DE3914728C2

DE3914728C2 - Verfahren zur Produktion von Antikörpern gegen Erreger von Infektionskrankheiten und Verfahren zum Nachweis dieser Erreger

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Publication number: DE3914728C2
Application number: DE19893914728
Authority: DE
Inventors: Andreas Roth
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1989-04-28
Filing date: 1989-04-28
Publication date: 1996-10-02
Anticipated expiration: 2009-04-29
Also published as: DE3914728A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion von Antikörpern gegen Erreger von Infektionskrankheiten, sowie ein Verfahren zum Nachweis eines Erregers von Infektions krankheiten unter Verwendung von nach diesem Verfahren produzierten Antikörpern.

Das Grundprinzip der gesamten Immunologie ist das Zusammenkom men von Antigen und Antikörper. Hier wird ein Antigen ver ändert und der benötigte Antikörper produziert. Die Erfindung beschäftigt sich mit dem Antigen, dem zu produzierenden Anti körper und einer gezielten Eingriffmöglichkeit beim Zustande kommen der Antigen-Antikörper-Reaktion mittels enzymatischer Veränderung des Antigens. Die Produktion eines Antikörper beinhaltet die Immunisierung eines Tieres und eine ent sprechende Vielfältigkeit im weiteren Umgang mit dem ge wonnenen Antikörper.

Aus der Literatur sind zahlreiche Verfahren zum Nachweis der Erreger von Infektionskrankheiten bekannt. In neuerer Zeit wurden häufig enzymatische Vorbereitungsstufen eingesetzt, um Erreger von Gewebe zu trennen. Diese dienten allein bisher da zu Erreger mittels Verdauung aus Gewebe zu extrahieren, so daß diese Erreger zu Antigenen zwecks Antikörperproduktion weiter verarbeitet werden konnten.

Aus der US-3,992,516 ist ein Verfahren zur Reinigung ("purification") von Antigenen bei Pneumocystis carinii Erregern in mehreren Reinigungsstufen bekannt. Die erste wird durch Einwirken von proteolytischen Enzymen, bevor zugt Trypsin, auf das Antigen bewirkt. Anschließend wird die Reinigung der Antigene durch weitere Maßnahmen fort gesetzt. Zur Gewinnung eines möglichst spezifischen Anti serums wird angestrebt, mit einer möglichst reinen Anti genpräparation zu immunisieren. Wirtsbestandteile wie beispielsweise Antikörper sind zu entfernen, weil sie die Antigene des Erregers blockieren können. Das Enzym wird in der genannten Druckschrift ausschließlich zur Verdauung von Gewebe und nicht zur Veränderung der Anti gene des Erregers eingesetzt.

In "Analytical Biochemistry", D. J. Holme und H. Peck, Longman, London und New York, 1983, Seite 241, wird die Sandwich-ELISA Methode beschrieben.

In Derwent-Abstract 86-017011/03 zur JP-84 095277 wird ein Verfahren beschrieben, bei dem die hohe Selektivität und die Standardisierung des Antikörpers durch Herstellung eines monoklonalen Antikörper erreicht wird.

Ein spezieller Erreger, auf den die Erfindung besonders ein geht, ist Pneumocystis carinii.

Pneumocystis carinii ist ein einzelliges Lebewesen, über dessen Biologie, Ökologie, Pathogenese und Biochemie wenig genaue Kenntnisse vorliegen. Pneumocystis carinii ist seit 1912 bekannt und war lange von geringer medizinischer Be deutung. Der Erreger lebt saprophytisch in den Alveolen der Lungen von Säugetieren und Vögeln. Die Durchseuchung der Be völkerung ist hoch; es besteht eine latente Infektion ohne Krankheitswert. Erst wenn der Wirt zellulär oder humoral immungeschwächt ist (iatrogen, angeboren oder erworben) wird er krank, weil sich der Erreger dann vermehrt und eine schwere Pneumonie, die Pneumocystis carinii-Pneumonie (PcP), verursachen kann.

Somit ist Pneumocystis carinii ein klassischer opportuni stischer Erreger, und man kann bei Diagnose einer Pneumo cystose immer davon ausgehen, daß eine Immunschwäche des Wirtes vorliegt. Die Erkrankung hat im Zeitalter der Immun schwächen erheblich an Bedeutung zugenommen und tritt fast ausschließlich bei folgenden Risikopatienten auf:

1. Säuglinge und Kinder mit angeborenen primären Immun defekten (z. B. Agammaglobulinämien),
2. Säuglinge und Kinder mit erworbenen Störungen des Immunsystems (z. B. Frühgeburten, Mangelernährung),
3. Patienten aller Altersklassen, die immunsuppressiv behandelt werden (z. B. Malignome, nach Transplantation) und
4. bei AIDS-Patienten.

Der Lebenszyklus von Pneumocystis carinii ist unvollständig bekannt. Pneumocystis carinii wird von den meisten Autoren den Protozoen zugeordnet. Es scheint so zu sein, daß dieser Erreger sowohl Eigenschaften der Protozoen (z. B. Zyste mit beweglichen "Sporozoiten", Erreger nicht in Kultur anzüchtbar), als auch der Pilze (z. B. Färbung der Zystenwand mit einer Pilzfärbung, Grocott-Färbung) in sich vereint. Man unter scheidet den kleinen amöboiden Trophozoiten (1-7 µm) und Zystenstadien (reife Zyste mit dicker Wand und Präzysten, 3-6 µm), in denen sich bis zu acht Sporozoiten (1-1,5 µm) befinden, mit denen der Erreger vermutlich aerogen übertragen wird. Diese Stadien sind mit verschiedenen mikroskopischen Techniken und Färbungen unterschiedlich gut nachweisbar. Die Trophozoiten sind klein, verklumpen miteinander und haben keine charakteristischen Merkmale, so daß die Orientierung an der typischen Zyste erfolgen muß. Deshalb finden Färbe methoden Anwendung, die diese Stadienform nachweisen. Die beste Methode ist die Grocott-Färbung, bei der nur die Zystenwand auf Grund einer Reduktion/Oxidation mit an schließender Gomorri′scher Methenamin-Silbernitrat-Imprägnie rung schwarz dargestellt wird. Ebenso werden Pilze, Glykogen und Mucin angefärbt, was die Anwendbarkeit sehr relativiert. Entscheidend bei dieser Färbung ist das Auftreten von klammer artigen Strukturen innerhalb der Zystenwand, so daß nur diese beweisend für die sichere Identifizierung von Pneumocystis carinii sind. Dieses Merkmal findet man nicht in jeder Zyste, so daß Probleme bei geringer Erregerzahl und Anfärbung frem der Partikel auftreten können. Zusätzlich finden Kriterien wie Form, Größe und Anordnung der Zysten Anwendung, sowie eine parallel durchzuführende Giemsa-Färbung, die unter anderem neben Gewebe und Zellkernen, Trophozoiten und Sporo zoiten nachweist. Die Zysten liegen oft in Clusters in einem schaumigen Material konglomeriert vor. Dieses Verfahren er fordert in seiner Gesamtheit also Erfahrung bzw. Zeit in der Durchführung und sollte spezialisierten Laboratorien vorbehalten bleiben.

Pneumocystis carinii ist der häufigste opportunistische Er reger bei AIDS-Patienten. Diese haben in ∼60-70% der Fälle Pneumocystis carinii-Pneumonie-Episoden mit zum Teil sehr hoher Rezidivrate. Die Pneumocystis carinii-Pneumonie führt unbehandelt zum Tode und ist eine der häufigsten Todesur sachen bei diesem Patientenkollektiv. Man schätzt, daß bis zum Jahre 1991 100 000 Pneumocystis-carinii-Pneumonie-Fälle bei AIDS-Patienten in den USA aufgetreten sein werden. Selbst verständlich wäre die Bedeutung von Pneumocystis carinii bei nicht HIV-infizierten Patienten größer, wenn man den Erreger besser nachweisen könnte.

Die Pneumocystis-carinii-Pneumonie kann auf Grund von klinischen Parametern (Labor, Symptomatik, Röntgen), die un typisch oder unspezifisch sind, nicht diagnostiziert werden, sondern nur vermutet werden, und dies teilweise auch nicht zuletzt wegen der hohen Inzidenz der Pneumocystis-carinii- Pneumonie unter diesem Patientenkollektiv. Bis zu 50% der HIV-infizierten erscheinen mit einer Pneumocystis carinii Pneumonie als Erstmanifestation bei ihrem Hausarzt.

Die Diagnose muß sofort, auch schon bei Verdacht, durch den Nachweis des Erregers im Untersuchungsmaterial der tiefen Respirationswege des Patienten gestellt werden, weil dadurch die Prognose verbessert und empirische komplikationsreiche Therapien verhindert werden. Die Letalität der Pneumocystis carinii-Pneumonie war anfänglich sehr hoch, weil die Laboratoriumsdiagnostik noch standardisiert und geeignete The rapien entwickelt werden mußten. Diese Konstellation hat sich verbessert, weil der Kliniker die Krankheit besser kennt, früher erkennt und vermutet und mit neuen therapeutischen Konzepten eingreift oder prophylaktisch behandelt. Es bleibt aber die Tatsache, daß der Kliniker die Laboratoriumsdiagno stik zwar durchführt, sich aber nicht darauf verlassen kann, und daraufhin im Rahmen des Möglichen bei begründetem Ver dacht immer empirisch behandelt. Im übrigen werden diese Patienten unabhängig von der mikrobiologischen Diagnostik mit einer prophylaktischen Chemotherapie behandelt. Die Patienten sind häufig multimorbide, und werden deshalb mit vielen hochdosierten Medikamenten belastet. Dieses Vorgehen ist sicherlich bei Patienten mit Pneumocystis carinii- Pneumonie-Anamnese, Rezidiv-Verdacht und nach Ausschluß anderer pulmonaler Komplikationen gerechtfertigt. Liegen aber andere pulmonale Infekte vor, so sollten empirische Therapien der Pneumocystis carinii-Pneumonie vermieden werden. Diese Situation ließe sich ändern, wenn dem Arzt eine ver läßlichere Laboratoriumsdiagnostik geboten wäre.

Da es keine serologische Diagnostik der Pneumocystis carinii- Pneumonie gibt (wegen der Grunderkrankung bleibt eine Anti körperbildung aus), muß dem Patienten, der zu diesem Zeit punkt meist sehr krank ist, invasiv Untersuchungsmaterial (Bronchioskopie mit bronchoalveolärer Lavage, BAL, oder eine transthorakale oder transbronchiale Biopsie) entnommen werden, um den direkten Nachweis des Erregers darin durchführen zu können. Dieser Nachweis kann mittels konventioneller Methoden durchgeführt werden. Dafür findet die Grocott-, in Kombination mit der Giemsa-Färbung, Anwendung. Da konventionelle Methoden nicht sensitiv bzw. spezifisch genug sind, wird versucht, die Laboratoriumsdiagnostik der Pneumocystis carinii-Pneumonie zu verbessern, z. B. durch Schaffung von Alternativen zu den jetzigen Nachweismethoden des Erregers, oder auch durch den Nachweis von Antigenen im Serum (Antigenämie).

Angestrebt wird ein direkter immunhistochemischer Nachweis des Erregers mittels spezifischer Antikörper, z. B. in einem Immunfluoreszenztest. Diese Methode bietet konventionellen Methoden gegenüber Vorteile: hohe Spezifität und Sensitivität vermeiden falsch-positive und -negative Ergebnisse (Konsequenz für den Patienten), so daß die Letalität der Pneumocystis carinii-Pneumonie bei AIDS-Patienten, die dank klinischer Erfahrung und empirischer Chemoprophylaxe zurückgegangen ist, verbessert wird, bzw. es werden dem vielfach behandelten Patienten zusätzliche unnötige Therapien oder weitere invasive Diagnosemaßnahmen erspart. Weiterhin kann die Diagnostik viel schneller (Notfälle) und umfangreicher durchgeführt werden, und bleibt nicht mehr spezialisierten Institutionen vorbehalten.

Ähnlich ist die Situation bei anderen Erregern, die diese Patienten bevorzugt befallen, wie z. B. Cryptosporidium, Toxoplasma gondii oder Cryptococcus neoformans. Auch hier sind immunhistochemische, spezifischere Verfahren für den direkten Nachweis der Erreger in Patientenmaterial als Alternative zu konventionellen Methoden wünschenswert.

All diesen Erregern ist gemeinsam, daß sie gegebenenfalls in mit anderen Antigenen hochkontaminierten Untersuchungs materialien, wie Sputum oder Stuhl, nachgewiesen werden müssen, was die Anwendbarkeit von den spezifischeren und doch empfindlicheren immuntechnischen Nachweisverfahren beeinträchtigt.

Insofern müssen diese Techniken verbessert werden, damit sie hier eine Anwendung finden können und Vorteilen den konventionellen Methoden gegenüber aufweisen.

Der immunhistochemische Nachweis muß einwandfrei ohne un spezifische oder unerwünschte Reaktionen des Antikörpers mit Fremdmaterial oder anderen Antigenen durchführbar sein, sonst hat er keine Vorteile gegenüber konventionellen Methoden.

Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein verbessertes und einfaches Verfahren zur Diagnostik einer Vielzahl von Er regern zur Verfügung zu stellen.

Dabei wird ausgegangen von einer enzymatischen Veränderung von Oberflächenantigenen bei Erregern von Infektionskrank heiten.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Produktion von Anti körpern umfaßt folgende Verfahrensschritte:

A. Ein den Erreger enthaltendes Gewebe wird mit einem Enzym derart versetzt, daß durch das Einwirken des Enzyms die proteinischen Bestandteile der Erreger oberfläche verändert werden, ohne daß das Gewebe ver daut wird;
B. Abtrennung der Erregerfraktion vom Gewebe durch physikalische Reinigungsvorgänge;
C. Gewinnung von Antikörpern durch Immunisieren eines Wirts mit der Erregerfraktion.

Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, daß die Oberflächenantigene durch Einwirkung von Enzymen und gegebenenfalls durch mechanische Einwirkung teilweise ver ändert oder zerstört werden, und anschließend die ver änderten Antigene zur selektiven Produktion von Antikörpern eingesetzt werden, wobei diese Antikörper spezifischer ein gesetzt werden können, weil sie nur das veränderte Antigen wiedererkennen.

Die einwirkenden Enzyme sind proteolytische Enzyme, welche proteinverwandte Bestandteile der Erregeroberfläche teil weise verändern oder zerstören. Bei den eingesetzten Enzymen handelt es sich vorzugsweise um Papain, Trypsin, Pepsin oder Pronase, wobei Pronase besonders bevorzugt ist.

Die Erreger der Infektionskrankheiten können unterschied licher Herkunft sein, beispielsweise aus der Gruppe der Protozoen, wie Cryptosporidium spec., Isospora spec., Sarcocystis spec., Toxoplasma gondii und Pneumocystis carinii oder aus der Gruppe der Pilze, wie Candida spec., Cryptococcus neoformans und Aspergillus spec. oder aus der Gruppe der Bakterien, wie Pneumococcus spec. und Legionella pneumophila. All diesen Erregern ist gemeinsam, daß ein Teil ihrer Oberflächenantigenen aus Polysacchariden oder kohlen hydrat-verwandten Strukturen bestehen und diese somit von der Proteolyse verschont oder zumindest nicht durch diese zerstört werden.

Im Anschluß an die Enzymbehandlung erfolgt eine mechanische Behandlung der veränderten Antigene, insbesondere durch Einwirkung von Ultraschall. Dadurch werden die Zysten oder Präzysten des Erregers aufgebrochen, und weitere im Sinne der vorherigen enzymatischen Behandlung gewünschte Anti gene befreit.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines Erregers von Infektionskrankheiten unter Verwendung von nach dem oben beschriebenen Verfahren produzierten Antikörpern zeichnet sich dadurch aus, daß die Antikörper mit den Oberflächenantigenen des Erregers aus einer auf Befall durch entsprechende Erreger zu untersuchende Probe eine Verbindung eingehen, wobei die Probe enzymatisch auf die gleiche Art und Weise behandelt wurde wie das den Erreger enthaltende Gewebe bei der Produktion der Antikörper.

Vorteilhafterweise wird dabei die eingegangene Verbindung immuntechnisch, bevorzugt durch einen Immunfluoreszenz test oder ein Enzyme-linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) nachgewiesen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis der Erreger von Infektionskrankheiten gliedert sich in mehrere Schritte:

a) Von einem infizierten Träger wird den Erreger enthal tendes Gewebe entnommen; dieses Gewebe wird homogeni siert und mit einem proteolytischen Enzym versetzt, wobei das Enzym die Oberfläche des Erregers verändert, ohne daß das Gewebe verdaut wird.
b) Anschließend wird mit Ultraschall behandelt, wonach zentrifugiert und die das Antigen enthaltende Erreger fraktion abgetrennt wird.
c) Das Antigen wird einem geeigneten Wirt verabfolgt, worauf das Antiserum, welches die gewünschten Anti körper enthält, gewonnen wird.
d) Eine auf Befall durch entsprechende Erreger zu unter suchende Probe wird homogenisiert und mit dem selben proteolytischen Enzym wie in Schritt a) ver setzt und anschließend gewaschen.
e) Die so behandelte Probe wird auf einem Objektträger ge trocknet.
f) Das unter Punkt c) gewonnene Antiserum wird auf die Probe aufgebracht, welche nach einer Inkubationszeit ge waschen wird.
g) Die so vorbereitete Probe wird mit an die Antikörper des Antiserums bindenden weiteren Antikörpern, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt sind, ver setzt, die Probe gewaschen und nachfolgend die Fluoreszenz beobachtet.

Dabei ist zu bemerken, daß der Erreger bei manchen Infektions krankheiten nicht aus dem Gewebe gewonnen werden muß, sondern einer Kultur oder einer infizierten Körperflüssigkeit ent stammen kann.

Bei dem erfindungsgemäßen Nachweisverfahren werden als proteolytische Enzyme in den beiden Schritten a) und d) je weils die selben Enzyme eingesetzt, vorzugsweise Papain, Tryp sin, Pepsin oder Pronase, wobei Pronase besonders bevorzugt ist. Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren läßt sich sowohl üblicherweise mit polyklonalen Antikörpern als aber auch mit monoklonalen Antikörpern durchführen. So können im Schritt a) aus den veränderten Antigenen nach einer der üblichen Verfahrensweisen monoklonale Antikörper gewonnen werden, die zum Nachweis des Erregers eingesetzt werden können, wobei dieser Nachweis mittels einer Antikörper-Anti gen-Verbindung eines polyklonalen oder monoklonalen Anti körpers erst durch den Schritt d) ermöglicht wird.

Die Nachweismethode geschieht durch die direkte und optisch sichtbare Identifizierbarkeit des Erregers in von Menschen und Tier gewonnenem Untersuchungsmaterial. Der Nachweis wird mittels indirektem Immunfluoreszenztest und eines Ausstriches des Untersuchungsmaterials vollzogen. Er ist also zunächst ein direkter immunhisto- oder immunzytochemischer Nachweis. Die Antigen-Antikörper-Reaktion wird durch eine Markierung optisch sichtbar gemacht, z. B. durch Markierung mit Fluorescein- Isothiocyanat (FITC) oder Dichlorotriazinyl-Amino Fluorescein (DTAF) konjugierten Anti-Antikörper-Antikörpern. Das erfindungs gemäße Verfahren kann auf Grund der Verbesserung der ge wählten Immuntechnik für den Nachweis des Erregers bisherige Nachweismethoden wie histologische oder chemische Färbungen ersetzen oder ergänzen, weil Alternativen zu vorliegenden Nachteilen konventioneller Methoden geboten sind.

Der Vorteil liegt darin, daß die Antigen-Antikörper-Verbin dung spezifisch ohne unerwünschte Nebenreaktionen auf Grund des gezielten Eingriffes mit Enzymen eingegangen wird.

Grundsätzlich kann diese Antigen-Antikörper-Verbindung im Sinne der Erfindung mit einer Vielfalt von Markern, wie Peroxidase, radioaktiven Substanzen, einem Enzym, einem fluoreszierenden Farbstoff, einem Marker für die Elektronen mikroskopie oder einer chemischen Bindung einer Restgruppe, nachweisbar gemacht werden.

Auf Grund der Allgemeingültigkeit des immunologischen Grund gesetzes der Antigen-Antikörper-Verbindung, bieten sich also eine Vielzahl von immuntechnischen Verfahren an, bei denen diese Verbindung eingegangen und schließlich nach weisbar gemacht wird.

Dabei läßt sich unterscheiden, ob das Antigen korpuskulär als Zelle, z. B. die Zyste von Protozoen, oder in gelöster Form, z. B. als Antigenämie im Serum, vorliegt.

Im ersten Fall erfolgt der Nachweis wie oben genannt immun zytochemisch, wobei der Erreger morphologisch erkennbar sichtbar gemacht wird. Im zweiten Fall bedient man sich eines Enzym-linked-Immuno-Assays, wobei die eingegangene Antigen-Antikörper-Verbindung mit einem an sich bekanntem Verfahren mittels eines Indikators (Farbentwicklung) photo metrisch bestimmt wird.

Im Fall des Erregers Pneumocystis carinii erfolgt der Nach weis mit den oben aufgezählten Schritten a) bis g).

Das in den Schritten a) und d) eingesetzte Enzym ist vor zugsweise Pronase.

Das proteolytische Enzym wirkt in einer Konzentration von 0,002 Gew.-% bis 0,1 Gew.-% für 5 bis 60 Minuten auf das Ge webe ein. Bevorzugt sind eine Konzentration von 0,01 bis 0,004 Gew.-% und eine Einwirkungszeit von 10 bis 30 Minuten. Dabei soll die Einwirkungszeit umso kürzer sein, je stärker die Konzentration des Enzyms ist.

Die Probe, die auf den Befall mit Pneumocystis carinii zu untersuchen ist, wird nach der Einwirkung des Enzyms mit einer Pufferlösung gereinigt.

Die im Schritt b) gewonnene Erregerfraktion wird im Falle des Nachweises von Pneumocystis carinii mit Ultraschall be handelt. Diese Behandlung soll derart erfolgen, daß die Zystenwände oder die Wände der Präzysten des Erregers zer stört werden. Das Ende der Ultraschall-Behandlung wird da durch erkannt, daß in einem Test keine Zystenwände des Er regers mehr durch Anfärbung festgestellt werden können. Die Zentrifugierung wird für etwa 10 bis 60 Minuten bei 2000 bis 4000 × g durchgeführt.

Beispiele Nachweis von Pneumocystis carinii 1. Antigenherstellung

Der Erreger in der Stadienform der Zyste und Präzyste wurde hochgereinigt (unter möglichst sterilen Bedingungen gegen eine Kontamination z. B. mit Pilzen) aus menschlicher Lunge extrahiert. Die Antigene wurden bei der gesamten Arbeit immer kühl gehalten. So wurde z. B. bei 4°C zentrifugiert.

Material:

- Pronase von Streptomyces griseus 5,2 DMC-U/mg,
- Saccharose als 12-, 24-, 36-, 48- und 60%ige Lösungen in Aqua bidest, (Gewicht zu Volumen);
- Antibiotika-Cocktail (ABC) aus Streptomycin, Penicillin, Nystatin, Amphotericin B und Gentamycin;
- PBS pH 7,2 (Phosphate Buffered Saline)
- menschliche Lunge mit Pneumocystis carinii aus Autopsie material.

2. Saccharose-Gradientenzentrifugation

Die Saccharose-Gradientenzentrifugation dient der Auf trennung verschiedener Bestandteile des zystenhaltigen Lungengewebes in Saccharose-Dichtegradienten. Die Zysten neigen dazu, untereinander und mit Gewebe zu konglomerieren, so daß eine milde enzymatische Vorbehandlung für die er folgreiche zentrifugale saubere Auftrennung unerläßlich ist. Hierbei werden erfindungsgemäß die Zysten bewußt chemisch oder morphologisch verändert, d. h. sie haben nach der Enzymbehandlung nicht mehr die Eigenschaft, sich mit Gewebe und untereinander zu verklumpen.

(Das Enzym dient nur der Moderation des gesuchten Antigens. Das Lungengewebe wird nicht verdaut, denn Gewebebrocken sind bei der Konzentration des Enzyms nicht zu verdauen und folg lich noch vorhanden. Das ist ein wichtiges Merkmal des er findungsgemäßen Verfahrens).

Erst diese Überlegung macht die Saccharose-Gradientenzentrifu gation sinnvoll, weil einzelne Zysten in einem mittlerem leichteren Gradienten hängen bleiben, während Pilze und Gewebebrocken, die schwerer sind, in den tieferen Gradi enten gelangen. Weiterhin werden bestimmte unerwünschte Anti gene (Trophozoiten), Antigene des Lungengewebes, Makrophagen u. a. = Proteine) teilweise antigenetisch zerstört und ge suchte Antigene der Zyste befreit oder zumindest in der anti genetischen Struktur nicht beeinträchtigt (=Polysaccharide).

Die Lunge (ein ca. 3 cm² großes Stück), die stark mit Pneumocystis carinii infiziert ist und bei -25°C eingefroren war, wird aufgetaut, in kleine Stücke zerschnitten und durch ein Drahtsieb durchgerieben. Dabei wird mit ABC nachgespült, so daß nur bindegewebige Reste im Sieb zurückbleiben. Das zystenhaltige Lungenhomogenat (50 ml) wird durch ein feines Sieb (0,2 mm) gerührt, und diese filtrierte Suspension mit 3000 U/Min. 15 Minuten (ca. 1500 × g) zentrifugiert. Der Boden satz (ca. 2 cm²) kann jetzt mit 3-4 ml Überstand re suspendiert, stark durchgeschüttelt und mit 0,004 Gew.-% Pronase versetzt werden. Nach nochmaligem Durchschütteln wird die Suspension 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wird sie wieder heftig durchgeschüttelt (mechanische Trennung der Zysten von Gewebe und untereinander), mit 3000 U/Min. für 15 Minuten abzentrifugiert und das Sediment gewonnen.

Anschließend wird das Sediment nochmals mit PBS bei 3000 U/Min. 10 Minuten gewaschen. Das gewaschene Sediment kann bis zur weiteren Verarbeitung eingefroren werden.

Jetzt können die Saccharoselösungen, mit der 60%igen beginnend, schichtweise in ein 50 ml Kunststoff-Zentri fugationsröhrchen zu je 5 ml eingefüllt werden. Die Grenz schichten werden markiert. Zuletzt werden 10 ml der obigen Suspension auf den letzten Gradienten (12%) auf gefüllt. Dieses Röhrchen wird mit 2400 U/Min. 50 Minuten (ca. 1000 × g) zentrifugiert. Innerhalb der Gradienten bil den sich klare Schichten. Diese Schicht (ca. 2,5 ml) im 36%igen Gradienten wird vorsichtig abpipettiert, umge füllt und zweimal mit PBS (5 ml) bei 3000 U/Min. 20 Minuten gewaschen, d. h. der Überstand wird jedesmal verworfen und das Sediment (=das rohe Antigen, Zysten + Präzysten = roAG) erneut resuspendiert. Zuletzt wird nochmals mit 3200 U/Min. für 15 Minuten (ca. 1700 × g) zentrifugiert und dann bei -25°C für höchstens 2 Monate eingefroren.

Die genaue Konzentration der Pronase (0,004%) und die Wahl dieses Enzyms wurden in Voruntersuchungen mit einer größeren Enzymzahl ermittelt. Dabei wurden immer wieder vergleichbare Konzentrationen und Inkubationszeiten für eine noch ausreichende Trennung der Zysten aus dem Gewebe debris bei gleichzeitiger Gewährleistung der möglichst geringsten Zerstörung der Erreger mit der gewünschten Moderation und Immunigenität des Antigens untersucht. Die Zysten sollten durchaus chemisch verändert werden, jedoch ihre Form behalten. Sodann wurde in Vorversuchen immunisiert, um die gewünschte Immunigenität und den Er folg des erfindungsgemäßen Prinzipes der Enzymtechnik zu verifizieren. Auch andere Enzyme, wie Kollagenase, Hyaluronidase und Trypsin wurden untersucht, allerdings mit weniger Erfolg, d. h. ohne die gleiche Lösung der Aufgabenstellung.

3. Auszählen der Zysten

Die Anzahl der Zysten im rohen Antigen mußte bestimmt werden, um eine standardisierte Dosis für die Immunisierung zu ermitteln. Für den Nachweis und die Darstellung der Zysten (Grocott-Färbung) der "intrazystischen" Körperchen (Sporozoiten, auch in den Präzysten) wurden konventionelle Methoden angewandt. Auch bereits mit dem indirekten Immunofluoreszenztest untersuchte Präparate wurden hinter her nach Grocott und anschließend nach Giemsa für den Ver gleich der Methoden "gegengefärbt" (auch mit Phasen kontrast). Bemerkenswerterweise färben sich die Zysten mit der Grocott-Färbung ( diese entspricht einer chemischen Reaktion) nach der enzymatischen Behandlung nicht mehr in der klassischen Weise an, sondern müssen, besonders wenn sie freiliegen, länger mit dem Silber imprägniert werden. Sie sind also unzerstört, aber chemisch verändert vor handen. Mit der Giemsa-Färbung wurden Verunreinigungen des rohen Antigens ausgeschlossen; die Grocott-Färbung diente der Zählung. Es wurden also nur reife Zysten ge zählt, weil die Präzysten nicht darstellbar sind. Es wurde aber immer in Stichproben darauf geachtet, daß genügend Präzysten vertreten waren (rZ:Pz = 3 : 1, nach Giemsa und Phasenkontrast). Zählung: 1 µl des gepoolten rohen Antigens wurde als Tropfen in ein Quadrat (3 × 3 mm) auf einen Objektträger aufgetragen, luftgetrocknet und angefärbt. Die Länge der Koordinaten des Quadrates wurden in Gesichtsfeld-Durchmessern (40/0,65 Objektiv) "abge messen", um die Fläche des Quadrates in Gesichtsfeldern zu ermitteln. Aus dem Mittelwert der Zystenzahl von mind. 50 verschiedenen Gesichtsfeldern (gleiches Objektiv) konnte nun die Zystenzahl pro 1 µl (und somit pro 1 ml) mittels der Fläche errechnet werden. Von drei solchen Messungen wurde der Mittelwert der Zystenzahl/ml ermittelt und das rohe Antigen entsprechend rechnerisch auf 2 Milli onen (Mio.) Zysten/ml mit sterilem PBS verdünnt.

4. Aufbereitung des rohen Antigens

Das zystenhaltige rohe Antigen wurde zu gelöstem Anti gen weiterverarbeitet. Dazu wurden 5 ml (10 Mio. reife Zysten) des rohen Antigens in einem sterilen dickwandigen Glasrohr (Boden rund), welches im Eisbad stand, für 50 Minuten mit 140 mA Ultraschall-zertrümmert (Bandelin- Suorex). Dieses zertrümmerte Antigen, welches in Färbungen kontrolliert wurde (Zerstörung von 90% der Zysten, be sonders der Wand), wurde mit 4000 U/Min. für 3 Minuten (ca. 2600 × g) abzentrifugiert. Der kristallklare Über stand ist das gelöste Antigen, mit dem immunisiert wurde. Das Sediment enthält Teile von den "wandlosen" Zysten und einige Reste der Verunreinigungen durch Gewebe.

Im 36%igen Gradienten befinden sich die meisten Zysten, d. h. Zysten, die frei von Gewebe vorliegen. Diese liegen einzeln frei von Verunreinigungen vor. Etwaige Pilz sporen oder Gewebebrocken sind schwerer (48,60%) und die Trophozoiten leichter (wenn sie klein sind) (12,24%), bzw. durch das Enzym zerstört (weiterhin ist der osmotische Druck der Gradienten so stark, daß ihn nur die Zysten tolerieren können). Wurde die Saccharose-Gradientenzentri fugation nur mit dem Lungenhomogenat durchgeführt, so ge langte fast das gesamte Material einschließlich der Zysten in den 60%igen Gradienten. War nur eine Verunreinigung durch andere Erreger nachweisbar, so wurde das Material nicht verwendet oder für andere Zwecke aufbewahrt. Die Aufarbeitung des Erreger zu gelöstem Antigen ist der ent scheidende Reinigungsschritt. Dadurch wird das Fremdanti gen entfernt. Diese Methode ist arbeitsintensiv, aber vom Prinzip her einfach und somit leicht reproduzierbar. Die Zysten werden in der Saccharose-Gradientenzentrifuga tion nicht angereichert, sondern physikalisch gereinigt, so daß der Arbeitsschritt öfter wiederholt werden muß, bis ge nügend Erreger extrahiert sind. Sie müssen in der Grocott- Färbung stärker angefärbt werden, sehen hier nicht mehr wie in der klassischen Färbung aus (die Wand ist etwas dicker, wie auch im Phasekontrast ersichtlich und leicht gekörnt) und sie sind wegen des osmotischen Druckes der Saccharose etwas kleiner. All dies beeinträchtigt die Immunogenität des Antigens bei Anwendung des erfindungsge mäßen Prinzips nicht. Im übrigen werden die Zysten gelöst und danach ultrazentrifugiert, so daß hierbei erst weitere Antigene in geeigneter Form aus ihrer Komplexität befreit werden und zentrifugal gereinigt werden, so daß dadurch die Immunigenität und Selektion gesteigert werden. Das ist der wichtigste Reinigungsschritt, denn nach dieser Aufarbeitung ist das gereinigte Antigen klar. Der Proteingehalt des ge lösten Antigens wurde mit der Bradford-Methode bestimmt. Er ist im Verhältnis zur starken Immunigenität dieses Antigens niedrig: 15,0-21,0 µg/ml bei 0,8 Mio. zertrümmer ten Zysten pro ml. Dieses Ergebnis spricht dafür, daß andere Komponenten (beispielsweise Polysaccharide der Zystenwand) die Eigenschaften dieses Antigens ausmachen. Ebenso verur sacht dieses gereinigte Antigen eine Antikörper-Produktion mit Antikörpern, die in der Immunofluoreszenz ein rim pattern zeigen, d. h. die Reaktion findet überwiegend an der Wand statt. Dasselbe Antigen, welches nicht ultraschallbe handelt wurde, aber zur Kontrolle genauso ultrazentrifu giert wurde, enthielt kein Protein, wodurch indirekt ge zeigt wird, daß die Zertrümmerung einen Effekt bewirkt.

5. Immunisierung und Antikörpergewinnung

Es wurden weiße Kaninchen (Rasse Neuseeländer, männliche Tiere, ca. 1,5 kg, 5 Monate alt) nach folgendem Schema immunisiert: verabreicht wurden alle sechs Tage viermal eine gleiche Viertelportion von der Gesamtdosis (2 Mio. Zysten/Tier).

1. Mal intramuskulär = i.m. (re. Oberschenkel), 1 : 1 mit komplettem Freud′schen Adjuvans vermischt
2. Mal intramuskular = i.m. (li. Oberschenkel), 1 : 1 mit inkomplettem Freud′schen Adjuvans vermischt
3. Mal subcutan = s.c., 1 : 1 mit inkomplettem Freud′schen Adjuvans
4. Mal subcutan = s.c., ohne Freud′sches Adjuvans.

Vor der Immunisierung und alle 2 Wochen danach (bis zu 30 Wochen) wurde aus dem Ohr Blut abgenommen, dieses nach der Gerinnung mit 3000 U/Min. 15 Minuten abzentrifugiert und das Serum eingefroren (-25°C). Der Titer gegen Pneumocystis carinii-Zysten wurde in einem indirekten Immunfluoreszenztest bestimmt (Zysten mit Enzymbehandlung wie aus der Antigen-Herstellung, ebenso aber auch mit Zysten von der Ratte und ohne Pronasebehandlung). Der Titer ist die vorletzte Verdünnung des Serums, bei dem die Zysten noch apfelgrün fluoreszieren.

Neben dem geschilderten Vorgang mit der Immunisierung mit dem gelösten Antigen wurden auch andere Antigene aus probiert, um die Wahl des geeigneten Antigens für die definitive Anwendung für eine geeignete Methode zur Herstellung des gewünschten polyklonalen Antikörpers zu bestätigen. Parallel zu den Immunisierungen mit gelöstem Antigen wurde vergleichend auch mit ganzen Zysten (gleiche Methode wie oben, also auch enzymbehandelt) = roAG und mit Zysten ohne Pronase = OP (nur das rohe zystenhaltige Lungenhomogenat vor der Enzymbehandlung) immunisiert. Ohne Pronase deswegen, weil ausgeschlossen werden sollte, daß die schlechte Immunigenität der Zysten im rohen Antigen nicht auf die Pronase zurückzuführen ist. Aus der Tabelle 1 können die Unterschiede des Titer verlaufes entnommen werden.

Gelöstes Antigen:
Titeranstieg ist signifikant, mit einem Peak von 1 : 1280 in der zweiten Woche. Danach fällt der Titer bis zur 10 Woche auf 1 : 240 ab. Im Zeitraum von ca. 1-4 Wochen kann also der höchste Titer erwartet wer den. Die Zysten stellen sich bei den Titerbestimmungen als stark apfelgrün fluoreszierende Gebilde (mit rim pattern, d. h. mit Randbetonung der Fluoreszenz = die Antikörper-Antigen-Reaktion ist an der Wand so intensiv, daß dieser optische Eindruck entsteht) ohne unspezifische Fluoreszenz dar.

Rohes Antigen:
der Titeranstieg mit Peak fehlt, auch bei Dosisverdopplung. Das bedeutet, daß die schlechte Immunigeni tät auf das Antigen in seiner physikalischen Beschaffenheit zurückzuführen ist. Die Zysten stellten sich wie unter gAG beschrieben dar, doch konnte manchmal eine unspezifische Fluoreszenz in Gewebematerial beobachtet werden. Das rim pattern war hier nicht ausgeprägt.

Tabelle 1

Titerbestimmungen durch indirekten Immunofluoreszenztest (menschliche Zysten) nach Immunisierung von Neuseeländer- Kaninchen mit verschiedenen Pneumocystis carinii-Antigenen. gAG: gelöstes Antigen; roAG: rohes Antigen (= ganze Zysten); Kontrollen: OP: Antigen ohne Pronase, Dosis nicht bestimmbar, neg.: ohne Immunisierung; Peak: erster höchster Titer mit mindestens dreifachem Anstieg (signifikanter Anstieg); ?: nicht bestimmbar; M: Median X; K: Kaninchen. Siehe auch Abb. 1.

Die Tabelle 1 zeigt, daß man mit derselben Erregerzahl als Do sis unterschiedliche Ergebnisse erhält, wobei mit dem gelösten Antigen sehr hohe Titer mit kleiner Dosis erreicht werden. Antigen ohne Pronase: hierbei ist zwar ein Titeranstieg (nicht signifikant) zu verzeichnen, doch waren die Zysten teilweise überhaupt nicht identifizierbar, weil eine massive unspezifi sche Fluoreszenz mit jeglichem Material vorlag (= klassisches polyklonales Antiserum, welches unkontrolliert mit all dem reagiert, mit dem es hergestellt wird). Das liegt daran, daß mit Lungenhomogenat immunisiert wurde. Es mußte Lungenhomo genat für diesen Versuch verwendet werden, weil die Extraktion der Erreger ohne Enzym kaum möglich ist.

Die Titer der Tabelle 1 wurden mit pronasebehandelten Zysten durchgeführt. Sämtliche Titerbestimmungen wurden auch mit anderen Antigenen durchgeführt, um festzustellen, wie die Anti sera reagieren. Bei Untersuchungen der Sera der Tabelle 1 mit Zysten von der Ratte, waren die Titer im Durchschnitt immer einen Titer niedriger. Das bedeutet, daß diese polyklonalen Antikörper Erreger aus der Ratte zwar nachweisen, aber es liegen antigenetische Unterschiede der Erreger verschiedener Wirtsherkunft vor, so daß es richtig war, polyklonale Anti körper für den Nachweis von Pneumocystis carinii im Menschen mit menschlichen Erregern herzustellen. Bei dem Versuch, mit diesem polyklonalen Antikörper, der ja nur pronasemoderiertes Antigen "kennt", Zysten ohne Pronasebehandlung nachzuweisen, zeigte sich, daß die Erreger in deutlich geringerer Zahl und unvollständig dargestellt wurden. Ebenso war störende unspezifische Fluoreszenz aufgetreten. Auf Grund dieser schlechten Ergebnisse bei der Identifizierbarkeit der Zysten in ihrer Nativform, wurde klar, daß das gesuchte Antigen offensichtlich erst nach Inkubation mit dem Enzym optimal erkannt wird. Ebenso wird die unspezifische Fluoreszenz so drastisch gemindert, daß dieses Vorgehen äußerst vorteilhaft ist.

Weiterhin wurden Tupfpräparate (positive Lunge) mit ähnlichen Ergebnissen untersucht, um festzustellen, ob der polyklonale Antikörper hier auch wirkt, so daß im Test später auch Biopsien untersucht werden können.

Ähnliche Ergebnisse in Bezug auf die Titerbestimmung nach Immunisierung mit den genannten verschiedenen Antigenen wurden mit Mäusen (Balb/cJ und NMRI) und Ratten (Sprague Dawley) ermittelt, was die Ergebnisse mit den Kaninchen untermauert und das erfindungsgemäße Verfahren besser be gründet. Es wurden andere Träger auch aus dem Grunde ver gleichend immunisiert, insbesondere Balb/c-Mäuse, weil ge zeigt werden sollte, daß die Wahl des Antigens und des Immunisierungsschemas auch geeignet sind, monoklonale Anti körper gegen Pneumocystis carinii unter Anwendung der enzymatischen Veränderung des Antigens herzustellen.

Die Pronase beeinträchtigt nicht die Immunigenität der Epitope, die für die Immunantwort der Gruppe gAG verantwort lich waren. Diese Epitope könnten Polysaccharide oder ähnliches sein (Kohlenhydrate in anderer Form, z. B. Glyko proteine), weil diese nicht vom Enzym angegriffen oder zumindest nicht zerstört werden. Sie werden sicherlich enzymatisch und durch die Aufarbeitung zu gAG günstig frei gesetzt, weil das roAG die Polysaccharide des gAG ja auch enthalten müßte, doch fehlte offensichtlich die richtige Verfügbarkeit letzterer.

Die Wirkung der Pronase ist sehr breit in der Proteolyse, und sie wirkt, einzigartig unter den proteolytischen Enzymen, auch gegen bestimmte strukturelle Komponenten, wie N- acethylhexosamine, Mucin und Glykoproteine.

6. Der Immunfluoreszenztest für den Nachweis von Pneumocystis carinii-Zysten und Präzysten in bronchoalveolärer Lavage, Sputum und Biopsiematerial

1) PBS-Puffer pH 7,2
2) Gepuffertes Glycerin
3) Evans Blue-Stammlösung 6 Waschbehälter mit PBS (PBS 1-6)
4) Konjugat

FITC-konjugiertes Ziege-Anti-Kaninchen (IgG H+L) oder ein anderes, z. B. Ziege-Anti-Kaninchen F(ab)₂.

Gebrauchsverdünnung:

I. 0,5 ml Evans-Stammlösung + 9,5 ml PBS
II. 0,5 ml gelöstes Konjugat + 9,5 ml aus I. 1 : 20

7. Das Pneumocystis carinii-Antiserum

Wird 1 : 40 verdünnt in Eppendorf-Gefäße abgefüllt und stehend eingefroren.

8. Die Enzymlösung

Wird nach Bedarf angesetzt: in 100,0 ml PBS kommen 0,004 g Pronase. Diese Lösung (0,004 Gew.-%) wird verpackt und für höchstens 2 Monate im Kühlschrank (+4°C) auf bewahrt.

9. Objektträger mit positiver und negativer Kontrolle Vorbereitung des Untersuchungsmaterials

Der Objektträger mit 10 Feldern wird so eingeteilt, daß 8 Felder für das zu untersuchende Material (1-8, d. h. 4 Patienten) und je ein Feld für die positive (+K) und für die negative (⌀ K) Kontrolle zur Verfügung stehen.

Die positiven und negativen Kontrollen werden aus positiver und negativer bronchoalveolärer Lavage hergestellt: die bronchoalveoläre Lavage mit 3000 U/Min. 15 Minuten (∼1500 × g) zentrifugieren, das Sediment (1 ml) mit 5,0 ml Enzymlösung auffüllen und 30 Minuten/37°C inku bieren. Daraufhin einmal in PBS waschen (3500 U/Min. 15 Minuten, ∼2000 × g) und das Sediment entsprechend ver dünnt verwenden. Es werden pro Objektträger je Kontrolle 40 µl aufgetragen, luftgetrocknet und daraufhin bis zum Gebrauch unfixiert eingefroren.

Vorbereitung des Untersuchungsmaterial (UM)

Dabei gibt es zwei Möglichkeiten, das Enzym anzuwenden:
Version 1:
Pronasebehandlung auf dem Objektträger - das Untersuchungsmaterial wird zunächst 2 × gewaschen (3500 U/5 Minuten, ∼2000 × g, vorher mit PBS pH 7,2 ver dünnen, gut durchschütteln). Danach wird das Sediment in 1,0 ml des Überstandes resuspendiert, auf den Objekt träger aufgetragen (dicker Tropfen, mind. 40 µl), luft getrocknet, in Methanol 5 Minuten fixiert und wieder ge trocknet (37°C 3 Minuten). Bei bronchoalveolärer Lavage sind 2 (80 µl), bei Sputum 4 Proben (160 µl) pro Unter suchungsmaterial aufzutragen. Pronasebehandlung: auf jedes Feld mit Untersuchungsmaterial (nur diese) 40 µl von Enzym lösung auftragen, 30 Minuten/37°C in Feuchtkammer inkubieren, mit Aqua bidest. abspülen und trocknen.

Version 2:
Pronasebehandlung im Zentrifugationsröhrchen - das Untersuchungsmaterial wird wie oben zentrifugiert, das Sediment (1,0 ml) mit 5,0 ml Enzymlösung aufgefüllt, kräftig geschüttelt, für 30 Minuten/37°C inkubiert und zweimal wie oben gewaschen. Der restliche Vorgang wie Version 1.

Ist das Sputum/die bronchoalveoläre Lavage sehr zähflüssig oder purulent, muß das Untersuchungsmaterial nach Version 2 behandelt werden, weil das Untersuchungsmaterial enzymatisch aufgelöst wird und dann gewaschen wird, bevor es auf den Objektträger kommt, so daß eine bessere Reinigung statt findet.

Biopsiematerial wird als Tupfpräparat wie Version 1 auf einen größeren Objektträger aufgetragen. Im übrigen können auch histologische Schnitte angefertigt werden; diese werden ebenfalls nach Version 1 behandelt.

Durchführung des Immunfluoreszenztestes:

1. Auf jedes Feld werden 40 µl von dem Antiserum aufge tragen, 15 Minuten/37°C in Feuchtkammer inkubiert, 3 × 5 Minuten in PBS pH 7,2 (PBS 1-3) schaukelnd gewaschen, mit Aqua bidest. abgespült und getrocknet.
2. Auf jedes Feld werden 30 µl vom Konjugat aufgetragen, 15 Minuten/37°C in Feuchtkammer inkubiert, 3 × 5 Minuten wie ad 1 gewaschen (PBS 4-6), mit Aqua bidest. abge spült und getrocknet.
3. Zwei Tropfen gepuffertes Glycerin auf den Objektträger aufgetragen, eingedeckt und unter dem Fluoreszenz mikroskop abgelesen.

Dauer:
1 Std./50 Min. Der Immunfluoreszenztest kann auch in Notfällen schneller durchgeführt werden (kürzer waschen).

Ergebnis des Immunfluoreszenztestes:
Wird das Untersuchungsmaterial gleich auf den Objektträger aufgetragen und erst dann mit Pronase behandelt, so liegen die Zysten überwiegend wie in der Grocott-Färbung in "Clusters" auf dem Objektträger. Wendet man die bessere Version 2 an, so ist die Möglichkeit geboten, das Unter suchungsmaterial neben der enzymatischen Behandlung auch kräftig durchzuschütteln. Dabei werden die Zysten mit Hilfe des Enzyms zusätzlich mechanisch aus den Konglomeraten ge trennt, so daß ein besseres Ergebnis erzielt wird, weil mehr Zysten für die Antikörper erreichbar sind.

Die positive Kontrolle stellt die Pneumocystis carinii- Zysten als pleomorph-ovale, teils runde, oft in Gruppen (4-5 Zysten) an Zelldetritus gebundene stark apfelgrüne fluoreszierende Gebilde dar.

In der negativen Kontrolle ist keine Fluoreszenz nach weisbar.

Auf Grund der Erkenntnisse über den Umgang mit der Pronase wurde eine größere Stichprobe an Untersuchungsmaterial unter sucht. Dasselbe Untersuchungsmaterial wurde parallel ohne Pronase (IIFT OP) und mit Pronase (IIFT Pro) behandelt und mit dem entwickelten Immunfluoreszenztest untersucht (Tabelle 2). Es fand die Version 2 Anwendung, bei der die Erreger besser aus den Clusters herausgetrennt werden, so daß die Zysten überwiegend frei lagen.

Dabei stellte sich folgendes heraus:

- der IIFT Pro ist 10% sensitiver (relativer Wert) als die Grocott-Färbung. In zwei Fällen ist dies darauf zurück zuführen, daß nur sehr wenig Zysten vorhanden waren, die aber im Immunfluoreszenztest wegen der starken Fluoreszenz der Zystengruppe nicht zu übersehen waren.

In einem Fall trat eine unspezifische Fluoreszenz auf (Nr. 20), die auf eine zu dicke Beschichtung des Objektträgers zurückge führt werden konnte, weil sie bei Wiederholung des Immun fluoreszenztestes nicht mehr auftrat.

- der IIFT OP ist um vieles weniger sensitiv als der IIFT Pro und unspezifische Fluoreszenz war häufig, so daß die An wendung des Enzyms ihre Bestätigung findet.
- fast alle diese Untersuchungsmaterialien, besonders Sputum, sind hochkontaminiert mit anderen Erregern, überwiegend Pilzen (in der Grocott-Färbung gesichtet). In keinem der 30 Präparate traten beim IIFT Pro Probleme in der Auswertung des Ergebnisses auf Grund von Kreuzreaktionen auf.

Weiterhin wurde untersucht, was für Stadien im Immun fluoreszenztest nachgewiesen werden. Einzelne Präparate des IIFT Pro wurden mit Grocott für die Darstellung der reifen Zysten gegengefärbt und das Resultat fotografisch doku mentiert.

Die Ergebnisse zeigen, daß der Immunfluoreszenztest insge samt mehr Erreger nachweist. Das liegt daran, daß der Immun fluoreszenztest auch Präzysten darstellt und die Grocott- Färbung nicht, und daran, daß die Zysten zuvor im Immun fluoreszenztest mit Pronase chemisch verändert wurden, so daß die Antikörper die Zysten hochspezifisch wiederfinden konnten.

Tabelle 2

Untersuchungen für die Anwendbarkeit des polyklonalen Anti serums zum Nachweis von Zysten und Präzysten mittels Immun fluoreszenztest in bronchoalveolärer Lavage (= BAL) und induziertem Sputum (= Sp). OP=Material ohne Pronasebehandlung; Pro=selbiges nach Inkubation mit Pronase.

Im Immunfluoreszenztest werden mehr Zysten nachgewiesen, was die höhere Sensitivität des Immunfluoreszenztestes gegen über der Grocott-Färbung erklärt, wobei sicherlich ein Teil davon Präzysten sind.

Bei richtiger Vorbereitung kann jedes Untersuchungsmaterial (auch Sputum) untersucht werden. Die Pronase hat eine hervor ragende mucinlösende Wirkung, was für purulentes Material oder zähflüssiges Sputum sehr nützlich ist, so daß die An wendung des Enzyms diesbezüglich einen weiteren Vorteil bietet, weil keine gesonderte Mucolyse in einem weiteren Arbeitsschritt erforderlich ist.

Claims

1. Verfahren zur Produktion von Antikörpern gegen Erreger von Infektionskrankheiten, bei dem folgende Verfahrens schritte durchgeführt werden:

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das einwirkende Enzym ein proteolytisches Enzym ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß als proteolytisches Enzym Pronase, Papain, Trypsin oder Pepsin eingesetzt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Erreger aus der Gruppe der Protozoen Cryptosporidium spec., Isospora spec., Sarcocystis spec., Toxoplasma gondii und Pneumocystis carinii oder aus der Gruppe der Pilze Candida spec., Cryptococcus neoformans Aspergillus spec. oder aus der Gruppe der Pneumococcus spec. und Legionella pneumophila stammen.

5. Verfahren zum Nachweis eines Erregers von Infektions krankheiten unter Verwendung von nach dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 produzierten Anti körpern, dadurch gekennzeichnet, daß die Antikörper mit den Oberflächenantigenen des Erregers aus einer auf Befall durch entsprechende Erreger zu untersuchende Probe eine Verbindung eingehen, wobei die Probe enzyma tisch auf die gleiche Art und Weise behandelt wurde wie das den Erreger enthaltende Gewebe bei der Produktion der Antikörper.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die eingegangene Verbindung immuntechnisch, bevorzugt durch einen Immunfluoreszenztest oder ein Enzyme-linked- Immunosorbent-Assay (ELISA) nachgewiesen wird.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet,

a) daß von einem infizierten Träger den Erreger ent haltendes Gewebe entnommen wird, dieses Gewebe homo genisiert und mit einem proteolytischen Enzym versetzt wird, wobei das Enzym die Oberfläche des Erregers verändert, ohne daß das Gewebe verdaut wird,
b) daß anschließend mit Ultraschall behandelt wird, wo nach zentrifugiert und die das Antigen enthaltende Erregerfraktion abgetrennt wird,
c) daß das Antigen einem geeigneten Wirt verabfolgt wird, worauf das Antiserum, welches die gewünschten Anti körper enthält, gewonnen wird,
d) daß eine auf Befall durch entsprechende Erreger zu untersuchende Probe homogenisiert und mit demselben proteolytischen Enzym wie in Schritt a) versetzt und anschließend gewaschen wird,
e) daß die so behandelte Probe auf einem Objektträger getrocknet wird,
f) daß das unter Punkt c) gewonnene Antiserum auf die Probe aufgebracht wird, welche nach einer Inkubations zeit gewaschen wird,
g) daß die so vorbereitete Probe mit an die Antikörper des Antiserums bindenden weiteren Antikörpern, die mit einem fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt sind, versetzt wird, die Probe gewaschen und nachfolgend die Fluoreszenz beobachtet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß als proteolytisches Enzym Pronase, Papain, Trypsin oder Pepsin eingesetzt wird.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß aus dem gemäß Schritt a) veränderten Antigenen mono klonale oder polyklonale Antikörper gewonnen werden, welche zum Nachweis des Erregers eingesetzt werden.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 9, dadurch ge kennzeichnet, daß Pneumocystis carinii nachgewiesen wird.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch ge kennzeichnet, daß das proteolytische Enzym in einer Kon zentration von 0,002 bis 0,1 Gew.-% für eine Zeit von 5 bis 60 Minuten, bevorzugt in einer Konzentration von 0,004 bis 0,01 Gew.-% für eine Zeit von 10 bis 30 Minu ten auf das Gewebe einwirkt.

12. Verwendung von proteolytischen Enzymen wie Pronase, Papain, Trypsin oder Pepsin zur Veränderung der Ober flächen von Erregern in einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11.