NL194961C - Compositie omvattende een component die in staat is tot reactie met Pseudomonas aeruginosa flagella, farmaceutisch preparaat, cellijn, monoklonaal antilichaam, werkwijze ter bepaling van Pseudomonas aeruginosa, alsmede pakket voor het detecteren daarvan. - Google Patents

Description

1 194961

Compositie omvattende een component die in staat is tot reactie met Pseudomonas aeruginosa flagella, farmaceutisch preparaat, cellijm, monoklonaal antilichaam, werkwijze ter bepaling van Pseudomonas aeruginosa, alsmede het pakket voor het detecteren daarvan 5 De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een compositie omvattende een component die in staat is tot reactie met Pseudomonas aeruginosa bacteriën.

Een dergelijke compositie is bekend uit Pollack, Immunoglobulins: Characteristics and Uses of Interven· ous Preparations, biz. 73-79, US Department of Health and Human services, 1979.

Gram-negatieve ziekten en de ernstigste complicaties daarvan, bijvoorbeeld bacteremie en endotoxemie, 10 zijn de oorzaak van ernstige ziektegevallen en sterfte bij menselijke patiënten. Dit is in het bijzonder het geval voor het gram-negatieve organisme Pseudomonas aeruginosa, dat in toenemende mate is geassocieerd met bacteriële infecties, in het bijzonder noscomiêle infecties, gedurende de afgelopen 50 jaren.

De afgelopen decaden zijn antibiotica de aangewezen therapie geweest voor de bestrijding van gram-negatieve ziekten. De voortdurende ernstige ziekte gevallen en hoge mortaliteit, geassocieerd met 15 gram-negatieve bacteriële ziekte wijst echter op de beperkingen van de antibiotische therapie, in het bijzonder met betrekking tot P. aeroginosa (zie bijvoorbeeld V.G. Andriole, J. Lab Clin Med. Med 94 (1978) 196-199).

Een methode voor de preventie en behandeling van Pseudomonas in het in de aanhef genoemde artikel. Het betreft de vermeerdering van het immuunsysteem van de gastheer door actieve of passieve immunise-20 ring. Er is bijvoorbeeld geconstateerd dat actieve immunisering van mensen of proefdieren met uit gehele cellen bestaande bacteriële vaccins of gezuiverde bacteriële endotoxinen uit P. aeruginosa leidt tot de ontwikkeling van specifieke opsonische antilichamen, primair gericht tegen determinanten op de repeterende oligosaccharide-eenheden van de lipopolysaccharide (LPS) moleculen, gesitueerd op het buitencel-membraan van P. aeruginosa. Dergelijke antilichamen, hetzij actief opgewekt of passief overgebracht, zijn 25 beschermend gebleken tegen de lethale effecten van P. aeruginosa infectie in een variëteit van dier- modellen (Pollack, zie boven) en in sommige preliminaire onderzoekingen met mensen (zie L.S. Young en M. Pollack, Pseudomonas aeruginosa, biz. 119-132, Hans Huber, 1980).

De genoemde rapporten doen vermoeden dat immunotherapeutische benaderingen zouden kunnen worden toegepast voor het voorkomen en behandelen van bacteriële ziekte, veroorzaakt door P. aerugi-30 nosa, zoals door toediening van gecombineerde menselijke immuunglobulinen, die anti-lichamen tegen de infecterende stam of stammen bevatten. Menselijke immuunglobulinen worden hier gedefinieerd als dat gedeelte van gefractioneerd menselijk plasma, dat verrijkt is aan antilichamen, waaronder specifieke antilichamen tegen stammen van P. aeruginosa zijn vertegenwoordigd. In verband met bepaalde inherente beperkingen in het gebruik van menselijke immuunglobulinecomponenten blijft deze benadering tot 35 behandeling van ziekte als gevolg van P. aeruginosa in onderzoek (zie bijvoorbeeld M. S. Collins en R.E. Roby, Am. J. Med. 76 (3A) (1984) 168-174, en tot nu toe zijn er geen handelsproducten beschikbaar, waarin deze componenten zijn toegepast Eén van de beperkingen, verbonden met immuunglobulinecomposities, is dat zij bestaan uit combinaties van monsters van duizend of meer donors, welke monsters zijn gekozen op de aanwezigheid van bijzon· 40 dere anti-Pseudomonas antilichamen. De combinatie leidt tot een uitmiddeling van individuele antilichaamti-ters, hetgeen op zijn best resulteert in bescheiden verhoging in de resulterende titer van de gewenste antilichamen.

Een andere beperking is dat het selectieproces zelf een kostbare continue screening vereist van de donorcombinatie ter verzekering van productconsjstentie. Ondanks deze pogingen kunnen de immuunglobu-45 lineproducten van batch tot batch en onder producten uit verschillende geografische gebieden aanmerkelijke variaties vertonen.

Nog een andere beperking, inherent aan immuunglobulinecomposities, is dat hun gebruik resulteert in gelijktijdige toediening van grote hoeveelheden van externe eiwitachtige stoffen, die virussen kunnen bevatten, zoals zulke, die onlangs geassocieerd bleken met Acquired Immune Deficiency Syndrome, of 50 AIDS), met de mogelijkheid om nadelige biologische effecten te veroorzaken. De combinatie van lage titers van gewenste antilichamen en een hoog gehalte aan externe stoffen kan dikwijls een beperking betekenen tot suboptimale niveaus van de hoeveelheid specifieke en derhalve gunstige immuunglobuline(s), die aan de patiënt kan worden toegediend.

In 1975 rapporteerden Kohier en Milstein hun ontdekking dat bepaalde muizecellijnen konden worden 55 gefuseerd met muizemiltcellen onder vorming van hybridomen, elk waarvan antilichamen van een enkele specificiteit kan afscheiden, met name monoklonale antilichamen (G. Kohier en C. Milstein, Nature, 256 (1975) 495-497). Door de komst van deze technologie werd het mogelijk in sommige gevallen grote 194961 2 hoeveelheden uitstekend specifieke murine antilichamen voor een bepaalde determinant of determinanten op antigenen te bereiden. Vervolgens werd het door toepassing van later ontwikkelde technologieën mogelijk menselijke monoklonale antilichamen te produceren (zie bijvoorbeeld het Amerikaanse octrooi-schrift 4.464.465).

5 Het wordt onderkend dat in sommige situaties monoklonale anti-lichamen van muizen of composities die zulke antilichamen bevatten problemen kunnen veroorzaken voor toepassing in mensen. Er is bijvoorbeeld gerapporteerd dat monoklonale antilichamen van muizen, gebruikt bij onderzoek voor de behandeling van bepaalde menselijke ziekten, een immuunreactie kunnen opwekken, die ze niet-effectief maakt (R.L. Levy en R.A. Miller, Ann. Rev. Med. 34 (1983) 107-116). Het is echter mogelijk dat met recente vorderingen in 10 recombinant DNA technologie, zoals de productie van muis/mens monoklonale antilichamen deze problemen kunnen worden overwonnen. Ook zijn nu methoden voor de productie van menselijke monoklonale antilichamen beschikbaar (zie Human Hybridomas en Monoclonal Antibodies, Plenum Publishing Corp., 1985).

Een aantal groepen heeft gerapporteerd over de productie onder toepassing van hybridoom en/of 15 celtransformatietechnologie van monoklonale antilichamen, beschermend tegen P. aeruginosa infecties. Er zijn monoklonale antilichamen geproduceerd, die reactief zijn met diverse epitopen van P. aeruginosa, waaronder enkel- en multi-serotype specifieke oppervlakepitopen, zoals gevonden in LPS moleculen van de bacteriën (zie bijvoorbeeld de Amerikaanse octrooiaanvragen 734.624 en 807.394). Ook werden beschermende monoklonale antilichamen bereid, specifiek voor P. aeruginosa exotoxine A (zie bijvoorbeeld de 20 Amerikaanse octrooiaanvrage 742.170).

Hoewel het gebruik van monoklonale antilichamen, specifiek voor het LPS gebied van P. aeruginosa of de exotoxinen van de bacterie, in bepaalde situaties voldoende bescherming kan geven, verdient het in het algemeen de voorkeur bredere beschermingsmogelijkheden te hebben. Zo zou het voor de profylactische behandeling voor potentiële infecties in mensen de voorkeur verdienen één of meer antilichamen toe te 25 dienen, die beschermen tegen een aantal P. aeruginosa stammen. Evenzo zou het in therapeutische toepassingen, waar de serotypen van de infecterende stammen niet bekend zijn, de voorkeur verdienen een antilichaam of combinatie van antilichamen toe te dienen, die effectief zijn tegen de meeste, zo niet alle, klinisch belangrijke P. aeruginosa serotypen, in het ideale geval door het verschaffen van antilichamen, die dwars door de traditionele serotypeschema’s reactief zijn.

30 Eén aspect aan P, aeruginosa fysiologie, dat blijkt bij te dragen aan de virulentie van het organisme, is motiliteit, een vermogen dat primair het resultaat is van de aanwezigheid van een flagellum (zie T. Montie e.a., Infect, and Immun. 38 (1982) 1296-1298).

P. aeruginosa wordt gekenmerkt door een enkele flagellum aan één einde van zijn staafvormige structuur. Modelstudies met muizen met brandwonden hebben getoond dat een groter percentage muizen 35 overleefde wanneer niet-motiele P. aeruginosa stammen in experimentele brandwonden werden geënt dan wanneer motiele stammen werden gebruikt (A. McManus e.a., Bums 6 (1980) 235-239 en T. Montie e.a. Infect, and Immun. 38 (1982) 1296-1298). Andere studies betreffende de pathogenese van P. aeruginosa doen vermoeden dat dieren, geïmmuniseerd met flagella antigeenpreparaten, werden beschermd bij brandwonden en geïnfecteerd met motiele stammen van de bacterie (zie I. Holder e.a., Infect, and Immun. 40 35(1982)276-280).

Van belang is dat P. aeruginosa flagella zijn bestudeerd door serologische methoden en in twee antigene hoofdgroepen blijken te vallen, aangeduid als Hl en H2 door B. Lanyi (Acta Microbiol. Acad. Sd. Hung. 17 (1970) 35-48) en als type a en type b door R. Ansorg (Zbl. Bakt. Hyg. I. Abt. Orig. A, 242 (1978) 228-238). Serologische typering van flagella door beide laboratoria toonden dat H1 flagella (B. Lanyi, zie boven) of 45 flagella type b (R. Ansorg, zie boven) serologisch uniform was, d.w.z. dat geen subgroepen werden geïdentificeerd. Dit serologisch uniforme flagellaire type zal worden aangeduid als type b. Het andere hoofdantigen, H2 (B. Lanyi, zie boven) of type a flagella (R. Ansorg, zie boven) bevatte vijf subgroepen. Dit antigen zal worden aangeduid als flagella type a en de vijf subgroepen als ag, a1t a2, a3 en a4. De vijf subgroepen van type a zijn uitgedrukt in variërende combinaties op diverse stammen van type a, die P.

50 aeruginosa dragen met uitzondering van antigen ag. Het 3g antigen werd gevonden op elk type a flagella, hoewel de mate waarin tussen de stammen varieerde.

Een serotyperingsschema, gebaseerd op de warmtestabiele voornaamste somatische antigenen van P. aeruginosa wordt aangeduid als het Habs schema, dat onlangs is opgenomen in het International Antigenic Typing System schema (zie Int. J. Syst. Bacteriol. 33 (1983) 256). De flagella typen van P. aeruginsa Habs 55 referentiestammen zijn gekarakteriseerd door immunofluorescentie met polyklonale sera door R. Ansorg (Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A, 242 (1978) 228-238) of door coagglutinatie (R. Ansorg e.a., J. Clin. Microbiol. 20 (1984) 84-88). Habs stammen 2,3,4,5,7,10,11 en 12 zijn flagella type b dragende 3 194961 stammen en Habs stammen 1, 6, 8 en 9 dragen type a flagella. Aldus zou een groot aantal stammen van P. aeruginosa mogelijkerwijze kunnen worden herkend door een klein aantal monoklonale antilichamen, specifiek voor flagellaire proteïnen.

Er bestaat derhalve een aanmerkelijke behoefte aan monoklonale antilichamen, die kunnen reageren met 5 epitopen op flagellaire proteïnen en in sommige gevallen ook bescherming bieden tegen meervoudige serotypen van P. aeruginosa. Verder zouden sommige van deze antilichamen geschikt zijn voor gebruik als profylactische en therapeutische behandelingen van P, aeruginosa infecties, alsmede voor de diagnose van dergelijke infecties.

De in de aanhef gevoerde compositie wordt daartoe volgens de uitvinding gekenmerkt doordat deze 10 component een monoklonaal antilichaam of bindend fragment daarvan is dat in staat is tot specifieke reactie met flagella van Pseudomonas aeruginosa bacteriën.

Een compositie volgens de uitvinding is bruikbaar voor de diagnose en/of behandeling van bacteriële infecties en kan bescherming bieden tegen een- of meervoudige serotypen van P. aeruginosa.

Een voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt gekenmerkt doordat het monoklonale antilichaam 15 of bindende fragment daarvan in vivo beschermend is. Deze uitvoeringsvorm geniet de voorkeur omdat zo'n anti-lichaam of fragment daarvan zowel voor diagnostische doeleinden alsook voor therapeutische doeleinden kan worden aangewend.

Een verdere voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt gekenmerkt doordat de genoemde component een monoklonaal antilichaam of bindend fragment daarvan is dat in staat is tot specifieke reactie 20 met flagellair proteïne-epitoop van Pseudomonas aeruginosa. Deze uitvoeringsvorm geniet de voorkeur omdat antilichamen die binden aan een flagellaire proteïne-epitoop bruikbaar zijn voor diagnose of behandeling van infecties door meerdere serotypen van Pseudomonas aeruginosa.

Een verdere voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt gekenmerkt doordat het monoklonale antilichaam in staat is de binding te blokkeren aan de epitoop van monoklonale antilichamen geproduceerd 25 door cellijnen, aangeduid als ATCC Accession Numbers HB9129, HB9130, CRL9300 en CRL9301. Deze uitvoeringsvorm geniet de voorkeur omdat zulke antilichamen bruikbaar zijn voor het selecteren van antilichamen die epitopen op flagella van Pseudomonas aeruginosa herkennen. De geselecteerde antilichamen zijn bruikbaar voor diagnose en/of behandeling van een Pseudomonas aeruginosa infectie.

Een verdere voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt gekenmerkt doordat de genoemde 30 component een monoklonaal antilichaam of bindend fragment daarvan is dat in staat is tot reactie met met type a of type b flagella van flagellair proteïne-epitoop van Pseudomonas aeruginosa. Deze uitvoeringsvorm geniet de voorkeur omdat daarmee een reactie met zowel type a als met type b flagella eiwit kan worden gerealiseerd. Een voorkeursvariant van deze uitvoeringsvorm wordt gekenmerkt doordat een tweede monoklonaal antilichaam in staat is tot reactie met een type flagella dat niet reactief is ten opzichte van het 35 eerste monoklonale antilichaam. Deze uitvoeringsvorm geniet de voorkeur omdat wanneer het ene antilichaam met type b flagella reageert en het andere met type a flagella, meerdere serotypen van Pseudomonas aeruginosa worden gedekt. Een voorkeursuitvoeringsvorm van deze uitvoeringsvormen wordt gekenmerkt doordat het eerste antilichaam een humaan monoklonaal antilichaam is. De reden voor deze voorkeur is dat bij gebruik van een humaan monoklonaal antilichaam geen afweerreactie tegen het 40 antilichaam optreedt, zoals wel het geval is bij gebruik van een heteroloog antilichaam. Het heeft in deze uitvoeringsvormen verder de voorkeur dat ten minste een van de monoklonale antilichamen in vivo beschermend is. De reden voor deze voorkeur is dat de compositie dan zowel voor diagnostiek als voor behandeling van een Pseudomonas aeruginosa infectie bruikbaar is.

Een verdere voorkeursuitvoeringsvorm van de uitvinding wordt gekenmerkt doordat de compositie verder 45 een gammaglobuline fractie van humaan bloedplasma en/of een antibioticum omvat. Deze uitvoeringsvorm geniet de voorkeur omdat aldus een betere antibacteriële respons kan worden verkregen dan met het antilichaam, gammaglobuline of antibioticum alleen.

De uitvinding verschaft verder een farmaceutische compositie gekenmerkt doordat deze een compositie als hierboven gedefinieerd alsmede een fysiologisch aanvaardbare drager omvat. Zo'n compositie heeft het 50 voordeel dat zij voor toediening aan patiënten geschikt is.

De uitvinding verschaft tevens een farmaceutische compositie welke gekenmerkt wordt doordat deze dient ten gebruike voor de behandeling of preventie van een Pseudomonas aeruginosa infectie, welke compositie een monoklonaal antilichaam, reactief met een flagellair proteïne van Pseudomonas aeruginosa en in vivo beschermend, een antimicrobieel middel, een gammaglobuline fractie van humaan bloedplasma 55 en een fysiologisch aanvaardbare drager omvat. Een dergelijke compositie heeft het voordeel van een bijzondere effectiviteit voor het doden van Pseudomonas aeruginosa bacteriën. Een voorkeursvariant van deze compositie wordt gekenmerkt doordat het antilichaam een humaan monoklonaal antilichaam is en de 194961 4 gammaglobuline fractie van humaan bloedplasma verkregen is van mensen die verhoogde concentraties vertonen van immunoglobulinen die reactief zijn ten opzichte van Pseudomonas aeruginosa bacteriën en/of producten daarvan. Deze uitvoeringsvorm geniet de voorkeur vanwege een grotere bescherming tegen infectie.

5 De uitvinding verschaft verder een farmaceutische compositie gekenmerkt doordat deze ten minste twee monoklonale antilichamen omvat, elk specifiek reactief met een verschillend type van Pseudomonas aeruginosa flagellair proteïne en geschikt voor behandeling of voorkoming van Pseudomonas aeruginosa infecties. Zo’n compositie heeft de voorkeur omdat zij geschikt is voor behandeling van een bredere selectie van meerdere serotypen van Pseudomonas aeruginosa bacteriën. Bij voorkeur is hierin ten minste één van 10 de monoklonale antilichamen een humaan monoklonaal antilichaam. Daarvan is het voordeel dat het niet zo’n sterke immuunreactie opwekt als een heteroloog antilichaam. Ook wordt geprefereerd dat de compositie verder ten minste één humaan monoklonaal antilichaam bevat, dat in staat is tot reactie met ten minste één serotypische determinant op een lipopolysaccharidemolecuul van Pseudomonas aeruginosa en/of een monoklonaal antilichaam, dat reactief is met exotoxine A. Het voordeel van zo’n combinatie van antilicha-15 men is een grotere effectiviteit tegen Pseudomonas aeruginosa.

De uitvinding verschaft verder een cellijn die gekenmerkt wordt doordat deze een monoklonaal antilichaam produceert, dat in staat is tot specifieke reactie met type a of type b Pseudomonas aeruginosa flagella.

Een voorkeursuitvoeringsvorm hiervan wordt gekenmerkt doordat het monoklonale antilichaam in vivo 20 beschermend is tegen Pseudomonas aeruginosa. Deze uitvoeringsvorm geniet de voorkeur omdat het door de cellijn geproduceerde antilichaam breed toepasbaar is, zowel voor diagnostiek als voor behandeling van een Pseudomonas aeruginosa infectie.

Een voorkeursuitvoeringsvorm van de cellijn wordt gekenmerkt doordat deze een hybride cellijn is. Het is gunstig dat zo’n hybride cellijn een antilichaam produceert dat slechts één enkele epitoop van Pseudomo-25 nas aeruginosa flagella herkent.

Een verdere voorkeursuitvoeringsvorm van de cellijn wordt gekenmerkt doordat deze humane monoklonale antilichamen produceert. Een voordeel daarvan is dat ze bij toediening aan een mens geen immuunreactie tegen het antilichaam opwekken.

Een verdere voorkeursuitvoeringsvorm van de cellijn wordt gekenmerkt doordat deze één van ATCC 30 Accession Numbers HB9129, HB9130 of CRL9300 en CRL9301 is. Deze zijn door deponering onder de genoemde nummers bij het ATCC voor het publiek toegankelijk.

De uitvinding verschaft verder een werkwijze voor het produceren van monoklonale antilichamen, specifiek voor flagellaire proteïnen van Pseudomonas aeruginosa en geschikt voor behandeling of voorkoming van Pseudomonas aeruginosa infecties, welke werkwijze gekenmerkt wordt doordat ten minste 35 één van de hierboven gespecificeerde cellijnen wordt gekweekt en de antilichamen worden gewonnen.

Ook verschaft de uitvinding een monoklonaal antilichaam gekenmerkt door dezelfde bindingsspecificiteit als één van de monoklonale antilichamen, aangeduid als FA6 IIG5, Pa3 IVC2, PaF4 IVE8,20H11 en 21B8. Het voordeel van dergelijke antilichamen is dat ze voor diagnose en behandeling van infecties bruikbaar zijn, die door meerdere serotypen van Pseudomonas aeruginosa zijn veroorzaakt.

40 Een voorkeursuitvoeringsvorm van dit monoklonale antilichaam wordt gekenmerkt, doordat het geconjugeerd is met een label, dat in staat is een waarneembaar signaal te leveren. Zulke gelabelde antilichamen zijn bijzonder geschikt voor gebruik in diagnostische tests voor Pseudomonas aeruginosa infecties. Voorkeur heeft dat het label fluorescerend of een enzym is. De reden voor deze voorkeur is dat fluorescerende en enzym labels gemakkelijk in een standaard immuuntest kunnen worden geconfigureerd.

45 De uitvinding betreft verder een werkwijze ter bepaling van de aanwezigheid van Pseudomonas aeruginosa in een monster, welke werkwijze gekenmerkt wordt doordat het monster wordt gecombineerd met een monoklonaal antilichaam, dat reactief is met Pseudomonas aeruginosa flagella en complexvorming wordt waargenomen.

Tevens verschaft de uitvinding een pakket ten gebruike voor het detecteren van de aanwezigheid van 50 Pseudomonas aeruginosa bacteriën, dat gekenmerkt wordt doordat dit pakket een monoklonale antilichaam-compositie, die ten minste één monoklonaal antilichaam bevat, dat reageert met een typespecifiek flagellair proteïne van de bacterie, en labels voor het verschaffen van een waarneembaar signaal, covalent gebonden aan het antilichaam of gebonden aan tweede antilichamen, die reactief zijn met het monoklonale antilichaam bevat.

55 Nieuwe cellijnen worden verschaft, die monoklonale antilichamen kunnen produceren, die in staat zijn tot binding van flagella, aanwezig op de meeste stammen van P. aeruginosa bacterie. De monoklonale anti-lichamen reageren specifiek met epitopen op flagella-proteïnen van P. aeruginosa en kunnen onder- 5 194961 scheiden tussen type a en type b flagella van de bacterie. Verder wordt een werkwijze verschaft voor de behandeling van mensen, die gevoelig zijn voor infectie of reeds zijn geïnfecteerd met P. aeruginosa door toediening van een profylactische of therapeutische hoeveelheid van een compositie, die ten minste één monoklonaal antilichaam of bindend fragment daarvan bevat, dat in staat is tot reactie met de flagella van 5 P. aeruginosa stammen, welke compositie bij voorkeur tevens een fysiologisch aanvaardbare drager bevat, te compositie kan ook één of meer van de volgende bestanddelen bevatten: verdere monoklonale antilichamen, die in staat zijn tot reactie met P. aeruginosa exotoxine A; monoklonale antilichamen, die in staat zijn tot reactie met serotype determinanten op de LPS van P. aeruginosa; een gammaglobulinefractie van menselijk bloedplasma; een gammaglobulinefractie van menselijk bloedplasma, welk plasma kan zijn 10 verkregen van een mens, die verhoogde spiegels van met P. aeruginosa reactieve immunoglobulinen vertoont en één of meer antimicrobiële middelen. Verder worden klinische toepassingen van de monoklonale antilichamen verschaft, waaronder de vervaardiging van diagnostische pakketten.

De uitvinding heeft betrekking op nieuwe cellen, die in staat zijn tot productie van monoklonale antilichamen en composities, die zulke antilichamen bevatten, welke composities in staat zijn tot selectieve 15 onderkenning van de flagella, aanwezig op een aantal P. aeruginosa stammen, waar individuele antilichamen typisch één type P. aeruginosa flagella onderkennen. De onderhavige cellen hebben identificeerbare chromosomen, waarin de kiem-lijn DNA daarvan of een precursorcel is herrangschikt voor codering van een antilichaam met een bindingsplaats voor een epitoop op een flagellair proteïne, dat gemeenschappelijk is onder bepaalde P. aeruginosa stammen. Voor type a flagellaire proteïnen kunnen pan-reactieve monoklo-20 nale antilichamen worden geproduceerd; voor type b flagellaire proteïnen worden antilichamen omvat, die pan-reactief zijn of met ten minste ongeveer 70% van de flagella dragende stammen reageren. Deze monoklonale antilichamen kunnen worden toegepast op een ruime variëteit van manieren, waaronder ! diagnose en therapie.

De aldus verschafte monoklonale antilichamen zijn bijzonder geschikt voor de behandeling of profylaxe 25 van ernstige ziekten, veroorzaakt door P, aeruginosa. De oppervlakteproteïnen op de flagella van P. aeruginosa zouden beschikbaar zijn voor direct contact door de anti-lichaammoleculen, daardoor waarschijnlijk de motiliteit van het organisme inhibiterend en/of andere effecten, die gunstig zijn voor de geïnfecteerde gastheer vergemakkelijkend.

De bereiding van monoklonale antilichamen kan geschieden door immortalisering van een cellijn, die in 30 staat is tot expressie van nucleïnezuursequenties, die coderen voor antilichamen, specifiek voor een epitoop op de flagellaire proteïnen van stammen van P. aeruginosa. De geïmmortaliseerde cellijn kan een zoogdiercellijn zijn, die door oncogenesis, door transfectie, mutatie of dergelijke is getransformeerd.

Dergelijke cellen omvatten myeloomlijnen, lymfoomlijnen, of andere cellijnen, die in staat zijn de expressie en secretie van het immunoglobuline of bindende fragment daarvan in vitro te ondersteunen. Het Immu-35 noglobuline of fragment daarvan kan een natuurlijk voorkomend immunoglobuline zijn van een zoogdier, anders dan de voorkeursmuis of van menselijke bronnen, geproduceerd door transformatie van een lymfocyt, in het bijzonder een splenocyt, door middel van een virus of door fusie van de lymfocyt met een neoplastische cel, bijvoorbeeld een myeloom, onder vorming van een hybridecellijn. Het splenocyt zal typisch worden verkregen uit een dier, dat geïmmuniseerd is tegen flagellaire antigenen of fragmenten 40 daarvan, die een epitopische plaats bevatten. Immuniseringsprotocols zijn algemeen bekend en kunnen aanmerkelijk variëren en toch effectief blijven. (Zie Golding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,

Academic Press (1983).

De hybridecellijnen kunnen worden gekloond en gescreend volgens conventionele technieken en antilichameri in de bovenstaande celvloeistof kunnen worden ontdekt, die in staat zijn tot binding met 45 P. aeruginosa flagellaire determinanten. Vervolgens kunnen de geschikte hybridecellijnen worden gekweekt in grootschalige cultuur of geïnjecteerd In de peritoneale caviteit van een geschikte gastheer voor productie van ascitesvloeistof.

In één belichaming van de uitvinding zijn de cellen getransformeerde menselijke lymfocyten, die menselijke monoklonale antilichamen vormen, bij voorkeur beschermend in vivo, tot toegankelijke epitopen, 50 specifiek voor ten minste één flagellair proteïne. De lymfocyten kunnen worden verkregen van menselijke donors, die blootgesteld zijn of geweest zijn aan de geschikte flagella-dragende stammen van P. aeruginosa. Een cel-gedreven transformatieproces, dat de voorkeur verdient, is in detail beschreven in het Amerikaanse octrooischrift 4.464.465.

Door het hebben van de antilichamen volgens de uitvinding, waarvan bekend is dat zij specifiek zijn voor 55 de flagellaire proteïnen, kunnen in sommige gevallen de bovenstaande vloeistoffen van volgende experimenten worden gescreend in een vergelijkend onderzoek met de onderhavige monoklonale antilichamen als middel voor identificatie van verdere voorbeelden van anti-flagellaire monoklonale antilichamen. Aldus 194961 6 kunnen hybridecellijnen gemakkelijk worden geproduceerd uit een variëteit van bronnen op basis van de beschikbaarheid van de onderhavige antilichamen, die specifiek zijn voor de bijzondere flagellaire antigenen.

Wanneer hybridecellijnen beschikbaar zijn, die antilichamen produceren, die specifiek zijn voor de onderhavige epitope plaatsen, kunnen deze hybridecellijnen ook worden gefuseerd met andere neoplasti-5 sche B-cellen, waarbij dergelijke andere B-cellen kunnen dienen als recipiënten voor genome DNA codering voor de receptors. Terwijl neoplastische B-cellen van knaagdieren, in het bijzonder van muizen, het gebruikelijkst worden toegepast, kunnen andere species van zoogdieren worden gebruikt, zoals lagomorfa van runderen, schapen, paarden, varkens, apen en dergelijke.

De monoklonale antilichamen kunnen van elk der klassen of subklassen van immunoglobulinen zijn, 10 zoals IgM, IgD, IgA, IgE of subklassen van IgG, bekend voor elke dierspecies. In het algemeen kunnen de monoklonale antilichamen intact of als bindingsfragmenten worden gebruikt, zoals Fv, Fab, F^b^, maar j gewoonlijk intact.

De cellijnen volgens de uitvinding kunnen andere toepassingen vinden dan voor de directe productie van de monoklonale antilichamen. De cellijnen kunnen worden gefuseerd met andere cellen (zoals geschikte 15 drug-gemerkte menselijke myeloma, muismyeloma of menselijke lymfoblastoïde cellen), ter vorming van hybridomen, en aldus voorzien in de transfer van de genen, die de monoklonale antilichamen coderen. Ook kunnen de cellijnen worden gebruikt als bron van de chromosomen, die de immunoglobulinen coderen, die kunnen worden geïsoleerd en volgens andere technieken dan fusie naar cellen kunnen worden overgebracht. Verder kunnen de genen, die de monoklonale antilichamen coderen, worden geïsoleerd en gebruikt 20 volgens recombinant DNA technieken voor de productie van het specifieke immunoglobuline in een variëteit van gastheren. In het bijzonder kan door vorming van cDNA bibliotheken uit boodschapper RNA, een enkele cDNA kloon, coderend voor het immunoglobuline en vrij van intronen, worden geïsoleerd en geplaatst in geschikte prokaryotische of eukaryotische expressievectors en vervolgens in een gastheer worden getransformeerd voor uiteindelijke massaproductie (zie in het algemeen de Amerikaanse octrooischriften 25 4.172.124, 4.350.683, 4.363.799, 4.381.292 en 4.423.147; zie verder Kennett e.a., Monoclonal Antibodies,

Plenum, New York (1980) en de daarin geciteerde referenties).

Meer specifiek kunnen in overeenstemming met hybride DNA technologie de immunoglobulinen of fragmenten volgens de uitvinding worden geproduceerd in bacteriën of gist (zie Boss e.a., Nucl. Acid.

Res. 12 3791 en Wood e.a., Nature 314, 446). Zo kan bijvoorbeeld de boodschapper RNA, overgedragen 30 van de genen coderende voor de lichte en zware ketens van de monoklonale antilichamen, geproduceerd door een cellijn volgens de uitvinding, worden geïsoleerd door differentiële cDNA hybridisering onder toepassing van cDNA uit andere BALB/c lymfocyten dan de onderhavige kloon. Het mRNA, dat niet hybridiseert, zal rijk zijn voor de boodschappen coderend voor de gewenste immunoglobulineketens. Voor zover noodzakelijk kan dit proces worden herhaald ter verdere verhoging van de gewenste mRNA niveaus.

35 De afgetrokken mRNA compositie kan dan in tegengestelde richting worden overgedragen ter verschaffing van een cDNA mengsel, dat verrijkt is voor de gewenste sequenties. Het RNA kan worden gehydrolyseerd met een geschikte RNase en het ssDNA kan dubbelstrengig worden gemaakt met DNA polymerase I en statistische primers, bijvoorbeeld statistisch gefragmenteerde kalfszwezerik DNA. Het resulterende dsDNA kan dan worden gekloond door invoeging in een geschikte vector, bijvoorbeeld virusvectors, zoals lambda 40 vectors of plasmide vectors, (zoals pBR322, pACYC184, enz.). Door ontwikkeling van sondes op basis van bekende sequenties voor de constante gebieden van de lichte en zware ketens, kunnen de cDNA klonen met de gencodering voor de gewenste lichte en zware ketens worden geïdentificeerd door hybridisering.

Daarna kunnen de genen worden uitgesneden uit de plasmiden, gemanipuleerd ter verwijdering van overtollig DNA bovenstroom van de initiatiecode of constant gebied DNA, en vervolgens worden ingevoerd 45 in een geschikte vector voor transformatie van een gastheer en uiteindelijke expressie van het gen.

Op geschikte wijze kunnen zoogdiergastheren, (b.v. muizecellen) worden gebruikt ter behandeling van de keten (b.v. verbinden van de zware en lichte ketens) ter productie van een intact immunoglobuline en verder desgewenst het immunoglobuline, vrij van de leidersequentie, af te scheiden. Ook kan men unicellulaire micro-organismen gebruiken voor de productie van de twee ketens, waar verdere manipulatie nodig kan zijn 50 ter verwijdering van de DNA sequenties, coderend voor de secretore leider en processignalen, terwijl voorzien wordt in een initiatiecode bij de 5' terminus van de sequentie, die voor de zware keten codeert. Op deze wijze kunnen de immunoglobulinen worden bereid en behandeld teneinde te kunnen worden geassembleerd en glycosyleerd in andere cellen dan zoogdiercellen. Desgewenst kan elk van de ketens worden afgeknot teneinde ten minste het variabele gebied te behouden, welke gebieden dan kunnen 55 worden gemanipuleerd ter verschaffing van andere immunoglobulinen of fragmenten, specifiek voor de flagellaatepitopen.

De monoklonale antilichamen volgens de uitvinding zijn bijzonder nuttig wegens hun specificiteit voor 7 194961 antigenen over bijna alle P. aeruginosa varianten, die momenteel bekend zijn. Ook zijn sommige van de monoklonale antilichamen beschermend in vivo, waardoor zij kunnen worden opgenomen in farmaceutische producten, zoals antilichaamcombinaties voor bacteriële infecties.

Monoklonale antilichamen volgens de uitvinding vinden ook een ruime variëteit van toepassingen In vitro.

5 Zo kunnen bijvoorbeeld de monoklonale antilichamen worden gebruikt voor het typeren van micro- organismen, voor het isoleren van specifieke P. aeruginosa stammen, voor de selectieve verwijdering van P. aeruginosa cellen in een heterogeen mengsel van cellen, en dergelijke.

Voor diagnostische doeleinden kunnen de monoklonale antilichamen al dan niet voorzien zijn van een label. Diagnostische onderzoeken omvatten typisch de detectie van de vorming van een complex door de 10 binding van het monoklonale antilichaam aan het flagellum van het P. aeruginosa organisme. Indien niet voorzien van een label vinden de anti-lichamen toepassing in agglutinatie-onderzoeken. Verder kunnen anti-lichamen zonder label worden gebruikt in combinatie met andere, van een label voorziene antilichamen (tweede antilichamen), die reactief zijn met het monoklonale antilichaam, zoals antilichamen, die specifiek zijn voor immunoglobuline. Ook kunnen de monoklonale antilichamen direct van een label worden voorzien.

15 Er kan een ruime variëteit van labels worden gebruikt, zoals radionucliden, fluorescerende stoffen, enzymen, enzymesubstraten, enzymecofactors, enzyme-inhibitors, liganden (in het bijzonder haptens), enz. Er zijn talrijke immunoassays beschikbaar en bij wijze van voorbeeld omvatten sommige zulke beschreven in de Amerikaanse octrooischriften 3.817.827, 3.850.752, 3.901.654, 3.935.074, 3.984.533, 3.996.345, 4.034.074 en 4.098.876.

20 Gewoonlijk worden de monoklonale antilichamen volgens de uitvinding gebruikt in enzyme- immunoassays, waar de onderhavige antilichamen of tweede antilichamen uit een andere species worden geconjugeerd aan een enzyme. Wanneer een monster, dat P. aeruginosa van een bepaald serotype, zoals menselijk bloed of lysaat daarvan, wordt gecombineerd met de onderhavige antilichamen, vindt binding plaats tussen de anti-lichamen en de moleculen, die de gewenste epitoop vertonen. Dergelijke cellen 25 kunnen dan uit de ongebonden reagentia worden afgescheiden en kan een tweede antilichaam (voorzien van een enzymelabel) worden toegevoegd. Daarna wordt de aanwezigheid van het antilichaam-enzymeconjugaat, dat specifiek aan de cellen gebonden is, bepaald. Ook kunnen andere conventionele technieken worden toegepast, die de deskundige bekend zijn.

Ook kunnen pakketten worden verschaft voor gebruik met de onderhavige antilichamen voor detectie van 30 P. aeruginosa in oplossingen of de aanwezigheid van P. aeruginosa flagellaire antigenen. Zo kan de onderhavige monoklonale antilichaamcompositie volgens de uitvinding worden verschaft, gewoonlijk in een gelyofiliseerde vorm, hetzij op zichzelf, hetzij tezamen met verdere antilichamen, die specifiek zijn voor andere gram-negatieve bacteriën. De antilichamen, die geconjugeerd kunnen zijn met een label of ongeconjugeerd, worden in het pakket opgenomen met buffers, zoals Tris, fosfaat, carbonaat, enz., 35 stabilisatoren, biociden, inerte proteïnen, bijvoorbeeld runderserumalbumine, of derg. In het algemeen zullen deze materialen aanwezig zijn in minder dan ongeveer 5 gew.%, berekend op de hoeveelheid actief antilichaam en gewoonlijk in een totale hoeveelheid van ten minste ongeveer 0,001 gew.%, berekend op de antilichaamconcentratie. Dikwijls zal het gewenst zijn een inert versnijdingsmiddel of excipiêns op te nemen ter verdunning van de actieve ingrediënten, waarbij het excipiêns aanwezig kan zijn in een hoeveelheid van 40 1-99 gew.% van de totale compositie. Wanneer een tweede antilichaam, dat in staat is tot binding van het monoklonale antilichaam, wordt toegepast zal dit gewoonlijk aanwezig zijn in een aparte ampul. Het tweede antilichaam wordt typisch geconjugeerd aan een label en samengesteld op analoge wijze als de hierboven beschreven samenstelling met het antilichaam.

De monoklonale antilichamen, in het bijzonder menselijke monoklonale antilichamen volgens de 45 uitvinding kunnen ook worden opgenomen als componenten van farmaceutische composities, die een therapeutische of profylactische hoeveelheid van ten minste één van de monoklonale antilichamen volgens de uitvinding met een farmaceutisch doelmatige drager bevatten. Een farmaceutische drager dient een verenigbare niet-toxische stof te zijn, die geschikt is om de monoklonale antilichamen aan de patiënt af te leveren. Steriel water, alcohol, vetten, wassen, en inerte vaste stoffen kunnen als drager worden gebruikt.

50 Farmaceutisch aanvaardbare hulpstoffen (buffermiddelen, dispergeermiddelen) kunnen eveneens in de farmaceutische compositie worden opgenomen. Dergelijke composities kunnen een enkelvoudig monoklo-naai antilichaam bevatten teneinde specifiek te zijn voor stammen van één flagellair type van P. aeruginosa.

Ook kan een farmaceutische compositie twee of meer monoklonale antilichamen bevatten onder vorming van een "cocktail”. Zo zou bijvoorbeeld een cocktail, die monoklonale antilichamen tegen beide typen 55 flagella of tegen groepen van de diverse P. aeruginosa stammen (b.v. verschillende serotypen) bevat, een | universeel product zijn met activiteit tegen de grote meerderheid van de klinische isolaten van de betrokken bacterie.

194961 8

De molverhouding van de verschillende monoklonale antilichaamcomponenten zal gewoonlijk niet meer dan een factor 10 verschillen, doorgaans niet meer dan een factor 5, en zal gewoonlijk in een molverhouding van ongeveer 1:1-2 tot elk van de andere antilichaamcomponenten zijn.

De monoklonale antilichamen volgens de uitvinding kunnen ook worden gebruikt in combinatie met 5 bestaande bloedplasmaproducten, zoals in de handel verkrijgbaar gammaglobuline en immuunglobulinepro-ducten, gebruikt voor de profylactische of therapeutische behandeling van P. aeruginosa ziekte in mensen. Bij voorkeur wordt het plasma voor immuunglobulinen verkregen van menselijke donors, die verhoogde niveaus vertonen van immunoglobulinen, reactief met P. aeruginosa (zie in het algemeen het compendium ’’Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host", Amer. J. Med. 76 (3a) (30 maart 1984), 10 blz. 1-231).

De onderhavige monoklonale antilichamen kunnen worden gebruikt als afzonderlijk toegediende composities, gegeven in samenhang met antibiotica of antimicrobiële middelen. De antimicrobiële middelen kunnen typisch een anti-pseudomonale penicilline (b.v. carbenicilline) bevatten tezamen met een aminoglycoside (b.v. gentamicine, tobramycine en derg.), maar ook kunnen talrijke verdere middelen (cefalospori-15 nen), die de deskundige bekend zijn, worden gebruikt.

De monoklonale antilichamen en farmaceutische composities daarvan volgens de uitvinding zijn bijzonder geschikt voor orale of parenterale toediening. Bij voorkeur worden de farmaceutische composities parente-raal, met name subcutaan, intramusculair of intraveneus toegediend. De uitvinding verschaft aldus composities voor parenterale toediening, die een oplossing van het monoklonale antilichaam of een cocktail 20 daarvan bevatten, opgelost in een aanvaardbare drager, bij voorkeur een waterige drager. Er kan een variëteit van waterige dragers worden gebruikt, bijvoorbeeld water, gebufferd water, 0,4% zoutoplossing, O, 3% glycine en dergelijke. Deze oplossingen zijn steriel en in het algemeen vrij van deeltjesvormig materiaal. Deze composities kunnen worden gesteriliseerd volgens conventionele en bekende sterilisatie-technieken. De composities kunnen farmaceutisch aanvaardbare hulpstoffen bevatten, voor zover nodig ter 25 benadering van fysiologische condities, zoals pH-regelaars en buffers, toxiteit-regelende middelen en dergelijke, bijvoorbeeld natriumacetaat, natriumchloride, kaliumchloride, calciumchloride, natriumtactaat en dergelijke. De concentratie van het antilichaam in deze composities kan binnen ruime grenzen variëren, met name van minder dan ongeveer 0,5%, gewoonlijk ten minste ongeveer 1% tot zoveel als 15 of 20 gew.% en wordt primair gekozen op basis van vloeistofvolumes, viscositeiten en dergelijke, die de voorkeur verdienen 30 voor de gekozen toedieningsvorm.

Een typische farmaceutische compositie voor intramusculaire injectie kan bijvoorbeeld 1 ml steriel gebufferd water en 50 mg monoklonaal antilichaam bevatten. Een typische compositie voor intraveneuze injectie kan bijvoorbeeld 250 ml steriele Ringer’s oplossing en 150 mg monoklonaal antilichaam bevatten. Feitelijke methoden voor de bereiding van parenteraal toedienbare composities zijn de deskundige bekend 35 of duidelijk en zijn in meer detail beschreven in bijvoorbeeld Remington's Pharmaceutical Science, 15d ed., Mack Publishing Company (1980).

De monoklonale antilichamen volgens de uitvinding kunnen worden gelyofiliseerd voor opslag en kunnen vóór het gebruik in een geschikte drager worden gereconstrueerd. Deze techniek is effectief gebleken met conventionele immuunglobulinen, waarbij bekende lyofiliserings- en reconstitutietechnieken kunnen worden 40 toegepast. Het zou de deskundige duidelijk zijn dat lyofilisering en reconstitutie kunnen leiden tot verschillende mate van activiteitsverlies van het antilichaam (b.v. met conventionele immuunglobulinen neigen IgM antilichamen tot groter activiteitsverlies dan IgG antilichamen) en dat de gebruikte niveaus ter compensatie kunnen moeten worden aangepast.

De composities, die de onderhavige monoklonale antilichamen of een cocktail daarvan bevatten, kunnen 45 worden toegediend voor de profylactische en/of therapeutische behandeling van P. aeruginosa infecties. Bij therapeutische toepassing worden composities toegediend aan één patiënt, die reeds met één of meer P. aeruginosa serotypen is geïnfecteerd, in een voldoende hoeveelheid om de infectie en zijn complicaties te genezen of althans partieel tot staan te brengen. Een hoeveelheid, die voldoende is om dit te bereiken, wordt gedefinieerd als een "therapeutisch effectieve dosis”. Hoeveelheden, die voor dit gebruik effectief zijn, 50 zijn afhankelijk van de ernst van de infectie en de algemene toestand van het eigen immuunsysteem van de patiënt, maar bedragen in het algemeen ongeveer 1 tot ongeveer 200 mg antilichaam per kilogram lichaamsgewicht, waarbij gewoonlijk dosis van 5-25 mg per kilogram worden gebruikt. Bedacht moet worden dat de materialen volgens de uitvinding in het algemeen zullen worden toegepast in ernstige ziektetoestanden, dat wil zeggen levensbedreigende of potentieel levensbedreigende situaties, in het 55 bijzonder bacteremie en endotoxemie, veroorzaakt door P. aeruginosa.

In profylactische toepassingen worden composities, die het onderhavige antilichaam of een cocktail daarvan bevatten, toegediend aan een patiënt, die nog niet door P. aeruginosa is geïnfecteerd, ter 9 194961 verbetering van de weerstand van de patiënt tegen een dergelijke potentiële infectie. Een dergelijke hoeveelheid wordt gedefinieerd als een ’’profylactisch effectieve dosis”. Bij deze toepassing zijn de precieze hoeveelheden eveneens afhankelijk van de gezondheidstoestand van de patiënt en zijn algemene immuniteitsniveau, maar bedragen in het algemeen 0,1-25 mg per kilogram, in het bijzonder 0,5-2,5 mg per 5 kilogram.

Enkelvoudige of meervoudige toedieningen van de composities kunnen worden uitgevoerd met doses en volgens één patroon, dat door de behandelende arts wordt gekozen. In ieder geval dienen de farmaceutische composities een hoeveelheid van de één of meer antilichamen volgens de uitvinding te verschaffen, die voldoende is om de patiënt effectief te behandelen of te beschermen.

10

VOORBEELD I

Voorbeeld I toont de methodologie, gebruikt voor de bereiding van een monoklonaal antilichaam van de muis dat specifiek aan P. aeruginosa flagella wordt gebonden.

Drie-maanden-oude BALB/c muizen werden acht maal intraperitoneaal geïmmuniseerd met levensvat-15 bare P. aeruginosa Fisher immunotype 1 en Fisher immunotype 2 (A.T.C.C. 27312 en 27313) bacteriën elke één tot twee weken gedurende in totaal negen weken. De initiële bacteriedoses waren 8x10s en 1 x107 organismen per muis voor respectievelijk Fisher immunotype 1 en Fisher immunotype 2, en de dosis werd tijdens het verloop van de immuniseringen tot het 30- tot 60-voudige verhoogd.

Drie dagen na de laatste injectie werd de milt van één muis aseptisch verwijderd en werd een enkelvou-20 dige celsuspensie bereid door zacht roteren van het orgaan tussen de bevroren uiteinden van twee steriele glasplaatjes. Mononucleaire miltcellen werden in een 4:1 verhouding gecombineerd met logfase muizemye-loomcellen (NSI-1, verkregen van dr. C. Milstein, Molecular Research Council, Cambridge, Engeland) en gefuseerd ter vorming van hybridomen volgens de procedure, beschreven in Infect. Immun. 36 (1982) 1042-1053. De uiteindelijke hybridecelsuspensie werd verdund tot een concentratie van 1,5 x 10® cellen per 25 ml in RPMI-hybride-HAT (RPM11640, bevattende 15% hitte-geïnactiveerd foetaal kalfserum, 1 mM

natriumpyruvaat, 100 pg/ml penicilline en streptomycine, 1,0 x 10"4 M hypoxantine, 4,0 x 10‘7 M aminop-terine en 1,6 x 10'5 M thymidine), die 2,0 x 10"6 per ml vers bereide BALB/c thymocyten als voedercellen bevatte.

Het mengsel werd aangebracht op 96-putplaten (200 pl per put). De culturen werden gevoed door 30 verwijdering en vervanging van 50% van het volume van elke put door verse RPMI-hybride-HAT elke twee tot drie dagen. De bovenstaande cultuurvloeistof werd onderzocht op de aanwezigheid van anti-P. aeruginosa antilichamen door enzyme-gebonden immunosorbent assay (ELISA) wanneer de celgroei ongeveer 40% samenvloeiing in de putten bereikte, gewoonlijk binnen 7-10 dagen.

De bovenstaande cultuurvloeistoffen van de hybridecellen werden gelijktijdig op buitenmembraan-35 preparaten van elk van de twee immuniserende bacteriën onderzocht. Buitenmembraanpreparaten werden geïsoleerd door een modificatie van de methode, beschreven in Infect. Immun. 36 (1982) 1042-1053. Bacteriën (P. aeruginosa Fisher immunotype 1 en Fisher immunotype 2) werden geënt in trypticase sojacultuurvloeistof (TSB) en gedurende 16-18 uur bij 34°C gekweekt met beluchting in een rondwentelend schudbad. De bacteriën werden geoogst door centrifugeren en tweemaal gewassen met fosfaat-gebufferde 40 zoutoplossing (PBS, 0,14 M NaCI, 3 mM KCI, 8 mM Na2HP04.7 H20, 1,5 mM KH2P04, PH 7,2), bevattende 150 trypsine-inhibiterende eenheden (T.I.U.) aprotinine per ml.

De korrel van de laatste centrifugering werd opnieuw gesuspendeerd is 0,17 M triêthanolamine, 20 mM dinatriumethyleendiamine-tetra-azijnzuur (EDTA) en vervolgens op ijs gedurende 10 minuten gehomogeniseerd. De vaste stof werd gekorreld door centrifugeren van het homogenaat bij 14.900 x g en geëcarteerd, 45 en de bovenstaande vloeistof werd opnieuw gecentrifugeerd zoals beschreven. De vaste stof werd andermaal geëcarteerd en de membranen werden gekorreld door centrifugeren van de bovenstaande vloeistof bij 141.000 x g gedurende 1 uur. De bovenstaande vloeistof werd geëcarteerd en de membraan-vaste stof werd overnacht bewaard bij 4°C in 10 ml PBS, bevattende 75 T.I.U. aprotinine per ml. De vaste stof werd de volgende dag opnieuw gesuspendeerd door vorticeren en vervolgens bemonsterd en bewaard 50 bij -70°C. Het proteïnegehalte van elk monster werd bepaald volgens de methode van Lowry e.a. (J. Biol. Chem. 193 (1951) 265-275).

De antigenplaten voor de ELISA werden als volgt geprepareerd. De buitenmembraanpreparaten werden verdund tot 5 pg per ml proteïne in PBS en 50 pl van de oplossingen werd in elke put van 96-putplaten gebracht, afgesloten en overnacht bij 37°C geïncubeerd. Ongebonden antigen werd uit de platen verwijderd 55 en 100 μΙ 5% (gewicht/volume) runderserumalbumine (BSA) in PBS werd aan elke put toegevoegd, waarna de platen gedurende 1 uur bij 37°C werden geïncubeerd.

Na verwijdering van het ongeadsorbeerde BSA werd de bovenstaande cultuurvloeistof (50 μΙ) uit elke put 194961 10 van de fusieplaten gekopieerd in overeenkomstige putten van antigenplaten en 30 minuten bij 37°C geïncubeerd. Het ongebonden antilichaam werd uit de putten verwijderd en de platen werden driemaal gewassen met 10 pl 1% (gewicht/volume) BSA-PBS per put. Vervolgens werd per put 50 μΙ op passende wijze verdund gebiotinyleerde geite-anti-muis IgG aan elke put toegevoegd en 30 minuten bij 37°C 5 geïncubeerd. De platen werden driemaal gewassen zoals hierboven beschreven, waarna 50 μΙ van een tevoren gevormd avidine:gebiotinyleerde mierikswortel peroxydasecomplex (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA), bereid volgens de specificaties van de fabrikant, aan de putten toegevoegd. Na 30 minuten bij kamertemperatuur werd het Vectastain reagens uit de putten verwijderd, waarna de putten op de beschreven wijze werden gewassen en per put 100 μΙ substraat o-fenyleendiamine 10 (0,8 mg/ml in 0,1 M citraatbuffer, pH 5,0, gemengd met een gelijk volume van 0,03% (volume/volume) H202) werd toegevoegd. Het substraat werd 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker geïncubeerd, waarna de reacties werden beëindigd door toevoeging van 50 μΙ 3N H2S04 per put.

Hybridoomcellen, die monoklonale antilichamen afscheidden, die zich bonden aan één van de twee antigenpreparaten, werden opgespoord door meting van de absorptie bij 490 nm van de colorimetrische 15 reacties in elke put op een Dynatech Model 580 MicroELISA reader. De cellen in een put, aangeduid Pa3 IVC2, produceerde antilichaam, dat zich alleen bond aan de Fisher Immunotype 2 antigenplaat. Deze put werd verder bestudeerd, zoals hieronder beschreven. Het monoklonale antilichaam en de klonale cellijn worden beide in de volgende tekst geïdentificeerd door de Pa3 IVC2 aanduiding. Pa3 IVC2 cellen uit de masterput werden geminikloneerd en gekloneerd door beperkende verdunningstechnieken, zoals beschre-20 ven in Infect. Immun. 36 (1982) 1042-1053.

Ascitesvloeistof, die het monoklonale antilichaam met hoge titer bevatte, werd bereid in CB6 F, muizen (BALB/c (vrouwelijk) x C57BL/6 (mannelijk) Fn) volgens procedures, beschreven in Infect. Immun. 36 (1982) 1042-1053. Twee- tot drie-maanden-oude mannelijke CB6 F, muizen werden intraperitoneaal geïnjecteerd met 0,5 ml Pristane (2, 6, 10, 14-tetramethylpentadecaan, Aldrich Chemical Co.) 10-21 dagen voor 25 intraperitoneale injectie met logfase Pa3 IVC2 cellen in RPMI. Elke muis werd geïnjecteerd met 0,5-1 x 107 cellen in 0,5 ml. Na ongeveer twee weken werd de vloeistof, die zich had verzameld, elke twee tot drie dagen uit de muizen verwijderd. De concentratie van antilichaam in de ascitesvloeistof werd bepaald door agarosegelelektroforese, en alle ascites die 5 mg/ml of meer antilichaam bevatte werd samengevoegd, bemonsterd en bevroren bij -70°C.

30 Bovenstaande cultuurvloeistof van de gekloonde Pa3 IVC2 cellijn werd onderzocht door ELISA, zoals hierboven beschreven, op buitenmembraanpreparaten van alle zeven P. aeruginosa Fisher immunoty-pestammen (A.T.C.C. 27313-27318), P. aureofaciens (A.T.C.C. 13985) en Klebsiella pneumoniae (A.T.C.C. 8047), alle bereid zoals hierboven beschreven. Antilichaam PA3 IVC2, gebonden aan de buitenmembraanpreparaten van P. aeruginosa Fisher immunotypen 2, 6 en 7 en niet aan andere Fisher immunotypen, 35 P. aureofaciens of K. pneumoniae.

Het specifieke antigen, geïdentificeerd door het antilichaam Pa3 IVC2 werd geïdentificeerd door radioimmuunprecipitatie. Deze omvat in het kort het incuberen van antigenen, die van een radialabel zijn voorzien, met Pa3 IVC2 antilichaam en een deeltjesvormige bron van proteïne A, hetgeen resulteert in de vorming van onoplosbare antilichaam:antigen complexen. Deze complexen worden gewassen ter verwijde-40 ring van niet-specifiek gebonden antigen, waarna de complexen worden gedissocieerd en gescheiden in een polyacrylamidegel. De in het gel gevonden overwegende radioactieve species worden daarbij geïdentificeerd als de corresponderende antigenen, waaraan het antilichaam Pa3 IVC2 zich bindt.

Monsters (25 pg) van oplosbare P. aeruginosa Fisher immunotypen 2, 3, 4 en 5 buitenmembraanpreparaten werden radioactief gemerkt in vaste fase met 12SI met behulp van lodo-gen (Pierce Chemical Co) 45 (Biochem. Biophys. Res. Commun. 80 (1978) 849-857; Biochemistry 17 (1978) 4807-4817). Deze procedure resulteerde in de jodering van blootgestelde tyrosineresidu’s van de meeste, zo niet alle proteïnen in de buitenmembraanpreparaten.

Ter vermindering van niet-specifieke binding van de buitenmembraanantigenen aan antilichaam Pa3 IVC2, werden de radioactief gemerkte preparaten (5 x 10® tellingen per minuut per analyse) eerst 1 uur bij 50 4°C geïncubeerd met BALB/c normaal muizeserum (1:40 uïteindelijke verdunning). Vervolgens werd bovenstaande vloeistof (0,5 ml) van de Pa3 IVC2 cultuur, die het Pa3 IVC2 antilichaam bevatte, aan elk buitenmembraanmonster toegevoegd. Na incubatie van antigen en antilichaam gedurende 1 uur bij 4°C werd de proteïne-A bron, IgGSORB (0,095 ml per monster) (The Enzyme Center, Ine., Boston, MA) toegevoegd, waarna nog 30 minuten bij 4°C werd geïncubeerd (J. Immunol. 115 (1975) 1617-1622).

55 IgGSORB werd bereid volgens de specificaties van de fabrikant en vlak voor het gebruik werden niet-specifieke reacties voorkomen door blokkering van potentieel reactieve plaatsen met cultuurmedia door tweemaal wassen van het IgGSORB met RPMI-hybride (RPMI-hyride-HAT media exclusief HAT).

11 194961

De antigen-antilichaam-lgGSORB complexen werden 10 minuten bij 4°C gecentrifugeerd bij 1500 x g, ' tweemaal gewassen met fosfaat-RIPA buffer (10 mM fosfaat, pH 7,2, 0,15 M NaCI, 1,0% (volume/volume)

Triton X-100, 1,0% (gewicht/volume) natriumdeoxycholaat, 0,1% (gewicht/volume) natriumdodecylsulfaat (SDS), en 1,0% (volume/volume) aprotinine); tweemaal met een buffer met hoog zoutgehalte (0,1 M 5 Tris-HCI, pH 8,0, 0,5 M LiCI, 1% (volume/volume) beta-mercaptoëthanol); en eenmaal met lysisbuffer (0,02 M Tris-HCL, pH 7,5, 0,05 M NaCI, 0,05% (volume/volume) Nonidet P-40) (Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 76 (1979) 4479-4483). Antigen, gebonden aan het complex, werd vrijgesteld door incubatie gedurende 10 minuten bij 95°C met monsterbuffer (0,125 M Tris-HCI, pH 6,8, 2% (gewicht/volume) SDS, 2% (volume/ 10 volume) betamercaptoëthanol en 20% (volume/volume) glycerol) en verzameld in de bovenstaande vloeistof na centrifugeren bij 1500 x g gedurende 10 min.

De bovenstaande vloeistofmonsters werden aangebracht op 14% polyacrylamidegels, bevattende SDS bereid volgens de methode van B. Lugtenberg e.a. (FEBS Lett. 58 (1978) 254-258), zoals gemodificeerd door Hancock en Carey (J. Bacteriol. 140 (1979) 902-910) en de antigenen werden in het gel gescheiden 15 door elektroforese overnacht bij een constante spanning van 50 V. Na fixatie van het gel in 40% (volume/ volume) methanol, 10% (volume/volume) azijnzuur en 5% (volume/volume) glycerol overnacht, werd het via een Biorad geldroger (Richmond, CA) gedroogd op Whatman 3 MM papier. Het gedroogde gel werd bedekt met kunststof wikkel en blootgesteld aan Kodak X-AR film gedurende 18 uur bij kamertemperatuur.

Resultaten van dit experiment toonden dat Pa3 IVC2 zich bond aan slechts één antigen in het buiten-20 membraanpreparaat van P. aeruginosa Fisher immunotype 2 en niet aan enig ander antigen, aanwezig in de andere buitenmembraanpreparaten. Het molecuulgewicht (MW) van het antigen in het gel was ongeveer 53.000 dalton, bepaald door vergelijking van zijn mobiliteit met die van 14C-gemerkte proteïnestandaards (fosforylase B, MW 92.500; BSA, MW 69.000; ovalbumine, MW 46.000; koolzuuranhydrase, Mw 30.000; cytochrome C, MW 12.000), die in hetzelfde gel werden gescheiden. Het molecuulgewicht van dit antigen 25 correleerde met het molecuulgewicht van flagelline, het proteïne van de flagella van P. aeruginosa (Infect. Immun. 35 (1982) 281-288).

Verder werd Pa3 IVC2 onderzocht volgens ELISA onder toepassing van P. aeruginosa Habs stammen 1-12 (A.T.C.C. 33343-33359), gefixeerd met ethanol op 96-put microtiterplaten. De antigenplaten werden als volgt geprepareerd.

30 Ovemachtvloeistofculturen van elk organisme werden gecentrifugeerd, tweemaal gewassen met PBS en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS tot een A^ van 0,2 O.D. eenheden. De verdunde bacteriën werden in putten gebracht (50 pl per put) en vervolgens gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur gecentrifugeerd bij 1500 x g. Het PBS werd geaspireerd en vervolgens werd ethanol (95%) aan de putten toegevoegd gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Nadat de ethanol uit de putten was verwijderd 35 werden de platen aan de lucht gedroogd en vervolgens tot het gebruik bedekt en bewaard bij 4°C.

De resultaten van de ELISA proeven, uitgevoerd als hierboven beschreven, toonden dat Pa3 IVC2 zich bond aan ethanol-gefixeerde Habs stammen 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 en 12. Dit specificiteitspatroon toonde dat Pa3 IVC2, gebonden aan type b flagella van P. aeruginosa (Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A 242 (1978) 228-238; J. Clin. Microbiol. 20 (1984) 84-88). Op basis van deze toekenning van specificiteit aan monoklo-40 naai Pa3 IVC2 dragen de P. aeruginosa referentiestammen, Fisher immunotype 2, Fisher immunotype 6 en Fisher immunotype 7 type b flagella. Uit de voorgaande experimentele gegevens werd geconcludeerd dat Pa3 IVC2 zich specifiek bindt aan P. aeruginosa flagelline type b.

In vivo beschermende activiteit van Pa3 IVC2

Er werden dierproeven uitgevoerd om te bepalen of monoklonaal antilichaam Pa3 IVC2 een muis zou 45 beschermen, bedreigd met meervoudige LDM van levende P. aeruginosa bacterie. Het gekozen model was het gebrande muismodel (J. Trauma 23 (1983) 530-534). Aan groepen van muizen werd een ernstige brandwond gegeven volgens het beschreven protocol en vervolgens onmiddellijk bedreigt met 5-10 LDso’s van Fisher immunotype 7. Vóór de brandwond en de bedreiging werd monoklonaal antilichaam intra-peritoneaal toegediend als ascites met hoge titer (0,2 ml intraperitoneaal). In de met Pa3 IVC2 behandelde 50 dieren werd geen toename van het aantal overlevenden waargenomen in vergelijking met de dieren, die geen antilichaam ontvingen.

VOORBEELD II

Voorbeeld II toont de methodologie voor de bereiding van een muizehybridoomcellijn, die een muizemono-55 klonaal antilichaam produceert tegen P. aeruginosa flagelline type b, dat in vivo beschermend Is.

Volwassen vrouwelijke BALB/c muizen werden eerst intraperitoneaal geïnjecteerd met levenskrachtige P, aeruginosa Fisher immunotype 6 (A.T.C.C. 27317) (8 x 106 organismen), twee weken later gevolgd door 194961 12 een injectie van levensvatbare P. aeruginosa Fisher immunotype 5 (A.T.C.C. 27316) (4x10® organismen). Tijdens de daarop volgende periode van twee weken werden levensvatbare P, aeruginosa Fisher immunotype 5 en Fisher immunotype 6 tezamen toegediend in twee injecties per week. De dosis van elk organisme werd verhoogd, zodanig dat de uiteindelijke dosis het tienvoudige was van de begindosis. Vier dagen na de 5 laatste levensvatbare bacterie-injectie werd een laatste injectie gegeven van P. aeruginosa Fisher immunotype 6 buitenmembraanpreparaten (50 pg proteïne), bereid volgens J. Bacteriol. 136 (1978) 381-390). Drie dagen na de laatste immunisering werd van één muis de milt verwijderd en werden de miltcellen geprepareerd voor hybridisering op de in voorbeeld I beschreven wijze.

Bovenstaande cultuurvloeistoffen van de hybridoomcellen werden onderzocht op de aanwezigheid van 10 anti-P. aeruginosa antilichamen door ELISA op de dag 10 na de fusie volgens de in voorbeeld I beschreven procedures, behalve dat het antigen voor de ELISA platen bestond uit levensvatbare bacteriën, geïmmobiliseerd in de putten van de 96-puts microtiterplaten. De platen werden als volgt geprepareerd.

Vijftig microliter poly-L-lysine (PLL) (1 pg/ml in PBS) werd toegevoegd aan elke put van de 96-putplaten en 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Ongeadsorbeerd PLL werd verwijderd en de putten 15 werden driemaal gewassen met PBS. De overnacht in TSB gegroeide bacterieculturen werden éénmaal gewassen met PBS en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in PBS tot O-D.^ „„ = 0,2. Vijftig microliter van de bacteriële suspensies werd toegevoegd aan eike put van de plaat en 1 uur bij 37°C met rust gelaten om te binden. Ongebonden bacteriën werden verwijderd, waarna de putten driemaal werden gewassen met zoutoplossing-Tween (0,9% (gewicht/volume) NaCI, 0,05% (volume/Volume) Tween-20).

20 Niet-specifieke binding van de antilichamen werd geblokkeerd door toevoeging van 200 pl/put blokkeringsbuffer (PBS, bevattende 5% (gewicht/volume) niet-vette droge melk, 0,01% (volume/volume) Antifoam A (Sigma) en 0,01% (gewicht/volume) thimerosal) aan de putten en incubatie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Overmaatbiokkeringsbuffer werd verdreven en de putten werden driemaal gewassen met zoutoplossing-Tween, zoals eerder beschreven.

25 Bovenstaande cultuurvloeistoffen (50 pl) werden gekopieerd in de corresponderende putten van de analyseplaten en 30 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De bovenstaande cultuurvloeistoffen werden verwijderd en de putten werden vijfmaal met zoutoplossing-Tween gewassen.

Een enzyme-geconjugeerd tweede trapantilichaam (mierikswortelperoxydase-geconjugeerde geiteanti-muis IgG + IgM) werd verdund in PBS, bevattende 0,1% (volume/volume) Tween-20 en 0,2% (gewicht/ 30 volume) BSA volgens eerder uitgevoerde titraties, waarna 50 μΙ van het reagens werd toegevoegd aan elke put en 30 minuten bij kamertemperatuur werd geïncubeerd. De overmaat reagens werd verwijderd; de putten werden vijfmaal gewassen in zoutoplossing-Tween; per put werd 100 μΙ o-fenyleendiaminesubstraat toegevoegd, waarna 30 minuten werd geïncubeerd zoals beschreven in voorbeeld I. De reacties werden beëindigd zoals vermeld in voorbeeld I en vervolgens afgelezen bij Α4Θ0 m op een Bio-Tek EL-310 35 Automated EIA Plate Reader.

Volgens de beschreven methoden werden de bovenstaande cultuurvloeistoffen van de fusie onderzocht op de aanwezigheid van antilichamen, die zich bonden aan P. aeruginosa Fisher immunotypen 1, 2,3 of 4, maar niet aan controleplaten, geprepareerd door dezelfde PLL en blokkeringsprocedure, maar zonder bacteriën. Bovenstaande vloeistoffen, die anti-lichaam bevatten, dat zich bond aan één van deze vier Fisher 40 immunotypen, werden een tweede maal onderzocht met elk van de zeven Fisher immunotypebacteriên afzonderlijk. Antilichaam aanwezig in de bovenstaande vloeistof van één put, PaF4 IVE8, bond zich alleen aan P, aeruginosa Fisher immunotypen 2, 6 en 7. Cellen uit put PaF4 IVE8 werden gekloond door beperkende verdunningsmethoden, zoals beschreven in voorbeeld I. Het monoklonale antilichaam en de klonale cellijn uit deze put worden beide in de volgende tekst geïdentificeerd door de aanduiding PaF4 45 IVE8. Monoklonale antilichaam-bevattende ascitesvloeistof met hoge titer werd gegenereerd zoals beschreven in voorbeeld I, behalve dat BALB/c muizen werden gebruikt in plaats van CB6F,.

Specificiteit van PaF4 IVE8

Een onderzoek, uitgevoerd ter identificatie van het antigen, gebonden door monoklonaal antilichaam PaF4 IVE8 was indirecte immunofluorescentie op bacteriële organismen. Elk van de zeven referentie Fisher 50 immunotypen van P. aeruginosa plus een niet-geflagelleerde stam van P. aeruginosa (PA 103, A.T.C.C. 29260, J. Bacteriol. 62 (1951) 377-389) en Escherichia coli (G.S.C. A25) werden overnacht bij 37°C in TSB gegroeid. De bacteriën werden gecentrifugeerd en vervolgens tweemaal gewassen in PBS. Elke stam werd opnieuw gesuspendeerd in PBS tot een O-D.^ „„ = 2,2.

De bacteriële suspensies werden vervolgens verder verdund 1:150 en monsters van 20 μΙ werden 55 geplaatst in individuele putten van Carlson glaasjes en op het glaasje gedroogd bij 40°C. Bovenstaande cultuurvloeistoffen (25 μΙ) van PaF4 IVE8 werden op de glaasjes in een vochtigheidskamer bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten op de gedroogde bacteriemonsters geïncubeerd. Ongebonden antilichaam 13 194961 werd van de glaasjes afgewassen door dompeling van de glaasjes in gedestilleerd water.

Nadat de glaasjes werden gedroogd werd fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-geconjugeerde geit anti-muis lgG+ IgM (25 pi per put van een 1:40 verdunning in PBS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer in het donker op de glaasjes geïncubeerd. De glaasjes werden opnieuw in 5 gedestilleerd water gewassen, gedroogd en vervolgens bedekt met een dekglas, gemonteerd met glycerol in PBS (9:1). De glaasjes werden met een fluorescentiemicroscoop bezichtigd.

Fluorescerende kleuring werd alleen waargenomen bij P. aeruginosa Fisher immunotypen 2, 6 en 7 en vertoonde een sinusoïdaal patroon (lijn) uitgaande van slechts één einde van de organismen. Dit is consistent met de morfolofie en locatie van de enkele polaire flagellum van deze bacteriën.

10 De reactie van PaF4 IVE8 met flagella werd bevestigd door immunovloeianalyse. Buitenmembraan-antigenen van P. aeruginosa Fisher immunotype 6 (zie voorbeeld I) werden gescheiden door elektroforese in een 14% polyacrylamidegel, dat SDS bevatte, zoals beschreven in voorbeeld I, behalve dat de elektroforese werd uitgevoerd gedurende 5 uur bij een constant amperage van 80 mA. Voorgekleurde molecuulge-wichtsmarkeringsmiddelen (lysozyme, Mw 14.300; beta-lactoglobuline, MW 18.400; alfa-chymotrypsinogeen, 15 Mw 25.700; ovalbumine, MW 43.000; runderserumalbumine, Mw 68.000; fosforylase B, MW 97.400; en myosine, MW 200.000) werden in hetzelfde polyacrylamidegel opgenomen.

Antigenen werden overnacht bij 4°C bij een constant amperage van 200 mA uit het polyacrylamidegel overgedragen op een nitrocellulosemembraan (NCM) (0,45 pm) in een Tris-glycine-methanolbuffer (Proc.

Natl. Acad. Sci., U.S.A. 76 (1979) 4350-4354), bevattende 0,05% (gewicht/volume) SDS. Na de overdracht 20 werd het NCM gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd in 0,05% (volume/volume) Tween-20 in PBS (PBS-Tween) (J. Immunol. Meth. 55 (1982) 297-307). Bij deze behandeling en alle volgende behandelingen werd de schotel, die het NCM bevatte, geplaatst op een schommelplatform teneinde verdeling van de oplossing over het gehele NCM te verzekeren.

Na 1 uur werd de PBS-Tween oplossing afgegoten en werd PaF4 IVE8 ascites (verdund 1:1000 in 25 PBS-Tween) toegevoegd en met het NCM gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Het NCM werd vervolgens vijfmaal, steeds 5 minuten, gewassen met PBS-Tween ter verwijdering van ongebonden antilichaam. Alkalische fosfatase-geconjugeerde geit anti-muis IgG + IgM (Tago, Inc.) werd verdund volgens de specificaties van de fabrikant en met het NCM gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd. Het NCM werd vijfmaal op de beschreven wijze gewassen, waarna substraat-bevattend broomchloorindolylfos-30 faat en nitroblauw tetrazolium (Sigma) bereid zoals beschreven in Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A. 80 (1983) 4045-4049) werd toegevoegd en 10-20 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De reactie werd ! beëindigd door wegwassen van het substraat met gedestilleerd water. !

De resultaten van dit experiment toonden dat PaF4 IVE8 zich specifiek bond aan een enkel antigen met i een molecuulgewicht van 53.00 dalton in het buitenste membraanpreparaat. De resultaten van het indirecte i 35 immunofluorescentie-onderzoek en immunovloeien tonen dat PaF4 IVE8 zich bindt aan de flagella van P, aeruginosa. j

Het flagellatype, dat PaF4 IVE8 onderkende werd door ELISA bepaald. Habs stammen 1-12 (A.T.C.C. j

33348-33359) werden elk gebonden aan putten van 96-puts microtiterplaten (Linbro) met PLL, waarna de I

ELISA werd uitgevoerd zoals eerder in dit voorbeeld beschreven. De bron van PaF4 IVE8 antilichaam was ! 40 bovenstaande cultuurvloeistof. Positieve reacties werden waargenomen in putten, die Habs stammen 2, 3, j 4, 5, 7,10,11 en 12 bevatten, waaruit blijkt dat PaF4 IVE8 zich bindt aan type b flagella. De beschermings-gegevens in vivo worden gepresenteerd in voorbeeld IV. i

VOORBEELD III

45 Voorbeeld III toont de methodologie voor de bereiding van een rnuizehybridoomcellijn, die een monoklonaal antilichaam produceert, dat reactief is met anti-P. aeruginosa flagella type a, dat beschermend is in vivo.

De lymfoldecelbron voor de fusie was een milt uit een geïmmuniseerde BALB/c muis, die in de loop van een periode van zes weken viermaal intraperitoneaal was geïnjecteerd met gezuiverd type a flagella (10-20 pg proteïne) uit Habs stammen 6 en 8 (A.T.C.C. 33353 en 33355). Flagella werden gezuiverd volgens de 50 methode, beschreven in Infect. Immun. 35 (1982) 281-288, met dit verschil dat de laatste centrifugering van flagella was bij 100.000 x g gedurende 1 uur in plaats van 40.000 x g gedurende 3 uur. Een tweede modificatie, die voor sommige procedures werd toegepast, was de flagella van de bacterie te scheiden gedurende 30 seconden in een menger in plaats van 3 minuten (Infect. Immun. 49 (1985) 770-774).

Proteïneconcentraties van elk preparaat werden bepaald met de Bio-Rad Protein Assay (Bio-Rad) en de 55 aanwezigheid van verontreinigend lipopolysaccharide (LPS) werd bepaald door meting van het KDO gehalte (Anal. Biochem. 85 (1978) 595-601). De molecuulgewichten van de flagellaproteïnen werden bepaald door vergelijking van hun migratie in een SDS polyacrylamidegel met de migratie van standaardprotelnemerkers 194961 14 (BRL) (zie voorbeeld II). Het molecuulgewicht van Habs 6 flagelline was 51.700 dalton en dat van Habs 8 flagelline 47.200 dalton. Deze waarden stemmen overeen met die van Infect. Immun. 49 (1985) 770-774.

Fusie van splenocyten uit flagelline-geïmmuniseerde muizen en NS-1 myeloomcellen werd drie dagen na de laatste immunisering uitgevoerd, zoals beschreven in de voorbeelden I en II. Toen de hybridoomcellen 5 groeiden tot een samenvloeiing van ongeveer 40% (dag 7) werden de bovenstaande cultuurvloeistoffen gekopieerd in overeenkomstige putten van drie verschillende antigenplaten, PLL-gebonden P. aeruginosa Fisher immunotype 1 (zie voorbeeld II voor de bereiding) en formaline-gefixeerde Habs 6 en Habs 9.

De bacteriën voor de formaline-gefixeerde antigenplaten werden gegroeid, gewassen en verdund zoals beschreven voor PLL-gebonden antigenplaten. Verdunde bacteriën (0,2 O.D.-eenheden bij A^) werden 10 toegevoegd aan individuele putten (50 pl per put) van Linbro 96-puts microtiterplaten, waarna de platen gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur werden gecentrifugeerd bij 1200 x g. De bovenstaande vloeistoffen werden uit de putten verwijderd en 75 pl 0,2%’s (volume/volume) formaline in PBS werd aan elke put toegevoegd en gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. Nadat de formaline uit de putten was verwijderd, werden de platen aan de lucht gedroogd en tot het gebruik bij 4°C bewaard.

15 Formaline bracht geen wijziging in de antigeniciteit van de flagella, zoals blijkt uit het vermogen van anti-flagella antisera tot agglutinatie van met formaline behandelde organismen (Acta Microbiol. Acad. Sci., Hung. 17 (1970) 3548). P. aeruginosa Fisher immunotype 1 stam werd als controle gebruikt, omdat deze stam niet-geflagelleerd was, zoals bij beitskleuring bleek (Manual of Clin. Microbiol. (1985) ed. Amer. Soc. Microbiol., blz. 1099). Hybridecellen in de put, aangeduid als FA6 IIG5 produceerde een antilichaam, dat 20 zich bond aan Habs 6 en Habs 9 (beide flagella type a dragende stammen), maar niet aan Fisher immunotype 1.

Cellen uit de put FA6 IIG5 werden in een subcultuur gekweekt en gekloond zoals beschreven in de vorige voorbeelden. Het monoklonale anti-lichaam en de klonale cellijn uit deze put worden in het hiernavolgende verder aangeduid als FA6 IIG5. Ascites werd geproduceerd in BALB/c muizen, zoals beschreven 25 in voorbeeld II.

Specificiteit van FA6 IIG5

De specificiteit van het antilichaam FA6 IIG5 werd bepaald door indirecte immunofluorescentie en immunovloeiing. De indirecte immunofluorescentie werd in wezen uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld II met de volgende modificaties.

30 Bacterieculturen, die overnacht waren gegroeid op trypticasesoja-agar bij 30°C werden van de platen verwijderd met wattenstaafjes en opnieuw gesuspendeerd in PBS tot een Aeeo van 0,2 O.D.-eenheden.

Formaline (0,37% (volume/volume) in PBS eindconcentratie) werd aan de suspensie onder wervelen toegevoegd. Na incubatie bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten werden de bacteriën 1:12 verdund in PBS, waarna 20 μΙ van de suspensie werd geplaatst in individuele putten van Carlson glaasjes. Na droging 35 werden de glaasjes geprepareerd voor bezichtiging, zoals beschreven in voorbeeld II. De bron van antilichaam was bovenstaande cultuurvloeistof van de FA6 IIG5 cellijn.

Fluorescerende kleuring door het FA6 IIG5 antilichaam werd alleen waargenomen met P. aeruginosa stammen, die type a flagella dragen en bij geen die type b dragen. Het waargenomen fluorescentiepatroon was een sinusoïdaal lijnpatroon, hetgeen toont dat het FA6 IIG5 zich aan de flagella bond. Het 40 fluorescentiesignaal werd versterkt door behandeling van de bacteriën met formaline, maar de behandeling was niet nodig om de flagellaire kleuring met het antilichaam zichtbaar te maken.

Immunovloeiing werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld II. De bronnen van flagella type a antigenen waren de gezuiverde flagellaire preparaten (zie dit voorbeeld). Antigenen werden gescheiden in 10% polyacrylamidegels, die SDS bevatten (Nature 227 (1970) 680-685) en overgedragen op een NCM.

45 Preparaten van FA6 IIG5, hetzij bovenstaande cultuurvloeistof, hetzij ascites verdund 1:1000, werden met het NCM tot reactie gebracht en de reactie werd ontdekt met een geschikt enzyme-geconjugeerd reagens en enzymesubstraat, zoals beschreven in voorbeeld II.

De immunovloeiing toonde dat FA6 IIG5 zich specifiek bond aan het 51.700 MW flagelline van Habs 6 en het 47.200 MW flagelline van Habs 8.

50 Bevestiging dat FA6 IIG5 alleen met flagella type a reageerde en niet met type b werd verkregen door ELISA, waarin Habs stammen 1-12 individueel werden gebonden met PLL aan de putten van Linbro 96-puts microtiterplaten. Het antilichaam bond zich alleen aan Habs stammen 1, 6, 8 en 9, die de enige flagella type a dragende stammen van de 12 zijn (J. Clin. Microbiol. 20 (1984) 84-88). Onderzoek betreffende bescherming In vivo wordt gepresenteerd in voorbeeld IV.

15 194961

VOORBEELD IV

Voorbeeld IV toont de bescherming van muizen, die passief 2ijn geïmmuniseerd met antilichamen PaF4 IVE8 en FA6 IIG5 tegen bedreiging met P. aeruginosa in het gebrande muismodel.

De anti-flagella monoklonale antilichamen werden in het gebrande muizemodel beproefd volgens de 5 methode, beschreven in J. Trauma 23 (1983) 530-534. Voor het beschermingsonderzoek werden alle antilichamen gezuiverd door proteïne A-Sepharose chromatografie (Immunochemistry 15 (1978) 429-436) en gedialyseerd in PBS buffer. De voor de dierproeven gebruikte flagella type a dragende stam was P. aeruginosa PA220 (van dr. James Pennington, Boston) en de flagella type b stam was de referentie K aeruginosa Fisher immunotype 2 (A.T.C.C. 27313).

10 Per muis werd 1-2 uur voor het branden en de bedreiging 40 pg gezuiverd monoklonaal antilichaam intraveneus toegediend. Onmiddellijk na de branding ontvingen de dieren 0,5 ml koude PBS subeschar, die de bedreigende bacteriën bevatte. De bedreigingsdosis was ongeveer 10 LD^’s voor elk organisme. De resultaten van de dierproeven zijn vermeld in de tabellen A en B.

15 TABEL A

Beschermingsonderzoek van een anti-flagella type a monoklonaal antilichaam in het gebrande muizemodel.1 20 % overleving per dag2

Behandeling 123456789

Anti-flagella a, 100 100 100 100 100 90 90 80 80 FA6 IIG5 25 Anti-flagella b, 100 20 10 10 10 10 10 10 10

PaF4 IVE8

Niet-specifiek 100 40 30 20 10 10 10 10 10 anti-LPS monoklonaal 30 antilichaam PBS, zonder 80 80 80 80 80 80 80 80 80 bacteriën 1 Muizen werden subeschar bedreigd met ongeveer 10 LDw’s van P. aeruginosa PA 220.

2 Het percentage is gebaseerd op de overleving van muizen in uit 10 dieren bestaande groepen, met uitzondering van de PBS alleen controlegroep, die uit 5 muizen bestond. De dagen worden geteld na het branden van de bedreiging.

TABEL B

Beschermingsonderzoek van een anti-flagella type b 40 monoklonaal antilichaam in het gebrande muizemodel.1 % overleving per dag2

Behandeling 123456789 45 Antiflagella b, 100 100 90 90 90 90 90 90 90

PaF4 IVE8

Anti-flagella a, 100 20 10 10 10 10 10 10 10 FA6 IIG5

Niet-specifieke 100 20 20 20 20 20 20 20 20 50 anti-LPS monoklonaal antilichaam PBS, zonder 100 100 100 100 100 100 100 100 100 bacteriën 55___

Muizen werden subeschar bedreigd met ongeveer 10 LD^'s van P. aeruginosa Fisher immunotype 2.

194961 16 * Zie voetnoot 2 bij tabel A.

Zeer significante overleving werd waargenomen in muizen, die waren behandeld met het anti-a antilichaam of anti-b antilichaam en vervolgens bedreigd met het corresponderende antigen. Omgekeerd stierf 80-90% 5 van de onbehandelde, maar bedreigde muizen of dieren, behandeld met een niet-passend anti-flagellair monoklonaal antilichaam of niet-specifiek anti-LPS antilichaam. Het onvermogen van het anti-flagella type a antilichaam om muizen van een dodelijke bedreiging van flagella type b dragende P. aeruginosa Fisher immunotype 2 te beschermen, en het onvermogen van het anti-flagella type b antilichaam om muizen te beschermen tegen een dodelijke bedreiging van type a dragende P, aeruginosa PA220, bevestigde in vivo 10 de specificiteit van de antilichamen, die in vitro was aangenomen. Overleving van gebrande, maar niet geïnfecteerde muizen toonde dat de brandwond zelf niet dodelijk was.

VOORBEELD V

Voorbeeld V toont de extensieve kruisreactiviteit van PaF4 IVE8 en Fa6 IIG5 met P. aeruginosa klinische 15 isolaten, waaruit de klinische bruikbaarheid van deze antilichamen voor de immunotherapie van P. aeruginosa infecties blijkt.

Klinische isolaten werden verkregen uit ziekenhuizen en klinieken. De isolaten waren afkomstig van een variëteit van isolatieplaatsen, waaronder bloed, wonden, ademhalingswegen, urine en oren. In totaal werden 157 isolaten onderzocht.

20 PaF4 IVE8 bond 2ich specifiek aan 34 klinische isolaten (22%), terwijl het flagella type a antilichaam, FA6 IIG5, zich bond aan 102 klinische isolaten (65%), dus in totaal 136 van 157 isolaten (87%). Van de 21 stammen, die door geen van beide antilichamen werden herkend, waren 19 niet-geflagelleerd, zoals bij beitskleuring bleek. Beide anti-lichamen in combinatie bonden zich derhalve aan 136 van 138 (98%) geflagelleerde klinische isolaten, hetgeen eerdere rapporten bevestigt (Zbi. Bakt. Hyg., I Abt. Orig. A 242 25 (1978)228-238).

VOORBEELD VI

Voorbeeld VI toont methoden voor de productie van menselijke monoklonale antilichamen, die zich binden P. aeruginosa type b flagella.

30 Een perifeer bloedmonster van een individu, geïmmuniseerd met een hoog moleculair polysaccharidepre-paraat (Infect. Immun. 45 (1984) 309) diende als bron van B cellen.

Mononucleaire cellen werden uit het bloed afgescheiden volgens standaardcentrifugeringstechnieken op Ficoll-Paque (Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21^ (1968) 77) en tweemaal gewassen in calcium/magnesium-vrije fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS).

35 De mononucleaire cellen werden verarmd aan T-cellen onder toepassing van een gemodificeerde E-rozetprocedure. De cellen werden eerst opnieuw gesuspendeerd tot een concentratie van 1 x 107 cellen/ml in PBS van 4°C, bevattende 20% foetaal kalfserum (FCS). Van deze suspensie werd 1 ml geplaatst in een 17 x 100 ml polystyreen rondbodembuis, waaraan 1 x 10s met 2-amino-isothiouroniumbromide (AET)-behandelde rode schapebloedcellen werd toegevoegd uit een 10%'s 40 (volume/volume) oplossing in Iscove’s gemodificeerd Dulbecco’s medium (Iscove’s medium) (zie J. Immun. Methods 27 (1979) 61). De suspensie werd 5-10 minuten zeer zacht bij 4°C gemengd, waarna de E-rozetcellen werden verwijderd door centrifugeren op Ficoll-Paque gedurende 8 minuten bij 2500 x g bij 4°C. E-rozetnegatieve perifere mononucleaire bloedcellen (E'PBMC), die zich verenigden aan het grensvlak, werden verzameld en eenmaal gewassen in Iscove’s medium, en vervolgens opnieuw gesuspendeerd in 45 hetzelfde medium, bevattende 15% (volume/volume) FCS, L-glutamine (2 mmol/l) penicilline (100 lU/ml), streptomycine (100 pg/ml), hypoxanthine (1 x 10"4 M), aminopterine (4 x 10‘7 M) en thymidine (1,6 x 10'5 M). Dit medium wordt verder aangeduid als HAT-medium.

Cel-gedreven transformatie van de E'PBMC werd tot stand gebracht door co-cultivering van deze cellen met een transformerende cellijn. De transformerende cellijn was een Epstein-Barr nucleair antigen (EBNA) 50 positief menselijke lymfoblastoïdecellijn, afgeleid door ethylmethaansulfonaat (EMS) mutagenese van de GM 1500 lymfoblastoïdecellijn, gevolgd door selectie in tegenwoordigheid van 30 pg/ml 6-thioguanine om de cellen hypoxanthine-guaninefosforibosyltransferase (HGPRT) deficiënt en aldus HAT-gevoelig te maken. Deze cellijn wordt aangeduid als de 1A2 cellijn en werd gedeponeerd bij de American Type Culture Collection (A.T.C.C.) op 29 maart 1982 onder A.T.C.C. No. CRL 8119. 1A2 cellen in logaritmische groeifase 55 werden gesuspendeerd in HAT-medium en vervolgens gecombineerd met de E'PBMC’s in een verhouding van vijftien 1A2 cellen per PBMC. Het celmengsel werd geplateerd in dertig rondbodem 96-puts microtiter-platen (Costar 3799) bij een concentratie van 32.000 cellen/put in een volume van 200 pl per put, en 17 194961 geïncubeerd bij 37°C in een bevochtigde atmosfeer, die 6% C02 bevatte. De culturen werden gevoed op de dagen 5 en 8 na het plateren door vervanging van de helft van de bovenstaande vloeistof met vers HAT-medium. Zestien dagen na het plateren vertoonde 100% van de putten prolifererende cellen en in de meeste van de putten waren de cellen van voldoende dichtheid voor verwijdering en beproeving van 5 bovenstaande vloeistoffen op anti-P. aeruginosa antilichamen.

Bovenstaande vloeistoffen werden gescreend op de aanwezigheid van anti-P. aeruginosa antilichamen onder toepassing van de ELISA-techniek, zoals beschreven in voorbeeld II met de volgende modificaties. Een combinatie van de zeven Fisher immunotype referentiestammen (A.T.C.C. 27312-27318) (A^ = 0,2 O.D.-eenheden) werd gebonden aan platbodem 96-puts microtiterplaten (Immulon II, Dynatech) voor-10 behandeld met poly-L-lysine, geïncubeerd en gewassen zoals beschreven in voorbeeld II. Na blokkering van niet-specifieke bindingsplaatsen en wassen van de platen werd per put 50 pi PBS, bevattende 0,1% (volume/volume) Tween-20 en 0,2% (gewicht/volume) BSA toegevoegd. Bovenstaande cultuurvloeistoffen werden vervolgens gekopieerd door plateren in de corresponderende putten van assayplaten en in controleplaten, die werden behandeld met PLL en geblokkeerd, maar geen bacteriën bevatten. Na incubatie 15 en wassen werden enzyme-geconjugeerde tweede-trapantilichamen (50 μΙ per put), mierikswortelperoxy-dase-geconjugeerde geit anti-mens IgG en geit anti-mens IgM, op passende wijze verdund in PBS, bevattende 0,1% (volume/volume) Tween-20 en 0,2% (gewicht/volume) BSA, aan de putten toegevoegd en werd de assay voltooid zoals beschreven in voorbeeld II.

Bovenstaande vloeistoffen, die antilichaam bevatten, dat zich bond aan de combinatie van Fisher 20 immunotypen, maar niet aan de controleplaat, werden een tweede maal onderzocht onder toepassing van elk van de zeven Fisher immunotype bacteriën afzonderlijk. Antilichaam aanwezig in de bovenstaande vloeistof van één put, 20H11, bond zich alleen aan P. aeruginosa Fisher immunotypen 2, 6 en 7. De cellen werden herhaaldelijk onderworpen aan subcultuur bij afnemende lage ceidichtheden, totdat alle putten met groei antilichaam afscheidden. De cellijn en het monoklonale antilichaam (IgM isotype) worden beide in het 25 hiernavolgende aangeduid als 20H11.

Een tweede transformatie werd uitgevoerd, waarbij de bron van B cellen afkomstig was van het perifere bloed van een blaasfibrosepatiênt, waarvan bekend was dat hij een chronische P. aeruginosa infectie had. E'PBMC’s werden bereid als hierboven beschreven en gecocultlveerd met de transformerende cellijn, 1A2, in een verhouding van 72 1A2 cellen per E'PBMC. Het celmengsel werd geplateerd in vipen rondbodem 30 96-puts microtiterplaten in een concentratie van 7,4 x 104 cellen per put en vervolgens gekweekt zoals boven.

Bovenstaande vloeistoffen werden 16 dagen na het plateren van de transformatie onderzocht volgens ELISA op de aanwezigheid van anti-P. aeruginosa antilichamen. De assay werd uitgevoerd als beschreven voor de vorige transformatie, behalve dat de combinatie van P. aeruginosa stammen, gebruikt voor de 35 eerste screening, was samengesteld uit Fisher immunotype referentiestammen F2, F4, F6 en F7 (A.T.C.C. 27313, 27315, 27316 en 27317) en drie klinische isolaten van de Genetic Systems Corporation Organism Bank (GSCOB), die verschillende LPS immunotypen en flagellatypen hadden. Het klinische isolaat PSA I277 (GSCOB) draagt type a flagella en Fisher immunotype 1 LPS; het tweede isolaat PSA G98 (GSCOB) draagt type a flagella en Fisher immunotype 3 LPS; en de derde, PSA F625 (GSCOB) draagt type b flagella 40 en Fisher immunotype 5 LPS. Dit mengsel van referentiestammen en klinische isolaten zal worden aangeduid als de P. aeruginosa geflagelleerde combinatie. Bovenstaande vloeistoffen, die antilichaam bevatten dat zich bond aan platen, die de P. aeruginosa geflagelleerde combinatie bevatten, maar niet aan de met PLL-beklede controleplaten, werden volgens ELISA een tweede maal onderzocht op de individuele stammen van de combinatie. Eén put, 3C1, bond zich aan referentiestammen F2, F6 en F7 en aan het 45 klinische isolaat F625.

Klonen van de 3C1 cellijn geschiedde door eerst de cellen te onderwerpen aan subcultuur in twee ronden van lage-dichtheidsubcultuur, eerst bij 20 cellen per put van 96-puts platen, gevolgd door kweken bij 2 cellen per put. Formeel klonen van de specifieke antilichaam-producerende cellen geschiedde door plateren van de cellen bij een dichtheid van ongeveer 1 cel/put in 72-puts Terasaki platen in een volume 50 van 10 μΙ HAT-medium zonder de aminopterinecomponent (HT-medium) per put. De platen werden 2-3 uur in een incubator geplaatst om de cellen te laten bezinken naar de bodem van de putten en werden vervolgens microscopisch onderzocht door twee individuen voor putten, die een enkele cel bevatten. De putten werden dagelijks gevoed met HT-medium en toen de uitgroei voldoende was werden de cellen overgebracht naar een 96-puts rondbodemplaat. Alle putten met uitgroei werden onderzocht volgens ELISA 55 op P. aeruginosa stammen, die type b flagella droegen, en alle bleken het geschikte antilichaam te produceren. De cellijn en het monoklonale antilichaam (IgM isotype) worden in het volgende aangeduid als 3C1.

194961 18

Het door 20H11 en 3C1 geïdentificeerde antigen was flagellair, zoals getoond door indirecte immunofluo-rescentie en immunovloeiing. De technieken werden in principe zoals beschreven in voorbeelden II en III toegepast. Voor het indirecte immunofluorescentie-onderzoek werden P. aeruginosa stammen met type b flagella, referentie Fisher immunotypen F2, F6 en F7 (A.T.C.C. 27313, 27317 en 27318) en een stam met 5 type a flagella, referentie Fisher immunotype 4 (A.T.C.C. 27315) geprepareerd als beschreven in voorbeeld III. Het flagellatype van de referentiestammen werd bepaald door typering met de muizemonoklonale antilichamen PaF4 IVE8 en FA6 IIG5. De glaasjes werden geprepareerd voor inspectie, zoals beschreven in voorbeeld II. De bronnen van beide antilichamen waren bovenstaande cultuurvloeistoffen en het FITC-geconjugeerde reagens was FITC-geconjugeerd geit anti-mens Ig (polyvalent) 1:100 verdund in PBS, 10 bevattende 0,5% (gewicht/volume) rundergammaglobulinen (Miles Scientific, Cat. No. 82-041-2) en 0,1% (gewicht/volume) natriumazide als conserveringsmiddel.

Fluorescerende kleuring door de 20HI1 en 3CI antilichamen werd alleen waargenomen met P. aeruginosa stammen met type b flagella en niet met de flagella type a dragende stam, referentie Fisher immunotype 4. Het waargenomen fluorescentiepatroon was een sinusoïdaal lijnpatroon, uitgaande van één uiteinde 15 van de bacterie, hetgeen toonde dat de anti-lichamen zich bonden aan de flagella van de bacterie.

Immunovloeiing werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld II.

Gezuiverde type b flagella van de P. aeruginosa referentiestammen Fisher immunotype 2 (A.T.C.C. 27313) en gezuiverde flagella type a van referentiestammen Habs 6 en Habs 8 (A.T.C.C. 33353 en 33355) werden bereid zoals in voorbeeld III beschreven. Antigenen werden gescheiden in een 10% polyacrylamide-20 gel (zie voorbeeld III) en overgedragen op een NCM.

Bovenstaande cultuurvloeistoffen, bevattende 20H11 of 3C1 antilichamen, bovenstaande cultuurvloeistof bevattende een niet-specifiek menselijk antilichaam en cultuurmedia werden met het NCM geïncubeerd en de reactie werd ontdekt met een alkalisch fosfatase-geconjugeerd geit anti-mens Ig (polyvalent), verdund in PBS bevattende 0,05% (volume/vofume) Tween-20. Enzymesubstraat werd bereid zoals beschreven in 25 voorbeeld II. De immunovloeiing toonde dat beide antilichamen zich bonden aan het 53.000 MW flagelline-proteïne van Fisher immunotype 2 en niet aan het 51.700 MW flagellineproteïne van Habs 6 noch aan het 47.200 MW flagellineproteïne van Habs 8. Er werd geen reactie waargenomen met het niet-specifieke menselijke antilichaam of met de cultuurmedia.

Verdere bevestiging dat antilichamen 20H11 en 3C1 zich alleen bonden aan type b flagella en niet aan 30 type a werd verkregen door ELISA, waarin Habs stammen 1-12 individueel werden gebonden met PLL aan de putten van Immulon 96-puts mlcrotiterplaten. De antilichamen bonden zich alleen aan Habs stammen 2, 3, 4,5,7,10,11 en 12, die type b dragende stammen zijn (J. Clin. Microbiol. 20 (1984) 84).

VOORBEELD VII

35 Voorbeeld VII toont methoden voor de productie van een menselijk monoklonaal antilichaam, dat zich bindt aan P. aeruginosa type a flagella.

Een perifeer bloedmonster van een individu, geïmmuniseerd met een hoogmoleculair polysaccharidepre-paraat (Infect. Immun. 34 (1981) 461) diende als bron van B cellen. De mononucleaire cellen werden uit het bloed afgescheiden en vervolgens verarmd aan T-cellen, zoals beschreven in voorbeeld VI. Daarna werden 40 de cellen bevroren in FCS, bevattende 10% dimethylsulfoxide in een vloeibare stikstofdamptank. Op een latere datum werden de cellen snel tot 37°C ontdooid, éénmaal gewassen in Iscove’s medium en opnieuw gesuspendeerd in HAT-medium. Cel-gedreven transformatie werd tot stand gebracht door co-cultivering van de E'PBMC’s met 1A2 cellen in een verhouding van 30 1A2 cellen per E'PBMC. Het celmengsel werd geplateerd in 30 96-puts weefselcultuurplaten in een concentratie van 62.000 cellen per put. De zevende 45 dag na het plateren werden de culturen gevoed door vervanging van de helft van het volume met HAT-medium. Op de veertiende dag na het plateren werd celproliferatie waargenomen in 100% van de putten en bovenstaande vloeistoffen werden uit de putten verwijderd en onderzocht

De bovenstaande vloeistoffen werden volgens ELISA onderzocht op de aanwezigheid van anti-P. aeruginosa antilichamen door gebruik van de geflagelleerde P. aeruginosa combinatie en PLL-50 behandelde platen als controle, zoals beschreven in voorbeeld VI. Bovenstaande vloeistoffen, die antilichamen bevatten, die zich bonden aan de geflagelleerde combinatie, maar niet aan de PLL controleplaten, werden opnieuw onderzocht op de individuele bacteriestammen van de geflagelleerde combinatie. Eén put, 21B8, bevatte antilichaam dat zich bond aan PSA I277, PSA G98 en referentie Fisher immunotype 4, dat wil zeggen de drie stammen van de geflagelleerde combinatie, die type a flagella dragen.

55 Klonen van de 21B8 cellijn geschiedde zoals beschreven in voorbeeld VI voor de 3CI cellijn met de volgende modificaties in de formele kloningstrap. Nadat de putten van de Terasaki platen waren onderzocht op de aanwezigheid van slechts één enkele cel, werd elke cel van de Terasaki plaat overgebracht naar één 19 194961 individuele put van een 96-puts rondbodemcultuurplaat in een volume van 100 μ! HAT-medium zonder de aminopterinecomponent (HT-medium). In alle putten werden niet-transformerende HAT-gevoelige lymfo-blastoïdecellen opgenomen in een dichtheid van 500 cellen/put als voedingscellen. Vijf dagen na het plateren werd 100 pl HAT-medium aan de putten toegevoegd om de voedingscellen selectief te doden. Op 5 de dagen 7 en 9 na het plateren werden de putten opnieuw gevoed door vervanging van de helft van de bovenstaande vloeistof door HAT-medium. Vervolgens werden de cellen gevoed met HT-medium, totdat de cellen van voldoende dichtheid waren om de aanwezigheid van anti-lichaam volgens ELISA te ontdekken. Alle putten met uitgroei produceerden antilichaam, dat zich bond aan flagella type a dragende P. aeruginosa stammen. De cellijn en het monoklonale antilichaam (IgG, isotype) worden in het volgende beide aangeduid 10 als 21B8.

Het door 21B8 geïdentificeerde antigen was flagella, zoals getoond door indirecte immunofluorescentie en immunovloeiing (zie voorbeeld VI voor beschrijvingen van de technieken). Fluorescerende kleuring door het 21B8 antilichaam werd alleen waargenomen met P. aeruginosa referentiestam Fisher immunotype 4 (A.T.C.C. 27315), dat type a flagella draagt, en niet met P. aeruginosa referentiestam immunotype 2 15 (A.T.C.C. 27313) dat type a flagella draagt. Het waargenomen fluorescentiepatroon was een sinusoïdaal lijnpatroon, uitgaande van een uiteinde van de bacterie, tonend dat het antilichaam was gebonden aan de flagella van de bacterie.

Immunovloeiing werd uitgevoerd zoals in voorbeeld II beschreven. Gezuiverde type a flagella van de P. aeruginosa referentiestam Habs 6 (A.T.C.C. 33353) en gezuiverde flagella type b van de P. aeruginosa 20 referentiestam Fisher immunotype 2 (A.T.C.C. 27313) werden bereid zoals in voorbeeld III beschreven. Antigenen werden gescheiden in een 10% polyacrylamidegel (zie voorbeeld III) en overgedragen op een NCM. Bovenstaande cultuurvloeistoffen, bevattende 21B8 of een niet-specifiek menselijk antilichaam en cultuurmedia werden tot reactie gebracht met het NCM en de reactie werd ontdekt met een alkalisch fosfatase-geconjugeerd geit anti-mens Ig (polyvalent) en enzymesubstraat, zoals beschreven in voorbeelden 25 II en VI. De immunovloeiing toonde dat het 21B8 antilichaam zich alleen bond aan het 51.700 Mw flagellineproteïne van Habs 6 en niet aan het 53.000 Mw flagellineproteïne van Fisher immunotype 2. Geen reactie werd waargenomen met het niet-specifieke menselijke antilichaam of de cultuurmedia.

VOORBEELD VIII

30 Voorbeeld VIII toont bescherming van muizen, die passief zijn geïmmuniseerd met menselijke anti-flagella antilichamen, 20H11, 3C1 en 21B8, tegen bedreiging met P. aeruginosa in het gebrande muizemodel.

De menselijke anti-flagella monoklonale antilichamen werden beproefd in het gebrande muizemodel (zie voorbeeld IV). 21B8 en 20H11 antilichamen werden bereid door precipitatie van bovenstaande cultuurvloeistoffen, gegenereerd uit de respectievelijke cellijnen met ammoniumsulfaat (50% uiteindelijke concen-35 tratie) (Selected Methods in Cellular Immunology, San Francisco, 1980, 279-286). Het precipitaat werd gesolubiliseerd in PBS, overnacht bij 4°C gedialyseerd tegen PBS en dan steriel gefiltreerd alvorens aan dieren te worden toegediend. De bron van antilichaam 3C1 en het niet-specifieke antl-LPS antilichaam, dat bij het onderzoek als negatieve controle werd gebruikt, was bovenstaande cultuurvloeistof. Als positieve controle voor elk onderzoek werd het geschikte gezuiverde monoklonale muize-antilichaam PaF4 IVE8 of 40 FA6 IIG5 opgenomen.

De flagella type a dragende stam, die bij de dierproeven werd gebruikt, was het klinische isolaat PSA A522 (GSCOB), dat in staat is tot expressie van Fisher immunotype 1 LPS, en de flagella type b stam was klinisch isolaat PSA A447 (GSCOB), dat in staat tot expressie van Fisher immunotype 6 LPS. De menselijke antilichamen (0,45 ml) werden voorgemengd met de bacteriën (meer dan 5 LD100’s in 0,05 ml) en sube* 45 schar geënt, onmiddellijk nadat de brandwond was veroorzaakt. De resultaten van de dierproeven zijn vermeld in tabellen C, D en E.

194961 20

TABEL C

Beschermingsonderzoek van het menselijke anti-flagella type a monoklonale antilichaam 21B8 in het gebrande muizemodel.1 5 - % overleving per dag2

Behandeling 1 234567 69 10 Muize anti- 100 100 100 100 88 88 88 88 88 flagella a, FA6 IIG53

Menselijke 100 100 100 100 100 100 100 100 100 anti-flagella a, 15 21B8

Menselijke 100 00000000 anti-flagella b, 21B8 PBS 100 25 12 12 12 12 12 12 12 20 - 1 Muizen werden subeschar bedreigd met meer dan 5 LD100’s van P. aeruginosa PSA A522.

2 % overleving was gebaseerd op het aantal overlevende muizen per groep van 8 dieren. De dagen zijn vanaf het branden en bedreigen.

3 Gezuiverd antilichaam (10 pg in 0,45 ml PBS) werd voorgemengd met de bacteriën en na het branden en bedreigen subeschar toegediend.

25 TABEL D

Beschermingsonderzoek van het menselijke anti-flagella type b monoklonale antilichaam 20H11 in het gebrande muizemodel.1 30 % overleving dag2

Behandeling 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Muize anti- 100 100 100 100 100 100 100 100 100 35 flagella b, PaF4 IVE83

Menselijke 100 100 100 100 100 100 100 100 100 anti-flagella b, 20H11 40 Menselijke 100 00000000 anti-flagella a, 21B8

Media 100 0 0 0 0 0 0 0 0 1 " 1 Muizen werden subeschar bedreigd met meer dan 5 LD100’s van P. aeruginosa klinisch isolaat, PSA A447.

2 % overleving was gebaseerd op het aantal overlevende muizen per groep van 5 dieren. De dagen zijn vanaf het branden en bedreigen.

3 Zie voetnoot 3 bij tabel C.

« 21 194961

TABEL E

Beschermingsonderzoek van het menselijke anti-flagella type b monoklonale antilichaam 3CI in het gebrande muizemodel.1 5 - % overleving per dag2

Behandeling 123456789

Muizeanti- 100 100 100 100 100 100 100 100 100 10 flagella b, PaF4 IVE83

Menselijke 100 100 80 80 80 80 80 80 80 anti-flagella b,

3CI

15 Niet-specifiek 100 0 0 0 0 0 0 0 0 anti-LPS monoklonaal antilichaam 2Q 1 Muizen werden subeschar bedreigd met meer dan 5 LD100's van PSA A447.

3 % overleving was gebaseerd op het aantal overlevende mui2en in groepen van 5 dieren. De dagen zijn na het branden en bedreigen.

3 Gezuiverd antilichaam (40 pg) werd 2 uur vóór het branden en bedreigen intraveneus toegediend.

Zeer significante overleving werd waargenomen in muizen, die behandeld waren met het anti-flagella type a antilichaam of met één van de twee anti-flagella type b antilichamen, en vervolgens bedreigd met het 25 corresponderende antigen. Omgekeerd stierf 88-100% van de onbehandelde, maar bedreigde muizen, of muizen behandeld met een niet-passend anti-flagellair monoklonaal antilichaam of niet-specifiek anti-LPS antilichaam. Zoals werd waargenomen met de monoklonale muize-antilichamen (zie voorbeeld IV) beschermen de menselijke anti-flagella antilichamen specifiek tegen lethale bedreiging alleen met de organismen, die het overeenkomstige flagellatype dragen, dat wil zeggen dat het menselijke anti-flagella 30 type a antilichaam bescherming verleende tegen lethale bedreiging met het flagella type a dragende organisme en niet het type b, en dat de anti-flagella type b antilichamen muizen beschermden, die waren bedreigd met flagella type b dragende stammen, maar niet het type a dragende organisme.

VOORBEELD IX

35 Voorbeeld IX toont de kruisreactiviteit van de menselijke anti-flagella antilichamen 20H11, 3C1 en 21B8 met P. aeruginosa klinische isolaten.

P. aeruginosa klinische isolaten (115), verkregen van ziekenhuizen en klinieken en voornamelijk geïsoleerd van brandwonden en bloed, werden geïdentificeerd als dragende flagella type a of type b door :

typering met de monoklonale muize-antilichamen FA6 IIG5 of PaF4 IVE8 (zie voorbeelden II, III en V). Van I

40 de klinische isolaten werden vijf-en-vijftig geïdentificeerd als dragende type a flagella door reactie met het j monoklonale muize-antilichaam FA6 IIG5, en 59 werden geïdentificeerd als type b dragend door hun reactie ; met het monoklonale muizeantilichaam PaF4 IVE8. j

De kruisreactiviteit van het anti-flagella type a menselijke monoklonale antilichaam 21B8 was extensief.

Het antilichaam herkende 54 van de 56 flagella type a dragende klinische isolaten (96%). De dwars-45 reactiviteit van 20H11 met de isolaten, die type b flagella dragen, was eveneens extensief: 20H11 herkende j alle 59 isolaten (100%). Daarentegen bond het andere anti-flagella type b monoklonale antilichaam, 3C1, slechts 43 van de 59 isolaten (73%). Deze resultaten tonen dat 20H11 zich bindt aan een pan-reactief epitoop (d.w.z. een epitoop, aanwezig op ten minste 95% van de geflagelleerde P. aeruginosa stammen), terwijl 3C1 zich bindt aan een epitoop dat niet op alle type b flagellinemoleculen aanwezig is. Zelfs hoewel 50 het flagella type b antigen serologisch uniform is wanneer geanalyseerd met polyklonale antisera, tonen de kruisreactiviteitspatronen van 20H11 en 3C1 verrassenderwijze, dat de type b flagella ten minste twee afzonderlijke epitopen heeft, die door monoklonale antilichamen kunnen worden geïdentificeerd.

De extensieve kruisreactiviteit van antilichamen 21B8 en 20H11 met P. aeruginosa klinische isolaten toont de bijzondere klinische bruikbaarheid van deze antilichamen in de immunotherapie van P. aeruginosa 55 infecties.

194961 22

VOORBEELD X

Voorbeeld 10 toont methoden voor de productie van een ander menselijk monoklonaal antilichaam, dat zich bindt aan P. aeruginosa type b flagella, alsmede de beschermende activiteit van dat antilichaam tegen bedreiging met P. aeruginosa in het gebrande muizemodel.

5 Een getransformeerde cellijn werd bereid en gekloond op de in voorbeeld VII beschreven wijze, behalve dat het getransformeerde celmengsel werd geplateerd op 20 96-puts weefselcultuurplaten in een concentratie van ongeveer 2250 E'PBMC per put. De bovenstaande vloeistoffen werden eerst onderzocht volgens ELISA aan de geflagelleerde combinatie, zoals beschreven in voorbeeld VI, behalve dat Fisher immunotype 2 en 4 referentiestammen in de combinatie ontbraken. Positieve putten werden vervolgens onderzocht op 10 elk van de stammen in de geflagelleerde combinatie, inclusief Fisher immunotype 2 en 4. De uiteindelijk geïsoleerde cellijn en het monoklonale antilichaam (IgG isotype) worden in het hiernavolgende aangeduid als 12D7.

Het 12D7 menselijke monoklonale antilichaam toonde extensieve kruisreactiviteit met anti-flagella type a isolaten, herkennende 54 van de 56 beproefde flagella type a dragende klinische isolaten (96%). De 15 beschermende activiteit van het 12D7 monoklonale antilichaam wordt in tabel F getoond. Het beschermings-onderzoek werd uitgevoerd op de in voorbeeld IV beschreven wijze, behalve dat de bedreigende dosis 1 LD100 bedroeg en dat de bedreigende stam I624 was, een klinisch isolaat, uitdrukkende Fisher immunotype 2 LPS en type a flagella.

20 TABEL F

Beschermingsonderzoek van het menselijke anti-flagella type a monoklonale antilichaam 12D7 in het gebrande muizemodel.1 25 % overleving per dag2

Behandeling3 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Menselijke 100 100 100 100 100 100 100 100 100 anti-flagella a, 30 12D7

Menselijke 90 90 90 90 90 90 90 90 90 anti-Fisher 2 LPS, 2H9

Muizeanti- 100 100 100 100 100 100 100 100 100 35 flagella a, 11G5

Menselijke 100 37,5 25 25 25 25 25 25 25 anti-flagella b, 15F4 40 1 Muizen werden subeschar bedreigd met 1 L010O (950 CFU) van P. aeruginosa 1624.

2 % overleving was gebaseerd op het aantal overlevende muizen per groep van 10 dieren, behalve de 15F4 groep, die 8 dieren bevatte.

De dagen zijn vanaf het branden en bedreigen.

3 Gezuiverd antilichaam (50 pg in 0,5 ml PBS) werd i.p. toegediend 2 uur vóór het branden en bedreigen. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

VOORBEELD XI

2

Voorbeeld XI toont de productie van een menselijk monoklonaal antilichaam, dat reactief is met flagella b 3 type P. aeruginosa en de bescherming van muizen, die passief zijn geïmmuniseerd met dit anti-lichaam 4 tegen bedreiging met P. aeruginosa in het gebrande muizemodel.

5

Een getransformeerde cellijn werd bereid en gekloond op de in voorbeeld X beschreven wijze, behalve 6 dat de transformatieverhouding van de 1A2 tot B cellen ongeveer 60:1 bedroeg en dat het getransformeerde 7 celmengsel werd geplateerd op 15 platen in een concentratie van ongeveer 1930 E'PBMC per put. Ook 8 werden de cellen onderzocht in een combinatie van P. aeruginosa stammen, omvattende G98 (Fisher 3 9 immunotype, flagella type a) en I739 (een klinisch isolaat van Fisher 5 immunotype, flagella type b), en 10 bevestigd op een andere combinatie van P. aeruginosa stammen; I277, G98,1739 en Fisher immunotypen 11 F2, F4, F6 en F7. De uiteindelijk geïsoleerde cellijn en het afgescheiden monoklonale anti-lichaam (lgG1 isotype) worden in het volgende aangeduid als 2B8.

Een immunofluorescentie-onderzoek, uitgevoerd met 2B8, was positief op een flagella type b, Fisher 2 f 23 194961 immunotypestam, maar negatief in een flagella type a, Fisher immunotype 4 referentiestam. Bij klinische isolaatbeproeving 59/59 (100%) van geflagelleerde type b isolaten was het resultaat positief.

De beschermende activiteit van 2B8 wordt getoond in tabel G. Het beschermende onderzoek werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld X, behalve dat klinisch isolaat FI64 (Fisher immunotype 4, flagella 5 type b) voor de bedreiging werd gebruikt.

TABEL G

Beschermingsonderzoek van het menselijke anti-flagella 10 type b monoklonale antilichaam 2B8 in het gebrande muizemodel.1 % overleving per dag2

Behandeling 1234567 8 9 15 Menselijke 100 89 89 89 89 89 89 89 89 anti-flagella b, 2b83

Muizeanti- 100 100 100 100 100 100 90 90 90 flagella b, PaF4 20 IVE8

Muize anti-Fisher 90 20 20 20 20 20 20 20 20 2 LPS, VH34 ' Muizen werden subeschar bedreigd met 1 LD100 (105 CFU) van P. aeruginosa F164.

25 2 % overleving was gebaseerd op het aantal overievende muizen per groep van 10 dieren, behalve de groep 2B8, die 9 dieren bevatten.

De dagen zijn vanaf het branden en bedreigen.

3 Gezuiverd antilichaam (50 pg in 0,5 ml PBS) werd i.p. toegediend 2 uur vóór het branden en bedreigen.

4 Gezuiverd antilichaam (5 pg in 0,5 ml PBS) werd i.p. toegediend 2 uur vóór het branden en bedreigen.

30 VOORBEELD XII

Voorbeeld XII toont de productie van een ander menselijk monoklonaal antilichaam, dat reactief is met flagella b type P. aeruginosa, en de bescherming van muizen, die passief met dit antilichaam zijn geïmmuniseerd tegen bedreiging met P. aeruginosa in het gebrande muizemodel.

Een getransformeerde cellijn werd bereid en gekloond op de in voorbeeld VII beschreven wijze met de 35 volgende uitzonderingen. Een ander individu werd geïmmuniseerd (Infect. Immun. 45 (1984) 309) en diende als bron van B cellen, en het plateringsniveau van E-PBMC bedroeg ongeveer 2000 cellen per put. De screening geschiedde op gecombineerd Fisher 1-7 immunotypen. De uiteindelijk geïsoleerde cellijn en het afgescheiden monoklonale antilichaam (lgG1 isotype) worden in het volgende beide aangeduid als 14C1.

Bij klinische beproeving bleken 59/59 (100%) van geflagelleerde type b isolaten positief met 14C1. Het 40 beschermingsonderzoek werd uitgevoerd zoals beschreven in voorbeeld XI en de resultaten zijn vermeld in tabel H.

TABEL H

45 Beschermingsonderzoek van het menselijke anti-flagella type b monoklonale antilichaam 14C1 in het gebrande muizemodel.1 % overleving per dag2

Behandeling 123456789 50---

Menselijke 100 100 100 100 100 90 90 90 90 anti-flagella b, 14C1

Muizeanti- 100 100 100 100 100 100 100 100 100 55 flagella b, PaF4 IVE8

Claims (26)

1. Compositie omvattende een component die in staat is tot reactie met Pseudomonas aeruginosa bacteriën, met het kenmerk, dat deze component een monoklonaal antilichaam of bindend fragment daarvan Is dat in staat is tot specifieke reactie met flagella van Pseudomonas aeruginosa bacteriën.

1 Muizen werden subeschar bedreigd met 1 LD100 (90 CFU) van P. aeruginosa F164. 2. overleving was gebaseerd op het aantal overlevende muizen per groep van 10 dieren, behalve de PaF4 IVE8 groep, die 9 dieren bevatte. De dagen zijn vanaf het branden en bedreigen.

2. Compositie volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het monoklonale antilichaam of bindende fragment 30 daarvan in vivo beschermend is.

3. Compositie omvattende een component die in staat is tot reactie met Pseudomonas aeruginosa, met het kenmerk, dat deze component een monoklonaal antilichaam of bindend fragment daarvan is dat in staat is tot specifieke reactie met flagellair protelne-epitoop van Pseudomonas aeruginosa.

3 Gezuiverd antilichaam (50 pg in 0,5 ml PBS) werd i.p. toegediend 2 uur vóór het branden en bedreigen. Uit het voorgaande zal duidelijk zijn dat de cellijnen volgens de uitvinding middelen verschaffen voor de 15 productie van monoklonale antilichamen en fragmenten daarvan, die reactief zijn met P. aeruginosa flagella en kruisbeschermend tegen diverse P. aeruginosa stammen. Verrassenderwijze werd een aantal monoklonale antilichamen geïsoleerd, die reactief waren met verschillende epitopen op elk type flagella. De anti-lichamen volgens de uitvinding maken het mogelijk, dat profylactische en therapeutische composities economischer en gemakkelijker worden geproduceerd voor toepassing tegen infecties, veroorzaakt door de 20 meeste P. aeruginosa stammen. Verder verschaffen de cellijnen antilichamen, die toepassing vinden in immuno-onderzoek en andere bekende procedures. 25

4. Compositie volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat het monoklonale antilichaam in staat is de binding 35 te blokkeren aan de epitoop van monoklonale antilichamen geproduceerd door cellijnen, aangeduid als T.T.C.C. Accession Numbers HB9129, HB9130, CRL 9300 en CRL 9301.

5. Compositie omvattende een component die in staat is tot reactie met Pseudomonas aeruginosa, met het kenmerk, dat deze component een monoklonaal antilichaam of bindend fragment daarvan is dat in staat is tot reactie met type a of type b flagella van flagellair proteïne-epitoop van Pseudomonas aeruginosa.

6. Compositie volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat een tweede monoklonaal antilichaam in staat is tot reactie met een type flagella dat niet reactief Is ten opzichte van het eerste monoklonale antilichaam.

7. Compositie volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat het eerste antilichaam een humaan monoklonaal antilichaam Is.

8. Compositie volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat ten minste een van de monoklonale antilichamen 45 in vivo beschermend is.

9. Compositie volgens een van de conclusies 1, 3, 5 of 7, met het kenmerk, dat deze verder een gamma-globuline fractie van humaan bloedplasma en/of een antibioticum omvat

10. Farmaceutische compositie, met het kenmerk, dat deze een compositie volgens een van de conclusies 1, 3, 5 of 7, alsmede een fysiologisch aanvaardbare drager omvat

11. Farmaceutische compositie, met het kenmerk, dat deze dient ten gebruike voor de behandeling of preventie van een Pseudomonas aeruginosa infectie, welke compositie een monoklonaal antilichaam, reactief met een flagellair proteïne van Pseudomonas aeruginosa en in vivo beschermend, een anti-microbieel middel, een gammaglobuline fractie van humaan bloedplasma en een fysiologisch aanvaardbare drager omvat.

12. Farmaceutische compositie volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het antilichaam een humaan monoklonaal antilichaam is en de gammaglobuline fractie van humaan bloedplasma verkregen is van mensen die verhoogde concentraties vertonen van immunoglobulinen die reactief zijn ten opzichte van 25 194961 Pseudomonas aeruginosa bacteriën en/of producten daarvan.

13. Farmaceutische compositie, met het kenmerk, dat deze ten minste twee monoklonale antilichamen omvat, elk specifiek reactief met een verschillend type van Pseudomonas aeruginosa flagellair proteïne en geschikt voor behandeling of voorkoming van Pseudomonas aeruginosa infecties.

14. Compositie volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat deze ten minste één van de monoklonale antilichamen een humaan monoklonaal antilichaam is.

15. Compositie volgens conclusie 13, met het kenmerk, dat deze verder ten minste één humaan monoklonaal antilichaam bevat, dat in staat is tot reactie met ten minste één serotypische determinant op een lipopolysaccharidemolecuul van Pseudomonas aeruginosa en/of een monoklonaal antilichaam, dat reactief 10 is met exotoxine A.

16. Cellijn, met het kenmerk, dat deze een monoklonaal antilichaam produceert, dat in staat is tot specifieke reactie met type a of type b Pseudomonas aeruginosa flagella.

17. Cellijn volgens conclusie 16, waarin het monoklonale antilichaam invivo beschermend is tegen Pseudomonas aeruginosa.

18. Cellijn volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat deze een hybridecellijn is.

19. Cellijn volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat deze humane monoklonale antilichamen produceert.

20. Cellijn volgens conclusie 16, met het kenmerk, dat deze één van A.T.C.C. Accession Numbers HB9129, HB9130 Of CRL 9300 en CRL 9301 is.

21. Werkwijze voor het produceren van monoklonale anti-lichamen, specifiek voor flagellaire proteïnen van 20 Pseudomonas aeruginosa en geschikt voor behandeling of voorkoming van Pseudomonas aeruginosa Infecties, met het kenmerk, dat ten minste één van de cellijnen van conclusie 20 wordt gekweekt en de antilichamen worden gewonnen.

22. Monoklonaal antilichaamcompositie, met het kenmerk, dat deze dezelfde bindingsspecificiteit als één van de monoklonale antilichamen, aangeduid als FA6 IIG5, Pa3 IVC2, PaF4 IVE8, 20H11 en 21 BB.

23. Monoklonaal antilichaam volgens conclusie 22, met het kenmerk, dat dit geconjugeerd is met een label, dat in staat is een waarneembaar signaal te leveren.

24. Monoklonaal antilichaam volgens conclusie 23, met het kenmerk, dat deze het label fluorescerend of een enzyme is.

25. Werkwijze ter bepaling van de aanwezigheid van Pseudomonas aeruginosa in een monster, met het 30 kenmerk, dat het monster wordt gecombineerd met een monoklonaal anti-lichaam, dat reactief is met Pseudomonas aeruginosa flagella en complexvorming wordt waargenomen.

26. Pakket ten gebruike voor het detecteren van de aanwezigheid van Pseudomonas aeruginosa bacteriën, met het kenmerk, dat dit pakket een monoklonale antilichaamcompositie, die ten minste één monoklonaal antilichaam bevat, dat reageert met een typespecifiek flagellair proteïne van de bacterie, en labels voor het 35 verschaffen van een waarneembaar signaal, covalent gebonden aan het antilichaam of gebonden aan tweede anti-lichamen, die reactief zijn met het monoklonale antilichaam bevat.