JPH05262666A - 豚胸膜肺炎多価ワクチン - Google Patents
豚胸膜肺炎多価ワクチンInfo
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- JPH05262666A JPH05262666A JP6595892A JP6595892A JPH05262666A JP H05262666 A JPH05262666 A JP H05262666A JP 6595892 A JP6595892 A JP 6595892A JP 6595892 A JP6595892 A JP 6595892A JP H05262666 A JPH05262666 A JP H05262666A
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 本発明は豚胸膜肺炎のワクチンを、Actinoba
cillus pleuropneumoniae の感染防御に有効な複数の血
清型菌抗原が所要量含まれるものとし、しかも副作用の
低減されたものとして、使用時の安全性が高く抗体のレ
スポンスに優れたワクチンとする。 【構成】 Actinobacillus pleuropneumoniae の血清型
１、２および５型菌の培養上清を限外濾過して濃縮し、
これにオイルアジュバントを添加して、上記Ａｐｐの血
清型１、２および５型菌の莢膜抗原およびこれらのサイ
トリジンを有効成分とする豚胸膜肺炎多価ワクチンとす
る。
cillus pleuropneumoniae の感染防御に有効な複数の血
清型菌抗原が所要量含まれるものとし、しかも副作用の
低減されたものとして、使用時の安全性が高く抗体のレ
スポンスに優れたワクチンとする。 【構成】 Actinobacillus pleuropneumoniae の血清型
１、２および５型菌の培養上清を限外濾過して濃縮し、
これにオイルアジュバントを添加して、上記Ａｐｐの血
清型１、２および５型菌の莢膜抗原およびこれらのサイ
トリジンを有効成分とする豚胸膜肺炎多価ワクチンとす
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は豚胸膜肺炎に有効な多
価ワクチン及びその製造方法に関する。
価ワクチン及びその製造方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】豚胸膜肺炎は、Actinobacillus pleurop
neumoniae （以下、これをＡｐｐと略記する）を起因菌
とする疾病であり、急性例では繊維素性の胸膜肺炎を呈
し、致死率が高く、また慢性の経過をとったものでは発
育遅延等の影響を与えるため、畜産上に大きな被害を与
えることが知られている。
neumoniae （以下、これをＡｐｐと略記する）を起因菌
とする疾病であり、急性例では繊維素性の胸膜肺炎を呈
し、致死率が高く、また慢性の経過をとったものでは発
育遅延等の影響を与えるため、畜産上に大きな被害を与
えることが知られている。
【０００３】本病が近年特に注目されるようになったの
は、１９６４年にアルゼンチンにおける流行に関する報
告以降のことであり、その後、各国で認識されるように
なった。わが国においては、１９７５年に新潟県下にお
ける発生の記載が最初であり、以後各地で発生が認めら
れている。
は、１９６４年にアルゼンチンにおける流行に関する報
告以降のことであり、その後、各国で認識されるように
なった。わが国においては、１９７５年に新潟県下にお
ける発生の記載が最初であり、以後各地で発生が認めら
れている。
【０００４】上記したような疾病の起因菌であるＡｐｐ
は、その同定を行なうに際し、生化学的性状として、ウ
レアーゼの産生、マンニット、Ｄ−キシロースおよびＤ
−リボースの分解性、ＤＮＡ中のグアニンおよびシトシ
ンの含量が４２．１±０．３％であること等を呈するこ
とが知られている。さらに、Ａｐｐは、その血清学的性
状を一般にスライド凝集反応により判別して１〜１２型
の血清型菌に分類される。この分類法は、American Jou
rnal of Veterinary Reaserch 、第４６巻第１号（１９
８５年１月）に記載されたＲａｐｐら（１９８４）のHa
emophilus pleuropneumoniae（Ａｐｐに同じ）のスライ
ド凝集法に詳しく説明され、また一般的にも研究報告は
多く挙げられる。
は、その同定を行なうに際し、生化学的性状として、ウ
レアーゼの産生、マンニット、Ｄ−キシロースおよびＤ
−リボースの分解性、ＤＮＡ中のグアニンおよびシトシ
ンの含量が４２．１±０．３％であること等を呈するこ
とが知られている。さらに、Ａｐｐは、その血清学的性
状を一般にスライド凝集反応により判別して１〜１２型
の血清型菌に分類される。この分類法は、American Jou
rnal of Veterinary Reaserch 、第４６巻第１号（１９
８５年１月）に記載されたＲａｐｐら（１９８４）のHa
emophilus pleuropneumoniae（Ａｐｐに同じ）のスライ
ド凝集法に詳しく説明され、また一般的にも研究報告は
多く挙げられる。
【０００５】上記の血清型別のＡｐｐによる発生例を国
別にみると、従来より複数の血清型菌が分布していた
が、最近では一国あたりの型数が、さらに増加する傾向
にある。たとえば、我が国では、従来、血清型２型菌に
よる発生がほとんどであったが、最近、血清型１型菌や
５型菌による多くの発生例が報告されるようになってき
た。また、最近１０年間の国内のと畜場出荷豚に対する
補体結合テストの結果として、Ａｐｐ２型菌に対するＣ
Ｆ抗体の保有率は６０〜８０％、病変保有率は４〜７％
であったとの報告（山本、動薬畜産資材だより、１９８
８年１月、全農畜産資材部）もある。本病は、不顕性感
染的な要因が強い疾病で感染豚の発見が難しく、未発症
の豚でも感染源となり得るので、我が国の養豚場におけ
る保菌豚の数は相当数に至ることが推察できる。
別にみると、従来より複数の血清型菌が分布していた
が、最近では一国あたりの型数が、さらに増加する傾向
にある。たとえば、我が国では、従来、血清型２型菌に
よる発生がほとんどであったが、最近、血清型１型菌や
５型菌による多くの発生例が報告されるようになってき
た。また、最近１０年間の国内のと畜場出荷豚に対する
補体結合テストの結果として、Ａｐｐ２型菌に対するＣ
Ｆ抗体の保有率は６０〜８０％、病変保有率は４〜７％
であったとの報告（山本、動薬畜産資材だより、１９８
８年１月、全農畜産資材部）もある。本病は、不顕性感
染的な要因が強い疾病で感染豚の発見が難しく、未発症
の豚でも感染源となり得るので、我が国の養豚場におけ
る保菌豚の数は相当数に至ることが推察できる。
【０００６】一方、本病の予防策として、不活化全菌体
ワクチンが実用化されており、その発症予防効果も知ら
れている。一般に、不活化全菌体ワクチンには種々の感
染防御抗原が含まれており、血清型特異抗原であり感染
防御抗原とされるリポポリサッカライド（以下ＬＰＳと
略記する）も当然に含まれる。ＬＰＳは、グラム陰性菌
の菌体に存在する内毒素であり、発熱作用や致死毒性の
他にＢ細胞マイトジェン、アジュバンド作用などの生物
活性を合わせ持つものである。また、ＬＰＳのＯ抗原多
糖は抗原決定基を有し、多くの細菌の血清型別診断及び
同定に用いられている。
ワクチンが実用化されており、その発症予防効果も知ら
れている。一般に、不活化全菌体ワクチンには種々の感
染防御抗原が含まれており、血清型特異抗原であり感染
防御抗原とされるリポポリサッカライド（以下ＬＰＳと
略記する）も当然に含まれる。ＬＰＳは、グラム陰性菌
の菌体に存在する内毒素であり、発熱作用や致死毒性の
他にＢ細胞マイトジェン、アジュバンド作用などの生物
活性を合わせ持つものである。また、ＬＰＳのＯ抗原多
糖は抗原決定基を有し、多くの細菌の血清型別診断及び
同定に用いられている。
【０００７】また、上記の不活化全菌体ワクチンには、
免疫増強のため、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アル
ミニウムゲル等のアジュバントが添加されていた。
免疫増強のため、水酸化アルミニウムゲル、リン酸アル
ミニウムゲル等のアジュバントが添加されていた。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかし、上記した不活
化全菌体ワクチンでは、我が国に蔓延する二種以上の血
清型菌体に起因する豚胸膜肺炎に対応する感染予防効果
が充分に得られない。この原因としては、従来の不活化
全菌体ワクチンが単一血清型のワクチンであり、当該血
清型のＡｐｐに対して発症予防効果はあるものの、異な
る血清型間における交差免疫効果が弱いため、充分な感
染防御ができない点が挙げられる。
化全菌体ワクチンでは、我が国に蔓延する二種以上の血
清型菌体に起因する豚胸膜肺炎に対応する感染予防効果
が充分に得られない。この原因としては、従来の不活化
全菌体ワクチンが単一血清型のワクチンであり、当該血
清型のＡｐｐに対して発症予防効果はあるものの、異な
る血清型間における交差免疫効果が弱いため、充分な感
染防御ができない点が挙げられる。
【０００９】また、上記欠点を考慮し、複数の血清型菌
体に有効であるワクチンとするためには、所要数の血清
型の不活化全菌体からなる混合ワクチンとすればよいと
も考えられる。
体に有効であるワクチンとするためには、所要数の血清
型の不活化全菌体からなる混合ワクチンとすればよいと
も考えられる。
【００１０】しかし、この場合は、ワクチン内の総菌体
量の増加と共にＬＰＳ等の菌体含有の内毒素量も増大す
ることとなる結果、ワクチン接種豚に副作用が強く現わ
れ、例えば元気消失、嘔吐、震え等の諸症状を呈し、時
には死亡原因ともなる。このように、全菌体を用いるワ
クチンでは、豚胸膜肺炎の感染防御に必要な充分量の抗
原を配合することができないという問題点があった。
量の増加と共にＬＰＳ等の菌体含有の内毒素量も増大す
ることとなる結果、ワクチン接種豚に副作用が強く現わ
れ、例えば元気消失、嘔吐、震え等の諸症状を呈し、時
には死亡原因ともなる。このように、全菌体を用いるワ
クチンでは、豚胸膜肺炎の感染防御に必要な充分量の抗
原を配合することができないという問題点があった。
【００１１】この発明は、上記した問題点を解決し、豚
胸膜肺炎のワクチンを、Ａｐｐの感染防御に有効な複数
の血清型菌の抗原が所要量含まれるものとし、しかも、
副作用の低いものとして、使用時の安全性が高く抗体の
レスポンスに優れたものとすることを課題としている。
胸膜肺炎のワクチンを、Ａｐｐの感染防御に有効な複数
の血清型菌の抗原が所要量含まれるものとし、しかも、
副作用の低いものとして、使用時の安全性が高く抗体の
レスポンスに優れたものとすることを課題としている。
【００１２】
【課題を解決するための手段】上記の課題を解決するた
め、この発明においては、豚胸膜肺炎の起因菌であるAc
tinobacillus pleuropneumoniae の血清型１、２および
５型菌の莢膜抗原およびこれらのサイトリジンを有効成
分とする豚胸膜肺炎多価ワクチンとしたのである。
め、この発明においては、豚胸膜肺炎の起因菌であるAc
tinobacillus pleuropneumoniae の血清型１、２および
５型菌の莢膜抗原およびこれらのサイトリジンを有効成
分とする豚胸膜肺炎多価ワクチンとしたのである。
【００１３】上記豚胸膜肺炎多価ワクチンは、Actinoba
cillus pleuropneumoniae の血清型１、２および５型菌
の培養上清を限外濾過してこの上清中に遊離または放出
される莢膜抗原およびサイトリジンを濃縮し、これにオ
イルアジュバントを添加することにより製造できる。以
下、その詳細を述べる。
cillus pleuropneumoniae の血清型１、２および５型菌
の培養上清を限外濾過してこの上清中に遊離または放出
される莢膜抗原およびサイトリジンを濃縮し、これにオ
イルアジュバントを添加することにより製造できる。以
下、その詳細を述べる。
【００１４】Ａｐｐは、自然発生した豚胸膜肺炎感染豚
から分離し、前記したスライド凝集法によって血清型別
に同定した菌株を用いることができる。また、防疫上の
理由により、事実上の使用は不可能であるが、市販ＡＴ
ＣＣ株もある。
から分離し、前記したスライド凝集法によって血清型別
に同定した菌株を用いることができる。また、防疫上の
理由により、事実上の使用は不可能であるが、市販ＡＴ
ＣＣ株もある。
【００１５】Ａｐｐの培養に適した培地としては、Brai
n Heart Infusion broth、Trypticase soy broth、Modi
fied S-broth（鶏肉ブイヨン２０％、カザミノ酸０．５
％、ソイペプトン０．５％、塩化ナトリウム０．５％、
イーストエキストラクト０．５％）などの合成培地にＡ
ｐｐの必須の発育因子であるβ−ＮＡＤを０．００１％
加えたものがあげられる。
n Heart Infusion broth、Trypticase soy broth、Modi
fied S-broth（鶏肉ブイヨン２０％、カザミノ酸０．５
％、ソイペプトン０．５％、塩化ナトリウム０．５％、
イーストエキストラクト０．５％）などの合成培地にＡ
ｐｐの必須の発育因子であるβ−ＮＡＤを０．００１％
加えたものがあげられる。
【００１６】この発明に用いるＡｐｐの血清型１、２お
よび５型菌の感染防御抗原としては、これらの莢膜抗原
（Capsular Antigen）（以下、ＣＡと略記する）および
サイトリジン（Cytolysin ）である。
よび５型菌の感染防御抗原としては、これらの莢膜抗原
（Capsular Antigen）（以下、ＣＡと略記する）および
サイトリジン（Cytolysin ）である。
【００１７】上記したＣＡは、多糖体であるが、同一菌
種でも型によって免疫学的特異性が異なる血清型特異抗
原である。ＣＡは一般的手法により精製できるが、あま
り高純度に精製すると抗原性は保持されるものの感染防
御能は極端に低下し、ある程度の蛋白を含んだ粗精製の
段階であるものが感染防御能が高く好ましい。
種でも型によって免疫学的特異性が異なる血清型特異抗
原である。ＣＡは一般的手法により精製できるが、あま
り高純度に精製すると抗原性は保持されるものの感染防
御能は極端に低下し、ある程度の蛋白を含んだ粗精製の
段階であるものが感染防御能が高く好ましい。
【００１８】一方、サイトリジンは、菌体の増殖に伴い
菌体外に放出される物質であり、Cytotoxic 活性及びHe
molysin 活性も報告されている物質である。また、ＳＤ
Ｓ（Sodium dodecyl sulfate）−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により分子量１００〜１２０ｋＤａ（キロ
ダルトン：原子量質量単位）の帯域に確認でき、血清型
に共通な感染防御抗原といわれる。しかし、サイトリジ
ン単独では、充分な感染防御を示さないことから、血清
型特異抗原との共存が必要と判断されている。
菌体外に放出される物質であり、Cytotoxic 活性及びHe
molysin 活性も報告されている物質である。また、ＳＤ
Ｓ（Sodium dodecyl sulfate）−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法により分子量１００〜１２０ｋＤａ（キロ
ダルトン：原子量質量単位）の帯域に確認でき、血清型
に共通な感染防御抗原といわれる。しかし、サイトリジ
ン単独では、充分な感染防御を示さないことから、血清
型特異抗原との共存が必要と判断されている。
【００１９】この発明の豚胸膜肺炎多価ワクチンを製造
するには、Ａｐｐ１、２、５型菌をそれぞれβ−ＮＡＤ
を添加した合成液体培地で対数増殖期のピークに達する
まで培養し、この時点で遠心により菌体を除去し培養上
清を採取する。次にこの培養上清を限外濾過器により濃
縮し、オイルアジュバントを添加する。
するには、Ａｐｐ１、２、５型菌をそれぞれβ−ＮＡＤ
を添加した合成液体培地で対数増殖期のピークに達する
まで培養し、この時点で遠心により菌体を除去し培養上
清を採取する。次にこの培養上清を限外濾過器により濃
縮し、オイルアジュバントを添加する。
【００２０】このようにオイルアジュバントを添加する
のは、コンポーネントワクチンの場合、アジュバントの
助けがないとその効果はワクチン抗原を非常に大量に生
体内にいれなければ現れないからである。オイルアジュ
バントの混合比は、親水性物質であるワクチン抗原を親
油性物質であるオイルアジュバントが効果的に包含する
比率であればよく、特にオイルアジュバントの品質によ
りこの比率は大きく変動する。
のは、コンポーネントワクチンの場合、アジュバントの
助けがないとその効果はワクチン抗原を非常に大量に生
体内にいれなければ現れないからである。オイルアジュ
バントの混合比は、親水性物質であるワクチン抗原を親
油性物質であるオイルアジュバントが効果的に包含する
比率であればよく、特にオイルアジュバントの品質によ
りこの比率は大きく変動する。
【００２１】なお、この発明の効果を阻害しない配合割
合において、菌体以外の成分で被接種豚の安全性に影響
しない成分をワクチンに含ませることもできる。
合において、菌体以外の成分で被接種豚の安全性に影響
しない成分をワクチンに含ませることもできる。
【００２２】
【作用】この発明の豚胸膜肺炎多価ワクチンは、ＬＰＳ
の含有量が少なく、Ａｐｐ１、２、５型菌の莢膜抗原お
よびサイトリジンを有効成分とするので、１、２または
５型のいずれにも充分な感染防御効果があり、しかも内
毒素による副作用が少ないものとなる。莢膜抗原は、通
常菌体最外殻表面に存在する菌体成分であるが、培養時
間の経過とともに菌体から遊離する。この時ＬＰＳも遊
離するがその遊離量は菌体に存在するＬＰＳ量と比較す
るとごく微量であり、副作用の少ない多価ワクチンが製
造される。
の含有量が少なく、Ａｐｐ１、２、５型菌の莢膜抗原お
よびサイトリジンを有効成分とするので、１、２または
５型のいずれにも充分な感染防御効果があり、しかも内
毒素による副作用が少ないものとなる。莢膜抗原は、通
常菌体最外殻表面に存在する菌体成分であるが、培養時
間の経過とともに菌体から遊離する。この時ＬＰＳも遊
離するがその遊離量は菌体に存在するＬＰＳ量と比較す
るとごく微量であり、副作用の少ない多価ワクチンが製
造される。
【００２３】また、親油性物質であるオイルアジュバン
トは、親水性物質である前記多価ワクチンの抗原を効果
的に包含するため、免疫機構が刺激されその反応が強め
られる。
トは、親水性物質である前記多価ワクチンの抗原を効果
的に包含するため、免疫機構が刺激されその反応が強め
られる。
【００２４】
【実施例】我が国において自然発生した豚胸膜肺炎に罹
患した豚から分離され、スライド凝集法により同定され
たＡｐｐ１、２および５型菌の菌株を用い、Modified S
-broth ６０ｌにあらかじめ同培地で３７℃２４時間振
盪培養した前記Ａｐｐ１、２、５型菌の培養液を２０ｍ
ｌずつ別々に接種した。この培養液を３７℃で攪拌しな
がら６時間培養した後、培養を止め、遠心（１２，００
０×ｇ）により菌体を除去し培養上清を得、この培養上
清を限外濾過器により１５０ｍｌまで濃縮した。この濃
縮液を１、２、５型菌のそれぞれについて作製した。
患した豚から分離され、スライド凝集法により同定され
たＡｐｐ１、２および５型菌の菌株を用い、Modified S
-broth ６０ｌにあらかじめ同培地で３７℃２４時間振
盪培養した前記Ａｐｐ１、２、５型菌の培養液を２０ｍ
ｌずつ別々に接種した。この培養液を３７℃で攪拌しな
がら６時間培養した後、培養を止め、遠心（１２，００
０×ｇ）により菌体を除去し培養上清を得、この培養上
清を限外濾過器により１５０ｍｌまで濃縮した。この濃
縮液を１、２、５型菌のそれぞれについて作製した。
【００２５】次に、この濃縮液中にサイトリジンおよび
莢膜抗原が含まれることを確認するため、前記培養上清
濃縮液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
解析した。この結果、図１に示すように、１００〜１２
０ｋＤａの帯域にサイトリジンの存在がメジャーなバン
ドとして確認された。一方、莢膜抗原は多糖体であるた
め、この方法では検出が困難である。そこでそれぞれの
血清型のＣＡに対する単クローン抗体を用いたイムノブ
ロティングで検出し、この結果を図２に示した。
莢膜抗原が含まれることを確認するため、前記培養上清
濃縮液を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動で
解析した。この結果、図１に示すように、１００〜１２
０ｋＤａの帯域にサイトリジンの存在がメジャーなバン
ドとして確認された。一方、莢膜抗原は多糖体であるた
め、この方法では検出が困難である。そこでそれぞれの
血清型のＣＡに対する単クローン抗体を用いたイムノブ
ロティングで検出し、この結果を図２に示した。
【００２６】図１および図２の結果から明らかなよう
に、この培養上清濃縮液には、莢膜抗原とサイトリジン
が優位に含まれることが判明した。
に、この培養上清濃縮液には、莢膜抗原とサイトリジン
が優位に含まれることが判明した。
【００２７】次に、前記した培養上清濃縮液とオイルア
ジュバントを容量比で３：７に混合し、豚胸膜肺炎多価
ワクチンを得た。
ジュバントを容量比で３：７に混合し、豚胸膜肺炎多価
ワクチンを得た。
【００２８】〔凝集抗体価および補体結合抗体価の測
定〕これらのワクチンの抗体のレスポンスについて検討
するため、ワクチン接種群、対照群の血清中のＡｐｐ
１、２、５型菌、それぞれに対する凝集抗体価および補
体結合抗体価を測定した。
定〕これらのワクチンの抗体のレスポンスについて検討
するため、ワクチン接種群、対照群の血清中のＡｐｐ
１、２、５型菌、それぞれに対する凝集抗体価および補
体結合抗体価を測定した。
【００２９】凝集抗体価の測定方法は、５６℃で３０分
非動化した血清をリン酸緩衝食塩水により２倍階段希釈
しこれにＡｐｐ１、２、５型菌のホルマリン死菌抗原
（McFarland No４に調整）を等量加え、５０℃で２時間
感作した後、室温に一晩静置して判定した。補体結合抗
体価は、非動化した血清をゼラチンベロナール緩衝液に
より２倍階段希釈した。Ａｐｐ１、２、５型菌の死菌抽
出抗原の抗原単位をあらかじめ測定し、４単位の濃度に
調整したものを等量加え、さらにモルモット補体２単位
を加え、４℃で一晩静置後３％感作血球液を加え、３７
℃、３０分感作ののち室温に静置して判定した。
非動化した血清をリン酸緩衝食塩水により２倍階段希釈
しこれにＡｐｐ１、２、５型菌のホルマリン死菌抗原
（McFarland No４に調整）を等量加え、５０℃で２時間
感作した後、室温に一晩静置して判定した。補体結合抗
体価は、非動化した血清をゼラチンベロナール緩衝液に
より２倍階段希釈した。Ａｐｐ１、２、５型菌の死菌抽
出抗原の抗原単位をあらかじめ測定し、４単位の濃度に
調整したものを等量加え、さらにモルモット補体２単位
を加え、４℃で一晩静置後３％感作血球液を加え、３７
℃、３０分感作ののち室温に静置して判定した。
【００３０】結果は、ワクチン群では、凝集抗体価は１
２８〜２５６倍、対照群で４倍以下、補体結合抗体価
は、ワクチン群で１２８〜５１２倍、対照群で４倍以下
であった。
２８〜２５６倍、対照群で４倍以下、補体結合抗体価
は、ワクチン群で１２８〜５１２倍、対照群で４倍以下
であった。
【００３１】さらに、抗原量と凝集抗体価、補体結合抗
体価の関係について検討するため、抗原量を段階的に調
整したワクチンを作製し、４０日齢の豚の頸部筋肉内に
３週間隔で２回接種し、経時的な凝集抗体価と補体結合
抗体価を測定し、さらに、最終免疫より３週後、Ａｐｐ
１、２、５型菌で気管内に攻撃した。
体価の関係について検討するため、抗原量を段階的に調
整したワクチンを作製し、４０日齢の豚の頸部筋肉内に
３週間隔で２回接種し、経時的な凝集抗体価と補体結合
抗体価を測定し、さらに、最終免疫より３週後、Ａｐｐ
１、２、５型菌で気管内に攻撃した。
【００３２】結果は、図３に示すように、抗原量と補体
結合抗体価との間に相関関係が認められ、さらに、補体
結合抗体価３２倍以下では明確な防御は認められなかっ
た。
結合抗体価との間に相関関係が認められ、さらに、補体
結合抗体価３２倍以下では明確な防御は認められなかっ
た。
【００３３】〔抗原量の規定〕上記のように、豚胸膜肺
炎多価ワクチンの抗原量は、血清型特異抗原である莢膜
抗原量と、サイトリジンの量を規定する必要がある。そ
こで、それぞれの抗原に特異的な単クローン抗体を用い
た酸素免疫測定法（Enzyme Linked Immno Adsorbent As
say:ELISA ）により抗原量を規定した。サイトリジンに
ついては、１、２及び５型菌に共通に反応するサイトリ
ジンに対する単クローン抗体に用いた。
炎多価ワクチンの抗原量は、血清型特異抗原である莢膜
抗原量と、サイトリジンの量を規定する必要がある。そ
こで、それぞれの抗原に特異的な単クローン抗体を用い
た酸素免疫測定法（Enzyme Linked Immno Adsorbent As
say:ELISA ）により抗原量を規定した。サイトリジンに
ついては、１、２及び５型菌に共通に反応するサイトリ
ジンに対する単クローン抗体に用いた。
【００３４】即ち、前記培養上清濃縮液をＥＬＩＳＡプ
レートに炭酸緩衝液にて段階希釈して１００ｕｌ／ｗｅ
ｌｌずつ分注し、４℃で一晩感作した。次に、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだリン酸緩衝食塩液（Ｔ−ＰＢ
Ｓ）にてプレートを洗浄後、５％牛血清を含むＴ−ＰＢ
Ｓで５ｕｇ／ｍｌに調整した１、２、５型菌莢膜抗原及
び１０５Ｋｄ蛋白に対する単クローン抗体（免疫グロブ
リンサブクラス：ＩｇＧ1 ）をそれぞれ１００ｕｌ／ｗ
ｅｌｌ加え、３７℃、１時間感作した。Ｔ−ＰＢＳで洗
浄後、同緩衝液で希釈したベルオキシダーゼ標識抗マウ
スＩｇＧを１００ｕｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃、１時間
感作した。Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、基質（ＯＰＤ）液を１
００ｕｌ加え、２５℃、３０分間感作した。これに１０
０ｕｌの１Ｍ硫酸溶液を加えて反応を停止させ、マイク
ロプレートオートリーダーを用いて９２０ｎｍの吸光度
（Ｏ．Ｄ．値）を測定した。この時の抗原の希釈倍率と
Ｏ．Ｄ．値から抗原量を規定することとした。
レートに炭酸緩衝液にて段階希釈して１００ｕｌ／ｗｅ
ｌｌずつ分注し、４℃で一晩感作した。次に、０．０５
％Ｔｗｅｅｎ２０を含んだリン酸緩衝食塩液（Ｔ−ＰＢ
Ｓ）にてプレートを洗浄後、５％牛血清を含むＴ−ＰＢ
Ｓで５ｕｇ／ｍｌに調整した１、２、５型菌莢膜抗原及
び１０５Ｋｄ蛋白に対する単クローン抗体（免疫グロブ
リンサブクラス：ＩｇＧ1 ）をそれぞれ１００ｕｌ／ｗ
ｅｌｌ加え、３７℃、１時間感作した。Ｔ−ＰＢＳで洗
浄後、同緩衝液で希釈したベルオキシダーゼ標識抗マウ
スＩｇＧを１００ｕｌ／ｗｅｌｌ加え、３７℃、１時間
感作した。Ｔ−ＰＢＳで洗浄し、基質（ＯＰＤ）液を１
００ｕｌ加え、２５℃、３０分間感作した。これに１０
０ｕｌの１Ｍ硫酸溶液を加えて反応を停止させ、マイク
ロプレートオートリーダーを用いて９２０ｎｍの吸光度
（Ｏ．Ｄ．値）を測定した。この時の抗原の希釈倍率と
Ｏ．Ｄ．値から抗原量を規定することとした。
【００３５】前記の抗原量と補体結合抗体価の関係を検
討した試験の際に使用した抗原についてＥＬＩＳＡにて
規定したところ、明確な感染防御を示す抗原量は、全て
抗原希釈８００倍でＯ．Ｄ．値０．５以上を示した。そ
こでこの値を抗原量の規定値とすることとした。
討した試験の際に使用した抗原についてＥＬＩＳＡにて
規定したところ、明確な感染防御を示す抗原量は、全て
抗原希釈８００倍でＯ．Ｄ．値０．５以上を示した。そ
こでこの値を抗原量の規定値とすることとした。
【００３６】次に、得られた多価ワクチンをマウスまた
は豚に投与して、その免疫効果および感染防御効果を調
べた。
は豚に投与して、その免疫効果および感染防御効果を調
べた。
【００３７】〔マウスを用いた試験〕上記のように作製
した抗原をオイルアジュバントと３：７の割合で混合し
た多価ワクチンを、２週間隔２回、４週齢のＣ３Ｈ／Ｈ
ｅＪマウス大腿部筋肉内に投与した。対照としてModifi
ed S-brothを同様に処理したものを投与した。さらに２
週後に、×５ＬＤ50のＡｐｐ１型菌、２型菌、５型菌を
腹腔内に投与し、攻撃した。この結果、ワクチン免疫群
は、８０〜１００％の生存率を示した。それに対し、対
照群の生存率は０％であった。
した抗原をオイルアジュバントと３：７の割合で混合し
た多価ワクチンを、２週間隔２回、４週齢のＣ３Ｈ／Ｈ
ｅＪマウス大腿部筋肉内に投与した。対照としてModifi
ed S-brothを同様に処理したものを投与した。さらに２
週後に、×５ＬＤ50のＡｐｐ１型菌、２型菌、５型菌を
腹腔内に投与し、攻撃した。この結果、ワクチン免疫群
は、８０〜１００％の生存率を示した。それに対し、対
照群の生存率は０％であった。
【００３８】〔豚を用いた試験〕４０日齢の豚の頸部筋
肉内に３週間隔２回接種した。さらに３週後、×１０Ｌ
Ｄ50のＡｐｐ１、２、５型菌をそれぞれ気管内で攻撃し
た。対照として、Modified S-brothを同様に処理したも
のを投与した群を設けた。その結果、対照群は攻撃後１
日目または２日目に死亡したのに対し、ワクチン接種群
は全例生存した。剖検所見では、対照群の肺には充出
血、腫大、硬結、線維素の滲出、胸水の貯留が認められ
たのに対し、ワクチン投与群では、これらの症状を認め
なかった。各臓器からの菌回収試験においても、対照群
では、気管スワブより高率に菌が回収されたのに対し、
ワクチン接種群では回収されなかった。
肉内に３週間隔２回接種した。さらに３週後、×１０Ｌ
Ｄ50のＡｐｐ１、２、５型菌をそれぞれ気管内で攻撃し
た。対照として、Modified S-brothを同様に処理したも
のを投与した群を設けた。その結果、対照群は攻撃後１
日目または２日目に死亡したのに対し、ワクチン接種群
は全例生存した。剖検所見では、対照群の肺には充出
血、腫大、硬結、線維素の滲出、胸水の貯留が認められ
たのに対し、ワクチン投与群では、これらの症状を認め
なかった。各臓器からの菌回収試験においても、対照群
では、気管スワブより高率に菌が回収されたのに対し、
ワクチン接種群では回収されなかった。
【００３９】
【効果】この発明は、以上説明したように、我が国で豚
胸膜肺炎の主たる原因菌であるとされているＡｐｐの感
染防御抗原である１、２、５型菌の莢膜抗原およびサイ
トリジンを有効成分とする多価ワクチンとしたので、血
清型間の交差免疫性が認められないＡｐｐの感染防御に
有効であり、また菌体を含まないため、副作用が低減さ
れたものとなる。また、オイルアジュバントの添加が効
果的で、生体への安全性が高く抗体のレスポンスもよい
ため、本病の蔓延防止に貢献するものであるといえる。
胸膜肺炎の主たる原因菌であるとされているＡｐｐの感
染防御抗原である１、２、５型菌の莢膜抗原およびサイ
トリジンを有効成分とする多価ワクチンとしたので、血
清型間の交差免疫性が認められないＡｐｐの感染防御に
有効であり、また菌体を含まないため、副作用が低減さ
れたものとなる。また、オイルアジュバントの添加が効
果的で、生体への安全性が高く抗体のレスポンスもよい
ため、本病の蔓延防止に貢献するものであるといえる。
【図１】培養上清濃縮液中のサイトリジンを示すＳＤＳ
−ポリアクリルアミド電気泳動図
−ポリアクリルアミド電気泳動図
【図２】培養上清濃縮液中の莢膜抗原を示すイムノブロ
ティング
ティング
【図３】（ａ）はＡｐｐ１型の抗原濃縮率と補体結合抗
体価の関係を示すグラフ （ｂ）はＡｐｐ２型の同上の関係を示すグラフ （ｃ）はＡｐｐ５型の同上の関係を示すグラフ
体価の関係を示すグラフ （ｂ）はＡｐｐ２型の同上の関係を示すグラフ （ｃ）はＡｐｐ５型の同上の関係を示すグラフ
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡部 達二 京都市伏見区桃山町大島38番地の218
Claims (2)
- 【請求項１】 豚胸膜肺炎の起因菌であるActinobacill
us pleuropneumoniae の血清型１、２および５型菌の莢
膜抗原およびこれらのサイトリジンを有効成分とする豚
胸膜肺炎多価ワクチン。 - 【請求項２】 Actinobacillus pleuropneumoniae の血
清型１、２および５型菌の培養上清を限外濾過してこの
上清中に遊離または放出される莢膜抗原およびサイトリ
ジンを濃縮し、これにオイルアジュバントを添加する請
求項１記載の豚胸膜肺炎多価ワクチンの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6595892A JPH05262666A (ja) | 1992-03-24 | 1992-03-24 | 豚胸膜肺炎多価ワクチン |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP6595892A JPH05262666A (ja) | 1992-03-24 | 1992-03-24 | 豚胸膜肺炎多価ワクチン |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05262666A true JPH05262666A (ja) | 1993-10-12 |
Family
ID=13302009
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6595892A Pending JPH05262666A (ja) | 1992-03-24 | 1992-03-24 | 豚胸膜肺炎多価ワクチン |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH05262666A (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013501028A (ja) * | 2009-08-06 | 2013-01-10 | インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー | 豚胸膜肺炎に対するワクチン及び当該ワクチンの取得方法 |
| KR101491792B1 (ko) * | 2013-09-10 | 2015-02-13 | 대한민국 | 신규한 액티노바실러스 플로르뉴모니아 혈청형 5번 균주, 이를 포함하는 진단용 조성물 및 백신 조성물 |
| KR101491803B1 (ko) * | 2013-09-10 | 2015-02-16 | 대한민국 | 신규한 액티노바실러스 플로르뉴모니아 혈청형 2번 균주, 이를 포함하는 진단용 조성물 및 백신 조성물 |
| KR20150086672A (ko) * | 2014-01-20 | 2015-07-29 | 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) | 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 및 써코바이러스에 의한 돼지의 감염을 예방하거나 치료하기 위한 다가 백신 조성물 |
| WO2020130224A1 (ko) * | 2018-12-19 | 2020-06-25 | 주식회사 이노백 | 마이코플라즈마 폐렴 및 흉막폐렴 예방용 백신 조성물 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02152930A (ja) * | 1988-08-12 | 1990-06-12 | Centraal Diergeneeskundig Inst | ワクチンおよび方法 |
-
1992
- 1992-03-24 JP JP6595892A patent/JPH05262666A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02152930A (ja) * | 1988-08-12 | 1990-06-12 | Centraal Diergeneeskundig Inst | ワクチンおよび方法 |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013501028A (ja) * | 2009-08-06 | 2013-01-10 | インターベツト・インターナシヨナル・ベー・ベー | 豚胸膜肺炎に対するワクチン及び当該ワクチンの取得方法 |
| KR101491792B1 (ko) * | 2013-09-10 | 2015-02-13 | 대한민국 | 신규한 액티노바실러스 플로르뉴모니아 혈청형 5번 균주, 이를 포함하는 진단용 조성물 및 백신 조성물 |
| KR101491803B1 (ko) * | 2013-09-10 | 2015-02-16 | 대한민국 | 신규한 액티노바실러스 플로르뉴모니아 혈청형 2번 균주, 이를 포함하는 진단용 조성물 및 백신 조성물 |
| KR20150086672A (ko) * | 2014-01-20 | 2015-07-29 | 대한민국(관리부서 : 농림축산식품부 농림축산검역본부) | 액티노바실루스 플로르뉴모니애, 파스튜렐라 멀토시다 및 써코바이러스에 의한 돼지의 감염을 예방하거나 치료하기 위한 다가 백신 조성물 |
| WO2020130224A1 (ko) * | 2018-12-19 | 2020-06-25 | 주식회사 이노백 | 마이코플라즈마 폐렴 및 흉막폐렴 예방용 백신 조성물 |
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