KR101588297B1

KR101588297B1 - 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 및 써코바이러스에 의한 돼지의 감염을 예방하거나 치료하기 위한 다가 백신 조성물

Info

Publication number: KR101588297B1
Application number: KR1020140006618A
Authority: KR
Inventors: 정병열; 김애란; 정석찬; 윤인중; 최환원; 유성식; 김충식
Original assignee: 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부); 주식회사 중앙백신연구소
Priority date: 2014-01-20
Filing date: 2014-01-20
Publication date: 2016-01-27
Also published as: KR20150086672A

Abstract

본 발명은 혈청형 1, 혈청형 2 및 혈청형 5의 액티노바실루스 플로르뉴모니애 항원, 파스튜렐라 멀토시다 A형 항원 및 돼지 써코바이러스 2형 항원을 포함하는 복합백신으로서, 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형에 의한 감염에 대해 동시 보호를 제공하기 위한 다가 백신 조성물에 관한 것이다.

Description

액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 및 써코바이러스에 의한 돼지의 감염을 예방하거나 치료하기 위한 다가 백신 조성물 {MULTIVALENT VACCINE COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING INFECTION BY ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA AND PORCINE CIRCOVIRUS}

액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 돼지 써코바이러스 2형에 의한 감염을 동시에 예방하거나 치료하기 위한 다가 백신 조성물에 관한 것이다.

양돈협회 2010년 질병실태조사보고서에 따르면, 지난 3년간 호흡기 질병 중 흉막폐렴(65%)이 가장 높은 발병빈도를 가지는 것으로 나타났다. 흉막폐렴은 주로 비육돈에서 발병하여 급성폐사와 만성형에 의한 성장지연 등을 유발하며, 현재까지 15종의 혈청형이 밝혀져 있으나 혈청형간 교차방어능이 없으며, 현재 국내에서는 2형 및 5형만을 함유한 백신이 제조되고 있다.

악조 노벨 엔.브이.가 1991년 4월 19일자로 출원한 한국특허출원 제1991-0006414호는 액티노바실루스 플루로뉴모니아 서브유니트 백신을 기술하고 있으며, 전북대학교 산학협력단이 2008년 12월 31일자로 출원한 한국특허출원 제2008-0138479호는 효모 세포 표면에 디스플레이되는 Apx IIA 단백질의 제조방법 및 사료 첨가제로서 이의 용도를 제시한다. 액티노바실루스 플로르뉴모니애 (Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)는 그람 음성간균으로 이유자돈 및 비육돈에서 전염성이 강한 호흡기 질병으로서 섬유소성 흉막염과 경색성 폐렴병변을 나타낸다. 일령에 관계없이 감수성이 있으며 현재까지 15종의 혈청형이 밝혀져 있다. 혈청형에 따라 급성형에서 만성형으로 질병형태가 다양하며 이환돈의 비즙이나 분비물, 직접접촉으로 전파되며 높은 폐사율과 만성 위축을 나타내고 회복돈은 보균돈으로 남아 농가에 피해를 주는 경제적으로 매우 중요한 질병이다. APP는 폐포의 대식세포에 의해 탐색되며, 혈청형에 따라 Apx I, Apx II 및 Apx III 등의 독소를 생산하고 폐포 대식세포, 내피세포, 폐포 상피세포, 폐포 벽, 모세혈관의 내피세포 등 조직세포에 독성을 발휘하는 것으로 알려져 있다.

또한, 전남대학교가 2006년 12월 27일자로 출원한 한국특허출원 제2006-0135461호는 파스튜렐라 멀토시다의 비병원성 약독화 균주 및 이를 함유하는 백신을 제공하고 있고, 성균관대학교 산학협력단에서 2006년 12월 27일자로 출원한 한국특허출원 제2006-0134798호는 파스튜렐라 멀토시다 균주의 재조합 외막단백질 Ｈ를 이용한 콜레라 백신을 기술한다. 파스튜렐라 멀토시다 A형 (Pasteurella multocida type A, PMA)은 작은 난원 상의 간균으로 혈액배지에서 잘 자라며 포도상의 볼록한 형태를 나타내고 직경은 1-2 ㎛ 크기이다. PMA는 건강돈의 상부호흡기 점막에 존재하다가 환경 악화나 스트레스, 기타 바이러스 질환 등으로 정상적인 방어기능이 약화되었을 때 기관지 및 폐포에 침입하여 심한 염증상태를 유발하며 감염돼지의 구강 또는 비강 분비물의 직접접촉이나 공기전파에 의해 감염되고, 가장 흔한 증상은 기관지 폐렴으로 기관에 거품이 차 호흡 곤란을 유발하는 것이다. 병이 진행됨에 따라 기관지 삼출물이 증가하고 이에 따라 습성기침을 하는 것이 관찰되며, 체온이 40~41℃까지 상승하고 침울, 식욕부진을 보이고 코에서 염증성 삼출물이 관찰된다. 급성형인 경우 5~10일 경과 후 폐사하고 만성으로 진행 시 지속적인 건성기침과 성장지연을 보인다.

한편, 본 출원인이 2008년 7월 7일자로 출원한 한국특허출원 제2008-0065488호, 인터벳 인터내셔널 비. 브이.가 2008년 4월 1일자로 출원한 한국특허출원 제2008-7007927호는 PCV-2 백신을 제공하고 있다. 돼지 써코바이러스 2형(Porcine circovirus type 2, PCV2)은 단일가닥 환형(single stranded circular) DNA 바이러스로서 형태학적으로는 입방대칭(icosahedral symmetry)이며 피막이 없고 크기는 15~17 nm 정도로 작은 바이러스에 속한다. PCV2는 돼지 써코바이러스 1형 (PCV1)과 대략 80%의 서열 동일성을 공유한다. 일반적으로 비병독성인 PCV1과는 대조적으로, PCV2에 감염된 돼지는 통상 이유자돈의 전신성 소모성 증후군 (PMWS; Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome)이라고 하는 증상을 나타낸다. 상기 PMWS는 임상적으로 소모(wasting), 피부의 창백함, 수척함, 호흡 곤란, 설사 및 황달(jaundice)이 특징이다. 감염된 일부 돼지에서는 모든 증상의 조합이 나타나고, 다른 돼지에서는 이러한 증상 중의 한두 가지만 나타난다. 부검 시 미시적 병변 및 육안 병변이 다수의 조직 및 기관에서 나타나는데, 림프 기관이 가장 흔한 병변 부위이다. PCV2에 감염된 돼지의 폐사율은 80%에 이를 수 있다. PMWS 외에도, PCV2는 가성 광견병(pseudorabies), 돼지 생식기 호흡기 증후군(PRRS), 글래서병(Glasser's disease), 연쇄 구균성 수막염(streptococcal meningitis), 살모넬라증(salmonellosis), 이유후대장균증(postweaning colibacillosis), 식이성 간증(dietetic hepatosis) 및 화농성 기관지폐렴(suppurative bronchopneumonia)을 포함하는 다수의 다른 감염을 동반할 수 있다.

따라서 돼지의 폐렴은 복합적인 원인체에 의해 발생하며, 효율적인 농장 활용을 위하여 백신 접종횟수를 줄여야 하므로 비육기에 다발하는 호흡기 세균, 바이러스를 방어할 수 있는 복합 백신의 개발이 여전히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 돼지에서의 주요 폐렴 원인균에 대해 방어능을 지니고 상승된 백신 효능을 보이는 다가 백신 개발에 노력한 결과, 본 발명의 백신 조성물을 완성하게 되었다.

이와 같이, 본 발명의 목적은 돼지의 주요 폐렴 원인체에 대해 방어능을 갖는 다가 백신 조성물을 제공하는 것이다.

따라서 본 발명은 다가 백신 조성물 중 어느 한 구성 성분의 면역학적 작용을 현저히 간섭하지 않고, 이의 투여가 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형에 의한 감염을 동시에 예방 및/또는 치료할 수 있는, 우수한 효능의 다가 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 다가 백신 조성물을 돼지에 투여하는 것을 포함하여, 폐렴에 대한 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 돼지에 백신하는 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 다가 백신 조성물 중 어느 한 구성 성분의 면역학적 작용을 현저히 간섭하지 않고, 이의 투여가 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형에 의한 감염 중 어느 하나의 원인체에 의한 질병의 중증도를 예방 및/또는 최소화하거나, 이들 중 하나 이상의 질병의 증상을 개선시키기 위한 다가 백신 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 돼지에 본 발명의 다가 백신 조성물을 투여하여, 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형에 의한 감염 중 하나 이상의 원인체에 의한 질병을 예방 및/또는 최소화하거나, 이들 중 하나 이상의 질병에 대한 증상을 개선시키기 위한 백신화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

발명의 일 구체예에서, 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애 항원, 파스튜렐라 멀토시다 A형 항원, 써코바이러스 2형 항원 및 수의학적으로 허용 가능한 애주번트를 포함하는, 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형에 의한 감염에 대해 동시 보호를 제공하기 위한 다가 백신 조성물이 제공된다. 본 발명의 일 구체예에서, KACC91772P로 기탁된 혈청형 1, KACC91766P로 기탁된 혈청형 2, 및 KACC91768P로 기탁된 혈청형 5가 각각 2 x 10⁹CFU의 양으로 사용되었다. 본 발명의 다른 일 구체예는 액티노바실루스 플로르뉴모니애의 주요 외독소인 Apx I, Apx II 및 Apx III를 추가로 포함한다. 상기 APP는 소위 RTX 독소(RTX는 독소 내에서 반복을 나타냄)을 생성한다. 이러한 RTX 독소의 존재는 APP의 주요한 병원성 특징이며, 알려진 모든 RTX 독소는 몇 가지 세포독성 또는 세포용해 활성을 나타내는데, 가장 중요한 발병력 인자는 세포외 단백질, 즉 Apx 외독소이다.

본 발명의 다른 일 구체예는, 재조합 rApx I (서열번호 1), rApx II (서열번호 2) 및 rApx III (서열번호 3)를 각각 20 ㎍씩 포함하는 다가 백신 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 구체예에서, 파스튜렐라 멀토시다 A형으로서 KCTC12541BP로 기탁된 항원이 4 x 10⁹CFU의 양으로 사용되었다.

돼지 써코바이러스 2형 항원은 ORF2일 수 있으며, 이때 ORF2는 서열번호 4로 나타낸 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 다른 일 구체예에서, 돼지 써코바이러스 2형으로서 KCTC11150BP로 기탁된 CAKY98가 10^6.25TCID₅₀의 양으로 사용되었다.

본 명세서에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명은 분자 생물학, 미생물학, 단백질 정제, 단백질 공학, 및 DNA 서열 분석 및 당업자의 능력 범위 안에서 재조합 DNA 분야에서 흔히 사용되는 통상적인 기술에 의해 수행될 수 있다. 상기 기술들은 당업자에게 알려져 있고, 많은 표준화된 교재 및 참고저서에 기술되어 있다.

본 명세서에 달리 정의되어 있지 않으면, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 설명하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용 가능하다.

본 명세서에서 사용되는 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 또한, 달리 지시된 바가 없으면, 핵산은 각각 왼쪽에서 오른쪽, 5'에서 3' 방향으로 이해되고, 아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽 카르복실 방향으로 이해된다.

본 명세서에 있을 수 있는 수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함하는 것으로 해석된다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 제시되어 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 제시된 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 제시된 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

본 명세서에서 발명의 명칭을 포함하여 설명을 위해 기재된 제목들은 발명의 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서 이해되며, 하기의 구체예를 제한하는 것이 아니다.

본 명세서에서 사용된 용어 "약" 또는 "대략"은 소정의 값의 통계학적으로 의미 있는 범위를 의미한다. 상기 용어 "약" 또는 "대략"에 의해 포괄되는 허용되는 변화는 연구 하에 있는 구체적인 시스템에 따라 다르고, 당업자에게 용이하게 인정될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "집락 형성 단위" 또는 "CFU"는 소정의 시료 내에서 복제할 수 있는 유기체의 수를 나타낸다. 이는 집락이 쌍/송이 또는 단일 세포의 박테리아의 복제로부터 유도된다는 이론에 근거한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "수의학적으로 허용 가능한 담체"는 화합물 또는 조성물과 함께 투여되는 희석제, 애주번트, 부형제, 안정화제, 방부제 도는 비히클을 의미한다. 이러한 담체는 멸균 액체, 예를 들면 물 및 오일, 예를 들면, 바실렌, 동물, 식물 또는 합성 유래의 오일, 예를 들면 땅콩 오일, 대부 오일, 광유, 참께 오일 등을 포함할 수 있다. 물 또는 수용액 염수 용액, 예를 들면 포스페이트-완충된 염수, 링거 용액 및 수성 덱스트로스 및 글리세롤 용액이 사용될 수도 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "면역학적 효과량"은 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형에 대한 면역 반응을 유도하는 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형의 양을 의미한다. "면역학적 효과량"은 수용하는 동물의 종, 품종, 연령, 크기 및 건강 상태에 따라 달라질 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 살아있는 비독성 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형의 "면역학적 효과량"은 수의학적으로 허용되는 적합한 애주번트와 함께 사용되는 경우 살아있는 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형의 면역성을 강화시키고, 이에 따라 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형에 의한 공격에 대해 보호성 면역력을 제공하기에 충분한 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형의 양을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "면역원성"은 살아있는 비독성 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형이 체액 및/또는 세포 면역 반응을 유도할 수 있음을 의미한다. 면역성 균주는 또한 항원성이다. 면역원성 조성물은 동물에게 투여되는 경우 체액 및/또는 세포 면역 반응을 유도할 수 있는 조성물을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어 "면역원성 조성물"은 예를 들면 미생물을 함유하는 임의의 약학 조성물에 관한 것으로, 이는 포유동물의 면역 반응을 유도하는데 사용될 수 있다. 면역 반응은 T 세포 반응, B 세포 반응, 또는 T 세포 및 B 세포 둘 모두의 반응을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 세포 표면에서 MHC 분자와 결합하는 항원의 제공에 의해 포유동물을 민감하게 하는 역할을 할 수 있다. 또한, 항원-특이적 T-림프구 또는 항체가 면역 처리된 숙주의 보호를 가능하게 하도록 생성될 수도 있다. "면역원성 조성물"은 세포-매개된 (T-세포) 면역 반응 또는 항체-매개된 (B-세포) 면역 반응 또는 둘 다를 유도하는 완전한 미생물 또는 이로부터 유도된 면역원성 부분을 포함하는 살아있는 약독화되거나 사멸된/불활성화된 백신을 함유할 수 있고, 미생물에 의한 감염과 관련된 하나 이상의 증상으로부터 동물을 보호할 수 있거나, 또는 미생물에 의한 감염에서 기인하는 사망으로부터 동물을 보호할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "백신" 또는 "백신 조성물"은 동물의 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 면역원성 조성물을 포함하는 약제학적 조성물을 의미한다. 백신 또는 백신 조성물은 감염에 기인한 질병 또는 가능한 사망으로부터 동물을 보호할 수 있고, 활성 성분의 면역학적 활성을 강화시키는 하나 이상의 부가적인 성분을 포함할 수도 있다. 백신 또는 백신 조성물은 약제학적 조성물에 전형적인 추가의 성분, 예를 들면 애주번트를 포함할 수도 있다. 백신의 면역학적 활성 성분은 이의 원래 형태이거나, 또는 개질된 살아있는 백신내의 약독화된 유기체 또는 사멸되거나 불활성화된 백신 내에서 적절한 방법에 의해 불활성화된 유기체이거나 완전한 살아있는 유기체, 또는 바이러스의 하나 이상의 면역원성 성분을 포함하는 아단위 백신, 또는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제조된 유전적으로 가공되거나, 돌연변이되거나 또는 클로닝된 백신을 포함할 수 있다.

본 발명에서, "수의학적으로 허용 가능한 애주번트"는 수산화알루미늄, 사포닌, DDA(Dimethyldioctadecylammonium Bromide), 폴리포스파젠(Polyphosphazene) 또는 미네랄 오일계통의 수중유적형 에멀젼, 스쿠알린, 대사 가능한 오일 계통의 유중수적형 에멀젼을 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구체예에서, 애주번트로서 이뮬랜트-α(Immulant-α)가 25%의 양으로 사용되었다. 본 발명의 다가 백신 조성물은 수의학적으로 허용 가능한 희석제, 등장화제, 또는 안정화제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 "수의학적으로 허용 가능한 희석제"는 물, 식염수, 덱스트로스, 에탄올, 또는 글리세롤을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 "수의학적으로 허용 가능한 등장화제"는 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 "수의학적으로 허용 가능한 안정화제"는 알부민 또는 에틸렌디아민테트라아세트산의 알칼리 염을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 다가 백신 조성물은 피내, 기관내 또는 질내로 투여될 수 있다. 전신 투여의 경우 정맥내, 혈관내, 근육내, 비강내, 동맥내, 복강내, 경구 또는 수막강내(intrathecal) 경로로 투여될 수 있다. 국부 투여의 경우 피하, 피내, 피부내, 심장내, 폐엽내(intralobal), 연수내, 폐내로 또는 치료할 조직 (결합-, 골-, 근육-, 신경-, 상피조직)의 내부 또는 근처로 직접 투여될 수 있다. 치료의 목적하는 지속기간 및 유효성에 따라, 본 발명에 따른 조성물은 1회 또는 수회, 또한 간헐적으로, 예를 들면 1일 기준으로 수일, 수주 또는 수개월 동안, 상이한 용량으로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형에 대한 면역 반응을 유도하고, 이러한 원인체에 의해 유발되는 질병의 중증도를 예방하고/예방하거나 최소화하거나 또는 상기 질병과 관련된 하나 이상의 증상을 개선시킬 수 있다. 이와 같이, 본 발명의 다가 백신 조성물은 다수의 병원체에 대한 보호를 제공하는데 필요한 면역접종 횟수를 최소화하고, 투여 비용을 낮추며, 허용율 및 적용율을 증가시킬 수 있다.

도 1은 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형 항원 및 수의학적으로 허용 가능한 애주번트를 포함하는 복합백신의 조성을 나타낸다.
도 2는 실시예 2에 따라 접종된 (10⁸CFU/dose) 폐사체에서의 흉막폐렴증상을 나타낸다.

이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 백신의 제조

하기의 표 1 및 도 1에 나타난 바와 같이 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애 항원, 파스튜렐라 멀토시다 A형 항원, 써코바이러스 2형 항원 및 수의학적으로 허용 가능한 애주번트를 포함하는 복합 백신의 조성으로 3롯트(T32APMX01, T32APMX02, T32APMX03)를 제조하여 본 실험에 사용하였다.

표 1. 실시예 1에 따른 복합 백신의 조성

실시예 2: 백신의 효능 평가

2.1. 각 혈청형별 흉막폐렴 공격접종에 따른 폐사율과 치사시간 평가

흉막폐렴 혈청형 1, 2 및 5에 대한 병원성을 확인하기 위하여 균주 배양액을 단계 희석하여 각각 10⁹, 10⁸, 10⁷, 10⁶, 10⁵, 10⁴CFU/dose로 10주령 육성돈, 2마리씩에 기관 내 접종하고 폐사율과 치사시간을 관찰하였다. 폐사하지 않은 개체는 일주일간 관찰 후 안락사하여 부검을 실시하고, 폐병변을 비교 관찰하였다. 그 결과를 하기의 표 2에 나타내었다. 또한 병원성 확인 데이터를 근거로 하여, 상기 백신이 2회 접종된 돼지에 공격접종하고 아래의 임상증상 점수기준 (표 3)과 폐병변 점수기준에 따라 공격접종에 대한 방어효과를 평가하였다.

표 2. 혈청형별 흉막폐렴 공격접종에 따른 폐사율과 치사시간

표 3. 임상증상에 따른 점수 기준

상기 표 2 및 도 2에서 확인되는 바와 같이, 접종균수가 줄어들수록 폐사율은 감소하였다. 10⁸CFU/dose이상으로 공격 접종한 경우 18시간 이내에 급성으로 폐사 또는 치사시간이 매우 짧았고 폐사체에서 비강출혈, 기관내 포말성 혈액성 삼출물 등의 전형적인 흉막폐렴 증상이 나타났다. 반면, 10⁴~10⁵CFU/dose로 공격 접종한 경우, 142시간 (약 6일) 이상 생존하였으나 침울, 입주위 거품, 간헐적 구토, 거친 호흡 등의 호흡기 증상이 관찰되었다.

2.2. 혈청형 1 공격접종에 따른 임상증상 평가

혈청형 1에 대한 목적동물 효력시험을 평가하고, 그 결과를 하기의 표 4에 나타내었다. 백신처리 하지 않은 PBS 처리군을 대조군으로 하였다.

표 4. 흉막폐렴 1형 공격접종에 따른 임상증상 점수비교

^aMean±SD, n=5; SPSS statistics ver.19/one-way NOVA/S-N-K (student-newman-keuls), p<0.05.

상기 표 4에 나타낸 바와 같이, 대조군에 비해 본원발명에 따른 백신군은 통계적으로 유의성 있는 효과를 나타냈다.

실시예 3: 복합백신의 안정성 시험

실시예 1에 따라 제조된 복합백신의 안정성을 확인하기 위하여, 3종류 롯트의 복합백신을 2~8℃ 냉암소에 보존하면서, 제조직후, 3개월, 6개월 및 9개월 후에 특성시험, 수소이온농도시험, 무균시험, 방부제정량시험, 불활화 확인시험, 안전시험, 및 역가 시험을 수행하였다.

3.1. 특성시험

실시예 1에 따라 제조된 3 롯트의 복합백신을 동물용의약품 생물학적제제의 국가검정기준의 일반시험법 1-11-20-01에 따라 색, 혼탁도, 이물 또는 이취에 대하여 검사하였으며, 현탁 상태를 검사할 때는 가볍게 흔들어서 용해도, 혼탁도 및 색조를 검사하였다. 그 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.

표 5. 실시예 1에 따른 복합백신의 특성시험 결과

* MPM: 제조 이후 개월 (Months Post Manufacture)

** -: 음성

상기 표 5로부터 확인되는 것과 같이, 3 롯트의 복합백신은 모두 9개월까지 노란 백색의 균일한 수성현탁액으로서 약간의 침전이 있었으나 흔들면 균등한 액체가 되었다. 또한 이물, 이취가 없고 내용물의 성상이 균일하였으며, 변화가 관찰되지 않았다.

3.2. 수소이온농도시험

실시예 1에 따라 제조된 3 롯트의 복합백신을 동물용의약품 생물학적제제의 국가검정기준의 일반시험법 1-11-20-03에 따라 수소이온농도를 측정하고, 그 결과를 하기의 표 6에 나타냈다.

표 6. 실시예 1에 따른 복합백신의 수소이온농도시험 결과

상기 표 6으로부터 알 수 있듯이, 3 롯트의 복합백신은 모두 9개월까지 검정기준(pH 6.0~8.0)을 만족하였다.

3.3. 무균시험

실시예 1에 따라 제조된 3 롯트의 복합백신을 동물용의약품 생물학적제제의 국가검정기준의 일반시험법 1-11-20-06에 따라 고체영양배지(nutrient agar, NA), 액체영양배지(nutrient broth, NB) 및 액상 티오글리콜산 배지(fluid thioglycollate medium, Thio)에 각각 2개의 시험관에 접종하여 22℃ 및 37℃에서 7일간 배양하면서 잡균의 존재 여부를 관찰하고, 그 결과를 하기의 표 7에 나타냈다.

표 7. 실시예 1에 따른 복합백신의 무균시험 결과

* MPM: 제조 이후 개월 (Months Post Manufacture)

** -: 세균 발육 없음

NA : nutrient agar, NB : nutrient broth, Thio : fluid thioglycollate medium

상기 표 7에서 확인되는 것과 같이, 3 롯트의 복합백신은 모두 9개월까지 어떠한 세균의 성장도 관찰되지 않았다.

3.4. 방부제 정량시험

실시예 1에 따라 제조된 3 롯트의 복합백신을 동물용의약품 생물학적제제의 국가검정기준의 일반시험법 1-11-20-09에 따라 포르말린 함량을 비색법으로 측정하였다. 3 롯트의 복합백신과 포르말린 표준액 각각 1 ㎖에 시프(Schiff) 시약 0.2 ㎖를 가하여 실온에서 30 분간 방치한 후 520nm 분광광도계(spectrophotometer)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 표준액의 흡광도를 이용하여 다항식의 표준곡선을 작성하고 백신과의 상관관계로 포르말린 농도를 계산하였다. 그 결과를 하기의 표 8에 나타내었다.

표 8. 실시예 1에 따른 복합백신의 방부제 정량시험 결과

상기 표 8로부터 알 수 있듯이, 3 롯트의 복합백신은 모두 9개월까지 0.3% 이하의 포르말린 함유량을 나타내었다.

3.5. 불활화 확인시험

실시예 1에 따라 제조된 3 롯트의 복합백신을 2~8℃의 냉암소에 보존하면서 제조 직후, 3개월, 6개월, 및 9개월 후에 각 롯트별로 백신 2 ㎖를 2 회에 걸쳐 동결 및 융해하였다. 그 다음, 원심분리한 상층액을 투석막에 넣고 4℃에서 백신의 100 배량 이상의 인산완충식염수(PBS: pH 7.2~7.4)에 하룻밤 투석하였다. 조직배양세포로 PK-15세포(충남대학교 분양, 1999년)를 플라스크 (25 ㎠)에 증식시키고, 상기 투석 처리한 시험재료 1 ㎖를 접종한 다음 37℃에서 1시간 감작시켰다. 1시간 후 새로운 세포유지용 배지를 더하여 7일간 배양하였다. 상층액을 제거한 후 형광항체법 (FA: fluorescent antibody method)을 이용하여 돼지 써코바이러스 증식여부를 확인하였다. 그 결과를 하기의 표 9에 나타내었다.

표 9. 실시예 1에 따른 복합백신의 불활화 확인시험 결과

상기 표 9에 제시된 바와 같이, 3 롯트의 복합백신에서 모두 9개월까지 써코바이러스 증식에 의한 형광은 관찰되지 않았다.

3.6. 안전성 시험

실시예 1에 따라 제조된 3 롯트의 복합백신을 2~8℃의 냉암소에 보존하면서 제조직후, 3개월, 6개월 및 9개월 후에 마우스, 기니픽 및 돼지에서 안전성을 확인하였다. 체중 15~20 g의 마우스 8마리 (수컷)를 준비하여, 8마리의 마우스 복강에 1/4두분 (0.5 ㎖)을 접종하고 7일간 관찰하였다. 기니픽은 체중 300~350 g의 기니픽 6마리 (수컷)를 준비하여, 피하 및 복강에 각각 2마리씩 1두분 (2 ㎖)을 접종하고, 2마리는 0.1 ㎖씩 피내에 접종하여 7일간 관찰하였다. 돼지는 과거 PCV2 관련 백신을 접종하지 않았으며, 관련 질병에 노출되지 않은 5~7주령 돼지 2마리 (도원농장, 전북 정읍소재, 수컷)에 백신의 2두분을 근육 접종하였다. 접종 후 1~2시간 내에 과민반응을 확인하였으며, 21일 동안 주사부위의 화농, 괴사, 발열 및 피부병변 등의 부작용을 확인하였다. 그 결과를 하기의 표 10에 나타냈다.

표 10. 실시예 1에 따른 복합 백신의 안전성 시험

* Number of abnormal animals/number of vaccinated animals

IP : Intraperitoneal, SC : Subcutaneous, ID : Intradermal, IM : Intramuscular

상기 표 10으로부터 알 수 있듯이, 백신 생산 후 9개월까지 매 3개월마다 3 롯트의 복합백신을 마우스, 기니픽 및 돼지에 접종하여 안전성 시험을 실시한 결과, 모두 부작용없이 생존하였다.

4. 역가시험

4.1 돼지 써코바이러스 2형 항원 ( PCV2 )

3 롯트의 시험백신을 2~8℃의 냉암소에 보존하면서 제조직후, 3개월, 6개월 및 9개월 후에 PCV2에 대하여 기니픽 역가시험을 실시하였다. 각 롯트별로 체중 300~350 g의 기니픽 8마리 (수컷)를 준비하여 피하로 1/2두분을 접종하고 3주후에 백신 처리하지 않은 2마리의 대조군과 같이 채혈하여 샌드위치 간접 ELISA와 IFA (immunofluorescence assay) 항체가를 측정하였다. 그 결과를 하기의 표 11에 나타내었다.

표 11. PCV2에 대한 ELISA 및 IFA 역가시험 결과

MPM : Months post manufacture, OD : Optical Density

T/C : Test serum optical density/average of Control serum optical density

GMT±SD : Geometric mean titer±standard deviation

상기 표 11에서 확인되는 것과 같이, PCV2에 대한 역가시험 결과, 9개월까지 3 롯트 시험백신의 ELISA에서 접종군 OD평균 (T)/대조군 OD평균 (C)인 T/C값이 모두 2.0 이상이었다. 또한, IFA 항체 결과도 평균 128배 이상임이 확인되었다.

4.2 파스튜렐라 멀토시다 A형 ( PMA )

3 롯트의 시험백신을 2~8℃의 냉암소에 보존하면서 제조직후, 3개월, 6개월 및 9개월 후에 PMA에 대하여 마우스 역가시험을 실시하였다. 각 롯트별로 체중 15~20g의 건강한 마우스 70마리 (수컷)를 선정하여 사용하였으며, 백신 원액, 5배 및 25배 희석액을 각각 20마리에 백신의 1/10두분 (0.2 ㎖) 용량으로 2주 간격으로 2회 복강에 접종하고, 10마리는 백신을 처리하지 않고 대조로 두었다. 2차 접종 10일 후에 PMA 100 LD₅₀/0.2㎖로 각각 복강에 접종하고 10일간 생존여부를 관찰하였다. 그 결과를 하기의 표 12에 나타내었다.

표 12. PMA에 대한 역가시험 결과

* 생존 동물수/시험 동물수

상기 표 12에 나타낸 바와 같이, PMA에 대한 역가시험 결과, 9개월까지 3 롯트의 복합백신은 모두 원액은 80%, 5배 희석액 접종군 50% 및 25배 희석액 접종군 20% 이상의 생존율이 확인되었다.

4.3 액티노바실루스 플로르뉴모니애 ( APP )

4.3.1 APP 혈청형 1, 2 및 5에 대한 역가시험

APP에 감염되지 않은 2kg의 건강한 토끼 6마리 (수컷)를 배정하여 그 중 토끼 4마리에 백신 1두분 용량을 2주 간격으로 2회 근육에 접종하고 2마리는 백신을 처리하지 않고 대조군으로 하였다. 2차 접종 2주 후에 각각 채혈하여 APP 균체 1형, 2형 및 5형에 대한 혈청형별 항체가를 국가검정동물의약품 검정기준 (농림축산검역본부 고시, 제2013-39호)에 따라 측정하였다.

APP 혈청형 1, 2 및 5 균체에 대한 항원을 각각 코팅 완충액(coating buffer)에 3㎍/㎖로 희석하여 100 ㎕씩 ELISA 플레이트에 분주하고, 37℃에서 30분간 흡착시킨 뒤 4℃에서 하룻밤 두었다. 항원이 흡착된 ELISA 플레이트를 실온에 30분 둔 뒤 PBS로 3회 씻어낸 후, 100 ㎕씩 블로킹 완충액(blocking buffer)를 모든 웰에 분주한 뒤 37℃에 1시간 두었다. 세척 완충액(Washing buffer)으로 3회 세척한 후, PBS로 100 ㎕를 각 플레이트 웰에 분주한 뒤 A 웰은 블랭크 웰(blank well), B와 C의 첫 웰에는 음성혈청과 양성혈청을 100 ㎕씩 분주하여 2배에서 1,024배까지 2진 희석하고 D웰부터는 시료 혈청을 같은 방법으로 2배에서 1,024배까지 2진 희석하였다. ELISA 플레이트를 125 rpm/1~3분 교반한 뒤 37℃에 1시간 두었다. 그 다음, 세척 완충액으로 3회 씻어내고 블로킹 완충액으로 적당히 희석된 안티-래빗 IgG HRP 컨주게이트를 100 ㎕씩 분주한 뒤 37℃에 1시간 보관한 후, 세척 완충액으로 3회 세척하였다. 100 ㎕ OPD 기질을 각 웰에 분주하여 실온에서 15분 정치시킨 후, 50 ㎕의 종료 용액으로 반응을 중지시키고 각 웰의 흡광도(O.D.)를 492 ㎚에서 측정하였다. 그 결과를 하기의 표 13 내지 표 15에 나타내었다.

표 13. APP 혈청형 1에 대한 토끼 ELISA 역가시험 결과

MPM : 제조 후 개월(Months post manufacture), GMT±SD : 기하평균역가±표준편차

표 14. APP 혈청형 2에 대한 토끼 ELISA 역가시험 결과

표 15. APP 혈청형 5에 대한 토끼 ELISA 역가시험 결과

상기 표 13 내지 표 15에서 확인되는 것과 같이, APP 혈청형 1, 2 및 5에 대한 ELISA 항체 역가는 각각 9개월까지 3 롯트의 복합백신에서 모두 320배 이상이었다. 반면, 대조군에서는 10배 이하로 확인되었다.

4.3.2 rApx I, rApx II 및 rApx III 에 대한 역가시험

APP에 감염되지 않은 2kg의 건강한 토끼 6마리(수컷)를 배정하여 그 중 토끼 4마리에 백신 1두분 용량을 2주 간격으로 2회 근육에 접종하고 2마리는 대조군으로 하였다. 2차 접종 2주 후에 각각 채혈하여 rApx I, II 및 III를 정제하여 얻어진 항원을 코팅하고, 백신을 접종한 토끼 혈청으로부터 독소에 대한 항체 역가를 국가검정동물의약품 검정기준 (농림축산검역본부 고시, 제2013-39호)에 따라 측정하였다. rApx I, II 및 III에 대한 항원을 각각 코팅 완충액에 1 ㎍/㎖로 희석하여 100 ㎕씩 ELISA 플레이트에 분주하고, 37℃에서 30분간 흡착시킨 뒤 4℃에서 하룻밤 두었다. 항원이 흡착된 ELISA 플레이트를 실온에 30분 둔 뒤 PBS로 3회 씻어낸 후, 100 ㎕씩 블로킹 완충액을 모든 웰에 분주한 뒤 37℃에 1시간 동안 두었다. 그 다음, 세척 완충액으로 3회 세척하고, PBS로 100 ㎕를 각 플레이트 웰에 분주한 뒤 A 웰 (블랭크 웰), B와 C의 첫 웰에 음성혈청과 양성혈청을 100 ㎕씩 분주하여 2배에서 1,024배까지 2진 희석하고 D 웰부터는 시료 혈청을 같은 방법으로 2배에서 1,024배까지 2진 희석하였다. ELISA 플레이트를 125 rpm/1~3분 교반시킨 뒤 37℃에 1시간 두었다. 그 다음, 세척 완충액으로 3회 씻어내고 블로킹 완충액으로 희석된 안티-래빗 IgG HRP 컨주게이트를 100 ㎕씩 분주한 뒤 37℃에 1시간 동안 두었다. 세척 완충액으로 3회 세척하고, 100 ㎕ OPD 기질을 각 웰에 분주하여 실온에서 15분 정치시켰다. 50 ㎕의 종료 용액으로 반응을 중지시키고 각 웰의 흡광도(O.D.)를 492 ㎚에서 측정하였다. 그 결과를 하기의 표 16 내지 표 18에 나타냈다.

표 16. rApx I에 대한 토끼 ELISA 역가시험 결과

MPM : 제조 후 개월(Months post manufacture), GMT±SD : 기하평균역가권±표준편차

표 17. rApx II에 대한 토끼 ELISA 역가시험 결과

표 18. rApx III에 대한 토끼 ELISA 역가시험 결과

상기 표 16 내지 표 18에서 확인되는 것과 같이, 정제된 독소에 대한 ELISA 항체 역가는 9개월까지 3 롯트의 백신 모두에서 320배 이상이었다. 반면, 대조군에서는 10배 이하로 확인되었다.

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KACC91772

20121214

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20121212

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KCTC12541

20140109

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KCTC11150

20070110

<110> KOREA ANIMAL AND PLANT QUARANTINE AGENCY <120> MULTIVALENT VACCINE COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING INFECTION BY ACTINOBACILLUS PLEUROPNEUMONIAE, PASTEURELLA MULTOCIDA AND PORCINE CIRCOVIRUS <130> IPDB-51932 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1023 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant rApx I <400> 1 Met Ala Asn Ser Gln Leu Asp Arg Val Lys Gly Leu Ile Asp Ser Leu 1 5 10 15 Asn Gln His Thr Lys Ser Ala Ala Lys Ser Gly Ala Gly Ala Leu Lys 20 25 30 Asn Gly Leu Gly Gln Val Lys Gln Ala Gly Gln Lys Leu Ile Leu Tyr 35 40 45 Ile Pro Lys Asp Tyr Gln Ala Ser Thr Gly Ser Ser Leu Asn Asp Leu 50 55 60 Val Lys Ala Ala Glu Ala Leu Gly Ile Glu Val His Arg Ser Glu Lys 65 70 75 80 Asn Gly Thr Ala Leu Ala Lys Glu Leu Phe Gly Thr Thr Glu Lys Leu 85 90 95 Leu Gly Phe Ser Glu Arg Gly Ile Ala Leu Phe Ala Pro Gln Phe Asp 100 105 110 Lys Leu Leu Asn Lys Asn Gln Lys Leu Ser Lys Ser Leu Gly Gly Ser 115 120 125 Ser Glu Ala Leu Gly Gln Arg Leu Asn Lys Thr Gln Thr Ala Leu Ser 130 135 140 Ala Leu Gln Ser Phe Leu Gly Thr Ala Ile Ala Gly Met Asp Leu Asp 145 150 155 160 Ser Leu Leu Arg Arg Arg Arg Asn Gly Glu Asp Val Ser Gly Ser Glu 165 170 175 Leu Ala Lys Ala Gly Val Asp Leu Ala Ala Gln Leu Val Asp Asn Ile 180 185 190 Ala Ser Ala Thr Gly Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Leu Gly Lys 195 200 205 Leu Ala Met Pro Tyr Leu Thr Leu Ala Leu Ser Gly Leu Ala Ser Lys 210 215 220 Leu Asn Asn Leu Pro Asp Leu Ser Leu Ala Gly Pro Gly Phe Asp Ala 225 230 235 240 Val Ser Gly Ile Leu Ser Val Val Ser Ala Ser Phe Ile Leu Ser Asn 245 250 255 Lys Asp Ala Asp Ala Gly Thr Lys Ala Ala Ala Gly Ile Glu Ile Ser 260 265 270 Thr Lys Ile Leu Gly Asn Ile Gly Lys Ala Val Ser Gln Tyr Ile Ile 275 280 285 Ala Gln Arg Val Ala Ala Gly Leu Ser Thr Thr Ala Ala Thr Gly Gly 290 295 300 Leu Ile Gly Ser Val Val Ala Leu Ala Ile Ser Pro Leu Ser Phe Leu 305 310 315 320 Asn Val Ala Asp Lys Phe Glu Arg Ala Lys Gln Leu Glu Gln Tyr Ser 325 330 335 Glu Arg Phe Lys Lys Phe Gly Tyr Glu Gly Asp Ser Leu Leu Ala Ser 340 345 350 Phe Tyr Arg Glu Thr Gly Ala Ile Glu Ala Ala Leu Thr Thr Ile Asn 355 360 365 Ser Val Leu Ser Ala Ala Ser Ala Gly Val Gly Ala Ala Ala Thr Gly 370 375 380 Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ala Ala Leu Val Ser Ala Ile Thr Gly 385 390 395 400 Ile Ile Ser Gly Ile Leu Asp Ala Ser Lys Gln Ala Ile Phe Glu Arg 405 410 415 Val Ala Thr Lys Leu Ala Asn Lys Ile Asp Glu Trp Glu Lys Lys His 420 425 430 Gly Lys Asn Tyr Phe Glu Asn Gly Tyr Asp Ala Arg His Ser Ala Phe 435 440 445 Leu Glu Asp Thr Phe Glu Leu Leu Ser Gln Tyr Asn Lys Glu Tyr Ser 450 455 460 Val Glu Arg Val Val Ala Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Val Asn Ile 465 470 475 480 Gly Glu Leu Ala Gly Ile Thr Arg Lys Gly Ala Asp Ala Lys Ser Gly 485 490 495 Lys Ala Tyr Val Asp Phe Phe Glu Glu Gly Lys Leu Leu Glu Lys Asp 500 505 510 Pro Asp Arg Phe Asp Lys Lys Val Phe Asp Pro Leu Glu Gly Lys Ile 515 520 525 Asp Leu Ser Ser Ile Asn Lys Thr Thr Leu Leu Lys Phe Ile Thr Pro 530 535 540 Val Phe Thr Ala Gly Glu Glu Ile Arg Glu Arg Lys Gln Thr Gly Lys 545 550 555 560 Tyr Glu Tyr Met Thr Glu Leu Phe Val Lys Gly Lys Glu Lys Trp Val 565 570 575 Val Thr Gly Val Glu Ser His Asn Ala Ile Tyr Asp Tyr Thr Asn Leu 580 585 590 Ile Gln Leu Ala Ile Asp Lys Lys Gly Glu Lys Arg Gln Val Thr Ile 595 600 605 Glu Ser His Leu Gly Glu Lys Asn Asp Arg Ile Tyr Leu Ser Ser Gly 610 615 620 Ser Ser Ile Val Tyr Ala Gly Asn Gly His Asp Val Ala Tyr Tyr Asp 625 630 635 640 Lys Thr Asp Thr Gly Tyr Leu Thr Phe Asp Gly Gln Ser Ala Gln Lys 645 650 655 Ala Gly Glu Tyr Ile Val Thr Lys Glu Leu Lys Ala Asp Val Lys Val 660 665 670 Leu Lys Glu Val Val Lys Thr Gln Asp Ile Ser Val Gly Lys Thr Cys 675 680 685 Ser Glu Lys Leu Glu Tyr Arg Asp Tyr Glu Leu Ser Pro Phe Glu Leu 690 695 700 Gly Asn Gly Ile Arg Ala Lys Asp Glu Leu His Ser Val Glu Glu Ile 705 710 715 720 Ile Gly Ser Asn Arg Lys Asp Lys Phe Phe Gly Ser Arg Phe Thr Asp 725 730 735 Ile Phe His Gly Ala Lys Gly Asp Asp Glu Ile Tyr Gly Asn Asp Gly 740 745 750 His Asp Ile Leu Tyr Gly Asp Asp Gly Asn Asp Val Ile His Gly Gly 755 760 765 Asp Gly Asn Asp His Leu Val Gly Gly Asn Gly Asn Asp Arg Leu Ile 770 775 780 Gly Gly Lys Gly Asn Asn Phe Leu Asn Gly Gly Asp Gly Asp Asp Glu 785 790 795 800 Leu Gln Val Phe Glu Gly Gln Tyr Asn Val Leu Leu Gly Gly Ala Gly 805 810 815 Asn Asp Ile Leu Tyr Gly Ser Asp Gly Thr Asn Leu Phe Asp Gly Gly 820 825 830 Val Gly Asn Asp Lys Ile Tyr Gly Gly Leu Gly Lys Asp Ile Tyr Arg 835 840 845 Tyr Ser Lys Glu Tyr Gly Arg His Ile Ile Ile Glu Lys Gly Gly Asp 850 855 860 Asp Asp Thr Leu Leu Leu Ser Asp Leu Ser Phe Lys Asp Val Gly Phe 865 870 875 880 Ile Arg Ile Gly Asp Asp Leu Leu Val Asn Lys Arg Ile Gly Gly Thr 885 890 895 Leu Tyr Tyr His Glu Asp Tyr Asn Gly Asn Ala Leu Thr Ile Lys Asp 900 905 910 Trp Phe Lys Glu Gly Lys Glu Gly Gln Asn Asn Lys Ile Glu Lys Ile 915 920 925 Val Asp Lys Asp Gly Ala Tyr Val Leu Ser Gln Tyr Leu Thr Glu Leu 930 935 940 Thr Ala Pro Gly Arg Gly Ile Asn Tyr Phe Asn Gly Leu Glu Glu Lys 945 950 955 960 Leu Tyr Tyr Gly Glu Gly Tyr Asn Ala Leu Pro Gln Leu Arg Lys Asp 965 970 975 Ile Glu Gln Ile Ile Ser Ser Thr Gly Ala Leu Thr Gly Glu His Gly 980 985 990 Gln Val Leu Val Gly Ala Gly Gly Pro Leu Ala Tyr Ser Asn Ser Pro 995 1000 1005 Asn Ser Ile Pro Asn Ala Phe Ser Asn Tyr Leu Thr Gln Ser Ala 1010 1015 1020 <210> 2 <211> 956 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant rApx II <400> 2 Met Ser Lys Ile Thr Leu Ser Ser Leu Lys Ser Ser Leu Gln Gln Gly 1 5 10 15 Leu Lys Asn Gly Lys Asn Lys Leu Asn Gln Ala Gly Thr Thr Leu Lys 20 25 30 Asn Gly Leu Thr Gln Thr Gly His Ser Leu Gln Asn Gly Ala Lys Lys 35 40 45 Leu Ile Leu Tyr Ile Pro Gln Gly Tyr Asp Ser Gly Gln Gly Asn Gly 50 55 60 Val Gln Asp Leu Val Lys Ala Ala Asn Asp Leu Gly Ile Glu Val Trp 65 70 75 80 Arg Glu Glu Arg Ser Asn Leu Asp Ile Ala Lys Thr Ser Phe Asp Thr 85 90 95 Thr Gln Lys Ile Leu Gly Phe Thr Asp Arg Gly Ile Val Leu Phe Ala 100 105 110 Pro Gln Leu Asp Asn Leu Leu Lys Lys Asn Pro Lys Ile Gly Asn Thr 115 120 125 Leu Gly Ser Ala Ser Ser Ile Ser Gln Asn Ile Gly Lys Ala Asn Thr 130 135 140 Val Leu Gly Gly Ile Gln Ser Ile Leu Gly Ser Val Leu Ser Gly Val 145 150 155 160 Asn Leu Asn Glu Leu Leu Gln Asn Lys Asp Pro Asn Gln Leu Glu Leu 165 170 175 Ala Lys Ala Gly Leu Glu Leu Thr Asn Glu Leu Val Gly Asn Ile Ala 180 185 190 Ser Ser Val Gln Thr Val Asp Ala Phe Ala Glu Gln Ile Ser Lys Leu 195 200 205 Gly Ser His Leu Gln Asn Val Lys Gly Leu Gly Gly Leu Ser Asn Lys 210 215 220 Leu Gln Asn Leu Pro Asp Leu Gly Lys Ala Ser Leu Gly Leu Asp Ile 225 230 235 240 Ile Ser Gly Leu Leu Ser Gly Ala Ser Ala Gly Leu Ile Leu Ala Asp 245 250 255 Lys Glu Ala Ser Thr Glu Lys Lys Ala Ala Ala Gly Val Glu Phe Ala 260 265 270 Asn Gln Ile Ile Gly Asn Val Thr Lys Ala Val Ser Ser Tyr Ile Leu 275 280 285 Ala Gln Arg Val Ala Ser Gly Leu Ser Ser Thr Gly Pro Val Ala Ala 290 295 300 Leu Ile Ala Ser Thr Val Ala Leu Ala Val Ser Pro Leu Ser Phe Leu 305 310 315 320 Asn Val Ala Asp Lys Phe Lys Gln Ala Asp Leu Ile Lys Ser Tyr Ser 325 330 335 Glu Arg Phe Gln Lys Leu Gly Tyr Asp Gly Asp Arg Leu Leu Ala Asp 340 345 350 Phe His Arg Glu Thr Gly Thr Ile Asp Ala Ser Val Thr Thr Ile Asn 355 360 365 Thr Ala Leu Ala Ala Ile Ser Gly Gly Val Gly Ala Ala Ser Ala Gly 370 375 380 Ser Leu Val Gly Ala Pro Val Ala Leu Leu Val Ala Gly Val Thr Gly 385 390 395 400 Leu Ile Thr Thr Ile Leu Glu Tyr Ser Lys Gln Ala Met Phe Glu His 405 410 415 Val Ala Asn Lys Val His Asp Arg Ile Val Glu Trp Glu Lys Lys His 420 425 430 Asn Lys Asn Tyr Phe Glu Gln Gly Tyr Asp Ser Arg His Leu Ala Asp 435 440 445 Leu Gln Asp Asn Met Lys Phe Leu Ile Asn Leu Asn Lys Glu Leu Gln 450 455 460 Ala Glu Arg Val Val Ala Ile Thr Gln Gln Arg Trp Asp Asn Gln Ile 465 470 475 480 Gly Asp Leu Ala Ala Ile Ser Arg Arg Thr Asp Lys Ile Ser Ser Gly 485 490 495 Lys Ala Tyr Val Asp Ala Phe Glu Glu Gly Gln His Gln Ser Tyr Asp 500 505 510 Ser Ser Val Gln Leu Asp Asn Lys Asn Gly Ile Ile Asn Ile Ser Asn 515 520 525 Thr Asn Arg Lys Thr Gln Ser Val Leu Phe Arg Thr Pro Leu Leu Thr 530 535 540 Pro Gly Glu Glu Asn Arg Glu Arg Ile Gln Glu Gly Lys Asn Ser Tyr 545 550 555 560 Ile Thr Lys Leu His Ile Gln Arg Val Asp Ser Trp Thr Val Thr Asp 565 570 575 Gly Asp Ala Ser Ser Ser Val Asp Phe Thr Asn Val Val Gln Arg Ile 580 585 590 Ala Val Lys Phe Asp Asp Ala Gly Asn Ile Ile Glu Ser Lys Asp Thr 595 600 605 Lys Ile Ile Ala Asn Leu Gly Ala Gly Asn Asp Asn Val Phe Val Gly 610 615 620 Ser Ser Thr Thr Val Ile Asp Gly Gly Asp Gly His Asp Arg Val His 625 630 635 640 Tyr Ser Arg Gly Glu Tyr Gly Ala Leu Val Ile Asp Ala Thr Ala Glu 645 650 655 Thr Glu Lys Gly Ser Tyr Ser Val Lys Arg Tyr Val Gly Asp Ser Lys 660 665 670 Ala Leu His Glu Thr Ile Ala Thr His Gln Thr Asn Val Gly Asn Arg 675 680 685 Glu Glu Lys Ile Glu Tyr Arg Arg Glu Asp Asp Arg Phe His Thr Gly 690 695 700 Tyr Thr Val Thr Asp Ser Leu Lys Ser Val Glu Glu Ile Ile Gly Ser 705 710 715 720 Gln Phe Asn Asp Ile Phe Lys Gly Ser Gln Phe Asp Asp Val Phe His 725 730 735 Gly Gly Asn Gly Val Asp Thr Ile Asp Gly Asn Asp Gly Asp Asp His 740 745 750 Leu Phe Gly Gly Ala Gly Asp Asp Val Ile Asp Gly Gly Asn Gly Asn 755 760 765 Asn Phe Leu Val Gly Gly Thr Gly Asn Asp Ile Ile Ser Gly Gly Lys 770 775 780 Asp Asn Asp Ile Tyr Val His Lys Thr Gly Asp Gly Asn Asp Ser Ile 785 790 795 800 Thr Asp Ser Gly Gly Gln Asp Lys Leu Ala Phe Ser Asp Val Asn Leu 805 810 815 Lys Asp Leu Thr Phe Lys Lys Val Asp Ser Ser Leu Glu Ile Ile Asn 820 825 830 Gln Lys Gly Glu Lys Val Arg Ile Gly Asn Trp Phe Leu Glu Asp Asp 835 840 845 Leu Ala Ser Thr Val Ala Asn Tyr Lys Ala Thr Asn Asp Arg Lys Ile 850 855 860 Glu Glu Ile Ile Gly Lys Gly Gly Glu Arg Ile Thr Ser Glu Gln Val 865 870 875 880 Asp Lys Leu Ile Lys Glu Gly Asn Asn Gln Ile Ser Ala Glu Ala Leu 885 890 895 Ser Lys Val Val Asn Asp Tyr Asn Thr Ser Lys Asp Arg Gln Asn Val 900 905 910 Ser Asn Ser Leu Ala Lys Leu Ile Ser Ser Val Gly Ser Phe Thr Ser 915 920 925 Ser Ser Asp Phe Arg Asn Asn Leu Gly Thr Tyr Val Pro Ser Ser Ile 930 935 940 Asp Val Ser Asn Asn Ile Gln Leu Ala Arg Ala Ala 945 950 955 <210> 3 <211> 1052 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> recombinant rApx III <400> 3 Met Ser Thr Trp Ser Ser Met Leu Ala Asp Leu Lys Lys Arg Ala Glu 1 5 10 15 Glu Ala Lys Arg Gln Ala Lys Lys Gly Tyr Asp Val Thr Lys Asn Gly 20 25 30 Leu Gln Tyr Gly Val Ser Gln Ala Lys Leu Gln Ala Leu Ala Ala Gly 35 40 45 Lys Ala Val Gln Lys Tyr Gly Asn Lys Leu Val Leu Val Ile Pro Lys 50 55 60 Glu Tyr Asp Gly Ser Val Gly Asn Gly Phe Phe Asp Leu Val Lys Ala 65 70 75 80 Ala Glu Glu Leu Gly Ile Gln Val Lys Tyr Val Asn Arg Asn Glu Leu 85 90 95 Glu Val Ala His Lys Ser Leu Gly Thr Ala Asp Gln Phe Leu Gly Leu 100 105 110 Thr Glu Arg Gly Leu Thr Leu Phe Ala Pro Gln Leu Asp Gln Phe Leu 115 120 125 Gln Lys His Ser Lys Ile Ser Asn Val Val Gly Ser Ser Thr Gly Asp 130 135 140 Ala Val Ser Lys Leu Ala Lys Ser Gln Thr Ile Ile Ser Gly Ile Gln 145 150 155 160 Ser Val Leu Gly Thr Val Leu Ala Gly Ile Asn Leu Asn Glu Ala Ile 165 170 175 Ile Ser Gly Gly Ser Glu Leu Glu Leu Ala Glu Ala Gly Val Ser Leu 180 185 190 Ala Ser Glu Leu Val Ser Asn Ile Ala Lys Gly Thr Thr Thr Ile Asp 195 200 205 Ala Phe Thr Thr Gln Ile 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Ser Asp Leu Leu Asp Gly Gly Glu Gly 835 840 845 Asn Asp Tyr Leu Glu Gly Gly Asp Gly Ser Asp Phe Tyr Val Tyr Arg 850 855 860 Ser Thr Ser Gly Asn His Thr Ile Tyr Asp Gln Gly Lys Ser Ser Asp 865 870 875 880 Leu Asp Lys Leu Tyr Leu Ser Asp Phe Ser Phe Asp Arg Leu Leu Val 885 890 895 Glu Lys Val Asp Asp Asn Leu Val Leu Arg Ser Asn Glu Ser Ser His 900 905 910 Asn Asn Gly Val Leu Thr Ile Lys Asp Trp Phe Lys Glu Gly Asn Lys 915 920 925 Tyr Asn His Lys Ile Glu Gln Ile Val Asp Lys Asn Gly Arg Lys Leu 930 935 940 Thr Ala Glu Asn Leu Gly Thr Tyr Phe Lys Asn Ala Pro Lys Ala Asp 945 950 955 960 Asn Leu Leu Asn Tyr Ala Thr Lys Glu Asp Gln Asn Glu Ser Asn Leu 965 970 975 Ser Ser Leu Lys Thr Glu Leu Ser Lys Ile Ile Thr Asn Ala Gly Asn 980 985 990 Phe Gly Val Ala Lys Gln Gly Asn Thr Gly Ile Asn Thr Ala Ala Leu 995 1000 1005 Asn Asn Glu Val Asn Lys Ile Ile Ser Ser Ala Asn Thr Phe Ala Thr 1010 1015 1020 Ser Gln Leu Gly Gly Ser Gly Met Gly Thr Leu Pro Ser Thr Asn Val 1025 1030 1035 1040 Asn Ser Met Met Leu 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Claims

혈청형 1의 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애(수탁번호: KACC91772P) 항원, 혈청형 2의 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애(수탁번호: KACC91766P) 항원, 혈청형 5의 돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애(수탁번호: KACC91768P) 항원, 파스튜렐라 멀토시다 A형(수탁번호: KCTC12541BP) 항원, 써코바이러스 2형(수탁번호: KCTC11150BP) 항원, 및 이뮬랜트-α(Immulant-α)를 포함하는,
돼지 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 A형 및 써코바이러스 2형에 의한 감염에 대해 동시 보호를 제공하기 위한 백신 조성물.
1항에 있어서,
상기 액티노바실루스 플로르뉴모니애 항원으로서, rApx I, rApx II 및 rApx III를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
25 중량%의 이뮬랜트-α를 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제 1항 또는 제 2항에 있어서,
1 x 10² 내지 1 x 10¹⁵ CFU의 혈청형 1의 액티노바실루스 플로르뉴모니애(수탁번호: KACC91772P) 항원, 1 x 10² 내지 1 x 10¹⁵CFU의 혈청형 2의 액티노바실루스 플로르뉴모니애(수탁번호: KACC91766P) 항원 및 1 x 10² 내지 1 x 10¹⁵ CFU의 혈청형 5의 액티노바실루스 플로르뉴모니애(수탁번호: KACC91768P) 항원, 1 x 10² 내지 1 x 10¹⁵ CFU의 파스튜렐라 멀토시다 A형(수탁번호: KCTC12541BP) 항원, 1 x 10² 내지 1 x 10¹⁵ TCID₅₀(50% 조직배양감염가, tissue culture infectious dose 50)의 돼지 써코바이러스 2형(수탁번호: KCTC11150BP) 항원, 및 25 중량%의 이뮬랜트-α를 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.
제 4항에 있어서,
상기 액티노바실루스 플로르뉴모니애 항원으로서, 각각 10 내지 50 ㎍의 rApx I, rApx II 및 rApx III를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 백신 조성물.