SE506421C2 - Monoklonala antikroppar mot Pseudomonas aeruginosa och beredningar innehållande dessa, testsats innehållande beredningen, samt cellinjer uttryckande antikropparna - Google Patents
Monoklonala antikroppar mot Pseudomonas aeruginosa och beredningar innehållande dessa, testsats innehållande beredningen, samt cellinjer uttryckande antikropparnaInfo
- Publication number
- SE506421C2 SE506421C2 SE8702734A SE8702734A SE506421C2 SE 506421 C2 SE506421 C2 SE 506421C2 SE 8702734 A SE8702734 A SE 8702734A SE 8702734 A SE8702734 A SE 8702734A SE 506421 C2 SE506421 C2 SE 506421C2
- Authority
- SE
- Sweden
- Prior art keywords
- antibody
- antibodies
- monoclonal antibody
- aeruginosa
- pseudomonas aeruginosa
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1214—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Pseudomonadaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
10
15
20
25
30
35
506 421
l--J
byggande atgärder och behandling.
En metod som har beaktats är förstärkning av värddjurets
immunsvstem genom aktiv eller passiv immunisering. Sa
exempelvis har det konstaterats att aktiv immunisering av
människa eller försöksdjur med bakteriella helcells-
vacciner eller renade bakteriella endotoxiner fran Q.
aeruginosa leder till utvecklingen av specifika opsoniska
antikroppar riktade primärt mot determinanter pa de ater-
kommande oligosackarid-enheterna i de lipopolysackarid-
(LPS)-molekyler som är lokaliserade pa det yttre cell-
aeruginosa (se Pollack, M., Immunoglobu-
lins: Characteristics and Uses of Intravenous Prepara-
Alving, B.M.
79, U.S. Department of Health and Human Services, 1979).
membranet av E.
tions, och Finlayson, J.S., red., sid. 73-
Dylika antikroppar har, vare sig de har alstrats aktivt
eller överförts passivt, visat sig skydda mot de letala
verkningarna av en E. aeruginosa-infektion i en mangfald
och vid vissa preliminära
L.5. och Pollack,
119-
djurmodeller (Pollack, sugra)
undersökningar med människor (gg Young,
M., Pseudomonas aeruginosa, Sabath, L., red. sid.
32, Hans Huber, 1980).
Ovan angivna rapporter visar att immunoterapeutiska
metoder skulle kunna utnyttjas för att förebygga och be-
handla bakteriesjukdomar orsakade av E. aeruginosa, sasom
genom administrering av poolade humanimmunoglobuliner,
vilka innehaller antikroppar mot den infekterande stammen
eller de infekterande stammarna. Humanimmunoglobuliner
definieras i föreliggande sammanhang som den del a.
fraktionerad humanplasma som är anrikad pa antikroppar,
bland vilka finns representerade specifika antikroppar
mot stammar av E. aeruginosa. Till följd av vissa
inneboende begränsningar vid användning av humanimmuno-
globulinkomoonenter är fortfarande denna metod för be-
handling av sjukdomar orsakade av E. aeruginosa föremal
10
15
20
25
30
35
soaí421
för undersökning (se exemgelvis Collins, M.S. och Roby,
R.E., Am. J. Med., 7ó(3A): 168-174, (1984), och för
närvarande finns icke nagra kommersiella produkter till-t;¿
gängliga som utnyttjar dessa komponenter.
En sadan begränsning förknippad med immunoglobulinbered-
ningar är att de utgörs av pooler av prov fran ett tusen- _
tal eller flera donatorer, vilka prover har valts ut i
förväg med avseende pa närvaron av speciella anti-Pseudofl
monas-antikroppar. Denna poolning leder till en Å
medelvärdestiter av individuella antikroppstitrar, vilket”
som bäst resulterar i mattliga ökningar i den
resulterande titern av de önskade antikropparna.
En annan begränsning är att själva preselektionsprocessen
kräver dyrbar kontinuerlig "screening" av donatorpoolen
för att ombesörja jämn produktkvalitet. Trots dessa an-
strängningar kan immunoglobulinprodukter fortfarande
uppvisa avsevärda variationer fran sats till sats och
bland produkter fran olika geografiska omraden.
Ytterligare en sadan begränsning som är inneboende hos
immunoglobulinberedningar är att deras användning W
resulterar i samtidig administrering av stora mängder avv
främmande proteinartade substanser (som kan innefatta I
virus sasom de vira som nyligen har visat sig vara
associerade med förvärvat immunbristsvndrom <ê:quired
lmmune Deficiencv Syndrome eller AIDS), med potential
att astadkomma ogynnsama biologiska verkningar.
Kombinationen av laga titrar av önskade antikroppar och
en hög halt av frammande substanser kan ofta begränsa,
till suboptimala nivaer, den mängd av specifika och
saledes gvnnsama immunoglobuliner som kan administreras
till patienten.
År 197? rapporterades Hohler och Milstein sin seminal-
10
15
20
25
30
35
506 421
upptäckt att vissa muscellinjer kunde sammansmältas
(fusioneras) med musmjältceller för skapande av hybridom,
som vart och ett skulle kunna utsöndra antikroppar med en
enda specificitet, d.v.s. monoklonala antikroppar
(Hohler, G. och Milstein, C., Nature, 256:495-497 (1975)).
Med tillkomsten av denna teknologi blev det möjligt att i
vissa fall framställa stora mängder av ytterst specifika
murinantikroppar mot en speciell determinant eller
determinanter pa antigener. Därefter blev det under
användning av senare utvecklad teknik möjligt att
framställa monoklonala humanantikroppar (se exempelvis
U.S. 4,464,4ó5, som införlivas med denna beskrivning
genom hänvisning därtill).
Det inses att i vissa situationer monoklonala
musantikroppar eller beredningar av dylika antikroppar
kan medföra problem vid användning pa människa. Sa
exempelvis har det rapporterats att monoklonala musanti-
ákroppar, som har använts vid försöksundersökningar för
behandling av vissa humansjukdomar, kan framkalla ett
immunsvar som gör dem ineffektiva (Levy, R.L., and Miller,
R.A., Ann. Rev. Med., 34: 107-116 (1983)). Med nyligen
gjorda framsteg inom rekombinant DNA-teknologi, sasom
framställning av chimera monoklonala mus/human-anti-
kroppar, kan dessa problem emellertid elimineras. Metoder
för framställning av monoklonala humanantikroppar är
ocksa nu tillgängliga (se, Human Hybridomas and
Monoclonal Antibodies, Engleman, 5.6., et al., red.,
Plenum Publishing Corp. (1985), som införlivas med denna
beskrivning genom hänvisning därtill).
Under användning av hvbridom- och/eller celltransforma-
tionsteknik har ett antal grupper rapporterat framställ-
ningen av monoklonala antikroppar, som skyddar mot
E. aeruginosa-infektioner. Monoklonala antikroppar har
framställts, vilka är reaktiva med avseende pa olika
10
15
20
25
30
35
SÛ6421
Ul
epitoper av fi. aerugihosa, innefattande specifika enkel- å
och multipelserotyp-vtepitoper. sasom det som aterfinns 1:,
LPS-molekuler hos bakterier (se exempelvis de amerikanska:
patentansökningarna 734,624 och 807,394, vilka bada införf
livas med denna beskrivning genom hänvisning därtill).
Man har även framställt protektiva monoklonala anti-
kroppar, som är specifika med avseende pa E. ag¿gg¿ggga; ß
-exotouin A (se exempelvis den amerikanska patentansök-
ningen 742,l70, som införlivas med denna beskrivning
genom hänvisning därtill).
Ehuru användning av monoklonala antikroppar, som är
specifika med avseende pa LPS-regionen av E. aergginosa
eller bakteriernas exotoniner, kan tillhandahalla till-
räckligt skydd i vissa situationer, är det i allmänhet
föredraget att ha bredare skyddsmöjlighet. Sa exempelvis
skulle det vid profylaktiska behandlingar med
avseende pa potentiella infektioner hos människa
vara föredraget att administrera en antikropp
eller antikroppar protektiva mot en mangfald
E. aeruginosa-stammar. Likaledes skulle det vid
terapeutiska tillämpningar, där serotypen eller
serotyperna av den infekterande stammen respektive de
infekterande stammarna ej är känd (a), vara föredraget
att administrera en antikropp eller en kombination av
antikroppar, som är effektiva mot de flesta, om ej alla,
av de kliniskt viktiga E. aeruginosa-serotyperna. Det 7
idealiska skulle vara att tillhandahalla antikroppar, som
är reaktiva oberoende av traditionella serotvpnings-
scheman.
En aspekt av E. aeruginosa-fysiologin, som har visat sig,
bidra till organismens virulens, är motiliteten, en för-
maga som härrör huvudsakligen fran närvaron av en flagell
Infect. and lmmun., 38:l29b-1298). E. aeruginosa utmärksï
10
15
20
25
30
35
506 421
av att uppvisa en enda flagell i ena anden av sin stavfor-
made struktur. Modellstudier med branda möss har visat
att en större procentuell andel möss överlevde när icke-
-mobila E. aeruginosa-stammar ympades i försöksbränn-
skador an när mobila stammar användes. (McManus, A. et
al. (1980), Burns, 6: 235-239 och Nontie. T.. et al.
(1982), Infect. and Immun., §§:1296-1298). ändra under-
sökningar avseende patogenesen av E. aeruginosa har
visat att djur, som har immuniserats med flagellantigen-
beredningar, skyddades da det brändes och infekterades
med mobila stammar av bakterierna (gg, Holder, I. et al.
(1982), lnfect. and Immun., 35: 276-280).
Vad som är viktigt är att E. aeruginosa-flageller har
studerats medelst serologiska metoder och har
rapporterats falla inom tva antigeniska huvudgrupper. som
betecknas H1 och H2 av E. Lanyi (1970, Acta Microbiol.
Acad. Sci. Hung.. 17: 35-48) och typ a och typ b av
Ansorg, R. (1978, Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Ürig. A,
242:228-238). Serologisk typning av flageller av bada
laboratorierna visade att Q;-flageller (Lanyi. B., sugra)
eller flageller av typ b (Ansorg. R., sugra) var
serologiskt homogena, d.v.s. nagra undergrupper har icke
identifierats. Denna serologiskt homogena flagelltyp be-
tecknas i det följande som typ b. Det andra huvud-
antigenet, H2 (Lanyi. B.. ggggg) eller flagell av typ a
(Qnsorg, R., sugra). innehöll fem undergrupper. Detta
antigen betecknas i det följande som flagell av typ a och
de fem undergrupperna som as, a,, az, as och aa. De fem
undergrupperna av typ a uttrycks i varierande kombina-
tioner hos olika stammar av E. aeruginosa. som uppbär
typ a, med undantag av antigenet ao. Antigenet ao
aterfanns pa alla flageller av typ a. ehuru graden av
dess expression varierade bland stammarna.
väfmê-
m
I-l
'Û
TJ
Ij|
ll
|U
Ett serotvoningsschema. som baserar
10
15
20
25
30
35
506 421
stabila somatiska huvudantigenerna av E. aeruginosa,
betecknas som Habs-schemat. vilket nyligen har införlivats
med schemat tillhörande the International Antigenic
Typing System (se Liu, Int. J. Syst. Bacteriol., 33:256
(1983).) Flagelltyperna av Habs-referensstammarna av
fi. aeruginosa har karakteriserats medelst immunofluor-
escens med polyklonala sera av R. Ansorg (1978, Zbl.
Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A, 242: 228-238) eller genom
1984, Q.
Clin. Hicrobiol., 20:84-BB). Habs-stammarna 2. 3, 4, 5,
objektglas-coagglutination (Ansorg, R. et al.,
ll och 12 ar stammar. som uppbär flageller av typ¿
b, och Habs-stammarna 1, 6, 8 och 9 uppbär flageller av
typ a. Ett stort antal av stammarna av E. aeruginosa
skulle saledes kunna kännas igen av ett litet antal monof
Vklonala antikroppar, som är specifika med avseende pa
flagellära proteiner.
Följaktligen föreligger ett signifikant behov av monoklo+
_nala antikroppar med förmaga att reagera med epitoper pa¿
flagellära proteiner och i vissa fall även med förmaga
att tillhandahalla skydd mot multipla serotyper av
E. aeruginosa. Vidare skulle vissa av dessa antikroppar
vara lämpliga för användning vid profylaktisk och
terapeutisk behandling av E. aeruginosa-infektioner
liksom vid diagnos av dylika infektioner. Föreliggande
uppfinning fyller dessa behov.
SAMMQNFATTNING QV UPFFINNINGEN
Nya cellinjer tillhandahalles, vilka kan producera
monoklonala antikroppar med förmaga att binda till
flageller närvarande pa de flesta stammar av
E. aeruginosa-bakterier. De monoklonala antikropparna
reagerar specifikt med epitoper pa flagellproteiner hos
E. aeruginosa och kan skilja mellan flageller av typ a
10
15
w'
25
30
35
506 421
och typ b hos bakterierna. Vidare tillhandahalles ett
sätt att behandla en människa, som är utsatt för infek-
tion av eller redan är infekterad med E. aeru inosa,
genom administrering av en profylaktisk eller terapeutisk
mängd av en beredning, som innehaller minst en monoklonal
antikropp eller bindningsfragment därav med förmaga att
reagera med flagellerna hos E. aeruginosa-stammar, varvid
beredningen företrädesvis även innefattar en fysiologiskt
godtagbar bärare. Beredningen kan även innehalla en eller
flera av följande: ytterligare monoklonala antikroppar
med förmaga att reagera med E. aggggiggäa-exotoxin A;
monoklonala antikroppar med förmaga att reagera med
serotyp-determinanter pa LPS av E. aeruginosa; en gamma-
globulinfraktion fran humanblodplasma; en gamma-globulin-
fraktion fran humanblodplasma, där plasman kan erhallas
fran människor som uppvisar förhöjda nivaer av immuno-
globuliner reaktiva med E. aeruginosa; och ett eller
flera antimikrobiella medel. Vidare tillhandahalles fram-
ställning av diagnostiska testsatser.
BESKRIVNING AV DE FÖREDRQGNA UTFÖRINGSFÜRMERNA
I enlighet med föreliggande uppfinning tillhandahalles
nya celler med förmaga att producera monoklonala
antikroppar och beredningar, som innefattar dylika anti-
kroppar, vilka beredningar selektivt kan känna igen de
aeruginosa-
varvid individuella antikroppar typiskt känner
flageller som är närvarande pa en mangfald E.
-stammar,
igen en typ av E. aggggiggga-flageller. Föreliggande
celler har identifierbara kromosomer, där mikroblinje-DNA
fran dem eller en förstadiecell har omlagrats för kodning
av en antikropp med ett bindningsställe för en epitop pa
ett flagellärt protein, som är gemensam för vissa
E. aeruginosa-stammar. För flagellara proteiner av typ a
kan pan-reaktiva monoklonala antikroppar framställas; och
för flagellära proteiner av typ b innefattas antikroppar.
10
15
20
25
30
35
506» 421
som är pan-reaktiva eller reagerar med minst cirka 70% av
de flagellbarande stammarna. Dessa monoklonala anti- 7
kroppar kan användas pa en mangfald olika satt inne¥attan4
de diagnos och terapi.
De monoklonala antikroppar som tillhandahalls pa detta
sätt är speciellt användbara vid behandling eller
profylax av allvarliga sjukdomar orsakade av
&. aeruginosa. aerugi~
Qgâå är tillgängliga 4ör direktkontakt med antikroppmole-
Ytproteinerna pa flagellerna av E.
kylerna, vilket saledes troligen skulle inhibera motili-
teten hos organismen och/eller underbygga andra verkningfi
ar som är gynnsamma {ör de infekterade varddjuren.
Framställningen av monoklonala antikroppar kan astad-
kommas genom immortalisering av en cellinje med förmaga
att uttrycka nukleinsyrasekvenser, som kodar för anti-
kroppar, vilka är speci¥ika för en epitop pa de
+lagellära proteinerna hos multipla stammar av E. aerugi-
nosa. Den immortaliserade cellinjen kan vara en daggdjursr
cellinje, som har transformerats genom onkogenes, genom
trans4ektion, mutation eller liknande. Dylika celler inne~
fattar myelomlinjer, lym+omlinjer eller andra cellinjer
med förmaga att underbygga eupressionen och utsöndringen
av immunoglobulinet eller bindningsfragment därav LQ
vitro. Immunoglobulinet eller fragmentet därav kan vara
ett naturligt förekommande immunoglobulin fran ett annat
däggdjur an de föredragna mus- eller humankallorna, som
zroduceras genom trans¥ormation av en lymíocyt, speciellt
en eplenocyt, med hjälp av ett virus eller genom samman-
emaltning av lym4ocyten med en neoplastisk cell.
exempelvis ett myelom, ¥ör framställning av en hybridcell-
linje. erhalles splenocyten fran ett djur, som
Typiskt
har immuniserats mot flagellära antigener eller ¥ragment:=
därav innehallande ett eoitopiekt ställe. lmmuniserings~
10
15
20
25
30
35
506 421
10
protokoll är väl kända och kan variera avsevärt men ända
vara effektiva. (se, Golding, Nonoclonal Antibodies:
Principles and PracticgL Academic Press, N.Y. (1983), som
införlivas med denna beskrivning genom hänvisning
därtill.)
Hybridcellinjerna kan klonas och underkastas screening i
enlighet med konventionell teknik och antikroppar i de
överliggande cellvätskorna kan pavisas, vilka har för-
maga att binda till flagellära E. aeruginosa-determinan-
ter. De lämpliga hybridcellinjerna ifraga kan därefter fa
växa i storskalig kultur eller injiceras i peritonealhalan
hos ett lämpligt värddjur för produktion av askites-
vätska.
Enligt en utföringsform av föreliggande uppfinning är
cellerna transformerade humanlymfocyter, som producerar
monoklonala humanantikroppar, företrädesvis protektiva ig
¿¿¿g, mot tillgängliga epitoper, som är specifika för
minst ett flagellärt protein. Lymfocyterna kan erhallas
fran humandonatorer, som är exponerade för eller har
exponerats för de lämpliga flagellbärande stammarna
ifraga av E. aeruginosa. En föredragen cellstyrd trans-
formationsprocess beskrivs i detalj i U.S. 4,4ó4,4ó5, som
införlivas härmed genom hänvisning därtill.
Genom tillgangen till antikropparna enligt föreliggande
uppfinning, vilka är kända att vara specifika för de
flagellära proteinerna, kan i vissa fall de överliggande
vätskorna vid efterföljande försök underkastas screening
vid en konkurrensanalys med föreliggande monoklonala anti-
kroppar som ett medel att identifiera ytterligare exempel
pa anti-flagellära monoklonala antikroppar. Saledes kan
hybridcellinjer lätt framställas fran en mangfald källor
baserad pa tillgängligheten hos föreliggande antikroppar,
som är specifika för speciella flagellära antigener.
10
15
20
25
30
35
_vilka är kända för varje djurart.
ses,
ll
När hybridcellinjer är tillgängliga, som producerar antij
kroppar specifika för föreliggande epitopiska ställen,
kan alternativt dessa hybridcellinjer sammansmältas med
andra neoplastiska B-celler, där dylika B-celler kan
tjäna som recipienter för genomisk DNA, som kzdar för
i synnerhet
receptorerna. Ehuru neoplastiska gnagar-,
rattdjur-B-celler är det som vanligen utnyttjas, kan
andra däggdjursarter användas, sasom hardjur, nötkreatur,
far, häst, svin, fagel eller liknande.
De monoklonala antikropparna kan tillhöra vilken som
helst av immunoglobulinklasserna eller- underklasserna,
sasom Igfi, IgD, Igâ, IgE, eller underklasser av IgG,
I allmänhet kan de
monoklonala antikropparna användas intakta eller som
sasom Fv, Fab, F(ab*)2,
bindningsfragment, men vanligt-
vis intakta.
Cellinjerna enligt föreliggande uppfinning kar finna
annan användning än för direkt framställning av de mono-f
klonala antikropparna. Cellinjerna kan sammansmältas medå
andra celler (sasom pa lämpligt sätt läkemedels-märkt Ü
humanmyelom, musmvelom eller lymfoblastoida hcmanceller)m
för framställning av hybridom och saledes tillhandahallaä
transferering av de gener som kodar för de monoklonala anti-i
kropparna. Alternativt kan cellinjen användas som en kälia
till de kromosomer som kodar för immunoglobulznerna, ä W
vilka kan isoleras och överföras till celler medelst
annan teknik än fusion. Vidare kan de gener som kodar för
de monoklonala antikropparna isoleras och användas i å
enlighet med rekombinant DNA-teknik för framstå lning avf f
det specifika immunoglobulinet i en mangfald -ärddjur. q
Genom preparering av CDNA-bibliotek fran budtarar-RNA kan
speciellt en enda cDNA-klon isoleras, vilken Lodar för V
immunoglobulinet och är fri fran introner, oc* införas tå»
421
10
15
20
25
30
35
506 421
12
lämpliga prokaryotiska eller eukaryotiska expressions-
vektorer och därefter transformeras till ett värddjur för
(se allmänt, U.S. 4,172,124;
och 4.423,147.
slutlig bulkframställning
4,350,ó83; 4,363,799; 4,38l,292; Se även,
Kennett et Monoclonal Antibodies, Plenum, New York
(1980)
al.,
och däri angivna hänvisningar, vilka samtliga
införlivas med denna beskrivning genom hänvisning
därtill.)
I enlighet med hybrid-DNA-teknologi kan närmare bestämt
immunoglobulinerna eller fragmenten enligt föreliggande
uppfinning framställas i bakterier eller jäst. (Se, Boss,
et al., Nucl. Acid. Res., 12:E791 och Wood et al., Nature
314:44ó, vilka bada införlivas med denna beskrivning
genom hänvisning därtill.) Sa exempelvis kan budbärar-
-RNA, som transkriberas frän de gener som kodar för de
lätta och tunga kedjorna av de monoklonala antikroppar
som produceras av en cellinje enligt föreliggande upp-
finning, isoleras medelst differentiell cDNA-hybridisering
under utnyttjande av cDNA fran andra BALB/c-lymfocyter än
föreliggande klon. mRNQ, som ej hybridiserar, är rik pa
de meddelanden som kodar för de önskade immunoglobulin-
kedjorna. Allt efter behov kan denna process upprepas för
att ytterligare öka de önskade mRNA-nivaerna. Den
avdragna mRNA-beredningen kan därefter transkriberas
omvänt för tillhandahallande av en cDNA-blandning, som är
anrikad med avseende pa de önskade sekvenserna. RNA kan
därefter hydrolyseras med en lämplig RNase och ssDNA kan
dubbelsträngas med DNA-polymeras I och slumpinitiatorer,
exempelvis slumpartat fragmenterad kalvtvmus-DNA. Den
resulterande dsDNA kan därefter klonas genom införande i
en lämplig vektor, exempelvis virus-vektorer sasom lambda-
pACYCl84.
-gfir
-vektorer eller plasmid-vektorer (sasom pBRu¿_.
etc.). Genom att framkalla prover baserade pa kända
sekvenser för de konstanta regionerna av de lätta och tunga
kedjorna kan sadana cDNA-kloner som innehaller den gen
10
15
20
25
30
35
5o6§421
som kodar för de önskade lätta och tunga kedjorna identi-f
fieras genom hybridisering. Därefter kan generna utskärafi
fran plasmiderna, manipuleras för avlägsnande av över- :
flödig DNA uppströms om initieringskodonen eller konstant
region-DNQ och därefter införas i en lämplig vektor för 7
transformation av en värdcell och slutligen expression av
genen.
Lämpligen kan värddäggdjursceller (exempelvis musceller)~*“
användas för bearbetning av kedjan (exempelvis förena det
tunga och lätta kedjorna) för framställning av ett intakf
immunoglobulin och vidare utsöndra immunoglobulinet fritt
fran ledarsekvensen. om sa önskas. Alternativt kan man V
använda encelliga mikroorganismer för framställning av dee
tva kedjorna, där ytterligare manipulation kan krävas föru
att avlägsna de DNA-sekvenser som kodar för den
sekret.riska ledaren och processignaler under det att de-
tillhandahaller en initieringskodon vid 5'-änden av den Ä
sekvens som kodar för den tunga kedjan. Fä detta sätt kan
immunoglobuliner framställas och bearbetas sa att de kan;
sammanföras och glykosyleras i andra celler än däggdjursfi
celler. Dm sa önskas kan var och en av kedjorna trunkerasš
sa att de bibehaller atminstone den variabla regionen, å
vilken därefter kan manipuleras för tillhandahallande av
andra immunoglobuliner eller fragment, som är specifika
för flagellat-epitoperna.
De monoklonala antikropparna enligt föreliggande upp-
finning är speciellt användbara pa grund av sin specifici*
tet för antigener hos praktiskt taget alla för närvarandev
aeruginosa-varianter.
antikropparna är dessutom protektiva Lg vivo,
kända E. Vissa av de monoklonala
vilket
medger införlivande därav med farmaceutiska produkter,
sasom antikroppkombinationer för bakterieinfektioner.
Monoklonala antikroppar enligt föreliggande uppfinning kan
10
15
20
25
30
35
506 421
14
även finna vidsträckt användning ig vitro. Sa exempelvis
kan de monoklonala antikropparna användas för typning av
mikroorganismer. för isolering av specifika E. aeruginosa-
för selektivt avlägsnande av E.
-stammar, aeruoinosa-
-celler i en heterogen blandning av celler eller liknande.
För diagnostiska ändamal kan de monoklonala antikropparna
antingen vara märkta eller omärkta. Typiskt innefattar
diagnostiska analysmetoder detektering av bildningen av
ett komplex genom bindning av den monoklonala antikroppen
till flagellen hos E. I omärkt
aeruginosa-organismen.
form finner antikropparna användning vid agglutinations-
-analyser. Vidare kan omärkta antikroppar användas i kom-
bination med andra märkta antikroppar (sekundära anti-
kroppar), som är reaktiva med den monoklonala anti-
kroppen, sasom antikroppar specifika för immunoglobulin.
Alternativt kan de monoklonala antikropparna märkas
direkt. En mangfald markörer kan användas, sasom radio-
nuklider, fluorescerande medel, enzymer, enzymsubstrat,
encym-cofaktorer, enzym-inhibitorer, ligander (speciellt
haptener), etc. Talrika typer av immunoanalysmetoder finns
tillgängliga och som exempel härpa hänvisas till de ameri-
kanska patentskrifterna 3,B17,827, 3,8SO.752. 3.901.654,
3, 35,074, 3,?84,S33, 3,996,345, 4,034,074 och 4,098,B76,
vilka samtliga införlivas med denna beskrivning genom hän-
visning därtill.
Vanligen utnvttjas de monoklonala antikropparna enligt
föreliggande uppfinning vid enzvm-immunoanalys. där före-
liggande antikroppar eller sekundära antikroppar fran en
annan art konjugeras till ett enzym. När ett prov. som
innehaller E. aeruginosa av en viss serotyp, sasom human-
blod eller lysat därav. kombineras med föreliggande anti-
kroppar inträder bindning mellan antikropparna och de
molekyler som uppvisar den önskade epitopen. Dwlika
celler kan därefter separeras fran icke-bundna reagens
10
15
20
25
30
35
5o@ 421
och en sekundär antikropp (märkt med ett enzym) till-
sättas. Därefter bestämmes närvaron av det antikropp-
-enzym-konjugat som är specifikt bundet till cellen.
Annan konventionell teknik, som är välkänd för fack-
mannen, kan även utnyttjas.
Testsatser kan även tillhandahallas för användning med
föreliggande antikroppar för att pavisa E. aeruginosa i
lösningar eller närvaron av flagellära E. ag;gQ¿gg§a-ant¶-
gener. Saledes kan föreliggande monoklonala antikropp- Å
beredning enligt föreliggande uppfinning tillhandahällasl
vanligen i lyofiliserad form, antingen separat eller till
sammans med ytterligare antikroppar, som är specifika med
avseende pa andra gram-negativa bakterier. Antikropparna,,,
som kan vara konjugerade till en markör eller vara
okonjugerade, ingar i testsatserna med buffertämnen,
sasom Tris, fosfat, karbonat, etc, stabiliseringsmedel,
biocider, inerta proteiner, exempelvis bovinserumalbuming
eller liknande.
I allmänhet är dessa material närvarande¿
i en mängd mindre än cirka 5 vikt%, räknat pa mängden av:
aktiva antikropp, och är vanligen närvarande i en total
mängd av minst cirka 0,001 viktï, anyo räknat pa anti-
kroppskoncentrationen. Ofta är det önskvärt att inför-
liva ett inert utdrygningsmedel eller excipient för ut-
spädning av de aktiva bestandsdelarna, varvid excipienten
kan vara närvarande i en mängd fran cirka 1 till 99 viktfl
av den totala beredningen. När en sekundär antikropp medq
förmaga att binda till den monoklonala antikroppen använ-
des, är denna vanligen närvarande i en separat ampull. Den;
sekundära antikroppen är typiskt konjugerad till en
markör och bereds pa ett sätt analogt med ovan beskrivnaw
antikroppsberedningar.
De monoklonala antikropparna, speciellt monoklonala
humanantikroppar, enligt denna uppfinning kan även införfi
livas som komponenter i farmaceutiska beredningar, vilkas
10
15
20
25
30
35
506 421
16
innehaller en terapeutisk eller profylaktisk mängd av
minst en av de monoklonala antikropparna enligt denna upp-
En farma-
finning och en farmaceutiskt effektiv bärare.
ceutisk bärare bör vara en kompatibel ogiftig substans,
som är lämplig för administrering av de monoklonala anti-
kropparna till patienten. Sterilt vatten. alkohol,
fetter, växer och inerta fasta ämnen kan användas som
bärare. Farmaceutiskt godtagbara adjuvantia (buffert-
medel, dispergeringsmedel) kan även införlivas med den
farmaceutiska beredningen. Dylika beredningar kan inne-
halla en enda monoklonal antikropp, som är specifik för
stammar av en flagellär typ av E. aeruginosa. Alternativt
kan en farmaceutisk beredning innehalla tva eller flera
monoklonala antikroppar för bildning av en "cocktail". Sa
exempelvis är en cocktail, som innehaller monoklonala
antikroppar mot bada typerna av flageller eller mot
grupper av de olika E. aeruginosa-stammarna (e empelvis
olika serotyper), en universalprodukt med aktivitet mot
det stora flertalet av de kliniska isolaten av denna
speciella bakterie.
Molförhallandet mellan de olika monoklonala antikroppskom-
ponenterna skiljer sig vanligen icke at med mer än en
faktor 10, vanligare icke med mer än en faktor 5, och mol-
>_\
förhallandet är vanligen cirka 1:1-e med avseende pa de
övriga antikroppskomponenterna.
De monoklonala antikropparna enligt föreliggande upp-
finning kan även användas 1 kombination med existerande
blodolasmaprodukter. sasom kommersiellt tillgängliga
gammaglobulin- och immunoglobulinprodukter. som användes
vid profvlaktisk eller terapeutisk behandling av
E. aeruginosa-sjukdomar hos människa. För immunoglobuli-
ner erhalles företrädesvis plasman fran humandonatorer,
1
som uppvisar förhöjda nivaer av immunoglobuliner, vilka
är reaktiva med avseende pa Q. aeruginosa. (För allmän
10
15
20
25
30
35
soe 421
17 É _ U
“Intravenous Immunef
Med.,
information hänvisas till kompendiet
Globulin and the Compromised Host," Amer. J.
7ó(3a), 1984,
30 mars, sid. 1-23 , vars innehall inför-
livas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.)
Föreliggande monoklonala antikroppar kan användas som
separat administrerade beredningar, som tillförs jämte
antibiotika eller antimikrobiella medel. Typiskt kan de
antimikrobiella medlen innefatta ett anti-pseudomonalt
penicillin (exempelvis karbenicillin) jämte en amino-
glykosid (exempelvis gentamycin, tobramycin, et:.>,
men talrika ytterligare medel (exempelvis cefaldsporiner),
som är välkända för fackmannen, kan även användas.
De monoklonala antikropparna och farmaceutiska bered-
ningarna därav enligt denna uppfinning är speciellt an-
vändbara för oral eller parenteral administrering. Före-
trädesvis kan de farmaceutiska beredningarna administre-
ras barenteralt, d.v.s. subkutant, intramuskulärt eller
intravenöst. Saledes tillhandahaller denna uppfinning
beredningar för parenteral administrering, vilka inne-
fattar en lösning av den monoklonala antikroppsn eller en
cocktail därav upplöst i en godtagbar bärare. företrädes-
vis en vattenhaltig sädan. En mangfald vattenhaltiga
bärare kan användas. exempelvis vatten, buffrat vatten,
O, 2 saltlösning, 0,32 glycin och liknande. Dessa
lösningar är sterila och i allmänhet fria fran partikel-vi
formigt material. Eeredningarna kan steriliseras medelst
konventionell välkänd steriliseringsteknik. Dessa bered-
ningar kan innehalla sadana farmaceutiskt godtagbara
hjälpsubstanser som krävs för att appronimera fysiologis-
ka betingelser, säsom pH-reglerande medel och buffert-
medel, tomicitetsreglerande medel och liknande, exempel-
vis natriumacetat, natriumklorid. kaliumklorid. kalcium-
-klorid, natriumlaktat etc. koncentrationen av antikropp
i dessa beredningar kan variera inom vida gränser, d.v.s.i
10
15
20
25
30
35
506 421
18
viktï, vanligen minst cirka l
viktï.
fran mindre än cirka 0,5
viktï till sa mycket som 15 eller 20 och valet
därav baserar sig primärt pa vätskevolymer. viskositeter
etc., allt efter det valda administreringssättet.
Saledes kan en typisk farmaceutisk beredning för intra-
muskulär injektion framställas innehallande 1 ml sterilt
buffrat vatten och 50 mg monoklonal antikropp. En typisk
beredning för intravenös infusion kan framställas inne-
ha lande 250 ml steril Ringers lösning och 150 mg mono-
klonal antikropp. Aktuella metoder för framställning av
parenteralt administrerbara beredningar är kända eller
uppenbara för fackmannen och beskrivs närmare i detalj
Pharmaceutical Science, 15:e
exempelvis i Reminqton's
_uppl., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania
(1980), som införlivas med denna beskrivning genom hän-
visning därtill.
De monoklonala antikropparna enligt denna uppfinning kan
lyofiliseras för lagring och rekonstitueras i en lämplig
bärare före användning. Denna teknik har visat sig vara
effektiv med konventionella immunoglobuliner och inom
tekniken känd lyofiliserings- och rekonstitueringsteknik
kan användas. Det är uppenbart för fackmannen att lyofili-
sering och rekonstituering kan leda till varierande grad
av förlust av antikroppsaktivitet (exempelvis med konven-
tionella immunoglobuliner tenderar IgM-antikroppar att
uppvisa större aktivitetsförlust än Igü-antikroppar) och
för kompensation
att användningsnivaerna maste justeras
därav.
Beredningarna, som innehaller föreliggande monoklsnala
antikroppar eller en cocktail därav, kan administreras
för profvlaktisk och/eller terapeutisk behandling av
admini-
É. aeruginosa-infektioner. För terapeutiskt bruk
streras beredningarna till en patient, som redan har
10
15
20
25
30
so§í421
19
infekterats med en eller flera E. aeruginosa-serotyper, kg
en mängd som är tillräcklig för att bota eller atminstone
partiellt hindra infektionen och dess komplikationer. En
mängd. som är adekvat för att astadkomma detta, 5
definieras som en "terapeutiskt effektiv dos". Mängder,
som är effektiva för detta ändamal, beror pa infektionene
svarighetsgrad och det allmänna tillstandet hos
patientens eget immunsystem men varierar i allmänhet fram
kilo kroppsvikt,;
cirka 1 till cirka 200 mg antikropp per
varvid doser av 5-25 mg per kilo vanligen används. Nan
maste halla i minnet att materialen enligt denna
uppfinning allmänt kan användas för allvarliga sjukdoms-
tillstànd,
d.v.s. livshotande eller potentiellt livshotan
de situationer, speciellt bakteremi och endotonemi till
följd av E. aeruginosa.
Vid profvlaktiska tillämpningar administreras bered-
ningar, som innehaller föreliggande antikropp eller en
cocktail därav, till en patient som ej redan har infek-
terats av E. aeruginosa i syfte att förstärka patientens
resistens mot en dylik potentiell infektion. En sadan 7
mängd definieras som en “profylaktiskt effektiv dos". Vid:
denna användning beror även här de exakta mängderna pa
patientens hälsotillstand och allmänna immunitetsniva ment
varierar i allmänhet fran 0,1 till 25 mg/kilo, speciellt V
0,5-2,5 mg/kilo.
Enkel- eller multipeladministreringar av beredningarna
kan utföras med dosnivaer och doseringsmönster som be- A
stämmes av den behandlande läkaren. Under alla omständigjwm
heter bör de farmaceutiska beredningarna tillhandahalla
en mängd av antikroppen eller antikropparna enligt denna
uppfinning som är tillräcklig för effektiv behandling
eller profylax av patienten.
10
15
20
25
30
506 421
FÖRSÖHSEESFRIVNING
EXEMFEL 1
Exempel 1 askadliggör den metodik som användes +ör att
framställa en monoklonal antikropp fran rattdjur. vilken
binder speci4ikt till E. aeruginosa-flageller.
Tre manader gamla BALB/c-möss immuniserades intraperito-
nealt atta ganger med livskraftiga E. aeruginosa-bak-
terier av Fisher-immunotyp l och Fisher-immunotyp 2
(A.T.C.C. %27312 och #273l3) var eller varannan vecka
under totalt nio veckor. De initiella doserna av
bakterierna var 8 N 10* och 1 107 organismer per mus av
E. aeruginosa Fisher-immunotyp 1 respektive Fisher-
tiil ao-faiaigt
-immunotyp 2 och doseringen ökades ZO-
under loppet av immuniseringen.
Tre dagar efter den sista injektionen avlagsnades mjälten
fran en mus aseptiskt och en enkelcellsuspension fram-
stalldes genom försiktig rotation av organet mellan de
matterade ändarna av tva sterila objektglas. Enkarniga
mjaltceller kombinerades 1 ett förhallande av 4:1 med
(NSI-1, erhallna fran Dr. C.
England)
musmyelom-log-fas-celler
Milstein. Molecular Research Council. Cambridge.
och íusionerades för alstring av hvbridom enligt det för-
+arande som har beskrivits av Tam et al. (1?82, Infect.
lmmun., 3é:1042-1053). Den slutliga hybridcellsuspen-
sionen spaddes till en koncentration av 1,5 u 10° celler
per ml i RPMI-hvbrid-HAT (RPMI 1640 (Gibco, Grand Island,
NY) innehallande 1-2 värme-inaktiverat kalv¥ostereerum,
1 mM natriumpvruvat, lüüpg/ml penicillin och strepto-
mycin, 1.0 r lO** M hypouantin. 4.0 10"? M aminopterin
och l.o 10"” M tvmidin). som innefattade 2,0 x 10° per
10
15
20
25
30
35
so@§421
ml av nyframställda BALB/c-tymocyter som matarceller.
Elandningen utströks (200 ul per fack) pa plattor med 96¿W
fack (#3596, Costar, Cambridge, MA). Hulturerna matades
genom avlägsnande och ersättning av 50% av volymen i
varje fack med färsk RPMI-hybrid-HAT varannan eller var_¿lf
tredje dag. överliggande odlingsvätskor analyserades med\
aeruginosa-antikroppar 0
när ceiiš
avseende pa närvaron av anti- E.
medelst enzymlänkad immunosorbensanalys
i facken,
växten nade natt cirka 40% sammanflytning van-V
ligen inom 7-10 dagar.
De överliggande odlingsvätskorna fran hybridcellerna
analyserades samtidigt pa yttermembranpreparat fran var
_och en av de tva immuniserande bakterierna. Yttermembranfi
preparat isolerades medelst en modifikation av den metod:
som har angivits av Tam et al. (1982. Infect. Immun.,
3b:l042-1053), som införlivas med denna beskrivning genom
Bakterierna aeruginosa Fisher-
hänvisning därtill. (E.
-immunotyp 1 och Fisher-immunotyp 2) ympades i tryptikasä
-soja-odlingsmedium (TSBV och fick växa lb-18 timmar vidQ
34°C under luftning i ett roterande skakbad. Bakteriernal?
skördades genom centrifugering och tvättades tva ganger
med fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 0,14 M NaCl. 3 mh
KC1, 8 mM NåzHPO4 -7 H20, 1,5 mfl HH=FÜ4, PH 7,2), som
innehöll ISO'trypsininhiberingsenheter (T.I.U.) aprotinin i
per ml (Sigma, St. Louis, M0).
Pelleten fran den slutliga centrifugeringen atersuspen-
derades i 0,17 M trietanolamin, 20 mM dinatrium-etylen-
(EDTA) och homogeniserades där-
-diamin-tetraättiksyra
efter pa is under 10 minuter. Cellfragmentet pelleteradee
fran homogenatet vid 14,900 x g och kasserades och den
överliggande vätskan centrifugerades anvo enligt ovan.
Pelleten kasserades anyo och membranen oelletiserades
fran den överliggande vätskan genom centrifugering vid
10
15
20
25
30
35
so6 421
l40,000 x g under en timme. Den överliggande vätskan
kasserades och membranpelleterna förvarades över natten
vid 4“C i 10 ml PBS,
ml. Nästa dag atersuspenderades pelleterna genom virvel-
som innehöll 75 T.I.U. aprotinin per
bildning och alikvoterades därefter och förvarades vid
-70'C. Proteinhalten hos varje pellet bestämdes medelst
den metod som har angivits av Lowry et al. (1951, Q.
Eiol. Chem., 193:2ó5-275).
ântigenplattorna för ELISA preparerades som följer.
Yttermembranpreparaten späddes till 5 pg per ml protein i
PBS och 50pl av lösningarna utströks i varje fack pa en
platta med 96 fack (Linbro #76-031-05, Flow Laboratories,
Inc., McLean, VA), förseglades och inkuberades över
natten vid 37°C. Übundet antigen avlagsnades fran plattor-
100 ul 5% bovinserumalbumin (BSA) i
na och (vikt/volym)
PBS sattes till varje fack och plattorna inkuberades
under en timme vid Z7°C.
Efter avlägsnande av icke-absorberat BSA replikatutströks
överliggande vätskor (S0ul) fran varje fack pa fusions-
i motsvarande fack pa antigenplattorna och in-
37°C.
plattorna
kuberades 30 minuter vid Den obundna antikroppen
avlägsnades fran facken och plattorna tvättades tre
ganger med 100 ul 1% (vikt/volym) BSQ-PBS per fack. Där-
efter sattes 50 ul per fack av pa lämpligt sätt utspätt
Inc.. Burlingame,
Vi d
biotinvlerat get-anti-mus-Igü (Tago,
CH)
I7°C.
ovan och därefter sattes till facken 50ul av ett i för-
till varje f ck och inkuberades under 30 minuter
a
Plattorna tvattades tre ganger sasom beskrivits
väg framställd avidin: biotinylerat pepparrotsperonidas-
(Vectastain ABC Hit, Vector Laboratories. Inc.,
CQ),
-komplex
Eurlingame, som hade framställts enligt till-
verkarens specifikationer. Efter 30 minuter vid rumstempe-
ratur avlägsnades Vectastain-reagenset fran facken,
facken tvättades enligt ovan och därefter tillsattes 100
10
15
BBQ
lf J
W
m1 per fack av substrat, o-fenylendiamin (0,8 mg/ml i
0,1 M citratbuffert, pH 5,0, blandat med en lika stor
volym 0,03 volymï H2D=).
minuter vid rumstemperatur i mörker och reaktionerna av-
bröts därefter genom tillsats av SO pl EN H2 S04 per
fack.
Hybridomceller, som avsöndrar monoklonala antikroppar,
.\:,a.
vilka binder till endera av de tva antigenpreparaten,
l
lokaliserades genom mätning av absorbansen vid 490 nm avà
rr
de kolorimetriska reaktionerna 1 varje íack med en
"Dynatech Model 580 NicroELlSA reader” (Alexandria, VA),å ä
Cellerna i
antikropp,
undersöktes närmare sasom
-immunotyp 2. Detta fack
beskrivs nedan.
Substratet inkuberades under Zfiš
ett fack med beteckningen Pa3 IVC2 producerade
som band endast till antigenplattan med Fishefá
10
15
20
25
30
35
506 421
24
Den monoklonala antikroppen och den klonala cellinjen
fran detta fack identifieras bada genom beteckningen Paï
IVC2 i följande text. Paš IVC2-celler fran moderfacket
miniklonades och klonades medelst den granssbädnings-
teknik som har beskrivits av Tam et al. (1982, lnfect.
Immun.. 36:lO42-1053).
som innehaller monoklonal
(BÅLB/C
Askitesvatska. antikropp med
hög titer, framställdes pa CBb F;-möss (honmöss)
C57BL/6 (hanmöss> Fl) enligt det förfarande som har
beskrivits av Tam et al. (1982, Infect. Immun., 36:1ü42-
1053 . Tva till tre manader gamla CBb F,-möss av hankön
erhöll injektioner intraperitonealt med 0,5 ml pristan
(2. 6, 10. 14-tetrametylpentadekan. Aldrich Chemical Co..
Milwaukee, NI) 10-21 dagar före intraoeritoneal injektion
med log-fas-Paš IVC2-celler i RPMI. Varje mus erhöll en
injektion av 0.5-1 107 celler i 0,5 ml. Efter cirka tva
veckor avlagsnades den ackumulerade vätskan fran mössen
varannan eller var tredje dag. Honcentrationen av anti-
kropp i askitesvätskan bestämdes medelst agaros-gelelek-
Beckman Instruments, Inc.. Brea, EA)
trofores (Paragon.
och all askites som innehöll 5 mg/ml eller mera antikropp
poolades, alikvoterades och frystes vid -70°C.
Harakterisering av det molekylära obiektmal som binds av
den monoklonala antikrobpen
overliggande odlingsvatska fran den klonade Pai IVC2-cell-
linjen analvserades medelst ELISA sasom beskrivits ovan
ba vttermembranbreparat fran samtliga sju Fisher-immuno-
aeruginosa (A.T.C.C. 27312-2?Z1B). E.
aureofaciens (A.T.C.C. 13?85)
(A.T.C.C. 8047).
tvpstammar av E.
och filebsiella pneumoniae
samtliga framställda enligt ovan. Anti-
kroooen Pai IVCI band till vttermembranpreparaten av
6 och 7 av E. aeruginoea men ej
till de övriga Fisher-immotvperna, E. agg§gi¿;¿§Q§. eller
Fisher-immunotvperna 2.
Q. gneumoniae.
10
15
20
25
30
35
,Fisher-immunotyperna 2, _,
506 å 421
Det specifika antigen som identifierades av antikroppen
Pa3 IVC2 identifierades medelst radioimmunprecipitation-Å»
I korthet innebär denna analysmetod att man inkuberar
radioaktivt märkta antigener med antikroppen Paï IVC2 och
en speciell källa till protein A, vilket resulterar i
bildningen av olösliga antikropp:antigen-komplex. Dessa
komplex tvättas för avlägsnande av eventuellt icke-specif
fikt bundet antigen och därefter dissocieras komplexen
och separeras i en polyakrylamidgel. De dominerande
radioaktiva ämnen som aterfinns i gelen identifieras
därigenom som motsvarande antigen eller antigener till
vilket eller vilka antikroppen Paï IVC2 binder.
Alikvoter (25 pg) av lösliga yttermembranpreparat fran
-v
~l
4 och 5 av E. aeruoinosa
märktes radioaktivt i fast fas med 1251 under använding W
av Iodo-gen (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (Fraker
och Speck, 1978, Biochem. Bioghys. Res. Commun., 80:84?-l
,857; Markwell och Fox, 1978, Biochemistry, 17:4807-4817)i
Detta förfarande resulterade i jodering av exponerade
tyrosinaterstoder av de flesta, om ej samtliga proteiner
ingaende i yttermembranpreparaten.
För att minska icke-specifik bindning av yttermembrananti~
genen till antikroppen Paš IVC2 inkuberades först de
(5 x
radioaktivt märkta preparaten 10* pulser per minut
Der analvs) under en timme vid 4°C med normalt BALB/c-muS-
serum (slutspädning 1:40). overliggande Paš IVC2-odlingsf
innehallande antikroppen Pa3 IVC2 sattes
Efter
vätska (0,5 ml)
därefter till vart och ett av yttermembranproven.
inkubering av antigen och antikropp under en timme vid
4°C tillsattes källan till protein A, lgG50RB (ü.Û95 ml
per prov) (The Enzyme Center, Inc., Boston, MA) och in-
kuberades under ytterligare 30 minuter vid 4°C (fiessler,{>
S.W., 1?75, J. Immunol., 115:1bl7-1622). IgGSORB fram-
ställdes enligt tillverkarens specifikationer ocn strax
före användning åörebvggdes icke-specifika reaktioner
10
15
20
25
30
35
under tio minuter och tillvaratogs i
506 421
26
genom blockering av potentiellt reaktiva ställen med
odlingsmedium genom tvättning av IgG5DRB tva ganger med
RPMI-hybrid
HAT).
(RPMI-hybrid-HAT-medium med uteslutning av
Antigen-antikropp-IQBSDRB-komplexen pelleterades vid
1500 x g under tio minuter vid 4°C, tvättades tva ganger
med fosfat-RIPA-buffert (10 mM fosfat, pH 7,2, 0,15 M
NaCl, 1,0 vo1vmZ Triton X-100, 1,02 (vikt/volym) natrium-
deoxicholat, 0,12 (vikt/volym) natriumdodecvlsulfat (SDS)
och 1,0 volymï aprotinin); tva
ganger med hög saltbuffert
1 volvml beta-
-merkaptoetanoll; (0.02 M
Iris-Hcl,
och en gang med lys-buffert
0,5 M Naßl,
1979,
pH 7,5, 0,05 volymk Nonidet P-40)
(Rohrschneider et al., Proc. Natl. Acad.
U.S.A., 76:4479-4483.
olemet,
(0.125 M Tris-HCl,
Sci.,
Antigen, som var bundet till kom-
frigjordes genom inkubering med orovbuffert
pH 6,8, 2% SDS, 2 volymï
vid 95°C
(vikt/volym)
beta-merkaptoetanol och 20 volymï glycerol)
den överliggande
vätskan efter centrifugering vid 1500 x g under tio
minuter.
De överliggande vätskeoroverna apolicerades därefter pa
14% polyakrvlamidgeler, som innehöll SDS och hade fram-
ställts medelst
(1978, FEBS Lett.,
(1?79. J. Bacteriol.,
den metod som anges av B. Lugtenberg et
5B:254-258)
140:902-?10).
al. modifierad av Hancock
och Carey som infër-
livas med denna beskrivning genom hanvisning dartíll)
gelen genom elehtrofores
Efter
ättik-
och antigenerna seoarerades i
over natten vid en konstant soänning av 50V.
fixering av gelen i 40 volymk metanol, 10 volvmï
svra och 5 volvmï glvcerol över natten torkades den pa
Whatman 3 MM-oaoper via en Biorad-geltorh (Richmond. CA).
Den torkade gelen täcktes med olastfilm och exoonerades
för Kodak X-AR-film under 18 timmar vid rumstemoeratur.
Resultaten av detta försök visade att Paš IVC2 band till
10
15
_20
25
30
35
5oe 421
27
endast ett antigen i yttermembranpreparatet av endast
F*-
Fisher-immunotyp s av E. aeruginosa och ej till nagot
annat antigen närvarande i de övriga yttermembranprepa-
raten. Molekylvikten (MV) åör antigenet i gelen var cirka“
53000 dalton, vid bestämning genom jämförelse av dess _
mobilitet med mobiliteten hos **C-märkt proteinstandard ågg
MV 92500; BSA, MV 69000: E
NV 3013043;
(fosforylas B. ovalbumin, MV
46000;
12000) (New England Nuclear,
kolsyraanhydras, cytohrom C, MV
Boston, MA), som separerades
i samma gel. Molekylvikten för detta antigen korreleradeÉ
med molekylvikten hos flagellin,
aeruginosa,
(1982, Infect.
förlivas med denna beskrivning genom hänvisning därtill.
det protein som utgör W
flagellerna hos E. sasom har rapporterats av¿
Montie et al. lmmun., 35:281-288), som inåt
Vidare undersöktes Paß IVC2 medelst ELISA under
användning av Habs-stammarna 1-12 av E. aeruginosa ;@~
mikrotiterplattor med 96 fack.
vilka +ixerades med etanol pa
Antigenplattorna prepa-
rerades som följer. -Ä
Kulturer av varje organism, vilka hade fatt sta över'
natten. pelleterades, tvättades tva ganger med PBS och
atersuspenderades däreíter i PBS till ett Aaèa-värde av
0.2 0.D.-enheter. De utsoadda bakterierna utströks i åachv
(50 ul per fack) och centrifugerades däreiter vid
PBS
till facken
1500 x g under 15 minuter vid rumstemperatur.
(95%)
Efter det att
luftades och därefter sattes etanol
under 15 minuter vid rumstemperatur.
etanolen hade avlägsnas +ran facken lufttorkades
plattorna och tacktes därefter och förvarades vid 4°C
till dess de skulle användas.
Resultaten av ELISA-testen, utförda sasom beskrivits
ovan. visade att Paï IVC2 band till de etanol4ixerade
Habs-stammarna 2, 3, 4, S, 7, 10. 11 och 12. Detta speci-
ficitetsmönster antydde att Paä IVCE band till
1978.
E. aeruginosa-+1age1lerna av typ b (Ansorg, R.,
10
15
20
25
30
35
506 421
28
Zbl. Bakt. Hyg.. I. Abt. Orig. A, 242:22 -238: Ansorg,
R.. et al.. 1984, J. Clin. Microbiol.. 20:84-BB. vilka
bada införlivas med denna beskrivning genom hanvisning
därtill). Baserad pa denna specificitetsbestämning med
avseende pa monoklonal Paï IVC2 uppbär E. aeruginosa-
-referensstammarna Fisher-immunotyp 2. Fisher-immunotyp 6
och Fisher~immunotyp 7 flageller av typ b. Av föregaende
försöksdata kan man dra den slutsatsen att Pa? IVC2
binder specifikt till E. aggggiggâg-flagellin av typ b.
SHYDDSAKTIVITET IN VIVO AV Päï IVC2
Djurförsök utfördes för att fastställa om den monoklonala
antikroppen Paš IVC2 skulle skydda en mus, som hade
utsatts för flerfaldiga LD=°-doser av levande
modellen var modellen
me., 1983,. g.
E. aeruginosa-bakterier. Den valda
M.S.,
Trauma, 23:530-534, som införlivas med denna beskrivning
med brända möss (Collins. and Roby,
genom hänvisning därtill). Grupper av möss utsattes för
en allvarlig brännskada enligt författarnas protokoll och
utsattes därefter omedelbart för 5-10 LD=°-doser av
Fisher-immunotyo 7. Monoklonal antikropp administrerades
intraperitonealt som högtiteraskites (0,2 ml intraperito-
nealt) före astadkommandet av brännskador och infektion.
Nagon ökning i antalet överlevande konstaterades ej hos
Paš IVC2-behandlade djur jämfört med sadana som ej erhöll
nagon antikropp.
EXEMPEL 2
Exempel visar metodiken för framställning ax en
rattdjurs-hvbridomcellinje. som alstrar en monoklonal
rattdjursantikropp mot E. aeruginosa-flagellin av typ b.
vilken skyddar ig vivo.
Vuxna BALB/c-möss av honkön erhöll först injektioner
intraperitonealt med livskraftig E. aeruginosa Fisher-
(ATCC Nr. 27317) (B x följt
-immungtyp g 10* organismer).
10
15
20
25
30
35
'29
tva veckor senare av en injektion med livskraftig
E. aeruginosa Fisher-immunotyp 5 (ATCC Nr. 27316) (4 x
Under den därpa följande tvaveckors-
aeruginosa Fisher-
lü* organismer).
perioden administrerades livskraftig E.
-immunotyp 5 och Fisher-immunotyp 6 tillsammans i tva inër
jektioner per vecka. Doseringen av varje organism ökadesn
sa att slutdoseringen var tiofaldigt större än den W
initiella doseringen. En sista injektion av yttermembran~
preparat av E. aeruginosa Fisher-immunotvp 6 (50 ug
protein), som hade framställts enligt den metod som har
and H. (1978, 1.
gavs fyra dagar efter den
angivits av R.E.N. Hancock Nikaido
sacteriui., 13e=3e1-390), sista
injektionen med livskraftiga bakterier. Tre dagar efter
den sista immuniseringen avlägsnades mjälten fran en mus
och mjaltcellerna preparerades för hybridisering sasom
beskrivits i exempel 1. r
överlíggande odlingsvätskor fran hybridomcellerna analy-H
serades med avseende pa närvaron av anti-E. aeruginosa-
-antikroppar medelst ELISA pa den tionde dagen efter
fusion enligt de förfaranden som anges i exempel 1, med
undantag av att antigenet för ELISA-plattorna var livs-
kraftiga bakterier, som hade immobiliserats i facken till
mikrotiterplattorna om 96 fack. Plattorna preparerades
som följer.
Femtio mikroliter poly-L-lysin (PLL) (1 ug/ml i PBS)
(Sigma #P-1524, St. Louis, MO) sattes till varje fack i
96-facks plattorna (Linbro) och inkuberades under 30
minuter vid rumstemperatur. Icke-adsorberat PLL avlägs-
nadee och facken tvattades tre ganger med PBS. Bakterie-V
kulturer, som hade fatt växa över natten i TSB, tvättades
en gang med PBS och atersuspenderades därefter i PBS till
ett
D.D.asa nm-värde av 0,2. Femtio mikroliter av
bakteriesuspensionerna sattes till varje fack i plattan
och fick binda vid 37°C under en timme. Icke-bundna bak-I
terier avlagsnades och därefter tvättades facken tre
ganger med saltlösning- Tween (O,9Z (vikt/volym) NaCl,
sne 421
10
15
20
25
30
35
506 421
“m
0,05 volymZ Tween-20).
Icke-specifik bindning av antikropparna blockerades genom
tillsats av 200 ul/fack av blockeringsbuffert (PBS
fettfri
Louis, MO)
innehallande 5% (vikt/volym)
(Sigma, St.
torrmjölk, 0.01
volymZ Antifoam A och 0,01%
(vikt/volym) timerosal) till facken och inkubering under
en timme vid rumstemperatur. överskottet blockerings-
buffert avlägsnades och facken tvattades tre ganger med
saltlösning-Tween sasom beskrivits ovan.
överliggande odlingsvätskor (50 ul) replikatutströks i
motsvarande fack pa analysplattorna och inkuberades vid
rumstemperatur under 30 minuter. De överliggande odlings-
vätskorna avlägsnades och facken tvattades fem ganger med
saltlösning-Tween.
En enzymkonjugerad andrastegs-antikropp (pepparrotsperoxi-
das-konjugerad get-anti-mus-Igß + IgM) (Tago, Inc.,
Burlingame, CA) späddes i PBS innehallande 0,1 volymï
Tween-20 och 0,22 (vikt/volym) BSA enligt tidigare
bestämda titreringar och därefter sattes 50 ul av
reagensen till varje fack och inkubering skedde 30
minuter vid rumstemperatur. överskottet reagens avlägs-
nades; facken tvättades fem ganger med saltlösning-Tween;
och 100 ul o-fenylendiamin-substrat per fack tillsattes
och inkubering skedde 30 minuter sasom beskrivits i
exempel 1. Reaktionerna avbröts sasom angivits i exempel
1 och därefter skedde avläsning vid A490 nm pa en Bio-Tek
EL-310 Automated EIA Flate Reader.
Medelst ovan beskrivna metoder analyserades de överliggan-
de odlingsvätskorna fran fusionen med avseende pa
som band till E. aeruginosa
men ej till
närvaron av antikroppar,
-u
Fisher-immunotyperna 1, 2. o eller 4,
kontrollplattorna. som hade framställts med samma PLL-
och blockeringsprocess men utan bakterier. overliggande
vilken band till nagon av
vätskor. som innehöll antikropp,
10
15
20
25
30
35
31
soag421
dessa fyra Fisher-immunotyper, analyserades en andra ganë.
under användning av var och en av de sju Fisher-immunotypf
Antikropp närvarande i den över- ll
PaF4 IVE8 band endast
6 och 7.
bakterierna separat.
liggande vätskan fran ett fack,
till E.
Celler fran facket FaF4 IVEB klonades genom gränsspäd-
aeruginosa Fisher-immunotyperna 2,
ningsmetoder sasom har beskrivits i exempel 1. Den monof
klonala antikroppen och den klonala cellinjen fran detta Å
fack identifieras bada med beteckningen PaF4 IVE8 i föl-V
jande text. Askitesvatska innehallande hög titer av monof
klonal antikropp producerades sasom beskrivits i exempel í“
med undantag av att BALB/c-möss användes istället för
CBóF;.
SPECIFICITET HOS E_E4 IVEB
En analys, som utfördes för att identifiera det antigen
som bands av den monoklonala antikroopen PaF4 IVE8, var
indirekt immunofluorescens ba bakterieorganismer. Var ooh
en av de sju Fisher-referensimmunotyperna av E. aeruoinåsa
plus en icke-flagellär stam av E. aeruginosa (PAIOE, _::
A.T.C.C. 29260, Leifson, 1951, J. Bacteriol., 62: 377-38%)
och Esgner-ichia ägg
37°E i TSB. Bakterierna pelleterades genom centrifu-å
gering och tvättades därefter tva ganger i PBS.
växa över natten
vid
Varje
stam atersuspenderades i PBS till ett 0.D.a.°nm-värde aví
P- Fl
32
fy:
Bakteriesusoensionerna späddes därefter ytterligare i fön-
hallandet 1:150 och orover om 20 ul placerades i de indifg
viduella facken pa Carlson-objektglas (Carlson Scientifié
Inc., Peotone. IL) och torkades pa objektglaset vid 4Ü'C¿
överliggande odlingsvätskor (25 ul) av PaF4 IVE8 inkube-í
rades pa de torkade bakterieproverna pa objektglasen i en
fuktkammare vid rumstemperatur under 30 minuter. i
Icke-bunden antikropp tvättades bort fran objektglasen
genom att dessa doppades i destillerat vatten. fa
10
15
20
25
30
35
506 421
Efter det att objektglasen hade torkats inkuberades
(FITC)-konjugerad get-anti-mus-
PBS)
fluorescein-isotiocyanat
-Igß + IgM (25 ul per fack i
CA)
en spadning av 1:40 i
(Tago, Burlingame. pa objektglasen under 30 minuter
vid rumstemperatur i en fuktkammare i mörker.
Übjektglasen tvattades anyo i destillerat vatten och
torkades och tacktes därefter med ett tackglas.
PBS (9:1).
SOM
monterades med glycerol i Übjektglasen
studerades därefter i ett fluorescensmikroskop.
Fluorescensfärgning observerades endast pa Fisher-immuno-
typerna 2, 6 och 7 av E. aeruoinosa och konstaterades
vara ett sinusformat mönster (linje). som utgick fran
endast en ande av organismerna. Detta Etår i överens-
stammelse med morfologin hos och lokaliseringen av den
enda polara flagellen hos dessa bakterier.
Reaktionen mellan PaF4 IVE8 och flageller bekräftades
medelst immunoblotting-analys. Yttermembranantigener fran
_E. aeruginosa Fisher-immunotyp 6 (se exempel 1)
separerades genom elektrofores i en 14% polyakrylamidgel,
som innehöll SDS. sasom beskrivits i exempel 1. med
undantag av att elektroforesen kördes under fem timmar
vid en konstant strömstvrka av SO mëmp. I förväg färgade
molekvlviktsmarkörer (lvsozym, MV 14300; beta-laktog1o-
MV 18400;
bumin. MV 43000;
B, MV 97400;
MD)
alfa-chymotrypsinogen. M 25700: oval-
MV 58000:
(BR-L,
bulin,
bovinserumalbumin. fosforvlas
och myosin. MV 200000 Gaithersburg,
införlivades med samma polyakrvlamidgel.
Antigener överfördes fran polyakrylamidgelen till ett
nitrocellulosamembran, (NCM). (0,45 um. Schleicher &
Schuell. Keen. NH) 1
(1979),
en Tris-glvcin-metanol-buffert
Natl. Acad. U.5.A.,
SDB,
Inc..
(Towbin et al. Proc. Sci..
7ó:4350-4354). innehallande 0,052 (vikt/volym) över
natten vid 4°C vid en konstant strómstvrka av 200 mA.
Efter ëverföringen inkuberades NCM i 0.05 volvmï Tween-20
i PBS E.. et 1982, Q.
(PBS-Tweeny (Batteiger,
10
15
20
25
30
35
506 421
Immunol. Meth., 55:297-307) under en timme vid rums-
temperatur. För detta steg och samtliga efterföljande steg
placerades den bricka som innehöll NCM pa en skakplatt-
form för att ombesörja fördelning av lösningen över helaww
NCM.
Efter en timme avhälldes PBS-Tween-lösningen och PaF4
IVEB-askites (spädd 1:1000 i PBS-Tween)
inkuberades med NCM under en timme vid rumstemperatur.
tillsattes och
NCM tvättades därefter fem ganger, fem minuter varje
gang, med PBS-Tween för att avlägsna icke-bunden
antikropp. Alkaliskt fosfatas-konjugerad get-anti-mus
IgG+lgM
specifikationer och inkuberades med NCM under en timme
(Tago, Inc.) späddes enligt tillverkarens
vid rumstemperatur. NCM tvättades fem ganger sasom
»beskrivits ovan och ett substrat, som innehall bromklor-g
indolylfosfat och nitroblatt-tetrazolium (Sigma.
St.Louis, MD) och hade framställts sasom beskrivits av
Leary et al. (1983, Natl. Acad. U.S.A.,
eo-4045-4049),
Froc. Sci.,
tillsattes och inkuberades 10-20 minuter
sub-
vid rumstemperatur. Reaktionen avbröts genom att
stratet borttvättades med destillerat vatten.
visade att PaF4 IVEB band
specifikt till ett enda antigen med en molekylvikt av
Resultaten av detta försök
53000 dalton i yttermembranpreparatet. Resultaten av den_
indirekta immunofluorescens-analysen och immunoblotting
visar att PaF4 IVES binder till flagellerna hos E. aerugi-
HDSå.
Den flagelltyp som PaF4 IVEB kände igen bestämdes medelst
ELISA. Habs-stammarna 1-12 (A.T.C.C. #33348-Ešïíë) bands
var och en till facken i mikrotiterplattor om 55 fack
(Linbro) med PLL och ELISA utfördes sasom beskrivits
tidigare i detta exempel. Källan till antikropcen PaF4 g\
IVES var överliggande odlingsvätska. Positiva reaktioner:
som innehöll Habs-stammarna E, 3. 4,
vilket visar att PaF4 IVEE binder
konstaterades i fack,
5, 7, io, 11 och 1:,
10
15
20
25
30
35
5oeg421
55-4
till flageller av typ b. Skyddsdata bestämda LQ vivo
aterges nedan i exempel 4.
EXEMPEL 3
Exempel 3 visar metodiken för framställning av en ratt-
djurs-hybridomcellinje, som producerar den monoklonala
antikropp vilken är reaktiv med anti-E. aeruginosa-fla-
geller av typ a och skyddar Lg vivo.
Lymfoidcellkällan för fusionen var en mjalte fran en
immuniserad BALB/c-mus, som hade erhallit injektioner
fyra ganger intraperitonealt under en sexveckors-period
av renade flageller typ a fran Habe-
(â.T.C.C.
(10-20 pg protein)
333353 och 33355).
-stammarna 6 och B
Flagellerna renades enligt den metod som har angivits av
T.C. (1982, 35:28!-288,
införlivas med denna beskrivning genom hänvisning
Montie et al. Infect. Immun., som
därtill) med undantag av att den slutliga centrifugering-
en av flagellerna utfördes vid 100000 x g under en timme
och ej vid 40000 x g under tre timmar. En andra modifika-
tion som gjordes vid vissa förfaranden var att
flagellerna fran bakterierna underkastades skjuvning
under 30 sekunder i en blandare istallet för under tre
1985, Infect. lmmun.. 49:770-
minuter. (Allison et al..
774).
Proteinkoncentrationerna hos varje preparat bestämdes med
(Bio-Rad. Richmond. CA)
(LFS)
Bio-Rad Proteinanalys och
närvaron av kontaminerande lipopolysackarid fast-
stalldes genom mätning av HDD-halten (Harkhanis, Y.D.. et
85:595-601).
Anal. Biochem., Molekvívikterna
al.. 1978,
hos flagellproteinerna bestamdes genom att man jämförde
en SDS-polyakrylamidgel med migreringen
Molekyl-
deras migrering i
hos proteinstandardmarkörer (BRL) (se exempel I).
vikten för Habs e-flagellin var 51700 dalton och för Habs
E-flagellin 47200 dalton. Dessa värden stammer överens
med de som har erhallits av J.S. Alllison et al. (1985.
10
15
20
25
30
35
49:770-774, som införlivas med denna be~
skrivning genom hänvisning därtill).
Infect.Immun.,
Fusion av splenocyter fran flagellin-immuniserade möss P
och NS-1-myelomceller utfördes tre dagar efter den sistaï
immuniseringen sasom beskrivits i exemplen 1 och 2. När
hybridomcellerna växte till en konfluens av cirka 40%
(dag 7) replikatutströks överliggande odlingsvätskor i
motsvarande fack hos tre olika antigenplattor. PLL-bunden T
E. aeruginosa Fisher-immunotyp 1 (se exempel 2 för prepaf
rering) och formalinfixerad Habs 6 och Habs 9.
Bakterierna för de formalinfixerade antigenplattorna ficfiu
växa.
na antigenplattor. Utspädda bakterier
vid A,.°) sattes till de individuella facken (50 ul per
fack) hos Linbro mikrotiterplattor med 96 fack och q
plattorna centrifugerades därefter vid 1200 x g under 20
minuter vid rumstemperatur. De överliggande vätskorna av?
_lägsnades fran facken och 75 pl av 0,2 vo1ymZ formalin i;
PÉS sattes till varje fack och inkuberades under 15
minuter vid rumstemperatur. Efter det att formalinet hade
avlägsnats fran facken lufttorkades plattorna och förvara-
des vid 4°C framtill användning. Formalin ändrade icke
antigeniciteten hos flagellerna, sasom framgar av
förmagan hos anti-flagell-antisera att agglutinera
formalin-behandlade organismer (Lanyi. B.. 1970, äcta
Hicrobiol. Acad. Sci., Hung.. 17:35-48). Stammen E. aeru¶,
giggäa Fisher-:mmunotyp 1 införlivades som kontroll efter
sasom framgar av V
Microbiol.. 1985,
Soc. Wash., D.C., p.
det fack som betecknade Fàé IIG5
som denna stam var icke-flagellär,
betfärgs-infärgning (Manual of Clin.
Lennette. red. ñmer. Microbiol..
1099). Hvbridceller i
producerade en antikropp, som band till Habs 6 och Habs Å
(bada stammar uppbarande flageller av typ a) men ej till,
Fisher-immunotyp 1.
Celler fran fack_FAó IIG5 underkastades subodling och
506 421
tvättades och späddes sasom beskrivits för PLL-bundw
(0,2 cam-enheter
10
15
20
25
35
36
klonades sasom beskrivits i föregaende exempel. Den mono-
klonala antikroppen och den klonala cellinjen fran detta
fack identifieras bada med beteckningen Fâó IIE5 i följan-
de text. Askites producerades i BALB/c-möss sasom beskri-
vits i exempel 2.
Specificitet hos FA6 IIG5
Specificiteten hos antikroppen Ffió IIE5 bestämdes medelst
indirekt immunofluorescens och immunoblotting. Indirekt
immunofluorescens utfördes i huvudsak sasom beskrivits i
exempel 2 med följande modifikationer.
Bakteriekulturer. som hade fatt växa över natten pa
tryptikas-soja-agar vid 30°C, avlagsnades fran plattorna
_med bomullstoppar och atersuspenderades i PBS till ett
9660-värde av 0,2 0.D.-enheter. Formalin (O,37 volvmï
slutkoncentration i PBS) sattes till suspensionen under
virvelbildning. Efter inkubering vid rumstemperatur under
15 minuter späddes bakterierna i förhallandet 1:12 med
PBS och EH ul av denna suspension placerades i de indivi-
duella facken pa Carlson-objektglas. Efter torkning prepa-
rerades objektglasen för mikroskopering sasom beskrivits
i exempel 2. Källan till antikropp var överliggande
odlingsvatska fran Fêé IIG5-cellinjen.
Fluorescerande färgning av Fâó IIG5-antikroppen konsta-
terades endast med E. aeruginosa-stammar uppbarande
flageller av typ a men icke med nagon av de som uppbar
typ b. Det observerade fluorescensmönstret var ett sinus-
format linjemönster. som visade att Fâb IIG5 band till
flagellerna. Fluorescenssignalen förstärktes genom be-
handling av bakterierna med formalin men behandlingen
krävdes icke för att visualisera den flagellara
fargningen med antikropoen.
exempel 2.
Immunoblotting utfördes s som beskrivits i
a
hallan till antigener av flagelltyp a var de renade
10
15
go
25
30
35
506 421
37
flagellara preparaten (se detta exempel). äntigenen
separerades i 10% polyakrylamidgeler innehallande SDB
(Laemmli. U.K., 1970, Nature 227:óBO-685) och
överfördes till ett NCM. Freparat av Fëó 1155,
överliggande odlingsvätska eller askites i spaddningen
(London),
antingen
l:1000, fick reagera med NCM och reaktionen pavisades medi
ett lämpligt enzvmkonjugerat reagens och enzymsubstrat 1
sasom beskrivits i exempel 2. Immunoblotting-analysen visade
att Fab 1165 bana spe=1+1kt till fiageiiin mv 51700 av
Habs 6 och flagellin MV 47200 av Habs B.
Bekräftelse pa att Fâb IIG5 reagerade endast med flagell-
-typ a och ej typ b erhölls med ELISA, dar Habs-stammar
1-12 bands individuellt med PLL till facken i Linbro
mikrotiterplattor med 96 fack. Antikroppen band endast
till Habs-stammarna 1, 6, 8 och 9, som är de enda
av de tolv stammarna som uppbär flageller av typ a, (se
Qnsorg, R., et al.. 1984, J. Clin. Microbiol., 20:84-88,
som införlivas med denna beskrivning genom hänvisning
därtill). Skyddsstudier gg vivg askadliggörs i exempel 4;
nedan.
EXEMPEL 4
Exempel 4 askadliggör skydd av möss, som passivt har
immuniserats med antikroppar FaF4 IVEB och Fâó IIGS mot
infektion av E. aeruginosa i modellen med brand mus.
De anti-flagellara'monoklonala antikropparna testades i
modellen med brand mus enligt den metod som nar beskri-
Robv (1983, J.
vits av M.S. Collins and R.E. Trauma,
of-=1o-5:4,
.'.-- n uæ
som införlivas med denna beskrivning genom
hänvisning därtill). För ekvddsstudier renades alla anti+§
kroppar medelst protein A-Sepharose-kromatografi (Ey,
P.L.. et al., 1978. Immunochemistry, 15:42?-43é. som in-
förlivas med denna beskrivning genom hanvisning dartill).
och dialvserades i PBS-buffert. Den stam som upobar
lageller av tvp a och som användes vid djurfärsöken var,
10
15
20
25
35
506 421
ie
E. aeru inosa PAEZO (fran Dr.
MQ)
E. agruginosa Fisher-immunotyp 2 (A.T.C.C.
James Pennington,
FIF
Boston,
och stammen av flagell-typ b var referensstammen
27313).
Fyrtio mikrogram av renad monoklonal antikrooo tillfördes
varje mus intravenöst 1-I timmar ¥öre astadkommandet av
brännskada och infektion.
skadan hade astadkommits erhöll djuren 0,5 ml
innehallande de infekterande bakterierna,
sarskorpan.
Resultaten
III
varje organism. av
Tabellerna I och
TABEL I.
-flagelltyo a
H
I l
-b
Behandling 1
Qfit i -f 1 agël 1 100 1 ÛÜ IC-'Ü
a, Fab 1165
100
Anti-flagell 100 20
b, PaF4 Ivee
Icke-soecifik
anti-LP5-mono-
klonal anti-
kropp 100
PBS. inga bakte-
rier
Lnfektionsdosen var cirka
Procentuell
vid modellen med bränd mus*
naii Pas,
under
10 LD=o-doser för
djurförsöken visas i
överlevnad pa dag*
100 90
10
80 50
w
w
90 BO
10 10
10
Omedelbart efter det att bränn-
Skyddsstudie av en monoklonal antikrooo av anti-
BO
10
10
30
01
*Möss infekterades under
med cirka
IÜ LDQQ'
10
15
20
25
30
35
so6 421
-doser av E. aeruginnsa PA220.
2Procentsi¥fran baserar sig pa överlevnaden hes möss i
grupper om tio djur, med undantag av kontrollgruppen med
endast Pas. 0
efter astadkommande av brannskada och infektion.
som bestod av fem möss. Dagarna är räknade
Tabell II. Skvddsstudie av en mondklonal antikropp av
anti-flagelltyp b vid modellen med bränd mus*
Behandling 1
Procentuell överlevnad pa dag2MÅm
h)
fl
-b
f.
O*
\|
N
6
Anti-flagell
b, PaF4 IVES 100 100 90 Q0 90 90 90 90
Anti-flagell
a, Fab 1155 :oo :o 10 10 10 10 lo lo aåxø
Icke-specifik
anti-LPS-mono-
klonal anti-
kropp 100 20 20 20 20 20 20 20 V20
PS5, inga
bakterier 100 100 100 100 100 100 100 100 _100
*Möss in¥ekterades under sarskornan med cirka 10 LD=°-
'ä
-doser av E.aeruginosa Fisher-immunetyp e.
2Prdcentsiffran baserar sig pa överlevnaden hos möss i
10
15
20
25
30
35
506 421
grupper om tio djur med undantag av kontrollgruppen med
endast PBS som bestod av fem möss. Dagarna är räknade
efter astadkommande av brännskada och infektion.
Mycket signifikant överlevnad konstaterades hos möss. som
hade behandlats med anti-a-antikropp eller anti-b-anti-
kropp och därefter infekterats med motsvarande antigen. I
motsats härtill dog 80-90% av de obehandlade men
infekterade mössen eller djuren. som hade behandlats med
en icke-matchande antiflagellär monoklonal antikropp
eller icke-specifik anti-LPS-antikropp. Üförmagan hos
antikroppen av anti-flagelltyp a att skydda moss fran en
letal infektion av E. aeruginosa Fisher-immunotyp 2, som
uppbär flageller av typ b, och oförmagan hos antikroppen
av anti-flagelltyp b att skydda möss fran en letal infek-
tion av E. aeruginosa PAEEO. som uppbär tvp a, bekräftade
Lg viïg den specificitet hos antikropparna som hade kon-
staterats LQ vitro. överlevnad hos brända möss. som ej
hade infekterats. visade att brännskadan i sig icke var
letal.
EXEMPEL 5
Exempel 5 askadliggör den extensiva korsreaktiviteten hos
FaF4 IVE8 och FQ6 IIG5 med kliniska E. aeruginosa-isolat,
vilket visar den kliniska användbarheten av dessa anti-
kroppar vid immunoterapi av E. aeruginosa-infektioner.
kliniska isolat erhölls fran sjukhus och kliniker.
Isolaten härrörde fran en mangfald isoleringsställen
o
inklusive blod, sar. rsspirati nsorganen. urin och öron.
Totalt undersöktes 157 isolat.
PaF4 IVE8 band specifikt till 34 kliniska isolat (222),
medan antikroopen av flagelltvp a, Fäo IIG5, nd till
ba
102 kliniska isolat (65%) för totalt 136 av 15* isolat
(87%). âv de 21 tammar som ej kändes igen av endera
III
10
15
20
25
30
35
so@ 421
'41
antikroppen var 19 icke-flagellära, sasom visades genomšf
infargning med betfärg. Därför band bada antikropparna t
kombination till 136 av 138 (98%) av flagellära kliniska
isolat. vilket bekräftar tidigare rapporter (se, R.
Ansorg, 1978, Zbl. Baht. Hyg., I Abt. Drig. A, 242:228-;
238, som införlivas med denna beskrivning genom hänvis-,7¶
ning därtill). @»l
EXEMPEL 6
Exempel 6 askadliggör metoder för framställning av mono¥“
klonala humanantikroppar, som binder till E. aeruginosaw
-flageller av typ b.
Ett perifert blodprov fran en individ, som hade
immuniserats med ett högmolekylärt polysackaridpreparatl:
(Pier et al., 1984 Infect. Immun., 45:309), tjänade somia
källa till B-celler. Enkärniga celler separerades fràn ä
blodet medelst standardcentrifugeringsteknik pa Ficoll-Faque:
scanu. J. ciin. Lab. Invgšg., 21-77> och 4'l '
tvättades tva gänger i kalcium/magnesium-fri fosfatbuffrèd
saltlösning (PBS).
De enkärninga cellerna befriades fran T-celler under
användning av en modifierad E-rosetterings-teknik. I Å
korthet innebar detta att cellerna först ätersuspenderadšs
till en koncentration av 1 107 cellerrml i PBS inne- ä
hallande 20% kalvfosterserum
susoension infördes därefter i ett 17 x 100 mm rund- á
bottnat bolystvrenrör, till vilket sattes 1 x 10' 2-aminon
-isotiouronium-bromid KAET)-behandlade röda blodkroooar 7
fran far fran en 10%-ig (volvmï) lösning i Iscoves modi-1
fierade Dulbecco-medium (Iscoves medium) (Madsen och
Johnson <1?79) Q¿ Immun. Methods, 27:61). Suspensionen
blandades mvcket försiktigt under S-10 minuter vid 4°C
och de E-rosetterade cellerna avlägsnades därefter genom
centrifugering oa Ficoll-Paque under B minuter vid
2500 x g vid 4°C. E-rosett-negativa enkärniga perifer-
10
15
20
25
30
35
506 421
042
blodceller (E*PBMC), som samlades vid gransytan. tillvara-
togs och tvattades en gang i Iscoves medium och ater-
suspenderades i detsamma innehallande 15 vo1ym% FCS.
L-glutamin (2 mmol/1, penicillin (100 IE/ml), streptomvcin
(100 ug/ml), hvpoxantin (1 l0_“N), aminopterin (4 x io-VM)
och tymidin (1,6 x 10“°M). Detta medium betecknas i det
följande som HAT-medium.
Cellstvrd transformation av E'PBMC astadkoms genom
samodling av dessa celler med en transformerande cellinje.
Den transformerande cellinjen var en Epstein-Barr kärn-
antigen
(EBNA)-oositiv lymfoblastoidhumancellinje, som
härrörde fran etylmetansulfonat (EMS)-mutagenes av den
lymfoblastoida cellinjen GM 1500, följt av selektion i
närvaro av 30 ug/ml 6-tioguanin för att förläna cellerna
brist pa hypoxantin-guanin-fosforibosyl-transferas
(HGPRT) och saledes göra cellerna HAT-känsliga. Denna
cellinje betecknas som 1A2-cellinjen och har deponerats
vid the American Type Culture Collection (A.T.C.C.) den
D? mars 1982 under A.T.C.C.-beteckningen Nr. CRL 8119.
1A2-celler i logaritmisk tillväxtfas suspenderades i HAT-
medium och kombinerades därefter med E'PBMC i ett för-
hallande av femton IAS-celler per PBMC. Cellblandningen
utströks pa trettio rundbottnade mikrotiterplattor med 96
fack (Costar 3799) i en koncentration av 32000 celler/fack
och i en volym av 200 ul per fack och inkuberades vid
37°C i fuktig atmosfär innehallande 6% C02. kulturer
matades oa dagarna 5 och 8 efter utstrykning genom
ersättning av halva den överliggande vätskan med färskt
HAT-medium. Sexton dagar efter utstrykning konstaterades
att 100% av facken innehöll prolifererande celler och
att i de flesta av facken cellerna hade tillräcklig
densitet för avlägsnande och analvs av de överliggande
vatskorna med avseende pa anti-E. aeruginosa-anti-
-kroppar.
De överliggande vätskorna underkastades screening med
avseende pa närvaron av anti-E. aeruginosa-antikroppar
10
15
20
25
35
4:
under användning av den i exempel 2 beskrivna ELISA-tek-Å
niken men med följande modifikationer. En pool av de sju
Fisher-immunotyp-referensstammarna (A.T.C.C. Nr. 27312-
2731e> bands :iii fiatboctnade'
mikrotiterplattor med 96 fack
(Immulon II, Dvnatech), som
hade förbehandlats med poly-L-lysin, inkuberades och _
tvättades sasom beskrivits i exempel 2. Efter blockering!
av icke-specifika bindningsställen och tvättning av i
plattorna sattes 50 pl PBS innehallande 0,1 volymï Tween-år
-20 och 0,22 (vikt/volym) BSA till varje fack. överligganšgp
de odlingsvatskor (SO pl) replikatutströks därefter i motåif
svarande fack pa analysplattorna och pa kontrollplattor,,j_
som hade behandlats med PLL och blockerats men som ej
innehöll bakterier. Efter inkubering och tvättning sattes:
enzymkonjugerade andrastegs-antikroppar (50 ml per fack>,_
pepparrotsperoxidas-konjugerat get-anti-human- Igß och
get-anti-human-IgM, som pa lämpligt sätt hade spätts i
PBS innehallande 0,1
ESA,
beskrivits i exempel ¿.
vøiymx Twesn-20 och 0,22 (vikt/voiymfa
till facken och analysen fullbordades sasom
överliggande vätskor. som innehöll antikropp som band
till poolen av Fisher-immunotyper men ej till kontroll-
plattan, analyserades en andra gang under användning av _
var och en av de sju Fisher-immunotyp-bakterierna separati
Antikropp närvarande i den överliggande vätskan fran ett
20Hi1.
n
:l
band endast till Fisher-immunotyperna 2, 6 “
aeruginosa.
upprepade ganger med minskande laga celldensiteter till
fack,
och 7 av E. Cellerna underkastades subodling
dess samtliga fack med tillväxt avsöndrade antikropp.
Cellinjen och den monoklonala antikroppen (lgfi-isotyp)
identifieras bada med beteckningen 2OH11 i det följande.
En andra transformation utfördes, där källan till B-
-celler härrörde fran periferiblodet fran en patient med :lr
systisk fibros och som var känd att ha en kronisk E. H
aeruginosa-infektion. E'PBMC framställdes sasom §_
s0¿ 421
10
15
20
25
30
35
506 421
44
beskrivits ovan och samodlades med den transformerande
cellinjen. 1A2, i ett förhallande av 72 IAS-celler per
E'PBMC. Cellblandningen utströks i femton rundbottnade
mikrotiterplattor med 96 fack i en koncentration av
7,4 10* celler per fack och odlades enligt ovan.
overliggande vätskor analyserades medelst ELISQ med
avseende pa närvaron av anti- E. aeruginosa-antikroppar
sexton dagar efter det att transformationen hade utstrykts.
Analysen utfördes sasom beskrivits för föregaende transfor-
mation med undantag av att poolen av E. aeruginosa-stammar.
som användes för den initiella screeningen. bestod av
Fisher-immunotyp-referensstammarna F2. F4. Fb och F7
(A.T.C.C. nr. 27313. 27315, 27316 och 27317) och tre
kliniska isolat fran Genetic Systems Corporation Ürganism
Bank (GSCDB), som hade olika LPS-immunotyper och flagell-
typer. Det kliniska isolatet PSA 1277 (ESCÜB) uppbär
flageller av typ a och Fisher-immunotyp 1 LPS; det andra
isolatet PSA G98 (BSCÜB) uppbär flageller av typ a och
LPS; och det tredje isolatet PSA Fó25
(GSCÜB) uppbär flageller av typ b och Fisher-immunotyp 5
Fisher-immunotyp 3
LPS. Denna blandning av referensstammar och kliniska
isolat betecknas som den flagellära E. aeruginosa-poolen.
överliggande vätskor, som innehöll antikropp. vilken band
till plattor innehallande den flagellära E. aeruginosa-
-poolen men ej till de FLL-överdragna kontrollplattorna,
analyserades medelst ELISA en andra gang med avseende pa
Ett fack, ECI. band
och till
de individuella stammarna i poolen.
till referensstammarna F2. Fb och F7 det klinis-
ka isolatet Fó25.
Kloning av cellinjen EC! utfördes genom att man först
subodlade cellerna i tva omgangar med subkultur av lag
densitet. först med 20 celler per fack i plattorna med 96
fack. följt av odling med 2 celler per fack. Formell
kloning av de specifika antikropp-producerande cellerna
utfördes genom att cellerna utströks i en densitet av
cirka 1 cell/fack i Terasaki-plattor med 72 fack (Nunc
UI
10
15
_20
25
30
35
506 421
#1-36538) i en volym av 10 pl/fack av HAT-medium, som
saknade aminopterin-komponenten (HT-medium). Plattorna
-v
placerades i en inkubator under 2-d timmar för att medge;
avsättning av cellerna pa bottnen av facken och under- Ä
söktes därefter mikroskopiskt av tva personer med avseen-
de pa fack som innehöll en enda cell. Facken matades dag-
ligen med HT-medium och när utväxten var tillräcklig
överfördes cellerna till en rundbottnad platta med 96
fack. Alla fack med utväxt analyserades medelst ELISA med
avseende pa E. aeruginosa-stammar, som uppbar flageller
av typ b, och samtliga befanns producera den lämpliga
antikroppen ifraga. Cellinjen och den monoklonala anti-
kroppen identifieras bada med beteckningen
ECI i
(IgM-isotyp)
följande text.
Det antigen som identifierades med 2OH11 och 361 var
flageller sasom framgick av indirekt immunofluorescens
och immunoblotting. Dessa metoder utfördes i huvudsak
sasom beskrivits i exemplen 2 och 3.
aeruginosa-stammar,
referens-Fisher-immunotyper
27313, 27317 och 27318)
fluoreecensanalys preparerades E.
uppbar flageller av typ b,
F2, Fb och F7 (A.T.C.C. nr. och
en stamm upobarande flageller av typ a, referens-Fisher-
(A.T.C.C. nr. 27315),
Heferensstammarnas flagelltyp bestämdes genom
-immunotyp 4 sasom beskrivits i
exempel 3.
typning med de monoklonala rattdjureantikrobparna PaF4
IVE3 och FA6 IIG5. l
tion sasom beskrivits i exempel 2. Källorna till bada
antikropparna var överliggande odlingsvatskor och det
FITC-konjugerade reagenset var FITC-konjugerat ;et-anti-
Burlingame, Cê) i spådd-
0.52
(flervärt)
PBS,
-human-Ig &Tago,
(vikt/volym)
82-041-2,
ningen 1:1OO i som innehöll
-gammaglobuliner (Miles Scientific, Cat. No.
Naperville, IL) och 0,12 (vikt/volym) natriumazid som
konserveringemedel.
Fluorescenefargning av antikropparna 2OHl1 och ÉC1 obeer-f
verades endast med E. aeruginosa-stammar, som uppbar
För indirekt immuno-
som
Dbjektglasen preparerades för examina-Å
bovin-
506 421
46
ílageller av typ b, och ej med den stam som uppbar
flageller av typ a, nämligen referens-Fisher-immunotypen
4. Det observerade fluorescensmönstret var ett sinuslinje-
mönster härrörande fran ena anden av bakterierna. vilket
visade att antikropparna band till bakteriernas flageller.
10
15
20
25
30
35
so§,421
47 ¿¿ '
lmmunoblotting utfördes sasom beskrivits i exempel 2
aeruginosa-re¥erens-
27313), och
Renade šlageller av typ b fran E.
stammarna Fisher-immunotyp 2 (A.T.C.C. nr.
renade flageller av typ a fran referensstammarna Habs 6
och Habs 8 (A.T.C.C.
vvwcv
nr. och 33355) framställdes
sasom beskrivits i exempel 3. Antigener separerades i en
10% polyakrylamidgel (se exempel 3) och överfördes till
ett NCM. överliggande odlingsvätskor innehallande anti-
3C1,
innehallande en icke-speci+ik humanantikropp och odlingsfl
kropparna 2OHl1 eller överliggande odlingsvätskor
medier inkuberades med NCM och reaktionen pavisades med 1
ett alkaliskt fosfatas-konjugerat get-anti-human-Ig (flëfi“
CA)
Enzymsubstrat framställdes sasom
vart) (Tago, Burlingame, utspätt i PBS innehållande
0,05 volymfi Tween-20.
beskrivits i exempel 2. Immunoblottinganalysen visade atä
_bada antikropparna band till ílagellinproteinet av Fisher-
_..
-immunotyp 2 med molekylvikten Sauuü och ej till
¥lagel1inproteinet av Habs 6 med molekylvikten 51700 ochï
ej heller till flagellinproteinet av Habs 8 med molekyl-šï.
vikten 47200. Ingen reaktion konstaterades vare sig med qen
icke-speci¥ika humanantikroppen eller odlingsmedierna.
Ytterligare bekräftelse pa att antikropparna 2OHll och H
361 band endast till flageller av typ b och ej till typ @,_
erhölls medelst ELISA, där Habs-stammar 1-12 bands indivi-
duellt med PLL till ëacken i Immulon mikrotiterplattor i
med 96 fack. Antikropparna band endast till Habs-stammarna
2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 och 12, vilka är stammar som uppbäfl».
<1ae4> J. clan. microbini., 2o=a4>.“ï
typ b (Ansorg et al.
EXQMPLE 7
Exempel 7 askadliggör metoder +ör ¥ramstallning av en
monoklonal humanantikropp, som binder till E. aeruoinosa~
-flageller av typ a.
Ett peri¥eriblodprov +ran en person, som hade immuniserafis
med ett högmolekylart polvsackaridpreparat (Pier et al.
10
15
20
25
30
35
506 421
48
(1981) Infect. lmmun., 34:46l), tjänade som källa till
E-celler. De enkärniga cellerna separerades fran blodet
och befriades därefter fran T-celler sasom beskrivits i
exempel 6. Cellerna frystes därefter i FCS innehallande
10% dimetylsulfoxid i en tank med flytande kväve. Vid ett
senare tillfälle tinades cellerna snabbt vid 37°C,
tvättades en gang i lscoves medium och atersuspenderades
i HQT-medium. Cellstyrd transformation astadkomms genom
samodling av E“PBMC med IAZ-celler i ett förhallande av
30 1A2-celler per E”PBMC. Cellblandningen utströks i 30
vävnadsodlingsplattor med 96 fack i en koncentration av
62000 celler per fack. Üdlingarna matades pa den sjunde
dagen efter utstrykningen genom ersättning av halva
volymen med HAT-medium. Cellproliferation konstaterades i
100% av facken pa den fjortonde dagen efter utstrykning
och överliggande vätskor avlägsnades fran facken och
analyserades vid denna tidpunkt.
De överliggande vätskorna analyserades medelst ELISA med
aeruginosa-antikroppar
genom användning av den flagellära E. aeruginosa-poolen
avseende pa närvaron av anti-E.
och PLL-behandlade plattor som kontroll, sasom beskrivits
i exempel o. overliggande vätskor, som innehöll anti-
kroppar, vilka band till den flagellära poolen men ej
till PLL-kontrollplattorna, analyserades anvo pa de indi-
viduella bakteriestammarna i den flagellära poolen. Ett
ZIBB,
,.Å.._.
fack, innehöll antikropp som band till PSA lax/,
PSA G98 och referens-Fisher-immunotyp 4, vilka är de tre
stammar i den flagellära poolen som uppbär flageller av
typ a.
Kloning av cellinjen 2158 astadkomms sasom beskrivits i
exempel 6 för cellinjen 3Cl med följande modifikationer i
det formella kloningssteget. Efter det att facken i
Terasaki-plattorna hade undersökts med avseende pa
närvaron av en enda cell. överfördes varje cell fran
Terasaki-plattan till ett individuellt fack 1 en rundbott-
nad odlingsolatta med 95 fack i en volym av 100 ul HAT-
10
15
20
25
35
49
505 421
-medium. som saknade aminopterin~komponenten (HT-medium).
Icke transformerande. HAT-känsliga lymfoblastdida celler _:
införlivades med samtliga fack i en densitet av 500 V
celler/fack som matarceller. Fem dagar efter utstrykningg
sattes 100 pl av HAT-medium till facken för att selektivå¿
döda matarcellerna. Facken matades anyo pa dagarna 7 ochi
9 efter utstrykning genom ersättning av halften av den
överliggande vätskan med HAT-medium. Cellerna matades därr_
efter med HT-medium till dess cellerna hade tillrackligf,,
densitet för att detektera närvaron av antikropp medelstí
ELISA. Samtliga fack med utväxt producerade antikropp. 1
som band till E. aeruginosa-stammar uppbärande flageller:
av typ a. Cellinjen och den monoklonala antikroppen
(IgG1-isotyp) identifieras bada med beteckningen 2188 i
följande text.
Det antigen som identifierades med 2138 var flageller
sasom kunde visas med indirekt immunofluorescens och
immunoblotting (se exempel 6 för en närmare beskrivning
av teknikerna). Fluorescensfargning av antikropøen 2188
konstaterades endast med E.aeruginosa-referensstammen
Fisher-immunotyp 4 (A.T.C.C. nr. 27315). som uppbär
aeruginosa-referens-
27313).
flageller av typ a. och ej med E.
stammen immunotyp 2 (A.T.C.C. nr. som uppbär
flageller av typ a. Det konstaterade flourescensmönstret¿
var ett sinuslinjemönster harrörande fran ena änden av ä
bakterierna, vilket visade att antikroppen band till bakf
teriernas flageller.
Immunoblotting utfördes sasom beskrivits i exempel 2.
Renade flageller av typ a fran E. aeruginosa-referens- _H
stammen Habs 6 (A.T.C.C. nr. 33353) och renade flagellerfi
av typ b fran E. aerudinosa-referensstammen Fisher-immuno-
typ 2 (A.T.C.C. nr. 27313) framställdes sasom beskrivitsè.
i exempel 3. Antigener separerades i en 10%-ig polyakrylê
och överfördes till ett Nam. 1
amidgel (se exempel 3)
överliggande odlingsvatskor, som innehöll antingen 21BB'šl
eller en icke-specifik humanantikropp. och odlingsmedier:
10
15
20
25
30
35
506 421
fick reagera med NCM och reaktionen pavisades med ett al-
kaliskt fosfatas-konjugerat get-anti-human-lg (flervart)
och enzvmsubstrat sasom beskrivits i exemplen 2 och 6.
Immunoblottinganalysen visade att antikroppen ZIBB endast
band till flagellinproteinet av Habs 6 med molekylvikten
51700 och ej till ílagellinproteinet av Fisher-immunotvp
'fl
c med molekylvikten 53000. Ingen reaktion observerades
med den icke-specifika humanantikroppen eller odlings-
medierna.
EXEMPEL E
Exempel 8 askadliggör skydd av möss, som passivt har
immuniserats med anti-flagellära humanantikroppar 2OH11,
3C1 och 2188 mot infektion med E. modellen
aeruginosa i
med brand mus.
De monoklonala anti-+lagel1ära humanantikropparna
testades i modellen med bränd mus (se exempel 4).
_Antikropparna 21BB och IOH11 preparerades genom utfall-
ning av överliggande odlingsvätskor, som hade slstrats av
respektive cellinjer, med amoniumsulfat (slutkoncentration
50%)
Mishell.
(Good et al., Selected Methods in Cellular Immunolooy,
B.B. 5.M.. W.J.
27?-286).
och Shiigi, Freeman & Co.,
iaao,
red.,
San Francisco, CA, Fällningen soluoilisera-
des i PBS, dialvserades mot PBS över natten vid 4°C och
sterilfiltrerades därefter före administrering till djur.
Hallan till antikropp SBI och den använda icke-specifika
anti-LPS-antikroppen som negativ kontroll vid denna under-
sökning var överliggande odlingsvatska. Som positiv
kontroll +är varje undersökning användes den lamoliga
renade monoklonala rattdjursantikroopen PaF4 IWEE eller
P4
Fëó IG5.
fi
IT
m anvandes
o
S,
S
E
U
Den stam som uppbar ilageller av ty o
ÉCÜÜ
H ~~
_>4'_
TU
ff
I)
a
vid djurförsëken var det kliniska isolat
(GSCÜE),
stammen med flageller av typ o var det kliniska isolatet
F.
som uttrvcker Fisher-immunotvp 1 LP . och
10
15
2.0
25
30
35
soel421
som uttrycker Fisher-immundtyb 6 LPS.
(0,45 ml)
0,05 ml)
FSA A447 (GSCOB),
Humanantikrnpparna §örblandades med bakterierna
(mer än 5 LD.@°-doser i och invmpades under ear~
ekdrpan omedelbart efter det brannekadan hade astad-
kommits. Resultaten av djurföreöken atgee i tabellerna
III, IV och V.
TABELL III.
kroppen 21B8 av anti-flagelltyp al vid modellen med bränd~
Skyddeetudie av den mdnoklonala humananti-
mus
Procentuell överlevnad pa dag:
Behandling 1 2 T 4 5 6 7 8 9
Rattdjurs- 100 100 100 100 88 88 BB BB V88
-anti-flagell
a, FA6 IIGSS
HLI m år! _ an t i " 1 O O I O O 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO 1 OO
-flagell a,
2138
Hccman-anti- mc» c» c» o c» I c» o c» o
-flagell D,
2OH11
PBS
100 25 12
M
H
D-l
H
b*
n
l-e
H
b-I
IJ
I-fl
rJ
*Möeeen inëekteradee under earekdrpan med mer än 5 LD,°°fi
-doser av E. aeruginnea PSA A522.
*Den prdcentuella överlevnaden baserar eig pa antalet
506 421
möss som överlevde per grupp om atta djur. Dagarna avser
efter astadkommande av brännskada och infektion.
3Renad antikropp (10 ug i 0,45 ml PBS) +örblandades med
5 bakterierna och administrerades under sarskorpan efter
astadkommande av brannskada och in{ektion.
TABELL IV. Skyddsstudie av den monoklonala humananti-
10 kroppen 2OH11 av anti-flagelltyp b vid modellen med bränd
mus*
__________________________________________________________ __1
Procentuell överlevnad pa dag:
15
Behandling 1 I T 4 5 6 7 E Q
RattdJurs-anti-
-flagell b,
20 PaF4 IVEB= 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Human-anti-
-flagell b,
20H 1 1 100 100 1 00 1 00 1 00 100 100 1 00 1 00
2 5
Human-anti-
-flagell a,
2 1 BB 1 00 0 0 0 0 0 0 0 0
3 0 Mgg 1 Ey- 30 0 0 0 0 0 0 0 0
*Mossen infekterades under sarekorpan med mer an 5 LD1°°-
-doser av det kliniska E. aeruoinosa-isolatet FEA Q447.
35
*Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet
möss som överlevde per gruoo om fem djur. Da
efter astadkommande_av brannshada och infektion.
10
15
20
25
30
35
_-flagell b,
U
U
so§0421
=Renad antikroop (10 pg i 0,45 ml PBS) förblandades
med bakterierna och administrerades under sarskorpan
efter astadkommande av brännskada och iníektion.
TABELL V. Skvddsstudie av den monoklonala humanantikroppgn
301 av anti-flagelltyp b vid modellen med bränd mus
_____________.._.__.._..._______..________._____..___.._-__.__...___..._~'_. _...
.i _:
Procentuell överlevnad pa dag*
H
M
b
U
0
w
W
m
Behandling 1
RattdJurs-anti-
-flagell b,
FaF4 IVE8$
100 100 100 100 100 100 100
100 100
Human-anti-
301 100 100 80 80 SO BO BO 80 EG
Icke-specifik
monoklonal anti-
~LPS-antikropp 100 O O O O O O O 10
L ______________________________________________________ -..,......1
*Mössen infekterades
-doser av PSA A447.
under sarskorpan med mer än 5 LDiøø?Ä
*Den procentuella överlevnaden baserar =ig pa antalet
grupper om fem djur. Dagarna avser efter
\f
astadkommande av orannskada och in+ektion.
3Renad antikrooo (40 ug> administrerades intravenöst tvaw
timmar före astadkommandet av brannskada och infektion.
En mycket signifikant overlevnad konstaterades hos möss,
10
15
20
25
30
35
lsoe 421
som hade behandlats med antikroppen av anti-flagelltyp a
eller nagon av de tva antikropparna av anti-flagelltyp b
efter
infektion med motsvarande antigen. Ümvant dog
BB-100% av de obehandlade men infekterade mössen eller
de som hade behandlats med en icke-matchande anti-
-flagellar monoklonal antikropp eller icke-specifik anti-
-LPS-antikropp. Sasom kunde konstateras med de
monoklonala rattdjursantikropparna (se exempel 4) skyddar
de anti-4lagellara humanantikropparna specifikt mot letal-
infektion endast av de organismer som uppbär motsvarande
flagelltvp, d.v.s. humanantikroppen av anti-flagelltvp a
astadkom skydd mot letalinfektion av den organism som
uppbar flagelltyp a och icke typ.b och antikropoarna av
anti-flagelltyp b skyddade möss, som hade infekterats
med stammar uppbarande ëlagelltyp b men ej organismer
uppbarande typ a.
_}EMPEL 9
Exempel 9 askadliggör korsreaktiviteten hos de anti-
-flagellara humanantikropparna 2OH11, 3C1 och BIBB med
kliniska E. aeruginosa-isolat.
Kliniska E. aeruginosa-isolat (115). som hade erhallits
fran sjukhus och kliniker och isolerats i huvudsak fran
brännskador och blod, identifierades sasom uppoarande
+lage1ler av typ a eller typ b genom typning med de
monoklonala rattdjursantikropparna FA6 IIG5 eller PaF4
Femtiofem av de kliniska
IVEB (se exemplen 2, I och 5).
isolate identi¥ierades som uppbarande ilageller av tyo a
3
genom reaktion med den monoklonala rattdgursantakroppen
Fâb IIGS och 5? identifierades som uopoarande tvo b genom
deras reaktion med den monoklonala rattdjursantikroooen
PaF4 IUEE.
Horsreaktiwiteten nos den monoklonala humanantikropoen av
ti-
anti-flagelltyp a, var omiattande genom att an
kropoen kande igen 54 av de Eb kliniska :solat flëoïl som
10
15
_20
25
30
35
UI
UI
so§ 421
uppbar flageller av typ a. Morsreaktiviteten nos 2OH11
med de isolat som uppbar flageller av typ b var aven om- 7
fattande genom att 2OH11 kande igen samtliga S9 isolat
(1002). I motsats härtill band den aterstaende monoklo-
nala antikroppen av anti-flagelltyp b, 3C1, till endast
43 av de 59 isolaten (73%). Dessa resultat visar att
EOHI1 binder till en pan-reaktiv epitop (d.v.s. en epitop>
närvarande pa minst cirka 95% av de flagellara >
E. aeruginosa-stammarna), medan ECI binder till en epitopï
som ej är närvarande pa alla flagellinmolekyler av typ bla
Även om antigenet av flagelltyp b ar serologiskt homDgentš“
vid analys med polyklonala antisera (Lanvi, B.,
supra),
för 2OH11 och 3C1 överraskande att flagellerna av typ b
su ra,
and Ansprg, R., visar korsreaktivitetsmönstren
har minst tva separata epitoper som kan identifieras av
monoklonala antikroppar.
Den omfattande korsreaktiviteten hos antikropparna 2138
och 2OH11 med kliniska P.
aeruginosa-isolat visar den
speciella kliniska användbarheten av dessa antikroppar
aeruginosa-infektioner.
vid immunoterapi av E.
EXENPEL 10
Exempel 10 askadliggör metoder för +ramställning av ett
vtterligare exempel pa en monoklonal humanantikropp, som
binder till E. aeruginosa-ilageller av typ b, liksom
denna antikropps skyddsaktivitet mot infektion med
E. aeruginosa vid modellen med bränd mus.
En trans¥ormerad cellinje preparerades och klonades i
»u
huvudsak sasom beskrivits i exempel /, med undantag av
att den transformerade cellblandningen utströks pa 20
vavnadsodlingsplattor med 96 tack i en koncentration av
cirka 2250 E'PBMC per fack. dverliggande vätskor analy-
serades initiellt medelst ELISA pa den flagellara poolen,
med undantag av att Fisher-
sasom beskrivits i exempel 6,
Ü
-immunotyp-referensstammarna e och 4 saknades 1 poolen.
10
15
20
25
30
35
506 421
Positiva fack analyserades därefter pa var och en av
stammarna i den flagellära poolen inklusive Fisher-immuno-
typ 2 och 4. Den slutligen isolerade cellinjen och den
identifieras bada
monoklonala antikroppen (IQG-isotyp)
med beteckningen 12D7 i följande text.
Den monoklonala humanantikroppen 12D7 visade omfattande
korsreaktivitet med isolat av anti-flagelltyp a och kande
igen 54 av de 56 testade kliniska isolaten (96%), som
Skyddsaktiviteten för den mono-
tabell VI.
uppbar flageller av typ a.
klonala antikroppen 12D7 visas i Skvddsstudier-
na utfördes i huvudsak sasom beskrivits i exempel 4, med
undantag av att den infekterande dosen var 1 Lüiom och
att den infekterande stammen var 1624, ett kliniskt
isolat som uttrycker Fisher-immunotyp 2 LPS och flageller
vav typ a.
TABELL VI. Skyddsstudie av den monoklonala humananti-
kroppen 1207 av anti-flagelltyp a vid modellen med bränd
mus*
Procentuell överlevnad pa dag*
Behandling: 1 I I 4 5 6 " 8 9
Human-anti-
-flagell a,
120? 100 100 100 100 100 100 100 100 100
Human-anti-
-Fisher 2
LP5. :H9 90 90 90 90 90 90 90 90 90
Rattdjurs-
-anti-ïlagell a.
1165 100 100 100 100 100 100 100 100 100
10
15
20
25
30
35
sne
57
Human-anti-
-flagell b,
15F4 100 37.5 25 25 25 25 25 25 25
___-__.-____________.__.________.__.___.__.___________________.__.,.,.,Q..
*Mössen in+ekterades under sarskorpan med 1 Lüioo (950
CPU) av E. aeruginosa 1624.
*Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet
överlevande möss per grupp om tio djur, med undantag av
gruppen 15F4 där N=8. Dagarna avser efter astadkommande
av brännskada och infektion.
0,5 ml PBS)
intraperitonealt tva timmar före astadkommande av bränn-
°Renad antikropp (50 pg i administrerades
skada och infektion.
EXENPEL 11
Exempel 11 askadliggör framställningen av en monoklonal
humanantikropp, som reagerar med E. aeruginosa av flagellf
typ b, och skyddet av möss, som passivt har immuniseratswfld
med denna antikroop mot infektion med E. aeruginosa vid
modellen med bränd mus.
En transformerad cellinje preparerades och klonades i
huvudsak sasom beskrivits i exempel 10, med undantag av
att transformationsförhallandet 1A2 till B-cell var cirka?
6Û:1 och den trans+ormerade cellblandningen utströks pa
femton plattor i en koncentration av cirka 1930 E'PBMC
per fack.
E. stammar innefattande G98
3, ilagelltyp a) och 1739
{lagelltyp b)
Cellen analyserades även pa en pool av
aeru inosa- (Fisher-immunotyp
(ett kliniskt isolat
-immunotvp 5, och bekräftades pa en annan M"
pool av E. aeruginosa-stammar: 1277. GQB, I73§ och Fisheršv
P4, Fa och F?.
-immunotyper F2, Den slutligen isolerade
cellinjen och den utsöndrade monoklonala antikroppen
42 1
av Fisher1§ï
506 A421
(lgßl-isotyp) identifieras bada med beteckningen 288 i
följande text.
En immunp+luorescensanalys, som utfördes med EEE, var
positiv pa en Fisher-immunotypstam 2 av flagelltyp b men
negativ pa en Fisher-immunotyp-referensstam 4 av ¥1agell-
typ a. Vid test pa klinisk isolat reagerade 59/5? (1002)
av isolat av flagelltyp b positivt.
Skyddsaktiviteten hos 288 visas i tabell VII.
Skyddsstudierna utfördes sasom beskrivits i exempel 10,
med undantag av att klinisk isolat F1b4 (Fisher-immunotyp
4, flagelltvp b) användes för infektionen.
TABELL VII. Skyddsstudie av den monoklonala humananti-
kroppen EEE av anti-flagelltyp b vid modellen med bränd
mus*
Procentuell överlevnad pa dagz
Behandling 1 2 3 4 S é 7 B 9
Human-anti-
-flagell b,
2B8= 100 89 89 89 89 B9 8? B? 89
Rattdjurs-
-anti-flagell b.
PaF4 IVEB“ 100 100 100 100 100 100 90 90 90
Rattdjurs-
-anti-Fisher 2
Lpg! VH3~ gg :Q 20 20 20 “Û 20 20 70
.__
*Mossen infekterades under sarskorpan med 1 Lßiøo (105
10
15
20
25
30
35
sø§ 421
CFU) av E. aeruginosa F1b4.
*Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet
överlevande möss per grupp om tio djur, med undantag för:
gruppen 288 där N=9. Dagarna avser efter astadkommande aya
brännskada och infektion.
3Renad antikropp (SO ug i 0,5 ml PBS) administrerades _
intraperitonealt tva timmar före astadkommande av bränn-_»
skada och infektion.
*Renad antikropp (5 pg i 0,5 ml PBS) administrerades
intraperitonealt tva timmar före astadkommande av bränn~~
skada och infektion.
EXEMPEL 12
Exempel 12 askadliggör framställningen av en annan mono-g
hlonal humanantikropp, som reagerar med E. aeruginosa avÉ
flagel1typ_b, och skydd av möss. som har immuniserats
passivt med denna antikropp mot infektion med E. aerugingea
vid modellen med bränd mus.
En transformerad cellinje framställdes och klonades i
huvudsak sasom beskrivits i exempel 7, med följande
undantag. En annan individ immuniserades (Pier et al.
(1984) 45:309) och tjänade som B-cellkälla och utstryk-
ningsnivan av E“PBMC var cirka 2099 celler per fack.
Screeningen utfördes pa ooolade Fisher-immunotyper 1-7.-É
Den slutligen isolerade cellinjen och den utsöndrade
monoklonala antikroopen (lgß,-isotvp) identifieras bada ¿
med beteckningen 14C1 i följande text.
Vid klinisk drovninâ var 59/59 (1002) av isolat av
flagelltvp b positiva med 14C1. škyddsstudierna utfördeså
sasom beskrivits för exempel
1 tabell VIII.
11 ovan och resultaten visasl
10
15
20
25
30
35
_-Fisher 2
506 421
60
TABELL VIII.
kroppen 1401 av anti-+lage1ltyp b vid modellen med bränd
Skvddsstudie av den monoklonala humananti-
mus*
ll
u
ß
L
m
w
m
n
Behandling” 1
Human-anti-
-flagell b,
14C1 100 100 100 100 100 90 90 90 90
Rattdjurs-
-anti-flagell b,
PaF4 IVE8 100 100 100 100 100
100 100 100 100
Human-anti-
LPS, VHB 100 40 20 20 20 20 20 20
_________._.___________.________.____________________._____.___-<
*Mössen infekterades under sarskorpan med mer än 1 LD1°°
(90 CFU) av E. aeruginosa F1ó4.
*Den procentuella överlevnaden baserar sig pa antalet
överlevande möss per grupp om tio djur, med undantag av
or open PaF4 IVE8 där N=?.
u Dagarna avser efter
astadkommande av brännskada och infektion.
°Renad antikropp (50 pg i 0,5 ml PBS) administrerades
intraperitonealt tva timmar före astadkommande av brann-
skada och in§ektion.
Av det ovan sagda ëramgar att cellinjerna enligt
föreliggande uppfinning tillhandahaller medel för fram-
ställning av monoklonala antikroppar och fragment därav,
10
sug 421
61
vilka är reaktiva med E. aeruginosa-flageller och kors-
protektiva mot olika E. aeruginosa-stammar. Ett antal
monoklonala antikroppar har överraskande isolerats, vilka
var reaktiva med olika epitoper pa varje typ av flagell.
Antikropparna enligt föreliggande uppfinning medger en V
mer ekonomisk och lättare framställning av pro+ylaktiska
och terapeutiska beredningar för använding mot
infektioner orsakade av de flesta Q. aeruginosa-stammar-L
na. Vidare tillhandahåller cellinjerna antikroppar, vilka
finner användning vid immunoanalyser och andra välkända
förfaranden.
Claims (25)
1. Monoklonal antikropp eller bindningsfragment därav kännetecknad av att den har förmåga att specifikt reagera med en flagellär proteinepitop av Pseudomonas aeruginosa- bakterier till att hämma bakteriernas motilitet vilken monoklonal antikropp eller bindningsfragment därav skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosa-infektion.
2. Monoklonal antikropp enligt krav 1, kännetecknad av, att den har förmåga att blockera bindningen till epitopen av monoklonala antikroppar producerade av cellinjer med beteckningarna ATCC depositionsnummer HB 9129, HB 9130, CRL 9300 och CRL 9301.
3. Monoklonal antikropp enligt krav 1, kännetecknad av att den har samma bindningsspecificitet till en flagellär proteinepitop av Pseudomonas aeruginosa som någon av de monoklonala anti-kropparna med ATCC depositionsnummer HB 9129, HB 9130, CRL 9300 Och CRL 9301. '
4. Monoklonal antikropp enligt krav 3, kännetecknad av, att den är konjugerad med en markör med förmåga att till- handahålla en detekterbar signal.
5. Monoklonal antikropp enligt krav 4, kännetecknad av, att markören är ett fluorescerande medel eller ett enzym.
6. Beredning av monoklonala antikroppar, kännetecknad av, att en första av dessa monoklonala antikroppar har förmåga att reagera med en flagellär proteinepitop av flagelltyp a eller flagelltyp b av Pseudomonas aeruqinosa till att hämma bakteriernas motilitet och att den monoklonala antikroppen skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruqinosa-infektion. 10 75 _20 25 30 35 es
7. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att en andra av nämnda monoklonala antikroppar har förmåga att reagera med en flagelltyp som ej är reaktiv med nämnda första mono- klonala antikropp. išf
8. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att nämnda första antikropp är en monoklonal humanantikropp. 6
9. Beredning omfattande en eller flera monoklonala anti- kroppar eller bindningsfragment därav såsom definierats i krav 1, 6 eller 8 och en gammaglobulinfraktion från ånman- blodplasma och/eller ett antibiotiskt medel. á ' z
10. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att epitopen uppvisas av minst cirka 70% av flagellerna av typ b.@
ll. Beredning enligt krav 6, kännetecknad av, att epitopen uppvisas enbart av flagellerna av typ b. '
12. Beredning enligt krav 11, kännetecknad av, att antikroppen är pan-reaktiv.
13. Farmaceutisk beredning, kännetecknad av, att denfi 2 innefattar en eller flera monoklonala antikroppar eller bindningsfragment därav såsom definierats i något avÅ I kraven 1, 6 eller 8 och en fysiologiskt godtagbar bäåare.
14. Farmaceutisk beredning användbar för behandling Ållar profylax av en Pseudomonas aeruginosa-infektion, känna- atc i reagerar med en aeruginosa till skyddar in vivo tecknad av, den innefattar en monoklonal antikro§p som flagellär proteinepitop av Pseudomog¿§f att hämma bakteriernas motilitet och som i mot Pseudomonas aeruginosa-infektion Ni: medel, en gammaglobulinfraktion från_human- antimikrobiellt blodplasma och en fysiologiskt godtagbar bärare. 506 421 10 15 20 25 30 35 64
15. Farmaceutisk beredning enligt krav 14, kännetecknad av, att antikroppen är en monoklonal humanantikropp och att gammaglobulinfraktionen från humanblodplasma har erhållits från människor med förhöjda nivåer av immunoglobuliner, som reagerar med Pseudomonas aeruginosa-bakterier eller produkter därav.
16. Farmaceutisk beredning innefattande minst två mono- klonala antikroppar, kännetecknad av, att var och en av antikropparna specifikt reagerar med en flagellär protein- epitop i olika typer av flagellärt Pseudomonas aeruginosa- protein till att hämma bakteriernas motilitet och kan behandla eller förhindra Pseudomonas aeruginosa-infektioner och att de skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosa- infektion.
17. Beredning enligt krav 16, kännetecknad av, att minst en av de monoklonala antikropparna är en monoklonal human- antikropp.
18. Beredning enligt krav 16, kännetecknad av, att den innefattar minst en monoklonal humanantikropp med förmåga att reagera med minst en serotypisk determinant på en lippolysackarid-molekyl av Pseudomonas aeruginosa och/eller en monoklonal antikropp, som reagerar med endotoxin A.
19. Cellinje, kännetecknad av, att den producerar en mono- klonal antikropp med förmåga att specifikt reagera med en flagellär proteintyp på Pseudomonas aeruginosa-flageller av typ a eller typ b till att hämma bakteriernas motilitet och att den monoklonala antikroppen skyddar in vivo mot Pseudo- monas aeruginosa-infektion.
20. Cellinje enligt krav 19, kännetecknat av, att den är en hybridcellinje. 10 15 20 25 30 Qi?
21. Cellinje enligt krav 19, kännetecknat av, att den producerar monoklonala humanantikroppar.
22. Cellinje enligt krav 19, kännetecknat av, att den är§ någon av cellinjerna ATCC depositionsnummer HB 9129, HB 9130, CRL 9300 OCh CRL 9301.
23. Sätt att producera monoklonala antikroppar, som är specifika med avseende på flagellära proteiner av Pseudomonas aeruginosa och hämmar bakteriernas motilitet och kan behandla eller förhindra Pseudomonas aeruginosa- infektioner, kännetecknat av, att man odlar minst en av cellinjerna enligt krav 22 och utvinner antikropparnå.
24. Sätt att påvisa närvaron av Pseudomonas aeruginogaiiï ett prov, kännetecknat av, att man kombinerar provetimed en monoklonal antikropp till en flagellär proteinepitop av Pseudomonas aeruginosa och som hämmar bakteriernas mdti- litet och skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosaÄ T z infektion, och detekterar komplexbildningen.
25. Testsats för användning vid påvisande av närvaron av Pseudomonas aeruginosa-bakterier, kännetecknad av, att den innefattar en monoklonal antikroppberedning innehållånfie minst en monoklonal antikropp, varvid antikroppen reagerar med en typ-specifik flagellär proteinepitop av bakterierna till att hämma bakteriernas motilitet och skyddar in vivo mot Pseudomonas aeruginosa-infektion, och markörer som tillhandahåller en detekterbar signal kovalent bundna till antikroppen eller bundna till andra antikroppar, som reagerar med den monoklonala antikroppen.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US88198486A | 1986-07-03 | 1986-07-03 | |
US06/946,554 US4834976A (en) | 1986-07-03 | 1986-12-24 | Monoclonal antibodies to pseudomonas aeruginosa flagella |
US4814387A | 1987-05-15 | 1987-05-15 |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
SE8702734D0 SE8702734D0 (sv) | 1987-07-02 |
SE8702734L SE8702734L (sv) | 1988-01-04 |
SE506421C2 true SE506421C2 (sv) | 1997-12-15 |
Family
ID=27367280
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SE8702734A SE506421C2 (sv) | 1986-07-03 | 1987-07-02 | Monoklonala antikroppar mot Pseudomonas aeruginosa och beredningar innehållande dessa, testsats innehållande beredningen, samt cellinjer uttryckande antikropparna |
Country Status (19)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2639422B2 (sv) |
KR (1) | KR910002373B1 (sv) |
AT (1) | AT399885B (sv) |
AU (1) | AU615162B2 (sv) |
BE (1) | BE1000743A3 (sv) |
CH (1) | CH677796A5 (sv) |
DE (1) | DE3722098C2 (sv) |
DK (1) | DK172840B1 (sv) |
ES (1) | ES2013321A6 (sv) |
FR (1) | FR2601458B1 (sv) |
GB (1) | GB2192185B (sv) |
IE (1) | IE60888B1 (sv) |
IL (1) | IL83047A (sv) |
IT (1) | IT1221940B (sv) |
LU (1) | LU86938A1 (sv) |
NL (1) | NL194961C (sv) |
OA (1) | OA08629A (sv) |
PT (1) | PT85247B (sv) |
SE (1) | SE506421C2 (sv) |
Families Citing this family (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4772464A (en) * | 1985-08-01 | 1988-09-20 | Miles Laboratories, Inc. | Protective antibodies to serotypic determinants of flagellar antigens |
NZ218499A (en) * | 1985-12-10 | 1990-04-26 | Genetic Systems Corp | Monoclonal antibodies against pseudomonas aeruginosa, pharmaceutical compositions and detection methods |
GB2192185B (en) * | 1986-07-03 | 1991-01-16 | Genetic Systems Corp | Monoclonal antibodies to pseudomonas aeruginosa flagella |
CA1341375C (en) * | 1988-10-12 | 2002-07-09 | Baxter International Inc. | Compositions and methods for the treatment and prevention of gram-negative bacterial infections |
JPH02299594A (ja) * | 1989-01-30 | 1990-12-11 | Sumitomo Chem Co Ltd | ヒトモノクローナル抗体およびその製法 |
WO1990013033A1 (en) * | 1989-04-14 | 1990-11-01 | Biocontrol Systems, Incorporated | Process and device for detecting a particular motile organism |
SG50585A1 (en) * | 1990-01-18 | 1998-07-20 | Cura Nominees Pty Ltd | Glycoalkaloids |
JP2012516897A (ja) * | 2009-02-04 | 2012-07-26 | カロバイオス ファーマシューティカルズ インコーポレイティッド | シュードモナス・エルギノーサ(PseudomonasAeruginosa)感染の治療のための抗生物質と抗体療法との組み合わせ |
US8653242B2 (en) | 2010-03-01 | 2014-02-18 | Lostam Pharmaceuticals Ltd. | Therapeutic antibodies against flagellated Pseudomonas aeruginosa |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB8422649D0 (en) * | 1984-09-07 | 1984-10-10 | Technology Licence Co Ltd | Monoclonal antibodies |
JP2691708B2 (ja) * | 1984-09-26 | 1997-12-17 | 住友製薬株式会社 | ヒトモノクローナル抗体およびその製法 |
JPS63500035A (ja) * | 1985-06-06 | 1988-01-07 | ジエネテイツク システムズ コ−ポレイシヨン | プソイドモナス アエルギノサ 外毒素aに対する保護用ヒトモノクロ−ナル抗体 |
DE3689713T2 (de) * | 1985-08-01 | 1994-07-07 | Miles Inc | Schützende Antikörper gegen serotypische Determinanten von flagellären Antigenen. |
US4918163A (en) * | 1985-09-27 | 1990-04-17 | Pfizer Inc. | Monoclonal antibodies specific for lipid-A determinants of gram negative bacteria |
NZ218499A (en) * | 1985-12-10 | 1990-04-26 | Genetic Systems Corp | Monoclonal antibodies against pseudomonas aeruginosa, pharmaceutical compositions and detection methods |
ZA868673B (en) * | 1985-12-10 | 1988-07-27 | Genetic Systems Corp | Monoclonal antibodies cross-reactive and cross-protective against p.aeruginosa serotypes |
GB2192185B (en) * | 1986-07-03 | 1991-01-16 | Genetic Systems Corp | Monoclonal antibodies to pseudomonas aeruginosa flagella |
-
1987
- 1987-06-30 GB GB8715347A patent/GB2192185B/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-30 AU AU74958/87A patent/AU615162B2/en not_active Expired
- 1987-06-30 DK DK198703366A patent/DK172840B1/da not_active IP Right Cessation
- 1987-07-01 IL IL83047A patent/IL83047A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-07-02 FR FR878709370A patent/FR2601458B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-02 JP JP62166234A patent/JP2639422B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-02 ES ES878701936A patent/ES2013321A6/es not_active Expired - Fee Related
- 1987-07-02 IT IT21163/87A patent/IT1221940B/it active
- 1987-07-02 SE SE8702734A patent/SE506421C2/sv not_active IP Right Cessation
- 1987-07-02 NL NL8701554A patent/NL194961C/nl not_active IP Right Cessation
- 1987-07-02 IE IE176987A patent/IE60888B1/en not_active IP Right Cessation
- 1987-07-03 CH CH2545/87A patent/CH677796A5/de not_active IP Right Cessation
- 1987-07-03 LU LU86938A patent/LU86938A1/fr unknown
- 1987-07-03 KR KR1019870007069A patent/KR910002373B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1987-07-03 AT AT0168387A patent/AT399885B/de not_active IP Right Cessation
- 1987-07-03 DE DE3722098A patent/DE3722098C2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-07-03 OA OA59157A patent/OA08629A/xx unknown
- 1987-07-03 PT PT85247A patent/PT85247B/pt unknown
- 1987-07-03 BE BE8700743A patent/BE1000743A3/fr not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4196265A (en) | Method of producing antibodies | |
FI111336B (sv) | Förfarande för framställning av ett vaccin som innehåller en polysackaridantigen av typ I av Staphylococcus epidermis och ett hyperimmunoglobulin mot antigenen | |
KR910008361B1 (ko) | 슈도모나스 이루지노사 항원형에 대한 교차면역 반응성 및 교차보호성 단일분지계 항체 | |
Halk et al. | Production of monoclonal antibodies against three ilarviruses and alfalfa mosaic virus and their use in serotyping | |
US4834976A (en) | Monoclonal antibodies to pseudomonas aeruginosa flagella | |
CA2015246A1 (en) | Human monoclonal antibody, and its production and use | |
NZ219187A (en) | Composition and hybridoma relating to monoclonal, antibody or binding fragment reactive with a non core carbohydrate epitope of two bacterial species, one species being either e.coli or an enterobacter species | |
SE506421C2 (sv) | Monoklonala antikroppar mot Pseudomonas aeruginosa och beredningar innehållande dessa, testsats innehållande beredningen, samt cellinjer uttryckande antikropparna | |
Gustafsson et al. | Monoclonal antibodies against group-and type-specific lipopolysaccharide antigens of Vibrio cholerae O: 1 | |
EP0259807B1 (en) | Complement-dependent cytolytic anti-trichomonas vaginalis monoclonal antibody and use thereof in therapy and in diagnosis | |
JPS63500035A (ja) | プソイドモナス アエルギノサ 外毒素aに対する保護用ヒトモノクロ−ナル抗体 | |
JP4044733B2 (ja) | ベロ毒素iiを認識するヒト型化抗体、および該抗体を産生する細胞株 | |
JPH0213376A (ja) | 緑膿菌に対するモノクローナル抗体、ならびにその調製および使用 | |
EP0326148A1 (en) | Human monoclonal antibody specific for Pseudomonas aeruginosa and hybrid cell lines | |
RU2010856C1 (ru) | Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus musculus l., используемый для получения преципитирующих моноклональных антител к jgg человека | |
KR100506118B1 (ko) | 수막염균증 백신 조성물 | |
WO1990011350A1 (fr) | Anticorps monoclonal humain reagissant avec le pseudomonas aeruginosa, cellule produisant cet anticorps, procede de production et preparation pharmaceutique | |
JPH0355106B2 (sv) | ||
JPH0361428B2 (sv) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
NUG | Patent has lapsed |