ES2274966T3 - Igy anti-pytyrosporum ovale y sus usos. - Google Patents
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Abstract
Composición adecuada para prevenir la caspa que comprende un anticuerpo de yema de huevo contra Pityrosporum ovale como un agente eficaz, en la que el anticuerpo de yema de huevo contra Pityrosporum ovale se puede obtener de huevos de una gallina ponedora inmunizada con Pityrosporum ovale como un antígeno.
Description
IgY anti-Pityrosporum ovale y sus
usos.
La presente invención se refiere a una
composición adecuada para prevenir la caspa, en la que dicha
composición comprende un anticuerpo de yema de huevo contra
Pityrosporum ovale que es la causa de la caspa. El anticuerpo
se produce separando proteínas específicas de Pityrosporum
ovale, inmunizando animales con las proteínas, y obteniendo el
anticuerpo anti-Pityrosporum ovale del animal.
Pityrosporum ovale es una levadura
lipófila que es un miembro de la flora normal en la piel humana,
especialmente en el cuero cabelludo. Pityrosporum ovale está
relacionado con varias enfermedades de la piel, en particular caspa
y dermatitis seborreica. Si la razón de P. ovale en una
flora normal es del 74% o más, el síntoma de caspa se manifestará
junto con escamas y producirá picor. Cuando la razón es del 83% o
más, aparecerá dermatitis seborreica (Shuster, S.: Br, J. Dematol,
3, 235 (1984), McGinley, K.J. et al: J Invest. Dermatol. 64,
40(1975)). En caso de que haya un estado de caspa anómalo,
la forma de P. ovale es en micelio y no en un forma de
espora germinales, que lo hace más difícil de tratar. Por tanto, el
estado de caspa llega a ser crónico (Mycos 1997: 40 supl.:
29-32).
Para mejorar el estado de la piel, se han usado
productos que comprenden componentes anticaspa tales como
ketoconazol, piritiona de zinc, climbazol, y otros. Sin embargo, los
componentes de estos productos tienen una especificidad baja por
P. ovale, eliminando así microorganismos útiles además de
P. ovale. Por tanto, es muy probable que P. ovale
pueda convertirse en un microorganismo principal en el cuero
cabelludo en estados seborreicos.
Hay varios ejemplos anteriores para eliminar un
microorganismo patógeno con anticuerpos, especialmente anticuerpo
de yema de huevo. Los ejemplos típicos son anticuerpos contra el
microorganismo que produce el acné, y la bacteria que induce caries
dental (publicación de patente coreana abierta a consulta por el
público número 1997-73607). Además, la publicación
de patente coreana abierta a consulta por el público número
2000-49499 describe el método de preparación de
leche fermentada usando la yema de huevo objeto líquida que mantiene
el título del anticuerpo anti-Helicobacter pylori y que está
dirigida a prevenir la contaminación de microorganismos y
levaduras. Además, la leche fermentada está disponible
comercialmente (KOREA YAKURT Co., Corea). Sin embargo, hasta el
momento no se ha presentado ningún producto o anticuerpo relacionado
con P. ovale.
La presente invención proporciona una
composición adecuada para prevenir la caspa, que comprende un
anticuerpo de yema de huevo contra Pityrosporum ovale como
un agente eficaz, en la que el anticuerpo de yema de huevo contra
Pityrosporum ovale se puede obtener de huevos de una gallina
ponedora inmunizada con Pityrosporum ovale como un
antígeno.
La presente invención se refiere a una
composición adecuada para prevenir la caspa, en la que dicha
composición comprende un anticuerpo de yema de huevo contra
Pityrosporum. El anticuerpo se puede obtener separando
proteínas específicas de Pityrosporum ovale, inmunizando
gallinas ponedoras con las proteínas, y obteniendo el anticuerpo en
la yema de huevo.
Comparado con las tecnologías anteriores, la
presente invención usa el método de preparación de anticuerpo
contra Pityrosporum ovale que está en la piel o cuero
cabelludo y normalmente produce y empeora la caspa, dermatitis
seborreica, y dermatitis atópica con el fin de inhibir la
proliferación de P. ovale o desactivar algunas enzimas
secretadas a partir de P. ovale. Debido a que el propio
anticuerpo es una macromolécula biológica aislada del huevo
comestible, apenas tiene efectos perjudiciales comparado con la
hormona o agente químico antifúngico. Por tanto, es un material
seguro para prevenir y tratar la caspa, dermatitis seborreica, y
dermatitis atópica.
Según la presente invención, el método de
preparación del anticuerpo anti-P. ovale comprende las
cuatro etapas siguientes:
1. Preparar el antígeno a partir de P.
ovale;
2. Inmunizar gallinas ponedoras con el antígeno
para producir yema de huevo que incluye IgY anti-Pityrosporum
ovale;
\newpage
3. Aislar la IgY; y
4. Preparar una composición que comprende la IgY
contra P. ovale.
El anticuerpo de la presente invención se puede
obtener inmunizando una gallina ponedora con un antígeno (por
ejemplo, P. ovale) y obteniendo el anticuerpo de sus huevos.
El método de inyectar el antígeno y obtener el anticuerpo se conoce
bien por un experto en el campo relacionado al que se refiere la
presente invención.
En la realización preferida de la invención, el
antígeno puede ser un extracto bruto o componentes de la pared
celular purificados de P. ovale. Se notificó que P.
ovale tiene proteínas únicas de 37 kD y 67 kD en la pared
celular que no podían encontrarse en otras levaduras. Los resultados
experimentales muestran que un anticuerpo monoclonal contra las
proteínas únicas se une a P. ovale con actividad de unión
del 90% o más (Zargari. A et al., Clin Exp Allergy, mayo de
1997, 2795); págs. 584-92). Por lo tanto, los
inventores de la presente invención usaron el extracto bruto de
P. ovale y los componentes de la pared celular como un
antígeno.
En la sangre de las aves, hay inmunoglobulinas
correspondientes a IgG, IgM, e IgA de los mamíferos en una cantidad
de 5,0 mg, 1,25 mg, y 0,61 mg por ml de suero, respectivamente. Las
aves ponedoras tienen características de transferencia del
componente inmunitario a un polluelo a través de inmunidad pasiva.
Como resultado, puede acumularse el anticuerpo en el huevo. De los
tres tipos de inmunoglobulinas, sólo IgG permanece en la yema de
huevo, y por tanto se denomina IgY (Immunoglobulin yolk
(inmunoglobulina de yema de huevo)). La concentración de IgY es
aproximadamente de 25 mg por ml de yema de huevo que se sabe que es
un anticuerpo policlonal excelente.
En comparación con otros métodos para obtener un
anticuerpo a partir de los mamíferos, existen ventajas importantes
en obtener un anticuerpo específico a partir de la gallina ponedora.
Es decir, un único huevo puede contener aproximadamente de 90 a 100
mg de anticuerpo, lo que es comprable a la cantidad contenida en la
sangre extraída de un conejo. Es más fácil recoger huevos de
gallinas inmunizadas que extraer sangre de mamíferos, y tal recogida
de los huevos no requiere sacrificar los animales. Además, puede
producirse mucho más anticuerpo debido a que se facilita fácilmente
la reproducción a gran escala de pollos inmunizados.
En particular, la IgY de la gallina ponedora
puede producirse en una cantidad de aproximadamente 40 kg al año,
lo que es tanto como ciento veinte veces la cantidad que produce el
conejo. Debido a una diferencia filogénica entre las aves y los
mamíferos, no es necesario producir una reacción cruzada de IgY de
aves con la IgG de mamífero, lo que es muy útil para producir IgY
específica para el antígeno de los mamíferos. Por encima de todo,
usando la gallina ponedora para producir un anticuerpo, es posible
producir repetitivamente un anticuerpo activo estable, con el que
se hará posible normalizar los procesos de fabricación e investigar
y desarrollar productos.
Las características de la presente invención
radican en el uso de huevos que contienen un anticuerpo que inhibe
la proliferación de P. ovale como componente eficaz para
preparar la composición útil para prevenir la caspa.
El antígeno según la invención puede inyectarse
mediante una administración intramuscular, una hipodérmica, una
intravenosa, abdominal u oral. Se prefiere la inyección
intramuscular. Una dosis de antígeno administrada puede ser de 10
\mug o 1 mg en lo que se refiere a la cantidad de proteína en el
antígeno, y depende de la condición o estados de los animales. El
antígeno se inyecta repetidamente hasta que la cantidad de
anticuerpo alcanza un valor máximo que puede examinarse mediante un
cambio en la cantidad de anticuerpo específica en la yema de huevo
mediante el método ELISA (Ensayo de inmunoabsorción unido a enzimas
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
El anticuerpo según la presente invención puede
aislarse a partir de los huevos anteriores mediante métodos
habituales para aislar un anticuerpo. El huevo en sí puede usarse
como un anticuerpo tras secar y convertir en polvo, y comprende
además todo el huevo en polvo, la yema de huevo en polvo y la
proteína soluble en agua en polvo de la yema de huevo. El
anticuerpo podría purificarse a partir de la yema de huevo. El
anticuerpo purificado podría usarse para preparar una composición
farmacéutica útil para prevenir y tratar la enfermedad de la piel
producida por P. ovale, especialmente anticaspa y dermatitis
seborreica.
Para examinar los efectos de prevenir y tratar
la caspa, dermatitis seborreica y dermatitis atópica de anticuerpo
anti-P. ovale, se aplicó la prueba a alguien que tiene
enfermedades de la piel tales como caspa o dermatitis seborreica y
dermatitis atópica con un champú y una fórmula externa. Como
resultado, el anticuerpo de yema de huevo contra Pityrosporum
ovale puede usarse como un componente eficaz para prevenir y
tratar la caspa y la dermatitis seborreica a la vez que remite el
crecimiento y la actividad de especies de Pityrosporum.
Se proponen los siguientes ejemplos únicamente
para ilustrar la invención y no pretenden limitar el alcance de la
invención tal como se define en las reivindicaciones.
Se cultivó Pityrosporum ovale a 37ºC
durante 3-4 días en el caldo Brucella (Difco) en el
que se añadió antibiótico (complemento de Skirrow) y una cantidad
pequeña de aceite esterilizado.
Se adquirió P. ovale de KCTC (colección
coreana para cultivos tipo (Korean Collection for Type Cultures))
en la forma liofilizada para obtener el antígeno. Se cultivó
Pityrosporum ovale en el medio de caldo Brucella (Difco) en
que se complementaron antibióticos (complemento de Skirrow) y una
cantidad pequeña de aceite esterilizado. Se recogieron las células
cultivadas mediante separación por centrífuga a 3000 x g y luego se
resuspendieron en solución salina tamponada con fosfato. Tras
sonicarse las células, se eliminaron las células que no se
rompieron mediante centrifugación a 10.000 x g durante 15 minutos.
Luego, se tomó el sobrenadante y se precipitó mediante
ultracentrifugación a 100.000 x g durante 30 minutos. Se
resuspendieron las células precipitadas en agua destilada y se usó
como un antígeno para el experimento siguiente.
Tras la recogida de las células que se
cultivaron en el medio de caldo de Brucella según el ejemplo 1, se
enjuagaron las células de tres a cuatro veces con solución salina
normal y luego se suspendieron en la solución salina. Se rompieron
las células completamente mediante onda ultrasónica. Después, se
filtró el líquido celular para separar el componente insoluble de
la pared celular con celulosa porosa o maya de nylon o se precipitó
mediante centrifugación según el ejemplo 2. Se usó el filtrado o
precipitado como un antígeno para el experimento siguiente.
Se usaron gallinas (Hy-Line
Brown), de 21 semanas de edad que ya habían empezado a poner huevos,
para la producción del anticuerpo. Se mezclaron los antígenos
obtenidos en los ejemplos 2 y 3 con el adyuvante completo de Freund
(Sigma chemical Co) en la misma cantidad y después se emulsionaron.
Se inyectó por vía intramuscular 1 ml del antígeno emulsionado en
la pata de las gallinas y después se realizó una inmunización de
refuerzo 3 veces en seis semanas. Se recogieron los huevos
inmunizados para someter a prueba el título de inmunidad y la
afinidad de unión al antígeno.
Se usó el método ELISA para decidir el efecto
del anticuerpo producido de yema de huevo. Se purificó el anticuerpo
de yema de huevo (IgY) que se iba a utilizar mediante el método
siguiente.
Se mezclaron 5 ml de yema de huevo líquida con 5
ml de agua destilada y se añadieron a 20 ml de carragenina lambda
al 0,15% y se dejó a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después, se centrifugó la disolución a 20ºC, 3.000 x g, durante 15
minutos, y se tomó el sobrenadante. Se añadió el sobrenadante a
sulfato de sodio al 19% (aproximadamente 3 g), se agitó, se dejó 40
minutos a temperatura ambiente, y se centrifugó a 10.000 x g
durante 15 minutos para producir el precipitado. Se resuspendió el
precipitado en una disolución de tampón fosfato para obtener el
anticuerpo.
Se vertieron 1 X 10^{9} células/ml de P.
ovale en cinco tubos de 10 ml, y se añadieron los dos tipos de
anticuerpos en una cantidad de 12,5, 25, 50, y 100 mg/ml en cuatro
de los cinco tubos. Se usó como control el tubo sin anticuerpos. Se
agitaron las células y se cultivaron a 37ºC durante 2 horas. Luego,
se tomó 1 ml de la disolución de cultivo, se calentó a 60ºC durante
30 minutos, y después se mantuvo fría.
Se midió el resultado de la reacción de
anticuerpo mediante el método de titulación ELISA y se muestra en
la tabla 1.
Tal como se muestra en la tabla 1, la IgY
producida con componente de pared celular tiene mayor actividad de
unión. Se demostró que la concentración de anticuerpos para reducir
el número celular hasta la mitad era de 25 mg/ml.
El método de valoración ELISA se realizó
mediante las etapas siguientes
(1) Diluir P. ovale en cada grupo con un
tampón de recubrimiento hasta que la concentración de proteína
alcance 5 \mug/mg, 100 \mul de disolución por pocillo, verter
el P. ovale diluido en cada pocillo y mantenerlo a 4ºC
durante 48 horas;
(2) Añadir 100 \mul de tampón de bloqueo a la
disolución y hacer reaccionar a 37ºC durante 2 horas;
(3) Enjuagar 3 veces con disolución de
lavado;
(4) Diluir la IgY purificada a partir de yema de
huevo con tampón de bloqueo a 100 \mug/mg, verter a 100 \mul
por pocillo y mantener a 4ºC durante la noche o incubar a 37ºC
durante 2 horas;
(5) Enjuagar 5 veces con disolución de
lavado;
(6) Diluir el conjugado IgY-AP
de cabra anti-pollo con tampón de bloqueo hasta
obtener la razón de 1:1000, verter 100 \mul por pocillo, e
incubar a 37ºC durante 2 horas;
(7) Añadir 100 \mul por pocillo del sustrato y
hacer reaccionar en la cámara oscura a 30ºC.
(8) Enjuagar 6 veces con disolución de
lavado;
(9) Añadir 100 \mul de disolución de parada;
y
(10) Leer mediante el lector ELISA (450 nm).
Se recogieron los huevos inmunizados que
contenían un anticuerpo anti-Pityrosporum ovale. Se mezclaron
5 ml de la yema de huevo separada de los huevos con 5 ml de agua
destilada y 20 ml de carragenina lambda al 0,15% y se dejó a
temperatura ambiente durante treinta minutos. Se tomó el
sobrenadante tras la centrifugación a 3.000 x g durante quince
minutos a 20ºC. Se añadió sulfato de sodio al sobrenadante a la
concentración final del 19% y luego se dejó a temperatura ambiente
durante cuatro minutos. Después se obtuvo el precipitado
centrifugando la disolución resultante a 10.000 x g durante quince
minutos, y se solubilizó la disolución con la disolución de tampón
fosfato para producir el anticuerpo. Se midió la concentración de
proteína en total con el kit BCA (ácido bicinconínico) de reactivo
de ensayo de proteína (Pierce). Se obtuvo la concentración de IgY
dividiendo la absorbancia medida a 280 nm entre 1,33 del
coeficiente de absorción de IgY y se corrigió con una curva patrón
de IgY de pollo (Promega).
Se probó el efecto anticaspa por el método de
difusión en disco en la piel. En primer lugar, se inoculó P.
ovale en una placa de agar y después se cultivó a 37ºC durante
dos días en condiciones aerobias. El papel del disco se esterilizó
con etanol al 70%, se trató con ketoconazol, piritiona de zinc,
climbazol, ácido salicílico, e IgY anticaspa en diversas
concentraciones y se puso sobre la placa de agar. Se midió el tamaño
de la zona de inhibición 3 veces tras incubarlo a 37ºC durante 48
horas, y el tamaño medio se muestra en la tabla 2, en la que la
zona de inhibición muestra el tamaño de la zona despejada que
incluye el tamaño del disco (1,2 cm).
Según la tabla 2, el diámetro de la zona
despejada del anticuerpo anti-P. ovale es mayor que el de
compuestos conocidos. Sin embargo, dado que la concentración molar
y la tasa de difusión de IgY son bajas en comparación con las de
los compuestos conocidos, IgY puede ser más eficaz.
Ejemplos 8 a
11
Se obtuvo y se probó el champú que contenía
anticuerpo anti-P. ovale para demostrar el efecto
anticaspa.
Se disolvió piroctona amina, piritiona de zinc,
o IgY en agua destilada añadiendo laurilsulfato de sodio,
polioxietilenlauril éter sulfato de sodio,
dietanol-laurilamida y propilenglicol en una
cantidad tal como se muestra en la tabla 3 y calentando hasta 60ºC.
Después se enfrió la disolución hasta 40ºC, se mezcló con colores,
éster de ácido para-benzoico, perfumes, y ácido
cítrico y se enfrió hasta temperatura ambiente para producir el
champú.
Ejemplos comparativos 1 a
3
Para comparar el efecto del champú anticaspa
usando anticuerpo de yema de huevo contra Pityrosporum ovale,
se mostró en la tabla 3 la composición del champú que contiene los
compuestos conocidos.
Experimento
1
Se sometieron a prueba los efectos anticaspa y
de anti-picor de los champús preparados mediante los
métodos de los ejemplos 8-11 y los ejemplos
comparativos 1-3.
Se aplicaron durante un mes los champús a
cuarenta y nueve voluntarios masculinos y femeninos que tenían
problemas con la caspa. Se tomó y se pesó la caspa acumulada
después de que los voluntarios se aplicaran un champú de uso común
durante tres días. Se aplicó el producto de champú mostrado en la
tabla 2 a los mismos voluntarios en días alternos durante 1 mes, y
se tomó y pesó la caspa acumulada en tres días. Se tomó la caspa
acumulada mediante un dispositivo de succión a vacío del cuero
cabelludo.
Se calculó la tasa de caspa según se muestra a
continuación.
Tasa de reducción de la caspa (%) _ (el peso de
la caspa antes del experimento (mg) - el peso de la caspa tras 1
mes (mg)) / el peso de la caspa antes del experimento x 100.
Se mostraron los resultados de la prueba en la
tabla 4.
Experimento
2
Se añadieron los materiales del champú en la
tabla 3 al caldo de Ym que contenía aceite de maíz en cantidades de
5,00, 1,00, 0,50, 0,10, 0,05, 0,01 y 0,005% en peso, respectivamente
para producir el medio de cultivo. Se inocularon
10^{5}-10^{6} UFC (unidades formadoras de
colonias))/ml de P. ovale en el medio de cultivo y se
cultivaron durante dos días. Se obtuvo la concentración mínima
inhibitoria (CMI) del cultivo. Los resultados de la prueba se
muestran en la tabla 5.
Tal como se muestra en los ejemplos anteriores,
la presente invención proporciona una composición anticaspa que
comprende anticuerpo anti-P. ovale que se produjo inmunizando
gallinas ponedoras con P. ovale como un antígeno, y tiene
una actividad de inhibición de la proliferación de P.
ovale.
Claims (3)
1. Composición adecuada para prevenir la caspa
que comprende un anticuerpo de yema de huevo contra Pityrosporum
ovale como un agente eficaz, en la que el anticuerpo de yema de
huevo contra Pityrosporum ovale se puede obtener de huevos
de una gallina ponedora inmunizada con Pityrosporum ovale
como un antígeno.
2. Composición según la reivindicación 1, en la
que el antígeno son extractos brutos o el componente de la pared
celular de Pityrosporum ovale.
3. Composición según la reivindicación 1, en la
que el antígeno es una proteína de 37 kD o una proteína de 67 kD
que es específica para Pityrosporum ovale y existe en la
superficie de la pared celular de Pityrosporum ovale.
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