CH677796A5 - - Google Patents

Description

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Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft monoklonale Antikörper, die fähig sind Pseudomonas aeruginosa flagella zu erkennen und die nützlich sind für die Diagnose und Behandlung bakterieller Infektionen. Die Erfindung betrifft auch Anwendung von solchen monokonalen Antikörpern.

Gram-negative Krankheiten und ihre schwersten Komplikationen, z.B. Bakterämie und Endotoxämie, sind die Ursachen signifikanter Morbidität und Mortalität beim Menschen. Insbesondere trifft dies zu für den gram-negativen Organismus Pseudomonas aeruginosa, der in den letzten 50 Jahren vermehrt mit bakteriellen Infektionen, speziell Nosocomial-Infektionen, in Zuammenhang gebracht wurden.

Während der letzten Dekaden waren Antibiotika das Therapeutikum der Wahl, um gram-negative Krankheiten zu bekämpfen. Die immer noch hohe Morbidität und hohe Mortalität, die bei gram-negativen bakteriellen Krankheiten beobachtet werden, zeigen jedoch die Grenzen der antibiotischen Therapie insbesondere mit Bezug auf P. aeruginosa (siehe z.B. Andriole, V.G., «Pseudomonas Bacteremia: Can An-tibiotic Therapy Improve Survival?», J. Lab. Clin. Med. (1978) 94:196-199). Dies veranlasste die Suche nach alternativen Methoden der Vorbeugung und der Behandlung.

Eine Methode, die in Betracht gezogen wurde, war die Verstärkung des Immunsystems des Wirtes durch aktive oder passive Immunisierung. So wurde zum Beispiel beobachtet, dass aktive Immunisierung von Menschen oder Versuchstieren mit Ganzzellenbakterien-Vaccinen oder mit gereinigten bakteriellen Endotoxinen von P. aeruginosa zur Entwicklung spezifischer opsonierter Antikörper führt, die primär gegen die Determinanten auf den sich wiederholenden Oligosaccharid-Einheiten der Lipopoly-saccharid (LPS)-Moleküie gerichtet sind, die sich auf der äusseren Zellmembrane von P. aeruginosa befinden (siehe Pollack, M., Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Intravenous Préparations, Aiving, B.M., and Finlayson, J.S., Herausgeber, Seiten 73-79, U.S. Department of Health and Human Services, 1979). Es konnte gezeigt werden, dass solche Antikörper, ob nun aktiv erzeugt oder passiv übertragen, in verschiedenen Tiermodellen Schutz vor den lethalen Effekten einer P. aeruoinosa-lnfek-tion bieten (Pollack, supra). In die selbe Richtung zeigen einige vorläufige Versuche mit Menschen (siehe Young, LS. and Poltack, M., Pseudomonas aeruginosa. Sabath, L, Herausgeber, Seiten 119-132, Hans Huber, 1980).

Diese Berichte legen nahe, dass ein immunotherapeutisches Vorgehen verwendet werden könnte, um bakterielle Erkrankungen wegen P. aeruginosa zu verhindern und zu behandeln. Ein solches Vorgehen wäre beispielsweise das Verabreichen gesammelter Human-Immunogiobuline, die Antikörper gegen den infizierenden Stamm enthalten. Human-Immunoglobuline werden hier definiert als die Portion des fraktionierten Human-Plasmas, welche an Antikörpern angereichert ist. Darunter sind auch spezifische Antikörper gegen Stämme von P. aeruginosa vertreten. Wegen gewisser înherenter Grenzen beim Gebrauch von Human-lmmunoglobulin-Komponenten ist dieses Vorgehen zur Behanldung von durch R aeruginosa verursachten Krankheiten immer noch in Untersuchung (siehe z.B. Collins, M.S. and Roby, R.E., Am. J. Med., 76:(3A): 168-174), (1984)) und vorderhand sind keine kommerziellen Produkte vorhanden» die diese Komponenten verwenden.

Eine der Grenzen bei der Verwendung von Immunoglobulin-Zusammensetzungen beruht darauf, dass solche Zusammensetzung aus den gesammelten Proben von Tausend oder mehr Spendern bestehen, wobei die Proben nach dem Vorhandensein eines bestimmten Anti-Pseudomonas-Antikörpers ausgewählt wurden. Durch dieses Sammeln werden die individuellen Antikörper-Titer gemittelt; dies führt im besten Falle zu einer bescheidenen Erhöhung des resultierenden Titers am gewünschten Antikörper.

Eine weitere Grenze ist, dass der Auswahlprozess selber eine teure und ständige Überwachung des Spender-Pools bedingt, um ein einheitliches Produkt zu garantieren. Trotz diesen Anstrengungen können Immunoglobulin-Produkte beträchtliche Unterschiede von Serie zu Serie und Produkte verschiedener geographischer Herkunft aufweisen.

Noch eine andere Grenze, die Immunoglobulin-Zusammensetzungen innewohnt ist, dass ihre Anwendung die gleichzeitige Verabreichung grosser Mengen fremder, proteinhaltiger Substanzen (so auch Viren, wie jene die mit AIDS in Zusammenhang gebracht wurden) bedingt, die schädliche biologische Effekte verursachen können. Die Kombination von niederem Titer an gewünschten Antikörpern und hohem Gehalt an fremden Substanzen begrenzen, oft auf suboptimale Niveaus, die Menge an spezifischen und daher nützlichen Immunoglobulinen, die einem Patienten verabreicht werden können.

Im Jahr 1975 berichteten Köhler und Milstein über ihre grundlegende Entdeckung, das gewisse Mäu-sezellinien mit Milzzellen von Mäusen verschmolzen werden können, um Hybridomas zu erzeugen. Diese Hybridomas sind in der Lage, Antikörper einer einzigen Spezifizität auszuscheiden, d.h. monoklonale Antikörper (Köhler, G., und Milstein, C., Nature, 256: 495-497 (1975)). Mit dem Aufkommen dieser Technologie wurde es in einigen Fällen möglich, grossen Mengen von ausgezeichnet spezifischen Murin-Antikörpern gegen eine bestimmte Determinante oder gegen Determinanten auf Antigenen herzustellen. In der Folge, unter Verwendung später entwickelter Technologien, wurde es möglich, monoklonale Human-Antikörperzu produzieren (siehe z.B. U.S. Patent Nr. 4464465).

Bekanntlich ist in gewissen Fällen der Gebrauch monoklonaler Maus-Antikörper oder Zusammensetzung mit solchen Antikörpern beim Menschen problematisch. So wurde beispielsweise berichtet, dass monoklonale Mausantikörpern, die in Versuchsstudien zur Behandlung gewisser Human-Krankheiten

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eingesetzt wurden, eine Immunantwort hervorriefen, die sie nutzlos machte (Levy, R.L. und Miller, R.A., Ann, Rev. Med., 34: 107-116 (1983)), Dank neuerer Fortschritte in der Rekombinant-DNA-Technologie, z.B. die Herstellung chimärer, monoklonaler Maus-Human-Antikörper, konnten diese Schwierigkeiten verringert werden. Des weiteren sind heute Methoden für die Produktion von monoklonalen Human-An-tikörpern verfügbar (siehe Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman, E.G., et al., Herausgeber, Plenum Publishing Corp. (1985)).

Mehrere Gruppen berichteten über die Produktion von monoklonalen Antikörpern, die gegen P. aeru-ainosa-lnfektionen schützen und die mittels Hybridomas- und/oder Zelltransformationstechnologien erhalten wurden. Es wurden auch monoklonale Antikörper hergesteilt, die mit verschiedenen Epitopen von P. aeruginosa reagieren. Inbegriffen sind dabei Einfach- und Multi-Serotypen-spezifische Oberflä-chenepitope, wie solche, die in LPS-Molekülen von Bakterien gefunden werden (siehe z.B. die hängigen U.S. Patentanmeldungen Nrn. 734 624 und 807 394). Ferner wurden schützende Antikörper hergestellt, die spezifisch sind für Exotoxin A von P. aeruginosa (siehe z.B. die hängige U.S. Patentanmeldung Nr. 742 170),

Obwohl die Verwendung monoklonaler Antikörper, die spezifisch sind für die LPS-Region oder für die Exotoxine von P. aeruginosa in einigen Fällen genügenden Schutz bieten kann, so ist es doch wünschenswert, breitere Schutzmöglichkeiten zu haben. Beispielsweise bei prophylaktischer Behandlung gegen potentielle Infektionen bei Menschen, wäre die Verabreichung eines oder mehrerer Antikörper, die gegen eine Mehrzahl von P. aeruoinosa-Stämme schützen, wünschenswert. Analog wäre in der Therapie bei jenen Fällen, in denen der Serotyp, bzw. die Serotypen des infizierenden Stammes unbekannt sind, die Verabreichung eines Antikörpers oder einer Kombination von Antikörpern wünschenswert, der bzw. die gegen die meisten, wenn nicht alle der klinisch wichtigten P. aeruginosa-Serotvoen effektiv sind. Dazu müssten idealerweise Antikörper zur Verfügung gestellt werden, die quer über die traditionellen Serotypen-Schemen reaktiv sind.

Ein Aspekt der P. aeruoinosa-Phvsioiooie. der erwiesenermassen zur Virulenz des Mikroorganismus beiträgt, ist dessen Motilität. Diese resultiert primär aus dem Vorhandensein eines Geisselfadens (siehe Montie, T., et al., (1982), Infect, and Immun., 38:1296-1298). P. aeruginosa ist gekennzeichnet durch einen einzelnen Geisselfaden an einem Ende von dessen stabförmiger Struktur. Studien an gebrannten Mäusen haben gezeigt, dass ein höherer prozentualer Anteil von Mäusen überlebte, wenn nicht molile P. aeruoinosa-Stämme in die experimentellen Brandwunden geimpft wurden, als wenn motile Stämme verwendet wurden (McManus, A., et al., (1980), Bums, 6:235-239 and Montie, T., et ai., (1982), Infect, and Immun., 38:1296-1298). In weiteren Studien über die Pathogenese von P. aeruginosa wurde behauptet, dass Tiere, die mit flagella-Antigen-Präparaten immunisiert worden waren, geschützt waren, wenn sie gebrannt und mit motilen Stämmen der Bakterien infiziert wurden (siehe Holder, I., et ai., 1982, Infect, and Immun., 35:276-280).

Von Bedeutung ist, dass gemäss Untersuchungen nach serologischen Methoden P. aeruginosa in zwei grössere antigene Gruppen eingeteilt werden kann. Diese Gruppen wurden von B. Lanyi mit H1 und H2 bezeichnet (1970, Acta Microlbiol. Acad. Sei. Hung., 17:35-48) und von Ansorg, R.mit Typ a und Typ b (1978, Zbl, Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A, 242: 228-238). Serologische Typisierung der flagella durch beide Laboratorien zeigten, dass H1 -flagella (Lanyi, B., supra) oder flagella-Typ b (Ansorg, R., supra) serologisch einheitlich waren, d.h. keine Untergruppen wurden identifiziert. Dieser serologisch einheitlich flagellare Typus wird im weiteren als Typ b bezeichnet. Das andere grössere Antigen, H2 (Lanyi, B., supra) oder Typus a-flagella (Ansorg, R., supra) enthielt fünf Untergruppen. Dieses Antigen wird im weiteren als flagella-Typus a und die fünf Untergruppen als ao, ai, az, a3 und a4 bezeichnet werden. Die fünf Untergruppen des Typs a werden in unterschiedlichen Kombinationen auf den verschiedenen Stämmen der Typ a-enthaltenden P. aeruoinosa-Stämmen ausgedrückt, mit Ausnahme des Antigens ao. Das ao-Antigen wurde auf allen flagella-Typen gefunden, obwohl das Ausmass, in dem es ausgedrückt ist, zwischen den Stämmen variiert.

Ein Serotypisierungsschema, das auf den wärmestabilen, bedeutenderen somatischen Antigenen von P. aeruginosa beruht, wird als Habs-Schema bezeichnet. Es wurde kürzlich in das Schema des International Antigenic Typing System aufgenommen (siehe, Liu, Int. J. Syst. Bacteriol., 33: 256 ( 1983 )). Die R. aeruoinosa-flaoella-Typen der Habs-Referenzstämme wurden alle mitteis Immunofluoreszens mit poly-klonalen Seren (Ansorg, R., 1978 , Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A, 242:228-238) oder durch Koagglu-tinationsausstrich (Ansorg, R., et al., 1984, J. Clin. Microbiol., 20: 84-88) charakterisiert. Die Habs-Stämme 2,3,4,5,7,10,11 und 12 sind flagella-Typ b-aufweisende Stämme, während die Habs-Stämme 1, 6, 8 und 9 flagella-Typ a-aufweisende Stämme sind. So lassen sich möglicherweise eine grosse Zahl von P. aeruoinosa-Stämme mit einer kleinen Zahl monoklonaler Antikörper, die spezifisch sind für flagellare Proteine, nachweisen.

Demzufolge besteht ein bedeutendes Bedürfnis nach monoklonalen Antikörpern, die in der Lage sind, mit Epitopen von flagellaren Proteinen zu reagieren und die in einigen Fällen Schutz gegen eine Mehrzahl von P. aeruoinosa-Serotvpen verleihen können. Ferner sollten einige dieser Antikörper verwendbar sein bei der Prophylaxe und Therapie von P. aeruoinosa-infektionen sowie für die Diagnose solcher Infektionen. Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis.

Gegenstände der vorliegenden Erfindung sind die monoklonalen Antikörper, Zellinien, welche die Antikörper ausscheiden, pharmazeutische Zusammensetzungen, ein Nachweisverfahren, welches die Anti3

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körper verwendet und ein Reagentiensatz gemäss den Definitionen in den Ansprüchen 1,10,14,20 bzw. 21.

Es werden neue Zeilinien zur Verfügung gestellt, die monoklonale Antikörper produzieren können, welche fähig sind, sich an die Geisseifäden zu binden, die auf den meisten Stämmen von P. aeruainosa-Bakterien vorhanden sind. Die monoklonalen Antikörper reagieren in spezifischer Weise mit den Epitopen auf den Geisselfäden-Proteinen von P. aeruginosa und können zwischen Typ a- und Typ b-Geissel-fäden der Bakterien unterscheiden. Zusätzlich wird ein Verfahren zur Behandlung von Menschen, die gegen eine Infektion mit P. aeruginosa anfällig oder bereits damit infiziert sind, zur Verfügung gestellt. Das Verfahren beruht auf der Verabreichung einer prophylaktischen oder therapeutischen Menge einer Zusammensetzung, welche mindestens einen monoklonalen Antikörper oder ein bindendes Fragment davon enthält, der bzw. die fähig sind, mit den Geisseifäden der P. aeruginosa-Stämme zu reagieren. Die Zusammensetzung enthält vorzugsweise einen physiologisch annehmbaren Träger. Die Zusammensetzung kann ebenfalls eins oder mehrere der folgenden Elemente enthalten: zusätzliche monoklonale Antikörper, die fähig sind, mit P. aeruoinos-Exotoxin A zu reagieren; monoklonale Antikörper, die fähig sind, mit Serotyp-Determinanten auf LPS von P. aeruginosa zu reagieren; eine Gammaglobulin-Fraktion aus menschlichem Blutplasma; eine Gammaglobulin-Fraktion aus menschlichem Blutplasma, wobei das Plasma von Menschen, die erhöhte Niveaus an Immunoglobulinen, die mit P. aeruginosa reagieren, stammen kann; sowie einen oder mehrere antimikrobielle Agenzien. Ferner werden klinische Anwendungen der monoklonalen Antikörper zur Verfügung gestellt, inklusive die Herstellung diagnostischer «Kits».

Wie bereits erwähnt, stellt die vorliegende Erfindung neue Zellen zur Verfügung, die fähig sind, monoklonale Antikörper zu produzieren sowie Zusammensetzungen, welche diese Antikörper enthalten. Diese Zusammensetzungen können selektiv die flagella, welche auf einer Mehrzahl von P. aeruoinosa-Stämmen vorhanden sind, erkennen, wobei individuelle Antikörper in typischer Weise ein Typ von P. aeruginosa flagella erkennen. Die obengenannten Zellen haben identifizierbare Chromosomen, in welchen deren Keim-Linien DNA oder die einer Vorläuferzelle umgelagert ist, um für einen Antikörper zu codieren, der eine Bindungstelle aufweist für ein Epitop auf einen der Flagellar-Proteine, die auf einigen P. aeruoinosa-Stämmen vorkommen. Für Typ a-Flagellar-Proteine können pan-reaktive, monoklonale Antikörper hergestellt werden; und für Typ b-Flagellar-Proteine sind Antikörper umfasst, die entweder pan-reaktiv sind oder mit mindestens etwa 70% der flagella-tragenden Stämme reagieren. Diese monoklonalen Antikörper können in vielseitiger Weise verwendet werden, inbegriffen Diagnose und Therapie.

Die auf diese Art und Weise zur Verfügung gestellten monoklonalen Antikörper sind insbesondere nützlich in der Behandlung oder Prophylaxe ernster Krankheiten, die durch P. aeruginosa verursacht werden. Die Oberflächenproteine auf der flagella von P. aeruginosa sollten verfügbar sein für direkten Kontakt mit den Antikörper-Molekülen. Dadurch wird wahrscheinlich die Motilität des Organismus inhibiert und/oder andere für den Wirt günstige Effekte ermöglicht.

Die Herstellung monoklonaler Antikörper kann erreicht werden durch lmmortalisieren einer Zellinie, die fähig ist, Nukleinsäuresequenzen zur Expression zu bringen, die für Antikörper, die spezifisch für ein Epitop auf den Flagellar-Proteinen verschiedenen Stämmen von P. aeruginosa sind codieren. Immor-talisierte Zeilinien können Säugetier-Zellinien sein, die durch Oncogenese, Transfektionsmutation oder ähnliches transformiert wurden. Solche Zellen umfassen Myeloma-Linien, Lymphoma-Linien oder andere Zeilinien die die in vitro-Expression und Sekretion von Immunoglobulin oder eines bindenden Fragmentes davon aushalten. Das Immunoglobulin oder dessen Fragment kann ein natürlich vorkommendes Immunoglobulin sein, das von einer anderen als der bevorzugten Maus- bzw. Menschquelle stammt. Es kann hergestellt werden durch Transformation eines Lymphocyten, insbesondere eines Splenocyten, mittels eines Virus oder durch Fusion des Lymphocyten mit einer neoplastischen Zelle, z.B. einer Myeloma-Zel-le, um eine hybride Zellinie zu produzieren. Der Splenocyt wird üblicherweise aus einem Tier erhalten, das gegen flagellare Antigene oder deren Fragmente, wie einen Epitop enthalten, immunisiert worden ist. Immunisierungsprotokolle sind gut bekannt und können beträchtlich voneinander abweichen, sie bleiben jedoch wirksam (siehe Golding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, N.Y. (1983)).

Die hybriden Zeilinien können geklont und einem Screening unterzogen werden, in Übereinstimmung mit konventionellen Techniken, wobei Antikörper, die an P. aeruginosa flagellare Determinanten binden können, in der überstehenden Zellflüssigkeit nachgewiesen werden. Die geeignete hybride Zellinie kann dann grossmassstäblich gezüchtet werden oder in die Bauchfellhöhle eines geeigneten Wirtes injiziert werden, um Ascltes-Flüssigkeit zu produzieren.

In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Zellentransformierte Human-Lym-phocyten, die vorzugsweise in vivo schützende, monoklonale Human-Antikörper für zugängliche Epito-pe produzieren, die spezifisch sind für mindestens ein Flagellar-Protein. Die Lymphocyten können von Menschen erhalten werden, die gegen geeignete flagellatragende Stämme von P. aeruginosa exponiert waren oder sind. Ein bevorzugter zellgetriebener Transformationsvorgang ist im Detail in der U.S. Patentschrift Nr. 4 464 465 beschrieben.

Mit den Antikörpern gemäss der vorliegenden Erfindung, von denen bekannt ist, dass sie spezifisch sind für Flagellar-Proteine, kann in einigen Fällen der Überstand aus späten Experimenten einem Screening unterworfen werden. Dabei werden in einem Wettbewerbsversuch die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper als Mittel zur Identifikation zusätzlicher Vertreter von anti-flagellaren mono-

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klonalen Antikörpern verwendet Auf diese Weise können hybride Zeilinien leicht aus unterschiedlichen Quellen hergestellt werden. Das Verfahren beruht lediglich auf dem Vorhandensein der erfindungsge-mässen Antikörper, die spezifisch sind für bestimmte Flagellar-Proteine.

Alternativ, wenn hybride Zeilinien vorhanden sind, die Antikörper mit Spezifität für die entsprechenden Epitope produzieren, können diese hybriden Zeilinien mit anderen neoplastischen B-Zellen verschmolzen werden. Diese B-Zellen dienen dabei als Empfänger für Genom-DNA, die für die Rezeptoren codieren. Meistens werden neoplastische B-Zellen, insbesondere von Mäusen verwendet, es können aber auch solche von anderen Säugetieren Verwendung finden, wie lagomorphe, bovine, ovine, equine, porcine, aviane oder dergleichen.

Die monoklonalen Antikörper können irgendeiner der Klassen oder Unterklassen der Immunoglobuline entstammen. Beispielsweise IgM, IgD, IgA, IgE oder Unterklassen von IgG, die für jede Tierspezies bekannt sind. Die monoklonalen Antikörper werden vorzugsweise intakt eingesetzt, es können aber auch bindende Fragmente, wie Fv, Fab, F(ab')2 verwendet werden.

Die Zeilinien der vorliegenden Erfindung können auch eine andere Verwendung als die direkte Produktion von monoklonalen Antikörpern finden. Sie können mit anderen Zellen fusioniert werden (beispielsweise auf geeignete Weise drogen-markierte Human-Myeloma, Mäuse-Myeloma oder Hurnan-Lymphoblastold-Zellen) um Hybridomas zu produzieren, und so die Gene übertragen, die für monoklonale Antikörper codieren. Des weiteren können die Zeilinien als Quelle für Chromosomen, die für Immunoglobuline codieren, dienen. Diese können isoliert und in Zellen transferiert werden durch andere Techniken, als die Verschmelzung. Zusätzlich können die Gene, die für monoklonale Antikörper codieren, isoliert werden und in Einklang mit Rekombinant-DNA-Techniken für die Herstellung spezifischer Immunoglobuline in einer Vielzahl von Wirten verwendet werden. Insbesondere kann, durch Vorbereiten von cDNA-Bibliotheken, ausgehend von Boten-RNA, ein einzelner cDNA-Klon isoliert werden, der dann in geeigneten prokaryotischen oder eukaryotischen Expressionsvektoren eingesetzt und nachfolgend in einen Wirt transformiert werden kann für die Massenproduktion (siehe generell, U.S. Patent Nr. 4 172 124; 4 350 683; 4 363 799; 4 381 292; und 4 423 147. Siehe auch Kennett, et al., Monoclonal Antibodies, Plenum, New York (1980) und den Referenzen, die darin zitiert sind).

Gemäss der vorliegenden Beschreibung können, in Übereinstimmung mit Hybrid-DNA-Technologien ganz spezifisch Immunoglobuline oder Fragmente davon in Bakterien oder Hefen hergestellt werden (siehe Boss, et al., Nucl, Acid. Res., 12:3791 und Wood, et al., Nature, 314:446). Zum Beispiel kann die Boten-RNA, die von Genen transkribiert wurde, welche für die leichten und schweren Ketten der mit einer erfindungsgemässen Zellinie hergestellten monoklonalen Antikörper codieren, isoliert werden mittels differenzieiler cDNA-Hybridisierung unter Verwendung von cDNA von anderen BALB/c-Lymphocyten als der erfindungsgemässe Klon. Die mRNA, die nicht hybridisiert, wird an Botschaften angereichert sein, die für die gewünschten Immunoglobulin-Ketten codieren. Falls notwendig, kann dieser Vorgang wiederholt werden, um die gewünschten mRNA-Niveaus weiter zu erhöhen. Die abgezogene mRNA-Zu-sammensetzung kann dann revers-transkribiert werden, um ein an gewünschten Sequenzen angereichertes cDNA-Gemisch zu liefern. Die RNA kann mit einer geeigneten RNAase hybridisiert werden und die ssDNA doppelstrangig gemacht werden mit DNA-Polymerase 1 und mit Wahllos-Sensibilisierern (Random-Primers), z.B. wahllos fragmentierte Kalbsthymus-DNA. Die resultierende dsDNA kann durch Infektion in einen geeigneten Vektor Moniert werden, beispielsweise Virus-Vektoren, wie Lambda-Vek-toren oder Plasmid-Vektoren (z.B. pBR322, pACYC184 usw.). Durch Entwickeln von Proben auf der Grundlage von bekannten Sequenzen für die konstanten Abschnitte der leichten und schweren Ketten können jene cDNA-KIone mit Genen, die für die gewünschten leichten und schweren Ketten codieren durch Hybridisierung identifiziert werden. Danach können die Gene aus den Plasmiden herausgeschnitten werden, zur Entfernung überflüssiger DNA-stromaufwärts des Starter-Codons oder des konstanten DNA-Abschnittes behandelt und dann in einen geeigneten Vektor eingeschleust werden zur Transformation eines Wirtes und schliesslicher Expression der Gene.

Vorteilhaft werden Säugerzellen (z.B. Mauszellen) als Wirte für den Aufbau der Kette (d.h. die leichten und die schweren Ketten verknüpfen) verwendet, um ein intaktes Immunoglobulin zu produzieren und um ferner das Immunoglobulin, falls erwünscht, frei von der Leader-Sequenz auszuscheiden. Alternativ können unicellulare Mikroorganismen für die Herstellung der zwei Keüen verwendet werden. Danach können weitere Manipulationen notwendig sein, um die DNA-Sequenzen, die für die Sekretionsleader-und Verarbeitungssignale codieren, zu entfernen, während ein Starter-Codon am 5'-Ende der für die schwere Kette codierenden Sequenz eingeführt wird. Auf diese Art können die Immunoglobuline hergestellt und verarbeitet werden, so dass sie in anderen als Säugerzelle zusammengefügt und glykosiliert werden können. Falls erwünscht, kann jede der Ketten gestutzt werden, so dass ihnen wenigstens der variable Abschnitt verbleibt. Diese Abschnitte können dann derart behandelt werden, dass sie andere Immunoglobuline oder Fragmente davon liefern, die spezifisch sind für Flagellat-Epitope.

Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung sind besonders nützlich wegen ihrer Spezi-fizität für Antigene, fast alle gegenwärtig bekannten P. aeruainosa-Varianten. Ausserdem sind einige der monoklonalen Antikörper in vivo schützend. Dies erlaubt deren Einbezug in pharmazeutische Produkte, wie Antikörper-Kombinationen gegen bakterielle Infektionen.

Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung finden ebenfalls eine Vielzahl von in vitro-Anwendungen. Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper zur Mikroorganismen-Typisierung,

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zur Isolierung spezifischer P. aeruqinosa-Stämme, für die selektive Entfernung von P. aeruainosa-Stämmen aus einer heterogenen Zeilmischung usw. verwendet werden.

Für diagnostische Zwecke können monoklonale Antikörper markiert oder unmarkiert sein. Typischerweise erfordern diagnostische Prüfungen den Nachweis der Bildung eines Komplexes durch Bindung eines monoklonalen Antikörpers an das Flagellum eines P. aeruainosa-Oraanismus.

Falls unmarkiert, finden die Antikörper Anwendung in Aggiutlnations-Prüfungen. Zusätzlich können unmarkierte Antikörper in Kombination mit anderen, markierten Antikörpern (zweite Antikörper) verwendet werden, die mit den monoklonalen Antikörpern reagieren, z.B. immunogiobulin-spezifische Antikörper. Alternativ können die monoklonalen Antikörper direkt markiert werden. Eine Vielzahl von Markierungen können eingesetzt werden, beispielsweise Radionuklide, fluoreszierende Agenzien, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzymkofaktoren, Enzyminhibitoren, Liganden (insbesondere Haptene) usw. Viele Typen von Immuno-Assays stehen zur Verfügung, z.B. die in den U.S. Patentschriften Nrn. 3- 817 827; 3 850 752; 3 901 654; 3 935 074; 3 984 533; 3 996 345; 4 034 074; und 4 098 876 beschriebenen.

Im allgemeinen werden die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung in Enzym-Immuno-As-says verwendet, in welchen die erfindungsgemässen Antikörper oder zweite Antikörper einer anderen Spezies mit einem Enzym konjugiert werden. Wenn eine Probe, die P. aeruginosa eines bestimmten Serotyps enthält, z.B. menschliches ßlut oder ein Lysat davon, mit den erfindungsgemässen Antikörpern kombiniert wird, werden die Antikörper an jene Moleküle gebunden, die den gewünschten Epitop aufweisen. Solche Zellen werden dann von ungebundenen Reagenzien abgetrennt und ein zweiter Antikörper, der mit einem Enzym markiert ist, zugefügt. Danach wird die Anwesenheit von Antikörper-Enzym-Konju-gaten bestimmt, die spezifisch an die Zellen gebunden sind. Andere übliche Techniken, die dem Fachmann wohlbekannt sind, können ebenfalls verwendet werden.

Es können ferner Kits bereitgestellt werden, um P. aeruginosa in Lösung oder die Anwesenheit von FL. aeruainosa-Flaaellar-Antikörpem nachzuweisen. Die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper werden üblicherweise in lyophilisierter Form zur Verfügung gestellt, entweder allein oder zusammen mit zusätzlichen Antikörpern, die spezifisch sind für andere gramnegative Bakterien. Die Antikörper, die unkonjugiert oder mit einer Markierung konjugiert sein können, befinden sich in den Kits zusammen mit Puffern, wie Tris, Phosphate, Carbonate etc., Stabilisatoren, Bioziden, Inerten Proteinen, z.B. Rinderserum-Albumin oder ähnliches, Im allgemeinen ist der Anteil dieser Stoffe kleiner als etwa 5 Gew.-%, bezogen auf die Menge an aktiven Antikörpern, während ihr Gesamtanteil üblicherweise mindestens etwa 0.001 Gew.-% beträgt, wiederum bezogen auf die Antikörper-Konzentration. Häufig wird es wünschenswert sein, einen inerten Extender oder Träger hinzuzufügen, um die aktiven Bestandteile zu verdünnen. Der Anteil des Trägers kann zwischen 1 und 99 Gew.-% der gesamten Zusammensetzung betragen. Wenn ein zweiter Antikörper verwendet wird, der fähig ist, sich an den monoklonalen Antikörper zu binden, so ist er im allgemeinen in einer zweiten Ampulle vorhanden. Der zweite Antikörper ist üblicherweise mit einer Markierung konjugiert und analog formuliert, wie die obenbeschriebene Antikörper-Formulierung.

Die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper, insbesondere monoklonale Human-Antikörper, können ebenfalls Komponenten von pharmazeutischen Zusammensetzungen sein, die eine therapeutische oder prophylaktische Menge mindestens eines erfindungsgemässen monoklonalen Antikörpers und einen pharmazeutisch wirksamen Träger enthalten. Pharmazeutischer Träger kann jede kompatible, nicht-toxische Substanz sein, die geeignet ist, um einem Patienten den monoklonalen Antikörper zu verabreichen, Dazu kommen in Frage steriles Wasser, Alkohol, Fette, Wachse und inerte Feststoffe. Pharmazeutisch annehmbare Adjuvanzien (Puffer, Dispersionsmittel) können ebenfalls der pharmazeutischen Zusammensetzung hinzugefügt werden. Solche Zusammensetzungen können einen einzigen monoklonalen Antikörper enthalten, so dass sie spezifisch sind für Stämme eines flagellaren Typs von P. aeruginosa. Alternativ kann eine pharmazeutische Zusammensetzung zwei oder mehr monoklonale Antikörper als «Cocktail» enthalten. Zum Beispiel ein Cocktail, der monoklonale Antikörper gegen Gruppen verschiedener P. aeruoinosa-Stämme (d.h. verschiedene Serotypen) enthält, wäre ein universelles Produkt, aktiv gegen die grosse Mehrheit der klinischen Isolate dieser bestimmten Bakterien.

Das Molverhältnis der verschiedenen monoklonalen Antikörper wird sich im allgemeinen um nicht mehr als einen Faktor 10 unterscheiden, üblicherweise um nicht mehr a!s einen Faktor 5. Meistens wird das Molverhältnis etwa 1:1 bis 2 für jeden der anderen Antikörper betragen.

Die monoklonalen Antikörper der vorliegenden Erfindung können ebenfalls in Kombination mit Plasma-Produkten verwendet werden, wie handelsübliche Gammaglobulin- oder Immunoglobulin-Präparate, wie sie für die prophylaktische oder therapeutische Behandlung einer P. aeruainosa-Erkrankuno des Menschen benutzt werden. Für Immunoglobuline wird das Plasma vorzugsweise von Spendern bezogen werden, die erhöhte Spiegel an Immunoglobulin, die mit P. aeruginosa reagieren, zeigen (siehe generell, das Handbuch «Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host», Amer, J, Med., 76(3a), 30. März 1984, Seiten 1-231).

Die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper können als getrennt zu verabreichende Präparate eingesetzt werden, die zusammen mit Antibiotika oder antimikrobiellen Agenzien gegeben werden. Die antimikrobiellen Agenzien umfassen typisGherweise anti-pseudomonales Penicillin (z.B. Carbenicillin) zusammen mit einem Aminoglykosid (z.B. Gentamicin, Tobramycin, etc.); es können aber viele andere zusätzliche Stoffe (z.B. Cephalosporine), die dem Fachmann gut bekannt sind, verwendet werden.

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Die monoklonalen Antikörper und die daraus gewonnenen pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäss dieser Erfindung eignen sich besonders gut für orale oder parenterale Verabreichungen. Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen parenteral verabreicht, d.h. subcutan, intramuskulär oder intravenös. Die Erfindung stellt somit Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung zur Verfügung, die eine Lösung eines monoklonalen Antikörpers oder eines Cocktails von solchen Antikörpern, gelöst in einem annehmbaren Träger, vorzugsweise einem wässrigen Träger enthalten. Eine Vielzahl wässriger Träger kann verwendet werden, z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4%ige Kochsalzlösung, 0,3%iges Glycin und dergleichen. Diese Lösungen sind steril und üblicherweise frei von Feststoffteilchen. Diese Zusammensetzungen können auf bekannte Art sterilisiert werden. Um annähernd physiologische Bedingungen zu erreichen, können die Zusammensetzungen pharmazeutisch annehmbare Hilfsstoffe enthalten, wie Mittel zur Anpassung des pH-Wertes oder der Toxizität, Puffer usw., z.B. Natriumacetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Kalziumchlorid, Natriumlactat usw. Die Konzentration des Antikörpers in diesen Formulierungen kann stark variieren, d.h. von weniger als etwa 0,5%, meistens um oder mindestens 1 % bis zu 15 oder 20%, bezogen auf das Gewicht. Sie wird im wesentlichen festgelegt aufgrund von Fluid-Volumina, Viskositäten etc., bevorzugt entsprechend der gewählten Verabreichungsmethode.

Eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für intramuskuläre Injektionen könnte beispielsweise 1 ml steriles, gepuffertes Wasser und 50 mg monoklonaler Antikörper enthalten. Eine typische Zusammensetzung für intravenöse Infusionen könnte 250 ml sterile Ringer's-Lösung und 150 mg monoklonale Antikörper enthalten. Gebräuchliche Methoden, um parenteral verabreichbare Zusammensetzungen herzustellen, sind dem Fachmann bekannt oder wenigstens naheliegend. Solche Methoden sind übrigens im Detail in beispielsweise Remington's Pharmaceutical Science, 15. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980) beschrieben.

Die erfindungsgemässen monoklonalen Antikörper können für die Lagerung lyophyllsiert und vor. dem Gebrauch mit einem geeigneten Träger rekonstituiert werden. Diese Technik hat sich mit konventionellen Immunoglobulinen als wirksam erwiesen, es können also Lyophylisierungs- und Rekonstitutionstechniken gemäss dem Stand der Technik angewendet werden. Es wird dem Fachmann bekannt sein, dass Lyophyii-sieren und Rekonstitution zu einem Verlust der Antikörper-Aktivität in unterschiedlichem Ausmass führen kann (z.B. neigen bei konventionellen Immunoglobulinen IgM-Antikörper zu einem grösseren Aktivitätsverlust als IgG-Antikörper), so dass zur Kompensation der Anwendungsspiegel gegebenenfalls an-gepasst werden muss.

Die Zusammensetzungen enthaltend die erfindungsgemässen Antikörper oder einen Cocktail davon, können zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von P. aeruainosa-lnfektionen verabreicht werden. Bei der therapeutischen Anwendung werden die Zusammensetzungen einem Patienten, der bereits mit einem oder mehreren P. aeruainosa-Serotvoen infiziert ist, in einer Menge verabreicht, die gross genug ist, um ihn zu heilen oder die Infektion und ihre Komplikationen wenigstens teilweise zu stoppen. Eine Menge, die geeignet ist, dies zu erreichen, wird definiert als eine «therapeutisch wirksame Dosis». Für diesen Zweck wirksame Mengen hängen ab von der Schwere der Infektion und dem allgemeinen Zustand des Immunsystems des Patienten. Sie bewegen sich aber im allgemeinen im Bereich von etwa 1 bis etwa 200 mg Antikörper pro kg Körpergewicht, wobei Dosierungen von 5 bis 25 mg pro kg Körpergewicht am üblichsten sind. Es muss daran erinnert werden, dass Substanzen gemäss der Erfindung allgemein bei ernsten Krankheitszuständen verwendet werden können, d.h. in lebensgefährlichen oder potentiell lebensgefährlichen Situationen, insbesondere durch P. aeruginosa verursachte Bakter-ämie und Endotoxämie.

Bei der prophylaktischen Anwendung werden die den erfindungsgemässen Antikörper oder einen Cocktail davon enthaltenden Zusammensetzungen einem Patienten, der noch nicht mit P. aeruginosa infiziert ist, verabreicht, um seine Widerstandskraft gegen eine potentielle Infektion zu erhöhen. Eine entsprechende Menge wird definiert als eine «prophylaktisch wirksame Dosis». Bei dieser Anwendung hängen die genauen Mengen wiederum vom Gesundheitszustand und dem allgemeinen Immunitätsniveau des Patienten ab. Normalerweise betragen die Dosen 0,1 bis 25 mg pro kg Körpergewicht, insbesondere 0,5 bis 2,5 mg pro kg.

Die Zusammensetzungen können einfach oder mehrfach verabreicht werden, wobei die Höhe der Dosen und das Verabreichungsmuster vom behandelnden Arzt festgelegt werden. Die pharmazeutischen Formulierungen gemäss der Erfindung sollten in jedem Fall eine für Prophylaxe oder Therapie genügende Menge an erfindungsgemässen Antikörpern zur Verfügung stellen.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Methodologie, die benützt wird, um monoklonale, murine Antikörper herzustellen, die sich spezifisch an P. aeruginosa binden.

3 Monate alte BALB/c-Mäuse wurden achtmal Intraperitoneal immunisiert mit lebensfähigen P. aeru-ginosa-Bakterien des Fisher-Immunotyps 1 und Fisher-Immunotyps 2 (ATCC 27 312 und 27 313), und zwar jede Woche bis alle zwei Wochen während total neun Wochen. Die Anfangsdosen der Bakterien waren 8 x 106 und 1 x 107 Organismen pro Maus für P. aeruginosa Fisher-Immunotyp 1 bzw. Fisher-Immunotyp 2 und sie wurden im Laufe der Immunisierung auf das 30- bis 60fache erhöht.

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3 Tage nach der letzten Infektion wurde die Milz einer Maus unter aseptischen Bedingungen entfernt und eine Einzellensuspension durch leichte Rotation des Organs zwischen den gekühlten Enden zweier steriler Objektträger hergestellt. Monoklonale Milzzellen wurden im Verhältnis 4:1 mit log-Phase-Maus-Myeloma-Zellen (NSI-1, erhalten von Dr. C. Milstein, Molecular Research Council, Cambridge, England) kombiniert und zusammen verschmolzen, um Hybridomas zu erzeugen, entsprechend dem von Tarn et al. (1982, Infect. Immun., 36: 1042-1053) beschriebenen Verfahren. Die erhaltene Suspension hybrider Zellen wurde auf eine Konzentration von 1,5 x 106 Zellen pro ml verdünnt in RPMl-Hybrid-HAT (RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY), enthaltend 15% wärme-inaktiviertes fötales Kälberserum, 1 mM Natriumpyruvat, 100 ng/ml Penicillin und Streptomycin, 1,0 x 10-* M Hypoxanthin, 4,0 x 10~7 M Aminop-terin und 1,6 x 10-5 M Thymidin), das pro ml 2,0 x 10B frisch hergestellte BALB/c-Thymocyten als «Feeder»-Zellen enthielt.

Die Mischung wurde auf eine Platte mit 96 Löchern (Nr. 3596, Costar, Cambridge, MA) übertragen (200 ni pro Loch). Die Kultur wurde ernährt durch Entfernung und Ersetzen von 50% des Volumens einer jeder Vertiefung mit RPMl-Hybrid-HAT jeden zweiten bis dritten Tag. Der Kulturüberstand wurde auf die Anwesenheit von Anti-P. aerualnosa-Antlköroer untersucht, mittels ELISA (Enzyme-Iinked im-munosorbant assay), als das Zellwachstum in den Löchern einen Zusammenfluss von etwa 40% erreicht hatte, was im allgemeinen in 7 bis 10 Tagen der Fall war.

Die Kulturüberstände der hybriden Zellen wurden gleichzeitig auf Präparaten von äusseren Membranen von jeder der beiden Immunisierenden Bakterien untersucht. Präparate von äusseren Membranen wurden isoliert, gemäss einer Modifikation der Methode von Tarn et al. (1982, Infect. Immun., 36:1042-1053). Bakterien (P. aeruginosa Fisher-Immunotyp 1 und Fisher Immunotyp 2) wurden in «trypticase soy broth» (TSB) inokuliert und während 16-18 Std bei 34°C mit Belüftung in einem Drehschüttelbad gezüchtet. Die Bakterien wurden mittels Zentrifugation geerntet und zweimal mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS, 0,14 M NaCI, 3 mM KCl, 8 mM Na2HPÛ4-7 HaO, 1,5 mM KH2P04, pH 7,2), die 150 trypsin-inhibierende Einheit (T.l.U.) Aprotinin pro ml enthielten (Sigma, St. Louis, MO) gewaschen.

Das Pellet aus der letzten Zentrifugation wurde erneut suspendiert in 0,17 M Triethanolamin, 20 mM Dinatriumefhylendiamin Tetraessigsäure (EDTA) und dann während 10 Min. auf Eis homogenisiert. Die Trümmer des Homogenates wurden bei 14 900 x g pelletislert und verworfen und der Überstand erneut wie oben zentrifugiert. Das Pellet wurde wiederum verworfen und die Membranen aus dem Überstand durch Zentrifugation bei 141 000 x g während 1 Std. pelletisiert. Der Überstand wurde verworfen und die Membranpellets über Nacht bei 4°C in 10 ml PBS, enthaltend 75 T.l.U. Aprotinin pro ml aufbewahrt. Am nächsten Tag wurden die Pellets durch Wirbelung resuspendiert, in aliquote Teile getrennt und bei -70°C aufbewahrt. Der Proteingehalt jedes Pellets wurde nach der Methode von Lowry et al., (1951, J. Biol. Chem., 193:265-275) bestimmt.

Die Antigen-Platten wurden für den ELISA wie folgt vorbereitet. Die Präparate von äusseren Membranen wurden auf 5 jxg pro ml Protein in PBS verdünnt und 50 jxl der Lösung in jede Vertiefung der 96 Löcher aufweisenden Lochplatten übertragen (Linbro Nr. 76-031-05, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA), versiegelt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Ungebundenes Antigen wurde von den Platten entfernt, 100 p.1 5%iges (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS in jede Vertiefung gegeben und die Platten während 1 Std. bei 37°C inkubiert.

Nach dem Entfernen der nicht-adsorbierten BSA, wurden die Kulturüberstände (50 jxl) aus jeder Vertiefung der Fusionsplatten in die entsprechenden Vertiefungen der Antigen-Platten replikaplatiert und während 30 Min. bei 37°C inkubiert. Das ungebundene Protein wurde aus den Vertiefungen entfernt und die Platten dreimal mit 100 ml 1%iger (w/v) BSA-PBS pro Loch gewaschen. Danach wurden pro Vertiefung 50 jil eines geeignet verdünnten biotinylierten Ziegen-Anti-Maus IgG (Tago, Inc., Buriinga-me, CA) in jede Vertiefung gegeben und bei 37°C während 30 Min. inkubiert Die Platten wurden wie oben beschrieben dreimal gewaschen und dann 50 ni eines vorgebildeten Avidin'biotinylierten Meerret-tich-Peroxidase-Komplexes (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), der gemäss den Spezifikationen des Herstellers hergestellt worden war, In die Vertiefungen gegeben. Nach 30 Min. bei Raumtemperatur wurde das Vectastain-Reagenz von den Vertiefungen entfernt, die Vertiefungen wie oben gewaschen und dann pro Vertiefung 100 jil Substrat, o-Phenylendiamin (0,8 mg/ml in 0,1 M Citratpuffer, pH 5,0, gemischt mit dem gleichen Volumen einer 0,03%igen (v/v) HzOa-Lösung) hinzugefügt Das Substrat wurde im Dunkeln 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert und danach die Reaktionen beendet durch Zugabe von 50 p.l 3N H2SO4 pro Vertiefung.

Hybridoma-Zellen, die monoklonale Antikörper ausschieden, die sich an eine der zwei Antigen-Zube-reitungen binden konnten, wurden lokalisiert durch Messen der Absorption bei 490 nm der kalorimetrischen Reaktion in jeder Vertiefung. Gemessen wurde mit einem Dynatech Model 580 MicroELISA-Leser (Alexandria, VA), Die Zellen in einer Vertiefung, die mit Pa3 IVC2 bezeichnet wurden, produzierten Antikörper, die sich nur an Fîsher-lmmunotyp 2 Antigen banden. Diese Vertiefungen wurden weiter untersucht, wie unten beschrieben. Im folgenden Text werden monoklonale Antikörper und die klonale Zellinie aus dieser Vertiefung, beide mit Pa3 IVC2 bezeichnet Pa3 IVC2-Zellen aus der Original-Vertiefung wurden minikloniert und durch begrenzende Verdünnungstechniken kloniert wie sie bei Tarn et al-, (1982, Infect Immun. 36:1042-1053) beschrieben sind.

Ascites-Flüssigkeit mit einem hohen Gehalt an monoklonalem Antikörper wurde in CB6 Fi-Mäusen hergestellt (BALB/c (weiblich) x C57BL/6 (männlich) Fi), entsprechend der Vorschrift von Tarn et al-,

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(1982, Infect. Immun. 36:1042-1053). 2 bis 3 Monate alten, männlichen CB6 Fi-Mäusen wurde intraperitoneal 0,5 ml Pristan (2, 6, 10, 14-Tetramethylpentadecan, Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) injiziert. 10 bis 21 Tage später erfolgte eine intraperitoneale Injection mit log-Phase Pa3 IVC2-Zellen in RPMI. Jeder Maus wurden 0,5 bis 1 x 107 Zellen in 0,5 ml injiziert. Nach etwa 2 Wochen wurde die angesammelte Flüssigkeit von den Mäusen alle 2 bis 3 Tage entfernt. Die Konzentration der Antikörper in der Ascites-Flüssigkeit wurde mit Agarosegel-Elektrophorese bestimmt (Paragon, Beckman Instruments, Inc., Brea, CA) und alle Ascites mit einer Antikörper-Konzentration von 5 mg pro ml oder mehr wurden vereinigt, aliquot geteilt und bei -70°C eingefroren.

Charakterisierung des molekularen Targets, an das der monoklonale Antikörper gebunden wird

Der Kulturüberstand der klonierten Pa3 IVC2-Zellinie wurde, wie oben angegeben, mit ELISA untersucht auf Präparaten von äusseren Zellmembranen von allen sieben P. aeruainosa-Fisher-lmmunotvp-Stämmen (ATCC Nr. 27312-27318V P. aureofaciens (ATCC Nr. 13985) und Klebsiella pneumoniae fATCC Nr. 8047), alle wie oben angegeben hergestellt. Der Antikörper Pa3 1VC2 wurde an die äusseren Membranpräparate der P. aeruqinosa-Fisher-lmmunotvpen 2, 6 und 7 gebunden, aber nicht an die anderen Fisher-Immunotypen, P. aureofaciens oder K. pneumoniae.

Das durch den Antikörper Pa3 IVC2 identifizierte spezifische Antigen wurde durch Radio-Immunfällung identifiziert. Kurz gesagt, umfasst die Analyse das Inkubieren radio-markierter Antigene mit dem Pa3 IVC2-Antikörper und einer Quelle von Protein A, wodurch unlösliche Antikörper:Antigeri-KompIexe gebildet werden. Diese Komplexe werden gewaschen, um unspezifisch gebundenes Antigen zu entfernen, dann werden die Komplexe dissoziert und auf Polyacrylamidgel getrennt. Die im Gel gefundenen, vorwiegend radioaktiven Spezies, werden dadurch identifiziert, als die entsprechenden Antigene, an welche der Antikörper Pa3 IVC2 gebunden wurde.

Aliquote Teile (25 jig) von löslichen Präparaten der äusseren Membrane von P. aeruoinosa-Fisher-Immunotypen 2, 3, 4 und 5 wurden in Festphase mit 12SI unter Verwendung von lodo-Gen (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (Fraker and Speck, 1978, Biochem. Biophys. Res, Commun., 80: 849-857; Markwell and Fox, 1978, Biochemistry, 17: 4807-4817) radiomarkiert. Dies führte zur lodierung der exponierten Tyrosinreste auf den meisten, wenn nicht allen Proteinen in den äusseren Membran-Präparaten.

Um unspezifisches Binden der äusseren Membran-Antigene an den Antikörper Pa3 IVC2 zu vermindern, wurden die radiomarkierten Präparate (5 x 106 Zählungen pro Minute und Untersuchung) zunächst für 1 Std. bei 4°C mit BALB/c normalem Mausserum (1:40 Endverdünnung) inkubiert. Der Überstand einer Pa3 IVC2-Kultur (0,5 ml) enthaltendenden Pa3 IVC2-Antikörper wurden dann zu jeder Probe von äusseren Membran-Präparaten zugegeben. Nach Inkubation von Antigen und Antikörper während 1 Std. bei 4°C, wurde die Protein-A-Quelle, IgGSORB (0,095 ml pro Probe) (The Enzyme Center, Inc., Boston, MA) hinzugefügt und während zusätzlicher 30 Min. bei 4°C inkubiert (Kessler, S.W., 1975, J. Immunol. 115:1617-1622). IgGSORB wurde entsprechend den Spezifikationen des Produzenten hergestellt. Unspezifische Reaktionen wurden verhindert, indem unmittelbar vor Gebrauch potentiell reaktive Stellen mit Kulturmedium blockiert wurden durch zweimaliges Waschen des IgGSORB mit RPMI-Hybrid (HAT-freies RPMl-Hybrid-HAT-Medium).

Die Antigen-Antikörper-lgGSORB-KompIexe wurden pelletiert bei 1500 x g während 10 Min. bei 4°C, zweimal mit Phosphat-RIPA-Puffer (10 mM Phosphat, pH 7,2, 0,15 M NaCI, 1,0% (v/v) Triton X-100, 1,0% (w/v) Natriumdeoxycholat, 0,1% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS) und 1,0% (v/v) Aprotinin); zweimal mit hoch salzhaltigem Puffer (0,1 M Tris-HCI, pH 8,0, 0,5 M LiCI, 1% (v/v) Beta-Mercaptoethanol); und einmal mit Lysis-Puffer (0,02 M Tris-HCI, pH 7,5, 0,05 M NaCI, 0,05% (v/v) Nonidet P-40) (Rohrschneider et al., 1979, Proc, Nati. Acad, Sci., U.S.A., 76: 4479-4483) gewaschen. Antigen, das an den Komplex gebunden war, wurde befreit durch Inkubation mit Probenpuffer (0,125 M Tris-HCI, pH 6,8, 2% (w/v) SDS, 2% Beta-Mercaptoethanol und 20% (v/v) Glycerin) bei 95°C während 10 Min. und im Überstand nach Zentrifugation bei 15 000 x g während 10 Min. aufgefangen.

Die überstehenden Proben wurden dann auf 14% Polyacrylamidgel-enthaltendes SDS aufgetragen, das gemäss der Methode von B. Lugtenberg et al., (1978, FEBS Lett, 58:254-258) nach der Modifikation von Hancock und Carey (1979, J. Bacteriol., 140: 902-910) hergestellt wurde. Die Antigene wurden dann über Nacht in dem Gel getrennt durch Elektrophorese bei einer konstanten Spannung von 50 Volt. Nach Fixierung des Gels über Nacht in 4% (v/v) Methanol, 10% (v/v) Essigsäure und 5% (v/v) Glycerin wurde es auf Whatman-Papier 3MM mittels eines Biorad-Geltrockners (Richmond, CA) getrocknet. Das trockene Gel wurde mit einer Plastikhülle bedeckt und einem Kodak X-AR-Film während 18 Std. bei Raumtemperatur ausgesetzt.

Die Ergebnisse dieses Experiments zeigten, dass Pa3 IVC2 nur an ein Antigen ausschliesslich in dem Präparat der äusseren Membranen von P. aeruainosa-Fisher-lmmunotvo 2 gebunden wurde, aber an keines der in den anderen Präparaten äusserer Membranen vorhandenen Antigenen. Das Molekulargewicht (MW) des Antigens im Gel betrug etwa 53 000 Daltons, wie durch Vergleich seiner Mobilität mit jener von 14C-Proteinstandars (Phosphorylase B, 92 500 MW; BSA, 69 000 MW; Ovalbumin, 46 000 MW; Carbonanhydrase, 30 000 MW; Cytochrom C, 12 000 MW) (New England Nuclear, Boston, MA) die im selben Gel getrennt wurden, bestimmt werden konnte. Das Molekulargewicht dieses Antigens kor-

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relïerte mît dem Molekulargewicht von Flagellin, dem Protein, welches die flagella von P. aeruginosa um-fasst, wie von Montie et al., (1982, Infect. Immun. 35:281-288) berichtet wurde.

Zusätzlich wurde Pa3 1VC2 mit ELISA untersucht unter Verwendung der P. aeruginosa-Habs-Stäm-me 1-12 (ATCC Nr, 33348-33359), die mit Ethanol in 96-Loch-Mlkrotiterplatten fixiert wurden. Die Anti-genplatten wurden wie folgt zubereitet.

Über Nacht inkubierte Brühen-Kulturen eines jeden Organismus wurden pelletiert, zweimal mit PBS gewaschen und in PBS resuspendiert bis zu einer Aeeo von 0,2 O.D.-Einheiten. Die verdünnten Bakterien wurden in Vertiefungen eingetragen (50 pl pro Vertiefung) und dann mit 1500 x g während 15 Min. bei Räumptemperatur zentrifugiert. Die PBS wurde abgesaugt und 95%iger Ethanol während 15 Min. bei Raumtemperatur in die Vertiefungen gegeben. Nachdem der Ethanol von den Vertiefungen entfernt worden war, wurden die Platten an der Luft getrocknet und dann bedeckt und bei 4°C bis zum Gebrauch aufbewahrt.

Die Ergebnisse der ELISA-Tests, wie oben beschrieben durchgeführt, zeigten, dass Pa3 IVC2 an die Ethanol-fixierten Habs-Stämme 2,3,4,5,7,10,11 und 12 gebunden wurde. Diese Spezlfizitätsmuster wiesen darauf hin, dass Pa3 IVC2 an die Typ-b-flagella von P. aeruginosa gebunden wurde (Ansorg, R., 1978, Zbl. Bakt. Hyg„ I. Abt. Orig. A„ 242:228-238; Ansorg, FL, et ai., 1984, J. Clin, Microbiol., 20: 84-88). Aufgrund dieser Zuordnung der Spezifizität von monoklonalem Pa3 IVC2 tragen die P. aeruginosa-Referenzstämme, Fisher-Immunotyp 2, 6 und 7 Typ-b-flagella. Aus den vorangegangenen experimentellen Daten konnte geschlossen werden, dass Pa3 IVC2 spezifisch an P. aeruginosa Flagellin-Typ-b gebunden wird.

in vivo schützende Aktivität von Pa3 IVC2

Es wurden Tierexperimente durchgeführt, um festzustellen, ob der monoklonale Antikörper Pa3 IVC2 eine mit mehrfachen LDso-Einheiten von lebenden P. aeruginosa infizierte Maus schützen würde. Als Modell wurde das gebrannte Mausmodell (Collins, M.S., und Roby, R.E., 1983, J. Trauma, 23:530-534) ausgewählt. Gruppen von Mäusen erhielten, entsprechend dem Protokoll der Autoren, eine ernste Verbrennung und wurden sofort mit 5-10 LDso-Einheiten von Fisher-Immunotyp 7 infiziert. Monoklonale Antikörper wurden intraperitoneal als hoch-titrige Ascites (0,2 ml intraperitoneal) vor Verbrennung und Infektion verabreicht. Bei den mit Pa3 IVC2 behandelten Tieren wurde keine Erhöhung der Zahl der Überlebenden festgestellt, im Vergleich zu jenen, die keinen Antikörper erhielten.

Beispiel 2

Dieses Beispiel demonstriert die Methodologie für die Herstellung einer murinen Hybridoma-Zellinle, die einen monoklonalen, murinen Antikörper gegen P. aeruginosa Flagellin-Typ-b, der in vivo schützend Ist, produziert.

Erwachsene weibliche BALB/c-Mäuse wurden zuerst intraperitoneal mit lebensfähigen P. aeruoinosa-Fisher-lmmunotyp 6 (ATCC Nr. 27317) (8 x 106 Organismen) injiziert. Zwei Wochen später folgte eine Injektion von lebensfähigen P. aeruainosa-Fisher-lmmunotvp 5 (ATCC Nr. 27316) (4 x 10e Organismen). Während der folgenden Zwei-Wochen-Periode wurden lebensfähige P. aeruoinosa-Fisher-lmmunotvp 5 und 6 zusammen in zwei-wöchentlicher Injektion verabreicht. Die Dosierung an jedem Organismus wurde so erhöht, dass die Enddosis zehnmal grösser war, als die Anfangsdosis. Eine letzte Injektion eines Präparates der äusseren Membranen von P. aeruoinosa-Fisher-lmmunotvo 6 (50 ng Protein), hergestellt nach der Methode von R.E.W. Hancock und H. Nikaido (1978, J. Bacteriol., 136:381-390) wurde 4 Tage nach der letzten Injektion lebensfähiger Bakterien gegeben. 3 Tage nach der letzten Immunisierung wurde die Milz einer Maus entfernt und die Milzzelle für die Hybridisierung vorbereitet, wie in Beispiel 1 beschrieben.

Kulturüberstände der Hybridoma-Zellen wurden am zehnten Tag Post-Fusion mit ELISA auf die Gegenwart von Anti-P. aeruoinosa-Antiköroer untersucht. Dabei wurde das im Beispiel 1 angegebene Vorgehen benutzt, mit der Ausnahme, dass das Antigen für die ELISA-Platten ein lebensfähiges Bakterium war, das in den Vertiefungen einer 96-Loch-Mikrotiterplatte immobilisiert war. Die Platten wurden wie folgt hergestellt.

50 iil Poly-L-Lysin (PUL) (1 [ig/ml in PBS) (Sigma Nr. P-1524, St. Louis, MO) wurden in jede Vertiefung von 96-Loch-Platten (Llnbro) gegeben und 30 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nlcht-adsorbiertes PLL wurde entfernt und die Vertiefungen dreimal mit PBS gewaschen. Bakterielle Kulturen, die über Nacht in TSB gezüchtet worden waren, wurden einmal mit PBS gewaschen und dann erneut in PBS suspendiert, bis zu einer O.D.660nm = 0,2. 50 gl der bakteriellen Suspension wurden in jede der Vertiefungen der Platte gegeben und zum Binden während 1 Std. bei 37°C stehengelassen. Ungebundene Bakterien wurden durch «Flicking» der Plätten und anschliessendes dreimaliges Waschen mit Kochsalzlösung-Tween (0,9% (w/v) NaCI, 0,05% (v/v) Tween-20) entfernt.

Unspezifisches Binden der Antikörper wurde blockiert durch Zugabe von 200 nl/Loch eines blockierenden Puffers (PBS, enthaltend 5% (w/v) fettfreie Trockenmilch, 0,01% (v/v) Antifoam A (Sigma, St. Louis, MO) und 0,01% (w/v) Thimerosal) in die Vertiefungen und Inkubieren während 1 Std. bei Raumptem-

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peratur. Überschüssiger blockierender Puffer wurde entfernt und die Vertiefungen dreimal mit Koch-salzlösung-Tween gewaschen, wie oben beschrieben.

Kulturüberstände (50 |il) wurden in die entsprechenden Vertiefungen der Testplatten Replikations-Übertragen und bei Raumtemperatur während 30 Min. inkubiert. Die Kulturüberstände wurden entfernt und die Vertiefungen fünfmal mit Kochsalzlösung-Tween gewaschen.

Ein Enzym-konjugierter, zweiter Schritt-Antikörper (Meerrettich-Peroxidase-konjugierte Ziegen-An-ti-Maus-IgG und IgM) (Tago, Inc. Burlingame, CA) wurde mit PBS, enthaltend 0,1% (v/v) Tween-20 und 0,2% (w/v) BSA, entsprechend früher durchgeführten Titrationen verdünnt. Dann wurden 50 nl des Reagenz zu jeder Vertiefung gegeben und 30 Min. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das überschüssige Reagenz wurde verworfen, die Vertiefungen fünfmal mit Kochsalzlösung-Tween gewaschen und 100 (il o-Phenylendiamin-Substrat pro Vertiefung zugefügt. Dann wurde während 30 Min., wie in Beispiel 1 beschrieben, inkubiert. Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 1 angegeben, beendet und anschliessend bei A49onm gelesen mit einem Bio-TEk EL310 Automated EIA-PIate-Reader.

Mit den obengeschilderten Methoden wurden die Kulturüberstände der Fusion auf die Anwesenheit von Antikörpern untersucht, die an P. aeruainosa-Fisher-lmmunotvpen 1, 2, 3 oder 4 aber nicht an Kontrollplatten gebunden wurden, die mit dem selben PLL und Blockierungsverfahren, aber ohne Bakterien hergestellt worden waren. Antikörper enthaltende Überstände, die an irgendeinem dieser 4 Fisher-Immunotypen gebunden wurden, wurden ein zweites Mal untersucht. Dabei wurde jede der 7 Fisher-Immunotypen-Bakterien einzeln eingesetzt. Der in der Vertiefung PaF4 IVE8 vorhandene Antikörper wurde, nur an P. aeruainosa-Fisher-lmmunotypen 2, 6 und 7 gebunden. Zellen aus der Vertiefung PaF4 IVE8 wurden durch limitierende Verdünnung kloniert, wie In Beispiel 1 beschrieben. Der monoklonale Antikörper und die klonale Zellinie aus dieser Vertiefung werden beide im folgenden Text mit PaF4 IVE8 bezeichnet. Ascites-Flüssigkeit mit hohem Titer an monoklonalen Antikörpern wurde hergestellt wie in Beispiel 1 angegeben, mit der Ausnahme, dass BALB/c-Mäuse statt CB6Fi-Mäuse verwendet wurden.

Spezifizität von PaF41VE8

Eine der Untersuchungen zur Identifikation des vom monoklonalen Antikörper PaF4 1VE8 gebundenen Antigens war die indirekte Immuno-Fluoreszenz bakterieller Organismen. Jeder der 7 Referenz-Fisher-Immunotypen von P. aeruginosa, plus ein Nicht-Flagellat-Stamm von P. aeruginosa (PA103, ATCC 29260, Leifson, 1951, J. Bacteriol., 62: 377-389) und Escherichia coli (G.S.C. A25) wurden über Nacht bei 37°C in TSB gezüchtet Die Bakterien wurden durch Zentrifugation pelletiert und zweimal mit PBS gewaschen. Jeder Stamm wurde in PBS resuspendiert bis zu einer O.D.660nm = 2,2.

Die bakteriellen Suspensionen wurden dann weiter 1:150 verdünnt und 20 nl Proben wurden in individuelle Vertiefungen von Carlsons-Objektträger (Carlson Scientific Inc., Peotone, IL) gegeben und auf dem Objektträger bei 40°C getrocknet. Kulturüberstände (25 gl) von PaF4 IVE8 wurden auf den trockenen bakteriellen Proben auf dem Objektträger in einer Feuchtkammer bei Raumtemperatur während 30 Min. inkubiert. Ungebundene Antikörper wurden von den Objektträgern abgewaschen, indem die Träger in destilliertes Wasser getaucht wurden. Nach dem Trocknen der Objektträger wurde darauf Fluores-ceinisothiocyanat (FITC) zu konjugierter Ziegen-Anti-Maus-lgG + IgM (25 nl pro Vertiefung einer 1:40 Verdünnung in PBS) (Tago, Burlingame, CA) während 30 Min. bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer inkubiert. Die Objektträger wurden wieder mit destilliertem Wasser gewaschen, getrocknet und mit einem Deckglas bedeckt, dass mit Glycerin in PBS (9:1) fixiert wurde. Die Objektträger wurden mit einem Fluoreszenz-Mikroskop betrachtet.

Fluoreszenz-Färbungen wurden nur bei P. aeruoinosa-Fisher Immunotypen 2, 6 und 7 beobachtet, und zwar als sinusiodales Muster (Linie), die nur einem Ende der Mikroorganismen entstammte. Dies ist konsistent mit der Morphologie und Lage des einzelnen polaren Flagellums dieser Bakterien.^

Die Reaktion von PaF4 IVE8 mit Flageila wurden durch Immunoblot-Analyse bestätigt. Äussere Mem-bran-Antigene von P. aeruoinosa-Fisher-lmmunotyp 6 (vgl. Beispiel 1) wurden durch Elektrophorese in 14% Polyacrylamid enthaltendes SDS, wie in Beispiel 1 beschrieben, getrennt, mit der Ausnahme, dass die Elektrophorese während 5 Std. bei einer konstanten Stromstärke von 80 mA durchgeführt wurde. Vorgefärbte Molekulargewichtsmarkierungen (Lysozym, MW 14 300; Beta-Lactoglobulin, MW 18 400; Alpha-Chymotrypsinogen, MW 25 700; Ovalbumin, MW 43 000; Rinderserumalbumin, MW 68 000; Phosphorylase B, MW 97 400; und Myosin, MW 200 000; (BRL, Gaithersburg, MD) waren dem gleichen Polyacrylamidgel beigegeben worden.

Die Antigene wurden mit einem Tris-Glycin-Methanol-Puffer (Towbin et al., (1979), Proc. Nati. Acad. Sci., U.S.A., 76: 4350-4354), der 0.05% (w/v) SDS enthielt über Nacht bei 4°C und einer konstanten Stromstärke von 200 mA vom Polyacrylamidgel auf eine Nitrocellulose-Membrane (NCM) (0,45 um, Schleicher & Schuell, Inc., Keen, NH) übertragen. Nach dem Transfer wurden die NCM in 0,05% (v/v) Tween-20 in PBS (PBS-Tween) (Batteiger, B., et al„ 1982, J. Immunol. Meth., 55: 297-307) während 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Für diese und alle folgenden Stufen wurde die NCM auf eine Schüttelplattform gelegt, um eine gleichmässige Verteilung der Lösung über die ganze NCM sicherzustellen.

Nach 1 Std. wurde die PBS-Tween-Lösung weggegossen und die PaF4 IVE8-Ascites (1:1000 in PBS-Tween verdünnt) zugegeben und mit der NCM während 1 Std. bei Raumtemperatur inkubiert. Die NCM

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wurde dann fünfmal, jeweils 5 Min. lang, mit PBS-Tween gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Alkaline Phosphatase-konjugierte Ziegen-Anti-Maus-IgG + IgM (Tage, Inc.) wurde entsprechend den Spezifikationen des Herstellers verdünnt und mit der NCM während 1 Std. bei Raumptempera-!ur inkubîert. Die NCM wurde wie oben angegeben fünfmal gewaschen und das substrat-enthaltende Bromochloroindolylphosphat und Nitroblautetrazolium (Sigma, St. Louis, MO), hergestellt, wie beschrieben, bei Leary et al., (1983, Proc. Nati. Acad. Sci., U.S.A., 80:4045-4049) wurde zugegeben und 10 bis 20 Min. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde durch Wegwaschen des Substrates mit destilliertem Wasser beendet.

Die Ergebnisse dieses Experiments zeigen, dass PaF4 IVE8 spezifisch an ein einziges Antigen mit einem Molekulargewicht von 53 000 Daltons in der äusseren Membran-Zubereitung gebunden wurde. Die Resultate der indirekten Immunofluoreszenz und Immunoblot-Untersuchung beweisen, dass PaF4 1VE8 an die Flageila von P. aeruginosa gebunden wird.

Die Flageila-Typen,die PaF4 IVE8 erkannte, wurden mit ELISA festgestellt, Habs-Stämme 1-12 (ATCC Nr. 33348-33359) wurden je mit PLL in die Vertiefungen von 96-Loch-MikrotiterpIatten (Linbro) gebunden und der ELISA-Test durchgeführt, wie früher in diesem Beispiel erwähnt. Die Quelle für PaF4 IVE8-Antikörper war Kulturüberstand. Positive Reaktionen wurden in Vertiefungen beobachtet, welGhe Habs-Stämme 2,3,4,5,7,10,11 und 12 enthielten. Dies weist darauf hin, dass PaF4 IVE8 an Typ-b-Fla-gella gebunden wird. Die in vivo-Schutzdaten werden weiter unten im Beispiel 4 dargelegt.

Beispiel 3

Dieses Beispiel demonstriert die Methodologie für die Herstellung einer murinen Hybridoma-Zellinie, welche einen monoklonalen Antikörper, der mit Anti-P. aeruginosa reagiert und in vivo schützend ist, produziert.

Die Quelle lymphoider Zellen für die Verschmelzung war die Milz einer immunisierten BALB/c-Maus, der in einer 6-Wochen-Periode viermal intraperitoneal gereinigte Typ-a-FIagella (10 bis 20 ng Protein) von Habs-Stämmen 6 und 8 (ATCC Nr. 33 353 und 33 355) injiziert worden war. Die Flagella wurden entsprechend der Methode von T.C. Montie et al. (1982, Infect. Immun. 35: 281-288) gereinigt, mit Ausnahme, dass die letzte Zentrifugation der Flagella mit 100 000 x g während 1 Std. statt mit 40 000 x g während 3 Std. durchgeführt wurde. In einigen Fällen wurde eine zweite Modifikation eingeführt, in de.m die Fla- " gella von den Bakterien in einem Blender in 30 Sek. statt in 3 Min. abgeschert wurden (Allison et al., 1985, Infect. Immun., 49:770-774).

Die Proteinkonzentrationen in jedem Präparat wurden mit einem Bio-Rad-Protein-Assay (Bio-Rad, Richmond, CA) bestimmt und die Anwesenheit kontaminierender Lipopolysaccharide (LPS) wurde durch Messen des KDO-Gehaltes (Karkhanis, Y.D., et al., 1987, Anal. Biochem., 85: 595-601) abgeschätzt. Die Molekulargewichte der Flageila-Proteine wurden durch Vergleich ihrer Migration in einem SDS-Po-lyacrylamidgel mit denen von Standard-Proteinmarkierungen (BRL) (siehe Beispiel 2) ermittelt. Das Molekulargewicht von Habs 6 Flagellin war 51 700 Dalton und jenes von Habs 8 Flagellin 47 200 Daiton. Diese Werte stimmen mit den von J.S. Allison et al. (1985, Infect. Immun., 49:770-774) überein.

Die Verschmelzung von Splenocyten von mit Flagellin immunisierten Mäusen und NS-1-Myeloma-Zel-len wurde 3 Tage nach der letzten Immunisierung, wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben durchgeführt. Als die Hybridoma-Zeilen zu einem Zusammenfluss von etwa 40% angewachsen waren (Tag 7) wurden die Kulturüberstände in die entsprechenden Vertiefungen von drei verschiedenen Antigenplat-ten Replikations-Übertragen, in denen P. aeruoinosa-Pisher-lmmunotvp 1 mit PLL gebunden (vgl, Beispiel 2 für die Herstellung) und Habs 6 und Habs 9 mit Formalin fixiert waren.

Die Bakterien für die Formalin-fixierten Antigenplatten wurden auf die selbe Art gezüchtet, gewaschen und verdünnt, wie für die PLL-gebundenen Antigenplatten beschrieben. Verdünnte Bakterien (0,2 O.D.-Einheiten bei Aeeo) wurden in individuelle Vertiefungen (50 nl pro Vertiefung) von Linbro-96-Loch-Mikrotiterplatten eingetragen und die Platten dann bei 1200 x g bei Raumtemperatur 20 Min. lang zentrifugiert. Die Überstände wurden entfernt und 75 nl 0,2% (v/v) Formalin in PBS in jede Vertiefung hinzugefügt und während 15 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Nachdem das Formalin entfernt worden war, wurden die Platten an der Luft getrocknet und bis zum Gebrauch bei 4°C aufbewahrt. Formalin be-einflusste die Antigenizität der Flagella nicht, wie die Fähigkeit von Anti-Flagella-Antiseren, mit Formalin behandelten Organismen zum agglutinieren, beweist (Lanyi, B., 1970, Acta Microbiol. Acad. Sei., Hung., 17: 35-48). Der P. aeruainosa-Fisher-lmmunotvp 1-Stamm wurde als Kontrolle eingeschlossen, weil es ein flagellat-freier Stamm ist, wie durch Beizenfärbungen gezeigt werden konnte (Manual of Clin. Microbiol., 1985, Lennette, Herausgeber Amer. Soc. Microbiol., Wash., D. C., Seite 1099). Hybride Zellen, in der mit Fa6 I1G5 bezeichneten Vertiefung produzierten einen Antikörper, der an Habs 6 und 9 (beides flagella-tragende Stämme), nicht aber an Fisher-Immunotyp 1 gebunden wurden.

Die Zellen der Vertiefungen FA6 IIG5 wurden in Subkulturen weiter gezüchtet und kloniert, wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben. Der monoklonale Antikörper und die klonale Zellinie aus dieser Vertiefung werden im folgenden Text mit FA6 IIG5 bezeichnet. Ascites wurde in BALB/c-Mäusen, wie in Beispiel 2 beschrieben, produziert.

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Spezifizität von FA6IIG5

Die Spezifizität des Antikörpers FA6 HG5 wurde durch indirekte Immunofluoreszenz und lmmunoblot-Untersuchung bestimmt. Die indirekte Fluoreszenz wurde im wesentlichen, wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt, mit den folgenden Änderungen:

Bakterienkulturen, die über Nacht bei 30°G auf Trypticase-Soja-Agar gezüchtet worden waren, wurden mit Wattetupfern von den Platten entfernt und in PBS bis zu einer A660 von 0,2 O.D. Einheiten resuspendiert. Formalin (Endkonzentration 0,37% (v/v) in PBS) wurde mit Wirbelung in die Suspension eingetragen. Nach der Inkubation bei Raumtemperatur während 15 Min. wurden die Bakterien 1:12 in PBS verdünnt und 20 nl dieser Suspension in einzelne Vertiefungen von Carlson-Objektträger gegeben. Nach dem Trocknen wurden die Objektträger wie in Beispiel 2 für die Betrachtung vorbereitet. Die Antikörperquelle war der Kulturüberstand der FA6 IIG5-Zellinie.

Fluoreszenz-Färbungen durch den FA6 IIG5-Antikörper wurden nur bei Typ-a-Flagella-tragenden P. aeruoinosa-Stämmen beobachtet, nicht aber bei Typ-b-tragenden. Das beobachtete Fluoreszenzmuster war ein sinusoïdales Linienmuster, was darauf hindeutete, dass FA6 IIG5 an die Flagella gebunden war. Das Fluoreszenzsignal wurde durch Behandeln der Bakterien mit Formalin verstärkt; diese Behandlung war aber nicht notwendig, um die Flagella-Färbung mit dem Antikörper sichtbar zu machen.

Die Immunoblot-Untersuchung wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt. Quelle für Flagella-Typ-a-Antige-ne waren die gereinigten Flagellar-Präparate (siehe dieses Beispiel). Die Antigene wurden in 10% Polyacrylamid enthaltendes SDS (Laemmli, U.K., 1970, Nature (London), 227: 680-685) getrennt und auf eine NCM übertragen. Zubereitungen von FA6 IGG5, entweder Kulturüberstand oder Ascites 1:1000 verdünnt, wurden mit der NCM umgesetzt und die Reaktion mit einem geeigneten enzym-konjugierten Reagenz und Enzymsubstrat, wie in Beispiel 2 beschrieben, nachgewiesen. Der Immunoblot-Versuch zeigte, dass FA6 IIG5 spezifisch an das Flagellin mit Molekulargewicht 51 700 von Habs 6 und an das Flagellin mit Molekulargewicht 47 200 von Habs 8 gebunden wurde.

Mit ELISA wurde bestätigt, dass FA6 1IG5 nur mit Flagella-Typ-a, aber nicht Typ-b reagierte. In diesem Test wurden Habs-Stämme 1—12 individuell mit PLL an die Vertiefungen von Linbro-96-Loch-Mikroti-terplatten gebunden. Der Antikörper wurde nur an Habs-Stämme 1, 6, 8 und 9, die von den 12 die einzigen Flagella-Typ-a-tragenden Stämme sind, gebunden (Ansorg, R., et al., 1984, J. Clin. Microbiol., 20: 84-88). In vivo-Schutzuntersuchunoen werden im folgenden Beispiel 4 erläutert.

Beispiel 4

Dieses Beispiel demonstriert den Schutz von Mäusen, die passiv mit den Antikörpern PaF4 IVE8 und FA6IIG5 immunisiert worden waren, gegen eine Infektion mit P. aeruginosa im gebrannte- Maus-Modell.

Die Anti-Flagella-monoklonalen Antikörper wurden im gebrannte-Maus-Modell gemäss der Methode von M.S. Collins und R.E. Roby (1983, J. Trauma, 23:530-534) getestet. Für diese Studien wurden alle Antikörper durch Protein A-Sepharose-Chromatographie gereinigt (Ey, P.L., et al., 1978, Immunochemi-stry, 15: 429-436) und in PBS-Puffer hineindialysiert. Der in den Versuchstieren benutzte Flagella-Typ-a-tragende Stamm war P. aeruginosa PA220 (von Dr. James Pennington, Boston, MA) und der Flagella-Typ-b-Stamm war die Referenz P. aeruainosa-Fisher-lmmunotvo 2 (ATCC Nr. 27313).

40 |ig gereinigter monoklonaler Antikörper wurden jeder Maus intravenös 1 bis 2 Std. vor Verbrennung und Infektion verabreicht. Sofort nach der Verbrennung erhielten die Tiere subeschar 0,5 ml kalte, die infizierenden Bakterien enthaltende, PBS. Die Infektionsdosis betrug etwa die zehnfache LD50 eines jeden Organismus. Die Ergebnisse der Tierversuche sind in den Tabellen I und II dargestellt.

Tabelle I

Studie über die Schutzwirkung eines Anti-Flagella-Typ-a-monoklonalen Antikörpers im gebrannte-Maus-Modell1

Behandlung

% Überlebende pro Tag2

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Anti-Flagellaa, FA6IIG5

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monoklonaler Antikörper

PBS ohne Bakterien

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1Die Mäuse wurden subeschar mit etwa der zehnfachen LD50 vom P. aeruginosa PA220 infiziert. 2Die Prozentanteile beruhen auf dem Überleben der Mäuse in Gruppen von je 10 Tieren, mit Ausnahme der Kontrc'lgruppe, die nur PBS erhielt, in der nur 5 Tiere waren. Angegebene Tage sind nach Verbrennung und Infektion.

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Tabelle II

Studie über die Schutzwirkung eines Anti-Flagella-Typ-b-monoklonalen Antikörpers im gebrannte-Maus-

Modell1 . •

Behandlung % Überlebende pro Tag2

1 2 3 4 5 6 7 8 9

Anti-Flageila b, PaF41VE8

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Anti-Flageila a, FA6IIG5

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nicht-spezifischer Anti-LPS-

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monoklonaier Antikörper

PBS ohne Bakterien

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100

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100 100

1Die Mäuse wurden subeschar mit etwa der zehnfachen LD50 vom P. aeruoinosa-Fisher-immunotvp 2 infiziert.

2Die Prozentanteiie beruhen auf dem Überleben der Mäuse in Gruppen von je 10 Tieren, mit Ausnahme der Kontrollgruppe, die nur PBS erhielt, in der nur 5 Tiere waren. Die angegebenen Tage sind nach Ver-brennung und Infektion.

Ein sehr signifikantes Überleben wurde bei Tieren beobachtet, die mit dem Anti-a- oder Anti-b-Anti-kärper behandelt und dann mit dem entsprechenden Antigen infiziert worden waren. Umgekehrt starben 80 bis 90% der unbehandelten, aber infizierten Mäuse oder aber die Tiere, die mit einem nicht entsprechenden monoklonalen Antikörper oder einem unspezifischen Anti-LPS-Antikörper behandelt worden waren. Die Unfähigkeit des Anti-Flagellä-Typ-a-Antikörpers, Mäuse gegen eine lethale Infektion mit Flagella-Typ-b-tragender P. aeruoinosa-Fisher-immunotvp 2 zu schützen, und die Unfähigkeit der Anti-Flagella-Typ-b-Antikörper, Mäuse gegen eine lethale Infektion mit Typ-a-tragender P. aeruginosa PA220 zu schützen, bestätigte in vivo die bereits in vitro beobachtete Spezifizität der Antikörper. Das Überleben von gebrannten, aber nicht infizierten Mäusen zeigte, dass die Verbrennung selber nicht tödlich war.

Beispiel 5

Beispiel 5 demonstriert die extensive Kreuzreaktivität von PaF4 IVE8 und FA6 IIG5 mit klinischen Isolaten von P. aeruginosa, was die klinische Nützlichkeit dieser Antikörper bei der Immunotherapie von P. aeruginosa-lnfektionen demonstriert.

Die klinischen Isolate wurden von Spitälern und Kliniken erhalten. Die Isolate stammten von einer Vielzahl von Isolierungsstellen, einschliesslich Blut, Wunden, des respiratorischen Trakts, Urin und Ohren. Es wurden insgesamt 157 isolate geprüft.

PaF4 IVE8 konnte mit 34 klinischen Isolaten (22%) eine Bindung eingehen, während der" Antikörper des Flagella-Typs a, FA6 IIG5, mit 102 klinischen Isolaten (65%) eine Bindung einging, beide zusammen insgesamt 136 von 157 Isolaten (87%). Von den 21 Stämmen, welche von keinem der Antikörper erkannt wurden, wiesen 19 keine Flagella auf, wie dies durch Beizen-Färbung nachgewiesen wurde. Demzufolge band die Kombination der beiden Antikörper 136 von 138 (98%) von klinischen Isolaten mit Flagella, was frühere Berichte bestätigten (vgl. R. Ansorg, 1978, Zbl. Bakt. Hyg., I Abt. Orig. A, 242:228-238).

Beispiel 6

Das Beispiel 6 demonstriert Verfahren für die Herstellung von humanen monoklonalen Antikörpern, welche sich mit den Flagella des P. aeruginosa Typ b verbinden.

Eine periphere Blutprobe eines Individuums, welche mit einem Polysaccharid-Präparat mit hohem Molekulargewicht immunisiert wurde (Pier et al., 1984, Infect, Immun., 45: 309), diente als B-Zellquelle. Die mononuklearen Zellen wurden durch übliche Blutzentrifugations-Techniken auf Ficoll-Paque (Boyum (1968) Scand. J. Clin. Lab. lnvest, 21:77) abgetrennt und wurden zweimal mit Kalzium- und Magnesiumfreier, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen.

Die mononuklearen Zellen wurden -von den T-Zellen befreit, wobei ein modifiziertes E-Rosetten-Ver-fahren verwendet wurde. Dabei wurden die Zellen auf eine Konzentration von 1 x 107 Zeilen/ml in PBS, welches 20% fötales Kälberserum (FCS) enthielt, bei 4°C resuspendiert. 1 ml dieser Suspension wurde dann in ein Polystyrol-Rundboden-Röhrchen mit der Dimension 7 x 100 mm gegeben, welchem 1 x 109 rote Blutkörperchen vom Schaf zugefügt wurden, welche mit 2-Amino-isothiouroniumbromid (AET) behandelt waren, aus einer 10% (v/v)-Lösung in Dulbecco'schem Medium modifiziert nach Iscove (Iscove'sches Medium) (Madsen und Johnson (1979) J. Immun. Methods., 27:61). Die Suspension wurde während 5 bis 10 Min. bei 4°C vorsichtig geschüttelt, und dann wurden die E-Rosettenzellen durch Zentrifugation auf

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Ficoll-Paque während 10 Min. bei 2500 g bei 4°G entfernt. Die E-Rosetten negativen, peripheren, mononuklearen Blutzellen (E-PBMC), welche an der Grenzfläche eine Bande bildeten, wurden gesammelt und einmal in Iscove'schem Medium gewaschen und in demselben, welches 15% (v/v) FCS, L-Glutamin (2 mmol/l), Penicillin (100 lU/ml), Streptomycin (100 ng/ml), Hypoxanthin (1 x 10-4 M), Aminopterin (4 x 10-7 M) und Thymidin (1,6 x 10~s M) enthielt, resuspendiert. Dieses Medium wird nachstehend als HAT-Medi-um bezeichnet.

Die zell-getriebene Transformation der E-PMBC wurde durch Kokultivierung dieser Zellen mit einer transformierenden Zellinie durchgeführt. Diese transformierende Zellinie war eine Epstein-Barr-Nuklear-Antigen (EBNA)-positive humane Lymphoblastoid-Zellinie, welche erhalten wurde durch Deri-vierung der GM 1500-LymphobIastoid-Zellinie durch Ethyl-methan-sulfonat (EMS)-Mutagenese und anschliessender Selektion in Gegenwart von 30 ng/ml 6-Thioguanin, um den Zeilen ein Hypoxanthin-guanin-phosphoribosyl-Transferase (HGPRT)-Defizit zu verleihen und sie somit HAT-empfindiich zu machen. Diese Zellinie wurde als 1A2-Ze!linie bezeichnet und bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 29. März 1982 mit der Hinterlegungsnummer ATCC CRL 8119 hinterlegt. Die 1 A2-Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden in HAT-Medium suspendiert und dann mit den E-PBMC im Verhältnis von fünfzehn 1A2-Zellen pro PBMC suspendiert. Die Zellmischung wurde auf 30 Rundboden-96-Loch-Mikrotiterplatten (Costar 3799) verteilt, mit einer Konzentration von 32 000 Zellen/Loch in einem Volumen von 200 I pro Loch und bei 37°C in einer angefeuchteten Athmosphäre, die 6% COz enthielt, inkubiert. Die Kulturen wurden an den Tagen 5 und 8 nach der Beschickung durch Ersetzen der Hälfte des Überstandes mit frischem HAT-Medium versetzt. 16 Tage der Beschickung enthielten 100% der Löcher proliferierende Zellen und in den meisten der Löcher waren die Zellen in genügender Dichte vorhanden, um die Überstände zu entfernen und auf Anti-P. aeruainosa-Antikörper zu testen.

Die Überstände wurden einem Screening unterworfen, auf die Gegenwart von Anti-P. aeruainosa-Antikörper unter Verwendung der ELISA-Technik, wie sie in Beispiel 2 beschrieben ist, jedoch mit den folgenden Änderungen. Ein Pool der 7 Fisher-Immunotyp-Referenzstämme (ATCC Nr. 27312-27318) (A660 = 0,2 O.D.-Einheiten) wurde auf Flachboden-96-Loch-Mikrotiterplatten (Immulon II, Dynatech) gebunden, mit Poly-L-lysin vorbehandelt, inkubiert und wie in Beispiel 2 gewaschen. Nach der Blockierung der nicht-spezifischen Bindungsstellen und Waschen der Platten wurde 50 nl PBS enthaltende 0,1% (v/v) Tween-20 und 0,2% (w/v) BSA pro Loch zugegeben. Die Kulturüberstände (50 nl) wurden dann in entsprechende Löcher von Testplatten und Kontrollplatten, welche mit PLL behandelt und blockiert waren, jedoch keine Bakterien enthielten, abgeklatscht. Nach der Inkubation wurden enzym-konjugierte Antikörper der zweiten Stufe (50 ml pro Loch) Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes Ziegen-Anti-Hu-man-lgG und Ziegen-Anti-Human-lgM zweckmässig in PBS, welches 0,1% (v/v) Tween-20 und 0,2% (w/v) BSA enthielt, in die Löcher gegeben und der Test wurde, wie in Beispiel 2 beschrieben, vervollständigt.

Überstände, die Antikörper enthielten, welche an den Pool der Fisher-Immunolypen gebunden wurden, jedoch nicht an die Kontrollplatte, wurde ein zweites Mal getestet, wobei jede der 7 Fisher-Immuno-typ-Bakterien separat getestet wurde. Nur im Überstand eines Lochs, 20H11, war ein Antikörper vorhanden, welcher nur an die P. aeruainosa-Fisher-lmmunotvpen 2, 6 und 7 gebunden wurde. Die Zellen wurden wiederholt Subkulturen unterworfen mit abnehmend niederen Zelldichten bis sämtliche Löcher, welche ein Wachstum aufwiesen, Antikörper ausschieden. Die Zellinie und der monoklonale Antikörper (IgM-lsotyp) wurden im folgenden Text mit 20H11 bezeichnet.

Es wurde eine zweite Transformation durchgeführt, worin die Quelle von B-Zeilen peripheres Blut war, welches einem Patienten mit zystischer Fibrose, von welchem bekannt war, dass er eine chronische P. aeruainosa-lnfektion aufwies, entnommen wurde. Die E-PBMC wurden wie oben beschrieben hergestellt und mit der transformierenden Zellinie 1A2 in einem Verhältnis von 72 1A2-Zellen pro E-PBMC ko-kultiviert. Die Zellmischung wurde auf 15 Rundboden-Mikrotiterplatten mit 96 Löchern mit einer Konzentration von 7,4 x 104 Zellen pro Loch aufgetragen und wie oben beschrieben kultiviert.

Die Überstände wurden durch ELISA auf Gegenwart von Anti P. aeruainosa-Antikörper 16 Tage nach Beginn der Transformation getestet. Der Test wurde durchgeführt, wie dies für die vorherigen Transformationen beschrieben wurde, mit der Ausnahme, dass der für das ursprüngliche Screening verwendete Pool von P. aeruainosa-Stämmen aus Fisher-Immunotyp-Referenzstämmen F2, F4, F6 und F7 (mit den ATCC Nr. 27 313, 27 315, 27 316 und 27 317) und aus drei klinischen Isolaten aus der Genetic Systems Corporation Organism Bank (GSCOB), welche verschiedene LPS-lmmunotypen und Flagella-Ty-pen aufwiesen, zusammengesetzt war. Das klinische Isolât PSA I277 (GSCOB) weist Flagella des Typs a und einen LPS des Fisher-Immunotyps 1 auf; das zweite Isolât PSA G98 (GSCOB) weist Flagella des Typs a und einen LPS des Fisher-Immunotyps 3 auf; und das dritte PSA F625 (GSCOB) weist Flagella des Typs b und ein LPS des Fisher-Immunotyps 5 auf. Diese Mischung von Referenzstämmen und klinischen Isolaten wird als flagelliertes P. aeruainosa-Pool bezeichnet. Die Überstände, welche Antikörper enthielten, die an den Platten, die den flagellierten P. aeruainosa-Pool enthielten, gebunden wurden, jedoch nicht an den PLL-beschichteten Kontrollplatten wurden durch ELISA ein zweites Mal auf individuelle Stämme des Pools getestet. Ein Loch 3CI band die Referenzstämme F2, F6 und F7 und das klinische Isolât F625.

Das Klonen der 3CI-Zellinie wurde durchgeführt, indem zuerst die Zellen in zwei Runden einer Subkultur niederer Dichte subkultiviert wurden, zuerst mit 20 Zellen pro Loch einer 96-Loch-Platte und an-

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schliessend durch Kultivierung mit 2 Zellen pro Loch. Das formelle Klonen der spezifischen Antikörperproduzierenden Zellen wurde durchgeführt, indem die Zellen mit einer Dichte von etwa 1 Zelle/Loch in 72-Loch-Terasaki-Platten aufgetragen wurden (Nunc Nr. 1-36538) mit einem Volumen von 10 nl/Loch mit HAT-Medium, wobei die Aminopteridin-Komponente (HT-Medium) fehlte. Die Platten wurden während 2 bis 3 Std. in einem Inkubator plaziert, damit sich die Zellen am Boden der Löcher ansetzen konnten und wurden dann durch 2 Personen auf Löcher geprüft, welche nur eine einzige Zelle enthielten. Diese Löcher wurden täglich mit HT-Medium versetzt, und wenn das Herauswachsen genügend war, wurden die Zellen in eine 96-Loch-Rundbodenplatte transferiert. Sämtliche Löcher mit einem Wachstum wurden durch ELISA auf P. aeruainosa-Stämme. welche Flagella des Typs b aufwiesen, geprüft, und es wurde gefunden, dass sämtliche den geeigneten Antikörper produzieren. Die Zellinie und der monoklonale Antikörper (IgM-lsotyp) werden beide im folgenden Text als 3CI bezeichnet.

Die mit 20H11 und 3CI bezeichneten Antigene waren Flagella, wie dies durch indirekte Immunofluoreszenz und Immunoblotting gezeigt wurde. Die Techniken wurden durchgeführt, wie dies im wesentlichen in den Beispielen 2 und 3 beschrieben ist. Für den indirekten Immunofluoreszenz-Test wurden die P. aeruainosa-Stämme. welche Flagella des Typs b trugen, die Referenz-Fisher-Immunotypen F2, F6 und F7 (ATCC Nr. 27 313,26 317 und 27 318) und ein Stamm mit Flagella des Typs a, Referenz-Fisher-Immunotyp 4 (ATCC Nr. 27 315), wie in Beispiel 3 präpariert. Der Flagella-Typ der Referenzstämme wurde bestimmt durch Typisierung mit den monoklonalen Mäuse-Antikörpern PaF4 IVE8 und FA6 IIG5. Die Objektträger wurden für die Beobachtung wie in Beispiel 2 präpariert. Die Quellen beider Antikörper waren Kulturüberstände und das FITC-konjugierte Reagenz war FITC-konjugiertes Ziegen-Anti-Human-Ig (Polyvalent) (Tago, Burlingame, CA) im Verhältnis 1:100 mit PBS, welches 0,5% (w/v) bovines Gammaglobulin (Miles Scientific, Cat. No. 82-041-1, Naperville, IL) und 0,1% (w/v) Natriumazid als Konservierungsmittel enthielt, verdünnt.

Das Fluoreszenz-Färben der Antikörper 20H11 und 3CI wurde nur bei P. aeruainosa-Stämmen beobachtet, welche Flageila des Typs b enthielten und nicht beim Fisher-Immunotyp 4 mit dem Flagella Typ a. Das beobachtete Fluoreszenz-Muster war ein sinus-artiges Linienmuster, welches von einem Ende der Bakterien ausgeht und anzeigt, dass die Antikörper an die Flagella der Bakterien gebunden sind.

Das Immunoblotting wurde wie in Beispiel 2 durchgeführt. Gereinigter Flagella Typ b von P. aeruaino-sa-Referenzstämmen Fisher-Immuntyp 2 (ATCC Nr. 27 313) und gereinigter Flageila Typ a der Referenzstämme Habs 6 und Habs 8 (ATCC Nr. 33 353 und 33 355) wurden wie in Beispiel 3 hergestellt. Die Antigene wurden in einem 10% Polyacrylamidgel getrennt (vgl. Beispiel 3) und auf ein NCM transferiert. Kulturüberstände, welche 20H11 oder 3CI-Antikörper enthielten, Kulturüberstand, welcher einen nicht-spezifischen humanen Antikörper enthielt und Kulturmedium wurden mit NCM inkubiert und die Reaktion wurde mit einem alkalyschen, phosphatase-konjugierten Ziegen-Anti-Human-Ig (Polyvalent) (Tago, Burlingame, CA), welches in PBS, das 0,05% (v/v) Tween-20 enthielt, nachgewiesen. Das Enzym-Substrat wurde wie in Beispiel 2 hergestellt. Der Immunoblock zeigte, dass beide Antikörper an das flagelline Protein des Fisher-Immunotyps 2 mit einem Molekulargewicht von 53 000 gebunden waren und nicht an das flagelline Protein von Habs 6 mit einem Molekulargewicht von 51 700 oder an das flagelline Protein von Habs 8 mit einem Molekulargewicht von 47 200. Keine Reaktion wurde beobachtet mit dem nicht-spezifischen humanen Antikörper oder dem Kulturmedium.

Eine zusätzliche Bestätigung, dass die Antikörper 20H11 und 3CI nur an die Flagellen des Typs b gebunden waren und nicht an diejenigen des Typs a, wurde durch ELISA erhalten, worin die Habs-Stämme 1-12 individuell mit PLL an die Löcher von lmmunoIon-96-Loch-Mikrotiterplatten gebunden wurden. Die Antikörper banden nur die Habs-Stämme 2,3,4,5,7,10,11 und 12, welche Stämme sind, die den Flagella Typ b aufweisen (Ansorg, et al., (1984) J. Clin. Microbiol. 20:84).

Beispiel 7

Das Beispiel 7 demonstriert Verfahren für die Herstellung eines humanen monoklonalen Antikörpers, welcher P. aeruginosa mit Flagella des Typs a bindet.

Eine periphere Blutprobe einer Person, welche mit einem Polysaccharid-Präparat mit hohem Molekulargewicht immunisiert worden war (Pier et al., (1981) Infect. Immun., 34:461) diente als B-Zeliquelle. Die mononuklearen Zellen wurden vom Blut abgetrennt und dann von T-Zellen, wie im Beispiel 6 beschrieben, befreit. Die Zellen wurden dann in FCS, welches 10% Dimethylsulfoxid enthielt in einem Flüssigstickstoff-Dampftank eingefroren. Zu einem späteren Zeitpunkt wurden die Zellen schnell bei 37°C aufgetaut, einmal in Iscove'schem Medium gewaschen und in HAT-Medium resuspendiert. Die zell-getriebene Transformation wurde durch Cokultivierung der E-PBMC mit 1A2-Zellen mit einem Verhältnis von 30 1A2-Zel-len pro E~PBMC. Die Zellmischung wurde auf 30 96-Loch-Gewebekulturplatten mit einer Konzentration von 62 000 Zellen pro Loch aufgetragen. Die Zellen wurden am 7. Tag nach der Auftragung durch Ersetzen der Hälfte des Volumens mit HAT-Medium durchgeführt. Es wurde eine Zellproliferation in 100% der Löcher am 14. Tag nach der Auftragung beobachtet und die Überstände wurden von den Löchern entfernt und zu dieser Zeit getestet.

Die Überstände wurden durch ELISA auf die Gegenwart von Anti-P. aeruainosa-Antikörper getestet, indem der flageliierte P. aeruainosa-Pool und PLL-behandelte Platten, wie im Beispiel 6 beschrieben als Kontrolle dienten. Die Uberstände, welche Antikörper enthielten, welche an den flagellierten Pool ge16

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bunden wurden, jedoch nicht an die PLL-Kontrollplatten, wurden wiederum auf individuelle Bakterien-Stämme des fiagellierten Pools getestet. Ein Loch, 21B8, enthielt einen Antikörper, welcher an PSA I277, PSA G98 und an den Referenz-Fisher-Immunotyp 4 gebunden war, wobei diese Stämme des fiagellierten Pools Flageila des Typs a aufweisen.

Das Klonen der 21B8-Zellinie wurde wie in Beispiel 6 für die 3Cl-Zellinie beschrieben, mit folgenden Modifikationen beim formellen Klonierungsschritt durchgeführt. Nachdem diejenigen Löcher der Terasa-ki-Platten, welche nur eine einzige Zelle enthielten, ausgezählt waren, wurde jede Zelle von der Terasa-ki-Platte in ein einzelnes Loch einer 96-Loch-Rundbodenkuiturplatte mit einem Volumen von 100 I HAT-Medium, ohne Aminopteridin-Komponente (HT-Medium) transferiert. Nicht transformierende, HAT-emp-findliche Lymphoblastoid-Zellen wurden zu allen Löchern in einer Dichte von 500 Zellen/Loch als Nährzellen zugegeben. 5 Tage nach der Auftragung wurde 100 I HAT-Medium zu den Löchern gegeben, um selektiv die Nährzellen abzutöten. Die Löcher wurden wiederum an den Tagen 7 und 9 nach der Auftragung durch Ersetzen der Hälfte des Überstandes mit HAT-Medium genährt. Die Zellen wurden dann mit HT-Medium genährt, bis die Zellen eine genügende Dichte aufwiesen, um die Gegenwart des Antikörpers durch ELISA nachzuweisen. Alle Löcher mit einem Auswuchs produzierten Antikörper, welche P. aeruainosa-Stämme mit dem Flagella Typ a banden. Die Zellinie und der monoklonale Antikörper (IgGi-Isotyp) werden im vorliegenden Text als 21B8 bezeichnet.

Das als 21B8 bezeichnete Antigen stellte Flageila dar, wie dies durch die indirekte Fluoreszenz und das Immunoblotting gezeigt wurde (vgl. Beispiel 6 für die Beschreibungen der Techniken). Das Fluoreszenz-Färben des 21B8-Antikörpers wurde nur beim P. aeruginosa-Referenzstamm des Fisher-Immunotyps 4 (ATCC Nr. 27 315), welcher Flagella des Typs a aufweist, beobachtet und nicht beim P. aeruginosa-Referenzstamm des Immunotyps 2 (ATCC Nr. 27 313), welcher Flagella des Typs a aufweist. Das beobachtete Fluoreszenzmuster war ein sinus-artiges Linienmuster, welches von einem Ende der Bakterien ausging, was zeigte, dass der Antikörper an die Flagella der Bakterien gebunden war.

Es wurde ein Immunoblotting durchgeführt, wie dies im Beispiel 2 dargestellt ist. Gereinigte Flagelle des Typs a von P. aeruginosa-Referenzstamm Habs 6 (ATCC Nr. 33 353) und gereinigter Flageila Typ b des P- aeruainosa-Referenzstammes des Fisher-Immunotyps 2 (ATCC Nr. 27 313) wurde wie in Beispiel 3 hergestellt. Die Antigene wurden in 10% Polyacrylamidgel aufgetrennt (vgl. Beispiel 3) und in NCM transferiert. Die Kulturüberstände, weiche entweder 21B8 oder einen nicht-spezifischen humanen Antikörper und Kulturmedium enthielten, wurden mit den NCM umgesetzt, und die Reaktion wurde mit einem alkalischen Phosphatase-konjugierten Geissen-Anti-Human-Ig (Polyvalent) und einem Enzymsubstrat, wie in den Beispielen 2 und 6 beschrieben, nachgewiesen. Der Immunoblot zeigte, dass der Antikörper 21B8 nur am flagellinen Protein mit dem Molekulargewicht von 51 700 von Habs 6 und nicht am flageilinen Protein mit dem Molekulargewicht von 53 000 des Fisher-Immunotyps 2 gebunden war. Keine Reaktion wurde mit dem nicht-spezifischen humanen Antikörper oder dem Kulturmedium beobachtet.

Beispiel 8

Das Beispiel 8 zeigt den Schutz bei Mäusen, welche passiv mit den humanen Anti-Flageila-Antikörpern 20H11, 3CI und 21B8 immunisiert waren gegen eine Herausforderung mit P. aeruginosa am Mäuse-brandwunden-Modeil.

Die humanen monoklonalen Anti-Flagella-Antikörper wurden am Mäusebrandwunden-Modell getestet (vgl. Beispiel 4). Es wurden 21B8 und 20H11-Antikörper hergestellt, indem Kulturüberstände, welche durch entsprechende Zeilinien gebildet wurden, mit Ammoniumsulfat (50% Endkonzentration) ausgefällt wurden (Good et al., Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, B.B. und Shiigi, S.M., Herausgeber, W.J. Freeman & Co., San Francisco, CA, 1980, 279-286). Das Präzipitat wurde in PBS aufgelöst, gegen PBS über Nacht bei 4°C dialysiert und dann vor der Verabreichung an die Tiere steril-filtriert. Die Quelle für die Antikörper 3CI und den nicht-spezifischen Anti-LPS-Antikörper, welcher in der vorliegenden Studie als Negativ-Kontrolle verwendet wurde, war Kulturüberstand. Als positive Kontrolle diente für jede Studie der zweckmässige, gereinigte Mäuse-Antikörper PaF4 IVE8 oder FA6IIG5.

Der Stamm mit dem Flageila Typ a, welcher in den Tierversuchen verwendet wurde, war das klinische Isolât PSA A522 (GSCOB), welches das LPS des Fisher-Immunotyps 1 exprimiert, und der Stamm des Flagella Typs b war das klinische Isolât PSA A447 (GSCOB), welcher das LPS des Fisher-Immunotyps 6 exprimiert. Die humanen Antikörper (0,45 ml) wurden mit den Bakterien (mehr als 5 LD100 in 0,05 ml) vorgemischt und unmittelbar, nachdem die Brandwunde beigebracht war, subeschar inokuliert. Die Resultate der Tierversuche sind in den Tabellen III, IV und V dargestellt.

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RR

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Tabelle ili

Schutzstudie des humanen, monoklonalen Antikörpers 21B8 des Anti-Flagella-Typs-a am Mäusebrand-wundenmodell1 .

Behandlung

% Überlebende am Tag: 1 2 3

>

4

5

6

7

8

9

Mäuse-Anti-Flagella a, FA6

100

100

100

100

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88

88

88

88

HG53

Human-Anti-Flageila b, 21B8

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Human-Anti-Flagella b, 20H11

100

0

0

0

0

0

0

0

0

PBS

100

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12

12

12

12

12

"• Die Mäuse wurden subeschar mit mehr als 5 LD100 P. aeruginosa PSA A522 herausgefordert. 2Die Prozentzahl der Überlebenden basiert auf der Zahl der Mäuse, welche in einer Gruppe von 8 Tieren überlebten. Die Tage sind die Tage nach der Beibringung der Brandwunde und der Herausforderung, bereinigter Antikörper (10 fxg in 0,45 ml PBS) wurde mit den Bakterien vorgemischt und subeschar nach Beibringung der Brandwunde und der Herausforderung verabreicht.

Tabelle IV

Schutzstudie des humanen, monoklonalen Antikörpers 20H11 des Anti-Flagella-Typs-b am Mäusebrand-wundenmodell1

Behandlung

% Überlebende am Tag2 12 3 4

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9

Mäuse-Anti-Flagella b.

100

100

100

100

100

100

100

100

100

PaF4 IVE83

Human-Anti-Flagella b, 20H11

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Human-Anti-Flagella a, 21B8

100

0

0

0

0

0

0

0

0

Medium

80

0

0

0

0

0

0

0

0

1Die Mäuse wurden subeschar mit mehr als 5 LD100 P. aeruginosa PSA A447 herausgefordert 2Dle Prozentzahl der Überlebenden basiert auf der Zahl der Mäuse, welche in einer Gruppen von 8 Tieren überlebten. Die Tage sind die Tage nach der Beibringung der Brandwunde und der Herausforderung. 3Gereinigter Antikörper (10 (xg in 0,45 ml PBS) wurde mit den Bakterien vorgemischt und subeschar nach Beibringung der Brandwunde und der Herausforderung verabreicht. '

Tabelle V

Schutzstudie des humanen, monoklonalen Antikörpers 3CI des Anti-Flagella-Typs-b am Mäusebrandwun-denmodell1

Behandlung % Überlebende am Tag2

1

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4

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8

9

Mäuse-Anti-Flagella b, PaF41VE83

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100

100

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Human-Anti-Flagella b, 3CI

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80

80

80

80

80

80

Nicht spezifischer Anti-LPS monoklonaler Antikörper

100

0

0

0

0

0

0

0

0

1Die Mäuse wurden subeschar mit mehr als 5 LD100 PSA A447 herausgefordert.

2Die Prozentzahl der Überlebenden basiert auf den überlebenden Mäusen in 5 Tiergruppen. Die Anzahl

Tage stellt die Anzahl Tage nach der Verbrennung und der Herausforderung dar.

3Der gereinigte Antikörper (40 jig) wurde intravenös 2 Tage vor der Verbrennung und der Herausforde-

rung verabreicht.

Ein sehr signifikantes Überleben wurde bei Mäusen beobachtet, welche mit dem Anti-Flagella-Typ-a-Antikörper behandelt wurden oder mit den beiden Anti-Flagella-Typ-b-Antikörpern und dann mit dem entsprechenden Antigen herausgefordert wurden. Umgekehrt starben 88 bis 100% der unbehandelten, her18

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ausgeforderten Mäuse oder diejenigen, welche mit einem nicht passenden anti-flagellaren monoklonalen Antikörper oder einem nicht-spezifischen LPS-Antikörper behandelt wurden. Wie mit den monoklonalen Mäuse-Antikörpern (vgl. Beispiel 4) beobachtet wurde, schützen die humanen Anti-Flagella-Antikörper spezifisch gegen die lethale Herausforderung nur gegen Organismen, welche den entsprechenden Flagella-Typ tragen, d.h. gegen humane Antikörper des Anti-Flagella-Typs a, unter der Voraussetzung, dass die lethale Herausforderung mit einem Organismus durchgeführt wurde, welche den Flagella-Typ a aufwies und nicht den Typ b, und dass Mäuse, welche mit Antikörpern des Anti-Flagella-Typs b geschützt wurden, wenn sie mit Stämmen, welche den Flageila-Typ-b aufwiesen, herausfordert wurden, jedoch nicht mit einem Organismus mit dem Typ a.

Beispiel 9

Das Beispiel 9 demonstriert die Kreuzreaktivität von humanen Anti-Flagella-Antikörpern 20H11, 3CI und 21B8 mit klinischen Isolaten von P. aeruginosa.

Klinische Isolate von P. aeruginosa (115), erhalten von Spitälern und Kliniken und die in erster Linie aus Brandwunden und Blut isoliert wurden, wurden mit monoklonalen Mäuse-Antikörpern FA6 IIG5 oder PaF4 IVE8 (vgl. Beispiele 2,3 und 5) als Organismen mit Flagella des Typs a oder b typisiert. 55 der klinischen Isolate wurden als solche identifiziert, welche Flageila des Typs a trugen, indem sie mit dem monoklonalen Mäuse-Antikörper FA6 IIG5 umgesetzt wurden und 59 wurden als dem Typ b zugehörig identifiziert, indem sie mit dem monoklonalen Mäuse-Antikörper PaF4 IVÉ7 identifiziert wurden.

Die Kreuzreaktivität des monoklonalen humanen Antikörpers des Anti-Flagella-Typs-a 21B8 war insofern extensiv, als der Antikörper 54 von 56 klinischen Isolaten, welche den Flagella-Typ-a trugen (96%) erkannte. Die Kreuzreaktivität von 20H11 mit den Isolaten, welche Flagella des Typs b aufwiesen, war ebenfalls insofern extensiv, als das 20H11 sämtliche 59 Isolate (100%) erkannte. Im Gegensatz dazu band der andere monoklonale Antikörper des Anti-Flagella-Typs-b 3Cl nur 43 der 59 Isolate (73%). Diese Resultate zeigen, dass 20H11 an ein pan-reaktives Epitop (d.h. an ein Epitop, welches mindestens bei etwa 95% der P. aeruoinosa-Stämme mit Flagella) gebunden wurde, während sich 3CI an ein Epitop bindet, welches nicht bei allen Typ b-flagellinen Molekülen vorhanden ist. Trotzdem sogar das Antigen des Flagella-Typs-b serologisch einheitlich ist, wenn es mit polyklonalen Antiseren analysiert wird (Lanvi, B., supra und Ansorg, R. supra) zeigen überraschenderweise die Kreuzreaktivitätsmuster von 20H11 und 3Cl, dass der Flagella-Typ-b mindestens zwei separate Epitope aufweist, welche durch monoklonale Antikörper identifiziert werden können.

Die extensive Kreuzreaktivität der Antikörper 21B8 und 20H11 mit klinischen Isolaten von P. aeruginosa zeigt insbesondere die klinische Nützlichkeit dieser Antikörper bei der Immunotherapie von P. aeru-oinosa-lnfektionen.

Beispiel 10

Das Beispiel 10 demonstriert Verfahren für die Herstellung eines anderen exemplarischen humanen monoklonalen Antikörpers, welcher P. aeruginosa des Flagella-Typs-b bindet und ebenso eine Antikörper-Schutzwirkung gegen eine Herausforderung mit P. aeruginosa im Mäusebrandwundenmodell aufweist.

Eine transformierte Zellinie wurde hergestellt und im wesentlichen wie in Beispiel 7 geklont, mit der Ausnahme, dass die transformierte Zellmischung auf 20 96-Loch-Gewebekulturplatten mit einer Konzentration von etwa 2250 E~PBMC pro Loch aufgetragen wurde. Die Überstände wurden zuerst durch ELISA am Flagellaten-Pool getestet, wie beschrieben in Beispiel 6, jedoch mit der Ausnahme, dass die Fisher-Immunotypen 2 und 4-Referenzstämme nicht im Pool vorhanden waren. Anschliessend wurden positive Löcher auf jeden der im Flagellaten-Pool vorhandenen Stamm getestet, einschliesslich auf Fisher-Immunotypen 2 und 4. Die schliesslich isolierte Zellinie und der monoklonale Antikörper (IgG-lsotyp) werden beide im folgenden Text mit der Bezeichnung 12D7 identifiziert.

Der humane monoklonale Antikörper 12D7 zeigte eine extensive Kreuzreaktivität mit Anti-Flagella-Typ-a-lsolaten, erkannte 54 von 56 der getesteten klinischen Isolate, welGhe Flagella des Typs a trugen. Die protektive Aktivität des monoklonalen Antikörpers 12D7 ist in Tabelle VI dargestellt. Die Schutzversuche wurden im wesentlichen wie in Beispiel 4 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Herausforderungsdosis 1 LDioo betrug und der Herausforderungsstamm 1624, ein klinisches Isolât, welches das Fisher-lmmunotyp 2 LPS exprimiert und Flagella-Typ-a war.

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Tabelle VI

Schutzstudie des humanen, monoklonalen Antikörpers des Anti-FIageila-Typs-a 12D7 im Mäusebrandwundenmodell1

Behandlung3

% Überlebende pro Tag2 12 3 4

5

6

7

8

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Human-Anti-Flagella a, 12D7

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Human-Anti-Fisher-2-LPS,

2H9

90

90

90

90

90

90

90

90

90

Mäuse-Anti-Flagella a, 11G5

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Human-Anti-Flagella b, 15F4

O

o

37,5

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25

25

25

25

25

25

1 Die Mäuse wurden subeschar mit mehr als 1 LDioo (950 CFU) von P. aeruginosa I624 herausgefordert. 2Die Prozente der Oberlebenden basieren auf der Zahl der überlebenden Mäuse pro Gruppe von 10 Heren, mit Ausnahme der 15F4-Gruppe wo N=8. Tage sind die Anzahl Tage nach der Beibringung der Brandwunde und der Herausforderung.

bereinigter Antikörper (50 jxg in 0,5 ml PBS) wurde i.p. 2 Std. vor der Verbrennung und der Herausforde-20 rung verabreicht.

Beispiel 11

2_ Das Beispiel 11 demonstriert die Herstellung eines humanen monoklonalen Antikörpers, welcher mit P. aeruginosa des Flagella-Typs-b reaktiv war und den Schutz von Mäusen, die passiv mit diesem Antikörper gegen eine Herausforderung mit P. aeruginosa am Mäusebrandwundenmodell immunisiert waren.

Es wurde eine transformierte Zellinie hergestellt und im wesentlichen wie im Beispiel 10 beschrieben geklont, mit der Ausnahme, dass das Zelltransformationsverhältnis von 1A2 zu B etwa 60*1 betrug und die transformierte Zellinie auf 15 Platten mit einer Konzentration von etwa 1930 E-PBMC pro Loch aufgetragen wurde. Ebenfalls wurden die Zellen an einem Pool von P. aeruainosa-Stämmen. welche G98 (Fisher-Immunotyp 3, Flagella-Typ-a) und 1739 (ein klinisches Isolât des Fisher-Immunotyps 5, Flagella-Typ b) enthielt, getestet und an einem anderen Pool, welcher die P. aeruginosa-Stämme 1277, G98,1739 und die Fisher-Immunotypen F2, F4, F6 und F7 enthielt, bestätigt. Die zuletzt isolierte Zellinie und der ausgeschiedene monoklonale Antikörper (IgGt-lsotyp) werden beide im folgenden Text mit der Bezeichnung 2B8 identifiziert.

Es wurde mit 2B8 ein Immunofluoreszenz-Test durchgeführt, welcher am Flagella-Typ-b (Fisher-Immu-notyp 2)-Stamm positiv war, jedoch am Flagella-Typ-a (Fisher-Immunotyp 4)-Referenzstamm negativ war. Beim Testen der klinischen Isolate waren 59/59 (100%) der Flagella-Typ-b-lsolate positiv.

Die protektive Aktivität von 2B8 ist in der Tabelle VII dargestellt. Die protektiven Studien wurden wie In Beispiel 10 beschrieben durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das klinische Isolât F164 (Fisher-lmmu-notyp 4, Flagella-Typ-b) für die Herausforderung verwendet wurde.

Tabelle VII

45 Schutzstudie des humanen, monoklonalen Antikörpers des Anti-Flagella-Typs-b 2B8 am Mäusebrandwundenmodell

Behandlung % Überlebende pro Tag2

1

2

3

4

5

6

7

8

9

50

Human-Anti-Flagella b, 2B83

100

89

89

89

89

89

89

89

89

Mäuse-Anti-Flagella b, PaF4

IVE84

100

100

100

100

100

100

90

90

90

Mäuse-Anti-Fisher 2 LPS,

55

VH34

90

20

20

20

20

20

20

20

20

1Die Mäuse wurden subeschar mit 1 LDioo (105 CFU) von P. aeruginosa F164 herausgefordert.

2Die Prozente der Überlebenden basieren auf der Anzahl Mäuse welche pro Gruppe von 10 Mäusen überlebten, mit der Ausnahme, dass in der 2B8-Gruppe N=9 war. Die Tage sind vom Zeitpunkt der Ver-60 brennung und der Herausforderung angerechnet.

bereinigter Antikörper (50 p.g in 0,5 ml PBS) wurde i.p. 2 Std. vor der Verbrennung und der Herausforderung verabreicht.

bereinigter Antikörper (5 ng in 0,5 ml PBS) wurde i.p. 2 Std. vor der Verbrennung und der Herausforderung verabreicht.

65 — — ————

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10

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35

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Beispiel 12

Das Beispiel 12 demonstriert die Herstellung eines anderen humanen monoklonalen Antikörpers, der mit Flagella-Typ-b P. aeruginosa reagiert und den Schutz von Mäusen, die passiv mit diesem Antikörper immunsieri: worden waren, gegen eine Infektion mit P. aeruginosa im Mäusebrandmodell.

Eine transformierte Zellinie wurde im wesentlichen, wie im Beispiel 7 beschrieben, hergestellt und klo-niert, aber mit folgenden Ausnahmen. Ein anderes Individuum wurde immunisiert (Pier et al., (1984) 45: 309) und diente als B-Zellquelle und das Beschickungsniveau von E-PBMC war etwa 2000 Zellen pro Vertiefung. Das Screening wurde auf vereinigten Fisher 1-7 Immunotypen durchgeführt. Die schliesslich isolierte Zellinie und der ausgeschiedene Antikörper (IgGMsotyp) werden beide im folgenden Text mit 14CI bezeichnet.

Im klinischen Test zeigten 59/59 (100%) der Flagella-Typ-b-lsolate positive Reaktion mit 14CI. Die Studien zur Schutzwirkung wurden wie im Beispiel 11 durchgeführt und sind in Tabelle VIII dargestellt.

Tabelle VIII

Studie über die Schutzwirkung von Anti-Flagella-Typ-b monoklonalem Human-Antikörper 14CI im Mäusebrandmodell1

Behandlung3

% Überlebende pro Tag2 12 3 4

5

6

7

8

9

Human-Anti-Flagella b, 14CI

100

100

100

100

100

90

90

90

90

Mäuse-Anti-Flagella b, PaF4

IVE8

100

100

100

100

100

100

100

100

100

Human-Anti-Fisher2 LPS,

VH3

100

40

20

20

20

20

20

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Die Prozentanteile beruhen auf dem Überleben der Mäuse in Gruppen an 10 Tieren mit Ausnahme der PaF4 1VE8-Gruppe, in welcher nur 9 Tiere vorhanden waren. Die angegebenen Tage sind nach Verbrennung und Infektion.

bereinigter Antikörper (50 [ig in 0,5 ml PBS) wurde i.p. 2 Std. vor Verbrennung und Infektion verabreicht.

Dem Vorangehenden kann entnommen werden, dass die Zeilinien der vorliegenden Erfindung ein Mittel sind für die Herstellung monoklonaler Antikörper und Fragmente davon, die mit P. aeruginosa flagella reagieren und auch Kreuzschutz gegen verschiedene P. aeruainosa-Stämme bieten. Uberraschenderweise wurde eine Anzahl monoklonaler Antikörper isoliert, die mit verschiedenen Epitopen auf jeden Flagella-Typ reagierten. Die Antikörper der vorliegenden Erfindung erlauben eine wirtschaftlichere und einfachere Produktion prophylaktischer und therapeutischer Zusammensetzungen, die zur Bekämpfung der meisten P. aeruginosa-lnfektionen eingesetzt werden können. Im weiteren liefern die Zeilinien Antikörper, die in Immunoassays und anderen bekannten Verfahren verwendbar sind.

Obschon die vorliegende Erfindung zum Zweck der besseren Verständlichkeit ziemlich detailliert dargestellt wurde, ist es selbstverständlich, dass gewisse Änderungen im Rahmen der Ansprüche möglich sind,

Claims (1)

1. Patentansprüche

   1. Monoklonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon, dadurch gekennzeichnet, dass er fähig ist, spezifisch mit Pseudomonas aeruoinosa-Bakterien-Flaoellen zu reagieren und in vivo gegen die genannten Bakterien protektiv ist.

   2. Monoklonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der monoklonale Antikörper human ist.

   3. Monoklonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er mit einem Epitop, welches auf den Flagellen des Typs a oder b, jedoch nicht auf beiden vorhanden ist, reaktiv ist.

   4. Monoklonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop mindestens bei etwa 70% der Flagellen des Typs b vorhanden ist.

   5. Monoklonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass er fähig ist, die Bindung zum Epitop von monoklonalen Antikörpern zu blockieren, welche durch die Zeilinien mit den Hinterlegungsnummem ATCC HB9129, HB9130, CRL9300, CRL9301, CRL9422, CRL9423 und CRL9424 produziert werden.

   6. Monoklonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon gemäss Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Epitop nur beim Flagella-Typ b ausgebildet ist.

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   CH677 796A5

   7. Monoklonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass er pan-reaktiv ist.

   8. Monoklonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon gemäss Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass er mit einem Label konjugiert ist, das ein nachweisbares Signal bewirkt.

   9. Monoklonaler Antikörper oder Bindungsfragment davon gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Label ein Fluoreszenz-Marker oder ein Enzym darstellt.

   10. Zellinie zur Herstellung monoklonaler Antikörper gemäss Anspruch 1, welcher Antikörper spezifisch mit einem Pseudomonas aeruainosa-Flaaellum-Tvp a oder Typ b reagieren kann.

   11. Zellinie gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Hybridzellinie ist.

   12. Zellinie gemäss Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen humanen, monoklonalen Antikörper produziert.

   13. Zellinie gemäss Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass sie die Hinterlegungsnummer ATCC HB9129, HB9130, CRL9300, CRL9301, CRL9422, CRL9423 oder CRL9424 aufweist.

   14. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen monoklonalen Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 aufweist.

   15. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie auch ein antimikroblelles Mittel und eine humane Gammaglobulin-Fraktion enthält.

   16. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist und die humane Gammaglobulin-Fraktion einen erhöhten Gehalt an Immunoglobulinen aufweist, die mit Pseudomonas aeruginosa und/oder Produkten davon reaktiv sind.

   17. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie mindestens zwei monoklonale Antikörper gemäss einem der Ansprüche 1 bis 9 enthält, wovon jeder mit einem unterschiedlichen Typ von flagellarem Protein von Pseudomonas aeruginosa reagiert und welcher fähig ist, Pseudomonas aeruoinosa-lnfektionen zu behandeln oder zu verhüten.

   18. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass mindestens einer der monoklonalen Antikörper ein humaner, monoklonaler Antikörper ist.

   19. Pharmazeutische Zusammensetzung gemäss Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass sie auch einen humanen, monoklonalen Antikörper enthält, welcher mit mindestens einer serotypischen Determinante eines Liposaccharid-Moleküls von Pseudomonas aeruginosa und/oder einem monoklonalen Antikörper, welcher mit Exotoxîn A reaktiv ist, reagieren kann.

   20. Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart von Pseudomonas aeruginosa in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einem monoklonalen Antikörper gemäss Anspruch 1 kombiniert wird, welcher mit Pseudomonas aeruainosa-Flaoellen reaktiv ist und die Komplexbildung nachgewiesen wird.

   21. Reagentiensatz zur Durchführung des Verfahrens gemäss Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der Reagentiensatz folgende Komponenten enthält:

   - eine monoklonale Antikörperzusammensetzung, welche mindestens einen monoklonalen Antikörper nach einem der Ansprüche 1 bis 9 enthält, welcher mit einem typenspezifischen, flagellaren Protein des Bakteriums reaktiv ist, und

   - Labels für nachweisbare Signale, welche kovalent an den genannten Antikörper oder an zweite Antikörper, welche mit jedem der genannten monoklonalen Antikörper reaktiv sind, gebunden sind.

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