
NS1タンパク質10μgを7回注射して、メスのBalb/Cマウスを免疫化した。完全フ
ロイントアジュバントでの最初の注射及び不完全フロイントアジュバントでのそ
の後の5回の注射は、15日あけて皮下で行う。動物を殺す3日前に行う不完全フロ
イントアジュバントでの最終注射は、腹膜内に行う。 標準的なプロトコルにしたがって、免疫化マウスの脾臓細胞をマウスの骨髄腫
と融合し、クローンが現れるまで培養する。
捕捉-ELISA技術の実施、及び上記捕捉-ELISA技術との比較 1. 材料と方法 a- デング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質に対するマウスのモノクローナル
抗体の産生及び特徴づけ a1- NS1タンパク質に対するマウスのモノクローナル抗体の産生 実施例1の方法にしたがって精製した、デング熱ウイルス血清型1のヘキサマー
NS1タンパク質10μgを7回注射して、メスのBalb/Cマウスを免疫化した。完全フ
ロイントアジュバントでの最初の注射及び不完全フロイントアジュバントでのそ
の後の5回の注射は、15日あけて皮下で行う。動物を殺す3日前に行う不完全フロ
イントアジュバントでの最終注射は、腹膜内に行う。 標準的なプロトコルにしたがって、免疫化マウスの脾臓細胞をマウスの骨髄腫
と融合し、クローンが現れるまで培養する。
【００４５】
a2- 抗-NS1抗体を分泌するハイブリドーマの同定
NS1タンパク質に特異的な抗体を、従来のELISA技術を用いるか、又は捕捉-ELI
SA技術を用いて検出した。 - 従来のELISA技術 実施例1の方法にしたがって精製したヘキサマーNS1タンパク質を、4℃で一晩P
BS溶液中1 μg/ml濃度で吸着によりプレートに付着させる。PBS/0.1% Tween (PT
)溶液で3回洗浄後、0.5% ゼラチン含有PT溶液(PTG)を用いて2倍希釈した種々の
ハイブリドーマの上清とタンパク質を1時間37℃でインキュベートする。PTで3回
洗浄後、PTGに希釈したペルオキシダーゼ-標識した抗-マウスIgG 抗体を加え、1
時間37℃でインキュベートする。3回洗浄後、オルソフェニレンジアミンの存在
下で過酸化水素溶液を用いて暴露を行う。
SA技術を用いて検出した。 - 従来のELISA技術 実施例1の方法にしたがって精製したヘキサマーNS1タンパク質を、4℃で一晩P
BS溶液中1 μg/ml濃度で吸着によりプレートに付着させる。PBS/0.1% Tween (PT
)溶液で3回洗浄後、0.5% ゼラチン含有PT溶液(PTG)を用いて2倍希釈した種々の
ハイブリドーマの上清とタンパク質を1時間37℃でインキュベートする。PTで3回
洗浄後、PTGに希釈したペルオキシダーゼ-標識した抗-マウスIgG 抗体を加え、1
時間37℃でインキュベートする。3回洗浄後、オルソフェニレンジアミンの存在
下で過酸化水素溶液を用いて暴露を行う。
【００４６】
- 捕捉-ELISA技術
使用した技術は、試験される血清の希釈を、非感染のVero細胞、又はデング熱
ウイルス血清型1で5日間感染し、ポリエチレングリコール7%で沈澱させたVero細
胞に対する培養上清(実施例1:デング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質の精製
参照)について、PTG溶液で1/10希釈に置換した以外は、実施例3に記載されてい
る(急性段階で循環しているNS1タンパク質の検出参照)。非感染のVero 細胞の培
養上清に対する種々のハイブリドーマ由来上清の反応性は、非特異的シグナルに
対する対照として用いる。
ウイルス血清型1で5日間感染し、ポリエチレングリコール7%で沈澱させたVero細
胞に対する培養上清(実施例1:デング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質の精製
参照)について、PTG溶液で1/10希釈に置換した以外は、実施例3に記載されてい
る(急性段階で循環しているNS1タンパク質の検出参照)。非感染のVero 細胞の培
養上清に対する種々のハイブリドーマ由来上清の反応性は、非特異的シグナルに
対する対照として用いる。
【００４７】
a3- 4つのデング熱ウイルス血清型の1つに感染したVero細胞に対する間接的な免
疫蛍光による抗-NS1モノクローナル抗体の反応性 Vero細胞は、4つのデング熱ウイルス血清型の1つで40時間感染させる: 血清型1: FGA/89株 血清型 2: NG株 血清型 3: H87株 血清型 4: H241株 PBS溶液で1回洗浄後、細胞を研究室温度で30分PBS中3%のパラホルムアルデヒ
ド溶液で固定する。次に、PBSで洗浄した細胞を10分PBS中0.5%のTriton X-100溶
液で浸透させる。PBSで洗浄後、ELISAで陽性に反応する種々のハイブリドーマか
らの上清とともに細胞を1時間インキュベートする。PBSで3回洗浄後、蛍光標識
した抗-マウスIgG抗体を加え、1時間インキュベートする。PBSで3回洗浄後、ス
ライドをカバーガラスで覆い、蛍光顕微鏡下で観察する。
疫蛍光による抗-NS1モノクローナル抗体の反応性 Vero細胞は、4つのデング熱ウイルス血清型の1つで40時間感染させる: 血清型1: FGA/89株 血清型 2: NG株 血清型 3: H87株 血清型 4: H241株 PBS溶液で1回洗浄後、細胞を研究室温度で30分PBS中3%のパラホルムアルデヒ
ド溶液で固定する。次に、PBSで洗浄した細胞を10分PBS中0.5%のTriton X-100溶
液で浸透させる。PBSで洗浄後、ELISAで陽性に反応する種々のハイブリドーマか
らの上清とともに細胞を1時間インキュベートする。PBSで3回洗浄後、蛍光標識
した抗-マウスIgG抗体を加え、1時間インキュベートする。PBSで3回洗浄後、ス
ライドをカバーガラスで覆い、蛍光顕微鏡下で観察する。
【００４８】
a4- マウスモノクローナル腹水の調製
モノクローナル腹水を、Balb/Cマウスで産生させる。モノクローナル抗体を分
泌するハイブリドーマクローンを腹膜内注射する1週間前に、マウスに 0.5 mlの
プリスタン(2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン, Sigma)を腹膜内注射する。
腹水を形状のまま除き、1500 rpmで20分遠心分離し、-20℃で保存する。 a5- 抗-NS1 モノクローナル抗体のイソタイプの決定 抗-NS1抗体のイソタイプを、種々のマウス免疫グロブリンのサブクラス: IgG1
、IgG2a、IgG2b 及びIgG3に対する抗体を用いるELISAで決定する。免疫グロブリ
ンの軽鎖を、同じ方法論にしたがって決定する。
泌するハイブリドーマクローンを腹膜内注射する1週間前に、マウスに 0.5 mlの
プリスタン(2,6,10,14-テトラメチルペンタデカン, Sigma)を腹膜内注射する。
腹水を形状のまま除き、1500 rpmで20分遠心分離し、-20℃で保存する。 a5- 抗-NS1 モノクローナル抗体のイソタイプの決定 抗-NS1抗体のイソタイプを、種々のマウス免疫グロブリンのサブクラス: IgG1
、IgG2a、IgG2b 及びIgG3に対する抗体を用いるELISAで決定する。免疫グロブリ
ンの軽鎖を、同じ方法論にしたがって決定する。
【００４９】
a6- 抗-NS1モノクローナル抗体の親和定数の測定(B Friguetら、J. Immunol, (1
985), 77, 305-319) 抗体の親和性は、抗体の部位の50%を飽和するのに必要な抗原濃度に相当する
。インキュベーションは、反応の平衡に達するために、抗体を一定濃度にし、抗
原の濃度は低下するようにした液体培地で4℃で一晩行う。平衡後の遊離抗体の
濃度は、ELISAアッセイを用いて測定する: 混合物を、抗原とプレインキュベー
トしたプレートに沈積させる。(平衡のシフトを避けるため)4℃で20分インキュ
ベート後、β-ガラクトシダーゼ-結合抗-マウスIgG、次いで酵素反応で、ELISA
を暴露する。解離定数KDを次いで測定する。
985), 77, 305-319) 抗体の親和性は、抗体の部位の50%を飽和するのに必要な抗原濃度に相当する
。インキュベーションは、反応の平衡に達するために、抗体を一定濃度にし、抗
原の濃度は低下するようにした液体培地で4℃で一晩行う。平衡後の遊離抗体の
濃度は、ELISAアッセイを用いて測定する: 混合物を、抗原とプレインキュベー
トしたプレートに沈積させる。(平衡のシフトを避けるため)4℃で20分インキュ
ベート後、β-ガラクトシダーゼ-結合抗-マウスIgG、次いで酵素反応で、ELISA
を暴露する。解離定数KDを次いで測定する。
【００５０】
a7- 種々の抗-NS1 モノクローナル抗体についての競合反応
この反応により、同じエピトープ又は異なるエピトープに対するモノクローナ
ル抗体の特異性を決定することができる。エピトープの決定は、非標識モノクロ
ーナル抗体及びビオチンに結合した第二モノクローナル抗体の抗原に対する反応
性を利用する。 非標識の第一モノクローナル抗体を、抗原を予め付着したプレートに飽和濃度
(ELISAで予め測定)で入れ、2時間37℃でインキュベートする。4℃でPT溶液で4回
洗浄後、ビオチンに結合した第二モノクローナル抗体を加え、20分4℃でインキ
ュベートする。4℃でPT溶液で4回洗浄後、ペルオキシダーゼ-標識したストレプ
トアビジン複合体溶液を加え、37℃で1時間インキュベートする。PT溶液で4回洗
浄後、オルソフェニレンジアミンの存在下で過酸化水素溶液を用いて複合体が認
められる。シグナルが分光光度計での読み取り後に得られる場合、 これは、2つ
の抗体によって認識されるエピトープが異なることを意味する。逆の場合には、
2つのモノクローナル抗体は抗原の同じエピトープに相対している。
ル抗体の特異性を決定することができる。エピトープの決定は、非標識モノクロ
ーナル抗体及びビオチンに結合した第二モノクローナル抗体の抗原に対する反応
性を利用する。 非標識の第一モノクローナル抗体を、抗原を予め付着したプレートに飽和濃度
(ELISAで予め測定)で入れ、2時間37℃でインキュベートする。4℃でPT溶液で4回
洗浄後、ビオチンに結合した第二モノクローナル抗体を加え、20分4℃でインキ
ュベートする。4℃でPT溶液で4回洗浄後、ペルオキシダーゼ-標識したストレプ
トアビジン複合体溶液を加え、37℃で1時間インキュベートする。PT溶液で4回洗
浄後、オルソフェニレンジアミンの存在下で過酸化水素溶液を用いて複合体が認
められる。シグナルが分光光度計での読み取り後に得られる場合、 これは、2つ
の抗体によって認識されるエピトープが異なることを意味する。逆の場合には、
2つのモノクローナル抗体は抗原の同じエピトープに相対している。
【００５１】
b- モノクローナル抗体G18及びF22の精製
抗体G18及びF22は、実施例3に記載されるように免疫親和性によって精製する
。 c- モノクローナル抗体を用いる捕捉-ELISAアッセイでの循環しているNS1タン
パク質の検出 精製モノクローナル抗体G18及びF22は、一定の希釈でPBS溶液中に混合し、4℃
で一晩インキュベートする。このELISAの後の工程は、先の実施例の工程と同様
である。 d- ポリクローナル手法を用いるアッセイとモノクローナル手法を用いる捕捉-EL
ISAアッセイの比較 フランス領ギアナの血清パネルを、モノクローナル手法を用いる捕捉-ELISAア
ッセイ、次いでポリクローナル手法を用いるアッセイで同じ日に試験した。血清
は、種々の希釈: 10、30及び90回で試験した。
。 c- モノクローナル抗体を用いる捕捉-ELISAアッセイでの循環しているNS1タン
パク質の検出 精製モノクローナル抗体G18及びF22は、一定の希釈でPBS溶液中に混合し、4℃
で一晩インキュベートする。このELISAの後の工程は、先の実施例の工程と同様
である。 d- ポリクローナル手法を用いるアッセイとモノクローナル手法を用いる捕捉-EL
ISAアッセイの比較 フランス領ギアナの血清パネルを、モノクローナル手法を用いる捕捉-ELISAア
ッセイ、次いでポリクローナル手法を用いるアッセイで同じ日に試験した。血清
は、種々の希釈: 10、30及び90回で試験した。
【００５２】
2. 結果
a- モノクローナル抗体の特徴づけ
結果を図6に示す。
抗体G18とF22を、NS1タンパク質の種々のエピトープに高い親和性で結合する
能力について選択した。抗体F22はデング熱ウイルス血清型1に特異的で、G18は
デング熱ウイルス血清型1と3に特異的である。 b- NS1抗原捕捉のためのモノクローナル抗体の使用 結果を図7に示す。 選択されたモノクローナル抗体は、ポリクローナル手法を用いて得られる結果
を再現するのみならず、ポリクローナル抗体より著しい反応性を示す。したがっ
て、開発されたモノクローナルの手段は、診断の用途に特に適していると思われ
る。
能力について選択した。抗体F22はデング熱ウイルス血清型1に特異的で、G18は
デング熱ウイルス血清型1と3に特異的である。 b- NS1抗原捕捉のためのモノクローナル抗体の使用 結果を図7に示す。 選択されたモノクローナル抗体は、ポリクローナル手法を用いて得られる結果
を再現するのみならず、ポリクローナル抗体より著しい反応性を示す。したがっ
て、開発されたモノクローナルの手段は、診断の用途に特に適していると思われ
る。
【００５３】実施例6
: 別のデング熱ウイルス血清型又は別のフラビウイルスでの感染に関連
したこの発明による捕捉-ELISA技術の実施 1. 材料と方法 a- 培養上清の調製 Vero細胞をデング熱ウイルス2又は日本脳炎ウイルス又は黄熱病ウイルスのい
ずれかで感染する。次いで、培養上清を実施例1に記載する方法にしたがって調
製する。 b- 黄熱病ウイルス及び日本脳炎ウイルスのNS1タンパク質に対するモノクローナ
ル抗体の精製 黄熱病ウイルスのNS1タンパク質に対する抗体8G4、1A5及び2D10 (J.J. Schles
ingerら、Virology, (1983), 125, 8-17)ならびに日本脳炎ウイルスのNS1タンパ
ク質に対する抗体171-2-2及び70-14-20のモノクローナル腹水を、タンパク質A S
epharose CL-4Bビーズ(Pharmacia Biotech)で精製する。これらのモノクローナ
ル腹水を、タンパク質Aビーズで4℃で一晩インキュベートする。ビーズを3回PBS
/0.05% Tweenで洗浄した後、タンパク質Aビーズに付着した抗体をグリシン緩衝
溶液pH=3で溶出する。それらを次に限外ろ過で濃縮し、1 mMアジ化ナトリウム含
有PBS緩衝液に戻す。
したこの発明による捕捉-ELISA技術の実施 1. 材料と方法 a- 培養上清の調製 Vero細胞をデング熱ウイルス2又は日本脳炎ウイルス又は黄熱病ウイルスのい
ずれかで感染する。次いで、培養上清を実施例1に記載する方法にしたがって調
製する。 b- 黄熱病ウイルス及び日本脳炎ウイルスのNS1タンパク質に対するモノクローナ
ル抗体の精製 黄熱病ウイルスのNS1タンパク質に対する抗体8G4、1A5及び2D10 (J.J. Schles
ingerら、Virology, (1983), 125, 8-17)ならびに日本脳炎ウイルスのNS1タンパ
ク質に対する抗体171-2-2及び70-14-20のモノクローナル腹水を、タンパク質A S
epharose CL-4Bビーズ(Pharmacia Biotech)で精製する。これらのモノクローナ
ル腹水を、タンパク質Aビーズで4℃で一晩インキュベートする。ビーズを3回PBS
/0.05% Tweenで洗浄した後、タンパク質Aビーズに付着した抗体をグリシン緩衝
溶液pH=3で溶出する。それらを次に限外ろ過で濃縮し、1 mMアジ化ナトリウム含
有PBS緩衝液に戻す。
【００５４】
c- デング熱ウイルス2培養上清中のNS1タンパク質の検出
c1- 使用した抗体
捕捉工程は、モノクローナル抗体3D1.4及び1A12の腹水混合物を用いて行う(A.
K.I. Falconarら、Arch. Virology, (1994), 137, 315-326)。次に、タンパク質
を2つのウサギ抗体混合物: 実施例3に記載される精製タンパク質で免疫化後に得
られる血清及び4つのデング熱血清型ウイルスでの免疫化後に得られるウサギ血
清を用いて認識する。 c2- 捕捉-ELISA法 用いた技術は、実施例3に記載されるものと同じである。 d- 日本脳炎ウイルス培養上清中のNS1タンパク質の検出 d1- 使用した抗体 精製モノクローナル抗体171-2-2 及び70-14-20 を、捕捉工程に用いる。次に
、日本脳炎のNS1タンパク質の組換えタンパク質で予め免疫化したウサギからの2
つの血清混合物で、タンパク質を認識する。
K.I. Falconarら、Arch. Virology, (1994), 137, 315-326)。次に、タンパク質
を2つのウサギ抗体混合物: 実施例3に記載される精製タンパク質で免疫化後に得
られる血清及び4つのデング熱血清型ウイルスでの免疫化後に得られるウサギ血
清を用いて認識する。 c2- 捕捉-ELISA法 用いた技術は、実施例3に記載されるものと同じである。 d- 日本脳炎ウイルス培養上清中のNS1タンパク質の検出 d1- 使用した抗体 精製モノクローナル抗体171-2-2 及び70-14-20 を、捕捉工程に用いる。次に
、日本脳炎のNS1タンパク質の組換えタンパク質で予め免疫化したウサギからの2
つの血清混合物で、タンパク質を認識する。
【００５５】
d2- 捕捉-ELISA法
用いた技術は、実施例3に記載されるものと同じである。
e- 黄熱病ウイルス培養上清及びこのウイルスの感染患者由来血清におけるNS1タ
ンパク質の検出 e1- 使用した抗体 精製したモノクローナル抗体8G4、1A5及び2D10を所定の希釈で、PBS溶液に混
合し、捕捉抗体として用いる。黄熱病NS1に特異的な第二抗体は、黄熱病17Dウイ
ルスのNS1タンパク質に対して予め免疫化したウサギ血清からの開始物を用いた(
J.J. Schlesingerら、J. immunol. (1985), 135, 2805-2809)。 e2- 捕捉-ELISA法 用いた技術は、実施例3に記載のものと同じである。
ンパク質の検出 e1- 使用した抗体 精製したモノクローナル抗体8G4、1A5及び2D10を所定の希釈で、PBS溶液に混
合し、捕捉抗体として用いる。黄熱病NS1に特異的な第二抗体は、黄熱病17Dウイ
ルスのNS1タンパク質に対して予め免疫化したウサギ血清からの開始物を用いた(
J.J. Schlesingerら、J. immunol. (1985), 135, 2805-2809)。 e2- 捕捉-ELISA法 用いた技術は、実施例3に記載のものと同じである。
【００５６】
2. 結果
NS1タンパク質の分泌は、種々のフラビウイルス、DEN2ウイルス(Winklerら、V
irology (1988), 162, 187-196、Pryorら、Virology (1993) 194, 769-780)、ダ
ニ媒介脳炎ウイルス(Leeら、J. Gen. Virol. (1989), 70, 335-343、Crooksら、
J. Chrom. (1990), 502, 59-68、Crooksら、J. Gen. Virol. (1994), 75, 3453-
3460)、日本脳炎ウイルス(Mason, Virology (1989), 169, 354-364、Fanら、Vir
ology (1990), 177, 470-476)、マリーバレー脳炎ウイルス(Hallら、J. Virol.
Meth. (1991), 32, 11-20)及び黄熱病ウイルス(Postら、Vir. Res. (1990), 18,
291-302)に感染したインビトロの細胞培養物で以前に報告されている。これら
の結果は、異なるELISA技術を用いて得られたので、感染した哺乳動物細胞上清
にこの発明の捕捉-ELISA技術を用いてタンパク質を決定するよう努めた。 NS1タンパク質は、DEN2ウイルス、日本脳炎ウイルス又は黄熱病ウイルスのい
ずれかに感染したVero細胞の培養上清で検出できる。
irology (1988), 162, 187-196、Pryorら、Virology (1993) 194, 769-780)、ダ
ニ媒介脳炎ウイルス(Leeら、J. Gen. Virol. (1989), 70, 335-343、Crooksら、
J. Chrom. (1990), 502, 59-68、Crooksら、J. Gen. Virol. (1994), 75, 3453-
3460)、日本脳炎ウイルス(Mason, Virology (1989), 169, 354-364、Fanら、Vir
ology (1990), 177, 470-476)、マリーバレー脳炎ウイルス(Hallら、J. Virol.
Meth. (1991), 32, 11-20)及び黄熱病ウイルス(Postら、Vir. Res. (1990), 18,
291-302)に感染したインビトロの細胞培養物で以前に報告されている。これら
の結果は、異なるELISA技術を用いて得られたので、感染した哺乳動物細胞上清
にこの発明の捕捉-ELISA技術を用いてタンパク質を決定するよう努めた。 NS1タンパク質は、DEN2ウイルス、日本脳炎ウイルス又は黄熱病ウイルスのい
ずれかに感染したVero細胞の培養上清で検出できる。
【００５７】
図8に示した結果で立証されるように、黄熱病ウイルスに感染した患者由来の
血清では、この技術を用いてタンパク質を決定することもできた。Ch. Mathiot
(Institut Pasteur of Dakar)によって寛大にも提供された18個の血清のうち、7
個はNS1抗原血症に陽性である。DEN1ウイルスに関して、循環しているNS1タンパ
ク質の検出は、黄熱病に特異的なIgMの存在と無関係であると考えられる。 この発明による捕捉-ELISA技術により、種々のフラビウイルスに感染した細胞
の培養上清及び黄熱病ウイルスに感染した患者由来血清中でNS1タンパク質を検
出することができる。このため、それは、DEN1ウイルス以外のフラビウイルスの
感染を検出するための診断上の応用性を有している。
血清では、この技術を用いてタンパク質を決定することもできた。Ch. Mathiot
(Institut Pasteur of Dakar)によって寛大にも提供された18個の血清のうち、7
個はNS1抗原血症に陽性である。DEN1ウイルスに関して、循環しているNS1タンパ
ク質の検出は、黄熱病に特異的なIgMの存在と無関係であると考えられる。 この発明による捕捉-ELISA技術により、種々のフラビウイルスに感染した細胞
の培養上清及び黄熱病ウイルスに感染した患者由来血清中でNS1タンパク質を検
出することができる。このため、それは、DEN1ウイルス以外のフラビウイルスの
感染を検出するための診断上の応用性を有している。
【００５８】
【配列表】
【図１】 排除クロマトグラフィー後に得られる、精製されたヘキサマー細
胞外NS1タンパク質を示す。(a) 排除クロマトグラフィー後、タンパク質を限外
ろ過で0.5 mg/mlに濃縮し、ジメチルスベリミデート(DMS)を用いて0、0.5、5 及
び50 mMで処理する。得られた生成物を非還元Laemmli緩衝液に入れ、4〜20%勾配
のアクリルアミドゲルで分離し、クマシーブルーで染色する。50 mM DMSで処理
した試料を電気泳動前に3分95℃で加熱し、非共有オリゴマーを分離する。(b)
精製NS1タンパク質を37℃で0.5% 又は1% のn-オクチルグルコシド(nOG)を用いて
一晩処理し、任意に25 mMのDMSを用いて1時間処理する。タンパク質を、4〜20%
勾配のアクリルアミドゲルで熱変性せずに分離し、文献からの又は上記のような
モノクローナル抗-NS1抗体を用いるイムノブロッティングにより検出する。
胞外NS1タンパク質を示す。(a) 排除クロマトグラフィー後、タンパク質を限外
ろ過で0.5 mg/mlに濃縮し、ジメチルスベリミデート(DMS)を用いて0、0.5、5 及
び50 mMで処理する。得られた生成物を非還元Laemmli緩衝液に入れ、4〜20%勾配
のアクリルアミドゲルで分離し、クマシーブルーで染色する。50 mM DMSで処理
した試料を電気泳動前に3分95℃で加熱し、非共有オリゴマーを分離する。(b)
精製NS1タンパク質を37℃で0.5% 又は1% のn-オクチルグルコシド(nOG)を用いて
一晩処理し、任意に25 mMのDMSを用いて1時間処理する。タンパク質を、4〜20%
勾配のアクリルアミドゲルで熱変性せずに分離し、文献からの又は上記のような
モノクローナル抗-NS1抗体を用いるイムノブロッティングにより検出する。
【図２】 後述の実施例2のクローン4Cを用いて得られるデング熱ウイル
ス血清型1のNS1タンパク質の配列、及びその相当するコード化配列を示す。
ス血清型1のNS1タンパク質の配列、及びその相当するコード化配列を示す。
【図３】 図3は、デング熱ウイルスに予め感染した患者(その血清を急性
段階と回復期段階中に採取した)における捕捉-ELISAによる検出方法を用いて循
環しているNS1タンパク質をアッセイして得られる結果、また従来技術IHA (デン
グ熱ウイルス血清型1、2、3又は4の赤血球凝集阻止) 及び MAC ELISA (免疫グロ
ブリンM抗体捕捉酵素-結合イムノソルベントアッセイ)を用いて得られる結果と
の比較を示している; D1はデング熱血清型1に相当し; D2はデング熱血清型2に相
当し;D3はデング熱血清型3に相当し、かつD4はデング熱血清型4に相当する; ID
= 患者の身元; 1は疾患の急性段階での第一試料に相当し、2は回復期段階(第一
の2〜4週間後に採取)での第二試料に相当する;捕捉-ELISAアッセイで、値は、10
、30又は90倍に希釈した同一の血清について得られる光学密度として示す。
段階と回復期段階中に採取した)における捕捉-ELISAによる検出方法を用いて循
環しているNS1タンパク質をアッセイして得られる結果、また従来技術IHA (デン
グ熱ウイルス血清型1、2、3又は4の赤血球凝集阻止) 及び MAC ELISA (免疫グロ
ブリンM抗体捕捉酵素-結合イムノソルベントアッセイ)を用いて得られる結果と
の比較を示している; D1はデング熱血清型1に相当し; D2はデング熱血清型2に相
当し;D3はデング熱血清型3に相当し、かつD4はデング熱血清型4に相当する; ID
= 患者の身元; 1は疾患の急性段階での第一試料に相当し、2は回復期段階(第一
の2〜4週間後に採取)での第二試料に相当する;捕捉-ELISAアッセイで、値は、10
、30又は90倍に希釈した同一の血清について得られる光学密度として示す。
【図４】 フランス領ギアナのデング熱ウイルス血清型1に感染した患者由
来の血清について捕捉-ELISAアッセイを用いるNS1タンパク質の検出を示す。 示
した数は、カテゴリー当たりに分けられた患者数を示す(捕捉-ELISAによる正又
は負ならびにIgMに対する正又は負)。
来の血清について捕捉-ELISAアッセイを用いるNS1タンパク質の検出を示す。 示
した数は、カテゴリー当たりに分けられた患者数を示す(捕捉-ELISAによる正又
は負ならびにIgMに対する正又は負)。
【図５】 デング熱ウイルス1に感染したフランス領ギアナ出身の4人の患者
について得られた結果を示す。試料は、患者からD1〜D5の疾患の臨床段階中に毎
日採取した。グラフはそれぞれ患者に対応しており、そのそれぞれの日に試料を
採取した。グラフは、開発した捕捉-ELISAアッセイでのNS1タンパク質の検出結
果、RT-PCRの結果及びMAC-ELISA技術を用いて得られた結果と併せている。報告
されたO.D.値は、バックグランドのノイズ値に対して1回較正した。正の閾値を
破線で示す。
について得られた結果を示す。試料は、患者からD1〜D5の疾患の臨床段階中に毎
日採取した。グラフはそれぞれ患者に対応しており、そのそれぞれの日に試料を
採取した。グラフは、開発した捕捉-ELISAアッセイでのNS1タンパク質の検出結
果、RT-PCRの結果及びMAC-ELISA技術を用いて得られた結果と併せている。報告
されたO.D.値は、バックグランドのノイズ値に対して1回較正した。正の閾値を
破線で示す。
【図６】 抗-NS1モノクローナル抗体F22及びG18の特徴を示す。
【図７】 実施例3に記載されるポリクローナル手法を用いる捕捉-ELISA
アッセイと比較した、モノクローナル手法を用いる捕捉-ELISAアッセイでのNS1
タンパク質の検出を示す。得られた結果は、分析した血清の各希釈(10回、30回
又は90回)について測定される光学密度値の形態で示しており、負の対照の平均
値より小さい。
アッセイと比較した、モノクローナル手法を用いる捕捉-ELISAアッセイでのNS1
タンパク質の検出を示す。得られた結果は、分析した血清の各希釈(10回、30回
又は90回)について測定される光学密度値の形態で示しており、負の対照の平均
値より小さい。
【図８】 黄熱病に特異的な捕捉-ELISAアッセイを用いて黄熱病ウイルス
に感染した患者由来の血清におけるNS1タンパク質の証明を示している。試験し
た各血清について、負の対照の平均値より小さい、開発されたアッセイを用いて
測定される光学密度値、黄熱病IgMに特異的なMAC-ELISAアッセイを用いて測定さ
れる光学密度値及びウイルスの単離結果を、入手できた際に示している。
に感染した患者由来の血清におけるNS1タンパク質の証明を示している。試験し
た各血清について、負の対照の平均値より小さい、開発されたアッセイを用いて
測定される光学密度値、黄熱病IgMに特異的なMAC-ELISAアッセイを用いて測定さ
れる光学密度値及びウイルスの単離結果を、入手できた際に示している。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ｃ０７Ｋ 14/18 Ｃ０７Ｋ 14/18
Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ
Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/543 ５０１ 33/577 Ｂ
33/577 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，
ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ
Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ
，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，
ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ
Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ
，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，
ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，
ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ
Ｈ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ
，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，
ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，Ｋ
Ｇ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ
，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，
ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ
Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ
，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，
ＺＡ，ＺＷ
(72)発明者 メグレ，フランソワーズ
フランス、エフ−75016 パリ、リュ フ
ァンタン ラトゥール 14
(72)発明者 アルコン，ソフィ
フランス、エフ−93190 リヴリ−ガルガ
ン、アレ モンパンジェ 35
(72)発明者 タラルマン，アントワーヌ
フランス、エフ−75724 パリ セデック
ス 15、リュ デュ ドクトール ル
28、インスティティ パスツール
(72)発明者 デスプレ，フィリップ
フランス、エフ−92250 ガレンヌ−コロ
ンブ、プラース ド ラ リベルテ 18
(72)発明者 ドベル，ヴァンサン
フランス、エフ−92170 ヴァンヴ、ブル
ヴァール デュ リセ 29
Ｆターム(参考） 4B024 AA14 BA51 CA04 DA02 DA06
EA04
4B064 AF27 AG32 CA02 CA10 CA19
CC24 DA13 DA15
4C084 AA13 NA01 NA14 ZB332
4C085 AA14 BA51 CC08
4H045 AA10 BA09 CA01 DA86 EA50
Claims (20)
- 【請求項１】 同じか異なっていてもよい少なくとも2つの抗体 - 第一抗体つまり - ヘキサマー形態の、フラビウイルスのNS1タンパク質の免疫捕捉によって
予備選択されたポリクローナル抗体、及び - ヘキサマー形態の、フラビウイルスのNS1タンパク質に対する高い親和性
について予備選択された抗-NS1モノクローナル抗体混合物(モノクローナル抗体
は次いで精製される) からなる群から選択される抗体からなるNS1糖タンパク質を捕捉するための抗体
、 - 第二抗体つまり - ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するポリクローナル抗体、及び - ヘキサマー形態のNS1タンパク質に対するモノクローナル抗体混合物 からなる群から選択される関連抗体 を用いる免疫学的方法により、感染の臨床段階期間にわたって生物試料における
フラビウイルスのNS1非構造糖タンパク質を検出することからなることを特徴と
する、フラビウイルス感染の早期検出方法。 - 【請求項２】 フラビウイルス感染が、デング熱ウイルス感染であることを
特徴とする請求項１に記載の検出方法。 - 【請求項３】 第一抗体が適当な固体支持体に付着し、第二抗体が適当な標
識に任意に複合していることを特徴とする請求項１及び２のいずれかに記載の検
出方法。 - 【請求項４】 第二抗体が標識に複合していない際に、固体支持体に付着し
たNS1タンパク質に対するその結合が、次いで第三抗体で検出され、適当な標識
に複合されることを特徴とする請求項３に記載の検出方法。 - 【請求項５】 第三抗体が酵素に複合していることを特徴とする請求項４に
記載の検出方法。 - 【請求項６】 - 第一抗体、つまり捕捉抗体は、デング熱ウイルスのNS1タ
ンパク質(タンパク質はヘキサマー形態である)での免疫捕捉によって選択される
マウスのポリクローナル抗体からなり、かつ - 第二抗体、つまり分析される生物試料でNS1の存在を検出するための抗体は、
デング熱ウイルス血清型1のNS1タンパク質(タンパク質はヘキサマー形態である)
で免疫化したウサギ由来のポリクローナル抗体からなり、第二抗体の付着は、ペ
ルオキシダーゼに複合し、第二抗体に対する抗体からなる第三抗体で認められる
ことを特徴とする請求項５に記載の検出方法。 - 【請求項７】 - 請求項１〜６のいずれか１つに定義される少なくとも1つ
の捕捉抗体及び少なくとも1つの関連抗体、 - フラビウイルス及び/又はフラビウイルスに応じた種々の血清型のNS1タンパ
ク質(タンパク質はヘキサマー形態である)からなる少なくとも1つの正の対照、
及び - 正常なヒト血清からなる少なくとも1つの負の対照 からなることを特徴とする、フラビウイルス感染の早期診断のための箱入りのセ
ット。 - 【請求項８】 NS1タンパク質が、感染した哺乳動物細胞、又はフラビウイ
ルスのNS1タンパク質遺伝子からなる組換えプラスミドもしくは該遺伝子のフラ
グメントもしくはフラビウイルスゲノムのフラグメント(フラグメントはNS1タン
パク質を全て又は一部発現できる)でトランスフェクトされた哺乳動物細胞いず
れかからの培養上清から得られることを特徴とする請求項７に記載の診断のため
の箱入りセット。 - 【請求項９】 NS1タンパク質がデング熱ウイルスのタンパク質であること
を特徴とする、請求項７及び８のいずれかに記載のフラビウイルス感染の早期診
断のための箱入りセット。 - 【請求項１０】 プラスミドが、1999年6月7日付けで番号I-2220でInstitut
Pasteurによって開設されているCollection Nationale de Cultures et de Mic
roorganismes [National collection of cultures and microorganisms]に寄託
されたことを特徴とする請求項８及び９のいずれかに記載のフラビウイルス感染
の早期診断のための箱入りセット。 - 【請求項１１】 従来技術を用いるNS1タンパク質の精製前に、沈降剤での
処理、続く遠心分離によって、NS1タンパク質の可溶型を該タンパク質の微粒子
形態から分離する工程からなることを特徴とする、感染した哺乳動物細胞、又は
NS1タンパク質遺伝子からなる組換えプラスミドもしくは該遺伝子のフラグメン
トもしくはフラビウイルスゲノムのフラグメント(フラグメントがNS1タンパク質
を発現し得る)でトランスフェクトした哺乳動物細胞のいずれかの培養上清から
、ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タンパク質を精製する方法。 - 【請求項１２】 任意に他のタンパク質と会合し、少なくとも1つの医薬的
に許容される賦形剤と組合わさった、ヘキサマー形態のフラビウイルスのNS1タ
ンパク質を有効成分として含むことを特徴とする、免疫原性組成物。 - 【請求項１３】 種々のデング熱ウイルス血清型に相当するヘキサマー形態
のNS1タンパク質の少なくとも1つの混合物からなることを特徴とする請求項１２
に記載の免疫原性組成物。 - 【請求項１４】 インビボで抗体の産生を誘発し得る免疫原性組成物を製造
するためのヘキサマー形態のNS1タンパク質又はその発現系の使用。 - 【請求項１５】 受動免疫を誘発し得る医薬品を製造するための、分解して
いないヘキサマー形態のNS1タンパク質に対する親和性が高い少なくとも1つのモ
ノクローナル抗-NS1抗体(該モノクローナル抗体は次いで精製され修飾される)の
使用。 - 【請求項１６】 早期段階でフラビウイルスの感染を診断できる特異的な抗
-NS1抗体をインビトロで選択するための、分解されていないヘキサマー形態のNS
1タンパク質の使用。 - 【請求項１７】 少なくとも1つの医薬的に許容される賦形剤と組みあわさ
った、 - あらゆる血清型のデング熱ウイルスのNS1タンパク質の全て又は一部を発現し
得るポリヌクレオチド、 - 宿主に注入されており、あらゆる血清型のデング熱ウイルスのNS1タンパク質
をエンコードするDNA(この遺伝子は該タンパク質を発現する)を発現できるプロ
モーターを少なくとも1つ含む発現系 からなる群から選択される有効成分を含むことを特徴とする免疫原性組成物。 - 【請求項１８】 プロモーターと結合した配列SEQ ID No. 1で定義されるポ
リヌクレオチドを適当な真核細胞で発現させることからなることを特徴とする、
デング熱ウイルスのNS1タンパク質をエンコードするポリヌクレオチドの発現方
法。 - 【請求項１９】 フラビウイルスがあらゆる血清型のデング熱ウイルスであ
ることを特徴とする、請求項１１に記載のNS1タンパク質の精製方法。 - 【請求項２０】 フラビウイルスがデング熱ウイルス血清型1であることを
特徴とする請求項１１及び１９に記載のNS1タンパク質の精製方法。
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9907290A FR2794864A1 (fr) | 1999-06-09 | 1999-06-09 | Methode de detection precoce des flavivirus et ses applications |
| FR99/07290 | 1999-06-09 | ||
| FR99/07361 | 1999-06-10 | ||
| FR9907361A FR2794865B1 (fr) | 1999-06-09 | 1999-06-10 | Methode de detection precoce des flavivirus et ses applications |
| PCT/FR2000/001620 WO2000075665A1 (fr) | 1999-06-09 | 2000-06-09 | Detection precoce des flavivirus en utilisant la clycoproteine ns1 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2003501661A true JP2003501661A (ja) | 2003-01-14 |
| JP2003501661A5 JP2003501661A5 (ja) | 2007-08-02 |
| JP4625215B2 JP4625215B2 (ja) | 2011-02-02 |
Family
ID=26234982
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001501889A Expired - Lifetime JP4625215B2 (ja) | 1999-06-09 | 2000-06-09 | Ｎｓ１糖タンパク質を用いるフラビウイルスの早期検出 |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (5) | US6870032B1 (ja) |
| EP (1) | EP1190257B1 (ja) |
| JP (1) | JP4625215B2 (ja) |
| KR (1) | KR20020042533A (ja) |
| CN (1) | CN1360678B (ja) |
| AT (1) | ATE274701T1 (ja) |
| AU (1) | AU776844B2 (ja) |
| BR (1) | BRPI0011369B8 (ja) |
| DE (1) | DE60013287T2 (ja) |
| ES (1) | ES2226894T3 (ja) |
| FR (1) | FR2794865B1 (ja) |
| HK (1) | HK1045729B (ja) |
| MX (1) | MXPA01012662A (ja) |
| PT (1) | PT1190257E (ja) |
| WO (1) | WO2000075665A1 (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007524350A (ja) * | 2003-01-31 | 2007-08-30 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 抗デング熱ウイルス抗体、組成物、方法および使用 |
| JP2008503720A (ja) * | 2004-06-18 | 2008-02-07 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド | ハンタウイルス感染の診断のための方法および試薬 |
| JP2008508863A (ja) * | 2004-05-17 | 2008-03-27 | インスティティ・パスツール | フラビウイルス科ウイルスタンパク質発現のための組換えレンチウイルスベクター、及びワクチンとしてのそれらの使用 |
| JP2010506166A (ja) * | 2006-10-05 | 2010-02-25 | エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ | デング熱の診断及び治療 |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2794865B1 (fr) * | 1999-06-09 | 2003-04-18 | Pasteur Institut | Methode de detection precoce des flavivirus et ses applications |
| CN100392087C (zh) * | 2001-11-26 | 2008-06-04 | 昆士兰大学 | 黄病毒疫苗输送系统 |
| US7189403B2 (en) * | 2003-06-30 | 2007-03-13 | Institut Pasteur | Attenuated flavivirus strains containing a mutated M-ectodomain and their applications |
| US7585621B2 (en) | 2003-09-09 | 2009-09-08 | Idexx Laboratories, Inc. | Detection of West Nile virus infection and vaccination |
| US7074555B2 (en) * | 2004-04-28 | 2006-07-11 | Idexx Laboratories, Inc. | Detection of West Nile Virus |
| FR2871888A1 (fr) * | 2004-06-22 | 2005-12-23 | Pasteur Institut | Methode de diagnostic ou de depistage d'une infection clinique ou asymptomatique par un flavivirus du groupe encephalitique |
| US8222029B2 (en) * | 2005-05-16 | 2012-07-17 | Institut Pasteur | Lentiviral vector-based vaccine |
| US20070211241A1 (en) * | 2006-02-24 | 2007-09-13 | Noriyuki Aizawa | Optical defect inspection apparatus |
| US7629117B2 (en) * | 2006-06-20 | 2009-12-08 | Mahidol University | Determination of risk of developing dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome, methods and compositions therefor |
| CN101226196B (zh) * | 2008-02-02 | 2012-05-09 | 南方医科大学 | 一种检测ⅱ型登革病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒 |
| US20090275499A1 (en) * | 2008-02-29 | 2009-11-05 | Marie Flamand | Nonstructural protein ns1 as a novel therapeutic target against flaviviruses |
| CN101551393B (zh) * | 2009-04-02 | 2012-09-19 | 南方医科大学 | 一种检测ⅳ型登革病毒ns1抗原的免疫诊断试剂盒 |
| US8920804B2 (en) | 2011-12-22 | 2014-12-30 | Inbios International, Inc. | Methods and materials for the detection of dengue virus infection |
| WO2015095735A2 (en) * | 2013-12-20 | 2015-06-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Vaccine compositions and uses thereof |
| FR3017713B1 (fr) * | 2014-02-18 | 2018-01-12 | Biomerieux | Procede et kit pour determiner la probabilite pour un patient d'evoluer vers une dengue severe |
| FR3017714A1 (fr) * | 2014-02-18 | 2015-08-21 | Biomerieux Sa | Procede et kit pour determiner la probabilite pour un patient d'evoluer vers une dengue severe |
| DE102014205098B4 (de) | 2014-03-19 | 2016-02-04 | Universität Leipzig | Verfahren und Verwendungen von Mitteln zum Nachweis einer Denguevirus-Infektion |
| CN105445458A (zh) * | 2015-11-13 | 2016-03-30 | 山东省滨州畜牧兽医研究院 | 鉴别鸭坦布苏病毒感染动物和灭活苗免疫动物的elisa检测试剂盒 |
| MX2018009738A (es) | 2016-02-11 | 2019-02-07 | Massachusetts Inst Technology | Anticuerpos monoclonales de proteína ns1 anti-virus del dengue. |
| BR112018014122A2 (pt) * | 2016-02-22 | 2018-12-11 | Euroimmun Medizinische Labordiagnostika Ag | imunoensaio para o diagnóstico de infecções virais |
| BR112019021872A2 (pt) * | 2017-04-26 | 2020-06-02 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Polipeptídeo, método de produção de um polipeptídeo, métodos para detectar anticorpos, usos de um polipeptídeo e kits de reagentes |
| US11531029B2 (en) | 2017-05-08 | 2022-12-20 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Methods and compositions for the detection of flavivirus infections |
| CN109053882B (zh) * | 2018-08-28 | 2019-08-23 | 东莞市朋志生物科技有限公司 | 一种ns1蛋白的结合蛋白以及应用 |
| KR102218517B1 (ko) * | 2019-01-23 | 2021-02-19 | 충북대학교 산학협력단 | 단일클론항체 쌍을 이용한 지카 바이러스의 검출 방법 |
| KR102218561B1 (ko) * | 2019-01-28 | 2021-02-19 | 충북대학교 산학협력단 | 단일클론항체 쌍을 이용한 뎅기 바이러스의 검출 방법 |
| BR112022005436A2 (pt) | 2019-09-25 | 2022-06-21 | Centre Nat Rech Scient | Um novo complexo formado entre a proteína não estrutural ns1 de flavivírus e as lipoproteínas plasmáticas |
| CN113355344B (zh) * | 2021-08-10 | 2021-11-02 | 北京溯本源和生物科技有限公司 | 一种流感病毒ns1蛋白的表达质粒、重组蛋白和特异性单克隆抗体及应用 |
| CN113683690B (zh) * | 2021-08-19 | 2023-05-23 | 中国科学院微生物研究所 | 针对黄热病毒ns1蛋白的抗体及其应用 |
| CN113621058B (zh) * | 2021-08-19 | 2023-05-23 | 中国科学院微生物研究所 | 黄热病毒抗体及其应用 |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR10904E (fr) | 1909-11-09 | David Rojat | Filtre réalisant dans le meme appareil la stérilisation par les rayons ultra-violets et la filtration, applicable aux liquides | |
| US4281061A (en) * | 1979-07-27 | 1981-07-28 | Syva Company | Double antibody for enhanced sensitivity in immunoassay |
| US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| YU109590A (sh) * | 1989-06-06 | 1992-07-20 | Immuno Ag. Fuer Chemisch Medizintsche Produkte | Proteini, vakcine i nukleinske kiseline |
| GB9209243D0 (en) * | 1992-04-29 | 1992-06-17 | Univ Singapore | Dengue virus |
| FR2794865B1 (fr) * | 1999-06-09 | 2003-04-18 | Pasteur Institut | Methode de detection precoce des flavivirus et ses applications |
-
1999
- 1999-06-10 FR FR9907361A patent/FR2794865B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
2000
- 2000-06-09 WO PCT/FR2000/001620 patent/WO2000075665A1/fr active IP Right Grant
- 2000-06-09 BR BRPI0011369A patent/BRPI0011369B8/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-06-09 EP EP00951579A patent/EP1190257B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-09 US US09/980,839 patent/US6870032B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-09 AT AT00951579T patent/ATE274701T1/de active
- 2000-06-09 MX MXPA01012662A patent/MXPA01012662A/es active IP Right Grant
- 2000-06-09 ES ES00951579T patent/ES2226894T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-09 DE DE60013287T patent/DE60013287T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-09 PT PT00951579T patent/PT1190257E/pt unknown
- 2000-06-09 JP JP2001501889A patent/JP4625215B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-06-09 KR KR1020017015913A patent/KR20020042533A/ko not_active Application Discontinuation
- 2000-06-09 AU AU64474/00A patent/AU776844B2/en not_active Expired
- 2000-06-09 CN CN008096767A patent/CN1360678B/zh not_active Expired - Lifetime
-
2002
- 2002-09-26 HK HK02107117.1A patent/HK1045729B/zh not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-12-21 US US11/017,048 patent/US7282341B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2007
- 2007-08-21 US US11/892,283 patent/US20090226478A1/en not_active Abandoned
- 2007-09-11 US US11/898,293 patent/US7670766B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2011
- 2011-07-26 US US13/190,547 patent/US8709427B2/en not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| JPN6010006369, Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ, 1990, Ｖｏｌ．５０２， Ｎｏ．１, Ｐａｇｅ．５９−６８ * |
| JPN6010006371, Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ, 1994, Ｖｏｌ．７５， Ｎｏ．１２, Ｐａｇｅ．３４５３−３４６０ * |
| JPN6010006373, Ｊ Ｖｉｒｏｌ, 199907, Ｖｏｌ．７３， Ｎｏ．７, Ｐａｇｅ．６１０４−６１１０ * |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007524350A (ja) * | 2003-01-31 | 2007-08-30 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 抗デング熱ウイルス抗体、組成物、方法および使用 |
| JP2008508863A (ja) * | 2004-05-17 | 2008-03-27 | インスティティ・パスツール | フラビウイルス科ウイルスタンパク質発現のための組換えレンチウイルスベクター、及びワクチンとしてのそれらの使用 |
| JP2008503720A (ja) * | 2004-06-18 | 2008-02-07 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド | ハンタウイルス感染の診断のための方法および試薬 |
| JP4813471B2 (ja) * | 2004-06-18 | 2011-11-09 | ノバルティス ヴァクシンズ アンド ダイアグノスティクス インコーポレイテッド | ハンタウイルス感染の診断のための方法および試薬 |
| JP2010506166A (ja) * | 2006-10-05 | 2010-02-25 | エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ | デング熱の診断及び治療 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20090068213A1 (en) | 2009-03-12 |
| AU776844B2 (en) | 2004-09-23 |
| AU6447400A (en) | 2000-12-28 |
| US7282341B2 (en) | 2007-10-16 |
| US8709427B2 (en) | 2014-04-29 |
| US6870032B1 (en) | 2005-03-22 |
| US20050186562A1 (en) | 2005-08-25 |
| DE60013287T2 (de) | 2005-09-15 |
| BRPI0011369B8 (pt) | 2021-05-25 |
| US20120009216A1 (en) | 2012-01-12 |
| KR20020042533A (ko) | 2002-06-05 |
| ATE274701T1 (de) | 2004-09-15 |
| HK1045729B (zh) | 2005-03-18 |
| EP1190257A1 (fr) | 2002-03-27 |
| PT1190257E (pt) | 2004-12-31 |
| ES2226894T3 (es) | 2005-04-01 |
| HK1045729A1 (en) | 2002-12-06 |
| FR2794865A1 (fr) | 2000-12-15 |
| WO2000075665A1 (fr) | 2000-12-14 |
| JP4625215B2 (ja) | 2011-02-02 |
| US7670766B2 (en) | 2010-03-02 |
| BRPI0011369B1 (pt) | 2019-03-19 |
| BR0011369A (pt) | 2003-08-12 |
| CN1360678B (zh) | 2013-07-03 |
| MXPA01012662A (es) | 2004-03-19 |
| US20090226478A1 (en) | 2009-09-10 |
| DE60013287D1 (de) | 2004-09-30 |
| CN1360678A (zh) | 2002-07-24 |
| FR2794865B1 (fr) | 2003-04-18 |
| EP1190257B1 (fr) | 2004-08-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4625215B2 (ja) | Ｎｓ１糖タンパク質を用いるフラビウイルスの早期検出 | |
| JP2003501661A5 (ja) | ||
| JPS62270534A (ja) | ウイルス糖蛋白サブユニツトワクチン | |
| CA2331368C (en) | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection | |
| JPH11506328A (ja) | 単離された、プロセシングされていないポリペプチドを使用するプラス鎖ｒｎａウイルスの診断およびプラス鎖ｒｎａウイルスに対するワクチン接種 | |
| AU2021275403A1 (en) | Antibody that binds specifically to the SARS CoV 2 spike protein, and methods for its manufacture | |
| Heinz et al. | Monoclonal antibodies to the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus | |
| JP4641695B2 (ja) | 新規なｈｅｖ抗原性ペプチド及び方法 | |
| JP2002537783A (ja) | Ｔ．ｃｒｕｚｉ感染の検出および予防のための、化合物および方法 | |
| FR2767324A1 (fr) | Utilisation de proteines d'enveloppe recombinantes pour le diagnostic du virus de la dengue | |
| KR20020008172A (ko) | Ττ바이러스 서열 유래의 펩티드 및 ττ바이러스에결합하는 단일특이적 항체 | |
| FR2794864A1 (fr) | Methode de detection precoce des flavivirus et ses applications | |
| JP2001522599A (ja) | 診断用及びワクチン用、ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質由来マルチマーペプチド | |
| WO2005018538A2 (en) | Severe acute respiratory syndrome (sars) polypeptides, antibodies to sars polypeptides and the use thereof in diagnostic, vaccination and therapeutic applications | |
| KR20020089371A (ko) | 진단 및 치료용 정제된 ｃ형 간염 바이러스 외피 단백질 | |
| KR102039059B1 (ko) | 일본 뇌염 바이러스 피막 단백질의 돌출 도메인을 포함하는 단백질, 이의 동형이량체, 및 이의 용도 | |
| Nawa | An enzyme-linked immunosorbent assay using a chaotropic agent (sodium thiocyanate) for serotype specific reaction between crude dengue viral antigen and anti-dengue mouse antibody | |
| CN116710128A (zh) | 特异性结合SARSCoV2刺突蛋白的抗体及其制造方法 | |
| WO2003013601A1 (en) | Toxin associated with sudden infant death syndrome, and uses thereof | |
| MXPA97009271A (en) | Diagnosis of, and vaccination against, in positive thread rna virus using an isolated polypeptide, do not process | |
| MXPA00001556A (en) | Use of recombinant envelope proteins for diagnosing the dengue virus | |
| JP2004525885A (ja) | 診断用および治療用の精製ｃ型肝炎ウイルスエンベロープタンパク質 | |
| JPH08127597A (ja) | ポリペプチドに対する抗体およびその製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20070606 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20070606 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20100121 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20100209 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100420 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100427 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100806 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20101012 |
|
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20101105 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 4625215 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131112 Year of fee payment: 3 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |