DE69434796T2

DE69434796T2 - Chlamydia impfstoff enthaltend anti-idiotypische antikörper

Info

Publication number: DE69434796T2
Application number: DE69434796T
Authority: DE
Inventors: 5 Woods Road Judith A. Whittum- Hudson; Alex Bruce Macdonald; Elizabeth Sutton Amherst Stuart; Ling Ling Lajolla An
Original assignee: University of Massachusetts UMass; Johns Hopkins University; UMass Amherst
Current assignee: University of Massachusetts UMass; Johns Hopkins University; UMass Amherst
Priority date: 1993-03-19
Filing date: 1994-03-15
Publication date: 2007-07-12
Anticipated expiration: 2014-03-16
Also published as: AU6663494A; ATE333286T1; EP0690724B1; EP0690724A1; CA2158575C; BR9406014A; JPH08512195A; EP0690724A4; AU695949B2; WO1994021291A1; JP2990211B2; ES2270417T3; NZ266053A; KR960700747A; IL109026A; US5840297A; DE69434796D1; CN1106203C; IL109026A0; CA2158575A1

Description

STAND DER TECHNIK
Die vorliegende Erfindung betrifft einen Impfstoff gegen Chlamydia-Antigene, ein Verfahren zur Herstellung des Impfstoffs sowie ein Verfahren zur Immunisierung eines Menschen oder eines Tiers gegen Chlamydia und ein Verfahren zum Testen auf eine Infektion mit Chlamydia. Bei der Chlamydia-Infektion handelt es sich um eine breit gefächerte Gruppe von Infektionen der Bindehaut, der Genitalien, der Atemwege und bei Neugeborenen, die vorwiegend an Schleimhautoberflächen auftreten. Das etiologische Agens der Infektion ist ein obligater intrazellulärer bakterieller Parasit eukaryontischer Zellen, Chlamydiae. Es gibt in dieser Gattung drei genetisch unterschiedliche Arten mit einer gewissen Ähnlichkeit hinsichtlich Morphologie, des intrazellulären Entwicklungszyklus sowie antigener Reaktionen: Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci und Chlamydia pneumoniae.
Die Infektion mit C. trachomatis ist auf den Menschen beschränkt. Dabei werden auf der Grundlage antigener Variationen des Proteins MOMP (major outer membrane protein) 15 Serovare unterschieden (Grayston und Wang, J. Infect. Dis. 132:87, 1975). Die Serotypen D-K sind die häufigste Ursache für durch Geschlechtsverkehr übertragene Geschlechtskrankheiten. Nach konservativen Schätzungen treten in den Vereinigten Staaten in jedem Jahr mehr als 4 Millionen Fälle von Sexualinfektionen mit Chlamydia auf, womit sie häufiger vorkommen als alle anderen Geschlechtskrankheiten zusammen. Zu den Krankheiten gehören die nicht-gonorrhoische Urethritis, mukopurulente Cervicitis, akute Epididymitis, ektopische Schwangerschaft sowie Adnexitis (PID [pelvic inflammatory disease], Endometritis, Salpingitis, Parametritis und/oder Peritonitis). Die Infektion kann bei Frauen ziemliche Schäden anrichten: von den durch diesen Organismus in den Vereinigten Staaten jährlich verursachten 250.000 Fällen von Adnexitis führen 10% zur Unfruchtbarkeit. Von mit Chlamydia infizierten Müttern geborene Kinder sind in großer Gefahr, Einschlusskonjunktivitis und Lungenentzündung zu entwickeln. Die Serovare C. trachomatis A, B, Ba und C verursachen Trachom, eine Infektion der Bindehautepithelzellen. Die chronischen und Sekundärinfektionen induzieren die Infiltration subepithelialer Lymphozyten unter Bildung von Follikeln sowie die Invasion von Fibroblasten und Blutgefäßen zur Kornea, was zur Blindheit führt. Andererseits führt die Narbenbildung und Missbildung des Augenlids zu ständigem Scheuern der Kornea durch die Wimpern, was zur Kornealopakifikation und Blindheit führen kann. Weltweit gibt es ungefähr 500 Millionen Trachomfälle, wobei zwischen 7 und 9 Millionen der Patienten jetzt aufgrund ihrer Komplikationen blind sind, womit diese Krankheit, die weltweit führende Ursache für verhinderbare Blindheit ist. Die Prävalenz von aktivem Trachom ist im jungen Alter hoch. Es gibt 80 Millionen Kinder, die behandelt werden müssen. Dies stellte ein enorm wichtiges Gesundheitsproblem im mittleren Osten, Nordafrika, Südasien und Nordindien dar.
C. psittaci befällt hauptsächlich Tiere und Vögel. Und wirkte sich bzw. wirkt sich immer noch wirtschaftlich stark auf die Milch-, Woll- und Fleischindustrie aus. Es gibt 9 Serovare aus Säugerspezies, 7 Serovare aus Vogelspezies und zwei Biovare aus Koalabär. Die Säugerserovare 1, 2, 3 und 9 infizieren Rinder und Schafe und verursachen eine große Bandbreite von Erkrankungen von Infektionen der Plazenta und des Fötus und anderer Fortpflanzungsprobleme, einschließlich Polyarthritis-Polysisitis, Encephalomyelitis, Konjunktivitis ebenso wie Darminfektionen. Obwohl zahlreiche Versuche unternommen wurden, Impfstoffe herzustellen, wurden dabei nur geringe Erfolge erzielt (Schnorr, J. Am. Vet. Med. Assoc. 195:1548, 1998). Die Serovare 4, 5 und 6 sind die Ursache für Fehlgeburten, Lungenentzündung und Polyarthritis in Schweinespezies. Das Serovar 7 stellt Chlamydienstämme für Konjunktivitis, Rhinitis und Pneumonitis in Katzen dar, und das Serovar 8 umfasst die Einschlusskonjunktivitis bei Meerschweinchen. Die Vogelstämme verursachen häufig eine Infektion beim Menschen im Umgang mit Vögeln und bei Arbeitern bei der Geflügelverarbeitung.
Bei C. pneumoniae handelt es sich um eine neuidentifizierte Spezies. Bislang konnte ein Serovar identifiziert werden, nämlich TWAR (Grayston, Proceeding of the Seventh International Symposium on Human Chlamydial Infections, S. 89, 1990). Zurzeit gibt es Hinweise dafür, dass es sich bei C. pneumoniae um einen primären menschlichen Erreger handelt, der von Mensch zu Mensch übertragen wird und in Erwachsenen etwa 10-20% der Fälle an allgemein erworbener Lungenentzündung verursacht. Es ist zum Hauptverursacher menschlicher Atemwegserkrankungen, wie z.B. Lungenentzündung, Bronchitis, Pharyngitis und Sinusitis, geworden sowie ein mögliches Agens bei reaktiver Arthritis. Epidemien traten in Krankenhäusern, beim Militär und in Familien auf. Die serologischen Befunde aus vielen Ländern zeigten, dass 50-55% der Erwachsenen mit Antikörper TWAR-Antigen für C. pneumoniae spezifisch sind. Es stellt die Hauptursache bakterieller Krankheiten in Neugeborenen dar. In älteren Personen sowie solchen mit chronischen Krankheiten kann die Infektion zu einer ernsten Krankheit oder sogar zu Tod führen.
Die Pathogenität der Chlamydieninfektion ist nicht sehr gut bekannt. Seit langem ist bekannt, dass verschiedene mit diesen Serovaren infizierte Individuen klinisch unterschiedliche Manifestationen präsentieren. Es wurde vorgeschlagen, dass dies wahrscheinlich an der verschiedenartigen Immunantwort des Wirts liegt. Es konnte gezeigt werden, dass die immunologische Antwort auf die synthetischen Th/B-Zellepitope in den verschiedenen Mausinzuchtstämmen unterschiedlich ist, was darauf hinweist, dass das T-Helferepitop im Zusammenhang mit dem multiplen Hauptkompatibilitätskomplex erkannt wird.
Das Ziel einer Chlamydieninvasion stellen typischerweise Epitelzellen eines Wirts dar. Es ist noch nicht sicher, wie die Chlamydien-Elementarkörperchen (EB [elementary bodies]) (ein sporenähnliches, rundes Partikel mit einem Durchmesser von etwa 300 nm) in die Wirtszelle eindringen: über rezeptorvermittelte Endocytose und/oder nichtspezifische hochaffine Absorption. Es wurde berichtet, dass zwei Proteine mit 18 bzw. 32 kD von C. trachomatis an Hela-299-Zellmembranpräparationen bindet. Kürzlich wurde vorgeschlagen, dass ein weiteres hitzelabiles Proteinmembranprotein mit 38 kD an die Hela-Zelllinie bindet, was auf einen ligandenähnlichen Mechanismus schließen lässt. Ebenso wurde vorgeschlagen, dass aufgrund der Fähigkeit von Chlamydien, verschiedene Säugerzellen in vitro zu infizieren, ein gewisser Anhaftungsmechanismus vorliegen muss, um die Infektion zu etablieren. Als ein solches Adhäsin wurde das Hauptprotein der äußeren Membran vorgeschlagen. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass ein auf der Oberfläche von Chlamydienorganismen vorhandenes Heparinsulfat-ähnliches Glycosaminoglycans für die Bindung an Wirtszellen erforderlich ist. Die Rezeptoren auf den Wirtszellen wurden ebenso untersucht. Dabei wurde vorgeschlagen, dass aufgrund von Trypsinsensitivität gegenüber der EB-spezifischen Bindung Proteine mit 18.000 und 31.000 kD aus Hela-Zellen die Rezeptoren sind. Ebenso konnte gezeigt werden, dass C. trachomatis und C. pneumoniae spezifisch an ein Lipid auf Hela-Zellen binden. Durch kernmagnetische Resonanzspektroskopieanalyse sowie Atombeschuss-Massenspektrometrie konnte gezeigt werden, dass es sich dabei um das Phosphatidylethanolamin (PE) handelte. Gleichzeitig stellte sich heraus, dass Glycolipide der Ganglio-Reihe spezifisch an EBs gebunden waren. Alle diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass der Mechanismus der Endocytose durch Wirtsepitelzellen immer noch unklar ist.
Sobald die EBs über Endocytose in die Wirtszellen eindringen werden sie je nach den Bedingungen in ein metabolisch aktives, nichtinfektiöses Retikularkörperchen (RB [reticulate body]) umgewandelt. Der Hauptzweck der RBs besteht in der intrazellulären Replikation durch binäre Spaltung unter Verwendung von Wirtsmetaboliten. Dies erfolgt in einem membrangebundenen Vesikel, das als Einschluss bezeichnet wird. Dieser Einschluss (Endosom) kann der Fusion mit den Lyosomen von Wirtszellen widerstehen. Aus jedem RB entstehen schließlich eine oder mehrere EBs, die einen weiteren Infektionszyklus starten können. Wirtszellen können durch Freisetzung von Eunschlusskörperchen lysiert oder durch Ausschlusskörperchen-Exocytose unbeschädigt bleiben. Man nimmt an, dass Oberflächenantigene sowohl die Phagocytose als auch das Umgehen einer phagolysosomalen Fusion steuern.
Die Behandlung von Chlamydiainfektionen beruhte bislang auf der Verabreichung von Antibiotika. Dies stellte sich in den frühen Phasen der Infektion in Abhängigkeit von dem korrekten Zeitpunkt der Diagnose und des Screening als wirksam heraus. Das Problem dabei ist, dass die Infektion asymptomatisch sein kann. Die meisten Patienten bemerken nicht, dass eine Infektion vorliegt, bis sie bereits seit einiger Zeit stattgefunden hat. Im chronischen Stadium, wie etwa bei einer Infektion der Genitalien, konnte demonstriert werden, dass zur Verhinderung der Schädigung der Reproduktionswege in einem Affeninfektionsmodell wenig getan werden kann.
In einem Versuch zur Verhinderung von durch Mitglieder der Trachombiovare verursachten Chlamydiainfektionen wurden Impfstoffe unter Einsatz des gesamten Organismus oder Untereinheiten des Organismus verwendet. Diese Versuche verliefen jedoch enttäuschend, und zwar teilweise aufgrund einer Überempfindlichkeit des Wirts hinsichtlich der Reaktion gegenüber den Impfstoffen (Graystone et al., Clini. Med. J. (Republic of China) 8:312, 1961, Wang et al., 1967, Am. J. Opthalmol. 63:1615, Schachter, Pathol. Immunopathol. Res. 8:206, 1989). Es wird vermutet, dass es sich bei der mit Infektionen assoziierten Pathologenese um einen Prozess verzögerter Überempfindlichkeit handelt. Man glaubt, dass eine durch wiederholte Neuinfektion von Menschen resultierende chronische Entzündung eine wichtige Rolle bei der Bindehautinfiltration, den Erblindungsfolgeerscheinungen von Trachom sowie der Vernarbung der Eileiter, die zur Unfruchtbarkeit und ektopischen Schwangerschaft führen, spielt. Die Oberflächenantigene von Elementarkörperchen standen im Mittelpunkt von Forschungsarbeiten, bei denen versucht wurde, ein schützendes Antigen zu identifizieren.
Oberflächenkomponenten von Chlamydia Wechselwirken aktiv mit Wirtszellen und mit dem Immunsystem des Wirts. Man nimmt an, dass sie für die Anbindung, die Endocytose und die Immunantwort verantwortlich sind, doch konnte die genaue Art und Regulation dieser Wechselwirkungen noch nicht vollständig identifiziert werden. Mehrere unterschiedliche antigene Komponenten von C. trachomatis, C. psittaci und C. pneumoniae sind untersucht worden, einschließlich der Identifizierung, Charakterisierung und Funktion bei der Chlamydieninfektion. Zudem ist es wichtig, den Infektionsmechanismus sowie die schützenden Antigene zu bestimmen. An der Oberfläche ausgesetzte Antigene bilden die Hauptziele für einen Großteil der Forschungsarbeiten, da sie für das Immun- oder andere Abwehrsysteme zugänglich sind. Zu den am stärksten untersuchten Antigenen gehören die Hauptproteine der äußeren Membran (MOMP), Chlamydien-Lipopolysaccharid, 60-kD-Hitzeschockprotein (HSPO 60), Adhäsine sowie ein Exoantigen (GLXA) genanntes Glycolipid-Exoantigen.
In der äußeren Membran von Chlamydia gibt es drei cysteinreiche Proteine mit 57,40 bzw. 12,5 kD, die den Matrixproteinen gramnegativer Bakterien ähneln. Die Proteine mit 57 und 12,5 kD sind in der replizierenden Form der Bakterien-RBs nicht zu finden. Da das Hauptprotein der äußeren Membran (MOMP) mit 40 kD sowohl in infektiösen EBs als auch RBs, stark vorhanden ist, könnte das Protein als Poren bildendes Protein fungieren, das den Austausch von Nährstoffen für die Retikularkörperchen gestattet. Durch genetische und molekulare Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass dieses Protein aus vier variablen Segmenten (VS), die zwischen fünf konstanten Segmenten liegen, zusammengesetzt ist. Diese variablen Segmente sind oberflächenexponiert und weisen die Determinanten einer Serovar-Subspezies- und Spezies-Spezifität auf.
Die Untersuchungen zu den Immunreaktionen gegenüber diesem Protein werden hauptsächlich über die Immunisierung von Tieren mit gereinigtem Protein durchgeführt. In-vitro-Neutralisierungsexperimente wurden unter Verwendung des Gemischs aus für MOMP und EBs spezifischen poly- oder monoklonalen Antikörpern zur Infektion der Zellkultur ausgeführt. Diese Experimente deuten darauf hin, dass die für das MOMP-Protein oder ein einziges Epitop spezifischen Antikörper die Bildung von Einschlusskörperchen in der Zellkultur verhindern. Der Neutralisierungsmechanismus beinhaltet nicht die Hemmung der Anbindung oder Penetration sondern stört eher den Vorgang nach der Internalisierung. Bei Verwendung von mit den vollständigen Elementarkörperchen des Serovars B erzeugten monoklonalen Antikörpern, die das immunologisch zugängliche MOMP-Epitop in Dot-Blot-Assays erkannten, neutralisierten diese die Infektiösität von Organismen gegenüber Affenaugen. Dabei war der Schutz Serovar-spezifisch. In einem späteren Experiment wurde unter Verwendung von FAB-Fragmenten des monoklonalen Antikörpers weiter demonstriert, das monovalentes FAB die Infektion durch Verhindern der Anbindung an HaK(Syrian hamster kidney)-Zellen neutralisierte. Damit wurde bestätigt, dass der Schutz nicht an der Aggregation bivalenter IgGs lag. Ebenso wurden T-Zellepitope von MOMP untersucht. Dabei wurden T-Zellproliferationsreaktionen in Milz-T-Zellen festgestellt, die aus mit MOMP in Gegenwart überlappender synthetischer Peptide, die die Primärsequenz von Serovar-A-MOMP darstellen, immunisierten A-J-Mäusen erhalten worden waren. Die eine T-Zellantwort produzierenden synthetischen Peptide entsprechen oberflächenzugänglichen Serovarspezifischen Epitopen, die in den variablen Domänen (VD) VD I und VD IV lokalisiert sind. Unter Verwendung eines ähnlichen Ansatzes stellte sich heraus, dass in BALB/cByJ-Mäusen das VDIII-Fragment T-Zellen-abhängig ist. Ebenso konnte gezeigt werden, dass bei Verwendung chimärer T/P-Zellpeptide, die von zwei Epitopen des MOMP abgeleitet sind, es sich bei einem um ein konserviertes T-Helferzellen-Epitop und bei dem anderen um ein Serovar-A-spezifisches neutralisierendes Epitop handelt. Einige Mäuse, die mit diesem Peptid immunisiert waren, produzierten Serum neutralisierende Antikörper mit hohem Titer, während andere dies nicht taten. Obwohl es sich bei MOMP um ein sehr intensiv untersuchtes Oberflächenantigen handelt und die Neutralisierungsantiseren in Versuchstieren produziert wurden, gibt es immer noch viele ungelöste Fragen hinsichtlich der Immunantwort. So ist beispielsweise die Neutralisierung der Infektion Serovar-spezifisch und somit als Impfstoffkandidat limitiert. Die Neutralisierung ist noch auf in-vitro-Untersuchungen beschränkt, und bislang gibt es keinen überzeugenden in-vivo-Schutz vor einer Herausforderung durch Immunisierung mit einem der bekannten MOMP- oder chimären Epitope.
Es ist seit langem bekannt, dass es sich bei einem gattungsspezifischen Chlamydia-Antigen um ein Glycolipid handelte (Dhir et al., J. Immunol. 109:116-122, 1972). Viel später stellte sich heraus, dass die äußere Membran sowohl der EBs als auch der RBs von Chlamydia Lipopolysaccharid (LPS) enthielt. Dieses weist eine ähnliche chemische Struktur zu enterobakteriellem LPS des RE-Chemotyps auf (Nurminen et al., Science 220: 1279-1281, 1983). Die durch Immunisierung mit EBs des Serovars L2 hergestellten monoklonalen Antikörper waren spezifisch gegen LPS von Chlamydia, aber nicht gegen LPS von N. Gonorrhoeae, S. typhimurium oder E. coli. Allerdings erkannten mit S. typhimurium-RE-LPS oder -Lipid-A produzierte Antikörper Chlamydien-LPS (Caldwell und Hitchcock, Infect. Immun., 44:306, 1984). Dies zeigte, dass Chlamydien-LPS im Vergleich mit anderen gramnegativen Bakterien eine einzigartige antigene Domäne aufweist. Durch weitere Charakterisierung konnte gezeigt werden, dass Chlamydia-spezifische Domäne in ihrem Saccharidanteil 3-Desoxy-D-manno-2-octulosonsäure (KDO) mit einer Sequenz von -kDo(2-8)- kDo(2-4)- -kDo(kDo3) enthielt. Die 2.8-verknüpfte Gruppierung stellt die strukturelle Charakteristik von Chlamydien-LPS dar. Untersuchungen wurden ebenso bei der Verteilung und Relokalisierung von LPS auf der äußeren Membran während des Entwicklungszyklus durchgeführt. Durch Immunfärbung mit einem monoklonalen Antikörper konnte gezeigt werden, dass LPS während des Entwicklungszyklus locker in der Membran gebunden und nicht an das Medium abgegeben wird.
Man glaubte, dass Chlamydien-LPS aufgrund seiner großen Menge auf der Oberfläche und seiner Antigenität ein ideales Antigen für den Impfstoffkandidaten darstellt. Es wurde vermutet, dass LPS eine wichtige virulente Determinante in den frühen Infektionsschritten ist, wobei die dafür spezifischen Antikörper einer gewissen Funktion bei der Beseitigung der Chlamydieninfektion dienen. Allerdings ist über die biologische Funktion von LPS bzw. der immunologischen Reaktion darauf wenig bekannt. Es scheint, dass die für LPS spezifischen Antikörper nur bei der Diagnose der Chlamydieninfektion und der Lokalisierung von LPS nützlich, jedoch unwirksam bei der Beseitigung einer Infektion waren.
Weitere gattungsspezifische Chlamydien-Antigene sind Proteine mit 57 bis 60 bzw. 75 kD, die als Verwandte der Familie der Hitzeschockproteine (HSP) identifiziert wurden. Dazu wurde die Sequenz der für diese Proteine codierenden Operons mit der mit dem Operon der groE-Stressantwort aus E. coli oder B. megaterium verglichen. Die antigene Identität des 57 kD großen Proteins wurde durch die Reaktion mit Anti-HSP-60-Antiserum bestätigt. Das 60 kD große Protein rief eine okulare Überempfindlichkeitsreaktion in immun gemachten Meerschweinchen hervor, die durch eine zelluläre Infiltration vorwiegend mononukleärer Makrophagen und Lymphozyten gekennzeichnet war (Watkins et al., Proc. Natl. Rcad. Sci. USA 83:7580, 1986, Morrison et al., S. Exp. Med. 169:663, 1989). Dies war der erste Hinweis darauf, dass ein Antigen für die verzögerte Überempfindlichkeit bei einer Augeninfektion mit Chlamydia verantwortlich ist. Die Beteiligung dieses Proteins bei der Stimulierung immunpathogener Reaktionen bei menschlichen Chlamydienerkrankungen konnte noch nicht genau bestimmt werden. Es gibt Anzeichen dafür, dass ein gewisser Prozentsatz an von Frauen mit PID, ektopischer Schwangerschaft und Eileiterunfruchtbarkeit entnommenen Seren eine große Menge Antikörper gegen Chlamydia aufweist, die auf das Chlamydien-Hitzeschockprotein HSPO-60 reagieren. Allerdings reagieren nicht alle Patientenseren, die hohe Titer gegen Chlamydia aufweisen, damit, was darauf hindeutet, dass HSP-60 entweder nicht oberflächenexponiert ist, oder die Antigenität MHC-beschränkt ist.
Es stellte sich heraus, dass das 75 kD große Protein vorzugsweise während Hitzestress von Chlamydia-Organismen transkribiert wird. Man fand heraus, dass die gegen das 75 kD große Protein produzierten monospezifischen Antikörper aus Kaninchen an den Organismus binden und die Infektion in vitro neutralisieren. Es handelt sich hierbei um ein in der äußeren Membran exponiertes Antigen.
Das gattungsspezifische Glycolipid-Exoantigen (GLXA) wurde ursprünglich aus den Überständen von mit Chlamydia infizierten Zellkulturen isoliert (Stuart and MacDonald, Current Microbiology, 11:123, 1982). In den letzten Jahren wurde es chemisch, biologisch und seroligisch charakterisiert (Stuart und MacDonald, Proceedings of the Sixth International Symposium on Human Chlamydia Infections, S. 167, 1986, Stuart et al., Immunology, 67:527, 1987). Eine massenspektrographische Analyse zeigte, dass GLXA Polysaccharide, und zwar Gulose (nicht Glukose), Mannose und möglicherweise Galactose, enthält, während die Lipidkomponente Fettsäuren der Kettenlänge C17 und C18:1 aufweist. KDO oder Lipid A werden in seiner Struktur nicht angetroffen. Es wird von den infizierten Zellen während des Wachstumszyklus in vitro produziert und freigesetzt. Mit Transmissionselektronenmikroskopie unter Nutzung eines mit kolloidalem Gold konjugierten zweiten Ziege-anti-Maus-Antikörper zum Nachweis des spezifisch gebundenen monoklonalen Antikörpers konnte gezeigt werden, dass GLXA 48 Stunden nach der Infektion größtenteils extrazellulär vorliegt (Stuart et al., Immunolgy, 74:747, 1991), was sich von dem Ergebnis für Chlamydien-LPS unterscheidet. Menschliche Seren aus Patienten mit klinisch definiertem Lymphogranuloma venereum (LGV) enthalten IgG-Antikörper, die GLXA erkennen (Stuart et al., Immunology, 68:469, 1989), was die immunologische Zugänglichkeit bei der natürlichen Infektion demonstriert. Es gab jedoch nur wenig Informationen über seine Funktion bei der Chlamydieninfektion und der Immunantwort dagegen. Die immunologische Reaktion gegen Chlamydien-Antigene wird in ihrer Gesamtheit nicht gut verstanden. Es ist immer noch nicht bekannt, wie die Chlamydien die Immunüberwachung des Wirts umgehen. In infizierten menschlichen Patienten gefundene, zu Chlamydien-Antigenen spezifische Antikörper zeigten wenig Schutz gegen eine spätere Infektion. Obwohl Chlamydia hauptsächlich Schleimhautoberflächen betrifft, wurde die klinische Relevanz der IgA-Immunität dagegen noch nicht vollständig beschrieben. Die Tauglichkeit eines Chlamydia-Impfstoffs hängt von der Erzeugung einer Schutzabwehr des Wirts ab, zu der eine S-IgGA-Antwort, eine zellvermittelte Antwort sowie möglicherweise ein humoraler Antikörper gehören können. Darüber hinaus deutet die Fähigkeit zur Produktion großer Mengen dieses Antigens an, dass das Verfahren der Wahl ein synthetisches und/oder chimäres Antigen sein kann.
Idiotypen sind im Anschluss an die Netzwerktheorie von Jeme von 1974 intensiv untersucht worden. Einer seiner Hauptvorschläge besteht in der Selbstregulation des Immunsystems über ein Netzwerk von Idiotyp-Antiidiotyp-Wechselwirkungen (Jeme, 1974). Dabei wird vorgeschlagen, dass die Ideotypen auf einem einzigen Antikörpermolekül ein beliebiges fremdes oder eigenes Epitop auf der molekularen Ebene imitieren können (d.h. das "interne Abbild" darstellen).
Es stellte sich heraus, dass alle Idiotypen eines einzelnen Immunglobulinmoleküls auf dem Fv ("fragment variable" [variables Fragment])-Bereich lokalisiert sind, und zwar durch Untersuchungen, in denen gezeigt wurde, dass die Hemmung der Bindung antiidiotypischer Antikörper an das Idiotyp zwischen Fv und Fab gleich ist (Givol, 1991). Im Allgemeinen werden antiidiotypische Antikörper in die drei Typen Ab₂α, AB₂β und Ab₂ε eingeteilt. Dabei bindet nur AB₂β an den Komplimentarität bestimmenden Bereich und kann somit das interne Abbild des Antigens darstellen. Das Auftreten von das interne Abbild oder interne Eigenschaften präsentierendem Ab₂ muss die folgenden Kriterien erfüllen; (1) Bindung an Ab₁ und an alle anderen Anti-nominales-Antigen-Antikörper aus anderen Spezies sowie Fehlen der Reaktivität mit Ab₂ zu anderen Antikörpern; (2) Hemmung der Bindung von Ab₁ an das spezifische Antigen, das nominale Antigen, und (3) die Fähigkeit zum Auslösen der Synthese von Ab3 mit Anti-Antigen-Spezifität in Tieren ohne vorherige Exposition gegenüber dem Antigen (Ertl und Bona, 1988).
Die wichtige Rolle antiidiotypischer Antikörper in vivo konnte in zahlreichen Experimenten gezeigt werden. Es stellte sich heraus, dass die Verabreichung antiidiotypischer Antikörper unterschiedliche Effekte hervorruft: entweder Unterdrückung oder Verstärkung der Reaktionen auf das spezifische Idiotyp (Hart, 1972, Kennedy, 1983). Bei der Autoimmunität spielt dies sicherlich eine wichtige Rolle. Die mit vielen Autoimmunkrankheiten assoziierte Pathologie liegt höchstwahrscheinlich (wenigstens zum Teil) an einer direkten Idiotyp-Antiidiotyp-Wechselwirkung der Autoimmunantikörper mit antiidiotypischen Antikörpern. Die idiotypische Spezifität in einem spezifischen Antikörper wurde zuerst dadurch charakterisiert, dass man demonstrieren konnte, dass die Idiotypenerkennung durch spezifische Haptenbindung gehemmt werden konnte. Die Gültigkeit des internen Abbilds wurde erstmals in der von Sege und Peterson 1978 vorgelegten Arbeit experimentell unterstützt, wobei Antiidiotyp als Sonde zur Identifizierung von Zelloberflächenrezeptoren verwendet wurde.
Die besten Informationen hinsichtlich der genauen molekularen Grundlage für die Imitierung erhält man gegenwärtig über Röntgenkristallographie des Idiotyp-Antiidiotyp-Komplexes. Bei der Grundlage für die molekulare Mimikry der Antikörper kann es sich entweder um eine lokale Sequenzhomologie zum ursprünglichen Protein, wie in einem Reovirus-System, oder in den meisten Fällen um identische Konformationen aus vollkommen unterschiedlichen Aminosäuresequenzen, wie bei der Hämoglobin-Myoglobin-Familie von Proteinen, handeln. Röntgenkristallographie sowie Sequenzdaten der späteren Untersuchungen zeigten, dass von Proteinen, bei denen bis zu 137 von 141 Aminosäuren verschieden sind, identische, funktionsfähige Konformationen angenommen werden können. Die Untersuchungen der Kristallstrukturen des Idiotop-Antiidiotop-Komplexes im Anti-Lysozym-Antikörper und dem Antiidiotop demonstrierten, dass ein privates Idiotop aus 13 Aminosäureresten besteht, die zum größten Teil aus den komplementaritätsbestimmenden Bereichen stammen, die jedoch drei Reste aus dem dritten Grundgerüstbereich seiner VL-Domäne einschließen. Sieben dieser Reste stimmen mit dem Paratop des Anti-Lysozym-Antikörpers überein, was auf eine signifikante Überlappung zwischen Idiotop und Antigenkombinierungsstelle hindeutet. Seit seiner Entdeckung und Realisierung stellte der Idiotyp ein einzigartiges Werkzeug bei der Charakterisierung und Manipulierung der Immunantwort dar: als klonaler Marker zur Verfolgung der B-Zellentwicklung, der somatischen Mutation und dem Schicksal von Klonen von B-Zellen. Sie wurden als phänotypischer Marker für Keimbahn-V-Gene verwendet. Antiidiotypische Antikörper, die das interne Abbild externer Krankheiterreger, wie z.B. Virus, Bakterien oder Parasiten, tragen, wurden als Ersatzantigene für Impfstoff verwendet und werden bei der Behandlung von B-Zellen-Lymphom und Autoimmunkrankheiten, wie z.B. Encelphalomyelitis, eingesetzt.
Vor der vorliegenden Erfindung wurde die Produktion neutralisierender Antikörper unter Verwendung eines Antiantiidiotypischer-Idiotyp-Antikörpers zur Imitierung eines Kohlenhydratantigens mittels eines Bakteriensystems erreicht, Schriver et al., J. of Immunol; 144: 1023, 1990.
Dementsprechend wäre es wünschenswert, ein Mittel zur Herstellung eines gattungsspezifischen Impfstoffs, mit dem für eine Immunisierung gegenüber einer Chlamydieninfektion gesorgt werden kann, bereitzustellen. Ebenso wäre es wünschenswert, ein Mittel zur quantitativen Herstellung eines derartigen Impfstoffs sowie ein Verfahren zur Erhöhung der Wirksamkeit des Impfstoffs bereitzustellen.
Entsprechend wird in einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ein monoklonaler Antiidiotypischer Antikörper nach Anspruch 1 bereitgestellt. Ebenso wird von der vorliegenden Erfindung eine kontinuierliche Hybridzelllinie nach Anspruch 2, ein Impfstoff nach Anspruch 6 sowie ein Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins eines Antikörpers nach Anspruch 9 bereitgestellt. Ebenso wird von der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis von Zellen nach Anspruch 12 sowie eine Zusammensetzung nach Anspruch 16 bereitgestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
Bei 1 handelt es sich um eine Bindungskurve von Meerschweinchen-Antiseren an monoklonalen GLXA-Ab₁.
Bei 2 handelt es sich um eine Bindungskurve von Meerschweinchen-Antiseren von anti-monoklonalem GLXA-Ab₁-IgG an normales Maus-IgG vor und nach Immunsorbtion.
Bei 3 handelt es sich um eine Kurve, die die Hemmung der Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA durch absorbierte antiidiotypische Meerschweinchen-Antiseren zeigt.
Bei 4 handelt es sich um eine Kurve, die die Auftrennung von antiidiotypischem Meerschweinchen-IgG zeigt.
Bei 5 handelt es sich um eine Kurve, die die Hemmung der Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA durch antiidiotypische Meerschweinchen-Isotypen zeigt.
Bei 6 handelt es sich um eine Kurve, die die Bindung von anti-antiidiotypischem Kaninchen-Antikörper an antiidiotypisches Meerschweinchen-IgG zeigt.
Bei 7 handelt es sich um eine Kurve, die die Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA durch Kaninchen-GLXA-Ab₃ zeigt.
Bei 8 handelt es sich um eine Kurve, die den Nachweis spezifischer ribosomaler Chlamydia-RNA aus Primaten zeigt.
Bei 9 handelt es sich um eine Kurve, die die Wirkung von GLXA-Ab3 -IgG auf eine Augeninfektion über einen klinischen Krankheitspunktwert zeigt.
Bei 10 handelt es sich um eine Kurve, die die Hemmung der Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA durch einen Hybridomklon zeigt.
Bei 11 handelt es sich um eine Kurve, die die direkte Bindung von Chlamydia-Patientenantiserum an monoklonalem GLXA-M Ab₂ zeigt.
Bei 12 handelt es sich um eine Kurve, die zeigt, dass Antichlamydia-Kaninchen-Antiserum monoklonalen GLXA-M Ab₂ kennt.
Bei 13 handelt es sich um eine Kurve, die den Schutz von Mäusen vor einer Chlamydieninfektion durch Immunisierung mit monoklonalem GLXA-M Ab₂ zeigt.
Bei 14 handelt es sich um eine Schutzkurve durch monoklonales GLXA-M Ab₂ IgG nach einer hohen Dosis von Augeninfektionen.
Bei 15 handelt es sich um eine Kurve, die die Wirkung von Alaun auf den Schutz einer Maus-Chlamydieninfektion zeigt.
In 16A und B sind Kurven des zeitlichen Verlaufs der Okularen Infektiösität nach Immunisierung mit monoklonalem GLXA-Ab₂ gezeigt.
BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass ein antiidiotypischer Antikörper (im Folgenden: GLXA-Ab₂) in einem Tier einen anti-antiidiotypischen (im Folgenden: GLXA-Ab3) Antikörper produzieren kann, der GLXA erkennt, mit dem ein Tier gegen Chlamydia immunisiert werden und eine Infektion mit Chlamydia in einem Tier neutralisiert werden kann. Darüber hinaus wurde im Sinne der vorliegenden Erfindung festgestellt, dass es sich bei dem geeigneten antiidiotypischen Antikörper entweder um einen polyklonalen Antikörper oder einen monoklonalen Antikörper handeln kann. Darüber hinaus wurde entdeckt, dass diese Aktivitäten des GLXA-Ab₂ überraschenderweise trotz der Tatsache, dass sein Vorläufer, der idiotypische Antikörper (im Folgenden: GLXA-Ab₁), von dem Ab₂ erhalten wird, keine signifikante Aktivität entweder bei der Immunisierung oder Neutralisierung gegen eine Infektion mit Chlamydia aufweist, erhalten werden.
Mit Verwendung des GLXA-Ab₂ zur Imitierung von Kohlenhydrat des Glycolipidantigens bietet die vorliegende Erfindung eine alternative Strategie für die Umwandlung eines Thymusunabhängigen Antigens zu einem Thymus-abhängigen Immunogen, da es sich bei den Idiotyp-Impfstoffen um Proteine handelt. Die Verfügbarkeit von GLXA-Ab₂, der das Chlamydien-Antigen GLXA im Sinne der vorliegenden Erfindung imitiert, ist von Bedeutung: (1) bei der Klärung der mit dem auf GLXA vorhandenen Kohlenhydratepitop assoziierten immunologischen Mechanismen, (2) seiner Funktion bei der Chlamydieninfektion, wie z.B. der Bindung und Phagozytose der Wirtszellen und (3) damit wird ein essentielles Werkzeug zur Identifizierung eines GLXA-spezifischen Rezeptors der Wirtszellen bereitgestellt. Ebenso wird ein Mittel zur Herstellung eines Chlamydien-Impfstoffs hergestellt.
Bei monoklonalem GLXA-Ab₂ handelt es sich um ein Immugen (d.h. er ist in der Lage, eine Immunantwort hervorzurufen) und spezifisch an die Produkte dieser Antwort zu binden, gleichgültig ob es sich dabei um Antikörper und/oder Zellrezeptoren von B-Zellen oder T-Zellen handelt. Die schnelle Reaktion auf monoklonalen GLXA-Ab₂ sowie das im unten im Beispiel I und 16A und 16B diskutierten „Re-Challenge"-Experiment demonstrierte Gedächtnis, deutet darauf hin, dass eine T-Zellantwort stimuliert wurde. Dies bedeutet, dass die T-Helferzelle auf eine antigene Determinante (Epitop) antwortet, die sich von dem GLXA-Epitop unterscheidet, und an der Stimulierung von B-Zellen beteiligt ist, die einen Antikörperrezeptor für GLXA-Ab3, der GLXA bindet, produzieren. Darüber hinaus kann es sich bei der T-Helferzelle um denjenigen Typ handeln, der Cytokine produziert, von denen gezeigt werden konnte, dass sie an Chlamydia-Schutzinfektionen beteiligt sind. Bei zwei dieser Cytokine handelt es sich um gamma-INF (gamma-Interferon) sowie TNF (Tumornekrosefaktor).
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird Folgendes bereitgestellt: (1) Produktion polyklonaler und monoklonaler antiidiotypischer Antikörper, ausgewählt für das interne Abbild von antigenem Epitop auf GLXA, (2) Charakterisierung der antiidiotypischen Antikörper und (3) Impfstoff, mit dem die Immunisierung, Neutralisierung und der Schutz einer Chlamydien-Infektion sowohl in vitro als auch in vivo bereitgestellt wird, und (49 Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins von Chlamydia in einer biologischen Probe.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird zur Herstellung eines gegen eine Infektion mit Chlamydia aktiven Impfstoffs in einem ersten Schritt ein Antikörper gegen GLXA mit einem beliebigen herkömmlichen Verfahren produziert.
Das GLXA wird mit einem beliebigen zurzeit verfügbaren Verfahren gewonnen und aufgereinigt. So lässt sich GLXA auf einer Octylsepharose-Säule isolieren und mit Alkohol eluieren, auf DEAE-Sepharose isolieren und in einer wässrigen Lösung mit einem niedrigen pH- wert eluieren oder auf einer Säule mit Polyacrylamidkügelchen isolieren und mit einer wässrigen KSCN-Lösung (5M) mit niedrigem pH- wert eluieren.
In einem bevorzugten Verfahren wird GLXA aus dem Überstand infizierter Zellkulturen mit zurzeit verfügbaren Verfahren, wie z.B. durch Ausschlusschromatographie mit einer Sepharose-6B-ClSäule in 0,075 M Phosphat, 0,154 M NaCl, pH 7,2, gewonnen und aufgereinigt. Dabei erscheint das GLXA in der vorderen Fraktion der Säule und wird über einen Chemilumineszenztest unter Verwendung eines mit Acridiniumester konjugierten monoklonalen GLXA-Ab₁ nachgewiesen. Die das GLXA enthaltenden Fraktionen sind üblicherweise mit Nukleinsäuren, jedoch nicht mit Protein verunreinigt. Die GLXA-Fraktionen werden vereinigt, eingeengt und mit RNase und DNAase etwa 2 Stunden bei 37°C, pH 8,0 behandelt. Das Gemisch wird nochmals über die gleiche Säule chromatographiert und ist dann rein. Es lässt sich bei 4°C (mit oder ohne Konservierungsstoff) lagern.
Der Antikörper kann polyklonal oder monoklonal sein. Bei der Produktion von monoklonalem Antikörper wird ein idiotypischer Antikörper GLXA-Ab₁ durch Immunisieren eines Tiers, üblicherweise einer Maus, mit GLXA als Antigen bereitgestellt. Anschließend werden Milzimmunzellen des Tiers identifiziert, isoliert und mit Lymphom- oder Myelomzellen fusioniert, indem sie mit einem Fusionsmittel, wie z.B. Polyethylenglykol, wie etwa nach dem Verfahren von Kohler & Milstein, Nature 256:459, 1975, in Kontakt gebracht werden. Die fusionierten Zellen werden dann in einem Selektionsmedium, wie z.B. HAT-Medium, das das Wachstum nichtfusionierter Malignantzellen ausschließt, inkubiert. Die Hybridomzellen werden durch limitierte Verdünnung kloniert, und Überstände werden auf sezernierten monoklonalen Antikörper der gewünschten Spezifität getestet. Ein geeignetes Hybridom zur Produktion von GLXA-Ab₁ ist bei der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC H.B.11300 hinterlegt. Monoklonale Antikörper lassen sich auch durch aszites Wachstum von Hybridomen in vivo gewinnen. Als Alternative können die Lymphocytenzellen durch in Kontakt bringen mit Epstein-Barr-Virus immortalisiert werden. Der Idiotypantikörper GLXA, Ab₁ eignet sich zur Produktion von GLXA-Ab₂, der überraschenderweise bei der Immunisierung gegen eine oder Neutralisation einer Chlamydieninfektion aktiv ist. Darüber hinaus ist GLXA-Ab₂ nicht Spezies-spezifisch sondern gattungsspezifisch, dahingehend, dass seine Immunisierungs- und Neutralisierungsaktivität bei vielen Tierspezies geeignet ist. Der monoklonale GLXA-Ab₂ lässt sich auch durch das Verfahren, bei dem Hybridome eingesetzte werden, wie oben für GLXA-Ab₁ angegeben, produzieren, wobei jedoch als Antigen GLXA-Ab₁ eingesetzt wird. Ein geeignetes Hybridom zur Produktion von GLXA-Ab₂ ist bei der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC H.B.11301 hinterlegt. GLXA-Ab₂ lässt sich auch als polyklonaler Antikörper produzieren, wobei er als polyklonaler Antikörper zur Immunisierung gegen eine oder Neutralisierung einer Infektion durch Chlamydia aktiv ist. Polyklonale Antikörper werden auf beliebige herkömmliche Weise hergestellt, wobei ein erstes Tier mit GLXA als Antigen immunisiert und polyklonaler GLXA-Ab₁ aus dem Serum des Tiers isoliert wird. Anschließend wird der polyklonale GLXA-Ab₁ oder monoklonale GLXA-Ab₁ in ein zweites Tier einer zum ersten Tier unterschiedlichen Spezies injiziert und anschließend polyklonaler GLXA-Ab₂ aus dem Serum des zweiten Tiers gewonnen.
Bei monoklonalem GLXA-Ab₂ bzw. polyklonalem GLXA-Ab₂ handelt es sich jeweils um anti-antiidiotypische Antikörper, die ein gattungsspezifisches Chlamydien-Glycolipid-Exoantigen (GLXA) umfassendes Antigen imitieren. Beide Formen von GLXA-Ab₂ eignen sich als Impfstoff zur Immunisierung eines Tiers gegen eine gattungsspezifische Chlamydieninfektion. Darüber hinaus eignen sich beide Formen von GLXA-Ab₂ zur Verabreichung an ein mit Chlamydia infiziertes Tier, um eine gattungsspezifische Infektion mit Chlamydia zu neutralisieren.
Ebenso können im Sinne der vorliegenden Erfindung die zur Immunisierung gegen eine oder Neutralisation einer Chlamydien-Infektion geeigneten Fab-Fragment-Impfstoffe aus den Fab-Fragmenten von GLXA-Ab₂ hergestellt werden. Die Fab-Fragmente lassen sich aus GLXA-Ab₂ mit beliebigen herkömmlichen Mitteln, wie z.B. durch in Kontakt bringen des GLXA-Ab₂ mit Papain oder durch in Kontakt bringen mit Trypsin oder Chymotrypsin mit anschließender Reduktion und Alkylierung herstellen.
Der Impfstoff wird hergestellt, indem man monoklonales GLXA-Ab₂ IgG oder das Fab-Fragment von monoklonalem GLXA-Ab₂ in einem geeigneten Verdünnungsmittel, wie z.B. wässrigem Phosphatpuffer oder dergleichen mischt, so dass eine Endkonzentration von 1 mg pro ml Protein erhalten wird. Für die Verabreichung an einen normal großen Menschen werden beispielsweise jeweils 50 μl (50 μg) bis 100 μl (100 μg) der Lösung auf 4500 μl verdünnt und dann mit 500 μl eines pharmazeutisch annehmbaren Adjuvans, wie z.B. Aluminiumhydroxid oder Aluminiumphosphat oder dergleichen, (500 μg), oder Aluminiumphosphat pH 6,0 + 0,1, gemischt. Die jeweilige Dosierung variiert von Tier zu Tier, beispielsweise je nach Gewicht des Tiers.
Die polyklonalen oder monoklonalen Ab₂ der vorliegenden Erfindung eignen sich auch bei der Bestimmung, ob ein biologisches Präparat mit Chlamydia infiziert ist. Der Ab₂ wird in einer markierten Form eingesetzt, um zu bestimmen, ob der Ab₁ mit antigenen Determinanten von Chlamydia in einer biologischen Probe bindet. Der Ab₂ kann mit einem Enzym, Fluorophor, Radioisotop oder Lumineszenzmittel markiert werden, und das Ausmaß der Bindung, falls vorhanden, lässt sich durch Bestimmen des Ausmaßes der anschließenden Enzymreaktion, Fluoreszenz-, radioaktiver oder Luminesszenzemission im biologischen Präparat nach in Kontakt bringen des letzteren mit dem markierten Ab₂ bestimmen. Dabei können alle möglichen Testverfahren eingesetzt werden, bei denen markierter Ab₂ oder markiertes Fab-Fragment von Ab2 mit einer biologischen Probe in Kontakt gebracht werden, um das Ausmaß der Bindung zu bestimmen. So lässt sich beispielsweise eine biologische Probe an einen festen Träger, wie etwa mittels Methanol- oder Ethanolfixierung, immobilisieren. Anschließend wird die Probe dem markierten Ab₂ oder dem Fab-Fragment von Ab2 ausgesetzt. Das Ausmaß der Bindung wird dann bestimmt, indem man das Vorhandensein der Markierung verfolgt. Darüber hinaus lässt sich der Ab₂ in unmarkierter Form einsetzen, indem der Ab₂ mit der biologischen Probe in Kontakt gebracht und die Konzentration eventuell gebildeter Immunkomplexe bestimmt wird.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung lässt sich der monoklonale GLXA-Ab₂ zur Bestimmung des Rezeptors für Chlamydia auf der Oberfläche eukaryontischer Zellen, wie z.B. Epithelzellen einsetzen. Dabei kann entweder das ganze monoklonale GLXA-Ab₂ IgG oder das Fab-Fragment von monoklonalem GLXA-Ab₂ mit Biotin unter Bildung eines ersten Immunkomplexes komplexiert werden, wobei letzterer wiederum mit den Zellen in Kontakt gebracht wird, um die Bindung des Komplexes mit dem Zellrezeptor für monoklonalen GLXA-Ab₂ zu bewirken. Anschließend werden die Zellen mit markiertem Avidin, das an das Biotin des an den Zellrezeptor gebundenen Immunkomplexes bindet, inkubiert. Zur Identifizierung des Rezeptors wird dann die Markierung auf der Zelle nachgewiesen. Die markierten Zellen lassen sich von unmarkierten Zellen mit einem herkömmlichen Zellsortierungsgerät, das in der Lage ist, die Markierung, wie z.B. eine Fluoreszenzmarkierung, zu identifizieren, aussortieren. Sobald der Rezeptor auf diese Weise bestimmt ist, lässt sich der Mechanismus der Zellendocytose in Bezug auf Chlamydia bestimmen. Als zusätzliche Markierungen können hierbei unter anderem Radioisotope, Enzyme und Lumineszenz eingesetzt werden.
In den folgenden Beispielen wird die vorliegende Erfindung veranschaulicht, wobei diese jedoch dadurch nicht beschränkt werden soll.
Beispiel 1
In der gesamten Arbeit wurden zwei Serovare von C. trachomatis verwendet. Organismen des Serovars B (Stamm Har 36), die ursprünglich von Abschabungen der Bindehaut eines Kinds isoliert wurden, wurden bei 37°C auf einem McCoy-Zellmonolayer mit Eagle's Minimum Essential Medium mit „Hank's balanced salt solution" (HMEM, Whittaker, MD) angezogen und bei –70°C im gleichen Medium mit 10% Dimethylsulfoxid (Sigma Chemical Co., MO) gelagert. Serovar C (TW-3) wurde in Massengewebekultur in McCoy-Zellen angezogen. Die Elementarkörperchen wurden durch Zentrifugation durch Renograffin aufgereinigt und in phosphatgepufferter Kochsalzlösung resuspendiert und bei –70°C gelagert.
Meerschweinchen eines Chlamydia – freien Hartley-Inzuchtstamms wurden ursprünglich vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten, und dann in einem Tierhaus gezüchtet und gehalten. In der vorliegenden Arbeit wurden einjährige Weibchen verwendet.
Von Pasteurella freie weibliche Kaninchen (New Zealand) wurden von Mill Brock Farm (Hadly, MA) erhalten. Die Kaninchen wogen etwa 6-8 Pfund bei ihrer Ankunft und wurden innerhalb einer Woche verwendet. BALB/cByJ (H-2d)-Mäuse wurden vom Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) erhalten. Junge erwachsene Cynomolgus-Affen (Macacca fasicuiareis) wurden von Charles River Primates, Inc. (Port Washington, NY) erhalten und waren frei von klinischen Augenkrankheiten. Alle Primaten waren für eine vorherige Augeninfektion mit Elementarkörperchen von C. trachomatis Serovar C verwendet worden und einige Primaten waren zuvor mit einem Chlamydien-Protein immunisiert worden. Die in dieser Arbeit einem Challenge unterzogenen Primaten waren krankheitsfrei und nicht immun. Sie wurden vor dem Start des Experiments randomisiert. Alle Vorgehensweisen wurden unter Narkose ausgeführt.
Zur Herstellung polyklonaler antiidiotypischer Antikörper wurden sechs Meerschweinchen jeweils subkutan mit 150 μg monoklonalem GLXA-Ab₁ (89MS30)-IgG in 1 ml H₂O plus 1 ml Maalox Plus-Suspension (William H. Roger, Inc.) PA) immunisiert. Drei Wochen später wurden die Meerschweinchen einer Auffrischimpfung mit 100 μg monoklonalem GLXA-Ab₁ in 1 ml Maalox (Aluminiumhydroxid, Alaun) und H₂O unterzogen, wobei die Auffrischimpfung monatlich wiederholt wurde.
Zur Produktion anti-antiidiotypischer Antikörper wurden drei Kaninchen mit absorbiertem antiidiotypischem Meerschweinchen-Isotyp IgGI (300 μg) in 1 ml Alaun und 1 ml H₂O intradermal an mehreren Stellen immunisiert und drei Wochen später unter Verwendung der gleichen Vorschrift einer Auffrischimpfung unterzogen. Anschließend wurden die Kaninchen monatlich einer Auffrischimpfung unterzogen. Zur Produktion von monoklonalem antiidiotypischem Antikörper GLXA-Ab₂ (91 MS441) wurden 50 μg KLH-konjugiertes monoklonales GLXA-Ab₁-IgG intraperitoneal in fünf 9 Wochen alte weibliche BALB/cByJ-Mäuse in einer gleichen Menge an komplettem Freundschem Adjuvans (Sigma, MO) injiziert. Die gleiche Menge wurde in der anschließenden Auffrischimpfung an Tag 14 sowie später wöchentlich für fünf Wochen in Gegenwart von inkomplettem Freundschem Adjuvans verwendet. Eine letzte Auffrischinjektion wurde drei Tage vor Entfernen der Milz gegeben. Für das Chlamydien-Infektionsschutzexperiment wurden zwei Gruppen von BALB/cByJ-Mäusen (6 bis 20 pro Gruppe) mit 50 μg monoklonalem GLXA-Ab₂-IgG oder 50 μg normalem Maus-IgG pro Maus subkutan mit oder ohne Maalox immunisiert und wöchentlich über einen Zeitraum von drei Wochen einer Auffrischimpfung unterzogen.
Monoklonales GLXA-Ab₁-IgG wurde mittels Protein-A-Affinitätschromatographie isoliert. Dabei wurde die Aszitis-Flüssigkeit, die monoklonales GLXA-Ab₁-IgG enthält, zunächst durch Glaswolle geleitet, um Lipid zu entfernen, und zur Abtrennung von Präzipitaten 10 min. bei 2000 UpM zentrifugiert. Die Affinitätssäule (1,5 × 9 cm) wurde mit 2 ml Protein-A-Sepharose CL4B (ZYMED, CA) gepackt, und zunächst in einem Bindungspuffer (1,5 M Glycin, 3 M NaCl, pH 8,9) (Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA) äquillibriert. 2 ml mit einer gleichen Menge an Bindungspuffer verdünnte Aszitisflüssigkeit wurde bei 0,6-0,8 ml/min. auf die Säule geladen. Die Säule wurde etwa 30 min. lang gestoppt, um die Bindung zu gestatten, und anschließend mit etwa 3 Bettvolumen Bindungspuffer gespült. Das gebundene IgG wurde mit 0,1 M Citronensäure, pH 3, in Glasröhrchen eluiert, die 50 μl 1 M TBS, pH 8,0 zur Äquillibrierung des pH-Werts enthielten. IgG wurde über eime Absorption bei 280 nm nachgewiesen. Absorptionen von mehr als 0,1 wurden vereinigt und gegen 0,075 M PBS, pH 7,2 über Nacht dialysiert. Die Reinheit des isolierten IgG wurde über SDS PAGE auf einem PhastSystem (Pharmacia, NJ) bestätigt.
Direkter ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay)
Die spezifische Antwort des mit monoklonalem Ab₁-IgG immunisierten Meerschweinchens wurde mittels direktem ELISA nachgewiesen. Dabei wurde eine 96-Loch-Platte mit entfernbaren Immulon-2-Streifen (Dynatech, RI) mit 0,4 μg monoklonalem Ab₁-IgG pro Loch in Beschichtungspuffer (0,015 M NaHCO3, 0,3 M Glycin, 0,02 NaN3 mit 0,06 M Polyethylenglykol, PEG), pH 9,6, beschichtet. Die Platte wurde über Nacht bei 4% C aufbewahrt. Die Platten wurden jeweils 3-mal mit 0, 05% Tween 20 in 0, 075 M PBS gespült und mit 1% BSA/PBS 2 Stunden bei Raumtemperatur blockiert. Die Platte wurde wiederum 3-mal gespült. Die Präimmunseren bzw. -antiseren aus Meerschweinchen wurden in einer Verdünnungsreihe mit 0,075 M PBS verdünnt, und jeweils 100 μl wurden in Doppelbestimmung in jedes Loch gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert und gespült. Nach Zugabe von Ziege-anti-Meerschweinchen-IgG (H & L) -Meerrettichperoxidase-Konjugat (Jackson ImmunoResearch Labs, Inc. PA) 1:1000, wurde 1 Stunde inkubiert und dann gespült. Nach dem Spülen wurde TMB-Substrat (Kirkegaard and Perry Laboratories, MD) zugegeben. Die Absorption bei 405 nm wurde mit einem Vmax-Microwell-Ablesegerät (Molecular Devices Corp., CA) bestimmt. Die Antiseren von mit Meerschweinchen-IgGI immunisierten Kaninchen wurden auf ähnliche Weise getestet. Dabei wurden die Platten jeweils mit Meerschweinchen-IgGI beschichtet, und bei dem zweiten Antikörper handelte es sich um Ziege-anti-Kaninchen (H und L)-Meerrettichperoxidase-Konjugat (Jackson ImmunoResearch Labs. Inc., PA). Präparation der Affinitätschromatographiesäule.
Normales Maus-IgG (Jackson ImmunoResearch Labs Inc., PA) wurde an Affi-Gel IO (Bio-Rad Laboratories, CA), wie vom Hersteller angegeben, konjugiert. Dazu wurden, kurz gesagt, 5 ml Affi-Gel IO-Aufschlämmung auf einen mit einer Absaugvorrichtung verbundenen Trichter mit Glasfritte überführt und mit drei Bettvolumen Isopropylalkohol und anschließend mit drei Bettvolumen eiskaltem entionisiertem Wasser gewaschen. Normales Maus-IgG (5 mg/ml), 10 ml, wurde mit Affi-Gel IO in einem Fläschchen gemischt. Die Kupplung wurde bei 4% C über Nacht unter leichter über Kopf Bewegung durchgeführt. Eine Säule (0,9 × 5 ml) wurde mit dem gekoppelten Gel gepackt und mit 0,075 M PBS, pH 7,2, gespült. Die UV-Absorption des Ausflusses wurde bei 280 nm verfolgt. Die höchste Absorption dieses Anteils wurde zum Testen auf den Proteingehalt mittels Bradford Assay (Bio-Rad Laboratories, CA) zur Beurteilung der Konjugation verwendet.
Absorption von Meerschweinchen-Antiseren mit normalem Maus-IgG
3, 4 und 5 Wochen nach der Immunisierung erhaltene Meerschweinchen-Antiseren wurden vereinigt und über Affinitätschromatographie an eine Normales-Maus-IgG-Agarosesäule absorbiert. Die Säule wurde wie oben präpariert. Die Antiseren von etwa einem Todvolumen wurden auf die Säule geladen und 30 min. bei 4°C inkubiert und mit 0,075 M PBS pH 7,2 eluiert. Das Antiserum wurde ein zweites Mal mit einer frisch präparierten Säule absorbiert.
Trennung der Isotypen von Meerschweinchen-IgG
Fünf ml Meerschweinchen-Antiseren, die mit normalem Maus-IgG absorbiert worden waren, wurden auf eine Protein-A-konjugierte Sepharose-Säule aufgetragen und mit 0,02 M Phosphat-Citrat-Puffer, pH 7,3, gespült. Die Meerschweinchen-Immunglobulin-Unterklassen IgG1 und IgG2 wurden unter Verwendung eines pH-Stufengradienten von 4,9 getrennt eluiert, bis kein Protein mehr im Ausfluss nachgewiesen wurde. Die Säule wurde dann mit einem Gradienten mit niedrigem pH, 4,3, eluiert. Nach der Dialyse gegen 0,02 M Phosphat-Citrat-Puffer, pH 7,3, wurden die Isotypen jeweils einer zweiten Runde Unterklassentrennung unterzogen.
Elementarkörperchen des C. trachomatis-Serovars B (Har. 36) wurden in einem McCoy-Zellmonolayer in einer 2-Liter-Rollerflasche (Corning, PA) in HMEM mit einem Zusatz von L-Glutamin (Endkonzentration: 0,5 mM), NaHCO3 (Endkonzentration: 0,4 mM) und 10% FBS (fetal bovine sera [fötales Rinderserum]) vermehrt. Kurz gesagt, wurde dazu das Medium nach Konfluenz des Monolayer aus der Flasche entfernt. Anschließend wurden 0,5-3,0 ml EBs-Suspension (je nach Dichte der Organismen) in 40 ml Cycloheximid-Überschichtungsmedium (COM [cycloheximide overlay medium]) (Whittacker, MD) mit einem Zusatz von L-Glutamin und FBS eingeimpft, und die Flasche wurde bei 3 UpM und 35°C gerollt. 2 Stunden später wurden 200 ml COM zugegeben und weitere 48 bis 72 Stunden gerollt. Der Überstand wurde nach Zentrifugation zur Abtrennung der Organismen erhalten.
Reinigung von Glycolipid-Exoantigen, GLXA
GLXA wurde in zwei Schritten aus dem Überstand aufgereinigt. Zunächst wurde der Überstand über eine Octyl-Sepharose CL4B-Säule gegeben und mit 95% Ethanol eluiert (Stuart und MacDonald, Current Microbiology, 11:123, 1984). Das Antigen in Ethanol (Antigengehalt entspricht 50 ml Überstand einer stark infizierten Gewebekultur) wurde auf ungefähr 50 μl auf konzentriert und in 0,1 M Phosphatpuffer, pH 7,5, zu 1 ml resuspendiert. Zweitens wurde das so präparierte Antigen weiter mittels Affinitätschromatographie aufgereinigt. Die Affinitätssäule wurde durch Konjugation eines monoklonalen GLXA-Ab₁-IgG an Affi-Gel 10 (Bio-Rad Laboratories, CA) nach Anweisung des Herstellers präpariert. Die Probe wurde zentrifugiert und auf die Affinitätssäule aufgetragen und 30 min. bei 4°C inkubiert. Die Säule wurde mit 0,1 M Phosphatpuffer gespült, bis das Elutionsmittel klar wurde. GLXA wurde in ungefähr 5 M Kaliumthiocyanat (KSCN, Mallinckrodt Inc., KY) über etwa 15-20 ml eluiert und über Nacht gegen 0,075 M PBS dialysiert.
Im unten beschriebenen Immuno-Dot-Blot-Assay zur Bindung von GLXA und monoklonalem GLXA-Ab3 durch monoklonalen GLXA-Ab₂ verwendetes GLXA wurde über ein Größenausschlussverfahren isoliert. Dabei wurde eine Sepharose 6BLC-Säule (2 × 100 cm) mit 0,075 M PBS äquilibriert. Der Überstand aus der Zellkultur des C. trachomatis-Serovars F wurde zunächst zur Abtrennung von Zelltrümmern bei 5000 UpM zentrifugiert, wovon ungefähr 20 ml auf die Säule aufgetragen wurden. Die Fließgeschwindigkeit betrug 0,5 ml/Minute. GLXA im Eluat wurde mit dem Magic Lite Analyzer (Ciba Coming Diagnostic Corp., MA) nachgewiesen. Die Vorschrift ist wie nachfolgend beschrieben.
Chemiluminumetrischer Immunoassay (Inhibition Assay [Hemmtest])
Die Hemmung der Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁-IgG an GLXA durch Meerschweinchen-GLXA-Ab₂ oder Kaninchen-GLXA-Ab3 (Antiseren, IgG, IgG-Isotypen) wurde in einem chemiluminometrischen Immunoassay mit einem Magic Lite Analyzer (Ciba Coming Diagnostic Corp., MA) nachgewiesen. Die Vorschrift für die Hemmung war wie folgt: affinitätsgereinigtes GLXA wurde mit Reagenz A (Ciba Coming) 1:5 verdünnt, gemischt und in Plastikröhrchen portioniert (200 μl/Röhrchen, Sarstedt, NJ). Die Röhrchen wurden jeweils mit 100 μe einer Neutralisierungslösung Reagenz B (Ciba Coming) versetzt und gut gemischt. In jedes der obigen Röhrchen wurden jeweils 50 μl einer Verdünnungsreihe von Meerschweinchen- GLXA-Ab₂ oder Kaninchen-GLXA-Ab3-IgG gegeben, wonach bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Eine Stunde nach der Inkubation wurde das Gemisch mit 100 μl Acridiumester-markiertem (AE-markiertem) monoklonalem GLXA-Ab₁-IgG in 1% BSA/PBS (zwischen 220.000 und 240.000 relative Lichteinheiten, RLE) versetzt und 1 Stunde inkubiert. Anschließend wurden polyklonale Anti-Chlamydien-Antikörper, die kovalent an paramagnetische Teilchen (500 μl) gebunden waren, in jedes Röhrchen gegeben, wonach für eine weitere Stunde inkubiert wurde. Der gebundene Immunkomplex (paramagnetische Teilchen-GLXA-AE-markierter monoklonaler GLXA-Ab₁-IgG) wird vom ungebundenen getrennt, indem das Gemisch einem Magnetfeld ausgesetzt wird. Die Teilchen wurden 3-mal gespült. Gebundener AE-markierter Antikörper wurde mit dem Magic Lite Analyzer gemessen, wobei RLE aufgezeichnet wurden. Die prozentuale Hemmung der Bindung wurde wie folgt berechnet:
wobei Kontrolle für PBS steht und Test entweder für zugegebene Präimmun- bzw. Antiseren (bzw. IgG) steht.
Immuno-Dot-Blot-Assay
Für diesen Test wurde eine Dot-Blot-Apparatur von Bio-rad verwendet. Eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran, 0,45 μm, Immobilon-NC (Millipore, MA), wurde mit dem affinitätsgereinigten GLXA oder Chlamydien-rLPS 18 Stunden bei 4°C beschichtet. Anschließend wurde die Membran mit 0,05% Tween 20 in 0,075 M PBS-Puffer, pH 7,2 gewaschen und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 3% BSA/PBS blockiert. Nach dem Spülen wurden Verdünnungsreihen von Kaninchen-GLXA-Ab3-IgG (90MS699) (isoliert über Protein-A-Affinitätschromatographie, Verfahren siehe oben) oder monoklonalem Ab₁-IgG (89MS30) zugegeben (100 μl pro Loch), 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert und zur Abtrennung von ungebundenem IgG gewaschen. Der PVDF-Film wurde der Apparatur entnommen und 2 Stunden unter leichter Bewegung mit 3% BSA/PBS blockiert und anschließend mit einer 1:1000-Verdünnung von Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG (H und L) oder Kaninchen-anti-Maus-IgG (H und L) (Jackson ImmunoResearch Labs., PA) als Sonde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Nichtgebundener konjugierter Antikörper wurde durch 4-maliges Waschen in einer Petrischale für jeweils 5 min. unter Bewegen abgetrennt. Die Bindung wurde mit dem 4-CN (4-Chlor-I-naphthol)-Membran-Peroxidasesubstrat-System (Kirkegaard & Perry Laboratories Inc., MD) nachgewiesen. Die Tests wurden in Doppelbestimmung durchgeführt.
Biotinylierung von IgG
Monoklonale GLXA-Ab₁- bzw. Kaninchen-GLXA-Ab₃-IgG wurden mit Biotin markiert. Kurz gesagt wurde dabei das GLXA-IgG zunächst gegen 0,1 M Natriumborat, pH 8,8 4 Stunden bei 4°C dialysiert. Anschließend wurden 200 μg Biotinamidocaproat-N-Hydroxysuccinimidester (Sigma Chemical Co., MO) pro mg IgG zugegeben, wonach 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Schließlich wurden 20 μl 1 M NH₄Cl pro 250 μl Ester verwendet und 10 min. bei Raumtemperatur inkubiert, um die Reaktion abzustoppen. Markierte IgGs wurden gegen 0,075 M PBS 3 Tage bei 4% C dialysiert.
Immunfluoreszenzanfärbung infizierter McCoy-Zellen
Konfluente McCoy-Zellmonolayer wurden auf den Deckgläschen in einer 24-Loch-Platte (Falcon, NJ) 24 Stunden wachsen gelassen. Das Medium wurde aus allen Löchern entfernt, bevor jeweils 200 μl Elementarkörperchen des C. trachomatis-Serovars B (Har 36) oder 200 μl HMEM allein in jedes Loch gegeben wurden. Die Anzahl an IFU (inclusions forming units [Einschlüsse bildende Einheiten]) betrug ungefähr 1000/200 μl. Unmittelbar nach dem Auftragen wurden die Löcher jeweils mit 200 μl Cycloheximid-Überschichtungsmedium (COM) mit L-Glutamin und FBS versetzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 37°C inkubiert und das Medium durch 1 ml COM pro Loch ersetzt. Anschließend wurden die Platten 48 Stunden bei 37°C in einem luftbefeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ kultiviert.
Nach der Inkubation wurden die Zelldeckgläschen mit 0,075 M PBS 2-mal jeweils 5 min. gewaschen. Die Deckgläschen wurden dann mit Papiertüchern vorsichtig abgetupft, um Puffer auf den Deckgläschen zu entfernen. Anschließend wurden die Deckgläschen mit 400 μl 50 μg/ml Biotin-markiertem monoklonalem GLXA-Ab₁ oder 400 μl 1,20 mg/ml Biotinmarkiertem GLXA-Ab3 versetzt und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Deckgläschen wurden 2-mal mit PBS gespült (5 min. pro Spülung). Nach Zugabe von 400 μl Fluoreszein-Streptavidin (1:50 in 1% BSA/PBS) wurde 1 Stunde inkubiert.
Das nichtgebundene Fluoreszein-Streptavidin wurde wie oben ausgespült. Fluoreszenz wurde mittels Fotografie mit einer 35 mm-Kamera vom Typ Olympus 25 (ASA 400 TMAX Kodak-Schwarzweißfilm), die auf einem Mikroskop (Zeiss A.7082 Oberkirchen) angebracht war, nachgewiesen, wobei die Beleuchtung mit einer 12v/100 Hz-Halogenlampe erfolgte.
Neutralisierung von Chlamydia durch GLXA-Ab3 (90MS699) in vivo
Animpflösungen und Präparate
Das Präimmun- und GLXA-Ab3-IgG aus Kaninchen sowie normales Maus- und monoklonales GLXA-Ab₁-IgG wurden filtersterilisiert. Die IgG (0,2 mg/ml) wurden jeweils mit Elementarkörperchen des C. trachomatis-Serovars C (TW-3) (2000 Einschluss bildende Einheiten/20 μl) gemischt (1:1). Die Gemische und unbehandelten EBs (als Kontrolle) wurden 45 min. bei 37°C inkubiert, wobei alle 15 min. leicht geschüttelt wurde.
Nach der Inkubation wurden ungefähr 2 μg IgG plus 1000 IFU als Inokulum auf den Fornix Inferior von jedem Auge von acht Affen aufgebracht, wobei vier Affen GLXA-Ab3-IgG plus EBs, zwei Präimmun-IgG plus EBs und zwei nurEBs erhielten. Gleichzeitig wurden jeweils 100 μl der verschiedenen Gemische zur Infektion von 10 Löchern von 2 Tage alten McCoy-Zellmonolayer-Deckgläschen in einer 48-Loch-Gewebekulturplatte zur Bestimmung der Infektiösität des Inokulums verwendet. Die Kultivierungsverfahren sind nachfolgend beschrieben.
Bindehautabstriche wurden durch Überstreichen des Tarsus bzw. Fornix Inferior, des seitlichen Fornix, des Tarsus bzw. Fornix Superior und des medialen Fornix am Tag vor der Inokulation und an Tag 2, 6, 9, 13 und 20 nach der Inokulation entnommen. Die Abstriche wurden sofort in 2 ml Sammelmedium eingetaucht und durch 2-minütiges Verwirbeln im Sammelmedium aufgeschlossen.
Bestimmung der Chlamydien-Infektiösität über Zellkultur
Bindehautabstriche wurden zunächst durch 2-minütiges Verwirbeln im Sammelmedium aufgeschlossen, um EBs aus den Abstrichen zu sammeln. Anschließend wurden 200 μl dieses Sammelmediums als Inokulum auf McCoy-Zellmonolayer-Deckgläschen aufgebracht. Die Zellen wurden in einer 48-Loch-Gewebekulturplatte 2 Tage wachsen gelassen, und zwar mit jeweils 5 Löchern pro Probe. Für ein in-vitro-Neutralisierungsexperiment wurden 100 μl des Gemischs als Inokulum auf die Monolayer-Deckgläschen von 10 Löchern für jede Probe aufgebracht. Die beimpften Platten wurden dann 1 Stunde bei Raumtemperatur und 1000 × g zentrifugiert. Die Platten wurden 2 Stunden bei 37°C inkubiert und das Medium durch 1 ml 10% FBS in COM (Whittacker, MD) ersetzt. Die Platten wurden bei 37°C in einem luftbefeuchteten Inkubator mit 5% CO₂ 48 Stunden kultiviert. Das Kulturmedium wurde nach der Inkubation aus allen Löchern abgesaugt. Die Monolayer-Deckgläschen wurden einmal mit 0,075 M PBS gewaschen, 5 min. mit Ethanol fixiert und dann 2-mal mit H₂O gespült. Anschließend wurden in jedes Loch 25 μl des Fluoreszeinmarkierten monoklonalen Kaninchen-anti-Chlamydien-Antikörpers mit Evans-Blue-Gegenfärbung (Syva. Co., CA) gegeben, wonach 30 min. bei 37°C inkubiert wurde. Nach der Inkubation wurden die Löcher 2-mal mit H₂O gespült, und in jedes Loch wurde ein Deckgläschen mit Einbettflüssigkeit aufgebracht. Die Einschlusskörperchen wurden durch Umdrehen der Platte an einem Fluoreszenzmikroskop gezählt.
Cytologie mit direkter Fluoreszenzantikörperfärbung (DFA)
Der Bindehautabstrich (Abschabung) von jedem Auge eines infizierten Primaten wurde auf einen mit Alkohol vorgereinigten Glasobjektträger aufgedrückt. Die Objektträger wurden an der Luft getrocknet und 5 min. mit kaltem Aceton fixiert. Anschließend wurden die Objektträger getrocknet und mit 30 μl Fluoreszein-markiertem monoklonalem Antikörperreagens mit Evans-Blue-Gegenfärbung (Micro Trak Chlamydia Direct Reagent, Syvo Co. CA) überschichtet. Die Inkubation wurde in einer abgedeckten, feuchten Kammer durchgeführt. Nach 15 min. wurden die Objektträger auf Kante gestellt, um überschüssigen Farbstoff zu entfernen und 10 Sekunden mit entionisiertem Wasser gespült. Man ließ die Objektträger an der Luft vollständig trocknen. Auf jeden Objektträger wurde ein Deckgläschen mit Einbettmedium (Syva Co., CA) platziert und mit Nagellack verschlossen. Die Objektträger wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 500x und 1250x untersucht. Der infektiöse Titer wurde auf einer halbquantitativen Skala von 0-4+ bewertet: 0 bedeutet negativ, 0,5 bedeutet negativ bei der ersten Passagierung und positiv gegenüber einem beliebigen Grad der zweiten Passagierung, 1 bedeutet 1 bis 9 Einschlüsse pro Loch bei der ersten Passagierung und so weiter.
Klinische Untersuchung und Punktwertung
Die klinische Reaktion eines jeden Auges wurde in Form von 10 klinischen Anzeichen eingestuft (Taylor et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 29:847, 1988): die follikuläre Reaktion im lumbalen, limbalen, Tarsus-Superior-, Fornix-Superior- und Fornix-Inferior-Teil der Bindehaut, Hyperämie oder Injektion der bulbären, Tarsus-Superior-, Fornix-Superior- und Fornix-Inferior-Bindehaut sowie okulare Absonderung. Die klinische Reaktion wurde auf einer Skala von 0 bis 3 für jedes der 10 Anzeichen einer Bindehautentzündung eingestuft, so dass für jeden Affen ein Gesamtentzündungspunktwert erhalten wurde. Der die Untersuchung durchführenden Person war die Zuordnung der Affen unbekannt. Die Mittelwerte der Punktwerte wurden zur Beschreibung der Reaktion einer Gruppe von Affen verwendet.
Analyse von Bindehautabstrichen über RNA-gerichtete Hybridisierung
Gesamt-RNA wurde aus mit GLXA-Ab3 oder normalem Kaninchen-IgG behandelten Affen am Tag vor dem Challenge und an Tag 2, 6, 9, 12 und 20 nach dem Challenge entnommenen Bindehautabstrichproben präpariert. Die Abstrichproben wurden zunächst in Phenol bei 65% im Puffer mit 50 mM Tris (pH 8,0), 150 mM NaCl, 10 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1% SDS homogenisiert. Die RNA wurde ausgefällt und im gleichen Puffer wieder gelöst. Diese RNA-Präparation wurde mehrmals mit Phenol:Chloroform (3:1) extrahiert, resuspendiert und ausgiebig mit DNase I behandelt. Die Qualität der RNA-Präparation wurde nach Trennung auf Formaldehyd-Agarosegelen visuell mittels Ethidiumbromid unter UV-Licht überwacht.
Bei der verwendeten Sonde handelte es sich um ein DNA-Fragment, das die ribosomale 16S- und 23S-RNA sowie flankierende Sequenzen enthielt und aus den genomischen Chlamydien-Plasmidklon pL2, 434ScI-IA (Cheema et al., The Amer. J. Med. Sci. 302:261-268, 1991) ausgeschnitten wurde. Das DNA-Fragment wurde mittels Nick-Translation unter Verwendung von 32PdCTP, 800 Ci/mmol (Amersham Corp., IL) markiert. Die spezifische Aktivität lag für alle Restriktionsfragmentsonden bei etwa 106 cpm/μg DNA. Die Taschen auf jedem Blot enthielten 1 μg aus Affe oder Mensch stammende Gesamt-RNA, 10 pg reine C. trachomatis- oder C-Serovar-RNA (Positivkontrolle), 3 μg Hefe- oder Ratten-RNA, nur Puffer sowie 1 μg RNA aus jedem Affen vor der Infektion entnommenen Abstrichen (Negativkontrolle). Die RNA wurde auf 0,22-μm-Filter (Schleicher und Schuell Corp., NH) fixiert. Die Hybridisierungsergebnisse wurden über Autoradiographie bei –70°C mit X-OMAT AR-Film (Kodak, New York) sichtbar gemacht.
Produktion und Charakterisierung monoklonaler antiidiotypischer Antikörper (monoklonaler GLXA-Ab₂)
Konjugation von Keyhole-Limpet-Hämocyanin mit monoklonalem GLXA
Monoklonales Ab₁ (89MS30)-IgG wurde von einer Protein-A-Chromatographiesäule, wie oben ausgeführt, isoliert. Die Konjugation mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin wurde unter Verwendung von Glutaraldehyd durchgeführt. Kurz gesagt wurde dabei 1,5 mg IgG mit 0,05 mg KLH (Sigma Chemical Co., MO) (ungefähr 1 M IgG pro 50 Aminosäuren KLH) in einem gleichen Volumen an 0,2% Glutaraldehyd in PBS gemischt, wonach unter leichtem Rühren bei Raumtemperatur inkubiert wurde. Eine Stunde später wurde 1 M Glycin zugegeben, so dass eine Endkonzentration von 0,02 M erhalten wurde, und anschließend wurde eine weitere Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Konjugat wurde dann über Nacht gegen PBS dialysiert.
Produktion von anti-monoklonalem Ab₁-Hybridom
Vier Tage nach der letzten Auffrischimpfung (siehe Immunisierung) wurden Milzzellen aus zwei Mäusen, die den höchsten Titer aufwiesen, isoliert. Die Fusion wurde mit der Maus-Myelomzelllinie Sp2/0-AgI4 gemäß den ursprünglich von Kohler und Milstein (Nature, 1975) entwickelten und modifizierten (Golsby, A Practical Guide to Making Hybridomas In Nucleic Acid & Monoclonal Antibody Probes, Swaminathn & Prokask, Hrsg. Deller. N.Y. S. 367, 1989) Techniken durchgeführt. Die Feeder-Zellschicht entstammte der Milz von 8 Wochen alten Mäusen.
Screening des monoklonalen antiidiotypischen Antikörpers 91 MS441 (monoklonaler GLXA-Ab₂)
Antiidiotypische Antiseren aus immunisierten Mäusen und Überständen aus klonierten Löchern wurden mit einem Sandwich-ELISA (Uytdehaag et al., J. Immunol., 134: 1225, 1985, Hiroshima et al., J. Immunol. 144:224, 1990) nachgewiesen. Kurz gesagt wurden dabei Immulon-II-Polystyrol-Mikrotiterplatten (Dynatech Laboraties Inc., VA) mit 100 μl von 1 μg monoklonalem Ab₁-IgG in 0,1 M Carbonatpuffer pH 8,9, über Nacht bei 4°C beschichtet. Das nichtgebundene IgG wurde abgetrennt, und die Löcher wurden 1 Stunde bei 37°C mit 3% BSA/PBS blockiert. Nach dem Waschen wurden in einer Verdünnungsreihe verdünnte Antiseren bzw. 100 μl Kulturüberstand aus Löchern mit Hybridomzellen zugegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei 37°C und Waschen wurde 1 μg Biotin-konjugiertes monoklonales Ab₁-IgG in jedes Loch gegeben und die Reaktivität durch Zugabe von Streptavidin-Meerrettichperoxidase (Jackson immuno Research Labs., PA) nachgewiesen. Eine Stunde später wurde TMB-Peroxidasesubstrat (Kirkergaard & Perry Laboratories inc., MD) zugegeben. Die Absorption wurde in einem Mikroplattenablesegerät bei 405 nm abgelesen. Als Positiv- bzw. Negativkontrollen dienten vor der Fusion entnommene Immunseren (Verdünnung: 1:10) bzw. Medium allein.
Test auf Hemmung der Bindung
Die Hemmung der Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA durch Maus-Antiserum und den Überstand der Klone wurde mittels Immuno-Chemiluminometrischem Test, wie oben beschrieben, bestimmt.
Erzeugung von Aszitisflüssigkeit
Zehn BALB/cByJ-Mäuse, deren Alter nicht unbedingt bekannt sein musste, wurden mit Pristan (2,6,10,14-Tetramethylpentadecan, Sigma Chemical Co., MO) interperitoneal injiziert, und zwar jeweils mit 1 ml pro Maus. Zehn Tage später wurden die Mäuse mit ungefähr 2 × 10⁶ monoklonalen GLXA-Ab₂ (91 MS441) produzierenden Hybridomzellen injiziert. Die Aszitisflüssigkeit wurde etwa 10 Tage später unter Verwendung einer Blutsammelnadel Vacutainer 20 g (Becton Dickinson, NJ) geerntet. Die Aszitisflüssigkeit wurde durch Zentrifugation bei 2000 UpM über 10 min. geklärt und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
Isotypisierung von antiidiotypischem IgG
Die Isotypisierung wurde mittels ELISA durchgeführt. Der Überstand von Klon 91 MS441 (100 μl) wurde zur Beschichtung in jedes Loch eingeführt und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach Spülen und Blockieren mit 3% BSAIPBS über einen Zeitraum von 2 Stunden wurde jedes Loch in Doppelbestimmung mit 100 μl Kaninchen-Antiserum versetzt, das für die folgenden Maus-Unterklassen spezifisch war: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA, K-Kette oder λ-Kette (Bio-Rad Laboratories, CA). Die Platte wurde eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Das Kaninchen-Antiserum wurde über Meerrettichperoxidase-konjugiertes Ziege-anti-Kaninchen (M und L) und TMB-Substrat (Kirkergaard & Perry Laboratories Inc. MD) nachgewiesen.
Reinigung von monoklonalem GLXA-Ab₂-IgG
Das monoklonale GLXA-Ab₂-IgG wurde über Affinitätschromatographie an einer Protein-G-Sepharose-Säule gereinigt. Dabei wurden 5 ml Protein-G-Sepharose 4B (Zymed, CA) in eine 0,5 × 9 cm große Säule gepackt. Die Aszitisflüssigkeit (2 ml) wurde mit 0,02 M Phosphatpuffer, pH 7,3, 1:1 verdünnt und auf die Säule aufgetragen und mit dem gleichen Puffer gewaschen, bis kein Protein mehr nachgewiesen wurde. Das gebundene IgG wurde mit 0,1 M Citronensäure-Glycin-Puffer, pH 2,6, eluiert. Das Eluat wurde in 1-ml-Fraktionen, die 50 μl 1 M Tris-Kochsalz-Puffer, pH 8,0, zum Ausgleichen des Eluats enthielten, gesammelt. Fraktionen mit einer UV-Absorption oberhalb von 0,1 wurden vereinigt und über Nacht bei 4°C in PBS dialysiert. Das gereinigte IgG wurde zur Bestätigung über SDS-PAGE identifiziert.
Immunpräzipitation von monoklonalem GLXA-Ab₂ mit Anti-Chlamydien-Antiseren aus anderen Spezies
Polyklonale Antikörper von einem mit einer Chlamydieninfektion diagnostizierten menschlichen Patienten sowie aus mit Chlamydien-EBs injizierten Kaninchen wurden hinsichtlich der Erkennung von monoklonalem GLXA-Ab₂ mittels ELISA getestet. Die Vorgehensweise entsprach dabei im Wesentlichen der oben beschriebenen mit den folgenden Ausnahmen. Kurz gesagt wurde die ELISA-Platte mit 1 μg monoklonalem GLXA-Ab₂ pro Loch in 0,075 M PBS ohne Beschichtungspuffer über Nacht bei 4°C beschichtet. Die Löcher wurden mit 0,05 Tween 20 in 0,075 M PBS gespült und 2 Stunden bei Raumtemperatur mit 3% BSA/PBS blockiert. Jeweils 100 μl des in Verdünnungsreihen verdünnten Patientenserums (92MS273), menschlichen Kontrollserums (88MS356), von Kaninchen-Antiseren (88MS188) oder Kaninchen-Kontrollserum (92MS450) wurden jeweils in Doppelbestimmung in jedes Loch gegeben. Nach einer Stunde Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Löcher 3-mal gewaschen und mit 100 μl Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Mensch- bzw. Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Jackson ImmunoResearch Labs, MD) versetzt. Nach einer Stunde Inkubation wurde TMB-Substrat zugegeben. Die Platte wurde an einem Vmax-Mikroplattenablesegerät (Molecular Devices Corp., CA) abgelesen.
Schutz vor einer Chlamydia-Infektion durch Immunisierung mit monoklonalem GLXA-Ab₂ in einem Maus-Infektionsmodell
Immuno-Dot-Blot-Assay der Bindung von GLXA und durch monoklonalen GLXA-Ab₂ erzeugten GLXA-Ab3
Der Immuno-Dot-Blot-Assay wurde nach dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben durchgeführt. Die Ausnahme bestand darin, dass ein PVDF-Film mit gereinigtem GLXA (100 μl) pro Spur in 0,075 M PBS beschichtet wurde. Denjenigen Mäusen, die mit monoklonalem GLXA-Ab₂-IgG oder normalem Maus-IgG immunisiert wurden, entnommene Antiseren wurden in einer Verdünnungsreihe mit 3% BAS/PBS verdünnt. Bei dem zweiten Antikörper handelte es sich um Meerrettichperoxidasekonjugiertes Kaninchen-anti-Maus-IgG (H und L). Die Fotografie wurde mit TMAX 100 von Kodak aufgenommen. Die Anfärbungsintensität des Dot-Blots wurde durch Scanning mit einem Densitometer bestimmt.
Inokulation und Präparate
Elementarkörperchen des C. trachomatis-Serovars C (TW-3) (5000/20 μl) wurden als Inokulum auf jedes Auge derjenigen Mäuse, die mit monoklonalem Ab₂- oder normalem Maus-IgG immunisiert wurden, aufgetragen. Am Tag vor der Inokulation sowie am Tag 7, 10, 14, 21, 28 und 35 nach der Inokulation wurden jedem Auge Bindehautabstriche entnommen. Der Bereich umfasste dabei den Tarsus Inferior und Fornix Inferior, den seitlichen Fornix, den Tarsus Superior und den Fornix Superior sowie den medialen Fornix. Die Bindehautabstriche wurden sofort in das Sammelmedium eingetaucht und durch 2-minütiges Verwirbeln aufgeschlossen und bis zur Kultivierung auf Eis gehalten.
Identifizierung des Rezeptors auf Wirtszellen durch monoklonales GLXA-Ab₂-IgG
FACS-Analyse der spezifischen Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₂ an HECEC-Zellen.
HECEC (human endometrial gland epitheria cells)-Zellen wurden in einen 75-mm²-Kolben bei 37°C mit 5% CO₂ angezogen. Nach Erreichen der Konfluenz wurden die Zellen mit einem Zellschaber (Baxter, IL) vom Kolben abgeschabt und 5 min. bei 200 × g zentrifugiert. Die Zellen wurden einmal mit 20% FBS in Hanks-Puffer (Whittker, MD) gespült und zur Gewinnung von Einzelzellen 4-mal durch eine 1 9G-Spritzennadel passiert. Fläschchen, die jeweils ungefähr 1,5 × 10⁶ HECEC-Zellen enthielten, wurden jeweils mit in Verdünnungsreihen verdünnten Biotin-markiertem monoklonalem GLXA-Ab₂ oder Bioton-markiertem normalem Maus-IgG in Hanks-Puffer (100 μl) versetzt und 30 min. auf Eis inkubiert. Jedes Fläschchen wurde 2-mal mit 0,02% Azid in Hanks-Puffer gespült. Später wurden 100 μl FITC-konjugiertes Streptavidin zugegeben und 30 min. auf Eis inkubiert. Nach zweimaligem Waschen wurden die Zellen in 400 μl Scheidepuffer ("sheath buffer") auf Eis gehalten. Als Hintergrundkontrolle wurden Zellen plus FITC-konjugiertes Streptavidin sowie Zellen allein verwendet. Einfarben-Durchflusscytometrie wurde sofort mittels FACS-Scan (Becton Dickinson) durchgeführt.
Nachweis und Charakterisierung polyklonaler antiidiotypischer Antikörper
Erzeugung antiidiotypischer Antikörper gegen monoklonalem GLXA-Ab₁ in Meerschweinchen
Bei dem Immunogen, das zur Produktion der antiidiotypischen Antikörper in Meerschweinchen verwendet wurde, handelte es sich um einen als 89MS30 identifizierten monoklonalen Antikörper (monoklonaler GLXA-Ab₁). Er wurde ursprünglich durch Immunisierung von BALB/cByJ-Mäusen mit im Embryonalei vermehrten Chlamydien-Elementarkörperchen produziert. Milzzellen von Mäusen wurden mit Sp2/0-Ag14-Myelomzellen fusioniert, und die Klone wurden einem Screening unterzogen. Der Klon (89MS30) reagierte auf alle 15 Serovare von C. trachomatis, C. pneumoniae und C. psittaci 6BC sowie Maus-Meningopneumonitis mittels EIA, wodurch die Erkennung eines gattungsspezifischen Antigens demonstriert wurde. Das IgG wurde mittels ELISA unter Verwendung eines Kaninchen-anti-Maus-Antiserums (Bio-Rad Laboratories, CA) als IgG2b isotypisiert. Das monoklonale GLXA-Ab-IgG wurde aus der Aszitisflüssigkeit mit einer Rec-Protein-A-Sepharose 4B-Konjugat-Säule (ZYMED, CA) isoliert. Inzucht-Meerschweinchen (Hartley 13) wurden mit jeweils 150 μg monoklonalem GLXA-Ab₁-IgG in Gegenwart von Maalox^® als Adjuvans immunisiert und einer Auffrischimpfung unterzogen. Präimmunseren sowie Antiseren wurden über Herzpunktion und Zentrifugation gewonnen. Fünf immunisierte Meerschweinchen zeigten starke Immunantworten gegen monoklonlale Ab₁-IgG im ELISA. Es konnte gezeigt werden, dass der anti-monoklonale GLXA-Ab₁-IgG-Titer eine Woche nach der ersten Auffrischimpfung mehr als 1 bis 20000 betrug. Diese Meerschweinchen-Antiseren stiegen zwei Wochen nach der Auffrischimpfung weiter an, wie in 1 gezeigt.
Bei Fig. handelt es sich um eine Bindungskurve von Meerschweinchen-Antiseren an mAb, bestimmt mittels ELISA für Anti-Idiotyp. Präimmunseren (☐); Antiseren 3 Wochen (☒) nach der Immunisierung; 1 Woche
bzw. 2 Wochen nach der Auffrischimpfung
sind gezeigt. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert der in Doppelbestimmung durchgeführten Bestimmungen.
Vollständige Absorption von Meerschweinchen-Antiseren mit normalem Maus-IgG
Um Meerschweinchen-anti-Maus-Antikörper, die gegen von den auf den hypervariablen Bereichen der monoklonalen Ab₁-IgG-Moleküle vorhandenen Idiotopen verschiedene Epitope gerichtet sind, abzutrennen, wurden die Meerschweinchen-Antiseren mit normalem Maus-IgG absorbiert. Die Absorption wurde mittels Affinitätschromatographie durchgeführt. Die Säule wurde durch Konjugation von normalem Maus-IgG an Affi-Gel 10 hergestellt. Die Konjugation wurde durch Nachweisen der Menge an nichtgebundenem Protein bei der Absorption bei 280 nm bewertet. Die höchste optische Dichte aus einer Fraktion lag bei 0,23, wobei diese Fraktion 0,18 mg Protein nach dem Bradford-Assay (Bio-Rad Laboratories, CA) enthielt. Bei der Konjugation wurden insgesamt 50 mg Maus-IgG verwendet, was zeigt, dass die Konjugation erfolgreich war. Die Meerschweinchen-Antiseren wurden auf die Säule aufgetragen und mit 0,075 M PBS pH 7,2, eluiert. Dieses Vorgehen wurde unter Verwendung einer neu präparierten Säule wiederholt. Die Antiseren vor und nach der Absorption wurden getestet und mit Präimmunseren hinsichtlich der Reaktivität gegenüber normalem Maus-IgG mittels ELISA verglichen. Die Konzentration der Antiseren wurde für den Test äquillibriert. Die Löcher wurden jeweils mit 1 μg normalem Maus-IgG beschichtet. Verdünnungsreihen von präabsorbierten (•), präimmunisierten
und absorbierten Meerschweinchen-Antiseren (☐) wurden zugegeben. Als Hintergrundkontrolle diente PBS (o). Als zweiter Antikörper wurde Meerrettichperoxidase-konjugiertes Ziege-anti-Meerschweinchen-IgG (H&L) verwendet. Jeder Wert repräsentiert den Mittelwert der Doppelbestimmungen. Das Ergebnis zeigte, dass Seren nach der Absorption die gleiche Reaktivität gegen normales Maus-IgG wie Präimmunseren aufwiesen (2). Die nicht absorbierten Antiseren wiesen eine 5-mal höhere Reaktivität auf, was darauf hindeutet, dass alle für von Idiotypen verschiedene Epitope spezifischen Antikörper vollständig abgetrennt wurden.
Hemmung der Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA durch Meerschweinchen-Antiseren
Falls Meerschweinchen-Antiseren den spezifischen antiidiotypischen Antikörper gegen monoklonale GLXA-Ab₁-IgG-Moleküle enthalten, so besteht der direkte Effekt darin, dass die Bindung von Antigen GLXA an den monoklonalen Antikörper, nämlich monoklonalen GLXA-Ab₁, gehemmt würde. Mit anderen Worten, die Antiseren binden den Komplimentarität bestimmenden Bereich von monoklonalem GLXA-Ab₁-IgG und verhindern somit die Bindung von GLXA an das aktive Zentrum. Um dies zu testen, wurde ein Bindungskonkurrenztest mittels chemiluminumetrischen Immunoassay durchgeführt. Dabei wurden Verdünnungsreihen von Meerschweinchen-Präimmunseren, nicht absorbierten Antiseren oder absorbierten Antiseren mit GLXA inkubiert, das über Immunaffinitätschromatographie isoliert wurde. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wurden die Gemische mit mit Acridiumester konjugiertem monoklonalem GLXA-Ab₁-IgG eine weitere Stunde lang inkubiert. Nach Zugabe paramagnetischer Festphasenteilchen wurde ein RLE-Wert bestimmt. Die prozentuale Hemmung wird wie oben erwähnt berechnet. Im chemiluminometrischen Immunoassay hemmen mit Maus-IgG
erschöpfend absorbierte antiidiotypische Meerschweinchen-Antiseren die Bindung von mAb₁ an GLXA bei ungefähr den gleichen Verdünnungen wie nichtabsorbierte Meerschweinchen-Antiseren (☐). Als Kontrollen waren Präimmun (o), mAb₁ (•) und 1X PBS (♦) beteiligt. Die prozentuale Hemmung der Bindung wurde wie im Text beschrieben berechnet. Wie in 3 gezeigt war bei einer Verdünnung der Meerschweinchen-Antiseren von 1:40 95% der Bindung von monoklonalem Ab₁ an GLXA sowohl durch nicht absorbierte als auch absorbierte Antiseren gehemmt, verglichen mit 15% bei Präimmunserum. Darüber hinaus wiesen die nicht absorbierten Antiseren bei äquivalenter Proteinkonzentration eine nahezu identische Hemmung auf wie absorbierte Antiseren, was darauf hindeutet, dass durch die Absorption keine antiidiotypischen Antikörper entfernt wurden. Daher war ein kompetitiver antiidiotypischer Antikörper in Meerschweinchen erzeugt worden.
Profil von Unterklassen von anti-monoklonalen GLXA-Ab₁-IgG aus Meerschweinchen
In früheren Experimenten war gezeigt worden, dass unterschiedliche Isotypen von Meerschweinchen-Antiidiotyp unterschiedliche Effekte auf die Idiotypproduktion ausüben. Der IgG₁-Isotyp verstärkt die Idiotypproduktion, wohingegen der IgG₂-Isotyp den Idiotypklon hemmt. Um die Hemmung unterschiedlicher Isotypen von antiidiotypischem Meerschweinchen-IgG zu testen, wurden IgG-Unterklassen aus absorbierten antiidiotypischen Meerschweinchen-Antiseren isoliert. Dabei wurde ein pH-Stufengradient von Phosphatcitrat-Puffer verwendet. IgG₁ und IgG₂ wurden auf einer Protein-A-Affinitätssäule getrennt und isoliert. Das Elutionsprofil der Isotypen IgG₁ und IgG₂ ist in 4 gezeigt. Die Reinigung von IgG wurde mittels Protein-A-Affinitätschromatographie bewerkstelligt. Die Trennung von Meerschweinchen-IgG₁ und -IgG₂ wurde mit einem pH-Stufengradienten von Phosphat-Citrat-Puffer durchgeführt. Jeder Spitzenwert wurde mittels Immunelektrophorese (IEP) mit Ziege-anti-Meerschweinchen-IgG gegen Immunpräzipitatbanden (Bethyl, TX) identifiziert. Der erste, aus IgG₁ zusammengesetzte Spitzenwert wurde sowohl mit Ziegeanti-Meerschweinchen-IgG₁ als auch -IgG₂ präzipitiert, bildete jedoch eine einzige Bande mit Ziege-anti-Meerschweinchen-Antiseren. Der erste Spitzenwert wurde dann nochmals mit dem gleichen Verfahren gereinigt.
Hemmung der Bindung von Unterklassen von Meerschweinchen-IgG
Der Konkurrenztest unterschiedlicher Unterklassen von IgG wurde wiederum mittels chemiluminometrischem Immunoassay unter Verwendung antiidiotypischer Meerschweinchen-Antikörper entweder des Isotyps IgG₁ oder des Isotyps IgG₂ durchgeführt. In 5 ist gezeigt, dass 0,4 μg IgG₁ in der Lage waren, die Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA um 50% zu hemmen. Wie in 5 gezeigt, Hemmung der Bindung von mAb₁ an GLXA durch antiidiotypische Meerschweinchen-Isotypen. Die Bindung von mAb₁ an GLXA wurde durch antiidiotypisches IgG₁ (•) und teilweise durch IgG₂
im chemiluminometrischen Immunoassay gehemmt. Als Kontrollen wurden homologe nichtkonjugierte mAb₁ (O) oder PBS (☐) verwendet. Die prozentuale Hemmung der Bindung wurde wie oben beschrieben berechnet. Die vollständige Hemmung fand statt, wenn 100 μg verwendet wurden. Dies war im Wesentlichen die gleiche Konzentration, die bei Verwendung von nicht markiertem monoklonalem GLXA-Ab₁-IgG benötigt wurde. IgG₂ zeigte, wenn überhaupt, nur geringe Hemmung, ungefähr 20% der Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA bei 1,0 μg. Durch diese Daten wurde demonstriert, dass die IgG₁-Unterklasse von antiidiotypischem IgG mindestens 5-mal stärker hemmt als die IgG₂-Unterklasse.
Erzeugung anti-antiidiotypischer Antikörper (GLXA-Ab3) in Kaninchen durch Meerschweinchen-IgG₁
Die erhaltenen Hinweise zeigten, dass antiidiotypisches Meerschweinchen-IgG₂ gegen den hypervariablen Bereich von monoklonalem GLXA-Ab₁-IgG gerichtet war und ebenso dessen Bindung an GLXA hemmte. Die letzten Kriterien für ein internes Abbild der antiidiotypischen Antikörper besteht in der strukturellen Bestätigung, dass es sich bei dem Ab₂ um Ab₂β und nicht um Ab₂α oder Ab₂ε handelt. Da Ab₂ an den Grundgerüstanteil von Immunglobulinen bindet, kann er auch die Bindung von Ab₁ an das entsprechende Antigen hemmen. Zur Bestätigung, dass es sich bei dem antiidiotypischen Meerschweinchen-IgG₁ um Ab₂β handelt, wurde der Isotyp IgG₁ zur Produktion eines anti-antiidiotypischen Antikörpers (GLXA-Ab3) verwendet, der das GLXA-Epitop in einem Tier erkennen kann, das dem GLXA-Antigen niemals ausgesetzt war (Ertl et al. Proc. Ntl. Acad. Sci. USA 81:2850, 1988) Drei weiße Kaninchen (New Zealand) wurden mit antiidiotypischem Meerschweinchen-IgG₁ in Gegenwart des Adjuvans Maalox^® (Alaun) immunisiert. Die Antiseren eines Kaninchens (S2) wurden mittels ELISA gegen IgG₁ getestet (6). Die spezifische Reaktivität der Kaninchenantiseren gegen Meerschweinchen-IgG₁ wurde mittels ELISA bestimmt. Als Antigen wurde Meerschweinchen-IgG₁ und als zweiter Antikörper Ziege-anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugat verwendet. Der Titer zeigt anti-antiidiotypische Kaninchen-Antiseren drei Wochen nach der Immunisierung (☒), 1 Woche
bzw. 3 Wochen
(nach Auffrischimpfung). Als Kontrolle wurde Präimmunserum verwendet (☐). Der Titer stieg mit der Zeit nach der Immunisierung an. Der Titer war viel höher als 20000 im Vergleich mit Präimmunseren drei Wochen nach der Auffrischimpfung.
Anti-antiidiotypische Antikörper aus Kaninchen erkennen GLXA
Zum Nachweis der Reaktivität von Kaninchen-Antiseren auf GLXA wurde die Dot-Blot-Apparatur (Bio-Rad Laboratories, CA) verwendet. Antiseren aus zwei Kaninchen wurden mittels Immuno-Dot-Blot-Assay getestet. Da monoklonaler GLXA-Ab_l mit Chlamydien-LPS kreuzreagiert, wurde die Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran sowohl mit GLXA als auch Chlamydien-rLPS beschichtet. Beide Kaninchen-Antiseren erkannten GLXA und LPS mit hoher Reaktivität. Bei der Verwendung von IgG aus Kaninchen (S2) (90MS699), waren die Dots bei einer Konzentration von 0,006 μg pro Spur positiv. Präimmun-IgG ergab keine Reaktion. Das aus diesen Antiseren isolierte IgG wurde auf seine Fähigkeit zur Hemmung der Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA getestet, da durch das interne Abbild GLXA-Ab₂ produzierter GLXA-Ab₃ eine ähnliche Bindung zeigen sollte. Dies wird bestätigt, wie in 7 gezeigt. Verdünnungsreihen von präimmunisierten (☐), Kaninchen-Ab3-Antikörper
mAb₁ (•)-IgG werden hinsichtlich der Bindung im chemiluminometrischen Immunoassay bewertet. Die prozentuale Hemmung erhalten aus den Mittelwerten von Doppelbestimmungen. Die Hemmung von GLXA-Ab3 steigt mit der Konzentration an, ist jedoch 5-mal weniger stark hemmend im Vergleich mit nichtmarkiertem monoklonalem Ab₁. Dies zeigt, dass es sich bei dem antiidiotypischen Meerschweinchen-Antikörper IgG₁ um das interne Abbild des Antigens GLXA handelt. GLXA-Ab3-IgG wurde weiter hinsichtlich der Erkennung von Elementarkörperchen von C. trachomatis in vitro getestet.
Monoklonaler GLXA-Ab₁- und GLXA-Ab3-IgG wurden mit Biotin mittels Glutaraldehyd konjugiert. Markierter monoklonaler GLXA-Ab₁ bzw. GLXA-Ab3 wurde mit McCoy-Zellmonolayer auf Deckgläschen, die mit Elementarkörperchen von C. trachomatis-Serovar B (Har 36) infiziert waren, 48 Stunden inkubiert. Als Kontrolle wurden nichtinfizierte Monolayer verwendet. Das Fluoreszenzanfärbungsmuster der Elementarkörperchen durch monoklonalen GLXA-Ab₁ und polyklonale GLXA-Ab₁-IgGs demonstrierte, dass GLXA-Ab3 nicht nur die gereinigte Form, sondern auch die native Form von GLXA erkannte.
Neutralisierung der Chlamydien-Infektion in Primaten durch GLXA-Ab3-IgG (90MS699)
Die nächste Frage betraf die Fähigkeit von monoklonalem GLXA-Ab₁ bzw. GLXA-Ab3, Elementarkörperchen von Chlamydia zu neutralisieren und somit Wirtszellen vor einer Infektion zu schützen. Die zur Beantwortung dieser Frage benutzten experimentellen Ansätze beinhalteten die Neutralisierung der Infektion in kultivierten Zellen sowie die Neutralisierung der Infektion in der Bindehaut von Primaten.
Eine Chlamydien-Infektion wird in vivo durch GLXA-Ab3, jedoch nicht durch monoklonalen GLXA-Ab₁ neutralisiert.
Die Neutralisierung in Bindehäuten von Primaten wurde durch Vorinkubation der Organismen mit Antikörper-IgG und Nachweis des Effekts auf eine Augeninfektion bestimmt. Dabei wurde die IgG-Fraktion von monoklonalem GLXA-Ab₁ oder Ab3 mit Elementarkörperchen des C. trachomatis-Serovars C inkubiert. Als Kontrolle dienten normales Maus- oder Kaninchen-Präimmun-IgG ebenso wie ein Ansatz ohne Immunglobulinzusatz. Das Gemisch wurde als Inokulum auf jedes Auge des Primaten aufgetragen. An den Tagen vor und nach der Inokulation wurden durch Überstreichen unterschiedlicher Bereiche der Bindehäute Bindehautabstriche entnommen (siehe oben). Die Okulare Chlamydien-Infektion in Primaten wurde im Zellkulturtest bestimmt, der die zweite Passagierung an Tagen nach der Infektion umfasste. wie in Tabelle 1 gezeigt, wurden drei Primaten mit monoklonalem GLXA-Ab₁ behandelten EBs jeweils auf dem linken Auge und mit GLXA-Ab3 behandelten EBs jeweils auf dem rechten Auge infiziert. Zur gleichen Zeit wurden zwei Primaten mit normalem Maus-IgG behandelten EBs (dargestellt als NI) oder EBs allein jeweils abwechselnd auf dem linken und dem rechten Auge infiziert. Das gleiche Verfahren wurde für Präimmun-Kaninchen-IgG angewandt (dargestellt als N3). Alle mit monoklonalem GLXA-Ab₁ behandelten EBs inokulierten Augen waren wenigstens einmal positiv (Primat Nr. 515, 84 und 26). Jedoch war nur ein Auge der mit GLXA-Ab3 behandelten Augen einmal positiv, und zwar an Tag 10 nach der Infektion, und zwei von ihnen waren nie positiv (Primat Nr. 515, 84 und 26). Mit normalem Maus- oder Präimmun-Kaninchen-IgG behandelten EBs inokulierte Augen waren alle wenigstens einmal positiv (Primat Nr. 563, 20, 17 und 329). Die unbehandelten EBs (dargestellt als C) produzierten eine Infektion in zwei der vier beteiligten Augen (Primat Nr. 563, 20, 17 und 329). Obwohl die Datenpunkte winzig sind, zeigen sie, dass monoklonaler GLXA-Ab₁ Chlamydia in der Bindehaut von Primaten nicht neutralisiert. Andererseits wird damit angedeutet, dass GLXA-Ab3 neutralisiert. Um zu bestätigen, dass GLXA-Ab3 neutralisiert, wurden eine Reihe von Tests durchgeführt, einschließlich: (A), Neutralisierung in der Zellkultur (B), Neutralisierung in Primaten-Bindehaut (C), Nachweis im klinischen Kulturtest (D), Nachweis durch direkte Fluoreszenzantikörper-Cytologie (E), Hybridisierung einer Chlamydia-spezifischen RNA-Sonde und (F) Bestimmung der Schwere einer Augeninfektion mittels klinischer Punktwertung. Tabelle 1. Neutralisierung einer Chlamydien-Infektion in Bindehäuten von Primaten durch Ab₃, doch nicht durch mAb₁

GLXA-Ab3 neutralisiert die Chlamydieninfektion in vitro.

Ein Zellkulturtest wurde in vitro mit GLXA-Ab3 und Präimmun-Kaninchen-Antikörper durchgeführt. Die Präimmun-Kaninchen- bzw. GLXA-Ab3 (9OMS699)-IgGs wurden mittels Protein-A-Affinitätschromatographie isoliert. Das Gemisch aus jeweils 10 μg IgG und 100 μl Serovar-C-EBs (1000 IFU/ml) oder EBs allein wurden als Inokulum auf Löcher mit McCoy-Zellmonolayern aufgetragen. Dabei wurden pro Probe 10 Löcher verwendet. Einschlusskörperchen wurden mittels FITC- konjugiertem monoklonalem Anti-Chlamydia-Antikörper 48 Stunden nach der Inkubation nachgewiesen. Der IFU/ml-Wert beruhte auf 15 Feldern pro Loch. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde die Infektiösität durch Ab3-IgG 3-mal stärker reduziert als durch Präimmun-IgG und 5-mal stärker reduziert als durch EBs allein, was auf eine Neutralisierung durch GLXA-Ab3 hinweist. Tabelle 2. in-vitro-Neutralisierung einer Chlamydien-Infektion durch Ab3-IgG

GLXA-Ab3 neutralisiert die Chlamydien-Infektion in Primaten

Bei diesem Experiment wurden 8 Primaten willkürlich in drei Gruppen eingeteilt. Die Augen von vier Primaten erhielten zuvor mit GLXA-Ab3-IgG inkubierte gereinigte EBs (rechte Augen), die Augen von zwei Primaten erhielten zuvor mit Präimmun-IgGs inkubierte EBs (vier Augen), und die Augen der beiden letzten Primaten erhielten unbehandelte EBs (vier Augen). Am Untersuchungstag wurden die Bindehautabstriche entnommen und als Zellkultur kultiviert. Da es keine signifikanten Unterschiede zwischen den Empfängern von Präimmun-IgG und EBs allein gibt, sind die Ergebnisse als 8 Versuchsaugen und 8 Kontrollaugen dargestellt. Die Zellkulturergebnisse sind als IFU/ml, bezogen auf das Zählen von Einschlüssen in 15 Feldern für zwei Löcher pro Probe, ausgedrückt. wie in Tabelle 3 gezeigt, war 20 Tage nach dem Challenge eines der 8 Augen positiv, verglichen mit 8 von 8 Augen, die in der Kontrollgruppe positiv waren. Bei der Untersuchung der akkumulierten Ergebnisse waren mit GLXA-Ab3 9 von 40 (22,5%) positiv gegenüber 36 von 40 (90%), die ohne GLXA-Ab3 positiv waren. Tabelle 3. Neutralisierung einer Chlamydien-Infektion in Bindehäuten von Primaten durch Ab₃-IgG im Zellkulturtest^a

^a Nur eine in der ersten Passagierung negative Probe war in der zweiten Passagierung positiv bEBs wurden zuvor ohne Antikörper inkubiert.

In einem Paralleltest wurde auch ein Cytologietest mit direktem Fluoreszenzantikörper (DFA) durchgeführt, um die Anzahl an EBs aus den Bindehautabstrichen abzuschätzen. Dabei wurden die Bindehautabstrichproben auf Objektträger fixiert und mit FITC-markiertem monoklonalem Antikörper gegen C. trachomatis angefärbt. Als positiv wurde gewertet, wenn jeweils 5 oder mehr charakteristische Elementarkörperchen auf dem Objektträger zu sehen waren (Micro Trak, Syva Co. CA). Wie in Tabelle 4 gezeigt, wurde EBs in der mit GLXA-Ab3 behandelten Gruppe nur bei zwei Gelegenheiten, nämlich Tag 6 bzw. 12 nach der Infektion, nachgewiesen, während der Rest bis Tag 20 positiv war. In der unbehandelten Gruppe war an Tag 2 nur ein Auge EB-negativ, was vermutlich ein Artefakt war. EBs wurden in allen Augen in dieser Gruppe im restlichen Experiment nachgewiesen. Am letzten Untersuchungstag (Tag 20) war keines der mit GLXA-Ab3 behandelten Augen positiv, während in der kombinierten Kontrollgruppe 8 von 8 positiv waren. Darüber hinaus sind die DFA- und Kulturergebnisse vollständig kongruent. Tabelle 4. Neutralisierung einer Chlamydien-Infektion durch Ab₃ unter Verwendung eines Zytometrietests mit direktem Fluoreszenzantikörper (DFA)^a

GLXA-Ab₃ schwächt die Chlamydien-Replikation bei einer Bindehautinfektion weitgehend ab.

Zum weiteren Verständnis des Mechanismus der Neutralisierung war chlamydien-spezifische ribosomale RNA aus jenen Primatenbindehautabstrichen mit einer DNA-Sonde untersucht worden (Cheema et al., The Ameri. J. Med. Sci. 302: 261-268, 1991). Gesamt-RNA wurde aus Primatenaugen entnommenen Bindehautabstrichen extrahiert. Als Kontrolle wurde RNA aus Serovar-CEBs, Mensch oder Hefe verwendet. Für die Gene der ribosomalen 16S- und 23S-RNA codierende ³²P-Chlamydien-DNA wurde zum Nachweis von chlamydien-spezifischer RNA in einem Northern-Slot-Blot-Hybridisierungsassay verwendet. Wie in 8 gezeigt, zeigen die Kontrollaugen (entweder mit Präimmun-Kaninchen-IgG plus EBs oder mit EBs allein infiziert) durchgehend signifikante Niveaus an Chlamydien-RNA zu allen untersuchten Zeitpunkten, und ähnliche, aus den Augen eines mit GLXA-Ab₃ behandelten Organismus präparierte RNA-Proben zeigen signifikante abgeschwächte Niveaus an Chlamydien-RNA. Ribosomale Chlamydien-RNA wurde aus Bindehautabstrichen von vier mit Ab₃ IgG (• in 8) behandelten EBs infizierten Primaten, von zwei mit Präimmun-Kaninchen-IgG (o in 8) behandelten Primaten und von zwei mit EBs allein
in 8) behandelten Primaten extrahiert. Die relative Signalintensität der Northern-Slot-Blot-Autoradiogramme wird unter Verwendung einer willkürlichen Skala ausgedrückt. Mittelwerte wurden von den Werten für jedes der beiden Augen von jedem Primaten an dem Zeitpunkt abgeleitet. Dies deutet darauf hin, dass die Neutralisierung in einem sehr frühen Stadium der Infektion stattfindet.
Der Grad der Bindehautentzündung nach der Inokulation mit zuvor mit entweder GLXA-Ab₃ oder Präimmun-IgG inkubierten EBs oder ohne vorherige Inkubation wurde anhand der klinischen Reaktion beurteilt. Die klinische Reaktion wurde bezogen auf einen klinischen Krankheitsgesamtpunktwert (TCDS [total clinical disease scores]), der sich von zehn klinischen Entzündungsmerkmalen ableitet (Taylor et al., Invest. Opthalmol. Vis. Sci. 29: 1847, 1988). gestuft. Die akkumulativen Krankheitspunktwerte wurde für jede Gruppe von Primaten durch Untersuchen der zehn in der Bindehaut existierenden Anzeichen erhalten. Die klinischen Krankheitspunktwerte wurden auf einer Skala von 0 bis 3 für jeweils zehn Anzeichen einer Bindehautentzündung gestuft. Von jedem mit mit Ab₃ (•) behandelten oder mit Präimmun-Kaninchen-IgG (o) behandelten Elementarkörperchen infizierten Primaten wurden Gesamtentzündungspunktwerte erhalten. wie in 9 gezeigt, entwickelten Empfänger von GLXA-Ab₃ nur in sehr geringem Ausmaß eine klinische Krankheit, die nach Tag 8 abnahm. Bei Kontrolltieren entwickelte sich eine schwere Krankheit weiter bis Tag 21 nach dem Challenge. Dieser pathologische Befund stimmt mit den Daten aus Zellkultur, DFA und RNA-Hybridisierung überein.
Erzeugung von und Charakterisierung von einen antiidiotypischen Antikörper produzierenden Hybridomzelllinien.
Herstellung von einen antiidiotypischen Hybridomzellen
Fünf syngene Mäuse (BLAB/cByJ) wurden intraperitoneal mit KLH-konjugiertem monoklonalem GLXA-AB, IgG in Gegenwart von komplettem Freundschem Adjuvanz immunisiert. Die antiidiotypischen Antiseren gegen monoklonales GLXA-Ab₁-IgG aus diesen Mäusen wurden mittels Sandwich-ELISA nachgewiesen. Der Titer betrug etwa 1:1000 drei Wochen nach der Immunisierung (Daten nicht gezeigt). Es wurden Fusionen zwischen Sp2/0-Ag14-Zellen und Milzzellen aus zwei Mäusen, die den höchsten Titer gegen monoklonalen GLXA-Ab₁ aufwiesen, hergestellt. Die Milz dieser Mäuse war fast zweimal so groß wie eine normale Milz. Die Klone wurden einem Screening nach dem gleichen Verfahren wie für das Testen von Maus-Antiseren unterzogen.
Als Kontrollen wurden in allen Screening-Tests vereinigte Maus-Antiseren bzw. Präimmunseren in einer Verbindung von 1:10 verwendet. Nach dem Screening von 283 Löchern wurden 8 von diesen als positiv gegen mAbI angesehen, wobei ein Titer vorlag, der zweimal so hoch oder höher war als die Negativkontrolle. Diese Hybridomen wurden kloniert. Ein Klon (91 MS441) wies den höchsten Titer im ELISA auf und wurde vermehrt.
Die Ascitesflüssigkeit wurde produziert und IgG-isoliert. Der IgG-Isotyp dieses Klons wurde als IgGI identifiziert und wies eine leichte Kette K auf (Bio-Rad Laboratories, CA). Die Fusionsergebnisse sind in Tabelle 5 zusammengefasst. Tabelle 5 Zusammenfassung der Fusion für antiidiotypische Antikörper

Leichte Kette: k
Schwere Kette: IgG₁

IgG sezernierendes Hybridom (91 MS441) hemmt die Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA.
Der Überstand von positiven Klonen wurde weiter auf die Hemmung der Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA mittels chemiluminometrischem Immunoassay getestet. Dabei wurde für die Überstände von vier Klonen ohne Verdünnung eine totale Hemmung der Bindung festgestellt. Zwei Wochen später stellte sich heraus, dass nur ein Klon (91 MS441) stabil war. Wie in 10 gezeigt, hemmt der Überstand von diesem Klon in einer Verdünnung von 1:10 die Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA um 80%, verglichen mit 0% für einen nicht positiven Klon (91 MS442) aus der gleichen Fusion. Reihenverdünnungen des Kulturüberstands von Klon 91MS441 (• in 10) und des negativen Klons 91MS442 (o in 10) wurden mittels chemiluminometrischem Immunoassay getestet. Der Prozentsatz wird aus dem Mittelwert der Doppelbestimmung erhalten. Dies zeigt, dass ein antiidiotypischer Klon produziert wurde. Er wird als monoklonaler GLXA-AB₂ identifiziert. Monoklonaler GLXA-Ab₂ wird von Anti-Chlamydia-Antiseren aus Patient und Kaninchen erkannt.
Als internes Abbild einer antigenen Determinante sollte der antiidiotypische Antikörper von allen spezifischen Antiseren gegen dieses Epitop unabhängig von der Spezies erkannt werden. Um diese Eigenschaft des von Klon (91MS441) produzierten IgG zu testen, wurde menschliches Serum aus einem klinisch als Chlamydia-positiv diagnostizierten Patienten verwendet. Da es sich bei dem Isotyp des monoklonalen GLXA-AB₂ um IgGI handelt, wurde die Reinigung des IgG mittels Protein-G-Affinitätschromatographie durchgeführt. Das isolierte monoklonale GLXA-Ab₂-IgG wurde als Beschichtung auf eine Mikrotiterplatte aufgetragen und auf Reaktivität mit dem Patientenserum (91MS253) mittels ELISA getestet. Als Negativkontrolle wurde menschliches Serum ohne eine klinisch diagnostizierte Chlamydien-Infektion (88MS356) verwendet. Die Ergebnisse zeigten, dass das Patientenserum einen Titer aufwies, der mehr als 1:2000 gegen monoklonalen GLXA-Ab₂ betrug (11). Der Test wurde mittels ELISA durchgeführt. Dabei wurden Verdünnungsreihen des aus einem mit einer Infektion mit Chlamydia diagnostizierten Patienten
und aus einem nicht diagnostizierten Individuum (☐) erhaltenen Antiserums mit auf den Polystyrollöchern beschichteten mAb₂IgG inkubiert. Bei dem zweiten Antikörper handelt es sich um Ziege-anti-Mensch-Peroxidase-Konjugat. Die Daten werden in Form der Mittelwerte für Doppelbestimmungen präsentiert und zeigen, dass das infizierte menschliche Antiserum den spezifischen Antikörper gegen monoklonalen GLXA-Ab₂ aufweist, was darauf schließen lässt, dass es sich bei dem monoklonalen GLXA-Ab₂ um das interne Abbild von GLXA handelt.
Die spezifische Erkennung von monoklonalem GLXA-Ab₂ durch ein Kaninchen-anti-Chlamydien-Antiserum (88MS188) wurde ebenso auf ähnliche weise getestet. Das Kaninchen-Antiserum wurde durch Inokulation mit EBs produziert. Wie in 12 gezeigt, weist das Kaninchen-Antiserum eine höhere Bindung am monoklonalen GLXA-Ab₂ auf als Präimmunserum, wobei die Bindung jedoch geringer als erwartet ist. Der Unterschied zwischen der Bindung wird bis zu einem Verdünnungsfaktor von 1:1000 gesehen. Eine Polystyrolplatte wurde mit mAb₂IgG (1 μg/Loch) beschichtet. Verdünnungsreihen von für Chlamydien-EBs
spezifischem Kaninchen-Antiserum oder Präimmun-Kaninchenserum (☐) wurden jeweils in Doppelbestimmung in die Löcher gegeben. Die spezifische Bindung des Antiserums wurde mittels Maus-anti-Kaninchen-IgG (H&L)-HRP-Konjugat sowie TMB-Substrat nachgewiesen. Dies zeigt, dass gegen Chlamydia gerichtetes Kaninchen-Antiserum den spezifischen, monoklonalen GLXA-Ab₂ erkennenden Antikörper aufweist, was einen zusätzlichen Hinweis auf monoklonalen GLXA-Ab₂ als internes Abbild darstellt.
Antiseren mit monoklonalem GLXA-Ab₃ aus syngenen Mäusen erkennen GLXA
Der antiidiotypische Antikörper kann als internes Abbild antigenspezifische Antiseren in Tieren erzeugen, die diesem Antigen niemals ausgesetzt waren. In diesem Fall sollte, falls es sich bei dem monoklonalen GLXA-Ab₃ (91MS441) um das als interne Abbild von GLXA (das die gleiche antigene Struktur trägt) handelt, ein Anti-GLXA-Antikörper in den gleichen Mäusen des Stamms BALB/cByJ trotz der Tatsache, dass diese GLXA nie ausgesetzt wurden, produziert werden. In einem ersten Experiment wurden acht Mäuse mit monoklonalem GLXA-Ab₂-IgG und vier Mäuse mit normalem Maus-IgG immunisiert. Bei der subkutanen Injektion wurde kein Adjuvanz verwendet. Sieben Tage bzw. 14 Tage nach der Immunisierung und einer Auffrischimpfung wurden aus diesen Mäusen Antiseren gewonnen, indem die Hälfte der Mäuse in jeder Gruppe getötet wurde. Ein Immuno-Dot-Blot-Assay wurde mit gereinigtem GLXA durchgeführt. Der Dot-Blot zeigte, dass mit monoklonalem GLXA-Ab₂-IgG immunisierte Mäuse einen bis zu 1:800 hohen Titer aufwiesen, verglichen mit einem Wert von 1:100 oder weniger bei den mit normalem Maus-IgG immunisierten Mäusen. Die Blots wurden weiter mittels eines Densitometers quantifiziert. Bei einer Verdünnung von 1:100 nach der ersten Auffrischimpfung binden die Antiseren aus allen vier Mäusen an GLXA, während in der Kontrollgruppe selbst bei einer Verdünnung von 1:50 keine Bindung beobachtet wurde. Dies zeigt, dass dieses Antiserum nur durch das Paratop des Antiidiotypen hervorgerufen wird, da die Empfänger syngen sind.
GLXA-Ab₃ aus syngenen Mäusen hemmt die Bindung von monodonalem Ab₁ an GLXA.
GLXA-Ab₃-Antiseren, die spezifisch an GLXA binden, wurden auch auf die Hemmung der Bindung von monoklonalem Ab₁ an GLXA mittels chemiluminometrischem Immunoassay getestet. Bei einer Verdünnung von 1:25 hemmt GLXA-Ab₃ 90% der Bindung verglichen mit 18% Hemmung durch die Kontroll-Antiseren an Tag 8 nach der Immunisierung. Dies entspricht der gleichen Hemmung, die von 10 μg nichtmarkiertem monoklonalen GLXA-Ab₁ gezeigt wurden. Die gleiche Hemmung wurde in den Antiseren an Tag 14, eine Woche nach der ersten Auffrischimpfung mit der gleichen Menge (50 μg/Maus) IgG, festgestellt. Es sei angemerkt, dass die prozentuale Hemmung von 70% an Tag 7 auf etwa 50% an Tag 14 abfiel, wenn 1:100 verdünnt wurde.
Immunisierung mit monoklonalem GLXA-Ab₂ schützt Mäuse vor einer Chlamydien-Infektion.
In dieser Untersuchung wurden BALB/cByJ-Mäuse als ein Tiermodell für eine okulare Chlamydien-Infektion verwendet. Das erste Experiment wurde mit 39 Mäusen durchgeführt. Dabei wurden 20 Mäuse subkutan mit 50 μg monoklonalem GLXA-Ab₂ und 19 mit normalem, Maus-IgG ohne jegliches Adjuvanz immunisiert. Insgesamt wurden drei Injektionen im Abstand von jeweils einer Woche gegeben. Eine Woche nach der letzten Injektion wurden die Mäuse mit Elementarkörperchen des C. trachomatis-Serovars C (5000 IFU pro Auge) inokuliert. Die Bindehautabstriche wurden den Augen der Mäuse jeweils an Tag 0, 7, 14 und 21 nach der Infektion entnommen. Proben von Bindehautabstrichen wurden gesammelt und 48 Stunden in McCoy-Zellmonolayern kultiviert. Die Einschlusskörperchen wurden gezählt, wobei fünf Einschlüsse als positiv in 15 Feldern betrachtet wurden. Wie in 13 gezeigt, wiesen mit monoklonalem GLXA-Ab₂ immunisierte Mäuse im Vergleich mit mit normalem Maus-IgG immunisierten Mäusen eine halb so große Infektiösität auf. In einem zweiten Experiment (20 Mäuse pro Gruppe) wurde die Immunisierung auf ähnliche Weise wiederholt. Allerdings erhielten die Mäuse 10⁶ IFU pro Auge, 100-mal mehr als die Anzahl EBs, wie sie im ersten Experiment verwendet wurde. 20 Mäuse wurden mit mAb₂ (•) und 19 mit normalem Maus-IgG (o) subkutan immunisiert (50 μg IgG/Maus). Sie wurden einem okularen Challenge mit EBs des C. trachomatis-Serovars C nach dreimaliger Immunisierung im Abstand von jeweils einer Woche unterzogen. Dabei erhielt jedes Auge 5000 IFU. Jeweils einen Tag von und nach dem Challenge wurde jedem Auge eine Bindehautprobe entnommen und als Zellkultur kultiviert. Der Prozentsatz an positiven Augen beruht auf der Anzahl der positiven Augen unter allen in einer Gruppe untersuchten Augen. Überraschenderweise wurde nahezu die gleiche Schutzkurve in den Mäusen festgestellt (14), was darauf schließen lässt, dass der monoklonale GLXA-Ab₂ eine heftige Abwehrreaktion des Wirts hervorruft. Nach dreimaliger Immunisierung im Abstand von jeweils einer Woche erhielten 20 mit mAb₂IgG (•) und 20 mit normalem Maus-IgG (o) immunisierte Mäuse ungefähr 5 × 10⁴ bis 5 × 10⁶ EBs des Chlamydia trachomatis-Serovars C pro Auge. Die Chlamydia-Bindehauteinschlüsse wurden mittels aus Bindehautabstrichen gewonnener Zellkultur getestet. Bei den Werten handelt es sich um die Mittelwerte der Ergebnisse der ersten und zweiten Passagierungskultur, außer Tag 28.
In einem dritten Experiment wurde bei der Immunisierung Aluminiumhydroxid (Alaun) verwendet. Dabei wurden zehn Mäuse mit monoklonalem GLXA-Ab₂ in Gegenwart von Maalox^® als Adjuvanz, acht Mäuse ohne Maalox^® und 16 Mäuse mit normalem Maus-IgG in Gegenwart von Maalox^® immunisiert. Bei der Immunisierungsverfahrensweise handelte es sich um die gleiche wie zuvor. Bei der Verwendung von Maalox^® in der Immunisierung wurde der Titer der Anti-antiidiotypischen Antiseren in Mäusen verdoppelt, wie gegen GLXA im Immuno-Dot-Blot getestet. Die höheren Antiserentiter in den mit Adjuvanz behandelten Mäusen demonstrieren einen wirksameren Schutz in den Mäusen vor der Augeninfektion im Vergleich zu den ohne Alaun immunisierten Mäusen (15). Zehn Mäuse wurden mit mAb₂-IgG plus Alaun (•), acht mit mAb -IgG ohne Alaun (o) und 16 mit normalem Maus-IgG plus Alaun
immunisiert. Eine Woche nach der letzten Auffrischimpfung wurden die Mäuse am Auge infiziert, und die Bindehautinfektion wurde über Zellkultur am angegebenen Tag nachgewiesen. Jedoch wiesen mit monoklonalem GLXA-Ab₂ immunisierte Mäuse eine wesentlich geringere Infektion auf als solche, die normales Maus-IgG plus Alaun erhalten hatten. Darüber hinaus war die Infektion an Tag 28 nach dem Challenge geklärt. Im vierten Experiment wurden acht Mäuse mit monoklonalem GLXA-Ab₂ und acht mit normalem Maus-IgG in Gegenwart von Alaun immunisiert. Bei den Immunisierungs- und Inokulationsvorschriften handelt es sich um die gleichen wie zuvor. Allerdings wiesen, wie in 16(A) gezeigt, an Tag 7 beide Gruppen den gleichen Infektionsgrad auf, wobei 50% der Augen infiziert sind. Man erkennt jedoch von Tag 10 an zwischen den beiden Gruppen einen signifikanten Infektionsunterschied. Bei der mit monoklonalem GLXA-Ab₂-IgG immunisierten Gruppe waren an Tag 14 zwei von acht Augen positiv. An Tag 22 eines von acht. Kein Auge war positiv an Tag 28, was einen deutlichen Rückgang der Infektion anzeigt. Dagegen waren bei mit normalen Mäuse-IgG immunisierten Mäusen an Tag 14 sechs von sechs Augen positiv und blieben positiv bis Tag 42. Die Anzahl an infizierten Augen begann mit Tag 28 zu fallen, wobei man annimmt, dass es sich dabei um einen natürlichen Erholungsprozess handelt. In einem letzten Experiment wurden die Mäuse mit vollständig geklärter Infektion aus dem obigen Experiment einem nochmaligen Challenge mit EBs unterzogen, um zu beurteilen, ob die Immunität mit Gedächtnis assoziiert war. Ein signifikanter Faktor hinsichtlich des Schutzes ist die Fähigkeit der immunisierten Mäuse, die Organismen aus ihren Augen wesentlich früher als die nicht immunisierten Mäuse zu klären. Es ist klar ersichtlich, dass dies bei mit monoklonalem GLXA-Ab₂ immunisierten Mäusen der Fall ist (16(B)). Dies zeigt, dass monoklonaler GLXA-Ab₂ nicht nur in der Lage ist, eine schützende Immunantwort, sondern auch eine Gedächtnisimmunantwort hervorzurufen. Nach dreimaliger Immunisierung im Abstand von jeweils einer Woche erhielten 20 mit mAb₂-IgG immunisierte Mäuse (•) und 20 mit normalem Maus-IgG immunisierte Mäuse (o) ungefähr 5 × 10⁴ bis 5 × 10⁶ EBs des Chlamydia trachomatis-Serovars C pro Auge. Die Chlamydien-Bindehauteinschlüsse wurden mit aus Bindehautabstrichen gewonnener Zellkultur getestet. Bei den Werten handelt es sich um die Mittelwerte der Ergebnisse der ersten und zweiten Passagierungskultur, außer Tag 28.
Dieses Beispiel veranschaulicht, dass ein GLXA imitierender antiidiotypischer Antikörper Mäuse als Tiermodell vor einer Augeninfektion mit Chlamydien schützt. Der zur Produktion antiidiotypischer Antikörper verwendete monoklonale Antikörper mAb₁ (89MS30) wurde durch Immunisierung mit ganzen EBs produziert und einem Screening auf seine Reaktion gegenüber einem gattungsspezifischen Antigen unterzogen. Er wurde zur Identifizierung von GLXA verwendet und zeigte eine spezifische Bindung an dem Polysaccharidanteil von GLXA. Ebenso wurde festgestellt, dass dieser Antikörper mit cLPS kreuzreagiert.
Zunächst handelt es sich bei GLXA und cLPS um deutlich unterschiedliche gattungsspezifische Antigene. GLXA wurde auf RBs, EBs, Einschlussmembranen und Wirtszellmembranen gefunden sowie in den Einschlussraum, das Zytoplasma der infizierten Zellen sowie in die Umgebung abgegeben. Es wurde aus dem Überstand einer infizierten Zellkultur gewonnen. Während cLPS sowohl auf EBs als auch RBs (hauptsächlich RBs) gefunden wurde, wird cLPS nicht sezeniert oder von infizierten Zellen abgegeben, sondern ist locker an die RBs gebunden. Strukturmäßig weisen sie unterschiedliche Polysaccharidgruppierungen auf. GLXA besitzt einen einzigartigen Zuckerrest: Gulose oder Gulosederivate, Mannose und Galactose, wahrscheinlich in sich wiederholenden Einheiten von Guluoronsäure und Mannuronsäure angeordnet. Es stellte sich heraus, dass mit dem Antigen nur zwei Fettsäuren assoziiert sind, verglichen mit wenigstens zwölf bei cLPS. Wohingegen cLPS ein typisches lineares 2-Keto-3-dexyoctonsäure (KDO)-trisaccharid (allgemeiner Kern) sowie Polysaccharide wie etwa Glucosamin und Heptose aufweist. Serologisch binden monoklonale GLXA-Ab₁ spezifisch an Gulose und Mannose-Wiederholungsblock. Während das cLPS-gattungsspezifische Epitop auf KDO vorliegt, ist die spezifische Determinate die 2-8-Verknüpfung. Es ist offensichtlich sehr unwahrscheinlich, dass GLXA und cLPS das gleiche Epitop teilen. Es ist bekannt, dass Antikörper, gleichgültig, ob es sich dabei um poly- oder monoklonale, entweder durch Immunisierung mit ganzen EBs oder durch gereinigtes cLPS produzierte Antikörper handelt, keine neutralisierenden oder schützenden Funktionen aufweisen. Aus der Zusammensetzungsanalyse lässt sich schließen, dass Gulose zusammen mit Mannose und Galactose das spezifische Epitop von GLXA bildet. Dagegen weist cLPS neben dem KDO-Trisaccharid als Epitop weitere Epitope im KDO-Bereich und auch weitere Saccharidanteile auf. Diese letzteren Strukturen zeigten eine breite Kreuzreaktion mit LPS aus anderen gramnegativen Bakterien. Da dieses Schutzepitop von GLXA aus einem Array von Zuckerresten besteht, ist es vernünftiger, anzunehmen, dass einige davon von cLPS teilweise mit GLXA geteilt werden.
Es bestehen einige weitere Möglichkeiten hinsichtlich dieser Kreuzreaktion. So teilen beispielsweise (1) GLXA und cLPS keinerlei primäre Ähnlichkeit, bilden jedoch strukturell ein ähnliches Bindungsmotiv; (2) zwar bindet monoklonaler GLXA-Ab₁ an cLPS, doch besteht zwischen den Antikörperbindungsstellen von GLXA und cLPS keine Ähnlichkeit. Der monoklonale Antikörper kann multispezifisch sein, das heißt er kann ein ziemlich unterschiedliches Epitop erkennen.
Aus der obigen Diskussion heraus wird angenommen, dass monoklonaler GLXA-Ab₁ spezifisch für das GLXA-Epitop ist, wobei die Möglichkeit, dass GLXA und cLPS einige Zuckerreste oder lediglich eine Strukturähnlichkeit teilen, die Kreuzreaktivität erklären kann.
Antiidiotypische Antikörper, GLXA-Ab₃ und monoklonaler GLXA-Ab₂
Ein antiidiotypischer Antikörper ist ein wirkungsvolles und langlebiges Immunogen
Monoklonaler GLXA-Ab₁ wurde subkutan in Abwesenheit von Konjugat oder Freundschem Adjuvanz in Meerschweinchen initiiert. Alle vier immunisierten Meerschweinchen entwickelten für monoklonalen Ab₁ spezifische antiidiotypische Antikörper mit hohem Titer, die bereits drei Wochen nach der ersten Immunisierung gefunden wurden. Der Titer betrug ungefähr 1:5000 im ELISA. Die produzierten antiidiotypische Antiseren enthielten eine relativ hohe Konzentration an GLXA-Ab₂, der für den hypervariablen Bereich von monoklonalem GLXA-Ab₁ spezifisch ist. Dies konnte nach zwei Absorptionen durch normales Maus-IgG gezeigt werden. Wurde als Immunogen der IgG₁-Isotyp von antiidiotypischen Meerschweinchen-Antikörpern in drei Kaninchen verwendet, so betrug der Titer am anti-antiidiotypischen Antikörper zwei Monate nach der Immunisierung mehr als 1:20 000. Dies zeigt, dass Immunglobulin selbst ein sehr wirkungsvolles Immunogen ist. Dies gilt nicht nur für eine Interspezies-Immunisierung, sondern auch für eine syngene Immunisierung. Mit dem monoklonalen antiidiotypischen Antikörper, monoklonaler GLXA-Ab₂, wurde die Immunisierung in syngenen Mäusen ohne KLH-Konjugation oder Freundsches Adjuvanz durchgeführt. Die Mäuse entwickelten GLXA-Ab₃ mit hohem Titer kurz nach der Immunisierung (g Tage). Die in dieser Untersuchung verwendete Vorschrift unterscheidet sich von den meisten Verfahren, bei denen entweder ein Konjugat oder Freundsches Adjuvans für eine höhere Immunogenität verwendet wird. Dies deutet darauf hin, dass Immunglobulin als Antigen stärker immunogen im Vergleich mit den meisten isolierten oder synthetischen Peptidantigenen ist.
Ein erfolgreicher Impfstoff erfordert nicht nur, dass es sich dabei um ein gutes Immunogen handelt, sondern dass er langlebig (vorzugsweise über die Lebensdauer des Wirts) ist. Die idiotyp-produzierte Immunität ist langlebig. Die Fähigkeit von Meerschweinchen-GLXA-Ab₂ aus drei immunisierten Meerschweinchen zur Hemmung der Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA wurde bis zu 77 Wochen lang beobachtet. Bei lediglich drei Auffrischimpfungen ist die Hemmung ein Jahr nach der Immunisierung fast die gleiche wie bei Antiseren, die in den frühen Stadien nach der Immunisierung gesammelt wurden. Dies deutet darauf hin, dass die von dem idiotypischen Antikörper monoklonaler GLXA-Ab₁ hervorgerufene Immunität ein Langzeitgedächtnis besitzt. Da die Halbwertszeit eines Antikörpermoleküls oder der Mehrzahl an Antikörper produzierenden Zellen etwa einige Wochen beträgt, geht das Auffrischintervall (sechs Monate) weit über die Lebensspanne der B-Zellen und der Immunglobuline hinaus. Dabei ist es die konstante Stimulierung innerhalb des idiotypischen Netzwerks, das diesen antiidiotypischen Antikörper auf einem bestimmten Spiegel hält. Die Änderung der idiotypischen Spezifität während dieses Zeitraums wurde in diesem Fall nicht beobachtet.
Ein internes Abbild von Chlamydien-GLXA, isotypischer Unterschied
In dieser Untersuchung wurden Meerschweinchen-GLXA-Ab₂-IgG1 und -IgG2 getrennt. Die Regulationsfunktion dieser beiden Isotypen gegenüber dem Isotyp wurde nicht bewertet. Allerdings wurde ein Unterschied zwischen den Unterklassen IgG1 und IgG2 bei der Hemmung der Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA gefunden. Mit einem neuartigen System, dem chemiluminometrischen Immunoassay, wurden sowohl die Inkubation als auch der endgültige Nachweis in Lösung statt an der Festphase wie im ELISA durchgeführt, womit die Möglichkeit einer Hemmung durch Hinderung stark verringert wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass GLXA-Ab₂-IgG1 100% der Bindung hemmt, wohingegen IgG2 bei gleicher Konzentration 50% hemmt. Dies lies darauf schließen, dass GLXA-Ab₂-IgG1 eine hohe Bindungsaffinität zum Idiotyp aufweist oder dem Antigen GLXA ähnlicher ist. Dies zeigt einen isotypischen Unterschied in ihrer Bindungsfähigkeit zum Idiotyp, was einen Unterschied in ihren jeweiligen aktiven Zentren widerspiegelt. IgG1 weist eine gegenüber IgG2 unterschiedliche Idiotypbindungsfähigkeit auf. Es gibt eine Reihe von Beispielen für dominante Idiotypen, beispielsweise das A5A-Idiotop von Anti-strep-A-Kohlenhydrat-Antikörpern oder das T15-Idiotop von Phosphorylcholin-Antikörpern. Es ist nicht klar, ob irgendeine Isotyppräferenz eines antiidiotypischen Antikörpers in unterschiedlichen Systemen vorliegt. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass ein bestimmter Isotyp von GLXA-Ab₂ das interne Abbild darstellt, während andere dies nicht tun.
Monoklonaler GLXA-Ab₂ als Immunogen von Chlamydien-GLXA
Der Zweck einer Herstellung monoklonaler antiidiotypischer Antikörper besteht darin: (1) eine ständige Quelle eines antiidiotypischen Antikörpers für die Wirkstoffuntersuchung zu besitzen; (2) einen möglichen Rezeptor für GLXA auf Wirtszellen zu identifizieren und (3) das Epitop auf GLXA weiter zu charakterisieren. Dadurch wird ein Verständnis der biologischen Funktionen von GLXA hinsichtlich Epitopdichte, seiner Rolle im Infektionsmechanismus und der Schutzfunktion gegen eine Chlamydieninfektion in vivo ermöglicht. Die Produktion monoklonaler antiidiotypischer Antikörper wurde in den syngenen BALB/cBYJ-Mäusen durchgeführt. Bei der ersten Fusion wurde nach einem Screening von 283 Klonen ein stabiler, stark hemmender Klon (91MS441) ausgewählt. Bei der zweiten Fusion wurde ein weiterer Klon (91MS442) ausgewählt, obwohl dieser im chemiluminometrischen Immunoassay nicht so stark hemmt wie der 91MS441-Klon. Es konnte gezeigt werden, dass der von diesem Klon (91MS441) produzierte monoklonale GLXA-Ab₂ das interne Abbild des Chlamydien-Antigens GLXA ist.
Interessanterweise sollte angemerkt werden, dass die Hemmfähigkeit von Maus-GLXA-Ab₃ mit der Zeit leicht, doch offensichtlich abnimmt. Die Dosierung des Antiidiotyps stellte einen Faktor sowohl bei der Verstärkung des Idiotyps als auch bei der Unterdrückung des Idiotyps dar. Diese Ergebnisse der Hemmung durch GLXA-Ab₃ zeigten, dass nach zweimaliger Verabreichung von monoklonalem GLXA-Ab₂-IgG die Hemmung höher ist als bei den nach dreimaliger Verabreichung erhaltenen Seren. Dies deutete darauf hin, dass 50 μg entweder zu viel für eine Dosis oder zuviel für wiederholte Verabreichungen ist. Andererseits wurde damit auch gezeigt, dass für eine schützende Immunität eine geringe Menge ausreicht. Der Grund für die Wahl von normalem Maus-IgG als Negativkontrolle bei der Immunisierung statt eines nichtverwandten Klons liegt darin, dass damit eine mögliche Voreingenommenheit eines spezifischen Klons verhindert wird.
Monoklonaler GLXA-Ab₁ und GLXA-Ab₃ tragen die gleiche Antigenbindungsstruktur.
GLXA-Ab₃ aus immunisierten Kaninchen und Mäusen erkannte affinitätsgereinigtes GLXA im Immuno-Dot-Blot-Assay trotz keiner vorherigen Exposition gegenüber GLXA oder Infektion. Die Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA wird mit steigender Konzentration an GLXA-Ab₃ gehemmt. Dies deutet darauf hin, dass der anti-Antiidiotyp eine äquivalente Antigenreaktivität wie der Idiotyp aufweist, das heißt, sie erkennen das gleiche Epitop. Da monoklonale GLXA-Ab₁ und GLXA-Ab₃ aus Kaninchen die gleiche Antigenreaktivität gegenüber GLXA besitzen, wurde ferner in der Immunfluoreszenzanfärbung der Einschlüsse in einer infizierten McCoy-Zellkultur bestätigt. Das Experiment ließ auf die strukturelle Ähnlichkeit der Antikörper schließen. Die Verwendung von GLXA imitierenden monoklonalen GLXA-Ab₂ zur Identifizierung seiner Rolle wäre zum Verständnis des Mechanismus des Antiidiotyp-Schutzes wertvoll. Das Experiment wird menschlichen epidermoiden Karzinomzellen (A431) ebenso wie mit HEGEC (human endometrial gland epithelial cells) durchgeführt. Diese Zelllinien wurden aufgrund ihres menschlichen Ursprungs verwendet. Ein Bindungsvorversuch wurde mit Durchflußzytometrie mit durch FACScan (Becton Dicknson, N.J.) nachgewiesener direkter Antikörperanfärbung durchgeführt. Da die Trennung dieser Epithelzellen in eine Einzelzellsuspension ohne die Verwendung von Enzym oder rauer Trennung schwierig ist, vor allem bei HEGEC-Zellen, besteht die Zellpopulation aus Einzel-, Doppel- und Mehrfachzellen. Die Einzelzell population wurde direkt über den Zelltrümmern abgegriffen. Da die Kontrolle, nämlich Zellen mit normalem Maus-IgG, an genau der gleichen Öffnung (gate) vorlagen, wird angenommen, dass die zwei Gruppen vergleichbar sind. Darüber hinaus ist die Bindung direkt, und monoklonaler GLXA-Ab₂ bzw. normales Maus-IgG wurden direkt mit Biotin markiert. Die Intensität von spezifisch an die Wirtszellen (MEGEC) gebundenem monoklonalem GLXA-Ab₂ steigt mit steigender Antikörperkonzentration an. Normales Maus-IgG weist selbst bei der höchsten Konzentration keine solche Bindung auf. Könnte dieses Ergebnis wiederholt werden und sich als gültig erweisen, so handelt es sich bei GLXA um ein Adhäsin oder einen Liganden, der an HEGEC-Zellen bindet. Es gibt einige Gründe dafür, anzunehmen, dass es sich bei GLXA um ein Adhäsin oder einen Liganden handelt. Erstens, wie oben erwähnt, findet die GLXA-Ab₃-Neutralisierung im sehr frühen Stadium statt. Dies wird dadurch bestätigt, dass man anscheinend keine signifikante Chlamydien-spezifische ribosomale RNA in mit mit GLXA-Ab₃ behandelten EBs inokulierten Primaten entnommenen Bindehautproben findet. Dies ließ darauf schließen, dass GLXA-Ab₃ das Eindringen von EBs in den Wirt blockiert. Zweitens stellte sich heraus, dass GLXA die Infektion bei einer Vorinkubation von McCoy-Zellen mit GLXA um ungefähr das Dreifache verstärkt. Dieses Ergebnis kann nur dann eintreten, falls es sich bei GLXA um ein Adhäsin oder einen Liganden handelt, der die Anbindung von EBs an Wirtszellen erleichtert. Tatsächlich ist es gut möglich, dass EBs diesen Mechanismus zur Infektion von Wirtszellen benutzen, da GLXA aus infizierten Zellen sezeniert wird.
Ein möglicher Mechanismus der Rolle von GLXA kann wie folgt aussehen: EBs binden an die Wirtszellen entweder über GLXA auf EBs oder über freies GLXA, das von den infizierten Zellen in die Umgebung sezerniert wurde. Dies macht die Absorption von umgebenden Zellen an GLXA wesentlich leichter und effizienter. EBs können dann an die Wirtszellen entweder über GLXA auf EBs andocken und somit an die Wirtszellen binden. Dieser Mechanismus scheint wesentlich effizienter als eine 1-zu-1-Anbindung zu sein.
Neutralisierung einer Chlamydien-Infektion durch GLXA-Ab₃
Der in-vitro-Vortest zur Neutralisierung zeigte, dass bei mit GLXA-Ab₁ behandelten EBs des C. trachomatis-Serovars B mehr Chlamydieneinschlüsse gefunden wurden als bei mit Kaninchen-Ab₃ behandelten EBs des gleichen Serovars. Dies zeigte, dass GLXA-Ab₃ die Infektion neutralisierte, wohingegen dies mit monoklonalem GLXA-Ab₁ nicht der Fall war. GLXA-Ab₃ neutralisierte die Infektion in der Zellkultur, wohingegen dies bei monoklonalem GLXA-Ab₁ nicht der Fall war. Dieses in-vitro-Ergebnis wurde in vivo in zwei späteren Experimenten mit dem Primateninfektionsmodell wiederholt. Dabei wurde bestätigt, dass GLXA-Ab₃ eine Chlamydia-Infektion sowohl in vitro als auch in vivo wirksam neutralisiert.
Das Verständnis des Mechanismus dieser Neutralisierung stammt aus dem Hybridisierungsexperiment mit Chlamydiaspezifischer RNA. Dabei wurden die Primaten am Auge mit mit GLXA-Ab₃ oder normalem Kaninchen-IgG behandelten EBs inokuliert. Chlamydien-RNA wurde in den Primaten an unterschiedlichen Tagen vor und nach der Inokulation entnommenen Bindehautabstrichen nachgewiesen. Der bei dieser Untersuchung verwendete RNA-Hybridisierungstest ist ein äußerst empfindlicher Weg zum Nachweis einer Chlamydien-Infektion in Proben, die in der Zellkultur oder/und im DFA eindeutig negativ sind. Die in mit Ab₃ behandelten Primaten gefundene, im Wesentlichen geringe RNA erbringt den Beweis dafür, dass die Neutralisierung in einem sehr frühen Stadium der Infektion, vor der Internalisierung der Organismen, erfolgt. Dies lässt darauf schließen, dass es sich bei GLXA um ein Adhäsin bzw. einen Liganden handelt, das bzw. der in diesem Stadium der Anbindung eine Funktion ausübt.
Die Rolle der humoralen Immunität beim Schutz gegen eine Chlamydien-Infektion war lange Zeit zwiespältig. Es konnte jedoch sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt werden, dass die humorale Immunität eine gewisse Rolle bei der Verhinderung einer Chlamydien-Infektion spielen dürfte.
Schutz von Mäusen vor einer Chlamydien-Infektion durch Immunisierung mit monoklonalem GLXA-Ab₂
Das Chlamydien-Augeninfektionsmodell in der BALB/cByJ-Maus wurde in einer Impfstoffuntersuchung mit monoklonalem antiidiotypischen Antikörper, dem monoklonalen GLXA-IgG, eingesetzt. Dabei handelt es sich um ein Modell für C. trachomatis-Serovare, die nur Menschen infizieren. In den Immunisierungsexperimenten wurde monoklonales (GLXA-Ab₂)-IgG (50 μg/Maus) zur subkutanen Immunisierung von 6 bis 20 Mäusen in jeder Gruppe entweder in Gegenwart von Adjuvanz oder ohne Adjuvanz verwendet. Mit monoklonalem GLXA-Ab₂ immunisierte Mäuse erbringen einen deutlichen GLXA-Ab₃-Titer, der eine Woche nach einer Einzelimmunisierung nachweisbar ist. Das in dieser Untersuchung verwendete System ist synergen: monoklonaler GLXA-Ab₁, monoklonaler GLXA-Ab₂ bzw. monoklonaler GLXA-Ab₃ werden jeweils im gleichen Mausstamm produziert. Sie tragen genetisch die gleichen Immunglobuline. Die einzige "Fremdstruktur" ist die spezifische Bindungsstelle eines jeden Typs Antikörpers (monoklonaler GLXA-Ab₁ oder monoklonaler GLXA-Ab₂). Normales Maus-IgG aus dem gleichen Stamm wurde als Negativkontrolle verwendet. Mit monoklonalem GLXA-Ab₂ immunisierte Mäuse entwickelten durchgehend einen signifikant hohen GLXA-Ab₃-Titer gegen gereinigtes GLXA im Vergleich mit der Kontrollgruppe. Der Durchschnittstiter betrug bis zu 1:3200, verglichen mit 1:200 in den mit normalem Maus-IgG immunisierten Mäusen. Dies zeigt eindeutig, dass die Produktion von GLXA-Ab₃-Antikörper in synergenen Mäusen durch den hypervariablen Bereich, der Struktur, die das GLXA imitiert, ausgelöst wird. Darüber hinaus wurde von dem GLXA-Ab₃ aus diesem Mäusen die Bindung von monoklonalem GLXA-Ab₁ an GLXA ebenso wirksam wie von nichtmarkiertem monoklonalem GLXA-Ab₁ gehemmt. Diese Experimente zeigen, dass monoklonaler GLXA-Ab₂ ein einziges Epitop von GLXA imitiert.
Der Schutz von Mäusen vor einer Augeninfektion durch C. trachomatis wurde durchgehend in vier individuellen Experimenten in vivo demonstriert. Die mit monoklonalem GLXA-Ab₂ bzw. normalem Maus-IgG immunisierten Mäuse (dreimal auf wöchentlicher Basis) wurden in den Augen durch Inokulation von EBs (5000 IFU/Auge) infiziert. Die Bindehautabstriche wurden an unterschiedlichen Tagen vor und nach der Infektion entnommen. Die Einschlüsse wurden mittels Zellkultur nachgewiesen. Die Augen der mit monoklonalem GLXA-Ab₂-IgG immunisierten Mäuse weisen eine deutlich kurze Erholung auf (9 Tage nach der Okularen Inokulation, verglichen mit 28 Tagen der mit normalem Maus-IgG immunisierten Kontrolle). Der GLXA-Ab₃-Titer korreliert gut mit den Zellkulturergebnissen. Dies zeigt, dass der ein einziges GLXA-Epitop imitierende monoklonale GLXA-Ab₂ ein wirksames Immunogen darstellt, das eine starke schützende Immunantwort gegen eine Chlamydien-Infektion hervorruft. Dies zeigt, dass ein einziges Schutzepitop auf dem Chlamydien-GLXA liegt.
Vorschau auf den Neutralisierungs- und Schutzmechanismus
Bei diesem Beispiel handelt es sich um die erste Demonstration davon, dass ein nichtneutralisierender monoklonaler GLXA-Ab₁ einen neutralisierenden GLXA-Ab₃ in vivo über einen antiidiotypischen Antikörper (GLXA-Ab₂) produzieren kann. Der zentrale Punkt hier ist, dass durch Immunisierung mit Chlamydien-EBs produzierter monoklonaler GLXR-Ab₁ nicht neutralisiert oder Primaten vor einer Neuinfektion schützt, während von Meerschweinchen-GLXA-Ab₂ produzierter GLXA-Ab₃ die Infektion neutralisierte und die Immunisierung mit monoklonalem GLXA-Ab₂ Mäuse vor einer Neuinfektion schützt.

Claims

Impfstoff, der einen monoklonalen antiidiotypischen Antikörper umfasst, zum Induzieren eines anti-antiidiotypischen Antikörpers, der ein Antigen erkennt, das ein gattungsspezifisches Chlamydien-Glycolipid-Exoantigen (GLXA) umfasst, bei einem Tier, wobei der antiidiotypische Antikörper ein IgG1-Antikörper ist.
Kontinuierliche Hybridzelllinie, die den monoklonalen antiidiotypischen Antikörper von Anspruch 1 produziert.
Kontinuierliche Hybridzelllinie ATCC Zugriffs-Nr. H.B. 11301.
Monoklonaler Antikörper, der durch die Zelllinie gemäß Anspruch 3 erhältlich ist.
Zelllinie gemäß Anspruch 2, wobei die Zelllinie ein Hybrid einer Immunmilzzelle ist, die einen antiidiotypischen Antikörper produziert, der bei einem Tier einen antiantiidiotypischen Antikörper induziert, der ein Antigen erkennt, das ein gattungsspezifisches Chlamydien-Glycolipid-Exoantigen (GLXA) umfasst.
Impfstoff, der einen antiidiotypischen Antikörper umfasst, der von der kontinuierlichen Zelllinie ATCC Zugriffs-Nr. H.B. 11301 produziert wurde.
Impfstoff gemäß Anspruch 6, der weiterhin Aluminiumhydroxid als Adjuvans umfasst.
Impfstoff gemäß einem der Ansprüche 6 bis 7 zur Verwendung bei einem Menschen.
Biologisch aktive Zusammensetzung zum Immunisieren eines Säugers gegen Infektion durch Chlamydien, wobei die Zusammensetzung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht: (i) einem monoklonalen antiidiotypischen Antikörper, der bei dem Säuger einen anti-antiidiotypischen Antikörper induziert, der ein Antigen erkennt, das ein gattungsspezifisches Chlamydien-Glycolipid-Antigen (GLXA) umfasst, wobei der antiidiotypische Antikörper ein IgG1-Antikörper ist; (ii) einem Fab-Fragment eines monoklonalen antiidiotypischen Antikörpers, der bei dem Säuger einen anti-antiidiotypischen Antikörper induziert, der ein Antigen erkennt, das ein gattungsspezifisches Chlamydien-GLXA umfasst; und (iii) Gemischen von (i) und (ii).
Biologisch aktive Zusammensetzung gemäß Anspruch 9, die weiterhin ein pharmazeutisch annehmbares Adjuvans umfasst.
Verwendung einer biologisch aktiven Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zum Immunisieren eines Säugers gegen Infektion durch Chlamydien, wobei die Zusammensetzung aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Folgenden besteht: (i) einem monoklonalen antiidiotypischen Antikörper, der bei dem Säuger einen anti-antiidiotypischen Antikörper induziert, der ein Antigen erkennt, das ein gattungsspezifisches Chlamydien-Glycolipid-Antigen (GLXA) umfasst, wobei der antiidiotypische Antikörper ein IgG1-Antikörper ist; (ii) einem Fab-Fragment eines monoklonalen antiidiotypischen Antikörpers, der bei dem Säuger einen anti-antiidiotypischen Antikörper induziert, der ein Antigen erkennt, das ein gattungsspezifisches Chlamydien-GLXA umfasst; und (iii) Gemischen von (i) und (ii).
Zusammensetzung gemäß Anspruch 10 oder Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei der antiidiotypische Antikörper von der kontinuierlichen Zelllinie ATCC Zugriffs-Nr. H.B. 11301 produziert wurde.
Zusammensetzung gemäß Anspruch 10 oder Verwendung gemäß Anspruch 11, wobei der Säuger ein Mensch ist.