PL169172B1

PL169172B1 - Sposób otrzymywania preparatu uodporniającego i/lub leczniczego w zakażeniach B I i bakteryjnych oraz zatruciach pokarmowych, zwłaszcza salmonelozami

Info

Publication number: PL169172B1
Application number: PL29574192A
Authority: PL
Inventors: Renata Glosnicka
Original assignee: Renata Glosnicka
Priority date: 1992-08-25
Filing date: 1992-08-25
Publication date: 1996-06-28
Also published as: PL295741A1

Abstract

1. Sposób otrzymywania preparatu uodporniającego i/lub leczniczego w zakażeniach bakteryjnych oraz zatruciach pokarmowych, zwłaszcza salmonelozami, w którym stosuje się jałową masę bakteryjną oraz przeciwciała mono- i poliklonalne, znamienny tym, że uzyskaną z bakterii Gramujemnych jałową masę bakteryjną miesza się z surowicą królików uodpornionych bakteriami Salmonella i/lub z przeciwciałami monoklonalnymi, uzyskanymi przez fuzję uczulonych mysich limfocytów z komórkami szpiczaka, w ilości nie mniejszej od 10%, całość pozostawia na kilkanaście godzin w temperaturze korzystnie 37°C, po czym odwirowuje i uzyskany osad zawiesza w fizjologicznym roztworze soli ewentualnie z dodatkiem środka konserwującego, korzystnie formaldehydu lub fenolu względnie ich mieszaniny o stężeniu nie przekraczającym 0,02%, zaś uzyskany preparat z zaadsorbowanymi przeciwciałami na bakteriach Salmonella izoluje ze środowiska reakcji.przez odwirowanie, przy czym stężenie bakterii w preparacie jest nie mniejsze od 1011 bakterii/ml.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania preparatu uodporniającego i/lub leczniczego w zakażeniach bakteryjnych oraz zatruciach pokarmowych zwłaszcza salmonelozami.

Dotychczas znane preparaty do uodporniania ludzi drogą pozajelitową sporządza się z masy bakteryjnej S.typhi zabijanej i jałowionej przez gotowanie, zabijanej i suszonej acetonem oraz zabijanej formaliną i konserwowanej fenolem. Preparat do uodporniania ludzi drogą doustną zawiera żywą masę bakteryjną sporządzoną z atenuowanego, auksotroficznego szczepu S.typhi Ty 21a. który jest zmodyfikowany genetycznie na drodze mutacji chemicznych. Najważniejsza mutacja dotyczy genu gal E, która uniemożliwia syntezę istotnych składników ściany komórkowej bakterii S.typhi w obecności egzogennej galaktozy.

Preparaty do uodpornienia zwierząt drogą doustną lub pozajelitową sporządza się z żywej masy bakteryjnej szczepów atenouwanych, auksotroficznych, jak S.typhimurium 3B6OC z mutacją genu aro A, które hoduje się w podłożu płynnym, a następnie liofilizuje.

Preparat do uodporniania zwierząt drogą doustną sporządza się przez namnażanie na płynnym wyciągu z serca wołu żywej masy bakteryjnej skonstruowanego genetycznie szczepu hybrydy S.dublin SL 7103 z mutacją genu aro A, który zawiera kompleks genów rfb bakterii S.typhimurium.

Dotychczas znane szczepionki uodparniające dla ludzi otrzymuje się ze szczepów S.typhi oraz S.paratyphi B, dla świń ze szczepu S.choleraesuis, dla cieląt i krów ze szczepu S.dublin, zaś dla owiec ze szczepu S.abortusovis bądź z pojedynczych szczepów powodujących lokalne epidemie, jak S.enteritidis czy S.typhimurium.

169 172

Natomiast dotychczas me jest znany preparat uodporniający i/lub leczniczy dla ludzi i zwierząt przeciw chorobom zakaźnym przewodu pokarmowego jak salmonelozy czy cholera oraz sposób jego otrzymywania, w którym stosuje się bakterie z zaadsorbowanymi na nich przeciwciałami.

Niedogodnością szczepionek stosowanych dla zwierząt jest uzyskliwanie krótkotrwałej i słabej odporności dla jednego wybranego serotypu użytego do szczepienia spośród 2000 poznanych serotypów Salmonella, szczególnie przy aplikacji pozajelitowej. Wartość szczepionek doustnych, wykonanych z bakterii żywych atenuowanych lub zmodyfikowanych genetycznie może być ograniczona przy powszechnym stosowaniu antybiotyków. Ponadto, szczepy atenuowane lub zmodyfikowane mogą powracać do wyjściowych form zjadliwych.

Sposób otrzymywania preparatu uodporniającego i/lub leczniczego w zakażeniach bakteryjnych oraz zatruciach pokarmowych zwłaszcza salmonelozami, w którym stosuje się jałową masę bakteryjną oraz przeciwciała mono-i poliklonalne, według wynalazklu charakteryzuje się tym, że uzyskaną z bakterii Gramujemnych jałową masę bakteryjną miesza się z surowicą królików uodpornionych bakteriami Salmonella i/lub z przeciwciałami monoklonalnymi, uzyskanymi przez fuzję uczulonych mysich limfocytów z komórkami szpiczaka, w ilości nie mniejszej od 10%, całość pozostawia na kilkanaście godzin w temperaturze korzystnie 37°C, po czym odwirowuje i uzyskany osad zawiesza w fizjologicznym roztworze soli ewentualnie z dodatkiem środka konserwującego, korzystnie formaldehydu, fenolu względnie ich mieszaniny o stężeniu nie przekraczającym 0,02%, zaś uzyskany preparat z zaadsorbowanymi przeciwciałami na bakteriach Salmonella izoluje ze środowiska reakcji przez odwirowanie, przy czym stężenie bakterii w preparacie jest nie mniejsze od 1011 bakterii/ml.

Jako bakterie Gramujemne stosuje się korzystnie następujące serotypy pałeczek Salmonella: S.enteritidis, S.typhimurium, S.heidelberg, S.reading, S.Stanley, S.dublin, S.rostock, S.gallinarum, S.choleraesuis, S.infantis, S.mbandaka, S.newport, S.kottbud, S.bovismorbificans, S.glostrup, S.kentucky, S.cocody, S.meleagridis, S.london, S.anatum, S.senftenberg, S.westerstede, S.poona względnie ich mieszaninę korzystnie stosuje się surowice królicze z królików uodpornionych antygenami somatrycznymi S.paratyphi B, S.newport, S.thomson, S.kapemba, S. haarlem, S.london oraz S.newington w ilości 5 : 1 w stosunku do masy bakteryjnej pałeczek Salmonella .

Preparat jest jałową zawiesiną pałeczek Salmonella, które posiadają przeciwciała królicze zaadsorbowane na wybranych determinantach antygenów somatrycznych tych bakterii. Aktywność przeciwbakteryjną in vitro preparatu badano w hodowli płynnej na pożywce bulionowej, zawierającej preparat w ilości odpowiadającej 3,5 x 1011 bakterii/ml z zastosowaniem szczepów S.enteritidis i S.typhimurium. Mieszaninę bakterii z preparatem inkubowano w temperaturze 37°C przez całą dobę w trzech równoległych próbach. W odstępach godzinnych pobierano po 0,1 ml zawiesiny z każdej próby i wysiewano na płytki z podłożem agarowym. Po 24 godzinnej inkubacji w 37°C liczono kolonie utworzone przez bakterie, które przeżyły. Wyniki badań zilustrowane są w tabeli nr 1.

Tabela 1

Czas inkubacji w godz.	Preparat 3,5x10H 1.kolonii S.enteritidis	bakt./ml 1 .kolonii S.typhi- murium	Kontrola 1.kolonii
0	24	43	20
1	11	10	14
2	11	7	30
3	12	11	80
4	13	9	253
24	6	9	5x1qB

169 172

Porównanie aktywności przeciwbakteryjnej in vivo preparatu przeprowadzono w doświadczeniach, do których użyto białe myszy linii BALB. 10 myszy zaszczepiono doustnie preparatem zawierającym 10,5 x 10^1 bakterii/mysz w ten sposób, że podano zawiesinę w naczyniu do pojenia. Po sześciu dniach myszy szczepione i 10 sztuk myszy nie szczepionych zakażono szczepem S.enteritidis nr 1525/5B76/8B, podając im do picia zawiesinę bakterii w ilości 2,5 x 10θ bakterii/ mysz w fizjologicznym roztworze soli. Wyniki badań przedstawione są w tabeli nr 2.

Tabela 2

Droga podawania	Szczepienie	Zakażenie	Przeżywalność
doustna	preparat 10,5 x 10*1	1525/5B76/BB S.enteritidis 2,5 x 10B	10/10
doustna		1525/5B76/BB S.enteritidis 2,5 x 10B	2/10

Stosowanie preparatu powoduje powstawanie odporności na zakażenia salmonelozami odzwierzęcymi. Posiada on również zdolność hamowania choroby u zakażonych zwierząt i zmniejsza wydalanie bakterii Salmonella. Preparat można stosować profilaktycznie, w zapobieganiu zakażeniom pałeczkami Salmonella szczególnie u drobiu, od pierwszych dni po urodzeniu przez całe życie, jak również w leczeniu zakażeń u zwierząt od pierwszych dni po urodzeniu. Nie stwierdzono przeciwwskazań do stosowania preparatu ani też jego działania ubocznego. Preparat jest przygotowany do stosowania doustnego.

Sposób otrzymywania preparatu uodporniającego i/lub leczniczego w zakażeniach bakteryjnych oraz zatruciach pokarmowych zwłaszcza salmonelozami charakteryzują podane niżej przykłady.

Przykład Ia. Przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S.enteritidis w ten sposób, że na płytkach Petriego z pożywką o składzie: 1000 ml wody destylowanej, 0,4 g wyciągu mięsnego, 5,4 g kwaśnego hydrolizatu kazeiny, 1,7 g ekstraktu drożdżowego, 3,5 g chlorowodorku sodowego oraz 20 g agaru, zwaną dalej agarem wzbogaconym, hoduje się bakterie przez 20 godzin, w temperaturze 23°C. Następnie zmywa je do kolby fizjologicznym roztworem soli, dodaje formaldehydu do stężenia 0,4% i pozostawia w temperaturze 37°C przez dobę w celu zabicia bakterii. Po sprawdzeniu jałowości zawiesiny odwirowuje się ją przez 30 minut. Otrzymuje się surowicę króliczą przez czterokrotne dożylne szczepienie królika w odstępach tygodniowych uprzednio zinaktywowaną przez gotowanie zawiesiną 10B bakterii S.paratyphi B. Do 1 ml osadu bakteryjnego dodaje się 15 ml surowicy rozcieńczonej w stosunku 1 : 3 fizjologicznym roztworem soli i mieszaninę pozostawia w temperaturze 37°C przez 20 godzin w celu zaabsorbowania przez bakterie właściwych przeciwciał, odwirowuje przez 30 minut, odrzuca supernatant, a osad zamraża w temperaturze -20°C. Następnie 100 ml rozmrożonej masy bakteryjnej zawiesza się w roztworze soli, zawierającym 0,02% formaldehydu uzyskując 50 litrów zawiesiny, zawierającej w 1 ml około 3,5x10^1 bakterii. Po odwirowaniu 100 ml zawiesiny uzyskuje się 0,2 ml preparatu, co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

b. analogicznie przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S.typhimurium i surowicę króliczą przez dożylne szczepienie królika zawiesiną bakterii S.kapemba. Dalej postępuje się jak w przykładzie Ia, zaś 100 ml rozmrożonej masy bakteryjnej zawiesza się w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 0,02% formaldehydu uzyskując 50 litrów zawiesiny, w której znajduje się około 3,5x1011 bakterii na 1 ml. Po odwirowaniu 100 ml zawiesiny uzyskuje się 0,2 ml preparatu, co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

169 172

Przykład II a. Podobnie jak wyżej przygotowuje się masę bakteryjną zawierającą szczepy: S.enteritidis, S.dublin, S.rostock, S.kentucky, S.cocody, S.senftenberg, S.westerstede, S.glostrup S.newport i S.kottbus w stosunku 4:2:2:1:1:1.1-1 : 0.5 :

: 0,5 i surowicę króliczą przez dożylne szczepienie królika zawiesiną bakterii S.paratyphi B. Dalej postępuje się identycznie jak w przykładzie I, a więc 100 ml rozmrożonej masy bakteryjnej zawiesza się w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 0,02% formaldehydu uzyskując 50 l zawiesiny, w której znajduje się około 3,5x1011 bakterii na 1 ml. Po odwirowaniu 100 ml zawiesiny uzyskuje się 0,2 ml preparatu co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

b. Analogicznie przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepów. S.paratyphi B, S.typhimurium, S.heidelberg, S.reading, S.london, S.anatum, S.senftenoerg, S.rubislaw i S.poona w stosunku 1 : 2 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 oraz surowicę króliczą przez dożylne szczepienie królika zawiesiną bakterii S.newport i S.thompson. Dalej postępuje się identycznie jak w przykładach I i II, a więc 100 ml rozmrożonej masy bakteryjnej zawiesza się w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 0,02% formaldehydu uzyskując 50 l zawiesiny, w której znajduje się około 3,5x10^1 bakterii w 1 ml. Po odwirowaniu 100 ml zawiesiny uzyskuje się 0,2 ml preparatu, co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

Przykład III a. Przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S.enteritidis w ten sposób, że na płytkach Petriego z pożywką o składzie: 1000 ml wyciągu mięsnego, 10 g enzymatycznego hydrolizatu mięsa, 5 g chlorowodorku sodowego oraz 20 g agaru, zwaną dalej agarem zwykłym, hoduje się bakterie przez 20 godzin w temperaturze 37°C. Następnie zmywa się je do kolby fizjologicznym roztworem soli, dodaje formaldehydu do stężenia 0,4% i pozostawia w temperaturze 37°C przez dobę w celu zabicia bakterii. Po sprawdzeniu jałowości zawiesiny odwirowuje się ją przez 30 minut, uzyskując masę bakteryjną.

Otrzymuje się surowicę króliczą przez czterokrotne dożylne szczepienie królika w odstę□ pach tygodniowych uprzednio zinaktywowaną przez gotowanie zawiesiną 10° bakterii S.paratyphi B, Do 1 ml osadu bakteryjnego dodaje się 15 ml surowicy rozcieńczonej w stosunku 1 : 3 fizjologicznym roztworem soli i mieszaninę pozostawia w temperaturze 37°C przez 20 godzin w celu zaabsorbowania przez bakterie właściwych przeciwciał, odwirowuje przez 30 minut, odrzuca supernatant, a osad zamraża w temperaturze -20°C.Następnie 100 ml rozmrożonej masy bakteryjnej zawiesza się w roztworze soli, zawierającym 0,02% formaldehydu uzyskując 50 l zawiesiny, zawierającym 0,02% formaldehydu uzyskując 50 l zawiesiny, zawierającej w 1 ml około 3,5x1011 bakterii. Po odwirowaniu 100 ml zawiesiny uzyskuje się 0,2 ml preparatu, co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

b. analogicznie przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S.typhimurium i surowicę króliczą przez dożylne szczepienie królika zawiesiną bakterii S.kapemba. Dalej postępując identycznie jak w przykładzie IIIa uzyskuje się 50 l zawiesiny o stężeniu bakterii około 3,5x1011 bakterii/ml. Po odwirowaniu 100 ml zawiesiny uzyskuje się 0,2 ml osadu, co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

Przykład IV a. Podobnie jak w przykładzie III przygotowuje się masę bakteryjną, zawierającą szczepy: S.enteritidis, S.dublin, S.rostock, S.kentucky, S.cocody, S.westerstede, S.glostrup S.newport i S.kottbus w stosunku 4:2:2:1:1:1:1:1: 0,5 : 0,5 oraz surowicę króliczą przez dożylne szczepienie królika zawiesiną bakterii S.paratyphi B. Dalej postępując identycznie jak w przykładzie I uzyskuje się 50 l zawiesiny, w której znajduje się około 3,5x1011 bakterii w 1 ml. Po odwirowaniu 100 ml zawiesiny uzyskuje się 0,2 ml preparatu co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

b. Analogicznie przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepów: S.paratyphi B, S.typhimurium, S.heidelberg, S.reading, S.london S.anatum, S.senftenberg, S.rubislaw i S.poona w stosunku 1:2:1:1:1:1:1:1:1 oraz surowicę króliczą przez dożylne szczepienie królika zawiesiną bakterii S.newport i S.thompson. Dalej postępując identycznie jak w przykładach I i II 100 ml rozmrożonej masy bakteryjnej zawiesza się w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 0,02% formaldehydu uzyskując 50 litrów zawiesiny, w której znajduje się około 3,5x1011 bakterii w 1 ml. Po odwirowaniu 100 ml zawiesiny uzyskuje się 0,2 ml preparatu, co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

Przykład Va. Przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S.enteritidis w ten sposób, że na płytkach Petriego z agarem wzbogaconym hoduje się bakterie przez 20 godzin,

169 172 w temperaturze 37°C. Następnie zmywa się je do kolby fizjologicznym roztworem soli, dodaje formaldehydu do stężenia 0,4% i pozostawia w temperaturze 37°C przez dobę w celu zabicia bakterii. Po sprawdzeniu jałowości zawiesiny odwirowuje się ją przez 30 minut, uzyskując masę bakteryjną.

Otrzymuje się surowicę króliczą przez czterokrotne dożylne szczepienie królika w odstępach tygodniowych uprzednio zinaktywowaną przez gotowanie zawiesiną 10⁸ bakterii S.paratyphi B. Do 1 ml masy bakteryjnej dodaje się 15 ml surowicy rozcieńczonej w stosunku 1 : 3 fizjologicznym roztworem soli i mieszaninę pozostawia w temperaturze 37°C przez 20 godzin w celu zaabsorbowania przez bakterie właściwych przeciwciał , odwioowjje pzzez 30 mintt , orzzcca supernatant, a osad zamraża w temperaturze -23°C. Następnie 133 ml rozmrożonej masy bakteryjnej zawiesza się w roztworze soli, zawierającym 3,32% fopmal0zchy0n uzyskując 53 litrów zawiesiny zawierającej w 1 ml około 3,5χ1ϋ11 bakterii. Po odwirowaniu 133 ml zawiesiny uzyskuje się 3,2 ml osadu, co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

b. Analogicznie przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S^yptiimurium i surowicę króliczą przez dożylne szczepienie królika zawiesiną bakterii S.kapemba. Dalej postępując jak wyżej 133 ml rozmrożonej 'may, bateryjnej0 zwieczaz wiz' w iżjj□1ogicznym roz-tworze sol i zawierającym 3,32% formaldehydu uzyskując 53 litrów zawiesiny, w której znajduje się około 3,5x1311 bakterii na 1 ml. Po odwirowaniu 133 ml zawiesiny uzyskuje się 3,2 ml osadu, co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

Przykład VI a. Podobnie jak w przykładzie V przygotowuje się masę bakteryjną, zawierającą szczepy: S.enteritidis, S.dublin, S^ostock, S.kentucky, S.cocody, S^en^enberg, S.dzaterstede, S^ostrug S.newpoit i S.kottbus w stosunku 4:2:2:1:1:1:1:1:

: 3,5 : 3,5 oraz surowicę króliczą przez dożylne szczepienie królika zawiesin bakterii S.pzpztyphi B. Dalej postępuje się identycznie jak w przykładzie I. 133 ml rozmrożonej masy bakteryjnej zawiesza się w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 3,32% formaldehydu, uzyskując 53 l zawiesiny, w której znajduje się około 3,5x1311 bakterii na 1 ml. Po j0wiiowaniu 133 ml zawiesiny uzyskuje się 3,2 ml preparatu co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

b. Analogicznie przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepów: S.paratyphi B, S .typhimunum, S .heidelberg, S.izbdlng, S.london, S.anatum. S^eoftenberg, S^ubis^w i S.poona w stosunku 1:2:1:1:1:1:1:1:1 oraz surowicę króliczą przez dożylne szczepienie królika zawiesiną bakterii S^ewport i S^hompson. Dalej postępując identycznie jak w przykładach I i II 133 ml rozmrożonej masy bakteryjnej zawiesza się w fizjologicznym roztworze soli zawierającym 3,32% formaldehydu uzyskując 53 l zawiesiny, w której znajduje się około 3,5χ^11 bakterii w 1 ml. Po jOdiijdaniu 133 ml zawiesiny uzyskuje się 3,2 ml preparatu, co stanowi 95% wydajności teoretycznej.

Przykład VII a. Przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S.enteritidis podobnie jak w przykładzie I. Następnie otrzymuje się pizzcldclałα monoklonalne dla sntygenu somatycznego 12 przez fuzję uczulonych limfocytów mysich z komórkami szpWceaka SP 2/3 i namnażanie wytworzonych hybryd w podłożu płynnym o składzie: 46,1% soli nieorganicznych, 44,5% aminokwasów, 3,2% witamin oraz 9,2% takich składników, jak glukoza, glutation i czerwień fenolowa zwanym dalej podłożem BPMI 164ϋ, z dodatkiem surowicy cielęcej. Do 1 ml osadu bakteryjnego dodaje się 13 ml supernatantu zawierającego przeciwciała o mianie 1 : 13333, określonym w odczynie hemaglutynacji. Mieszaninę pozostawia się w temperaturze 37°C przez 23 godzin w celu zaabsorbowania przez bakterie przeciwciał. Dalej postępuje się jak w przykładach I i II. Po odwirowaniu 1ϋ3 ml zawiesiny bakteryjnej uzyskuje się 3,2 ml osadu, co stanowi 96% wydajności teoretycznej.

b. Analogicznie jak w przykładzie I przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S.typhimurium i przeciwciała się masę bakteryjną ze szczepu S.typhimurium i przeciwciała monoklonalne dla antygenu somatycznego 12, dalej postępuje się jak w przykładzie III. Po oOwirjdanlu 133 ml zawiesiny bakteryjnej uzyskuje się 3,2 ml osadu, co stanowi 96% wydajności teoretycznej.

169 172

Przykład VIII a. Przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S.enteritidis podobnie jak w przykładzie III. Otrzymuje się przeciwciała monoklonalne dla antygenu somatrycznego 12 przez fuzję uczulonych limfocytów mysich z komórkami szpiczaka SP 2/0 i namnażanie hybryd w podłożu BPMI 1640 z dodatkiem surowicy cielęcej. Do 1 ml osadu bakteryjnego dodaje się 10 ml supernatantu zawierającego przeciwciała o mianie 1:10000 określonym w odczynie hemaglunacji i mieszaninę pozostawia w temperaturze 37°C przez 20 godzin w celu zaabsorbowania przez bakterie przeciwciał. Dalej postępuje się jak w przykładach I i II. 100 ml masy bakteryjnej zawiesza się w roztworze soli, zawierającej 0,02% formaldehydu uzyskując 50 litrów zawiesiny, w której znajduje się około 3,5x1011 bakterii w 1 ml. Po odwirowaniu 100 ml zawiesiny bakteryjnej uzyskuje się 0,2 ml osadu, co stanowi 96% wydajności teoretycznej.

b. Analogicznie jak w przykładzie III przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S.typhimurium i przeciwciała monoklonalne dla antygenu somatycznego 12. Dalej postępuje jak w przykładzie VII. Następnie tak Jak w przykładach I i II, 100 ml masy bakteryjnej zawiesza się w roztworze soli zawierajjcej 0,02% formaldehydu uzyskując 50 l zawiesiny. w której znajduje się około 3,3,1θ10 babaetei w 1 ml. Po oowirowannu 100 ml zawieśmy bakteryjnej uzyskuje się 0,2 ml osadu, co stanowi 96% wydajności teoretycznej.

Przykład XX a. Przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S^nteritidis podobnie jak w przykładzie V. Otrzymuje się przeciwciała moioklwiaiie dla antygenu somatrycznego 12 przez fuzję uczulonych lrmfacytda mysich z komórkami szpiczaka SP 2/0 i namnażanie wytworzonych hybryd w podłożu BPMI 1640 z dodatkiem surowicy cielęcej. Do 1 ml masy bakteryjnej dodaje się 10 ml supernatantu zawierającego przeciwciała o mianie 1 :10000, określonym w odczynie hemaglutynacji. Mieszaninę pozostawia przez 20 godzin w temperaturze 37°C w celu zaabsorbowania przez bakierie przeciwciał. Dalej postępuje się jak w przykładach I i II. Po odwirowaniu zawiesiny uzyskujj yię 0,2 ml csadu bakteryjnego, co stanowi 96% wayaαeoWci teewejyyznee.

b. Analogicznie jak w przykładzie V przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu S.typhimurium i przeciwciała monoklonalij dla antygenu somatrycznego 12. Dalej postępując jak w przykładzie VIII uzyskuje się 0,2 ml osadu bakteryjnego, co stanowi 96% wydajności.

Przykład X. Przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu Viariw cholerae Inaba w ten sposób, że na płytkach Petnego z agarem odżywczym o składzie: 1000 ml wody destylowanej, 10 g enzymatycznego hydrolizatu mięsa, 2,5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g chlorku sodowego i 20 g agaru, o odczynie pH B,5 hoduje się bakterie przez 20 godzin w temperaturze 37°C. Następnie zmywa się je do kolby roztworem soli i gotuje w temperaturze 100°C przez 60 minut w celu zabicia bakterii. Po sprawdzeniu jałowości zawiesiny odwirowuje się ją, uzyskując osad bakteryjny.

Następnie otrzymuje się surowicę króliczą przez czterokrotne dożylne szczepienie królika w odstępach tygodniowych uprzednio zinaktywowaną przez gotowanie zawiesiną bakterii V.cholerae Ogawa. Do 1 ml osadu bakteryjnego dodaje 15 ml surowicy rozcieńczonej 1:3 fizjologicznym roztworem soli i mieszaninę pozostawia w temperaturze 37°C przez 20 godzin w celu zaabsorbowania przez bakterie właściwych przeciwciał, odwirowuje się ją przez 30 minut, odrzuca supernatant, a osad zamraża w temperaturze -2O°C.

Analogicznie przygotowuje się masę bakteryjną ze szczepu V.cholerae Ogawa i surowicę króliczą przez dożylne szczepienie królika zawiesiną bakterii v.choljrαj Inaba. 10 ml rozmrożonej masy bakteryjnej ze szczepu V.cholerae Ogawa i 10 ml rozmrożonej masy bakteryjnej ze szczepu V.choleare Inaba zawiesza się w roztworze soli zawierającym 0,02% formaldehydu, uzyskując 20 litrów zawiesiny zawierającej około 1011 bakterii w 1 ml. Po odwirowaniu 100 ml zawiesiny uzyskuje się 0,2 ml preparatu, co stanowi około 96% wydajności teoretycznej.

169 172

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 2,00 zł

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania preparatu uodporniającego i/lub leczniczego w zakażeniach bakteryjnych oraz zatruciach pokarmowych zwłaszcza salmonelozami, w którym stosuje się jałową masę bakteryjną oraz przeciwciała mono- i poliklonalne, znamienny tym, że uzyskaną z bakterii Gramujemnych jałową masę bakteryjną miesza się z surowicą królików uodpornionych bakteriami Salmonella i/lub z przeciwciałami monoklonalnymi, uzyskanymi przez fuzję uczulonych mysich limfocytów z komórkami szpiczaka, w ilości nie mniejszej od 10%, całość pozostawia na kilkanaście godzin w temperaturze korzystnie 37°C, po czym odwirowuje i uzyskany osad zawiesza w fizjologicznym roztworze soli ewentualnie z dodatkiem środka konserwującego, korzystnie formaldehydu lub fenolu względnie ich mieszaniny o stężeniu nie przekraczającym 0,02%, zaś uzyskany preparat z zaadsorbowanymi przeciwciałami na bakteriach Salmonella izoluje ze środowiska reakcji przez odwirowanie, przy czym stężenie bakterii w preparacie jest nie mniejsze od 1θ11 bakterii/ml.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako bakterie Gramujemne stosuje się następujące serotypy pałeczek Salmonella: S.enteritidis, S.typhimurium, S.heidelberg, S.reading, S.Stanley, S.dublin, S.rostock, S.gallinarum, S.choleraesuis, S.infantis, S.mbandaka. S.newport, S.kottbus, S.bovismorbificans, S.glostrup, S.kentucky, S.cocody, S.meleagndis, S.london, S.anatum, S.senftenberg, S.westerstede, S.poona lub ich mieszaninę.
3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się surowice królicze z królików uodpornionych antygenami somatycznymi S.paratyphi B, S.newport, S.thompson, S.kapemba, S.haarlem, S.london oraz S.newington w ilości 5 : 1 w stosunku do masy bakteryjnej pałeczek Salmonella.

* * *