PT85247B - Processo para a preparacao de anticorpos monoclonais contra estirpes de "pseudomonas aeruginosa"flageladas e de composicoes que os contem - Google Patents

Description

PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS CONTRA ESTIRPES DE PSEUDOMONAS AERUGINOSA FLAGELADAS E DE COMPOSIÇÕES QUE OS CONTÊM

Âmbito da Invenção

A presente invenção refere-se à aplicação de técnicas imunológicas para proporcionar novos materiais utilizáveis no diagnóstico de tratamento de infecções bacterianas e mais particularmente, à produção e aplicação de anti-corpos monoclonais que são susceptíveis de reconhecer flage los de Pseudomonas aeruginosa.

Antecedentes da Invenção

Doenças provenientes de agentes gram negativos e as suas consequências mais graves, por exemplo, bacterémia e endotoxêmia, são a causa de morbilidade significativa e mortalidade em doentes humanos. Este facto é particular mente revelante para o organismo gram negativo Pseudomonas aeruginosa , que tem sido associado de uma maneira cada vez maior com infecções bacterianas, especialmente infecções nosocomiais, nos últimos 50 anos.

Durante algumas das décadas passadas, os anti

bióticos têm sido a terapêutica de escolha para controlar doenças provocadas por agentes gram negativos. A elevada morbilidade continuada e a elevada mortalidade associada com doenças bacterianas por agentes gram-negativos, contudo, ê um indicativo das limitações da terapêutica com antibiótico particularmente no que se refere a P. aeruginosa (vêr por exemplo, Andriole, V.G·., Pseudomonas bacteriámia : Can Anti biotic Terapy Improve Survival?”, J. Lab, Clin. Med. (1978) 94 : 196 - 199).

Sste facto incitou à investigação de métodos alternativos para a prevenção e tratamento.

Um método que tem sido considerado é o que consiste no reforço do sistema imunitário do hospedeiro por meio de imunização activa ou passiva. Por exemplo, verificou -se que a imunização activa de seres humanos ou em animais de experiência com vacinas bacterianas de células completas ou endotoxinas bacterianas purificadas de P. aeruginosa conduz ao desenvolvimento de anti-corpos opsónicos específicos, dirigidos principalmente a determinantes nas unidades oligos sacáridas repetitivas das moléculas lipopolissacáridas (LPS) localizadas na membrana externa da célula de P. aeruginosa (consultar Pollack, M., Immunoglobulins: (rlaracteristics and Uses of Intravenous Preparations, Alving, 3.M., and Finalayson, J.S., eds., pp. 73 - 79, U.S. Department of Healht and Human Services, 1979). Bsse tipo de anti-corpos se constitui dos activamente ou passivamente transferidos demontraram pos suir uma acção protectora sobre as infecções letais provocadas por P. aeruginosa numa variedade de animais de experiên

- 3 cia (Pollack, Supra) e em algumas investigações preliminares em seres humanos, (ver Young, L.S. and Pollack, M., Pseudomo nas aeruginosas, Sabath, L·., ed., pp. 119 - 132, Hans Huber 1980). Os relatórios citados anteriormente sugerem que vias imunoterapêuticas podem ser utilizadas para prevenir e tratar a doença bacteriana devida à P. aeruginosa por meio da administração de imuno-globulinas humanas reunidas que contêm anti-corpos contra estirpes infecciosas. As imuno-globulinas humanas são aqui definidas como a porção do plasma humano fraccionado enriquecido com anti-corpos entre os quais estão representados anti-corpos específicos, para estirpes de P. aeruginosa. Devido a certas limitações inerentes à uti lização de componentes de imuno-globulina humana, esta via para o tratamento da doença provocada por P. aeruginosa permanece sob investigação (Vêr, por exemplo, Collins, M.S. and Roby, R.B., AM. J. MED., 76 (3A) : 168 - 174 /19847), θ Portanto ainda não existem produtos comercializados que utilizem estes componentes.

Uma das limitações associada com composições de imuno-globulina é que estas consistem em conjuntos de amostras provenientes de mil ou mais dadores, amostras que foram previamente seleccionadas relativamente à presença de anti-corpos anti-Pseudomonas específicos. Este aglomerado conduz a uma concentração média de anti-corpos individuais que, no melhor dos casos, resulta num pequeno aumento da con centração resultante dos anti-corpos desejados.

Outra limitação consiste no processo de pré-selecção propriamente dito, que ê dispendioso, requere son- 4 f dagem contínua do conjunto de dadores para se assegurar a consistência do produto. Apesar destes esforços, os produtos de imuno-globulinas variam consideravelmente de lote para lote e entre os produtos provenientes de regiões geográficas diferentes.

Ainda uma outra limitação inerente às composições que incorporam imuno-globulinas é que a sua utilização resulta numa administração simultânea de grandes quantidades de substâncias proteináceas estranhas (que podem incluir vírus, tais como, os que recentemente se demonstrou estarem associados com o sindroma de imunodeficiência adquirida, ou SIDA), que possuem potencial para provocar efeitos biológicos indesejáveis. A associação de baixas concentrações de anti-corpos desejados e de conteúdo elevado de substâncias estranhas, pode limitar muitas vezes, para níveis subóptimos, a quantidade de imuno-globulina (s) benéfica específica, que se administra ao doente.

Bm 1975 Kohler e Milstein referiram na sua descoberta embrionária que certas linhas de células de murganho podem ser fundidas com células de baço de murganho para criar hibridomas, os quais segregam anti-corpos de especificidade única, isto é, anti-corpos monoclonais (Kohler,

G., and Milstein, C., Nature 256 : 495 - 497 /19757). Com o advento desta tecnologia começou a ser possível, nalguns casos, produzir grandes quantidades de anti-corpos murinos estritamente específicos para determinante ou determinantes especiais de anti-genos. Subsequentemente, utilizando-se te£ nologias desenvolvidas posteriormente, tornou-se possível

- 5 produzir anti-corpos monoclonais humanos (ver, por exemplo a patente de invenção norte americana número 4.464.465, cuja referência aqui se cita)·

Reconheceu-se que em algumas situações, anti-corpos monoclonais de murganho ou as suas composições podem apresentar problemas para serem utilizadas em seres humanos. Por exemplo, foi referido que anti-corpos monoclonais murinos utilizados em estudos de investigação no tratamento de certas doenças humanas podem provocar uma resposta imune que os toma ineficazes (Levy, R.L., and Miller, R.A., Ann. Rev. Med. 34 : 107 - 116 /19827). Contudo, com progressos recentes da tecnologia de DNA recombinante, tais como a produção de anti-corpos monoclonais quiméricos murganho/homem, estes problemas podem ser minorados. Também, métodos para a produção de anti-corpos monoclonais humanos estão presentemente comercializados (vêr, Human Hybridomas and Monoclonal Antibodies, Engleman, Ê.G., et al., eds., Plenum Publishing Corp. /19827, que aqui se incorpora pela referência).

Utilizando-se tecnologia para a transformação de células e/ou hibridomas, um certo número de grupos referiu a produção de anti-corpos monoclonais protectores contra infecções por Pseudomona aeruginosa. Têm-se produzido anti-corpos monoclonais que são reactivos para vários epitopes de P. aeruginosa, que incluem os epitopes de superfície específicos para serotipos múltiplos ou simples, tais como os epitopes encontrados nas moléculas de LPS de bactérias (vér, por exemplo, os pedidos de patente de invenção nortemaericana pendentes depositados juntos com os números de sê rie 734.624 e 807.394, que aqui são ambos incorporados como referência. Também, foram produzidos anti-corpos monoclonais protectores específicos para a exotoxina A de P. aeruginosa (ver, por exemplo, 0 pedido de patente de invenção norte-americano depositado em conjunto número 742.179, que aqui se incorpora pela referência).

Quando se utilizam anti-corpos monoclonais específicos para a região LPS de P. aeruginosa, ou para as exotoxinas da bactéria, pode proporcionar-se protecção suficiente, em algumas situações, geralmente ê preferível ter uma capacidade de protecção mais lata. Por exemplo, no tratamento profilático de infecções potenciais em seres humanos é preferível administrar-se um anti-corpo ou anti-corpos prjo tectores contra uma diversidade de estirpes de P. aeruginosa. De um modo idêntico, nas aplicações terapêuticas onde o serotipo (s) da estirpe(s) infectante não ê conhecido, é preferível administrar um anti-corpo ou associação de anti-corpos eficazes contra a maior parte, senão todos os seroti pos clinicamente importantes de P. aeruginosa, proporcionando-se de um modo ideal anti-corpos com reacção cruzada com os esquemas de serotipos tradicionais.

Um aspecto da fisiologia da P, aeruginosa que tem mostrado contribuir para a virulência do organismo ê a sua motilidade, uma capacidade que resulta principalmente da presença de um flagelo (vêr, Montie, T., et al., /19827 Infect. and Immun., 38 : 1296 - 1298), A P. aeruginosa ê earacterizada por possuir um único flagelo numa extremidade da sua estrutura arredondada. Modelos experimentais em mur

- 7 ganhos queimados mostraram que há uma maior percentagem de sobreviventes quando a estirpe de P. aeruginosa inoculada nas queimaduras experimentais não e móvel, do que quando se utiliza para inoculação uma estirpe móvel. (Mclíanus, A., et al. /19807, Bums, 6 : 235 - 239 and Montie, T., et al., /19827, Infect. and Immun., 38 : 1296 - 1298). Outros estudos sobre a patogénese de P, aeruginosa evidenciaram que animais imunizados com preparações de antigénio de flagelo foram protegidos quando queimados e infectados com estirpes móveis de bactéria (vér, Holder, I., et al. /19827, Infect. and Immun., 35 : 276 - 280).

Estudaram-se seriamente os flagelos de P. aeruginosa por métodos serológicos e descreveram-se dois grupos de antigenos principais designados por Hl e H2 por B. Lanyi (1970, Acta Microbiol. Acad. Sei. Hung., 17 : 35 - 48) e de tipo A e tipo B por Ansorg, R. (1978, Ebl. Bakt. Hyg.,

I. Abt. Orig. A, 242 í 228 - 238). A tipificação serológica dos flagelos de ambos os laboratórios mostrou que 0 flagelo de Hl (Lanyi, B. supra) ou os flagelos do tipo B (Ansorg, R., supra) eram serologicamente uniformes, isto é, não foram iden tificados como subgrupos. Este tipo flagelar uniforme do ponto de vista serológico será referido como 0 tipo 17. 0 outro flagelo principal, H2 (Lanyi, B., supra) ou 0 tipo A de flagelo (Ansorg, R., supra) contém cinco subgrupos. Estes antigenos serão referidos como flagelo do tipo A com cinco subgru pos designados por Αθ, A^, Ag, e A^. Os cinco subgrupos do tipo A são expressos em associações diversas em diferentes estirpes do tipo A de P. aeruginosa com execepção do antige-

ηο Αθ. O antigeno Αθ foi encontrado em todos os flagelos de tipo A, ainda que o grau da sua expressão varie entre as estirpes.

esquema de serétipos fundamentado na estabilidade ao calor dos antigenos sumáticos principais de P, aeruginosa é referido como o esquema Habs, que foi recen temente incorporado no esquema do Intemational Antigenic Typing System. (ver, Liu, Int. J. Syst. Bacteriol., 33 : 256· /Ϊ9θ27)· Os tipos de flagelos de estirpes de P, aeruginosa referidas por Habs, foram caracterizados por imunofluorescencia com soros policlonais por R. Ansorg ((1978), ZBL. Bakt. Hyg., I. ABT. Orig. A, 24-2 : 228 - 238) ou por coaglutinação em lâmina (Ansorg, R., et al., 1984, J. Clin. Microbiol., 20 : 84 - 88). As estirpes de Habs 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 e 12 são estirpes que se incorporam nos flagelos de tipo B, e as estirpes de Habs 1, 6, 8 e 9 transportam flagelos do tipo A.

Assim, um grande número de estirpes de P. aeruginosa pode ser possivelmente reconhecido por um pequeno número de anti-corpos monoclonais específicos para proteínas flagelares.

Deste modo existe uma necessidade acentuada de anti-corpos monoclonais capazes de reagir com epitopes nas proteínas flagelares e, em alguns casos, também de proporcionarem protecção contra múltiplos serétipos de P. aeru ginosa. Além disso, alguns destes anti-corpos devem ser adequados para se utilizarem para tratamentos profiláticos e terapêuticos de infecções por P. aeruginosa, assim como no /

t

diagnóstico de tais infecçoes. A presente invenção preenche estas necessidades.

Resumo da Invenção

Proporcionam-se novas linhas de células que podem produzir anti-corpos monoclonais susceptíveis de se ligarem aos flagelos presentes na maior parte das estirpes da bactéria de P. aeruginosa. Os anti-corpos monoclonais especificamente reagem com epitopes das proteínas flagelares de P. aeruginosa e podem distinguir entre o tipo A e o tipo B de flagelos da bactéria. Adicionalmente, o método é fornecido para o tratamento de um ser humano susceptível a infecção ou já infectado com P« aeruginosa mediante administração de uma quantidade profilática ou terapêutica de uma composição que compreende pelo menos um anti-corpo monoclonal ou um seu fragmento de ligação susceptível de reagir com os flagelos de estirpes de P. aeruginosa. tendo a composição de preferência incluído um veículo fisiologicamente compatível. A composição também pode conter qualquer um ou mais dos agen tes seguintes: anti-corpos monoclonais adicionais susceptíveis de reagir com a exotoxina A de P. aeruginosa; anti-corpos monoclonais susceptíveis de reagirem· com determinantes de serotipo nos LPS da P. aeruginosa; uma fracção de gamma globulina proveniente de plasma de sangue humano; uma fracção de gamma globulina de plasma humano, em que o plasma pode ser obtido a partir de um ser humano que sd.be níveis elevados de imuno-globulinas que reagem com P. aeruginosa; e um ou mais agentes anti-microbianos. Além disso proporcionam-se anti-corpos monoclonais para utilização clínica, que incluem a produção de conjuntos de diagnóstico.

Descrição de aspectos específicos

De acordo com a presente invenção, proporcionam-se novas células capazes de produzir anti-corpos monoclo nais e composições que incorporam esses anti-corpos tais como composições que são susceptíveis de reconhecer de um modo selectível os flagelos presentes numa pluralidade de estirpes de P. aeruginosa, onde anti-corpos individuais tipicamen te reconhecem um tipo de flagelos de P, aeruginosa. As referidas células possuem cromossomas identificáveis em que seu DNA da linha do germes ou uma célula precursora se rearranjou para codificar um anti-corpo que possui um sítio de liga ção para um epitope na proteína flagelar comum entre certas estirpes de P. aeruginosa. Para as proteínas flagelares do tipo A, podem ser produzidos anti-corpos monoclonais pan-reactivos; e para as proteínas flagelares do tipo B incluem-se anti-corpos que são pan-reactivos ou que reagem com, pelo me nos, cerca de 70% das estirpes que possuem flagelos. Estes anti-corpos monoclonais podem ser utilizados numa grande variedade de vias que incluem o diagnóstico e a terapêutica.

Os anti-corpos monoclonais proporcionados de_s te modo são particularmente úteis no tratamento ou profilaxia de doenças graves provocadas por P. aeruginosa. As proteínas de superfície dos flagelos de P« aeruginosa devem estar disponíveis para contacto directo com as moléculas do anti-corpo, portanto como que inibindo a motilidade do orga-

nismo e/ou facilitando outros efeitos benéficos para os hospeleiros infectados.

A preparação de anti-corpos monoclonais pode ser realizada por uma linha de células imortalizada capaz de exprimir sequências de ácido nucleico que codificam para anti-corpos específicos de um epitope nas proteínas flagelares de estirpes múltiplas de P. aeruginosa. A linha de células imortalizada pode ser uma linha de células de mamífero que foi transformada por meio de oncogénese, por transfecção, mutação ou equivalente. Tais células incluem as linhas de células de mieloma, linhas de linfoma ou outras linhas de células capazes de suportarem a expressão e secreção de imuno globulinas ou de se ligarem aos seus fragmentos in vitro. A imunoglobulina ou fragmento pode ser uma imunoglobulina da ocorrência natural de um mamífero diferente de fontes humanas ou murinas preferidas, produzida por transformação de um linfócito, particularmente um esplenocito, por meio de um vírus ou por fusão do linfócito com uma célula neoplástica, por exemplo, um mieloma, para produzir uma linha de célu las híbridas. Tipicamente, o esplenocito pode ser obtido a partir de um animal imunizado contra antigenos flagelares ou seus fragmentos que contêm o sitio do epitope. Os protocolos de imunização são bem conhecidos e podem variar consideravelmente ainda que permanecendo eficazes, (ver, Golding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, Ν.ϊ. /19827, 9^ue aqui se incorpora pela referência).

Às linhas de células híbridas podem ser clona das e sondadas de acordo com técnicas convencionais e os an- 12 ti-corpos nos sobrenadantes celulares detectados são susceptíveis de se ligar a determinantes flagelares de P. aerugino sa. As linhas de células híbridas apropriadas podem em segui da desenvolver-se em cultura de larga escala ou injectadas na cavidade peritonial de um hospedeiro apropriado para a produção de líquido ascítico.

Num aspecto da presente invenção, as células são linfécitos humanos transformados que produzem anti-corpos monoclonais humanos, de preferência com acção protectora in vivo, acessíveis a epitopes específicos de pelo menos uma proteína flagelar. Os linfécitos podem ser obtidos a partir de dadores humanos que estiveram expostos a estirpes de P. aeruginosa que incorporam flagelos apropriados. Uma célula preferida submetida a um processo de transformação está descrita detalhadamente na patente de invenção norte américa na número 4*464.465, que aqui se inclui como referência.

Devido ao facto de possuírem anti-corpos da presente invenção, que são conhecidos por serem específicos para proteínas flagelares, nalguns casos os sobrenadantes das experiências subsequentes podem ser sondados por meio de um ensaio competitivo com os anti-corpos monoclonais referidos como um meio para identificar mais exemplos de anticorpos monoclonais anti-flagelares. Assim, linhas de células híbridas podem ser facilmente produzidas a partir de uma variedade de fontes fundamentadas na disponibilidade dos anti-corpos específicos presentes para os antigenos flagelares particulares.

De um modo alternativo, quando linhas de célu

- 13 / las híbridas estão disponíveis e produzem anti-corpos especí ficos para os sítios dos epitopes referidos, estas linhas de células híbridas podem ser fundidas com outras células B neo plásticas, onde as referidas células B podem servir como recipiente para o DNA genómico que codifica para os receptores. Ainda que sejam utilizadas frequentemente células B neoplásticas de roedores, particularmente murinos, podem-se empregar outras espécies de mamíferos, tais como lagomorfa, bovina, ovina, equina, porcina, espécies aviculares e outras.

Os anti-corpos monoclonais podem pertencer a qualquer das classes ou subclasses de imunoglobulinas tais como IgM, IgD, IgA, IgE, ou subclasses de IgG para espécies de animais. Geralmente, os anti-corpos monoclonais podem ser utilizados intactos, ou sob a forma de fragmentos de ligação tais como Fv, Fab, FÍab’^, mas utilizam-se usualmente intac tos.

As linhas de células da presente invenção podem encontrar outras utilizações além da produção directa de anti-corpos monoclonais. As linhas de células podem ser fundidas com outras células (tais como, células de mieloma huma no marcadas com um fármaco apropriado, mieloma de murganho, ou células linfoblastoides humanas), para produzirem hibridç) mas, e assim proporcionarem a transferencia de genes que codificam os anti-corpos monoclonais. Alternativamente as linhas de células podem ser utilizadas como uma fonte de cromossomas que codificam as imunoglobulinas que podem ser isoladas e transferidas para outras células por técnicas diferentes da fusão. Além disso, os genes que codificam os anti-

-corpos monoclonais podem ser isolados e utilizados de acordo com técnicas de recombinaçao de DITA para a produção da imunoglobulina específica numa variedade de hospedeiros. Par ticularmente, mediante preparação de bibliotecas de cDNA a partir de RITA mensageiro, um único clone de cDITA, que codifique para a imunoglobulina e isento de intrões, pode ser isolado e colocado em vectores de expressão eucarióticos ou pró-carióticos apropriados e seguidamente transformado num hospedeiro para completar a produção em quantidade, (ver, geralmente as patentes de invenção norte-americanas números 4.172.124; 4.350.683; 4.363.799; 4.381.292 e 4.423.147. Ver também, Kennett et al., Monoclonal Antibodies, Plenum, New lork /19807, e referências aqui citadas, as quais são incluí das por referência)·

Mais especificamente, de acordo com tecnologia de hibridação de DNA, as imunoglobulinas ou fragmentos da presente invenção podem ser produzidos em bactérias ou leveduras, (ver, Boss, et al., Nucl. Acid. Res., 12 : 3791 e Wood et al., IT ature 314 í 446, que aqui são incluídos como referência). Por exemplo, o RNA mensageiro, transcrito dos genes que codificam para as cadeias leve e pesada dos anti-corpos monoclonais produzidos por uma linha de células da presente invenção, pode ser isolado por hibridação diferencial de cDNA, que utiliza cDNA de linfócitos BALB/c diferentes do clone referido. 0 mRNA que não hibridizou será valioso para os mensageiros que codificam para as cadeias de imunoglobulina desejada. Se necessário este processo pode ser repetido para reforçar mais os níveis do mRlTA desejados. A

- 15 composição deste mRNA pode sofrer uma transcrição inversa para proporcionar uma mistura de cDNA enriquecida para as sequências desejadas. 0 RITA pode ser hidrolizado com uma RNase apropriada e pode fazer-se o ssDNA de cordão duplo com polimerase I de DNA e precursores aleatórios, por exemplo, de DNA de timo de vitela fragmentado aleatoriamente. 0 dsDNA resultante pode em seguida ser clonado por inserção num vector apropriado, por exemplo, vectores de vírus tais como, o vector lambda ou vectores plasmídicos (tais como pBR322, PACYC184, etc.). Através do desenvolvimento de sondas baseadas em sequências conhecidas para regiões constantes das cadeias leve e pesada, estes clones de cDNA que possuem o gene que codifica para as cadeias leve e pesada desejadas pode ser identificado por hibridação. Portanto, os genes podem ser retirados dos plasmídeos, retirados para eliminar o DNA supérfluo, a montante do codão de iniciação ou o DNA da região constante e, em seguida, ser introduzido num vector apropriado para a transformação de um hospedeiros e para completar a expressão do gene.

Convenientemente, hospedeiros mamíferos (por exemplo, células de murganho) podem ser utilizados para processar a cadeia (por exemplo, junção das cadeias leve e pesa da) para produzir uma imunoglobulina intacta e além disso, segregar a imunoglobulina isenta da sequência iniciadora se apropriado.

De um modo alternativo, podem-se utilizar microorganismos unicelulares para produzir as duas cadeias, quando é necessário manipulação adicional para eliminar as

- 16 sequências de DNA que codificam para os sinais de processamen to e de secreção principal, enquanto se proporciona um codão de iniciação para o terminal 5’ da sequência que codifica a cadeia pesada. Deste modo, as imunoglobulinas podem ser prepa radas e processadas de modo a serem reunidas e glicosiladas noutras células que não células de mamífero. Se apropriado, cada uma das cadeias pode ser truncada de modo a reter pelo menos, a região variável, cujas regiões podem então ser manipuladas para proporcionar outras imunoglobulinas ou fragmentos específicos para epitopes flagelares.

Os anti-corpos monoclonais da presente invenção são particularmente úteis porque a sua especificidade para antigênos abrange a maior parte de todas as variantes de P. aeruginosa presentemente conhecidas. Além disso, alguns dos anti.-corpos monoclonais possuem acção protectora in vivo, que permite a incorporação em produtos farmacêuticos, tais como associações de anti-corpos para infecções bacterianas.

Anti-corpos monoclonais da presente invenção também podem encontrar uma grande variedade de utilizações in vitro. Por exemplo, os anti-corpos monoclonais podem ser utilizados para imprimir microorganismos, para isolamento de estirpes de P. aeruginosa específicas, para eliminar selectivamente células de P. aeruginosa numa mistura heterogénea de células e outros.

Para fins de diagnóstico, os anti-corpos monoclonais podem ser eventualmente marcados. Habitualmente os ensaios de diagnóstico abrangem a detecção da formação de um complexo através da ligação de um anti-corpo monoclonal com

o flagelo do organismo de P, aeruginosa. Quando não são marcados, os anti-corpos podem ser utilizados em ensaios de aglutinação. Além disso, anti-corpos não marcados podem ser utilizados em associação com outros anti-corpos marcados (anti-corpos secundários) que são reactivos com o anti-corpo monoclonal, tais como anti-corpos específicos para imunoglobulina.

De um modo alternativo, os anti-corpos monoclonais podem ser marcados directamente. Uma grande variedade de marcadores pode ser utilizada, tais como, radionuclidos, agentes fluorescentes, enzimas, substractos de enzima, cofactores enzimáticos inibidores de enzimas, ligantes (particular mente haptenos), etc. Existem inúmeros tipos de ensaios aplicáveis e por exemplo, alguns incluem os descritos nas patentes de invenção norte americanas números, 3.817.827; 3.850.75¾ 3.901.654; 3.935.074; 3.984.533; 3.996.345; 4.034.074; o 4.098.876; todos aqui incluídos como referência.

Frequentemente os anti-corpos monoclonais da presente invenção são utilizados para imuno-ensaios ligados a enzima, onde os referidos anti-corpos ou anti-corpos secundários provenientes de espécies diferentes são conjugados com um enzima. Quando a amostra que contém P. aeruginosa de um determinado serétipo tal como de sangue humano ou de um seu lisado, é combinada com os referidos anti-corpos, a ligação ocorre entre os anti-corpos e aquelas moléculas que exibem o epitope desejado. Tais células podem em seguida ser separadas dos reagentes não ligados e adicionado um segundo anti-corpo (marcado com um enzima). Portanto, a presença do conjugado anti-corpo-enzima, é determinada através da ligação específica às células. Outras técnicas convencionais que podem ser utilizadas são bem conhecidas dos especialistas na matéria.

Também podem ser fornecidos conjuntos para serem utilizados com os referidos anti-corpos para a detecção de P. aeruginosa em soluções ou para a presença de antigénos flagelares de P, aeruginosa. Assim a composição que contém o referido anti-corpo monoclonal da presente invenção pode ser fornecida usualmente sob uma forma liofilizada quer isoladamente quer em conjunção com anti-corpos adicionais específicos para outras bactérias gram negativas. Os anti-corpos que podem ser conjugados com um marcador ou não conjugados são incluídos em conjuntos com agentes tampão como por exemplo, tris, fosfato, carbonato, etc.; agentes estabilizad£ res, biocidas, proteínas inertes, por exemplo, albumina de s£ ro bovino, ou equivalentes. Geralmente, estes materiais estarão presentes numa quantidade inferior a 5% em peso, baseado na quantidade de anti-corpo activo e usualmente, presentes numa quantidade total inferior a cerca de 0,01% em peso, baseada ainda na concentração do anti-corpo. Frequentemente, se rá desejável incluir uma carga inerte ou um excipiente para diluir os ingredientes activos, podendo o excipiente estar presente em cerca de um a 99% em peso da composição total. Quando se utiliza um anti-corpo secundário capaz de se ligar com o anti-corpo monoclonal, este estará usualmente presente numa ampola separada. 0 segundo anti-corpo ê tipicamente conjugado com um marcador e formulado de um modo análogo ao do anti-corpo das composições referidas anteriormente.

- 19 Os anti-corpos monoclonais, particularmente, anti-corpos monoclonais humanos da presente invenção, também podem ser incorporados como componentes de composições farma ceuticas que contêm uma quantidade terapêutica ou profilática de pelo menos um dos anti-corpos monoclonais desta invenção conjuntamente com um veículo farmacêutico eficaz. Um veí culo farmacêutico compatível pode ser qualquer substância não tóxica compatível apropriada para libertar os anti-corpos monoclonais no doente. Pode ser utilizada água estriliza da, álcool, gorduras, ceras, agentes sólidos inertes como veículos. Adjuvantes aceites em farmácia (agentes tampão, agentes dispersantes) também podem ser incorporados na compo sição farmacêutica. Tais composições podem conter um único anti-corpo monoclonal de modo a ser específica para as estir pes de um tipo flagelar de P. aeruginosa. De um modo alterna tivo, uma composição farmacêutica pode conter dois ou mais anti-corpos monoclonais para formar uma ’^,mistura^r’. Por exemplo, um '‘cocktail que contenha anti-corpos monoclonais anti ambos os tipos de flagelos ou anti grupos de várias estirpes P.aeruginosa (por exemplo sérotipos diferentes) seria um pro duto universal com actividade sobre a maior parte dos isolados clínicos daquela bactéria especial.

A proporção molar dos diversos componentes de anti-corpos monoclonais não diferirá usualmente mais do que um factor de 10, mais usualmente não mais do que um factor de 5, e usualmente será numa proporção molar de cerca de 1:1-2 para cada dos outros anti-corpos componentes.

Os anti-corpos monoclonais da presente inven ção podem ser utilizados em associação com produtos que existem no plasma sanguíneo, tais como gamma globulina e produtos de imunoglobulina comercializados, utilizados no tratamento ou na profilaxia de doenças provocadas por D. aeruginosa em seres humanos. De preferência para as imunoglobulinas o plasma será obtido de dadores humanos que exibem níveis elevados de imunoglobulinas que reagem com P. aeruginosa. (ver de um modo geral, o compêndio Intravenous Immune Globulin and the Compromised Host,” Amer. J. Med., 76(3A), 30 de Março, pp. 1-231, 1984, que aqui se inclui como referência).

Os anti-corpos monoclonais referidos podem ser utilizados separadamente em composições para serem administradas em conjunto com anti-corpos ou agentes anti-microbianos. Tipicamente, os agentes anti-microbianos podem incluir uma penicilina anti-pseudomonas, (por exemplo, carbenicilina) em associação com um aminoglicosido (por exemplo, gentamicina, tobramicina, etc.), mas podem ser utilizados numerosos agentes adicionais (por exemplo, cefalosporinas) bem conhecidos da técnica.

Os anti-corpos monoclonais e as composições farmacêuticas que os contêm, desta invenção, são particularmente utilizáveis para a administração oral ou parentêrica. De preferência, as composições farmacêuticas podem ser administradas por via parentêrica, isto ê, subcutânea, intra-muscular ou intra-venosamente. Assim, esta invenção proporciona composições para a administração parentêrica que consiste numa solução do anti-corpo monoclonal ou de uma sua mistura dissolvida num veículo aceitável, de preferência um veículo aquoso. Pode-se utilizar uma grande variedade de veículos aquosos, por exemplo, água, água tamponada, solução de cloreto de sódio a 0,4$, glicina a 0,3$ θ outros equivalentes. Estas soluções são estéreis e geralmente isentas de outras partículas. Estas composições podem ser esterilizadas por meios convencionais, habituais como técnicas de esterilização. As composições podem conter substâncias adjuvantes aceitáveis em farmácia de acordo com a necessidade para se aproximar das condições fisiológicas, tais como, ajustamentos de pH e agentes tampão, agentes que ajustam a toxicidade e outros, por exemplo, acetato de sódio, cloreto de sódio, cloreto de potássio, cloreto de cálcio, acetato de sódio, etc.. A concentração de anti-corpos nestas composições pode ser largamente variada, isto é, desde cerca de 0,5%, usualmente de ou pelo menos de cerca de 1% até 15% ou 20% em peso e â escolhida principalmente de acordo com os volumes de líquido, viscosidade, etc., de preferência para uma forma particular de administração.

Assim, uma composição farmacêutica típica para injecção intra-muscular, pode ser preparada para conter 1 ml de água tamponada estéril e 50 mg de anti-corpo monoclonal. Uma composição típica para perfusão endovenosa pode ser constituída por 250 ml de solução de Ringer estéril e 150 mg de anti-corpo monoclonal. Métodos actuais para a preparação de composições que são para administrar por via parentérica serão conhecidas ou evidentes aos técnicos mais detalhadamente, por exemplo no Remingtons Pharmaceutical Science, 15^ã edição, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylavania (1980),

que aqui se inclui como referência.

Os anti-corpos monoclonais desta invenção podem ser liofilizados para a sua armazenagem e reconstituídos num veículo apropriado no momento da utilização. Esta técnica mostrou ser muito eficaz com imunoglobulinas e podem ser utilizadas técnicas conhecidas de liofilização e de reconstituição. Os técnicos têm o conhecimento de que a liofilização e a reconstituição podem conduzir a vários graus de perda de ac. tividade do anti-corpo (por exemplo, com imunoglobulinas convencionais, anti-corpos IgM tendem a perder uma maior quantidade de actividade do que os anti-corpos IgG) e que os níveis habituais têm de ser ajustados para compensação.

As composições que contêm os presentes anti-corpos monoclonais ou uma sua mistura podem ser administradas para fins profiláticos e/ou tratamento terapêutico de infecções por P. aeruginosa. Para a aplicação terapêutica, as composições são administradas a um doente já infectado com uma ou mais dos serótipos de P. aeruginosa, numa quantidade suficiente para curar ou pelo menos parcialmente deter a infecção e as suas complicações. Uma quantidade adequada para cumprir este fim é definida como uma dose terapêuticamente eficaz. Quantidades eficazes para esta utilização dependerão da gravidade da infecção, do estado geral do doente, do seu sistema imunitário, mas geralmente está compreendida entre cerca de 1 e cerca de 200 mg de anti-corpo por quilograma de peso do corpo, sendo as dosagens de 5 a 25 mg por quilograma as mais correntemente utilizadas. Deve ter-se em atenção que os materiais da presente invenção podem ser, geralmente, uti- 23 lizados em estados de doença graves, isto ê, situações de ris co de vida ou situações de risco de vida potenciais, especial mente a bacteriêmia e a endotoxêmia, devido à P, aeruginosa.

Nas aplicações profiláticas, as composições que contêm o presente anti-corpo ou uma sua mistura são administradas a um doente ainda não infectado por P. aeruginosa com a finalidade de reforçar a resistência do doente a uma potencial infecção deste tipo. Uma tal quantidade é definida como a dose profilática eficaz”. Para esta finalidade as quantidades exactas dependem também do estado do doente ou da saúde do paciente e geralmente do grau de imunidade, mas frequentemente estão compreendidas entre 0,1 e 25 mg por quilograma, especialmente entre 0,5 e 2,5 mg por quilograma.

Pode-se realizar uma administração única ou administrações múltiplas das composições com um nível de dose e esquema seleccionado pelo médico assistente. Sm qualquer ca so, as composições farmacêuticas devem proporcionar uma quantidade de anti-corpo (s) desta invenção suficiente para tratar ou exercer a profilática eficaz do paciente.

Experiências

Sxemplo 1 exemplo 1 demonstra a metodologia utilizada para preparar anti-corpo monoclonal murino que se liga especi ficamente a flagelos de P. aeruginosa.

lurganhos balb/c foram imunizados por via intra-peritonial oito vezes com bactérias imunotipo 1 de Pisher e imunotipo a de Pisher de P. aeruginosa (A.T.C.C. 27312 e

- 24 27313) cada uma ou duas vezes por semana durante um total de nove semanas. As doses iniciais da bactéria foram de 3 x 10°

Fisher e imunotipo 2 de Fisher de P. aeruginosa respectivamente, e a dose foi aumentada de 30 a 60 vezes durante o decurso das imunizações.

Três dias após a última injecção, o baço de um murganho foi retirado assepticamente e uma suspensão celular única foi preparada por rotação cuidadosa do orgão entre as extremidades arrefecidas de duas lâminas de vidro estéreis. Células mononucleares de baço foram reunidas numa proporção de 4 : 1 com células de mieloma de murganho na fase lugarítmi ca (NSI-1, obtidas de Dr. C. Milstein, Molecular Research Council, Caníbridge, Sngland) e fundidas para criar hibridomas de acordo com o processo descrito por Tam et al., (1982, Infect. Immun., 36 : 1042 - 1053). A suspensão final de células híbridas foi diluída para uma concentração de 1,5 x 10° células por ml em meio de RPMI-hibrido-HAT (RPMI 1640 Grand Island, ±Ty7 que continha 15% de soro fetal de vitela inactivado pelo calor, piruvato de sódio a 1 Mm 100 jug/ml de penicilina e estreptomicina, e 1,0 x 10“^ m de hipoxantina,

-7 -5

4,0 x 10 ' m de aminopterina e 1,6 x 10 m de timidina), que z· incluía 2,0 x 10° por ml de timocitos da balb/c preparados recentemente como células alimentadores.

A mistura foi colocada em placas de 96 cavidades, 200 ml por cavidade, (3596, Costar, Cambridge, MA).

A cultura foi alimentada por remoção e substituição de 50% do volume de cada cavidade com um meio fresco de RPMI-hibrido

-HAT cada dois a três dias. Os sobrenadantes da cultura foram analisados para a presença de anti-corpos anti P. aeruginosa pelo ensaio de imunoabsorção ligado à enzima (ELISA), quando o desenvolvimento celular alcançou aproximadamente 40$, confluentemente nas cavidades, o que se verificou entre 7 a 10 dias.

Os sobrenadantes da cultura das células hibri das foram analisados simultaneamente em preparações da membra na mais externa de cada de duas bactérias imunizantes. Preparações da membrana mais externa foram isoladas por um método modificado de Tam et al. (1982, Infect. Immun., 36 : 1042 - 1053) que aqui está incluído como referência. As bactérias imunotipo 1 de Fisher e imunotipo 2 de Fisher de P. aerugino sa) foram inoculadas em caldo de tripticase de soja (TBS) e desenvolveram-se durante 16 a 18 horas à temperatura de 34°C com arejamento num banho com agitação giratória. As bactérias foram colhidas por centrifugação e lavadas duas vezes com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS, 0,14M íJaCl, 3 mJJ KC1, 8 mM Κ^ΗΡΟ^-Ϊ H₂0, 1,5 mM KHgPO^, pH 7,2) que continha 150 unidades inibidoras de tripsina (T.I.U.) aprotinina por ml (Sigma, St. Louis, MO).

Fez-se de novo a suspensão do gramulo proveniente da centrifugação final em 0,17 m de trietanolamina, 20 mM de ácido etilenoaminotetracético, (EDTA), e em seguida homogeneizado em gelo durante 10 minutos. Recolheram-se os detritos a partir do homogeneizado a 14.900 x g e deitaram-se fora, e centrifugou-se outra vez o sobrenadante, como se refriu anteriormente. 0 aglomerado foi novamente inutilizado e as membranas recolhidas a partir do sobrenadante por centri fugação a 141.000 x g durante uma hora. A fracção sobrenadante foi inutilizada e as membranas recolhidas foram guardadas durante a noite à temperatura de 4°C em 10 ml de PBS que continha 75 T.I.U. aprotinina por ml. No dia seguinte fez-se de novo a suspensão dos grânulos num vértice e em seguida as alí quotas foram armazenadas â temperatura de -70°C. 0 conteúdo proteico de cada foi determinado pelo método de Lowry et al. (1951, J. Biol. Chem., 193 : 265 - 275).

As placas de antigeno para ELISA foram preparadas do seguinte modo. Diluiram-se as preparações da membrana mais externa para 5 jug por ml de proteína em PBS e 50 p.1 das soluções foram colocados em cada cavidade de placas com 96 cavidades (limbro #76-031-05, Plow Laboratories, Inc., McLean, VA), fechadas e incubadas durante a noite à temperatura de 37°C. 0 antigeno não ligado foi removido rapidamente das placas e adicionaram-se 100 ml de albumina de soro bovino a 5% (p/v) em PBS em cada cavidade e as placas foram incubadas durante uma hora à temperatura de 37°C.

Após se retirar o BSA, não absorvido, foram replicadas culturas dos sobrenadantes (50 jil) de cada cavidade das placas de fusão em cavidades correspondentes de placas de antigeno e incubadas durante 30 minutos à temperatura de 37°C. 0 anti-corpo não ligado foi removido rapidamente das cavidades, lavaram-se as placas três vezes com 100 ml de BSA-PBS a 1% (p/v) por cavidade. Em seguida adicionaram-se 50 yl de anti IgG de rato desenvolvido em cabra botinilado e diluído por cavidade apropriadamente (Tago, Inc., Burlingame,

- 27 CA) e incubadas durante 30 minutos à temperatura de 37°C. As placas foram lavadas três vezes como se descreveu anteriormen te e em seguida adicionaram-se 50 jul de um complexo pre-forma do de avidina: peroxidase de rábano biodinilada em cada cavidade (Vectastain ABC Kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) preparado de acordo com as indicações do fabricante. Após 30 minutos à temperatura ambiente removeu-se o reagente de vectastaína rapidamente das cavidades, lavaram-se as cavidades como se descreveu anteriormente e, em seguida, adicionaram-se 100 pl em cada cavidade de substrato de O-fenileno-diamina (0,8 mg/ml em tampão de citrato 0,1 m, pH 5,0, misturado com igual volume de H2O2 a 0,03% v/v). 0 substrato foi incubado durante 30 minutos à temperatura ambiente na ausência da luz e as reacções terminaram mediante adição em cada cavidade de 50 pl de I^SO^ 3N.

As células híbridas que segregam anti-corpos monoclonais que se ligam a qualquer das duas preparações de antigenos foram localizadas mediante a avaliação da absorvência a 490 nm de reacções olorimétricas em cada cavidade num leitor de micro ELISA Dynatech modelo 580, Alexandria, VA. As células de uma cavidade, designadas por PA3 IVC2, produziram anti-corpos que se ligaram apenas à placa com 0 antigeno do imunotipo 2 de Fisher. Esta cavidade foi depois estudada como se descreve posteriormente. 0 anti-corpo monoclonal e a linha de células clonal desta cavidade são ambos identificados pela designação PA3 IVC2 no texto seguinte. As células PA3 IVC2 da cavidade principal foram mini-clonadas e clonadas por técnicas de diluição restritiva como descrito por

Tam et al. (1982, Infect. Immun., 36 : 1042 - 1053). Preparou-se o fluido de ascite que continha anti-corpos monoclonais numa concentração elevaia em murganhos 036 (balb/c fêmea, C57BL/6 F^, macho) de acordo com os processos descritos por Tam et al. (1982, Infect. Immun. 36 : 1042 - 1053). Murganhos CB6 machos com dois ou três meses foram injectados por via intra-peritonial com 0,5 ml de Pristane (2, 6, 10, 14 - tetra metilpentadecano, Aldrich Chemical Go., Milwaukee, 7/1) 10 dias a 21 dias antes da injecção intra-peritonial com células PA3 e IVC2 na fase lugarítmica em RPIidl. Cada murganho foi injectado com 0,5 a 1 x 10 células em 0,5 ml. Aproximadamente após duas semanas, o fluido que se acumulou foi removido dos murganhos cada dois ou três dias. A concentração de anti-corpo no fluido ascítico foi determinada por electroforese sobre gel de agarose (Pargon, Beckman Instruments, Inc., Brea, CA) e todas as ascites que continham 5 mg/ml ou maior quantidade de anti-corpo foram reunidas, divididas em alíquotas e congeladas à temperatura de -70 °C.

Caracterização do Alvo Molecular ligado por anti-corpos monoclonais sobrenadante de cultura da linha de células clonada PA 3 IVC2 foi analisada por ELISA como descrito anteriormente em preparações de membrana mais externa de todas as sete estirpes de imunotipo de Fisher de P. aeruginosa. (A.T.C.C. 27312 - 27318), P. aerofacíens (A.T.C.C. 13985), e Klebsiella Pneumoniae (A.T.C.C. 8047), todas preparadas co mo se descreveu anteriormente. Anti-corpo PA3 IVC2 ligou-se

- 29 às preparações de membrana mais externa de P, aeruginosa dos imunotipos de Fisher 2, 6, e 7, e não aos outros imunotipos de Fisher de P, aerofaciens ou K. Pneumonia.

Este antigeno especifico identificado pelo anti-corpo PA3 IVC2 foi identificado por precipitação radioimune. De um modo breve, esta análise abrange a incubação de antigenos radiomarcados com anti-corpo PA3 IVC2 e uma fonte especial de proteína A que resulta na formação de complexos insolúveis anti-corpo-antigeno. Estes complexos são lavados para eliminar qualquer antigeno ligado de modo não específico e em seguida os complexos são dissociados e separados em gel de poliacrilamida. Espécies radioactivas predominantes encontradas no gel, são, assim, identificadas como o antigeo(s) correspondente ao qual o anti-corpo PA3 IVC2 se liga.

Alíquotas de 25 /xg de P. aeruginosa solúvel dos imunotipos de Fisher 2, 3, 4, e 5 de preparações de membrana mais externa foram radiomarcados em fase sólida com η nc

I ³ utilizando-se um iodogênio (Pierce Chemical Co., Rockford, IL) (Fraker and Speck, 198, Biochem, Biophys, Res. Commun., 80 : 849 - 857; Markwell and Fox, 1978, Biochemistry, 17: 4807 - 4817)· Este processo resultou na iodação de resíduos de tirosina expostos da maior parte, se não de todas, as proteínas contidas nas preparações de membranas mais externas.

Para reduzir a ligação não específica dos antigenos da membrana mais externa ao anti-corpo PA3 IVC2, as preparações radiomarcadas (5 x 10 contagens por minuto, por ensaio) foram primeiro incubadas durante uma hora à tem /

peratura de 4°C com soro de murganho normal balb/c com uma diluição final de 1 : 40. 0 sobrenadante da cultura de PA3 IVC2 (0,5 ml) que continha o anti-corpo PA3 IVC2 foi em seguida adicionado a cada amostra das membranas externas. Após a incubação do antigeno e anti-corpo, durante uma hora à temperatura de 4°C a fonte de proteína A, IgGSORB (0,095 ml por amostra), (the Enzyme Center, Inc., Boston, LIA) foi adicionada e incubada durante mais de 30 minutos à temperatura de 4°C. (Kesseler, S.W., 1975, J. Immunol., 115 : 1617 - 1622). Preparou-se a IgGSORB de acordo com as especificações do fabricante e, imediatamente antes da sua utilização, evitaram-se relações não específicas por bloqueio dos sítios potencialmente reactivos com meio de cultura, por meio de lavagem de IgGSORB duas vezes com RPMI-híbrido isto é meio RPMI-híbrido-HAT de onde se excluiu HAT.

Juntaram-se os complexos antigeno-anti-corpo-IgGSORB a 1500 x g durante 10 minutos à temperatura de 4°C, lavaram-se duas vezes com tampão RIPA fosfato (10 mM fosfato, pH 7,2, 0,15 M NaCl, 1,0% /v/v/ trinton X-100, 1,0% /p/v/ de desoxicolato de sódio, 0,1% Zp/v7 de dodecilsulfato de sódio /SDSj, e 1, 0/o /v7' yj de aprotinina); duas vezes com tampao salino concentrado (0,1 K tris-HCl, pH 8,0, 0,5 M LiCl, 1% /v/v7 beta-mercaptoetanol); e uma vez com tampão de lise (0,02 M tris-HCl, pH 7,5, 0,05 M NaCl, 0,05% /v/v7 Nonídet P-40) (Rohrschneider et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 76 : 4479 - 4433). 0 antigeno ligado ao complexo foi libertado por incubação com tampão de amostra (0,125 M tris-HC1, pH 6,8, 2% Zp/y7 SDS, 2% /v/v7 beta-mercaptoetanol, e

- 31 20$ /v/v/ Glicerol) à temperatura de 95°O durante 10 minutos e recolhido no sobrenadante após centrifugação a 1500 x g durante 10 minutos.

As amostras de sobrenadante foram em seguida aplicadas em geles de poliacrilamida a 14% contendo SDS preparados de acordo com o método de B. Lugtenberg et al. (1978, ΕΞΒ3 Lett., 58 í 254 - 258) modificado por Hancock e Carey (1979, J. Bacteriol., 140 : 902 - 910, que aqui está incluído como referência), e os antigenos foram separados por electroforese sobre gel durante a noite com uma voltagem constante de 50 ν. A seguir à fixação do gel em metanol a 40% (v/v), ácido acético a 10% (v/v) e glicerol a 5% (v/v) durante a noite, este foi seco com papel ?/hatman 3 mm via um secador de gel Biorad (Richmond, CA). 0 gel seco foi coberto e exposto a uma película Kodak X-AR durante 18 horas à temperatura ambiente.

Os resultados desta experiência esclarecem que PA3 IVC2 se liga apenas a um antigeno nas preparações da membrana externa do imunotipo de Fisher 2 de P, aeruginosa, somente, e não a qualquer antigeno presente noutras preparações de membrana externa. 0 peso molecular (PM) do antigeno no gel foi de cerca de 53.000 daltons como determinado mediante a comparação da sua mobilidade com a de proteínas marcadas 0^4 padrões (Fosforilase 3, 92.500 PM; BSA, 69.000 PM, ovalbumina, PM 46.000, anidrase carbónica PM 30.000, citocromo C, PM 12.000) (New Bngland, Nuclear, Boston, LIA) que foram separadas no mesmo gel. 0 peso molecular deste antigeno relacionado com o peso molecular de flagelina a proteína que in- 32 corpora os flagelos de P. aeruginosa como referido por

Montie et al. (1982, Infect. Imiaun., 35 : 281 - 288), que aqui está incluído como referência.

Além disso, PA 3 IVC2 foi examinado por ELISA utilizando--se estirpes HABS de P. aeruginosa de 1 a 12 (A.T.C.C. 33348 - 33359) que foram fixadas com etanol em placas microtituladoras de 96 cavidades. As placas de antigeno foram preparadas do modo seguinte.

Culturas em caldo de uma noite de cada organismo foram reunidas, lavadas duas vezes com PBS e em seguida fez-se de novo a sua suspensão em PBS para uma absorção a 660 A de 0,2 unidades de D.O. As bactérias diluídas foram colocadas em cavidades, 50 p.1 por cavidade, e em seguida centrifugadas em 1500 x g durante 15 minutos à temperatura ambiente. 0 PBS foi aspirado e em seguida foi adicionado etanol a 95% às cavidades durante 15 minutos à temperatura ambiente. Em seguida o etanol foi rapidamente retirado das cavidades, as placas foram secas ao ar e em seguida cobertas e guardadas â temperatura de 4°C até à sua utilização.

Os resultados dos ensaios de ELISA, realizados como se descreveu anteriormente, mostraram que PA3 IVC 2 se liga às estirpes HABS fixadas com etanol, 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 e 12. Este esquema de especificidade indicou que PA3 IVC2 se liga ao tipo B dos flagelos de P. aeruginosa (Ansorg, R., 1978, Zbl. Bakt. Hyg., I. Abt. Orig. A., 242 : 228 - 238; Ansorg, R., et al., 1984, J. Clin. Microbiol., 20 : 84-88, que aqui estão incorporados ambos como referen cia). Baseada nesta indicação de especificidade para anti- 33 /

/ ,

-corpo monoclonal ΡΑ3 IVC2, as estirpes de referência de imunotipo 2 de Pisher, imunotipo 6 de Pisher e imunotipo 7 de Pisher de P. aeruginosa incorporam flagelos do tipo 3. A partir das experiências anteriores conclui-se que o anti-corpo PA3 IVC2 se liga especificamente à flagelina do tipo 3 de P. aeruginosa.

Actividade protectora in vivo de PA3 IVC2

Experiências com animais foram conduzidas de maneira a determinar se o anti-corpo monoclonal PA3 IVC2 proteje um rato inoculado com LD^q múltiplos de bactéria viva de P. aeruginosa. A experiência escolhida foi a experiência de rato queimado (Collins, M.S., and Roby, R.E., 1983, J. Trauma, 23 : 530 - 534, o qual se incorpora aqui como referên cia). Grupos de murganhos foram submetidos a sérias queimaduras, de acordo com o protocolo do autor, e em seguida, imedia tamente inoculados com 5 a 10 ΒΏ^θ do imunotipo 7 de Pisher. 0 anti-corpo monoclonal foi administrado por via intra-peritonial como elevado grau de concentração de ascite. (0,2 ml por via intraperitonial) anteriormente às queimaduras e à inoculação.

IJão se observou um aumento do número de sobreviventes como se observou no tratamento de animais com PA3 IVC2, comparados àqueles que não receberam anti-corpo. Exemplo. 2 exemplo 2 descreve a metodologia para a preparação de uma linha de células de hibridoma murina que produz um anti-corpo monoclonal murino para P, aeruginosa / ι * do tipo flagelina B que é protector in vivo.

Primeiro injectram-se fêmeas de murganho balb/c adultas por via intraperitonial oom imunotipo 6 de Fisher de P. aeruginosa viável (A.T.C.C. IIs 27317) (8 x 10^ organismos) seguida por injecção duas semanas depois de imunotipos 5 de Fisher de P, aeruginosa (A.T.C.C, N2 27316) (4 x 10 organismos). Durante o período subsequente de duas semanas os imunotipos 5 de Fisher ie P. aeruginosa viável e os imunotipos 6 de Fisher de P. aeruginosa foram administrados conjuntamente em injecções bi-semanais. A dose de cada organismo foi aumentando de tal modo que a dose final era dez vezes maior do que a dose inicial. Uma injecção final de imunotipo 6 de Fisher de P. aeruginosa de uma preparação da membrana mais externa (50 pg de proteína) preparada de acordo com o método de R.3.W. Hancock e H. Nikaido (1978,

J. Bacteriol., 136 : 381 - 390) foi administrada quatro dias depois da última injecção de bactérias viáveis. Três dias depois da última imunização, o baço foi removido de cada murganho e as células do baço preparadas para hibridação como descrito no exemplo 1.

Os sobrenadantes de cultura das células de hibridoma foram ensaiados para a presença de anti-corpos anti P. aeruginosa por 3LISA e no dia 10 após a fusão de acordo com os processos estabelecidos no exemplo 1, excepto no facto de o antigeno para as placas de 3LISA consistir em bactérias viáveis imobilizadas nas cavidades de placas microtituladoras de 96 cavidades. As placas foram preparadas como se segue.

Adicionaram-se 50 pl de poli-L-lisina (PL1>) (1 mg/ml em P3S), (Sigma ϊ?2 P-1524, 3t. Louis, MO) a cada cavidade das placas de 96 cavidades (Limbro) e incubaram-se durante 30 minutos à temperatura amhiente. A PLL não absorvida foi retirada e as cavidades foram lavadas três vezes com P3S. As culturas bacterianas desenvolvidas durante a noite em TSB foram lavadas uma vez com P3S e em seguida fez-se de novo a suspensão em P3S para 0,0. 660 nm = 0,2. Cinquenta microlitros das suspensões bacterianas foram adicionados a cada cavidade das placas e deixaram-se ligar à temperatura de 37°C durante uma hora. As bactérias não ligadas foram removidas por agitação das placas e em seguida por lavagem das cavidades três vezes com solução salina-Tween (cloreto de sódio a 0,9% p/v e Tween-20 v/v a 0,05%).

A ligação não específica dos anti-corpos foi bloqueada mediante a adição de 200 ml por cavidade de tampão de bloqueio (P3S contendo 5% de leite seco não gordo p/v, 0,01% de anti-espuma a v/v, (Sigma, St. Louis, MO), e timerosal a 0,01%p /v) nas cavidades e incubação durante uma hora â temperatura ambiente. 0 excesso de tampão de bloqueio foi expelido e as cavidades lavadas três vezes com solução de cloreto de sódio - Tween como descrito anteriormnete.

Os sobrenadantes da cultura (50 yul) foram replicados nas cavidades correspondentes das placas de ensaio e incubaios à temperatura ambiente durante 30 minutos. Os so. brenadantes da cultura foram removidos, sacudindo-se as placas e lavando-se as cavidades cinco vezes com solução de cloreto de sódio - Tween.

- 36 Dilui-se um anticorpo do segundo passo conju gado ao enzima (anti IgLí + IgG do rato conjugado com peroxidase de rábano, na cabra), (Tago, Inc., Burlingame, CA) em PBS que continha 0,1% v/v de Tween 20 e 0,2% p/v de BSA de acordo com titulações previamente determinadas e em seguida adicionou-se a cada cavidade 50 jul do reagente e incubou-se durante 30 minutos à temperatura anbiente. Retirou-se o excesso de reagente. Lavaram-se cavidades cinco vezes com solução de cloreto de sódio-Tween e adicionou-se 100 jul por ca vidade de substracto de ortofenilenodiamina e incubaram-se durante 3θ minutos, como descrito no exemplo 1. Terminaram-se as reacções como estabelecido no exemplo 1 e em seguida fez-se a leitura a A 490 nm num bio-tek EL-310 Automated Plate Reader,

Pelos métodos descritos anteriormente os sobrenadantes da cultura proveniente da fusão foram ensaiados para a presença de anti-corpos ligados com os imunotipos 1, 2, 3 ou 4 de Fisher de P, aeruginosa. mas não com às placas de controle preparadas pelo mesmo processo de PLL e bloqueio mas sem bactérias. Os sobrenadantes que continham o anti-cor po que se ligou a qualquer destes quatro imunotipos de Fisher, foram ensaiados uma segunda vez utilizando-se de cada vez um dos sete imunotipos de Fisher da bactéria. 0 anti-corpo presente no sobrenadante de uma cavidade, PaF4 IVE8, ligou-se apenas com os imunotipos 2, 6 e 7 de Fisher de P. aeruginosa. As células ia cavidade PaF4 IVE8 foram clonadas por meio de métodos de diluição restritiva como descrito no exemplo 1. 0 anti-corpo monoclonal e a linha de células

- 37 clonal desta cavidade são ambos identificados pela designação Pa?4 IVi28 no texto que se segue. 0 fluido ascítico que continha uma concentração elevada de anti-corpos monoclonais foi obtido como descrito no exemplo 1 excepto na utilização de murganhos balb/c em substituição de CB6F^·

Especificidade de Pa?4 IVE8

Um ensaio realizado para identificar o antigeno ligado pelo anti-corpo monoclonal Pa?4 IVE8 consistiu num ensaio de imunofluorescência indirecto nos organismos bacterianos. Cada um dos sete imunotipos de Fisher de P. aeruginosa referenciados, mais uma estirpe não flagelada de P. aeruginosa (PA103, A.T.C.C. 29260, Leifson, J. Bacteriol, 62 : 377 - 389, 1951), e Escherichia Coli (G.S.C. A25) desen volveram-se durante a noite à temperatura de 37°C em TBS. A bactéria foi aglomerada por centrifugação e em seguida lavada duas vezes com PBS, Fez-se de novo a suspensão de cada estirpe em PBS para uma D.O. 660 nm = 2,2.

As suspensões bacterianas foram ainda diluídas a 1 : 150 e amostras de 20 ml foram colocadas em cavidades individuais de placas de Carlson (Carlson Scientific Inc., Peotone, IL) e secas nas placas à temperatura de 40°C.

Sobrenadantes das culturas de 25 jul de Pa?4 IVE8, foram incubados nas amostras bacterianas secas nas placas numa câmara humidificada â temperatura ambiente duran te 30 minutos. 0 anti-corpo não ligado foi retirado por lavagem das placas por imersão em água destilada.

Após a secagem das placas fez-se a incubação de anti-IgG + IgM de rato conjugado com isotiocianato de flu oresceína (FITO), macabra (25 yul por cavidade numa diluição a 1 í 40 em 233, Tago Burlingame, CA) durante 30 minutos à temperatura ambiente numa câmara humidificada na ausência da luz. As placas foram lavadas novamente com âgua destilada, secas e em seguida cobertas com uma cobertura constituída por glicerol em P3S a 9 : 1. As placas foram observadas com um microscópio de fluorescência.

A coloração de fluorescência foi observada apenas nos imunotipos 2, 6 e 7, de Fisher de P. aeruginosa, e verificou-se apresentar um esquema sinusoidal (linha) que emanava de uma extremidade apenas do organismo. Esta observação é consistente com a morfologia e localização de um único flagelo polar desta bactéria.

A reacção do PaF4 IVE8 com os flagelos foi confirmada por análise de imunocloração. Os antigenos da membrana mais externa do imunotipo 6 de Fisher de P. aeruginosa (vér exemplo 1) foram separados por electroforese em gel de poliacrilamida a 15% contendo SDS como descrito no exemplo 1, excepto que a electroforese desenvolveu-se durante cinco horas com 80 milamperes numa amperagem constante. Marcadores de peso molecular pré-corados (liozima de peso molecular 14300; beta-lactoglobulina de peso molecular 18.400; alfa-quimotripsinogeno de peso molecular 25.700; ovalbumina de peso molecular 43.000; seroalbumina bovina de peso molecular 68.000; fosforilase 3 de peso molecular 97.400 e miosina de peso molecular 200.000) (B3L, Gaithersburg, MD) foram incluídas no mesmo gel de poliacrilamida.

Os antigenos foram transferidos do gel de poliacrilamida para uma membrana de nitrocelulose, (NCM), (0,45 um Schleicher e Schuell, Inc., Keen, NH) em tampão de tris-glicina-metanol (Towbin et al., /1979/, Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., 76 : 4350 - 4354) contendo 0,05% de SDS p/v durante a noite à temperatura de 4°C com uma amperagem constante de 200 mA. Após transferência a NCM foi incubada em Tween 20 a 0,05% v/v, em PBS (PBS-Tween), (Batteiger, B. et al., J. Immunol. Meth., 55 : 297 - 307, 1982) durante uma I hora à temperatura ambiente. Para esta fase e todas as fases subsequentes a bandeja que continha a NCM foi colocada numa plataforma oscilante para assegurar a distribuição da solução na NCM inteira.

Após uma hora a solução PBS-Tween foi decantada e adicionada com ascite PaP4 IVE8. (diluída: a 1 : 1000 em PBS-Tween) e incubada com a membrana de nitrocelulose durante uma hora â temperatura ambiente. A membrana de nitrocelulose foi em seguida lavada cinco vezes durante cinco minutos de cada vez com PBS-Tween para eliminar o anti-corpo não ligado. Dilui-se o anti-IgG + IgM de rato conjugado com fosfatase alcalina, na cabra (Tago, Inc.) de acordo com as especificações dos fornecedores e incubada com a membrana de nitrocelulose durante uma hora â temperatura ambiente. A NCM foi lavada cinco vezes como descrito anteriormente e adiciona da com um substrato que continha fosfato de bromocloroindol e azul de nitrotetrazol (Sigma, St. Louis, MO), preparado como descrito por Leáry et al., (1983, Proc. Natl. Acad. Sci.,U.S.A., 80 i 4045 - 4049), e incubado dez a vinte minutos à tempera-

- 4.0 tura ambiente. A reacção foi determinada por lavagem do substracto com água destilada.

Os resultados desta experiência mostraram que o PaF4 IVE8 se liga especificamente a um único antigeno com um peso molecular de 53.000 daltons numa preparação da membrana mais externa. Os resultados do ensaio de imunofluorescência indirecta e de imunocoloração demonstraram que o PaF4 IVE8 se liga com os flagelos de P. aeruginosa.

tipo dos flagelos que são reconhecidos pelo PaF4 IVE8 foi determinado por ELISA. Ligou-se cada uma das estirpes de 1 a 12 (A.T.C.C. IK 33348 - 33359) às cavidades de placas microtituladores de 96 cavidades (limbro) com PLL e os ensaios ELISA realizados como se descreveu previamente neste exemplo. A fonte do anti-corpo PáF4 IV38 foi o sobrenadante de cultura. As reacções positivas foram verificadas em cavidades que continham estirpes Habs 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 e 12, indicando portanto que 0 anti-corpo Pá? 4 IVE8 se liga a flagelos do tipo B. Os dados de protecção in vivo são apresentados a seguir no exemplo 4.

Exemplo 3 exemplo 3 descreve a metodologia para a preparação de uma linha de células de hibridoma murina que produz um anti-corpo monoclonal que reage com os flagelos do tipo A de P. aeruginosa, que tem, portanto, uma acção protectora in vivo.

A fonte de células linfoides para a fusão consistiu num baço proveniente de murganhos 3alb/c imunizados que tinham sido injectadas quatro vezes por via intraperitonial, durante um período de seis semanas, com flagelos do tipo A purificados (10-20 jug de proteína) de estirpes Habs 6 e (A.T.C.C. N2_S. 33353 e 33355).

Os flagelos purificados de acordo com o método de T.C. Llontie et al, (1932, Infect. Immun., 35 : 281 - 288, que é aqui citada como referência) com a diferença de que a centrifugação final dos flagelos foi a uma velocidade de 100.000 x g durante uma hora em vez de 40.000 x g durante três horas. Uma segunda modificação adoptada para alguns processos foi cortar os flagelos da bactéria de preferência durante 30 segundos num misturador em vez de durante três minutos. (Allison et al., Infect. Immun., 49 : 770 - 774, 1985).

As concentrações de proteína de cada preparação foram determinadas com um ensaio de proteína Bio-Rad (Bio-Rad, Richmond, CA) e a presença de lipolissacâridos contaminantes (LPS) foi avaliada por medida do conteúdo em KDO (Karkhanis, Z.D., et al., Anal. Biochem., 85 : 595 - 601, 1978). Os pesos moleculares das’ proteínas flagelares foram determinadas por comparação da sua migração sm gel de poliacrilamido da SDS com a migração de marcadores de proteína padrão (BRL, vér exemplo 2). 0 peso molecular da flagelina 6 de Habs era de 51.700 daltons e da flagelina de Habs 8 era de 47.200 daltons. Estes valores estão de acordo co:;: os obtidos por J.3. Allison et al., (Infect. Immun., 49 : 770 - 774, 1985, que aqui se inclui como referência).

A fusão de esplenocitos de flagelina de murganhos imunizados e células de mieloma N3-1 foi realizada três dias após a última imunização, como descrito nos exemplos 1 e 2. Quando as células de hibridoma se desenvolveram aproximadamente para uma confluência de 40% (dia 7) os sobrenadantes da cultura foram replicados nas cavidades correspondentes de três placas diferentes de antigenos, PLL-ligada ao imunotipo 1 de Pisher de P, aeruginosa (para a preparação ver o exemplo 2) e ríabs 6 e Habs 9 fixados com formalina.

As bactérias para as placas de antigeno fixa das com formalina desenvolveram-se, lavaram-se e diluiram-se como descrito para a ligação PLL das placas de antigeno. As bactérias diluídas (D.O. 0,2 unidades a A 660) foram adicionadas a cavidades individuais (50 jul por cavidade) em placas microtituladoras de 96 cavidades Limbro e as placas foram em seguidas centrifugadas a uma velocidade de 1.200 x g durante 20 minutos à temperatura ambiente. Os sobrenadantes foram retirados das cavidades e adicionou-se a cada cavidade 75 pl de formalina a 0,2% v/v em PBS e incubou-se cada cavidade durante 15 minutos à temperatura ambiente. Depois de se retirar a formalina das cavidades, secaram-se as placas ao ar e guardaram-se à temperatura de 4°C até à sua utilização. A formalina não alterou a anti-genicidade dos flagelos como foi mostrado pela capacidade de enti-soros de anti-flagelos aglutinarem os organismos tratados com formalina (Lanyi, B., Acta Microbiol. Acad. Sei., Hung., 17 : 35 48, 1970). 0 imunotipo 1 de Pisher da estirpe de P. aeruginosa foi incluído como um controle porque esta estirpe não é flagelada como se mostra por uma coloração com um mordente (Manual of Clin. Microbiol., Lennette ed. Amer. Soc. Microbiol., ’,7ash., D.S., P. 1099, 1985). As células híbridas da cavidade designada por PAô IIG5 produziram um anti-corpo que se liga a Habs 6 e Habs 9 (ambas estirpes que incorporam flagelos do tipo A) mas não se ligaram com o imunotipo 1 de Fisher.

As células da cavidade EA. 6 IIG5 foram sub-cultivadas e clonadas como se descreveu nos exemplos anteriores. 0 anti-corpo monoclonal e a linha de células clonal des ta cavidade são ambos identificados pela designação FA6 IIG5 no texto que se segue. A ascite foi produzida em murganhos Balb/c como descrito no exemplo 2.

Especificidade de FAó IIG5

A especificidade do anti-corpo PAó IIG5 foi deteiminada por um ensaio de imuno-fluorescência indirecta, e por imuno-coloração. A imuno-fluorescéncia indirecta foi realizada essencialmente como descrito no exemplo 2 com as modificações seguintes.

As culturas bacterianas desenvolveram-se durante a noite em agar de soja tripticase à temperatura de 30°C e foram eliminadas das placas com algodão cariado e fez-se de novo a sua suspensão em PBS para uma AóóO de D.O. 0,2 unidades. Adicionou-se à suspensão formalina (em PBS a 0,37% v/v de concentração final), para a suspensão num vórtice. Após uma incubação a temperatura ambiente durante 15 minutos, as bactérias foram diluídas a 1 : 12 em PBS e 20 desta sus pensão foi colocada em cavidades individuais de placas Carlson. Após secagem as placas foram preparadas para visualização como descrito no exemplo 2. A fonte de anti-corpo consis- 44 - k___ / / tiu num sobrenadante de cultura da linha de células FAó IIG5.

A coloração fluorescente do anti-corpo FA.6

IIG5 foi observada apenas na estirpe de P. aeruginosa que incorporava um flagelo do tipo A e em nenhuma das estirpes que incorporam flagelos do tipo B. 0 esquema de fluorescência observado consistia numa linha sinusoidal que indicava que o anti-corpo PA6 IIG5 se ligava com os flagelos. 0 sinal fluorescente foi reforçado mediante tratamento da bactéria com formalina mas o tratamento não era requerido para visualizar a coloração flagelar com o anti-corpo.

A imunocoloração foi realizada como descrito no exemplo 2. As fontes de antigénio de flagelos do tipo A foram preparações flagelares purificadas (ver este exemplo). Os antigenos foram separados em geles de poliacrilamida a 10% contendo SDS (Kaemmli, U.K., Nature /London7 227 : 680 - 685, 1970) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. Piz£ ram-se reagir as preparações de ?A6 IIG5, ou sobrenadantes da cultura ou ascite diluída a 1 : 1000, com a membrana de nitro celulose e a reacção foi detectada com um reagente conjugado com enzima apropriado e substracto de enzima, como descrito no exemplo 2. A imunocoloração demonstrava que Fâj6 IIG5-se liga especificamente a flagelina de peso molecular 51.700 de Habs 6 e flagelina de peso molecular de 47.200 de Habs 8.

A confirmação de que o FA6 IIG5 reage apenas com os flagelos do tipo A e não com os flagelos do tipo 3 foi obtida por meio de ELISA em que estirpes Habs 1-12 se ligaram individualmente com PLL nas cavidades das placas microtituladoras de 96 cavidades Limbro. 0 anti-corpo ligado apenas às

- 45 estirpes 1, 6, 8 e 9, de Habs que são as únicas estirpes de entre as doze que possuem flagelos do tipo A (vêr, Ansorg,

R., et al, J. Clin. I.iicrobiol, 20 í 84 - 88, 1984, que aqui é incorporado como referência). Os estudos de protecção in vivo são apresentados no exemplo 4 seguinte.

Exemplo 4 exemplo 4 descreve a protecção de murganhos imunizados passivamente com an^i-corpo PaE4 IVE8 e FA6 IIG5 contra a inoculação com P. aeruginosa em murganhos de experiência queimados.

Os anti-corpos monoclonais anti-flagelos fo ram ensaiados em murganhos de experiência queimados de acordo com o método de M.S. Collins e R.E. Roby (J. Trauma, 23 : 530 - 534, 1983, que aqui é incorporada como referência). Pa ra os ensaios de protecção todos os anti-corpos foram purifi cados por cromatografia em sefarose A da proteína (3y, P.L., et al., Immunochemistry, 15 : 429 - 436, 1978, que aqui é in corporada como referência) e iializada com tampão de PBS. A estirpe que transportava o flagelo do tipo A utilizada nos ensaios com animais foi a P. aeruginosa PA 220 (proveniente do Dr. James Pennington, Boston, 1IA) e a estirpe com flagelos do tipo B tinha a referência do imunotipo 2 de Fisher de P. aeruginosa (A.T.C.C. N2. 27313).

Quarenta microgramas de anti-corpo monoclonal purificado foi administrado por via endovenosa a cada murganho uma a duas horas antes de se queimarem e de se inocularem. Imediatamente após a queimadura os animais recebe- 46 ram 0,5 ml de P33 arrefecido que continha a bactéria de inoculação. À dose de inoculação foi aproximadamente dez vezes a DL^q para cada organismo. Os resultados ios ensaios em ani mais são apresentados nos Quadros I e II.

Quadro I. Estudo de protecção do anti-corpo monoclonal anti-flagelos do tipo A em murganhos de experiên (1) cia queimados ρ Percentagem de sobreviventes por dia

Tratamento	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Anti-flagelos a, FA6 IIG5	100	100	100	100	100	90	90	80	80
Anti-flagelos b, PaF4 IVB8	100	20	10	10	10	10	10	10	10
Anti-corpo não específico anti-LPS monoclonal	100	40	30	20	10	10	10	10	10
PB3, sem bactérias	80	80	80	30	80	80	80	80	80

> ------------------------------------------------------------------------------------------------------

1. Os murganhos foram inoculados com dez vezes a DL^q aproximadamente de P. aeruginosa PA220. ’

2. A percentagem foi fundamentada na sobrevivência de murganhos em grupos de dez animais com a excepção do grupo de controle que apenas recebeu P33 e que consistia em cinco murganhos. Os lias sao posteriores à queimadura e inocula ção.

- 4⁷ Quadro II. Estudo de protecção do anti-corpo monoclonal anti-flagelos tipo B em murganhos queimados de .1 experiencia

Percentagem de sobreviventes por dia

Tratamento	1	2	3	4	5	6	7	8	9
Anti-flagelos b,
Pa?4 IVE8	100	100	90	90	90	90	90	90	90
Anti-flagelos a,
FA6 IIG5	100	20	10	10	10	10	10	10	10
Anti-corpo não específico anti-LPS monoclonal	100	20	20	20	20	20	20	20	20
PBS, sem bactérias	100	100.	100	100	100	100	100	100	100

Os murganhos foram inoculados ccm.dez ^zes a aproxima-

damente do imunotipo 2 de Fisher de P. aeruginosa.

2. A percentagem de sobrevivência foi baseada no número de murganhos que sobreviveram por cada grupo de dez com a excepção do grupo de controle que recebeu apenas P3S e que consistia em cinco murganhos. Os dias são posteriores à queimadura e inoculação.

Uma sobrevivência deveras significativa foi observada nos murganhos que foram tratados com o anti-corpo anti-A ou com o anti-corpo anti-3 e em seguida inoculados com o correspondente antigeno. Inversamente, 80% a 90% dos animais não-tratados mas inoculados ou animais tratados com um anti-corpo monoclonal anti-flagelar errado ou não específico para anti-LPS morreram. A incapacidade do anti-corpo anti-flagelo do tipo A para proteger os murganhos da inoculação letal de flagelos do tipo 3 transportados pela P. aeruginosa do imunotipo 2 de Pisher e a incapacidade de o anti-corpo anti-flagelos do tipo B para proteger os murganhos da inoculação letal de uma P, aeruginosa PA220 com flagelos do tipo A corroborou a especificidade in vivo dos anti-corpos que se tinha observado in vitro. Os murganhos queimados sobreviventes não infectados indicam que a queimadura só por si não é letal.

Exemplo 5 exemplo 5 demonstra extensivamente a reactividade cruzada de isolados clínicos de P. aeruginosa Pa?4 IVE8 e PA6 IIG5 que indicam a utilidade clínica destes anti-corpos na imunoterapia das infecçoes por P. aeruginosa.

Estes isolados clínicos foram obtidos de hospitais e de clínicas. Estes isolados eram provenientes de uma variedade de locais, incluindo sangue, feridas, trato respiratório, urina e orelhas. Um total de 157 isolados foram examinados.

Ligou-se PaP4 IVE8 especificamente a 34 iso- 49 /

lados clínicos, 22%, enquanto que, o anti-corpo do flagelo do tipo A j?A6 1115 se ligou a 102 isolados clínicos, 65%, num total de 136 dos 157 isolados (87%). Das 21 estirpes que não foram reconhecidas por qualquer dos anti-corpos, 19 eram estirpes não flageladas como ficou demonstrado por coloração com um mordente. Portanto, ambos os anti-corpos em associação ligaram-se a 136 de 138 de isolados clínicos flagelados, 93%, o que confirma os relatórios anteriores (ver, R. Ansorg, Zbl. Bakt, Hyg., I Abt. Orig, A, 242 : 228 - 238, 1978, que

I aqui se incorpora como referência).

Exemplo 6 exemplo 6 descreve métodos para a produção de anti-corpos monoclonais humanos que se ligam a P. aeruginosa com flagelos do tipo B.

Amostras de sangue periférico de indivíduos imunizados com uma preparação polissacarídica de peso molecular elevado (Pier et al., Infect. Immun., 45 : 309, 1984), foi utilizada como fonte de células B. as células B mononucleares foram separadas do sangue por técnicas de centrifugação padrão em Ficoll-Paque (Boyum Scand. J. Clin. Lab. Invest., 21 : 77, 1968), e lavadas duas vezes com tampão de cloreto de sódio com fosfato isento de magnésio e cálcio (PB3).

As células mononucleares foram desprovidas de células 1, utilizando-se um processo modificado de E-Roset. ting. Rapidamente primeiro, fez-se de novo a suspensão das células para uma concentração de 1 x 10 células por ml em PB3 que continha 20$ de soro fetal de vitela (?C3) à tempera tura de 4°C. Um ml desta suspensão foi em seguida colocado em tubos de fundo redondo de polistireno de 17 x 100 mm aos quais se adicionou glóbulos vermelhos de carneiro tratados com brometo de 2 amino-isotio-urônio provenientes de uma solução em meio de Dulebcco modificado por Iscove a 10% v/v, meio de Iscove, (Liadsen, and Johnson J. Immun. Methods, 27 : .’61, 1979). A solução foi misturada muito cuidadosamente durante 5 a 10 minutos à temperatura de 4°C, e as células S-Rosetted em seguida eliminadas por centrifugação em meio Ficoll-Paque durante 8 minutos com uma velocidade de 2.500 x x g à temperatura de 4°C. Os glóbulos mononucleares de sangue periféricos 3-Rosette negativos (E“ PBMC) que se ligaram na inter-fase foram recolhidos e lavados uma vez com meio de Iscove e fez-se de novo a sua suspensão no mesmo meio contendo 15% v/v de PG3, L-glutamina (2 mmol por litro) 100 UI por ml de penicilina, 100 jug por ml de estreptomicina, 1 x 10^M de hipoxantina, 4 x 10M de aminopterina, e 1,6 x 10M de timidina . Este meio será referido posteriormente como meio-HAT.

As células provenientes da transformação de E PBMC foram completadas por co-cultura destas células com uma linha de células transformante. A linha de células transformante era o antigeno nuclear Epstein-Barr (ΕΒ1ΊΑ) derivado de uma linha de células linfoblastóides humanas positivas por mutagénese com metano-sulfonato de etilo (3MS) de uma linha de células linfoblastóides de 1500 GM seguida de selecção na presença de 30 jug por ml de 6-tioguanina para tornar as células deficientes em hipoxantina-guanina fosforibosil transferase (HGPRT) e portanto sensíveis a HAT. Esta linha de células foi denominada linha de células 1 a 2 e foi depositada na American Type Gulture Gollection (A.2.C.C.) em 29 de Março de 1932, sob o número de depósito da A.T.C.C.

CRL 8119. As células 1 a 2 na fase de crescimento logarítmico foram suspensas em meio HAT e em seguida associadas com células E“ P31IC numa proporção de quinze células de 1 a 2 por cada PBMG. A mistura de células foi colocada em trinta placas microtituradoras de 96 cavidades de fundo redondo (Gostar 3799) com uma concentração de 32000 células por cavidade num volume de 200juL por cavidade e incubadas à temperatura de 37°C numa atmosfera húmida que continha cerca de 6% de dióxido de carbono.

As culturas foram alimentadas nos dias 5 e após colocação em placas por substituição de metade do sobrenadante com meio HAT recente. Dezasseis dias após a colocação em placas, 100% das cavidades continham células em pro. liferação e a maior parte das células das cavidades que possuíam uma densidade suficiente para se removerem e ensaiarem os sobrenadantes relativamente aos anti-corpos de P, aeruginosa.

Os sobrenadantes foram sondados para a presença de anti-corpos anti-P. aeruginosa utilizando-se a técnica de ELISA como descrito no exemplo 2 com as modificações seguintes.

Um conjunto de sete estirpes de referência do imunotipo de Fisher (A.T.C.C. H2 27312 - 27318) ( com uma densidade óptica ^ΑββΟ = 0,2 unidades), foram ligadas a pia >2 / cas microtituladoras de 96 cavidades de fundo plano (Immulon II, Dynatech) prê-tratadas com poli-L-lisina, incubadas e la vadas como se descreveu no exemplo 2. Após bloqueamento os sítios de ligação não específicos e lavagem das placas, adicionou-se a 50 yil de PBS que continha 0,1% v/v de Tween 20 e 0,2% (p/v) de BSA por cada cavidade.

Os sobrenadantes da cultura, 50 jfL, foram em seguida novamente colocados nas cavidades correspondentes das placas de ensaio e em placas de controle que tinham sido tratadas com PLL e bloqueadas, mas que não continham bactérias. Após incubação e lavagem adicionaram-se anti-corpos do segundo passo conjugado ao enzima (50 ml por cavidade), anti IgG humano e anti IgM humano conjugados com peroxidase de rá bano, na cabra, diluída de um modo conveniente em PBS que continha 0,1% v/v de Tween 20 e 0,2% p/v de BSA nas cavidades e o ensaio completado, como se descreveu no exemplo 2.

Os sobrenadantes que continham anti-corpo que se ligavam ao conjunto dos imunotipos de Fisher mas que não se ligava nas placas de controle, foram ensaiados uma segunda vez utilizando-se cada um dos sete imunotipos de Fisher da bactéria de modo individual. 0 anti-corpo presente no sobrenadante de uma cavidade, 20H11, ligou-se apenas com os imunotipos 2, 6 e 7 de Fisher de P. aeruginosa. As células foram sub-cultivadas repetidamente a densidades celulares baixas decrescentes até que todas as cavidades representassem desenvolvimento e segregação do anti-corpo. A linha de células e o anti-corpo monoclonal (isotipo Igjã) são ambos identificados pela designação 20H11 no texto seguinte.

- 53 / Foi realizada uma segunda transformação em que a fonte de células B consistiu em sangue periférico de um doente com fibrose cística comprovada como posssuindo uma infecção de P, aeruginosa crónica. As células E“ PBMC foram preparadas como se descreveu anteriormente e co-cultivadas com uma linha de células transformantes 1 a 2 numa proporção de 72 células 1 a 2 por células 3~PBMC. A mistura de células foi colocada em quinze placas microtituladoras de 96 cavidades de fundo redondo numa concentração de 7,4 x 10 células por cavidade e cultivadas como anteriormente.

Os sobrenadantes foram analisados por ELISA .

para a presença de anti-corpos anti-P. aeruginosa dezasseis dias após a transformação ter sido colocada em placas. 0 ensaio foi realizado como se descreveu para a transformação prévia, excepto no facto do conjunto de estirpes de P, aerugi nosa utilizada para a sondagem inicial ser constituída por as estirpes de referência dos imunotipos de Pisher, F2, F4, 36 e F7, correspondentes aos números da A.T.C.C. 27313, 27315, 27316 e 27317, e três dos isolados clínicos serem pro venientes da Genetic Systems Corporation Organism Bank (GSCOB) que tinham diferentes imunotipos de LPS e de flagelos. 0 isolado clínico PSA 1277 (GSCOB) era portador de flagelos do tipo A,e LPS do imunotipo 1 de Fisher; 0 segundo isolado PSA G98 (GSCOB) era portador de flagelos do tipo A e de LPS do imunotipo 3 de Pisher; e o terceiro, PSA 3G25 (GSCOB), transportava flagelos do tipo B e LPS do imunotipo 5 de Pisher. Eêj ta mistura de estirpes de referência e de isolados clínicos será referido como conjunto de P. aeruginosa flagelada. Os

- q²*· / sobrenadantes que continham o anti-corpo que se ligou às placas que continham o conjunto de P, aeruginosa flagelada, mas que não se ligou às placas de controle revestidas com PLL, foi analisado por ELISA uma segunda vez nas estirpes individuais do conjunto. Uma cavidade, 3C1, ligou-se com as estirpes de referência F2, ?6 e ?7 e com o isolado clínico F625.

A clonagem da linha de células 3C1 foi realizada primeiro por sub-cultura das células em duas fases de sub-cultura de densidade baixa, primeiro com 20 células por cavidade de placas de 96 cavidades seguida de cultura com 2 células por cavidade.

A clonagem formal das células que produziam o anti-corpo foi realizada por colocação em placas das células com uma densidade de cerca d.e uma célula por cavidade em placas de 72 cavidades Terasaki (Nunc Ρ 1 - 36538) com um volume de 10 jul por cavidade de meio HAT isento do componente aminopterina (meio-HAT). As placas foram colocadas num incubador durante 2 a 3 horas para permitir que as células se acomodassem ao fundo das cavidades e em seguida foram classificadas microcopicamente para as cavidades que continham uma única célula. As cavidades foram alimentadas diariamente com o meio - ΙΊΤ e quando o desenvolvimento era suficiente transferidas para placas de 96 cavidades de fundo redondo. Todas as cavidades com crescimento foram analisadas por ELISA para as estirpes de P. aeruginosa que incorporavam flagelos do tipo B e todas se encontraram como produzindo o anti-corpo apropriado. A linha de células e anti-corpo monoclonal (do isotipo IgM) são ambas identificadas pela designação 3C1 no

texto que se segue.

antigénio identificado por 20H11 e 3C1 era flagelo como se mostra por imunofluorescência indirecta e imunocoloração. As técnicas foram realizadas basicamente como se descreve nos exemplos 2 e 3. Para o ensaio de imunofluorescência indirecto das estirpes de P. aeruginosa que incorporam os flagelos do tipo B que produzem imunotipos de Fisher de referência F2, Fó e F7 (A.T.C.C. IT2s, 27313, 27317 e 27318) e uma estirpe que transporta o flagelo do tipo A do imunotipo de Fisher referência 4 (A.T.C.C. NQ 27315), foram preparadas como se descreveu no exemplo 3. Os tipos de flagelos das estirpes de referência foram determinados por tipi ficação com anti-corpos monoclonais murinos PaF4 IVE8 e FAó IIG5» As lâminas foram preparadas para visualização como se descreveu no exemplo 2. As origens de ambos os anti-corpos foram sohrenadantes de cultura e o reagente conjugado com FITC era anti-Ig humano conjugado com FITC, na cabra, (polivalente) (Tago, Burlingame, CA), diluída a 1 : 100 em PBS que continha 0,5% de gama globulina bovinas p/v (Miles Scientific, Cat. 82-041-2, Naperville, IL) e 0,1% de azida de sódio p/v como conservante.

A fluorescência dos anti-corpos 20H11 e 3G1 foi observada apenas com estirpes de P, aeruginosa que incorporavam flagelos do tipo B e não com estirpes que incor poravam flagelos do tipo A do imunotipo 4 de Fisher de referencia. 0 esquema de fluorescência observado consistia numa linha sinusoidal emitida de uma extremidade da bactéria o que indicava que os anti-corpos se ligavam aos flagelos da

- 56 bactéria.

A imunocoloração foi realizada como se descreveu no exemplo 2. Flagelos do tipo B purificados provenientes de estirpes de referência de P. aeruginosa do imunoti po 2 de Fisher (A.T.C.C. 27313), e flagelos purificados do tipo A provenientes de estirpes Habs 6 e Habs 8 (A.T.C.C. N2s. 33353 e 33355) foram preparados como se descreveu no exemplo 3· Os antigenos foram separados em gel de poliacrilamida a 10$ (ver o exemplo 3) e transferidos para uma membra na de nitrocelulose. Os sobrenadantes da cultura que continham anti-corpos 20H11 ou 3C1, sobrenadante da cultura que continha um anti-corpo humano não específico e meio de cultu ra foram incubados com a membrana de nitrocelulose e a reacção detectada com anti-Ig humana conjugada com fosfatase alcalina, na cabra, (polivante) (Tago, Burlingame, CA) diluído em PBS que continha 0,05$ de Tween 20 v/v. 0 substracto de enzima foi preparado como se descreveu no exemplo 2. A imuno coloração demonstrou que ambos os anti-corpos se ligavam à proteína de flagelina com 53 000 de peso molecular do imunotipo 2 de Pisher e não se ligava à proteína de flagelina com 51.700 de peso molecular de Habs 6 ou de peso molecular de 47.200 de Habs 8. Não foi observada qualquer reacção com o anti-corpo humano nao específico ou com o meio de cultura.

A posterior confirmação de que os anti-corpos 20H11 e 3C1 se ligavam apenas aos flagelos do tipo B e não aos flagelos do tipo A foi obtida por BLISA, em que as estirpes Habs de 1 a 12 foram ligadas individualmente com PLL às cavidades de placas microtituladoras de 96 cavidades

Immulon. Os anti-corpos ligaram-se apenas às estirpes Habs 2, 3, 4, 5, 7, 10, 11 e 12, que eram estirpes portadoras de flagelos do tipo B (Ansorg et al., J. Clin. Microbiol., 20 : .*84, 1984).

Exemplo 7 exemplo 7 descreve métodos para a preparação de anti-corpo monoclonal humano que se liga a P. aeruginosa com flagelos do tipo A.

Uma amostra de sangue periférico proveniente de indivíduos imunizados com uma preparação polissacarídi ca de elevado peso molecular (Pier et al., Infect. Immun., 34 í 461, 1981) serviu como fonte de células B. As células mononucleares foram separadas do sangue e em seguida elimina das as células T como se descreveu no exemplo 6. As células foram em seguida congeladas em FCS que continha 10^ de dimetil sulfóxido num tanque de vapor de azoto líquido. Huma data posterior as células foram descongeladas rapidamente â temperatura de 37°C, lavadas uma vez com o meio de Iscove e fez-se de novo a sua suspensão em meio HAT. A transformação derivada das células foi completada por co-cultura de EPBMC com células 1 a 2 numa proporção de trinta células 1A2 por cada célula EPBLiC. A mistura de células foi colocada em trinta placas de cultura de tecidos de 96 cavidades com uma concentração de 62.000 células por cavidade. As culturas foram alimentadas após sete dias de colocação em placas e substituído metade do volume de células foi observada em 100;5 das cavidades no dia catorze após a colocação em placas, e os so_ -8 _

-ζ brenadantes foram removidos das cavidades e analisados neste momento.

Os sobrenadantes foram analisados por ELISA para a presença de anti-corpos anti-P, aeruginosa utilizando-se um conjunto de P. aeruginosa flagelada e placas trata das com PLL como um controle como se descreveu no exemplo 6. Os sobrenadantes que continham anti-corpos que se ligaram ao conjunto flagelado mas que não se ligaram às placas PLL foram analisados novamente para as estirpes de bactérias individuais do conjunto flagelado. Uma cavidade, 2138, continha um anti-corpo que se ligou a PSA 1277, PSA G98 e ao imunotipo 4 de Pisher de referência que são as três estirpes do con junto flagelado que transportam os flagelos do tipo A.

A clonagem da linha de células 21B8 foi rea lizada como se descreveu no exemplo 6 para a linha de células 3C1 com as modificações seguintes nas fases de clonagem formal. Depois das cavidades das placas Terasaki serem inve_s tigadas para a presença de somente uma célula simples, cada célula foi transferida da placa Terasaki para uma cavidade individual de uma placa de cultura de 96 cavidades de fundo redondo com um volume de 100 /11 de meio HAT isento do componente aminopterina (meio-HT). Poram incluídas em todas as cavidades células linfoblastóides sensíveis a HAT, não-tranjs formadas com uma densidade de 500 células por cavidade como meio de alimentação. Cinco dias após a colocação em placas adicionou-se 100 p.1 de meio HAT para matar selectivamente as células de alimentação. As cavidades foram novamente alimentadas nos dias 7 e 9 após plaqueamento por substituição de

metade do sobrenadante com um meio HAT. 3m seguida as células foram alimentadas com meio HT até que as células apresen tassem uma densidade suficiente para se detectar por meio de 3LISA a presença do anti-corpo. Todas as cavidades com desen volvimento produziram um anti-corpo que se ligou a flagelos do tipo A transportados por estirpes de P. aeruginosa. A linha de células e o anti-corpo monoclonal (do isotipo IgGl) são ambas identificadas pela designação 2138 no texto seguin te.

antigeno identificado por 21B8 consistia num flagelo como ficou demonstrado por ensaios de imunofluorescência indirecta e imunocoloração (ver o exemplo 6 para a descrição das técnicas).

A fluorescência do anti-corpo 21B8 foi observada apenas com o imunotipo 4 de Fisher da estripe de referência de P. aeruginosa (A.T.C.C. 1TS 27315), que incorpora o flagelo do tipo A e não com o imunotipo 2 da estirpe de referência de P. aeruginosa (A.T.C.C. N2 27313) que transporta o flagelo do tipo A. 0 esquema de fluorescência . observado consistia numa linha sinusoidal que era emitida por uma extremidade da bactéria o que indicava que o anti-corpo se liga ao flagelo da bactéria.

A imunocoloração foi. realizada como se descreveu no exemplo 2. Os flagelos do tipo A purificados prove nientes da estirpe de referência de P. aeruginosa Habs 6 (A.T.C.C. iTS 33353) e os flagelos purificados do tipo 3 da estirpe de referência de P. aeruginosa do imunotipo 2 de

Fisher (A.T.C.C. N2 27313) foram preparados como se descre- 60 ,fi f

Á (

veu no exemplo 3, Os antigenos foram separados em gel de poliacrilamida a 10%, ver exemplo 3, e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. Os sobrenadantes da cultura que continham o anti-corpo 2138 ou um anti-corpo humano não esp.e cifico e um meio de cultura foram reagir com a membrana de nitrocelulose e a reacção foi detectada com anti-Ig humana conjugada com fosfatase alcalina, na cabra, (polivalente) e substracto de enzima como descrito nos exemplo 2 e 6. A imunocoloração demonstrou que o anti-corpo 2138 se liga apenas a proteína flagelina de peso molecular 51.700 de Habs 6 e não se liga com a flagelina de peso molecular 53.000 do imunotipo 2 de Fisher. Não se observou qualquer reacção com o anti-corpo humano não específico ou com o meio de cultura.

Exemplo 8

O exemplo 8 demonstra a protecção de murganhos passivamente imunizados com anti-corpos anti-flagelos, 20H11, 301 e 2138, contra a inoculação com P. aeruginosa em murganhos queimados. Os anti-corpos monoclonais anti-flagelos humanos foram ensaiados com murganhos de experiência queimados (vér exemplo 4).

Os anti-corpos 2138 e 20H11-foram preparados por precipitação dos sobrenadantes da cultura provenientes das respectívas linhas de células com sulfato de amónio (concentração final de 50%) (Good et al., Selected Methods in Cellular Immunology, Mishell, 3.3., and Shiigi, S.L·'., eds., W.J. Freeman & Co., San Francisco, Ca, 279 - 236, 1980). 0 precipitado foi solubilizado em PBS, dializado com

PBS durante a noite à temperatura de 4°C e em seguida submetido a filtração estéril antes da administração nos animais. Neste ensaio a fonte do anti-corpo 3C1 e o anti-corpo anti-LPS nao específico utilizado como controle negativo consistia numa cultura de sobrenadante. Como controle positivo para cada ensaio utilizou-se anti-corpo monoclonal murino puri ficado apropriado, PaP4 IVS8 ou PA6 IIG5.

A estirpe que transportava os flagelos do tipo A utilizada nos ensaios com os animais consistia no iso * lado clínico PSA A522 (GSCOB), que exprime LPS do imunotipo de Pisher e a estirpe era proveniente de um isolado clínico PSA A447 (GSCOB), que exprime LPS do imunotipo 6 de Pisher.

Os anti-corpos humanos, 0,45 ml, foram pré-misturados com a bactéria (mais do que 5 vezes a em

0,05 ml) e inoculados imediatamente após a queimadura. Os resultados dos ensaios com os animais estão apresentados nos Quadros III, IV e V.

- C2

Quadro III. Estudo de protecção de anti-corpo monoclonal anti-flagelos do tipo A humanos em murganhos de ensaio queimados .

Percentagem de sobreviventes por dia

Tratamento	1	2	3	4	5	6	7	8	9
PA6 IIG3 anti-flagelos a, murino	100	100	100	100	88	88	88	88	88
21B8 anti-flagelos a, humano	100	100	100	100	100	100	100	100	100
20H11 anti-flagelos b, humano	100	0	0	0	0	0	0	0	0
PBS	100	25	12	12	12	12	12	12	12

1. Os ratos foram inoculados com uma dose superior a 5 ^^OO de P. aeruginosa PSA A522.

2. A percentagem de sobrevivência é fundamentada no número de murganhos que sobreviveram por cada grupo de oito animais, Os dias são posteriores à queimadura e inoculação.

3. 0 anti-corpo purificado, 100 pg em 0,45 ml de PBS, foi prê-misturado com a bactéria e administrado após queimadura e inoculação.

Quadro IV.

Estudo da protecção do anti-corpo monoclonal

20H11 anti-flagelos do tipo 3 humano em murganhos de ensaio queimados''·.

Percentagem de sobreviventes por dia

Tratamento	1	2	3	4	5	6	7	8	9
PaF4 IVE83 antiflagelos b, murinos	100	100	100	100	100	100	100	100	100
20H11 anti-flagelos b, humano	100	100	100	100	100	100	100	100	100
21B8 antiflagelos a, humano	100	0	0	0	0	0	0	0	0
Media	80	0	0	0	0	0	0	0	0

1. Os ratos foram inoculados com uma dose superior a 5 DL^qq de P. aeruginosa PSA A447.

2. A percentagem de sobrevivência é fundamentada no número de murganhos que sobreviveram por cada grupo de oito animais. Os dias são posteriores à queimadura e inoculação.

3. 0 anti-corpo purificado, 100 pg em 0,45 ml de PBS, foi pré-misturado com a bactéria e administrado após queimadura e inoculação.

2uadro V. 3studo de protecção do anti-corpo monoclonal 301 humano anti-flagelos do tipo 3 em murganhos queimados de ensaio^.

Percentagem de sobreviventes por dia

Tratamento	1	2	3	4	5	6	7	8	9
PaF4 IVB83 antiflagelos b, murino	100	100	100	100	100	100	100	100	100
301 anti-flagelos b, humano	100	100	80	80	80	80	80	80	80
Anti-corpo monoclonal anti-LPS não específico	100	0	0	0	0	0	0	0	0
1. Os ratos foram	inoculados com	uma	dose	superior	a 5	DL100

de P. aeruginosa P3A 447

2. A percentagem de sobreviventes è fundamentada no número de murganhos que sobreviveram por cada grupo de cinco animais.

Os dias são posteriores à queimadura e inoculação.

3. 0 anti-corpo purificado, 40 ^íg, foi administrado por via intravenosa duas horas antes da queimadura e inoculação.

/

I

Observou-se uma sobrevivência significativa com os murganhos que foram tratados com anti-corpo anti-flage los do tipo A ou com os anti-corpos anti-flagelos do tipo 3 e em seguida inoculados com o correspondente antigeno. Inversamente 88% a 100% dos murganhos inoculados mas não tratados ou dos murganhos tratados com um anti-corpo monoclonal anti-flagelar trocado ou com um anti-corpo anti-LPS não específico morreram. Como se observou com os anti-corpos monocloanis murinos (ver exemplo 4) os anti-corpos anti-flagelos humanos protegem especificamente contra a inoculação letal somente com os organismos que transportam o tipo de flagelo correspon dente, isto é, o anti-corpo anti-flagelo do tipo A humano pro. porciona protecção contra a inoculação letal com o flagelo do tipo A transportado pelo organismo e não com o flagelo do tipo B, e os anti-corpos anti-flagelos do tipo B protegeram os murganhos que foram inoculados com estirpes que transportavam flagelos do tipo B mas não com os organismos que incorporam os flagelos do tipo À.

Exemplo 9 exemplo 9 demonstra a reacção cruzada de anti-corpos anti-flagelos humanos 20H11, 3C1 e 2138 com isola dos clínicos de P. aeruginosa.

Obtiveram-se 115 isolados clínicos de

P. aeruginosa a partir de hospitais e clínicas e os isolados de queimaduras de primeira ordem e de sangue foram identifica dos como transportando flagelos do tipo A ou do tipo B por meio de tipificação com anti-corpos murinos monoclonais, J?Aó

IIG5 ou Pa?4 IV38 (ver os exemplo 2, 3 e 5), Cinquenta dos isolados clínicos foram identificados como apresentando flagelos do tipo A por meio da reacção com anti-corpo monoclonal murino FA6 IIG5 e 59 foram identificados como incorporando flagelos do tipo B por meio da reacção com o anti-corpo monoclonal murino PaF4 IVE8.

A reactividade cruzada de anti-corpos monoclonais humanos anti-flagelos do tipo A, 2138, foi extensiva no reconhecimento do anti-corpo para 54 dos 56 isolados clíI nicos com flagelos do tipo A (96%). A reactividade cruzada de 20H11 com isolados que incorporavam flagelos do tipo B foi tão extensa quanto o anti-corpo 2OH11 reconheceu todos os 59 isolados (100%). Em contraste, o anti-corpo monoclonal anti-flagelos do tipo 3, 301, ligou-se apenas com 43 dos 59 isola dos (73%)· Estes resultados demonstram que o anti-corpo 20H11 se liga a um epitope Pan reactivo (isto é, um epitope presente pelo menos em cerca ie 59% das estirpes de P. aeruginosa flageladas) enquanto que o anti-corpo 301 se liga a um epitope que não está presente em todas as moléculas de flagelina do tipo B. Ainda que o antigeno dos flagelos do tipo B seja serologicamente uniforme quando analisado com auti-soros poli clonais (Lanvi, 3., Supra, and Ansorg, R., Supra), os esquemas de reactividade cruzados de 20H11 e 301 mostram de um modo surpreendente que os flagelos do tipo 3 possuem pelo menos dois epitopes separados que podem ser identificados por anti-corpos monoclonais.

A reactividade cruzada extensa dos anti-corpos 2138 e 20H11 com os isolados clínicos de P. aeruginosa

- 6? indicam a utilidade clínica particular destes anti-corpos na imuno-terapia de infecções provocadas por P. aeruginosa.

Exemplo 10 exemplo 10 descreve métodos para a produção do outro exemplar de anti-corpo monoclonal humano que se liga a P, aeruginosa flagelada do tipo B assim como à protec, ção deste anti-corpo contra a inoculação com P> aeruginosa em murganhos queimados.

A linha de células transformada foi preparada e clonada essencialmente como descrito no exemplo 7, excepto no facto de que a mistura de células transformadas foi colocada em 20 placas de culturas de tecidos de noventa e seis cavidades com uma concentração de cerca de 2.250 células E“PBMC por cavidade. Os sobrenadantes foram inicialmente analisados por ELISA no conjunto flagelado como se descreveu no exemplo 7 excepto no facto de que os imunotipos 2 e 4 de Fisher das estirpes de referência não estavam presentes no conjunto. As cavidades positivas foram subsequentemente anali sadas para cada estirpe no conjunto flagelado que incluía os imunotipos 2 e 4 de Fisher. A linha de células uitimamente isolada e o anti-corpo monoclonal (do isotipo IgG) são ambos identificados pela designação 12Ώ7 no texto seguinte.

anti-corpo monoclonal 12D7 mostrou a extensa reactividade cruzada com anti-flagelos do tipo A, com isolados, que reconheceu 54 de 56 dos isolados clínicos que incorporavam flagelos do tipo  (96%). A actividade protectora do anti-corpo monoclonal 12D7 está representada no Quadro VI.

£8

Os estudos de protecção foram realizados essencialmente como se descreveu no Exemplo 4, excepto no facto de que a dose de inoculação foi de 1 DL^qq ^{e a} estirpe inoculada foi de 1624, um isolado clínico que exprime o LFS do imunotipo 2 de Fisher e flagelos do tipo A.

- 69 ~

Quadro VI. Estudo de protecção do anti-corpo 1207 monoclonal humano anti-flagelo do tipo A em murganhos queimados^ * 2 Percentagem de sobrevivência por dia

Tratamento 3	1	2	3	4	5	6	7	8	9
12D7 anti-flagelos a, humano	100	100	100	100	100	100	100	l—' o o	100
2H9 anti-Fisher 2 LPS, humano	90	90	90	90	90	90	90	90	90
11G5 anti-flagelos a, murinos	100	100	100	100	100	100	100	100	100
15F4 anti-flagelos b, humanos	100	37,5	25	25	25	25	25	25	25

► ------------------------------------------------------------------------------------------------------

1. Os murganhos foram inoculados com 1 x ^qoo ^50 UPC) de P. aeruginosa e 1624.

2. A percentagem de sobrevivência foi baseada no número de murganhos que sobreviveram por cada grupo de dez animais excepto para o grupo 15F4 que eram de II = 8. Os dias são posteriores à queimadura e inoculação.

3. 0 anti-corpo purificado, 50 ^g em 0,5 ml de P3o, foi administrado i.p. duas horas antes da queimadura e inoculação.

/

- 7ο -ί

Exemplo 11 exemplo 11 descreve a produção de anti-corpo monoclonal humano reactivo com flagelos do tipo 3 de Pseudomonas aeruginosa e a protecção de murganhos passivamente imunizados com este anti-corpo contra a inoculação com P, aeruginosa de murganhos queimados.

Uma linha de células transformada foi preparada e clonada essencialmente como se descreveu no exemplo 10 excepto no facto de que a proporção de transformação de células 1A2 para células 3 era de cerca de 60 para 1, e a mistura de células transformada foi plaqueada em quinze placas com uma concentração de cerca de 1930 S“PBMC por cavidade. Também as células foram analisadas num conjunto de estirpes de P, aeruginosa que compreendia G98 (imunotipo 3 de Fisher com flagelos do tipo A) e 1739 (um isolado clínico do imunotipo 5 de Fisher com flagelos do tipo B) e confirmada com um conjunto diferente de estirpes de P. aeruginosa : 1277, G98, 1739 θ os imunotipos F2, 34, F6 e 37 de Fisher. A linha de células isoladas ultimamente e o anti-corpo monoclonal segregado (isotipo IgGp são ambos referidos pela designação 238 no texto seguinte.

Um ensaio de imunofluorescência foi realiza do com 238 positivo em flagelos do tipo 3, estirpe do imunotipo 2 de Fisher, mas negativo com flagelos do tipo A, estirpe de referência do imunotipo 4 de Fisher. Cinquenta e nove isolados clínicos com. flagelos do tipo B evidenciaram resulta dos positivos ao ensaio do isolado clínico (100%).

A actividade protectora de 2B8 mostra-se no

- 71 Quadro VII. Os estudos de protecção foram realizados como se descreveu no exemplo 10, excepto no facto de que o isolado clínico era F164 (imunotipo 4 de Fisher, flagelos do tipo B) que se utilizou para inoculação.

- 7² Quadro VII. Bstudo de protecção do anti-corpo monoclonal humano 2B8 anti-flagelos do tipo B em murganhos de experiência queimados^ * 2

Percentagem de sobrevivência por dia

Tratamento	1	2	3	4	5	6	7	8	9
2383 antiflagelos b, | humanos	100	89	89	89	89	89	89	89	89
PáF4 IVB84anti-flagelos b, murino	100	100	100	100	100	100	90	90	90
VH34 anti- -Pisher 2 LPS, murino	90	20	20	20	20	20	20	20	20
1. Os murganhos foram	inoculados	com	l.DL	100 (105 WC)	de

P. aeruginosa F164.

2. A percentagem de sobreviventes foi fundamentada no número de murganhos que sobreviveram por cada grupo de dez animais excepto no grupo de 2B8 que era N = 9. Os dias são posteriores à queimadura e inoculação.

3. 0 anti-corpo purificado, 50 jug em 0,5 ml de PBS, foi administrado i.p. duas horas antes da queimadura e da inoculação.

4. 0 anti-corpo purificado, 5 pg em 0,5 ml de PBS, foi administrado i.p. duas horas antes da queimadura e inoculação.

Exemplo 12 exemplo 12 demonstra a produção de um outro anti-corpo monoclonal humano reactivo com flagelos do tipo 3 de P. aeruginosa e a protecção de murganhos imunizados passivamente com este anti-corpo contra a inoculação com P. aeruginosa em murganhos de experiência queimados.

Uma linha de células transformada foi prepa rada e clonada como essencialmente descrito no exemplo 7, com as seguintes excepções. Utilizou-se como fonte de células B um indivíduo diferente e imunizado (Pier et al., 45 : 309, 1984) e a taxa de colocação em placas de 3PBMC foi de cerca de 2.000 células por cavidade. A sondagem foi realizada em imunotipos de 1 a 7 de Pisher reunidos. A linha de células isolada ultimamente e o anti-corpo monoclonal segregado (isotipo IgG-|_) são ambos referidos pela designação 1401 nos textos seguintes.

ensaio clínico de 59/59 (100?o) dos isolados com flagelos do tipo B permitiu resultados positivos com 1401. Os estudos de protecção foram realizados como se descre veu no exemplo 11 anterior e mostrara-se no Quadro VIII.

Quadro VIII. Estudo de protecção do anti-corpo monoclonal humano 1401 anti-flagelos do tipo 3 em murganhos queimados^

A O

Percentagem de sobrevivência por dia

Tratamento 1 2 3 4 5673 9

1401 anti-flagelos b, humanos	100	100
Pa?4 IVE8 anti- -flagelos b, murino s	100	100
VH3 anti-
-Fisher 2
LPS, humanos	100	40

100 100 100 90 90 90 90

100	100	100	100	100	100	100
20	20	20	20	20	20	20

1. Os murganhos foram inoculados com I.DL^qq (90 UFC) de

P. aerugino sa F164.

2. A percentagem de sobreviventes está baseada no número de murganhos que sobreviveram por cada grupo de 10 animais excepto no grupo Pai’4 IV38 em que 1T = 9. Os lias são posteriores à queimadura e inoculação.

3. 0 anti-corpo purificado, 50 jig em 0,5 ml de PBS, foi administrado i.p. duas horas antes da queimadura e inoculação.

Da exposição anterior, notar-se-á que as linhas de células da presente invenção proporcionam meios para a produção de anti-corpos monoclonais e seus fragmentos que reagem com flagelos de P, aeruginosa e que têm protecção cruzada contra várias estirpes de P. aeruginosa. Surpreendentemente, o número de anti-corpos monoclonais que foram isolados são reactivos com diferentes epitopes em cada tipo de fia gelo. Os anti-corpos da presente invenção permitem a preparação de composições profiláticas e terapêuticas produzidas de I um modo mais económico e fácil contra infecções provenientes de estirpes de P. aeruginosa. Além disso, as linhas de células proporcional anti-corpos que encontram utilidade em imunoensaios e outros processos convencionais conhecidos.

Ainda que a presente invenção tenha sido descrita com algum detalhe por meio de ilustração e exemplos, para fins de clareza e compreensão, é óbvio que certas altera ções e modificações que podem ser praticadas estão abrangidas pelas reivindicações apensas.

Claims (32)

1. REIVINDICAÇÕES

   1Processo para a preparação de composições farmacêuticas utilizadas como agentes para prevenir ou tratar infecçoes originadas por Pseudomonas aeruginosa, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de pelo menos dois anticorpos monoclonais, como ingrediente activo cada um deles capaz de reagir especificamente com um tipo diferente de proteína flagelar de Pseudomonas aeruginosa, com veículos ou diluentes aceitáveis em farmácia.
2. 2.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de se utilizar, como ingrediente activo, pelo me-7⁷~ ncs um anticorpo monoclonal humano.

   í .*»
3. 3.- Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do pelo facto de se utilizar ainda como ingrediente activo, pelo menos um anticorpo monoclonal humano capaz de reagir com pelo menos um serotipo determinante de uma molécula lipopolissacarídica de Pseudomonas aeruginosa e/ou um anticorpo monoclonal reactivo com exotoxina A.
4. 4. - Linha de células caracterizada pelo facto de produzir um anticorpo monoclonal capaz de reagir especificamente com flagelas do tipo a ou flagelas do tipo b de Pseudomonas aeruginosa.
5. 5. - Linha de células de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo facto de o anticorpo monoclonal proteger contra a Pseudomonas aeruginosa in vivo.
6. 6. - Linha de células de acordo com a reivindicação 5,caracterizada pelo facto de ser uma linha de células híbridas.
7. 7. - Linha de células de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo facto de produzir anticorpos monoclonais humanes.
8. 8. - Linha de células de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de ser uma linha de células de entre as

   -78designadas sob os números de aceitação HB9129, HB9130 ou

   CRL9300 e CRL9301, na ATCC.
9. 9. - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais específicos para proteínas flagelares de Pseudomonas aeruginosa utilizadas como agentes para impedir ou tratar infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa, caracterizado pelo facto de se cultivar pelo menos uma linha de células de acordo com a reivindicação 8 e de se recuperar os referidos anticorpos.
10. 10. - Anticorpo monoclonal ou um seu fragmento reactivo, caracterizado pelo facto de reagir com um epitope capaz de se ligar a um anticorpo produzido de acordo com a reivindicação 9.
11. 11. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de um anticorpo monoclonal humano, especificamente reactivo com um epitope presente nas flagelas de Pseudomonas aeruginosa, como ingrediente activo, com um ou mais veículos ou diluentes aceitáveis em farmácia.
12. 12. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o epitope pertencer a flagelas do tipo a ou a flagelas do tipo b, mas não a ambos.
13. 13. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o epitope ser exibido por pelo menos 70% das flagelas do tipo b.
14. 14. - Processo de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo facto de o epitope ser exibido apenas pelas flagelas do tipo b.
15. 15. - Processo de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo facto de o anticorpo ser pan-reactivo.
16. 16, - Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo facto de possuir espicificidade de ligação igual a qualquer um dos anticorpos monoclonais designados por FA6, IIG5, Pa3, IVC2, PaF4, IVE8, 20H11 e 21B8.

    ►
17. 17. - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo facto de se conjugar com um marcador capaz de fornecer um sinal detectável.
18. 18, - Anticorpo monoclonal de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de o marcador ser um marcador fluorescente ou um enzima.
19. 19.- Processo para a determinação da presença de Pseudomonas

    -80c aeruginosa em uma amostra, caracterizado pelo facto de se combinar a referida amostra com um anticorpo monoclonal capaz de reagir com as flagelas de Pseudomonas aeruginosa, de se formar um complexo e de se detectar esse complexo.
20. 20.- Processo para detectar a presença de bactérias de Pseudomonas aeruginosa, caracterizado pelo facto de se utilizar um conjunto que contém pelo menos um anticorpo monoclonal, de o referido anticorpo reagir com um tipo específico de proteínas flagelares das referidas bactérias e de fornecer marcadores, que proporcionam um sinal detectável, ligados de uma forma covalente ao referido anticorpo ou a segundos anticorpos, e de reagirem com cada um dos anticorpos monoclonais referidos antes.
21. 21Processo para a preparação de composições farmacêuticas, caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de um anticorpo monoclonal ou de um seu fragmento de ligação capaz de reagir com flagelas da bactéria Pseudomonas aeruginosa, como ingrediente activo, com um ou mais veículos aceitáveis em farmácia.
22. 22.- Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal ou o seu fragmento de ligação inibir a motilidade das bactérias.
23. 23. - Processo de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo facto de o anticorpo monoclonal, ou um seu fragmento de ligação, possuir acção protectora in vivo. .
24. 24. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas , caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de um anticorpo monoclonal capaz de reagir especificamente com o epitope de proteínas flagelares de Pseudomonas aeruginosa, como ingrediente activo, com um ou mais veículos aceitáveis em farmácia.
25. 25. - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo facto de se incorporar um anticorpo monoclonal capaz de inibir a ligação ao epitope de anticorpos monoclonais produzidos pelas linhas de células como designadas pelos números de aceitação HB9129, HB9130, CRL 9300, CRL 9301, CRL 9422, CRL 9423 e

    CRL 9424 na ATCC.
26. 26. - Linha de células, caracterizada pelo facto de produzir anticorpos monoclonais capazes de reagir de um modo específico com as flagelas do tipo a ou flagelas do tipo b de Pseudomonas aeruginosa.
27. 27.- Linha de células de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo facto de o anticorpo monoclonal possuir acção protectora in vivo contra Pseudomonas aeruginosa.
28. 28. - Linha de células de acordo com a reivindicação 27, caracterizada pelo facto de ser constituída por células híbridas.
29. 29. - Linha de células de acordo com a reivindicação 26, caracterizada pelo facto de produzir anticorpos monoclonais humanos.
30. 30. - Linha de células de acordo com a reivindicação 26, earacterizada pelo facto de ser uma das linhas de células tal como designadas pelos números de aceitação HB9129, HB9130,CRL 9300,

    CRL 9301, CRL 9422, CRL 9423 ou CRL 9424 na ATCC.
31. 31. - Processo para a preparação de anticorpos monoclonais específicos para as proteínas flagelares de Pseudomonas aeruginosa utilizáveis para tratar ou impedir infecções produzidas pela referida bactéria, caracterizado pelo facto de se cultivar pelo menos uma linha de células de acordo com a reivindicação 30 e de se isolar os anticorpos referidos antes.
32. 32. - Processo para a preparação de composições farmacêuticas caracterizado pelo facto de se misturar uma quantidade efectiva de um anticorpo monoclonal ou um seu fragmento, capaz de reagir com um epitope capaz de se ligar a um anticorpo monoclonal, produzido de acordo com a reivindicação 31, como ingrediente activo, com um ou mais veículos aceitáveis em farmácia,

    Lisboa, 03 de Julho de 1987

    RESUMO

    Processo para a preparação de anticorpos monoclonais contra estirpes de Pseudomonas aeruginosa flageladas e de composições que os contêm

    I

    Descreve-se um processo para a preparação de anticorpos monoclonais obtidos mediante a utilização de novas linhas de células que segregam os referidos anticorpos, capazes de se ligarem específicamente ãs proteínas flagelares de certas estirpes de Pseudomonas aeruginosa.

    Alguns dos anticorpos citados antes têm actividade protectora contra as doenças letais provocadas por P. aeruginosa.

    A presente invenção também descreve composições farmacêuticas que utilizam os anticorpos referidos antes, como ingrediente activo, isoladamente ou associados com outros anticorpos monoclonais, fracçoes de plasma sanguíneo e agentes antimicrobianos, para o tratamento ou prevenção de infecções.

    As linhas de células de acordo com a presente invenção, transformadas continuamente, PaF4, IVE8, Fa6, IIG5, 20H11 e 21b8 referidas antes foram previamente depositadas na ATCC sob os números HB9129, HB9130, CRL 9300 e CRL 9301.