DE60013287T2 - Früherkennung der flaviviren unter verwendung des ns1-glycoproteins - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum frühen Nachweis von Flaviviren, insbesondere des Virus des Dengue-Fiebers, sowie seine Anwendungen.
  • Dengue ist eine tropische Krankheit, die akut fiebrig ist, deren verursachendes Virus ein Arbovirus ist, das von Moskitos übertragen wird. Die Überträger der Krankheit sind Moskitos der Gattung Aedes, insbesondere Aedes aegypti, deren Larven am häufigsten im Haus oder in der Umgebung eines Hauses vorkommen. Das verantwortliche Virus, das 1951 isoliert wurde, wurde in vier unterschiedliche antigene Typen eingeteilt (DEN1, DEN2, DEN3 und DEN4). Es gehört zu der Familie der Flaviviridae, Gattung Flavivirus.
  • Mehr als 2 Milliarden Einwohner leben in den endemischen Zonen und die Anzahl der durch das Virus infizierten Personen könnte pro Jahr sich auf mehr als 100 Millionen erhöhen. Dengue ist für 500.000 Krankenhausaufnahmen und mehrere zehntausend Todesfälle, in der Mehrzahl Kinder, pro Jahr verantwortlich.
  • Nach einer Inkubation von fünf bis acht Tagen ist der Beginn der klinischen Anzeichen im Allgemeinen plötzlich und besteht im Auftreten von nicht-differenziertem Fieber (DF, dengue fever), das von schweren Kopfschmerzen, Lombalgien, Muskelschmerzen und artikulären Schmerzen sowie von Schüttelfrost begleitet ist. Vom dritten bis fünften Tag der fiebrigen Phase kann ein kongestiver, maculo-papulöser Ausschlag während drei bis vier Tagen auftreten (klassische Dengue-Erkrankung).
  • In seiner schweren Form kann die Infektion zum Auftreten eines Hämarrhogie-Syndroms führen (DHF oder dengue haemorrhagic fever), das durch eine verstärkte vaskuläre Permeabilität und eine Störung der Hämostase gekennzeichnet ist. Während in der Mehrheit der Fälle die Entwicklung innerhalb einer Woche im Allgemeinen günstig ist, kann der Ausgang im Fall eines hypovolämischen Schocks (DSS oder Dengue-Schock-Syndrom) fatal sein. Diese Komplikationen könnten im Vorliegen einer vorher existierenden Immunität, die während einer Primo-Infektion durch ein Virus, das zum Dengue-Virus heterolog ist (unterschiedlicher Serotyp) erworben wurde, begründet sein. In der Tat werden zwei unterschiedliche Typen einer serologischen Reaktion bei den Personen identifiziert, die durch Dengue infiziert sind: die Personen, die niemals eine Flavivirus-Infektion hatten und nicht gegen ein anderes Flavivirus (Gelbfiebervirus, Virus der japanischen Enzephalitis beispielsweise) geimpft waren, werden eine Primärantwort zeigen, die durch das langsame Auftreten von spezifischen Antikörpern gegen das für die Infektion verantwortliche Virus charakterisiert ist; die Personen, die bereits eine Flavivirus-Infektion hatten (z.B. anderer Serotyp des Dengues) oder gegen ein anderes Flavivirus geimpft waren, werden eine Sekundärreaktion zeigen, die durch das schnelle Auftreten der Antikörper gekennzeichnet ist.
  • Das infektiöse Agens ist das Virus des Dengue-Fiebers, das zur Familie der Flaviviridae gehört, zu der auch das Gelbfiebervirus und das der japanischen Enzephalitis gehört (T.P. Monath et al., (1996) Flaviviruses in B.N. Fields, D.M. Knipe, P.M. Howly et al. (Herausg.) „Fields Virology" Philadelphia : Lippincott Raven Press Publishers). Diese Viren besitzen eine einsträngige RNA mit positiver Polarität, die 11.000 Nukleotide umfasst und die für ein Polyprotein mit etwa 3400 Aminosäuren kodiert. Dieses individualisiert sich im Verlauf von co- und post-translationalen Spaltungen durch virale und zelluläre Proteasen in drei Strukturproteine und sieben nicht-strukturelle Proteine NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B und NS5. Das nicht-strukturelle Protein NS1 wurde zum ersten Mal 1970 von P.K. Russel et al. identifiziert (J. Immunol., (1970), 105, 838–845) und 1985 von G.W. Smith et al. (J. Gen. Virol., (1985), 66, 559-571) charakterisiert. Dieses Glycoprotein wird in der Gattung der Flaviviren (T.P. Monath, bereits zitiert) in hohem Maße konserviert und zwar insbesondere in den vier Serotypen des Virus des Dengue-Fiebers, und liegt in einer intrazellulären Form und einer extrazellulären Form vor. Die intrazelluläre Form greift in die frühen Phasen der Replikation des Virus ein (Hall R.A. et al., J. Virol. (1999), 73, 10272–10280; Rice C.M. et al., J. Virol., (1997), 71, 291–298; Rice C.M. et al., J. Yirol., (1996), 222, 159–168 ; Rice C.M. et al., J. Virol., (1997), 71, 9608–9617). Bevor das Protein NS1 zur Plasmamembran transportiert wird, macht es eine Dimerisierung durch. In den Säugetierzellen, nicht aber in den Insektenzellen, wird ein Teil des Proteins NS1 in das extrazelluläre Milieu freigesetzt, und zwar entweder hauptsächlich in Form eines löslichen Proteins oder untergeordnet in Mikropartikelform. Wenn es in löslicher Form geschieht, liegt das Protein in Form eines Oligomers, insbesondere eines Pentamers oder eines Hexamers, vor (Crooks A.J. et al., J. Chrom., (1990), 502, 59–68 und J. Gen. Virol., (1994), 75, 3453–3460). Derzeit ist die biologische Funktion des Proteins NS1 nicht bekannt.
  • Mehrere Studien legen einen immundominanten Charakter des Proteins NS1 in der schützenden Immunantwort gegen die Flavivirus-Infektionen nahe. Experimente, die mit einer bestimmten Anzahl von Flaviviren, wie z.B. dem Gelbfiebervirus, dem Dengue-Fieber-Virus, dem Virus der japanischen Enzephalitis und dem Virus der Zecken-Enzephalitis durchgeführt wurden, haben einen partiellen oder vollständigen Schutz gegen eine tödliche Dosis eines homologen Virus bei den Tieren gezeigt, die mit dem Protein NS1 geimpft worden waren, entweder als Untereinheit oder durch Virusträger produziert, als Impfstoff oder Adenovirus (Schlesinger et al., J. Virol., (1986), 60, 1153–1155; J. Gen. Virol. (1987), 68, 853–857; Falgout et al., J. Yirol., (1990), 64, 4356–4363; Jacobs et al., J. Virol., (1992), 66, 2086–2095 ; Hall et al., J. Gen. Virol., (1996), 77, 1287–1294 ; Konishi et al., Virology, (1991), 185, 401–410).
  • Die passive Immunisierung von Mäusen durch monoklonale Antikörper gegen NS1 hat es außerdem ermöglicht, einen gewissen Grad des Schutzes zu erlangen (Schlesinger, et al., J. Immunol, (1985), 135, 2805–2809; Gould et al., J. Gen. Virol., (1986), 67, 591–595; Henchal et al., J. Gen. Yirol., (1988), 69, 2101–2107). Die Rolle der Antikörper gegen NS1 beim Schutz kennt man nicht vollständig. Es könnte sein, dass die Proteine NS1 an der Oberfläche der infizierten Zellen von den Antikörpern erkannt werden, die das Komplement fixieren, was zur Lyse der infizierten Zellen führt (Schlesinger, et al., Virology, (1993), 192, 132–141).
  • Es gibt keine spezifische Behandlung und die Versorgungen, die für den Patienten erbracht werden, sind einzig symptomatisch. Im Fall der klassischen Dengue-Erkrankung beruht die Behandlung auf der Verabreichung von Analgetika und Antipyretika. Im Falle von DHF besteht die Behandlung in einer Perfusion, um den plasmatischen Verlust auszugleichen, verbunden mit der Korrektur hydroelektrischer Störungen und der Wiederbelebung der Diurese.
  • Im Handel ist kein Impfstoff gegen das Virus des Dengue-Fiebers verfügbar. Dagegen wurden Assays bezüglich des Schutzes durch abgeschwächte Stämme der vier Serotypen des Virus des Dengue-Fiebers von N. Bhamarapravati et al. (Dengue and Dengue haemorrhagic fever (1997), 367–377) mit nicht-zufrieden stellenden Ergebnissen durchgeführt. Die Prävention beruht demnach einzig auf der Bekämpfung des Überträgers. Diese Bekämpfung verbindet eine Larvenzerstörung und die Verstäubung von „Adulticiden".
  • Bei Fehlen von Impfstoff ist es notwendig, die Epidemien zu überwachen und die vorstehend genannten Komplikationen zu verhindern; um dies zu tun, wurden durch die Welt-Gesundheits-Organisation Programme zur aktiven Überwachung eingeführt; diese umfassen im Wesentlichen die Überwachung der Fälle mit Fieber und der Insektenüberträger sowie das serologische und virologische Screening von Personen, die Fieber haben und die verdächtigt werden, mit dem Virus des Dengue-Fiebers infiziert zu sein.
  • Die Ätiologie des Dengue-Fiebers ist manchmal schwierig zu erkennen, wenn ein Kranker ein nicht-differenziertes fiebriges Syndrom zeigt, das „Dengue-artig" ist, das von einem anderen Arbovirus, Viren, die eruptives Fieber hervorrufen, wie Grippe, oder nicht-viralen Pathogenen von Krankheiten, wie Leptospirose und sogar Malaria, herrühren. Hier kann nur eine Laboruntersuchung die Diagnose herbeiführen.
  • Derzeit gibt es mehrere Diagnosetests für Dengue-Fieber. Um ein interpretierbares Resultat zu erhalten, ist es jedenfalls notwendig, mehrere Verfahren zu kombinieren:
    • – die Isolierung des Virus durch Techniken der klassischen Virologie, insbesondere durch Infektion von Zellkulturen oder Vermehrung im Gehirn junger Mäuse oder durch Amplifikation durch Inokulation in Moskitos und Untersuchung, z.B. durch Immunfluoreszenz. Diese Verfahren haben den Nachteil, dass sie schwierig durchzuführen sind und von der Frühzeitigkeit der Entnahme und guter Konservierungsbedingungen abhängen; darüber hinaus können die ersten Resultate frühestens nach einer Woche erhalten werden; um diese Unzulänglichkeiten auszuräumen, kann man sich eines Tests durch RT/PCR bedienen (V. Deubel., L'eurobiologiste (1997), Band XXXI, 37–155); allerdings ist dieses Mittel nicht immer zuverlässig und kann in den Ländern, die von der Infektion durch das Virus des Dengue-Fiebers betroffen sind, aus Kostengründen und Gründen der Ausstattung nicht routinemäßig durchgeführt werden;
    • – die serologischen Tests; die früheste serologische Diagnose besteht darin, für virale Antigene spezifischer IgM durch die MAC-ELISA-Technik (immunoglobulin MAntibody Capture Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) zu bestimmen. Ihre Detektion mehrere Tage nach Einsetzen der Symptome ermöglicht es, eine Diagnose für die Wahrscheinlichkeit einer Infektion durch ein Flavivirus zu entwickeln. Die Antikörper des IgG-Typs treten im Vergleich zu den Antikörpern des IgM-Typs später auf. In jedem Fall benötigt die Suche bzw. Bestimmung der Antikörper zwei Entnahmen: eine zu Beginn der klinischen Anzeichen, die andere 10 bis 28 Tage danach, um so eine serologische Umwandlung durch Inhibierungsreaktion der Hämagglutination (IHA) oder ELISA zu beweisen.
  • Es wurden auch einfache und kostengünstige immunologische Tests vorgeschlagen, die in den Risikoländern einsetzbar sind und die als spezifisches immunologisches Reagens Peptide verwenden, die vom nicht-strukturellen Protein NS1, das für Flavivirus charakteristisch ist, abgeleitet sind. So beschreibt das Patent US 5 824 506 ein Verfahren, das Peptide verwendet, die vom nicht-strukturellen Protein NS1 abgeleitet sind, und die es erlauben, die Antikörper zu detektieren, die durch das Vorliegen des Virus des Dengue-Fiebers induziert werden; jedenfalls erkennen die selektionierten Peptide im Wesentlichen die Proben, die von Rekonvaleszenten erhalten werden, und erkennen auch die Patienten, die zum zweiten Mal infiziert wurden, besser als die, die zum ersten Mal infiziert wurden; diese enttäuschenden Ergebnisse können aus der Tatsache erklärt werden, dass die verwendeten Peptide für die antigenen Merkmale des nativen Proteins nicht repräsentativ sind und daher zu einer schlechten Erkennung der gesuchten Antikörper führen.
  • In allen Fällen kann nur die verzögerte Bestätigung einer Infektion durch ein Flavivirus erbracht werden.
  • Ein von Sir Albert Sakzewski Virus Research Centre Royal Children's Hospital, (A. Falconar, 1991) stammender Artikel beschreibt die Bestimmung des nicht-strukturellen Glycoproteins NS1 in Serum von Patienten, die durch das Virus DEN2 infiziert waren. Die Autoren dieses Berichts verwenden einen ELISA-Test des Doppel-Sandwich-Typs, in dem ein Kaninchenserum, das polyklonale Antikörper gegen NS1 enthält, die als Abfangantikörper verwendet werden, auf einer Mikrotiterplatte immobilisiert ist. Das abgefangene Antigen wird mit Hilfe von monoklonalen Mausantikörpern, die gegen das Protein NS1 entweder des Virus des Dengue-Fiebers, Typ DEN2, oder spezifisch des serologischen Komplexes des Dengue-Fiebers gerichtet sind, detektiert; die Entwicklung der Bildung des Antigen/Antikörper-Komplexes erfolgt mit Hilfe von Ziegen-anti-Maus-IgG, gebunden an Peroxidase. Mit diesem Verfahren haben die Autoren gezeigt, dass die Detektionsempfindlichkeit des Tests mit den polyklonalen Antikörpern DEN2 als Entwicklungssonde etwa 4 ng/ml ist und mit den monoklonalen Antikörpern der Gruppe etwa 60 ng/ml ist, wenn man das gereinigte oder abgebaute dimere Protein NS1 als Standard verwendet.
  • Dieser Test jedoch erlaubt die Detektion des Proteins NS1 weder im Fall von Primärinfektionen in der akuten oder rekonvaleszenten Phase noch im Fall von Sekundärinfektionen in der rekonvaleszenten Phase, in denen ein erhöhter Titer der Antikörper gegen NS1 vorliegt; die Autoren haben daraus den Schluss gezogen, dass das Protein NS1 nur im Fall von Sekundärinfektionen in bedeutenden Mengen vorliegen kann und das vorübergehend während der Infektion.
  • Nun haben die Erfinder ein Reinigungsverfahren des Proteins NS1 eines Flavivirus in Hexamerform verwendet, was ihnen die Möglichkeit gibt, spezifische Antikörper dieses Proteins in Hexamerform zu selektionieren und in überraschender Weise zu zeigen, dass diese Antikörper die Werkzeuge der Wahl sind um die verschiedenen Formen des Proteins NS1 zu beweisen, das im Rahmen einer Infektion durch ein Flavivirus, insbesondere in den frühen Phasen, in denen die Reaktion in spezifischen Antikörpern nicht nachweisbar ist, insbesondere während Primärinfektionen durch das Virus des Dengue-Fiebers, im Blutkreislauf befindet.
  • Als Folge haben sich die Erfinder die Aufgabe gestellt, ein Verfahren zum frühen Nachweis einer Flavivirus-Infektion bereitzustellen, das besser auf die Anforderungen der Praxis reagiert als die Verfahren des Standes der Technik, d.h. ein Verfahren bereitzustellen, das zuverlässig, schnell, kostengünstig ist und das rechtzeitig an die medizinischen Versorgungen angepasst werden kann.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist folglich ein Verfahren zum frühen Nachweis einer Flavivirus-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass es den Nachweis des nicht-strukturellen Glycoproteins NS1 eines Flavivirus in einer biologischen Probe während der gesamten Dauer der klinischen Phase der Infektion durch ein immunologisches Verfahren unter Verwendung von mindestens zwei Antikörpern, die gleich oder unterschiedlich sind, umfasst, wobei
    • – der erste Antikörper oder Einfangantikörper des Glycoproteins NS1 durch Antikörper gebildet wird, die aus der Gruppe bestehend aus:
    • – polyklonalen Antikörpern, die vorher durch Immuneinfangen auf dem Protein NS1 des Flavivirus in Hexamerform selektioniert werden; und
    • – Gemischen monoklonaler Anti-NS1-Antikörper, die vorher bezüglich ihrer erhöhten Affinität für das Protein NS1 des Flavivirus in Hexamerform selektioniert werden, wobei die monoklonalen Antikörper dann gereinigt werden, ausgewählt ist;
    • – der zweite Antikörper oder Entwicklungsantikörper aus der Gruppe bestehend aus:
    • – polyklonalen Antikörpern, die gegen das Protein NS1 in Hexamerform gerichtet sind, und
    • – einem Gemisch monoklonaler Antikörper, die gegen das Protein NS1 in Hexamerform gerichtet sind, ausgewählt ist.
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter Hexamerform des Proteins NS1 eines Flavivirus das native Protein, das ausgehend vom Kulturüberstand von Säugetierzellen, die durch das Flavivirus infiziert sind oder durch ein Expressionssystem transformiert sind, welches das Gen des Proteins NS1 des Flavivirus trägt, erhalten wird und nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, wie es nachfolgend beschrieben wird, gereinigt wird. Diese Hexamerform des Proteins NS1, die sich von anderen Formen, wie der Monomerform oder der Dimerform des Proteins unterscheidet, wird durch Elektrophoresetechniken oder Chromatographietechniken, wie sie in 1 beschrieben sind, bewiesen.
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter polyklonalen und monoklonalen Antikörpern, die gegen das Protein NS1 eines Flavivirus gerichtet sind, Antikörper, die durch Immunisierung eines nicht-menschlichen Säugetiers erhalten werden,
    • – entweder durch ein Protein NS1 in Hexamerform
    • – oder durch ein lebendes oder inaktiviertes Flavivirus,
    wobei die polyklonalen Antikörper auf ihre Affinität für das Protein NS1 in Hexamerform selektioniert werden und in einer einzigen Stufe gereinigt werden und wobei die monoklonalen Antikörper vornehmlich auf ihre erhöhte Affinität zu dem Protein NS1 in Hexamerform selektioniert und dann durch klassische Techniken gereinigt werden, insbesondere durch Affinitätschromatographie oder Ionenaustausch.
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter Affinität eines monoklonalen Antikörpers für das Protein NS1 in Hexamerform die Konzentration an dem Protein, die notwendig ist, um 50% der Stellen des Antikörpers zu sättigen; sie wird durch die Affinitätskonstante des Antikörpers nach dem in Beispiel 5 beschriebenen Protokoll gemessen.
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter erhöhter Affinität eine Affinität, deren Konstante unter 10–8M liegt.
  • In überraschender Weise kann die Verwendung ausgewählter und gereinigter polyklonaler Antikörper zur Detektion des Proteins NS1 in einer biologischen Probe durch Immuneinfangen am Protein NS1 in Hexamerform oder monoklonaler Antikörper, die eine erhöhte Affinität für das Protein NS1 in Hexamerform zeigen und gereinigt wurden anstelle eines hyperimmunisierten Kaninchenserums die Empfindlichkeit des Verfahrens in signifikanter Weise verbessern und das Protein NS1, das infolge eines frühen Stadiums der Infektion oder infolge einer Primärinfektion wie auch infolge einer Sekundärinfektion im Blut der Kranken zirkuliert, nachweisen. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung besitzt eine Reihe von Vorteilen:
    • – es kann in einem frühen Stadium durchgeführt werden: das Vorliegen des Glycoproteins NS1 wird während der klinischen Phase entwickelt, bevor die Reaktion in Form von Antikörpern nachweisbar ist,
    • – es ist empfindlich: man kann bis zu weniger als 1 ng Protein/ml Serum detektieren, was es möglich macht, dass in der frühen Phase der Primärinfektionen zirkulierende Protein NS1 zu detektieren,
    • – es ist schnell: man kann innerhalb eines Tages die Antwort erhalten,
    • – es ist relativ kostengünstig und kann demnach in den Risikoländern verwendet werden,
    • – es ermöglicht die Unterscheidung von geimpften Personen von Personen, die kürzlich durch ein Flavivirus infiziert wurden, da das Protein NS1 bei den geimpften Personen fehlen wird, bei denen die Antikörper noch nachweisbar sein können.
  • Nach einer vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens ist die Flavivirus-Infektion eine Infektion durch das Virus des Dengue-Fiebers.
  • Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens ist der erste Antikörper vorzugsweise auf einem zweckdienlichen festen Träger fixiert und ist der zweite Antikörper gegebenenfalls mit einem geeigneten Marker konjugiert.
  • Nach einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens wird, wenn der zweite Antikörper nicht an einen Marker konjugiert ist, seine Bindung an das Protein NS1, das auf dem festen Träger fixiert ist, durch einen dritten Antikörper, der mit einem zweckdienlichen Markier konjugiert ist, detektiert; der dritte Antikörper ist ein klassischerweise verwendeter Antikörper, z.B. ein IgG, das gegen den zweiten Antikörper gerichtet ist und insbesondere durch Ziege, Schwein oder Esel produziert wird.
  • Von den verwendeten Markern kann man als Beispiele fluoreszierende Marker, das System Biotin/Streptavidin, Nicht-Isotopen-Marker oder Enzyme, wie z.B. Meerrettichperoxidase oder alkalische Phosphatase, nennen.
  • Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens ist der dritte Antikörper mit einem Enzym konjugiert.
  • Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform des Verfahrens ist dieses dadurch gekennzeichnet, dass
    • – der erste Antikörper oder Einfangantikörper aus polyklonalen Mausantikörpern gebildet wird, die durch Immuneinfangen an dem Protein NS1 des Virus des Dengue-Fiebers selektioniert werden, wobei das Protein in Hexamerform vorliegt, und
    • – der zweite Antikörper oder Antikörper zum Nachweis des Vorliegens von NS1 in der zu analysierenden biologischen Probe aus polyklonalen Antikörpern von Kaninchen, die durch das Protein NS1 des Virus des Dengue-Fiebers immunisiert sind, wobei das Protein in Hexamerform vorliegt, besteht, wobei die Fixierung des zweiten Antikörpers durch einen dritten Antikörper entwickelt wird, der aus Antikörper besteht, die an Peroxidase konjugiert sind und gegen den zweiten Antikörper gerichtet sind.
  • Nach einer anderen weiter bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens werden die polyklonalen Mausantikörper durch Immuneinfangen an dem hexameren Protein NS1 des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, gereinigt.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist außerdem ein Kit oder eine Kassette zur Diagnose einer Flavivirus-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass er/sie umfasst:
    • – mindestens einen Einfangantikörper und mindestens einen Entwicklungsantikörper, wie sie vorstehend definiert sind,
    • – mindestens eine positive Kontrolle, die durch das Protein NS1 eines Flavivirus und/oder verschiedener Serotypen entsprechend dem Flavivirus gebildet wird, wobei das Protein in Hexamerform vorliegt, und
    • – mindestens eine negative Kontrolle, die aus einem normalen humanen Serum besteht.
  • Nach einer vorteilhaften Ausführungsform der Kassette zur Diagnose gemäß der Erfindung wird das Protein NS1 in Hexamerform aus einem Kulturüberstand entweder von infizierten Säugerzellen oder Säugerzellen, die durch ein rekombinantes Plasmid transfiziert sind, welches das Gen des Proteins NS1 oder ein Fragment des Gens oder ein Fragment des Flavivirusgenoms trägt, wobei die Fragmente geeignet sind, das Protein NS1 ganz oder teilweise zu exprimieren.
  • Nach einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Kassette zur Diagnose gemäß der Erfindung ist das Protein NS1 das des Virus des Dengue-Fiebers.
  • Nach einer anderen noch vorteilhafteren Ausführungsform der Kassette zur Diagnose ist das Plasmid das Plasmid pClneo-NS1.FGA, das bei der Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes, unterhalten vom Institut Pasteur, mit der Nummer I-2220 am 7. Juni 1999 hinterlegt wurde.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Reinigung des Proteins NS1 eines Flavivirus in Hexamerform, ausgehend von einem Kulturüberstand entweder von infizierten Säugerzellen oder von Säugerzellen, die durch ein rekombinantes Plasmid transfiziert sind, welches das Gen des Proteins NS1 eines Flavivirus oder ein Fragment des Gens oder ein Fragment des Flavivirusgenoms trägt, wobei die Fragmente fähig sind, das Protein NS1 in Hexamerform zu exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass es vor der Reinigung des Proteins NS1 durch klassische Techniken eine Stufe der Abtrennung der löslichen Form des Proteins NS1 von der Mikroteilchenform des Proteins durch Behandlung mit einem Präzipitationsmittel und danach eine Zentrifugation umfasst.
  • Die Zentrifugation wird beispielsweise bei einer Geschwindigkeit von 10.000 g oder darüber durchgeführt.
  • Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter einem Präzipitationsmittel ein Mittel, das die Proteine in Mikroteilchenform oder Zelldebris spezifisch präzipitiert, z.B. Polyethylenglykol, wobei das Mittel unter klassischen Bedingungen verwendet wird, die es ermöglichen, die löslichen Proteine und die Proteine in Mikroteilchenform oder Zelldebris zu trennen.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform des Reinigungsverfahrens ist das hexamere Protein NS1 das des Virus des Dengue-Fiebers, insbesondere das Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff das Protein NS1 eines Flavivirus in Hexamerform, gegebenenfalls assoziiert mit anderen Proteinen, in Kombination mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel umfasst.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der immunogenen Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfasst die immunogene Zusammensetzung mindestens ein Gemisch der Proteine NS1 in Hexamerform, die verschiedenen Serotypen des Virus des Dengue-Fiebers entsprechen.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch eine immunogene Zusammensetzung, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:
    • – einem Polynukleotid, das fähig ist, das Protein NS1 des Virus des Dengue-Fiebers, ganz gleich welcher sein Serotyp ist, zu exprimieren, und
    • – einem Expressionssystem, das mindestens einem Promotor, der fähig ist, bei einem Wirt, in den es injiziert ist, die DNA, die für das Protein des Virus des Dengue-Fiebers, ganz gleich, welcher sein Serotyp ist, kodiert, zu exprimieren, wobei die DNA das Protein exprimiert, umfasst,
    • – in Kombination mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel umfasst. Vakzinierungs-Protokolle, die Nukleinsäure verwenden, werden insbesondere in der internationalen Anmeldung WO 90/11092 beschrieben.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des Proteins NS1 eines Flavivirus in Hexamerform oder eines seiner Expressionssysteme zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung, die geeignet ist, die Antikörperproduktion in vivo zu induzieren.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Verwendung ist das Protein NS1 das das Virus des Dengue-Fiebers, insbesondere Serotyp 1.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung mindestens eines monoklonalen Anti-NS1-Antikörpers, der eine erhöhte Affinität für das Protein NS1 in Hexamerform aufweist, wobei die monoklonalen Antikörper dann gereinigt werden und zur Herstellung eines Medikaments, das geeignet ist, eine passive Immunisierung zu induzieren, modifiziert werden.
  • Die Modifikationen der Antikörper sind vorteilhafterweise die Selektion von Fragmenten Fab oder die Humanisierung der Antikörper.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung des Proteins NS1 in Hexamerform zum Selektionieren in vitro der spezifischen Antikörper des Proteins NS1, die zum frühen Nachweis einer Flavivirus-Infektion geeignet sind.
  • In einer vorteilhaften Ausführungsform der Verwendung sind die Antikörper polyklonale Antikörper.
  • In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Verwendung sind die Antikörper monoklonale Antikörper.
  • In einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der Verwendung ist das Protein das Protein NS1 des Virus des Dengue-Fiebers, insbesondere Serotyp 1.
  • Die monoklonalen Anti-NS1-Antikörper werden vorteilhafterweise durch Fusion von Milzzellen von Mäusen, die durch das Protein NS1 in Hexamerform immunisiert waren, mit geeigneten Myelomzellen erhalten.
  • Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zur Expression eines Polynukleotids, das für das Protein NS1 eines Virus des Dengue-Fiebers kodiert, dadurch gekenn zeichnet, dass es die Expression eines Polynukleotids, wie es in SEQ ID NO:1 definiert ist, verbunden mit einem Promotor des Nukleotids, in zweckdienlichen Eukaryontenzellen umfasst.
  • Andere Merkmale und Vorzüge der Erfindung werden im Verlauf der Beschreibung und der Beispiele, die durch die Figuren veranschaulicht werden, klar; diese sind wie folgt:
  • 1 stellt das gereinigte, extrazelluläre hexamere Protein NS1 dar, das nach Ausschlusschromatographie erhalten worden war: (a) nach Ausschlusschromatographie wird das Protein durch Ultrafiltration auf 0,5 mg/ml konzentriert und mit Dimethylsuberimidat (DMS) mit 0, 0,5, 5 und 50 mM behandelt. Die erhaltenen Produkte werden in einen nichtreduzierenden Laemmli-Puffer gegeben, auf Acrylamidgel mit einem Gradienten von 4 bis 20% getrennt und mit Coomassieblau markiert. Eine Probe, die mit 50 mM DMS behandelt worden war, wird vor der Elektrophorese 3 min lang bei 95°C erwärmt, um die nicht-covalenten Oligomere zu dissoziieren; (b) das gereinigte Protein NS1 wird während einer Nacht bei 37°C mit 0,5% oder 1% n-Octylglucosid (nOG) behandelt und gegebenenfalls mit 25 mM DMS während 1 Stunde behandelt. Die Proteine werden ohne Denaturierung in der Wärme auf einem Acrylamidgel mit einem Gradienten von 4 bis 20% getrennt und durch Immunblotting mit einem monoklonalen Anti-NS1-Antikörper der Literatur oder wie er vorstehend definiert wurde, detektiert;
  • 2 stellt die Sequenz des Proteins NS1 des Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, erhalten durch den Klon 4C des im Folgenden beschriebenen Beispiels 2, sowie die entsprechende kodierende Sequenz dar;
  • 3 stellt die Resultate dar, die durch Dosierung des Proteins NS1 im Blutkreislauf durch das Detektionsverfahren durch ELISA-Einfangen bei Patienten, die vorher durch ein Virus des Dengue-Fiebers infiziert waren, deren Serum während akuter und rekonvaleszenter Phasen entnommen worden war, sowie den Vergleich mit den Resultaten, die durch die Techniken des Standes der Technik IHA (Inhibierung der Hämagglutination der Serotypen 1, 2, 3 oder 4 des Virus des Dengue-Fiebers) und MAC-ELISA (immunoglobulin M Antibody Capture Enryme-Linked ImmunoSorbent Assay) erhalten wurden, dar; D1 entspricht dem Serotyp 1 des Dengue; D2 entspricht dem Serotyp 2 des Dengue; D3 entspricht dem Serotyp 3 des Dengue und D4 entspricht dem Serotyp 4 des Dengue; ID = Identität des Kranken; 1 entspricht der ersten Entnahme in der akuten Phase der Krankheit, 2 entspricht der zweiten Entnahme in der rekonvaleszenten Phase (durchgeführt 2 bis 4 Wochen nach der ersten); im ELISA-Einfangtest sind die Werte als optische Dichte ausgedrückt, die für dasselbe Serum, 10-, 30- oder 90-fach verdünnt, erhalten wurden;
  • 4 veranschaulicht die Detektion des Proteins NS1 durch den ELISA-Einfangtest für Seren von Patienten, die durch das Virus des Dengue, Serotyp 1, auf Französisch Guayana infiziert waren. Die angegebenen Zahlen stellen die Anzahl der Patienten dar, die in die Kategorie eingeteilt wurden (positiv oder negativ beim ELISA-Einfangen und positiv oder negativ bezüglich IgM);
  • 5 veranschaulicht die Resultate, die von 4 Patienten aus Französisch Guayana erhalten worden waren, wobei die Patienten durch das Dengue-Virus 1 iniziert waren; die Proben wurden täglich während der klinischen Phase der Krankheit vom Tag 1 bis Tag 5 entnommen. Jedes Diagramm entspricht einem Patienten mit täglicher Probennahme, wobei die Resultate der Detektion des Proteins NS1 mit dem entwickelten ELISA-Einfangstest, die Resultate der RT-PCR und die Resultate, die durch die MAC-ELISA-Technik erhalten wurden, gleichzeitig angegeben sind. Die angegebenen D.O.-Werte wurden bezüglich des Hintergrundrauschens korrigiert. Die Positivitätsgrenzen werden durch die unterbrochenen Striche angegeben;
  • 6 zeigt die Charakteristika der monoklonalen Anti-NS1-Antikörper F22 und G18;
  • 7 veranschaulicht die Detektion des Proteins NS1 durch den ELISA-Einfang-Test, der den monoklonalen Ansatz verwendet, im Vergleich zu dem ELISA-Einfang-Test, der den polyklonalen Ansatz verwendet, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist. Die erhaltenen Resultate sind in Form der Werte der optischen Dichte angegeben, welche für jede Verdünnung des analysierten Serums (10-fach, 30-fach oder 90-fach) gemessen wurden und von denen der Mittelwert der negativen Vergleiche abgezogen worden war;
  • 8 veranschaulicht den Nachweis des Proteins NS1 in den Seren von Patienten, die mit dem Gelbfiebervirus infiziert waren, durch einen ELISA-Einfang-Test, der für Gelbfieber spezifisch ist. Für jedes untersuchte Serum wird der Wert der optischen Dichte, der für den entwickelten Test gemessen wurde, wobei der Mittelwert der negativen Vergleiche abgezogen wurde, angegeben; ebenso angegeben sind der Wert der optischen Dichte, der durch den MAC-ELISA-Test gemessen wurde, welcher für Gelbfieber-IgM spezifisch ist, sowie die Resultate der Virusisolierung, wenn sie verfügbar sind.
  • Beispiel 1: Reinigung des Proteins NS1 des Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1
  • 1. Material und Verfahren
  • Das Protein wird an Vero-Zellen, die durch das Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, Stamm FGA/89 infiziert waren (P. Despres et al., Virol., (1993), 196, 209–219) unter den Bedingungen, die an das Verfahren angepasst waren, welches von A.K.I. Falconar et al., (J. Virol. Meth., (1990), 30, 323–332) beschrieben wurde, produziert.
  • Das Kulturmedium wird 5 Tage nach der Infektion geerntet und bei 1500 g zentrifugiert, um Zelldebris zu entfernen. Der Zentrifugationsüberstand wird in 20 mM Tris-HCl, 1 mM Natriumazid gebracht, durch Ultrafiltration in der Kälte 6-fach konzentriert und die viralen Partikel werden durch Präzipitation mit Polyethylenglykol (PEG) in einer Konzentration von 7,5% über 2 Stunden bei 4°C, gefolgt von einer Zentrigugation bei 10.000 g über 30 min eliminiert. Der geklärte Überstand, der 7,5% PEG enthält, wird mit 0,05% Tween 20 und 1 mg/ml Aprotinin behandelt, dann über eine Immunaffinitätssäule, an der ein monoklonaler Anti-NS1-Antikörper fixiert ist, geführt. Das Protein wird nach der Technik mit Diethylamin, wie sie von Falconar et al. (vorstehend zitiert) beschrieben ist, eluiert, durch Ultrafiltration konzentriert und die Elutionslösung durch einen Puffer, 10 nM Tris-HCl pH 7,5, der 1 mM Natriumazid enthält, ausgetauscht.
  • 2. Resultate
  • Die Resultate sind in 1 veranschaulicht.
  • 1a zeigt, dass das Protein NS1 reichlich in Hexamerform vorliegt. Der Anteil der Hexamerform nimmt mit wachsender DMS-Konzentration zu (1a).
  • Das extrazelluläre Protein NS1 in Hexamerform kann in Gegenwart des nichtionischen oberflächenaktiven Mittels n-Octylglucosid (nOG) (1b) in dimere Untereinheiten transformiert werden. Nach einer Nacht bei 37°C in Abwesenheit oder in Gegenwart von n-Octylglucosid (nOG) und Behandlung mit 25 mM DMS beobachtet man in Abwesenheit von nOG das Auftreten von Banden, die dem Dimer, Tetramer oder Hexamer entsprechen, und in Gegenwart von nOG eine partielle oder vollständige Dissoziierung des Hexamers als Funktion der Konzentration an nOG (1b).
  • Beispiel 2: Expression des Proteins NS1 des Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, durch Vero-Zellen
  • 1. Material und Verfahren
  • Das Plasmid pClneo-NS1.FGA, das am 7. Juni 1999 bei der Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes (CNCM) des Institut Pasteur mit der Nummer I-2220 hinterlegt wurde, das das Gen des Proteins NS1 enthält, umfasst das Gen, das für sein Peptidsignal kodiert, vorangestellt ein Initiationskodon der Translation und gefolgt von einem Kodon der Translations-Terminierung wird in das kompetente Bakterium Escherichia coli (Epicurian SURE von Stratagene) eingeführt. Dieses Plasmid wird in Bakterienkultur amplifiziert und nach der klassischen Technik der Herstellung von Plasmid-DNA gereinigt. Die gereinigte DNA wird zur Sequenzierung verschiedener Klone (die Sequenz des Klons 4C ist in 2 dargestellt) und zum Transfizieren der Vero-Zellen entweder mit einem adäquaten Gemisch mit kationischen Liposomen, wie z.B. DOTAP (Boehringer-Mannheim) oder mit einem nicht-liposomalen Agens, z.B. FuGENE (Boehringer-Mannheim) zu transfizieren, verwendet. FuGENE und DNA werden in Medium ohne Serum für 15 min vorinkubiert, dann wird die Mischung mit einem Zellteppich aus Vero-Zellen für 24 h in Kontakt gebracht. Die Zellen werden dann mit Hilfe von PBS (Phosphat-Kochsalz-Puffer) gespült, 20 min bei Umgebungstemperatur mit einer PBS-Lösung, die 3% Paraformaldehyd enthält, fixiert, 5 min mit PBS, der 0,5% Triton X-100 enthält, permeabilisiert. Das Vorliegen des Antigens NS1 wird dann mit Hilfe spezifischer Antikörper, welche durch einen mit Fluorescein markierten Antikörper konjugiert sind, erkannt.
  • 2. Resultate
  • Es ist möglich, in etwa 20% der transfizierten Zellen durch ein verstärktes Fluoreszenzsignal, das für das virale Antigen NS1 spezifisch ist, dieses nachzuweisen.
  • Die Expression von NS1 ist somit bewiesen und in Gegenwart von Neomycin, einem Selektionsmarker der transfizierten Zellen, konnten stabile Zelllinien entwickelt werden.
  • 2 stellt die Sequenz des Proteins NS1 des Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, die so erhalten wurde und auch die entsprechende kodierende Sequenz dar.
  • Beispiel 3: Verwendung der ELISA-Einfang-Technik gemäß der Erfindung im Rahmen einer Infektion durch das Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, und Vergleich mit Verfahren des Standes der Technik.
  • 1. Prinzip der ELISA-Einfang-Technik
  • Das virale Antigen NS1 wird durch monospezifische, zuvor gereinigte, polyklonale Mausantikörper durch Immuneinfangen am gereinigten hexameren Protein NS1 des Dengue, Serotyp 1, eingefangen.
  • Das Vorliegen von NS1 wird durch Antikörper von Kaninchen, die durch das gereinigte hexamere Protein NS1 immunisiert worden waren, die selbst wiederum durch an Meerrettichperoxidase-konjugierte Antikörper erkannt werden, gezeigt.
  • 2. Material und Verfahren
  • a - Reinigung von polyklonalen Mausantikörpern die gegen das Protein NS1 gerichtet sind
  • a1 – Fixierung des Proteins NS1 an einer Membran
  • Das gereinigte Protein NS1 wird durch Adsorption an einer amphoteren Nylonmembran (Nytran, Schleicher & Schuell) fixiert. Die Oberfläche der Membran wird dann durch Rinderserumalbumin gesättigt, welches in einer Konzentration von 3% in einer mit Phosphat gepufferten Salzlösung vorliegt (PBS: Phosphat-Puffer-Salzlösung; 10 mM Phosphat; pH 7,2; 150 mM NaCl). Nach 2 Spülgängen in PBS wird die Membran mit PB5, das 0,25% Glutaraldehyd enthält, 15 min lang bei Umgebungstemperatur behandelt. Nach 3 Spülgängen in PBS wird die Membran durch einen Puffer aus 100 mM Glycin, 3% Rinderalbumin, neutralisiert, 2mal in PBS gespült, dann bei 4°C in PBS mit 1 mM Natriumazid konserviert.
  • a2 – Reinigung der monospezifischen polyklonalen Mausantikörper (Einfangantikörper bzw. Fangantikörper)
  • – Produktion von polyklonalen Asziten: die Gehirne von jungen Swiss-Mäusen, die mit dem Virus des Dengue-Fiebers infiziert waren und moribund waren, werden in 9 ml PBS-Puffer verrieben. Das Produkt wird 10 min bei 4°C und 10.000 g zentrifugiert.
  • Die virale Suspension wird Swiss-Mäusen nach dem folgenden Zeitplan injiziert:
    • – Tag 0: 0,5 ml Antigen subkutan in den Oberschenkel,
    • – Tag 3: 0,4 ml Antigen und 0,1 ml Freund'sches vollständiges Adjuvans auf intraperitonealem Weg,
    • – Tag 25: 0,5 ml Antigen auf intraperitonealem Weg,
    • – Tag 26: 0,5 ml Mäuse-Asziten TG180 und
    • – Tag 28: 0,5 ml Antigen auf intraperitonealem Weg.
  • Die Asziten werden am Tag 42 geerntet.
  • Nach Ernte der Asziten lässt man sich das Koagulum während 1 Stunde bei Umgebungstemperatur bilden, dann führt man eine Zentrifugation für mindestens 30 Minuten bei 1500 g durch. Den Überstand lässt man eine Nacht bei 4°C stehen. Der pH des Überstands wird mit 2 M Essigsäure auf 4,8 eingestellt, dann wird der Überstand erneut unter denselben Bedingungen zentrifugiert. Der pH des Überstands wird dann durch Zusatz einer 2 N Natriumcarbonatlösung auf 7,0 bis 7,2 gebracht. Der Überstand kann bei –20°C konserviert werden.
  • - Reinigung der Mäuseantikörper, die für das Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, spezifisch sind:
  • Die Membran wird während einer Stunde bei Umgebungstemperatur in einem Gemisch polyklonaler Asziten, die gegen die 4 Serotypen des Virus des Dengue-Fiebers gerichtet waren und wie oben beschrieben hergestellt worden waren, inkubiert. Nach 3 Spülgängen der Membran in PBS werden die Antikörper, die an dem Protein NS1 fixiert sind, mit einer Diethylaminlösung pH 11,4 (Dulbecco-Medium, modifiziert durch Iscove (Gibco), enthaltend 100 mM Diethylamin) eluiert. Die Antikörper werden durch Ultrafiltration konzentriert und in PBS-Puffer, der 1 mM Natriumazid enthält, überführt.
  • b - Herstellung von polyklonalen Kaninchenantikörpern, die gegen das Protein NS 1 gerichtet sind (Entwicklungsantikörper):
  • Die Immunisierung der Kaninchen wird durch 3 oder 4 aufeinander folgende Injektionen mit 30 μg hexamerem Protein NS1, das nach dem Verfahren von Beispiel 1 gereinigt worden war, durchgeführt und zwar am Tag 0, Tag 7, Tag 21 und gegebenenfalls am Tag 49 und Ausbluten lassen am Tag 83. Das Serum wird durch Inkubation mit Sepharose-Perlen, die einen monoklonalen Antikörper tragen, der in der Literatur beschrieben ist oder wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, an nicht-spezifischen Signalen verarmt.
  • c – ELISA-Einfang-Verfahren
  • c1 – Eichkurve
  • Für jede ELISA-Einfang-Platte, die dazu bestimmt ist, humane Seren zu untersuchen, wird ausgehend von einer Lösung des Proteins NS1, das nach der in Punkt 1 beschriebenen Methode gereinigt worden war, ein Eichbereich realisiert, wobei die Anfangskonzentration 0,5 μg/ml ist und 3:3 verdünnt wird.
  • c2 – Nachweis des Proteins NS1 im Blutkreislauf während der akuten Phase:
  • Die gereinigten polyklonalen Mausantikörper, die nach dem vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten worden waren (Einfangantikörper bzw. Fangantikörper) werden an einer Platte fixiert, in einer PBS-Lösung verdünnt und während einer Nacht bei 4°C inkubiert. Nach 3 Spülgängen zu je 5 Minuten mit einer Lösung von PBS/0,05% Tween wird die Platte mit einem Gemisch aus PBS, 0,05% Tween und 3% Milch für 30 Minuten bei Umgebungstemperatur gesättigt. Nach 3 Spülgängen mit einer Lösung von PBS/0,05% Tween bringt man die zu testenden Seren, verdünnt oder nicht, ein und lässt sie während einer Stunde reagieren und zwar immer bei Umgebungstemperatur. Die Verdünnungen 1/10, 1/30 und 1/90 werden in einer Lösung von PBS/0,05% Tween durchgeführt. Nach 3 Spülungen fügt man den zweiten NS1-spezifischen Antikörper hinzu (Entwicklungsantikörper, im vorstehenden Punkt 3 erhalten), nachdem dieser in einem Gemisch aus PBS/0,05% Tween und 3% Milch verdünnt worden war, und inkubiert 45 Minuten bei 37°C. Nach 3 Spülgängen wird der Anti-IgG-Antikörper, der gegen den zweiten Antikörper gerichtet ist und mit Peroxidase markiert ist, wobei der Antikörper unter klassischen Bedingungen, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt wurde, zugesetzt und es wird eine Inkubation über 45 Minuten bei 37°C durchgeführt. Nach 3 Spülgängen entwickelt man 10 Minuten lang durch eine TMB-Lösung (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin, Kierkegaard & Perry Lab.). Die kolorimetrische Reaktion wird mit Schwefelsäure angehalten.
  • 3. Resultate
  • Diese sind in 3 dargestellt.
  • Die ELISA-Einfang-Technik gemäß der Erfindung ermöglicht es, das Vorliegen des Proteins NS1 in der akuten Phase der Krankheit zu detektieren und dies unabhängig von der Tatsache, dass die Kranken eine primäre oder sekundäre Infektion haben.
  • Die Resultate bestätigen, dass das Vorliegen des Proteins NS1 vorübergehend ist, da die während der Rekonvaleszenz durchgeführten Entnahmen dieses Protein nicht detektieren (3).
  • 93% der Entnahmen in der akuten Phase der Krankheit waren beim MAC-ELISA-Test negativ, während 100% der in der Rekonvaleszenz durchgeführten Entnahmen in demselben Test ein positives Ergebnis zeigen (3).
  • In gleicher Weise ermöglicht der Test auf Hemmung der Hämagglutination (IHA) keine Detektion der Infektion durch das Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, in 80% der Fälle in der akuten Phase der Krankheit, allerdings zeigt dieser Test in 100% der Entnahmen, die in der Rekonvaleszenzphase durchgeführt wurden, positive Ergebnisse (3). Nach den OMS-Kriterien ermöglicht ein IHA-Wert von unter 1280 im Serum, dass in der Rekonvaleszenzphase entnommen wurde, die Diagnose einer primären Dengue-Infektion und ein Wert über 1280 die Diagnose einer sekundären Dengue-Infektion. Die Hälfte der positiven Seren dieser Untersuchung entspricht demnach den Fällen einer primären Dengue-Infektion und die andere Hälfte entspricht den Fällen einer sekundären Dengue-Infektion. Die erfindungsgemäße ELISA-Einfang-Technik ermöglicht somit die Detektion des Proteins NS1 in den Fällen einer primären und sekundären Dengue-Infektion.
  • Beispiel 4: Bestimmung des Detektionsfensters
  • 1. Materialien und Verfahren
  • a - Untersuchung, die an einer Gruppe von Patienten aus Französisch Guayana durchgeführt wurde, die mit dem Dengue-Virus 1 infiziert waren
  • Die Entnahmen werden bei Patienten, die durch das Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, infiziert sind, zwischen Tag 0, der durch das Auftreten klinischer Anzeichen (zu Beginn un differenziertes Fieber) gekennzeichnet ist, und Tag 66, der dem Ende der Rekonvaleszenzphase entspricht, durchgeführt.
  • Mit den Seren dieser Patienten untersucht man das Vorliegen von NS1, das im Blutkreislauf ist, nach dem ELISA-Einfang-Verfahren, das in Beispiel 3 beschrieben ist, und man vergleicht das erhaltene Resultat mit der Positivität bezüglich spezifischer IgM, die in einem MAC-ELISA gemessen wurde, wenn die Daten verfügbar sind.
  • b - Tägliche Überwachung von 4 Patienten, die mit dem Virus des Dengue-Fiebers Serotyp 1, infiziert sind
  • Bei vier Patienten wurden während der klinischen Phase von Tag 1 bis Tag 5 täglich Proben genommen. Für jede Blutentnahme wurde eine RT-PCR-Reaktion zum Nachweis viraler RNA, ein MAC-ELISA-Test zur Detektion spezifischer IgM des Virus des Dengue-Fiebers und eine Bestimmung des Dengue-Antigens NS1 nach dem vorstehend beschriebenen ELISA-Einfang-Verfahren durchgeführt.
  • 2. Resultate
  • a - Bestimmung des Detektionsfensters
  • Die Resultate sind in 4 zusammengefasst.
  • Zwischen Tag 1 und Tag 6 schwankt die Möglichkeit, dass im Blutkreislauf zirkulierende Protein NS1 zu detektieren, zwischen 64% (am Tag 2) und 100% (am Tag 5) der infizierten Patienten. Über Tag 10 hinaus wird das zirkulierende Protein NS1 nicht mehr nachgewiesen, da die Antikörperantwort vorherrschend wird.
  • Die Detektion des im Blutkreislauf zirkulierenden Proteins NS1 scheint nicht vom Vorliegen der gesamten IgM (für virale Antigene spezifisch) zu sein, welche in bestimmten Fällen am Tag 3 auftreten und ab Tag 5 ein Maximum erreichen, und auch nicht von der Anwesenheit der Gesamt-IgG für bestimmte Patienten abhängen, die ab Tag 2 auftreten können. Dagegen kann das Fehlen einer Detektion des Antigens NS1 in den Seren der klinischen Phase sich durch das Vorliegen von IgG, die spezifisch gegen NS1 gerichtet sind, erklären.
  • Somit liegt das Detektionsfenster für das Serumantigen NS1 durch die ELISA-Einfang-Technik gemäß der vorliegenden Erfindung zwischen Tag 1 und Tag 6 nach Auftreten klinischer Symptome.
  • b - Tägliche Überwachung von 4 Patienten, die mit dem Dengue-Virus infiziert waren
  • Die Resultate sind in 5 zusammengefasst.
  • Bei den 4 untersuchten Patienten wirkt das Protein NS1 kontinuierlich bis zum Tag 5 und dieser Tag der Entnahme sollte bezüglich des Beginns der Symptome bezeichnet sein. Für bestimmte Patienten ist das Detektionsfenster für das Protein größer als der Virämie-Zeitraum, der durch RT-PCR detektiert wird.
  • Beispiel 5: Verwendung der ELISA-Einfang-Technik mit monoklonalen Werkzeugen im Rahmen einer Infektion durch das Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, und Vergleich mit der vorher beschriebenen ELISA-Einfang-Technik
  • 1. Material und Verfahren
  • a – Herstellung und Charakterisierung monoklonaler Mäuseantikörper, die gegen das Protein NS1 des Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, gerichtet sind.
  • a1 – Herstellung von monoklonalen Mausantikörpern, die gegen das Protein NS1 gerichtet sind.
  • Die Immunisierung der weiblichen Balb/C-Mäuse erfolgte durch 7 Injektionen von 10 μg Protein von NS1 des Virus des Dengue, Serotyp 1, in Hexamerform, das nach dem Verfahren von Beispiel 1 gereinigt worden war. Die erste Injektion in Freund'schem vollständigem Adjuvans und die folgenden fünf Injektionen in Freund'schem unvollständigem Adjuvans wurden in einem Intervall subkutan durchgeführt. Die letzte Injektion in Freund'schem unvollständigem Adjuvans, die drei Tage vor Töten des Tieres erfolgte, wurde auf intraperitonealem Weg durchgeführt.
  • Die Zellen der Milz der immunisierten Mäusen wurden mit Mäuse-Myelom fusioniert und bis zum Auftreten der Klone nach Standardprotokoll kultiviert.
  • a2 – Identifizierung der Hybridome, die Antikörper gegen NS1 sezernieren
  • Die Detektion der Antikörper, die für das Protein NS1 spezifisch sind, wurde durch eine klassische ELISA-Technik oder eine ELISA-Einfang-Technik durchgeführt.
  • - Klassische ELISA-Technik
  • Das hexamere Protein NS1, das nach dem Verfahren von Beispiel 1 gereinigt worden war, wird durch Adsorption in einer Konzentration von 1 μg/ml in PBS-Lösung während einer Nacht bei 4°C an einer Platte fixiert. Nach 3 Waschgängen mit einer PBS/0,1%-Tween(PT)-Lösung wird das Protein mit den Überständen verschiedener Hybridome, 1/2 mit einer PT-Lösung, die 0,5% Gelatine enthält (PTG), verdünnt, 1 h bei 37°C inkubiert. Nach 3 Waschgängen mit PT wird der Mäuse-Anti-IgG-Antikörper, der mit Peroxidase markiert und in PTG verdünnt ist, zugesetzt und es wird 1 h bei 37°C inkubiert. Nach 3 Waschgängen entwickelt man mit einer Wasserstoffperoxidlösung in Gegenwart von Orthophenylendiamin.
  • - ELISA-Einfang-Technik
  • Die verwendete Technik ist in Beispiel 3 beschrieben (siehe Detektion des Proteins NS1 im Blutkreislauf in der akuten Phase), allerdings wurden die Verdünnungen der zu untersuchenden Seren durch eine 1/10-Verdünnung in der PTG-Lösung des Kulturüberstands von nicht-infizierten oder infizierten Vero-Zellen während 5 Tagen durch das Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, ersetzt und mit 7% Polyethylenglykol präzipitiert (siehe Beispiel 1: Reinigung des Proteins NS1 des Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1). Die Reaktivität der Überstände der verschiedenen Hybridome gegenüber dem Kulturüberstand der nicht-infizierten Vero-Zellen dient als Vergleich für ein nicht-spezifisches Signal.
  • a3 – Reaktivität der monoklonalen anti-NS1-Antikörper für indirekte Immunfluoreszenz an Vero-Zellen, die mit einem der 4 Serotypen des Virus des Dengue-Fiebers infiziert sind
  • Die Vero-Zellen werden 40 h mit einem der 4 Serotypen des Virus des Dengue-Fiebers infiziert:
    Serotyp 1: Stamm FGA/89
    Serotyp 2: Stamm NG
    Serotyp 3: Stamm H87
    Serotyp 4: Stamm H241
  • Nach einem Waschgang mit einer PBS-Lösung werden die Zellen durch eine 3%ige Paraformaldehydlösung in PBS 30 Minuten lang bei Labortemperatur fixiert. Die in PBS gespülten Zellen werden dann 10 Minuten lang durch eine 0,5%ige Lösung von Triton X-100 in PBS permeabilisiert. Nach Spülen in PBS werden die Zellen 1 h lang mit den Überständen verschiedener Hybridome, die in ELISA positiv reagiert haben, inkubiert. Nach 3 Waschgängen mit PBS wird der Maus-Anti-IgG-Antikörper, der mit Fluorescein markiert ist, zugesetzt und es wird 1 h lang inkubiert. Nach 3 Waschgängen mit PBS werden die Objektträger mit einem Deckgläschen bedeckt und unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.
  • a4 – Herstellung monoklonaler Maus-Asziten
  • Die monoklonalen Asziten werden mit Ba1b/C-Mäusen produziert. Die Mäuse erhalten eine intraperitoneale Injektion von 0,5 ml Pristan (2,6,10,14-Tetramethyl-pentadecan, Sigma) eine Woche vor intraperitonealer Injektion des Hybridomklons, der monoklonale Antikörper sezerniert. Die Asziten werden entsprechend ihrer Bildung nach und nach entnommen, 20 Minuten lang mit 1500 UpM zentrifugiert und bei –20°C konserviert.
  • a5 – Bestimmung des Isotyps monoklonaler Antikörper gegen NS1
  • Die Bestimmung des Isotyps der Anti-NS1-Antikörper erfolgt mit Hilfe von Antikörpern, die gegen die unterschiedlichen Unterklassen von Mäuse-Immunglobulinen: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 gerichtet sind, durch ELISA. Die Bestimmung der leichten Kette des Immunglobulins wird nach einer identischen Methodologie durchgeführt.
  • a6 – Bestimmung der Affinitätskonstante der monoklonalen Antikörper gegen NS1 (B. Friguet et al., J. Immunol., (1985), 77, 305–319)
  • Die Affinität eines Antikörpers entspricht der Konzentration an Antigen, die notwendig ist, um 50% der Stellen des Antikörpers zu sättigen. Es wird eine Inkubation in flüssigem Medium mit dem Antikörper in konstanter Konzentration und dem Antigen mit abnehmender Konzentration während 1 Nacht bei 4°C durchgeführt, damit das Gleichgewicht der Reaktion erreicht werden kann. Die Konzentration an freiem Antikörper nach Erreichen des Gleichgewichts wird durch einen ELISA-Test bestimmt. Die Mischung wird auf einer vorher mit dem Antigen inkubierten Platte abgeschieden. Nach einer Inkubation von 20 Minuten bei 4°C (um eine Verschiebung des Gleichgewichts zu vermeiden) erfolgt die Entwicklung des ELISA mit einem Maus-Anti-IgG, gekoppelt an β-Galactosidase, unter Überwachung der enzymatischen Reaktion. Danach wird die Dissoziationskonstante KD bestimmt.
  • a7 – Kompetitionsreaktion der verschiedenen monoklonalen Antikörper gegen NS1
  • Diese Reaktion ermöglicht es, die Spezifität der monoklonalen Antikörper gegenüber einem gleichen Epitop oder gegenüber unterschiedlichen Epitopen zu bestimmen. Die Epitopbestimmung spielt bei der Reaktivität eines nicht-markierten monoklonalen Antikörpers und eines zweiten monoklonalen Antikörpers, der an Biotin gekoppelt ist, für ein Antigen eine Rolle.
  • Der nicht-markierte monoklonale primäre Antikörper wird in sättigender Konzentration (vorher durch ELISA bestimmt) auf eine Platte gebracht, auf der vorher das Antigen fixiert worden war, und 2 h bei 37°C inkubiert. Nach 4 Waschgängen mit PT-Lösung mit 4°C wird der zweite monoklonale Antikörper, der an Biotin gebunden ist, zugesetzt und es wird 20 Minuten bei 4°C inkubiert. Nach 4 Waschgängen mit PT-Lösung bei 4°C wird die Lösung von konjugiertem Streptavidin, markiert mit Peroxidase, zugesetzt und es wird 1 h bei 37°C inkubiert. Nach 4 Waschgängen mit PT-Lösung entwickelt man mit einer Wasserstoffperoxidlösung in Gegenwart von Orthophenylendiamin. Der Erhalt eines Signals nach Ablesen im Spektralphotometer zeigt, dass die durch die zwei Antikörper erkannten Epitope unterschiedlich sind. Im umgekehrten Fall sind die 2 monoklonalen Antikörper gegen dasselbe Epitop des Antigens gerichtet.
  • b - Reinigung der monoklonalen Antikörper G18 und F22
  • Die Antikörper G18 und F22 werden durch Immunaffinität gereinigt, wie es in Beispiel 3 beschrieben ist.
  • c - Detektion des Proteins NS 1 im Blutkreislauf durch einen ELISA-Einfang-Test der die monoklonalen Antikörper verwendet
  • Die gereinigten monoklonalen Antikörper G18 und F22 werden mit einer PBS-Lösung zu einer gegebenen Verdünnung gemischt und eine Nacht bei 4°C inkubiert. Die folgenden Stufen dieses ELISA-Tests sind ähnlich denen des vorangehenden Beispiels.
  • d - Vergleich des ELISA-Einfan-Tests, der einen monoklonalen Ansatz verwendet mit dem, der einem polyklonalen Ansatz verwendet
  • Eine Reihe von Seren aus Französisch Guayana wurde am gleichen Tag mit dem ELISA-Einfang-Test getestet, wobei der monoklonale Ansatz verwendet wurde, und auch mit dem getestet, bei dem der polyklonale Ansatz verwendet wurde. Die Seren wurden bei verschiedenen Verdünnungen getestet: 10fach, 30fach und 90fach.
  • 2. Resultate
  • a – Charakteristika der monoklonalen Antikörper
  • Die Resultate sind in 6 zusammengefasst.
  • Die Antikörper G18 und F22 wurden auf ihre Fähigkeit, sich mit starker Affinität an den unterschiedlichen Epitopen des Proteins NS1 zu fixieren, selektioniert. Der Antikörper F22 ist für Serotyp 1, G18 für die Serotypen 1 und 3 des Virus des Dengue-Fiebers spezifisch.
  • b - Verwendung der monoklonalen Antikörper zum Einfangen des Antigens NS1
  • Die Resultate sind in 7 zusammengefasst.
  • Die selektionierten monoklonalen Antikörper reproduzieren nicht nur die Resultate, die mit dem polyklonalen Ansatz erhalten wurden, sondern zeigen die Reaktivität auch deutlicher als die polyklonalen Antikörper. Das entwickelte monoklonale Werkzeug scheint besonders an die diagnostische Verwendung angepasst zu sein, welche damit durchgeführt wird.
  • Beispiel 6: Verwendung der erfindungsgemäßen ELISA-Einfang-Technik im Rahmen einer Infektion durch einen anderen Serotyp des Virus des Dengue-Fiebers oder durch ein anderes Flavivirus
  • 1. Material und Verfahren
  • a - Herstellung der Kulturüberstände
  • Die Vero-Zellen werden durch das Dengue-Virus 2, entweder durch das Virus der japanischen Enzephalitis oder das Gelbfiebervirus, infiziert. Dann werden die Kulturüberstände nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren hergestellt.
  • b – Reinigung der monoklonalen Antikörper, die gegen das Protein NS1 des Gelbfiebervirus und des Virus der japanischen Enzephalitis gerichtet sind.
  • Die monoklonalen Asziten der Antikörper 8G4, 1A5 und 2D10 (J.J. Schlesinger et al., Virology, (1983), 125, 8–17), die gegen das Protein NS1 des Gelbfiebervirus gerichtet sind, und der Antikörper 171-2-2 und 70-14-20, die gegen das Protein NS1 des Virus der japanischen Enzephalitis gerichtet sind, werden an Perlen aus Protein A-Sepharose CL-4B (Pharmacia Biotech) gereinigt. Diese monoklonalen Asziten werden über Nacht bei 4°C an den Protein A-Perlen inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Perlen in PBS/0,05% Tween werden die an den Protein A-Perlen fixierten Antikörper mit einer Glycinpufferlösung, pH = 3, eluiert. Sie werden anschließend durch Ultrafiltration konzentriert und wieder in PBS-Puffer, der 1 mM Natriumazid enthielt, gebracht.
  • c - Detektion des Proteins NS1 in den Kulturüberständen des Dengue-Virus 2
  • c1 – Verwendete Antikörper
  • Die Einfangstufe wird mit einem Gemisch der Asziten der monoklonalen Antikörper 3D1.4 und 1A12 durchgeführt (A.K.I. Falconar et al., Arch. Virology, (1994), 137, 315–326). Die Erkennung des Proteins erfolgt dann mit einem Gemisch der zwei Kaninchenantikörper: das Serum, das nach Immunisierung mit dem Protein, das wie in Beispiel 3 beschrieben gereinigt worden war, erhalten wurde, und ein Kaninchenserum, das durch Immunisierung mit den Viren der vier Dengue-Serotypen erhalten worden war.
  • c2 – ELISA-Einfang-Verfahren
  • Die verwendete Technik ist dieselbe wie die, die in Beispiel 3 verwendet wird.
  • d - Detektion des Proteins NS1 in den Kulturüberständen des Virus der japanischen Enzephalitis
  • d1 – Verwendete Antikörper
  • Für die Stufen des Einfangens werden die monoklonalen Antikörper 171-2-2 und 70-14-20, die gereinigt waren, verwendet. Die Erkennung des Proteins erfolgt dann mit einem Gemisch von zwei Seren von Kaninchen, die vorher mit den rekombinanten Proteinen des Proteins NS1 der japanischen Enzephalitis immunisiert worden waren.
  • d2 – ELISA-Einfang-Verfahren
  • Die verwendete Technik ist dieselbe wie die, die in Beispiel 3 beschrieben ist.
  • e - Detektion des Proteins NS1 in den Kulturüberständen des Gelbfiebervirus und den Seren von Patienten, die mit diesem Virus infziert sind
  • e1 – Verwendete Antikörper
  • Die gereinigten monoklonalen Antikörper 8G4, 1A5 und 2D10 werden in einer PBS-Lösung zu einer gegebenen Verdünnung vermischt und als Einfang-Antikörper bzw. Fang-Antikörper eingesetzt. Der zweite verwendete Antikörper, der für Gelbfieber-NS1 spezifisch ist, stammt aus einem Serum von Kaninchen, das vorher gegen das Protein NS1 des Gelbfiebervirus 17D immunisiert worden war (J.J. Shlesinger et al., J. Immunol., (1985), 135, 2805–2809).
  • e2 – ELISA-Einfang-Verfahren
  • Die verwendete Technik ist dieselbe wie die, die in Beispiel 3 beschrieben wurde.
  • 2. Resultate
  • Die Sekretion des Proteins NS1 wurde bereits früher für Zellkulturen beschrieben, die in vitro durch verschiedene Flaviviren infiziert waren: das Virus des DEN2 (Winkler et al., Virology, (1988), 162, 187–196, Pryor et al., Virology, (1993), 194, 769–780), das Virus der Zecken-Enzephalitis (Lee et al., J. Gen. Yirol., (1989), 70, 335–343, Crooks et al., J. Chrom., (1990), 502, 59–68, Crooks et al., J. Gen. Virol., (1994), 75, 3453–3460), das Virus der japanischen Enzephalitis (Mason, Virology, (1989), 169, 354–364, Fan et al., Yirology, (1990), 177, 470–476), das Virus der Enzephalitis des Murray-Tals (Hall et al., J. Yirol. Meth., (1991), 32, 11–20) und des Gelbfiebervirus (Post et al., Vir. Res., (1990), 18, 291–302). Da diese Resultate durch unterschiedliche ELISA-Techniken erhalten wurden, haben wir versucht, das Protein durch die ELISA-Einfang-Technik der vorliegenden Erfindung in Zellüberständen von infizierten Säugern nachzuweisen.
  • Das Protein NS1 ist in den Kulturüberständen der Vero-Zellen, die entweder durch das Virus DEN2 oder durch das Virus der japanischen Enzephalitis oder das Virus des Gelbfiebers infziert sind, nachweisbar.
  • Das Protein konnte durch diese Technik auch in Seren von Patienten nachgewiesen werden, die durch das Gelbfiebervirus infiziert waren, wie dies durch die in 8 zusammengefassten Resultate gezeigt wird. Unter den 18 Seren, die großzügigerweise von Ch. Mathiot (Institut Pasteur, Dakar) zur Verfügung gestellt wurden, sind 7 bezüglich der NS1-Antigenämie positiv; wie für das Virus DEN1 scheint die Detektion des Proteins NS1 im Blutkreislauf gegenüber dem Vorliegen von IgM, die für Gelbfieber spezifisch sind, indifferent zu sein.
  • Die erfindungsgemäße ELISA-Einfang-Technik gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht es, das Protein NS1 in den Kulturüberständen von Zellen, die durch unterschiedliche Flaviviren infiziert sind, und in Seren von Patienten, die durch das Gelbfiebervirus infiziert sind, nachzuweisen. Sie könnte aufgrund dieser Tatsache diagnostische Anwendung finden, um eine Infektion durch ein anderes Flavivirus als das Virus DEN1 nachzuweisen.
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00230001
  • Figure 00240001
  • Figure 00250001

Claims (20)

  1. Verfahren zum frühen Nachweis einer Flavivirus-Infektion, dadurch gekennzeichnet, dass es den Nachweis des nicht-strukturellen Glycoproteins NS1 eines Flavivirus in einer biologischen Probe während der gesamten Dauer der klinischen Phase der Infektion durch ein immunologisches Verfahren unter Verwendung von mindestens zwei Antikörpern, die gleich oder unterschiedlich sind, umfasst, wobei – der erste Antikörper oder Einfangantikörper des Glycoproteins NS1 durch Antikörper gebildet wird, die aus der Gruppe bestehend aus: – polyklonalen Antikörpern, die vorher durch Immuneinfangen auf dem Protein NS1 des Flavivirus in Hexamerform selektioniert werden; und – Gemischen monoklonaler Anti-NS1-Antikörper, die vorher bezüglich ihrer erhöhten Affinität für das Protein NS1 des Flavivirus in Hexamerform selektioniert werden, wobei die monoklonalen Antikörper dann gereinigt werden, ausgewählt wird; – der zweite Antikörper oder Entwicklungsantikörper aus der Gruppe bestehend aus – polyklonalen Antikörpern, die gegen das Protein NS1 in Hexamerform gerichtet sind und – einem Gemisch monoklonaler Antikörper, die gegen ein Protein NS1 in Hexamerform gerichtet sind, ausgewählt wird.
  2. Nachweisverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Flavivirusinfektion eine Infektion durch das Virus des Dengue-Fiebers ist.
  3. Nachweisverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der erste Antikörper auf einem zweckdienlichen festen Träger fixiert ist und der zweite Antikörper gegebenenfalls mit einem geeigneten Marker konjugiert ist.
  4. Nachweisverfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass, wenn der zweite Antikörper nicht an einen Marker konjugiert ist, seine Bindung an das Protein NS1, das auf dem festen Träger fixiert ist, durch einen dritten Antikörper, der mit einem zweckdienlichen Marker konjugiert ist, detektiert wird.
  5. Nachweisverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass der dritte Antikörper mit einem Enzym konjugiert ist.
  6. Nachweisverfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass – der erste Antikörper oder Einfangantikörper aus polyklonalen Mausantikörpern gebildet wird, die durch Immuneinfangen an dem Protein NS1 des Virus des Dengue-Fiebers selektioniert werden, wobei das Protein in Hexamerform vorliegt, und – der zweite Antikörper oder Antikörper zum Nachweis des Vorliegens von NS1 in der zu analysierenden biologischen Probe aus polyklonalen Antikörpern von Kaninchen, die durch das Protein NS1 des Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, immunisiert sind, wobei das Protein in Hexamerform vorliegt, besteht, wobei die Fixierung des zweiten Antikörpers durch einen dritten Antikörper entwickelt wird, der aus Antikörpern besteht, die an Peroxidase konjugiert sind und gegen den zweiten Antikörper gerichtet sind.
  7. Kit zur frühen Diagnose einer Flavivirusinfektion, dadurch gekennzeichnet, dass er umfasst: – mindestens einen Einfangantikörper und mindestens einen Entwicklungsantikörper, wie sie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert sind, – mindestens eine positive Kontrolle, die durch das Protein NS1 eines Flavivirus und/oder verschiedener Serotypen entsprechend dem Flavivirus gebildet wird, wobei das Protein in Hexamerform vorliegt, und – mindestens eine negative Kontrolle, die aus einem normalen humanen Serum besteht.
  8. Kit zur Diagnose nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein NS1 aus einem Kulturüberstand, entweder von infizierten Säugerzellen oder Säugerzellen, die durch ein rekombiniertes Plasmid transfiziert sind, welches das Gen des Proteins NS1 eines Flavivirus oder ein Fragment des Gens oder ein Fragment des Flavivirusgenoms trägt, wobei die Fragmente geeignet sind, das Protein NS1 ganz oder teilweise zu exprimieren, erhalten wird.
  9. Kit zur frühen Diagnose einer Flavivirusinfektion nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein NS1 das des Virus des Dengue-Fiebers ist.
  10. Kit zur frühen Diagnose einer Flavivirusinfektion nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Plasmid bei der Collection Nationale de Cultures et de Microorganismes, unterhalten vom Institut Pasteur, mit der Nummer I-2220 am 7. Juni 1999 hinterlegt wurde.
  11. Verfahren zur Reinigung des Proteins NS1 eines Flavivirus in Hexamerform ausgehend vom einem Kulturüberstand entweder von infizierten Säugerzellen oder von Säugerzellen, die durch ein rekombiniertes Plasmid transfiziert sind, welches das Gen des Proteins NS1 oder ein Fragment dieses Gens oder ein Fragment des Flavivirusgenoms trägt, wobei die Fragmente fähig sind, das Protein NS1 zu exprimieren, dadurch gekennzeichnet, dass es vor der Reinigung des Proteins NS1 durch klassische Techniken eine Stufe der Abtrennung der löslichen Form des Proteins NS1 von der Mikroteilchenform des Proteins durch Behandlung mit einem Präzipitationsmittel und danach eine Zentrifugation umfasst.
  12. Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff das Protein NS1 eines Flavivirus in Hexamerform, gegebenenfalls assoziiert mit anderen Proteinen, in Kombination mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel umfasst.
  13. Immunogene Zusammensetzung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens ein Gemisch der Proteine NS1 in Hexamerform, die verschiedenen Serotypen des Virus des Dengue-Fiebers entsprechen, umfasst.
  14. Verwendung des Proteins NS1 in Hexamerform oder eines seiner Expressionssysteme zur Herstellung einer immunogenen Zusammensetzung, die geeignet ist, die Antikörperproduktion in vivo zu induzieren.
  15. Verwendung mindestens eines monoklonalen Anti-NS1-Antikörpers, der eine erhöhte Affinität für das Protein NS1 in Hexamerform aufweist, wobei die Form nicht abgebaut ist, die monoklonalen Antikörper dann gereinigt werden und zur Herstellung eines Medikaments, das geeignet ist, eine passive Immunisierung zu induzieren, modifiziert werden.
  16. Verwendung des Proteins NS1 in Hexamerform, wobei die Form nicht abgebaut ist, um in vitro spezifische Anti-NS1- Antikörper zu selektionieren, welche für eine frühe Diagnose einer Infektion durch ein Flavivirus geeignet sind.
  17. Immunogene Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Wirkstoff, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: – einem Polynucleotid, das fähig ist, das Protein NS1 des Virus des Dengue-Fiebers, ganz gleich welcher sein Serotyp ist, ganz oder teilweise zu exprimieren, und – einem Expressionssystem, das mindestens einen Promotor, der fähig ist, bei einem Wirt, in den es injiziert ist, die DNA, die für das Protein NS1 des Virus des Dengue-Fiebers, ganz gleich welcher sein Serotyp ist, codiert, zu exprimieren, wobei die DNA das Protein exprimiert, umfasst, in Kombination mit mindestens einem pharmazeutisch annehmbaren Vehikel umfasst.
  18. Verfahren zur Expression eines Polynucleotids, das für das Protein NS1 eines Virus des Dengue-Fiebers codiert, dadurch gekennzeichnet, dass es die Expression eines Polynucleotids, wie es in der Sequenz SEQ ID NO:1 definiert ist, verbunden mit einem Promotor des Polynucleotids, in zweckdienlichen Eukaryontenzellen umfasst.
  19. Verfahren zur Reinigung des Proteins NS1 nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Flavivirus ein Virus des Dengue-Fiebers, ganz gleich welcher sein Serotyp ist, ist.
  20. Verfahren zur Reinigung des Proteins NS1 nach den Ansprüchen 11 und 19, dadurch gekennzeichnet, dass das Flavivirus ein Virus des Dengue-Fiebers, Serotyp 1, ist.
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