DE4419264A1 - Antigen, um Menschen und Tieren eine schützende Immunität gegen Wurminfektionen zu verleihen - Google Patents

Description

Diese Erfindung betrifft im allgemeinen von Helminthen bzw. Würmern abgeleitetes antigenes Material, welches in der La­ ge ist, einen wirksamen und langandauernden Schutz gegen Parasiten zu bewirken, insbesondere Antigene, welche eine schützende Immunität gegen Helminthen vermitteln.

Unter den Helminthen umfassen die Trematoden, insbesondere solche der Ordnung Digenea (digenetic trematodes), oder Saugwürmer (flukes) über 100 Familien. Die Mehrheit sind vergleichsweise harmlose Parasiten, welche im Intestinum und anderen Organen von Wirbeltieren leben und demgemäß ei­ ne geringe Beachtung von angewandten Parasitologen empfan­ gen haben. Jene Trematoden, welche ernste Krankheiten in Menschen verursachen, sind die Blutsaugwürmer oder Schisto­ somen und die Lebersaugwürmer und Lungensaugwürmer, welche sehr wichtige Parasiten sind, die Tiere infizieren.

Fasciola, der wichtigste der Lebersaugwürmer, parasitiert hauptsächlich in domestizierten Widerkäuern und ist für ei­ nen schwerwiegenden ökonomischen Verlust in der ganzen Welt (Rinder, Schafe und Ziegen) verantwortlich.

Die Haupteigenschaft der Krankheit und eine, welche verant­ wortlich ist für die pathologische Erscheinung, Krankheit und Sterblichkeit der erwähnten Tiere, ist die Zerstörung des Lebergewebes des Wirtes und eine Schädigung der Gallen­ gänge. Die Krankheit ist ausgeprägter bei jungen Tieren, die besonders betroffen sind, und ausgezehrt werden und sterben. Fasciola kann ebenfalls Menschen parasitieren, wenn ihm die Gelegenheit gegeben wird, und dieses ist häu­ figer der Fall in Kuba und lateinamerikanischen Ländern. Nichtsdestoweniger ist der wahre menschliche Lebersaugwurm ein anderer Parasit, nämlich der Clonorchis sinensis, wel­ cher in China, Japan, Korea, Vietnam und Indien weitver­ breitet ist. Die pathologischen Veränderungen werden im we­ sentlichen durch Verdickung der Gallengangwände verursacht und führen in schweren Fällen zu Leberzirrhose und Tod.

Sowohl Fasciola als auch Clonorchis erlangen Zugang auf passive Weise als Metazerkarien, welche mit der Nahrung aufgenommen werden (Gras und roher Fisch für Fasciola bzw. Clonorchis), aber ihr Migrationsweg in dem Körper des Wir­ beltierwirtes zu den Gallengängen unterscheidet sich.

Während Clonorchis aus dem Darm durch die Vater-Ampulle in die Gallengangsgabelung (biliary tree) kommt, wandert Fasciola über die Bauchhöhle, indem es aufeinanderfolgend die Darmwand und das Leberparenchym durchdringt, was zu ei­ ner ernsthafteren Schädigung der Wirtsgewebe führt.

Was die Fascioliasis in Haustieren betrifft, gibt es wider­ sprüchliche Ergebnisse und dürftige Beweise, um vorzuschla­ gen, daß Schafe oder Ziegen nach der Immunisierung mit Roh­ extrakten eine Immunität gegen Fasciola hepatica erlangen (Sinclair, 1967).

Es gibt ebenfalls Beweise, die zeigen, daß bei experimen­ tell infizierten Schafen eine Infektion für mindestens 11 Jahre anhalten kann (Durbin, 1952). Es wird ebenfalls be­ richtet, daß eine sehr kleine oder keine Reaktion des Wir­ tes gegenüber dem Parasiten auftritt; somit wird das Über­ leben des Schafes vollständig von der Anzahl der aufgenom­ menen Metazerkarien abhängen (Boray, 1969). Von Vieh wird angenommen, daß es resistenter ist: F. hepatica lebt im allgemeinen von 9 bis 12 Monaten in diesem Wirt, aber es sind junge Kälber, welche die ernstere klinische Fasciolia­ sis zeigen.

Verschiedene Versuche wurden unternommen, um immunopro­ phylaktische Antigene zu identifizieren, welche eine gute Grundlage zur Entwicklung von wirksamen Impfstoffen gegen Fascioliasis zur Verfügung stellen könnten. Im wesentlichen wurden zwei unabhängige experimentelle Strategien durch ei­ nige Wissenschaftler verfolgt. Diese basierten auf: 1) Im­ munität, induziert durch bestrahlte Lebendimpfstoffe und 2) Immunität, welche durch nicht-Lebendimpfstoffe induziert wurde.

Nichtsdestoweniger sind nur wenige Versuche über eine er­ langte Resistenz gegenüber Fasciola hepatica in Kälbern un­ ter Verwendung von somatischen Saugwurmextrakten veröffent­ licht worden (Ross, 1967; Hall und Lang, 1978; Hillyer, 1979) und diese berichten widersprüchliche Daten.

Immunität, welche durch bestrahlte Lebendimpfstoffe indu­ ziert wurde, hat ebenfalls bei Experimenten frustrierende Ergebnisse gezeigt, welche in Mäusen, Kaninchen oder Scha­ fen ausgeführt wurden (Campbell et al., 1978, Hughes 1963); daher gibt es keinen Beweis von einer Entwicklung von Immu­ nität in diesen Tieren, welche auf eine Verabreichung von bestrahlten Metazerkarien folgte.

Zusätzlich waren Experimente mit verschiedenen Extrakten oder exkretorischen/sekretorischen Produkten von adulten Gallensaugwürmern nicht-immunogen, was zu dem Ergebnis führte, daß geimpfte Tiere einen geringen Schutz und patho­ logische Schädigungen im Leberparenchym zeigten.

Wie sich aus dem vorhergehenden Stand der Technik ergibt, erwartet man, daß Rinder besser auf eine Impfung mit nicht- Lebendimpfstoffen ansprechen würden, aber es war zweifel­ haft, ob auf der Grundlage von nur mäßigem Schutz, welcher durch eine Anzahl von verschiedenen Antigenen in Versuchs­ tieren induziert wurde, ähnliche Vorhersagen für Schafe ge­ macht werden könnten.

Die Induktion von schützender Immunität gegenüber F. hepa­ tica mittels heterologer Immunität wurde ebenfalls von Campbell et al. (1977) ins Auge gefaßt, welcher zeigte, daß eine Infektion von Schafen mit Cysticercus tenuicollis, welcher das metazestode Stadium des Hundebandwurms Taenia hydatigena ist, einen teilweisen Schutz gegen F. hepatica erzeugte, aber Hughes et al. (1978) konnten jedoch dieses Ergebnis nicht bestätigen. Andere Experimente waren eben­ falls nicht in der Lage, einen Schutz gegenüber Fasciola hepatica in Versuchstieren mit diesem Bandwurm zu induzie­ ren.

Mäuse, welche mit bisexuellen adulten S. mansoni infiziert wurden, entwickelten eine statistisch signifikante Resi­ stenz gegenüber F. hepatica und gleichzeitige Infektionen mit beiden Parasiten führten zu einer verminderten Zahl von festgesetzten Schistosomen und verminderter Schistosomen- Eierproduktion pro Wurm (Christensen et al., 1978). Kälber, welche mit S. bovis infiziert wurden, zeigten ebenfalls ei­ ne gewisse Resistenz gegenüber F. hepatica und eine weniger ausgeprägte Lebergewebsschädigung (Sirag et al. 1981).

Pelley und Hillyer, 1978, Hillyer und de Atica 1980, be­ richteten gemeinsame Antigene zwischen F. hepatica und Schistosoma mansoni, welche in dem Schistosomen-Ei gefunden wurden. Ein weiterer Fund, der auf eine kreuzreaktive Immu­ nität hinweist, ist das Auftreten von falschen positiven Reaktionen in Gebieten, wo beide Parasiten endemisch sind. Hillyer, 1985 und Hillyer et al. 1987, zeigten ebenfalls, daß eine Mischung von Antigenen, welche von Fasciola hepa­ tica abgeleitet waren, einen Schutz gegen eine nachfolgende Infektion mit sowohl F. hepatica als auch Schistosoma man­ soni verleihen kann.

Schistosomiasis oder Bilharziose ist eine alte durch Wasser übertragene Krankheit, welche durch die Ägypter vor 4000 Jahren aufgezeichnet wurde, und heute ein weltweites Pro­ blem der öffentlichen Gesundheit ist, von der geschätzt wird, daß sie mehr als 200 Millionen Leute in städtischen und Vorstadtgebieten der Dritten Welt befällt. Die drei hauptsächlichen Schistosomen, welche Menschen infizieren, werden durch Süßwasserschnecken übertragen und die frei­ schwimmenden Larven, genannt Zerkarien, welche in das Was­ ser entlassen werden und in der Lage sind, die Haut des Wirtes direkt zu durchdringen. Nach der Wanderung von der Haut durch die Lungen zu dem Leberpfortadersystem, leben die Schistosomen in den kleinen Mesenterial- oder Beckenve­ nen, wo jedes Weibchen über 100 Eier pro Tag in den Blut­ strom hineinlegt. Die Immunreaktion des Wirtes auf jene Ei­ er, welche sich in den Geweben festsetzen, ist vor allem für die chronisch schwächende und oft tödliche Krankheit verantwortlich. Die Ausdehnung von Bewässerungssystemen, der Bau von Dämmen und die Konzentration von menschlichen Populationen tragen heute zu dem Anwachsen in der Vertei­ lung und Intensität von Schistosomeninfektionen bei.

Schneckenkontrolle und Chemotherapie sind die hauptsächli­ chen, aber in keinem Fall zufriedenstellenden Kontrollme­ thoden. Ein wirkungsvoller Impfstoff würde das Endziel sein, um beträchtlich bei den Versuchen zu helfen, die Krankheit auszurotten.

Eine Vielzahl von Wirtsarten kann eine teilweise Resistenz gegenüber Schistosoma mansoni entwickeln, welche auf eine frühere Infektion oder Immunisierung mit strahlengeschwäch­ ten Zerkarien folgt (Smithers & Doenhoff, 1982). Der frü­ here Status der Remission, was die Möglichkeit betrifft, experimentell gegenüber einer S. mansoni-Infektion zu immu­ nisieren (Clegg & Smith, 1978) ist durch den gegenwärtigen Enthusiasmus ersetzt worden, im Hinblick auf die Möglich­ keit, einen definierten und wirksamen Impfstoff gegen die­ sen Parasiten mit toten Impfstoffen zu erzeugen (Tendler, 1987). Nichtsdestoweniger bleibt die hauptsächliche Be­ schränkung der unvollständige Grad an Schutz, welcher bei Tieren in den meisten Experimenten mit gereinigten und che­ misch definierten Parasitenantigenen erreicht wurde. Wie durch einige Autoren beschrieben und durch Smithers 1982 im Überblick dargestellt, gab es eine allgemeine Übereinstim­ mung im Hinblick auf die Notwendigkeit, den Schutzgrad, welcher durch experimentelle Immunoprophylaxe induziert wurde, zu vergrößern. Jedoch war die Einrichtung eines gu­ ten Tiermodells für die Entwicklung eines wirksamen Impf­ stoffes gegen Schistosomiasis sehr schwer zu erreichen. Der Fortschritt hängt ab von der Identifizierung und Reinigung von hochwirksamen antigenen Molekülen, welche eine schüt­ zende Immunität vermitteln würden. (Schistosoma mansoni: Protective Antigens, M. Tendler-Mem. Inst. Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, Vol. 82, Suppl. IV: 125-128, 1987).

In früheren Untersuchungen auf der Suche nach Antigenen, welche eine schützende Immunität gegenüber Schistosomen vermitteln, berichteten wir von der Verwendung einer kom­ plexen Mischung aus Schistosomenbestandteilen (genannt SE), welche früh während der Inkubation von lebendigen und frisch perfundierten adulten S. mansoni-Würmern in phos­ phatgepufferter Salzlösung abgegeben wurden (Tendler & Sca­ pin, 1979; Kohn et al. 1979). Beim Konzentrieren auf den Versuch, einen Schutz gegen Zerkarieninfektion unter Ver­ wendung eines Impfstoffes zu erreichen, wurde ein experi­ mentelles Modell entworfen, mit zwei verschiedenen, nicht verwandten bzw. Nachkommen aus der Kreuzung entfernt ver­ wandter (outbred) tierischer Wirte, der SW-Maus und NZ-Ka­ ninchen, von welchen bekannt ist, daß sie vollständig an­ fällig bzw. teilweise resistent gegenüber S. mansoni-Infek­ tion sind.

In dem S. mansoni-Modell mit dem Neuseeländer-Kaninchen, war es möglich, ein verläßliches Modell von perkutanen In­ fektionen zu errichten, mit einer recht homogenen Belastung an adulten Würmern, was die Anzahl und Größe der Parasiten und die männlich/weiblich-Verhältnisse betrifft, für eine lange Zeitdauer nach der Infektion (Tendler, 1982, 1985, 1986). Neuere Beweise legen nahe, daß die Verwendung des Kaninchens als einen experimentellen Wirt für S. mansoni ein neues Immunitätsmodell für die Krankheit darstellen könnte (Almeida et al., 1987).

Immunisierungsexperimente, welche mit der SE-Mischung an Kaninchen durchgeführt wurden, führten bei Immunitätstests zu sehr hohen Schutzgraden (Scapin et al., 1980; Tendler, 1980; Tendler et al., 1982) (90% mittlere Verminderung des Wurmbefalls in immunisierten Tieren, verglichen mit in Ge­ schlecht und Alter übereinstimmenden angepaßten Kontrollen, wenn diese gleichzeitig mit derselben Anzahl und Pool von aktiven Zerkarien aus dem LE, einem brasilianischen Stamm von S. mansoni, provoziert wurden). Von SW-Mäusen, welche mit SE immunisiert waren, ist ebenfalls gezeigt worden, daß diese gegen eine Provokation mit normalen Zerkarien deut­ lich geschützt sind und völlig resistent gegen tödliche In­ fektion sind (Tendler, 1986). Um die Resistenz zu messen, wurden geimpfte und provozierte Tiere und parallel dazu die Kontrollen einer hepatischen und mesenterischen Perfusion unterworfen, um die Belastung mit adulten Parasiten zu be­ stimmen. Der Schutzgrad wird berechnet durch die Differenz in der Anzahl von Parasiten, welche in den Kontrollen ge­ genüber den geimpften Tieren gefunden wurden (Tendler et al., 1982).

Im Hinblick auf in vitro-Nachweise, daß Antikörper, welche gegen verschiedene Stadien des Lebenszyklus, der Parasiten in eosinophilen oder komplementabhängigen Cytotoxitätstests wirksam sind (Grzych et al., 1982; Smith et al., 1982), wird die Charakterisierung von Antigenen, welche von Seren aus nachweisbar immunen Wirten erkannt wurden, dazu be­ nutzt, um antigene Moleküle, welche mit schützender Immuni­ tät zusammenhängen, zu identifizieren (Bickle et al., 1986; Horowitz & Arnon, 1985). Western-Blot-Experimente wurden durchgeführt, um die Antikörperantwort der mit SE geimpften Kaninchen zu analysieren. Durch Testen von SE-Antigenen mit einer Gruppe von Antiseren, welche aus Kaninchen abgeleitet waren, die nach demselben Schema (SE-FCA) immunisiert wa­ ren, waren die Autoren in der Lage in Immunoblots zu zei­ gen, daß zwei verschiedene Erkennungsmuster von SE-Antige­ nen in diesen Individuen vorlagen. Interessanterweise wur­ den manche SE-Antigene in nur eingeschränkter Weise durch Antiseren von fast vollständig geschützten Kaninchen er­ kannt. Dieser Fund ermöglichte den Autoren, zwei Untergrup­ pen von Antigenen in SE zu identifizieren: eine, welche in allen individuellen Kaninchenantiseren vorkommt, und eine zweite Untergruppe, welche auf hochgeschützte Tiere be­ schränkt ist. Jene zwei Muster wurden jeweils Niedriges und Hohes Schutzmuster genannt und als "differentiellell Anti­ körper benutzt. Indem man den Vorteil dieser zwei Erken­ nungsmuster von SE-Bestandteilen durch polyklonale Antikör­ per aus Kaninchen, welche "auf differentielle Weise" auf dasselbe Immunisierungsschema antworteten, ausnutzte (möglicherweise aufgrund von individuellen Variationen, von welchen man erwartet, daß sie in nicht-verwandten Popula­ tionen auftreten) wurde die Strategie des Screenens von cDNA-Bibliotheken mit jenen Seren angewendet. Mit der Be­ schränkung des unvollständigen Verständnisses von kriti­ schen Mechanismen der Schutzantwort in sowohl experimentel­ ler als auch menschlicher Schistosomiasis, umfaßten die Screening-Verfahren, welche durch andere angewendet wurden, häufig die Verwendung von infiziertem menschlichen Seren ("mutmaßlich" immune oder "anfällige" Individuen aus ende­ mischen Gebieten [Carter & Colley, 1986] oder ausgewählte monoklonale oder polyklonale Seren von immunisierten Tieren [Lanar et al., 1986; Balloul et al., 1987]), welche gegen mehrere nicht-charakterisierte Antigene gerichtet sind.

Bei anfänglichen Versuchen auf das molekulare Klonieren von potentiell schützenden SE-Bestandteilen hin, wurden zwei cDNA-Bibliotheken von vollständigen adulten Würmern von S. mansoni und S. japonicum, aufgebaut von den Doktoren Klin­ kert, Universität Heidelberg, bzw. Donnelson/Henkle, Iowa University, mit doppelten Filtern und durch differentielles Screenen gescreent. Es konnte eine Parallele zu den Ergeb­ nissen der Immunoblots gezogen werden, derart, daß zwei verschiedene Gruppen von Klonen entdeckt wurden, welche vermutlich zu den verschiedenen Gruppen bei der Erkennung durch anfällige und resistente Kaninchen-anti-SE-Seren kor­ respondieren. In zusätzlichen Experimenten, welche auf die Identifizierung der SE-Bestandteile abzielten, verglichen wir in Immunoblots polyklonale Kaninchen-anti-SE-Seren (Hoher und Niedriger Schutz) mit einem Kaninchen-Antiserum für gereinigtes Schistosomenparamyosin (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von Dr. A. Sher, NIH). Dieses Pro­ tein ist ein vor kurzem definiertes Molekül, welches teil­ weise gegen eine Provokationsinfektion durch S. mansoni-Be­ fall in Inzuchtmäusen schützt (Lanar et al., 1986), mit ei­ nem Mr von 97 000, von dem gezeigt wurde, daß es anfällig für proteolytischen Abbau zu zwei Hauptabbauprodukten mit Mr von 95000 und 78000 ist (Pearce et al., 1986).

Der 97/95/78 kDa-Komplex wurde sowohl durch Hoch- und Nied­ rigschutz-anti-SE-Seren erkannt als auch durch monospezifi­ sche Antiparamyosinseren. Das "Hoch"-Schutz-anti-SE-Serum erkannte zusätzlich zu Paramyosin andere Polypeptide, wel­ che noch gut charakterisiert und im Hinblick auf ihre Schutzaktivität und immunologische Rolle getestet werden müssen. Der Fund von Paramyosin als einem Bestandteil von SE bestärkt wieder frühere indirekte Immunofluoreszenzun­ tersuchungen, welche an Abschnitten von adulten Schistoso­ men mit Kaninchen-anti-SE-Seren durchgeführt wurden, welche mit Eiern auf der Parasitenoberfläche und zwischen den Mus­ kelschichten reagierten (Mendonca et al., 1987) auf eine ähnliche Weise wie für Paramyosin gezeigt (Pearce et al., 1986). Dieser Fund entspricht ebenfalls Ergebnissen von in cDNA-Bibliotheken durchgeführtem Immunscreening, wie oben erwähnt. Wieder wurden gemeinsame Paramyosinklone mit so­ wohl anti-Paramyosin- als auch anti-SE-Seren isoliert, mit weiteren Klonen, welche nur durch das letztere Kaninchense­ rum erkannt wurden (Hoher Schutz). Unter den anderen SE-Be­ standteilen mit niedrigem Molekulargewicht wurde die 31/32 kDa Zweiergruppe, welche als potentielle Kandidaten für ei­ ne Diagnose von Schistosomiasis beschrieben wurden (Klinkert et al, 1987) und vor kurzem als Proteasen, welche in dem Schistosomen-Eingeweide identifiziert wurden, ebenfalls identifiziert (Klinkert et al., 1988). Diese An­ tigene und weitere, welche in dem Salzextrakt identifiziert wurden, zeigten beim Testen einen sehr geringen Schutz.

Die Inkubation von frisch per fundierten Schistosomen in ei­ nem chemisch definierten Medium (PBS) war auf die Extrak­ tion von früh abgegebenen Antigenen aus lebendigen adulten Würmern (insbesondere exkretorische/sekretorische Produkte und Hüllenbestandteile) gerichtet. Diese Strategie wurde angewendet im Hinblick auf frühere frustrierende Versuche, eine gleichmäßige Resistenz gegen Schistosomeninfektion mit verschiedenen Rohextrakten von S. mansoni zu induzieren, welche theoretisch frei von Antigenen mit relevanter Funk­ tion sein könnten. Diese Prämisse wurde hauptsächlich durch die Extraktionsverfahren welche gewöhnlicherweise angewen­ det wurden, beeinflußt, welche sich von der Verwendung von toten Parasiten ableiteten. Tatsächlich erreichten wir un­ ter Verwendung von SE welches in FCA (als bevorzugtem Adju­ vans) emulgiert war und durch den subkutanen/intradermalen Weg verabreicht wurde, einen hohen und lang andauernden Schutz gegen S. mansoni Infektion in zwei Labortierwirten. Die Grundlage für die Verwendung des Kaninchenmodells, wel­ ches ungewöhnlich in Schutzversuchen ist, war es, die an­ fängliche Idenfizierung von potentiell schützenden und dis­ kreten Antigenen in einem teilweise resistenten Wirt (welche im weiteren in anfälligen Wirten getestet werden muß) zu erreichen, welche daher die Immunantwort und Wirk­ mechanismen des Tötens von Parasiten "amplifizieren" könn­ te, da Kaninchen bekannte wirksame Erzeuger von Antikörpern sind.

Studien im Hinblick auf die induzierte Immunantwort in ge­ impften Tieren, welche sich auf die Identifizierung der funktional wichtigen SE-Schutzbestandteile, Ort und Mecha­ nismus des Todes von Parasiten und Schutzmarker richteten, waren das Zentrum unserer Anstrengungen in den vergangenen Jahren, aber eine Information über die molekulare Zusammen­ setzung von SE wie auch über die Idenfizierung und Isolie­ rung von seinen schützenden Bestandteilen war bis vor kur­ zem nicht erhältlich.

Das US Patent 4 396 000, erteilt am 2. August 1983 auf den Namen von Luigi Messineo & Mauro Scarpin (gemäß dem Re­ examination Certificate 461stB1 4 396 000, herausgegeben am 11. Februar 1986, wurde es für nichtig erklärt) beschrieb einen Extrakt aus adulten Schistosome mansoni Würmern, wel­ cher durch eine Inkubation in 0,15 M Natriumchlorid-Natri­ umphosphatpuffer (pH 5,8) erhalten wurde, welcher Protein­ carboxyhydrate und Nukleinsäuren und/oder Nebenprodukte des lezteren Bestandteil enthielt und welcher sich durch Gelchromatographie in G-100 und G-200 Sephadexsäulen in vier Hauptfraktionen auflöste. Immundiffusionstests mit Ka­ ninchenserum gegen den Gesamtextrakt zeigten drei Prezipi­ tationslinien, welche den Fraktionen I und II und eine der Fraktion III oder IV entsprachen. Kaninchen, welche mit diesem Gesamtextrakt immunisiert waren, zeigten eine völ­ lige oder teilweise (wenigstens 77%) Resistenz gegenüber einer Provokationsinfektion. Das antigene Salzextraktmate­ rial war ein wirkungsvoller Impfstoff für die Behandlung und Immunisierung von Schistosomiasis und anderen schisto­ somen Infektionen.

Die oben erwähnte offizielle Handlung beruhte auf zwei Ar­ tikeln der Erfinder und wurde hier als das Prinzip der vor­ liegenden Erfindung benutzt. Unter der Masse von Daten, die dem Hintergrund der vorliegenden Erfindung entsprechen, war das neueste Datum das Klonieren und Sequenzieren eines von SE abgeleiteten Bestandteils, welcher als Sm14 identifi­ ziert wurde.

Die als letzte veröffentlichte Untersuchung ist "A 14-kDa Schistosoma mansoni Polypeptide is Homologous to a gene fa­ mily offatty Acid Binding Proteins - The Journal of Biolo­ gical Chemistry - Vol. 266, Nr. 13, Ausgabe vom 5. Mai, Seiten 8477-8454, 1991; D. Moser, M. Tendler, G. Griffiths und Mo-Quen Klinkert". Diese Untersuchung beschreibt das Sequenzieren des Gens und den Nachweis der funktionellen Aktivität des Sm14 als ein Protein, welches Lipide an die Sm14-Struktur bindet.

Die vollständige Nukleotidsequenz, welche ein Schistosoma mansoni Protein, genannt Sm14, codiert wurde aus cDNA-Klo­ nen bestimmt, welche in Bakteriophagen λ gt 11 in Escheri­ chia coli vermehrt wurden. Das 14,8-kDa. Das Protein zeigt signifikante Homologien mit einer Familie von verwandten Polypeptiden, welche hydrophobe Liganden binden. Mitglieder dieser Gruppe von cytosolischen Proteinen wurden ursprüng­ lich aufgrund ihrer Affinität für langkettige Fettsäuren identifiziert. Das gereinigte rekombinante Protein zeigte eine Affinität für Fettsäuren, im Gegensatz zu einer Mutan­ te, welcher die 16 N-terminalen Aminosäuren fehlen. Die vollständige Nukleotidsequenz kann als ein offener Leserah­ men beschrieben werden, beginnend mit dem Starttriplett ATG, welches an der Stelle der Nukleotide 123-125 liegt. Die kodierende Region umfaßt 399 Nukleotide und endet bei der Position 521. Das Protein mit 133 Aminosäureresten hat, berechnet auf der Grundlage der Sequenz, eine molekulare Masse von 14847 kDa.

Das Sm14 wird dadurch charakterisiert, daß es die folgende Aminosäuresequenz zeigt:
MET-SER-SER-PHE-LEU-GLY-LYS-TRP-LYS-LEU-SER-GLU-SER-HIS- ASN-PHE-ASP-ALA-VAL-MET-SER-LYS-LEU-GLY-VAL-SER-TRP-ALA- THR-ARG-GLN-ILE-GLY-ASN-THR-VAL-THR-PRO-THR-VAL-THR-PHE- THR-MET-ASP-GLY-ASP-LYS-MET-THR-MET-LEU-THR-GLU-SER-THR- PHE-LYS-ASN-LEU-SER-CYS-THR-PKE-LYS-PHE-GLY-GLU-GLU-PHE- ASP-GLU-LYS-THR-SER-ASP-GLY-ARG-ASN-VAL-LYS-SER-VAL-VAL- GLU-LYS-ASN-SER-GLU-SER-LYS-LEU-THR-GLN-THR-GLN-VAL-ASP- PRO-LYS-ASN-THR-THR-VAL-ILE-VAL-ARG-GLU-VAL-ASP-GLY-ASP- THR-MET-LYS-THR-THR-VAL-THR-VAL-GLY-ASP-VAL-THR-ALA-ILE- ARG-ASN-TYR-LYS-ARG-LEU-SER.

Zusätzlich offenbart Moser, D. et al, daß es wünschenswert wäre auszuwerten, welche Rolle Sm14 beim Verleihen von Im­ munität für Labortiere in der Proteinmischung spielt und ob es ein relevantes Antigen für einen wirksamen immunologi­ schen Angriff auf den Parasiten wäre.

Perez, J.R. et al, Journal of Experimental Parasitology, Vol. 74: Nr. 4, Juni 1992 offenbart, daß das Polypeptid, welches kreuzreagiert mit Antiserum gegen das immunopro­ phylaktische Fh12-Antigen, eine signifikante Aminosäurese­ quenzhomologie mit einem 14,8 kDa S. mansoni fettsäurebin­ denden Protein, genannt Sm14 zeigt (Moser et al., 1991). Zusätzlich ist offenbart, daß Fh12 ein wirksames Immunogen und ein Kandidat für ein immunoprophylaktisches Molekül für die Verhinderung von sowohl Schistosomiasis als auch Fascioliasis ist (Hillyer 1985; Hillyer et al., 1987), wie auch ein nützlicher immonodiagnostischer Marker bei mensch­ licher Fascioliasis (Hillyer et al., 1992), und daß die Au­ toren danach strebten, rekombinante Antigenpreparationen, welche Fh15-Epitopuntergruppen und Untergruppenkombinatio­ nen enthielten, zu erzeugen, wobei Fh15 dasselbe Protein sein konnte wie Fh12.

Nichtsdestoweniger wertete sogar die zu der vorliegenden Erfindung am meisten verwandte Arbeit (durch Moser, D. et al. und Perez, J.R. et al.) nicht die Rolle von Sm14 aus, die dieses in der Proteinmischung SE im Übertragen von Im­ munität auf Labortiere spielt und ob dies ein wirkungsvol­ les Schutzantigen gegen Infektionen durch Schistosomen und andere Helminthen wie z. B. F. hepatica sein würde.

Die vorliegende Erfindung ergab sich aus der Fortsetzung von früher veröffentlichter Forschung insoweit, daß sie be­ wiesen hat, daß Sm14 ein extrem aktiver Schutzbestandteil von SE ist, welcher in der Lage ist, einen hohen Grad von schützender Immunität in einer rekombinanten Form in Labor­ tieren gegen eine Infektion entweder durch S. mansoni oder F. hepatica zu stimulieren.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Schutz­ antigen gegen Helmintheninfektionen zur Verfügung zu stel­ len.

Die Lösung dieser Aufgabe erfolgt durch die Merkmale der Ansprüche 1, 7, 13, 17, 22 und 23. Die Unteransprüche stel­ len vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung dar.

Eine weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist es, eine rekombinante Form von Sm14, nämlich rSm14, zur Verfü­ gung zu stellen.

Eine weiterer Vorteil der Erfindung ist darin begründet, daß ein Impfstoff gegen die Infektion, welche durch Fascio­ la hepatica in Rindern, Ziegen und Schafen verursacht wird, zur Verfügung gestellt wird.

Noch ein weiterer Vorteil der Erfindung ist darin begrün­ det, daß ein Impfstoff gegen eine Infektion, welche durch Schistosoma mansoni und alle anderen Arten von Schistosoma, welche verantwortlich für Infektionen und Krankheiten in Menschen und Tieren sind, verursacht werden, zur Verfügung gestellt wird.

Noch ein weiterer Vorteil der Erfindung ist darin begrün­ det, daß ein Impfstoff gegen Infektionen, welche durch alle Arten von Helminthen von medizinischem und veterinärmedizi­ nischem Interesse verursacht werden, zur Verfügung gestellt wird.

Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung liegt in der Bereitstellung eines dignostischen Reagenz, für Schi­ stosomiasis und Fascioliasis.

Insbesondere wird die obige Aufgabe gelöst, indem ein Anti­ gen zur Verfügung gestellt wird, um schützende Immunität gegen helmithische Infektionen von Menschen und Tieren zu verleihen, und das Verfahren zur Impfung für eine Immunpro­ phylaxe von helmithologischen Krankheiten von veterinärme­ dizinischem und humanmedizinischem Interesse als auch durch Zur-Verfügung-stellen eines Antigens, um als ein immunodia­ gnostisches Reagenz zu wirken.

Gemäß der vorliegenden Erfindung besteht das Antigen aus einem Protein, welches von Schistosoma mansoni ableitbar ist, Sm14, welches die Möglichkeit hat, eine schützende Im­ munität in Labortieren mit Wurminfektionen, insbesondere durch S. mansoni und F. hepatica, zu stimulieren.

Zusätzlich umfaßt die vorliegende Erfindung eine rekombi­ nante Form von Sm14, rSm14, welche ein Fusionsprotein mit dem Capsidprotein des Bakteriophagen T7 ist.

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aufgrund der Beschreibung von Ausführungsbei­ spielen sowie anhand der Zeichnungen.

Fig. 1 zeigt ein Gel der Antigen-Endpräparation (rSm14-Rei­ nigung) im Vergleich mit SE.

Fig. 2 zeigt die dreidimensionale Struktur von Sm14, welche durch Computer-Modelling vorhergesagt wurde.

Fig. 3 zeigt die Auswertung des Schutzgrades von rSm14 ge­ mäß Experiment 1.

Fig. 4 zeigt die Auswertung des Schutzgrades von rSm14 ge­ mäß Experiment 2.

Fig. 5 zeigt die Auswertung des Schutzgrades von rSm14 ge­ mäß Experiment 3.

Fig. 6 zeigt die Auswertung des Schutzgrades von rSm14 ge­ mäß Experiment 4.

Fig. 7 zeigt die gesammelten Ergebnisse der Experimente 1, 2, 3 und 4.

Fig. 8 zeigt die Impfung von Schweizer Mäusen mit rSm14 ge­ gen eine Infektion mit Fasciola hepatica.

Fig. 9 zeigt die Leber eines nicht geimpften Tieres, wel­ ches mit Fasciola hepatica infiziert war.

Fig. 10 zeigt ebenfalls die Leber eines nicht geimpften Tieres, welches mit Fasciola hepatica infiziert war.

Fig. 11 zeigt die Leber eines geimpften Tieres, welches mit Fasciola hepatica infiziert war.

Das Verfahren zur Entwicklung eines Impfstoffes gegen die menschliche Schistosoma-Art unter Verwendung desselben Impfantigens in der Immunprophylaxe von Krankheiten, welche durch verschiedene Parasitenarten, die Menschen und ver­ schiedene Tiere befallen, verursacht werden, kann durch die folgenden Schritte beschrieben werden:

• - Erreichen der Isolation eines allgemein kreuzreagieren­ den Antigens (welches gemäß der bevorzugten Ausfüh­ rungsform der vorliegenden Erfindung Sm14 ist), welches in hohem Maße Schutz gegen Krankheiten sowohl von Tie­ ren als auch Menschen verleiht;
• - Testen dieses Antigens als einen Impfstoff für die Im­ munprophylaxe der Krankheit von Tieren in experimentel­ len und bestimmten Wirten für den Parasiten, welcher die Infektion und/oder die Krankheit verursacht;
• - Analysieren der Information, welche aus der Impfung des tierischen Wirtes abgeleitet wurde, nämlich domesti­ zierten Widerkäuern, indem alle verwandten Fragen und Voraussetzungen für die endgültige Entwicklung eines Impfstoffes gegen gegebene menschliche Krankheiten so­ wie Toxikologie und Pathologie konzentriert werden.

Verwendet man das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfin­ dung, ist es möglich, ein Antigen zu finden, welches gleichzeitig sehr wirksam als ein Impfstoff gegen zwei pa­ rasitische Krankheiten, von sowohl Haustieren als auch Men­ schen ist. Gemäß der bevorzugten Ausführungsform der vor­ liegenden Erfindung sind die parasitischen Krankheiten von sowohl Haustieren als auch Menschen Fascioliasis bzw. Schi­ stosomiasis, wie auch andere helminthische Krankheiten, welche insbesondere Menschen und verschiedene Tierarten be­ fallen.

Eines der Antigene in der komplexen SE-Mischung, Sm14, ist kloniert worden und zeigt eine signifikante Homologie mit fettsäurebindenden Proteinen und ebenfalls mit Fh15, einem Fasciola hepatica Antigen. Dieses kreuzreagierende Antigen, nämlich Sm14, in seiner rekombinanten Form - rSm14, ver­ leiht schützende Immunität gegen sowohl Schistosomiasis als auch Fascioliasis.

rSm14 ist ein Fusionsprotein aus den ersten 260 Aminosäuren des Capsidproteins des Bakteriophagen T7 und dem vollstän­ digen Sm14-Polypeptid, wie oben definiert, welches durch Verknüpfung zwischen dem 260ten Rest des T7 Proteins und dem Startmethionin (MET) von Sm14 erhalten wurde, mit der folgenden Aminosäurensequenz:
Capsidprotein-Rest 260-LEU-LEU-THR-LEU-THR-LYS-GLY-LYS -ALA-LYS-SER-ALA-GLU-LEU-GLU-PHE-VAL-ASP-LEU-GLU GLY-SER-VAL-Sm14.

Wir werden hier die Fähigkeit einer rekombinanten Form von Sm14 aufzeigen, einen hohen Schutz gegen Fasciola hepatica, Schistosoma mansoni, wie auch alle anderen Arten von Schi­ stosoma und Echeinococcus und möglicherweise andere Hel­ minthen, die pathogen für Menschen und Tiere sind, zu ver­ leihen. Die Schutzgrade, welche bei der experimentellen Impfung von Hunderten von Tieren erreicht wurden, haben ge­ zeigt, daß Sm14 ein von SE abgeleitetes wichtiges schützen­ des Molekül ist, und ein Kandidat für sowohl einen anti- Schistosomen-Impfstoff als auch einen anti-Fasciola-Impf­ stoff ist.

Die vorliegende Erfindung wird nun in bezug auf, aber nicht beschränkt durch die Beispiele beschrieben werden.

BEISPIEL 1

Das Verfahren zum Erhalten, Charakterisieren und Reinigen des rekombinanten Sm14 ist im folgenden beschrieben:

Phase 1

Der Übergang von dem schützenden Salzextrakt (SE) zu dem molekularen Impfstoff wurde wie folgt erreicht:

• a) eine λgt 11 cDNA-Bibliothek aus einem brasilianischen Stamm von S. mansoni, LE (hergestellt aus den adulten Würmern des endemischen LE-Stammes von Schistosoma man­ soni) wurde mit anti-SE-Immunserum gescreent, welches von vollständig geschützten Individuen abgeleitet war (nämlich Kaninchen und Kaninchen "Hochschutz"-Serum, wie vorher in diesem Dokument beschrieben).
• b) Eine Art von cDNA-Klon, welche durch Kaninchen-anti-SE- Hochschutzserum erkannt wurde und hochintensive Signale lieferte, wurde unter den anderen ausgewählt.
• c) Die Sequenz und Charakterisierung zeigte das Protein von 14 kDa, genannt Sm14 (die Nukleotid- und abgeleite­ te Aminosäuresequenz ist die schon in der Arbeit von Moser, Tendler et al. veröffentlichte).

Ein praktisches Beispiel, wie die Herstellung des cDNA- Klons durchzuführen ist, ist im Stand der Technik beschrie­ ben.

Phase 2

Expression von Sm14 in einem effizienten Vektorsystem.

Das Verfahren, dieses bis zu pDS-14 durchzuführen, ist im Stand der Technik beschrieben (A 14-kDa Schistosoma mansoni Polypeptide is Homologous to a gene Family of Fatty Acid Binding Proteins, The Journal of Biological Chemistry, Vol. 266, Nr. 13, Ausgabe vom 5. Mai, Seiten 8447-8454, 1991), wie auch die Identifizierung und Ergebnisse der klonierten cDNA-Sequenz, und bezüglich Verfahren und Sequenz wird hierauf vollinhaltlich Bezug genommen.

Antiserum, welches in Kaninchen, die mit dem Schistosomen- Extrakt immunisiert waren, hergestellt wurde, wurde be­ nutzt, um die cDNA-Bibliothek von adultem S. mansoni (vorher beschrieben) zu screenen. Ein Klon, welcher als Sm14 bezeichnet wurde, wurde plaque-gereinigt nach dreima­ ligem Immunscreening. Der rekombinante Phage wurde in E. coli Y1089 lysogenisiert und induziert, um ein Beta-Galak­ tosidase-Sm14-Fusionsprotein mit 122 kDa zu exprimieren. Das Protein wurde durch präparative SDS-Polyacrylamidgel- Elektrophorese gereinigt und Antikörper gegen das Fusions­ protein wurden in Kaninchen erzeugt.

Das Subklonieren von Sm14 und seine Expression in dem vor­ liegenden Vektor, in welchem die Impfungsversuche gegen Schistosoma und Fasciola gemacht wurden, sind im folgenden beschrieben:

Herausschneiden des vollständigen offenen Leserahmens, wel­ cher das Sm14 kodiert, aus dem ursprünglichen Konstrukt pDS-Sm14, durch Schneiden mit Bam HI und HindIII.

Das erhaltene Fragment wurde in pGEMEX-1 (Promega) ligiert, welches mit denselben Enzymen geschnitten wurde.

Phase 3

Das resultierende Konstrukt, welches dann wieder zu dem Gen führte, welches in den Rahmen für die Expression als ein Fusionsprotein mit dem T7 Gen-10-Protein paßte, unter der Kontrolle eines T7 RNA Polymerasepromotors, wurde benutzt, um E.coli Stamm BL 21 (DE3), welcher das Gen für T7 RNA Po­ lymerase unter der Kontrolle von Lac UV enthält, zu trans­ formieren. Der E.coli Stamm BL 21 (DE3) wurde für eine Ex­ pression von rekombinantem Protein benutzt. Andere Stämme von E.coli können wahlweise für denselben Zweck angewendet werden, wie auch andere Expressionssysteme, z. B. pDS-14, wie schon im Stand der Technik.

Phase 4

Kolonien, welche das rekombinante Plasmid enthielten, wur­ den über Nacht kultiviert, und die Expression von T7 RNA Polymerase wurde während des folgenden log-Phasenwachstums durch die Zugabe von IPTG (Isopropylthio-β-D-Galaktosid) induziert.

Dieses Verfahren führte zu der Expression eines Fusionspro­ teins mit dem vorhergesagten Molekulargewicht von 40 kDa (14 kDa von Sm14 und 26 kDa von dem Gen-10-Protein).

Phase 5

Die Bakterienzellen wurden durch Zentrifugation (5000 rpm/10 min) angesammelt und in einem Lysispuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 2 mg/ml Lysozym) re­ suspendiert und 15 Minuten lang auf Eis inkubiert. Die Ly­ sate wurden dann in zwei 30 Sekunden-Zyklen beschallt und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde in einem Waschpuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 1 mM DTT, 0,5% Triton X-100) resuspendiert und zentrifugiert.

Phase 6

Folgend auf eine weitere Runde von Resuspension und Zentri­ fugation wurde das endgültige Pellet in Wasser resuspen­ diert. Ein SDS-PAGE wurde dann durchgeführt, das Antigen wurde durch Elektroelution gereinigt und bei Temperaturen, welche von -70°C bis -200°C reichen, bis zur Verwendung ge­ lagert.

Fig. 1 zeigt den Reinheitsgrad von rSm14 und die große Ef­ fizienz der Expression.

Analyse von Polyacrylamidgel-Elektrophorese von vollständi­ gen S. mansoni SE-Antigenen und gereinigtem Sm14, welche auf Nitrocellulosepapier übertragen wurden. Bahnen 1 und 3, SE und Sm14, aufgelöst in 10 bzw. 15% SDS-PAGE, gefärbt mit C-Blau. Bahnen 2 und 4 zeigen einen Immunblot. Bahn 2 wurde mit polyklonalem Antiserum aus einem Kaninchen, welches mit SE immunisiert war, getestet. Bahn 4, Kaninchen-anti-Sm14- Fusionsprotein-Antiserum. Standardmarker für niedriges Mo­ lekulargewicht sind auf beiden Seiten der Figur gezeigt.

Die folgende Erläuterung zu Fig. 2 betrifft die dreidimen­ sionale Struktur von Sm14.

Das Computer-Modelling der Struktur von Sm14 gemäß der vor­ liegenden Erfindung ergibt sich auf der Grundlage der be­ kannten hohen Homologie von Sm14 mit Proteinen, für welche die Kristallstruktur schon bestimmt wurde. Dieses führt zu einer detaillierten und verläßlichen dreidimensionalen Struktur von Sm14, welches durch Computer-Modelling model­ liert werden kann.

Die dreidimensionale Struktur lehrt, daß: (1) Sm14 ein faß­ förmiges Protein ist; (2) die Fettsäure innerhalb des Fas­ ses bindet; (3) das Faß durch zehn Betafaltblätter gebildet wird; (4) die Faltblätter durch kurze Schleifen verbunden sind; (5) die Schleifen eine Divergenz zwischen Mitgliedern der Familie von fettsäurebindenden Proteinen zeigen und verantwortlich für die antigenen Eigenschaften von Sm14 sind.

Beispiel 2

Beispiel 2 umfaßt Experimente 1 bis 4. Die Protokolle der Experimente 1 bis 4 wurden wie unten beschrieben durchge­ führt, und sie zeigen die schützende Aktivität von SE und rSm14 in Schweizer Mäusen.

Die Immunisierungsprotokolle mit SE (300 µg/ml pro Do­ sis/Tier) und rSm14-Fusionsprotein (10 µg/ml/Dosis) wurden mit dem folgenden Immunisierungsprotokoll durchgeführt, welches aus zwei Dosen von Antigenen, mit oder ohne Freund′s Adjuvans besteht, welche juvenilen Mäusen in In­ tervallen von sieben Tagen durch subkutane Injektion verab­ reicht wurden, gefolgt von einer Verstärkungsdosis 21 Tage nach der zweiten Dosis. Die Intervalle zwischen den Anwen­ dungen der Impfdosen können variiert werden. Nach einem In­ tervall von 60 Tagen (welches ebenfalls variiert werden kann, z. B. 45 Tage) wurden die Tiere mit 100 Zerkarien pro­ voziert.

Der Gesamtschutz für jede Gruppe von Tieren (immunisierte/provozierte Tiere und entsprechende Kontrol­ len) wurde wie folgt berechnet:

(C-V)/C × 100,

wobei C = Parasiten, die in den Kontrollen gefunden wurden; und V = Parasiten, die in den geimpften Tieren gefunden wurden.

Die Ergebnisse sind in Tab. I gezeigt.

Verschiedene Kontrollgruppen, welche durch im Geschlecht und Alter abgestimmte SW-Mäuse charakterisiert, und gleich­ zeitig mit derselben Anzahl und Pool von S. mansoni Zerka­ rien provoziert waren, wurden als Infektionskontrollen für jedes einzelne Experiment benutzt. Diese Tiere empfingen nur parallele Injektionen von PBS (phosphatgepufferter Salzlösung). Zusätzliche Kontrollgruppen für das Fusions­ protein (Gen 10) und das Adjuvans (Freund′s komplettes Ad­ juvans) wurden ebenfalls eingeschlossen.

In Experiment 1 wurde die schützende Aktivität von Sm14 mit oder ohne Adjuvans (FCA) parallel zu der Aktivität von Gen- 10-Protein analysiert, wie man in Tab. II sehen kann. Die mittleren Wurmbelastungen, welche aus Mäusen, die mit ge­ reinigtem Gen-10-Protein, mit oder ohne FCA, geimpft waren, erhalten wurden, waren faktisch dieselben wie die Wurmbe­ lastung, welche bei Tieren der PBS-Kontrollgruppe gefunden wurde.

In Experiment 2 wurde die durch rSm14 und rSm14 mit FCA in­ duzierte schützende Aktivität getestet, im Vergleich zur Impfung mit SE (mit oder ohne FCA).

Experimente 3 und 4 wurden geplant, um die Aktivität von FCA alleine zu testen und die Reproduzierbarkeit der durch Impfung mit rSm14 induzierten schützenden Aktivität.

In allen Experimenten ist die hohe Kapazität von rSm14, um signifikant hohe Grade von Immunschutz gegen weitere Provo­ kationsinfektionen von Mäusen mit S. mansoni zu induzieren, schlüssig gezeigt.

Die statistische Analyse der präsentierten Daten zeigt, daß die Wurmbelastung, welche bei den geimpften Gruppen gefun­ den wurde, signifikant niedriger ist (p<0,05) als die mitt­ lere Anzahl von Parasiten, welche in nichtgeimpften infi­ zierten Tieren gefunden wurde.

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt eine schützende Aktivität von SE und rSm14 in Kaninchen.

Die Immunisierungsprotokolle sind dieselben wie jene, die bei den Schweizer Mäusen in Beispiel 2 benutzt wurden. Die Mengen der Dosis/Tiere sind in Tab. II gezeigt. Die Kanin­ chen wurden mit 1000 Zerkarien (anstelle von 100 wie in Beispiel 2) provoziert.

Tab. II zeigt die Kapazität von rSm14 signifikant hohe Grade von Immunschutz gegen Provokationsinfektion von Ka­ ninchen mit S. mansoni zu induzieren.

Weiterhin macht dieses Beispiel die Aktivität von rSm14 als einem isolierten Antigen im Vergleich mit der SE-Mischung deutlich.

Die Ergebnisse sind in Tab. II gezeigt.

Beispiel 4

Dieses Beispiel zeigt Experimente 1 bis 4 von Beispiel 2 (was heißt, daß dieselben Immunisierungsprotokolle benutzt wurden), aber mit einer unterschiedlichen Methodik, um den Schutz auszuwerten.

Diese Methodik beruht auf der Bildung einer impfstoffindu­ zierten Resistenz mittels einer Populationsanalyse von Wurmbelastungshäufigkeiten durch die Verteilung von Wurmbe­ lastungen in einer Reihe von Parasitenbereichen.

Die Ergebnisse sind in Tab. III gezeigt.

Gemäß Tab. III stimuliert gereinigtes rekombinantes Sm14 Fusionsprotein einen Grad an Schutz, der nicht signifikant verschieden war von dem des vollständigen SE, nach den mittleren Graden von Wurmbelastung (Tab. I) beurteilt. Die Schutzgrade, welche mit SE erreicht wurden, stimmen mit den früher veröffentlichten Ergebnissen überein. Von besonderem Interesse ist die Tatsache, daß ein ähnlicher Schutzgrad mit oder ohne Adjuvans erreicht wird, was Gutes verspricht für die Verwendung des Antigens im Menschen. Zusätzlich zeigt die Tatsache, daß wir erfolgreich Gruppen von nicht­ verwandten Schweizer Mäusen mit dem Antigen schützten, daß eine genetische Restriktion des Immunsystems nicht zu gro­ ßen Änderungen der Schutzantwort führt.

Wie man in Tab. III sehen kann, wurden vollständig ver­ schiedene Muster von Wurmbelastungsverteilung in den ge­ impften gegenüber den nichtgeimpften Gruppen beobachtet.

Besonders auffällig ist der Unterschied in der Anzahl von Mäusen in der Gruppe mit 0 bis 10 Würmern. Gefolgt auf eine Provokationsinfektion von 100 Zerkarien/Maus hatte keine der nicht geimpften Mäuse Infektionsgrade in diesem Bereich und der Häufigkeitspeak (60%) für infizierte (nicht geimpf­ te) Tiere lag im Bereich von 21 bis 30 Würmern. Im Gegen­ satz dazu war der Häufigkeitspeak (64,5%) für entweder mit SE oder rSm14 geimpfte Mäuse in dem Bereich von 0 bis 10 Würmern/Maus.

Wie man gemäß der vorliegenden Erfindung sehen kann, ist es von besonderem Interesse, daß im wesentlichen der gesamte Schutzeffekt der komplexen SE-Mischung mit diesem einzelnen Antigen reproduziert werden kann. Versuche mit anderen de­ finierten Antigenen, welche aus SE abgeleitet waren (Glutathion-S-Transferase und Paramyosin) führten nicht zu demselben hohen Schutzgrad. Wie oben erwähnt, hat Sm14 ebenfalls einen hohen Grad an Homologie mit verschiedenen fettsäurebindenden Proteinen.

Die Ergebnisse, welche in Tab. III von den Experimenten 1 bis 4 gezeigt sind, sind grafisch in den Fig. 3 bis 6 dargestellt.

Fig. 3 bis 6 beziehen sich auf Experimente 1 bis 4. In diesen Figuren ist es möglich, den Schutz durch die Analyse der Populationsprofile an Wurmbelastungen von geimpften ge­ genüber nicht geimpften Gruppen auszuwerten.

Fig. 7 zeigt die gesammelten Ergebnisse.

Beispiel 5

In diesem Beispiel wurden geimpfte Mäuse mit 500 und 1000 Zerkarien/Tier provoziert oder 2 oder 3 Male (100 Zerka­ rien/Tier/Infektion) mit einem einwöchigen Intervall dazwi­ schen provoziert. Wie man bemerken kann, ist die Größe und Anzahl von Provokationsinfektionen geändert.

Der Schutz, welcher durch drei 10 µg-Dosen an injiziertem Protein (rSm14) induziert wurde, bleibt höher als 50% ge­ genüber einer einzelnen Provokationsinfektion mit 500 oder 1000 Zerkarien/Tier. Die gleiche Wirkung wird beobachtet, wenn die Provokationsinfektion mit 100 Zerkarien/Tier zwei- oder dreimal wiederholt wird, wobei ein einwöchiges Inter­ vall zwischen diesen eingehalten wird.

Die Daten von Beispiel 5 sind in den Tabellen IV bzw. V zu­ sammengefaßt.

Beispiel 6

Um die Reaktivität von Seren aus Schistosomiasis-Patienten gegenüber fettsäurebindendem Protein aus Schistosoma man­ soni-rSm14 zu demonstrieren, wird das Beispiel wie folgt durchgeführt.

Die Seren von menschlichen Patienten aus einem brasiliani­ schen endemischen Gebiet und Seren von jungen Männern, wel­ che außerhalb der endemischen Region leben, werden durch Immunblotting gegen das rekombinante Sm14 Antigen getestet. Die Patienten werden nach klinischem Verlauf der Erkrankung und Eizählungen in Gruppen klassifiziert. Eine parasitolo­ gische Diagnose wird durch die Kato-Katz-Methode erreicht.

Die Ergebnisse zeigen, daß Seren aus allen infizierten In­ dividuen rSm14 beim Immunoblotting erkannten, unabhängig von Alter, Wurmbelastung oder klinischer Form, was somit die Immunogenität von rSm14 widerspiegelt.

Beispiel 7

Dieses Beispiel zeigt die Impfung von Schweizer Mäusen mit rSm14 gegen eine Infektion mit Fasciola hepatica und den erreichten vollständigen Schutz gegen Fasciolosis.

Beispiel 7 wurde wie folgt durchgeführt.

Zwei Gruppen mit 15 Mäusen wurden mit rSm14 mit oder ohne Adjuvans immunisiert. Das Impfprotokoll ist: (a) zwei wö­ chentliche Injektionen mit Antigen (10 µg/Dosis/Tier rSm14) in FCA (Adjuvans) emulgiert oder nicht; (b) Anwenden einer neuen Dosis von Injektionen von Antigen drei Wochen später; (c) 45 Tage nach der dritten Dosis wurden diese mit drei Fasciola hepatica Metazerkarien provoziert und 30 Tage nach der Infektion getötet.

Dieses Beispiel zeigt kreuzreagierende Schutzantigene zwi­ schen verschiedenen Helminthen, wie Schistosomen und Fasciola hepatica.

Es wurde vor kurzem berichtet, daß ein Antigen mit dem Na­ men FSh15, welches aus dem verwandten Parasiten, dem Leber­ saugwurm Fasciola hepatica kloniert war, einen signifikan­ ten Grad an Homologie mit Sm14 auf der Basis der vorherge­ sagten Aminosäuresequenz hat und vorliegende Ergebnisse zeigen, daß Sm14 das Homologe dieses Proteins in Fasciola hepatica ist.

Rekombinantes Sm14 wurde somit als ein Impfantigen gegen Fasciola hepatica-Infektion, wie in diesem Beispiel be­ schrieben, getestet.

Verweise auf Fig. 9, 10 und 11 werden folgen, welche die Leber von nicht geimpften (Fig. 9 und 10) gegenüber geimpf­ ten Tieren (Fig. 11) zeigen.

Nach dem parasitologischen Test, um die Infektion durch Fasciola hepatica der mit rSm14 geimpften und nicht-geimpf­ ten (Kontroll-) Tiere auszuwerten, welche derselben Infek­ tion mit drei Metazerkarien/Maus unterworfen wurden, wurden die Leber, Därme und andere Organe durch klassische histo­ logische Verfahren untersucht, um die Pathologie auszuwer­ ten, welche sich in den Tieren der zwei Gruppen entwic­ kelte. Es sollte herausgestellt werden, daß hauptsächlich die Leber und die Därme die durch Fasciola hepatica am mei­ sten betroffenen Organe sind und daher wurden diese einge­ hend untersucht.

Somit wurden 30 Tage nach der oralen Infektion durch die klassische Methode mit drei Metazerkarien von Fasciola he­ patica pro Maus die Tiere getötet, um eine Auswertung der Infektionsbelastung, welche in der Gegenwart der vorherge­ henden Impfung mit rSm14, verglichen mit den nicht-geimpf­ ten Tieren, erworben wurde, zu erhalten. Die Organe wurden in Milloning-Lösung fixiert, geschnitten, durch die Hämatoxylin-Eosin-Technik gefärbt und unter dem Lichtmikro­ skop untersucht.

Es wird schlüssig auf der Grundlage von parasitologischen und anatomisch-pathologischen Daten durch die Fig. 8, 9, 10 und 11 gezeigt, daß rSm14 in der Lage ist, einen Schutz gegen Fasciola hepatica-Infektion zu bewirken. Von den mit rSm14 geimpften Tieren erwarb praktisch kein Individuum, nach einem Aussetzen an drei (maximale Dosis, die für Mäuse erlaubt ist) Metazerkarien von Fasciola hepatica die Infek­ tion. Demgegenüber wurden alle nicht-geimpften Kontroll­ tiere nach demselben Aussetzen infiziert.

Aus anatomisch-pathologischem Gesichtspunkt zeigte das Le­ berparenchym aller Individuen, welche mit rSm14 geimpft wurden, keine Änderungen, welche mit der Fasciola hepatica- Infektion zusammenhingen, außer kleinen fibrotischen Berei­ chen in der Gegend der Glisson-Kapsel. Dieser Befund zeigt, daß die provozierenden Parasiten durch Wirkung der Impfung in einem sehr frühen Stadium ihres Lebenszyklus, in dem Wirbeltierwirt getötet wurden. Im Gegensatz dazu zeigten alle nicht-geimpften/infizierten Tiere ausgedehnte Bereiche der Zerstörung von Hepatozyten mit ernsten hemorragischen Bereichen, welche sich bis zur Glisson-Kapsel ausdehnten.

Wie man in den Fig. 9 und 10 sehen kann, wurde eine weitgehende Zerstörung des Parenchyms zusammen mit der Ge­ genwart von adulten Parasiten in mehreren Individuen be­ obachtet.

Tabelle I

Schutzaktivität von SE und rSm14 bei Schweizer Mäusen

Tabelle II

Schutzaktivität von SE und rSm14 bei Kaninchen (Neuseeländer)

Tabelle III

Schutzaktivität von rSm14 bei nicht verwandten (outbred) Mäusen

Diskretisierung (discrition) der Wurmbelastungshäufigkeiten

Experiment 1

Experiment 2

Experiment 3

Experiment 4

Claims (24)

1. Sm14-Protein bzw. Impfstoff, wobei das Protein ein Molekulargewicht zwischen 14 und 15 kDa aufweist, aus Schistosoma mansoni erhältlich ist und die folgende Aminosäuresequenz aufweist:
MET-SER-SER- PHE-LEU-GLY-LYS-TRP-LYS-LEU-SER-GLU-SER-MIS-ASN- PHE-ASP-ALA-VAL-MET-SER-LYS-LEU-GLY-VAL-SER-TRP- ALA-THR-ARG-GLN-GLE-GLY-ASN-THR-VAL-TMR-PRO-THR- VAL-THR-PHE-THR-MET-ASP-GLY-ASP-LYS-MET-THR- MET-LEU-THR-GLU-SER-THR-PHE-LYS-ASN-LEU-SER-CYS- THR-PHE-LYS-PHE-GLY-GLU-GLU-PHE-ASP-GLU-LYS-THR- SER-ASP-GLY-ARG-ASN-VAL-LYS-SER-VAL-VAL-GLU-LYS- ASN-SER-GLU-SER-LYS-LEU-THR-GLN-THR-GLN-VAL-ASP- PRO-LYS-ASN-THR-THR-VAL-ILE-VAL-ARG-GLU-VAL-ASP- GLY-ASP-THR-MET-LYS-THR-THR-VAL-THR-VAL-GLY- ASP-VAL-THR-ALA-ILE-ARG-ASN-TYR-LYS-ARG-LEU-SER;
wobei das Protein in der Lage ist, Fettsäuren zu binden, und Labortieren einen bis zu 100%-igen Immunschutz gegen Wurminfektionen zu verleihen, wobei der Immunschutz durch Impfung mit bis zu drei Dosen von 10 µg oder weniger des Proteins in nativer, rekombinanter oder synthetischer Form bei Vorliegen oder Abwesenheit eines Adjuvans erhältlich ist.

2. Sm14 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Sm14 durch eine Peptidkette gebildet wird, welche in 10 Beta Faltblattstrukturen, die durch kurze Schleifen, wie in Fig. 2 gezeigt, gefaltet sind.

3. Sm14 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Immunschutz gegenüber Schistosoma mansoni von bis zu ca. 67,9% bei Nachkommen aus der Kreuzung entfernter Verwandter von schweizer Mäusen (outbred Swiss mice) verleiht, erhältlich durch Impfung mit drei Dosen von 10 µg oder weniger des Proteins in nativer, rekombinanter oder synthetischer Form bei Abwesenheit von Adjuvans.

4. Sm14 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Immunschutz gegenüber Schistosoma mansoni von bis zu ca. 72,1% bei Nachkommen aus der Kreuzung entfernter Ver­ wandter von schweizer Mäusen (outbred Swiss mice) verleiht, erhältlich durch Impfung mit drei Dosen von 1 µg oder weniger des Proteins in nativer, rekombinanter oder synthetischer Form bei Vorliegen von Freundschem kompletten Adjuvans.

5. Sm14 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Immunschutz gegenüber Schistosoma mansoni von bis zu ca. 89% in Neuseeländer-Kaninchen verleiht, erhältlich durch Impfung mit drei Dosen von 80 µg oder weniger des Proteins in nativer, rekombinanter oder synthetischer Form in Gegenwart von Freundschem kompletten Adjuvans.

6. Sm14 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es einen Immunschutz gegenüber Fasciola hepatica von bis zu 100% in Nachkommen aus der Kreuzung entfernter Verwandter von schweizer Mäusen (outbred Swiss mice) verleiht, erhältlich durch Impfung mit drei Dosen von 10 µg oder weniger des Proteins in nativer, rekombinanter oder synthetischer Form in Abwesenheit von Adjuvans.

7. rSm14, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Fusionspro­ tein zwischen den ersten 260 Aminosäuren des Bakteriophagen T7 Capsidproteins und des vollständigen Sm14 Polypeptids, wie in Anspruch 1 definiert, ist, erhältlich durch Verknüpfung zwischen dem 260ten Rest des T7 Proteins und dem Startmethionin (MET) des Sm14 mit der folgenden Aminosäuresequenz:
Capsidproteinrest 260 LEU-LEU-THR-LEU-THR-LYS-GLY-LYS- ALA-LYS-SER-ALA-GLU-LEU-GLU-PHE-VAL-ASP-LEU-GLU- GLY-SER-VAL-Sm14.

8. rSm14 nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das T7 Protein durch ein anderes Protein ersetzt ist.

9. rSm14 nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Expression in Mikroorganismen und geeigneter Reinigung erhältlich ist.

10. rSm14 nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Expression in Escherichia coli erhältlich ist.

11. rSm14 nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorreinigung des exprimierten Fusionsproteins durch Beschallung, wiederholte Lyse und Zentrifugation erreicht wird und Endreinigung durch Elektroelution aus SDS-PAGE-Gelen durchgeführt wird.

12. rSm14 nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es erhältlich ist durch chemische Synthese der vollständigen Polypeptidkette oder eines Teils davon.

13. Verwendung von Sm14, gemäß Anspruch 1 als Impfstoff gegen von Würmern verursachte Erkrankungen.

14. Verwendung von Sm14 gemäß Anspruch 1 als Impfstoff ge­ gen die von Fasciola hepatica verursachten Erkrankungen.

15. Verwendung von Sm14 gemäß Anspruch 1 als Impfstoff ge­ gen die von Schistosomen verursachten Erkrankungen.

16. Verwendung von Sm14 gemäß Anspruch 1 als Impfstoff ge­ gen die von Schistosoma mansoni verursachten Erkrankungen.

17. Verwendung von rSm14 gemäß Anspruch 7 oder 8 als Impf­ stoff gegen die von Würmern verursachten Erkrankungen.

18. Verwendung von rSm14 gemäß Anspruch 7 oder 8 als Impf­ stoff gegen die von Fasciola hepatica verursachten Erkran­ kungen.

19. Verwendung von rSm14 gemäß Anspruch 7 oder 8 als Impf­ stoff gegen die von Schistosomen verursachten Erkrankungen.

20. Verwendung von rSm14 gemäß Anspruch 7 oder 8 als Impf­ stoff gegen die von Schistosoma mansoni verursachten Er­ krankungen.

21. Verwendung von rekombinanten Fusionsproteinen, insbe­ sondere von solchen, wie Anspruch 6 definiert, worin Sm14 durch ein anderes Protein ersetzt ist, als Human- und Vete­ rinärimpfstoff.

22. Verwendung von Sm14 gemäß Anspruch 1 als ein diagno­ stisches Mittel zur Diagnose von Schistosomiasis und Fascioliasis.

23. Verwendung von rSm14, wie in Anspruch 7 oder 8 defi­ niert, als ein Reagenz zur Diagnose für Schistosomiasis und Fascioliasis.

24. Ein Verfahren zum Anwenden eines tierischen Impfstoffs beim Menschen, welches die folgenden Schritte umfaßt:
Bewirken der Isolierung eines allgemeinen kreuzreagie­ renden Antigens, welches Schutz gegen eine Erkrankung von Tieren und Menschen verleiht;
Testen des Antigens als ein Impfstoff für die Immunpro­ phylaxe der Erkrankung von Tieren in dem tierischen Wirt auf den Parasiten, der die Infektion und/oder die Erkrankung bewirkt;
Analysieren der Information, welche durch Impfung aus dem tierischen Wirt abgeleitet ist; und
Fokussieren sämtlicher damit in Beziehung stehender Fragen und Voraussetzungen auf die Anwendung des tieri­ schen Impfstoffes gegen die Humanerkrankung.