KR890004019B1 - 요로 감염 치료용 백신의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

요로 감염 치료용 백신의 제조방법
본 발명은 요로 감염 치료용 백신의 제조방법에 관한 것이다.
인간 도는 동물의 각종 질병에 대한 백신은 이미 제안되어, 오랜 기간동안 사용되어 오고 있다. 예를들면, 스위스 특허 제 158,980호에 따르면, 특정 병소, 예를들면 편도선, 건, 객담 또는 분변에 존재하는 세균을 제거하여 이들을 무차별 배양하고 불활성화 시킴으로써 환자로부터 각 혼합 백신을 제조할 수 있다. 프랑스 특허 제 2,034,743호에 따라 알루미늄 탄네이트를 적당한 액체 추출물을 가함으로써 매우 다양한 유리의 항원을 수불용성으로 만들수 있으며, 생성물은 지연된 흡착성을 가지므로 그의 작용이 연장된다.
유럽 특허 제 28,172호, 미합중국 특허 제 4,338,298호 또는 언리스티드 드러그스 30(1978), 123-글래트박스 K 88에 따르면, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli) 종의 장 병원성 균주를 기초로 한 백신이 도살용 신생 동물의 수동 면역에 사용된다는 것이 기재되어 있다. 백신을 출산 전에 어미 짐승에게 근육 내 또는 피하 투여하여 콜리 박테리아에 의한 설사로부터 출생후의 송아지, 돼지새끼 등을 보호한다.
콜리 박테리아에 의한 백신은 이미 인간에게도 제안되고 있다. 독일특허 제 1,931,195호에 따르면, 기도의 감염으로 고통받는 환자의 객담으로부터 미생물을 채취하여 에어로졸 형태의 백신을 제조하고, 이를 흡입법에 의해 투여하는 기도의 면역 요법이 시도되었다. 많은 다른 박테리아종 및 균주외에도, 백신은 에스케리키아 콜리의 종 및 균주를 포함한다.
프랑스 특허 제 2,397,839호에 따르면, 11종의 다른 에스케리키아 콜리 균주와 함께 여러종의 박테리아의 죽거나 감쇄된 세균으로 구성된 또 다른 백신을 경구 투여하여, 위장관의 면역에 사용하고, 위장염을 치료 및 예방하였다. 이 백신은 또한 메티오닌, 철염, 비타민, 락토바실리 등을 함유한다.
반면에 요로 감염에 대한 백신, 특히 에스케리키아 콜리 유래의 백신은 아직까지 개발되어 있지 않고 있다. 이런 요로 감염에 대한 백신의 부재는 이 감염이 첫째 항생물질 및 화학 요법의 광범위한 사용에도 불구하고 이 감염이 줄어들지 않고 만연하고 있다는 것 및, 둘째 재발(재발율이 80% 이상)되어 만성적으로 된다는 것과 같은 의학상 중요한 문제를 야기시키기 때문에 더욱 놀라운 것이다.
이 백신이 없는 이유는 많은 수의 에스케리키아 콜리 혈청 타입 때문이다. 특히, 이들 박테리아는 주로 3군의 항원, 즉 약 160의 0항원 타입, 60이상의 K타입 및 60이상의 H타입을 갖는 매우 복잡한 항원 구조를 가지고 있으며, 이들을 조합하면 약 10,000종의 혈청의 다른 에스케리키아 콜리 균주가 된다. 이렇게 많은 수의 균주로 인해, 적절하게 수용할 수 있는 수의 에스케리키아 콜리 균주로부터 요로 감염에 대해 널리 효과적인 백신을 얻을 수 있다는 것은 거의 희망이 없다.
요로 감염에 대한 전반적 활성을 얻기 위해, 질병의 박테리아 기원과는 상관없이 방광염, 전립선염, 신우염 및 신우염에 대한 면역성을 갖는 백신을 사용해야 한다. 그러나, 면역성의 범위가 넓을수록 내생계에 퍼져있는 면역 반응의 가능성이 더 커진다는 것은 명백하다.
공지한 바와 같이, 콜리 박테리아는 채(綵)(털,원섬유)를 보유하며, 이는 장의 콜리 박테리아를 장점막에 부착시키며, 채의 도움 없이는 콜리 박테리아가 장에서 흘러 나오므로 장 내의 콜리 종과 다른 박테리아 종 사이의 생리적 평형이 심하게 파괴된다. 그러므로, 콜리 박테리아 유래의 백신을 사용하면, 채내에서 생성된 항체가 통상적으로 채를 보유하는 모든 계 및 장의 콜리 박테리아와 반응하게 되므로, 장내 균상에 상술한 바와같은 파괴가 일어난다.
그러나, 놀랍게도 요로 감염 환자의 뇨로부터 분리된 적당수의 에스케리키아 콜리 주 및 다른 몇 종의 박테리아로부터 상술한 단점과는 반대로 장내 균상에 실제적으로 해로운 효과를 나타내지 않으며 요로 감염에 대해 특이적이고 전반적인 활성을 나타내는 백신을 제조할 수 있다는 것이 발견되었다.
본 발명에 따르면, (1) 요로 감염 환자의 뇨로부터 분리된 에스케리키아 콜리, 크랩시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumoniae), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 모르가니이(Proteus morganii) 및 스트랩토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis)로 이루어진 8∼14종의 뇨의 병원성 박테리아 균주의 배양액으로부터 유래되고, 1ml당 각 균주의 세균이 약 5천만∼5억의 양으로 존재하고, 사용된 균주의 1/2∼3/4이 에스케리키아 콜리 종에 속하는 불활성화 박테리아, 및 (2) 콜로이드형 인산 알루미늄을 1ml당 1.5∼10mg의 AlPO4의 양으로 함유하는 멸균 등장 용액의 현탁액으로 구성된 신규의 백신이 제조된다.
이 백신은 요로 감염 환자의 뇨로부터 분리 되었으며 그의 1/2∼3/4이 에스케리키아 콜리 종에 속하는 상술한 8∼14뇨의 병원성 박테리아 균주를 각각 적당한 영양 배지에서 배양하고, 배양이 끝났을때 생성된 특정 생물적 물질을 수거하여 공지방법에 의해 불활성화시키고, 각 균주로부터 수득된 불활성화 박테리아를 또 다른 박테리아와 혼합하고, 혼합물을 1ml당 각 균주의 약 5천만∼5억세균이 존재하도록 멸균등장 용액으로 희석하고, 콜로이드형 인산 알루미늄을 1ml당 1.5∼10mg의 AlPO4농도로 가함으로써 제조된다.
본 발명은 하기에 더욱 상세히 설명된다.
[실시예]
오료 감염 환자로부터 뇨시료(중간부분의 뇨)를 먼저 분리하여 맥콘케이(MacConkey)한천에 즉시 접종시키고, 접종 후 한천 평판을 37℃에서 16∼18시간동안 배양한 후, 형성된 군락을 분리하여 그의 생화학 및 생물적 특성을 결정함으로써 확인한다.
스트렙코코쿠스 파에칼리스(장내구균 속)의 확인
특징적인 작은 군락의 그램 염색 및 하기의 시험에 의해 확인한다.
카탈리제(가열된 혈액존재하)
- 용혈현상 -/β
- 45℃에서의 성장 +
- pH 9.6에서의 성장 +
- 6.5% NaCl 용액에서의 성장 +
- 40% 담즙에서의 성장 +
- 다당류 항원 D의 검출 +
이·콜리, 프로테우스 속 및 크렙시엘라 속의 균주를 확인하기 위해 하기의 표준을 사용한다.
Figure kpo00001
이러한 방법으로 확인된 군락을 한천 평판에서 37℃로 24시간 동안 더 성장시키고, 생리 식염수에 현탁시킨 후, 그램 염색 방법에 의해 순도를 시험하고, 동결 건조시킨다. 수득된 각 균주는 하기와 같은 특성을 나타내며, 이들을 표에서와 같이 명명한다.
Figure kpo00002
Figure kpo00003
Figure kpo00004
Figure kpo00005
분리된 상술한 균주의 형태학적 특성은 다음과 같다.
에스케리키아 콜리(Escherichia coli) : 그램 음성의 막대형, 1.1∼1.5×2.0∼6.0㎛(생존형), 균체에 돌출한 편모에 의한 운동.
프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 및 프로테우스 모르가니이(Proteus morganii) : 그램 음성의 막대형, 캡슐이 없는 0.4∼0.6×0.1∼3.0㎛ 균체에 돌출한 편모에 의해(모두 다 그런것은 아님).
크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella penumoniae) : 그램음성, 비운동성 막대형, 0.3∼1.5×0.6∼6.0㎛ 스트렙토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis) : 그램 음성의 난원성 구균, 0.5∼0.1㎛, 비운동성.
에스케리키아 콜리 주의 혈청학적 특성을 더 연구한다.
이런 목적을 위해 먼저 슬라이드에서 다가의 OK 혈청, A,B,C,D 및 E으로 응집 시험을 수행한다. 디프코 실험실[디트로이트(MI, USA), 1976]의 지시에 따라 혈청 타입을 결정한다.(O,K 및 H 항원의 결정). 이 확인은 다음의 양상을 나타낸다.
Figure kpo00006
상기에서 언급 및 확인한 10균주는 네덜란드 3740 AG 바안 오스테르스트라트 1의 센트랄뷰로 보르 쉼멜컬쳐스(Centraalbureau voor Schimmelcultures)에 1984년 8월 8일자로 GBS 516.84∼CBS 525.84의 수탁번호로, 그리고 독일연방공화국 3400 괴팅겐 그리세바흐스트라쎄 8의 도이취삼룽 폰 미크로오르가니스멘에 DSM 3229∼DSM 3238의 수탁번호로 기탁되어 있다.
백신을 제조하기 위해, 균주를 각각 고체 또는 액체 영양 배지에서 배양한다. 고체 영양 배지, 예를들면 하기의 조성을 갖는 영양한천(영양한천 Difco)이 바람직하게 사용된다 :
육류 추출물(Difco 육류 추출물) 3g/1
박토 펩톤 5g/1
염화나트륨 5g/1
박토 한천 15g/1
배지는 121℃에서 15분간 살균하며 그의 pH는 약 7.2이다.
대규모 생산을 위해서는 루(Roux)병을 사용하며, 실험실에서 제조하는데는 페트리디시를 사용한다. 접종은 접종물질을 사용하여 수행하며, 접종물 수 ml를 표면 전체에 균일하게 접종한다. 루 병을 목면 마개로 닫고, 배지를 접종된 표면이 바닥에 오도록 저장한다. 접종된 배양액을 37℃에서 24시간 동안 배양한다.
박테리아 배양물을 한천 표면이 손상되지 않도록 부르럽게 교반하면서 필요량(용기에서 배양물의 성장 밀도에 따라)의 인산 완충액/식염 용액(PBS)로 헹군다. 각 병 또는 각 페트라디시로부터 도말 표본을 수득하여 그램 방법에 의해 염색하고, 순도를 시험한다. 오염된 것으로 나타나는 병 또는 페트리디시는 버린다. 한균주 및 한 수확물로부터 얻은 현탁액을 멸균 나일론 거즈를 통해 함께 통과시킨다.
배양물 그 자체와 마찬가지고 각 균주에 대해 불활성화를 일으킨다. 불활성화는 약 55∼60℃의 온도에서 1시간 동안 가열하거나, 포름 알데히드 용액으로 처리하거나, γ-선을 조사함으로써 수행될 수 있다. 그의 단순성 때문에 가열에 의한 불활성화가 바람직하다.
배양에 의해 수득된 양을 합하여 60℃의 수욕에서 1시간 동안 불활성화시키고, 열에 의한 불활성화 후에 폐놀을 가한다.(최종 농도 0.35%)
살균 시험 및 확인시험을 위해 현탁액의 샘플을 취하고, 농축된 총저장물을 냉장고에 저장한다.
살균 시험에서 30일 후 어떤 불순물도 나타나지 않는다면, 제조공정을 계속한다. 살균 시험을 14일간 행하고, 살균성 샘플이 어떤 생물체의 성장을 나타낸다면, 이 수확물을 제거한다.
저장용기의 내용물(한 균주로부터 얻어진 불활성화 현탁액)을 냉각된 원심분리기(소르발 4CR, 업스윙 로우터 2,000)에서 3,000rpm으로 1시간동안 원심분리하고, 상층의 액체를 제거한후, 박테리아 침전물 0.01% 티오메살을 함유한 식염 용액에 현탁시킨다. 저장 농축물의 밀도를 혼탁도 표준에 의해 결정하고, 현탁액을 명명하여 4℃(±2℃)에서 저장한다.
이.콜리, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 모르가니이, 크렙시엘라 뉴모니아 및 스트렙토코쿠스 파엘칼리스의 10균주의 농축된 현탁액을 1ml의 혼합물 속에
이.콜리, 6균주
각각 2.5×108, 합계 1.5×109세균
프로테우스 미라빌리스, 1균주 1.5×107세균
프로테우스 모리가니이, 1균주 7.5×107세균
크렙시엘라 뉴모니아, 1균주 3×108세균
스트렙토코쿠스 파에칼리스, 1균주 5×107세균
총 2×109세균/ml
가 함유되도록 혼합한다.
최종 농도는 각각의 저장 현탁액을 혼합함으로써 수득한다. 설명된 농도는 0.01%의 메티올레이트를 함유한 0.15M 인산완충염 용액으로 회석함으로써 얻어진다. 저장액을 실온에서 24시간동안 유지시키고, 4℃(±2℃)에서 저장한다.
인산알루미늄 겔을 가하기 때문에, 농도는 따라서 더 높아져야 한다. 인산 알루미늄 겔은 다음과 같이 제조된다.
854g의 포타슘 알루미늄 설페이트, 12H2O를 6l의 물에 용해시키고, 용액을 여과한다. 또한, 685g의 트리소듐 포스페이트. 12H2O를 6l의 물에 용해시킨다. 알루미늄 용액은 실온에서 상당히 과포하되기 때문에, 37℃의 온도에서 유지시킨다. 2용액을 동시에 21l의 물에 붓는다. 침전물을 원심 분리하여, 침전물을 13l의 물에 재현탁시키고, 현탁액을 다시 원심 분리한다.
최종적이로, 침저물을 재현탁시키고, 현탁액을 총 부피가 8.1l로 되도록 만든후, 5N NaOH에 pH 6.0으로 조절하고, 121℃에서 1시간동안 오토클레이브 한다. 이 양은 3mg의 AlPO4/ml 또는 0.66mg의 Al/ml를 함유한 백신 66l를 제조하기에 충분한 것이다.
pH 6.2∼7.0이 되도록 pH 시험한후, 흡착된 최종 백신을 1ml 용량의 피로겐이 없는 멸균 앰플에 1회용량 0.5ml씩 도입한다. 백신은 도입하는 동안 반드시 진탕되어야 한다.
1회용량, 즉 0.5ml중의 불활성화 된 미생물의 총수는 약 1×109세균이다.
최종적으로, 백신을 유럽 약전(2판, 1st supplement 1980)에 따른 살균성 시험, 세계 보건 기구의 명세서(생쥐의 체중 증가)에 따른 독성시험, 및 유럽 약전에 따른 정상 독성 시험한다.
백신은 또한 상술한 액체형 대신에 동결 건조형으로 존재할 수 있다. 동결 건조형은 다음과 같이 제조된다.
상기의 제조벙법에서 제조된 농축 불활성화 현탁액을 이미 설명한 바와 같이 0.5ml에 약 1×109세균/ml 의 불활성화 박테리아가 포함되도록 희석한다. 0.85N NaCl 용액중에 0.01%의 티오메살을 함유하는 인체 알부민 또는 혈장 대응 헤마셀 R(제조원 : 독일연방공화국 3500 마르부르그 베링 베르케 AG)의 1% 용액을 희석용으로 사용한다.
2ml의 바이알에 멸균 조건하 상술한 희석 현탁액 0.5ml를 채우고, 약 -45℃에서 동결시킨후, 동결 건조장치에서 진공 건조시킨다. 건조 온도는 +36℃를 초과하지 않아야 한다. 완전한 동결 건조 과정은 24시간 걸린다. 동결 건조 후, 바이알을 질소 대기하에 고무 마개로 밀봉하고, 알루미늄 캡으로 고정시킨다.
2mg/ml의 AlPO4농도를 갖는 수성 인산 알루미늄겔을 인산 알루미늄 도입용으로 사용하고 동시에 투여전재용해용 용매로 사용한다.
인산 알루미늄 겔의 제법은 상술한 제조방법에서 설명되었다. 이렇게 수득된 인산 알루미늄 겔은 앰플에 도입하기 전에 최종 농도가 2mg/ml가 되도록 식염 용액(약12배)으로 희석한다.
1ml 용양의 앰플에 0.5ml 양을 채운다. 백신의 저장기간을 시험하기 위해, 생쥐에서 항체을 형성하는 백신의 능력을 2번, 특히 제조 후 즉시(1981년12월 3일) 및 그로부터 2년후(1983년12월 7일)에 측정하였다.
생쥐의 면역 : 각각10마리씩으로 이루어진 6군의 생쥐(숫컷, NMRI 이계 교배, 16∼20g 체중)를 백신으로 복강내 면역화한다. 2회 용량(0.5ml의 백신)을 2주 간격으로 주사한다. 대조용으로 사용된 동일 교배 및 동일 체중의 생쥐 20마리에는 인산 알루미늄 겔(0.5ml)만을 주사한다. 2번째 주사로부터 2주후에 혈액을 무균채취하고, 각 군에 따라 모은다. 응고후, 각 군으로부터 원심분리에 의해 혈청을 수득하고, 혈청 시험이 수행될 때까지 -22℃에서 심부 동결 저장한다.
항원(응집원)의 제법 : 백신에 함유된 9종의 동종 박테리아 균주를 항원 제조용으로 사용한다. 균주 Ec 654는 응집될 수 없으므로(R형)응집원으로 사용될 수 없다. 박테리아 균주의 동결 건조된 배양액을 9ml의 영양 배지(송아지 침출 브로스-Difco)에 현탁시키고, 37℃에서 24시간 동안 배양한다. 항원 제조를 위해 두번째 계대 배양액을 사용한다. 600ml의 영양배지(송아지 침출 브로스)를 종 배양액(각 균주)으로 접종하고, 37℃에서 36시간 동안 배양한다. 최종 농도가 0.1%가 되도록 포르말린을 가하고, 37℃에서 7일동안 배양한다. 각 배양액에 대해 생존 미생물의 부재 및 살균성을 시험한다. 불활성화 된 박테리아 현탁액을 냉각된 원심 분리기(소르발)에서 3,000rpm으로 1시간동안 원심분리한다. 침전물을 인산완총액/식염용액(pH 7.2)에 재현탁시켜 1ml에 20×109박테리아가 함유되도록 한다. 응집 시료를 위한 응집원으로 약 2×109박테리아/ml를 사용한다.
응집시험 : 생쥐 혈청은 pH 7.2의 인산 완충 생리 식염수로 1:2 희석 단계로 희석한다. 각 경우, 0.3ml의 혈청 희석물을 칸 튜브에서 같은 부피의 항원과 혼합한다. 혈청을 가하지 않은 하나의 튜브를 대조용 항원으로 사용한다. 37℃에서 18시간 및 4℃에서 24시간 배양한 후, 반응을 체크한다. 박테리아의 응집을 눈으로 검사할 수 있는 최대 희석물을 특정 혈청의 타이터로 취한다. 음성 및 양성 혈청을 모든 배치의 대조용으로 실시한다.
생쥐 혈청의 응집 타이터로 하기의 평균치가 관찰된다.
Figure kpo00007
이들 결과로부터, 이 백신은 4℃에서 2년이상 저장할때 그의 활성을 그대로 유지한다는 것을 알수 있다. 이 백신의 적응증은 특히 방광염, 전립선염, 방광신우염 및 신우신염이다.
급성의 열(금기)이 없는 환자에게 각 1∼2주 간격으로 0.5ml의 백신을 주사액을 총 3번 근육내 주사한다. 백신에 대한 부작용이 나타나면 치료를 중단해야 한다.
1년후, 추가 면역으로서, 0.5ml를 반복 주사해야 한다.
각종 병원에서 요로 가염의 증세가 나타난 383 환자에게 백신을 접종하고, 1년이상 더 관찰한다. 결과는 이 접종에 의해 요로의 저항성이 1년이상 지속되는 향상된 결과를 나타내며, 이것은 실제로 요로 감염의 재발을 예방할 수 있다는 것을 나타낸다. 임상적 연구의 결과는 하기표에에 요약한다.
1-12개월 관찰하는 동안의 재발/재감염의 수
Figure kpo00008
내성은 양호한 것으로 설명될 수 있다. 어떤 심한 부작용도 나타나지 않는다. 이 백신은 또한 문제없이 임산부에 사용될 수 있다. 이것은 100명 이상의 임산부에서 얻어진 결과이다.
본 발명의 필수적인 태양 및 이점 및 본 명세서에서는 상세히 설명되지 않은 신규 백신의 약학적 및 임상적 연구의 결과는 하기에 요약한다 : 10종의 상이한 균주의 정량적 조성은 요로 감염 병원균의 분포에 따른다.
75%의 균주는 이.콜리 주(일률적으로 표시)이고, 25%는 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 모르가니이, 크렙시엘라 뉴모니아 및 스트렙토코쿠스 파에칼리스 주이다.
이들 뇨 병원성 균주를 불활성화하여 예를들면 채 항원 및 0-항원과 같이 예방할 수 있는 항원을 함유하게 한다. 또한, 항원으로 선택된 균주는 생쥐에 예방 시험할때 동일 병원균 종의 이종 균주에 대해 교차예방을 나타낸다.
생쥐의 체중 증가 시험에서 증명할 수 있는 바와 같이, 백신으로 표현되는 불활성화 항원은 6개월 이상 냉저장소에 저장한 후에 독성이 현저하게 저하된다.
이 백신은 접종된 동물(생쥐,토끼) 및 접종된 인간에 면역 반응을 일으키며, 치명적인 감염으로부터 생쥐를 예방하고, 실험적인 신우신염으로부터 쥐를 예방한다.
양호한 면역 반응을 일으키는 항원 양에 상응하는 정량 및 정성적인 조성은 환자에게 어떤 심한 부작용 또는 어떤 부작용도 나타내지 않는다.
이 백신은 또한 접종된 환자의 뇨에서 면역 글로부린 A를 분비하게 한다.
이 백신은 료로 감염으로 고통 받는 환자를 치료하고, 12개월 이상 동안 감염의 재발을 방지한다.
이 백신은 액체 또는 동결 건조형으로 제조될 수 있다. 동결 건조형인 경우, 투여전의 재용해 용매로 인산 알루미늄 겔을 사용한다.

Claims (6)

  1. 요로 감염 환자의 뇨로부터 분리되며, 에스케리키아 콜리(Escherichia coli), 크렙시엘라 뉴모니아(Klebsiella pneumonia), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 프로테우스 모르가니이(Proteus morganii) 및 스트렙토코쿠스 파에칼리스(Streptococcus faecalis)로 이루어지고 그중 1/2∼3/4이 에크케리키아 콜리종에 속하는 8∼14종의 뇨의 병원성 박테리아 균주 각각을 적당한 영양 배지에서 배양하고, 배양이 종결되었을때 생성된 생물적 물질을 제거하여 통상적인 방법으로 불활성화하고, 각 균주로부터 수득된 불활성화 박테리아를 서로 혼합하고, 혼합물을 1ml당 각 균주의 약 5천만∼5억 세균이 존재하도록 멸균 등장 용액으로 희석하고, 콜로이드형 인산알루미늄을 1ml당 1.5∼10mg의 AlPO4농도로 가함을 특징으로 하는, 인체의 요로 감염의 예방 및 치료용 백신의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 에스케리키아 콜리 종 6균주 및 기타 크렙시엘라 뉴모니아, 프로테우스 미라빌리스, 프로테우스 모르가니이 및 스트렙토코쿠스 파에칼리스 종 각각 1균주를 배양에 사용하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 에스케리키아 콜리 Ec 455 UB(DSM 3229), 525 UB(DSM 3230), 560 UB(DSM 3231), 616 UB(DSM 3232), 654 UB(DSM 3233) 및 719 UB(DSM 3234), 크렙시엘라 뉴모니아 16B(DSM 3235), 프로테우스 미라빌리스 63B(DSM 3238), 프로테우스 모르가니이 58B(DSM 3237) 및 스트렙토코쿠스 파엘칼리스 676(DSM 3236)의 균주를 배양에 사용하는 방법.
  4. 제1∼3항중 어느 한항에 있어서, 생물적 물질의 수 현탁액을 55∼60℃에서 약 1시간 동안 가열하거나, 포름 알데히드로 처리하거나 또는 Υ-선을 조사함으로써 생물적 물질을 불활성화 시키는 방법.
  5. 제1∼3항중 어느 한항에 있어서, 각 균주로부터 수득된 불활성화 박테리아를 서로 혼합하고, 백신이 1ml당 총 2×109세균의 양을 함유하도록 혼합물을 희석하는 방법.
  6. 제1∼3항중 어느 한항에 있어서, 0-(에틸 머큐리티오)벤조산(티오메살)과 같은 방부제를 백신에 가하는 방법.
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