JPH07502174A - 家禽病を発症させる新規バクテリアとそれから誘導されたワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、　培養物が請求項１または２に記載の細菌を含むことを特徴とする、細菌を 含む微生物培養物。

４、　請求項１または２に記載の細菌から誘導したものであることを特徴とする 、家禽類の呼吸器疾患に有効なワクチン。

５、　細菌が不活性化されていることを特徴とする請求項４に記載のワクチン。

６、ワクチンが補助剤をも含むことを特徴とする請求項４または５に記載のワク チン。

７、さらに家禽類にとって発病性のあるウィルスまたは微生物からの少なくとも １つの他の抗原を含むことを特徴とする請求項４から６のいずれかに記載のワク チン。

８、　微生物またはウィルスが、感染性気管支炎ウィルス、ニューキャッスル病 ウィルス、感染性粘液貴店（Ｇｗｍｂｏｒｏ　）、ニワトリ貧血因子、鳥類レオ ウィルス、Ｍ７ｃｏｐｌｓｓｍｚｇｓｌ１ロｅｐｌｉｅｕｍ　、シチメンチョウ 鼻気管炎ウィルス、Ｈ＊！ａｏｐｈｉｌｏｓ　ｐｔ＋＊Ｂ１１１ｎｓ＋ｕ＋　（ Ｃａｒ！■）　、ニワトリ天然痘ウィルス、鳥類脳を髄炎ウィルス、鳥禽コレラ 、大腸菌からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項７に記載 のワクチン。

９、　細菌性疾患防止用のワクチン調製のための、請求項１または２に記載の細 菌の使用。

明細書 家禽病を発症させる新規バクテリアと それから誘導されたワクチン 本発明は、新規タイプのグラム陰性好気性桿状細菌、それから誘導されたワクチ ン、及び新規タイプのグラム陰性好気性桿状細菌の使用に関する。

この数十年間に多くの国ではニワトリと家禽の飼育場の数が急増し、また１飼育 場当りの飼育数も増加してきた。この状況は深刻な結果を招いている。新しいよ り優れたワクチンとこれら諸国でのワクチン接種計画がますます必要になってき た。今日では、大部分の家禽が、ウィルス、バクテリア、寄生虫によるいくつか の病気に対する免疫を持っている。家禽のウィルス性疾患の例には、ニューキャ ッスル病、感染性気管支炎、シチメンチョウ鼻炎気管支炎、ンチメンチョウヘル ペスウイルス、伝染性」二皮腫、感染性帖液嚢症などがある。細菌性疾患の例に は、鼻感冒、サルモネラ感染症、敗血症、パスツレラ菌感染症、大腸菌感染症が ある。

新しい細菌性呼吸器疾患が、ニワトリとシチメンチョウで驚くほど観察されてい る。この疾患は、鼻感冒と呼ばれる疾病の原因であるＨｇｅｍｏｐｈｉｌｕｓ　 ｐＩ＋ｘｇｇｌｌｉ■＋ａｍ菌のワクチンを接種したニワトリに見られた。鼻感 冒は、パスツレラ科及びナイセリア科に属する細菌によって起こる、ニワトリの これまでに知られている唯一の呼吸器疾患である。この新しい疾病の症候は、鼻 感冒特有の症候とは異なる。鼻感冒は主として上部気道の感染症である。感染し た家禽は、奨液ないし粘液様の鼻水、顔面浮腫、結膜炎を示す。しかし、たとえ ば気嚢炎、咳、肺炎、肋膜炎などの下部気道の疾患に属する臨床的徴候を示さな い。この新しく発見された疾病が下記のような下部気道感染症の臨床的徴候を示 すとすれば、Ｈｐ１目ｇＩｌｌｉｎｓ＋ａｍは原因から除外できる。

この新しく発見された疾病は、ニワトリでは次のような臨床的徴候を特徴とする 。この新病病の最初の前兆は、軽いスニッキングである。２〜３日後に少数のブ ロイラーに通常は軽い鼻水または軽い顔面浮腫あるいはその両方が発生し、通常 は２〜４０後には消える。スニッキングは、家禽を処分するまで続いた。呼吸器 徴候の出現から１〜３日以内に飼料接種量減少の証拠が検出できる。これは、主 としてしばしば胸部気嚢の肥大を伴う肺炎及び肋膜炎で倒れたブロイラーの致死 率の若干の増大に関連している。これらの病巣からは大腸菌が主に単離される。

その後の損失は、主として大幅な気嚢膜に関連する。徴候の出現時に生きたブロ イラーを検査すると、通常は特定の病変は見つからない。罹患したブロイラーの 膿廖からは時々パスツレラ様微生物が単離できる。２日後に、３０〜６０％のブ ロイラーで、特に腹部及び一部気嚢の広範な併発を示す。気嚢膜のひどい肥大が 特に顕著である。これらの気嚢は、しばしば大量の白黄色のクリーム状滲出物を 含んでいる。幾分ベルベット状の外観の気嚢も普通に見られる。白っぽいクリー ム色の気泡状滲出物がＳ間膜にもしばしば見られる。組織病理学検査によれば、 表面上及び膜内に線維素性滲出物を伴う滲出性炎症過程が卓越し、浮腫も伴う。

血漿細胞及び異好性抗原の蓄積が、若干の多核巨大細胞及び肉芽腫性浸潤と共に 顕著である。チール・ネールゼン染色及びＰＡＳ染色した切片には特定の微生物 は見えない。生きた家禽では、心責炎、肝周囲炎、肺炎は通常見られない。罹患 した気嚢からパスツレラ／カイセリア様の微生物が単離された。この単離物は、 パスツレラやナイセリアに関係はあるもののそれらの種には属さず、その生物学 的能力に若干の変動が認められたという意味で、従来種ではないように思われた 。

世界のいくつかの地域ではクチメンチョウ群で上部気道のかなりの感染が見られ た。当初は致死率は低いとされていたが、現在では、この疾患によるシチメンチ ョウの死亡率は５％にも上ることがある。最初の臨床的徴候は、ニワトリの感染 症と同様であり、くしゃみと鼻水である。急性感染症の臨床的徴候が見られるの ものあった。死亡したシチメンチョウを剖検すると、肺浮腫、線維素性化膿性肺 炎、それにしばしば奨液線維素性心嚢炎と奨液線維性気嚢感染症が見られた。

感染した気嚢から細菌を単離し精製した。大量の純粋な病原体を得るため、精製 後に単離物を濃厚寒天培養皿で増殖させた。

コツホの法則の有効性を検査するため、一群の特定の病原体を含まない（ＳＰＡ ）実験動物を単離体の混合物で感染させた。

感染後、実験動物はすべて、現場感染で見られるものと区別できない臨床的徴候 を示した。感染した実験動物の気嚢からは、攻撃菌株と血清学的に区別できない 細菌が単離された。

罹患したニワトリの気嚢から、類似した相同性の高い４種の菌株が単離された。

非常に類似した１種の菌株がシチメンチョウの気嚢から単離された。これらの菌 株はグラム陰性好気性桿状菌と同定された。様々な単離体は、その発酵パターン に僅かな違いを示した。しかし、すべての菌株は明ら力）書こ同じ血清型に属し ている。すなわちこの５種の菌株のそれぞれ（こ対して生成された血清が各菌株 と（交叉）反応した。ニワトーノ菌株の１つを、オランダ０ｏｓｌｅｚｌ＋■ｌ 　１．　ＰＧ、　ｂｏｘ　２７３．　３７４０八Ｇ　８１１＋１１のＣｅｎ１＋ ■ｌｂｕｒｅｓｗ　ｔｏｏｒ　ＳｃｈｉｍＩＩｅｌｃａｌｌｕ＋！＋　（ＣＢ　 Ｓ　）　ｌこ受入れ番号４００．９２として寄託した。

本発明は、新規タイプのグラム陰性好気性桿状ｍ菌を提供するものである。この 新規タイプの細菌は、Ｃｅｎ１＋ｓ＊Ｉｂａ＋ｅｔ。

マｏｏ＋　Ｓｃｈｉｍｓｅｌｃｅｌｌｏ＋ｓ＋　ｌこ受入れ番号４００．９２と して寄託された細菌であることを特徴とする。

「新規タイプの細菌」とは、寄託された菌株と血清学的１こ関係するグラム陰性 好気性桿状細菌を言う。血清学的１こ関係する細菌とは、寄託された菌株に対し て生成された血清と交叉反応性を示す細菌を言う。

詳細には、このグラム陰性好気性桿状細菌は、寄託された菌株に対する抗血清と 血清学的検査で既知のグラム陰性好気性桿状細菌に対する抗血清よりも高いタイ ターを与えると考えられる。

さらに詳細には、本発明は、寒天ゲル沈降試験で、寄託された菌株に対して誘導 された抗血清と陽性に反応する、グラム陰性好気性桿状細菌を対象とする。

寄託された細菌は、ＢｅＢＢ’＋　Ｍｔｎ■ｌ　ｏｆ　５Ｈ１ｅ−１目ＣＢｔｃ ｌｅ＋ｉｏｌｏｇ７　Ｖｏｌｗｓｅ　ｌ　（１９８４，ｍ１ｌｌｉｏｎｓ　ｓｎ ｄ　Ｗｉｌｋｉｎｓ、４２１１Ｅ＊ｓｌ　Ｐ＋ｅ＋Ｎ＋ｎ　５ｌｉｅｅｔ、Ｂｔ ｌｌｉｍｏ＋ｅ　Ｕ、Ｓ、＾、、１９８４１及び＾、Ｐ、ＩＳＹＳＴＥＭ　（Ｌ ！Ｂｓ１ｍｅ−ｌｅｓ−Ｇ＋ｏｌｌｅ＋　３１１３９０　Ｎｏｌ１ｌ＊ｌｉｓｗ −Ｖｓ＋ｃｉｅ。

Ｆ＋ｔｎｃｅｌ　システム番号ＡＰＩ　２ＧＥ、　ＡＰＩ　２０１１Ｅ、　Ａｌ ’＋　５（ＩｃＨＥ、　ＡＩ’＋２ＹＭ、ＡＰＩ　ＯＦを使って、標準の決定方 法にしたがって型式検査した。結果を表１に示す。

表１．　鑑別試験 硝酸塩還元　− ■因子必要性　− カタラーゼ　− チトクローム酸化酵素　十　− ＭｃＣｏＬｌｋｔ７寒天培養　− ホゲス・プロスカラエル試験（３７℃）＋（引ウレアーゼ　＋ リジンデカルボキシラーゼ　− オルニチンデカルボキシラーゼ　− ０、　Ｎ、　Ｐ、　ＧまたはＰ、　Ｉｔ、　Ｐ、　Ｇ　（β−１１）　＋偏性好 気性　− アルギニンデヒドロラーゼ　＋（Ｉｆに依存）インドール　− 果糖発酵　十 乳糖発酵　十 ガラクトース発酵　十 表１に示した特徴の組合せは、この新規タイプの細菌において他の既知の細菌性 家禽病原体に比べて独特である。

（Ｄｉｓｅｓｓｅ＋　ｏｌ　Ｐｏ５ｌｌ＋ｒ　８．　１ｏｆｔ　５１ｇ１ｔ　Ｕ ｎｉｙｅ＋５ｉ１７　Ｐｒｅ■＋９８４）。本発明による菌株は、寄託した菌株 が陽性に反応する表１の試験で陰性に反応し、あるいはその逆のことが偶然にあ る。反応が弱陽性と陰性との間で変わるとき特にそうである。

これは、被験菌株間の小さな差異、生物系に固有の僅かな差異によるものかもし れない。また様々な試験所における反応条件の小さな差異によるものかもしれな い。

寄託細菌の特徴をもつ数種のニワトリ菌株を上記の疾患に罹ったニワトりから単 離し、特定の病原体を含まない（Ｓ　Ｐ　Ｆ）ニワトリの生きた病原体による攻 撃で誘導された抗血清が単離した菌株と（交叉）反応を起こすかどうか検査した 。表２に示すように、Ｋ、Ｌ、ヘドルストン（ｔｌｅｄｄｌｅ＋１ｏｎ）らの方 法（Ａｔ口ｎ　Ｄｉ＋ｅ■ｅｓ　１６：　９２５　（１９７２）　）に従って煮 沸嚢抗原を使ってＥＬ　Ｉ　ＳＡ法によって決定した、各菌株に対して生成され た抗血清は、他のすべての菌株と〉６の陽性反応を示す。

表２．　寄託菌株と３種の同族菌株の、Ｅｌ、ＩＳＡによって決定した（交叉） 反応性 Ｌ！！　３０３７／９１　３０３／９１　３２Ｎ／９１／（八）　３２Ｈ１／９ １／（Ｋ＞３２６３／９１　Ｎ　＋２　＞１３　１３３２９０／９Ｈ＾ｌ　９　 ９　ＩＩ　１０３２９０／９１（Ｋ）　１３　１２　１２　１２下線を施した菌 種は、ｎｒ、　ＣＢＳ　４００．９２として寄託された細菌である。

表に示した菌株のうちの１つをワクチン（例Ｉのように調製したワクチン）接種 したブロイラ一群のプールした血清を上記のＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験で（交叉）反応 性について試験した。補助薬の存在下でワクチンの反復接種後にタイターは増加 した。菌株ＧＧＤ１２６１は、Ｈ，Ｍ、　ハーフエズ（Ｈａｆｅｚ）博士（Ｓｌ ａｔｅ　Ｖｅｔｃ＋ｉＩＢ　Ｌｔｂｏ口ｔｏＢ　ｏｆ　Ｓｌｕｌ１ｇｓ目Ｇｅ＋ ｍ１ｎ７）によりシチメンチョウから最近単離された菌株である。表３を見ると 明らかなように、すべての菌株は（交叉）反応するが、ニワトリに由来する菌株 はニワトリ菌株に対する抗血清とより強く反応し、シチメンチョウ菌株はシチメ ンチョウ菌株に対する抗血清とより強く反応する。

表３．　煮沸嚢抽出物に対する群の混合血清の、ワクチン接種後の血清学的応答 。血清は２回目のワクチン接種の３週間後に採取。

下線を施した菌種は、ｎｒ、ＣＢＳ　４０Ｇ−９２として寄託された細菌である 。

前記の疾患に罹患した実験動物の気嚢から単離可能などの菌株もまた寄託菌株に 血清学的に関係するどの菌株も本発明の範囲内に含まれる。したがって、この新 規タイプの細菌は、寄託細菌菌株と交叉反応する細菌を含む。すなわち、この新 規タイプの細菌に対して生成された（２）清は、寄託細菌に結合し、その逆も成 り立つ。本発明の新規タイプの細菌と他のグラム陰性好気性桿状細菌を区別する ために、次の２つの血清学的試験を行った。

ａ）本発明の菌株をニワトリから単離した菌株３０３７／９１、菌株３２９０／ ９１　（Ａ）　、菌株３２９０／９１　（Ｋ）及びシチメンチタウから単離した 菌株ＧＧＤ１２６１に対して、Ｋ。

Ｌ、ヘドルストーン（Ｈｅｄｄｌｅ＋１ｏｎ）等（＾マｉ１ｎ　［！口ｅｓｓｅ ＋　１６＋９２５＋１’１７２１）に従って寒天ゲル沈澱試験で試験した。すべ ての場合に交叉反応が見られた。

本発明の菌株をまた、Ｈ１ｅｉｏｐｈｉｌ＋ｕ　ｐｔｒｔ（ｔｌｌｉｎｓ＋ｏ− 菌株Ｈ１８，５ｐｒｏｕ＋　００８３で、Ｋｉｎｇｅｌｌ＊　ｋｉｎｌｅ　とＫ １Ｂｅ１ｌ＊ｄｅｎｉ１＋１ｌｉｃ＊ｎｔに対して、ＳＩ１口ｏｎｃｌ１ｇ　１ ｎｄｏｌｏ（ｅｎｅ＋ｌこ対して、ＰＭ＋ｔｅｕ＋ｅｌｌｉ　ｇｓｌｌｉｎｔ＋ ｕａに対して、Ｐｉ＋ｆｅｕ＋ｅｌｌ＊　ｍｏＨｏｃｉｄ＊の既知の１６の血清 型に対して、またＰ■ｌｅｕ＋ｅｌｌｓ　ｔｎ＊１ｉｐｅ＋１ｉｌｅ＋の１Ｇの 血清型に対して試験した。交叉反応は全く見られなかった。

ｂ）表３に記載の菌株を、Ｉｌｓｅｍｏｐｈｉｌｉｓ　ｐｓ口（１１１ｉｎｔ＋ ａｍの異なる３つの血清型に対して、２種のＫｉｎ（ｅｌｌｔ菌株に対して、５ ｗ１ｌ＋ｅｅｌｌｉ　１ａｄｏ１ｏ（ｓｎｅ＋ｌこ対して、またＩ’■ｌｅｗ＋ ｅｌｌｓ１１１ｉｎＩ＋＊ｓに対してＥＬＩＳＡ検定で試験した。その結果を表 ４に示すが、それを見ると、関係のある菌株間の交叉反応性は（非常に）高いが 、表３の菌株と表４に列挙した既知の菌株の間では交叉反応が全く見られないこ とがわかる。

表４８．　２回目のワクチン接種から３週間後に採取した煮沸嚢抽出物（Ｂ、Ｃ ，Ａ、）血清に対する群の混合血清の血清学的応答。タイターが１０以上の血清 を同じ血清型に属するものと見なす。

表４ｂ、２回目のワクチン接種から３週間後に採取した煮沸嚢抽出物ＣＢ、Ｃ， Ａ、）血清に対する群の混合血清の血清学的応答。タイターが１０以上の血清を 同じ血清型に属するものと見なす。

本発明は、表１に示した生物化学的類似を示すことをさらに特徴とする、上記に 定義した新規タイプの細菌を提供することが好ましい。

詳細には、本発明は、新規細菌の特定の菌株、すなわちオランダのＣｅｎ１ｒｔ ＊１ｂｕｒｅｔａ　ｔｏｏｔ　ＳｃｈｉｍｍｚｌｃＩｌｌｌｎ＋ｅ＋　（ＣＢＳ Ｉ、０ｏ＋Ｉｅｒｚｌ＋■ｌ　１．　ＰＯ，ｂｏｘ　２７３．　３７４０＾Ｇ　 Ｂ■＋ｎに受入れ番号４００．９２として寄託された菌株を提供するものである 。

本発明はまた、上記の新規タイプの細菌を含む微生物の培養に関する。この培養 は、上記細菌を３０〜４１℃の温度で増殖させることによって行う。この細菌は 通常の大気中の酸素圧で増殖させることができるが、環境中のＣＯｘ含有率は０ 〜１０９６に保つことが好ましい。この細菌は、様々な汎用細菌成長促進培地、 たとえばＬｕｒｉａ肉汁や脳心臓浸出液肉汁中で増殖させることができる。この 細菌は、卵たとえばニワトリまたはシチメンチョウの受精卵上で増殖させること もできる。これらの卵は、３５〜４０℃に保温することが好ましい。

本発明はさらに、上記に定義した新たに同定された細菌から誘導したワクチンを 提供するものである。

本発明は、ＣＢＳにｎｒ、４００．９２として寄託された菌株から誘導された細 菌を含むワクチンを提供することが好ましい。

本発明によるワクチンは、生または弱毒または不活性の形の細菌を含むことがで きる。さらに、細胞全体の分画を本発明によるワクチン中の重要な免疫原として 使用することもできる。

好ましい実施例では、上記ワクチンは不活性化した細菌を含む。当技術分野では 様々な物理的または化学的不活性化の方法が知られている。物理的不活性化の例 には、紫外線照射、Ｘ線照射、ガンマ線照射、及び加熱がある。不活性化剤の例 としては、β−プロピオラクトン、ゲルタールアルデヒド、エチレンイミン、及 びホルムアルデヒドがある。

この菌株はホルムアルデヒドで不活性化することが好ましい。

本発明で細菌を不活性化するその他の方法も実施できることは明らかである。゛ 本発明によるワクチンは、好ましい実施例では、補助剤をも含む。補助剤は一般 に、注射された実験動物の免疫応答を高める物質を含む。異なるいくつかの補助 剤が当技術分析で知られる。補助剤の例には、フロイントの完全補助液と不完全 補助液、ビタミンＥ、非イオン性ブロック・ポリマー、ムラミル−ジペプチド、 Ｑｏｉｌｌ　Ａ　、鉱油、植物油、Ｃ５ｒｂｏｐｏｌ　（一種のホモポリマー） がある。さらに、このワクチンは１種または複数の乳化剤、たとえば５ｐｔｎや Ｔｖｅｅ＋＋を含むことができる。

好ましい実施例では、この細菌は油中水型乳濁補助液を含む。

細菌に補助剤を与える他の方法も本発明で実施できることは勿論である。

本発明のワクチンは、ＣＢＳ　４００．９２として寄託された細菌の特徴を有す る新規タイプの細菌の少なくとも１つの抗原を含む。これには、細胞全体、細菌 抽出物、外膜分画、細菌性外毒素／内毒素、精製蛋白が含まれる。抗原性ポリペ プチドまたはその破片が、たとえば精製した細菌蛋白からあるいは対応する遺伝 物質の原始核または真核発現システムでの発現によって、あるいは有機化学合成 によって得られることは明らかである。

本発明のワクチンは、この新規細菌の抗原の他に、好ましくは生または不活性化 したウィルスまたは微生物の形態の、家禽病原体群の少なくとも１種のウィルス または微生物あるいはその両方の抗原性物質を含む。

より好ましい実施例では、上記ワクチンはまた、それだけには隔らないが感染性 気管支炎ウィルス、ニューキャッスル病ウィルス、感染性粘液真症ウィルス（Ｇ ｗｍｂｏ＋ｏ　）　、ニワトリ貧血因子、鳥類レオウィルス、Ｍ７ｃｏｐｌ＊＊ １Ｍ１ｓｌｌｉ＋ｅｐｌｉｃｏｍ、シチメンチョウ鼻気管炎ウィルス、Ｈ＊１ｏ ｐｈｉｌ＋ｕ　ｐ＊ｒｔｇ＊ｌｌｉ＋＋＋＋ｕｍ（ＣＯＩＦＩｌｌ、ニワトリ天 然痘ウィルス、鳥類脳を髄膜ウィルス、鳥禽コレラ、大腸菌からなる群から選択 されたウィルスまたは細菌の抗原性物質を含む。

本発明はまた、呼吸器疾患の予防用ワクチンの調製の為に新規タイプの細菌を使 用することにも関する。

帆↓ 新規細菌の増殖、ワクチンの調製、及びブロイラーのワクチン接種 菌株３０３７／９１．３２６３／９１　（寄託菌株ＣＢ５４００．９２）　、３ ２９０／９１　（Ａ）及び３２９０／９１（Ｋ）の高度に同一の単離体の細胞を Ｃｏ２５〜１０％の環境を得るためにガス・パック中システムを使ってヒツジ血 液寒天上で３７℃で４８時間増殖させた。細胞を洗い流し、コロニー形成単位（ ＣＦＵ）の数を数えた。ホルムアルデヒドを最終濃度０．１８５％まで添加して 、細胞を殺した。滅菌検査の後、細胞を希釈して最終ワクチン１１中に細胞タイ プ当り５×１０’　Ｃ，Ｆ、Ｕ、となるようにした。

４つの菌株と油補助液（鉱油をベースとする油５５％／水４５％の油中水型乳濁 液）を混合して１１当り１菌株当り５×１０８細胞の最終濃度にすることにより 、ワクチンを調製しワクチン接種は生後１０日のブロイラーで行い、ワクチン０ ．５１を首部の中間に皮下注射した。

例■ 攻撃菌株の調製及びワクチン接種群と対照群の攻撃標本１）：細菌菌株３０３７ ／９１．３２６３／９１．３２９０／９１　（Ａ）、３２９０／９１　（Ｋ）を 脳心臓浸出液肉汁中で３７℃で２０時間増殖させた。攻撃のため、最終攻撃ボリ ューム中に下記の数の細胞を含む標本を作成した。

菌株３０３７／９１　３．４Ｘ１０’　Ｃ，Ｆ、Ｕ。

菌株３２６３／９１　２．２ｘｌＯ８Ｃ，Ｆ、Ｕ。

菌株３２９０／９１　（Ａ）３．４Ｘ１０８　Ｃ８Ｆ、Ｕ。

菌株３２９０／９１　（Ｋ）７．０ＸＩＯ’　Ｃ，Ｆ、Ｕ、標本２）：授精卵に 細菌菌株３０３７／９１．３２６３／９１．３２９０／９１　（Ａ）　、３２９ ０／９１　（Ｋ）を接種した。

卵を３７℃で保温し、２日後に卵黄を採取した。攻撃のために、最終攻撃ボリュ ーム中に下記の数の細胞を含む標本を作成した。

菌株３０３７／９１　３．６Ｘ１０’　Ｃ，Ｆ、Ｕ。

菌株３２６３／９１　６．６ｘｌＯ’　Ｃ，Ｆ、Ｕ。

菌株３２９０／９１　（Ａ）４．６Ｘ１０’　Ｃ，Ｆ、Ｕ。

菌株３２９０／９１　（Ｋ）４．４ｘｌＯ’　Ｃ，Ｆ、Ｕ。

生後３２日目に、ワクチン接種した動物９羽と接種しない動物９羽を上記の標本 １と同じ攻撃混合物０．２ｍｌで右胸気嚢中に攻撃した。生後４１日目に動物を 秤量し剖検を行った。

生後３５日目に、ワクチン接種した動物９羽と接種しない８羽を上記の標本２と 同じ攻撃混合物０．２１で右胸気嚢中に攻撃した。生後４１日目に動物を秤量し 剖検を行った。

結果 Ａ）ニワトリにおける菌株３２６３／９１の発病力下記の表５に、生攻撃菌株と して使用したときの成長遅延によって決定した、ＣＢＳ　４００．９２として寄 託された菌株３２６３／９１のブロイラーにおける発病力を示す。成長遅延は疾 病の結果であり、したがって、病原性菌株の発病力ならびにワクチン接種の効能 のよい指標となる。菌株を例■：攻撃菌株の調製に述べたように卵黄上で増殖さ せた。攻撃物質を動物１羽当り１．２Ｘ１０８Ｃ，Ｆ、Ｕ、の濃度で気嚢中に直 接導入した。

表５．　生菌法３２６２／９１で感染させたニワトリ及び対照群における成長発 育の比較 攻撃　菌株３２６３／９１　対照群 平均体重０日　１１００　（±　９８）　＋１４３　（±１１Ｇ）平均体重８０ 　目７９（±　１３２）　１４７８　（±　９２）平均体重１４日　１６８４　 （±１６２）　１９３５　（±　９１）平均体重差０−８日　９３（±１１４） 　’　３１４　（±　６４）平均体重差０−１４日　６００（±　１６５）　ｂ ７９６　（±　７４）ａ＝対照群と有意の差、ｐ＜０．００５ｂ＝対照群と有意 の差、ｐ＜Ｑ、０５ Ｂ）シチメンチョウにおける菌株３２６３／９１及びＧＧＤ１２６１の発病力 下記の表６に、ＣＢＳ　４００．９２として寄託された菌株３２６３／９１とシ チメンチョウ菌株ＧＧＤ　１２６１の、生攻撃菌株として使用したときの成長遅 延によって決定したシチメンチョウにおける発病力を示す。これらの菌株は、例 ■：攻撃菌株の調製で述べたように卵黄上で増殖させた。攻撃物質を生後３２日 の実験動物１羽当り５Ｘ１０’　Ｃ，Ｆ、Ｕ、の濃度で気嚢中に導入した。感染 の１１日後に、シチメンチョウを屠殺した。

表６、　生菌法３２６２／９１、生菌法ＧＧＤ　１２６１で感染させたシチメン チョウ及び対照群における成長発育の比較 攻撃　菌株３２６３／Ｈ菌株ＧＧ１１　対照群１１日後の １日当りの平均体重　６５’　５６″８２増加量（ｇ） ａ＝対照群と有意の差、Ｐ＜Ｏ，・０Ｏ１ｂ＝対照群と有意の差、Ｐ＜０．００ １Ｃ）病理学に関するワクチン接種・攻撃実験１）Ｂ、Ｈ，Ｉ、−培養混合物で 攻撃したワクチン接種しない９羽のグループでは、９羽のうちの５羽で頭または 自乗の腫脹が見られたが、そのうち７羽の気嚢は注射部位のみに局限した微小な 黄色っぽい斑点を示した。Ｂ、Ｈ，１，〜培養混合物で攻撃したワクチン接種し た９羽のグループでは、９羽のうちの２羽でのみ頭または自乗の腫脹が見られた が、すべての鳥の気嚢は完全に透明で注射部位に斑点はなかった。

２）卵黄培養混合物で攻撃した、９羽の対照群では、８羽のうちの３羽で注射部 位に微小な黄色っぽい斑点が見られた。３羽では気嚢の若干の混濁が見られたが 、１羽はすべての気嚢にクリーム状の滲出液が見られた。この滲出液から、寄託 菌株と完全に相同の細菌の純粋な培養物を増殖させることができた。

１羽のみは全（反応を示さなかった。卵黄培養混合物で攻撃したワクチン接種し た９羽のグループは、気嚢が非常に透明で注射部位に斑点のない健康な鳥であっ た。

Ｄ）１日当りの体重増加に関するワクチン接種・攻撃実装表７に、３４日間にわ たるニワトリの１日当りの平均体重増加を示す。この表から、１日当りの体重増 加の差に基づいて、ンチメンチタウ菌株ＧＧＤ−１２６１がニワトリにとって病 原性があることが容易にわかる。しかし、最も重要なことは、寄託菌株３２６３ ／　９１でワクチン接種するとＧＧＤ−１２６１の攻撃からの保護が得られるこ とである。

表７：　菌株３２６３／９１及びＧＧＤ−１２６１をベースとするワクチンによ るニワトリでのワクチン接種・攻撃実験 群　平均　標準偏差　動物数 １）対照　６０　１４　１０ ２］ＧＧＤ−１２６１攻撃　４２　９　１０３）　ＧＧＤ−１２６１ワクチンと 　６１　２４　１０同類攻撃 ４１３２６３／９１　ワクチン＋　６０　１２　１０ＧＧＤ−１２６１攻撃 群１対群２　＜０．００５ 群１対群３　＞０．　０５ 群２対群３　＜０．０２５ 群２対群４　＜０．００５ 結論を述べると、諸結果は、ＣＢＳ　４００．９２として寄託された菌株３２６ ３／９１は、生きた形では、成長遅延、自乗腫脹、頭部腫脹、気嚢炎を導入する 能力を有する発病性攻撃菌種であることを示している。ワクチンの調製に使用す るとき、この新規細菌の不活性化細胞は、ニワトリにおいてもシチメンチロウに おいても生きた菌株によって起こる臨床的徴候に対する防護力を誘発する能力を 有する。

フロントページの続き Ａ６１Ｋ　３９／１５　９２８４−４Ｃ３９／１７　ＡＦＥ　９２８４−４Ｃ ３９／２８５　９２８４−４Ｃ Ｃ１２Ｒ１：０１） Ｉ

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．Ｃｅ■■ｒ■■ｌｂｕｒｅａ■　■ｏｏｒ　Ｓｃｈｉ■■ｅｌｃ■■■ｒｅ ■に寄託番号４００．９２として寄託された細菌の特徴を有する、新規タイプの グラム陰性好気性桿状細菌。
2. ２．細菌がＣｅｎ■■■■ｌｂ■ｒｅ■ｕ　ｖｏｏｒ　Ｓｃｈｉ■■ｅｌｃ■ｌ ■ｕｒｅｓに寄託番号４００．９２として寄託された菌株であることを特徴とす る、請求項１の細菌。
3. ３．培養物が請求項１または２に記載の細菌を含むことを特徴とする、細菌を含 む徴生物培養物。
4. ４．請求項１または２に記載の細菌から誘導したものであることを特徴とする、 家禽類の呼吸器疾患に有効なワクチン。
5. ５．細菌が不活性化されていることを特徴とする、請求項４に記載のワクチン。
6. ６．ワクチンが補助剤をも含むことを特徴とする、請求項４または５に記載のワ クチン。
7. ７．さらに家禽類にとって発病性のあるウイルスまたは微生物からの少なくとも １つの他の抗原を含むことを特徴とする、請求項４から６のいずれかに記載のワ クチン。
8. ８．微生物またはウイルスが、感染性気管支炎ウイルス、ニューキャッスル病ウ イルス、感染性粘液嚢病（Ｇ■■ｂｏｒｏ）、ニワトリ貧血因子、鳥類レオウイ ルス、Ｍ■ｃｏｐｌ■■■■ｇ■ｌｌｉ■ｅｐ■ｉｃｕ■、シチメンチョウ鼻気 管炎ウイルス、Ｈａｅ■ｏｐｈｉｌｕ■　ｐ■ｒ■ｇ■ｌｌｉｎａｒｕ■（Ｃｏ ｒｙｚ■）、ニワトリ天然痘ウイルス、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥禽コレラ、大 腸菌からなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項７に記載の ワクチン。
9. ９．細菌性疾患防止用のワクチン調整のための、請求項１または２に記載の細菌 の使用。