SE506421C2 - Monoklonala antikroppar mot Pseudomonas aeruginosa och beredningar innehållande dessa, testsats innehållande beredningen, samt cellinjer uttryckande antikropparna - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 35 506 421 l--J byggande atgärder och behandling.

En metod som har beaktats är förstärkning av värddjurets immunsvstem genom aktiv eller passiv immunisering. Sa exempelvis har det konstaterats att aktiv immunisering av människa eller försöksdjur med bakteriella helcells- vacciner eller renade bakteriella endotoxiner fran Q. aeruginosa leder till utvecklingen av specifika opsoniska antikroppar riktade primärt mot determinanter pa de ater- kommande oligosackarid-enheterna i de lipopolysackarid- (LPS)-molekyler som är lokaliserade pa det yttre cell- aeruginosa (se Pollack, M., Immunoglobu- lins: Characteristics and Uses of Intravenous Prepara- Alving, B.M. 79, U.S. Department of Health and Human Services, 1979). membranet av E. tions, och Finlayson, J.S., red., sid. 73- Dylika antikroppar har, vare sig de har alstrats aktivt eller överförts passivt, visat sig skydda mot de letala verkningarna av en E. aeruginosa-infektion i en mangfald och vid vissa preliminära L.5. och Pollack, 119- djurmodeller (Pollack, sugra) undersökningar med människor (gg Young, M., Pseudomonas aeruginosa, Sabath, L., red. sid. 32, Hans Huber, 1980).

Ovan angivna rapporter visar att immunoterapeutiska metoder skulle kunna utnyttjas för att förebygga och be- handla bakteriesjukdomar orsakade av E. aeruginosa, sasom genom administrering av poolade humanimmunoglobuliner, vilka innehaller antikroppar mot den infekterande stammen eller de infekterande stammarna. Humanimmunoglobuliner definieras i föreliggande sammanhang som den del a. fraktionerad humanplasma som är anrikad pa antikroppar, bland vilka finns representerade specifika antikroppar mot stammar av E. aeruginosa. Till följd av vissa inneboende begränsningar vid användning av humanimmuno- globulinkomoonenter är fortfarande denna metod för be- handling av sjukdomar orsakade av E. aeruginosa föremal 10 15 20 25 30 35 soaí421 för undersökning (se exemgelvis Collins, M.S. och Roby, R.E., Am. J. Med., 7ó(3A): 168-174, (1984), och för närvarande finns icke nagra kommersiella produkter till-t;¿ gängliga som utnyttjar dessa komponenter.

En sadan begränsning förknippad med immunoglobulinbered- ningar är att de utgörs av pooler av prov fran ett tusen- _ tal eller flera donatorer, vilka prover har valts ut i förväg med avseende pa närvaron av speciella anti-Pseudofl monas-antikroppar. Denna poolning leder till en Å medelvärdestiter av individuella antikroppstitrar, vilket” som bäst resulterar i mattliga ökningar i den resulterande titern av de önskade antikropparna.

En annan begränsning är att själva preselektionsprocessen kräver dyrbar kontinuerlig "screening" av donatorpoolen för att ombesörja jämn produktkvalitet. Trots dessa an- strängningar kan immunoglobulinprodukter fortfarande uppvisa avsevärda variationer fran sats till sats och bland produkter fran olika geografiska omraden.

Ytterligare en sadan begränsning som är inneboende hos immunoglobulinberedningar är att deras användning W resulterar i samtidig administrering av stora mängder avv främmande proteinartade substanser (som kan innefatta I virus sasom de vira som nyligen har visat sig vara associerade med förvärvat immunbristsvndrom <ê:quired lmmune Deficiencv Syndrome eller AIDS), med potential att astadkomma ogynnsama biologiska verkningar.

Kombinationen av laga titrar av önskade antikroppar och en hög halt av frammande substanser kan ofta begränsa, till suboptimala nivaer, den mängd av specifika och saledes gvnnsama immunoglobuliner som kan administreras till patienten. År 197? rapporterades Hohler och Milstein sin seminal- 10 15 20 25 30 35 506 421 upptäckt att vissa muscellinjer kunde sammansmältas (fusioneras) med musmjältceller för skapande av hybridom, som vart och ett skulle kunna utsöndra antikroppar med en enda specificitet, d.v.s. monoklonala antikroppar (Hohler, G. och Milstein, C., Nature, 256:495-497 (1975)).

Med tillkomsten av denna teknologi blev det möjligt att i vissa fall framställa stora mängder av ytterst specifika murinantikroppar mot en speciell determinant eller determinanter pa antigener. Därefter blev det under användning av senare utvecklad teknik möjligt att framställa monoklonala humanantikroppar (se exempelvis U.S. 4,464,4ó5, som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill).

Det inses att i vissa situationer monoklonala musantikroppar eller beredningar av dylika antikroppar kan medföra problem vid användning pa människa. Sa exempelvis har det rapporterats att monoklonala musanti- ákroppar, som har använts vid försöksundersökningar för behandling av vissa humansjukdomar, kan framkalla ett immunsvar som gör dem ineffektiva (Levy, R.L., and Miller, R.A., Ann. Rev. Med., 34: 107-116 (1983)). Med nyligen gjorda framsteg inom rekombinant DNA-teknologi, sasom framställning av chimera monoklonala mus/human-anti- kroppar, kan dessa problem emellertid elimineras. Metoder för framställning av monoklonala humanantikroppar är ocksa nu tillgängliga (se, Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman, 5.6., et al., red., Plenum Publishing Corp. (1985), som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill).

Under användning av hvbridom- och/eller celltransforma- tionsteknik har ett antal grupper rapporterat framställ- ningen av monoklonala antikroppar, som skyddar mot E. aeruginosa-infektioner. Monoklonala antikroppar har framställts, vilka är reaktiva med avseende pa olika 10 15 20 25 30 35 SÛ6421 Ul epitoper av fi. aerugihosa, innefattande specifika enkel- å och multipelserotyp-vtepitoper. sasom det som aterfinns 1:, LPS-molekuler hos bakterier (se exempelvis de amerikanska: patentansökningarna 734,624 och 807,394, vilka bada införf livas med denna beskrivning genom hänvisning därtill).

Man har även framställt protektiva monoklonala anti- kroppar, som är specifika med avseende pa E. ag¿gg¿ggga; ß -exotouin A (se exempelvis den amerikanska patentansök- ningen 742,l70, som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill).

Ehuru användning av monoklonala antikroppar, som är specifika med avseende pa LPS-regionen av E. aergginosa eller bakteriernas exotoniner, kan tillhandahalla till- räckligt skydd i vissa situationer, är det i allmänhet föredraget att ha bredare skyddsmöjlighet. Sa exempelvis skulle det vid profylaktiska behandlingar med avseende pa potentiella infektioner hos människa vara föredraget att administrera en antikropp eller antikroppar protektiva mot en mangfald E. aeruginosa-stammar. Likaledes skulle det vid terapeutiska tillämpningar, där serotypen eller serotyperna av den infekterande stammen respektive de infekterande stammarna ej är känd (a), vara föredraget att administrera en antikropp eller en kombination av antikroppar, som är effektiva mot de flesta, om ej alla, av de kliniskt viktiga E. aeruginosa-serotyperna. Det 7 idealiska skulle vara att tillhandahalla antikroppar, som är reaktiva oberoende av traditionella serotvpnings- scheman.

En aspekt av E. aeruginosa-fysiologin, som har visat sig, bidra till organismens virulens, är motiliteten, en för- maga som härrör huvudsakligen fran närvaron av en flagell Infect. and lmmun., 38:l29b-1298). E. aeruginosa utmärksï 10 15 20 25 30 35 506 421 av att uppvisa en enda flagell i ena anden av sin stavfor- made struktur. Modellstudier med branda möss har visat att en större procentuell andel möss överlevde när icke- -mobila E. aeruginosa-stammar ympades i försöksbränn- skador an när mobila stammar användes. (McManus, A. et al. (1980), Burns, 6: 235-239 och Nontie. T.. et al. (1982), Infect. and Immun., §§:1296-1298). ändra under- sökningar avseende patogenesen av E. aeruginosa har visat att djur, som har immuniserats med flagellantigen- beredningar, skyddades da det brändes och infekterades med mobila stammar av bakterierna (gg, Holder, I. et al. (1982), lnfect. and Immun., 35: 276-280).

Vad som är viktigt är att E. aeruginosa-flageller har studerats medelst serologiska metoder och har rapporterats falla inom tva antigeniska huvudgrupper. som betecknas H1 och H2 av E. Lanyi (1970, Acta Microbiol.

Acad. Sci. Hung.. 17: 35-48) och typ a och typ b av Ansorg, R. (1978, Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Ürig. A, 242:228-238). Serologisk typning av flageller av bada laboratorierna visade att Q;-flageller (Lanyi. B., sugra) eller flageller av typ b (Ansorg. R., sugra) var serologiskt homogena, d.v.s. nagra undergrupper har icke identifierats. Denna serologiskt homogena flagelltyp be- tecknas i det följande som typ b. Det andra huvud- antigenet, H2 (Lanyi. B.. ggggg) eller flagell av typ a (Qnsorg, R., sugra). innehöll fem undergrupper. Detta antigen betecknas i det följande som flagell av typ a och de fem undergrupperna som as, a,, az, as och aa. De fem undergrupperna av typ a uttrycks i varierande kombina- tioner hos olika stammar av E. aeruginosa. som uppbär typ a, med undantag av antigenet ao. Antigenet ao aterfanns pa alla flageller av typ a. ehuru graden av dess expression varierade bland stammarna. väfmê- m I-l 'Û TJ Ij| ll |U Ett serotvoningsschema. som baserar 10 15 20 25 30 35 506 421 stabila somatiska huvudantigenerna av E. aeruginosa, betecknas som Habs-schemat. vilket nyligen har införlivats med schemat tillhörande the International Antigenic Typing System (se Liu, Int. J. Syst. Bacteriol., 33:256 (1983).) Flagelltyperna av Habs-referensstammarna av fi. aeruginosa har karakteriserats medelst immunofluor- escens med polyklonala sera av R. Ansorg (1978, Zbl.

Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A, 242: 228-238) eller genom 1984, Q.

Clin. Hicrobiol., 20:84-BB). Habs-stammarna 2. 3, 4, 5, objektglas-coagglutination (Ansorg, R. et al., ll och 12 ar stammar. som uppbär flageller av typ¿ b, och Habs-stammarna 1, 6, 8 och 9 uppbär flageller av typ a. Ett stort antal av stammarna av E. aeruginosa skulle saledes kunna kännas igen av ett litet antal monof Vklonala antikroppar, som är specifika med avseende pa flagellära proteiner.

Följaktligen föreligger ett signifikant behov av monoklo+ _nala antikroppar med förmaga att reagera med epitoper pa¿ flagellära proteiner och i vissa fall även med förmaga att tillhandahalla skydd mot multipla serotyper av E. aeruginosa. Vidare skulle vissa av dessa antikroppar vara lämpliga för användning vid profylaktisk och terapeutisk behandling av E. aeruginosa-infektioner liksom vid diagnos av dylika infektioner. Föreliggande uppfinning fyller dessa behov.

SAMMQNFATTNING QV UPFFINNINGEN Nya cellinjer tillhandahalles, vilka kan producera monoklonala antikroppar med förmaga att binda till flageller närvarande pa de flesta stammar av E. aeruginosa-bakterier. De monoklonala antikropparna reagerar specifikt med epitoper pa flagellproteiner hos E. aeruginosa och kan skilja mellan flageller av typ a 10 15 w' 25 30 35 506 421 och typ b hos bakterierna. Vidare tillhandahalles ett sätt att behandla en människa, som är utsatt för infek- tion av eller redan är infekterad med E. aeru inosa, genom administrering av en profylaktisk eller terapeutisk mängd av en beredning, som innehaller minst en monoklonal antikropp eller bindningsfragment därav med förmaga att reagera med flagellerna hos E. aeruginosa-stammar, varvid beredningen företrädesvis även innefattar en fysiologiskt godtagbar bärare. Beredningen kan även innehalla en eller flera av följande: ytterligare monoklonala antikroppar med förmaga att reagera med E. aggggiggäa-exotoxin A; monoklonala antikroppar med förmaga att reagera med serotyp-determinanter pa LPS av E. aeruginosa; en gamma- globulinfraktion fran humanblodplasma; en gamma-globulin- fraktion fran humanblodplasma, där plasman kan erhallas fran människor som uppvisar förhöjda nivaer av immuno- globuliner reaktiva med E. aeruginosa; och ett eller flera antimikrobiella medel. Vidare tillhandahalles fram- ställning av diagnostiska testsatser.

BESKRIVNING AV DE FÖREDRQGNA UTFÖRINGSFÜRMERNA I enlighet med föreliggande uppfinning tillhandahalles nya celler med förmaga att producera monoklonala antikroppar och beredningar, som innefattar dylika anti- kroppar, vilka beredningar selektivt kan känna igen de aeruginosa- varvid individuella antikroppar typiskt känner flageller som är närvarande pa en mangfald E. -stammar, igen en typ av E. aggggiggga-flageller. Föreliggande celler har identifierbara kromosomer, där mikroblinje-DNA fran dem eller en förstadiecell har omlagrats för kodning av en antikropp med ett bindningsställe för en epitop pa ett flagellärt protein, som är gemensam för vissa E. aeruginosa-stammar. För flagellara proteiner av typ a kan pan-reaktiva monoklonala antikroppar framställas; och för flagellära proteiner av typ b innefattas antikroppar. 10 15 20 25 30 35 506» 421 som är pan-reaktiva eller reagerar med minst cirka 70% av de flagellbarande stammarna. Dessa monoklonala anti- 7 kroppar kan användas pa en mangfald olika satt inne¥attan4 de diagnos och terapi.

De monoklonala antikroppar som tillhandahalls pa detta sätt är speciellt användbara vid behandling eller profylax av allvarliga sjukdomar orsakade av &. aeruginosa. aerugi~ Qgâå är tillgängliga 4ör direktkontakt med antikroppmole- Ytproteinerna pa flagellerna av E. kylerna, vilket saledes troligen skulle inhibera motili- teten hos organismen och/eller underbygga andra verkningfi ar som är gynnsamma {ör de infekterade varddjuren.

Framställningen av monoklonala antikroppar kan astad- kommas genom immortalisering av en cellinje med förmaga att uttrycka nukleinsyrasekvenser, som kodar för anti- kroppar, vilka är speci¥ika för en epitop pa de +lagellära proteinerna hos multipla stammar av E. aerugi- nosa. Den immortaliserade cellinjen kan vara en daggdjursr cellinje, som har transformerats genom onkogenes, genom trans4ektion, mutation eller liknande. Dylika celler inne~ fattar myelomlinjer, lym+omlinjer eller andra cellinjer med förmaga att underbygga eupressionen och utsöndringen av immunoglobulinet eller bindningsfragment därav LQ vitro. Immunoglobulinet eller fragmentet därav kan vara ett naturligt förekommande immunoglobulin fran ett annat däggdjur an de föredragna mus- eller humankallorna, som zroduceras genom trans¥ormation av en lymíocyt, speciellt en eplenocyt, med hjälp av ett virus eller genom samman- emaltning av lym4ocyten med en neoplastisk cell. exempelvis ett myelom, ¥ör framställning av en hybridcell- linje. erhalles splenocyten fran ett djur, som Typiskt har immuniserats mot flagellära antigener eller ¥ragment:= därav innehallande ett eoitopiekt ställe. lmmuniserings~ 10 15 20 25 30 35 506 421 10 protokoll är väl kända och kan variera avsevärt men ända vara effektiva. (se, Golding, Nonoclonal Antibodies: Principles and PracticgL Academic Press, N.Y. (1983), som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.) Hybridcellinjerna kan klonas och underkastas screening i enlighet med konventionell teknik och antikroppar i de överliggande cellvätskorna kan pavisas, vilka har för- maga att binda till flagellära E. aeruginosa-determinan- ter. De lämpliga hybridcellinjerna ifraga kan därefter fa växa i storskalig kultur eller injiceras i peritonealhalan hos ett lämpligt värddjur för produktion av askites- vätska.

Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning är cellerna transformerade humanlymfocyter, som producerar monoklonala humanantikroppar, företrädesvis protektiva ig ¿¿¿g, mot tillgängliga epitoper, som är specifika för minst ett flagellärt protein. Lymfocyterna kan erhallas fran humandonatorer, som är exponerade för eller har exponerats för de lämpliga flagellbärande stammarna ifraga av E. aeruginosa. En föredragen cellstyrd trans- formationsprocess beskrivs i detalj i U.S. 4,4ó4,4ó5, som införlivas härmed genom hänvisning därtill.

Genom tillgangen till antikropparna enligt föreliggande uppfinning, vilka är kända att vara specifika för de flagellära proteinerna, kan i vissa fall de överliggande vätskorna vid efterföljande försök underkastas screening vid en konkurrensanalys med föreliggande monoklonala anti- kroppar som ett medel att identifiera ytterligare exempel pa anti-flagellära monoklonala antikroppar. Saledes kan hybridcellinjer lätt framställas fran en mangfald källor baserad pa tillgängligheten hos föreliggande antikroppar, som är specifika för speciella flagellära antigener. 10 15 20 25 30 35 _vilka är kända för varje djurart. ses, ll När hybridcellinjer är tillgängliga, som producerar antij kroppar specifika för föreliggande epitopiska ställen, kan alternativt dessa hybridcellinjer sammansmältas med andra neoplastiska B-celler, där dylika B-celler kan tjäna som recipienter för genomisk DNA, som kzdar för i synnerhet receptorerna. Ehuru neoplastiska gnagar-, rattdjur-B-celler är det som vanligen utnyttjas, kan andra däggdjursarter användas, sasom hardjur, nötkreatur, far, häst, svin, fagel eller liknande.

De monoklonala antikropparna kan tillhöra vilken som helst av immunoglobulinklasserna eller- underklasserna, sasom Igfi, IgD, Igâ, IgE, eller underklasser av IgG, I allmänhet kan de monoklonala antikropparna användas intakta eller som sasom Fv, Fab, F(ab*)2, bindningsfragment, men vanligt- vis intakta.

Cellinjerna enligt föreliggande uppfinning kar finna annan användning än för direkt framställning av de mono-f klonala antikropparna. Cellinjerna kan sammansmältas medå andra celler (sasom pa lämpligt sätt läkemedels-märkt Ü humanmyelom, musmvelom eller lymfoblastoida hcmanceller)m för framställning av hybridom och saledes tillhandahallaä transferering av de gener som kodar för de monoklonala anti-i kropparna. Alternativt kan cellinjen användas som en kälia till de kromosomer som kodar för immunoglobulznerna, ä W vilka kan isoleras och överföras till celler medelst annan teknik än fusion. Vidare kan de gener som kodar för de monoklonala antikropparna isoleras och användas i å enlighet med rekombinant DNA-teknik för framstå lning avf f det specifika immunoglobulinet i en mangfald -ärddjur. q Genom preparering av CDNA-bibliotek fran budtarar-RNA kan speciellt en enda cDNA-klon isoleras, vilken Lodar för V immunoglobulinet och är fri fran introner, oc* införas tå» 421 10 15 20 25 30 35 506 421 12 lämpliga prokaryotiska eller eukaryotiska expressions- vektorer och därefter transformeras till ett värddjur för (se allmänt, U.S. 4,172,124; och 4.423,147. slutlig bulkframställning 4,350,ó83; 4,363,799; 4,38l,292; Se även, Kennett et Monoclonal Antibodies, Plenum, New York (1980) al., och däri angivna hänvisningar, vilka samtliga införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.) I enlighet med hybrid-DNA-teknologi kan närmare bestämt immunoglobulinerna eller fragmenten enligt föreliggande uppfinning framställas i bakterier eller jäst. (Se, Boss, et al., Nucl. Acid. Res., 12:E791 och Wood et al., Nature 314:44ó, vilka bada införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.) Sa exempelvis kan budbärar- -RNA, som transkriberas frän de gener som kodar för de lätta och tunga kedjorna av de monoklonala antikroppar som produceras av en cellinje enligt föreliggande upp- finning, isoleras medelst differentiell cDNA-hybridisering under utnyttjande av cDNA fran andra BALB/c-lymfocyter än föreliggande klon. mRNQ, som ej hybridiserar, är rik pa de meddelanden som kodar för de önskade immunoglobulin- kedjorna. Allt efter behov kan denna process upprepas för att ytterligare öka de önskade mRNA-nivaerna. Den avdragna mRNA-beredningen kan därefter transkriberas omvänt för tillhandahallande av en cDNA-blandning, som är anrikad med avseende pa de önskade sekvenserna. RNA kan därefter hydrolyseras med en lämplig RNase och ssDNA kan dubbelsträngas med DNA-polymeras I och slumpinitiatorer, exempelvis slumpartat fragmenterad kalvtvmus-DNA. Den resulterande dsDNA kan därefter klonas genom införande i en lämplig vektor, exempelvis virus-vektorer sasom lambda- pACYCl84. -gfir -vektorer eller plasmid-vektorer (sasom pBRu¿_. etc.). Genom att framkalla prover baserade pa kända sekvenser för de konstanta regionerna av de lätta och tunga kedjorna kan sadana cDNA-kloner som innehaller den gen 10 15 20 25 30 35 5o6§421 som kodar för de önskade lätta och tunga kedjorna identi-f fieras genom hybridisering. Därefter kan generna utskärafi fran plasmiderna, manipuleras för avlägsnande av över- : flödig DNA uppströms om initieringskodonen eller konstant region-DNQ och därefter införas i en lämplig vektor för 7 transformation av en värdcell och slutligen expression av genen.

Lämpligen kan värddäggdjursceller (exempelvis musceller)~*“ användas för bearbetning av kedjan (exempelvis förena det tunga och lätta kedjorna) för framställning av ett intakf immunoglobulin och vidare utsöndra immunoglobulinet fritt fran ledarsekvensen. om sa önskas. Alternativt kan man V använda encelliga mikroorganismer för framställning av dee tva kedjorna, där ytterligare manipulation kan krävas föru att avlägsna de DNA-sekvenser som kodar för den sekret.riska ledaren och processignaler under det att de- tillhandahaller en initieringskodon vid 5'-änden av den Ä sekvens som kodar för den tunga kedjan. Fä detta sätt kan immunoglobuliner framställas och bearbetas sa att de kan; sammanföras och glykosyleras i andra celler än däggdjursfi celler. Dm sa önskas kan var och en av kedjorna trunkerasš sa att de bibehaller atminstone den variabla regionen, å vilken därefter kan manipuleras för tillhandahallande av andra immunoglobuliner eller fragment, som är specifika för flagellat-epitoperna.

De monoklonala antikropparna enligt föreliggande upp- finning är speciellt användbara pa grund av sin specifici* tet för antigener hos praktiskt taget alla för närvarandev aeruginosa-varianter. antikropparna är dessutom protektiva Lg vivo, kända E. Vissa av de monoklonala vilket medger införlivande därav med farmaceutiska produkter, sasom antikroppkombinationer för bakterieinfektioner.

Monoklonala antikroppar enligt föreliggande uppfinning kan 10 15 20 25 30 35 506 421 14 även finna vidsträckt användning ig vitro. Sa exempelvis kan de monoklonala antikropparna användas för typning av mikroorganismer. för isolering av specifika E. aeruginosa- för selektivt avlägsnande av E. -stammar, aeruoinosa- -celler i en heterogen blandning av celler eller liknande.

För diagnostiska ändamal kan de monoklonala antikropparna antingen vara märkta eller omärkta. Typiskt innefattar diagnostiska analysmetoder detektering av bildningen av ett komplex genom bindning av den monoklonala antikroppen till flagellen hos E. I omärkt aeruginosa-organismen. form finner antikropparna användning vid agglutinations- -analyser. Vidare kan omärkta antikroppar användas i kom- bination med andra märkta antikroppar (sekundära anti- kroppar), som är reaktiva med den monoklonala anti- kroppen, sasom antikroppar specifika för immunoglobulin.

Alternativt kan de monoklonala antikropparna märkas direkt. En mangfald markörer kan användas, sasom radio- nuklider, fluorescerande medel, enzymer, enzymsubstrat, encym-cofaktorer, enzym-inhibitorer, ligander (speciellt haptener), etc. Talrika typer av immunoanalysmetoder finns tillgängliga och som exempel härpa hänvisas till de ameri- kanska patentskrifterna 3,B17,827, 3,8SO.752. 3.901.654, 3, 35,074, 3,?84,S33, 3,996,345, 4,034,074 och 4,098,B76, vilka samtliga införlivas med denna beskrivning genom hän- visning därtill.

Vanligen utnvttjas de monoklonala antikropparna enligt föreliggande uppfinning vid enzvm-immunoanalys. där före- liggande antikroppar eller sekundära antikroppar fran en annan art konjugeras till ett enzym. När ett prov. som innehaller E. aeruginosa av en viss serotyp, sasom human- blod eller lysat därav. kombineras med föreliggande anti- kroppar inträder bindning mellan antikropparna och de molekyler som uppvisar den önskade epitopen. Dwlika celler kan därefter separeras fran icke-bundna reagens 10 15 20 25 30 35 5o@ 421 och en sekundär antikropp (märkt med ett enzym) till- sättas. Därefter bestämmes närvaron av det antikropp- -enzym-konjugat som är specifikt bundet till cellen.

Annan konventionell teknik, som är välkänd för fack- mannen, kan även utnyttjas.

Testsatser kan även tillhandahallas för användning med föreliggande antikroppar för att pavisa E. aeruginosa i lösningar eller närvaron av flagellära E. ag;gQ¿gg§a-ant¶- gener. Saledes kan föreliggande monoklonala antikropp- Å beredning enligt föreliggande uppfinning tillhandahällasl vanligen i lyofiliserad form, antingen separat eller till sammans med ytterligare antikroppar, som är specifika med avseende pa andra gram-negativa bakterier. Antikropparna,,, som kan vara konjugerade till en markör eller vara okonjugerade, ingar i testsatserna med buffertämnen, sasom Tris, fosfat, karbonat, etc, stabiliseringsmedel, biocider, inerta proteiner, exempelvis bovinserumalbuming eller liknande.

I allmänhet är dessa material närvarande¿ i en mängd mindre än cirka 5 vikt%, räknat pa mängden av: aktiva antikropp, och är vanligen närvarande i en total mängd av minst cirka 0,001 viktï, anyo räknat pa anti- kroppskoncentrationen. Ofta är det önskvärt att inför- liva ett inert utdrygningsmedel eller excipient för ut- spädning av de aktiva bestandsdelarna, varvid excipienten kan vara närvarande i en mängd fran cirka 1 till 99 viktfl av den totala beredningen. När en sekundär antikropp medq förmaga att binda till den monoklonala antikroppen använ- des, är denna vanligen närvarande i en separat ampull. Den; sekundära antikroppen är typiskt konjugerad till en markör och bereds pa ett sätt analogt med ovan beskrivnaw antikroppsberedningar.

De monoklonala antikropparna, speciellt monoklonala humanantikroppar, enligt denna uppfinning kan även införfi livas som komponenter i farmaceutiska beredningar, vilkas 10 15 20 25 30 35 506 421 16 innehaller en terapeutisk eller profylaktisk mängd av minst en av de monoklonala antikropparna enligt denna upp- En farma- finning och en farmaceutiskt effektiv bärare. ceutisk bärare bör vara en kompatibel ogiftig substans, som är lämplig för administrering av de monoklonala anti- kropparna till patienten. Sterilt vatten. alkohol, fetter, växer och inerta fasta ämnen kan användas som bärare. Farmaceutiskt godtagbara adjuvantia (buffert- medel, dispergeringsmedel) kan även införlivas med den farmaceutiska beredningen. Dylika beredningar kan inne- halla en enda monoklonal antikropp, som är specifik för stammar av en flagellär typ av E. aeruginosa. Alternativt kan en farmaceutisk beredning innehalla tva eller flera monoklonala antikroppar för bildning av en "cocktail". Sa exempelvis är en cocktail, som innehaller monoklonala antikroppar mot bada typerna av flageller eller mot grupper av de olika E. aeruginosa-stammarna (e empelvis olika serotyper), en universalprodukt med aktivitet mot det stora flertalet av de kliniska isolaten av denna speciella bakterie.

Molförhallandet mellan de olika monoklonala antikroppskom- ponenterna skiljer sig vanligen icke at med mer än en faktor 10, vanligare icke med mer än en faktor 5, och mol- >_\ förhallandet är vanligen cirka 1:1-e med avseende pa de övriga antikroppskomponenterna.

De monoklonala antikropparna enligt föreliggande upp- finning kan även användas 1 kombination med existerande blodolasmaprodukter. sasom kommersiellt tillgängliga gammaglobulin- och immunoglobulinprodukter. som användes vid profvlaktisk eller terapeutisk behandling av E. aeruginosa-sjukdomar hos människa. För immunoglobuli- ner erhalles företrädesvis plasman fran humandonatorer, 1 som uppvisar förhöjda nivaer av immunoglobuliner, vilka är reaktiva med avseende pa Q. aeruginosa. (För allmän 10 15 20 25 30 35 soe 421 17 É _ U “Intravenous Immunef Med., information hänvisas till kompendiet Globulin and the Compromised Host," Amer. J. 7ó(3a), 1984, 30 mars, sid. 1-23 , vars innehall inför- livas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.) Föreliggande monoklonala antikroppar kan användas som separat administrerade beredningar, som tillförs jämte antibiotika eller antimikrobiella medel. Typiskt kan de antimikrobiella medlen innefatta ett anti-pseudomonalt penicillin (exempelvis karbenicillin) jämte en amino- glykosid (exempelvis gentamycin, tobramycin, et:.>, men talrika ytterligare medel (exempelvis cefaldsporiner), som är välkända för fackmannen, kan även användas.

De monoklonala antikropparna och farmaceutiska bered- ningarna därav enligt denna uppfinning är speciellt an- vändbara för oral eller parenteral administrering. Före- trädesvis kan de farmaceutiska beredningarna administre- ras barenteralt, d.v.s. subkutant, intramuskulärt eller intravenöst. Saledes tillhandahaller denna uppfinning beredningar för parenteral administrering, vilka inne- fattar en lösning av den monoklonala antikroppsn eller en cocktail därav upplöst i en godtagbar bärare. företrädes- vis en vattenhaltig sädan. En mangfald vattenhaltiga bärare kan användas. exempelvis vatten, buffrat vatten, O, 2 saltlösning, 0,32 glycin och liknande. Dessa lösningar är sterila och i allmänhet fria fran partikel-vi formigt material. Eeredningarna kan steriliseras medelst konventionell välkänd steriliseringsteknik. Dessa bered- ningar kan innehalla sadana farmaceutiskt godtagbara hjälpsubstanser som krävs för att appronimera fysiologis- ka betingelser, säsom pH-reglerande medel och buffert- medel, tomicitetsreglerande medel och liknande, exempel- vis natriumacetat, natriumklorid. kaliumklorid. kalcium- -klorid, natriumlaktat etc. koncentrationen av antikropp i dessa beredningar kan variera inom vida gränser, d.v.s.i 10 15 20 25 30 35 506 421 18 viktï, vanligen minst cirka l viktï. fran mindre än cirka 0,5 viktï till sa mycket som 15 eller 20 och valet därav baserar sig primärt pa vätskevolymer. viskositeter etc., allt efter det valda administreringssättet.

Saledes kan en typisk farmaceutisk beredning för intra- muskulär injektion framställas innehallande 1 ml sterilt buffrat vatten och 50 mg monoklonal antikropp. En typisk beredning för intravenös infusion kan framställas inne- ha lande 250 ml steril Ringers lösning och 150 mg mono- klonal antikropp. Aktuella metoder för framställning av parenteralt administrerbara beredningar är kända eller uppenbara för fackmannen och beskrivs närmare i detalj Pharmaceutical Science, 15:e exempelvis i Reminqton's _uppl., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), som införlivas med denna beskrivning genom hän- visning därtill.

De monoklonala antikropparna enligt denna uppfinning kan lyofiliseras för lagring och rekonstitueras i en lämplig bärare före användning. Denna teknik har visat sig vara effektiv med konventionella immunoglobuliner och inom tekniken känd lyofiliserings- och rekonstitueringsteknik kan användas. Det är uppenbart för fackmannen att lyofili- sering och rekonstituering kan leda till varierande grad av förlust av antikroppsaktivitet (exempelvis med konven- tionella immunoglobuliner tenderar IgM-antikroppar att uppvisa större aktivitetsförlust än Igü-antikroppar) och för kompensation att användningsnivaerna maste justeras därav.

Beredningarna, som innehaller föreliggande monoklsnala antikroppar eller en cocktail därav, kan administreras för profvlaktisk och/eller terapeutisk behandling av admini- É. aeruginosa-infektioner. För terapeutiskt bruk streras beredningarna till en patient, som redan har 10 15 20 25 30 so§í421 19 infekterats med en eller flera E. aeruginosa-serotyper, kg en mängd som är tillräcklig för att bota eller atminstone partiellt hindra infektionen och dess komplikationer. En mängd. som är adekvat för att astadkomma detta, 5 definieras som en "terapeutiskt effektiv dos". Mängder, som är effektiva för detta ändamal, beror pa infektionene svarighetsgrad och det allmänna tillstandet hos patientens eget immunsystem men varierar i allmänhet fram kilo kroppsvikt,; cirka 1 till cirka 200 mg antikropp per varvid doser av 5-25 mg per kilo vanligen används. Nan maste halla i minnet att materialen enligt denna uppfinning allmänt kan användas för allvarliga sjukdoms- tillstànd, d.v.s. livshotande eller potentiellt livshotan de situationer, speciellt bakteremi och endotonemi till följd av E. aeruginosa.

Vid profvlaktiska tillämpningar administreras bered- ningar, som innehaller föreliggande antikropp eller en cocktail därav, till en patient som ej redan har infek- terats av E. aeruginosa i syfte att förstärka patientens resistens mot en dylik potentiell infektion. En sadan 7 mängd definieras som en “profylaktiskt effektiv dos". Vid: denna användning beror även här de exakta mängderna pa patientens hälsotillstand och allmänna immunitetsniva ment varierar i allmänhet fran 0,1 till 25 mg/kilo, speciellt V 0,5-2,5 mg/kilo.

Enkel- eller multipeladministreringar av beredningarna kan utföras med dosnivaer och doseringsmönster som be- A stämmes av den behandlande läkaren. Under alla omständigjwm heter bör de farmaceutiska beredningarna tillhandahalla en mängd av antikroppen eller antikropparna enligt denna uppfinning som är tillräcklig för effektiv behandling eller profylax av patienten. 10 15 20 25 30 506 421 FÖRSÖHSEESFRIVNING EXEMFEL 1 Exempel 1 askadliggör den metodik som användes +ör att framställa en monoklonal antikropp fran rattdjur. vilken binder speci4ikt till E. aeruginosa-flageller.

Tre manader gamla BALB/c-möss immuniserades intraperito- nealt atta ganger med livskraftiga E. aeruginosa-bak- terier av Fisher-immunotyp l och Fisher-immunotyp 2 (A.T.C.C. %27312 och #273l3) var eller varannan vecka under totalt nio veckor. De initiella doserna av bakterierna var 8 N 10* och 1 107 organismer per mus av E. aeruginosa Fisher-immunotyp 1 respektive Fisher- tiil ao-faiaigt -immunotyp 2 och doseringen ökades ZO- under loppet av immuniseringen.

Tre dagar efter den sista injektionen avlagsnades mjälten fran en mus aseptiskt och en enkelcellsuspension fram- stalldes genom försiktig rotation av organet mellan de matterade ändarna av tva sterila objektglas. Enkarniga mjaltceller kombinerades 1 ett förhallande av 4:1 med (NSI-1, erhallna fran Dr. C.

England) musmyelom-log-fas-celler Milstein. Molecular Research Council. Cambridge. och íusionerades för alstring av hvbridom enligt det för- +arande som har beskrivits av Tam et al. (1?82, Infect. lmmun., 3é:1042-1053). Den slutliga hybridcellsuspen- sionen spaddes till en koncentration av 1,5 u 10° celler per ml i RPMI-hvbrid-HAT (RPMI 1640 (Gibco, Grand Island, NY) innehallande 1-2 värme-inaktiverat kalv¥ostereerum, 1 mM natriumpvruvat, lüüpg/ml penicillin och strepto- mycin, 1.0 r lO** M hypouantin. 4.0 10"? M aminopterin och l.o 10"” M tvmidin). som innefattade 2,0 x 10° per 10 15 20 25 30 35 so@§421 ml av nyframställda BALB/c-tymocyter som matarceller.

Elandningen utströks (200 ul per fack) pa plattor med 96¿W fack (#3596, Costar, Cambridge, MA). Hulturerna matades genom avlägsnande och ersättning av 50% av volymen i varje fack med färsk RPMI-hybrid-HAT varannan eller var_¿lf tredje dag. överliggande odlingsvätskor analyserades med\ aeruginosa-antikroppar 0 när ceiiš avseende pa närvaron av anti- E. medelst enzymlänkad immunosorbensanalys i facken, växten nade natt cirka 40% sammanflytning van-V ligen inom 7-10 dagar.

De överliggande odlingsvätskorna fran hybridcellerna analyserades samtidigt pa yttermembranpreparat fran var _och en av de tva immuniserande bakterierna. Yttermembranfi preparat isolerades medelst en modifikation av den metod: som har angivits av Tam et al. (1982. Infect. Immun., 3b:l042-1053), som införlivas med denna beskrivning genom Bakterierna aeruginosa Fisher- hänvisning därtill. (E. -immunotyp 1 och Fisher-immunotyp 2) ympades i tryptikasä -soja-odlingsmedium (TSBV och fick växa lb-18 timmar vidQ 34°C under luftning i ett roterande skakbad. Bakteriernal? skördades genom centrifugering och tvättades tva ganger med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 0,14 M NaCl. 3 mh KC1, 8 mM NåzHPO4 -7 H20, 1,5 mfl HH=FÜ4, PH 7,2), som innehöll ISO'trypsininhiberingsenheter (T.I.U.) aprotinin i per ml (Sigma, St. Louis, M0).

Pelleten fran den slutliga centrifugeringen atersuspen- derades i 0,17 M trietanolamin, 20 mM dinatrium-etylen- (EDTA) och homogeniserades där- -diamin-tetraättiksyra efter pa is under 10 minuter. Cellfragmentet pelleteradee fran homogenatet vid 14,900 x g och kasserades och den överliggande vätskan centrifugerades anvo enligt ovan.

Pelleten kasserades anyo och membranen oelletiserades fran den överliggande vätskan genom centrifugering vid 10 15 20 25 30 35 so6 421 l40,000 x g under en timme. Den överliggande vätskan kasserades och membranpelleterna förvarades över natten vid 4“C i 10 ml PBS, ml. Nästa dag atersuspenderades pelleterna genom virvel- som innehöll 75 T.I.U. aprotinin per bildning och alikvoterades därefter och förvarades vid -70'C. Proteinhalten hos varje pellet bestämdes medelst den metod som har angivits av Lowry et al. (1951, Q.

Eiol. Chem., 193:2ó5-275). ântigenplattorna för ELISA preparerades som följer.

Yttermembranpreparaten späddes till 5 pg per ml protein i PBS och 50pl av lösningarna utströks i varje fack pa en platta med 96 fack (Linbro #76-031-05, Flow Laboratories, Inc., McLean, VA), förseglades och inkuberades över natten vid 37°C. Übundet antigen avlagsnades fran plattor- 100 ul 5% bovinserumalbumin (BSA) i na och (vikt/volym) PBS sattes till varje fack och plattorna inkuberades under en timme vid Z7°C.

Efter avlägsnande av icke-absorberat BSA replikatutströks överliggande vätskor (S0ul) fran varje fack pa fusions- i motsvarande fack pa antigenplattorna och in- 37°C. plattorna kuberades 30 minuter vid Den obundna antikroppen avlägsnades fran facken och plattorna tvättades tre ganger med 100 ul 1% (vikt/volym) BSQ-PBS per fack. Där- efter sattes 50 ul per fack av pa lämpligt sätt utspätt Inc.. Burlingame, Vi d biotinvlerat get-anti-mus-Igü (Tago, CH) I7°C. ovan och därefter sattes till facken 50ul av ett i för- till varje f ck och inkuberades under 30 minuter a Plattorna tvattades tre ganger sasom beskrivits väg framställd avidin: biotinylerat pepparrotsperonidas- (Vectastain ABC Hit, Vector Laboratories. Inc., CQ), -komplex Eurlingame, som hade framställts enligt till- verkarens specifikationer. Efter 30 minuter vid rumstempe- ratur avlägsnades Vectastain-reagenset fran facken, facken tvättades enligt ovan och därefter tillsattes 100 10 15 BBQ lf J W m1 per fack av substrat, o-fenylendiamin (0,8 mg/ml i 0,1 M citratbuffert, pH 5,0, blandat med en lika stor volym 0,03 volymï H2D=). minuter vid rumstemperatur i mörker och reaktionerna av- bröts därefter genom tillsats av SO pl EN H2 S04 per fack.

Hybridomceller, som avsöndrar monoklonala antikroppar, .\:,a. vilka binder till endera av de tva antigenpreparaten, l lokaliserades genom mätning av absorbansen vid 490 nm avà rr de kolorimetriska reaktionerna 1 varje íack med en "Dynatech Model 580 NicroELlSA reader” (Alexandria, VA),å ä Cellerna i antikropp, undersöktes närmare sasom -immunotyp 2. Detta fack beskrivs nedan.

Substratet inkuberades under Zfiš ett fack med beteckningen Pa3 IVC2 producerade som band endast till antigenplattan med Fishefá 10 15 20 25 30 35 506 421 24 Den monoklonala antikroppen och den klonala cellinjen fran detta fack identifieras bada genom beteckningen Paï IVC2 i följande text. Paš IVC2-celler fran moderfacket miniklonades och klonades medelst den granssbädnings- teknik som har beskrivits av Tam et al. (1982, lnfect.

Immun.. 36:lO42-1053). som innehaller monoklonal (BÅLB/C Askitesvatska. antikropp med hög titer, framställdes pa CBb F;-möss (honmöss) C57BL/6 (hanmöss> Fl) enligt det förfarande som har beskrivits av Tam et al. (1982, Infect. Immun., 36:1ü42- 1053 . Tva till tre manader gamla CBb F,-möss av hankön erhöll injektioner intraperitonealt med 0,5 ml pristan (2. 6, 10. 14-tetrametylpentadekan. Aldrich Chemical Co..

Milwaukee, NI) 10-21 dagar före intraoeritoneal injektion med log-fas-Paš IVC2-celler i RPMI. Varje mus erhöll en injektion av 0.5-1 107 celler i 0,5 ml. Efter cirka tva veckor avlagsnades den ackumulerade vätskan fran mössen varannan eller var tredje dag. Honcentrationen av anti- kropp i askitesvätskan bestämdes medelst agaros-gelelek- Beckman Instruments, Inc.. Brea, EA) trofores (Paragon. och all askites som innehöll 5 mg/ml eller mera antikropp poolades, alikvoterades och frystes vid -70°C.

Harakterisering av det molekylära obiektmal som binds av den monoklonala antikrobpen overliggande odlingsvatska fran den klonade Pai IVC2-cell- linjen analvserades medelst ELISA sasom beskrivits ovan ba vttermembranbreparat fran samtliga sju Fisher-immuno- aeruginosa (A.T.C.C. 27312-2?Z1B). E. aureofaciens (A.T.C.C. 13?85) (A.T.C.C. 8047). tvpstammar av E. och filebsiella pneumoniae samtliga framställda enligt ovan. Anti- kroooen Pai IVCI band till vttermembranpreparaten av 6 och 7 av E. aeruginoea men ej till de övriga Fisher-immotvperna, E. agg§gi¿;¿§Q§. eller Fisher-immunotvperna 2.

Q. gneumoniae. 10 15 20 25 30 35 ,Fisher-immunotyperna 2, _, 506 å 421 Det specifika antigen som identifierades av antikroppen Pa3 IVC2 identifierades medelst radioimmunprecipitation-Å» I korthet innebär denna analysmetod att man inkuberar radioaktivt märkta antigener med antikroppen Paï IVC2 och en speciell källa till protein A, vilket resulterar i bildningen av olösliga antikropp:antigen-komplex. Dessa komplex tvättas för avlägsnande av eventuellt icke-specif fikt bundet antigen och därefter dissocieras komplexen och separeras i en polyakrylamidgel. De dominerande radioaktiva ämnen som aterfinns i gelen identifieras därigenom som motsvarande antigen eller antigener till vilket eller vilka antikroppen Paï IVC2 binder.

Alikvoter (25 pg) av lösliga yttermembranpreparat fran -v ~l 4 och 5 av E. aeruoinosa märktes radioaktivt i fast fas med 1251 under använding W av Iodo-gen (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (Fraker och Speck, 1978, Biochem. Bioghys. Res. Commun., 80:84?-l ,857; Markwell och Fox, 1978, Biochemistry, 17:4807-4817)i Detta förfarande resulterade i jodering av exponerade tyrosinaterstoder av de flesta, om ej samtliga proteiner ingaende i yttermembranpreparaten.

För att minska icke-specifik bindning av yttermembrananti~ genen till antikroppen Paš IVC2 inkuberades först de (5 x radioaktivt märkta preparaten 10* pulser per minut Der analvs) under en timme vid 4°C med normalt BALB/c-muS- serum (slutspädning 1:40). overliggande Paš IVC2-odlingsf innehallande antikroppen Pa3 IVC2 sattes Efter vätska (0,5 ml) därefter till vart och ett av yttermembranproven. inkubering av antigen och antikropp under en timme vid 4°C tillsattes källan till protein A, lgG50RB (ü.Û95 ml per prov) (The Enzyme Center, Inc., Boston, MA) och in- kuberades under ytterligare 30 minuter vid 4°C (fiessler,{> S.W., 1?75, J. Immunol., 115:1bl7-1622). IgGSORB fram- ställdes enligt tillverkarens specifikationer ocn strax före användning åörebvggdes icke-specifika reaktioner 10 15 20 25 30 35 under tio minuter och tillvaratogs i 506 421 26 genom blockering av potentiellt reaktiva ställen med odlingsmedium genom tvättning av IgG5DRB tva ganger med RPMI-hybrid HAT).

(RPMI-hybrid-HAT-medium med uteslutning av Antigen-antikropp-IQBSDRB-komplexen pelleterades vid 1500 x g under tio minuter vid 4°C, tvättades tva ganger med fosfat-RIPA-buffert (10 mM fosfat, pH 7,2, 0,15 M NaCl, 1,0 vo1vmZ Triton X-100, 1,02 (vikt/volym) natrium- deoxicholat, 0,12 (vikt/volym) natriumdodecvlsulfat (SDS) och 1,0 volymï aprotinin); tva ganger med hög saltbuffert 1 volvml beta- -merkaptoetanoll; (0.02 M Iris-Hcl, och en gang med lys-buffert 0,5 M Naßl, 1979, pH 7,5, 0,05 volymk Nonidet P-40) (Rohrschneider et al., Proc. Natl. Acad.

U.S.A., 76:4479-4483. olemet, (0.125 M Tris-HCl, Sci., Antigen, som var bundet till kom- frigjordes genom inkubering med orovbuffert pH 6,8, 2% SDS, 2 volymï vid 95°C (vikt/volym) beta-merkaptoetanol och 20 volymï glycerol) den överliggande vätskan efter centrifugering vid 1500 x g under tio minuter.

De överliggande vätskeoroverna apolicerades därefter pa 14% polyakrvlamidgeler, som innehöll SDS och hade fram- ställts medelst (1978, FEBS Lett., (1?79. J. Bacteriol., den metod som anges av B. Lugtenberg et 5B:254-258) 140:902-?10). al. modifierad av Hancock och Carey som infër- livas med denna beskrivning genom hanvisning dartíll) gelen genom elehtrofores Efter ättik- och antigenerna seoarerades i over natten vid en konstant soänning av 50V. fixering av gelen i 40 volymk metanol, 10 volvmï svra och 5 volvmï glvcerol över natten torkades den pa Whatman 3 MM-oaoper via en Biorad-geltorh (Richmond. CA).

Den torkade gelen täcktes med olastfilm och exoonerades för Kodak X-AR-film under 18 timmar vid rumstemoeratur.

Resultaten av detta försök visade att Paš IVC2 band till 10 15 _20 25 30 35 5oe 421 27 endast ett antigen i yttermembranpreparatet av endast F*- Fisher-immunotyp s av E. aeruginosa och ej till nagot annat antigen närvarande i de övriga yttermembranprepa- raten. Molekylvikten (MV) åör antigenet i gelen var cirka“ 53000 dalton, vid bestämning genom jämförelse av dess _ mobilitet med mobiliteten hos **C-märkt proteinstandard ågg MV 92500; BSA, MV 69000: E NV 3013043; (fosforylas B. ovalbumin, MV 46000; 12000) (New England Nuclear, kolsyraanhydras, cytohrom C, MV Boston, MA), som separerades i samma gel. Molekylvikten för detta antigen korreleradeÉ med molekylvikten hos flagellin, aeruginosa, (1982, Infect. förlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill. det protein som utgör W flagellerna hos E. sasom har rapporterats av¿ Montie et al. lmmun., 35:281-288), som inåt Vidare undersöktes Paß IVC2 medelst ELISA under användning av Habs-stammarna 1-12 av E. aeruginosa ;@~ mikrotiterplattor med 96 fack. vilka +ixerades med etanol pa Antigenplattorna prepa- rerades som följer. -Ä Kulturer av varje organism, vilka hade fatt sta över' natten. pelleterades, tvättades tva ganger med PBS och atersuspenderades däreíter i PBS till ett Aaèa-värde av 0.2 0.D.-enheter. De utsoadda bakterierna utströks i åachv (50 ul per fack) och centrifugerades däreiter vid PBS till facken 1500 x g under 15 minuter vid rumstemperatur. (95%) Efter det att luftades och därefter sattes etanol under 15 minuter vid rumstemperatur. etanolen hade avlägsnas +ran facken lufttorkades plattorna och tacktes därefter och förvarades vid 4°C till dess de skulle användas.

Resultaten av ELISA-testen, utförda sasom beskrivits ovan. visade att Paï IVC2 band till de etanol4ixerade Habs-stammarna 2, 3, 4, S, 7, 10. 11 och 12. Detta speci- ficitetsmönster antydde att Paä IVCE band till 1978.

E. aeruginosa-+1age1lerna av typ b (Ansorg, R., 10 15 20 25 30 35 506 421 28 Zbl. Bakt. Hyg.. I. Abt. Orig. A, 242:22 -238: Ansorg, R.. et al.. 1984, J. Clin. Microbiol.. 20:84-BB. vilka bada införlivas med denna beskrivning genom hanvisning därtill). Baserad pa denna specificitetsbestämning med avseende pa monoklonal Paï IVC2 uppbär E. aeruginosa- -referensstammarna Fisher-immunotyp 2. Fisher-immunotyp 6 och Fisher~immunotyp 7 flageller av typ b. Av föregaende försöksdata kan man dra den slutsatsen att Pa? IVC2 binder specifikt till E. aggggiggâg-flagellin av typ b.

SHYDDSAKTIVITET IN VIVO AV Päï IVC2 Djurförsök utfördes för att fastställa om den monoklonala antikroppen Paš IVC2 skulle skydda en mus, som hade utsatts för flerfaldiga LD=°-doser av levande modellen var modellen me., 1983,. g.

E. aeruginosa-bakterier. Den valda M.S., Trauma, 23:530-534, som införlivas med denna beskrivning med brända möss (Collins. and Roby, genom hänvisning därtill). Grupper av möss utsattes för en allvarlig brännskada enligt författarnas protokoll och utsattes därefter omedelbart för 5-10 LD=°-doser av Fisher-immunotyo 7. Monoklonal antikropp administrerades intraperitonealt som högtiteraskites (0,2 ml intraperito- nealt) före astadkommandet av brännskador och infektion.

Nagon ökning i antalet överlevande konstaterades ej hos Paš IVC2-behandlade djur jämfört med sadana som ej erhöll nagon antikropp.

EXEMPEL 2 Exempel visar metodiken för framställning ax en rattdjurs-hvbridomcellinje. som alstrar en monoklonal rattdjursantikropp mot E. aeruginosa-flagellin av typ b. vilken skyddar ig vivo.

Vuxna BALB/c-möss av honkön erhöll först injektioner intraperitonealt med livskraftig E. aeruginosa Fisher- (ATCC Nr. 27317) (B x följt -immungtyp g 10* organismer). 10 15 20 25 30 35 '29 tva veckor senare av en injektion med livskraftig E. aeruginosa Fisher-immunotyp 5 (ATCC Nr. 27316) (4 x Under den därpa följande tvaveckors- aeruginosa Fisher- lü* organismer). perioden administrerades livskraftig E. -immunotyp 5 och Fisher-immunotyp 6 tillsammans i tva inër jektioner per vecka. Doseringen av varje organism ökadesn sa att slutdoseringen var tiofaldigt större än den W initiella doseringen. En sista injektion av yttermembran~ preparat av E. aeruginosa Fisher-immunotvp 6 (50 ug protein), som hade framställts enligt den metod som har and H. (1978, 1. gavs fyra dagar efter den angivits av R.E.N. Hancock Nikaido sacteriui., 13e=3e1-390), sista injektionen med livskraftiga bakterier. Tre dagar efter den sista immuniseringen avlägsnades mjälten fran en mus och mjaltcellerna preparerades för hybridisering sasom beskrivits i exempel 1. r överlíggande odlingsvätskor fran hybridomcellerna analy-H serades med avseende pa närvaron av anti-E. aeruginosa- -antikroppar medelst ELISA pa den tionde dagen efter fusion enligt de förfaranden som anges i exempel 1, med undantag av att antigenet för ELISA-plattorna var livs- kraftiga bakterier, som hade immobiliserats i facken till mikrotiterplattorna om 96 fack. Plattorna preparerades som följer.

Femtio mikroliter poly-L-lysin (PLL) (1 ug/ml i PBS) (Sigma #P-1524, St. Louis, MO) sattes till varje fack i 96-facks plattorna (Linbro) och inkuberades under 30 minuter vid rumstemperatur. Icke-adsorberat PLL avlägs- nadee och facken tvattades tre ganger med PBS. Bakterie-V kulturer, som hade fatt växa över natten i TSB, tvättades en gang med PBS och atersuspenderades därefter i PBS till ett D.D.asa nm-värde av 0,2. Femtio mikroliter av bakteriesuspensionerna sattes till varje fack i plattan och fick binda vid 37°C under en timme. Icke-bundna bak-I terier avlagsnades och därefter tvättades facken tre ganger med saltlösning- Tween (O,9Z (vikt/volym) NaCl, sne 421 10 15 20 25 30 35 506 421 “m 0,05 volymZ Tween-20).

Icke-specifik bindning av antikropparna blockerades genom tillsats av 200 ul/fack av blockeringsbuffert (PBS fettfri Louis, MO) innehallande 5% (vikt/volym) (Sigma, St. torrmjölk, 0.01 volymZ Antifoam A och 0,01% (vikt/volym) timerosal) till facken och inkubering under en timme vid rumstemperatur. överskottet blockerings- buffert avlägsnades och facken tvattades tre ganger med saltlösning-Tween sasom beskrivits ovan. överliggande odlingsvätskor (50 ul) replikatutströks i motsvarande fack pa analysplattorna och inkuberades vid rumstemperatur under 30 minuter. De överliggande odlings- vätskorna avlägsnades och facken tvattades fem ganger med saltlösning-Tween.

En enzymkonjugerad andrastegs-antikropp (pepparrotsperoxi- das-konjugerad get-anti-mus-Igß + IgM) (Tago, Inc., Burlingame, CA) späddes i PBS innehallande 0,1 volymï Tween-20 och 0,22 (vikt/volym) BSA enligt tidigare bestämda titreringar och därefter sattes 50 ul av reagensen till varje fack och inkubering skedde 30 minuter vid rumstemperatur. överskottet reagens avlägs- nades; facken tvättades fem ganger med saltlösning-Tween; och 100 ul o-fenylendiamin-substrat per fack tillsattes och inkubering skedde 30 minuter sasom beskrivits i exempel 1. Reaktionerna avbröts sasom angivits i exempel 1 och därefter skedde avläsning vid A490 nm pa en Bio-Tek EL-310 Automated EIA Flate Reader.

Medelst ovan beskrivna metoder analyserades de överliggan- de odlingsvätskorna fran fusionen med avseende pa som band till E. aeruginosa men ej till närvaron av antikroppar, -u Fisher-immunotyperna 1, 2. o eller 4, kontrollplattorna. som hade framställts med samma PLL- och blockeringsprocess men utan bakterier. overliggande vilken band till nagon av vätskor. som innehöll antikropp, 10 15 20 25 30 35 31 soag421 dessa fyra Fisher-immunotyper, analyserades en andra ganë. under användning av var och en av de sju Fisher-immunotypf Antikropp närvarande i den över- ll PaF4 IVE8 band endast 6 och 7. bakterierna separat. liggande vätskan fran ett fack, till E.

Celler fran facket FaF4 IVEB klonades genom gränsspäd- aeruginosa Fisher-immunotyperna 2, ningsmetoder sasom har beskrivits i exempel 1. Den monof klonala antikroppen och den klonala cellinjen fran detta Å fack identifieras bada med beteckningen PaF4 IVE8 i föl-V jande text. Askitesvatska innehallande hög titer av monof klonal antikropp producerades sasom beskrivits i exempel í“ med undantag av att BALB/c-möss användes istället för CBóF;.

SPECIFICITET HOS E_E4 IVEB En analys, som utfördes för att identifiera det antigen som bands av den monoklonala antikroopen PaF4 IVE8, var indirekt immunofluorescens ba bakterieorganismer. Var ooh en av de sju Fisher-referensimmunotyperna av E. aeruoinåsa plus en icke-flagellär stam av E. aeruginosa (PAIOE, _:: A.T.C.C. 29260, Leifson, 1951, J. Bacteriol., 62: 377-38%) och Esgner-ichia ägg 37°E i TSB. Bakterierna pelleterades genom centrifu-å gering och tvättades därefter tva ganger i PBS. växa över natten vid Varje stam atersuspenderades i PBS till ett 0.D.a.°nm-värde aví P- Fl 32 fy: Bakteriesusoensionerna späddes därefter ytterligare i fön- hallandet 1:150 och orover om 20 ul placerades i de indifg viduella facken pa Carlson-objektglas (Carlson Scientifié Inc., Peotone. IL) och torkades pa objektglaset vid 4Ü'C¿ överliggande odlingsvätskor (25 ul) av PaF4 IVE8 inkube-í rades pa de torkade bakterieproverna pa objektglasen i en fuktkammare vid rumstemperatur under 30 minuter. i Icke-bunden antikropp tvättades bort fran objektglasen genom att dessa doppades i destillerat vatten. fa 10 15 20 25 30 35 506 421 Efter det att objektglasen hade torkats inkuberades (FITC)-konjugerad get-anti-mus- PBS) fluorescein-isotiocyanat -Igß + IgM (25 ul per fack i CA) en spadning av 1:40 i (Tago, Burlingame. pa objektglasen under 30 minuter vid rumstemperatur i en fuktkammare i mörker. Übjektglasen tvattades anyo i destillerat vatten och torkades och tacktes därefter med ett tackglas.

PBS (9:1).

SOM monterades med glycerol i Übjektglasen studerades därefter i ett fluorescensmikroskop.

Fluorescensfärgning observerades endast pa Fisher-immuno- typerna 2, 6 och 7 av E. aeruoinosa och konstaterades vara ett sinusformat mönster (linje). som utgick fran endast en ande av organismerna. Detta Etår i överens- stammelse med morfologin hos och lokaliseringen av den enda polara flagellen hos dessa bakterier.

Reaktionen mellan PaF4 IVE8 och flageller bekräftades medelst immunoblotting-analys. Yttermembranantigener fran _E. aeruginosa Fisher-immunotyp 6 (se exempel 1) separerades genom elektrofores i en 14% polyakrylamidgel, som innehöll SDS. sasom beskrivits i exempel 1. med undantag av att elektroforesen kördes under fem timmar vid en konstant strömstvrka av SO mëmp. I förväg färgade molekvlviktsmarkörer (lvsozym, MV 14300; beta-laktog1o- MV 18400; bumin. MV 43000; B, MV 97400; MD) alfa-chymotrypsinogen. M 25700: oval- MV 58000: (BR-L, bulin, bovinserumalbumin. fosforvlas och myosin. MV 200000 Gaithersburg, införlivades med samma polyakrvlamidgel.

Antigener överfördes fran polyakrylamidgelen till ett nitrocellulosamembran, (NCM). (0,45 um. Schleicher & Schuell. Keen. NH) 1 (1979), en Tris-glvcin-metanol-buffert Natl. Acad. U.5.A., SDB, Inc..

(Towbin et al. Proc. Sci.. 7ó:4350-4354). innehallande 0,052 (vikt/volym) över natten vid 4°C vid en konstant strómstvrka av 200 mA.

Efter ëverföringen inkuberades NCM i 0.05 volvmï Tween-20 i PBS E.. et 1982, Q.

(PBS-Tweeny (Batteiger, 10 15 20 25 30 35 506 421 Immunol. Meth., 55:297-307) under en timme vid rums- temperatur. För detta steg och samtliga efterföljande steg placerades den bricka som innehöll NCM pa en skakplatt- form för att ombesörja fördelning av lösningen över helaww NCM.

Efter en timme avhälldes PBS-Tween-lösningen och PaF4 IVEB-askites (spädd 1:1000 i PBS-Tween) inkuberades med NCM under en timme vid rumstemperatur. tillsattes och NCM tvättades därefter fem ganger, fem minuter varje gang, med PBS-Tween för att avlägsna icke-bunden antikropp. Alkaliskt fosfatas-konjugerad get-anti-mus IgG+lgM specifikationer och inkuberades med NCM under en timme (Tago, Inc.) späddes enligt tillverkarens vid rumstemperatur. NCM tvättades fem ganger sasom »beskrivits ovan och ett substrat, som innehall bromklor-g indolylfosfat och nitroblatt-tetrazolium (Sigma.

St.Louis, MD) och hade framställts sasom beskrivits av Leary et al. (1983, Natl. Acad. U.S.A., eo-4045-4049), Froc. Sci., tillsattes och inkuberades 10-20 minuter sub- vid rumstemperatur. Reaktionen avbröts genom att stratet borttvättades med destillerat vatten. visade att PaF4 IVEB band specifikt till ett enda antigen med en molekylvikt av Resultaten av detta försök 53000 dalton i yttermembranpreparatet. Resultaten av den_ indirekta immunofluorescens-analysen och immunoblotting visar att PaF4 IVES binder till flagellerna hos E. aerugi- HDSå.

Den flagelltyp som PaF4 IVEB kände igen bestämdes medelst ELISA. Habs-stammarna 1-12 (A.T.C.C. #33348-Ešïíë) bands var och en till facken i mikrotiterplattor om 55 fack (Linbro) med PLL och ELISA utfördes sasom beskrivits tidigare i detta exempel. Källan till antikropcen PaF4 g\ IVES var överliggande odlingsvätska. Positiva reaktioner: som innehöll Habs-stammarna E, 3. 4, vilket visar att PaF4 IVEE binder konstaterades i fack, 5, 7, io, 11 och 1:, 10 15 20 25 30 35 5oeg421 55-4 till flageller av typ b. Skyddsdata bestämda LQ vivo aterges nedan i exempel 4.

EXEMPEL 3 Exempel 3 visar metodiken för framställning av en ratt- djurs-hybridomcellinje, som producerar den monoklonala antikropp vilken är reaktiv med anti-E. aeruginosa-fla- geller av typ a och skyddar Lg vivo.

Lymfoidcellkällan för fusionen var en mjalte fran en immuniserad BALB/c-mus, som hade erhallit injektioner fyra ganger intraperitonealt under en sexveckors-period av renade flageller typ a fran Habe- (â.T.C.C. (10-20 pg protein) 333353 och 33355). -stammarna 6 och B Flagellerna renades enligt den metod som har angivits av T.C. (1982, 35:28!-288, införlivas med denna beskrivning genom hänvisning Montie et al. Infect. Immun., som därtill) med undantag av att den slutliga centrifugering- en av flagellerna utfördes vid 100000 x g under en timme och ej vid 40000 x g under tre timmar. En andra modifika- tion som gjordes vid vissa förfaranden var att flagellerna fran bakterierna underkastades skjuvning under 30 sekunder i en blandare istallet för under tre 1985, Infect. lmmun.. 49:770- minuter. (Allison et al.. 774).

Proteinkoncentrationerna hos varje preparat bestämdes med (Bio-Rad. Richmond. CA) (LFS) Bio-Rad Proteinanalys och närvaron av kontaminerande lipopolysackarid fast- stalldes genom mätning av HDD-halten (Harkhanis, Y.D.. et 85:595-601).

Anal. Biochem., Molekvívikterna al.. 1978, hos flagellproteinerna bestamdes genom att man jämförde en SDS-polyakrylamidgel med migreringen Molekyl- deras migrering i hos proteinstandardmarkörer (BRL) (se exempel I). vikten för Habs e-flagellin var 51700 dalton och för Habs E-flagellin 47200 dalton. Dessa värden stammer överens med de som har erhallits av J.S. Alllison et al. (1985. 10 15 20 25 30 35 49:770-774, som införlivas med denna be~ skrivning genom hänvisning därtill).

Infect.Immun., Fusion av splenocyter fran flagellin-immuniserade möss P och NS-1-myelomceller utfördes tre dagar efter den sistaï immuniseringen sasom beskrivits i exemplen 1 och 2. När hybridomcellerna växte till en konfluens av cirka 40% (dag 7) replikatutströks överliggande odlingsvätskor i motsvarande fack hos tre olika antigenplattor. PLL-bunden T E. aeruginosa Fisher-immunotyp 1 (se exempel 2 för prepaf rering) och formalinfixerad Habs 6 och Habs 9.

Bakterierna för de formalinfixerade antigenplattorna ficfiu växa. na antigenplattor. Utspädda bakterier vid A,.°) sattes till de individuella facken (50 ul per fack) hos Linbro mikrotiterplattor med 96 fack och q plattorna centrifugerades därefter vid 1200 x g under 20 minuter vid rumstemperatur. De överliggande vätskorna av? _lägsnades fran facken och 75 pl av 0,2 vo1ymZ formalin i; PÉS sattes till varje fack och inkuberades under 15 minuter vid rumstemperatur. Efter det att formalinet hade avlägsnats fran facken lufttorkades plattorna och förvara- des vid 4°C framtill användning. Formalin ändrade icke antigeniciteten hos flagellerna, sasom framgar av förmagan hos anti-flagell-antisera att agglutinera formalin-behandlade organismer (Lanyi. B.. 1970, äcta Hicrobiol. Acad. Sci., Hung.. 17:35-48). Stammen E. aeru¶, giggäa Fisher-:mmunotyp 1 införlivades som kontroll efter sasom framgar av V Microbiol.. 1985, Soc. Wash., D.C., p. det fack som betecknade Fàé IIG5 som denna stam var icke-flagellär, betfärgs-infärgning (Manual of Clin.

Lennette. red. ñmer. Microbiol.. 1099). Hvbridceller i producerade en antikropp, som band till Habs 6 och Habs Å (bada stammar uppbarande flageller av typ a) men ej till, Fisher-immunotyp 1.

Celler fran fack_FAó IIG5 underkastades subodling och 506 421 tvättades och späddes sasom beskrivits för PLL-bundw (0,2 cam-enheter 10 15 20 25 35 36 klonades sasom beskrivits i föregaende exempel. Den mono- klonala antikroppen och den klonala cellinjen fran detta fack identifieras bada med beteckningen Fâó IIE5 i följan- de text. Askites producerades i BALB/c-möss sasom beskri- vits i exempel 2.

Specificitet hos FA6 IIG5 Specificiteten hos antikroppen Ffió IIE5 bestämdes medelst indirekt immunofluorescens och immunoblotting. Indirekt immunofluorescens utfördes i huvudsak sasom beskrivits i exempel 2 med följande modifikationer.

Bakteriekulturer. som hade fatt växa över natten pa tryptikas-soja-agar vid 30°C, avlagsnades fran plattorna _med bomullstoppar och atersuspenderades i PBS till ett 9660-värde av 0,2 0.D.-enheter. Formalin (O,37 volvmï slutkoncentration i PBS) sattes till suspensionen under virvelbildning. Efter inkubering vid rumstemperatur under 15 minuter späddes bakterierna i förhallandet 1:12 med PBS och EH ul av denna suspension placerades i de indivi- duella facken pa Carlson-objektglas. Efter torkning prepa- rerades objektglasen för mikroskopering sasom beskrivits i exempel 2. Källan till antikropp var överliggande odlingsvatska fran Fêé IIG5-cellinjen.

Fluorescerande färgning av Fâó IIG5-antikroppen konsta- terades endast med E. aeruginosa-stammar uppbarande flageller av typ a men icke med nagon av de som uppbar typ b. Det observerade fluorescensmönstret var ett sinus- format linjemönster. som visade att Fâb IIG5 band till flagellerna. Fluorescenssignalen förstärktes genom be- handling av bakterierna med formalin men behandlingen krävdes icke för att visualisera den flagellara fargningen med antikropoen. exempel 2.

Immunoblotting utfördes s som beskrivits i a hallan till antigener av flagelltyp a var de renade 10 15 go 25 30 35 506 421 37 flagellara preparaten (se detta exempel). äntigenen separerades i 10% polyakrylamidgeler innehallande SDB (Laemmli. U.K., 1970, Nature 227:óBO-685) och överfördes till ett NCM. Freparat av Fëó 1155, överliggande odlingsvätska eller askites i spaddningen (London), antingen l:1000, fick reagera med NCM och reaktionen pavisades medi ett lämpligt enzvmkonjugerat reagens och enzymsubstrat 1 sasom beskrivits i exempel 2. Immunoblotting-analysen visade att Fab 1165 bana spe=1+1kt till fiageiiin mv 51700 av Habs 6 och flagellin MV 47200 av Habs B.

Bekräftelse pa att Fâb IIG5 reagerade endast med flagell- -typ a och ej typ b erhölls med ELISA, dar Habs-stammar 1-12 bands individuellt med PLL till facken i Linbro mikrotiterplattor med 96 fack. Antikroppen band endast till Habs-stammarna 1, 6, 8 och 9, som är de enda av de tolv stammarna som uppbär flageller av typ a, (se Qnsorg, R., et al.. 1984, J. Clin. Microbiol., 20:84-88, som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill). Skyddsstudier gg vivg askadliggörs i exempel 4; nedan.

EXEMPEL 4 Exempel 4 askadliggör skydd av möss, som passivt har immuniserats med antikroppar FaF4 IVEB och Fâó IIGS mot infektion av E. aeruginosa i modellen med brand mus.

De anti-flagellara'monoklonala antikropparna testades i modellen med brand mus enligt den metod som nar beskri- Robv (1983, J. vits av M.S. Collins and R.E. Trauma, of-=1o-5:4, .'.-- n uæ som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill). För ekvddsstudier renades alla anti+§ kroppar medelst protein A-Sepharose-kromatografi (Ey, P.L.. et al., 1978. Immunochemistry, 15:42?-43é. som in- förlivas med denna beskrivning genom hanvisning dartill). och dialvserades i PBS-buffert. Den stam som upobar lageller av tvp a och som användes vid djurfärsöken var, 10 15 20 25 35 506 421 ie E. aeru inosa PAEZO (fran Dr.

MQ) E. agruginosa Fisher-immunotyp 2 (A.T.C.C.

James Pennington, FIF Boston, och stammen av flagell-typ b var referensstammen 27313).

Fyrtio mikrogram av renad monoklonal antikrooo tillfördes varje mus intravenöst 1-I timmar ¥öre astadkommandet av brännskada och infektion. skadan hade astadkommits erhöll djuren 0,5 ml innehallande de infekterande bakterierna, sarskorpan.

Resultaten III varje organism. av Tabellerna I och TABEL I. -flagelltyo a H I l -b Behandling 1 Qfit i -f 1 agël 1 100 1 ÛÜ IC-'Ü a, Fab 1165 100 Anti-flagell 100 20 b, PaF4 Ivee Icke-soecifik anti-LP5-mono- klonal anti- kropp 100 PBS. inga bakte- rier Lnfektionsdosen var cirka Procentuell vid modellen med bränd mus* naii Pas, under 10 LD=o-doser för djurförsöken visas i överlevnad pa dag* 100 90 10 80 50 w w 90 BO 10 10 10 Omedelbart efter det att bränn- Skyddsstudie av en monoklonal antikrooo av anti- BO 10 10 30 01 *Möss infekterades under med cirka IÜ LDQQ' 10 15 20 25 30 35 so6 421 -doser av E. aeruginnsa PA220. 2Procentsi¥fran baserar sig pa överlevnaden hes möss i grupper om tio djur, med undantag av kontrollgruppen med endast Pas. 0 efter astadkommande av brannskada och infektion. som bestod av fem möss. Dagarna är räknade Tabell II. Skvddsstudie av en mondklonal antikropp av anti-flagelltyp b vid modellen med bränd mus* Behandling 1 Procentuell överlevnad pa dag2MÅm h) fl -b f.

O* \| N 6 Anti-flagell b, PaF4 IVES 100 100 90 Q0 90 90 90 90 Anti-flagell a, Fab 1155 :oo :o 10 10 10 10 lo lo aåxø Icke-specifik anti-LPS-mono- klonal anti- kropp 100 20 20 20 20 20 20 20 V20 PS5, inga bakterier 100 100 100 100 100 100 100 100 _100 *Möss in¥ekterades under sarskornan med cirka 10 LD=°- 'ä -doser av E.aeruginosa Fisher-immunetyp e. 2Prdcentsiffran baserar sig pa överlevnaden hos möss i 10 15 20 25 30 35 506 421 grupper om tio djur med undantag av kontrollgruppen med endast PBS som bestod av fem möss. Dagarna är räknade efter astadkommande av brännskada och infektion.

Mycket signifikant överlevnad konstaterades hos möss. som hade behandlats med anti-a-antikropp eller anti-b-anti- kropp och därefter infekterats med motsvarande antigen. I motsats härtill dog 80-90% av de obehandlade men infekterade mössen eller djuren. som hade behandlats med en icke-matchande antiflagellär monoklonal antikropp eller icke-specifik anti-LPS-antikropp. Üförmagan hos antikroppen av anti-flagelltyp a att skydda moss fran en letal infektion av E. aeruginosa Fisher-immunotyp 2, som uppbär flageller av typ b, och oförmagan hos antikroppen av anti-flagelltyp b att skydda möss fran en letal infek- tion av E. aeruginosa PAEEO. som uppbär tvp a, bekräftade Lg viïg den specificitet hos antikropparna som hade kon- staterats LQ vitro. överlevnad hos brända möss. som ej hade infekterats. visade att brännskadan i sig icke var letal.

EXEMPEL 5 Exempel 5 askadliggör den extensiva korsreaktiviteten hos FaF4 IVE8 och FQ6 IIG5 med kliniska E. aeruginosa-isolat, vilket visar den kliniska användbarheten av dessa anti- kroppar vid immunoterapi av E. aeruginosa-infektioner. kliniska isolat erhölls fran sjukhus och kliniker.

Isolaten härrörde fran en mangfald isoleringsställen o inklusive blod, sar. rsspirati nsorganen. urin och öron.

Totalt undersöktes 157 isolat.

PaF4 IVE8 band specifikt till 34 kliniska isolat (222), medan antikroopen av flagelltvp a, Fäo IIG5, nd till ba 102 kliniska isolat (65%) för totalt 136 av 15* isolat (87%). âv de 21 tammar som ej kändes igen av endera III 10 15 20 25 30 35 so@ 421 '41 antikroppen var 19 icke-flagellära, sasom visades genomšf infargning med betfärg. Därför band bada antikropparna t kombination till 136 av 138 (98%) av flagellära kliniska isolat. vilket bekräftar tidigare rapporter (se, R.

Ansorg, 1978, Zbl. Baht. Hyg., I Abt. Drig. A, 242:228-; 238, som införlivas med denna beskrivning genom hänvis-,7¶ ning därtill). @»l EXEMPEL 6 Exempel 6 askadliggör metoder för framställning av mono¥“ klonala humanantikroppar, som binder till E. aeruginosaw -flageller av typ b.

Ett perifert blodprov fran en individ, som hade immuniserats med ett högmolekylärt polysackaridpreparatl: (Pier et al., 1984 Infect. Immun., 45:309), tjänade somia källa till B-celler. Enkärniga celler separerades fràn ä blodet medelst standardcentrifugeringsteknik pa Ficoll-Faque: scanu. J. ciin. Lab. Invgšg., 21-77> och 4'l ' tvättades tva gänger i kalcium/magnesium-fri fosfatbuffrèd saltlösning (PBS).

De enkärninga cellerna befriades fran T-celler under användning av en modifierad E-rosetterings-teknik. I Å korthet innebar detta att cellerna först ätersuspenderadšs till en koncentration av 1 107 cellerrml i PBS inne- ä hallande 20% kalvfosterserum susoension infördes därefter i ett 17 x 100 mm rund- á bottnat bolystvrenrör, till vilket sattes 1 x 10' 2-aminon -isotiouronium-bromid KAET)-behandlade röda blodkroooar 7 fran far fran en 10%-ig (volvmï) lösning i Iscoves modi-1 fierade Dulbecco-medium (Iscoves medium) (Madsen och Johnson <1?79) Q¿ Immun. Methods, 27:61). Suspensionen blandades mvcket försiktigt under S-10 minuter vid 4°C och de E-rosetterade cellerna avlägsnades därefter genom centrifugering oa Ficoll-Paque under B minuter vid 2500 x g vid 4°C. E-rosett-negativa enkärniga perifer- 10 15 20 25 30 35 506 421 042 blodceller (E*PBMC), som samlades vid gransytan. tillvara- togs och tvattades en gang i Iscoves medium och ater- suspenderades i detsamma innehallande 15 vo1ym% FCS.

L-glutamin (2 mmol/1, penicillin (100 IE/ml), streptomvcin (100 ug/ml), hvpoxantin (1 l0_“N), aminopterin (4 x io-VM) och tymidin (1,6 x 10“°M). Detta medium betecknas i det följande som HAT-medium.

Cellstvrd transformation av E'PBMC astadkoms genom samodling av dessa celler med en transformerande cellinje.

Den transformerande cellinjen var en Epstein-Barr kärn- antigen (EBNA)-oositiv lymfoblastoidhumancellinje, som härrörde fran etylmetansulfonat (EMS)-mutagenes av den lymfoblastoida cellinjen GM 1500, följt av selektion i närvaro av 30 ug/ml 6-tioguanin för att förläna cellerna brist pa hypoxantin-guanin-fosforibosyl-transferas (HGPRT) och saledes göra cellerna HAT-känsliga. Denna cellinje betecknas som 1A2-cellinjen och har deponerats vid the American Type Culture Collection (A.T.C.C.) den D? mars 1982 under A.T.C.C.-beteckningen Nr. CRL 8119. 1A2-celler i logaritmisk tillväxtfas suspenderades i HAT- medium och kombinerades därefter med E'PBMC i ett för- hallande av femton IAS-celler per PBMC. Cellblandningen utströks pa trettio rundbottnade mikrotiterplattor med 96 fack (Costar 3799) i en koncentration av 32000 celler/fack och i en volym av 200 ul per fack och inkuberades vid 37°C i fuktig atmosfär innehallande 6% C02. kulturer matades oa dagarna 5 och 8 efter utstrykning genom ersättning av halva den överliggande vätskan med färskt HAT-medium. Sexton dagar efter utstrykning konstaterades att 100% av facken innehöll prolifererande celler och att i de flesta av facken cellerna hade tillräcklig densitet för avlägsnande och analvs av de överliggande vatskorna med avseende pa anti-E. aeruginosa-anti- -kroppar.

De överliggande vätskorna underkastades screening med avseende pa närvaron av anti-E. aeruginosa-antikroppar 10 15 20 25 35 4: under användning av den i exempel 2 beskrivna ELISA-tek-Å niken men med följande modifikationer. En pool av de sju Fisher-immunotyp-referensstammarna (A.T.C.C. Nr. 27312- 2731e> bands :iii fiatboctnade' mikrotiterplattor med 96 fack (Immulon II, Dvnatech), som hade förbehandlats med poly-L-lysin, inkuberades och _ tvättades sasom beskrivits i exempel 2. Efter blockering! av icke-specifika bindningsställen och tvättning av i plattorna sattes 50 pl PBS innehallande 0,1 volymï Tween-år -20 och 0,22 (vikt/volym) BSA till varje fack. överligganšgp de odlingsvatskor (SO pl) replikatutströks därefter i motåif svarande fack pa analysplattorna och pa kontrollplattor,,j_ som hade behandlats med PLL och blockerats men som ej innehöll bakterier. Efter inkubering och tvättning sattes: enzymkonjugerade andrastegs-antikroppar (50 ml per fack>,_ pepparrotsperoxidas-konjugerat get-anti-human- Igß och get-anti-human-IgM, som pa lämpligt sätt hade spätts i PBS innehallande 0,1 ESA, beskrivits i exempel ¿. vøiymx Twesn-20 och 0,22 (vikt/voiymfa till facken och analysen fullbordades sasom överliggande vätskor. som innehöll antikropp som band till poolen av Fisher-immunotyper men ej till kontroll- plattan, analyserades en andra gang under användning av _ var och en av de sju Fisher-immunotyp-bakterierna separati Antikropp närvarande i den överliggande vätskan fran ett 20Hi1. n :l band endast till Fisher-immunotyperna 2, 6 “ aeruginosa. upprepade ganger med minskande laga celldensiteter till fack, och 7 av E. Cellerna underkastades subodling dess samtliga fack med tillväxt avsöndrade antikropp.

Cellinjen och den monoklonala antikroppen (lgfi-isotyp) identifieras bada med beteckningen 2OH11 i det följande.

En andra transformation utfördes, där källan till B- -celler härrörde fran periferiblodet fran en patient med :lr systisk fibros och som var känd att ha en kronisk E. H aeruginosa-infektion. E'PBMC framställdes sasom §_ s0¿ 421 10 15 20 25 30 35 506 421 44 beskrivits ovan och samodlades med den transformerande cellinjen. 1A2, i ett förhallande av 72 IAS-celler per E'PBMC. Cellblandningen utströks i femton rundbottnade mikrotiterplattor med 96 fack i en koncentration av 7,4 10* celler per fack och odlades enligt ovan. overliggande vätskor analyserades medelst ELISQ med avseende pa närvaron av anti- E. aeruginosa-antikroppar sexton dagar efter det att transformationen hade utstrykts.

Analysen utfördes sasom beskrivits för föregaende transfor- mation med undantag av att poolen av E. aeruginosa-stammar. som användes för den initiella screeningen. bestod av Fisher-immunotyp-referensstammarna F2. F4. Fb och F7 (A.T.C.C. nr. 27313. 27315, 27316 och 27317) och tre kliniska isolat fran Genetic Systems Corporation Ürganism Bank (GSCDB), som hade olika LPS-immunotyper och flagell- typer. Det kliniska isolatet PSA 1277 (ESCÜB) uppbär flageller av typ a och Fisher-immunotyp 1 LPS; det andra isolatet PSA G98 (BSCÜB) uppbär flageller av typ a och LPS; och det tredje isolatet PSA Fó25 (GSCÜB) uppbär flageller av typ b och Fisher-immunotyp 5 Fisher-immunotyp 3 LPS. Denna blandning av referensstammar och kliniska isolat betecknas som den flagellära E. aeruginosa-poolen. överliggande vätskor, som innehöll antikropp. vilken band till plattor innehallande den flagellära E. aeruginosa- -poolen men ej till de FLL-överdragna kontrollplattorna, analyserades medelst ELISA en andra gang med avseende pa Ett fack, ECI. band och till de individuella stammarna i poolen. till referensstammarna F2. Fb och F7 det klinis- ka isolatet Fó25.

Kloning av cellinjen EC! utfördes genom att man först subodlade cellerna i tva omgangar med subkultur av lag densitet. först med 20 celler per fack i plattorna med 96 fack. följt av odling med 2 celler per fack. Formell kloning av de specifika antikropp-producerande cellerna utfördes genom att cellerna utströks i en densitet av cirka 1 cell/fack i Terasaki-plattor med 72 fack (Nunc UI 10 15 _20 25 30 35 506 421 #1-36538) i en volym av 10 pl/fack av HAT-medium, som saknade aminopterin-komponenten (HT-medium). Plattorna -v placerades i en inkubator under 2-d timmar för att medge; avsättning av cellerna pa bottnen av facken och under- Ä söktes därefter mikroskopiskt av tva personer med avseen- de pa fack som innehöll en enda cell. Facken matades dag- ligen med HT-medium och när utväxten var tillräcklig överfördes cellerna till en rundbottnad platta med 96 fack. Alla fack med utväxt analyserades medelst ELISA med avseende pa E. aeruginosa-stammar, som uppbar flageller av typ b, och samtliga befanns producera den lämpliga antikroppen ifraga. Cellinjen och den monoklonala anti- kroppen identifieras bada med beteckningen ECI i (IgM-isotyp) följande text.

Det antigen som identifierades med 2OH11 och 361 var flageller sasom framgick av indirekt immunofluorescens och immunoblotting. Dessa metoder utfördes i huvudsak sasom beskrivits i exemplen 2 och 3. aeruginosa-stammar, referens-Fisher-immunotyper 27313, 27317 och 27318) fluoreecensanalys preparerades E. uppbar flageller av typ b, F2, Fb och F7 (A.T.C.C. nr. och en stamm upobarande flageller av typ a, referens-Fisher- (A.T.C.C. nr. 27315), Heferensstammarnas flagelltyp bestämdes genom -immunotyp 4 sasom beskrivits i exempel 3. typning med de monoklonala rattdjureantikrobparna PaF4 IVE3 och FA6 IIG5. l tion sasom beskrivits i exempel 2. Källorna till bada antikropparna var överliggande odlingsvatskor och det FITC-konjugerade reagenset var FITC-konjugerat ;et-anti- Burlingame, Cê) i spådd- 0.52 (flervärt) PBS, -human-Ig &Tago, (vikt/volym) 82-041-2, ningen 1:1OO i som innehöll -gammaglobuliner (Miles Scientific, Cat. No.

Naperville, IL) och 0,12 (vikt/volym) natriumazid som konserveringemedel.

Fluorescenefargning av antikropparna 2OHl1 och ÉC1 obeer-f verades endast med E. aeruginosa-stammar, som uppbar För indirekt immuno- som Dbjektglasen preparerades för examina-Å bovin- 506 421 46 ílageller av typ b, och ej med den stam som uppbar flageller av typ a, nämligen referens-Fisher-immunotypen 4. Det observerade fluorescensmönstret var ett sinuslinje- mönster härrörande fran ena anden av bakterierna. vilket visade att antikropparna band till bakteriernas flageller. 10 15 20 25 30 35 so§,421 47 ¿¿ ' lmmunoblotting utfördes sasom beskrivits i exempel 2 aeruginosa-re¥erens- 27313), och Renade šlageller av typ b fran E. stammarna Fisher-immunotyp 2 (A.T.C.C. nr. renade flageller av typ a fran referensstammarna Habs 6 och Habs 8 (A.T.C.C. vvwcv nr. och 33355) framställdes sasom beskrivits i exempel 3. Antigener separerades i en 10% polyakrylamidgel (se exempel 3) och överfördes till ett NCM. överliggande odlingsvätskor innehallande anti- 3C1, innehallande en icke-speci+ik humanantikropp och odlingsfl kropparna 2OHl1 eller överliggande odlingsvätskor medier inkuberades med NCM och reaktionen pavisades med 1 ett alkaliskt fosfatas-konjugerat get-anti-human-Ig (flëfi“ CA) Enzymsubstrat framställdes sasom vart) (Tago, Burlingame, utspätt i PBS innehållande 0,05 volymfi Tween-20. beskrivits i exempel 2. Immunoblottinganalysen visade atä _bada antikropparna band till ílagellinproteinet av Fisher- _.. -immunotyp 2 med molekylvikten Sauuü och ej till ¥lagel1inproteinet av Habs 6 med molekylvikten 51700 ochï ej heller till flagellinproteinet av Habs 8 med molekyl-šï. vikten 47200. Ingen reaktion konstaterades vare sig med qen icke-speci¥ika humanantikroppen eller odlingsmedierna.

Ytterligare bekräftelse pa att antikropparna 2OHll och H 361 band endast till flageller av typ b och ej till typ @,_ erhölls medelst ELISA, där Habs-stammar 1-12 bands indivi- duellt med PLL till ëacken i Immulon mikrotiterplattor i med 96 fack. Antikropparna band endast till Habs-stammarna 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 och 12, vilka är stammar som uppbäfl». <1ae4> J. clan. microbini., 2o=a4>.“ï typ b (Ansorg et al.

EXQMPLE 7 Exempel 7 askadliggör metoder +ör ¥ramstallning av en monoklonal humanantikropp, som binder till E. aeruoinosa~ -flageller av typ a.

Ett peri¥eriblodprov +ran en person, som hade immuniserafis med ett högmolekylart polvsackaridpreparat (Pier et al. 10 15 20 25 30 35 506 421 48 (1981) Infect. lmmun., 34:46l), tjänade som källa till E-celler. De enkärniga cellerna separerades fran blodet och befriades därefter fran T-celler sasom beskrivits i exempel 6. Cellerna frystes därefter i FCS innehallande 10% dimetylsulfoxid i en tank med flytande kväve. Vid ett senare tillfälle tinades cellerna snabbt vid 37°C, tvättades en gang i lscoves medium och atersuspenderades i HQT-medium. Cellstyrd transformation astadkomms genom samodling av E“PBMC med IAZ-celler i ett förhallande av 30 1A2-celler per E”PBMC. Cellblandningen utströks i 30 vävnadsodlingsplattor med 96 fack i en koncentration av 62000 celler per fack. Üdlingarna matades pa den sjunde dagen efter utstrykningen genom ersättning av halva volymen med HAT-medium. Cellproliferation konstaterades i 100% av facken pa den fjortonde dagen efter utstrykning och överliggande vätskor avlägsnades fran facken och analyserades vid denna tidpunkt.

De överliggande vätskorna analyserades medelst ELISA med aeruginosa-antikroppar genom användning av den flagellära E. aeruginosa-poolen avseende pa närvaron av anti-E. och PLL-behandlade plattor som kontroll, sasom beskrivits i exempel o. overliggande vätskor, som innehöll anti- kroppar, vilka band till den flagellära poolen men ej till PLL-kontrollplattorna, analyserades anvo pa de indi- viduella bakteriestammarna i den flagellära poolen. Ett ZIBB, ,.Å.._. fack, innehöll antikropp som band till PSA lax/, PSA G98 och referens-Fisher-immunotyp 4, vilka är de tre stammar i den flagellära poolen som uppbär flageller av typ a.

Kloning av cellinjen 2158 astadkomms sasom beskrivits i exempel 6 för cellinjen 3Cl med följande modifikationer i det formella kloningssteget. Efter det att facken i Terasaki-plattorna hade undersökts med avseende pa närvaron av en enda cell. överfördes varje cell fran Terasaki-plattan till ett individuellt fack 1 en rundbott- nad odlingsolatta med 95 fack i en volym av 100 ul HAT- 10 15 20 25 35 49 505 421 -medium. som saknade aminopterin~komponenten (HT-medium).

Icke transformerande. HAT-känsliga lymfoblastdida celler _: införlivades med samtliga fack i en densitet av 500 V celler/fack som matarceller. Fem dagar efter utstrykningg sattes 100 pl av HAT-medium till facken för att selektivå¿ döda matarcellerna. Facken matades anyo pa dagarna 7 ochi 9 efter utstrykning genom ersättning av halften av den överliggande vätskan med HAT-medium. Cellerna matades därr_ efter med HT-medium till dess cellerna hade tillrackligf,, densitet för att detektera närvaron av antikropp medelstí ELISA. Samtliga fack med utväxt producerade antikropp. 1 som band till E. aeruginosa-stammar uppbärande flageller: av typ a. Cellinjen och den monoklonala antikroppen (IgG1-isotyp) identifieras bada med beteckningen 2188 i följande text.

Det antigen som identifierades med 2138 var flageller sasom kunde visas med indirekt immunofluorescens och immunoblotting (se exempel 6 för en närmare beskrivning av teknikerna). Fluorescensfargning av antikropøen 2188 konstaterades endast med E.aeruginosa-referensstammen Fisher-immunotyp 4 (A.T.C.C. nr. 27315). som uppbär aeruginosa-referens- 27313). flageller av typ a. och ej med E. stammen immunotyp 2 (A.T.C.C. nr. som uppbär flageller av typ a. Det konstaterade flourescensmönstret¿ var ett sinuslinjemönster harrörande fran ena änden av ä bakterierna, vilket visade att antikroppen band till bakf teriernas flageller.

Immunoblotting utfördes sasom beskrivits i exempel 2.

Renade flageller av typ a fran E. aeruginosa-referens- _H stammen Habs 6 (A.T.C.C. nr. 33353) och renade flagellerfi av typ b fran E. aerudinosa-referensstammen Fisher-immuno- typ 2 (A.T.C.C. nr. 27313) framställdes sasom beskrivitsè. i exempel 3. Antigener separerades i en 10%-ig polyakrylê och överfördes till ett Nam. 1 amidgel (se exempel 3) överliggande odlingsvatskor, som innehöll antingen 21BB'šl eller en icke-specifik humanantikropp. och odlingsmedier: 10 15 20 25 30 35 506 421 fick reagera med NCM och reaktionen pavisades med ett al- kaliskt fosfatas-konjugerat get-anti-human-lg (flervart) och enzvmsubstrat sasom beskrivits i exemplen 2 och 6.

Immunoblottinganalysen visade att antikroppen ZIBB endast band till flagellinproteinet av Habs 6 med molekylvikten 51700 och ej till ílagellinproteinet av Fisher-immunotvp 'fl c med molekylvikten 53000. Ingen reaktion observerades med den icke-specifika humanantikroppen eller odlings- medierna.

EXEMPEL E Exempel 8 askadliggör skydd av möss, som passivt har immuniserats med anti-flagellära humanantikroppar 2OH11, 3C1 och 2188 mot infektion med E. modellen aeruginosa i med brand mus.

De monoklonala anti-+lagel1ära humanantikropparna testades i modellen med bränd mus (se exempel 4). _Antikropparna 21BB och IOH11 preparerades genom utfall- ning av överliggande odlingsvätskor, som hade slstrats av respektive cellinjer, med amoniumsulfat (slutkoncentration 50%) Mishell.

(Good et al., Selected Methods in Cellular Immunolooy, B.B. 5.M.. W.J. 27?-286). och Shiigi, Freeman & Co., iaao, red., San Francisco, CA, Fällningen soluoilisera- des i PBS, dialvserades mot PBS över natten vid 4°C och sterilfiltrerades därefter före administrering till djur.

Hallan till antikropp SBI och den använda icke-specifika anti-LPS-antikroppen som negativ kontroll vid denna under- sökning var överliggande odlingsvatska. Som positiv kontroll +är varje undersökning användes den lamoliga renade monoklonala rattdjursantikroopen PaF4 IWEE eller P4 Fëó IG5. fi IT m anvandes o S, S E U Den stam som uppbar ilageller av ty o ÉCÜÜ H ~~ _>4'_ TU ff I) a vid djurförsëken var det kliniska isolat (GSCÜE), stammen med flageller av typ o var det kliniska isolatet F. som uttrvcker Fisher-immunotvp 1 LP . och 10 15 2.0 25 30 35 soel421 som uttrycker Fisher-immundtyb 6 LPS. (0,45 ml) 0,05 ml) FSA A447 (GSCOB), Humanantikrnpparna §örblandades med bakterierna (mer än 5 LD.@°-doser i och invmpades under ear~ ekdrpan omedelbart efter det brannekadan hade astad- kommits. Resultaten av djurföreöken atgee i tabellerna III, IV och V.

TABELL III. kroppen 21B8 av anti-flagelltyp al vid modellen med bränd~ Skyddeetudie av den mdnoklonala humananti- mus Procentuell överlevnad pa dag: Behandling 1 2 T 4 5 6 7 8 9 Rattdjurs- 100 100 100 100 88 88 BB BB V88 -anti-flagell a, FA6 IIGSS HLI m år! _ an t i " 1 O O I O O 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO -flagell a, 2138 Hccman-anti- mc» c» c» o c» I c» o c» o -flagell D, 2OH11 PBS 100 25 12 M H D-l H b* n l-e H b-I IJ I-fl rJ *Möeeen inëekteradee under earekdrpan med mer än 5 LD,°°fi -doser av E. aeruginnea PSA A522.

*Den prdcentuella överlevnaden baserar eig pa antalet 506 421 möss som överlevde per grupp om atta djur. Dagarna avser efter astadkommande av brännskada och infektion. 3Renad antikropp (10 ug i 0,45 ml PBS) +örblandades med 5 bakterierna och administrerades under sarskorpan efter astadkommande av brannskada och in{ektion.

TABELL IV. Skyddsstudie av den monoklonala humananti- 10 kroppen 2OH11 av anti-flagelltyp b vid modellen med bränd mus* __________________________________________________________ __1 Procentuell överlevnad pa dag: 15 Behandling 1 I T 4 5 6 7 E Q RattdJurs-anti- -flagell b, 20 PaF4 IVEB= 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- -flagell b, 20H 1 1 100 100 1 00 1 00 1 00 100 100 1 00 1 00 2 5 Human-anti- -flagell a, 2 1 BB 1 00 0 0 0 0 0 0 0 0 3 0 Mgg 1 Ey- 30 0 0 0 0 0 0 0 0 *Mossen infekterades under sarekorpan med mer an 5 LD1°°- -doser av det kliniska E. aeruoinosa-isolatet FEA Q447. 35 *Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet möss som överlevde per gruoo om fem djur. Da efter astadkommande_av brannshada och infektion. 10 15 20 25 30 35 _-flagell b, U U so§0421 =Renad antikroop (10 pg i 0,45 ml PBS) förblandades med bakterierna och administrerades under sarskorpan efter astadkommande av brännskada och iníektion.

TABELL V. Skvddsstudie av den monoklonala humanantikroppgn 301 av anti-flagelltyp b vid modellen med bränd mus _____________.._.__.._..._______..________._____..___.._-__.__...___..._~'_. _... .i _: Procentuell överlevnad pa dag* H M b U 0 w W m Behandling 1 RattdJurs-anti- -flagell b, FaF4 IVE8$ 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- 301 100 100 80 80 SO BO BO 80 EG Icke-specifik monoklonal anti- ~LPS-antikropp 100 O O O O O O O 10 L ______________________________________________________ -..,......1 *Mössen infekterades -doser av PSA A447. under sarskorpan med mer än 5 LDiøø?Ä *Den procentuella överlevnaden baserar =ig pa antalet grupper om fem djur. Dagarna avser efter \f astadkommande av orannskada och in+ektion. 3Renad antikrooo (40 ug> administrerades intravenöst tvaw timmar före astadkommandet av brannskada och infektion.

En mycket signifikant overlevnad konstaterades hos möss, 10 15 20 25 30 35 lsoe 421 som hade behandlats med antikroppen av anti-flagelltyp a eller nagon av de tva antikropparna av anti-flagelltyp b efter infektion med motsvarande antigen. Ümvant dog BB-100% av de obehandlade men infekterade mössen eller de som hade behandlats med en icke-matchande anti- -flagellar monoklonal antikropp eller icke-specifik anti- -LPS-antikropp. Sasom kunde konstateras med de monoklonala rattdjursantikropparna (se exempel 4) skyddar de anti-4lagellara humanantikropparna specifikt mot letal- infektion endast av de organismer som uppbär motsvarande flagelltvp, d.v.s. humanantikroppen av anti-flagelltvp a astadkom skydd mot letalinfektion av den organism som uppbar flagelltyp a och icke typ.b och antikropoarna av anti-flagelltyp b skyddade möss, som hade infekterats med stammar uppbarande ëlagelltyp b men ej organismer uppbarande typ a. _}EMPEL 9 Exempel 9 askadliggör korsreaktiviteten hos de anti- -flagellara humanantikropparna 2OH11, 3C1 och BIBB med kliniska E. aeruginosa-isolat.

Kliniska E. aeruginosa-isolat (115). som hade erhallits fran sjukhus och kliniker och isolerats i huvudsak fran brännskador och blod, identifierades sasom uppoarande +lage1ler av typ a eller typ b genom typning med de monoklonala rattdjursantikropparna FA6 IIG5 eller PaF4 Femtiofem av de kliniska IVEB (se exemplen 2, I och 5). isolate identi¥ierades som uppbarande ilageller av tyo a 3 genom reaktion med den monoklonala rattdgursantakroppen Fâb IIGS och 5? identifierades som uopoarande tvo b genom deras reaktion med den monoklonala rattdjursantikroooen PaF4 IUEE.

Horsreaktiwiteten nos den monoklonala humanantikropoen av ti- anti-flagelltyp a, var omiattande genom att an kropoen kande igen 54 av de Eb kliniska :solat flëoïl som 10 15 _20 25 30 35 UI UI so§ 421 uppbar flageller av typ a. Morsreaktiviteten nos 2OH11 med de isolat som uppbar flageller av typ b var aven om- 7 fattande genom att 2OH11 kande igen samtliga S9 isolat (1002). I motsats härtill band den aterstaende monoklo- nala antikroppen av anti-flagelltyp b, 3C1, till endast 43 av de 59 isolaten (73%). Dessa resultat visar att EOHI1 binder till en pan-reaktiv epitop (d.v.s. en epitop> närvarande pa minst cirka 95% av de flagellara > E. aeruginosa-stammarna), medan ECI binder till en epitopï som ej är närvarande pa alla flagellinmolekyler av typ bla Även om antigenet av flagelltyp b ar serologiskt homDgentš“ vid analys med polyklonala antisera (Lanvi, B., supra), för 2OH11 och 3C1 överraskande att flagellerna av typ b su ra, and Ansprg, R., visar korsreaktivitetsmönstren har minst tva separata epitoper som kan identifieras av monoklonala antikroppar.

Den omfattande korsreaktiviteten hos antikropparna 2138 och 2OH11 med kliniska P. aeruginosa-isolat visar den speciella kliniska användbarheten av dessa antikroppar aeruginosa-infektioner. vid immunoterapi av E.

EXENPEL 10 Exempel 10 askadliggör metoder för +ramställning av ett vtterligare exempel pa en monoklonal humanantikropp, som binder till E. aeruginosa-ilageller av typ b, liksom denna antikropps skyddsaktivitet mot infektion med E. aeruginosa vid modellen med bränd mus.

En trans¥ormerad cellinje preparerades och klonades i »u huvudsak sasom beskrivits i exempel /, med undantag av att den transformerade cellblandningen utströks pa 20 vavnadsodlingsplattor med 96 tack i en koncentration av cirka 2250 E'PBMC per fack. dverliggande vätskor analy- serades initiellt medelst ELISA pa den flagellara poolen, med undantag av att Fisher- sasom beskrivits i exempel 6, Ü -immunotyp-referensstammarna e och 4 saknades 1 poolen. 10 15 20 25 30 35 506 421 Positiva fack analyserades därefter pa var och en av stammarna i den flagellära poolen inklusive Fisher-immuno- typ 2 och 4. Den slutligen isolerade cellinjen och den identifieras bada monoklonala antikroppen (IQG-isotyp) med beteckningen 12D7 i följande text.

Den monoklonala humanantikroppen 12D7 visade omfattande korsreaktivitet med isolat av anti-flagelltyp a och kande igen 54 av de 56 testade kliniska isolaten (96%), som Skyddsaktiviteten för den mono- tabell VI. uppbar flageller av typ a. klonala antikroppen 12D7 visas i Skvddsstudier- na utfördes i huvudsak sasom beskrivits i exempel 4, med undantag av att den infekterande dosen var 1 Lüiom och att den infekterande stammen var 1624, ett kliniskt isolat som uttrycker Fisher-immunotyp 2 LPS och flageller vav typ a.

TABELL VI. Skyddsstudie av den monoklonala humananti- kroppen 1207 av anti-flagelltyp a vid modellen med bränd mus* Procentuell överlevnad pa dag* Behandling: 1 I I 4 5 6 " 8 9 Human-anti- -flagell a, 120? 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- -Fisher 2 LP5. :H9 90 90 90 90 90 90 90 90 90 Rattdjurs- -anti-ïlagell a. 1165 100 100 100 100 100 100 100 100 100 10 15 20 25 30 35 sne 57 Human-anti- -flagell b, 15F4 100 37.5 25 25 25 25 25 25 25 ___-__.-____________.__.________.__.___.__.___________________.__.,.,.,Q..

*Mössen in+ekterades under sarskorpan med 1 Lüioo (950 CPU) av E. aeruginosa 1624.

*Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet överlevande möss per grupp om tio djur, med undantag av gruppen 15F4 där N=8. Dagarna avser efter astadkommande av brännskada och infektion. 0,5 ml PBS) intraperitonealt tva timmar före astadkommande av bränn- °Renad antikropp (50 pg i administrerades skada och infektion.

EXENPEL 11 Exempel 11 askadliggör framställningen av en monoklonal humanantikropp, som reagerar med E. aeruginosa av flagellf typ b, och skyddet av möss, som passivt har immuniseratswfld med denna antikroop mot infektion med E. aeruginosa vid modellen med bränd mus.

En transformerad cellinje preparerades och klonades i huvudsak sasom beskrivits i exempel 10, med undantag av att transformationsförhallandet 1A2 till B-cell var cirka? 6Û:1 och den trans+ormerade cellblandningen utströks pa femton plattor i en koncentration av cirka 1930 E'PBMC per fack.

E. stammar innefattande G98 3, ilagelltyp a) och 1739 {lagelltyp b) Cellen analyserades även pa en pool av aeru inosa- (Fisher-immunotyp (ett kliniskt isolat -immunotvp 5, och bekräftades pa en annan M" pool av E. aeruginosa-stammar: 1277. GQB, I73§ och Fisheršv P4, Fa och F?. -immunotyper F2, Den slutligen isolerade cellinjen och den utsöndrade monoklonala antikroppen 42 1 av Fisher1§ï 506 A421 (lgßl-isotyp) identifieras bada med beteckningen 288 i följande text.

En immunp+luorescensanalys, som utfördes med EEE, var positiv pa en Fisher-immunotypstam 2 av flagelltyp b men negativ pa en Fisher-immunotyp-referensstam 4 av ¥1agell- typ a. Vid test pa klinisk isolat reagerade 59/5? (1002) av isolat av flagelltyp b positivt.

Skyddsaktiviteten hos 288 visas i tabell VII.

Skyddsstudierna utfördes sasom beskrivits i exempel 10, med undantag av att klinisk isolat F1b4 (Fisher-immunotyp 4, flagelltvp b) användes för infektionen.

TABELL VII. Skyddsstudie av den monoklonala humananti- kroppen EEE av anti-flagelltyp b vid modellen med bränd mus* Procentuell överlevnad pa dagz Behandling 1 2 3 4 S é 7 B 9 Human-anti- -flagell b, 2B8= 100 89 89 89 89 B9 8? B? 89 Rattdjurs- -anti-flagell b.

PaF4 IVEB“ 100 100 100 100 100 100 90 90 90 Rattdjurs- -anti-Fisher 2 Lpg! VH3~ gg :Q 20 20 20 “Û 20 20 70 .__ *Mossen infekterades under sarskorpan med 1 Lßiøo (105 10 15 20 25 30 35 sø§ 421 CFU) av E. aeruginosa F1b4.

*Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet överlevande möss per grupp om tio djur, med undantag för: gruppen 288 där N=9. Dagarna avser efter astadkommande aya brännskada och infektion. 3Renad antikropp (SO ug i 0,5 ml PBS) administrerades _ intraperitonealt tva timmar före astadkommande av bränn-_» skada och infektion.

*Renad antikropp (5 pg i 0,5 ml PBS) administrerades intraperitonealt tva timmar före astadkommande av bränn~~ skada och infektion.

EXEMPEL 12 Exempel 12 askadliggör framställningen av en annan mono-g hlonal humanantikropp, som reagerar med E. aeruginosa avÉ flagel1typ_b, och skydd av möss. som har immuniserats passivt med denna antikropp mot infektion med E. aerugingea vid modellen med bränd mus.

En transformerad cellinje framställdes och klonades i huvudsak sasom beskrivits i exempel 7, med följande undantag. En annan individ immuniserades (Pier et al. (1984) 45:309) och tjänade som B-cellkälla och utstryk- ningsnivan av E“PBMC var cirka 2099 celler per fack.

Screeningen utfördes pa ooolade Fisher-immunotyper 1-7.-É Den slutligen isolerade cellinjen och den utsöndrade monoklonala antikroopen (lgß,-isotvp) identifieras bada ¿ med beteckningen 14C1 i följande text.

Vid klinisk drovninâ var 59/59 (1002) av isolat av flagelltvp b positiva med 14C1. škyddsstudierna utfördeså sasom beskrivits för exempel 1 tabell VIII. 11 ovan och resultaten visasl 10 15 20 25 30 35 _-Fisher 2 506 421 60 TABELL VIII. kroppen 1401 av anti-+lage1ltyp b vid modellen med bränd Skvddsstudie av den monoklonala humananti- mus* ll u ß L m w m n Behandling” 1 Human-anti- -flagell b, 14C1 100 100 100 100 100 90 90 90 90 Rattdjurs- -anti-flagell b, PaF4 IVE8 100 100 100 100 100 100 100 100 100 Human-anti- LPS, VHB 100 40 20 20 20 20 20 20 _________._.___________.________.____________________._____.___-< *Mössen infekterades under sarskorpan med mer än 1 LD1°° (90 CFU) av E. aeruginosa F1ó4.

*Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet överlevande möss per grupp om tio djur, med undantag av or open PaF4 IVE8 där N=?. u Dagarna avser efter astadkommande av brännskada och infektion.

°Renad antikropp (50 pg i 0,5 ml PBS) administrerades intraperitonealt tva timmar före astadkommande av brann- skada och in§ektion.

Av det ovan sagda ëramgar att cellinjerna enligt föreliggande uppfinning tillhandahaller medel för fram- ställning av monoklonala antikroppar och fragment därav, 10 sug 421 61 vilka är reaktiva med E. aeruginosa-flageller och kors- protektiva mot olika E. aeruginosa-stammar. Ett antal monoklonala antikroppar har överraskande isolerats, vilka var reaktiva med olika epitoper pa varje typ av flagell.

Antikropparna enligt föreliggande uppfinning medger en V mer ekonomisk och lättare framställning av pro+ylaktiska och terapeutiska beredningar för använding mot infektioner orsakade av de flesta Q. aeruginosa-stammar-L na. Vidare tillhandahåller cellinjerna antikroppar, vilka finner användning vid immunoanalyser och andra välkända förfaranden.

Claims (25)

soe,421 70 15 20 25 30 35 61 PATENTKRAV

1. Monoklonal antikropp eller bindningsfragment därav kännetecknad av att den har förmåga att specifikt reagera med en flagellär proteinepitop av Pseudomonas aeruginosa- bakterier till att hämma bakteriernas motilitet vilken monoklonal antikropp eller bindningsfragment därav skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosa-infektion.

2. Monoklonal antikropp enligt krav 1, kännetecknad av, att den har förmåga att blockera bindningen till epitopen av monoklonala antikroppar producerade av cellinjer med beteckningarna ATCC depositionsnummer HB 9129, HB 9130, CRL 9300 och CRL 9301.

3. Monoklonal antikropp enligt krav 1, kännetecknad av att den har samma bindningsspecificitet till en flagellär proteinepitop av Pseudomonas aeruginosa som någon av de monoklonala anti-kropparna med ATCC depositionsnummer HB 9129, HB 9130, CRL 9300 Och CRL 9301. '

4. Monoklonal antikropp enligt krav 3, kännetecknad av, att den är konjugerad med en markör med förmåga att till- handahålla en detekterbar signal.

5. Monoklonal antikropp enligt krav 4, kännetecknad av, att markören är ett fluorescerande medel eller ett enzym.

6. Beredning av monoklonala antikroppar, kännetecknad av, att en första av dessa monoklonala antikroppar har förmåga att reagera med en flagellär proteinepitop av flagelltyp a eller flagelltyp b av Pseudomonas aeruqinosa till att hämma bakteriernas motilitet och att den monoklonala antikroppen skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruqinosa-infektion. 10 75 _20 25 30 35 es

7. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att en andra av nämnda monoklonala antikroppar har förmåga att reagera med en flagelltyp som ej är reaktiv med nämnda första mono- klonala antikropp. išf

8. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att nämnda första antikropp är en monoklonal humanantikropp. 6

9. Beredning omfattande en eller flera monoklonala anti- kroppar eller bindningsfragment därav såsom definierats i krav 1, 6 eller 8 och en gammaglobulinfraktion från ånman- blodplasma och/eller ett antibiotiskt medel. á ' z

10. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att epitopen uppvisas av minst cirka 70% av flagellerna av typ b.@

ll. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att epitopen uppvisas enbart av flagellerna av typ b. '

12. Beredning enligt krav 11, kännetecknad av, att antikroppen är pan-reaktiv.

13. Farmaceutisk beredning, kännetecknad av, att denfi 2 innefattar en eller flera monoklonala antikroppar eller bindningsfragment därav såsom definierats i något avÅ I kraven 1, 6 eller 8 och en fysiologiskt godtagbar bäåare.

14. Farmaceutisk beredning användbar för behandling Ållar profylax av en Pseudomonas aeruginosa-infektion, känna- atc i reagerar med en aeruginosa till skyddar in vivo tecknad av, den innefattar en monoklonal antikro§p som flagellär proteinepitop av Pseudomog¿§f att hämma bakteriernas motilitet och som i mot Pseudomonas aeruginosa-infektion Ni: medel, en gammaglobulinfraktion från_human- antimikrobiellt blodplasma och en fysiologiskt godtagbar bärare. 506 421 10 15 20 25 30 35 64

15. Farmaceutisk beredning enligt krav 14, kännetecknad av, att antikroppen är en monoklonal humanantikropp och att gammaglobulinfraktionen från humanblodplasma har erhållits från människor med förhöjda nivåer av immunoglobuliner, som reagerar med Pseudomonas aeruginosa-bakterier eller produkter därav.

16. Farmaceutisk beredning innefattande minst två mono- klonala antikroppar, kännetecknad av, att var och en av antikropparna specifikt reagerar med en flagellär protein- epitop i olika typer av flagellärt Pseudomonas aeruginosa- protein till att hämma bakteriernas motilitet och kan behandla eller förhindra Pseudomonas aeruginosa-infektioner och att de skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosa- infektion.

17. Beredning enligt krav 16, kännetecknad av, att minst en av de monoklonala antikropparna är en monoklonal human- antikropp.

18. Beredning enligt krav 16, kännetecknad av, att den innefattar minst en monoklonal humanantikropp med förmåga att reagera med minst en serotypisk determinant på en lippolysackarid-molekyl av Pseudomonas aeruginosa och/eller en monoklonal antikropp, som reagerar med endotoxin A.

19. Cellinje, kännetecknad av, att den producerar en mono- klonal antikropp med förmåga att specifikt reagera med en flagellär proteintyp på Pseudomonas aeruginosa-flageller av typ a eller typ b till att hämma bakteriernas motilitet och att den monoklonala antikroppen skyddar in vivo mot Pseudo- monas aeruginosa-infektion.

20. Cellinje enligt krav 19, kännetecknat av, att den är en hybridcellinje. 10 15 20 25 30 Qi?

21. Cellinje enligt krav 19, kännetecknat av, att den producerar monoklonala humanantikroppar.

22. Cellinje enligt krav 19, kännetecknat av, att den är§ någon av cellinjerna ATCC depositionsnummer HB 9129, HB 9130, CRL 9300 OCh CRL 9301.

23. Sätt att producera monoklonala antikroppar, som är specifika med avseende på flagellära proteiner av Pseudomonas aeruginosa och hämmar bakteriernas motilitet och kan behandla eller förhindra Pseudomonas aeruginosa- infektioner, kännetecknat av, att man odlar minst en av cellinjerna enligt krav 22 och utvinner antikropparnå.

24. Sätt att påvisa närvaron av Pseudomonas aeruginogaiiï ett prov, kännetecknat av, att man kombinerar provetimed en monoklonal antikropp till en flagellär proteinepitop av Pseudomonas aeruginosa och som hämmar bakteriernas mdti- litet och skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosaÄ T z infektion, och detekterar komplexbildningen.

25. Testsats för användning vid påvisande av närvaron av Pseudomonas aeruginosa-bakterier, kännetecknad av, att den innefattar en monoklonal antikroppberedning innehållånfie minst en monoklonal antikropp, varvid antikroppen reagerar med en typ-specifik flagellär proteinepitop av bakterierna till att hämma bakteriernas motilitet och skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosa-infektion, och markörer som tillhandahåller en detekterbar signal kovalent bundna till antikroppen eller bundna till andra antikroppar, som reagerar med den monoklonala antikroppen.