KR101484469B1 - 돼지 써코바이러스 관련 질환을 예방하기 위한 ｐｃｖ-2의 전체 바이러스를 포함하는 혼합백신 - Google Patents

돼지 써코바이러스 관련 질환을 예방하기 위한 ｐｃｖ-2의 전체 바이러스를 포함하는 혼합백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 써코바이러스 관련 질환 (PCVAD; Porcine circovirus associated diseases)을 예방하기 위한, PCV-2 전체 바이러스 (whole virus)를 포함하는 모돈 및/또는 자돈 접종용 혼합백신에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 각각을 불활화시킨 돼지 써코바이러스 2형 (CAKY98, KCTC 11150BP)의 전체 바이러스 (whole virus), 파스튜렐라 멀토시다 cDNT (P. multocida cDNT), 파스튜렐라 멀토시다 박테린 (P. multocida bacterin) 및 보데텔라 브론키셉티카 (B. bronchiseptica)을 포함하는 돼지 써코바이러스 및 위축성 비염의 예방을 위한 모돈용 혼합백신을 제공한다. 본 발명의 PCV-2 전체 바이러스(whole virus)를 포함하는 모돈용 혼합백신과 자돈용 혼합백신을 통해 돼지 써코바이러스에 의한 복합 감염으로 인한 피해를 줄일 수 있고, 모돈과 자돈 전용으로 혼합 백신을 개발함으로써 접종 횟수를 줄이고 효과적인 접종 프로그램을 갖출 수 있다.

Description

돼지 써코바이러스 관련 질환을 예방하기 위한 ＰＣＶ-2의 전체 바이러스를 포함하는 혼합백신{MIXED VACCINE COMPRISING THE WHOLE VIRUS OF PCV-2 FOR PREVENTING PORCINE CIRCOVIRUS ASSOCIATED DISEASES}
본 발명은 돼지 써코바이러스 관련 질환 (PCVAD; Porcine circovirus associated diseases)을 예방하기 위한 혼합백신에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 PCV-2 전체 바이러스 (whole virus)를 포함하는 모돈 및 자돈 접종용 혼합백신에 관한 것이다.
돼지의 써코바이러스 2형 (PCV-2; Porcine circovirus 2)은 이유자돈의 이유자돈 전신성소모성증후군 (Postweaning multisystemic wasting syndrome; PMWS)의 중요한 원인체로 밝혀진 바이러스이다.　 ‘이유자돈 전신성소모성증후군(PMWS)'이란 이유자돈에서의 소모성 증상을 특징으로 하는 돼지의 질병으로, 캐나다, 미국, 북 아일랜드, 유럽, 한국, 일본, 대만 등의 국가에서 보고되고 있다.　 ‘전신성소모성증후군 (PMWS)'에 걸리면 이유자돈에서 폐사나 위축, 증체량의 감소를 초래하며, 보통 6개월에서 1년간 지속되기 때문에 매우 심각한 경제적 피해를 가져오게 된다.
새로운 동물 바이러스과인 써코비리대 (Circoviridae)로 분류된 돼지 써코바이러스는 PMWS 임상증상 및 병리소견을 나타내는 돼지에서 지속적으로 확인되었다.　 PMWS 증상의 돼지에서 분리된 PCV-2는 PRRS 바이러스와 돼지 파보바이러스 등의 복합감염 형태 또는 글래서씨병, 마이코플라즈마, 흉막폐렴 등의 질병을 일으키는 세균의 2차 감염에 의해 이유자돈에서 PMWS 증상을 나타낸다. 이 질병은 일반적으로 건강상태가 좋은 돈군에서 발생하며 이환률은 낮으나, 5-12주령의 돼지에 있어서 비교적 높은 폐사율을 보인다. 또한 호흡기 질병으로 5~7주령이 이유자돈에서는 잘 발생하지 않는 흉막폐렴이 급성으로 발병하여 많은 수의 자돈들이 폐사하고, 흉막폐렴 예방백신을 접종하여도 크게 개선되지 않는 사례가 보고 되고 있다.
돼지써코바이러스와 관련된 질환으로는 이미 언급한 이유자돈 전신성 소모성 증후군 (PMWS; post-weaning multisystemic wasting syndrome) 이외에 돼지 피부염 신부전 증후군 (PDNS; porcine dermatitis and nephropathy syndrome), 복합 돼지 호흡기 질병 (PRDC; porcine respiratory disease complex), 모돈유산폐사증후군 (SAMS; sow abortion and mortality syndrome), 번식장애 등에서 관련성이 입증되고 있다. 복합 돼지 호흡기 질병에 관련된 세균 질환에는 마이코플라스마 폐렴, 파스튜렐라성 폐렴, 흉막폐렴, 글래서씨병 등이 복합적으로 관여하는 것으로 확인되고 있다. 돼지 글래서병의 원인균은 헤모필루스 파라수이스 (Haemophilus parasuis)로 생후 2 내지 4개월령의 자돈에 감수성이 있으며, 생후 5 내지 8주령의 이유 후 자돈에서 많이 발생하며, 상부 호흡기도에 상재해 있다가 수송 및 이동 환경 변화 등의 스트레스 요인에 의해 면역력이 약화돼 감염이 일어나는 질병으로, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae)와 PRRS (porcine reproductive and respiratory disease) 등은 글래서병을 촉진시킨다. 돼지 유행성 폐렴은 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (Mycoplasma hyopneumoniae)가 원인으로 연중 발생하며 이병율은 높으나 폐사율은 낮고, 어린 자돈에서 감염이 시작되어 모체이행항체가 소실되는 4 내지 5주령에 많이 발생을 하며, 상부 호흡기도에 감염되어 기관의 편모와 상피세포를 파괴하여 1차적인 방어기능을 약화시켜 건성기침과 만성 폐렴을 유발하며, 폐의 탐식기능 세포의 면역력을 저하시켜 특히 다른 호흡기 질병 (돼지 글래서병, 흉막폐렴, PRRS등)을 쉽게 감염되게 하여 육성, 비육돈까지 문제가 되어 폐사율이 높아지는 호흡기 질병이다.
동시 감염의 경우, 바이러스 질환에는 PRRS 바이러스, PPV (porcine parvovirus), PED (porcine epidemic diarrhea) 바이러스, 돼지인플루엔자 바이러스 등이 감염되어 있는 것으로 확인되고 있다. 돼지 써코바이러스는 단독으로 감염, 질병을 유발하기보다는 다른 바이러스나 세균의 혼합감염으로 발병하며 그 폐사율도 급격하게 증가하고 있는 실정이다.
PMWS로 경제적 피해를 보고 있는 농장은 질병예방을 위하여 과도한 백신을 접종하는 경우가 많이 있다. 이러한 과도 백신 접종은 이유자돈에게 과도한 스트레스를 부과하여 돼지 써코바이러스 2형에 감염된 돼지가 이유자돈 전신성 소모성 증후군으로 진행된다. 따라서 이유자돈이 위축 등의 문제가 있는 농장에서는 백신의 접종횟수를 줄이고 돼지 써코바이러스에 관련된 질병을 예방하기 위해 반드시 PCV를 함유하는 혼합백신의 개발이 절실히 필요한 형편이다.
PMWS 전 세계적으로 분포하는 것으로 보고되고 있으며, 유럽에서는 여전히 조기 이유 양돈장에서 4~14주령의 돼지에서 주로 발생하여 지속적인 만성 폐렴, 증체율의 둔화, 쇠약, 설사로 인하여 5~50% 폐사 (보통 15~20%), 약 10%는 위축으로 인하여 출하일령에 정상 체중에 도달하지 못하므로 경제적 손실을 가중시킨다. 북아메리카에서는 요즈음　주로 12주령 이전에 발병하던 PMWS 발병시점이 모돈과 질병의 관리로 12주령 이후로 점점 늦추어지고 있는 설정이다. 이러한 상황을 감안할 때 농장 상황에 맞추어 돼지 써코바이러스를 함유하는 혼합백신을 모돈용과 자돈용으로 구분하여 개발할 필요가 있게 되었다. 모돈에 접종하여 충분한 모체 이행항체를 형성하여 12주령 이전의 돼지에서의 PMWS 발병을 예방할 수 있도록 돼지 모돈용 PCV 혼합백신과, 자돈에 접종하여 12주령 이후에도 PMWS 발병을 예방할 수 있도록 자돈용 PCV 혼합백신의 개발이 PCV 관련 질환 예방에 효과를 볼 수 있다.
이에 본 발명자들은 PCV-2 (CAKY98, KCTC 11150BP)를 고농도 대량 배양하여 PCV-2와 동시 감염되었을 때 그 증상이 심해질 수 있는 바이러스와 세균을 선택 배양하여 불활화한 후 보조제를 넣어 모돈용 혼합백신과 자돈용 혼합백신을 각각 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 돼지 써코바이러스의 감염과 더불어 마이코플라스마 폐렴, 파스튜렐라성 폐렴, 흉막폐렴, 글래서씨병, PED 바이러스 복합 감염에 의한 PMWS, PRDC, SAMS, 번식장애 등의 질병을 효과적으로 예방하기 위한, 모돈용 혼합백신과 자돈용 혼합백신을 제조하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적을 위하여, 본 발명자들은 PCV-2 (CAKY98, KCTC 11150BP)를 고농도 대량 배양하여 PCV-2와 동시 감염되었을 때 그 증상이 심해질 수 있는 바이러스와 세균을 선택 배양하여 불활화한 후 수의학적으로 허용가능한 보조제를 넣어 모돈용 백신과 자돈용 백신을 각각 제조하였다.
구체적으로, 본발명은 각각을 불활화시킨 돼지 써코바이러스 2형 (CAKY98, KCTC 11150BP)의 전체 바이러스 (whole virus), 파스튜렐라 멀토시다 cDNT (P. multocida cDNT), 파스튜렐라 멀토시다 박테린 (P. multocida bacterin) 및 보데텔라 브론키셉티카 (B. bronchiseptica)를 포함하는, 돼지 써코바이러스 및 위축성 비염의 예방을 위한 모돈용 혼합백신을 제공한다. 바람직하게는 상기 파스튜렐라 멀토시다 cDNT는 D4 형이고, 파스튜렐라 멀토시다 박테린은 A3 형이지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 각각을 불활화시킨 돼지 써코바이러스 2형 (CAKY98, KCTC 11150BP)의 전체 바이러스 (whole virus), 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV; Porcine epidemic diarrhea virus) 및 돼지 전염성 위장염 바이러스 (TGEV: Transmissible gastroenteritis virus)를 포함하는, 돼지 써코바이러스, PEDV 및 TGEV에 의한 질환 예방을 위한 모돈용 혼합백신을 제공한다.
또한, 본 발명은 각각을 불활화시킨 돼지 써코바이러스 2형 (CAKY98, KCTC 11150BP)의 전체 바이러스 (whole virus), 헤모필루스 파라수이스 박테린 (H. parasuis bacterin), 및 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 박테린 (M. hyopneumoniae bacterin)를 포함하는, 돼지 써코바이러스, 글래서씨병 및 유행성 폐렴 예방을 위한 자돈용 혼합백신을 제공한다. 바람직하게는, 상기 헤모필루스 파라수이스 박테린의 균주는 4형 및 5형이고, 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 박테린의 균주는 J/101이지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 각각을 불활화시킨 돼지 써코바이러스 2형 (CAKY98, KCTC 11150BP)의 전체 바이러스 (whole virus), 파스튜렐라 멀토시다 박테린 (P. multocida bacterin), 악티노바실러스 플루로뉴모니애 (A. pleuropneumoniae bacterin), 및 악티노바실러스 플루로뉴모니애 독소 (A. pleuropneumoniae bacterin toxin)을 포함하는, 돼지 써코바이러스, 파스튜렐라 폐렴 및 흉막 폐렴 예방을 위한 자돈용 혼합백신을 제공한다. 바람직하게는, 상기 파스튜렐라 멀토시다 박테린의 균주는 A3 형 및 D4 형이고, 악티노바실러스 플루로뉴모니애의 균주는 2 형 및 5 형이며, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 독소의 균주는 2 형 및 5 형이지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 혼합백신은 당업자에게 공지된 기술에 따라 불활화될 수 있다. 불활화는 바람직하게는 화학적 루트, 예컨대 항원을 포름알데히드(포르말린), 파라포름알데히드, 베타-프로피올락톤 또는 에틸렌이민 또는 이의 유도체와 같은 화학제에 노출시켜 실시한다. 본 발명의 실시예에서는 PCV-2 등을 불활화하기 위해서 포르말린을 사용하였지만, 이것에 한정되는 것은 아니다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 불활화된 혼합백신은 수의학적으로 허용가능한 보조제를 포함할 수 있다. 보조제는 유리하게는 당업자에게 공지된 기술에 따라 에멀션, 예컨대 유중수 또는 수중유 형태로 보충될 수 있다. 사용할 수 있는 보조제의 예로는, 알루미늄 히드록시드, 사포닌 (예, Quillaja saponin 또는 Quil A; Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach, 1995, Plennum Press, New-York and London, p.210), Avridine®(Vaccine Design p. 148), DDA (Dimethyldioctadecylammonium bromide, Vaccine Design p. 157), 폴리포스파젠 (Vaccine Design p.204) 또는 광물유, 스쿠알렌 (예, SPT 에멀션, Vaccine Design p.147), 스쿠알렌 (예, MF59, Vaccine Design p. 183)에 기초한 수중유 에멀션, 또는 신진대사성 오일 (바람직하게는 WO-A-94 20071 에 따른) 에 기초한 유중수 에멀션 및 US-A-5,422,109 에 기술된 에멀션을 들 수 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 혼합백신은 수의학적으로 허용가능한 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다.
돼지 써코바이러스의 감염과 더불어 마이코플라스마 폐렴, 파스튜렐라성 폐렴, 흉막폐렴, 글래서씨병, PED 바이러스 복합 감염에 의한 PMWS, PRDC, SAMS, 번식장애 등의 질병을 효과적으로 예방하는 본 발명의 PCV-2 전체 바이러스 (whole virus)를 포함하는 모돈용 혼합백신과 자돈용 혼합백신을 통해 돼지 써코바이러스에 의한 복합 감염으로 인한 피해를 줄일 수 있다. 또한 모돈과 자돈 전용으로 혼합 백신을 개발함으로써 접종 횟수를 줄이고 효과적인 접종 프로그램을 갖출 수 있다.
이하, 비제한적인 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의하여 본 발명의 범위가 국한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야 및 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: PCV -2 균주 및 혼합된 균주들의 배양
세포 증식용 배양액에 PK-15 세포 (미국 아이오와 대학교)를 증식시켜 적정세포가 배양되면 세포 증식용 배양액을 제거하였다. 돼지 써코바이러스 (CAKY98, KCTC 11150BP)를 바이러스 증식용 배양액에 0.5~1.0 M.O.I로 혼합하고 단층이 형성된 세포에 접종하여 37℃에서 5~7일간 회전 배양하였다. 일정기간 배양된 바이러스액은 -70℃에서 동결한 후 상온에서 해동하는 과정을 2회 반복하였다. 해동 동결 후 세포 잔여물을 제거한 후 백신 원료로 사용하였다.
본 발명에서 혼합 균주들로 사용된 파스튜렐라 멀토시다 (P. multocida) A3형, D4형; 보데텔라 브론키셉티카 (B. bronchiseptica) P4 형; 돼지 유행성 설사 바이러스 (PEDV; Porcine epidemic diarrhea virus); 돼지 전염성 위장염 바이러스 (TGEV: Transmissible gastroenteritis virus); 헤모필루스 파라수이스 (H. parasuis) 4형, 5형; 마이코플라즈마 하이오뉴모니애 (M. hyopneumoniae) J/101; 악티노바실러스 플루로뉴모니애 (A. pleuropneumoniae) 2형, 5형은 국립수의과학검역원에서 입수하였으며, 통상적인 방법으로 배양하였다.
실시예 2: PCV -2 및 혼합 균주들의 불활화
바이러스 배양액에 포르말린을 최종농도 0.3%가 되도록 가한 후 37℃에서 교반하며 2일간 불활화시킨 다음 4℃ 냉실에 보존하였다.
실시예 3: PCV -2 전체 바이러스 ( whole virus )를 포함하는 혼합백신의 제조 및 접종
(1) 돼지 써코바이러스 및 위축성 비염 예방을 위한 모돈용 혼합백신
아래 [표 1]과 같은 돼지 써코바이러스 및 위축성 비염 예방을 위한 모돈용 혼합백신(사균 백신)을 제조하여 본 실험에 이용하였다.
돼지 써코바이러스 (PCV-2) 및 위축성 비염 예방을 위한 모돈용 혼합백신의 조성
병원체 균주 비 고
돼지 써코바이러스 2형
(Porcine Circovirus type-2)		 CAKY98 KCTC 11150BP
파스튜렐라 멀토시다 톡소이드
(P. multocida cDNT)		 D4 형 　
파스튜렐라 멀토시다 박테린
(P. multocida bacterin)		 A3 형 　
보데텔라 브론키셉티카
(B. bronchiseptica ) 		P4 　
알루미늄 하이드록시 겔
(Aluminum hydroxide gel)		 　 　
10 마리의 기니아피그 (Guinea pig) (체중 300~350 g) 및 4 마리의 토끼 (1~2Kg)의 근육에 시험백신 0.5 ㎖과 2 ㎖를 각각 접종한 후 2 주 후 동일 방법으로 추가 접종하였다. 대조군으로서 동일 일령의 기니아피그 5 마리 및 토끼 2 마리를 이용하였다. 2차 접종 2 주 후 채혈하여 돼지 써코바이러스는 Synbiotics ELISA (Blocking ELISA)를 실시하였으며, 파스튜렐라 멀토시다 D형의 독소 항체역가를 확인하기 위해 ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay)를 실시하였다.
상기 Synbiotics ELISA는 SERELISA PCV2 Ab Mono Blocking 키트 (Synbiotics corp. 미국)를 이용하여 실시하였다. 먼저, 검사하고자하는 샘플을 10배 희석하여 웰 (well)에 100 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 1시간 인큐베이션 (incubation)하였다. 1시간 후 키트의 wash buffer로 4회 세척하였다. 세척 후 콘쥬게이트 (conjugate)를 100배 희석하여 100 ㎕씩 웰에 분주한 후 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후 wash buffer로 4회 세척하였다. 세척된 웰에 기질 (substrate)를 100 ㎕씩 분주한 후 laboratory temperature에서 30분간 반응시켰다. 반응한 후 stop sloution을 50 ㎕씩 웰에 넣고 반응을 정지하여 흡광도 값을 측정하였다. S/N 값의 평균이 0.63보다 작은 경우 양성, 0.75 보다 큰 경우 음성으로 판정한다.
파스튜렐라 멀토시다 D형의 독소 항체 역가를 확인하기 위해 실시하는 ELISA는 먼저 각 항원의 적정한 코팅 농도 (0.4~1.0 mg/㎖)로 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, washing buffer로 4회 세척하고, 100 ㎕의 blocking buffer를 첨가한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 동일한 방법으로 세척 후, 혈청을 10배부터 2진 희석하여 1280배까지 희석하여 ELISA 플레이트로 옮긴 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 동일한 방법으로 세척 후, blocking buffer로 Anti-guinea pig 또는 Anti-rabbit HRP를 5,000배 희석하여 100 ㎕씩 각 웰에 분주한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 동일한 방법으로 세척 후, substrate (OPD) solution을 100 ㎕ 분주한 후, 실온에서 15분 동안 반응시킨 후 stop solution을 50 ㎕ 첨가하여 반응을 중지시켰다. 반응이 정지된 15분 이내에 ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하여 항체가를 분석하였다.
또한, 마우스 (체중 15~20 g) 100 마리를 선정하고 20 마리씩 1 개 그룹으로 나누었다. 5개 그룹에 시험백신을 원액, 5배 희석, 10배 희석, 25배 희석하여 0.2 ㎖씩 복강에 2주 간격으로 2회 접종하고 나머지는 대조군으로 두었다. 2차 접종 10일 후 10배 희석그룹과 대조군 10 마리에 보데텔라 브론키셉티카 공격균주를 10 LD50/0.2 ㎖ 접종하여 10일간 생존여부를 관찰하였고, 원액 및 5배, 25배 희석 그룹과 대조군 10 마리에 파스튜렐라 멀토시다 A형 공격균주를 10 LD50/0.2 ㎖ 접종하여 10일간 생존여부를 관찰하였다.
그 결과, 돼지 써코바이러스의 역가는 대조군에 비해 월등한 ELISA 양성값을 보였으며 (표 2 참조), 파스튜렐라와 보데텔라의 역가는 마우스 치사율로 확인한 결과 검정역가 이상의 역가를 보였다 (표 3 참조).
돼지 써코바이러스 (PCV-2) 및 파스튜렐라 멀토시다 D4형의 역가
그룹 시험동물 S/N 값의 평균
(양성 < 0.63)		 ELISA 역가
파스튜렐라 멀토시다 D4형
시험군 기니아피그 10 마리 0.12 861.1*
대조군 기니아피그 5 마리 0.82 <10*
*: Geometric titer (항체 역가의 기하평균치)
S/N 값 = 샘플의 OD 값 / 음성 대조군의 OD 값
보데텔라 브론키셉티카 P4형 및 파스튜렐라 멀토시다 A3형의 역가
항원 마우스 생존율
보데텔라
브론키셉티카
P4형		 10배 희석 대조군
100% 0%
파스튜렐라
멀토시다 A3형		 원액 5배 희석 25배 희석 대조군
100% 100% 80% 0%
(2) 돼지 써코바이러스 및 PEDV , TGEV 에 의한 질환 예방을 위한 모돈용 혼합백신
아래 [표 4]와 같은 돼지 써코바이러스 및 PEDV, TGEV 모돈용 혼합백신 (사균 백신)을 제조하여 본 실험에 이용하였다.
돼지 써코바이러스 (PCV-2) 및 PEDV, TGEV 모돈용 혼합백신의 조성
병원체 균주 비 고
돼지 써코바이러스 2형
(Porcine Circovirus type-2)		 CAKY98 KCTC 11150BP　
돼지 유행성 설사 바이러스
(Porcine epidemic diarrhea virus)		 　SM98P 　
돼지 전염성 위장염 바이러스
(Transmissible gastroenteritis virus)		 　175L 　
애주번트(adjuvant) 　 　
10 마리의 기니아피그 (체중 300~350 g)의 근육에 시험백신 0.5 ㎖을 접종한 후 2주 후 동일 방법으로 추가 접종하였다. 대조군으로서, 동일 일령의 기니아피그 5 마리를 이용하였다. 2차 접종 2주 후 채혈하여 돼지 써코바이러스는 전술한 방법과 동일하게 Synbiotics ELISA (Blocking ELISA)를 실시하였으며, PED 바이러스, TGE 바이러스의 항체 역가를 확인하기 위해 SN(Serum Neutralization) 시험을 실시하였다.
상기 SN (Serum Neutralization) 시험을 위하여 먼저 시험혈청을 10배 단계희석하여 각 희석 배수당 5개씩 96 웰 플레이트에 50 ㎕씩 웰에 분주하였다. 각 웰에 PED 바이러스를 100TCID50으로 동량 분주하여 37℃에서 1시간 배양하였다. 1시간 후 70% 단층이 형성된 VERO 세포를 무혈청 배지로 3회 세척하고 중화 혼합액을 넣고 1시간 동안 배양하였다. 배양 후 0.02 ㎍/㎖ Trypsin (Trypsin, from porcine pancreas, Sigma T4799-100G)이 함유된 배지를 100 ㎕씩 분주한 후 37℃에서 5일간 배양하면서 세포 변성효과를 확인하였다. 세포변성효과가 일어나지 않는 웰을 중화 양성으로 판정한다.
TGE 바이러스에 대한 SN (Serum Neutralization) 시험 방법 또한 상기와 동일하며, 다만 세포는 ST 세포를, Trypsin 양은 0.01 ㎍/㎖을 사용하였다.
그 결과,　돼지 써코바이러스의 역가는 대조군에 비해 월등한 ELISA 양성값을 보였으며, TGE와 PED 바이러스의 역가를 중화 항체가 (Serum Neutralization)로 확인한 결과 검정역가 이상의 역가를 보였다.
돼지 써코바이러스 (PCV-2) 및 PEDV, TGEV의 항체 역가
그룹 시험동물 S/N 값의 평균
(양성 < 0.63)		 SN 역가
TGE PED
시험군 기니아피그 10 마리 0.12 294.1* 14.9*
대조군 기니아피그 5 마리 0.88 <2 <2
*: Geometric titer
(3) 돼지 써코바이러스 및 글래서씨병 , 유행성 폐렴 예방을 위한 자돈용 혼합백신
아래 [표 6]과 같은 돼지 써코바이러스 및 글래서씨병, 유행성 폐렴 예방을 위한 자돈용 혼합백신(사균 백신)을 제조하여 본 실험에 이용하였다.
돼지 써코바이러스 (PCV-2) 및 글래서씨병, 유행성 폐렴 예방을 위한 자돈용 혼합백신의 조성
병원체 균주 비 고
돼지 써코바이러스 2형
(Porcine Circovirus type-2)		 CAKY98 KCTC 11150BP　
헤모필루스 파라수이스 박테린
(H. parasuis bacterin ) 		4형 　
헤모필루스 파라수이스 박테린
(H. parasuis bacterin ) 		5형 　
마이코플라즈마 하이오뉴모니애 박테린
(M. hyopneumoniae bacterin ) 		J/101 　
알루미늄 하이드록시드 겔
(Aluminum hydroxide gel)		 　 　
10 마리의 기니아피그 (체중 300~350 g)의 근육에 시험백신 0.5 ㎖을 접종한 후 2주 후 동일 방법으로 추가 접종하였다. 대조군으로 동일 일령의 기니아피그 5 마리를 사용하였다. 2차 접종 2주 후 채혈하여, 전술한 방법과 동일하게 돼지 써코바이러스는 Synbiotics ELISA (Blocking ELISA)를 실시하였으며, HPS (H. parasuis) 4형, 5형의 항체 역가를 확인하기 위해 ELISA를 실시하였다. 또한, 10 마리의 마우스 (체중 15~20 g)에 피하에 시험백신 0.2 ㎖을 접종한 후 2주 후 무접종 대조군과 함께 채혈하여 마이코플라즈마 하이오뉴모니애의 ELISA 항체가를 측정했다.
그 결과, 돼지 써코바이러스의 역가는 대조군에 비해 월등한 ELISA 양성값을 보였으며, HPS 4형과 HPS 5형, 그리고 마이코플라스마의 역가를 ELISA 역가로 확인한 결과 검정역가 이상의 역가를 보였다 (표 7 참조).
돼지 써코바이러스 (PCV-2), HPS 4, HPS 5형 및 마이코플라즈마의 역가
그룹 시험동물 S/N 값의 평균
(양성 < 0.63)		 ELISA 역가
HPS 4형 HPS 5형 마이코플라즈마
하이오뉴모니애
시험군 기니아피그 10마리 0.11 207.9* 415.9* 2896.3*
대조군 기니아피그 5마리 0.76 <2* <2* <2*
*: Geometric titer
(4) 돼지 써코바이러스 및 파스튜렐라 폐렴, 흉막폐렴 예방을 위한 자돈용 혼합백신
아래 [표 8]과 같은 돼지 써코바이러스 및 파스튜렐라 폐렴, 흉막폐렴 예방을 위한 자돈용 혼합백신 (사균 백신)을 제조하여 본 실험에 이용하였다.
돼지 써코바이러스 (PCV-2) 및 파스튜렐라 폐렴, 흉막폐렴 예방을 위한 자돈용 혼합백신의 조성
병원체 균주 비 고
돼지 써코바이러스 2형
(Porcine Circovirus type-2)		 CAKY98 　KCTC 11150BP
파스튜렐라 멀토시다 박테린
(P. multocida bacterin)		 D4형 　
파스튜렐라 멀토시다 박테린
(P. multocida bacterin)		 A3형 　
악티노바실러스 플루로뉴모니애 박테린
(A. pleuropneumoniae bacterin ) 		2형 　
악티노바실러스 플루로뉴모니애 박테린
(A. pleuropneumoniae bacterin ) 		5형 　
악티노바실러스 플루로뉴모니애 박테린 독소
(A. pleuropneumoniae bacterin toxin ) 		2형 　
악티노바실러스 플루로뉴모니애 박테린 독소
(A. pleuropneumoniae bacterin toxin ) 		5형 　
알루미늄 히드록시드 겔
(Aluminum hydroxide gel)		 　 　
10 마리의 기니아피그 (체중 300~350 g) 및 4 마리의 토끼(체중 1~2 kg)의 근육에 시험백신 0.5 ㎖과 2 ㎖를 각각 접종한 후 2주 후 동일 방법으로 추가 접종하였다. 대조군으로서 동일 일령의 기니아피그 5 마리 및 토끼 2 마리를 사용하였다. 2차 접종 2주 후 채혈하여, 돼지 써코바이러스는 전술한 방법과 동일하게 Synbiotics ELISA (Blocking ELISA)를 실시하였으며, App (A. pleuropneumoniae) 항체 역가를 확인하기 위해 ELISA 및 MAT (Microplate Agglutination Test)를 실시하였다.
MAT를 실시하기 위하여, 먼저 96-웰 마이크로플레이트의 모든 웰에 PBS 50 ㎕씩 첨가한 후 첫 번째 칸에 시험혈청 50 ㎕를 넣은 후, 10 단계 (1,024배)까지 2진 희석하였다. 불활화된 MAT용 항원을 50 ㎕씩 모든 웰에 첨가한 후 37℃에서 2시간 동안 반응시킨 다음, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시킨 후, 응집 여부를 통해 항체가를 측정하였다.
그 결과, 돼지 써코바이러스의 역가는 대조군에 비해 월등한 ELISA 양성값을 보였으며, App 2형과 App 5형의 역가를 MAT 역가로, App 2형과 App 5형의 외독소의 역가를 ELISA 역가로, 파스튜렐라의 역가를 마우스 생존율로 확인한 결과 검정역가 이상의 역가를 보였다 (표 9 및 10 참조).
돼지 써코바이러스 (PCV-2)의 역가, App 2형과 App 5형의 역가, App 2형과 App 5형의 외독소의 역가

그룹
마리		 S/N 값의
평균
(양성 < 0.63)		 MAT 역가 ELISA 역가
App
2형		 App
5형		 App
2형
외독소		 App
5형
외독소
시험군 기니아피그 10 마리 0.13 134.5* 269.1* 452.5* 905.1*
대조군 기니아피그
5 마리		 0.91 <10* <10* <10* <10*
*: Geometric titer
파스튜렐라 멀토시다의 역가
항 원 마우스 생존율
파스튜렐라 멀토시다 원액 5배 희석 25배 희석 대조군
100% 100% 90% 0%
이상에서 본 발명을 특정 실시예들을 중심으로 하여 설명하였지만, 본 발명의 취지 및 첨부된 특허청구범위 내에서 다양한 변형, 변경 또는 수정이 당해 기술 분야에서 가능하며, 따라서 전술한 설명 및 도면은 본 발명의 기술사상을 한정하는 것이 아니라 본 발명을 예시하는 것으로 해석되어져야 한다. 본 발명에서 인용된 모든 문헌은 본 발명의 명세서에 참조로서 통합된다.

Claims (10)

  1. 각각을 불활화시킨 KCTC 11150BP로 기탁된 돼지 써코바이러스 2형의 전체 바이러스(whole virus), 파스튜렐라 멀토시다 박테린(P. multocida bacterin) A3형, 파스튜렐라 멀토시다 박테린 D4형, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 박테린(A. pleuropneumoniae bacterin) 2형, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 박테린 5형, 악티노바실러스 플루로뉴모니애 박테린 2형 독소, 및 악티노바실러스 플루로뉴모니애 박테린 5형 독소(A. pleuropneumoniae bacterin toxin)를 포함하는 돼지 써코바이러스의 감염, 파스튜렐라 폐렴 및 흉막 폐렴 예방을 위한 자돈용 혼합백신.
  2. 제 1항에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 보조제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 혼합백신.
  3. 제 2항에 있어서, 수의학적으로 허용가능한 부형제 또는 희석제를 추가로 포함함을 특징으로 하는 혼합백신.
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