DE3402492A1 - Antigene parasitischer wuermer sowie ihre herstellung und verwendung - Google Patents
Antigene parasitischer wuermer sowie ihre herstellung und verwendungInfo
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Description
Dr. Kenneth K. Lew Brookline, Massachusetts o2146 V.St.A.
Antigene parasitischer Würmer sowie ihre Herstellung und Verwendung
Die Erfindung betrifft Antigene von Helminthen (parasitischen Würmern), ihre technische Herstellung
sowie ihre Verwendung für Diagnostika bzw Impfstoffe.
Die Verwendung von Antigenen für Diagnostika und Impfstoffe zur Feststellung bzw Verhütung von Infektionskrankheiten
wie Poliomyelitis, Pocken, Diphtherie, Tetanus sowie etwa Maul- und Klauenseuche in der Humanwie
auch in der Veterinärmedizin ist bereits bekannt. Die meisten als Diagnostika und Impfstoffe verwendeten
Antigene leiten sich dabei von durch Kultivierung erzeugten infektiösen Organismen ab. Derartige infektiöse
Organismen werden in vitro oder in vivo in tierischen Organismen oder in Gewebekulturen kultiviert. Ein Beispiel
hierfür ist die Herstellung von Polio-Antigenen, die sich von in vitro in Affennierenzellen kultivierten
Viren ableiten. Diese Antigene werden als Diagnostika sowie für Impfzwecke in der Humanmedizin verwendet.
065-Ser. 399.718-SF-Bk
Wenn ein Wirts-Organismus mit einer kleinen Menge eines abgeschwächten Virus geimpft wird, induzieren
die eingeimpften Viren, die spezifische Antigene tragen, die Antikörperbildung im Wirts-Organismus, der
zukünftig eingedrungene Polioviren erkennt und zerstört. Die gleichen Poliovirus-Antigene können auch
zur Diagnose von Polioinfektionen herangezogen werden. Wenn ein Wirts-Organismus mit Poliomyelitis
infiziert ist, führt dies zur Bildung spezifischer Antikörper im Organismus, wobei das Vorliegen dieser
Antikörper ein Indiz für eine Infektion darstellt. Die Feststellung von Antikörpern kann durch Tests
auf Bindung an Polio-Antigene durch Standard-Testverfahren wie Immunfluoreszenz, Radioäimmunoassay,
Immunoassay mit Enzymmarkierung, Immunelektrophorese, Hämagglutinintest sowie Immundiffusion udgl vorgenommen
werden.
Es ist allerdings nicht möglich, für sämtliche Infektionskrankheiten Antigene technisch herzustellen.
Eine diesbezügliche Begrenzung liegt in der Unmöglichkeit, infektiöse Organismen, von denen sich die entsprechenden
Antigene ableiten, in vivo oder in vitro in großen Mengen zu kultivieren. Dies gilt insbesondere
für Impfstoffe, bei deren Herstellung infektiöse Organismen herangezogen werden müssen, die komplizierte Lebenszyklen
aufweisen und/oder mehr als einai Wirts-Organismus besitzen. In diese Kategorie fallen die meisten Erkrankungen
durch parasitische Würmer, die Hunde, Katzen, Schafe, Schweine, Pferde und auch Menschen befallen.
Ein Beispiel hierfür sind die Dirofilariosen, die als Infektionskrankheiten zahlreiche Tiere wie
etwa Hunde, Katzen und Seehunde, sowie, jedoch selten,
auch Menschen befallen. Der Parasit lebt allerdings im allgemeinen in Hunden als Wirts-Organismen, wobei das
Moskito den Zwischenwirt darstellt. In diesem Fall trifft es auf große Schwierigkeiten, die zur Herstellung
von Diagnostika und Impfstoffen erforderlichen Antigene zu gewinnen, da der parasitische Wurm verschiedene
Stufen der Larvenentwicklung durchmacht und lediglich eine Larvenstufe die geeigneten Antigene
enthält. Im Fall der Dirofilarien befinden sich in dieser speziellen Entwicklungsstufe die infektiösen
Larven in Moskitos. Unter diesen Umständen müssen entsprechend zur Erzeugung der zur Herstellung entsprechender
Impfstoffe benötigten Antigene die als Zwischenwirte dienenden Moskitos eingefangen und
ihre infektiösen Larven durch Sektion zerlegt werden (vgl M.M. Wong, M.F. Guest und M.J. Laviopierre,
Dirofilaria immitis, Fate and Immunogenicity of Irradiated Infective Stage Larvae in Beagles,
Experimental Parasitology 3_5 (1974) 65-74). In ähnlicher Weise müssen zur Diagnose von Dirofilaria-Antikörpern
zur Feststellung entsprechender Infektionen benötigte Antigene aus ausgewachsenen Dirofilarien
gewonnen werden, die sich im Herz infizierter Hunde finden (vgl R.S. Desowitz und S.R. Una, The Detection
of Antibodies in Human and Animal Filariosis by Counter-immunoelectrophoresis with Dirofilaria
immitis Antigen, Journal of Helminthology 5JD (1976)
53-57; R.B. Grieve, M. Mika-Johnson, R.H. Jacobson und CH. Raymond, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
for Measurement of Antibody Response to Dirofilaria immitis in Experimentally Infected Dogs, American
Journal of Veterinary Research 4_2 (1981) 66-69). Diese Quellen und Verfahren zur Erzeugung von
Dirofilaria-Antigenen für Diagnostika (aus Hundeherzen)
und Impfstoffen (aus Moskitos) sind weder für die technische Auswertung geeignet noch in sozialer Hinsicht
akzeptabel.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Antigene parasitischer Würmer, Verfahren zu ihrer Herstellung sowie
ihre Verwendung für Diagnostika bzw Impfstoffe anzugeben.
Die Aufgabe wird anspruchsgemäß gelöst.
Vorteilhafte Weiterbildungen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Das Erfindungskonzept der Herstellung von Antigenen parasitischer Würmer beruht wesentlich darauf,
daß eine mit dem infektiösen Wurm verwandte Species, die leicht kultivierbar ist, genetisch modifiziert wird.
Bei diesem Verfahren werden die Oberflächenantigene des schwierig zu kultivierenden parasitischen Wurms
identifiziert, worauf die gleichen Antigene in der leicht kultivierbaren Species erzeugt werden.
Die leicht kultivierbare Species wird durch Mutationen genetisch verändert, bis sie einige Antigene
aufweist, die immunologisch gleichartig mit den Antigenen des schwierig zu kultivierenden parasitischen
Wurms sind. Durch diese genetischen Manipulationen werden Art und Mengen der interessierenden Antigene
bei der leicht kultivierbaren Species geändert. Die von der genetisch veränderten Species abgeleiteten
Antigene werden dann zur technischen Herstellung von Antigenen herangezogen, die zur Herstellung von Diagnostika
und Impfstoffen erforderlich sind.
Aufgrund des Erfindungskonzepts werden die Antigen-Gene
der leicht kultivierbaren Species geändert, so daß sie^orzugsweise in sitUjAntigene der schwer zu kultivierenden
parasitischen Species erzeugen. Die Expression dieser veränderten Gene zur Produktion dieser Antigene
kann auch in Bakterien oder Hefen unter Clonierung der Antigen-Gene erfolgen, was gegebenenfalls eine noch
effizientere Produktion dieser gleichen Antigene erlaubt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform werden Antigene von Dirofilaria immitis erzeugt, wobei als
verwandte Species der freilebende hermaphroditische Nematode Caenorhabditis elegans eingesetzt wird.
Das Erfindungskonzept wird im folgenden anhand
von Beispielen näher erläutert.
Erzeugung von Antikörpern gegen Antigene von Dirofilaria immitis
Zunächst müssen Antikörper gegen die interessierenden Parasiten-Antigene erzeugt werden. Diese Antikörper,
die spezifisch die Antigene des schwer zu kultivierenden Parasiten erkennen und Bindungen mit ihnen eingehen,
können dann zur Isolierung von Mutanten der leicht kultivierbaren Species herangezogen werden, die zur Erzeugung
der entsprechenden Parasiten-Antigene befähigt s ind.
Die folgenden Beispiele beziehen sich auf die Herstellung von Antikörpern gegen Antigene ausgewachsener
Dirofilarien und isolierter Mutanten von Caenorhabditis elegans mit den entsprechenden Dirofilaria-Antigenen.
Obgleich sich die beispielhaften Angaben auf C.elegans beziehen, können im Rahmen der Erfindung auch andere
Species herangezogen werden, zu denen insbesondere Panagrellas redivious, Turbatric acetic und C. briggsae
gehören.
Ausgewachsene Dirofilarien wurden von einem mit Dirofilariose infizierten Wurm isoliert. Die ausgewachsenen
Dirofilarien wurden aus dem Herz ausgeschnitten und in mit 0,15 m Phosphatpuffer gepufferter Salzlösung
von pH 7,4 (PBS) suspendiert. Die Dirofilarien wurden dann homogenisiert; das Homogenisat wurde auf
eine Endkonzentration von 500 μg Protein (Feuchtgewicht) pro ml PBS eingestellt. Dieses Homogenisat
wurde anschließend mit dem gleichen Volumen an vollständigem Freund'sehen Adjuvans gemischt. Eine Probe
von 2 ml dieses Gemischs wurde zur Immunisierung eines Kaninchens gegen Dirofilaria-Antigene verwendet. Vor
der jeweiligen Immunisierung wurde dem Kaninchen eine Vorimmunisierungs-Serumprobe entnommen. Das Kaninchen
wurde dann 25 und 35 d nach der ersten Immunisierung mit 2 ml eines Gemischs gleicher Volumina des Homogenisats
und von unvollständigem Freund'sehen Adjuvans geimpft. Nach einem positiven Bluttest am 45. Tag wurde
das Serum gewonnen und zum Test auf Bildung von Antikörpern gegen Dirofilaria-Antigene verwendet, die zur
Immunisierung herangezogen worden waren.
Test eines Serums mit Gehalt an Anti-Dirofilaria-Antikörpern
Das Serum des mit Dirofilaria-Antigenen immunisierten
Kaninchens wurde auf Antikörperaktivität gegen Dirofilaria-Antigene und Antigene von C. elegans
getestet. Ein bevorzugtes Verfahren hierfür besteht im Immunfluoreszenz-Test des fluorescein- oder rhodaminkonjugierten
Anti-Kaninchen-IgG von Ziegen. Andere Verfahren wie etwa Immunoassay mit Enzymlabel, Radioimmunoassay,
Hämagglutinintest und Immundiffusion können ebenfalls herangezogen werden. Die Antigene
enthaltende Stücke von Dirofilariagewebe aus Hunden wurden dreimal mit PBS gewaschen und dann mit den
Kaninchenantikörpern gegen Dirofilaria bei Raumtemperatur 30 min inkubiert, worauf die Gewebestücke zur
Entfernung der Kaninchen-Antikörper gegen Dirofilaria dreimal mit PBS gewaschen wurden. Anschließend wurden
die Gewebestücke mit fluoresceinmarkierten Antikaninchen-IgG-Antikörpern
von Ziegen inkubiert. Nach der Inkubation wurden die freien Antikaninchen-IgG-Antikörper
von Ziegen durch dreimaliges Waschen des Dirofilariagewebes mit PBS entfernt. Das Vorliegen
von Kaninchen-Antikörperaktivitäten zur Bindung spezifischer Dirofilaria-Antigene wurde aufgrund der
Bindung der fluoreszenzmarkierten Antikaninchen-IgG-Antikörper
von Ziegen nachgewiesen, die in einem Fluoreszenzmikroskop untersucht wurden und eine
rote (Rhodamin) bzw grüne Fluoreszenzfarbe (Fluorescein)
ergaben.
Zum Test von mit dem Serum des immunisierten Kaninchens
erzeugten Anti-Dirofilaria-Antikörpern wurde auch C. elegans in Form ganzer Organismen als auch in
Form von Gewebestücken herangezogen. Die Ergebnisse der Fluoreszenztests auf Anti-Dirofilaria-Aktivität
sind in Tabelle I zusammengestellt.
Das zu Kontrollzwecken dienende Vorimmunisierungs-Serum
besaß weder gegenüber Dirofilariagewebe noch
gegenüber Gewebe von C. elegans Aktivität. Im Gegensatz dazu wurde Antikörperaktivität im Serum des immunisierten
Kaninchens gegen Dirofilariagewebe, nicht jedoch gegen C. elegans, festgestellt. Dementsprechend ist
die Erzeugung von Antikörpern gegen Dirofilaria-Antigene lediglich für Dirofilaria, jedoch nicht für C. elegans
spezifisch. Dieses spezifisch erscheinende Serum wurde als Testmaterial zur Isolierung von Mutanten von
C. elegans herangezogen, die erfindungsgemäß den
Dirofilaria-Antigenen entsprechende Antigene tragen.
Antikörperaktivität des Serums eines mit Dirofilaria-Antigenen immunisierten Kaninchens
| Titer | Immunserum | Gewebe von | Vorimmunisierungs-Serum | Gewebe von |
| Dirofilaria- | C. elegans | Dirofilaria- | C. elegans | |
| Gewebe | - | Gewebe | - | |
| 1 :5 | + | - | - | - |
| 1 :20 | + | - | - | - |
| 1 :40 | + | - | - | - |
| 1 :80 | + | - | - | - |
| 1 :1 60 | + | - |
+ = Fluoreszenzaktivität
- = keine Fluoreszenzaktivität
Mutationsauslösung bei C. elegans zur Erzeugung von
Mutanten mit geänderten Antigenen, die Dirofilaria-Antigenen entsprechen
Hierfür eignet sich der freilebende Bodennematode
C. elegans besonders günstig, da er leicht in großen Mengen kultiviert werden kann und homozygote
rezessive Mutationen erzeugt werden können (vgl S. Brenner, The Genetics of Caenorhabditis elegans,
Genetics 77 (1974) 71-94). Dieser Umstand beruht auf der hermaphroditischen Natur dieses Organismus, der
selbstbefruchtend ist. Eine bei diesem Organismus induzierte Mutation nach Selbstbefruchtung über
zwei Generationen führt zu einer homozygoten Mutation.
Junge Larven von C. elegans im ersten und zweiten
Larvenstadium ihrer Entwicklung wurden Ethylmethylsulfonat als Mutagen ausgesetzt. Zu diesem Zweck können
auch andere Mutagene wie Methylmethansulfonat, Acridinorange, Nitrosoguanidin sowie etwa Hydroxynitrosamin
herangezogen werden (vgl. J. W. Drake und R. H. Baltz, The Biochemistry of Mutagenesis,
Annual Review of Biochemistry £5_ (1976) 11). Danach
erfolgten die Selbstbefruchtung sowie die Eiablage. Die F.-Generation dieser Mutagenisierung wurde sich
vermehren gelassen; die F^-Generation wurde dann einem Screening-Schritt zur Erfassung solcher
Organismen unterzogen, deren Antigene an gegen spezifische Dirofilaria-Antigene hergestellte Antikörper gebunden
werden. Da im Fall des Wildtyps C. elegans keine Bindung an Antikörper gegen Dirofilaria-Antigene
eintritt, die im obigen Kaninchen-Dirofilaria-Antiserum
erzeugt wurden (vgl Tabelle I), wurde der Screening-Schritt zur Ermittlung von Mutanten mit
Antigenen, die an Dirofilaria-Antikörper gebunden werden, unter Verwendung des obigen Fluoreszenztests visuell
vorgenommen. Mutanten, die im Gegensatz zum Wildtyp (keine Fluoreszenz) an den Dirofilaria-Antikörpern
gebunden werden, besaßen eine rote (Rhodamin) oder
grüne Fluoreszenzfarbe (Fluorescein). Diese Mutantenorganismen wurden abgetrennt und cloniert.
Organismen, bei denen sich dieses Merkmal als gegeben erweist, werden als Mutanten betrachtet, die
ein verändertes Gen aufweisen, das zur Erzeugung eines oder mehrerer den Antigenen von Dirofilaria
entsprechender Antigene führt.
Nach den obigen Verfahren wurde im Rahmen der Erfindung nachgewiesen, daß Mutanten von C. elegans
mit "veränderten Antigenen, die denen der Dirofilaria-Antigene entsprechen, erzeugt werden können. Die
Antikörper-Bindungsaktivität mit Anti-Dirofilaria-Serum
von sechs unabhängig isolierten Mutanten wurde anhand von Dirofilaria-Gewebe und Wildtypgewebe verglichen.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengefaßt.
Antikörper-Bindungsaktivität von sechs unabhängig isolierten Mutanten von C. elegans mit 1:50-verdünntem
Kaninchen-Antidirofilaria-Serum
| Immunserum | VorImmunisierungs-Serum | |
| Wildtyp C.elegans |
- | - |
| Dirofilaria | + | - |
| Mutanten-Stamme | ||
| VGI-1 | + | - |
| VGI-2 | + | - |
| VGI-3 | + | - |
| VGI-4 | + | - |
| VGI-5 | + | - |
| VGI-6 | + | - |
In Tabelle III sind Ergebnisse einer weiteren Charakterisierung einer repräsentativen Mutante
der sechs in Tabelle II aufgeführten Mutanten dargestellt, bei der die Bindung der Antikörperaktivität
sich sehr ähnlich wie bei Dirofilariagewebe verhält.
Antikörper-Bindungsaktivität der Mutante VGI-6 gegenüber Kaninchen-Antidirofilaria-
Se rum
| Titer | Gewebe von VGI-6 |
Gewebe von Dirofilaria |
Gewebe des Wild typs (C.elegans) |
| 1 :5 | + | + | |
| 1 :2O | + | + | - |
| 1 :40 | + | + | - |
| 1 :8O | + | + | - |
| 1 :160 | + | + | - |
Ferner wurde festgestellt, daß bei Verabreichung einer dieser Mutanten von C. elegans an Kaninchen zur
Immunisierung diese zur Auslösung einer immunogenen Antwort führte, wobei die erzeugten Antikörper im Serum
gegenüber einer Species der Dirofilaria-Antigene Bindungsaktivität
besaßen.
Die erfindungsgemäß isolierten Mutanten weisen daher
nicht nur eine Antigenantwort bei Bindung an Dirofilaria-Antikörper
auf, sondern führen auch zu einer immunogenen Antwort bei der Herstellung von Antikörpern gegen Dirofilaria-Antigene.
Mit dem oben erläuterten Verfahren wurde ferner auch eine Mutante von C. elegans isoliert, die zumindest
hinsichtlich einiger ihrer Oberflächenantigene so verändert wurde, daß diese immunologisch mit den
Antigenen eines anderen parasistischen Wurms, Ancylostoma caninum, immunologisch identisch waren.
Ancylostoma caninum ist ein Hakenwurm, der Hunde befällt und im Darmbereich lebt.
Beliebige Wurmspecies, die leicht kultivierbar sind und bei denen Mutationen eingeführt werden können,
durch die eine Änderung bei ihren Antigenen in Entsprechung zu einem oder mehreren Antigenen eines
schwierig zu kultivierenden parasitischen Wurms hervorgerufen wird, sind im Rahmen des Erfindungskonzepts
verwendbar.
Beispielsweise unter Verwendung von C. elegans und D. immitis nach dem obigen Verfahren erzeugte
Antigene eines interessierenden Parasiten können entsprechend zur Entwicklung eines weiten Bereichs von
Diagnostika zur Ermittlung des Vorliegens von Antikörpern herangezogen werden, die durch Infektion
mit einem parasitischen Wurm induziert wurden. Ein derartiger Versuch mit Dirofilaria-Antigenen erwies
sich bei der Diagnose verschiedener Wurminfektionen als nützlich (vgl Desowitz und Una, aaO sowie Hedge
und Ridley, Immunofluorescent Reactions with Microfilariae, 1 Diagnostic Evaluation; Transactions of
the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene J7_J_
(1977) 304-307). Im Fall der erfindungsgemäß erzeugten
Dirofilaria-Antigene wurde festgestellt, daß
eine der von C. elegans isolierten Mutanten, die Mutante VGI-2, gut zur Diagnose von Dirofilariosen
geeignet ist.
Beim Test von Serumproben von Hunden, bei denen eine Infektion mit Dirofilarien bzw keine Infektion
diagnostiziert worden war, mit der Mutante VGI-2 ergaben sich bemerkenswert genaue Resultate, da
sich bei sechs Hunden, bei denen durch den Standard-Filtertest ein Mikrofilarienbefall positiv diagnostiziert
worden war, auch beim Immunfluoreszenz test ein bezüglich dieser Mutante positiver Befund ergab. Im
Gegensatz dazu ergab sich bei fünf Serumproben von klinisch als nicht infiziert diagnostizierten Hunden
ein bezüglich der Mutante ebenfalls negativer Befund. Neben dem Immunfluoreszenztest zur Ermittlung von
Infektionen mit parasitischen Würmern unter Verwendung von Mutanten-Antigenen können auch das Radioimmunoassay,
Immunoassays mit Enzymlabel, Immundiffusion oder der Hämagglutinationstest gleichermaßen herangezogen
werden (vgl D. Stites, Laboratory Methods for Detection of Antigens and Antibodies, Basic and Clinical
Immunology, Lange Medical Publications, 1976, 281-315).
oben
Mit dem erläuterten Verfahren erzeugte Antigene
Mit dem erläuterten Verfahren erzeugte Antigene
können auch zur Herstellung von Impfstoffen gegen parasitische Würmer herangezogen werden. Im beispielhaften
Fall der Dirofiliarose ist bekannt, daß die von infektiösen Larven abgeleiteten Antigene als Impfstoffe
für Hunde gegen Dirofiliarosen herangezogen werden können (vgl M.M. Wong, M.F. Guest und
M.J. Lavoipierre, Dirofilaria immitis, Fate and
Immunogenicity of Irradiated Infective Stage Larvae in Beagles, Experimental Parasitology 3_5_ (1974) 65-79).
Sofern Antikörper spezifisch gegen diese speziellen Antigene infektiöser Larven erzeugt und Mutanten von
C. elegans mit entsprechenden Antigenen isoliert
werden, können diese Mutanten zur Ableitung der immunogenen Antigene herangezogen werden, die zur Herstellung entsprechender
Impfstoffe gegen Dirofilaria erforderlich sind. Der erzeugte Impfstoff kann dann beispielsweise
in einer gepufferten Salzlösung suspendiert und danach Tieren subcutan oder intramuskulär injiziert werden,
um Immunität gegen Infektionen mit Dirofilaria hervorzurufen (vgl W.J. Herbert, Laboratory Animal Techniques
for Immunology in 'Handbook of Experimental Immunology',
Vol. 1 Immuno Chemistry, 3. Auflage, Hrsg. D.M. Weir, Blackwell Scientific Publishers, Oxford, London 1978).
Das Grundprinzip des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht auf der Änderung eines oder mehrerer Gene einer
nahe verwandten, leicht zu kultivierenden Wurmspecies in der Weise, daß Antigene eines schwierig zu kultivierenden
parasitischen Wurms erzeugt werden. Bei der oben erläuterten Ausführungsform liegt die Konzeption
vor, daß die Antigene in situ in der Species des leicht zu kultivierenden Wurms erzeugt werden. Diese
Konzeption kann ferner auch auf die Expression von Antigenen in anderen Organismen wie Bakterien,
Hefen oder anderen Mikroorganismen ausgedehnt werden, die gegebenenfalls zu einer effizienteren Gewinnung
der entsprechend angestrebten Antigene mit höherer Produktivität führen. Die Isolierung des Antigens
bzw der Antigene und ihre Insertion in Bakterien mit genetischen Vektoren ist auch im Rahmen der Erfindung
anwendbar. Die Gene beispielsweise von C. elegans können dadurch isoliert werden, daß zunächst
die Nucleinsäure des betreffenden Organismus nach dem Proteinase-K-SDS-Verfahren isoliert wird
(vgl S. Emmons, M.R. Klass und D. Hirsch, Analysis
of the Constancy of DNA Sequences During Development
and Evolution of the Nematode Caenorhabditis elegans , Proceedings of the National Academy of Sciences _7j6_
(1979) 1333-1337 )·
Die PoIy-A-(RNA) wird dann durch Ethanolfällung
und Bindung an 01igo(dT)-Cellulose abgetrennt (vgl Aviv und Leder, Purification of Biologically Active
Globin Messenger RNA by Chromatography on Oligothymidylic Acid Cellulose, Proceedings of the
National Academy of Science 6JJ (1972) 1408-1412).
Das an 01igo(dT)-Cellulose bindende Material ist das, was zur Reinigung der PoIy-A-(RNA) herangezogen
wurde, die die Codierung bezüglich des Antigen-Gen-Produkts vornimmt. Da die PoIy-A-(RNA) lediglich mit
der DNA hybridisiert, die das Antigen-Gen codiert, kann diese PoIy-A-(RNA) zur Selektion von Rekombinant-Poly-A"(DNA)-Molekülen
von C. elegans herangezogen werden, die das interessierende Antigen-Gen codieren.
Diese Rekombinant-DNA-Moleküle können dann mit Hilfe
verschiedener genetischer Vektoren wie Plasmide oder Bakteriophagen zur Expression des Antigen-Gens und
Erzeugung des angestrebten Produkts nach dem literaturbekannten Grundverfahren in Bakterien oder Hefen eingeführt
werden (vgl R. W. Davis, D. Botstein und J.R. Roth, A manual for genetic engineering, Advanced
Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1980).
Dabei besteht die Möglichkeit, daß von natürlichen Parasiten erzeugte Antigene gegebenenfalls wirksamer
oder spezifischer sind als durch genetische Mutationen von C. elegans herrührende Antigene. Dementsprechend
kann die Clonierung von Natur aus schwierig zu kultivierender parasitischer Gene im Hinblick auf ihre
Antigene in einem Mikroorganismus von Vorteil sein. Das obige Clonierungsverfahren ist jedoch extrem schwierig
durchzuführen bzw undurchführbar, da die Menge der zur Isolierung der interessierenden PoIy-A-(RNA) verfügbaren
Parasitengewebe beschränkt ist. Die PoIy-A-(RNA) liegt lediglich in Geweben vor, die das Antigen exprimieren.
Im Fall der den Antigenen infektiöser Larven von Dirofilaria entsprechenden PoIy-A-(RNA) müssen die
Gewebe aus zerschnittenen Larven von gefangenen Moskitos gewonnen werden, die diese Parasiten beherbergen.
Die Verfügbarkeit von Geweben infektiöser Larven, die zur Isolierung hinreichender Mengen von PoIy-A-(RNA),
erforderlich ,.ist. , ,
die ihren Antigenen entspricht,/ ist folglich begrenzt,
weshalb die Isolierung von PoIy-A-(RNA) in diesem Fall extrem schwierig bzw nicht durchführbar ist. Wenn
andererseits die PoIy-A-(RNA) verwendet wird, die aus einer Mutante von C. elegans isoliert wurde,
die den betreffenden interessierenden Antigenen entspricht, können durch Hybridisierung der Dirofilaria-DNA
die Rekombinanten-DNA-Gene isoliert werden, die den Antigenen der infektiösen Larven von Dirofilaria
entsprechen. Die Verfügbarkeit von Dirofilaria-DNA ist andererseits nicht begrenzt, da sämtliche Gewebe
eine alle Gene enthaltende DNA aufweisen und aus ausgewachsenen Dirofilarien große Mengen an entsprechendem
Gewebe zugänglich sind.
Claims (32)
1. Antigene parasitärer Würmer,
erhältlich durch
erhältlich durch
- Identifizierung der Antigene eines parasitischen Wurms,
- genetische Modifizierung eines mit dem parasitischen Wurm verwandten Organismus, bis eine Mutante gebildet
ist, deren Antigene mit denen des parasitischen Wurms immunologisch identisch sind,
- Kultivierung der Mutante
und
und
- Gewinnung der Mutante, wobei die Antigene zur Verwendung als Diagnostika oder Impfstoffe zur Erkennung
von bzw Vorbeugung gegen durch den betreffenden parasitischen Wurm hervorgerufene Infektionen gewonnen
werden können.
2. Antigene von Helminthen als parasitären Würmern nach Anspruch 1.
3. Antigene von Trematoden, Cestoden und Nematoden als
parasitären Würmern nach Anspruch 1 .
4. Antigene nach einem der Ansprüche 1 bis 3, erhältlich unter Verwendung von Helminthen bzw parasitären Würmern
als verwandte Organismen.
065-Ser. 399718-SF-Bk
5. Antigene nach einem der Ansprüche 1 bis 4, erhältlich unter Verwendung von Trematoden, Cestoden und Nematoden als
verwandte Organismen.
6. Antigene nach Anspruch 5, erhältlich unter Verwendung eines Nematoden als verwandten Organismus.
7. Antigene nach einem der Ansprüche 1 bis 5, erhältlich unter Verwendung von Caenorhabditis elegans, Panagrellas
redivious, Turbatric acetic und Caenorhabditis briggsae
als verwandte Organismen.
8. Antigene von Dirofilaria immitis als parasitischem
Wurm nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
Wurm nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
9. Antigene von Ancylostoma canium als parasitischem Wurm nach
einem der Ansprüche 1 bis 7.
10. Antigene nach einem der Ansprüche 1 bis 9, erhältlich durch Identifizierung der Mutanten, deren Antigene
immonologisch mit denen des parasitischen Wurms
identisch sind, durch Auswahl solcher Mutanten,
immonologisch mit denen des parasitischen Wurms
identisch sind, durch Auswahl solcher Mutanten,
die an Antikörper gebunden werden,
die von einem mit Antigenen des parasitischen Wurms
immunisierten Wirt erzeugt wurden.
11. Antigene nach Anspruch 10, erhältlich durch Abtrennung der so identifizierten Mutanten und Clonierung der abgetrennten
Mutanten.
12. Antigene nach einem der Ansprüche 1 bis 11, erhältlich durch genetische Modifizierung nahe verwandter Organismen
mit folgenden Schritten:
- Isolierung der Nucleinsäure des verwandten Organismus,
- Abtrennung der PoIy-A-RNA,
- anschließende Auswahl der Rekombinanten-Poly-A-DNA-Moleküle
des eng verwandten Organismus,
- Codierung des bzw der interessierenden Antigen-Gene,
- Insertion der Rekombinanten-DNA-Moleküle in eine
Trägerkultur zur Expression des bzw der Antigen-Gene und
- anschließende Gewinnung-
13. Antigene nach einem der Ansprüche 1 bis 11, erhältlich durch genetische Modifizierung nahe verwandter Organismen
mit folgenden Schritten:
- Isolierung der Nucleinsäure des verwandten Organismus,
- Abtrennung der PoIy-A-RNA des verwandten Organismus,
- anschließende Auswahl der Rekombinanten-PoIy-A-DNA-Moleküle
des parasitischen Wurms,
- Codierung des bzw der interessierenden Antigen-Gene,
- Insertion der Rekombinanten-DNA-Moleküle in eine Trägerkultur zur Expression des bzw der Antigen-Gene
und
- anschließende Gewinnung.
14. Verfahren zur Herstellung von Antigenen parasitärer Würmer,
gekennzeichnet durch
- Identifizierung der Antigene eines parasitischen Wurms,
- genetische Modifizierung eines mit dem parasitischen
Wurm verwandten Organismus, bis eine Mutante gebildet ist, deren Antigene mit denen des parasitischen Wurms
immunologisch identisch sind,
- Kultivierung der Mutante
und
und
- Gewinnung der Mutante, wobei die Antigene zur Verwendung als Diagnostika oder Impfstoffe zur Erkennung
von bzw Vorbeugung gegen durch den betreffenden parasitischen Wurm hervorgerufene Infektionen gewonnen
werden können.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß Antigene von Helminthen als parasitischen Würmern hergestellt
werden.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, dadurch gekennzeichnet, daß Antigene von Trematoden, Cestoden und Nematoden
als parasitischen Würmern hergestellt werden.
17. Verfahren nach Anspruch 14 oder 16, dadurch gekennzeichnet,
daß als verwandter Organismus ein Helminth bzw parasitischer Wurm verwendet wird.
18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet,
daß Trematoden, Cestoden und/oder Nematoden als verwandte Organismen verwendet werden.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß ein Nematode als verwandter Organismus verwendet wird.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß Caenorhabditis elegans, Panagrellas
redivious, Turbatric acetic und Caenorhabditis briggsae
als verwandte Organismen verwendet werden.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß Antigene von Dirofilaria immitis
als parasitärem Wurm hergestellt werden.
22. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß Antigene von Ancylostoma caninum
als parasitärem Wurm hergestellt werden.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch '
gekennzeichnet, daß die Identifizierung der Mutanten,
deren Antigene immonologisch mit denen des parasitischen Wurms identisch sind, durch Auswahl solcher Mutanten
vorgenommen wird, die an Antikörper gebunden werden, die von einem mit Antigenen als parasitischen Wurms
immunisierten Wirt erzeugt wurden.
24. Verfahren nach Anspruch 23, gekennzeichnet durch Abtrennung der so identifizierten Mutanten und Clonierung
der abgetrennten Mutanten.
25. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Modifizierung
nahe verwandter Organismen folgende Schritte umfaßt:
- Isolierung der Nucleinsäure des verwandten Organismus,
- Abtrennung der PoIy-A-RNA,
- anschließende Auswahl der Rekombinanten-Poly-A-DNA-Moleküle
des eng verwandten Organismus,
- Codierung des bzw der interessierenden Antigen-Gene,
- Insertion der Rekombinanten-DNA-Moleküle in eine
Trägerkultur zur Expression des bzw der Antigen-Gene und
- anschließende Gewinnung.
26. Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß die genetische Modifizierung der
nahe verwandten Organismen folgende Schritte umfaßt:
- Isolierung der Nucleinsäure des verwandten Organismus,
- Abtrennung der PoIy-A-RNA des verwandten Organismus,
- anschließende Auswahl der Rekombinanten-Poly-A -DNA-Moleküle
des parasitischen Wurms,
- Codierung des bzw der interessierenden Antigen-Gene,
- Insertion der Rekombinanten-DNA-Moleküle in eine
Trägerkultur zur Expression des bzw der Antigen-Gene
und
- anschließende Gewinnung.
27. Zusammensetzungen, gekennzeichnet durch einen biologisch geeigneten Träger und eine wirksame Menge einer Mutante
nach einem der Ansprüche 1 bis 13.
28. Zusammensetzungen nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Diagnostika formuliert sind.
29. Zusammensetzungen nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Impfstoffe formuliert sind.
30. Verfahren zur Immunisierung von mit parasitischen Würmern infizierten oder infizierbaren Wirts-Organismen, gekennzeichnet
durch Verabreichung einer Zusammensetzung nach Anspruch 27 oder 29.
31. Verfahren zur Immunisierung von mit parasitischen Würmern
infizierten oder infizierbaren Wirts-Organismen, gekennzeichnet durch Verabreichung einer Zusammensetzung, die
einen biologisch geeigneten Träger sowie von einer Mutante
eines mit dem parasitischen Wurm verwandten Organismus erzeugte Antigene enthält, die mit denen des parasitischen
Wurms immunologisch identisch sind, an Wirts-Organismen, bei denen eine durch Verabreichung eines
Antigens hervorgerufene Immunantwort auftritt.
Antigens hervorgerufene Immunantwort auftritt.
32. Verfahren zur Ermittlung des Vorliegens von durch eine Infektion mit einem parasitischen Wurm induzierten
Antikörpern,
Antikörpern,
gekennzeichnet durch
Testen eines Serums eines infizierten Wirts-Organismus mit einer Zusammensetzung, die einen biologisch geeigneten
Träger und Antigene enthält, die von einer Mutante eines mit dem parasitischen Wurm verwandten Organismus
erzeugt und mit den Antigenen des parasitischen Wurms
immunologisch identisch sind.
immunologisch identisch sind.
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